JP2005237389A - ランダム化ペプチドの表面発現ライブラリー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1および第2オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
【選択図】なし
Description
Kunkelら、Meth. Enzymol. 154: 367〜382頁 (1987) Smithら、Focus,12巻,38〜40頁,1990年 Sanbrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989年 Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1989年 MessingおよびVieira、Gene, 19巻, 262〜276頁, 1982年 Aruffoら、Cell, 61巻, 1303〜1313頁, 1990年
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(b)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;および
(c)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が、発現され得る結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
を包含する、方法。
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(b)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;
(c)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
(d)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;および
(e)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
を包含する、方法。
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(b)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;
(c)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
(d)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;
(e)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
(f)該ペプチドをコードする核酸を単離する工程;および
(g)該核酸の配列を決定する工程;
を包含する、方法。
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(b)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;および
(c)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
をさらに包含する、方法。
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程;
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;および
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
を包含する、方法。
(a1)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(a2)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;および
(a3)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
をさらに包含する、方法。
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程;
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
(d)該ペプチドをコードする核酸を単離する工程;および
(e)該核酸の配列を決定する工程;
を包含する、方法。
(a1)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1オリゴヌクレオチドの多様な集団を第1ベクターに作動可能に結合させる工程;
(a2)所望の偏りのランダムコドン配列を有する第2オリゴヌクレオチドの多様な集団を第2ベクターに作動可能に結合させる工程;および
(a3)該第1および第2オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程(a)および(b)のベクター生成物を結合する工程;
をさらに包含する、方法。
NO:1)を有する、項目81に記載のベクター。
本発明は、個々のモノマーを用いて、所望の偏りのランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成しおよび発現させる簡単で安価な方法に関する。この方法は、個々のモノマーをトリプレットの代わりに使い、単に全トリプレットの非縮重サブセットだけを合成することによって、コドン重複性が軽減されるという点で有利である。従って、合成されたオリゴヌクレオチドは、生じ得るランダムトリプレット配列を大きな比率で得ることができることを示す。得られたオリゴヌクレオチドは、例えば、ファージの生存度を変えないか、または所定のペプチド配列に対して生物学的選択を課することができない形態の繊維状バクテリオファージの表面に発現させることができる。それ故に生成したオリゴヌクレオチドは、薬理学および研究用の生成物を無限の数で生成させるのに有用である。
(a)ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第1オリゴヌクレオチドの多様集団を第1ベクターとして使用し得るように結合し;(b)ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第2オリゴヌクレオチドの多様集団を第2ベクターとして使用し得るように結合し;(c)工程(a)と(b)でのベクター生成物を、第1と第2のオリゴヌクレオチドの前記の集団が互いに結合して結合ベクターの1つの集団になる条件下で結合させ;(d)前記の結合ベクターの集団を前記のランダムペプチドの集団を発現するのに充分な条件下で、和合性宿主内に導入し;および(e)前記の結合タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。本発明は、また、このようなペプチドのコーディング核酸配列も決定する。
右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドから生成されるペプチドリガンドの単離と特性の決定
この実施例は、ランダムオリゴヌクレオチドの合成およびコードされたランダム化ペプチドの表面発現ライブラリーの発現を示す。この実施例のランダムペプチドは、2種のランダムオリゴヌクレオチドを混合し、結合させることによって生成される。ペプチドリガンドの単離および特性決定および特異的結合タンパク質に対応するヌクレオチド配列もまた示される。
2つのランダム化オリゴヌクレオチドの合成を以下に示す。これらのランダム化オリゴヌクレオチドは、長い方のランダム化オリゴヌクレオチドの短い部分に対応する。2つの短い部分の各々が長いオリゴヌクレオチドの半分を構成する。各々の半分を構成するランダム化オリゴヌクレオチドの集団を、右半分および左半分と命名する。右半分および左半分の各々の集団は、10コドンの長さであり、各位置に20種のランダムコドンを含有する。右半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのセンス配列に対応し、発現されるペプチドのカルボキシ末端側の半分をコードする。左半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列に対応し、発現されるペプチドのアミノ末端側の半分をコードする。ランダム化オリゴヌクレオチド集団の右半分および左半分は、別々のベクター種にクローン化され、次いで混合され結合された。その結果、右半分および左半分はともにランダム結合し、20コドンの長さのランダム化オリゴヌクレオチドの集団を含有する単一の発現ベクターを生成する。ベクター集団を適する宿主にエレクトロポーレーション法で導入して、ランダムペプチドを表面で発現する繊維状バクテリオファージを生成させる。
10の反応カラムを使用し、長さが10コドンのランダムオリゴヌクレオチドの右半分を合成した。オリゴヌクレオチドは、配列の3’末端に5つのモノマー5’GAGCT3’を有し、配列の5’末端に8つのモノマー5’AATTCCAT3’を有する。合成機に、チミンヌクレオチドで誘導体化されたカラム(T−カラム、MilliGen/Biosearch # 0615.50)を取り付け、そして、独立の反応セット中で10の各カラムについて表Iに示しす配列を合成するように合成機にプログラムした。最後の3つのモノマーの配列(合成は3’から5’へ進むので右から左へ)は、指定のアミノ酸をコードする:
ランダムオリゴヌクレオチドの左半分の合成は、右半分の合成と同様にして行った。オリゴヌクレオチドのこの半分は、コードされたランダム化ペプチドのアンチセンス配列に対応する。従って、表I〜表IIIのコドンの相補性配列が合成される。左半分のオリゴヌクレオチドも配列の3’末端に5つのモノマー5’GAGCT3’を有し、配列の5’末端に8つのモノマー5’AATTCCAT3’を持つ。合成、洗浄、乾燥、混合、および分割の一課程は、上に記載しものと同様である。
「X」で示される2つの第1モノマーは、その位置における4つすべてのヌクレオチドの等しい混合物を表す。これは、右半分および左半分のオリゴヌクレオチドとの結合部で比較的偏っていないコドン配列を保持するのに必要である。上記の右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドを、支持体から切り離して精製し、下記の表面発現ライブラリーの構築に用いた。
2つのM13ベースのベクターのM13IX42(SEQ ID NO:1)とM13IX22(SEQ ID NO:2)の各々を、ランダムオリゴヌクレオチドの右半分および左半分の集団をクローン化し、増幅させるために構築した。ベクターは、特に、右半分および左半分のオリゴヌクレオチド集団のランダム結合と逐次発現を容易に行なうために構築された。その集団内の各々のベクターは、ともに結合した集団からの1つの右半分オリゴヌクレオチドと1つの左半分オリゴヌクレオチドを含有し、22のコドンの長さのランダムコドンを有する単一の連続オリゴヌクレオチドを形成する。生成したベクター集団は、表面発現ライブラリーの構築のために用いられる。
III部位をベクターから取り出した。取り出しには、突然変異オリゴヌクレオチド5’−CATTTTTGCAGATGGCTTAGA−3’(SEQ ID NO:18)および5’−TAGCATTAACGTCCAATA−3’(SEQ ID NO:19)を用いた。新しいHind IIIとMlu Iの部位を、またM13IX42の3919および3951の位置に導入した。この変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、各々、5’−ATATATTTTAGTAAGCTTCATCTTCT−3’(SEQ ID NO:20)および5’−GACAAAGAACGCGTGAAAACTTT−3’(SEQ ID NO:21)の配列を有した。Lac Zのアミノ末端部位は、突然変異オリゴヌクレオチド5’−GCGGGCCTCTTCGCTATTGCTTAAGAAGCCTTGCT−3’(SEQ ID NO:22)が用いられ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発法によって欠失された。この欠失によって、M13mp18由来のFok I部位の1/3が除かれた。スペーサ配列を挿入することによって、Eco RI部位およびSac I部位との間の距離が増大され、完全な二重消化が保証された。そのスペーサ配列は、オリゴヌクレオチド5’−TTCAGCCTAGGATCCGCCGAGCTCTCCTACCTGCGAATTCGTACATCC−3’(SEQ ID NO:23)を用いて挿入した。最後にアンバー終止コドンを突然変異オリゴヌクレオチド5−TGGATTATACTTCTA AATAATGGA−3’(SEQ ID NO:24)を用いて4492位に配置した。このアンバー終止コドンは、生物学的選択として用いられる。これによって、ベクター配列を適正に組替え、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分および左半分の結合が保証される。上記の突然変異を行う際に、M13のコーディング領域内でなされる全ての変化は、そのようなアミノ酸配列が変化することなく残るように行われた。M13mp18内にはいくつかの突然変異が見出され、これらは発表された配列とは異なることに留意すべきである。これらの配列の差異が、見つかった場合には、見出された通りにその差異を本発明に記載したので、M13mp18の発表された配列とは正確には一致しない。
カラム1R〜40Rとカラム1L〜40L由来の右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドの各集団をそれぞれ、別々にM13IX42とM13IX22にクローン化して、右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドのサブライブラリーを作製する。それ故に、合計80のサブライブラリーを生成させる。右半分と左半分のオリゴヌクレオチドのアニーリングの効率を確実に最大にするために、ランダム化オリゴヌクレオチドの各集団は最終のスクリーニングのステップが実施されるまで、別個に保管される。効率が高い程、得ることができるランダム化オリゴヌクレオチド合計数が増大する。あるいは、右半分のオリゴヌクレオチドの40の集団全体(カラム1R〜40R)を混合し、1つの集団にし、左半分のオリゴヌクレオチドの40の集団全体(カラム1L〜40L)を混合して第2の集団にして、各々について1つのサブライブラリーを作ることができる。
4℃で貯蔵されたファージの貯蔵品から10のm.o.i.で感染させたXL1 BlueTM細胞(Stratagene社)の液体培養物50mlから、精製ファージを作製する。その培養物は2mM IPTGによって誘導される。全培養物の上澄み液を合わせ、2回遠心分離に付して透明にし、次いで1/7.5容積のPEG溶液(25% PEG−8000,2.5M NaCl)を添加することによってファージを沈澱させ、次いで4℃にて一夜インキュベートする。生成した沈澱を10,000×gで90分間遠心分離することによって回収する。ファージのペレットを、0.01M トリス−HCl,pH7.6,1.0mM EDTAおよび0.1% Sarkosylを含有する液25ml中に再懸濁させ、室温下30分間、ゆっくりと振盪する。生成した溶液を、0.5M NaClに調節し、5%ポリエチレングリコールの最終濃度にする。4℃で2時間保存した後、ファージを含有する沈澱を、15,000×gで1時間遠心分離を行って回収する。得られた沈澱を10mlのNET緩衝液(0.1M NaCl,1.0mM EDTAおよび0.01M トリス−HCl,pH7.6)中に再懸濁させ、十分に混合し、次いで170,000×gで3時間遠心分離してファージを再ペレット化する。ファージのペレットを続いて、2mlのNET緩衝液中に一夜再懸濁させ、次に110,000×gで18時間塩化セシウム遠心分離に付す(10mlの緩衝液中3.86gの塩化セシウム含有)。ファージのバンドを収集し、NET緩衝液で7倍に希釈し、170,000×gで3時間再度遠心分離し、再懸濁し、0.1mMアジ化ナトリウムを含有するNET緩衝液0.3ml中、4℃にて貯蔵する。
XL1を個々のプラークとともに一夜培養したものの1:100希釈物を含有する2XYTの培養物1mlを接種することによって、配列決定用の鋳型を作製する。滅菌トゥースピックを用いてプラークを拾い集める。その培養物を、37℃で5〜6時間振盪しながらインキュベートし、次に1.5mlのミクロフュージ管に移す。200μlのPEG溶液を添加し、次いで撹拌し、氷上に10分間置く。ミクロフュージ管中で12,000 x gにて5分間遠心分離することによってファージの沈澱を回収する。上澄み液を廃棄し、イエローピペットチップでゆっくりピペッティングを行うことによって、ペレットを230μlのTE(10mM トリス−HCl、pH7.5、1mM EDTA)中に再懸濁させる。フェノール(200μl)を添加し、続いて軽く撹拌し、ミクロフュージして相を分離する。水相を別の管に移し、フェノール抽出について先に述べたのと同様にして、200μlのフェノール/クロロホルム(1:1)で抽出する。0.1容積の3M NaOAcを添加し、次に2.5容積のエタノールを添加して、−20℃で20分間沈澱させる。沈澱させた鋳型を、マイクロフュージ管中で、12,000 x gにて8分間遠心分離することによって回収する。得られたペレットを70%エタノールで洗浄し、乾燥し、25μlのTEに再懸濁させる。配列決定は、メーカー(U.S.Biochemical社、オハイオ州、クリーブランド)が提供するプロトコルに従って、SequenaseTM配列決定キットを用いて行った。
2つの予め決められた位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離および特性決定
この実施例は、ランダム化コドンを有するオリゴヌクレオチドの集団由来の表面発現ライブラリーの生成について示す。そのオリゴヌクレオチドは10のコドンの長さを有し、M13遺伝子VIIIベースの表面発現ライブラリーを生成させるために、単一のベクター種にクローン化する。この実施例はまた、リガンド結合タンパク質のペプチドの選択およびそのコードされた核酸配列の特性決定についても述べる。
オリゴヌクレオチドを実施例Iに記載されたようにして合成した。合成器を、表IX に示す配列を合成するようにプログラムした。これらの配列は、ベクターのリーダー配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの合成された第1ランダムコドン位置および3’フランキング配列に相当する。相補性配列は、オリゴヌクレオチドの合成された集団の挿入突然変異誘発に用いられる。
単一のオリゴヌクレオチド集団から(すなわち右半分および左半分のオリゴヌクレオチドを結合させることなしに)表面発現ライブラリーを生成させるのに使用されるベクターについて以下に説明する。このベクターは、遺伝子VIII−ペプチド融合タンパク質の合成を誘導するM13ベースの発現ベクター(図4)である。このベクターは、実施例Iの右半分および左半分のベクターを結合したものが示すすべての機能を示す。
M13IX30表面発現ライブラリーの構築は、上記のオリゴヌクレオチドを、連結法によらずに変異誘発法でM13IX30に挿入することを除いて、サブライブラリー構築について実施例Iに記載したのと同じにして行う。このライブラリーは、MK30−3(BMB)上に構築して増殖させ、次にXLI細胞の感染およびスクリーニングに用いるファージのストックを製造する。表面発現ライブラリーをスクリーニングし、次いで実施例Iに記載したのと同様にして、コードしているオリゴヌクレオチドの特性を決定する。
右半分と左半分の縮重オリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離と特性決定
この実施例は、縮重オリゴヌクレオチドの表面発現ライブラリーの構築と発現を示す。この実施例のコードされたペプチドは、2つの別個のオリゴヌクレオチド集団を混合し、結合させることによって生成する。またペプチドリガンドの単離と特性決定および特定の結合タンパク質に対するそれらの対応するヌクレオチド配列も説明する。
左半分の縮重オリゴヌクレオチドと右半分の縮重オリゴヌクレオチドの集団を、実施例Iに記載した標準の自動化した方法を用いて合成した。
先に記載したベクターの修飾形を、右半分と左半分のサブライブラリーを構築するのに使用した。左半分のサブライブラリーの構築は、M13ED03と命名されるM13ベースのベクター中で行った。このベクターは先に述べたM13IX30ベクターの修飾形であり、M13IX30とM13IX22の両者の必須の特徴をすべてもっている。M13ED03は、野生型とプソイド野生型の遺伝子VIIIに加えて、発現に必要な配列、および右半分のオリゴヌクレオチドサブライブラリーと結合するための2つのFOK I部位をもっている。それ故に、このベクターは、単一オリゴヌクレオチド集団からの表面発現ライブラリーの生成と発現を行うのに使用できるか、または1つのサブライブラリーと結合して、右半分と左半分のオリゴヌクレオチドの集団と結合して1つの表面発現ライブラリーとすることができる点で、先に述べた両方のベクターの利点を兼ね備えている。
サブライブラリーを、オリゴヌクレオチドの縮重集団の先に記載したものの各々について構築した。オリゴヌクレオチドの左半分の集団をM13ED03.Lに組み込んでサブライブラリーM13IX421.Rを生成させた。各オリゴヌクレオチド集団を、実施例Iに記載した部位特異的変異誘発法を用いてそれぞれのベクターに組み込んだ。簡単に述べれば、縮重コドン配列に隣接するヌクレオチド配列は、組み込み部位においてベクターと相補的であった。ヌクレオチドの集団は、一本鎖のM13ED03ベクターまたはM13IX421ベクターとハイブリダイズし、T4 DNAポリメラーゼによって延長し、二本鎖環状ベクターを生成した。変異体の鋳型は、Kunkelらの前記文献に記載されているのと同様にして生体内ウリジン選択法で得た。各ベクター集団は、実施例Iに記載されているようにして、エレクトロポレーションに付して宿主細胞に導入し、増殖させた。
左半分のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの生成
この実施例は、左半分のランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーの合成と構築を示す。
Claims (7)
- 発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第1および第2オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
- 発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
- 所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、複数のベクター。
- 所望の偏りのランダムコドン配列を有する2つ以上のオリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、物質の組成物。
- 所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドを含有するベクターの多様な集団を構築する方法であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程を包含する、方法。
- ランダムペプチドの集団由来の結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって:
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程;
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;および
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
を包含する、方法。 - ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって:
(a)所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程;
(b)該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程;
(c)該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程;
(d)該ペプチドをコードする核酸を単離する工程;および
(e)該核酸の配列を決定する工程;
を包含する、方法。
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