JP2005245404A - 処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の処理容器を備えるハイブリダイゼーション用の試料を自動的に準備する処理装置を提供する。
【解決手段】複数の処理容器においてそれぞれハイブリダイゼーションに用いる試料を準備する装置であって、前記試料の原料を入れた前記処理容器を保持する処理容器保持部材と、処理容器に設けられた開口部より所定の試薬を入れることができる試薬ノズルと、該試薬及び前記試料の原料の反応で生じた廃液を吸引する吸引ノズルと、前記処理容器保持部材材を移動させる駆動装置と、を備える処理装置であって、ハイブリダイゼーションに用いる試料の準備工程に用いられる処理装置を提供する。前記試薬ノズルにより試薬を入れ、前記吸引ノズルにより廃液等を吸引することができ、前記ハイブリダイゼーションに用いる試料の準備工程に応じて適宜行われる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程自動化装置に関する。

近年、食品や飲料等の製品、あるいは生活空間等の環境中における有害菌の存在が注目されている。有害菌の発生源を同定する方法としては、発生源と思われる場所から得られたサンプルをＰＣＲ法やコロニーハイブリダイゼーション法で処理し、その場所における有害菌の存在の有無を調べて行うものが一般的である。

ＰＣＲ法は、ＤＮＡの目的とする一部分のみを大幅に増幅させる方法である。一方、コロニーハイブリダイゼーション法は、プラスミドベクターによって作製したｃＤＮＡライブラリーなどから目的とするクローンを選び出す方法である。このハイブリダイゼーション法では、プレート上に生育させた菌体をフィルター上に移し、溶菌させることによって抽出したＤＮＡをそのままフィルター上に固定化したものに対して行う。例えば、寒天培地上のコロニー（１個の細菌に由来する均一な集団）に、アイソトープなどでラベルしたプローブ（検出子）をハイブリダイズさせることによって、目的遺伝子コロニーを検出する。

具体的には、コロニーを形成したプレートに、ナイロン膜を接着させてコロニーをフィルターに移行させる。フィルターを平板培地に裏返しに置いて、数時間以上培養することにより、コロニーをナイロン膜に確実に増殖させることもできる。あるいは、既にコロニーを形成させたプレートに、ナイロン膜を接着させることにより、コロニーをナイロン膜に付着させることができる。コロニーを付着させたナイロン膜は、菌の残渣を除去し、ＤＮＡをナイロン膜に固定する必要がある。例えば、ナイロン膜を用いた場合は、アルカリ溶液を作用させて、ＤＮＡを一本鎖に変性し、中和した後、標識したＤＮＡもしくはＲＮＡプローブとハイブリッド形成させる。このフィルターをオートラジオグラフィー蛍光色素法あるいは酵素発色法などにかけ、目的のＤＮＡ断片を取り込んだコロニーを検出する。多くのコロニーの中からプローブと結合しうるクローンを素早く選び出すことができる方法である。菌種によっては、アルカリ処理の前にリゾチームやプロテアーゼ処理等をする溶菌工程を加える必要がある場合もある。

対象となるサンプル中の目的菌の数が極めて少なかった場合や、毒素により菌が死滅している場合では、ＰＣＲ法によって目的菌の存在を検出できたとしても、その菌の単離は困難であるところ、コロニーハイブリダイゼーション法によれば、このような場合でも目的菌を単離することが可能である。また、サンプル中の数千に及ぶ数の菌を一度に検定して、目的菌の存否を推定できるというより有利な特徴を有している。

しかし、膜の処理工程は、アルカリ工程、中和工程、洗浄工程という多段階工程から成り、場合によっては、アルカリ工程の前にリゾチ−ムやプロテアーゼによる溶菌工程が必要となる場合もある。その作業が煩雑であり長時間を要するのが一般的である。ハイブリダイゼーション工程も多段階工程から成るため同様である。通常、これらの操作は手作業で行なわれており、多量の膜の処理を行い、また、多量の処理膜についてハイブリダイゼーションを行うことは、容易ではない。
特開２００３−９３０３９号公報 特開２００３−１６９６６２号公報 特開２００３−１７７１２８号公報 特開２００３−１８０３２９号公報 特開２００３−１９４８２２号公報 特開２００３−１２１４４１号公報 特開２００３−１２５７５１号公報 特開２００３−１０２４６０号公報 特開２００３−８８３９９号公報 特開２００３−９３０３８号公報 特開２００３−７９３９８号公報 特開２００３−８３９６４号公報

上述のようにハイブリダイゼーション法では手作業で種々の工程が行われているため、同時に多量の処理を行うことが難しく、多量処理において効率が低い。また、菌を取り扱うので、自動化により作業者の接触の機会を減少させコンタミネーション生じさせ難くすることは有益となる。

本発明においては、ハイブリダイゼーション法のサンプルである膜を多量に実質的に同時に処理をするための膜処理装置を提供する。即ち、複数の種類の異なるサンプルを実質的に同時に、ほぼ自動的に処理する装置であって、該複数のサンプルが入った複数の処理容器（又は処理槽）を備え、所定の試薬を所定の時間間隔で加え、保持し、廃液等を排出する手段を備える。

上記装置は、サンプルに対して施される種々の処理を行う手段のうち少なくとも１つをサンプル間で共有することができるため、装置の小型化を図ることができる。

より具体的には、以下のようなものを提供する。

（１）複数の処理容器においてそれぞれハイブリダイゼーションに用いる試料を準備する処理装置であって、前記試料の原料の少なくとも一部を入れた前記処理容器を保持する処理容器保持部材と、前記複数の処理容器のそれぞれに設けられた開口部より所定の試薬を入れることができる試薬ノズルと、前記所定の試薬が入れられた前記処理容器は、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部を入れることができ、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を前記処理容器から吸引する吸引ノズルと、前記試薬ノズル及び前記吸引ノズルを保持し、前記処理容器に対して相対的に移動可能に備えられるノズル保持部材と、前記試薬ノズルにより試薬を入れ、前記吸引ノズルにより前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を吸引することができるように、前記ノズル保持部材を前記処理容器に対して相対的に移動させる駆動装置と、を備え、前記試薬ノズルにより試薬を入れ、前記吸引ノズルにより前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を吸引することが、前記ハイブリダイゼーションに用いる試料の準備工程に応じて行われる処理装置。

（２）前記処理容器保持部材は、前記処理容器を保持したまま回動し、前記試薬ノズル及び／又は前記吸引ノズルに対して、前記処理容器を相対的に移動させることができる上記（１）記載の処理装置。

（３）前記処理容器は、前記処理容器保持部材の回動方向に沿って当該処理容器保持部材上に並べられており、前記処理容器保持部材は、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部の十分な反応時間に応じて、前記試薬ノズル又は前記吸引ノズルが各処理容器に対して試薬を入れ又は吸引するように、複数の前記処理容器を回動・停止することができる上記（１）又は（２）記載の処理装置。

（４）前記処理容器内に前記試料の原料が付着したナイロン膜を備え、該ナイロン膜がシート状に水平よりやや傾斜して前記処理容器内に配置される上記（１）から（３）いずれか記載の処理装置。

（５）更に、熱風循環器を備えることで、処理容器の温度を一定にすることができる上記（１）から（４）いずれか記載の処理装置。

（６）前記試薬が、強アルカリ溶液を含む上記（１）から（５）いずれか記載の処理装置。

ここで、試料とは、ハイブリダイゼーション法に直接用いられるものを意味することができる。また、試料の原料とは、かかる試料を生成する元となるものであって、直接的及び／又は間接的な原料を含んでもよい。例えば、かかる試料は、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の膜を含んでよく、試料の原料が、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の膜を含んでもよい。更に、試料の原料は、かかる膜について対象となる菌を含んでよい。また、試料は、その膜について当該菌に由来する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の少なくとも一部を含んでいてよい。

菌種によっては、リゾチーム処理あるいはプロテアーゼ処理等の溶菌工程を加える必要があり、これには処理容器を一定の温度に保つ必要がある。このための熱風循環器を配置することがより好ましい。

処理容器の底は、所定の傾斜角で傾斜する傾斜面を有することができる。この傾斜面は、処理容器を水平な面に置いたときに水平面に対して所定の傾斜を有してもよく、また、上記処理容器保持部材に配置したときに水平面に対して所定の傾斜を有してもよい。従って、この傾斜面により、特定の位置に液体を容易に集めることができる。この傾斜面は複数種類あってもよく、任意の位置に液体を誘導することが容易となる。例えば、ナイロン膜のような処理容器内のものをシート状にして、上記処理容器の底に配置することができる。

また、本発明の装置により準備された試料は、例えば、核酸が固定された膜であってよい。膜はニトロセルロース膜、ナイロン膜等核酸を固定できる膜であればよい。当該試料は、コロニーハイブリダイゼーション法のみならず、プラークハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等において、試料として用いることを排除するものではない。

また、ハイブリダイゼーション反応は、コロニーハイブリダイゼーション法における膜とプローブとのハイブリダイゼーションだけでなく、プラークハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等におけるものも含むことができる。

本発明による装置では、多サンプルについて実質的に自動的かつ同時並行的に処理することができる。そのため、効率の向上だけでなく、安全性に優れることが期待される。

本発明の好適な実施形態を、図面を参照しつつ以下に説明する。

図１は、本発明の好適な実施形態の１つであるコロニーハイブリダイゼーション法に用いる試料となるナイロン膜を処理する自動処理装置１０の見取り図である。見やすくするために、処理中は通常閉じられる蓋であるプラスチックカバー１７が開いた状態で、更に、プラスチックカバー１７及び該プラスチックカバー１７をちょうつがい４３で保持しているカバー部材４４を部分的に破壊した状態で示してある。この自動処理装置１０の本体４６には、処理容器であるトレー１４を保持する処理容器保持部材である回転テーブル１３が、その回転軸４５（図３参照）を中心に回動できるように備えられている。この回転軸４５に沿うシャフトは、本体４６内の駆動モータ等により駆動され、回転テーブル１３の駆動装置となることができる。本体４６の右手前隅近傍に、試薬を注入する試薬ノズル４８、４９及び廃液等を排出する吸引ノズル５０を保持するノズル保持部材であるヘッド１１が、支柱５２の上に保持される。本体４６から延び回動可能な支柱５２の回動により、ヘッド１１も回動する。吸引ノズル５０で吸引された廃液は、該吸引ノズル５０がヘッド１１の回動により廃液ポット１２の開口部の真上に来たときに、該吸引ノズル５０から排出され、廃液ポット１２へと廃棄される。

本体４６の奥側の隅にほぼ三角柱状に立っている熱風循環器５４は、開口グリッド１５を回転テーブル１３側に向けて、プラスチックカバー１７やカバー部材４４に覆われるように配置されている。また、本体４６には、手前側の正面に表示部１８を備える入力装置１９が配置されている。

図２は、プラスチックカバー１７及びカバー部材４４を実質透明にした上面図であり、図３は、プラスチックカバー１７を取り外した自動処理装置１０の正面図であり、図４は、プラスチックカバー１７を透明にした側面図である。図２では、ヘッド１１が支柱５２の回動により回動する様子を示している。図３で示すように、回転テーブル１３は、回転軸４５を中心に回動できるように配置されている。また、図４に示すように、表示部１８は、上を向くように傾斜をもって配置されている。

図５は、回転テーブル１３に置かれたトレー１４を真上から見た上面図である。図６は、図５にあるＡＡ断面線でトレー１４等を切った断面図であり、参考のために、試薬ノズル４８、４９及び吸引ノズル５０をそれぞれの注入又は吸引口となる開口部６５、６６、６７の真上に配置した状態で示している。図７は、回転テーブル１３に置かれたトレー１４を右側面から見た正面図である。図８は、このような回転テーブル１３に置かれたトレー１４を一部破断させて内部が見えるようにした見取り図である。

回転テーブル１３には、凹部５９が設けられ、トレー１４が所定の位置に配置しやすいように構成されている。回転テーブル１３は、ほぼ水平な床面等に置かれた自動処理装置１０に従って、ほぼ水平に備えられている。回転テーブル１３に設けられた凹部５９の底面もほぼ水平になっており、置かれるトレー１４も、ほぼ水平に配置されている。トレー１４は、このように凹部５９に配置されると２つの押え板バネ６０によって所定の位置に固定される。トレー１４は、本体容器７０及び該本体容器７０の開口部にずれないように嵌る蓋ガイド７４を備える上蓋６２から構成され、上蓋６２と容器本体７０のシール部にパッキン７２を挟んで内容物が漏れないようになっている。上蓋６２には、中央及びその両脇にそれぞれ確認窓６３、６４が配置されている。また、上蓋６２には、丸い４つの分注ノズル入口としての開口部６５、６６が二つずつ設けられており、更に、丸い１つの排液用の吸引ノズル入口としての開口部６７が設けられている。

図６に示すように、それぞれ、分注ノズル入口としての開口部６５、６６と吸引ノズル入口としての開口部６７の上に、それぞれ、試薬ノズル４８、４９及び吸引ノズル５０がヘッド１１の回転によりもってこられると、各ノズルは必要に応じて上下に伸縮し、容器本体７０内に試薬を注入し、また、反応液を吸引して排出する。注入された試薬は、傾斜して設けられた本体容器７０の床部７６上に配置されたテフロン（登録商標）メッシュ８０の上に配置された菌体が付着したナイロン膜８４に適用される。テフロン（登録商標）メッシュ８０には、孔８２が複数設けられており、試薬が容易にナイロン膜８４に接触できるようになっている。余分な試薬は、床部７６の傾斜に従って、液溜部８５に集まり、吸引ノズル５０で容易に排出される。

図９は、ナイロン膜の処理工程を示すフローチャートである。左側には、主な処理工程がそれぞれ示してあり、右側には実際の作業手順が記されている。まず、寒天培地において、サンプルされた菌体が生育される。このコロニー上にナイロン膜を塗布し、これを剥がす。この剥がした膜を、トレー１４のテフロン（登録商標）メッシュ８０の上に置き、パッキン７２を挟んで上蓋６２を被せて、回転テーブル１３の凹部５９にセットし、押え板バネ６０で固定する。同様にして、回転テーブル１３の全ての凹部５９にトレー１４をセットする。次に、自動処理装置１０の入力装置１９にある自動処理装置１０のスイッチをいれて、以下のような膜処理工程を行う。

[ナイロン膜の自動処理装置の使用方法] 処理に必要な溶菌用の酵素溶液、アルカリ溶液、中和溶液、洗浄溶液がトレーに注入、除去されるように設定する。コロニーを転写してあるナイロン膜８４をトレー１４にのせ、上蓋６２をかぶせる（Ｓ１０）。入力装置１９のスイッチパネルを作動させると、所定の位置に回転テーブル１３が停止する。そして、ヘッド１１が所定の角度で回転し停止する。試薬ノズル４８が開口部６５の上に配置され、試薬タンクから最初に溶菌用に酵素溶液（リゾチ−ム２ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫ 1ｍｇ／ｍＬ ５０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）が、分注吸引ノズル４８からトレーに注入される。トレーがのっているテーブル１３は回転し、また、分注吸引ノズルを保持するヘッド１１は伸縮するので、回転テーブル１３にセットされた３０枚の全トレーに必要な溶液を注入することができる（Ｓ２０）。ナイロン膜を所定時間（例えば１０分間）、溶液に接触させた後、吸引ノズル５０を、開口部６７上に配置し、トレー１４内の溶液を吸引する。これにより、トレー１４内の溶液を排出することができる（Ｓ２０）。全てのトレー１４内の分注した酵素溶液を排出させた後、アルカリ溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ ＮａＯＨ）を酵素溶液の場合と同様に、試薬ノズル４９から開口部６６を通して全てのトレー１４に注入する（Ｓ３０）。ナイロン膜を所定時間（例えば7分間）、アルカリ溶液に接触させた後（変性）、吸引ノズル５０が、開口部６７上に配置され、トレー１４内の溶液を吸引することで、全てのトレー１４内の溶液を排出することができる（Ｓ３０）。次に、中和溶液（１．５ Ｍ ＮａＣｌ−０．８Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７．２）を酵素溶液やアルカリ溶液の場合と同様に、試薬ノズル４９から開口部６６を通して全てのトレー１４に注入する（Ｓ３０）。ナイロン膜を所定時間（例えば7分間）、アルカリ溶液に接触させた後、吸引ノズル５０が、開口部６７上に配置され、トレー１４内の溶液を吸引することで、全てのトレー１４内の溶液を排出することができる（Ｓ４０）。このようにして、ナイロン膜に１本鎖ＤＮＡを固定することができる。洗浄のために、２×ＳＳＣ溶液を、試薬ノズル４９によって開口部６６からトレー１４内に分注し、全てのトレー１４に関して洗浄を行う（Ｓ５０）。更に、同様に吸引ノズル５０によって、全てのトレー１４の溶液の排出を行う（Ｓ５０）。

以上により、コロニーハイブリダイゼーション法に用いるナイロン膜の処理が終了し、該方法に、各トレー１４のナイロン膜８４を試料として提供することができる。

このようにして、ナイロン膜上に菌をのせ、強アルカリ溶液に浸すことによって、菌の溶解と、菌体内にあるＤＮＡを１本鎖にした後、その１本鎖ＤＮＡをナイロン膜に固定する操作を行なうことができる。このような操作を手作業で行うと、煩雑であるため、一度に数枚程度のナイロン膜しか処理することができないところを、多量に処理することができる。特に、工場等で、汚染菌の同定を行うには、律速段階となる作業であったが、この自動化装置により、一度に３０枚又はそれ以上の処理を行うことができる。従って、工場で汚染菌の同定を行うことに適しているといえる。

コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程自動化装置の見取り図である。 コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程自動化装置の上面図である。 コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程自動化装置の正面図である。 コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程自動化装置の側面図である。 膜処理工程自動化装置にセットされたトレーの上面図である。 膜処理工程自動化装置にセットされたトレーの断面図である。 膜処理工程自動化装置にセットされたトレーの正面図である。 膜処理工程自動化装置にセットされたトレーの見取り図である。 コロニーハイブリダイゼーション法における膜処理工程のフローチャートである。

符号の説明

１０ 自動処理装置
１１ ヘッド
１２ 廃液ポット
１３ 回転テーブル
１４ トレー
１５ 開口グリッド
１７ プラスチックカバー
１８ 表示部
１９ 入力装置
４４ カバー部材
４５ 回転軸
４６ 本体
４８ 試薬ノズル
４９ 試薬ノズル
５０ 吸引ノズル
５２ 支柱
５４ 熱風循環器
５９ 凹部
６０ 押え板バネ
６２ 上蓋
６３ 確認窓
６５ 開口部
６６ 開口部
６７ 開口部
７０ 容器本体
７２ パッキン
７４ 蓋ガイド
７６ 床部
８０ テフロン（登録商標）メッシュ
８２ 孔
８４ ナイロン膜
８５ 液溜部

Claims (6)

1. 複数の処理容器においてそれぞれハイブリダイゼーションに用いる試料を準備する処理装置であって、
   前記試料の原料の少なくとも一部を入れた前記処理容器を保持する処理容器保持部材と、
   前記複数の処理容器のそれぞれに設けられた開口部より所定の試薬を入れることができる試薬ノズルと、
   前記所定の試薬が入れられた前記処理容器は、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部を入れることができ、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を前記処理容器から吸引する吸引ノズルと、
   前記試薬ノズル及び前記吸引ノズルを保持し、前記処理容器に対して相対的に移動可能に備えられるノズル保持部材と、
   前記試薬ノズルにより試薬を入れ、前記吸引ノズルにより前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を吸引することができるように、前記ノズル保持部材を前記処理容器に対して相対的に移動させる駆動装置と、を備え、
   前記試薬ノズルにより試薬を入れ、前記吸引ノズルにより前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部及び／又はそれらから生ずる廃液を吸引することが、前記ハイブリダイゼーションに用いる試料の準備工程に応じて行われる処理装置。
2. 前記処理容器保持部材は、前記処理容器を保持したまま回動し、前記試薬ノズル及び／又は前記吸引ノズルに対して、前記処理容器を相対的に移動させることができる請求項１記載の処理装置。
3. 前記処理容器は、前記処理容器保持部材の回動方向に沿って当該処理容器保持部材上に並べられており、
   前記処理容器保持部材は、前記所定の試薬及び前記試料の原料の少なくとも一部の十分な反応時間に応じて、前記試薬ノズル又は前記吸引ノズルが各処理容器に対して試薬を入れ又は吸引するように、複数の前記処理容器を回動・停止することができる請求項１又は２記載の処理装置。
4. 前記処理容器内に前記試料の原料が付着したナイロン膜を備え、該ナイロン膜がシート状に水平よりやや傾斜して前記処理容器内に配置される請求項１から３いずれか記載の処理装置。
5. 更に、熱風循環器を備え、前記処理容器の温度を一定にすることができる請求項１から４いずれか記載の処理装置。
6. 前記試薬が、強アルカリ溶液を含む請求項１から５いずれか記載の処理装置。

Images