JP2005269928A - Method for controlling activity of rice ssiia, and mutant therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、より詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、並びにそのためのイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体及びそれをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、当該ＳＳIIａの変異体をコードする遺伝子で形質転換された植物、当該植物による改質されたデンプンを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for controlling the activity of SSIIa comprising replacing one or more amino acids of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids, and more particularly, rice starch synthase IIa (SSIIa). A method for controlling the activity of SSIIa, comprising substituting one or more amino acids selected from the group consisting of 88th, 604th, 737th, and 781th of the above with other amino acids, and rice starch therefor The present invention relates to a mutant of synthase IIa (SSIIa) and a DNA encoding the same. The present invention also relates to a plant transformed with a gene encoding the SSIIa mutant, and a method for producing modified starch by the plant.
米は穀物植物として全世界で広く栽培され、世界の人口の約１／３は米食によっている。米は栽培される地域により物理化学的な特性が異なっていることはよく知られており、そして米の味覚は米のデンプンの質に大きく依存しており、各地域によりその地域に応じた米の種類が選択されてきた。
米の栽培品種としては、オリザサティバ（Oryza sativa）とグラベリマステウド（glaberrima Steud）の２種類がある。前者はアジアで栽培され熱帯、亜熱帯及び温帯地域に広く分布しているが、後者は西アフリカ地域に極限されている。
Rice is widely grown all over the world as a cereal plant, and about 1/3 of the world's population is based on rice. It is well known that rice has different physicochemical characteristics depending on the region where it is cultivated, and the taste of rice greatly depends on the starch quality of the rice. Types have been selected.
There are two types of rice cultivars: Oryza sativa and Glaberrima Steud. The former is grown in Asia and is widely distributed in tropical, subtropical and temperate regions, while the latter is limited to West Africa.
雑種の花粉の不捻における遺伝学的分析に基づいて、加藤らはオリザサティバ（Oryza sativa）をジャポニカ（japonica）とインディカ（indica）に分類した（非特許文献１参照）。また、森永（非特許文献２参照）及びチャング（非特許文献３参照）は、インディカ（indica）、ジャポニカ（japonica）及びジャバニカ（javanica）の３種に分類することを提唱した。
このようにオリザサティバ（Oryza sativa）（以下、イネという。）の分類については種々の意見が提案され、遺伝学的な分析やイネの種子に含まれているデンプンや脂質の違いなどに基づくイネの分類が報告されてきている。本明細書においては、エステラーゼのアイソザイムの分析、並びに生理学的及び生化学的特性からイネをインディカ（Indica）及び中国インディカ（Chinese Indica）、並びに、温帯ジャポニカ（Temperate Japonica）及び熱帯ジャポニカ（Tropical Japonica）の４種に分類することにする。
Based on genetic analysis of hybrid pollen sterility, Kato et al. Classified Oryza sativa into japonica and indica (see Non-Patent Document 1). Morinaga (see Non-Patent Document 2) and Chang (see Non-Patent Document 3) proposed classifying them into three types: indica, japonica, and javanica.
As described above, various opinions have been proposed for the classification of Oryza sativa (hereinafter referred to as rice), and rice based on genetic analysis and differences in starch and lipids contained in rice seeds. Classifications have been reported. In the present specification, rice is extracted from Indica and Chinese Indica, and Temperate Japonica and Tropical Japonica from analysis of esterase isozymes and physiological and biochemical characteristics. It will be classified into four types.
イネの味覚は主としてそのデンプンによるものであり、ジャポニカのねっとりとした味覚や、インディカのパサパサとした味覚は、それらのデンプンの質の相違によるものであることがわかってきている。
そもそもデンプンは植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−ポリグルコースからなる多糖類の１種で、アミロースとアミロペクチンからなっている。グリコーゲンもデンプンと同様にα−ポリグルコースからなる多糖類であるが、グリコーゲンは主として動物のエネルギー貯蔵物質として利用されている。
デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。
The taste of rice is mainly due to its starch, and it has been found that the sticky taste of japonica and the taste of indica papasa are due to differences in the quality of the starch.
In the first place, starch is an energy storage substance of plants and is a kind of polysaccharide consisting of α-polyglucose, and is composed of amylose and amylopectin. Glycogen, like starch, is a polysaccharide composed of α-polyglucose, but glycogen is mainly used as an energy storage material for animals.
Starch is not only used as a main ingredient of grains as food and feed, but also processed into dextrins, oligosaccharides, isomerized sugars, etc., and is also used in processed foods. It is also used as a raw material.
デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、植物の種類や品種によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの微細な化学構造による違いから来ていると説明されてきている。
デンプンは主としてアミロース（Amylose）とアミロペクチン（Amylopectin）からできているものであり、これらによって植物のデンプン粒が形成さているが、デンプン粒の形成にはアミロースは必須ではないとされている。
アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占め、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がり、少量のα‐１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンはデンプン粒中の７０‐８０％を占め、グルコース・ユニットがα‐１，４グルコシド結合で伸び、主鎖と平行にα‐１，６グルコシド結合で枝が繋がった構造をとっている。アミロペクチンのこの特徴的な構造は”クラスター”構造と呼ばれている。
また、動物やバクテリアの貯蔵エネルギーであるグリコーゲン(Glycogen)もデンプンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、アミロペクチンのようなクラスター構造は持っておらず、グリコーゲンは”tree like”や”bush like”構造と呼ばれる不規則な枝分かれ構造であると報告されている。
Speaking of starch, rice starch, potato starch, wheat starch, corn starch, etc., the starch shape, taste, and physical properties when gelatinized slightly differ depending on the type and variety of plants. We have been using various types of plant-derived starch depending on the application. It has been explained that such differences in the properties of starch stem from differences due to the fine chemical structure of starch.
Starch is mainly composed of Amylose and Amylopectin, and these form the plant starch granules, but amylose is not essential for the formation of starch granules.
Amylose is a linear helical molecule that accounts for 20-30% of stored starch, with glucose units linked by α-1,4 glucoside bonds and small amounts of α-1,6 glucoside bond branches. . On the other hand, amylopectin occupies 70-80% of starch granule, and glucose unit is extended by α-1,4 glucoside bond, and branches are connected by α-1,6 glucoside bond in parallel with the main chain. Yes. This characteristic structure of amylopectin is called the “cluster” structure.
Also, glycogen (Glycogen), the storage energy of animals and bacteria, is composed of glucose homopolymers like starch, but it does not have a cluster structure like amylopectin, and glycogen is “tree like” or “bush”. It is reported to be an irregular branched structure called “like” structure.
図１にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの構造を示す。図１に示される線はα−グルコースの連鎖であり、アミロース（図１の（Ｃ））は枝分かれがほとんど無くα−１，４−グルコースのほぼ１本鎖の構造をしている。アミロペクチン（図１の（Ｂ））は規則正しい枝分かれ構造を有し、α−１，４−グルコースの連鎖とα−１，６−グルコースの枝分かれ構造（クラスター）を一定の間隔で規則正しく有している。また、動物などのエネルギー貯蔵物質であるグリコーゲン（図１の（Ａ））は、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。 FIG. 1 shows the structures of amylose, amylopectin, and glycogen. The line shown in FIG. 1 is a chain of α-glucose, and amylose ((C) of FIG. 1) has almost no branching and has a substantially single-stranded structure of α-1,4-glucose. Amylopectin ((B) of FIG. 1) has a regular branched structure, and has a chain of α-1,4-glucose and a branch structure (cluster) of α-1,6-glucose regularly at regular intervals. . Moreover, glycogen ((A) of FIG. 1), which is an energy storage substance such as animals, has a completely irregular branched structure. Glycogen has smaller molecules and shorter branches than amylopectin, and many of them are water-soluble substances. In contrast, amylopectin has a long branch and is filled with glucose at a high density, and is generally a water-insoluble substance.
このようなアミロペクチンのクラスター構造は、結晶構造を造る際に有利であり、結晶構造によるデンプン粒が形成される。アミロペクチンのクラスター構造は、ほぼ９ｎｍの規則正しい繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズは組織や種が異なっても余りばらつきが見られない。
アミロペクチンの構造をさらに詳細に見てゆくと、３タイプのα‐１，４−グルコシド鎖を持っている（図２参照）。Ａ鎖は最も外側の鎖で鎖の中に分岐結合を持たない鎖である。Ｂ鎖は一つの鎖あたり１つ以上の鎖が分岐結合している鎖であり、Ｂ鎖はさらに、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及んでいるＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を持っている鎖であり、アミロペクチン１分子あたり１つのＣ鎖を持っている。
Such a cluster structure of amylopectin is advantageous in producing a crystal structure, and starch grains are formed by the crystal structure. The cluster structure of amylopectin is a regular repetitive structure of about 9 nm, and the size of 9 nm does not show much variation even when the tissues and species are different.
When the structure of amylopectin is examined in more detail, it has three types of α-1,4-glucoside chains (see FIG. 2). The A chain is the outermost chain and has no branch bond in the chain. The B chain is a chain in which one or more chains are branched in one chain, and the B chain further includes a B1 chain that stays in one cluster, a B2 chain that spans two clusters, and a three cluster There are B3 chains. The C chain is a chain having a reducing end, and has one C chain per molecule of amylopectin.
このように、アミロペクチンの構造はほぼ一定ではあるが、植物の種類や品種によりアミロペクチンの構造も微妙に異なってきている。最近の研究によれば、ねっとりとしたデンプンを有するジャポニカと、パサパサとしたデンプンを有するインディカのアミロペクチンの構造上の相違が報告されている。図３の上段（図３の（ａ））はジャポニカ米のアミロペクチン、図３の下段（図３の（ｂ））はインディカ米のアミロペクチンの構造を模式的に示したものである。クラスターの枝の長さを比べるとインディカ米の方が比較的長く、その密度も比較的密になっている。このためにインディカ米のデンプンの方が糊化が難しくなっていると考えられている。
このようなアミロペクチンの微細な構造上の相違は、アミロペクチンを合成する際の合成方法の相違により生起してくると考えられている。
As described above, the structure of amylopectin is almost constant, but the structure of amylopectin varies slightly depending on the type and variety of plants. Recent studies have reported structural differences between japonica with a thick starch and indica amylopectin with papasa starch. The upper part of FIG. 3 ((a) of FIG. 3) schematically shows the structure of amylopectin of japonica rice, and the lower part of FIG. 3 ((b) of FIG. 3) schematically shows the structure of amylopectin of indica rice. Comparing the length of the cluster branches, Indica rice is relatively long and its density is relatively dense. For this reason, starch of indica rice is considered to be more difficult to gelatinize.
Such a difference in the fine structure of amylopectin is considered to be caused by a difference in the synthesis method when synthesizing amylopectin.
アミロペクチンは次の４つのクラスの酵素の連続反応で合成されると考えられている。
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ADPglucose pyrophosphorylase（ＡＧＰ ａｓｅ））、
（２）デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））、
（３）デンプン枝作り酵素（Starch branching enzyme（ＢＥ））、
（４）デンプン枝切り酵素（Starch debranching enzyme（ＤＢＥ））
である。
ＡＧＰａｓｅは、デンプン・ポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。ＳＳは、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα‐１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、ＢＥは、アミロペクチンのα‐１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。
図４にアミロース、アミロペクチン、及びグリコーゲンの合成過程をまとめた。図４の左側のグリコーゲンの合成は主として動物や細菌類の場合であり、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。
図４の中側は、高等植物の場合のアミロペクチンの合成過程を示すものであり、図中のＳＳＳは水溶性ＳＳのことである。図４の右側は高等植物におけるアミロースの合成過程を示すものであり、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素Ｉ（granule‐bound starch synthaseＩ（ＧＢＳＳＩ））のことである。
このように、高等植物においては、前記した４種類の酵素群により植物の種類に応じたアミロペクチンを産生している。そして、植物の種類によるアミロペクチンの構造の相違は、これらの酵素の種類の違いによるところが大きいと考えられる。
Amylopectin is thought to be synthesized by the continuous reaction of the following four classes of enzymes.
(1) ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase),
(2) Starch synthase (SS),
(3) Starch branching enzyme (BE),
(4) Starch debranching enzyme (DBE)
It is.
AGPase is an enzyme that synthesizes ADP glucose, which is a raw material of starch polymer. SS has the role of extending the chain by linking ADP glucose to the non-reducing end of amylopectin via an α-1,4 glucoside bond. While SS extends the amylopectin chain, BE is an enzyme that forms an α-1,6 glucoside bond of amylopectin, and an enzyme that forms a branched portion of a branched structure.
FIG. 4 summarizes the synthesis process of amylose, amylopectin, and glycogen. The synthesis of glycogen on the left side of FIG. 4 is mainly in the case of animals and bacteria, UGPase is a phosphorylated glucose synthase that is a glycogen material, GS is a glycogen synthase, and GBE is a glycogen branching enzyme. is there.
The middle side of FIG. 4 shows the synthesis process of amylopectin in the case of higher plants, and SSS in the figure is water-soluble SS. The right side of FIG. 4 shows the process of synthesizing amylose in higher plants, and GBSS is granule-bound starch synthase I (GBSSI).
Thus, in higher plants, amylopectin according to the kind of plant is produced by the aforementioned four kinds of enzyme groups. The difference in the structure of amylopectin depending on the type of plant is thought to be largely due to the difference in the type of these enzymes.
本発明者らは、ジャポニカの日本晴（品種名）及び金南風（品種名）と、インディカのカサラス（品種名）及びＩＲ３６（品種名）との胚乳のアミロペクチンの構造を比較し、後者ではα‐１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数（ＤＰ）が１１以下のものが著しく少なく、かつＤＰが１２以上で２４以下のものに富むことを報告してきた（非特許文献４及び５参照）。また、本発明者らは、この２グループのアミロペクチンの構造の相違の原因となっている遺伝子が、スターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａと略す。）の遺伝子と同じ位置である第６染色体上にちょうど位置していることを見出した。このことはアミロペクチンのＤＰ（α‐１，４−グルコシド鎖におけるα−１，４−グルコースの数）が１０以下という短いα‐１，４−グルコシド鎖を伸長して長い鎖を形成することに、ＳＳIIａが極めて重要な役割を果たしていることを示している。 The present inventors compared the structure of amylopectin in the endosperm of Japonica Nipponbare (variety name) and Kinnan style (variety name) with the indica kasaras (variety name) and IR36 (variety name). It has been reported that the number of α-1,4-glucose (DP) in the -1,4-glucoside chain is significantly less than 11 and that the DP is more than 12 and less than 24 (non-patent literature) 4 and 5). In addition, the present inventors have located the gene responsible for the difference in the structure of these two groups of amylopectin on chromosome 6 which is the same position as the gene of starch synthase IIa (abbreviated as SSIIa). I found out. This means that the short α-1,4-glucoside chain with a DP of amylopectin (number of α-1,4-glucosides in the α-1,4-glucoside chain) of 10 or less is elongated to form a long chain. , Showing that SSIIa plays a very important role.
デンプン合成酵素（Starch synthase（ＳＳ））には、図４に示されるように３種類のサブタイプが知られており、それぞれスターチシンターゼＩ（ＳＳＩと略す。）、スターチシンターゼII（ＳＳIIと略す。）、及びスターチシンターゼIII（ＳＳIIIと略す。）と呼ばれている。ＳＳIIａはスターチシンターゼII（ＳＳII）のさらにサブタイプである。
一般にイネの胚乳における各スターチシンターゼのサブタイプの含有率は、全スターチシンターゼの約７０％がＳＳＩであり、約２５％がＳＳIIIであり、残りの約５％がそれ以外のＳＳ（ＳＳIIａを含む）であるとされており、アミロペクチンのα‐１，４−グルコシド鎖は主としてＳＳＩ及びＳＳIIIにより形成されるものであると考えられていたのであるが、ジャポニカとインディカのアミロペクチンの微細な構造上の相違がＳＳII、特にＳＳIIａの機能の相違に起因していたとする本発明者らの知見は驚くべきことである。
本発明者らは、さらに各種のイネについてアミロペクチンの微細構造を比較検討し、その原因となる遺伝子を見出してきた（特許文献１参照）。
Starch synthase (SS) has three types of subtypes as shown in FIG. 4, and starch synthase I (abbreviated as SSI) and starch synthase II (SSII), respectively. ) And starch synthase III (abbreviated as SSIII). SSIIa is a further subtype of starch synthase II (SSII).
In general, the content of each starch synthase subtype in rice endosperm is about 70% of total starch synthase, about 25% is SSIII, and the remaining about 5% contains other SS (SSIIa). The α-1,4-glucoside chain of amylopectin was thought to be mainly formed by SSI and SSIII, but the fine structure of amylopectin of Japonica and Indica Our findings that the differences were due to differences in the functions of SSII, particularly SSIIa, are surprising.
The present inventors have further compared the fine structure of amylopectin for various types of rice, and have found a gene that causes it (see Patent Document 1).
本発明は、植物、特にイネのデンプンの特性を決定しているスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を制御しているアミノ酸配列を特定し、これらのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによりＳＳIIａの活性を制御する方法、そのためのＳＳIIａの変異体を提供する。さらに、本発明はＳＳIIａの活性を制御することによりアミロペクチンによるデンプンのクラスター構造を制御し、もって新規なクラスター構造を有する改質デンプンを製造する方法、及びそのための形質転換された植物に関する。 The present invention identifies amino acid sequences that control the activity of starch synthase IIa (SSIIa), which characterizes plant starches, particularly rice starch, and substitutes these amino acids with other amino acids for SSIIa Methods of controlling activity and SSIIa variants therefor are provided. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a modified starch having a novel cluster structure by controlling the cluster structure of starch by amylopectin by controlling the activity of SSIIa, and a transformed plant therefor.
お米には大きく分けてインディカ米とジャポニカ米があり、両者の食味、食感の違いには日本人は特に敏感である。これらの違いは、いくつかの要因が絡んでいると考えられるが、従来はアミロース含量の違いばかりが着目されてきた。
本発明者らは、米デンプンの約７０−８０％を占めるアミロペクチンの構造に着目し、これまで以下のことを明らかにしてきた。
１）両者の胚乳アミロペクチンの構造は全く異なっており、その単位構造であるクラスタ ーのタイプによって区別される。インディカ米品種の多くが生産するアミロペクチンは クラスターを構成する鎖の長さが長いＬ型、ジャポニカ米品種の多くが生産するアミロ ペクチンは鎖長の短いＳ型と分類できる（図５）。
２）両者のアミロペクチンの構造の違いはスターチシンターゼIIａ型(ＳＳIIａ)が関わっ ており、この酵素が正常であれば、アミロペクチンクラスター内の鎖長を伸長できるた めにＬ型、異常であれば伸長できないためにＳ型アミロペクチンになる（図５）。
３）アミロペクチンの構造は、糊化温度の違いに影響を与え、Ｌ型アミロペクチンの糊化 開始温度はＳ型アミロペクチンより１０〜１５℃高い。
以上の結果から、ＳＳIIａのアミノ酸配列の置換が原因で、ＳＳIIａ活性が低下し、それが胚乳アミロペクチンの構造変化とそれに伴う糊化温度の低下を引き起こしていると考えられる。
Rice is roughly divided into Indica rice and Japonica rice, and Japanese people are particularly sensitive to the difference in taste and texture between the two. These differences are thought to be related to several factors, but conventionally only the difference in amylose content has been noticed.
The present inventors have focused on the structure of amylopectin, which accounts for about 70-80% of rice starch, and have clarified the following.
1) The structures of both endosperm amylopectins are completely different, and are distinguished by the type of cluster that is their unit structure. Amylopectin produced by many Indica rice varieties can be classified as L-types with long chain lengths constituting the cluster, and amylopectin produced by many Japonica rice varieties as S-types with short chain lengths (FIG. 5).
2) The difference in the structures of both amylopectins is related to starch synthase type IIa (SSIIa). If this enzyme is normal, it can extend the chain length in the amylopectin cluster, and if it is abnormal, it is extended. Since it is not possible, it becomes S-type amylopectin (FIG. 5).
3) The structure of amylopectin affects the difference in gelatinization temperature, and the gelatinization start temperature of L-type amylopectin is 10 to 15 ° C. higher than that of S-type amylopectin.
From the above results, it is considered that SSIIa activity is reduced due to substitution of the amino acid sequence of SSIIa, which causes structural change of endosperm amylopectin and accompanying reduction of gelatinization temperature.
そこで、本発明者らは、ジャポニカ品種である日本晴と金南風のＳＳIIａ活性の低下を引き起こす原因となるアミノ酸配列を同定するため、まず、各イネのＳＳIIａのアミノ酸配列を比較した。また、インディカ品種ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ品種金南風に形質転換した。その結果、
４）Ｌ型アミロペクチンを持つインディカ品種（Kasalath, IR36）のＳＳIIａ遺伝子に対 してＳ型アミロペクチンを持つジャポニカ品種である日本晴と金南風のＳＳIIａ遺伝子 は、アミノ酸が置換している箇所が、４カ所存在していた（図６参照）。
５）インディカ品種ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ品種金南風に形質転換したと ころ、胚乳アミロペクチン構造がＳ型からＬ型に変更し、それに伴って糊化温度も上昇 した。
即ち、本発明者ら、ＳＳIIａの４カ所のアミノ酸の相違がＳＳIIａの活性に大きな影響を与えていることを明らかにした。そこで、これらの４カ所のアミノ酸の相違がＳＳIIａの活性にどのような影響を与えるのかと言うことを検討するために、これらの４カ所のアミノ酸の置換部位をシャッフリングしたコンストラクトを作成し、それらを大腸菌に形質転換して人工的にＳＳIIａタンパク質を生産させ、それらのＳＳIIａ活性を測定した。その結果、どのアミノ酸置換が活性低下を引き起こす原因であるかが明らかにした。そして、驚くべきことに、インディカ品種のＳＳIIａの活性とジャポニカ品種ＳＳIIａの活性の中間の活性を有するＳＳIIａを創生することができることを見出した。即ち、本発明者らは、ＳＳIIａのポイントとなるアミノ酸を置換することによってＳＳIIａ活性をさまざまに制御する技術を確立することができたのである。
Therefore, the present inventors first compared the amino acid sequences of SSIIa of each rice in order to identify the amino acid sequences that cause a decrease in SSIIa activity of Japonica varieties Nipponbare and Kinnan-style. In addition, the SSIIa gene of Indica variety IR36 was transformed into Japonica variety Kinnan style. as a result,
4) In contrast to the SSIIa gene of the indica variety (Kasalath, IR36) with L-type amylopectin, the Nihonbare and Kinnan-style SSIIa gene, which is a japonica variety with S-type amylopectin, has 4 amino acid substitutions. Existed (see FIG. 6).
5) When the SSIIa gene of the indica variety IR36 was transformed into the japonica variety Kinnan style, the endosperm amylopectin structure was changed from S-type to L-type, and the gelatinization temperature increased accordingly.
That is, the present inventors have clarified that the difference in four amino acids of SSIIa has a great influence on the activity of SSIIa. Therefore, in order to examine how the difference between these four amino acids affects the activity of SSIIa, we created a construct that shuffled these four amino acid substitution sites, E. coli was transformed to artificially produce SSIIa proteins, and their SSIIa activity was measured. As a result, it was clarified which amino acid substitution causes the decrease in activity. Surprisingly, it was found that SSIIa having an activity intermediate between the activity of SSIIa of the Indica variety and the activity of Japonica variety SSIIa can be created. That is, the present inventors were able to establish a technique for variously controlling SSIIa activity by substituting an amino acid serving as a point of SSIIa.
即ち、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、より詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法に関する。
また、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性が制御されたＳＳIIａの変異体タンパク質に関する。詳細には、本発明は、カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、（１）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（２）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、かつ７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（３）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、（４）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、７８１番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、又は（５）イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）であり、７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質に関する。
さらに、本発明は、前記してきた本発明のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有するベクター、当該ＤＮＡにより形質転換された植物、及び当該形質転換植物を用いて外来性のＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンを製造する方法に関する。
That is, the present invention relates to a method for controlling the activity of SSIIa comprising replacing one or more amino acids of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids, and more specifically, rice starch synthase IIa (SSIIa). 88), 604th, 737th, and 781th, a method for controlling the activity of SSIIa, comprising replacing one or more amino acids selected from the group consisting of the other amino acids, more specifically, The present invention relates to a method for controlling the activity of SSIIa, comprising substituting one or more amino acids selected from the group consisting of 604th, 737th and 781th of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids.
The present invention also relates to a mutant protein of SSIIa in which the activity of SSIIa is controlled by substituting one or more amino acids of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids. Specifically, the present invention relates to 88th, 604th, 737th, and 781th of one rice starch synthase IIa (SSIIa) selected from the group consisting of Kasaras, IR36, Nipponbare, and Kinnankaze. The present invention relates to a mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) in which one or more amino acids selected from the group consisting of are substituted with other amino acids. More specifically, the present invention relates to (1) rice starch synthase IIa in which the 604th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is glycine (Gly) and the 737th amino acid is methionine (Met). (SSIIa) mutant protein, (2) rice starch synthase IIa (SSIIa), the 604th amino acid is glycine (Gly), the 737th amino acid is valine (Val), and the 781st amino acid is Mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) which is phenylalanine (Phe), (3) The 88th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is glutamic acid (Glu), and the 604th amino acid is serine ( Ser), rice starch synthase IIa (SSIIa) Mutant protein, (4) Rice starch synthase IIa (SSIIa), amino acid 88 is aspartic acid (Asp), amino acid 604 is serine (Ser), amino acid 737 is valine (Val) A mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) wherein the 781st amino acid is leucine (Leu), or (5) the 88th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is aspartic acid (Asp ), The amino acid at 604 is serine (Ser), the amino acid at 737 is methionine (Met), and the amino acid at 781 is phenylalanine (Phe), which is a mutation in rice starch synthase IIa (SSIIa) It relates to body proteins.
Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding a mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) of the present invention described above, a vector containing the DNA, a plant transformed with the DNA, and the transformed plant To a method for producing starch having characteristics according to the exogenous SSIIa gene.
本発明者らは、デンプンの特性や構造と、これを合成する酵素との関係を解明するために、ジャポニカイネとインディカイネのデンプンの主成分であるアミロペクチンの構造の差異は、両者のＳＳIIａ遺伝子の構造と機能の違いが原因であると考えられることから、インディカイネの１種であるカサラスと、ジャポニカイネの１種である日本晴のＳＳIIａの遺伝子をクローニングしてきた（特許文献１参照）。
そして、ジャポニカイネのＳＳIIａ遺伝子の機能が、何らかの変異によって、劣っていると考えられる。その原因としては、遺伝子の発現量が顕著に低下したか、酵素としての触媒能が低下したかのいずれかであろうと思われる。前者はプロモーターの変異によって、後者はアミノ酸置換による変異によって引き起こされる可能性が高い。
そこで、両者の遺伝子のプロモーター部分を比較したが、全配列のうちのプロモーター部分は、日本晴では１〜１，３４１ｂｐであり、カサラスでは１〜１，３３１ｂｐであった。このプロモーター部分では、カサラスには、中ほどに（７０２ｂｐ）９塩基のギャップがある程度で、両者のサイズや塩基配列の相同性はかなり高かった。このことから、プロモーターの変異に起因しているのではなく、ＳＳIIａのアミノ酸配列に起因している可能性が極めて高いと考えられた。
In order to elucidate the relationship between the characteristics and structure of starch and the enzyme that synthesizes it, the present inventors have found that the difference in the structure of amylopectin, the main component of japonica rice and indica rice starch, Since the difference in structure and function is considered to be the cause, the gene of Kasalath which is one kind of indica rice and SSIIa of Nipponbare which is one kind of japonica rice has been cloned (see Patent Document 1).
And it is thought that the function of the SSIIa gene of Japonica rice is inferior due to some mutation. It seems that the cause is either that the gene expression level is remarkably reduced or the catalytic ability as an enzyme is reduced. The former is likely to be caused by promoter mutations, and the latter by amino acid substitution mutations.
Therefore, the promoter portions of both genes were compared, and the promoter portion of all sequences was 1-1,341 bp in Nipponbare and 1-1,331 bp in Kasaras. In this promoter portion, Kasalath had a moderate (702 bp) 9 base gap to some extent, and the size and base sequence homology of both was quite high. From this, it was considered that it was very likely not due to the mutation of the promoter but to the amino acid sequence of SSIIa.
両者のＳＳIIａのアミノ酸配列を比較すると、共に８１０個のアミノ酸からなる点では同じであるが、８８番目、９９番目、６０４番目、及び７３７番目の４箇所において、アミノ酸の種類が異なっていた。これらの違いによって酵素機能の違いが生じる可能性が考えられる。
この４箇所のアミノ酸置換のうち、７３７番目のアミノ酸配列が、カサラスではＶ（バリン）のところ、日本晴ではＭ（メチオニン）となっている。スターチシンターゼのアミノ酸配列中にはいくつかの保存領域が知られているが、そのうちの１つがＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）で植物のスターチシンターゼにおいて高度に保存されていて、リージョン７（Region 7）と命名されている（Li et al., (1999）Plant Physiol. 120: 1147-1155）。イネＳＳIIａにおいて、７３７番目のアミノ酸がカサラスではＶで保存されているのに対して日本晴ではＭに変化している。この変化がＳＳIIａの機能の低下に関係している可能性があ極めて高いと考えられた。
When the amino acid sequences of both SSIIa were compared, they were the same in that they consisted of 810 amino acids, but the amino acid types were different at the four positions of 88th, 99th, 604th and 737th. These differences may cause differences in enzyme function.
Of these four amino acid substitutions, the 737th amino acid sequence is V (valine) in Kasaras and M (methionine) in Nipponbare. Several conserved regions are known in the amino acid sequence of starch synthase, one of which is VGGLRDTV (amino acid sequence 730-737), which is highly conserved in plant starch synthase. (Li et al., (1999) Plant Physiol. 120: 1147-1155). In rice SSIIa, the 737th amino acid is conserved as V in Kasaras, whereas it changes to M in Nipponbare. It is considered that this change is very likely to be related to the decrease in the function of SSIIa.
そこで、さらに他の品種についてもＳＳIIａの遺伝子のクローニングを試みた。インディカイネとしてＩＲ３６と、ジャポニカイネとして金南風のＳＳIIａの遺伝子をクローニングし、そのアミノ酸配列を検討した。その結果、カサラスとＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列は同じであったが、金南風は７３７番目のアミノ酸がバリンであるにもかかわらず、ジャポニカタイプのＬ型のデンプンを産生する。そして、金南風は７８１番目のアミノ酸がカサラス、ＩＲ３６、及び日本晴のロイシンとは異なりフェニルアラニンとなっていた。そこで、本発明者らは、ＳＳIIａの８１０個のアミノ酸のうち次の４箇所のアミノ酸に着目することにした。これらのアミノ酸の番号と各品種のアミノ酸の種類をまとめてアミノ酸の３文字表記で以下に示す。 Therefore, we attempted to clone the SSIIa gene for other varieties. The genes of IR36 for indicaine and SSIIa of Jinnan style for Japonica were cloned and their amino acid sequences were examined. As a result, although the amino acid sequences of SSIIa of Kasalath and IR36 were the same, Kinnanfu produces japonica-type L-type starch even though the 737th amino acid is valine. In contrast, in the Kinnan style, the 781st amino acid is phenylalanine, unlike Kasalas, IR36 and Nipponbare leucine. Therefore, the present inventors decided to pay attention to the following four amino acids among 810 amino acids of SSIIa. The numbers of these amino acids and the types of amino acids of each variety are collectively shown in the following three-letter code.
インディカ ジャポニカ
カサラス ＩＲ３６ 日本晴 金南風
８８番目 Ｇｌｕ(gag) Ｇｌｕ(gag) Ａｓｐ(gac) Ａｓｐ(gac)
６０４番目 Ｇｌｙ(ggc) Ｇｌｙ(ggc) Ｓｅｒ(agc) Ｓｅｒ(agc)
７３７番目 Ｖａｌ(gtg) Ｖａｌ(gtg) Ｍｅｔ(atg) Ｖａｌ(gtg)
７８１番目 Ｌｅｕ(ctc) Ｌｅｕ(ctc) Ｌｅｕ(ctc) Ｐｈｅ(ttc)
Indica japonica
Casalas IR36 Nippon Hare Kinnan Kaze
88th Glu (gag) Glu (gag) Asp (gac) Asp (gac)
604th Gly (ggc) Gly (ggc) Ser (agc) Ser (agc)
737th Val (gtg) Val (gtg) Met (atg) Val (gtg)
781st Leu (ctc) Leu (ctc) Leu (ctc) Phe (ttc)
これらの関係を図示したのが、図６Ａ（図６上段）である。図６Ａは各バーがＳＳIIａの全長のアミノ酸配列を示しており、上からカサラス、ＩＲ３６、日本晴、金南風である。カサラスの上に示す＃記号が付されている数字はメチオニン（Ｍｅｔ）を１番にしたときのアミノ酸の番号であり、金南風の下に示す＃記号が付されている数字は翻訳開始点のメチオニン（Ｍｅｔ）をコードする塩基を１番にしたときの塩基の番号を示している。アミノ酸の番号で８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のいずれか又はこれらの組合せがＳＳIIａの活性に大きな影響を与えると予想され、その部分の各アミノ酸及びそれをコードする塩基を記載している。上側のカサラスとＩＲ３６はインディカイネで、ＳＳIIａの活性がある。下側の日本晴と金南風はジャポニカイネで、ＳＳIIａの活性が無いものである。 These relationships are illustrated in FIG. 6A (upper part of FIG. 6). FIG. 6A shows the full-length amino acid sequence of SSIIa in each bar. The numbers marked with a # symbol above Kasalath are the amino acid numbers when methionine (Met) is number 1, and the numbers marked with a # symbol below the gold south wind are the translation start points. The number of the base when the base encoding methionine (Met) of No. 1 is shown is shown. Amino acid numbers 88, 604, 737, and 781 or any combination thereof are expected to have a significant effect on the activity of SSIIa, and each amino acid in that portion and the base that encodes it are listed. ing. Upper Kasalath and IR36 are indicaine and have SSIIa activity. The lower Nihonbare and Kinnankaze are japonica rices, which have no SSIIa activity.
本発明者らは、当初リージョン７（Region 7）のアミノ酸配列ＶＧＧＬＲＤＴＶ（アミノ酸配列７３０−７３７）に基づいて、７３７番目のアミノ酸であるバリンがメチオニンに変更することにより、ＳＳIIａの活性の有無が決定されると予想していた。しかし、金南風のアミノ酸配列を見ると、７３７番目のアミノ酸は、活性を有すると予想されるバリンであった。したがって、７３７番目のアミノ酸のバリンからメチオニンへの変更のみがＳＳIIａの活性を左右しているのではなく、ＳＳIIａの活性は多くのアミノ酸の組み合わせによって決定されていることがわかった。
そこで、さらに、金南風のＳＳIIａのアミノ酸配列を検討してみると、７８１番目のアミノ酸がロイシンからフェニルアラニンに変更されている。そして、８８番目と６０４番目はジャポニカイネの日本晴と同じアスパラギン酸とセリンであった。そうすれば、この８８番目と６０４番目もジャポニカとなる要因であることが予想された。しかし、７８１番目がフェニルアラニンになっている意義については、これだけのデータからは確定することができなかった。
そこで、本発明者らは、アミノ酸の番号で８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のアミノ酸の種類とＳＳIIａの活性についてさらに検討するために、これらのアミノ酸のすべての組み合わせを合成し、これらのＳＳIIａの活性を測定して、アミノ酸配列とＳＳIIａの関連性を解明することにした。
Based on the amino acid sequence VGGLRDTV (amino acid sequence 730-737) of Region 7 (Region 7), the present inventors changed the 737 amino acid valine to methionine, thereby determining the presence or absence of SSIIa activity. I was expecting it. However, looking at the amino acid sequence of Kinnan style, the 737th amino acid was valine, which is expected to have activity. Therefore, it was found that not only the change of the 737th amino acid from valine to methionine affects the activity of SSIIa, but the activity of SSIIa is determined by a combination of many amino acids.
Then, when examining the amino acid sequence of SSIIa of Kinnan style, the amino acid at position 781 was changed from leucine to phenylalanine. The 88th and 604th were aspartic acid and serine, the same as Nipponbare's Nipponbare. In that case, it was expected that the 88th and 604th would be a factor that would be japonica. However, the significance that the 781st is phenylalanine could not be determined from these data.
Therefore, the present inventors synthesized all combinations of these amino acids in order to further examine the types of amino acids of amino acids 88, 604, 737, and 781 and the activity of SSIIa, The activity of these SSIIa was measured to elucidate the relationship between the amino acid sequence and SSIIa.
イネのＳＳIIａの塩基配列を検討すると、翻訳開始点（agt）から２０４番目に制限酵素ＰｓｈＡＩのサイトがあり、１１７３番目に制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉのサイトがあり、２１６０番目に制限酵素ＢｓｉＷＩのサイトがあり、さらに２３０２番目に制限酵素ＸｈｏＩのサイトがあることがわかる（図６Ｂ参照）。ＳＳIIａをコードするＤＮＡを、これらの制限酵素で切断することにより、図６Ｂの下側に示される４つのフラグメントとすることができ、これらの各フラグメントは、それぞれ８８番、６０４番、７３７番、及び７８１番のアミノ酸をコードする部分を含有している。
そして、これらの制限酵素で切断される４種類のフラグメントを、５’領域から順にフラグメント１〜４(図６Ｂ中のFrag.1-4)と名付け、これらの各フラグメントがカサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風のＳＳIIａに出現したアミノ酸のすべての組み合わせになるようなコンストラクトを設計した（図７参照）。
Examining the base sequence of SSIIa in rice, the site of the restriction enzyme PshAI is 204th from the translation start point (agt), the site of the restriction enzyme EcoT22I is 1173th, the site of the restriction enzyme BsiWI is 2160th, Further, it can be seen that there is a site of restriction enzyme XhoI at 2302 (see FIG. 6B). By cleaving the DNA encoding SSIIa with these restriction enzymes, the four fragments shown in the lower side of FIG. 6B can be obtained, and each of these fragments is numbered 88, 604, 737, And a portion encoding the amino acid at position 781.
The four types of fragments cleaved by these restriction enzymes are named as fragments 1 to 4 (Frag. 1-4 in FIG. 6B) in order from the 5 ′ region, and these fragments are named Kasaras, IR36, Nipponbare, In addition, a construct was designed so as to be all combinations of amino acids that appeared in SSIIa of Kinnan style (see FIG. 7).
即ち、各フラグメントについて次の２種類のアミノ酸が存在するように設計した。
フラグメント１： ８８番目のアミノ酸が、Ｇｌｕ又はＡｓｐ、
フラグメント２：６０４番目のアミノ酸が、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、
フラグメント３：７３７番目のアミノ酸が、Ｖａｌ又はＭｅｔ、
フラグメント４：７８１番目のアミノ酸が、Ｌｅｕ又はＰｈｅ、
これらの全ての組み合わせは、図７に示すように１６通りとなる。図の左側は各フラグメントを１〜４の順に並べて示しており、その右側の＋や−の記号はＳＳ活性を示し、その右側の＃印の付いた番号は、各ＳＳIIａの識別番号を示している。図７では上記に示した各フラグメントの左側のアミノ酸を灰色で、右側のアミノ酸を白色で示す。ただし、フラグメント４のＰｈｅのみ灰色で斜線を付して示す。ＳＳ活性は、後記する活性試験の結果を示し、＋印は高活性であることを示し、−印は失活であることを示し、±はそれらの中間の活性を有していることを示している。＃印の付された識別番号の４桁の数字は、各桁が４個のフラグメントのそれぞれを示し、それらの各フラグメントのアミノ酸が上記した左側のアミノ酸であるときを１とし、右側のアミノ酸であるときを２として識別している。各識別番号の右側のカッコ内はイネの品種を示している。
That is, each fragment was designed to have the following two types of amino acids.
Fragment 1: The 88th amino acid is Glu or Asp,
Fragment 2: The amino acid at position 604 is Gly or Ser,
Fragment 3: The amino acid at position 737 is Val or Met,
Fragment 4: The amino acid at position 781 is Leu or Phe,
All of these combinations are 16 as shown in FIG. The left side of the figure shows the fragments arranged in the order of 1 to 4, the + and − symbols on the right side indicate SS activity, and the number with the # mark on the right side indicates the identification number of each SSIIa. Yes. In FIG. 7, the left amino acid of each fragment shown above is gray and the right amino acid is white. However, only Phe of fragment 4 is shown in gray and hatched. SS activity indicates the result of the activity test described later, + indicates high activity,-indicates inactivation, and ± indicates that they have intermediate activity. ing. The four-digit number of the identification number marked with # indicates each of the four fragments, and when the amino acid of each fragment is the left amino acid as described above, it is 1, and the right amino acid A certain time is identified as 2. The parentheses on the right side of each identification number indicate the rice variety.
各フラグメントは、インディカ種のＩＲ３６、日本晴、又は金南風のＳＳIIａ遺伝子を、制限酵素ＰｓｈＡＩ及び制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで切断して、切断された断片からフラグメント１を得ることができ、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ及び制限酵素ＢｓｉＷＩで切断して、切断された断片からフラグメント２を得ることができ、制限酵素ＢｓｉＷＩ及び制限酵素ＸｈｏＩで切断して、切断された断片からフラグメント３をえることができ、そして、フラグメント４は制限酵素ＸｈｏＩのサイトからストップコドンまでの領域と定義されるが、制限酵素ＸｈｏＩとストップコドンの下流の適当な制限酵素、例えばＳａｌＩで切断して制限酵素ＸｈｏＩのサイトからストップコドンまでの領域からなるフラグメント４を含有する断片を得ることができる。そして、得られた各フラグメントを任意にライゲーションして、必要に応じてコドンが一致するように調整して、それぞれの目的のアミノ酸となるコンストラクトを構築することができる。
例えば、図７に示す＃１１１２のコンストラクトの場合では、ＩＲ３６から得られたフラグメント１〜３と金南風から得られたフラグメント４とをライゲーションして、目的のコンストラクトを得ることができる。このようにして製造されたコンストラクトの塩基配列を配列表の配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。この配列表の配列番号７に示される塩基配列の１番目は、配列表の配列番号１の塩基配列の２０５番目の塩基に相当するものである。なお、配列番号１の２０５番目からは、ｃｇｃｃｇｃｇｃｇ・・・・・となっているが、末端に制限酵素サイトを作るために、配列番号７では、ｃｇｔｃｇｃｇｃｇ・・・・・と変更されているが、アミノ酸には変更はない。この＃１１１２のコンストラクトはフラグメント４が金南風に由来しているから、塩基の２１３６〜２１４０番目が、ｔｔｔｃｃとなっている。
同様にして製造された＃２１１２のコンストラクトの塩基配列を配列表の配列番号９に示し、そのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。この＃２１１２のコンストラクトもフラグメント４が金南風に由来するために、塩基の２１３６〜２１４０番目が、ｔｔｔｃｃとなっている。
Each fragment can be obtained by cleaving Indica species IR36, Nipponbare, or Kinnan-style SSIIa gene with restriction enzyme PshAI and restriction enzyme EcoT22I to obtain fragment 1 from the cleaved fragment. It can be cleaved with the enzyme BsiWI to obtain fragment 2 from the cleaved fragment, cleaved with the restriction enzyme BsiWI and the restriction enzyme XhoI to obtain fragment 3 from the cleaved fragment, and fragment 4 It is defined as the region from the restriction enzyme XhoI site to the stop codon, but consists of the restriction enzyme XhoI and a region from the restriction enzyme XhoI site to the stop codon after cutting with an appropriate restriction enzyme downstream of the stop codon, for example, SalI. To obtain a fragment containing fragment 4. That. Then, the obtained fragments can be arbitrarily ligated and adjusted so that the codons coincide with each other as necessary, thereby constructing constructs to be the respective target amino acids.
For example, in the case of the # 1112 construct shown in FIG. 7, fragments 1 to 3 obtained from IR 36 and fragment 4 obtained from the golden south wind can be ligated to obtain the target construct. The base sequence of the construct thus produced is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8. The first base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in this sequence listing corresponds to the 205th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. From the 205th position of SEQ ID NO: 1, cgccgcgcg is changed to cgtccgcgcg ... in order to create a restriction enzyme site at the end. There is no change in amino acids. In this # 1112 construct, since fragment 4 is derived from the gold south wind, the 2136th to 2140th bases are ttttcc.
The base sequence of the # 2112 construct produced in the same manner is shown in SEQ ID NO: 9 of the Sequence Listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10. In this # 2112 construct, since fragment 4 is derived from the gold south wind, the 2136th to 2140th bases are ttttcc.
このようにして１６通りのコンストラクトを製造し、それらの両末端に作成したＰｓｈＡＩおよびＳａｌＩサイトを用いて、内部配列を大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ４３ｂ（Novagen）のタグタンパク質の下流にクローニングした。このベクターは、ＩＰＴＧの存在下で下流側に挿入された遺伝子が発現できるように設計されている。インサートの入ったクローンを大腸菌発現用宿主であるＡＤ４９４ ｐＬｙｓＳ（Novagen）に形質転換し、それぞれのインサートを含むコロニーを単離した。
得られた形質転換大腸菌を培養して、培養液からサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的タンパク質の発現を確認した。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、左から日本晴のＤＮＡを導入した場合、ＩＲ３６のＤＮＡを導入した場合、右側はコントロールを示す。コントロールは、ベクターのみを挿入した大腸菌を用いた。各場合は１ｍＭのＩＰＴＧ（大腸菌にインサートした遺伝子を発現させるための試薬）を添加した場合を＋記号でそれぞれの左側に示し、添加しない場合を−印でそれぞれの右側に示す。それぞれの場合についてサンプルのアプライ量が１０μＬと５μＬの場合を示している。日本晴とＩＲ３６における矢印（原図では赤色）は、ＩＰＴＧの添加により発現した目的のタンパク質を示している。ＳＳIIａの分子量は８８．９ｋＤａであるが、ここで発現させたタンパク質はタグが付着しているために約１６０ｋＤａのところにバンドが出現している。コントロールにおける矢印（原図では赤色）はタグタンパク質（Ｎｕｓタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ）を示している。
In this way, 16 kinds of constructs were produced, and the internal sequence was cloned downstream of the tag protein of pET43b (Novagen), an E. coli expression vector, using the PshAI and SalI sites prepared at both ends thereof. This vector is designed so that a gene inserted downstream can be expressed in the presence of IPTG. A clone containing the insert was transformed into AD494 pLysS (Novagen), which is an E. coli expression host, and a colony containing each insert was isolated.
The obtained transformed Escherichia coli was cultured, sampled from the culture, and the expression of the target protein was confirmed by SDS-PAGE. The results are shown in FIG. The SDS-PAGE in FIG. 8 shows a control on the right side when the DNA of Nipponbare is introduced from the left, and when the DNA of IR36 is introduced. As a control, E. coli into which only the vector was inserted was used. In each case, the case where 1 mM IPTG (reagent for expressing the gene inserted into E. coli) is added is shown on the left side with a + symbol, and the case where it is not added is shown on the right side with a-symbol. In each case, the sample application amounts are 10 μL and 5 μL. The arrows in Nipponbare and IR36 (red in the original map) indicate the target protein expressed by the addition of IPTG. Although the molecular weight of SSIIa is 88.9 kDa, a band appears at about 160 kDa because the protein expressed here has a tag attached. An arrow (red in the original drawing) in the control indicates a tag protein (Nus tag, His tag, S tag).
目的のタンパク質が発現している大腸菌のけん濁液から後述する試験法によりＳＳ活性を測定した。大腸菌に人工的に発現させたタンパク質は、使用した発現ベクターのｐＥＴ４３ｂの構造上、ＳＳＩＩａタンパク質の上流域にＮｕｓ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｓ−Ｔａｇが付着している。これらが付着したままＳＳ活性の測定を試みた。ＳＳ活性測定法としては、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法により定性的な活性を確認し、試験管内で行うＡＤＰ遊離法により定量化を行った。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法では、ヨードヨードカリ液で染色した。ＳＳIIａ活性が正常であると予想されるＩＲ３６では、ゲル上に茶色い帯が生じ、この方法でＳＳＩＩａ活性によって得られたポリグルカンを検出できることを確認した。一方、ＳＳＩＩａ遺伝子を含まないベクターを形質転換したもの（Control）では、ＩＲ３６で見られた茶色い帯が得られなかった（図９参照）。したがって、この方法でＳＳIIａ活性を測定できることが確認できた。
試験管内で行うＡＤＰ遊離法では、ＳＳ活性は、鎖長を伸長したときに基質ＡＤＰ−グルコースからＡＤＰが遊離するため、遊離したＡＤＰを定量することで、ＳＳ活性を測定することができる(Nishi et al., 2001 Plant Physiol., 127; 459-472)。
SS activity was measured from a suspension of E. coli expressing the target protein by the test method described below. The protein artificially expressed in E. coli has Nus-Tag, His-Tag, and S-Tag attached to the upstream region of the SSIIa protein due to the structure of pET43b of the expression vector used. The SS activity was measured with these attached. As the SS activity measurement method, qualitative activity was confirmed by a Native-PAGE / SS activity staining method, and quantification was performed by an ADP release method performed in a test tube.
In the Native-PAGE / SS activity staining method, staining was carried out with an iodoiodoli solution. IR36, which is expected to have normal SSIIa activity, produced a brown band on the gel, confirming that polyglucan obtained by SSIIa activity could be detected by this method. On the other hand, in the case of transforming a vector not containing the SSIIa gene (Control), the brown band seen with IR36 was not obtained (see FIG. 9). Therefore, it was confirmed that SSIIa activity can be measured by this method.
In the ADP release method performed in a test tube, the SS activity is measured by quantifying the released ADP because the ADP is released from the substrate ADP-glucose when the chain length is extended (Nishi et al., 2001 Plant Physiol., 127; 459-472).
結果を図９にまとめて図面に代わる写真で示す。図９の上段はＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法の結果を示し、図９の下段はＡＤＰ遊離法の結果をグラフ化して示したものである。図９のＡ〜Ｅは、それぞれ実験を行った日別に示されている。Ａ〜Ｃで１６通りの全てが実験されており、Ａの左側末端はベクターのみを導入した大腸菌を用いたものをコントロールとして示している。図９のＤは、中間型の＃２１１２及び＃１１１２、並びにやや中間型に近い＃１１２２と対照としての＃１１１１（ＩＲ３６）を行ったものである。Ｅは高活性型の＃２２１１、＃２１１１、＃１２１１、及び＃１１１１（ＩＲ３６）を行ったものである。
ＡＤＰ遊離法では、大腸菌に内在するグリコーゲンシンターゼ（ＧＳ）による活性が図９におけるグラフで約０．１程度現れる。したがって、図９の下段のグラフでＳＳ相対活性が０．１程度のものは導入したＳＳIIａの活性ではなく、宿主の大腸菌の内在性のＧＳの値だけが示されていることになる。
図９の上段のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法では、ＳＳ活性が存在すれば茶色のバンドとして染色される。その濃さによりＳＳ活性の強弱を判定することができる。なお、大腸菌による発現では、イネのような明瞭なバンドとはならなくて、図９に示されるようなテーリングが生じる。
これらの結果から、インディカイネのＩＲ３６のような高い活性を示すもの（図７では＋印で示される高活性型）を白色に、コントロールと同程度の活性しか示さないもの（図７では−印で示される失活型）を黒色に、それらの中間の活性を示すもの（図７では±印で示される中間型）を灰色にしたグラフで示している。
The results are summarized in FIG. 9 and shown by a photograph replacing the drawing. The upper part of FIG. 9 shows the results of the Native-PAGE / SS activity staining method, and the lower part of FIG. 9 is a graph showing the results of the ADP release method. 9A to 9E are shown for each day of the experiment. A total of 16 types of A to C have been tested, and the left end of A shows a control using E. coli into which only the vector was introduced. D in FIG. 9 is obtained by performing # 1111 (IR36) as a contrast with # 2112 and # 1112 of the intermediate type, and # 1122 slightly close to the intermediate type. E is obtained by performing highly active types # 2211, # 2111, # 1211, and # 1111 (IR36).
In the ADP release method, the activity of glycogen synthase (GS) inherent in Escherichia coli appears about 0.1 in the graph of FIG. Therefore, in the lower graph of FIG. 9, the SS relative activity of about 0.1 indicates not the introduced SSIIa activity but only the endogenous GS value of the host E. coli.
In the Native-PAGE / SS activity staining method in the upper part of FIG. 9, if SS activity is present, it is stained as a brown band. The strength of SS activity can be determined by the intensity. In addition, expression by E. coli does not form a clear band like rice, but tailing as shown in FIG. 9 occurs.
From these results, those showing high activity such as IR36 of Indica rice (highly active type indicated by + sign in FIG. 7) are white, and those showing only the same level of activity as control (-sign in FIG. 7). The inactive type shown in FIG. 7 is shown in black, and those showing intermediate activities (intermediate type shown by ± marks in FIG. 7) are shown in gray.
以上の結果をまとめると次のようになる（図７参照）。
（１）７３７番目と７８１番目のアミノ酸が正常（それぞれＶａｌとＬｅｕ）であれば、８８番目と６０４番目の変異の有無によらず、ＳＳIIａは高活性型（タイプ１）となる。
（２）７３７番目のアミノ酸がＶａｌがＭｅｔに変異した場合、７８１番目のアミノ酸の変異の有無にかかわらず、ＳＳIIａは失活型（タイプ２）となる。
（３）７８１番目のアミノ酸がＰｈｅに変異した場合、６０４番目のアミノ酸が正常（Ｇｌｙ）であれば、ＳＳIIａの活性は、若干の活性を有し前記タイプ１とタイプ２の中間の活性を有する中間型（タイプ３）となる。
（４）７８１番目のアミノ酸がＰｈｅに変異した場合、６０４番目のアミノ酸が変異（Ｓｅｒ）していれば、ＳＳIIａは失活型（タイプ２）となる。
即ち、７８１番目のアミノ酸が変異した場合は、６０４番目のアミノ酸の変異の有無に影響される。言い換えると、７８１番目のアミノ酸と６０４番目のアミノ酸の間には相互作用が存在し、７８１番目のアミノ酸が変異しても、６０４番目のアミノ酸に変異がなければ（インディカ型であれば）、ＳＳIIａ活性はある程度レスキューされる。このような相互作用の例は今まで知られておらず、極めて興味深いものであり、本発明により初めてあきらかにされたものである。
The above results are summarized as follows (see FIG. 7).
(1) If the 737th and 781st amino acids are normal (Val and Leu, respectively), SSIIa becomes highly active (type 1) regardless of the presence or absence of the 88th and 604th mutations.
(2) When Val at the 737th amino acid is mutated to Met, SSIIa is inactivated (type 2) regardless of whether the 781st amino acid is mutated or not.
(3) When the amino acid at 781 is mutated to Phe, if the amino acid at 604 is normal (Gly), the activity of SSIIa has a slight activity and an intermediate activity between type 1 and type 2 Intermediate type (type 3).
(4) When the 781st amino acid is mutated to Phe, SSIIa is inactivated (type 2) if the 604th amino acid is mutated (Ser).
That is, when the 781st amino acid is mutated, it is influenced by whether or not the 604th amino acid is mutated. In other words, there is an interaction between the 781st amino acid and the 604th amino acid. Even if the 781st amino acid is mutated, if there is no mutation in the 604th amino acid (if it is an Indica type), SSIIa Activity is rescued to some extent. Examples of such interactions have not been known so far and are very interesting and have been revealed for the first time by the present invention.
以上の結果を総合すると、ＳＳIIａの活性に重要なサイトは一カ所ではなく、しかも複数の箇所が優先順位をもっていることが判明した。即ち、最もＳＳIIａ活性に必須な箇所は７３７番目のアミノ酸のバリン（Val）であり、ここがメチオニン（Met）に変異すれば例外なく活性が低下する。第２に重要な変異箇所は７８１番目のロイシン（Leu）である。７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Phe）に変異するとＳＳIIａ活性に影響が出るが、６０４番目のアミノ酸によって活性低下の度合いが異なる。６０４番目のアミノ酸がセリン（Ser）（変異型）の場合には完全に失活するが、グリシン（Gly）（正常型）の場合には、中間型程度の活性を示すようになる。また、８８番目の変異サイトは重要ではないことが明らかになった。
以上、本発明によって、人工的に作成したＳＳIIａの遺伝子にさまざまな性質を付与でき、こうした遺伝子を植物に導入するなどによって、形質転換植物に新規デンプンを作らせる技術が確立された。特に、７８１番目のアミノ酸と６０４番目のアミノ酸の相互作用によって、自然には存在しない中間型の活性を有する人工ＳＳIIａ遺伝子は、ジャポニカ型とインディカ型の中間型の新規デンプンを作成する上で利用価値が高い。
From the above results, it was found that the site important for the activity of SSIIa is not one place, and that a plurality of places have priority. That is, the most essential part for SSIIa activity is the 737th amino acid valine (Val), and if this is mutated to methionine (Met), the activity decreases without exception. The second important mutation site is the 781st leucine (Leu). When the 781st amino acid is mutated to phenylalanine (Phe), the SSIIa activity is affected, but the degree of decrease in activity differs depending on the 604th amino acid. When the 604th amino acid is serine (Ser) (mutant type), it is completely inactivated, but when it is glycine (Gly) (normal type), it shows an activity of about the intermediate type. It was also revealed that the 88th mutation site is not important.
As described above, according to the present invention, various properties can be imparted to the artificially produced SSIIa gene, and a technique for causing a transformed plant to produce a new starch by introducing such a gene into the plant has been established. In particular, an artificial SSIIa gene having an intermediate type activity that does not exist naturally by the interaction between the 781st amino acid and the 604th amino acid is useful for producing a new starch of the intermediate type of Japonica type and Indica type. Is expensive.
以上のように、本発明は、イネのデンプンにおける味覚や糊化温度などの特性の相違が生じる原因となっているイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性が変化する原因をアミノ酸配列に基づいて解明することができた。即ち、スターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の４種、より詳細には３種のアミノ酸がＳＳIIａの活性を決定するものであることを本発明が明らかにした。さらに、各種のＳＳIIａの変異体タンパク質の活性を試験した結果、ジャポニカイネ（失活型ＳＳIIａ（タイプ２））やインディカイネ（高活性型（タイプ１））とは異なる中間型の活性を有するＳＳIIａ（タイプ３）が存在することが明らかになった。この型のＳＳIIａは、天然では未だ確認されておらず、人工的な変異体タンパク質であり、このＳＳIIａによりジャポニカイネのデンプンとインディカイネのデンプンの中間の特性（例えば、糊化温度など）を有するデンプンが産生されるものと期待され、食糧としてだけでなく、産業用デンプンとしても新種のデンプンとして期待される。 As described above, the present invention is based on the amino acid sequence to determine the cause of the change in the activity of rice starch synthase IIa (SSIIa) that causes differences in characteristics such as taste and gelatinization temperature in rice starch. I was able to elucidate. That is, the present invention revealed that four types of starch synthase IIa (SSIIa), more specifically three types of amino acids, determine SSIIa activity. Furthermore, as a result of testing the activity of various SSIIa mutant proteins, SSIIa having an intermediate type activity different from Japonica rice (inactivated SSIIa (type 2)) and indicaine (highly active type (type 1)). It became clear that (Type 3) exists. This type of SSIIa has not yet been confirmed in nature, and is an artificial mutant protein, and has characteristics (for example, gelatinization temperature, etc.) intermediate between those of japonica rice and indica rice by SSIIa. It is expected that starch will be produced, and it is expected as a new kind of starch not only as food but also as industrial starch.
したがって、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法を提供するものであり、この方法は天然のＳＳIIａのいずれかのアミノ酸を他のアミノ酸に変更してＳＳIIａの活性を変化させるものであり、ＳＳIIａの活性が変化するのであればアミノ酸の種類、数は特に限定はない。例えば、配列表の配列番号８又は１０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のように、天然のＳＳIIａの６９番目のアミノ酸から８１０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸配列からなるものであってもよい。
ここで、他のアミノ酸に置換するとは、１：１で弛緩する場合に限定されるものではなく、１：２以上の付加的置換や、１：０のような削除的置換を包含している。より詳細には、本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法、さらに詳細には、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性を制御する方法を提供するものである。この方法における「他のアミノ酸に置換」するとは、前記したような付加的置換及び削除的置換を包含するものである。
Accordingly, the present invention provides a method for controlling the activity of SSIIa, comprising substituting one or more amino acids of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids. Any amino acid of SSIIa is changed to another amino acid to change the activity of SSIIa, and the type and number of amino acids are not particularly limited as long as the activity of SSIIa is changed. For example, like the protein which has an amino acid sequence shown by sequence number 8 or 10 of a sequence table, it may consist of an amino acid sequence corresponding to the 810th amino acid from the 69th amino acid of natural SSIIa.
Here, substitution with another amino acid is not limited to 1: 1 relaxation, but includes additional substitution of 1: 2 or more and deletion substitution such as 1: 0. . More specifically, the present invention substitutes one or more amino acids selected from the group consisting of 88th, 604th, 737th, and 781th of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids. More specifically, one or more amino acids selected from the group consisting of the 604th, 737th, and 781st positions of rice starch synthase IIa (SSIIa), The present invention provides a method for controlling the activity of SSIIa comprising substitution with an amino acid. “Substitution with other amino acids” in this method includes the additional substitution and the deletion substitution as described above.
本発明における置換するアミノ酸としては、天然型のα−アミノ酸が好ましいがこれに限定されるものではなく、デンプンを産生する植物において発現可能であり、ＳＳIIａの活性を変更することができるものであれば任意のアミノ酸を使用することができる。
本発明の好ましい置換の態様としては、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸を、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）のいずれかとする方法、６０４番目のアミノ酸を、グリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）のいずれかとする方法、７３７番目のアミノ酸を、バリン（Ｖａｌ）又はメチオニン（Ｍｅｔ）のいずれかとする方法、７８１番目のアミノ酸を、ロイシン（Ｌｕｅ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のいずれかとする方法、及びこれらの任意の２種以上の組み合わせからなる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
例えば、ＳＳIIａの７３７番目のアミノ酸を、メチオニン（Ｍｅｔ）にしてスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の活性を失活型とする方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
The amino acid to be substituted in the present invention is preferably a natural α-amino acid, but is not limited thereto, and can be expressed in a plant producing starch and can change the activity of SSIIa. Any amino acid can be used.
As a preferred substitution mode of the present invention, a method in which the 88th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is either aspartic acid (Asp) or glutamic acid (Glu), and the 604th amino acid is glycine (Gly). ) Or serine (Ser), 737th amino acid as valine (Val) or methionine (Met), 781st amino acid as leucine (Lue) or phenylalanine (Phe) Examples of such methods include, but are not limited to, a method comprising a combination of any two or more of these methods.
For example, a method in which the activity of starch synthase IIa (SSIIa) is inactivated by changing the amino acid at 737 of SSIIa to methionine (Met) is not limited thereto.
本発明の方法におけるアミノ酸を変更する手段としては、特に制限はないが、ＳＳIIａをコードする遺伝子の塩基の変更によって行う方法が例示される。ここで、塩基を変更するとは、存在している塩基を他の塩基に１：１で置換する方法、１：２以上、好ましくはコドンを形成できるように３塩基単位での付加的置換をする方法、及び当該塩基の属するコドンを削除する削除的置換をする方法が包含されている。
このような塩基を置換する手法としては、特に制限はなく、目的の塩基配列を導入することができる各種の手法を採用することができる。例えば、ポイントミューテーションのような変異によってもよく、また置換使用とする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作成し、適当な制限酵素部位でＳＳIIａの遺伝子を切断した後、当該オリゴヌクレオチドを導入する方法によることもできる。
The means for changing the amino acid in the method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method performed by changing the base of the gene encoding SSIIa. Here, changing the base is a method of substituting the existing base with another base 1: 1, or more, 1: 2 or more, preferably additional substitution in units of 3 bases so that a codon can be formed. Methods and methods of deletion substitution that deletes the codon to which the base belongs are included.
There is no restriction | limiting in particular as a method of substituting such a base, The various method which can introduce | transduce the target base sequence is employable. For example, a mutation such as point mutation may be used, or an oligonucleotide having a base sequence to be used for substitution is prepared, and after the SSIIa gene is cleaved at an appropriate restriction enzyme site, the oligonucleotide is introduced. You can also.
本発明は、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）のアミノ酸の１種以上を、他のアミノ酸に置換することからなるＳＳIIａの活性が制御されたＳＳIIａの変異体タンパク質、より詳細には、本発明は、カサラス、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質を提供する。カサラスとＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列は全く同じであるから、結局、ＩＲ３６、日本晴、及び金南風の３品種からなる群から選ばれた１種のイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）、即ち公知になっているイネのＳＳIIａのアミノ酸配列に基づいて、当該ＳＳIIａ類のいずれかの、８８番目、６０４番目、７３７番目、及び７８１番目からなる群から選ばれたアミノ酸の１種以上が、他のアミノ酸に置換されてなるイネのＳＳIIａの新規なアミノ酸配列を有する変異体タンパク質を提供するものである。ここで、他のアミノ酸に置換されてなるとは、前記した置換の態様と同じである。
本発明のＳＳIIａの変異体タンパク質の好ましい例としては、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の６０４番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、かつ７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ）であり、７８１番目のアミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の８８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ）であり、６０４番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、７３７番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）であり、７８１番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である、イネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質、及びこれらの任意の２種以上の組み合わせからなる変異体タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
The present invention relates to a mutant protein of SSIIa in which the activity of SSIIa is controlled by substituting one or more amino acids of rice starch synthase IIa (SSIIa) with other amino acids. Selected from the group consisting of 88th, 604th, 737th and 781th of one kind of rice starch synthase IIa (SSIIa) selected from the group consisting of Kasaras, IR36, Nipponbare, and Kinnan A mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) in which one or more amino acids are substituted with other amino acids is provided. Since the SSIIa amino acid sequences of Casalas and IR36 are exactly the same, after all, one rice starch synthase IIa (SSIIa) selected from the group consisting of three varieties of IR36, Nipponbare, and Kinnan-style, that is, publicly known Based on the amino acid sequence of SSIIa in rice, one or more amino acids selected from the group consisting of 88th, 604th, 737th, and 781st of any of the SSIIa are other amino acids The present invention provides a mutant protein having a novel amino acid sequence of SSIIa of rice substituted with Here, being substituted with another amino acid is the same as the above-described substitution mode.
Preferred examples of the SSIIa mutant protein of the present invention include rice starch in which the 604th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is glycine (Gly) and the 737th amino acid is methionine (Met). Synthase IIa (SSIIa) mutant protein, rice starch synthase IIa (SSIIa) 604th amino acid is glycine (Gly), 737th amino acid is valine (Val), and 781st amino acid is phenylalanine (Phe) rice starch synthase IIa (SSIIa) mutant protein, rice starch synthase IIa (SSIIa) 88th amino acid is glutamic acid (Glu) and 604th amino acid is serine (Ser) Rice starch synthase II (SSIIa) mutant protein, rice starch synthase IIa (SSIIa), amino acid 88 is aspartic acid (Asp), amino acid 604 is serine (Ser), amino acid 737 is valine (Val And a mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) in which the 781st amino acid is leucine (Leu), and the 88th amino acid of rice starch synthase IIa (SSIIa) is aspartic acid (Asp) A mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa), wherein the amino acid at 604 is serine (Ser), the amino acid at 737 is methionine (Met), and the amino acid at 781 is phenylalanine (Phe), And a combination of any two or more of these Ranaru mutant proteins, and the like, but not limited thereto.
本発明は前記してきたイネのスターチシンターゼIIａ（ＳＳIIａ）の変異体タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは発現可能な形態であってもよいし、そうでなくても、前記した本発明のＳＳIIａの変異体タンパク質の全長又は変異部分を含む部分長をコードするものであってもよい。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、２本鎖であってもよく、前記した本発明のＳＳIIａのの変異体を発現させるためのものだけでなく、これらのＤＮＡの存在を特異的に検出・同定または定量するためのプローブや、ＰＣＲなどの増幅用のプライマーとして使用可能な部分長のものであってもよい。
さらに、本発明のＤＮＡをプラスミドなどのベクターに組み込んだものであってもよい。したがって、本発明は本発明のＤＮＡを含有するベクターを提供するものである。本発明のベクターは発現可能なものであってもよいが、かならずしも発現可能である必要はない。使用されるベクターとしては、プラスミドやウイルスなどが挙げられる。
このようなベクターには必要に応じて、各種のプロモーター、レポーター遺伝子、タグ、耐性遺伝子などを含有させることもできる。
The present invention provides a DNA encoding the mutant protein of rice starch synthase IIa (SSIIa) described above. The DNA of the present invention may be in an expressible form, or may not encode the full length of the SSIIa mutant protein of the present invention described above or a partial length including the mutant portion. . The DNA of the present invention may be single-stranded or double-stranded, and is not only for expressing the above-described mutant of SSIIa of the present invention, but also specifically indicates the presence of these DNAs. The probe may be of a partial length that can be used as a probe for detection / identification or quantification, or a primer for amplification such as PCR.
Furthermore, the DNA of the present invention may be incorporated into a vector such as a plasmid. Therefore, the present invention provides a vector containing the DNA of the present invention. The vector of the present invention may be capable of expression, but is not necessarily capable of expression. Examples of the vector used include plasmids and viruses.
Such vectors can contain various promoters, reporter genes, tags, resistance genes, and the like as necessary.
前記した本発明のＤＮＡを用いて、各種の生物、例えば、大腸菌のような微生物、イネなどの高等植物を形質転換することも可能である。形質転換する手法としては、公知の各種の手法、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などの手法を使用することもできる。
したがって、本発明はこのような手法により、形質転換された植物を提供するものである。本発明における宿主となる植物としては、デンプンを産生することができる植物、好ましくは高等植物であれば特に制限はないが、使用する遺伝子がイネ由来のものであることから、イネ科植物が好ましいがこれに限定されるものではない。
宿主植物は、内在性のＳＳIIａの遺伝子を有したままでもよいが、内在性のＳＳIIａの遺伝子を欠損した変異体であるのが好ましい。内在性の遺伝子を欠損させる方法としてはジーンターゲンッティング法などによってもよいが、発現を抑制できればよいと意味でＲＮＡｉ法なども使用することが可能である。
It is also possible to transform various organisms, for example, microorganisms such as Escherichia coli and higher plants such as rice using the above-described DNA of the present invention. As a technique for transformation, various known techniques such as electroporation method, particle gun method, and Agrobacterium method can be used.
Therefore, the present invention provides a plant transformed by such a technique. The plant serving as a host in the present invention is not particularly limited as long as it is a plant capable of producing starch, preferably a higher plant, but a grass plant is preferable because the gene used is derived from rice. However, it is not limited to this.
The host plant may remain with the endogenous SSIIa gene, but is preferably a mutant lacking the endogenous SSIIa gene. Although a gene targeting method or the like may be used as a method for deleting an endogenous gene, an RNAi method or the like can be used in the sense that expression can be suppressed.
また、本発明は、前記した形質転換植物を用いて外来性のＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンを製造する方法を提供する。本発明のこの方法におけるＳＳIIａの遺伝子に応じた特性を有するデンプンとは、元の宿主となる植物が産生するデンプンとは異なるアミロペクチンのクラスター構造、特にグルコースの鎖長の分布が異なるデンプンのことである。
デンプンの味覚や糊化温度などの特性の多くは、このクラスター構造に依存しており、本発明のこの方法により製造されるデンプンは、デンプン合成におけるＳＳIIａの活性が制御されているために、その制御下でのクラスター構造を有するものとなり、使用目的に応じた特性を有するデンプンの製造が可能となる。
したがって、本発明は、食糧用としてのデンプンだけでなく、各種の特性を有する産業用デンプンを産生させるための基本技術を提供するものである。
The present invention also provides a method for producing starch having characteristics according to the exogenous SSIIa gene using the above-described transformed plant. The starch having the characteristics according to the SSIIa gene in this method of the present invention is a starch having a different cluster structure of amylopectin from the starch produced by the original host plant, in particular, the distribution of glucose chain length. is there.
Many of the properties of starch, such as taste and gelatinization temperature, depend on this cluster structure, and starch produced by this method of the present invention has its controlled activity of SSIIa in starch synthesis. It will have a cluster structure under control, and it will be possible to produce starch having properties according to the intended use.
Therefore, the present invention provides a basic technique for producing not only starch for food use but also industrial starch having various characteristics.
本発明は、植物におけるデンプンの合成、特にイネにおけるデンプンの合成において、その味覚や糊化温度などの特性を決定する重要な因子としてのＳＳIIａの活性を調節できることを明らかにするものであり、本発明は、目的の特性を有するデンプンを得るための手法として遺伝子の操作により可能であることを具体的に示すものである。また、本発明は、イネのデンプンとしてインディカイネの作るデンプンやジャポニカイネの作るデンプンの他に、これらの中間型の特性を有するデンプンを製造させることを可能とする中間型の活性を有するＳＳIIａの存在を初めて明らかにしたものである。
ＳＳIIａなどの酵素の活性低下に関わるアミノ酸置換は、同時に活性に重要な部位であることは言うまでもない。これらの部位をさまざまなアミノ酸に変更することで、酵素活性をさまざまなレベルに変えることができる。即ち、ＳＳIIａの活性を増強させることができたなら、既存のインディカ米よりも高い糊化温度をもつデンプンを開発することができることになる。また、インディカ型の活性型ＳＳIIａと、ジャポニカ型の不活性型ＳＳIIａの中間の活性をもつ人工ＳＳIIａ遺伝子をジャポニカ型イネに導入することによって新規な特性を有するデンプンを作成することができる。このように、本発明によるＳＳIIａの活性の制御により、目的に応じた特性を有するデンプンの製造が可能となる。
また、植物、特にイネにおける他のＳＳのアイソザイム、特にＳＳIIａと相同性の高いＳＳIIｂ、ＳＳIIｃの機能は現在まで全く未解明であり、本発明によるＳＳIIａの活性部位と比較することでこれらの機能解明の手がかりになるものである。
The present invention clarifies that the activity of SSIIa can be regulated as an important factor for determining characteristics such as taste and gelatinization temperature in starch synthesis in plants, particularly starch synthesis in rice. The invention specifically shows that it is possible by genetic manipulation as a technique for obtaining starch having the desired properties. In addition to the starch produced by Indica rice and the starch produced by Japonica rice as the starch of rice, the present invention is capable of producing a starch having these intermediate-type properties. This is the first time that existence has been clarified.
It goes without saying that amino acid substitutions related to activity reduction of enzymes such as SSIIa are simultaneously important sites for activity. By changing these sites to different amino acids, enzyme activity can be changed to different levels. That is, if the activity of SSIIa can be enhanced, starch having a gelatinization temperature higher than that of existing indica rice can be developed. Furthermore, starch having novel characteristics can be prepared by introducing an artificial SSIIa gene having an intermediate activity between indica type active SSIIa and japonica type inactive SSIIa into japonica rice. Thus, the control of the activity of SSIIa according to the present invention makes it possible to produce starch having characteristics according to the purpose.
In addition, the functions of other SS isozymes in plants, particularly rice, particularly SSIIb and SSIIc, which are highly homologous to SSIIa, have not been elucidated until now, and their functions are elucidated by comparing with the active site of SSIIa according to the present invention. It is a clue of
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
イネの３品種からのコンストラクトの作成
インディカ品種であるＩＲ３６、ジャポニカ品種である日本晴、金南風の３品種のそれぞれに由来するＳＳIIａのｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、これを鋳型に、ＳＳＩＩａのＮ末端と予想される位置より２残基上流に制限酵素ＰｓｈＡＩサイト含むようにプライマーを設計し、これと終始コドンとＳａｌＩサイトを含むプライマーを用いてＰＣＲを行った。それぞれのプライマーの配列は以下の通りである。
フォーワードプライマー： 5’-ATGAATTCATAGACAAACGTCGCGCGGATGATATCTAGTCG-3’
リバースプライマー ： 5’-CTCTTCTACCGCAGGAATAGGGGAAGGGGGAGAACG-3’
得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターにクローニングし、それぞれ３品種のコンストラクトを作成した。
Construction of constructs from three rice varieties cDNA was prepared from mRNA of SSIIa derived from each of the three varieties of Indica varieties IR36, Japonica varieties Nipponbare, and Kinnan-style. A primer was designed so as to contain a restriction enzyme PshAI site 2 residues upstream from the predicted position, and PCR was performed using this primer and a primer containing a stop codon and a SalI site. The sequence of each primer is as follows.
Forward primer: 5'-ATGAATTCATAGACAAACGTCGCGCGCGGATGATATCTAGTCG-3 '
Reverse primer: 5'-CTCTTCTACCGCAGGAATAGGGGAAGGGGGAGAACG-3 '
The obtained PCR product was cloned into the pGEM-T easy vector to construct 3 varieties of constructs.
シャッフリングコンストラクトの作成
日本晴と金南風のＳＳＩＩａ遺伝子は、インディカ種のカサラスやＩＲ３６の遺伝子に比べてアミノ酸置換を生じる変異がそれぞれ３カ所、即ち日本晴では、アミノ酸の８８番目、６０４番目、及び７３７番目であり、金南風では８８番目、６０４番目、及び７８１番目に変異が存在し、このうち２カ所が共通した変異であった（図６Ａ参照）。したがって、これらの変異の箇所を合わせると合計４カ所（塩基配列で、２６４番目、 １８１０番目、２２０９番目、及び２３４１番目）にアミノ酸の置換が生じる変異があり、これらの箇所をそれぞれ独立に組み換えることができるように、これらの箇所をそれぞれ１箇所づつ含むフラグメント化するために、制限酵素部位として、塩基配列で２０４番目のＰｓｈＡＩ、１１７３番目のＥｃｏＴ２２Ｉ、２１６０番目のＢｓｉＷＩ、及び２３０２番目のＸｈｏＩを選んだ（図６Ａ参照）。
これらの制限酵素で切断されて形成される４種類の断片を、５’領域から順にフラグメント１〜４と名付け、これらがすべての組み合わせになるようなコンストラクトを設計した（図７参照）。
これらのコンストラクトの製造方法を図に示す＃１２２２を例として簡単に説明する。まず、ＩＲ３６のＳＳIIａ遺伝子を制限酵素ＰｓｈＡＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで切断して、アガロースゲル電気泳動により分離して切り出して抽出してフラグメント１とした。同様に、日本晴れのＳＳIIａ遺伝子をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢｓｉＷＩで切断して抽出してフラグメント２とし、また、これをＢｓｉＷＩ及びＸｈｏＩで切断して抽出してフラグメント３とした。さらに、金南風のＳＳIIａ遺伝子をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで切断して抽出してフラグメント４を含有する断片とした。これらをライゲーションして、目的の＃１２２２のコンストラクトを製造した。
Creation of a shuffling construct Nipponbare and Kinnan-style SSIIa genes have three mutations that cause amino acid substitutions compared to the Indica casalas and IR36 genes, respectively, that is, the 88th, 604th, and 737th amino acids in Nipponbare. In the Kinnan style, there were mutations at the 88th, 604th, and 781st, and two of these were common mutations (see FIG. 6A). Therefore, when these mutation sites are combined, there are mutations in which amino acid substitution occurs in a total of 4 sites (base sequence: 264th, 1810th, 2209th, and 2341th), and these sites are recombined independently. As a restriction enzyme site, the 204th PshAI, the 1173th EcoT22I, the 2160th BsiWI, and the 2302th XhoI are used as restriction enzyme sites in order to fragment each of these sites. Selected (see FIG. 6A).
Four types of fragments formed by cleavage with these restriction enzymes were named as fragments 1 to 4 in order from the 5 ′ region, and a construct was designed so that these were all combinations (see FIG. 7).
The manufacturing method of these constructs will be briefly described by taking # 1222 shown in the figure as an example. First, the SSIIa gene of IR36 was cleaved with restriction enzymes PshAI and EcoT22I, separated by agarose gel electrophoresis, cut out and extracted to obtain fragment 1. Similarly, the SSIIa gene in Japan was cleaved with EcoT22I and BsiWI and extracted into fragment 2, and this was cleaved with BsiWI and XhoI and extracted into fragment 3. Furthermore, the gold-south-style SSIIa gene was cut with XhoI and SalI and extracted to obtain a fragment containing fragment 4. These were ligated to produce the desired # 1222 construct.
形質転換大腸菌の作成
実施例１及び実施例２で作成したコンストラクトのＰｓｈＡＩおよびＳａｌＩサイトを用いて、これらのコンストラクトを大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ４３ｂ（Novagen）のタグタンパク質の下流にそれぞれクローニングした。インサートの入ったクローンを大腸菌発現用宿主であるＡＤ４９４ ｐＬｙｓＳ（Novagen)にそれぞれ形質転換し、インサートを含むコロニーを単離した。
大腸菌のコロニーを２ｍｌのカベニシリン５０μg/ml、クロラムフェニコール３４μg/mlを含むＬＢ培地(LBCbCm)で３７℃で回転培養し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０になったところで、４℃で終夜保存した。
翌日、４℃で９５００ｒｐｍで１分間遠心分離することで沈殿を得て、これを２ｍｌの前記と同じＬＢ培地でけん濁して、５０ｍｌのＬＢ培地で希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０になるまで３７℃で振とう培養した。
５分間氷上に放置して冷却した後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で２時間、振とう培養した。
培養液から４ｍｌを取り、５分間氷上に置き、４℃で１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで沈殿を集め、８００μｌのＰＢＳでけん濁した。
これに電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１２％２−メルカプトエタノール、０．２％ＢＰＢ(Bromo Phenol Blue)、２０％グリセリン）を加え、超音波を5秒を２回かけ、４℃で１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的タンパク質の発現を確認した。結果を図８に示す。
Preparation of transformed Escherichia coli Using the PshAI and SalI sites of the constructs prepared in Example 1 and Example 2, these constructs were respectively cloned downstream of the tag protein of pET43b (Novagen), an E. coli expression vector. Each clone containing the insert was transformed into AD494 pLysS (Novagen), which is a host for expression of E. coli, and a colony containing the insert was isolated.
E. coli colonies were rotated and cultured at 37 ° C. in LB medium (LBCbCm) containing 2 ml of cabenicillin 50 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml. When OD 600 nm = 0.6 to 1.0, 4 ° C. And stored all night.
The next day, the precipitate was obtained by centrifuging at 9500 rpm for 1 minute at 4 ° C., suspended in 2 ml of the same LB medium as described above, diluted with 50 ml of LB medium, and OD 600 nm = 0.6-1. Cultured with shaking at 37 ° C. until zero.
After allowing to cool on ice for 5 minutes, IPTG was added to 1 mM, and further cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours.
4 ml was taken from the culture solution and placed on ice for 5 minutes, and the precipitate was collected by centrifugation at 15000 rpm for 2 minutes at 4 ° C. and suspended in 800 μl of PBS.
To this, a sample buffer for electrophoresis (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% SDS, 12% 2-mercaptoethanol, 0.2% BPB (Bromo Phenol Blue), 20% glycerin) was added, and ultrasonic waves were added. The protein of interest was confirmed by SDS-PAGE of the supernatant centrifuged at 15000 rpm for 1 minute at 4 ° C. twice for 5 seconds. The results are shown in FIG.
ＳＳ活性の測定（Native-PAGE/SS活性染色法）
実施例３において大腸菌で人工的に発現させたタンパク質は、使用した発現ベクターのｐＥＴ４３ｂの構造上、ＳＳＩＩａタンパク質の上流域にＮｕｓ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｓ−Ｔａｇが付着している。これらが付着したままＳＳ活性の測定を試みた。
目的のタンパク質が発現している大腸菌けん濁液４ｍｌを採取した。この大腸菌けん濁液に１００μｌの抽出バッファー（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセリン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ、５ｍＭ ジチオスレイトール、０．４ ｍＭ ＰＭＳＦ／ＥｔＯＨ）を加えて超音波で破砕し、１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（０．３Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動には７．５％アクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから３０分で電流を止めた。その後、洗浄液（クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、０．５Ｍ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ バイシン−ＮａＯＨ（Bicine-NaOH）、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２ｍＭ ジチオスレイトール）で２回洗浄し（各１５分）、洗浄液にＡＤＰＧを１ｍＭになるように加えた反応液中で２０時間３０℃で振とうしながら反応させた。反応後、ヨードヨードカリ液（１％ＫＩ／０．１％Ｉ２）で染色した。
結果を図９上段に示す。ＳＳIIａの活性が正常であると予想されるＩＲ３６では、ゲル状に茶色い帯が生じ、ＳＳIIａの遺伝子を含まないベクターを形質転換したもの（コントロール）では、ＩＲ３６で見られた茶色い帯が生じなかった。
Measurement of SS activity (Native-PAGE / SS activity staining method)
In the protein artificially expressed in E. coli in Example 3, Nus-Tag, His-Tag, and S-Tag are attached to the upstream region of SSIIa protein due to the structure of pET43b of the expression vector used. The SS activity was measured with these attached.
4 ml of an E. coli suspension in which the target protein was expressed was collected. To this E. coli suspension, 100 μl of extraction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerin, 10 mM EDTA-Na, 5 mM dithiothreitol, 0.4 mM PMSF / EtOH) is added and disrupted with ultrasound. Sample buffer for Native-PAGE (0.3 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.1% bromophenol blue, 50% glycerol) is added to the supernatant obtained by centrifugation at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. 1/2 volume was added and used for electrophoresis. A 7.5% acrylamide gel was used for electrophoresis. Electrophoresis was carried out at 4 ° C. with a steady current of 7.5 mA until the front passed through the concentrated gel, and 15 mA after passing, and the current was stopped 30 minutes after the front came out. Then, 2 with a washing solution (sodium citrate buffer pH 7.5, 0.5 M sodium citrate, 100 mM bicine-NaOH, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 10% glycerol, 2 mM dithiothreitol). After washing twice (each 15 minutes), the reaction was carried out in a reaction solution in which ADPG was added to the washing solution to a concentration of 1 mM while shaking at 30 ° C. for 20 hours. After the reaction, it was stained with iodoiodoli solution (1% KI / 0.1% I 2 ).
The results are shown in the upper part of FIG. In IR36, which is expected to have normal SSIIa activity, a gel-like brown band was produced, and in the case of transforming a vector not containing the SSIIa gene (control), the brown band seen in IR36 was not produced. .
ＳＳ活性の測定（ＡＤＰ遊離法）
ＳＳ活性は、鎖長を伸長したときに基質ＡＤＰ−グルコースからＡＤＰが遊離するため、遊離したＡＤＰを定量することで、ＳＳ活性を測定することができる(Nishi et al., 2001)。反応液（５０ｍＭバイシン−ＮａＯＨ(Bicine-NaOH)、ｐＨ７．４、５００ｍＭクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＤＰグルコース、２ｍｇ／ｍｌ牡蛎グリコーゲン(oyster glycogen)）に、大腸菌のけん濁液４ｍｌに抽出バッファー（(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ、５ｍＭ ジチオスレイトール、０．４ｍＭ ＰＭＳＦ／ＥｔＯＨ）を加えて超音波で破砕し、１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清を加え、２０分間、３０℃で反応させた。煮沸することで反応を停止し、これに第２反応液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ クレアチンホスファート(Creatin phosphate)、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ(Creatin phosphokinase)）を１００μｌ加え、３０℃で３０分反応させた。煮沸することで反応を停止し、遠心分離した上清１５０μｌに第３反応液（１２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＮＡＤＰ＋）を加え、ヘキソキナーゼ（hexokinase）とＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ（dehydrogenase）を加える前と加えた後、１時間後の３４０ｎｍの吸光度の差を測定し、ＳＳ活性値とした。
Measurement of SS activity (ADP release method)
Since SS activity is released from the substrate ADP-glucose when the chain length is extended, SS activity can be measured by quantifying the released ADP (Nishi et al., 2001). Suspension of E. coli in the reaction solution (50 mM bicine-NaOH, pH 7.4, 500 mM citrate-NaOH, pH 7.4, 20 mM DTT, 2 mM ADP glucose, 2 mg / ml oyster glycogen) Extraction buffer ((50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 10 mM EDTA-Na, 5 mM dithiothreitol, 0.4 mM PMSF / EtOH) is added to 4 ml of the solution, and the mixture is sonicated and 15000 rpm, 10 minutes. The supernatant obtained by centrifugation at 4 ° C. was added and reacted for 20 minutes at 30 ° C. The reaction was stopped by boiling, and the second reaction solution (50 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 10 mM Creatin phosphate, 200 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 0.5 mg / m 100 μl of creatine phosphokinase was added and reacted for 30 minutes at 30 ° C. The reaction was stopped by boiling, and the third reaction solution (125 mM HEPES-NaOH, pH 7. 5, 20 mM MgCl 2 , 10 mM glucose, 1 mM NADP + ), and before and after the addition of hexokinase and G6P dehydrogenase, the difference in absorbance at 340 nm after 1 hour was measured, and the SS activity value It was.
本発明は、植物におけるデンプンの合成、特にイネにおけるデンプンの合成において、その味覚や糊化温度などの特性を決定する重要な因子としてのＳＳIIａの活性を調節できることを明らかにするものであり、本発明は、目的の特性を有するデンプンを得るための手法として遺伝子の操作により可能であることを具体的に示すものである。また、本発明は、イネのデンプンとしてインディカイネの作るデンプンやジャポニカイネの作るデンプンの他に、これらの中間型の特性を有するデンプンを製造させることを可能とする中間型の活性を有するＳＳIIａを提供するものである。
したがって、本発明によれば、本発明で開示された部位のアミノ酸をさまざまなアミノ酸に変更することで、酵素活性をさまざまなレベルに変えることができ、植物のデンプン合成に関与するＳＳIIａの活性を増強させたり、失活させたり、またその中間的な活性にすることを可能とし、既存のインディカ米よりも高い糊化温度をもつデンプンや、さまざまな糊化温度を有するデンプンを開発することが可能となる。また、インディカ型の活性型ＳＳIIａと、ジャポニカ型の不活性型ＳＳIIａの中間の活性をもつ人工ＳＳIIａの遺伝子をジャポニカ型イネに導入することによってインディカ−ジャポニカ中間型のデンプンを製造することができ、デンプン産業のみならず、食糧問題においても本発明の寄与は大きく、産業上極めて有用である。
The present invention clarifies that the activity of SSIIa can be regulated as an important factor for determining characteristics such as taste and gelatinization temperature in starch synthesis in plants, particularly starch synthesis in rice. The invention specifically shows that it is possible by genetic manipulation as a technique for obtaining starch having the desired properties. In addition to the starch produced by Indica rice and the starch produced by Japonica rice, the present invention also includes SSIIa having an intermediate type activity that makes it possible to produce starch having these intermediate type properties. It is to provide.
Therefore, according to the present invention, by changing the amino acid at the site disclosed in the present invention to various amino acids, the enzyme activity can be changed to various levels, and the activity of SSIIa involved in plant starch synthesis is increased. It is possible to develop, inactivate, and have intermediate activity, and develop starch with higher gelatinization temperature than existing indica rice and starch with various gelatinization temperatures. It becomes possible. Indica-japonica intermediate starch can be produced by introducing an artificial SSIIa gene having an intermediate activity between indica-type active SSIIa and japonica-type inactive SSIIa into japonica rice, The present invention greatly contributes not only to the starch industry but also to food problems, and is extremely useful in industry.
配列番号１； ＩＲ３６のＳＳIIａの翻訳領域の塩基配列
配列番号２； ＩＲ３６のＳＳIIａのアミノ酸配列
配列番号３； 金南風のＳＳIIａの翻訳領域の塩基配列
配列番号４； 金南風のＳＳIIａのアミノ酸配列
配列番号５； フォーワードプライマー
配列番号６； リバースプライマー
配列番号７； ＃１１１２の構築物の塩基配列
配列番号８； ＃１１１２の構築物のアミノ酸配列
配列番号９； ＃２１１２の構築物の塩基配列
配列番号１０； ＃２１１２の構築物のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 1; base sequence of the translation region of SSIIa of IR36 SEQ ID NO: 2; amino acid sequence of SSIIa of IR36 SEQ ID NO: 3; base sequence of translation region of SSIIa of Kinnan style SEQ ID NO: 4; amino acid sequence of SSIIa of Kinnan style SEQ ID NO: 5; Forward primer SEQ ID NO: 6; Reverse primer SEQ ID NO: 7; Base sequence of construct # 1112 SEQ ID NO: 8; Amino acid sequence of construct # 1112 SEQ ID NO: 9; Base sequence of construct # 2112 SEQ ID NO: 10; Amino acid sequence of construct # 2112
Claims (21)
A method for producing a starch having characteristics according to an exogenous SSIIa gene using the transformed plant according to any one of claims 18 to 20.
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