JP2005218379A - Method for determining state of cultured cell and apparatus therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、培養細胞の状態計測方法及び計測装置に関し、特に、培養容器内で培養された細胞の個体数、形態、分布等を計測する方法及び装置に関するものである。 The present invention relates to a method and an apparatus for measuring the state of cultured cells, and more particularly to a method and apparatus for measuring the number, morphology, distribution, etc. of cells cultured in a culture vessel.
生体内から採取された細胞を培養して増殖させ、培養された細胞を医療や薬効試験に応用する研究が進められている。 Research is being carried out in which cells collected from the living body are cultured and proliferated, and the cultured cells are applied to medical and medicinal effects tests.
培養された細胞は、特定の数量が必要になる。このため、従来は、培養容器内の細胞を顕微鏡で観察し、細胞数の計測や培養の進み具合の確認を目視によって行っていた。また、顕微鏡による観察画像をCCDカメラ等で取り込み、画像処理を行って細胞数を計測することが試みられている(特許文献1)。
上記のような目視による計測及び観察の場合、培養容器全面の計測時間が長くなる、観察者の個人差がある、繰り返し再現性が低い等の問題がある。 In the case of the measurement and observation by visual observation as described above, there are problems such as a long measurement time for the entire culture vessel, individual differences among observers, and low reproducibility.
また、画像処理による方法の場合は、検出する細胞部分と細胞以外の部分との像コントラストの違いから細胞部分を抽出する。そのため、照明光量分布の変化や観察環境の変化による検出画像のS/Nの変化に影響される。また、観察倍率を高くする必要があり、培養容器全面を計測する時間が長くなる問題がある。 In the case of a method using image processing, a cell portion is extracted from a difference in image contrast between a cell portion to be detected and a portion other than the cell. Therefore, it is affected by a change in S / N of the detected image due to a change in illumination light quantity distribution and a change in observation environment. In addition, it is necessary to increase the observation magnification, and there is a problem that it takes a long time to measure the entire culture vessel.
本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、外乱等に影響されずに再現性良く培養細胞の個体数、形態、分布等の状態を計測できる方法と装置を提供することである。 The present invention has been made in view of such problems of the prior art, and its purpose is a method capable of measuring the state of cultured cell population, morphology, distribution, etc. with good reproducibility without being affected by disturbances, etc. And to provide a device.
上記目的を達成する本発明の培養細胞の状態計測方法は、照明光学系と、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の2つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた2つの画像の差演算を行って差演算処理した画像を形成し、得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度の少なくとも何れか1つを計測すること特徴とする方法である。 The cultured cell state measurement method of the present invention that achieves the above object includes an illumination optical system, an observation optical system that includes a unit that converts an observation image into a contrast image by interference, and a sign of a phase difference when the observation image interferes A microscope having an imaging device that captures opposite contrast images is used to capture an image composed of two contrast images with opposite phase difference signs, and perform a difference operation processing by performing a difference operation between the two captured images. It is a method characterized by measuring at least any one of the number of cells in the observation range, the occupied area of the cells, the presence distribution of the cells, and the density of the existing cells from the formed and obtained difference-calculated image. .
この場合に、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値0値近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、それ以外の部分を細胞の存在する部分として、細胞の存在する部分と存在しない部分を分離することが望ましい。 In this case, from the intensity distribution of the difference-calculated image, a portion in the vicinity of the intensity value of 0 is extracted as a portion where cells do not exist, and the other portion as a portion where cells exist, and a portion where cells exist It is desirable to separate the parts that do not exist.
また、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値0値近傍の部分を抽出して強度値を1つの値に割り当て、それ以外の部分を別の1つの強度値を値に割り当てて2値化するようにしてもよい。
Further, from the intensity distribution of the difference-processed image, a portion in the vicinity of the
本発明の別の培養細胞の状態計測方法は、照明光学系と、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡によって、位相差の符号が反対の2つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた2つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行った2つの画像を形成し、差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、観察範囲内の細胞の厚み情報を計測すること特徴とする方法である。 Another culture cell state measurement method of the present invention includes an illumination optical system, an observation optical system including a unit that converts an observation image into a contrast image by interference, and a sign of a phase difference at the time of interference of the observation image is opposite. A microscope having an image sensor that captures a contrast image captures an image composed of two contrast images with opposite phase difference signs, and forms two images obtained by performing a difference operation and a sum operation of the two captured images, respectively. Then, the difference-calculated image is divided by the sum-calculated image, and the thickness information of the cells in the observation range is measured.
本発明の培養細胞の状態計測装置は、照明光学系と、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡と、前記顕微鏡によって位相差の符号が反対の2つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた2つの画像の差演算を行って差演算処理した画像を形成し、得られた差演算処理した画像から、観察範囲内の細胞数、細胞の占有面積、細胞の存在分布、細胞の存在密度の少なくとも何れか1つを計測する処理ユニットとを有すること特徴とするものである。 The cultured cell state measurement apparatus of the present invention includes an illumination optical system, an observation optical system including a unit that converts an observation image into a contrast image due to interference, and a contrast image in which the sign of the phase difference at the time of interference of the observation image is opposite. A microscope having an image pickup device that captures the image, and an image composed of two contrast images having opposite signs of the phase difference are captured by the microscope, and a difference calculation process is performed by calculating a difference between the two captured images. And a processing unit that measures at least one of the number of cells in the observation range, the occupied area of the cells, the presence distribution of the cells, and the density of the cells from the obtained difference-calculated image. Is.
この場合に、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値0値近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、それ以外の部分を細胞の存在する部分として、細胞の存在する部分と存在しない部分を分離処理する分離処理ユニットを有することが望ましい。 In this case, from the intensity distribution of the difference-calculated image, a portion in the vicinity of the intensity value of 0 is extracted as a portion where cells do not exist, and the other portion as a portion where cells exist, and a portion where cells exist It is desirable to have a separation processing unit that separates the non-existing portion.
また、差演算処理した画像の強度分布から、その強度値0値近傍の部分を抽出して強度値を1つの値に割り当て、それ以外の部分を別の1つの強度値を値に割り当てて2値化する2値化処理ユニットを有するようにしてもよい。
Further, from the intensity distribution of the difference-processed image, a portion in the vicinity of the
本発明のもう1つの培養細胞の状態計測装置は、照明光学系と、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系と、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対のコントラスト像を取り込む撮像素子とを有する顕微鏡と、前記顕微鏡によって位相差の符号が反対の2つのコントラスト像からなる画像を取り込み、取り込まれた2つの画像の差演算と和演算をそれぞれ行う演算ユニットと、差演算処理した画像を和演算処理した画像で割り算し、観察範囲内の細胞の厚み情報を計測する厚み計測ユニットと有すること特徴とするものである。 Another cultured cell state measuring apparatus of the present invention is an illumination optical system, an observation optical system including a unit for converting an observation image into a contrast image by interference, and a sign of a phase difference at the time of interference of the observation image. A microscope having an imaging device that captures the contrast image of the image, and an arithmetic unit that captures an image composed of two contrast images having opposite signs of phase difference by the microscope, and performs difference calculation and sum calculation of the two captured images, respectively And a thickness measurement unit that divides the difference-calculated image by the sum-calculated image and measures cell thickness information within the observation range.
以上において、照明光学系の略瞳位置に開口が配置されており、観察像を干渉によるコントラスト像に変換するユニットを含む観察光学系が、照明光学系の前記開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置から近点側及び遠点側のずれた位置各々で撮像素子により取り込むように構成された観察光学系からものとしてもよい。 In the above, an opening is arranged at a substantially pupil position of the illumination optical system, and the observation optical system including the unit that converts the observation image into a contrast image by interference is illuminated by the light that has passed through the opening of the illumination optical system. The image of the observation object may be from an observation optical system configured to be captured by the image sensor at each position shifted from the in-focus position on the near point side and the far point side.
以上の本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置においては、差演算処理した画像を形成することにより、照明ムラ等の外乱の影響が小さい培養細胞の画像情報を得ることができる。特に、細胞が分布していない部分は影響がほとんどないものとなる。 In the above-described cultured cell state measuring method and measuring apparatus of the present invention, image information of cultured cells that are less affected by disturbances such as illumination unevenness can be obtained by forming an image subjected to difference calculation processing. In particular, a portion where cells are not distributed has little influence.
また、細胞の存在しない部分をまず抽出し、それに基づいて細胞が存在する部分と細胞が存在しない部分の分離を容易に行うことができる。 In addition, it is possible to first extract a portion where cells are not present, and easily separate a portion where cells are present from a portion where cells are not present.
さらに、細胞が存在する部分と細胞が存在しない部分を分離し2値化することで、細胞の占有面積を計算することができる。さらに、予め細胞の平均面積を求めておくことにより、細胞数を計算することもできる。 Furthermore, the area occupied by the cells can be calculated by separating and binarizing the portion where the cells are present and the portion where the cells are not present. Furthermore, the number of cells can be calculated by obtaining the average area of the cells in advance.
また、差演算処理した画像と和演算処理した画像を形成し、その商を計算することで、細胞の高さ分布を計算することが可能である。さらに、特定の抽出範囲を設定し、2値化を行うことにより、細胞の核を抽出することが可能になる。そして、細胞の核に依存した情報を得ることもできるようになる。 Moreover, it is possible to calculate the height distribution of the cells by forming an image that has been subjected to difference calculation processing and an image that has been subjected to sum calculation processing, and calculating the quotient thereof. Furthermore, it is possible to extract cell nuclei by setting a specific extraction range and performing binarization. And it becomes possible to obtain information depending on the nucleus of the cell.
本発明の基本は、位相物体としての培養細胞の観察像を干渉によるコントラスト像に変換するときに干渉する光束間の位相差の符号を反転させてコントラストが反転した2つの画像を得ることにより、培養細胞のコントラスト像のコントラストを増強して、培養細胞の個体数、形態、分布等を確実に計測可能にすることである。 The basis of the present invention is to obtain two images in which the contrast is inverted by inverting the sign of the phase difference between the interfering light beams when converting the observation image of the cultured cell as a phase object into a contrast image by interference, It is to enhance the contrast of the contrast image of the cultured cells and to reliably measure the number, morphology, distribution, etc. of the cultured cells.
位相物体を干渉によるコントラスト像に変換する手法としては、位相差法や微分干渉法(非特許文献1)、本発明者が特願2003−151506号、特願2003−414158号等で提案したデフォーカス法あるいは波面収差導入法がある。 As a method for converting a phase object into a contrast image by interference, a phase difference method or differential interference method (Non-Patent Document 1), a method proposed by the present inventors in Japanese Patent Application Nos. 2003-151506 and 2003-414158, etc. There is a focus method or a wavefront aberration introduction method.
以下に、主として本発明者が特願2003−151506号、特願2003−414158号等で提案したデフォーカス法、波面収差導入法に基づいて本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置を説明する。 The following is a description of the cultured cell state measurement method and measurement apparatus of the present invention based mainly on the defocus method and the wavefront aberration introduction method proposed by the present inventors in Japanese Patent Application Nos. 2003-151506 and 2003-414158. To do.
まず、デフォーカス法、波面収差導入法について説明する。詳細は特願2003−414158号参照。 First, the defocus method and the wavefront aberration introduction method will be described. For details, see Japanese Patent Application No. 2003-414158.
図1は原理説明図であり、物点、結像光学系入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示した図である。図1に示すように、合焦位置に観察物体を配置すると、観察物点から出た光は実線で示すように球面波状に広がり、結像光学系の入射瞳に入る。入射瞳に入った光は、結像光学系の射出瞳から球面波状の収束光になり、結像面に集光して像を形成する。このとき、結像光学系を透過する各光線の間に光路(位相)差は生じないので、像にボケは生じない。 FIG. 1 is a diagram for explaining the principle, and schematically shows an object point, an imaging optical system entrance pupil, an exit pupil, and an imaging plane. As shown in FIG. 1, when the observation object is placed at the in-focus position, the light emitted from the observation object point spreads in a spherical wave shape as indicated by the solid line and enters the entrance pupil of the imaging optical system. The light that enters the entrance pupil becomes spherical-wave-like convergent light from the exit pupil of the imaging optical system, and is condensed on the imaging surface to form an image. At this time, since there is no optical path (phase) difference between the light beams transmitted through the imaging optical system, no blur occurs in the image.
しかし、物点を点線に示す位置に移動させると、物点からの光は入射瞳に球面波状に入射する。入射瞳に入射した光は、射出瞳から移動後の像面に向かう球面波状の光に変わる。移動後の像面で観察すれば、光に光路(位相)差は発生しないが、観察点を移動させずに当初の結像面で観察すると、各光線に光路(位相)差が発生する。 However, when the object point is moved to the position indicated by the dotted line, the light from the object point enters the entrance pupil in a spherical wave shape. The light that has entered the entrance pupil changes to spherical wave light that travels from the exit pupil toward the image plane after movement. When observed on the image plane after movement, no optical path (phase) difference occurs in the light, but when observed on the original imaging plane without moving the observation point, an optical path (phase) difference occurs in each light beam.
本発明においては、この点を利用して、観察物体を結像光学系の合焦位置からずらした位置に配置することにより、結像光学系を透過する夫々の光線に位相差を発生させている。 In the present invention, by utilizing this point, the observation object is arranged at a position shifted from the in-focus position of the imaging optical system, thereby generating a phase difference in each light beam transmitted through the imaging optical system. Yes.
また、図1において、結像光学系の光軸上光線と、最大NA(開口数)光線との位相の差が最も大きくなる。 In FIG. 1, the phase difference between the light beam on the optical axis of the imaging optical system and the maximum NA (numerical aperture) light beam is the largest.
したがって、観察物体を結像光学系の合焦位置から外れた位置で観察することにより、観察物体を透過した光と回折した光の間に合焦位置からのずれ量(デフォーカス量)に対応した位相差量を発生させることができる。 Therefore, by observing the observation object at a position outside the in-focus position of the imaging optical system, the amount of deviation (defocus amount) from the in-focus position between the light transmitted through the observation object and the diffracted light can be accommodated. It is possible to generate a phase difference amount.
よって、この位相差量が位相差観察法で用いている位相膜と等価な機能をして、培養細胞等の位相分布に比例した像コントラストを与えることができ、無色透明な培養細胞等を観察することができる。 Therefore, this phase difference function is equivalent to the phase film used in the phase difference observation method, and can provide an image contrast proportional to the phase distribution of the cultured cells, etc. can do.
このとき、結像光学系の結像面に結像する倍率が低い場合の方が、結像光学系を通過する回折光の角度を限定しやすくなり、像のコントラストも良くなる。 At this time, when the magnification for forming an image on the imaging surface of the imaging optical system is low, it becomes easier to limit the angle of the diffracted light passing through the imaging optical system, and the contrast of the image is improved.
位相物体を観察する場合、位相物体の位相分布に比例した像コントラストは、観察物体の位相量と透過光と回折光の間に与える位相差量とに比例する。観察物体で回折される光と透過光の間の角度は、観察物体の形状に依存して変わる。回折光と透過光の間の角度が変わると、同じデフォーカス量でも2つの光束の間に発生する位相差量が異なってくる。そのため、観察する例えば細胞毎にデフォーカス量を変えることにより、より良い像コントラストを得ることができる。 When observing a phase object, the image contrast proportional to the phase distribution of the phase object is proportional to the phase amount of the observation object and the phase difference amount provided between transmitted light and diffracted light. The angle between the light diffracted by the observation object and the transmitted light varies depending on the shape of the observation object. When the angle between the diffracted light and the transmitted light changes, the amount of phase difference generated between the two light beams varies even with the same defocus amount. Therefore, a better image contrast can be obtained by changing the defocus amount for each cell to be observed.
デフォーカスによって生じる各光線の位相差は、観察物体が結像光学系の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合で符号が変わる。そのため、培養細胞等の観察物体を結像光学系の合焦位置から近点側にずらして観察した画像と遠点側にずらして観察した画像は、観察物体の位相分布に相当して夫々得られる画像の像コントラストが反転している。 The sign of the phase difference of each light beam caused by defocusing changes depending on whether the observation object is shifted to the near point side or the far point side from the in-focus position of the imaging optical system. For this reason, an image observed by shifting an observation object such as a cultured cell from the focusing position of the imaging optical system to the near point side and an image observed by shifting the observation object to the far point side respectively correspond to the phase distribution of the observation object. The image contrast of the resulting image is inverted.
また、シャーレに付着したゴミ等の光を吸収する物体は、位相物体ではなくなり、デフォーカスによって位相差が与えられても像コントラストに変化は生じない。そのため、近点側にずらして撮像した画像と遠点側にずらして撮像した画像を画像間演算することにより、デフォーカスによって与えられる位相差に影響されない画像成分を分離することができる。特に、2つの画像の各画素毎に差演算を行うことにより、観察物体の位相分布に相当する画像成分の像コントラストは2倍にすることができ、ゴミや異物、照明ムラ等の位相情報を持たない画像成分をなくすことができる。 Further, an object that absorbs light such as dust attached to the petri dish is no longer a phase object, and even if a phase difference is given by defocusing, the image contrast does not change. Therefore, an image component that is not affected by the phase difference given by defocusing can be separated by performing an inter-image calculation on the image captured by shifting to the near point side and the image captured by shifting to the far point side. In particular, by performing the difference calculation for each pixel of the two images, the image contrast of the image component corresponding to the phase distribution of the observation object can be doubled, and phase information such as dust, foreign matter, and illumination unevenness can be obtained. It is possible to eliminate image components that are not provided.
なお、以上のような位相物体の観察方法は、視野内の位相物体の存在を認識するような用途において、結像光学系の結像倍率が4倍以下の場合に、特に好ましい方法である。 Note that the phase object observation method as described above is a particularly preferable method when the imaging magnification of the imaging optical system is 4 times or less in an application for recognizing the presence of the phase object in the field of view.
以上のような原理を、以下に若干理論的に説明する。 The above principle will be explained somewhat theoretically below.
位相物体:
a(U)=exp{−iφ(U)} ・・・(1)
の部分的コヒーレント照明における結像I(x)は、非特許文献1の式(6)で与えられる。その式は以下のようになる。なお、本発明において、式番号は非特許文献1の式番号には対応していない。
Phase object:
a (U) = exp {−iφ (U)} (1)
The image formation I (x) in the partially coherent illumination is given by Equation (6) in
式(2)中、“×" を“○" で囲んだ記号(右辺の第1項)は、コンボリューションである。なお、U,fi (i=1,2),xは、それぞれ物体面、瞳面、像面での座標であり、φ(U)は、観測物体の位相情報である。
In Expression (2), the symbol (first term on the right side) in which “×” is surrounded by “◯” is convolution. U, f i (i = 1, 2), x are coordinates on the object plane, pupil plane, and image plane, respectively, and φ (U) is phase information of the observed object.
ここで、Φ(f)は、φ(U)のフーリエ変換であり、T(f1 ,f2 )は、非特許文献1の式(2)で与えられており、部分的コヒーレント結像の空間周波数特性(transmission cross coefficient:TCC)と呼ばれており、次式で与えられる。
Here, Φ (f) is the Fourier transform of φ (U), and T (f 1 , f 2 ) is given by Equation (2) in
ここで、S(ξ)は照明光学系の瞳の強度分布を表し、P(ξ)は結像光学系の瞳関数を表す。ξは、瞳内の位置座標である。
Here, S (ξ) represents the intensity distribution of the pupil of the illumination optical system, and P (ξ) represents the pupil function of the imaging optical system. ξ is a position coordinate in the pupil.
無収差光学系のときは、P(ξ)は瞳の領域を表す関数になり、次式で表せる。 In the case of a non-aberration optical system, P (ξ) is a function representing the pupil region and can be represented by the following equation.
結像光学系にデフォーカス等の収差W(ξ)(位相量で表現)が発生した場合には、
When aberration W (ξ) such as defocus (expressed by phase amount) occurs in the imaging optical system,
となる。
It becomes.
上記式(2)において、右辺の第1項と第3項は位相φ(U)に関する高次項であり、第2項が位相分布φ(U)に比例した像コントラストを与える項である。そこで、上記式(2)の第2項を変形する。 In the above equation (2), the first and third terms on the right side are high-order terms relating to the phase φ (U), and the second term is a term giving an image contrast proportional to the phase distribution φ (U). Therefore, the second term of the above formula (2) is modified.
収差W(ξ)の量が小さく回転対称であり、結像光学系の瞳の領域を表す関数p(ξ)は回転対称であるとすると、 If the amount of aberration W (ξ) is small and rotationally symmetric, and the function p (ξ) representing the pupil region of the imaging optical system is rotationally symmetric,
となる。
It becomes.
式(2)の第2項と式(6)から、位相物体を観察する際に、デフォーカス等の収差を与えて式(6)が0以外の値になるようにすることにより、位相分布が可視化できることが分かる。 From the second term of equation (2) and equation (6), when observing a phase object, aberration such as defocus is given so that equation (6) becomes a value other than 0, thereby providing a phase distribution. Can be visualized.
以上は、式の展開を見やすくするために、1次元変数での展開を行ったが、2次元変数としても同様である。 In the above, in order to make it easy to see the expansion of the expression, the expansion is performed with a one-dimensional variable, but the same applies to a two-dimensional variable.
式(6)を照明光学系の瞳と結像光学系の瞳を用いて模式的に示すと、図2(a)、(b)のように表せる。ここで、図2(a)は照明光学系の瞳の強度分布(開口形状)S(ξ)が円形、図2(b)は輪帯状の形状を有していた場合である。図2(a)及び(b)は、物体での回折で結像光学系の瞳が移動する形で表している。これを、座標系を入れ換えて照明光学系の瞳S(ξ)の移動で表すと、照明光学系の瞳形状が輪帯状の場合を例にとると、図3(a)と(b)のようになる。図3(a)が式(6)のW(ξ)について計算する部分(ハッチ部分)であり、図3(b)がW(ξ+f)について計算する部分(ハッチ部分)である。図3(a)は物体で回折されない光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像に相当し、図3(b)は物体で1次回折された光による結像光学系の瞳における照明光学系の瞳の像にに相当する。 When Expression (6) is schematically shown by using the pupil of the illumination optical system and the pupil of the imaging optical system, it can be expressed as shown in FIGS. Here, FIG. 2A shows a case where the pupil intensity distribution (aperture shape) S (ξ) of the illumination optical system has a circular shape, and FIG. 2B shows an annular shape. FIGS. 2A and 2B show the pupil of the imaging optical system moving by diffraction at the object. If this is represented by the movement of the pupil S (ξ) of the illumination optical system with the coordinate system replaced, taking the case where the pupil shape of the illumination optical system is an annular shape as an example, it is shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b). It becomes like this. 3A is a portion (hatched portion) that is calculated for W (ξ) in Expression (6), and FIG. 3B is a portion that is calculated for W (ξ + f) (hatched portion). FIG. 3A corresponds to an image of the pupil of the illumination optical system in the pupil of the imaging optical system by light that is not diffracted by the object, and FIG. 3B is a diagram of the imaging optical system by light that is first-order diffracted by the object. This corresponds to the pupil image of the illumination optical system in the pupil.
したがって、結像光学系の瞳位置での収差W(ξ)が回転対称で半径に応じて大きさが変化するものであれば、位相分布の可視化が可能であることになる。 Therefore, if the aberration W (ξ) at the pupil position of the imaging optical system is rotationally symmetric and changes in size according to the radius, the phase distribution can be visualized.
ここで、デフォーカスしたときのW(ξ)を考える。焦点ずれによる波面収差は、非特許文献2に示されるように、瞳面内の光線の高さをh、レンズの焦点距離をf、焦点ずれ量をz、瞳の各点の光路長さをΔLとすると、
ΔL=−h2 z/f2 ・・・(7)
で与えられる。h/fは瞳面上の位置を表した値であり、瞳内の位置座標を表すξに相当する。また、ΔLは位置ξでの光路長差であることから、波長をλとして、
ΔL=W(ξ)×λ=−ξ2 z ・・・(8)
で表せる。したがって、
W(ξ)=−ξ2 z/λ ・・・(9)
で表せる。このデフォーカスによる収差W(ξ)は回転対称で半径の2乗に比例してマイナス方向に大きくなるので、位相分布に比例した像コントラストを与えることができることになる。
Here, W (ξ) when defocused is considered. As shown in
ΔL = −h 2 z / f 2 (7)
Given in. h / f is a value representing a position on the pupil plane, and corresponds to ξ representing a position coordinate in the pupil. Also, since ΔL is the optical path length difference at position ξ, the wavelength is λ,
ΔL = W (ξ) × λ = −ξ 2 z (8)
It can be expressed as Therefore,
W (ξ) = − ξ 2 z / λ (9)
It can be expressed as The aberration W (ξ) due to defocusing is rotationally symmetric and increases in the minus direction in proportion to the square of the radius, so that an image contrast proportional to the phase distribution can be provided.
ここで、zの座標は一般的に焦点位置に対し、図1の右側を正、左側を負にとる。よって、焦点ずらしを焦点から左側(遠点側)に行う場合と右側(近点側)に行う場合とで、W(ξ)の符号も変わる。 Here, the z coordinate is generally positive on the right side and negative on the left side in FIG. Therefore, the sign of W (ξ) also changes depending on whether the focus shift is performed on the left side (far point side) or the right side (near point side) from the focus.
ここで、収差W(ξ)として、デフォーカスによるものでなく、瞳面で同様に回転対称で半径に応じて大きさが変化する波面収差を与える光学手段(具体的には、後で説明するような可変形状ミラー(デフォーマブルミラー)等)を用いても可能であることが、以上の検討より明らかである。 Here, as the aberration W (ξ), optical means that gives wavefront aberration that is not rotationally defocused but similarly rotationally symmetric on the pupil surface and changes in size according to the radius (specifically, will be described later). It is clear from the above examination that it is possible to use such a deformable mirror (deformable mirror).
以上のようなデフォーカス法を利用してコントラスト反転を含めて培養細胞のコントラスト像を観察・撮像可能な顕微鏡の実施例に基づいて、本発明の培養細胞の状態計測装置の実施例を説明する。 Based on the example of the microscope which can observe and image the contrast image of the cultured cell including the contrast inversion using the defocus method as described above, the example of the cultured cell state measuring apparatus of the present invention will be described. .
図4は、このようなデフォーカスを利用して培養細胞のコントラスト像が観察・撮像可能な顕微鏡の1実施例の全体の概略図を示す。この実施例の顕微鏡は倒立型顕微鏡1として構成されており、この倒立顕微鏡1は、光源2と、光源2から発せられた光を導くための照明光学系3と、X−Yステージ40上のシャーレ4の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像を形成するための観察光学系5と、シャーレ4の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像をを拡大して目視観察するための接眼レンズ6と、シャーレ4の内部底面位置の培養細胞を撮像するための撮像素子7を有するCCDカメラ8とから構成されている。また、CCDカメラ8には、撮像された画像を記憶し演算処理しその結果を記憶及び出力するパソコン21とテレビモニター22とが接続されている。パソコン21からのX−Yステージ走査信号は駆動回路を経てX−Yステージ40に送られ、また、パソコン21からのフォーカス信号は駆動回路を経て対物レンズ移動機構43に送られるように接続されている。
FIG. 4 shows an overall schematic diagram of one embodiment of a microscope capable of observing and capturing a contrast image of cultured cells using such defocusing. The microscope according to this embodiment is configured as an
照明光学系3は、光源2側から順に、コレクターレンズ10、照明光の光軸11を偏向させるための偏向ミラー12、光源2からの光を準単色とするための干渉フィルタ13、及び、コンデンサレンズ14により構成されている。
The illumination optical system 3 includes, in order from the
観察光学系5は、観察物体のシャーレ4側から順に、シャーレ4の内部底面位置の培養細胞のコントラスト像を形成するための対物レンズ15、第1のリレーレンズ16、対物レンズ15からの光を偏向するための偏向ミラー17、第1のリレーレンズ16と共に対物レンズ15による像を結像面に結像させるための第2のリレーレンズ18により構成されている。
The observation optical system 5 sequentially receives light from the
また、第2のリレーレンズ18と結像面19との間には、培養細胞のコントラスト像をを接眼レンズ6による目視観察とCCDカメラ8による観察が同じ又は任意に切り換えることができるように、ハーフミラーである切り換えミラー20が配置されている。
In addition, between the
また、光源2からの光が投射されるコンデンサーレンズ14の瞳位置25には、円形開口や輪帯開口からなる部分開口を有する開口ユニット28が、着脱自在に配置されている。また、開口ユニット28の部分開口以外は、遮光性の遮光板から形成されている。
In addition, an
この実施例はこのように構成されているので、光源2からの照明光は、コンデンサーレンズ14の瞳位置に投射される。そして、この照明光は、コンデンサーレンズ14によってケーラー照明としてシャーレ4の内部底面位置の培養細胞を照明する。照明光は培養細胞を透過して対物レンズ15に入射する。対物レンズ15に入射した光は、対物レンズ15と第1のリレーレンズ16及び第2のリレーレンズ18により結像面19に培養細胞の像を形成する。結像面19に形成された培養細胞のコントラスト像は、接眼レンズ6に入射すると共に、切り換えミラー20により、CCDカメラ8の撮像素子7の撮像面上に結像する。したがって、合焦位置で観察物体の培養細胞の通常の顕微鏡観察ができる。
Since this embodiment is configured in this manner, the illumination light from the
この実施例では、対物レンズ15の光軸方向の位置を、パソコン21からのフォーカス信号により対物レンズ移動機構43を介して対物レンズ15を通常の観察の合焦位置とされている位置から観察物体に対し前後何れかに微小量だけ移動させてデフォーカスさせる。デフォーカスを与えると、開口ユニット28の部分開口を通った照明光は、観察物体の培養細胞で回折した光とそれを透過した光が、対物レンズ15の瞳30内の異なる部分を通過する(図3参照)。透過光束と回折光束の間には、回折角とデフォーカスに基づく波面の変化量に対応した位相差が生じる。この位相差は、位相差顕微鏡の位相膜と同様の作用をし、観察物体の培養細胞の位相分布に比例した像強度分布を結像面19上に形成する。
In this embodiment, the position of the
対物レンズ15を前後に移動させる移動量は、形成される像にボケが生じない範囲であることが必要であり、観察に使用する光源2の波長を使用する対物レンズ15のNAの2乗で割った値以下であることが望ましい。
The amount of movement by which the
ここで、前記したように 対物レンズ15のデフォーカスによって生じる各光線の位相差は、観察物体が対物レンズ15の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合で符号が変わる。そのため、観察物体の培養細胞を対物レンズ15の合焦位置から近点側にずらして撮像素子7によりパソコン21に取り込んだ画像と遠点側にずらして撮像素子7によりパソコン21に取り込んだ画像は、観察物体の位相分布に相当して夫々得られる画像の像コントラストは相互に反転している。その様子を図5(a)、(b)に示す。図5(a)、(b)各々において、左側に上記のように対物レンズ15のデフォーカスによって得られる培養細胞のコントラスト像を、右側に左側の破線で示す走査線位置での像強度を表す階調を模式的に示した図を示してあり、図5(a)は遠点側に、図5(b)は近点側にそれぞれ略同じ移動量デフォーカスしたときの様子を示す。細胞がない背景領域は何れも略一定の階調nを示しており、図5(a)に示すように、近点側(遠点側)にデフォーカスすると、細胞及び核の部分は背景に対して若干明るくコントラストがつき、逆に図5(b)に示すように、遠点側(近点側)にデフォーカスすると、細胞及び核の部分は背景に対して若干暗くコントラストがつく。
Here, as described above, the phase difference of each light beam generated by the defocusing of the
したがって、このように、デフォーカスの方向が変わることにより位相差の符号が相互に反対となり、得られた培養細胞のコントラスト像のコントラストが相互に反転した2枚の画像(図5(a)、(b))の対応する個々の画素の値の差を取って新たな画素とする差演算をパソコン21内で行わせると、図5(c)の左側に示すような画像となり、観察範囲内の照明光の強度変化や異物等による光強度変化は相殺されて0になり、一方、培養細胞のような位相分布は位相差の符号の反転により像のコントラストが反転するので、このような位相差の符号が反対の2つのコントラスト像からなる画像の差演算を行うことにより、図5(c)の右側に示すように、像のコントラストが2倍になる(ただし、デフォーカス量が近点側と遠点側で同じ場合)。
Therefore, in this way, by changing the defocus direction, the signs of the phase difference are opposite to each other, and two images in which the contrasts of the obtained contrast images of the cultured cells are mutually inverted (FIG. 5 (a), When the difference calculation of the corresponding individual pixel value in (b)) is performed in the
このように差演算によって得られた画像の細胞以外の部分の階調(強度値)は0になる。したがって、差演算を行った画像(図5(c)の左側)からパソコン21内で階調0近傍の部分を抽出して細胞の存在しない部分とし、そのようにして求めた細胞の存在しない部分を同様にパソコン21内で観察範囲から除いて、残った部分を細胞の存在する部分とするようにすることが望ましい。すなわち、差演算した画像の強度が略0になる部分は、位相が略0であって細胞が存在しない部分を表している。これに対して、差演算した画像の強度が略0以外の部分は、位相分布に対応した部分であるが、照明光の強度ムラや容器の蓋についた結露の影響等によって強度ムラが含まれ位相分布を必ずしも正確に反映していない。そのため、細胞が存在する部分を直接抽出するより、細胞が存在しない部分を抜き出して観察範囲から除外することにより、細胞が存在する部分を換算する方が、外乱の影響が小さくて望ましい。
Thus, the gradation (intensity value) of the part other than the cells of the image obtained by the difference calculation is zero. Therefore, a portion near the
また、差演算を行った画像(図5(c)の左側)に、図5(c)の右側に一点鎖線で示すように、強度0近傍に2値化の敷居値を設けて、それ以下の領域の画素に0の強度を割り当て、敷居値以上の画素に1の強度を割り当てて図5(d)に示すような2値化画像を形成することができる。この2値化画像は、細胞の存在分布を表すことになる。
Further, in the image (left side of FIG. 5C) on which the difference calculation is performed, a threshold value for binarization is provided in the vicinity of
この2値化画像の画像データを画素毎に足し算し、その足し算した値を観察範囲内の総画素数で割り算すると、細胞の観察範囲内での存在密度が算出される。また、足し算した値に実際の物体面(シャーレ4の内部底面)上での1画素の面積を掛けることにより、観察範囲内での細胞が存在する総面積が計算でき、その総面積を1つの細胞の平均的な面積で割り算することにより、観察範囲内での細胞の存在個数が計算できる。 When the image data of the binarized image is added for each pixel, and the added value is divided by the total number of pixels in the observation range, the existence density of the cells in the observation range is calculated. Further, by multiplying the added value by the area of one pixel on the actual object plane (the inner bottom surface of the petri dish 4), the total area where the cells exist within the observation range can be calculated. By dividing by the average area of the cells, the number of cells present within the observation range can be calculated.
あるいは、細胞が存在する画素数を画像の総画素数で割り算することにより、観察範囲内での細胞の平均密度、細胞の占有率を求めることができる。また、予め細胞1個が占有する平均画素数を求めておくことにより、細胞が存在する画素数を細胞1個の平均画素数で割ることにより、観察範囲内に存在する細胞の個数を求めることができる。 Alternatively, by dividing the number of pixels in which cells are present by the total number of pixels in the image, the average density of cells and the occupancy rate of cells within the observation range can be obtained. In addition, by obtaining the average number of pixels occupied by one cell in advance, the number of cells existing in the observation range is obtained by dividing the number of pixels in which the cell exists by the average number of pixels per cell. Can do.
また、2値化とは別に、パソコン21に取り込まれた2つの画像(図5(a)の左側の画像と図5(b)の左側の画像)の差演算に加えて和演算を行う。
In addition to the binarization, a sum operation is performed in addition to a difference operation between two images (the left image in FIG. 5A and the left image in FIG. 5B) captured by the
上記のように、差演算によって得られた画像から観察物体(培養細胞)の位相分布に相当する画像情報が得られる。しかし、照明ムラ等の影響は含まれたままで位相分布を必ずしも正確に表しているとは言い難い。そこで、コントラストが相互に反転した2枚の画像(図5(a)、(b))の対応する個々の画素の値の和を取って新たな画素とする和演算をパソコン21内で行わせると、細胞が存在する部分は反転分布のため位相分布が相殺され、観察範囲内の照明ムラ等の強度分布の情報が得られることになる。この和演算によって得られた画像で差演算によって得られた画像を割り算することにより、照明ムラ等の影響を小さくすることができ、位相分布に比例した画像情報が得られる。
As described above, image information corresponding to the phase distribution of the observation object (cultured cell) can be obtained from the image obtained by the difference calculation. However, it is difficult to say that the phase distribution is always accurately represented with the influence of illumination unevenness and the like being included. Therefore, a sum operation is performed in the
シャーレ4内では同じ細胞を培養していることから、細胞は略同じ屈折率を持つと考えることができ、得られた位相分布は細胞の高さ情報に相当すると言える。したがって、このようにして得られた画像(差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像)の強度(階調)分布から培養細胞の高さ分布計測することができる。 Since the same cells are cultured in the petri dish 4, it can be considered that the cells have substantially the same refractive index, and it can be said that the obtained phase distribution corresponds to the height information of the cells. Therefore, measurement of the height distribution of cultured cells from the intensity (gradation) distribution of the image obtained in this way (the image obtained by dividing the image obtained by the difference operation by the image obtained by the sum operation). can do.
さらに、培養する細胞によっては、核の部分とそれ以外の部分で厚みが異なり、核の部分が盛り上がっている細胞がある(図5(c)の右側の図のN)。上記の差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像において、敷居値を特定の値(核のない部分の高さに相当する値より大きく、核のある部分の高さに相当する値より小さい値)以下の部分を0、それ以外を1とする2値化画像処置をすることで、細胞の核の部分を抽出した画像が得られる。この2値化画像から各細胞の核の面積を求めることができる。 Furthermore, depending on the cells to be cultured, there are cells in which the thickness differs between the nucleus portion and other portions, and the nucleus portion is raised (N in the diagram on the right side of FIG. 5C). In the image obtained by dividing the image obtained by the above difference operation by the image obtained by the sum operation, the threshold value is larger than a specific value (a value corresponding to the height of the part without the nucleus, By performing a binarized image treatment in which the following portion is set to 0 and the other portions are set to 1, a value obtained by extracting the cell nucleus portion can be obtained. From the binarized image, the area of the nucleus of each cell can be obtained.
また、上記の核の分布を表した2値化画像と前の位相分布を表す画像(差演算によって得られた画像を和演算によって得られた画像で割り算して得られた画像)の掛け算を行うことで、核の部分の高さ分布が計算できる。各細胞の核の面積と高さ情報から核の扁平率を求めることもできる。 In addition, the above-described binary image representing the distribution of nuclei and the image representing the previous phase distribution (an image obtained by dividing the image obtained by the difference operation by the image obtained by the sum operation) are multiplied. By doing so, the height distribution of the core part can be calculated. The flatness of the nucleus can also be obtained from the area and height information of the nucleus of each cell.
さらに、干渉の際の位相差の符号が反対の2つのコントラスト像(図5(a)の左側の画像と図5(b)の左側の画像)を取り込む際に、同時に、コンデンサーレンズ14の瞳位置25に、デフォーカス法用の部分開口を有する開口ユニット28の代わりに、暗視野照明用の輪帯開口を有する別の開口ユニットを挿入して暗視野照明して同じ培養細胞の暗視野画像を取り込んでおく。この暗視野画像と上記の核の分布を表した2値化画像の掛け算を行うことで、核の部分の暗視野画像を得ることができ、核の散乱分布を計算することができるようになる。
Further, when capturing two contrast images (the left image in FIG. 5A and the left image in FIG. 5B) having opposite signs of the phase difference at the time of interference, the pupil of the
ところで、以上の説明では、位相物体である培養細胞の観察像であってその結像における干渉の際の位相差の符号が相互に反対である2枚のコントラスト像を得る手段としては、デフォーカス法に基づいて説明してきたが、波面収差導入法によってもよい。そのためには、図4において、コンデンサーレンズ14の瞳位置25に、部分開口を有する開口ユニット28を配置すると共に、対物レンズ15の瞳面30に、その瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入する。そのためには、例えば対物レンズ15の瞳面30と共役な位置の偏向ミラー17の面形状を変形させる。その変形を同じ形状で符号が反対になるようにすることにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の2枚のコントラスト像が得られる。
By the way, in the above description, as a means for obtaining two contrast images, which are observation images of cultured cells that are phase objects and the signs of the phase difference at the time of interference in the image formation are opposite to each other, Although described based on the method, a wavefront aberration introducing method may be used. For this purpose, in FIG. 4, an
あるいは、位相差顕微鏡に原理によってもよい。そのためには、図4において、コンデンサーレンズ14の瞳位置25に、部分開口を有する開口ユニット28の代わりに、輪帯開口を有する別の開口ユニットを挿入し、その輪帯開口の像が結像する対物レンズ15の瞳面30に、その輪帯開口の像に対応する輪帯状の位相膜31を配置する。その位相膜31の位相差の符号を相互に反対の4分の1波長にすることにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の2枚のコントラスト像が得られる。
Alternatively, the principle may be applied to a phase contrast microscope. For this purpose, in FIG. 4, another aperture unit having an annular aperture is inserted at the
あるいは、微分干渉顕微鏡に原理によってもよい。そのためには、図4において、コンデンサーレンズ14の瞳位置25に、開口ユニット28の代わりに、ノマルスキープリズムやウォラストンプリズムの直交する偏光間にシャーを与える第1プリズムを挿入し、その第1プリズムと共役な対物レンズ15の瞳面30に、そのシャーを戻すノマルスキープリズムやウォラストンプリズムからなる第2ププリズムを配置し、第1プリズムの入射側にポーラライザーを、第2プリズムの射出側にアナライザーを配置する。そして、2つの偏光成分間のリターデーション量を反転させるて2枚の画像を撮影することにより、上記のような位相差の符号が相互に反対の2枚のコントラスト像が得られる。
Alternatively, a differential interference microscope may be used based on the principle. For this purpose, in FIG. 4, instead of the
以上、本発明の培養細胞の状態計測方法及び計測装置をその原理と実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例に限定されず種々の変形が可能である。 As mentioned above, although the state measuring method and measuring apparatus of the cultured cell of this invention were demonstrated based on the principle and Example, this invention is not limited to these Examples, A various deformation | transformation is possible.
1…倒立型顕微鏡
2…光源
3…照明光学系
4…シャーレ
5…観察光学系
6…接眼レンズ
7…撮像素子
8…CCDカメラ
10…コレクターレンズ
11…光軸
12…偏向ミラー
13…干渉フィルタ
14…コンデンサレンズ
15…対物レンズ
16…第1のリレーレンズ
17…偏向ミラー
18…第2のリレーレンズ
19…結像面
20…切り換えミラー
21…パソコン
22…テレビモニター
25…コンデンサーレンズの瞳位置
28…部分開口を有する開口ユニット
30…対物レンズの瞳
31…位相膜
40…X−Yステージ
43…対物レンズ移動機構
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