JP2005229874A - Ｂａｇ３ドメインポリペプチド及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【課題】
マウスＢＡＧ３ドメイン領域を正確に特定し、当該ドメインの立体構造を決定してその構造と機能との関係を明らかにする。
【解決手段】
マウスＢＡＧ３ドメインを形成する特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドの製造方法、及び当該ポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニング方法等を提供する。
【選択図】
なし

Description

本発明はＢＡＧタンパク質ファミリーの機能ドメインを形成するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた化合物のスクリーニング方法等に関する。より詳しくは、マウスＢＡＧ３タンパク質が有する保存されたモチーフであるＢＡＧドメインポリペプチド及びその用途に関する。
アポトーシスは生物の体内で起こる非常に重要なメカニズムである。生物の発生過程では多くの細胞が細胞死することによって、個体の複雑な形態が作られていくが、このような細胞死は遺伝的に決められた発生スケジュールに従って起こるものであり、「プログラム細胞死」と呼ばれる。一方、外的ストレスや癌細胞、感染細胞に対する生体防御の目的でもアポトーシスが起こる。何らかの要因でこの機構が正常に働かなくなると、様々な疾患が引き起こされる。アポトーシスが起こらなくなることによる疾患としては、ＤＮＡ損傷を引き金とした癌化や、自己反応性のリンパ球除去システムが不完全となることで起こる自己免疫疾患等が挙げられる。また、過剰にアポトーシスが起こることによって発症するものとしては、神経細胞の過剰なアポトーシスに起因する神経変性疾患等が挙げられる。今後アポトーシスによる様々な疾患の原因解明や治療法の開発にアポトーシスの分子機構解明が必要である。またアポトーシスの調整を行うことで様々な疾患の治療が可能となる。
アポトーシスは、アポトーシス機構に関与する様々な遺伝子産物によって生ずる多様なシグナルにより制御されている。これらの遺伝子産物の機能を刺激するものとしては、細胞外及び細胞内シグナルの両方を含む。アポトーシスを抑制する生理的な刺激は、例えば、種々の成長因子、細胞外マトリクス、ＣＤ４０リガンド、ウイルス遺伝子産物、中性アミノ酸、エストロゲン及びアンドロゲン等が挙げられる。一方、アポトーシスを促進する刺激としては、例えば、ＴＮＦ、Ｆａｓ、ＴＧＦ−β、神経伝達因子、成長因子の除去、細胞外マトリクスの消失細胞内カルシウム及びグルココルチコイド等が挙げられる。これらの多様な刺激は細胞内タンパク質の複雑な相互作用を通じ、最終的にはカスパーゼと呼ばれるタンパク質分解酵素の活性化とＤＮＡの断片化を伴う共通したメカニズムによって細胞死の経路に導かれる。
このようなアポトーシス機構に関与するシグナル伝達系の１つのタンパク質として、ＢＡＧタンパク質ファミリーが知られている。ＢＡＧ１タンパク質は、当初はＨｓｐ７０結合タンパク質ファミリーの１つとして見出されたものであり、「ＢＡＧドメイン」と呼ばれる保存されたＣ末端領域を有するタンパク質である（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）ＢＡＧ１タンパク質の有する様々な機能については今までに多くの研究がなされているが、主に細胞増殖と抗アポトーシス活性が挙げられる。ＢＡＧ１タンパク質にはｈｓｃ７０とＲａｆ１が競合しながら結合しており、Ｒａｆ１がＢＡＧ１と解離してＨｓｃ７０が結合するとＤＮＡ合成や細胞増殖が阻害されることから、Ｒａｆ１又はＨｓｃ７０の結合がそれぞれ細胞増殖又はストレス時における増殖休止の切り替えを行っているものと考えられる。一方、Ｈｓｐ７０／ＢＡＧ１ヘテロ複合体がＢｃｌ−２のコンフォメーション変化を誘導して抗アポトーシス活性を促進していることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
上記ＢＡＧドメインを有するＢＡＧタンパク質ファミリーについての研究の進展によって、ヒトのＢＡＧタンパク質ファミリーには６つのファミリーが存在することが明らかになった。これらのＣ末端側には共通のドメイン（ＢＡＧドメイン）が存在しており（ＢＡＧ５タンパク質にはＮ末端側にも存在している）、このドメインについてはＨｓｃ７０との結合が報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。ヒトＢＡＧ３タンパク質はＨｓｃ７０に結合するものとして単離され、ＥＧＦの刺激による細胞増殖に関わっているとの報告がなされている（例えば、非特許文献２参照。）。
ところで、アポトーシスや細胞増殖のような極めて複雑なメカニズムにおいて、ＢＡＧタンパク質ファミリーの役割を解明し、ＢＡＧタンパク質ファミリーによるシグナル伝達系を調節しうるような医薬品の開発を行うためには、上記ＢＡＧドメインの立体構造を明らかにして、相互作用するタンパク質との結合様式やこれらの結合を阻害する化合物を見出すことが必要である。すなわちＢＡＧタンパク質ファミリーのように、共通のドメイン（ＢＡＧドメイン）が存在する場合には、それぞれのタンパク質による特徴的な機能を理解するためには、それぞれのＢＡＧドメインによる立体構造の微妙な違いを明らかにし、これらの構造と機能との関係を明確にすることが重要である。
しかしながら、構造解析に適したドメインを発現させるためにはドメイン境界の位置に関する情報が必要である。一般に、このドメイン境界はアミノ酸配列の相同性等を手がかりとして予測されるが、予測されたドメイン領域のアミノ酸配列に基づいてポリペプチドの発現を行っても実際に構造をとる（フォールドする）ドメインを形成する確率は非常に低く、このことがタンパク質立体構造解析の障害の一つとなっている。現在のところＢＡＧタンパク質ファミリーの中で立体構造が明らかにされたＢＡＧドメインはＢＡＧ１（ＰＤＢ ＩＤ １１６Ｚ）及びＢＡＧ４（ＰＤＢ ＩＤ ＩＭ６２）のみであり、ＢＡＧ３タンパク質のＢＡＧドメインについては未だ知られていない。
米国特許出願公開第２００３／０１７５９５８号明細書 Takayama and Reed, Nature Cell Biology 3, 237-241 (2001) Doong, H. et al., Oncogene, 2000, 19, 4385-4395
本発明は上記のような技術的背景においてなされたものであって、マウスＢＡＧ３ドメイン領域を正確に特定し、当該ドメインの立体構造を決定してその構造と機能との関係を明らかにすることを目的とする。
即ち、本発明は以下のようなＢＡＧ３ドメインを形成するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドの製造方法、及び当該ポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニング方法等を提供する。
（１）配列番号２、４及び６の何れか一つに示したアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド又はその塩。
（２）配列番号４に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドのＮ末端から１〜１７個の任意のアミノ酸残基が欠失したことを特徴とするポリペプチド又はその塩。
（３）配列番号２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列領域が３重へリックスバンドルを形成することを特徴とするポリペプチド又はその塩。
（４）（１）、（２）又は（３）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウスＢＡＧ３ドメインと実質的に同一のアポトーシス抑制機能、又は細胞増殖阻害機能を有するポリペプチド又はその塩。
（５）（１）〜（４）に記載されたポリペプチドのいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（６）配列番号１、３及び５の何れか一つに示した塩基配列からなる（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチドを産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（８）（７）に記載の発現ベクターを含んでなる形質転換細胞。
（９）（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチドに対する抗体。
（１０）（８）に記載の形質転換細胞を培養し、ポリペプチドを発現させる工程を含む、（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチド又はそれらの塩の製造方法。
（１１）無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチド又はそれらの塩の製造方法。
（１２）宿主細胞内においてＢＡＧ３ドメインを発現させる工程を含み、当該ＢＡＧ３ドメインが当該細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
（１３）前記ＢＡＧドメインが（１）〜（５）の何れか一つに記載のポリペプチドである（１２）に記載の方法。
（１４）（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチドの立体構造に関する情報を用いて、配列番号２に示したアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる構造未知のポリペプチドのホモロジーモデリングを行い、前記構造未知のポリペプチドの立体構造を推定する方法。
（１５）前記構造未知のポリペプチドがヒトＢＡＧ３ドメインである（１４）に記載の方法。
（１６）ＢＡＧ３ドメインポリペプチドの立体構造に関する情報を用いて、前記ポリペプチドのリガンド結合部位を決定する工程と、当該結合部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含むことを特徴とする、ＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物のスクリーニング方法。
（１７）前記リガンドが、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０、Ｒａｆ１又はそれらのホモログである（１６）に記載の方法。
（１８）前記ＢＡＧ３ドメインポリペプチドが（１）〜（４）の何れか一項に記載のポリペプチド、（１５）に記載の方法により推定されたヒトＢＡＧ３ドメイン、又はそれらの一部である（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９）（１６）、（１７）又は（１８）に記載の方法により特定された化合物を候補化合物として用意し、（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチドと前記候補化合物とを接触させる工程と、前記ポリペプチドと候補化合物とが相互作用するかどうかを確認する工程とを含むことを特徴とするＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物のスクリーニング方法。
（２０）アポトーシス活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法が、（１６）、（１７）又は（１８）に記載の方法により特定された化合物を候補化合物として用意し、（１）〜（４）の何れか一つに記載のポリペプチドと、Ｈｓｃ７０と、前記候補化合物とを接触させる工程と、前記候補化合物が、前記ポリペプチドとＨｓｃ７０との結合を阻害するか否かを検出する工程とを含み、前記ポリペプチドとＨｓｃ７０との結合を阻害する物質がアポトーシス活性を調節することを特徴とするスクリーニング方法。
（２１）細胞増殖活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法が、前記細胞増殖活性の測定に適した条件において候補化合物の存在又は非存在下で（８）に記載の形質転換細胞を培養し、前記形質転換細胞の増殖活性を測定することを含む方法。
（２２）前記候補化合物が、（１６）〜（１９）の何れか一つに記載の方法により得られた化合物である（２１）に記載の方法。
本発明はマウスＢＡＧ３ドメインの構造を初めて明らかにしたものであり、特に、ＢＡＧ３ドメインの立体構造を決定することにより、そのドメイン構造と機能との関係を明らかにし、ＢＡＧ３タンパク質による細胞内シグナル伝達機能の解明に新たな知見を与え、医薬品等の開発（例えば、ラショナルドラッグデザインやバーチャルスクリーニングによる開発）に寄与するものである。また、本発明のスクリーニング方法により得られたＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物は、細胞のアポトーシス活性を調節する薬剤や、ガン細胞の増殖阻害剤として、種々の疾患の予防や治療に用いられる。
（本発明のポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、立体構造をもったドメインを形成するポリペプチドである。本発明は、より具体的には、配列番号２、４及び６の何れか一つに記載されるポリペプチド、又は配列番号４に示したアミノ酸配列のＮ末端から１〜１７個の任意のアミノ酸残基が欠失したポリペプチド（これらを「マウスＢＡＧ３ドメインポリペプチド」と称する場合もある。）に関する。また、本発明は、配列番号２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列領域が３重へリックスバンドルを形成することを特徴とするポリペプチド、さらに上記各ポリペプチドにおいて、１若しくは数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウスＢＡＧ３ドメインと実質的に同一のアポトーシス抑制機能、又は細胞増殖阻害機能を有するポリペプチドに関する。本明細書においては、上記各ポリペプチドを総称して「本発明のポリペプチド」と称する。
以下、本発明のポリペプチドの構造や機能などについて説明する。
本発明において、「ＢＡＧドメイン」とは、ＢＡＧタンパク質に共通して存在する相同性の高い約８０〜１００アミノ酸残基からなるポリペプチドをいう。ＢＡＧタンパク質は真核生物においてよく保存されており、脊椎動物、昆虫、線虫、酵母及び植物で相同性を有する。ヒトのＢＡＧタンパク質ファミリーは、ＢＡＧ１、ＢＡＧ２、ＢＡＧ３（Ｂｉｓ）、ＢＡＧ４（ＳＯＤＤ）、ＢＡＧ５及びＢＡＧ６を含む。ＢＡＧタンパク質は多様なＮ末端領域を有するが、Ｃ末端側には共通のドメイン（ＢＡＧドメイン）を含み、これらのＢＡＧドメインはＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０のＡＴＰａｓｅドメインと結合してこれらの分子シャペロンの働きを調節している。これらの保存されたＢＡＧドメインはＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０と結合するために必要であるが、ＢＡＧタンパク質ファミリーによってその大きさはかなり異なり、例えば、ＢＡＧ１タンパク質のＢＡＧドメインに比べてＢＡＧ４タンパク質のそれはかなり小さいことが報告されている。
また、本発明において「３重へリックスバンドル」とは、３本のα‐へリックスが反平行に束ねられ、２つのループを介して連結された立体構造のことである。図１（ａ）は、本発明により明らかとなったマウスＢＡＧ３ドメインの主鎖の立体構造を示すリボン図である。３本のへリックスはすべて同じ長さではなく、特に２番目のへリックスの長さがＣ末端側で短く、３番目のへリックスとの間は伸びたループで連結される。この領域はタンパク質間相互作用に重要な残基が保存されており、上記ＢＡＧドメインに共通して認められる構造である。しかしながら、それぞれのへリックスを構成するアミノ酸残基の長さは各ＢＡＧタンパク質によって異なり、本発明のＢＡＧ３ドメインは、ＢＡＧ１ドメインに比べて第一へリックスのＣ端側と第二へリックスのＮ端側でヘリックスが短くなっている。また、それぞれのＢＡＧドメインを構成する側鎖のアミノ酸残基の種類により、Ｈｓｃ７０との結合部位の構造も微妙に異なると考えられる。
なお、本発明のポリペプチドの機能としては、例えば、アポトーシス抑制機能、及び細胞増殖阻害機能を挙げることができる。ＢＡＧタンパク質ファミリーの有する保存されたＣ末端領域（ＢＡＧドメイン）はＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０のＡＴＰａｓｅドメインと結合し、そのシャペロン活性を調節することが知られている。ＢＡＧタンパク質の他のドメインは他のタンパク質との相互作用に関与する。例えば、ＢＡＧ１はＢｃｌ２やレチノイン酸受容体と相互作用し、これらをＨｓｃ７０／Ｈｓｐ７０と相互作用させることによってコンフォメーションの変化を誘導して機能を調節する。一方、ＢＡＧ４タンパク質はＨｓｃ７０を腫瘍壊死因子受容体１やデスレセプター３と相互作用させると推測されている。従って、ＢＡＧタンパク質の種類によって様々な細胞内のシグナル伝達機能を担っていることが示唆される。
本明細書の実施例に示したように、本発明のポリペプチドについても細胞内で発現させるとアポトーシスを抑制することから、ＢＡＧ１タンパク質と同様にアポトーシス調節機能を有することが理解される。ＢＡＧ３タンパク質はＥＧＦの刺激による細胞増殖に関わっているとの報告がされているが（Doong, H. et al., Oncogene, 2000, 19, 4385-4395）、本明細書の実施例において示されるように、本発明のポリペプチドを種々の細胞内で発現させると細胞増殖活性が阻害されることが分かった。これらの結果は、ＢＡＧ３タンパク質は本来、細胞増殖を調節する役割を果たしており、ＢＡＧ３ドメインのみを細胞内で発現させることによって、ＢＡＧ３タンパク質本来の機能が阻害され、細胞増殖が抑制されるのではないかと考えられる。このように、本発明のポリペプチドは、アポトーシス調節機能及び細胞増殖抑制機能を有することから、細胞内でのシグナル伝達機構を調整する重要な役割を果たしており、少なくともこれらの機能を調節する薬物のスクリーニングへの利用や、立体構造情報を利用しての薬物の最適化、および細胞の分化誘導や細胞増殖機能を阻害する抗がん剤として有効に用いられ得る。
（本発明のポリペプチドの配列）
本発明のポリペプチドの配列決定に関しては、ｉ）公知のタンパク質配列情報に基づき、対象とする機能を有するドメイン領域を推定した後、ii)その推定ドメイン領域のアミノ酸配列を基本パターンとするドメイン候補配列パターンを用意し、iii)各配列パターン毎にポリペプチド発現を行い、得られたドメインを形成するポリペプチドの構造安定性評価により、良好な結果を示すものを目的ドメインとし、この目的ドメインのアミノ酸配列により各ポリペプチドを定義する。即ち、本発明のポリペプチドは、全長タンパク質中のある一部分（目的とする機能を有する）を断片化してドメインを形成するポリペプチドとして発現させた時に、安定な構造を有するものを経験的に選別したものであり、ドメイン領域予測の段階では数１００のオーダーで存在するドメイン候補が、種々の要因により絞り込まれて実際は１０〜数１０のオーダーまで厳選される。従って、このように選別されたポリペプチドを、立体構造解析に用いることにより、高精度で且つ信頼性に優れた構造解析を行うことが可能となる。
（ドメイン領域の推定）
全長タンパク質中のドメイン領域を推定する手法としては、バイオインフォーマティクスなどの情報科学的な手法や計算科学的な手法（特願2001‐309434号明細書参照）、deleted ＤＮＡライブラリーとＧＦＰの組み合わせ（特開2002-262873号公報参照）、プロテアーゼによる限定分解などの実験的な手法等、いずれも利用可能であり、特に限定されるものではなく、より精度の高い手法を用いることにより、ドメイン候補群から目的ドメインを選び出す作業効率が向上する。
（ドメイン候補配列パターンの作製）
上記ドメイン候補配列パターンは、上述のように推定されたドメイン領域を基準にしてドメイン境界の位置をＮ末端側又はＣ末端側に伸ばしたり縮めたりすることにより作製される。
例えば、推定ドメイン領域のＮ末端側のドメイン境界におけるアミノ酸残基の位置より、Ｎ末端側に数から数十残基分伸長させた、又はＣ末端側に数から数十残基分短縮したおよそ数十種類の境界を新たに設け、それらの境界をＮ末端とするドメイン候補配列パターンが用意される。同様に、推定ドメイン領域のＣ末端側のドメイン境界においても数種類のドメイン境界を選定し、各境界をＣ末端とするドメイン候補配列パターンが作製される。
（ドメイン境界の伸縮）
上記推定ドメイン領域のドメイン境界を伸縮させる方法としては、例えば上記ドメイン候補配列パターンに対応したｃＤＮＡを作成できるＰＣＲプライマーを個々に合成して、ＰＣＲにより作成する方法が挙げられ、特に特開2003-9880号公報に示される２段階ＰＣＲ法が好適である。
（ドメイン候補配列パターンからの目的ドメインの抽出）
このようなドメイン候補配列パターンから実際に安定な立体構造を有する目的ドメインを選び出すためには、まず上述のようにして作製されたドメイン候補配列パターンのｃＤＮＡを用いてそれぞれタンパク質合成を行う。
このドメイン候補配列パターンの発現系としては、特に限定されず、従来より公知の発現系がいずれも使用可能である。
次に、得られたポリペプチドが実際に安定な立体構造をとっているかどうかを判定し、立体構造を有することが確認できたものを本発明におけるポリペプチドとして採用する。
このポリペプチドの立体構造の安定性の指標としては、例えば合成されたドメインポリペプチドが可溶性ポリペプチドとしてＳＤＳゲル電気泳動等により検出され、かつ適当な分子量相当な均一なバンドとして検出されるかという生化学的指標や、Ｃ末端側に融合させたＧＦＰの蛍光強度、ＮＭＲスペクトル、ＣＤスペクトルなどの分光学的手法等が挙げられる。
従来のポリペプチドの配列決定の過程では、例えば[１]上記ポリペプチド合成で、目的とするドメインを形成するポリペプチドが発現しない、或いは[２]発現はしたものの、凝集を起こす、溶解度が低い等の問題があった。本発明者らは、このような問題点を克服し、本発明を完成させるに至った。
（安定な立体構造を有することの確認）
上記ＮＭＲスペクトルにおいてドメインを形成するポリペプチドのフォールディングの判定を以下に示す。
１Ｄスペクトルにおいて、ドメインを形成するポリペプチドがフォールドしていない場合はVal、Leu、Ileなどのメチル基プロトンに由来するシグナルが０．８ｐｐｍ付近に観測される。しかしフォールドしている場合はメチル基プロトンの環境が変化し、シグナルが高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）にシフトする。
1Ｈ-15ＮＨＳＱＣにおける判定は、クロスピーク収束度合いとシグナル強度の均一性の評価を目視により行うことが挙げられる。すなわち、クロスピークが密集した場合は、立体構造を形成していない状態とし、逆に分散した場合は安定な立体構造を形成している状態として立体構造の安定性の評価を行う。
（本発明のポリヌクレオチド）
また、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドの両方をいい、それらは修飾されていてもよい。例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ及びそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定されない。「本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリペプチドをコードし得る限り、遺伝暗号の縮退に基づく任意の塩基配列を選択することができ、このようなポリヌクレオチドとしては、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含まれる。一旦ポリヌクレオチドの塩基配列が確定すると、その後は化学合成によってこのポリヌクレオチドを得ることができる。これらのポリヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。または当該ポリヌクレオチドが由来する遺伝子の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとして、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの全部又は一部を鋳型としたＰＣＲによって特定の遺伝子に由来するポリヌクレオチドを得ることができる。
（ベクター）
本発明の（組換え）ベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpRSET、pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、 pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、 YEp24、 YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のポリヌクレオチドは、それがコードするポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（形質転換細胞）
本発明の形質転換細胞は、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。簡便で効率が良いことから多くの場合、ベクターを用いて形質転換が行われる。ここで、宿主としては、本発明のポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のポリヌクレオチドを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153,163-168)等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
（抗体）
本発明のポリペプチドを抗原として用いて、その抗原に対する抗体を調製することができる。
[本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製]
前記の抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて100〜500μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなどの非ヒト哺乳動物）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜60日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA；enzyme-linked immunosorbent assay)、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
[タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製]
上記抗原を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり50μgである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜3週間間隔で、最低2〜3回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
[細胞融合]
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む) で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはP3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを15:1〜25:1の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在のもとで、あるいは電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。
[ハイブリドーマの選別及びクローニング]
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay)、RIA (radioimmuno assay)等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
[モノクローナル抗体の採取]
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％牛胎児血清含有 RPMI-1640培地又はMEM 培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件 (例えば37℃、５％ CO2濃度) で3〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
（本発明のポリペプチドの製造）
本発明のポリペプチドは、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
（無細胞タンパク質合成系を用いるドメインを形成するポリペプチドの製造方法）
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは無細胞タンパク質合成系を用いて製造することができる。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。「無細胞タンパク質合成系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、及びＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む。無細胞タンパク質合成系は、系を容易に改変することができるため、目的のタンパク質に適した発現系を構築しやすいという利点がある。なお、無細胞タンパク質合成系の詳細については、特許公開２０００−１７５６９５号などに記載されている。
[細胞抽出液]
粗細胞抽出液は、細菌（例えば大腸菌等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であってもよい（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
粗細胞抽出液はリボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含むことが好ましい。粗抽出液の調製は、例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載の方法を使用できる。具体的には、フレンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら、上掲）やグラスビーズを用いた破砕によって行うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ株から既知の方法、例えばＰｒａｔｔら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。細胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血球由来のものが使用される。
[透析装置]
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えばDispo Dialyzer（登録商標）（Spectrum社製）やSlidealyzer（登録商標）（Pierce社製）が挙げられる。
また、大スケール反応用装置としては、Spectra/Por（登録商標）透析用チューブ（Spectrum社製）を例示できる。
[透析内液]
無細胞タンパク質合成系における透析内液（すなわち、タンパク質合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴＰ（アデノシン５'−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５'−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５'−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５'−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含んでもよい。
その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３'，５'−ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。一方、透析外液（すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、塩類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
[緩衝液]
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌（回転攪拌など）し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することができる。温度および攪拌速度などの反応条件は、タンパク質の種類に応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃であるが、高度好熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。
また、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のタンパク質の生成を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
上記無細胞タンパク質合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが好ましい。また、透析膜の分子量限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場合には、タンパク質の生産量をさらに高めることができる。
[ポリペプチドの精製]
生成ポリペプチドの精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法は、ポリペプチドの性質に応じて従来公知のものを単独にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げることができる。この精製工程の間又は後においてプロテアーゼ処理により、精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。生成タンパク質の同定および定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
（立体構造解析）
ポリペプチドの立体構造は、ＮＭＲによる構造解析、Ｘ線構造解析などによって解析することができる。
（ＮＭＲ）
ＮＭＲに用いる試料としては、特に限定されるわけではないが、好ましくは、タンパク質中の１２Ｃ、または１４Ｎを１３Ｃ、１５Ｎ核で安定同位体標識した試料を用いる（多核多次元ＮＭＲ測定）。タンパク質を安定同位体標識する技術は慣用技術であり、例えば、Clore,G.M.& Gronenborn,A.M.,Science,252,p.1390-1399,1991等の文献に記載されている。特に、主鎖１５Ｎ均一安定同位体標識したタンパク質試料を用いた解析が容易であり好ましい。また、タンパク質の主鎖の骨格を、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈのうち少なくとも２種類以上の同位体標識したものを使用してもよい（特表２００１−５１４２３９）。
好ましくは、ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトルの観測等による１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数の測定を行う。「ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトル」とは、準位相、反位相の２つのＨＳＱＣスペクトルを同時に観測し、両者のスペクトルの足しあわせをすることにより、シグナルのオーバーラップを防いで、効果的に１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数を読みとるための測定法である。
２種類以上のＮＭＲ法により化学シフト帰属が行われる。例えば、２次元ＮＭＲとしては２Ｄ、ＤＯＱ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ等、多次元ＮＭＲとしては、ＨＮＣＯ、ＨＣＡＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＣＡ（ＣＯ）Ｎ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＨＢ、ＣＢＣＡＮＨ、Ｈ（ＣＡ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＡＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＡＣＯＮ、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ等が公知技術として知られている。ＮＭＲの一般的手法は周知であり、例えば、「タンパク質のＮＭＲ」（共立出版、１９９６、荒田洋治）；「日本生化学会編 基礎生化学実験法 第３巻 タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」第１８章ＮＭＲによる立体構造解析（東京化学同人、２００１年２月）；伊藤隆ら、日本農薬学会誌２１，ｐ．４５０−４５９、１９９６；田中俊之、化学と工業 第４９巻 第２号 ｐ．１５５−１５８、１９９６等に詳述されている。
立体構造解析にＮＭＲを用いる場合、タンパク質の各プロトン間の核オーバーハウザー効果の大きさから各プロトン間の距離を見積もり、その距離情報に基づき立体構造を決定する方法が一般的である。化学シフト値、スカラーカップリング値、残余双極子カップリング値、水素結合等の情報を加えて立体構造を精密化することも可能である。
ＮＭＲデータから構造解析を行うための多くのプログラムが周知である。好ましくは、化学シフト帰属のためのものとして、ＮＭＲ Ｐｉｐｅ、ＰIＰＰ、Ｃａｐｐ、Ｆｅｌｉｘ、ＮＭＲ Ｖｉｅｗ、ＸＥＡＳＹ、立体構造計算ソフトとしてＸ−ＰＬＯＲ、ＣＮＳ、ＤＹＡＮＡ、ＤＹＮＡＭＯ等を用いて構造解析を行う。
（Ｘ線結晶構造解析）
立体構造解析にＸ線結晶構造解析を用いる場合、結晶化させたタンパク質のＸ線回折像に基づき電子密度図を計算し、立体構造を決定する。すなわち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像をもとに、該蛋白質の３次元構造を明らかにしていくものである（Blundell,T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY,1-565頁，(1976) Academic Press, New York)。
（ホモロジーモデリングによる立体構造予測）
一般的にタンパク質の立体構造は、一次構造（アミノ酸配列）より進化的に保存されやすいと考えられている。２つのタンパク質のアミノ酸配列の相同性が３０％以上であれば、それらの立体構造も類似している可能性が高い。従って、本発明のポリペプチドの立体構造情報を用いて、アミノ酸配列の類似するポリペプチドの立体構造を予測することができる。「ホモロジー（相同性）」とは、２つのポリペプチド部分間における類似性のパーセントを意味する。パーセント配列同一性は、配列を整列させ、当該整列させた２つの配列間でマッチングしている正確な数を数え、より短いほうの配列の長さで割り、その結果を１００倍することにより、２つの分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。このような分析を支援するためのコンピュータプログラムは容易に入手可能であり、例えば、ＡＬＩＧＮ(Dayhoff, M.O. et al)、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等が挙げられる。例えば、ヒトＢＡＧ３、及びＢＡＧ５ドメイン等の構造未知のポリペプチドと本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をアライメントし、本発明のポリペプチドをテンプレート構造として構造未知のポリペプチドの全原子をモデリングする。主鎖原子の座標はできるだけテンプレート構造を使い、挿入された配列の主鎖構造は新たに作成する。続いて側鎖原子の分子モデリングを行うことによって構造未知のポリペプチドの立体構造を推測することができる。
（立体構造情報に基づくスクリーニング方法）
次に、本発明は、本発明のポリペプチドの立体構造に関する情報を用いて、前記ポリペプチドのリガンドとの結合部位を決定する工程と、当該結合部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で探索する工程とを含む、ＢＡＧ３ドメインポリペプチドと相互作用する化合物のスクリーニング方法をも提供する。
本発明のポリペプチドのリガンドとしては、いわゆる分子シャペロンとしてタンパク質のフォールディング反応に関与するＨｓｐ７０ファミリーが挙げられる。哺乳類の細胞質に構成的に存在するＨｓｐ７０ファミリーはＨｓｃ７０(heat shock cognate protein 70、熱ショック関連タンパク質７０)（Ｈｓｃ７３）である。これに対して、一部の組織や器官、培養細胞等では誘導型のＨｓｐ７０（Ｈｓｐ７２）も存在している。細胞内の各コンパートメント（細胞質、小胞体、ミトコンドリア）にそれぞれメンバーが存在する。これらの各メンバーのことをホモログ（相同体）と称する場合がある。Ｈｓｐ７０ファミリーは、不安定なタンパク質の疎水性領域に結合してシールドし、互いに凝集しないようにする役割をもつ。Ｈｓｐ７０ファミリーにはＡＴＰａｓｅ活性があり、Ｈｓｐ４０等のコシャペロン依存的に標的タンパク質との結合、解離を繰り返しながら、その本来あるべき立体構造形成を促進する。タンパク質の折れたみ、オルガネラへのタンパク質輸送、複合体の会合、解離、変性タンパク質の修復、分解等の局面に関与している。また、Ｒａｆ１やＢｃｌ２等と相互作用して細胞増殖やアポトーシス等のシグナル伝達系を調節している。
（インシリコ スクリーニング）
分子の３次元構造に基づく薬物設計、いわゆる分子シミュレーションについては、医薬品の開発・第７巻「分子設計」（廣川書店）をはじめとして数多くの総説がある。具体的には、第一に、ターゲットとなるタンパク質又はポリペプチドのリガンド結合部位を発見する。リガンドの形状は、一般にタンパク質のリガンド結合部位の形状と立体構造的に相補的である傾向があるから、リガンドが結合するような幾何学的に特徴（溝、凹部）のある部位を探索することが、リガンド結合部位の候補発見として有効である。あるいは、リガンドとの複合体として構造が決定された類似のタンパク質との相同性から推測することができる。タンパク質の立体構造を比較するプログラムは種々のものが公知である（例えば、FSSP,http://www2.ebi.ac.uk/dali/fssp/、 DALI,http://www2.ebi. ac.uk/dali/ 、MATRAS, http://spock.genes.nig.ac.jp/~takawaba/Matras.html等）。
次に、GOLD、FlexX等のフレキシブルリガンドドッキングシミュレーションソフトウエアを用いて、Oracle等のリレーショナルデータベースに格納された低分子（分子量500以下）化合物のライブラリー（たとえば約1000000種）をコンピュータでスクリーニングする。このライブラリー内の化学物質はCORINA等のプログラムで３次元構造を作成し、結合部位にはめ込める物質を選択することができる。選ばれた物質の中からSybylやMOE等の分子シミュレーションプログラムを用いて目視により更に詳細に結合状態を解析し化合物を絞り込む。一連の過程で利用されるコンピュータソフトウエアは、以下のようなものである（GOLD: Cambridge Crystallographic Data Centre; FlexX: Tripos Inc.; CORINA: Molecular Networks GmbH; Oracle: Oracle Corp.; Sybyl: Tripos Inc.; MOE: Chemical Computing Group Inc.）。
他の方法は、未知の物質を含めた候補化合物のコンピュータによる設計である。この方法には、メチル、エチル等の化学基をリガンド結合部位に並べて適合するものを探す方法と、原子をリガンド結合部位にコンピュータプログラムを用いて並べていく方法とが知られている。
（ウエットスクリーニング）
本発明のポリペプチドと相互作用する候補化合物の有力候補を選択するために、インシリコスクリーニングにより得られた候補化合物と本発明のポリペプチドと接触させ、本発明のポリペプチドの分子機能又は生理活性を測定する。候補化合物と本発明のポリペプチドの立体構造データをもとに候補化合物を修飾し、より望ましい構造とする。
絞り込まれた化合物を合成し、実際に前記ポリペプチドと作用させ、スクリーニングする。前記ポリペプチドの活性を変化させた化合物を、更に動物実験によってインビボでの活性や、体内動態、あるいは毒性等に関する試験を行う。
（インビトロスクリーニング方法）
インビトロでのスクリーニング方法としては、本発明のポリペプチドまたはその塩と候補物質とを接触させる工程と、前記ポリペプチドと候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む前記タンパク質と相互作用を有する化合物のスクリーニング方法が挙げられる。ここで、「相互作用を有する」とは、化合物とポリペプチドが結合して、そのポリペプチドの分子機能及び／又は生理活性を抑制または増強すること、などをいう。このスクリーニング方法においては、そのポリペプチドと候補物質を接触させて、そのポリペプチドの分子機能または生理活性が変化するか否かを測定する。
例えば、具体的な方法として、ＮＭＲを用いた相互作用物質探索、ビーズ等に固定したリガンドへの結合を遠心や溶出等によって調べるプルダウン解析やアフィニティークロマトグラフィー、さらに表面プラズモン共鳴（SPR: Surface Plasmon Resonance）を用いてリアルタイムに相互作用を解析する方法等がある。
相互作用物質探索にＮＭＲを用いる場合、候補物質の添加前後でのタンパク質のシグナル変化の有無により、相互作用の有無を判定することができる。すなわち、相互作用候補物質がタンパク質と相互作用する場合には、タンパク質の相互作用部位近傍に由来するＮＭＲシグナルの化学シフト値、線幅、個数等に変化が起きることが期待されるので、その変化を検出することで相互作用の有無を判定できる。特に15Nで標識したタンパク質は調製が比較的容易であり、そこから得られる15N-HSQCスペクトルは、分解能や感度が比較的高く、添加した相互作用候補物質由来のＮＭＲシグナルの影響を受けにくいため、その有用性は高い。
BIACORE（登録商標）はＳＰＲを測定原理として用い、生体分子間の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができる装置である。BIACOREを用いて本発明のＢＡＧ３ドメインと相互作用する分子をスクリーニングするためには、対象となる生体分子の一方をセンサーチップと呼ばれる表面に固定化し、これに作用する分子を含む試料をマイクロ流路系を介して一定の流速で送液する。２分子間の結合、解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化をＳＰＲシグナルとして検出し、このシグナルの経時変化をセンサーグラムと呼ぶグラフとして表示する。さらに、生体分子間の相互作用に関して、平衡状態における２分子間の親和性（解離定数Ｋｄあるいは親和定数Ｋａ）だけでなく、結合、解離反応の速さに関する情報、即ち結合速度定数ka、及び解離速度定数kdを得ることができるという特徴をもっている。ＢＡＧ３ドメインはＨｓｃ７０と相互作用することから、本発明のＢＡＧ３ドメイン及びＨｓｃ７０タンパク質の何れか一方をセンサーチップに固定化することによりこれらの相互作用を解析することができる。まず、センサーチップ上で本発明のＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０を結合させ、ランニングバッファーのみに切り替えたのち、種々の候補化合物を添加してこれらがＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０の解離を促進するか否かを観察することにより、ＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０と相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。以下の実施例において示されるように、本発明のＢＡＧ３ドメインはＨｓｃ７０と強く結合し、この相互作用を介してアポトーシスを抑制すると考えられるから、本スクリーニング方法によって得られたＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０との結合を阻害する物質は、その阻害作用の程度に応じてアポトーシス活性を調節し得ることが強く期待される。
（相互作用する物質を含む医薬）
本発明のポリペプチドと相互作用を有する物質は、そのポリペプチドが関与する疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。そのような医薬は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあたり0.01mg〜1000 mgの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
（配列の説明）
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
[配列番号１]
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（マウスＢＡＧ３タンパク質の４２４〜５０３）をコードするＤＮＡ配列を示す。
[配列番号２]
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（マウスＢＡＧ３タンパク質の４２４〜５０３）のアミノ酸配列を示す。
[配列番号３]
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（マウスＢＡＧ３タンパク質の４０６〜５０３）をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号４］
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（マウスＢＡＧ３タンパク質の４０６〜５０３）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号５］
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端にそれぞれアミノ酸残基ＧＳＳＧＳＳＧ、及びＳＧＰＳＳＧが付加されたポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号６］
ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端にそれぞれアミノ酸残基ＧＳＳＧＳＳＧ、及びＳＧＰＳＳＧが付加されたポリペプチド）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号７］
マウスＢＡＧ３タンパク質全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号８］
マウスＢＡＧ３タンパク質全長のアミノ酸配列を示す。
［配列番号９］
実施例３の第１次ＰＣＲで使用するプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１０］
実施例３の第１次ＰＣＲで使用するプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１１］
実施例３の第２次ＰＣＲで使用するプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１２］
実施例３の第２次ＰＣＲで使用するプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号１３］
実施例３の第２次ＰＣＲで使用するプライマーの塩基配列を示す。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実験例１］Bioinformaticsによるドメイン推定と評価
（１）ドメイン領域の推定
ドメイン領域の推定は以下の手順で行った。
まず、１）＜ＳＣＯＰ法＞問い合わせ配列が、タンパク質データベースＳＣＯＰ（Version1.55）に含まれる配列と相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はBLASTPを利用し、E-valueが0.1以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。
２）＜ＰＦＡＭ法＞問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰＦＡＭ（version7.1）に含まれる配列プロファイルと相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＨＭＭＥＲを利用し、E-valueが0.1以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。
３）＜ＰｒｏＤｏｍ法＞問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰｒｏＤｏｍ（2001年3月にWebより取得したバージョン）に含まれるコンセンサス配列のいずれかに対して相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＢＬＡＳＴＰを利用し、E-valueが0.1以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。
４）＜ＮＲ法＞問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（NCBI-nr）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、E-valueが0.1以下のヒットがあった場合、その相同性領域をグループとしてまとめ、ドメインとして予測した。
５）＜ＰＡＳＳ法＞問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（NCBI-nr）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、相同性が検出された頻度を計算した。頻度の高い部分を山、低い部分を谷として表示し、谷となっている部分でドメイン境界となるように、一つの山をドメインとして予測した。
６）＜Ｎｏ Ｈｉｔ法＞以上１）から５）までの方法のいずれを用いてもドメインとして検出されなかった領域（残余領域）をドメインとして予測した。
７）＜差分ドメイン境界設定法＞上記６つのドメイン予測について、ヒット領域が重なっている場合の優先順位は１）を最優先として、以下２），３），４），５），６）の順序とし、ヒット領域が重なっているものの、ドメイン境界のずれが30残基以上あり、かつ低い優先度での定義のほうがN末側あるいはC末側により長く存在している場合は、その差分の配列を別途ドメインとして予測した。
そして以上のいずれかの方法で推定されたドメイン領域のうち、Low-Complexity領域（複雑性の低い配列領域）を1箇所以上有するものや、全長３０残基に未満のものは、除外した。
配列番号８に示したマウスＢＡＧ３タンパク質全長アミノ酸配列について、４２６〜５０３をＰＦＡＭ法によりドメインと推定した。Low-Complexity領域（複雑性の低い配列領域）をもたず、全長も３０残基以上であるため、最終的に本領域をBioinformaticsによるドメイン推定の結果とした。
（２） 推定ドメインの発現
上記Bioinformaticsにより推定されたマウスＢＡＧ３タンパク質ドメイン（ここで、推定ドメインと称する。）について、後述の無細胞タンパク質合成系を用い、タンパク質合成反応を行った。その後、得られた試料について定法に従ってＳＤＳゲル電気泳動を行い、タンパク質の発現状態を調べたところ、推定ドメインのアミノ酸配列情報からは、何れも目的とするタンパク質の発現を行うことができなかった。
［実施例２］コンストラクトの製造
そこで、上記推定ドメインのアミノ酸配列を基準にして、マウスＢＡＧ３タンパク質のアミノ酸配列に対し、該推定ドメインのドメイン境界の位置をＮ末端およびＣ末端においてそれぞれ数残基ずつ伸ばしたり縮めたりしたコンストラクトを系統的に作成した。
即ち、以下の表１に示したようにＢＡＧ３タンパク質の４２６番目のアミノ酸残基を基準として、Ｎ末端側に１０又は２０残基伸長させ、またＣ末端側に１０残基短縮させたパターンと、ＢＡＧ３タンパク質の５０３番目のアミノ酸残基を基準として、Ｃ末端側に１０、２０又は３０残基伸長させたパターンを用意した。これらのコンストラクトを後述の実施例と同様の方法に従ってＰＣＲにより鋳型ＤＮＡを増幅し、無細胞タンパク質合成系にてそれぞれのタンパク質合成を試みた。その結果、表１に示したように、ＢＡＧ３タンパク質ではアミノ酸残基４０６〜５０３と、アミノ酸残基４０６〜５２３のコンストラクトのみ発現が認められた。実施例１で推定されたコンストラクトは発現しなかったことが分かる。発現が認められたポリペプチドを用いて１次元ＮＭＲと１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル測定により構造安定性を評価したところ、いずれのポリペプチドも１次元ＮＭＲスペクトルのメチル領域の高磁場側（０．７ｐｐｍ〜０．５ｐｐｍ付近）に高磁場シフトしたシグナルが認められ、また１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルには７ｐｐｍ〜９ｐｐｍにわたって分離したアミドプロトンのシグナルが認められた。これらの結果より安定した構造をとることが分かった。
Figure 2005229874
[実施例３]
本実施例では、上述のようにして作成したコンストラクトのうち、立体構造解析に用いて好適なＢＡＧ３ドメインを有するポリペプチド（４０６〜５０３）：（配列番号４）について検討した結果を説明する。
（１）発現ベクターの構築
[１] 第１次ＰＣＲ
マウスＢＡＧ３タンパク質をコードするｃＤＮＡ（DDBJ accession No. AK016510）がプラスミドpBluescriptII SK+にクローン化されたプラスミドを含む組換え大腸菌培養液を用いて、BAG3 domain FWプライマー：5'-CCAGCGGCTCCTCGGGAGCCCCTGCAGAACCT-3'（配列番号９）、BAG3 domain RVプライマー:5'-CCTGACGAGGGCCCCGATGCTTTCTGCTCAAGTTTTTC-3'（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成は、表２に示す通りとし、プログラムは、通常のＰＣＲのプロトコルに従った。
Figure 2005229874
[２] 第２次ＰＣＲ
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有するT7P-DM5-KH6プライマー：5'-GCTCTTGTCATTGTGCTTCGCATGATTACG AATTCAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCAGCGGCTCCTCGGG-3'(配列番号１１)とＴ７ターミネーター配列を有するT7T-DM3-Termプライマー：5'-CGGGGCCCTCGTCAGGATAATAATTGATTGATGCTGAGTTGGCTGC TGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATAACCTCGAGCTGCAGGCATGCA AGCTTGGCGA AGCACAATGACAAGAGC-3'（配列番号１８)、及びユニバーサルプライマーＵ２:5'-GCTCTTGTCATTGTGCTTCG-3'(配列番号１３)とを用いて、第２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成は、表３に示す通りとし、プログラムは上記第１次ＰＣＲと同様とした。
Figure 2005229874
この結果、Ｔ７プロモーターの制御下で、Ｈｉｓタグ配列とＢＡＧ３ドメインポリペプチド（４０６〜５０３）との融合タンパク質を発現することのできる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅できた。
[３] クローン化
上記第２次ＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ ＴＡ−クローニングキット（cloning kit） (インビトロジェン（invtrogen）社) により、ベクターｐＰＣＲ２．１（インビトロジェン社）にクローン化することにより、発現ベクターｐＰＣＲ２．１を構築した。
（２）ＢＡＧ３ドメインポリペプチド（４０６〜５０３）の発現
[１] 透析法を用いた無細胞タンパク質合成法による１５Ｎ標識ＢＡＧ３ドメインの合成
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Zubayら(Annu. Rev. Geneti. 7, 267-287, 1973)の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１ コドン プラス(codon plus)株から調製した。
タンパク質合成反応は、表４に示す反応液組成の反応液３ｍｌ及び表５に示す透析外液組成の透析外液３０ｍｌのスケールで、液温を３０℃に維持しつつ一晩行った。
Figure 2005229874
Figure 2005229874
[２] ＳＤＳゲル電気泳動による発現状態の判定
合成反応終了後、常法に従ってＳＤＳゲル電気泳動を行い、得られたタンパク質の発現状態を判定した。その結果、分子量約１５０００のバンドが検出され、目的とするＢＡＧ３ドメインが発現することが確認された。
［実施例４］マウス由来のＢＡＧ３ドメインのＮＭＲによる構造決定
（１）１３Ｃ１５Ｎ標識ドメインの精製
全ての炭素核および窒素核をそれぞれ安定同位体である炭素１３、窒素１５により置換した配列番号６に記載されたポリペプチドを、上述の無細胞タンパク質発現系により作成した。配列番号６に記載されたポリペプチドは、配列番号４に記載されたポリペプチドのＮ末端にＧＳＳＧＳＳＧ、Ｃ末端にＳＧＰＳＳＧで表されるアミノ酸残基を付加したものであり、これらの付加配列は立体構造には影響を与えないものである。したがって、配列番号６に記載されたポリペプチドの立体構造を解析すれば、配列番号４に記載された本発明のポリペプチドの立体構造に関する情報を得ることができる。
得られた高純度標品を高速遠心機用の限外濾過膜付タンパク質濃縮器を用いて標品濃度がおよそ０．７ｍＭとなるまで濃縮した。その後、ＮＭＲ解析用標品緩衝液により濃縮液を１０倍に希釈した。この濃縮、希釈の操作を３回繰返し、標品精製用の緩衝液をＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全に置換した。用いたＮＭＲ解析用標品緩衝液の組成は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、９０ｍＭ塩化ナトリウム、４０ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４ｍＭアジ化ナトリウムであった。ＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換された標品の最終的な標品濃度は、およそ０．７ｍＭであった。得られた標品を、外径５ｍｍのＮＭＲ測定用シゲミ試料管に注入、脱気後、測定に用いた。
（２）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ実験には、アメリカ・バリアン社製Unity INOVA600、及びUnity INOVA800を使用した。全ての測定を２５℃の温度環境下で行った。主鎖シグナルの帰属を目的としたＮＭＲ実験として、二次元スペクトルは１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ、三次元スペクトルはＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、（ＨＣＡ）ＣＯ（ＣＡ）ＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＢ を測定した。また、側鎖シグナルの帰属を目的としたＮＭＲ実験として、二次元スペクトルは１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ、芳香族系側鎖用ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、三次元スペクトルはＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ、ＨＢＨＡＮＨ、Ｃ（ＣＣＣＯ）ＮＨ、脂肪族系側鎖用ＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、同ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹを測定した。距離制限情報採取を目的としたＮＭＲ実験として、三次元１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹと三次元１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹを測定した。
（３）測定データの解析
測定データを、アメリカ・シリコングラフィックス社製ワークステーションオクタン（Octane）2、およびオリジン（Origin）3800を用いてフーリエ変換計算を行い、各二次元および三次元スペクトルを得た。得られたスペクトルデータに基づいて、アミノ酸残基における主鎖シグナルとしてα位およびβ位の炭素核であるＣαとＣβ、カルボニル基の炭素核であるＣ’、アミド基の水素核であるＨＮ、アミド基の窒素核であるＮを連鎖的に帰属した。この手法は、まずＨＮ（ＣＯ）ＣＡ上で隣接残基のＣαシグナルの化学シフト値に一致するシグナルをＨＮＣＡＣＢ上で検索し、自身と隣接する残基のＣαシグナルの連鎖性を明らかにする。この操作を繰り返すことによりプロリン残基および何らかの原因でアミドプロトンシグナルが観測できない場合を除く全てのＣαシグナルを連鎖的に帰属できる。同様の操作を行うことにより、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨと ＨＮＣＡＣＢによりＣβシグナル、さらにＨＮＣＯと（ＨＣＡ）ＣＯ（ＣＡ）ＮＨによりＣ’シグナルを帰属することで、より正確に帰属を行うことができる。さらに、得られた主鎖帰属情報および側鎖帰属用に測定したスペクトルデータを用いてγ、δ、ε、ζ、η位の炭素核、窒素核、水素核の帰属を行う。以上の操作によりほぼ全てのアミノ酸残基に対するシグナルの帰属データを得た。また、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹからは９５９個のシグナル、１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹではそれぞれ２６２６個のシグナルから距離制限データを得た。これらシグナルの帰属データ、距離制限データを元に、タンパク質立体構造計算用ソフトウエアであるＣＹＡＮＡを用いてドメイン構造の計算を行った。得られた立体構造に基づいて、供した距離制限が満たされていないＮＯＥ群を比較検討しながら最適化を行った。これを繰返すことで最終的に３２９９個の距離制限を用いて計算し、エネルギー的に安定な上位２０個の立体構造を得た。これら構造において二次構造を形成するアミノ酸残基部分の収斂度は、主鎖の原子団に対して０．４２Å、側鎖を含めた水素原子以外の全原子団に対しても同じく０．９０Åであった。
（４）立体構造座標
得られた構造座標を以下に示す。なお、座標表記は簡略化のため得られた２０構造のうちの最初の１構造のみを示す。この構造は、２０個の構造のうちでもエネルギー的に最安定な立体構造であり、残りの１９構造も上記収斂度の精度で互いに重なり合う。
以下の立体構造座標データは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて記載されているものである。１列目のATOMはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目は配列番号６に対応したアミノ酸の番号を、６、７、８列目はその原子の座標（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）を、９列目は、その原子の占有率（本発明においてはすべて１．００）を、１０列目はその原子の温度因子を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。
ＢＡＧ３立体構造座標表１

ATOM 1 N GLY A 1 -20.608 -18.927 2.524 1.00 0.00 N
ATOM 2 CA GLY A 1 -20.181 -17.982 1.506 1.00 0.00 C
ATOM 3 C GLY A 1 -20.753 -18.355 0.137 1.00 0.00 C
ATOM 4 O GLY A 1 -21.259 -19.461 -0.048 1.00 0.00 O
ATOM 5 1H GLY A 1 -21.588 -19.126 2.532 1.00 0.00 H
ATOM 6 1HA GLY A 1 -20.505 -16.978 1.778 1.00 0.00 H
ATOM 7 2HA GLY A 1 -19.092 -17.963 1.457 1.00 0.00 H
ATOM 8 N SER A 2 -20.653 -17.412 -0.788 1.00 0.00 N
ATOM 9 CA SER A 2 -21.154 -17.627 -2.134 1.00 0.00 C
ATOM 10 C SER A 2 -20.188 -17.023 -3.155 1.00 0.00 C
ATOM 11 O SER A 2 -20.225 -15.821 -3.414 1.00 0.00 O
ATOM 12 CB SER A 2 -22.551 -17.027 -2.305 1.00 0.00 C
ATOM 13 OG SER A 2 -23.540 -18.030 -2.517 1.00 0.00 O
ATOM 14 H SER A 2 -20.240 -16.515 -0.629 1.00 0.00 H
ATOM 15 HA SER A 2 -21.207 -18.710 -2.252 1.00 0.00 H
ATOM 16 1HB SER A 2 -22.807 -16.447 -1.419 1.00 0.00 H
ATOM 17 2HB SER A 2 -22.548 -16.336 -3.148 1.00 0.00 H
ATOM 18 HG SER A 2 -24.225 -17.703 -3.169 1.00 0.00 H
ATOM 19 N SER A 3 -19.345 -17.883 -3.707 1.00 0.00 N
ATOM 20 CA SER A 3 -18.371 -17.449 -4.694 1.00 0.00 C
ATOM 21 C SER A 3 -17.464 -16.372 -4.095 1.00 0.00 C
ATOM 22 O SER A 3 -17.748 -15.844 -3.021 1.00 0.00 O
ATOM 23 CB SER A 3 -19.060 -16.922 -5.954 1.00 0.00 C
ATOM 24 OG SER A 3 -18.586 -17.568 -7.132 1.00 0.00 O
ATOM 25 H SER A 3 -19.321 -18.859 -3.490 1.00 0.00 H
ATOM 26 HA SER A 3 -17.794 -18.340 -4.941 1.00 0.00 H
ATOM 27 1HB SER A 3 -20.137 -17.071 -5.867 1.00 0.00 H
ATOM 28 2HB SER A 3 -18.893 -15.848 -6.036 1.00 0.00 H
ATOM 29 HG SER A 3 -19.078 -18.427 -7.273 1.00 0.00 H
ATOM 30 N GLY A 4 -16.392 -16.078 -4.816 1.00 0.00 N
ATOM 31 CA GLY A 4 -15.443 -15.073 -4.369 1.00 0.00 C
ATOM 32 C GLY A 4 -14.184 -15.083 -5.239 1.00 0.00 C
ATOM 33 O GLY A 4 -13.301 -15.919 -5.050 1.00 0.00 O
ATOM 34 H GLY A 4 -16.169 -16.512 -5.689 1.00 0.00 H
ATOM 35 1HA GLY A 4 -15.906 -14.087 -4.407 1.00 0.00 H
ATOM 36 2HA GLY A 4 -15.173 -15.259 -3.330 1.00 0.00 H
ATOM 37 N SER A 5 -14.141 -14.145 -6.174 1.00 0.00 N
ATOM 38 CA SER A 5 -13.005 -14.036 -7.073 1.00 0.00 C
ATOM 39 C SER A 5 -13.144 -12.785 -7.942 1.00 0.00 C
ATOM 40 O SER A 5 -14.077 -12.677 -8.736 1.00 0.00 O
ATOM 41 CB SER A 5 -12.876 -15.282 -7.952 1.00 0.00 C
ATOM 42 OG SER A 5 -11.515 -15.643 -8.171 1.00 0.00 O
ATOM 43 H SER A 5 -14.863 -13.469 -6.321 1.00 0.00 H
ATOM 44 HA SER A 5 -12.131 -13.957 -6.426 1.00 0.00 H
ATOM 45 1HB SER A 5 -13.400 -16.114 -7.481 1.00 0.00 H
ATOM 46 2HB SER A 5 -13.362 -15.101 -8.910 1.00 0.00 H
ATOM 47 HG SER A 5 -11.462 -16.393 -8.830 1.00 0.00 H
ATOM 48 N SER A 6 -12.202 -11.871 -7.763 1.00 0.00 N
ATOM 49 CA SER A 6 -12.207 -10.632 -8.521 1.00 0.00 C
ATOM 50 C SER A 6 -10.887 -9.886 -8.315 1.00 0.00 C
ATOM 51 O SER A 6 -10.169 -10.143 -7.350 1.00 0.00 O
ATOM 52 CB SER A 6 -13.387 -9.744 -8.118 1.00 0.00 C
ATOM 53 OG SER A 6 -13.182 -9.128 -6.850 1.00 0.00 O
ATOM 54 H SER A 6 -11.446 -11.966 -7.115 1.00 0.00 H
ATOM 55 HA SER A 6 -12.319 -10.931 -9.563 1.00 0.00 H
ATOM 56 1HB SER A 6 -13.537 -8.975 -8.875 1.00 0.00 H
ATOM 57 2HB SER A 6 -14.297 -10.343 -8.087 1.00 0.00 H
ATOM 58 HG SER A 6 -13.895 -9.415 -6.210 1.00 0.00 H
ATOM 59 N GLY A 7 -10.608 -8.977 -9.238 1.00 0.00 N
ATOM 60 CA GLY A 7 -9.387 -8.192 -9.170 1.00 0.00 C
ATOM 61 C GLY A 7 -9.244 -7.292 -10.399 1.00 0.00 C
ATOM 62 O GLY A 7 -10.182 -7.152 -11.182 1.00 0.00 O
ATOM 63 H GLY A 7 -11.197 -8.774 -10.020 1.00 0.00 H
ATOM 64 1HA GLY A 7 -9.393 -7.582 -8.266 1.00 0.00 H
ATOM 65 2HA GLY A 7 -8.526 -8.857 -9.099 1.00 0.00 H
ATOM 66 N ALA A 8 -8.063 -6.705 -10.528 1.00 0.00 N
ATOM 67 CA ALA A 8 -7.786 -5.822 -11.649 1.00 0.00 C
ATOM 68 C ALA A 8 -6.328 -5.364 -11.582 1.00 0.00 C
ATOM 69 O ALA A 8 -6.039 -4.266 -11.109 1.00 0.00 O
ATOM 70 CB ALA A 8 -8.767 -4.649 -11.630 1.00 0.00 C
ATOM 71 H ALA A 8 -7.306 -6.824 -9.886 1.00 0.00 H
ATOM 72 HA ALA A 8 -7.937 -6.392 -12.566 1.00 0.00 H
ATOM 73 1HB ALA A 8 -8.404 -3.861 -12.289 1.00 0.00 H
ATOM 74 2HB ALA A 8 -9.745 -4.987 -11.972 1.00 0.00 H
ATOM 75 3HB ALA A 8 -8.852 -4.263 -10.614 1.00 0.00 H
ATOM 76 N PRO A 9 -5.423 -6.252 -12.076 1.00 0.00 N
ATOM 77 CA PRO A 9 -4.002 -5.949 -12.077 1.00 0.00 C
ATOM 78 C PRO A 9 -3.657 -4.936 -13.171 1.00 0.00 C
ATOM 79 O PRO A 9 -3.410 -5.313 -14.315 1.00 0.00 O
ATOM 80 CB PRO A 9 -3.314 -7.291 -12.272 1.00 0.00 C
ATOM 81 CG PRO A 9 -4.374 -8.224 -12.836 1.00 0.00 C
ATOM 82 CD PRO A 9 -5.728 -7.561 -12.644 1.00 0.00 C
ATOM 83 HA PRO A 9 -3.738 -5.519 -11.214 1.00 0.00 H
ATOM 84 1HB PRO A 9 -2.469 -7.201 -12.955 1.00 0.00 H
ATOM 85 2HB PRO A 9 -2.922 -7.670 -11.328 1.00 0.00 H
ATOM 86 1HG PRO A 9 -4.189 -8.417 -13.893 1.00 0.00 H
ATOM 87 2HG PRO A 9 -4.344 -9.187 -12.326 1.00 0.00 H
ATOM 88 1HD PRO A 9 -6.261 -7.468 -13.591 1.00 0.00 H
ATOM 89 2HD PRO A 9 -6.363 -8.144 -11.978 1.00 0.00 H
ATOM 90 N ALA A 10 -3.653 -3.670 -12.780 1.00 0.00 N
ATOM 91 CA ALA A 10 -3.343 -2.600 -13.714 1.00 0.00 C
ATOM 92 C ALA A 10 -2.913 -1.357 -12.933 1.00 0.00 C
ATOM 93 O ALA A 10 -3.730 -0.480 -12.656 1.00 0.00 O
ATOM 94 CB ALA A 10 -4.555 -2.337 -14.609 1.00 0.00 C
ATOM 95 H ALA A 10 -3.855 -3.372 -11.848 1.00 0.00 H
ATOM 96 HA ALA A 10 -2.512 -2.933 -14.336 1.00 0.00 H
ATOM 97 1HB ALA A 10 -4.218 -1.967 -15.577 1.00 0.00 H
ATOM 98 2HB ALA A 10 -5.113 -3.263 -14.748 1.00 0.00 H
ATOM 99 3HB ALA A 10 -5.198 -1.592 -14.139 1.00 0.00 H
ATOM 100 N GLU A 11 -1.631 -1.320 -12.599 1.00 0.00 N
ATOM 101 CA GLU A 11 -1.083 -0.199 -11.856 1.00 0.00 C
ATOM 102 C GLU A 11 0.336 0.113 -12.335 1.00 0.00 C
ATOM 103 O GLU A 11 1.226 -0.731 -12.242 1.00 0.00 O
ATOM 104 CB GLU A 11 -1.105 -0.475 -10.351 1.00 0.00 C
ATOM 105 CG GLU A 11 -0.157 -1.621 -9.990 1.00 0.00 C
ATOM 106 CD GLU A 11 -0.770 -2.521 -8.915 1.00 0.00 C
ATOM 107 OE1 GLU A 11 -0.028 -2.858 -7.967 1.00 0.00 O
ATOM 108 OE2 GLU A 11 -1.966 -2.852 -9.066 1.00 0.00 O
ATOM 109 H GLU A 11 -0.973 -2.038 -12.828 1.00 0.00 H
ATOM 110 HA GLU A 11 -1.741 0.643 -12.074 1.00 0.00 H
ATOM 111 1HB GLU A 11 -0.817 0.425 -9.808 1.00 0.00 H
ATOM 112 2HB GLU A 11 -2.119 -0.725 -10.038 1.00 0.00 H
ATOM 113 1HG GLU A 11 0.062 -2.210 -10.881 1.00 0.00 H
ATOM 114 2HG GLU A 11 0.790 -1.216 -9.634 1.00 0.00 H
ATOM 115 N PRO A 12 0.508 1.360 -12.851 1.00 0.00 N
ATOM 116 CA PRO A 12 1.803 1.794 -13.345 1.00 0.00 C
ATOM 117 C PRO A 12 2.755 2.104 -12.188 1.00 0.00 C
ATOM 118 O PRO A 12 2.328 2.216 -11.041 1.00 0.00 O
ATOM 119 CB PRO A 12 1.508 3.006 -14.213 1.00 0.00 C
ATOM 120 CG PRO A 12 0.125 3.485 -13.802 1.00 0.00 C
ATOM 121 CD PRO A 12 -0.524 2.385 -12.977 1.00 0.00 C
ATOM 122 HA PRO A 12 2.238 1.061 -13.868 1.00 0.00 H
ATOM 123 1HB PRO A 12 2.253 3.787 -14.060 1.00 0.00 H
ATOM 124 2HB PRO A 12 1.532 2.745 -15.271 1.00 0.00 H
ATOM 125 1HG PRO A 12 0.196 4.406 -13.222 1.00 0.00 H
ATOM 126 2HG PRO A 12 -0.479 3.709 -14.682 1.00 0.00 H
ATOM 127 1HD PRO A 12 -0.836 2.755 -12.001 1.00 0.00 H
ATOM 128 2HD PRO A 12 -1.414 1.994 -13.470 1.00 0.00 H
ATOM 129 N ALA A 13 4.029 2.234 -12.531 1.00 0.00 N
ATOM 130 CA ALA A 13 5.045 2.529 -11.535 1.00 0.00 C
ATOM 131 C ALA A 13 6.288 3.087 -12.231 1.00 0.00 C
ATOM 132 O ALA A 13 6.963 2.372 -12.970 1.00 0.00 O
ATOM 133 CB ALA A 13 5.348 1.267 -10.725 1.00 0.00 C
ATOM 134 H ALA A 13 4.368 2.141 -13.467 1.00 0.00 H
ATOM 135 HA ALA A 13 4.642 3.288 -10.865 1.00 0.00 H
ATOM 136 1HB ALA A 13 4.538 1.086 -10.018 1.00 0.00 H
ATOM 137 2HB ALA A 13 5.438 0.415 -11.399 1.00 0.00 H
ATOM 138 3HB ALA A 13 6.283 1.400 -10.181 1.00 0.00 H
ATOM 139 N ALA A 14 6.552 4.359 -11.970 1.00 0.00 N
ATOM 140 CA ALA A 14 7.702 5.021 -12.563 1.00 0.00 C
ATOM 141 C ALA A 14 8.111 6.205 -11.684 1.00 0.00 C
ATOM 142 O ALA A 14 7.959 7.359 -12.082 1.00 0.00 O
ATOM 143 CB ALA A 14 7.366 5.445 -13.994 1.00 0.00 C
ATOM 144 H ALA A 14 5.998 4.933 -11.368 1.00 0.00 H
ATOM 145 HA ALA A 14 8.520 4.301 -12.593 1.00 0.00 H
ATOM 146 1HB ALA A 14 6.284 5.444 -14.129 1.00 0.00 H
ATOM 147 2HB ALA A 14 7.753 6.448 -14.176 1.00 0.00 H
ATOM 148 3HB ALA A 14 7.821 4.747 -14.696 1.00 0.00 H
ATOM 149 N PRO A 15 8.637 5.870 -10.476 1.00 0.00 N
ATOM 150 CA PRO A 15 9.069 6.892 -9.538 1.00 0.00 C
ATOM 151 C PRO A 15 10.395 7.516 -9.980 1.00 0.00 C
ATOM 152 O PRO A 15 11.345 6.803 -10.298 1.00 0.00 O
ATOM 153 CB PRO A 15 9.165 6.181 -8.198 1.00 0.00 C
ATOM 154 CG PRO A 15 9.235 4.696 -8.517 1.00 0.00 C
ATOM 155 CD PRO A 15 8.833 4.513 -9.972 1.00 0.00 C
ATOM 156 HA PRO A 15 8.409 7.642 -9.513 1.00 0.00 H
ATOM 157 1HB PRO A 15 10.049 6.504 -7.647 1.00 0.00 H
ATOM 158 2HB PRO A 15 8.301 6.406 -7.574 1.00 0.00 H
ATOM 159 1HG PRO A 15 10.242 4.316 -8.349 1.00 0.00 H
ATOM 160 2HG PRO A 15 8.569 4.134 -7.863 1.00 0.00 H
ATOM 161 1HD PRO A 15 9.606 3.990 -10.534 1.00 0.00 H
ATOM 162 2HD PRO A 15 7.921 3.923 -10.059 1.00 0.00 H
ATOM 163 N LYS A 16 10.415 8.840 -9.986 1.00 0.00 N
ATOM 164 CA LYS A 16 11.608 9.568 -10.384 1.00 0.00 C
ATOM 165 C LYS A 16 11.385 11.065 -10.160 1.00 0.00 C
ATOM 166 O LYS A 16 10.251 11.509 -9.990 1.00 0.00 O
ATOM 167 CB LYS A 16 11.999 9.213 -11.820 1.00 0.00 C
ATOM 168 CG LYS A 16 13.302 8.411 -11.851 1.00 0.00 C
ATOM 169 CD LYS A 16 13.236 7.298 -12.898 1.00 0.00 C
ATOM 170 CE LYS A 16 14.407 6.326 -12.741 1.00 0.00 C
ATOM 171 NZ LYS A 16 15.142 6.189 -14.018 1.00 0.00 N
ATOM 172 H LYS A 16 9.638 9.413 -9.726 1.00 0.00 H
ATOM 173 HA LYS A 16 12.422 9.240 -9.738 1.00 0.00 H
ATOM 174 1HB LYS A 16 11.201 8.635 -12.286 1.00 0.00 H
ATOM 175 2HB LYS A 16 12.115 10.125 -12.405 1.00 0.00 H
ATOM 176 1HG LYS A 16 14.137 9.075 -12.074 1.00 0.00 H
ATOM 177 2HG LYS A 16 13.491 7.980 -10.868 1.00 0.00 H
ATOM 178 1HD LYS A 16 12.294 6.757 -12.800 1.00 0.00 H
ATOM 179 2HD LYS A 16 13.251 7.732 -13.898 1.00 0.00 H
ATOM 180 1HE LYS A 16 15.082 6.684 -11.963 1.00 0.00 H
ATOM 181 2HE LYS A 16 14.038 5.352 -12.420 1.00 0.00 H
ATOM 182 1HZ LYS A 16 14.489 6.080 -14.768 1.00 0.00 H
ATOM 183 2HZ LYS A 16 15.695 7.007 -14.174 1.00 0.00 H
ATOM 184 3HZ LYS A 16 15.737 5.386 -13.976 1.00 0.00 H
ATOM 185 N SER A 17 12.486 11.803 -10.166 1.00 0.00 N
ATOM 186 CA SER A 17 12.425 13.240 -9.966 1.00 0.00 C
ATOM 187 C SER A 17 12.608 13.963 -11.302 1.00 0.00 C
ATOM 188 O SER A 17 13.693 14.460 -11.600 1.00 0.00 O
ATOM 189 CB SER A 17 13.485 13.702 -8.964 1.00 0.00 C
ATOM 190 OG SER A 17 13.063 13.512 -7.616 1.00 0.00 O
ATOM 191 H SER A 17 13.405 11.434 -10.305 1.00 0.00 H
ATOM 192 HA SER A 17 11.432 13.433 -9.559 1.00 0.00 H
ATOM 193 1HB SER A 17 14.410 13.153 -9.135 1.00 0.00 H
ATOM 194 2HB SER A 17 13.705 14.757 -9.129 1.00 0.00 H
ATOM 195 HG SER A 17 13.705 12.912 -7.138 1.00 0.00 H
ATOM 196 N GLY A 18 11.530 13.999 -12.071 1.00 0.00 N
ATOM 197 CA GLY A 18 11.557 14.652 -13.369 1.00 0.00 C
ATOM 198 C GLY A 18 10.511 15.767 -13.444 1.00 0.00 C
ATOM 199 O GLY A 18 9.357 15.517 -13.788 1.00 0.00 O
ATOM 200 H GLY A 18 10.651 13.592 -11.822 1.00 0.00 H
ATOM 201 1HA GLY A 18 12.549 15.067 -13.550 1.00 0.00 H
ATOM 202 2HA GLY A 18 11.370 13.919 -14.153 1.00 0.00 H
ATOM 203 N GLU A 19 10.953 16.972 -13.116 1.00 0.00 N
ATOM 204 CA GLU A 19 10.069 18.125 -13.142 1.00 0.00 C
ATOM 205 C GLU A 19 9.130 18.047 -14.348 1.00 0.00 C
ATOM 206 O GLU A 19 9.452 17.411 -15.350 1.00 0.00 O
ATOM 207 CB GLU A 19 10.870 19.429 -13.154 1.00 0.00 C
ATOM 208 CG GLU A 19 11.598 19.637 -11.825 1.00 0.00 C
ATOM 209 CD GLU A 19 13.115 19.655 -12.029 1.00 0.00 C
ATOM 210 OE1 GLU A 19 13.779 20.403 -11.279 1.00 0.00 O
ATOM 211 OE2 GLU A 19 13.576 18.921 -12.929 1.00 0.00 O
ATOM 212 H GLU A 19 11.893 17.167 -12.838 1.00 0.00 H
ATOM 213 HA GLU A 19 9.492 18.069 -12.219 1.00 0.00 H
ATOM 214 1HB GLU A 19 11.592 19.409 -13.970 1.00 0.00 H
ATOM 215 2HB GLU A 19 10.201 20.269 -13.342 1.00 0.00 H
ATOM 216 1HG GLU A 19 11.277 20.576 -11.374 1.00 0.00 H
ATOM 217 2HG GLU A 19 11.330 18.841 -11.131 1.00 0.00 H
ATOM 218 N ALA A 20 7.987 18.704 -14.211 1.00 0.00 N
ATOM 219 CA ALA A 20 6.999 18.717 -15.276 1.00 0.00 C
ATOM 220 C ALA A 20 6.490 17.293 -15.510 1.00 0.00 C
ATOM 221 O ALA A 20 7.019 16.339 -14.942 1.00 0.00 O
ATOM 222 CB ALA A 20 7.614 19.331 -16.535 1.00 0.00 C
ATOM 223 H ALA A 20 7.733 19.219 -13.392 1.00 0.00 H
ATOM 224 HA ALA A 20 6.168 19.342 -14.950 1.00 0.00 H
ATOM 225 1HB ALA A 20 7.825 18.542 -17.258 1.00 0.00 H
ATOM 226 2HB ALA A 20 6.914 20.044 -16.970 1.00 0.00 H
ATOM 227 3HB ALA A 20 8.540 19.843 -16.275 1.00 0.00 H
ATOM 228 N GLU A 21 5.467 17.195 -16.347 1.00 0.00 N
ATOM 229 CA GLU A 21 4.880 15.904 -16.664 1.00 0.00 C
ATOM 230 C GLU A 21 4.167 15.331 -15.438 1.00 0.00 C
ATOM 231 O GLU A 21 4.206 15.922 -14.359 1.00 0.00 O
ATOM 232 CB GLU A 21 5.941 14.933 -17.186 1.00 0.00 C
ATOM 233 CG GLU A 21 5.848 14.786 -18.706 1.00 0.00 C
ATOM 234 CD GLU A 21 6.873 15.680 -19.407 1.00 0.00 C
ATOM 235 OE1 GLU A 21 6.782 16.911 -19.208 1.00 0.00 O
ATOM 236 OE2 GLU A 21 7.724 15.113 -20.126 1.00 0.00 O
ATOM 237 H GLU A 21 5.043 17.976 -16.805 1.00 0.00 H
ATOM 238 HA GLU A 21 4.156 16.101 -17.454 1.00 0.00 H
ATOM 239 1HB GLU A 21 6.933 15.290 -16.911 1.00 0.00 H
ATOM 240 2HB GLU A 21 5.811 13.959 -16.714 1.00 0.00 H
ATOM 241 1HG GLU A 21 6.017 13.746 -18.985 1.00 0.00 H
ATOM 242 2HG GLU A 21 4.844 15.047 -19.040 1.00 0.00 H
ATOM 243 N THR A 22 3.533 14.186 -15.643 1.00 0.00 N
ATOM 244 CA THR A 22 2.813 13.526 -14.568 1.00 0.00 C
ATOM 245 C THR A 22 3.666 13.487 -13.299 1.00 0.00 C
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ATOM 248 OG1 THR A 22 1.340 12.402 -15.983 1.00 0.00 O
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ATOM 250 H THR A 22 3.506 13.712 -16.523 1.00 0.00 H
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ATOM 255 2HG2 THR A 22 2.313 11.379 -13.047 1.00 0.00 H
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ATOM 257 N PRO A 23 2.978 13.651 -12.138 1.00 0.00 N
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ATOM 259 C PRO A 23 4.054 12.212 -10.460 1.00 0.00 C
ATOM 260 O PRO A 23 3.579 11.245 -11.053 1.00 0.00 O
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ATOM 273 C PRO A 24 4.326 10.140 -8.122 1.00 0.00 C
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ATOM 276 CG PRO A 24 6.599 12.626 -7.829 1.00 0.00 C
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ATOM 284 2HD PRO A 24 5.952 13.985 -9.390 1.00 0.00 H
ATOM 285 N LYS A 25 4.601 8.889 -7.781 1.00 0.00 N
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ATOM 334 1HG PRO A 27 5.194 9.556 0.835 1.00 0.00 H
ATOM 335 2HG PRO A 27 6.372 9.849 -0.429 1.00 0.00 H
ATOM 336 1HD PRO A 27 3.525 9.690 -0.741 1.00 0.00 H
ATOM 337 2HD PRO A 27 4.711 9.867 -2.019 1.00 0.00 H
ATOM 338 N GLY A 28 3.046 6.959 0.749 1.00 0.00 N
ATOM 339 CA GLY A 28 2.084 6.412 1.691 1.00 0.00 C
ATOM 340 C GLY A 28 1.317 5.241 1.075 1.00 0.00 C
ATOM 341 O GLY A 28 0.847 4.357 1.790 1.00 0.00 O
ATOM 342 H GLY A 28 2.908 7.921 0.514 1.00 0.00 H
ATOM 343 1HA GLY A 28 2.601 6.080 2.592 1.00 0.00 H
ATOM 344 2HA GLY A 28 1.384 7.191 1.994 1.00 0.00 H
ATOM 345 N VAL A 29 1.215 5.271 -0.246 1.00 0.00 N
ATOM 346 CA VAL A 29 0.513 4.223 -0.966 1.00 0.00 C
ATOM 347 C VAL A 29 1.481 3.075 -1.259 1.00 0.00 C
ATOM 348 O VAL A 29 1.247 1.940 -0.847 1.00 0.00 O
ATOM 349 CB VAL A 29 -0.132 4.797 -2.229 1.00 0.00 C
ATOM 350 CG1 VAL A 29 -0.839 3.702 -3.030 1.00 0.00 C
ATOM 351 CG2 VAL A 29 -1.097 5.933 -1.884 1.00 0.00 C
ATOM 352 H VAL A 29 1.600 5.994 -0.820 1.00 0.00 H
ATOM 353 HA VAL A 29 -0.282 3.854 -0.318 1.00 0.00 H
ATOM 354 HB VAL A 29 0.661 5.209 -2.853 1.00 0.00 H
ATOM 355 1HG1 VAL A 29 -1.905 3.924 -3.087 1.00 0.00 H
ATOM 356 2HG1 VAL A 29 -0.422 3.661 -4.036 1.00 0.00 H
ATOM 357 3HG1 VAL A 29 -0.695 2.741 -2.537 1.00 0.00 H
ATOM 358 1HG2 VAL A 29 -0.936 6.767 -2.567 1.00 0.00 H
ATOM 359 2HG2 VAL A 29 -2.123 5.580 -1.978 1.00 0.00 H
ATOM 360 3HG2 VAL A 29 -0.918 6.263 -0.860 1.00 0.00 H
ATOM 361 N LEU A 30 2.550 3.410 -1.967 1.00 0.00 N
ATOM 362 CA LEU A 30 3.554 2.422 -2.320 1.00 0.00 C
ATOM 363 C LEU A 30 3.843 1.539 -1.104 1.00 0.00 C
ATOM 364 O LEU A 30 4.099 0.344 -1.247 1.00 0.00 O
ATOM 365 CB LEU A 30 4.798 3.103 -2.894 1.00 0.00 C
ATOM 366 CG LEU A 30 4.569 3.998 -4.114 1.00 0.00 C
ATOM 367 CD1 LEU A 30 5.557 5.166 -4.130 1.00 0.00 C
ATOM 368 CD2 LEU A 30 4.623 3.185 -5.409 1.00 0.00 C
ATOM 369 H LEU A 30 2.733 4.336 -2.298 1.00 0.00 H
ATOM 370 HA LEU A 30 3.136 1.797 -3.109 1.00 0.00 H
ATOM 371 1HB LEU A 30 5.255 3.704 -2.108 1.00 0.00 H
ATOM 372 2HB LEU A 30 5.518 2.331 -3.165 1.00 0.00 H
ATOM 373 HG LEU A 30 3.568 4.424 -4.043 1.00 0.00 H
ATOM 374 1HD1 LEU A 30 6.488 4.849 -4.600 1.00 0.00 H
ATOM 375 2HD1 LEU A 30 5.129 5.996 -4.693 1.00 0.00 H
ATOM 376 3HD1 LEU A 30 5.757 5.487 -3.107 1.00 0.00 H
ATOM 377 1HD2 LEU A 30 4.115 3.732 -6.203 1.00 0.00 H
ATOM 378 2HD2 LEU A 30 5.663 3.017 -5.690 1.00 0.00 H
ATOM 379 3HD2 LEU A 30 4.129 2.225 -5.256 1.00 0.00 H
ATOM 380 N LYS A 31 3.793 2.161 0.065 1.00 0.00 N
ATOM 381 CA LYS A 31 4.046 1.447 1.304 1.00 0.00 C
ATOM 382 C LYS A 31 3.126 0.227 1.382 1.00 0.00 C
ATOM 383 O LYS A 31 3.556 -0.855 1.780 1.00 0.00 O
ATOM 384 CB LYS A 31 3.918 2.390 2.502 1.00 0.00 C
ATOM 385 CG LYS A 31 5.243 2.497 3.260 1.00 0.00 C
ATOM 386 CD LYS A 31 5.448 3.910 3.811 1.00 0.00 C
ATOM 387 CE LYS A 31 6.808 4.038 4.498 1.00 0.00 C
ATOM 388 NZ LYS A 31 7.090 5.453 4.828 1.00 0.00 N
ATOM 389 H LYS A 31 3.584 3.133 0.172 1.00 0.00 H
ATOM 390 HA LYS A 31 5.079 1.100 1.276 1.00 0.00 H
ATOM 391 1HB LYS A 31 3.610 3.378 2.161 1.00 0.00 H
ATOM 392 2HB LYS A 31 3.139 2.028 3.173 1.00 0.00 H
ATOM 393 1HG LYS A 31 5.256 1.778 4.079 1.00 0.00 H
ATOM 394 2HG LYS A 31 6.068 2.239 2.596 1.00 0.00 H
ATOM 395 1HD LYS A 31 5.376 4.634 2.999 1.00 0.00 H
ATOM 396 2HD LYS A 31 4.654 4.146 4.520 1.00 0.00 H
ATOM 397 1HE LYS A 31 6.822 3.437 5.407 1.00 0.00 H
ATOM 398 2HE LYS A 31 7.590 3.648 3.846 1.00 0.00 H
ATOM 399 1HZ LYS A 31 7.568 5.885 4.063 1.00 0.00 H
ATOM 400 2HZ LYS A 31 6.230 5.934 4.998 1.00 0.00 H
ATOM 401 3HZ LYS A 31 7.663 5.497 5.647 1.00 0.00 H
ATOM 402 N VAL A 32 1.878 0.441 0.995 1.00 0.00 N
ATOM 403 CA VAL A 32 0.893 -0.628 1.015 1.00 0.00 C
ATOM 404 C VAL A 32 1.088 -1.518 -0.214 1.00 0.00 C
ATOM 405 O VAL A 32 1.095 -2.743 -0.102 1.00 0.00 O
ATOM 406 CB VAL A 32 -0.516 -0.040 1.110 1.00 0.00 C
ATOM 407 CG1 VAL A 32 -0.500 1.306 1.838 1.00 0.00 C
ATOM 408 CG2 VAL A 32 -1.149 0.094 -0.276 1.00 0.00 C
ATOM 409 H VAL A 32 1.536 1.324 0.672 1.00 0.00 H
ATOM 410 HA VAL A 32 1.072 -1.222 1.911 1.00 0.00 H
ATOM 411 HB VAL A 32 -1.128 -0.728 1.693 1.00 0.00 H
ATOM 412 1HG1 VAL A 32 0.344 1.337 2.527 1.00 0.00 H
ATOM 413 2HG1 VAL A 32 -0.404 2.112 1.110 1.00 0.00 H
ATOM 414 3HG1 VAL A 32 -1.429 1.429 2.395 1.00 0.00 H
ATOM 415 1HG2 VAL A 32 -2.166 0.472 -0.176 1.00 0.00 H
ATOM 416 2HG2 VAL A 32 -0.561 0.786 -0.879 1.00 0.00 H
ATOM 417 3HG2 VAL A 32 -1.171 -0.882 -0.761 1.00 0.00 H
ATOM 418 N GLU A 33 1.241 -0.868 -1.358 1.00 0.00 N
ATOM 419 CA GLU A 33 1.435 -1.585 -2.606 1.00 0.00 C
ATOM 420 C GLU A 33 2.618 -2.548 -2.487 1.00 0.00 C
ATOM 421 O GLU A 33 2.622 -3.612 -3.105 1.00 0.00 O
ATOM 422 CB GLU A 33 1.634 -0.614 -3.772 1.00 0.00 C
ATOM 423 CG GLU A 33 0.444 0.338 -3.902 1.00 0.00 C
ATOM 424 CD GLU A 33 0.641 1.306 -5.070 1.00 0.00 C
ATOM 425 OE1 GLU A 33 1.783 1.794 -5.216 1.00 0.00 O
ATOM 426 OE2 GLU A 33 -0.354 1.537 -5.791 1.00 0.00 O
ATOM 427 H GLU A 33 1.234 0.129 -1.440 1.00 0.00 H
ATOM 428 HA GLU A 33 0.514 -2.147 -2.764 1.00 0.00 H
ATOM 429 1HB GLU A 33 2.548 -0.040 -3.619 1.00 0.00 H
ATOM 430 2HB GLU A 33 1.761 -1.173 -4.699 1.00 0.00 H
ATOM 431 1HG GLU A 33 -0.471 -0.236 -4.052 1.00 0.00 H
ATOM 432 2HG GLU A 33 0.319 0.900 -2.976 1.00 0.00 H
ATOM 433 N ALA A 34 3.593 -2.141 -1.688 1.00 0.00 N
ATOM 434 CA ALA A 34 4.779 -2.955 -1.479 1.00 0.00 C
ATOM 435 C ALA A 34 4.386 -4.243 -0.752 1.00 0.00 C
ATOM 436 O ALA A 34 4.846 -5.326 -1.111 1.00 0.00 O
ATOM 437 CB ALA A 34 5.824 -2.146 -0.709 1.00 0.00 C
ATOM 438 H ALA A 34 3.582 -1.274 -1.189 1.00 0.00 H
ATOM 439 HA ALA A 34 5.183 -3.209 -2.459 1.00 0.00 H
ATOM 440 1HB ALA A 34 6.160 -2.717 0.157 1.00 0.00 H
ATOM 441 2HB ALA A 34 6.674 -1.938 -1.359 1.00 0.00 H
ATOM 442 3HB ALA A 34 5.383 -1.206 -0.375 1.00 0.00 H
ATOM 443 N ILE A 35 3.542 -4.082 0.256 1.00 0.00 N
ATOM 444 CA ILE A 35 3.083 -5.219 1.036 1.00 0.00 C
ATOM 445 C ILE A 35 2.153 -6.078 0.178 1.00 0.00 C
ATOM 446 O ILE A 35 2.392 -7.272 0.001 1.00 0.00 O
ATOM 447 CB ILE A 35 2.450 -4.748 2.347 1.00 0.00 C
ATOM 448 CG1 ILE A 35 3.491 -4.088 3.253 1.00 0.00 C
ATOM 449 CG2 ILE A 35 1.725 -5.898 3.050 1.00 0.00 C
ATOM 450 CD1 ILE A 35 2.917 -2.842 3.931 1.00 0.00 C
ATOM 451 H ILE A 35 3.173 -3.197 0.541 1.00 0.00 H
ATOM 452 HA ILE A 35 3.959 -5.812 1.296 1.00 0.00 H
ATOM 453 HB ILE A 35 1.701 -3.991 2.112 1.00 0.00 H
ATOM 454 1HG1 ILE A 35 3.822 -4.798 4.010 1.00 0.00 H
ATOM 455 2HG1 ILE A 35 4.368 -3.815 2.666 1.00 0.00 H
ATOM 456 1HG2 ILE A 35 2.119 -6.012 4.059 1.00 0.00 H
ATOM 457 2HG2 ILE A 35 0.658 -5.679 3.098 1.00 0.00 H
ATOM 458 3HG2 ILE A 35 1.882 -6.821 2.492 1.00 0.00 H
ATOM 459 1HD1 ILE A 35 2.379 -2.244 3.196 1.00 0.00 H
ATOM 460 2HD1 ILE A 35 2.234 -3.143 4.725 1.00 0.00 H
ATOM 461 3HD1 ILE A 35 3.730 -2.252 4.354 1.00 0.00 H
ATOM 462 N LEU A 36 1.111 -5.439 -0.332 1.00 0.00 N
ATOM 463 CA LEU A 36 0.143 -6.130 -1.168 1.00 0.00 C
ATOM 464 C LEU A 36 0.883 -7.040 -2.150 1.00 0.00 C
ATOM 465 O LEU A 36 0.564 -8.223 -2.267 1.00 0.00 O
ATOM 466 CB LEU A 36 -0.794 -5.128 -1.844 1.00 0.00 C
ATOM 467 CG LEU A 36 -2.120 -4.862 -1.129 1.00 0.00 C
ATOM 468 CD1 LEU A 36 -3.055 -4.021 -2.001 1.00 0.00 C
ATOM 469 CD2 LEU A 36 -2.776 -6.172 -0.684 1.00 0.00 C
ATOM 470 H LEU A 36 0.923 -4.468 -0.184 1.00 0.00 H
ATOM 471 HA LEU A 36 -0.468 -6.752 -0.513 1.00 0.00 H
ATOM 472 1HB LEU A 36 -0.265 -4.181 -1.950 1.00 0.00 H
ATOM 473 2HB LEU A 36 -1.012 -5.486 -2.850 1.00 0.00 H
ATOM 474 HG LEU A 36 -1.913 -4.284 -0.228 1.00 0.00 H
ATOM 475 1HD1 LEU A 36 -4.077 -4.381 -1.890 1.00 0.00 H
ATOM 476 2HD1 LEU A 36 -3.001 -2.978 -1.690 1.00 0.00 H
ATOM 477 3HD1 LEU A 36 -2.751 -4.105 -3.045 1.00 0.00 H
ATOM 478 1HD2 LEU A 36 -2.341 -7.002 -1.240 1.00 0.00 H
ATOM 479 2HD2 LEU A 36 -2.605 -6.319 0.382 1.00 0.00 H
ATOM 480 3HD2 LEU A 36 -3.847 -6.126 -0.878 1.00 0.00 H
ATOM 481 N GLU A 37 1.857 -6.455 -2.832 1.00 0.00 N
ATOM 482 CA GLU A 37 2.644 -7.198 -3.801 1.00 0.00 C
ATOM 483 C GLU A 37 3.026 -8.568 -3.236 1.00 0.00 C
ATOM 484 O GLU A 37 3.015 -9.565 -3.956 1.00 0.00 O
ATOM 485 CB GLU A 37 3.889 -6.410 -4.216 1.00 0.00 C
ATOM 486 CG GLU A 37 3.880 -6.123 -5.718 1.00 0.00 C
ATOM 487 CD GLU A 37 4.862 -7.036 -6.457 1.00 0.00 C
ATOM 488 OE1 GLU A 37 6.080 -6.840 -6.255 1.00 0.00 O
ATOM 489 OE2 GLU A 37 4.372 -7.908 -7.206 1.00 0.00 O
ATOM 490 H GLU A 37 2.110 -5.492 -2.730 1.00 0.00 H
ATOM 491 HA GLU A 37 1.995 -7.323 -4.667 1.00 0.00 H
ATOM 492 1HB GLU A 37 3.931 -5.472 -3.663 1.00 0.00 H
ATOM 493 2HB GLU A 37 4.784 -6.974 -3.955 1.00 0.00 H
ATOM 494 1HG GLU A 37 2.875 -6.269 -6.114 1.00 0.00 H
ATOM 495 2HG GLU A 37 4.144 -5.081 -5.895 1.00 0.00 H
ATOM 496 N LYS A 38 3.354 -8.573 -1.952 1.00 0.00 N
ATOM 497 CA LYS A 38 3.738 -9.804 -1.282 1.00 0.00 C
ATOM 498 C LYS A 38 2.492 -10.659 -1.044 1.00 0.00 C
ATOM 499 O LYS A 38 2.490 -11.854 -1.339 1.00 0.00 O
ATOM 500 CB LYS A 38 4.526 -9.497 -0.008 1.00 0.00 C
ATOM 501 CG LYS A 38 5.830 -8.765 -0.332 1.00 0.00 C
ATOM 502 CD LYS A 38 6.194 -7.775 0.777 1.00 0.00 C
ATOM 503 CE LYS A 38 7.679 -7.871 1.132 1.00 0.00 C
ATOM 504 NZ LYS A 38 8.484 -7.018 0.230 1.00 0.00 N
ATOM 505 H LYS A 38 3.360 -7.757 -1.373 1.00 0.00 H
ATOM 506 HA LYS A 38 4.406 -10.345 -1.952 1.00 0.00 H
ATOM 507 1HB LYS A 38 3.920 -8.886 0.662 1.00 0.00 H
ATOM 508 2HB LYS A 38 4.747 -10.424 0.520 1.00 0.00 H
ATOM 509 1HG LYS A 38 6.636 -9.489 -0.457 1.00 0.00 H
ATOM 510 2HG LYS A 38 5.728 -8.235 -1.279 1.00 0.00 H
ATOM 511 1HD LYS A 38 5.958 -6.761 0.455 1.00 0.00 H
ATOM 512 2HD LYS A 38 5.591 -7.977 1.662 1.00 0.00 H
ATOM 513 1HE LYS A 38 7.833 -7.564 2.166 1.00 0.00 H
ATOM 514 2HE LYS A 38 8.011 -8.907 1.054 1.00 0.00 H
ATOM 515 1HZ LYS A 38 8.105 -6.092 0.220 1.00 0.00 H
ATOM 516 2HZ LYS A 38 9.429 -6.987 0.555 1.00 0.00 H
ATOM 517 3HZ LYS A 38 8.462 -7.396 -0.696 1.00 0.00 H
ATOM 518 N VAL A 39 1.463 -10.015 -0.513 1.00 0.00 N
ATOM 519 CA VAL A 39 0.214 -10.703 -0.232 1.00 0.00 C
ATOM 520 C VAL A 39 -0.122 -11.636 -1.396 1.00 0.00 C
ATOM 521 O VAL A 39 -0.362 -12.825 -1.194 1.00 0.00 O
ATOM 522 CB VAL A 39 -0.890 -9.684 0.056 1.00 0.00 C
ATOM 523 CG1 VAL A 39 -2.238 -10.379 0.256 1.00 0.00 C
ATOM 524 CG2 VAL A 39 -0.535 -8.818 1.267 1.00 0.00 C
ATOM 525 H VAL A 39 1.474 -9.044 -0.276 1.00 0.00 H
ATOM 526 HA VAL A 39 0.364 -11.302 0.666 1.00 0.00 H
ATOM 527 HB VAL A 39 -0.976 -9.028 -0.810 1.00 0.00 H
ATOM 528 1HG1 VAL A 39 -3.006 -9.851 -0.310 1.00 0.00 H
ATOM 529 2HG1 VAL A 39 -2.172 -11.409 -0.095 1.00 0.00 H
ATOM 530 3HG1 VAL A 39 -2.498 -10.371 1.315 1.00 0.00 H
ATOM 531 1HG2 VAL A 39 0.281 -8.145 1.005 1.00 0.00 H
ATOM 532 2HG2 VAL A 39 -1.406 -8.234 1.564 1.00 0.00 H
ATOM 533 3HG2 VAL A 39 -0.227 -9.458 2.094 1.00 0.00 H
ATOM 534 N GLN A 40 -0.130 -11.062 -2.590 1.00 0.00 N
ATOM 535 CA GLN A 40 -0.433 -11.827 -3.788 1.00 0.00 C
ATOM 536 C GLN A 40 0.206 -13.215 -3.706 1.00 0.00 C
ATOM 537 O GLN A 40 -0.412 -14.210 -4.081 1.00 0.00 O
ATOM 538 CB GLN A 40 0.026 -11.085 -5.044 1.00 0.00 C
ATOM 539 CG GLN A 40 -0.842 -9.851 -5.300 1.00 0.00 C
ATOM 540 CD GLN A 40 -2.110 -10.223 -6.072 1.00 0.00 C
ATOM 541 OE1 GLN A 40 -2.996 -10.898 -5.575 1.00 0.00 O
ATOM 542 NE2 GLN A 40 -2.146 -9.746 -7.313 1.00 0.00 N
ATOM 543 H GLN A 40 0.067 -10.093 -2.747 1.00 0.00 H
ATOM 544 HA GLN A 40 -1.519 -11.920 -3.804 1.00 0.00 H
ATOM 545 1HB GLN A 40 1.068 -10.784 -4.933 1.00 0.00 H
ATOM 546 2HB GLN A 40 -0.024 -11.753 -5.904 1.00 0.00 H
ATOM 547 1HG GLN A 40 -1.113 -9.390 -4.350 1.00 0.00 H
ATOM 548 2HG GLN A 40 -0.273 -9.112 -5.862 1.00 0.00 H
ATOM 549 1HE2 GLN A 40 -1.385 -9.198 -7.661 1.00 0.00 H
ATOM 550 2HE2 GLN A 40 -2.934 -9.935 -7.899 1.00 0.00 H
ATOM 551 N GLY A 41 1.437 -13.237 -3.215 1.00 0.00 N
ATOM 552 CA GLY A 41 2.166 -14.486 -3.079 1.00 0.00 C
ATOM 553 C GLY A 41 1.490 -15.409 -2.064 1.00 0.00 C
ATOM 554 O GLY A 41 1.328 -16.602 -2.316 1.00 0.00 O
ATOM 555 H GLY A 41 1.932 -12.423 -2.912 1.00 0.00 H
ATOM 556 1HA GLY A 41 2.224 -14.984 -4.047 1.00 0.00 H
ATOM 557 2HA GLY A 41 3.190 -14.281 -2.765 1.00 0.00 H
ATOM 558 N LEU A 42 1.114 -14.822 -0.938 1.00 0.00 N
ATOM 559 CA LEU A 42 0.458 -15.577 0.117 1.00 0.00 C
ATOM 560 C LEU A 42 -0.899 -16.073 -0.385 1.00 0.00 C
ATOM 561 O LEU A 42 -1.405 -17.090 0.087 1.00 0.00 O
ATOM 562 CB LEU A 42 0.373 -14.745 1.398 1.00 0.00 C
ATOM 563 CG LEU A 42 1.707 -14.265 1.975 1.00 0.00 C
ATOM 564 CD1 LEU A 42 1.484 -13.340 3.174 1.00 0.00 C
ATOM 565 CD2 LEU A 42 2.611 -15.448 2.325 1.00 0.00 C
ATOM 566 H LEU A 42 1.249 -13.851 -0.740 1.00 0.00 H
ATOM 567 HA LEU A 42 1.083 -16.443 0.336 1.00 0.00 H
ATOM 568 1HB LEU A 42 -0.250 -13.873 1.201 1.00 0.00 H
ATOM 569 2HB LEU A 42 -0.137 -15.336 2.158 1.00 0.00 H
ATOM 570 HG LEU A 42 2.220 -13.682 1.211 1.00 0.00 H
ATOM 571 1HD1 LEU A 42 2.402 -13.276 3.759 1.00 0.00 H
ATOM 572 2HD1 LEU A 42 1.207 -12.347 2.820 1.00 0.00 H
ATOM 573 3HD1 LEU A 42 0.683 -13.740 3.797 1.00 0.00 H
ATOM 574 1HD2 LEU A 42 2.002 -16.280 2.678 1.00 0.00 H
ATOM 575 2HD2 LEU A 42 3.165 -15.756 1.438 1.00 0.00 H
ATOM 576 3HD2 LEU A 42 3.311 -15.152 3.106 1.00 0.00 H
ATOM 577 N GLU A 43 -1.450 -15.332 -1.335 1.00 0.00 N
ATOM 578 CA GLU A 43 -2.739 -15.684 -1.906 1.00 0.00 C
ATOM 579 C GLU A 43 -2.601 -16.908 -2.813 1.00 0.00 C
ATOM 580 O GLU A 43 -3.342 -17.880 -2.668 1.00 0.00 O
ATOM 581 CB GLU A 43 -3.342 -14.502 -2.668 1.00 0.00 C
ATOM 582 CG GLU A 43 -4.864 -14.471 -2.515 1.00 0.00 C
ATOM 583 CD GLU A 43 -5.506 -15.692 -3.178 1.00 0.00 C
ATOM 584 OE1 GLU A 43 -5.934 -16.589 -2.420 1.00 0.00 O
ATOM 585 OE2 GLU A 43 -5.556 -15.700 -4.426 1.00 0.00 O
ATOM 586 H GLU A 43 -1.032 -14.506 -1.713 1.00 0.00 H
ATOM 587 HA GLU A 43 -3.377 -15.924 -1.055 1.00 0.00 H
ATOM 588 1HB GLU A 43 -2.917 -13.570 -2.296 1.00 0.00 H
ATOM 589 2HB GLU A 43 -3.080 -14.573 -3.723 1.00 0.00 H
ATOM 590 1HG GLU A 43 -5.127 -14.446 -1.458 1.00 0.00 H
ATOM 591 2HG GLU A 43 -5.260 -13.560 -2.964 1.00 0.00 H
ATOM 592 N GLN A 44 -1.648 -16.822 -3.730 1.00 0.00 N
ATOM 593 CA GLN A 44 -1.404 -17.910 -4.661 1.00 0.00 C
ATOM 594 C GLN A 44 -1.349 -19.245 -3.914 1.00 0.00 C
ATOM 595 O GLN A 44 -1.788 -20.269 -4.434 1.00 0.00 O
ATOM 596 CB GLN A 44 -0.118 -17.674 -5.456 1.00 0.00 C
ATOM 597 CG GLN A 44 -0.366 -16.725 -6.630 1.00 0.00 C
ATOM 598 CD GLN A 44 -0.105 -17.424 -7.965 1.00 0.00 C
ATOM 599 OE1 GLN A 44 0.366 -18.548 -8.025 1.00 0.00 O
ATOM 600 NE2 GLN A 44 -0.436 -16.699 -9.030 1.00 0.00 N
ATOM 601 H GLN A 44 -1.050 -16.028 -3.842 1.00 0.00 H
ATOM 602 HA GLN A 44 -2.253 -17.903 -5.344 1.00 0.00 H
ATOM 603 1HB GLN A 44 0.647 -17.256 -4.801 1.00 0.00 H
ATOM 604 2HB GLN A 44 0.265 -18.624 -5.827 1.00 0.00 H
ATOM 605 1HG GLN A 44 -1.394 -16.363 -6.599 1.00 0.00 H
ATOM 606 2HG GLN A 44 0.281 -15.852 -6.540 1.00 0.00 H
ATOM 607 1HE2 GLN A 44 -0.819 -15.783 -8.911 1.00 0.00 H
ATOM 608 2HE2 GLN A 44 -0.303 -17.071 -9.949 1.00 0.00 H
ATOM 609 N ALA A 45 -0.807 -19.189 -2.707 1.00 0.00 N
ATOM 610 CA ALA A 45 -0.689 -20.381 -1.884 1.00 0.00 C
ATOM 611 C ALA A 45 -2.087 -20.862 -1.488 1.00 0.00 C
ATOM 612 O ALA A 45 -2.388 -22.050 -1.585 1.00 0.00 O
ATOM 613 CB ALA A 45 0.189 -20.077 -0.668 1.00 0.00 C
ATOM 614 H ALA A 45 -0.452 -18.352 -2.291 1.00 0.00 H
ATOM 615 HA ALA A 45 -0.205 -21.151 -2.483 1.00 0.00 H
ATOM 616 1HB ALA A 45 -0.107 -19.121 -0.236 1.00 0.00 H
ATOM 617 2HB ALA A 45 0.066 -20.865 0.075 1.00 0.00 H
ATOM 618 3HB ALA A 45 1.233 -20.028 -0.977 1.00 0.00 H
ATOM 619 N VAL A 46 -2.902 -19.914 -1.050 1.00 0.00 N
ATOM 620 CA VAL A 46 -4.260 -20.226 -0.639 1.00 0.00 C
ATOM 621 C VAL A 46 -5.011 -20.859 -1.813 1.00 0.00 C
ATOM 622 O VAL A 46 -5.445 -22.007 -1.730 1.00 0.00 O
ATOM 623 CB VAL A 46 -4.946 -18.969 -0.099 1.00 0.00 C
ATOM 624 CG1 VAL A 46 -6.463 -19.155 -0.040 1.00 0.00 C
ATOM 625 CG2 VAL A 46 -4.387 -18.586 1.272 1.00 0.00 C
ATOM 626 H VAL A 46 -2.649 -18.949 -0.974 1.00 0.00 H
ATOM 627 HA VAL A 46 -4.200 -20.952 0.171 1.00 0.00 H
ATOM 628 HB VAL A 46 -4.735 -18.151 -0.788 1.00 0.00 H
ATOM 629 1HG1 VAL A 46 -6.712 -20.190 -0.276 1.00 0.00 H
ATOM 630 2HG1 VAL A 46 -6.820 -18.914 0.961 1.00 0.00 H
ATOM 631 3HG1 VAL A 46 -6.939 -18.493 -0.764 1.00 0.00 H
ATOM 632 1HG2 VAL A 46 -3.736 -19.382 1.635 1.00 0.00 H
ATOM 633 2HG2 VAL A 46 -3.816 -17.661 1.186 1.00 0.00 H
ATOM 634 3HG2 VAL A 46 -5.209 -18.441 1.973 1.00 0.00 H
ATOM 635 N ASP A 47 -5.140 -20.083 -2.879 1.00 0.00 N
ATOM 636 CA ASP A 47 -5.831 -20.553 -4.067 1.00 0.00 C
ATOM 637 C ASP A 47 -5.336 -21.958 -4.417 1.00 0.00 C
ATOM 638 O ASP A 47 -6.062 -22.743 -5.025 1.00 0.00 O
ATOM 639 CB ASP A 47 -5.550 -19.642 -5.264 1.00 0.00 C
ATOM 640 CG ASP A 47 -6.766 -19.335 -6.141 1.00 0.00 C
ATOM 641 OD1 ASP A 47 -6.969 -18.135 -6.430 1.00 0.00 O
ATOM 642 OD2 ASP A 47 -7.464 -20.306 -6.504 1.00 0.00 O
ATOM 643 H ASP A 47 -4.784 -19.150 -2.938 1.00 0.00 H
ATOM 644 HA ASP A 47 -6.889 -20.536 -3.809 1.00 0.00 H
ATOM 645 1HB ASP A 47 -5.139 -18.701 -4.897 1.00 0.00 H
ATOM 646 2HB ASP A 47 -4.782 -20.105 -5.883 1.00 0.00 H
ATOM 647 N SER A 48 -4.102 -22.232 -4.019 1.00 0.00 N
ATOM 648 CA SER A 48 -3.502 -23.529 -4.282 1.00 0.00 C
ATOM 649 C SER A 48 -3.044 -24.170 -2.971 1.00 0.00 C
ATOM 650 O SER A 48 -1.975 -24.776 -2.911 1.00 0.00 O
ATOM 651 CB SER A 48 -2.324 -23.404 -5.251 1.00 0.00 C
ATOM 652 OG SER A 48 -2.549 -24.120 -6.461 1.00 0.00 O
ATOM 653 H SER A 48 -3.518 -21.588 -3.525 1.00 0.00 H
ATOM 654 HA SER A 48 -4.289 -24.123 -4.745 1.00 0.00 H
ATOM 655 1HB SER A 48 -2.152 -22.351 -5.479 1.00 0.00 H
ATOM 656 2HB SER A 48 -1.419 -23.777 -4.771 1.00 0.00 H
ATOM 657 HG SER A 48 -1.681 -24.451 -6.830 1.00 0.00 H
ATOM 658 N PHE A 49 -3.877 -24.015 -1.952 1.00 0.00 N
ATOM 659 CA PHE A 49 -3.571 -24.572 -0.645 1.00 0.00 C
ATOM 660 C PHE A 49 -4.404 -25.827 -0.375 1.00 0.00 C
ATOM 661 O PHE A 49 -5.309 -26.153 -1.142 1.00 0.00 O
ATOM 662 CB PHE A 49 -3.930 -23.505 0.391 1.00 0.00 C
ATOM 663 CG PHE A 49 -3.998 -24.029 1.827 1.00 0.00 C
ATOM 664 CD1 PHE A 49 -5.198 -24.359 2.374 1.00 0.00 C
ATOM 665 CD2 PHE A 49 -2.858 -24.163 2.556 1.00 0.00 C
ATOM 666 CE1 PHE A 49 -5.261 -24.846 3.707 1.00 0.00 C
ATOM 667 CE2 PHE A 49 -2.921 -24.650 3.889 1.00 0.00 C
ATOM 668 CZ PHE A 49 -4.121 -24.981 4.436 1.00 0.00 C
ATOM 669 H PHE A 49 -4.744 -23.521 -2.008 1.00 0.00 H
ATOM 670 HA PHE A 49 -2.513 -24.833 -0.643 1.00 0.00 H
ATOM 671 1HB PHE A 49 -3.193 -22.703 0.342 1.00 0.00 H
ATOM 672 2HB PHE A 49 -4.894 -23.068 0.129 1.00 0.00 H
ATOM 673 HD1 PHE A 49 -6.112 -24.251 1.790 1.00 0.00 H
ATOM 674 HD2 PHE A 49 -1.896 -23.898 2.118 1.00 0.00 H
ATOM 675 HE1 PHE A 49 -6.223 -25.111 4.145 1.00 0.00 H
ATOM 676 HE2 PHE A 49 -2.007 -24.758 4.473 1.00 0.00 H
ATOM 677 HZ PHE A 49 -4.170 -25.354 5.459 1.00 0.00 H
ATOM 678 N GLU A 50 -4.067 -26.498 0.716 1.00 0.00 N
ATOM 679 CA GLU A 50 -4.772 -27.711 1.097 1.00 0.00 C
ATOM 680 C GLU A 50 -4.357 -28.147 2.503 1.00 0.00 C
ATOM 681 O GLU A 50 -3.169 -28.201 2.815 1.00 0.00 O
ATOM 682 CB GLU A 50 -4.527 -28.829 0.081 1.00 0.00 C
ATOM 683 CG GLU A 50 -5.578 -29.933 0.217 1.00 0.00 C
ATOM 684 CD GLU A 50 -5.554 -30.864 -0.997 1.00 0.00 C
ATOM 685 OE1 GLU A 50 -6.110 -30.453 -2.039 1.00 0.00 O
ATOM 686 OE2 GLU A 50 -4.980 -31.966 -0.856 1.00 0.00 O
ATOM 687 H GLU A 50 -3.329 -26.227 1.335 1.00 0.00 H
ATOM 688 HA GLU A 50 -5.829 -27.446 1.088 1.00 0.00 H
ATOM 689 1HB GLU A 50 -4.552 -28.420 -0.929 1.00 0.00 H
ATOM 690 2HB GLU A 50 -3.532 -29.249 0.231 1.00 0.00 H
ATOM 691 1HG GLU A 50 -5.392 -30.507 1.124 1.00 0.00 H
ATOM 692 2HG GLU A 50 -6.567 -29.487 0.318 1.00 0.00 H
ATOM 693 N GLY A 51 -5.361 -28.447 3.315 1.00 0.00 N
ATOM 694 CA GLY A 51 -5.115 -28.877 4.681 1.00 0.00 C
ATOM 695 C GLY A 51 -6.309 -28.552 5.581 1.00 0.00 C
ATOM 696 O GLY A 51 -7.445 -28.903 5.262 1.00 0.00 O
ATOM 697 H GLY A 51 -6.325 -28.401 3.053 1.00 0.00 H
ATOM 698 1HA GLY A 51 -4.922 -29.950 4.700 1.00 0.00 H
ATOM 699 2HA GLY A 51 -4.221 -28.386 5.066 1.00 0.00 H
ATOM 700 N LYS A 52 -6.012 -27.887 6.687 1.00 0.00 N
ATOM 701 CA LYS A 52 -7.047 -27.511 7.635 1.00 0.00 C
ATOM 702 C LYS A 52 -6.649 -26.206 8.327 1.00 0.00 C
ATOM 703 O LYS A 52 -5.670 -25.568 7.942 1.00 0.00 O
ATOM 704 CB LYS A 52 -7.328 -28.660 8.606 1.00 0.00 C
ATOM 705 CG LYS A 52 -6.030 -29.360 9.017 1.00 0.00 C
ATOM 706 CD LYS A 52 -6.013 -30.812 8.534 1.00 0.00 C
ATOM 707 CE LYS A 52 -6.205 -31.781 9.702 1.00 0.00 C
ATOM 708 NZ LYS A 52 -6.792 -33.054 9.229 1.00 0.00 N
ATOM 709 H LYS A 52 -5.086 -27.606 6.939 1.00 0.00 H
ATOM 710 HA LYS A 52 -7.962 -27.337 7.069 1.00 0.00 H
ATOM 711 1HB LYS A 52 -7.835 -28.278 9.491 1.00 0.00 H
ATOM 712 2HB LYS A 52 -8.001 -29.379 8.139 1.00 0.00 H
ATOM 713 1HG LYS A 52 -5.177 -28.825 8.601 1.00 0.00 H
ATOM 714 2HG LYS A 52 -5.926 -29.333 10.102 1.00 0.00 H
ATOM 715 1HD LYS A 52 -6.803 -30.963 7.798 1.00 0.00 H
ATOM 716 2HD LYS A 52 -5.068 -31.021 8.034 1.00 0.00 H
ATOM 717 1HE LYS A 52 -5.246 -31.972 10.184 1.00 0.00 H
ATOM 718 2HE LYS A 52 -6.854 -31.331 10.453 1.00 0.00 H
ATOM 719 1HZ LYS A 52 -6.082 -33.606 8.792 1.00 0.00 H
ATOM 720 2HZ LYS A 52 -7.172 -33.555 10.006 1.00 0.00 H
ATOM 721 3HZ LYS A 52 -7.518 -32.861 8.569 1.00 0.00 H
ATOM 722 N LYS A 53 -7.429 -25.847 9.336 1.00 0.00 N
ATOM 723 CA LYS A 53 -7.171 -24.629 10.085 1.00 0.00 C
ATOM 724 C LYS A 53 -6.176 -24.927 11.209 1.00 0.00 C
ATOM 725 O LYS A 53 -5.649 -24.010 11.836 1.00 0.00 O
ATOM 726 CB LYS A 53 -8.482 -24.011 10.573 1.00 0.00 C
ATOM 727 CG LYS A 53 -9.325 -23.513 9.397 1.00 0.00 C
ATOM 728 CD LYS A 53 -10.636 -22.893 9.886 1.00 0.00 C
ATOM 729 CE LYS A 53 -11.803 -23.298 8.983 1.00 0.00 C
ATOM 730 NZ LYS A 53 -12.846 -23.996 9.768 1.00 0.00 N
ATOM 731 H LYS A 53 -8.223 -26.371 9.643 1.00 0.00 H
ATOM 732 HA LYS A 53 -6.714 -23.915 9.400 1.00 0.00 H
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ATOM 737 1HD LYS A 53 -10.834 -23.213 10.909 1.00 0.00 H
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ATOM 739 1HE LYS A 53 -12.228 -22.413 8.509 1.00 0.00 H
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ATOM 741 1HZ LYS A 53 -12.443 -24.364 10.605 1.00 0.00 H
ATOM 742 2HZ LYS A 53 -13.574 -23.351 10.003 1.00 0.00 H
ATOM 743 3HZ LYS A 53 -13.227 -24.744 9.224 1.00 0.00 H
ATOM 744 N THR A 54 -5.949 -26.214 11.428 1.00 0.00 N
ATOM 745 CA THR A 54 -5.027 -26.645 12.465 1.00 0.00 C
ATOM 746 C THR A 54 -3.655 -26.958 11.863 1.00 0.00 C
ATOM 747 O THR A 54 -2.626 -26.626 12.449 1.00 0.00 O
ATOM 748 CB THR A 54 -5.656 -27.834 13.193 1.00 0.00 C
ATOM 749 OG1 THR A 54 -5.573 -28.901 12.252 1.00 0.00 O
ATOM 750 CG2 THR A 54 -7.159 -27.654 13.419 1.00 0.00 C
ATOM 751 H THR A 54 -6.381 -26.954 10.913 1.00 0.00 H
ATOM 752 HA THR A 54 -4.888 -25.822 13.166 1.00 0.00 H
ATOM 753 HB THR A 54 -5.142 -28.032 14.133 1.00 0.00 H
ATOM 754 HG1 THR A 54 -6.121 -29.677 12.565 1.00 0.00 H
ATOM 755 1HG2 THR A 54 -7.363 -26.619 13.693 1.00 0.00 H
ATOM 756 2HG2 THR A 54 -7.696 -27.901 12.503 1.00 0.00 H
ATOM 757 3HG2 THR A 54 -7.487 -28.314 14.222 1.00 0.00 H
ATOM 758 N ASP A 55 -3.686 -27.592 10.700 1.00 0.00 N
ATOM 759 CA ASP A 55 -2.458 -27.953 10.012 1.00 0.00 C
ATOM 760 C ASP A 55 -1.450 -26.811 10.144 1.00 0.00 C
ATOM 761 O ASP A 55 -1.833 -25.643 10.196 1.00 0.00 O
ATOM 762 CB ASP A 55 -2.711 -28.191 8.522 1.00 0.00 C
ATOM 763 CG ASP A 55 -2.885 -29.657 8.122 1.00 0.00 C
ATOM 764 OD1 ASP A 55 -3.391 -29.883 7.001 1.00 0.00 O
ATOM 765 OD2 ASP A 55 -2.507 -30.519 8.944 1.00 0.00 O
ATOM 766 H ASP A 55 -4.528 -27.858 10.230 1.00 0.00 H
ATOM 767 HA ASP A 55 -2.117 -28.868 10.496 1.00 0.00 H
ATOM 768 1HB ASP A 55 -3.606 -27.641 8.229 1.00 0.00 H
ATOM 769 2HB ASP A 55 -1.879 -27.771 7.956 1.00 0.00 H
ATOM 770 N LYS A 56 -0.180 -27.187 10.195 1.00 0.00 N
ATOM 771 CA LYS A 56 0.886 -26.208 10.320 1.00 0.00 C
ATOM 772 C LYS A 56 0.948 -25.362 9.047 1.00 0.00 C
ATOM 773 O LYS A 56 0.986 -24.134 9.114 1.00 0.00 O
ATOM 774 CB LYS A 56 2.208 -26.897 10.665 1.00 0.00 C
ATOM 775 CG LYS A 56 3.207 -25.901 11.259 1.00 0.00 C
ATOM 776 CD LYS A 56 3.847 -25.047 10.162 1.00 0.00 C
ATOM 777 CE LYS A 56 4.941 -24.146 10.738 1.00 0.00 C
ATOM 778 NZ LYS A 56 6.021 -23.944 9.747 1.00 0.00 N
ATOM 779 H LYS A 56 0.123 -28.139 10.152 1.00 0.00 H
ATOM 780 HA LYS A 56 0.635 -25.556 11.156 1.00 0.00 H
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ATOM 828 1HB TYR A 58 -3.664 -24.709 7.264 1.00 0.00 H
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ATOM 834 HH TYR A 58 -7.601 -19.909 9.583 1.00 0.00 H
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ATOM 837 C LEU A 59 0.559 -20.704 9.590 1.00 0.00 C
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ATOM 843 H LEU A 59 -0.853 -23.541 9.566 1.00 0.00 H
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ATOM 845 1HB LEU A 59 0.960 -22.997 11.152 1.00 0.00 H
ATOM 846 2HB LEU A 59 0.571 -21.627 12.172 1.00 0.00 H
ATOM 847 HG LEU A 59 -1.388 -23.858 11.583 1.00 0.00 H
ATOM 848 1HD1 LEU A 59 -0.229 -23.835 14.264 1.00 0.00 H
ATOM 849 2HD1 LEU A 59 -0.488 -25.184 13.132 1.00 0.00 H
ATOM 850 3HD1 LEU A 59 0.969 -24.171 12.992 1.00 0.00 H
ATOM 851 1HD2 LEU A 59 -2.407 -21.757 12.304 1.00 0.00 H
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ATOM 853 3HD2 LEU A 59 -1.352 -21.725 13.737 1.00 0.00 H
ATOM 854 N MET A 60 1.372 -21.302 8.732 1.00 0.00 N
ATOM 855 CA MET A 60 2.372 -20.546 7.998 1.00 0.00 C
ATOM 856 C MET A 60 1.722 -19.439 7.165 1.00 0.00 C
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ATOM 859 CG MET A 60 4.346 -22.104 7.805 1.00 0.00 C
ATOM 860 SD MET A 60 4.936 -23.532 6.912 1.00 0.00 S
ATOM 861 CE MET A 60 5.243 -22.794 5.316 1.00 0.00 C
ATOM 862 H MET A 60 1.355 -22.282 8.535 1.00 0.00 H
ATOM 863 HA MET A 60 3.021 -20.107 8.755 1.00 0.00 H
ATOM 864 1HB MET A 60 2.491 -22.279 6.719 1.00 0.00 H
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ATOM 871 N ILE A 61 0.742 -19.840 6.369 1.00 0.00 N
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ATOM 875 CB ILE A 61 -0.798 -19.639 4.472 1.00 0.00 C
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ATOM 878 CD1 ILE A 61 -0.771 -21.676 2.986 1.00 0.00 C
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ATOM 890 N GLU A 62 -1.431 -18.525 7.398 1.00 0.00 N
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ATOM 892 C GLU A 62 -1.433 -16.596 8.905 1.00 0.00 C
ATOM 893 O GLU A 62 -1.822 -15.433 8.801 1.00 0.00 O
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ATOM 896 CD GLU A 62 -2.812 -17.046 11.377 1.00 0.00 C
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ATOM 920 N TYR A 64 1.545 -15.629 7.955 1.00 0.00 N
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ATOM 925 CG TYR A 64 3.744 -16.497 5.754 1.00 0.00 C
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ATOM 929 CE2 TYR A 64 5.198 -18.445 5.514 1.00 0.00 C
ATOM 930 CZ TYR A 64 6.268 -17.659 5.805 1.00 0.00 C
ATOM 931 OH TYR A 64 7.504 -18.227 5.830 1.00 0.00 O
ATOM 932 H TYR A 64 1.506 -16.616 7.802 1.00 0.00 H
ATOM 933 HA TYR A 64 3.010 -14.370 7.218 1.00 0.00 H
ATOM 934 1HB TYR A 64 1.602 -16.645 5.778 1.00 0.00 H
ATOM 935 2HB TYR A 64 2.219 -15.350 4.771 1.00 0.00 H
ATOM 936 HD1 TYR A 64 4.737 -14.664 6.256 1.00 0.00 H
ATOM 937 HD2 TYR A 64 3.015 -18.451 5.257 1.00 0.00 H
ATOM 938 HE1 TYR A 64 7.043 -15.733 6.301 1.00 0.00 H
ATOM 939 HE2 TYR A 64 5.327 -19.508 5.306 1.00 0.00 H
ATOM 940 HH TYR A 64 7.679 -18.624 6.731 1.00 0.00 H
ATOM 941 N LEU A 65 -0.139 -14.197 6.282 1.00 0.00 N
ATOM 942 CA LEU A 65 -1.184 -13.291 5.836 1.00 0.00 C
ATOM 943 C LEU A 65 -1.254 -12.094 6.786 1.00 0.00 C
ATOM 944 O LEU A 65 -1.117 -10.949 6.358 1.00 0.00 O
ATOM 945 CB LEU A 65 -2.512 -14.037 5.687 1.00 0.00 C
ATOM 946 CG LEU A 65 -2.640 -14.939 4.458 1.00 0.00 C
ATOM 947 CD1 LEU A 65 -3.953 -15.724 4.488 1.00 0.00 C
ATOM 948 CD2 LEU A 65 -2.484 -14.132 3.167 1.00 0.00 C
ATOM 949 H LEU A 65 -0.448 -15.122 6.504 1.00 0.00 H
ATOM 950 HA LEU A 65 -0.904 -12.931 4.846 1.00 0.00 H
ATOM 951 1HB LEU A 65 -2.665 -14.646 6.578 1.00 0.00 H
ATOM 952 2HB LEU A 65 -3.317 -13.303 5.660 1.00 0.00 H
ATOM 953 HG LEU A 65 -1.829 -15.667 4.482 1.00 0.00 H
ATOM 954 1HD1 LEU A 65 -3.926 -16.507 3.731 1.00 0.00 H
ATOM 955 2HD1 LEU A 65 -4.084 -16.174 5.472 1.00 0.00 H
ATOM 956 3HD1 LEU A 65 -4.784 -15.049 4.283 1.00 0.00 H
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ATOM 958 2HD2 LEU A 65 -3.126 -13.252 3.209 1.00 0.00 H
ATOM 959 3HD2 LEU A 65 -1.446 -13.819 3.057 1.00 0.00 H
ATOM 960 N THR A 66 -1.469 -12.400 8.057 1.00 0.00 N
ATOM 961 CA THR A 66 -1.559 -11.363 9.071 1.00 0.00 C
ATOM 962 C THR A 66 -0.302 -10.491 9.056 1.00 0.00 C
ATOM 963 O THR A 66 -0.391 -9.266 9.110 1.00 0.00 O
ATOM 964 CB THR A 66 -1.813 -12.041 10.419 1.00 0.00 C
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ATOM 966 CG2 THR A 66 -1.684 -11.071 11.596 1.00 0.00 C
ATOM 967 H THR A 66 -1.580 -13.334 8.397 1.00 0.00 H
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ATOM 1013 C LEU A 69 -1.263 -5.912 8.605 1.00 0.00 C
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ATOM 1016 CG LEU A 69 -3.979 -8.545 7.552 1.00 0.00 C
ATOM 1017 CD1 LEU A 69 -5.084 -9.193 8.388 1.00 0.00 C
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ATOM 1069 1HB LEU A 72 -2.249 -4.255 6.302 1.00 0.00 H
ATOM 1070 2HB LEU A 72 -2.715 -2.915 5.273 1.00 0.00 H
ATOM 1071 HG LEU A 72 -0.562 -4.910 4.531 1.00 0.00 H
ATOM 1072 1HD1 LEU A 72 -2.514 -6.223 4.717 1.00 0.00 H
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ATOM 1075 1HD2 LEU A 72 -0.385 -2.775 3.374 1.00 0.00 H
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ATOM 1077 3HD2 LEU A 72 -2.091 -2.882 2.877 1.00 0.00 H
ATOM 1078 N ASP A 73 -1.418 -2.034 8.389 1.00 0.00 N
ATOM 1079 CA ASP A 73 -1.901 -1.127 9.416 1.00 0.00 C
ATOM 1080 C ASP A 73 -0.769 -0.187 9.834 1.00 0.00 C
ATOM 1081 O ASP A 73 -0.997 0.999 10.067 1.00 0.00 O
ATOM 1082 CB ASP A 73 -2.361 -1.895 10.657 1.00 0.00 C
ATOM 1083 CG ASP A 73 -3.660 -1.388 11.286 1.00 0.00 C
ATOM 1084 OD1 ASP A 73 -3.695 -1.314 12.534 1.00 0.00 O
ATOM 1085 OD2 ASP A 73 -4.589 -1.087 10.506 1.00 0.00 O
ATOM 1086 H ASP A 73 -1.188 -2.953 8.711 1.00 0.00 H
ATOM 1087 HA ASP A 73 -2.737 -0.597 8.959 1.00 0.00 H
ATOM 1088 1HB ASP A 73 -2.489 -2.944 10.390 1.00 0.00 H
ATOM 1089 2HB ASP A 73 -1.570 -1.851 11.406 1.00 0.00 H
ATOM 1090 N SER A 74 0.427 -0.751 9.915 1.00 0.00 N
ATOM 1091 CA SER A 74 1.595 0.022 10.301 1.00 0.00 C
ATOM 1092 C SER A 74 1.641 1.330 9.508 1.00 0.00 C
ATOM 1093 O SER A 74 2.241 2.308 9.952 1.00 0.00 O
ATOM 1094 CB SER A 74 2.881 -0.777 10.083 1.00 0.00 C
ATOM 1095 OG SER A 74 4.036 -0.053 10.498 1.00 0.00 O
ATOM 1096 H SER A 74 0.603 -1.717 9.724 1.00 0.00 H
ATOM 1097 HA SER A 74 1.469 0.223 11.365 1.00 0.00 H
ATOM 1098 1HB SER A 74 2.823 -1.715 10.634 1.00 0.00 H
ATOM 1099 2HB SER A 74 2.974 -1.033 9.027 1.00 0.00 H
ATOM 1100 HG SER A 74 4.696 -0.675 10.920 1.00 0.00 H
ATOM 1101 N VAL A 75 1.000 1.305 8.349 1.00 0.00 N
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ATOM 1109 HA VAL A 75 1.977 2.865 7.417 1.00 0.00 H
ATOM 1110 HB VAL A 75 -0.464 1.584 6.177 1.00 0.00 H
ATOM 1111 1HG1 VAL A 75 1.237 3.520 4.661 1.00 0.00 H
ATOM 1112 2HG1 VAL A 75 -0.492 3.135 4.491 1.00 0.00 H
ATOM 1113 3HG1 VAL A 75 0.062 4.174 5.826 1.00 0.00 H
ATOM 1114 1HG2 VAL A 75 1.171 0.887 4.422 1.00 0.00 H
ATOM 1115 2HG2 VAL A 75 2.481 1.525 5.444 1.00 0.00 H
ATOM 1116 3HG2 VAL A 75 1.486 0.166 6.019 1.00 0.00 H
ATOM 1117 N ASP A 76 0.610 4.753 8.202 1.00 0.00 N
ATOM 1118 CA ASP A 76 -0.121 5.865 8.787 1.00 0.00 C
ATOM 1119 C ASP A 76 -0.544 6.831 7.678 1.00 0.00 C
ATOM 1120 O ASP A 76 0.275 7.595 7.170 1.00 0.00 O
ATOM 1121 CB ASP A 76 0.752 6.636 9.779 1.00 0.00 C
ATOM 1122 CG ASP A 76 2.043 7.211 9.194 1.00 0.00 C
ATOM 1123 OD1 ASP A 76 2.638 8.075 9.872 1.00 0.00 O
ATOM 1124 OD2 ASP A 76 2.406 6.772 8.081 1.00 0.00 O
ATOM 1125 H ASP A 76 1.525 4.978 7.868 1.00 0.00 H
ATOM 1126 HA ASP A 76 -0.973 5.412 9.293 1.00 0.00 H
ATOM 1127 1HB ASP A 76 0.165 7.454 10.197 1.00 0.00 H
ATOM 1128 2HB ASP A 76 1.008 5.974 10.606 1.00 0.00 H
ATOM 1129 N PRO A 77 -1.856 6.763 7.327 1.00 0.00 N
ATOM 1130 CA PRO A 77 -2.397 7.623 6.288 1.00 0.00 C
ATOM 1131 C PRO A 77 -2.572 9.055 6.797 1.00 0.00 C
ATOM 1132 O PRO A 77 -2.507 10.006 6.020 1.00 0.00 O
ATOM 1133 CB PRO A 77 -3.710 6.972 5.884 1.00 0.00 C
ATOM 1134 CG PRO A 77 -4.081 6.038 7.024 1.00 0.00 C
ATOM 1135 CD PRO A 77 -2.855 5.870 7.907 1.00 0.00 C
ATOM 1136 HA PRO A 77 -1.761 7.682 5.519 1.00 0.00 H
ATOM 1137 1HB PRO A 77 -4.485 7.722 5.726 1.00 0.00 H
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ATOM 1139 1HG PRO A 77 -4.912 6.448 7.599 1.00 0.00 H
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ATOM 1255 CB GLN A 85 -8.509 4.337 -1.044 1.00 0.00 C
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ATOM 1257 CD GLN A 85 -7.722 4.739 -3.407 1.00 0.00 C
ATOM 1258 OE1 GLN A 85 -8.763 5.348 -3.593 1.00 0.00 O
ATOM 1259 NE2 GLN A 85 -6.799 4.541 -4.343 1.00 0.00 N
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ATOM 1261 HA GLN A 85 -9.155 3.315 0.733 1.00 0.00 H
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ATOM 1263 2HB GLN A 85 -8.646 5.403 -0.859 1.00 0.00 H
ATOM 1264 1HG GLN A 85 -6.458 4.586 -1.666 1.00 0.00 H
ATOM 1265 2HG GLN A 85 -7.173 3.065 -2.162 1.00 0.00 H
ATOM 1266 1HE2 GLN A 85 -5.966 4.032 -4.123 1.00 0.00 H
ATOM 1267 2HE2 GLN A 85 -6.936 4.901 -5.265 1.00 0.00 H
ATOM 1268 N ALA A 86 -6.057 2.662 -0.215 1.00 0.00 N
ATOM 1269 CA ALA A 86 -5.100 1.595 -0.454 1.00 0.00 C
ATOM 1270 C ALA A 86 -5.032 0.691 0.778 1.00 0.00 C
ATOM 1271 O ALA A 86 -5.070 -0.533 0.657 1.00 0.00 O
ATOM 1272 CB ALA A 86 -3.740 2.199 -0.810 1.00 0.00 C
ATOM 1273 H ALA A 86 -5.679 3.587 -0.263 1.00 0.00 H
ATOM 1274 HA ALA A 86 -5.458 1.012 -1.303 1.00 0.00 H
ATOM 1275 1HB ALA A 86 -3.135 2.290 0.093 1.00 0.00 H
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ATOM 1278 N ARG A 87 -4.933 1.328 1.936 1.00 0.00 N
ATOM 1279 CA ARG A 87 -4.860 0.597 3.189 1.00 0.00 C
ATOM 1280 C ARG A 87 -6.092 -0.295 3.356 1.00 0.00 C
ATOM 1281 O ARG A 87 -5.973 -1.516 3.437 1.00 0.00 O
ATOM 1282 CB ARG A 87 -4.766 1.552 4.380 1.00 0.00 C
ATOM 1283 CG ARG A 87 -3.647 1.129 5.335 1.00 0.00 C
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ATOM 1285 NE ARG A 87 -2.980 2.031 7.531 1.00 0.00 N
ATOM 1286 CZ ARG A 87 -4.022 2.022 8.373 1.00 0.00 C
ATOM 1287 NH1 ARG A 87 -5.251 2.302 7.920 1.00 0.00 N
ATOM 1288 NH2 ARG A 87 -3.835 1.733 9.668 1.00 0.00 N
ATOM 1289 H ARG A 87 -4.903 2.324 2.025 1.00 0.00 H
ATOM 1290 HA ARG A 87 -3.952 -0.001 3.110 1.00 0.00 H
ATOM 1291 1HB ARG A 87 -4.580 2.566 4.023 1.00 0.00 H
ATOM 1292 2HB ARG A 87 -5.716 1.571 4.913 1.00 0.00 H
ATOM 1293 1HG ARG A 87 -4.030 0.399 6.048 1.00 0.00 H
ATOM 1294 2HG ARG A 87 -2.851 0.640 4.774 1.00 0.00 H
ATOM 1295 1HD ARG A 87 -2.101 2.595 5.690 1.00 0.00 H
ATOM 1296 2HD ARG A 87 -3.726 3.203 5.935 1.00 0.00 H
ATOM 1297 HE ARG A 87 -2.076 1.817 7.901 1.00 0.00 H
ATOM 1298 1HH1 ARG A 87 -5.391 2.518 6.953 1.00 0.00 H
ATOM 1299 2HH1 ARG A 87 -6.029 2.296 8.548 1.00 0.00 H
ATOM 1300 1HH2 ARG A 87 -2.917 1.524 10.006 1.00 0.00 H
ATOM 1301 2HH2 ARG A 87 -4.612 1.727 10.296 1.00 0.00 H
ATOM 1302 N ARG A 88 -7.248 0.351 3.402 1.00 0.00 N
ATOM 1303 CA ARG A 88 -8.501 -0.368 3.558 1.00 0.00 C
ATOM 1304 C ARG A 88 -8.629 -1.451 2.485 1.00 0.00 C
ATOM 1305 O ARG A 88 -9.296 -2.463 2.695 1.00 0.00 O
ATOM 1306 CB ARG A 88 -9.697 0.581 3.461 1.00 0.00 C
ATOM 1307 CG ARG A 88 -10.325 0.531 2.066 1.00 0.00 C
ATOM 1308 CD ARG A 88 -11.499 1.506 1.958 1.00 0.00 C
ATOM 1309 NE ARG A 88 -11.426 2.246 0.678 1.00 0.00 N
ATOM 1310 CZ ARG A 88 -11.789 1.736 -0.506 1.00 0.00 C
ATOM 1311 NH1 ARG A 88 -12.253 0.481 -0.582 1.00 0.00 N
ATOM 1312 NH2 ARG A 88 -11.689 2.481 -1.616 1.00 0.00 N
ATOM 1313 H ARG A 88 -7.337 1.345 3.336 1.00 0.00 H
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ATOM 1321 HE ARG A 88 -11.084 3.186 0.699 1.00 0.00 H
ATOM 1322 1HH1 ARG A 88 -12.327 -0.075 0.246 1.00 0.00 H
ATOM 1323 2HH1 ARG A 88 -12.523 0.100 -1.466 1.00 0.00 H
ATOM 1324 1HH2 ARG A 88 -11.343 3.417 -1.559 1.00 0.00 H
ATOM 1325 2HH2 ARG A 88 -11.960 2.100 -2.500 1.00 0.00 H
ATOM 1326 N ASP A 89 -7.980 -1.200 1.357 1.00 0.00 N
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ATOM 1330 CB ASP A 89 -7.531 -1.484 -1.045 1.00 0.00 C
ATOM 1331 CG ASP A 89 -7.732 -2.322 -2.309 1.00 0.00 C
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ATOM 1340 C GLY A 90 -5.265 -4.882 2.222 1.00 0.00 C
ATOM 1341 O GLY A 90 -5.156 -6.106 2.167 1.00 0.00 O
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ATOM 1360 3HG2 VAL A 91 -5.139 -2.268 5.507 1.00 0.00 H
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ATOM 1365 CB ARG A 92 -10.515 -4.971 2.203 1.00 0.00 C
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ATOM 1367 CD ARG A 92 -12.688 -4.936 0.923 1.00 0.00 C
ATOM 1368 NE ARG A 92 -13.714 -5.796 0.292 1.00 0.00 N
ATOM 1369 CZ ARG A 92 -15.011 -5.474 0.200 1.00 0.00 C
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ATOM 1372 H ARG A 92 -8.329 -4.224 3.107 1.00 0.00 H
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ATOM 1378 1HD ARG A 92 -13.106 -4.442 1.800 1.00 0.00 H
ATOM 1379 2HD ARG A 92 -12.383 -4.152 0.230 1.00 0.00 H
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ATOM 1381 1HH1 ARG A 92 -14.809 -3.682 1.139 1.00 0.00 H
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ATOM 1385 N LYS A 93 -8.140 -6.896 1.303 1.00 0.00 N
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ATOM 1387 C LYS A 93 -7.205 -9.141 1.232 1.00 0.00 C
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ATOM 1390 CG LYS A 93 -5.773 -8.529 -1.141 1.00 0.00 C
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ATOM 1392 CE LYS A 93 -4.957 -9.132 -3.450 1.00 0.00 C
ATOM 1393 NZ LYS A 93 -5.331 -8.564 -4.765 1.00 0.00 N
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ATOM 1454 N ILE A 97 -8.360 -13.140 1.830 1.00 0.00 N
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ATOM 1473 N LEU A 98 -7.565 -14.538 4.044 1.00 0.00 N
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ATOM 1476 O LEU A 98 -8.970 -17.219 5.694 1.00 0.00 O
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ATOM 1491 3HD2 LEU A 98 -6.112 -16.044 7.725 1.00 0.00 H
ATOM 1492 N GLU A 99 -10.031 -15.326 5.056 1.00 0.00 N
ATOM 1493 CA GLU A 99 -11.353 -15.927 5.077 1.00 0.00 C
ATOM 1494 C GLU A 99 -11.426 -17.085 4.081 1.00 0.00 C
ATOM 1495 O GLU A 99 -12.187 -18.032 4.278 1.00 0.00 O
ATOM 1496 CB GLU A 99 -12.434 -14.884 4.786 1.00 0.00 C
ATOM 1497 CG GLU A 99 -13.334 -14.672 6.005 1.00 0.00 C
ATOM 1498 CD GLU A 99 -14.533 -13.789 5.654 1.00 0.00 C
ATOM 1499 OE1 GLU A 99 -14.468 -12.586 5.986 1.00 0.00 O
ATOM 1500 OE2 GLU A 99 -15.488 -14.337 5.062 1.00 0.00 O
ATOM 1501 H GLU A 99 -10.009 -14.361 4.792 1.00 0.00 H
ATOM 1502 HA GLU A 99 -11.484 -16.303 6.092 1.00 0.00 H
ATOM 1503 1HB GLU A 99 -11.968 -13.940 4.505 1.00 0.00 H
ATOM 1504 2HB GLU A 99 -13.037 -15.207 3.937 1.00 0.00 H
ATOM 1505 1HG GLU A 99 -13.684 -15.636 6.375 1.00 0.00 H
ATOM 1506 2HG GLU A 99 -12.761 -14.210 6.809 1.00 0.00 H
ATOM 1507 N LYS A 100 -10.624 -16.973 3.032 1.00 0.00 N
ATOM 1508 CA LYS A 100 -10.588 -17.999 2.004 1.00 0.00 C
ATOM 1509 C LYS A 100 -9.740 -19.175 2.493 1.00 0.00 C
ATOM 1510 O LYS A 100 -10.138 -20.331 2.359 1.00 0.00 O
ATOM 1511 CB LYS A 100 -10.114 -17.410 0.674 1.00 0.00 C
ATOM 1512 CG LYS A 100 -10.042 -18.488 -0.409 1.00 0.00 C
ATOM 1513 CD LYS A 100 -10.092 -17.865 -1.806 1.00 0.00 C
ATOM 1514 CE LYS A 100 -8.729 -17.289 -2.198 1.00 0.00 C
ATOM 1515 NZ LYS A 100 -7.896 -18.325 -2.849 1.00 0.00 N
ATOM 1516 H LYS A 100 -10.008 -16.200 2.879 1.00 0.00 H
ATOM 1517 HA LYS A 100 -11.610 -18.349 1.855 1.00 0.00 H
ATOM 1518 1HB LYS A 100 -10.794 -16.618 0.360 1.00 0.00 H
ATOM 1519 2HB LYS A 100 -9.133 -16.953 0.804 1.00 0.00 H
ATOM 1520 1HG LYS A 100 -9.123 -19.062 -0.295 1.00 0.00 H
ATOM 1521 2HG LYS A 100 -10.871 -19.185 -0.288 1.00 0.00 H
ATOM 1522 1HD LYS A 100 -10.394 -18.619 -2.533 1.00 0.00 H
ATOM 1523 2HD LYS A 100 -10.845 -17.078 -1.831 1.00 0.00 H
ATOM 1524 1HE LYS A 100 -8.866 -16.445 -2.874 1.00 0.00 H
ATOM 1525 2HE LYS A 100 -8.221 -16.908 -1.312 1.00 0.00 H
ATOM 1526 1HZ LYS A 100 -6.935 -18.053 -2.808 1.00 0.00 H
ATOM 1527 2HZ LYS A 100 -8.017 -19.196 -2.374 1.00 0.00 H
ATOM 1528 3HZ LYS A 100 -8.174 -18.424 -3.804 1.00 0.00 H
ATOM 1529 N LEU A 101 -8.585 -18.839 3.050 1.00 0.00 N
ATOM 1530 CA LEU A 101 -7.677 -19.852 3.559 1.00 0.00 C
ATOM 1531 C LEU A 101 -8.453 -20.826 4.448 1.00 0.00 C
ATOM 1532 O LEU A 101 -8.637 -21.988 4.089 1.00 0.00 O
ATOM 1533 CB LEU A 101 -6.483 -19.199 4.258 1.00 0.00 C
ATOM 1534 CG LEU A 101 -5.177 -19.996 4.239 1.00 0.00 C
ATOM 1535 CD1 LEU A 101 -4.415 -19.830 5.556 1.00 0.00 C
ATOM 1536 CD2 LEU A 101 -5.436 -21.467 3.908 1.00 0.00 C
ATOM 1537 H LEU A 101 -8.268 -17.896 3.155 1.00 0.00 H
ATOM 1538 HA LEU A 101 -7.288 -20.402 2.702 1.00 0.00 H
ATOM 1539 1HB LEU A 101 -6.301 -18.230 3.794 1.00 0.00 H
ATOM 1540 2HB LEU A 101 -6.755 -19.009 5.297 1.00 0.00 H
ATOM 1541 HG LEU A 101 -4.543 -19.594 3.448 1.00 0.00 H
ATOM 1542 1HD1 LEU A 101 -5.113 -19.560 6.348 1.00 0.00 H
ATOM 1543 2HD1 LEU A 101 -3.922 -20.769 5.811 1.00 0.00 H
ATOM 1544 3HD1 LEU A 101 -3.667 -19.045 5.447 1.00 0.00 H
ATOM 1545 1HD2 LEU A 101 -5.679 -21.563 2.850 1.00 0.00 H
ATOM 1546 2HD2 LEU A 101 -4.545 -22.052 4.132 1.00 0.00 H
ATOM 1547 3HD2 LEU A 101 -6.271 -21.832 4.507 1.00 0.00 H
ATOM 1548 N GLU A 102 -8.888 -20.316 5.591 1.00 0.00 N
ATOM 1549 CA GLU A 102 -9.640 -21.126 6.534 1.00 0.00 C
ATOM 1550 C GLU A 102 -10.610 -22.045 5.789 1.00 0.00 C
ATOM 1551 O GLU A 102 -10.781 -23.205 6.160 1.00 0.00 O
ATOM 1552 CB GLU A 102 -10.383 -20.246 7.542 1.00 0.00 C
ATOM 1553 CG GLU A 102 -11.272 -19.226 6.828 1.00 0.00 C
ATOM 1554 CD GLU A 102 -12.198 -18.518 7.819 1.00 0.00 C
ATOM 1555 OE1 GLU A 102 -11.870 -17.367 8.179 1.00 0.00 O
ATOM 1556 OE2 GLU A 102 -13.213 -19.143 8.194 1.00 0.00 O
ATOM 1557 H GLU A 102 -8.734 -19.370 5.875 1.00 0.00 H
ATOM 1558 HA GLU A 102 -8.896 -21.723 7.061 1.00 0.00 H
ATOM 1559 1HB GLU A 102 -10.992 -20.871 8.195 1.00 0.00 H
ATOM 1560 2HB GLU A 102 -9.664 -19.727 8.176 1.00 0.00 H
ATOM 1561 1HG GLU A 102 -10.650 -18.491 6.317 1.00 0.00 H
ATOM 1562 2HG GLU A 102 -11.866 -19.728 6.064 1.00 0.00 H
ATOM 1563 N GLN A 103 -11.220 -21.492 4.751 1.00 0.00 N
ATOM 1564 CA GLN A 103 -12.168 -22.248 3.950 1.00 0.00 C
ATOM 1565 C GLN A 103 -11.439 -23.315 3.130 1.00 0.00 C
ATOM 1566 O GLN A 103 -11.852 -24.473 3.106 1.00 0.00 O
ATOM 1567 CB GLN A 103 -12.982 -21.321 3.044 1.00 0.00 C
ATOM 1568 CG GLN A 103 -14.026 -20.545 3.850 1.00 0.00 C
ATOM 1569 CD GLN A 103 -15.441 -21.020 3.513 1.00 0.00 C
ATOM 1570 OE1 GLN A 103 -15.650 -21.905 2.700 1.00 0.00 O
ATOM 1571 NE2 GLN A 103 -16.398 -20.383 4.183 1.00 0.00 N
ATOM 1572 H GLN A 103 -11.075 -20.548 4.455 1.00 0.00 H
ATOM 1573 HA GLN A 103 -12.837 -22.725 4.667 1.00 0.00 H
ATOM 1574 1HB GLN A 103 -12.315 -20.623 2.539 1.00 0.00 H
ATOM 1575 2HB GLN A 103 -13.477 -21.907 2.269 1.00 0.00 H
ATOM 1576 1HG GLN A 103 -13.839 -20.676 4.916 1.00 0.00 H
ATOM 1577 2HG GLN A 103 -13.935 -19.480 3.638 1.00 0.00 H
ATOM 1578 1HE2 GLN A 103 -16.159 -19.666 4.837 1.00 0.00 H
ATOM 1579 2HE2 GLN A 103 -17.358 -20.622 4.032 1.00 0.00 H
ATOM 1580 N LYS A 104 -10.368 -22.886 2.479 1.00 0.00 N
ATOM 1581 CA LYS A 104 -9.578 -23.789 1.661 1.00 0.00 C
ATOM 1582 C LYS A 104 -9.155 -24.995 2.502 1.00 0.00 C
ATOM 1583 O LYS A 104 -9.071 -26.112 1.995 1.00 0.00 O
ATOM 1584 CB LYS A 104 -8.405 -23.045 1.020 1.00 0.00 C
ATOM 1585 CG LYS A 104 -8.881 -21.773 0.316 1.00 0.00 C
ATOM 1586 CD LYS A 104 -8.727 -21.894 -1.201 1.00 0.00 C
ATOM 1587 CE LYS A 104 -9.470 -23.122 -1.731 1.00 0.00 C
ATOM 1588 NZ LYS A 104 -9.443 -23.146 -3.210 1.00 0.00 N
ATOM 1589 H LYS A 104 -10.039 -21.942 2.505 1.00 0.00 H
ATOM 1590 HA LYS A 104 -10.218 -24.140 0.851 1.00 0.00 H
ATOM 1591 1HB LYS A 104 -7.670 -22.789 1.784 1.00 0.00 H
ATOM 1592 2HB LYS A 104 -7.905 -23.696 0.303 1.00 0.00 H
ATOM 1593 1HG LYS A 104 -9.926 -21.585 0.565 1.00 0.00 H
ATOM 1594 2HG LYS A 104 -8.309 -20.918 0.676 1.00 0.00 H
ATOM 1595 1HD LYS A 104 -9.112 -20.996 -1.683 1.00 0.00 H
ATOM 1596 2HD LYS A 104 -7.670 -21.966 -1.458 1.00 0.00 H
ATOM 1597 1HE LYS A 104 -9.012 -24.030 -1.338 1.00 0.00 H
ATOM 1598 2HE LYS A 104 -10.502 -23.109 -1.381 1.00 0.00 H
ATOM 1599 1HZ LYS A 104 -8.580 -23.544 -3.521 1.00 0.00 H
ATOM 1600 2HZ LYS A 104 -10.206 -23.697 -3.549 1.00 0.00 H
ATOM 1601 3HZ LYS A 104 -9.525 -22.213 -3.560 1.00 0.00 H
ATOM 1602 N ALA A 105 -8.901 -24.728 3.775 1.00 0.00 N
ATOM 1603 CA ALA A 105 -8.489 -25.777 4.692 1.00 0.00 C
ATOM 1604 C ALA A 105 -9.700 -26.641 5.049 1.00 0.00 C
ATOM 1605 O ALA A 105 -9.593 -27.864 5.127 1.00 0.00 O
ATOM 1606 CB ALA A 105 -7.836 -25.150 5.925 1.00 0.00 C
ATOM 1607 H ALA A 105 -8.972 -23.817 4.180 1.00 0.00 H
ATOM 1608 HA ALA A 105 -7.751 -26.395 4.180 1.00 0.00 H
ATOM 1609 1HB ALA A 105 -7.808 -24.066 5.811 1.00 0.00 H
ATOM 1610 2HB ALA A 105 -8.415 -25.407 6.813 1.00 0.00 H
ATOM 1611 3HB ALA A 105 -6.820 -25.530 6.032 1.00 0.00 H
ATOM 1612 N SER A 106 -10.824 -25.971 5.256 1.00 0.00 N
ATOM 1613 CA SER A 106 -12.054 -26.662 5.603 1.00 0.00 C
ATOM 1614 C SER A 106 -12.665 -27.303 4.354 1.00 0.00 C
ATOM 1615 O SER A 106 -13.715 -27.938 4.429 1.00 0.00 O
ATOM 1616 CB SER A 106 -13.057 -25.708 6.254 1.00 0.00 C
ATOM 1617 OG SER A 106 -14.186 -26.399 6.783 1.00 0.00 O
ATOM 1618 H SER A 106 -10.903 -24.976 5.190 1.00 0.00 H
ATOM 1619 HA SER A 106 -11.762 -27.428 6.322 1.00 0.00 H
ATOM 1620 1HB SER A 106 -12.564 -25.153 7.053 1.00 0.00 H
ATOM 1621 2HB SER A 106 -13.393 -24.977 5.518 1.00 0.00 H
ATOM 1622 HG SER A 106 -14.374 -27.216 6.237 1.00 0.00 H
ATOM 1623 N GLY A 107 -11.980 -27.114 3.236 1.00 0.00 N
ATOM 1624 CA GLY A 107 -12.441 -27.665 1.974 1.00 0.00 C
ATOM 1625 C GLY A 107 -12.803 -26.552 0.989 1.00 0.00 C
ATOM 1626 O GLY A 107 -13.494 -25.600 1.348 1.00 0.00 O
ATOM 1627 H GLY A 107 -11.126 -26.596 3.184 1.00 0.00 H
ATOM 1628 1HA GLY A 107 -11.665 -28.298 1.544 1.00 0.00 H
ATOM 1629 2HA GLY A 107 -13.310 -28.300 2.146 1.00 0.00 H
ATOM 1630 N PRO A 108 -12.306 -26.712 -0.267 1.00 0.00 N
ATOM 1631 CA PRO A 108 -12.570 -25.731 -1.307 1.00 0.00 C
ATOM 1632 C PRO A 108 -14.005 -25.851 -1.822 1.00 0.00 C
ATOM 1633 O PRO A 108 -14.760 -26.713 -1.374 1.00 0.00 O
ATOM 1634 CB PRO A 108 -11.528 -26.006 -2.380 1.00 0.00 C
ATOM 1635 CG PRO A 108 -11.022 -27.415 -2.118 1.00 0.00 C
ATOM 1636 CD PRO A 108 -11.483 -27.826 -0.729 1.00 0.00 C
ATOM 1637 HA PRO A 108 -12.488 -24.805 -0.939 1.00 0.00 H
ATOM 1638 1HB PRO A 108 -11.964 -25.926 -3.376 1.00 0.00 H
ATOM 1639 2HB PRO A 108 -10.715 -25.282 -2.329 1.00 0.00 H
ATOM 1640 1HG PRO A 108 -11.408 -28.105 -2.868 1.00 0.00 H
ATOM 1641 2HG PRO A 108 -9.934 -27.448 -2.185 1.00 0.00 H
ATOM 1642 1HD PRO A 108 -12.054 -28.754 -0.760 1.00 0.00 H
ATOM 1643 2HD PRO A 108 -10.636 -27.994 -0.064 1.00 0.00 H
ATOM 1644 N SER A 109 -14.340 -24.974 -2.757 1.00 0.00 N
ATOM 1645 CA SER A 109 -15.671 -24.971 -3.339 1.00 0.00 C
ATOM 1646 C SER A 109 -15.732 -23.980 -4.503 1.00 0.00 C
ATOM 1647 O SER A 109 -15.900 -22.780 -4.293 1.00 0.00 O
ATOM 1648 CB SER A 109 -16.729 -24.622 -2.290 1.00 0.00 C
ATOM 1649 OG SER A 109 -17.957 -24.213 -2.886 1.00 0.00 O
ATOM 1650 H SER A 109 -13.720 -24.276 -3.117 1.00 0.00 H
ATOM 1651 HA SER A 109 -15.834 -25.989 -3.693 1.00 0.00 H
ATOM 1652 1HB SER A 109 -16.907 -25.488 -1.652 1.00 0.00 H
ATOM 1653 2HB SER A 109 -16.354 -23.825 -1.648 1.00 0.00 H
ATOM 1654 HG SER A 109 -18.303 -23.394 -2.428 1.00 0.00 H
ATOM 1655 N SER A 110 -15.591 -24.520 -5.705 1.00 0.00 N
ATOM 1656 CA SER A 110 -15.627 -23.698 -6.903 1.00 0.00 C
ATOM 1657 C SER A 110 -15.700 -24.588 -8.145 1.00 0.00 C
ATOM 1658 O SER A 110 -14.711 -25.214 -8.524 1.00 0.00 O
ATOM 1659 CB SER A 110 -14.405 -22.780 -6.979 1.00 0.00 C
ATOM 1660 OG SER A 110 -13.184 -23.510 -6.899 1.00 0.00 O
ATOM 1661 H SER A 110 -15.454 -25.497 -5.867 1.00 0.00 H
ATOM 1662 HA SER A 110 -16.530 -23.094 -6.811 1.00 0.00 H
ATOM 1663 1HB SER A 110 -14.432 -22.218 -7.912 1.00 0.00 H
ATOM 1664 2HB SER A 110 -14.447 -22.053 -6.168 1.00 0.00 H
ATOM 1665 HG SER A 110 -13.076 -24.086 -7.709 1.00 0.00 H
ATOM 1666 N GLY A 111 -16.881 -24.616 -8.745 1.00 0.00 N
ATOM 1667 CA GLY A 111 -17.096 -25.418 -9.938 1.00 0.00 C
ATOM 1668 C GLY A 111 -18.559 -25.854 -10.048 1.00 0.00 C
ATOM 1669 O GLY A 111 -19.369 -25.169 -10.670 1.00 0.00 O
ATOM 1670 H GLY A 111 -17.680 -24.103 -8.431 1.00 0.00 H
ATOM 1671 1HA GLY A 111 -16.816 -24.845 -10.821 1.00 0.00 H
ATOM 1672 2HA GLY A 111 -16.452 -26.297 -9.910 1.00 0.00 H
TER 1673 GLY A 111
ENDMDL
END
なお、得られた原子座標はプロテイン・データ・バンク（Protein Data Bank(PDB)、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)が運営）に受け入れコードＰＤＢ ＩＤ：１ＵＫ５として登録予定であり、本明細書において援用される。このＰＤＢ中の２０個の構造を重ね合わせて表示すると、上記立体構造座標の２６番目のヒスチジン残基から１０５番目のアラニン残基まで（配列番号２に示したアミノ酸配列）がよく重なり合う（同じコンフォメーションを持っている）ことが分かる。また、２５番目のリジンの側鎖がヘリックス上のグルタミン酸と静電相互作用し、ドメインの安定化に寄与している可能性もある。ＮＭＲ解析によって得られたこれらの立体構造情報は、本発明のＢＡＧ３ドメインの構造を理解する上で極めて有用である。
このように、タンパク質全長からコンピュータによりタンパク質の構造・機能を有する構成要素（ドメイン）を予測して、予測した領域を中心にＮ端、Ｃ端へ伸ばしたりカットしたりしたコンストラクトを各種作成し、これらのポリペプチドを発現させ、実際に取得したドメインポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥでその発現を確認した。さらに構造を有するか否かはＮＭＲを用いてＨＳＱＣ測定を行い個々のドメイン全てについて確認した。したがって、実際に構造をもつ（フォールドする）ドメインのタンパク質配列上の位置を正確に決定できたことが確認された。また、このような分子量の小さいドメインタンパク質を用いることで、容易に立体構造解析を行うことができるようになったことが確認された。
［実施例５］ＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物のインシリコスクリーニング
上記の立体構造解析結果に基づいてインシリコスクリーニングを行い、リガンド候補の検索と、ＢＡＧ３ドメインのファルマコフォアを探索した。
（１）データベース最適化
低分子化合物データベースの対照データベースとしてSPECS社から提供されている低分子化合物カタログデータベース用いた。１エントリーに複数分子を含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団として用いた。ここには152323分子含まれている。
Lipinski's Rule of 5に基づき、低分子化合物データベースについてターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞込み条件は以下の通りである。
１．分子量100以上500以下
２．計算LogP値(o/w)5以下(XLOGP-1アルゴリズム使用)
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるNとOの数） 10以下
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるNHとOHの数） 5以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な端結合数が２1以上のもの
２．ラジカルを含むもの
３．Ｈ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ以外の原子を含むもの
絞込み後の候補化合物の分子個数は、103773となった。
（２）結合部位予測
[１]立体構造類似性検索
距離行列比較[Holm L., Sander C., J. Mol. Biol. (1993), 233:123-138]を用いて、ＮＣＢＩが公開しているNon-redundat PDB chain setのうちredundancy levelがnon-identicalなものを対象に立体構造類似性検索を行った。この立体構造類似性検索には立体構造座標表１を用いた。
[２]結合部位予測
図１（ｂ）にターゲットであるＢＡＧ３ドメイン(赤)と、複合体構造として得られているＢＡＧ１（青）／Ｈｓｃ７０（緑） (PDB: 1HX1)のＢＡＧ１とを重ね合わせたもの示す。重ね合わせはＢＡＧ３ドメインとＢＡＧ１との配列アライメントに基づいている。次に図１（ｄ）に予測結合部位を黄で示す。ＳＰＨＧＥＮにより生成したスフィアの中で，ＢＡＧ１／Ｈｓｃ７０の相互作用（Science 291, 1553-1557 (2001)）に関わるＨｓｃ７０側残基のうちArg258, Arg261, Arg262, Thr265, Glu283, Ser286, Asp292及びTyr294(に含まれる原子)との中心間距離が４．５オングストローム以内にあるものを結合部位として選択した。
（３）スクリーニング
[１]一次スクリーニング
Dock4.0を用いて、結合サイトについて先に最適化を行った低分子化合物ライブラリー全体に対してドッキングを行った。Dockのエネルギースコア(energy score)に基づいて低分子化合物をランク付けした。
[２]二次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位10000分子について、AutoDock 3.0.5 を用いて、詳細なドッキングを行った。AutoDock終了後、ドッキングの際に使用したスフィアーから4オングストローム以内にある化合物に絞り込み更に計算が異常終了した分子を除去した結果、最終的に9934分子についてドッキング構造を得た。
（４）ファーマコフォア定義における重要な残基の探索
ターゲットであるＢＡＧ３ドメインの構造座標情報から、各リガンドについて４オングストローム以内のものを選択することによりファーマコフォア定義における重要なアミノ酸（立体構造座標表１に示したAla8、Pro9、Ala10、Glu11、Arg88、Val91、Arg92、Gln95、Thr96、Leu98、Glu99、Glu102）を求めた。
［実施例６］細胞増殖の測定
（１）細胞培養
[１] ＨｅＬａ細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清 (fetal bovine serum （FBS）)、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（L-glutamine）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン(penicillin)、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（streptomycin）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium（ＤＭＥＭ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとでＨｅＬａ細胞を培養した。
[２] ２９３細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清 (fetal bovine serum （FBS）)、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（L-glutamine）、０．１ｍＭのシグマ社製非必須アミノ酸（non-essential amino acids）、１ｍＭのシグマ社製ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（penicillin）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（streptomycin）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium（ＤＭＥＭ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとで２９３細胞を培養した。
（２）培養細胞への本発明のポリペプチドの遺伝子導入
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるマウスＢＡＧ３ドメインのｃＤＮＡ（配列番号３）を実施例３の発現ベクターより、制限酵素BamHI、XhoIで切り出し、インビトロジェン社のエントリーベクター（ゲートウェイシステム）のBamHI/XhoIマルチクローニングサイトに導入し、サブクローニングした。その後、ゲートウェイＬＲ反応によりｃＤＮＡ部分を、動物培養細胞の発現ベクターであるインビトロジェン社製ｐＤＥＳＴ２６（ＦＬＡＧ−ｔａｇおよびＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ配列を導入し、改変した。以下、単にｐＤＥＳＴ２６と記す。）に導入した。９６穴カルチャープレートの各ウェルに上記の２９３細胞、及びＨｅＬａ細胞をそれぞれ７５００個、５０００個ずつ蒔き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で約２４時間培養を行った。その後、それぞれに上記ｃＤＮＡを導入したプラスミドＤＮＡを遺伝子導入試薬である、インビトロジェン社のリポフェクタミン(LipoFectamine)２０００を用い、公知のプロトコルに従って、細胞に遺伝子を一過的に導入した。その際に対照として、ｐＤＥＳＴ２６のみを導入した細胞を調製し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養を行った。
（３）細胞増殖の測定
細胞増殖の測定をするために、以下の対照実験を行った。遺伝子導入から４８時間後、生細胞数測定用試薬ＳＦ(Cell Count Reagent SF)（ナカライテスク株式会社製）を各ウェルに培地容量の１０％となるように添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（参照波長：６００ｎｍ）の吸光度を測定した。生成した水溶性ホルマザン（ＷＳＴ−８ホルマザン）の量は生細胞数と比例関係にあるため、上記の吸光度を測定することによって容易に生細胞数を測定することができる。測定は６個の独立したウェルについて行い、その平均値と標準偏差（SE）を求めた。その結果を図２に示す。図２から、２９３細胞、及びＨｅＬａ細胞のいずれの場合においても、ＢＡＧ３ドメインを発現するｃＤＮＡを導入したものは、導入しないものに比べて生細胞の数が減少していることがわかる。以上から、本発明のポリペプチドを培養動物細胞内で発現させる事によって、細胞は増殖抑制性の制御をうけることがわかる。
［実施例７］抗アポトーシス活性の測定
ＨｅＬａ細胞を１ｗｅｌｌのチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に２×１０５個で蒔いた。その後、約２４時間の培養を行った後、実施例６で作製したプラスミドＤＮＡを、遺伝子導入試薬であるインビトロジェン社のリポフェクタミン（LipoFectamine）２０００を用い、公知のプロトコルに従って、細胞に遺伝子を一過的に導入した。その際に対照として、ｐＤＥＳＴ２６のみを導入した細胞を調製し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養を行った。
アポトーシスの誘導は、細胞を１．０μｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１、ＭＢＬ社製）で３時間処理して行った。細胞の固定は、ＰＢＳで洗浄後、４％のPara formaldehyde用いて室温で１時間行った。再びＰＢＳで洗浄した後、In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて付属のマニュアルに従ってアポトーシス細胞の蛍光染色を行った。作成した標本は、Laser Scanning Cytometer（オリンパス社製）により蛍光強度を測定し、アポトーシスの評価とした。その結果を下記表６及び図３に示した。
Figure 2005229874
図３に示したように、コントロールベクターを添加した細胞は抗Ｆａｓ抗体によって染色されアポトーシスが誘導されていることが分かる。これに対し、ＢＡＧ３ドメインを含むベクターを添加した系では有意にアポトーシスの誘導が抑えられていることが分かった。
［実施例８］ＢＡＧ３ドメインの細胞内局在観察
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるマウスＢＡＧ３ドメインのｃＤＮＡ（配列番号３）を実施例３の発現ベクターより、制限酵素BamHI、XhoIで切り出し、インビトロジェン社のエントリーベクター（ゲートウェイシステム）のBamHI/XhoIマルチクローニングサイトに導入した。その後、ゲートウェイＬＲ反応によりｃＤＮＡ部分を、Ｎ末に黄色蛍光タンパク質ＥＹＦＰを融合して発現するように改変したベクター(pcDNA/YFP-GW)に導入した。このようにして作成したベクターpcDNA/YFP-BAGdomainと、小胞体局在赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ−ＥＲを発現するベクター（pcDNA3.1/Zeo(インビトロジェン社)に分泌シグナルと小胞体滞留シグナルを付加したＤｓＲｅｄ遺伝子（クロンテック社）を導入して作成）と共発現させ局在観察を行った。イワキのＥＺＶｉｅｗカルチャープレート（ガラスボトムの培養プレート）の２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞を７×１０４個／ｗｅｌｌ撒き込み、次の日に遺伝子導入をLipofectamin2000(インビトロジェン社)を使って行った。１ウェル当たり、プラスミド０．４μｇ（各０．２μｇ）、Lipofectamin 2000は１．４μｌ使用し、プロトコルどおりに遺伝子導入した。約２４時間後にLeica Confocal Systems TCS SP2にてＥＹＦＰの励起波長は５１４ｎｍ、蛍光波長は５２５−５５０ｎｍ、ＤｓＲｅｄは励起波長５４３ｎｍ、蛍光波長６２０−７００ｎｍで観察した。
その結果、図４に示したように、小胞体に局在するはずのＤｓＲｅｄが細胞質に広がり、EYFP融合タンパクは核の周りや細胞質に網目状に局在した。ＢＡＧドメインのＨＳＣ７０との結合部位と思われるアミノ酸に変異を入れた３種類のコンストラクト（Ｄ４７１Ａ、Ｒ４８５Ａ及びＤ４７１Ａ−Ｒ４８５Ａ）では、ＹＦＰは細胞質に分布し、ＤｓＲｅｄは小胞体に局在した。これらの結果から、ＢＡＧ３のＢＡＧドメインがＨｓｃ７０と結合することにより、細胞内の局在の変化や蛋白質の細胞内小胞輸送阻害などを起こす可能性が示唆された。
［実施例９］Ｈｓｃ７０との結合実験
本発明のポリペプチドがＨｓｃ７０と結合することをインビトロで確認するために、表面プラズモン共鳴センサーとしてBIACORE-3000 (Biacore社）を用いて以下の実験を行った。BiacoreのセンサーチップにマウスのＨｓｃ７０の全長（ＦＬ：１−６４６アミノ酸残基）とＡＴＰａｓｅドメイン（１−３８６アミノ酸残基)をそれぞれ固定化し、実施例３と同様の方法で調製したＢＡＧ３ドメインの濃度を変えて測定した。
図５（ａ）は、Ｈｓｃ７０ＦＬとＢＡＧ３ドメインとの相互作用の解析例を示し、図５（ｂ）はＨｓｃ７０ＡＴＰａｓｅドメインとＢＡＧ３ドメインとの相互作用の解析例を示す。流したＢＡＧ３ドメインの濃度は下から４、１６、６３、２５０ｎＭ、１μＭ、及び４μＭで、それぞれのセンサーグラムを重ねて表示した。さらに、濃度依存的な実験から１：１結合モデルにて、結合解離の速度論的解析を行ったところ、以下のような定数が得られた。（カーブフィッティングを行った解析曲線もセンサグラムに重ねて表示した。）
Figure 2005229874
表７に示したように、Ｈｓｃ７０ＦＬ及びＨｓｃ７０ＡＴＰａｓｅドメインの何れを用いた場合でも本発明のＢＡＧ３ドメインと強く結合することが分かる。
さらに、ＢＡＧ３ドメインのＨｓｃ７０結合部位に位置し、結合に大きな影響を与えると考えられる残基（配列番号８の４７１番目のアスパラギン酸及び４８５番目のアルギニン）をそれぞれアラニンに置換した変異体Ｄ４７１Ａ、Ｒ４８５Ａ及びこれらの二重変異体を作製し、BIACOREを用いてＨｓｃ７０（全長）との相互作用解析を行った。その結果を図６に示した。野生型のＢＡＧ３ドメインはＨｓｃ７０に対して強く結合する(Kd=1.4×10-8(M))のに対して、Ｒ４８５Ａの変異体ではＨｓｃ７０との結合がかなり弱まり(Kd=3.5×10-4(M))、二重変異体（Ｄ４７１Ａ−Ｒ４８５Ａ）においてはＨｓｃ７０とほとんど結合を示さなくなった。これらの結果より、ＢＡＧ３ドメインの４７１番目のアスパラギン酸残基及び４８５番目のアルギニン残基はＨｓｃ７０との結合に大きく関わっていることが明らかになった。また、弱く結合するＲ４８５Ａ等の変異体を応用することによりＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０との結合が関わる生理活性効果を調節できる可能性も考えられる。なお、Ｄ４７１Ａのみの変異体は精製途中で沈殿を形成したため、サンプルの調製が難しく測定できなかった。
ＢＡＧ３ドメインの立体構造を表す図である。 ＢＡＧ３ドメインの細胞増殖阻害活性を表すグラフである。 ＢＡＧ３ドメインの抗アポトーシス活性を表すグラフである。 ＢＡＧ３ドメインの細胞内局在を観察した写真である。 ＢＡＧ３ドメインとＨｓｃ７０との相互作用を解析したセンサーグラムである。 ＢＡＧ３ドメイン野生型及び各種変異体とＨｓｃ７０との相互作用を解析したセンサーグラムである。

Claims (22)

  1. 配列番号２、４及び６の何れか一つに示したアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド又はその塩。
  2. 配列番号４に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドのＮ末端から１〜１７個の任意のアミノ酸残基が欠失したことを特徴とするポリペプチド又はその塩。
  3. 配列番号２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列領域が３重へリックスバンドルを形成することを特徴とするポリペプチド又はその塩。
  4. 請求項１〜３の何れか一項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウスＢＡＧ３ドメインと実質的に同一のアポトーシス抑制機能、又は細胞増殖阻害機能を有するポリペプチド又はその塩。
  5. 請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  6. 配列番号１、３及び５の何れか一つに示した塩基配列からなる請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドを産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターを含んでなる形質転換細胞。
  9. 請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドに対する抗体。
  10. 請求項８に記載の形質転換細胞を培養し、ポリペプチドを発現させる工程を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチド又はそれらの塩の製造方法。
  11. 無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチド又はそれらの塩の製造方法。
  12. 宿主細胞内においてＢＡＧ３ドメインを発現させる工程を含み、当該ＢＡＧ３ドメインが当該細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
  13. 前記ＢＡＧ３ドメインが請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドの立体構造に関する情報を用いて、配列番号２に示したアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる構造未知のポリペプチドのホモロジーモデリングを行い、前記構造未知のポリペプチドの立体構造を推定する方法。
  15. 前記構造未知のポリペプチドがヒトＢＡＧ３ドメインである請求項１４に記載の方法。
  16. ＢＡＧ３ドメインポリペプチドの立体構造に関する情報を用いて、前記ポリペプチドのリガンド結合部位を決定する工程と、当該結合部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含むことを特徴とする、ＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物のスクリーニング方法。
  17. 前記リガンドが、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０、Ｒａｆ１又はそれらのホモログである請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＢＡＧ３ドメインポリペプチドが、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項１５に記載の方法により推定されたヒトＢＡＧ３ドメイン又はそれらの一部である請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法により特定された化合物を候補化合物として用意し、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドと前記候補化合物とを接触させる工程と、前記ポリペプチドと候補化合物とが相互作用するかどうかを確認する工程とを含むことを特徴とするＢＡＧ３ドメインと相互作用する化合物のスクリーニング方法。
  20. アポトーシス活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法が、
    請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法により特定された化合物を候補化合物として用意し、請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドと、Ｈｓｃ７０と、前記候補化合物とを接触させる工程と、
    前記候補化合物が、前記ポリペプチドとＨｓｃ７０との結合を阻害するか否かを検出する工程とを含み、
    前記ポリペプチドとＨｓｃ７０との結合を阻害する物質がアポトーシス活性を調節することを特徴とするスクリーニング方法。
  21. 細胞増殖活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法が、
    前記細胞増殖活性の測定に適した条件において候補化合物の存在又は非存在下で請求項８に記載の形質転換細胞を培養し、
    前記形質転換細胞の増殖活性を測定することを含む方法。
  22. 前記候補化合物が、請求項１６〜１９の何れか一項に記載の方法により得られた化合物である請求項２１に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2012087835A3 (en) * 2010-12-22 2012-11-01 Boston Biomedical Research Institute Compositions and methods for enhancing protein folding
JP2013513101A (ja) * 2009-12-04 2013-04-18 バイオユニヴァーサ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 生化学的な血清マーカー

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