JP2005211068A - Bacillus natto with high glutaminate polypeptidase activity and fermented soybean improved in threading property - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された糸切れのよい納豆に関する。 The present invention relates to a novel natto bacterium and a novel natto produced using the natto bacterium, and more specifically, a glutamic acid polypeptide-degrading enzyme highly active natto bacterium, and a thread breakage produced using the natto bacterium. Regarding natto.
納豆は日本古来の発酵食品であり、一般には糸引納豆と言われるように、強い粘りを持つ粘質物が多く、糸を引けば引く程、良質の納豆であるとされている。一般に納豆は、未熟の状態であると、粘りが少なく糸引き性は弱いが、その一方で香味や食感が悪い。そのため、納豆は充分熟成させる必要がある。熟成後のものは、美味しい反面糸引き性が強い。
納豆の糸を引く原因である粘質物は、納豆菌によって納豆発酵過程で生成されるグルタミン酸ポリペプチドとフラクタンの混合物であるとされている。
納豆を食する際には、一般に、納豆に添付された小袋入りの納豆調味用たれや、或いは好みに応じて、醤油や砂糖などの調味料を納豆にかけ、さらに、添付のからしや、好みによっては、きざみネギなどの薬味を加えたりした後、箸などで納豆を良く攪拌して糸を引かせてから食されるのが常である。
Natto is a fermented food from ancient Japan, and it is generally said that it is a high-quality natto as the string is pulled more and more as it is called “Itobiki Natto”. In general, when natto is in an immature state, it has little stickiness and weak stringiness, but on the other hand, it has poor flavor and texture. Therefore, natto must be aged sufficiently. The one after aging is delicious but has strong stringiness.
It is said that the sticky substance that causes natto string to be pulled is a mixture of glutamic acid polypeptide and fructan produced by natto bacteria during the natto fermentation process.
When natto is eaten, generally, the natto seasoning sauce in a sachet attached to the natto, or a seasoning such as soy sauce or sugar, if necessary, is applied to the natto, and the attached mustard or taste Depending on the condition, it is usually eaten after adding a seasoning such as chopped leek and then stirring natto well with chopsticks and pulling the string.
ここで、納豆の糸引き性を強める方法として、グルタミン酸ソーダ、グルコース、蔗糖などを蒸煮大豆に添加して納豆菌で発酵させ、なるべく粘質物の生成を増大させて糸引き性を強めようとする方法なども提案されている。
しかしながら、一方で、納豆は糸引きの原因である粘質物に起因して、喫食時に口中や唇にベタつきが残り、また糸引きが衣服などに付着したりすることもあるため、糸引きが逆に嫌われる場合があった。
Here, as a method of strengthening the stringiness of natto, sodium glutamate, glucose, sucrose, etc. are added to steamed soybeans and fermented with natto bacteria to increase the production of sticky materials as much as possible to increase the stringiness. Methods have also been proposed.
On the other hand, however, natto is sticky on the mouth and lips when eating due to sticky substances that cause stringing. There were cases where I was disliked.
このような観点から、納豆の糸引き性を消失させる方法が種々提案されているが、発酵や菌の改良での検討例は少なく、ほとんどがタレの組成を改良することにより、糸引き性を低下させる方法であった。
例えば、特許文献１には、糸ひき納豆に酸又はアルカリを加え、粘質物のｐＨを６以下、又は１０以上とし、温度１００℃〜０℃で処理する方法が開示されている。該文献には、さらに、納豆１００ｇに４．５％（重量）酢酸水溶液１５ｃｃを加えて混合した時、ｐＨが５．２であり、細かい泡で白味をおびているものが得られ、さらにこれを９８℃で加熱し、攪拌したところ細かい泡は失くなり、見かけもよくなり、その結果糸引き性は見られないが、ヌメリは充分残存することが判明した旨記載されている。
しかしながら、このような方法では、酸やアルカリの添加によって、納豆の香味に影響を与えてしまうことから、食味に劣るものしか得られないという問題があった。
From this point of view, various methods for eliminating the stringiness of natto have been proposed, but there are few examples of studies on improving fermentation and fungi, and most have improved the stringiness by improving the composition of the sauce. It was a method of lowering.
For example,
However, such a method has a problem that only the inferior taste can be obtained because the addition of acid or alkali affects the flavor of natto.
また、特許文献２には、塩類濃度４．０重量／容量％以下とした納豆泡立てたれを納豆当り１３．３〜６６．７重量／重量％の割合で添加、攪拌することにより、糸引き性が低下し、食感が軽くなることが判明した旨記載されている。しかし、該文献２記載の方法では、糸切れは十分でなかった。
このような観点から、納豆の用途範囲拡大や消費増加の為には、納豆の食味に影響を与えない範囲で糸引きがあり、かつ、また粘質物によるヌメリ感の少ない、糸切れのよい納豆の開発が望まれていた。
Further, in
From this point of view, in order to expand the range of use and increase consumption of natto, natto with good thread breakage, which has stringing within a range that does not affect the taste of natto, and has less stickiness due to sticky material Development of was desired.
本発明は、納豆の特徴である糸を切れ易くした糸切れのよい納豆を効率良く製造することができる納豆菌を提供すると共に、該納豆菌を用いた糸切れがよく、喫食性の改善された納豆を提供することを目的とするものである。 The present invention provides a natto bacterium capable of efficiently producing a natto with good yarn breakage, which is a characteristic of natto, and is capable of efficiently producing natto with good yarn breakage. The purpose is to provide natto.
上記課題に鑑み、本発明者らは、納豆のネバを構成しているグルタミン酸ポリペプチドに着目し、該ポリペプチドの分子量と糸引き性に相関性があるものと考え、このグルタミン酸ポリペプチドに作用するグルタミン酸ポリペプチド分解酵素が、従来検討のなされていなかった納豆菌の改良に適応可能かどうかを鋭意検討した。
その結果、バチルス属に属する枯草菌や納豆菌のエンド型分解酵素遺伝子であるγ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ遺伝子あるいはエクソ型分解酵素遺伝子であるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を高発現させ、該酵素を高活性化させた納豆菌は、糸切れがよく、かつ官能的にも良好な納豆を製造できることを見出した。
In view of the above problems, the present inventors focused on the glutamic acid polypeptide constituting the natto neva and considered that there is a correlation between the molecular weight of the polypeptide and the stringiness, and acted on this glutamic acid polypeptide. Whether or not the glutamate polypeptide-degrading enzyme to be applied can be applied to the improvement of Bacillus natto, which has not been studied previously.
As a result, the γ-D, L-glutamyl hydrolase gene which is an endo-degrading enzyme gene of Bacillus subtilis or Bacillus natto belonging to the genus Bacillus or the γ-glutamyl transpeptidase gene which is an exo-degrading enzyme gene is highly expressed, It has been found that natto bacteria having a highly activated natto can produce natto with good thread breakage and good sensuality.
さらに、このようにグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させた納豆菌が製造した納豆を喫食するにあたり、糸引き性に影響を与える可能性のあるたれの組成を鋭意検討した。
その結果、たれ中の２価カチオンの含量を特定割合以上に高めることにより、該たれを混合して食する場合の糸引き性が変化することを見出し、さらに、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させた納豆菌で製造した納豆の糸切れ性をよくする条件を検討し、２価カチオンのうち、食品として使用可能なカルシウムやマグネシウムを含ませると、糸切れがよくなり、かつ納豆としての官能的な品質に影響を与えない濃度で有効なことを見出し、本発明を完成した。
Furthermore, when eating natto produced by natto bacteria with enhanced expression of the glutamate polypeptide degrading enzyme gene in this way, the composition of the sauce that may affect the stringiness was investigated.
As a result, it was found that by increasing the content of divalent cations in the sauce to a specific ratio or more, the stringiness when the sauce is mixed and eaten changes, and further, the expression of the glutamate polypeptide degrading enzyme gene Natto produced with natto with enhanced natto, and the conditions to improve the thread breakage of the natto, including calcium and magnesium that can be used as food among divalent cations, the thread breakage is improved, and as natto The present invention has been completed by finding that it is effective at a concentration that does not affect the sensory quality.
すなわち、請求項１記載の本発明は、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させたことを特徴とする納豆菌である。
請求項２記載の本発明は、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子がγ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ遺伝子及び／又はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１の納豆菌である。
請求項３記載の本発明は、γ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ遺伝子の発現を増強させてなる納豆菌バシルス・サチリスｙｗｔＤ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８１）である。
請求項４記載の本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の発現を増強させてなる納豆菌バシルス・サチリスｇｇｔ５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８０）である。
請求項５記載の本発明は、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させてなる納豆菌バシラス・サチリスＤ８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６４）である。
That is, the present invention according to
The present invention according to
The present invention described in
The present invention according to
The present invention described in
請求項６記載の本発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の納豆菌を用いることを特徴とする糸切れのよい納豆の製造方法である。
請求項７記載の本発明は、請求項６記載の製造方法で得られる納豆と、２価カチオンの濃度が１．２重量／容量％以上のたれとからなる容器入り納豆である。
請求項８記載の本発明は、２価カチオンがカルシウム及び／又はマグネシウムであることを特徴とする請求項７記載の容器入り納豆である。
請求項９記載の本発明は、カルシウム及び／又はマグネシウムの濃度が、納豆当り０．１４重量／重量％以上であることを特徴とする請求項８記載の容器入り納豆である。
The present invention according to
The present invention as set forth in claim 7 is a natto in a container comprising natto obtained by the production method according to
The present invention according to claim 8 is the natto in a container according to claim 7, wherein the divalent cation is calcium and / or magnesium.
The present invention according to
本発明によれば、納豆のネバを構成しているグルタミン酸ポリペプチドに作用するグルタミン酸ポリペプチド分解酵素が高活性化された納豆菌が提供される。該納豆菌を用いることにより、糸切れがよく、かつ官能的にも良好な納豆を製造することができる。
さらに、本発明によれば、このようにグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させた納豆菌が製造した納豆と、２価カチオンの含量を特定割合以上に高めたたれとからなる容器入り納豆が提供される。該容器入り納豆によれば、たれを添加することにより、糸切れが一層よくなり、かつ納豆としての官能的な品質に影響を与えないことから、納豆の消費拡大に貢献することが明らかである。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the Bacillus natto in which the glutamate polypeptide degrading enzyme which acts on the glutamate polypeptide which comprises the natto neva is highly activated is provided. By using the Bacillus natto, it is possible to produce natto with good thread breakage and good sensory properties.
Furthermore, according to the present invention, natto in a container comprising natto produced by natto bacteria with enhanced expression of the glutamate polypeptide degrading enzyme gene as described above, and a product obtained by increasing the content of divalent cations to a specific ratio or more. Is provided. According to the natto contained in the container, by adding dripping, the yarn breakage is further improved and the sensory quality as natto is not affected, so it is clear that it contributes to the expansion of consumption of natto. .
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、請求項１に係る本発明について説明する。
請求項１に係る本発明は、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させたことを特徴とする納豆菌である。すなわち、納豆菌をグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させるよう育種改良して得られる納豆菌である。
請求項１に係る本発明において、育種改良の対象として用いる元の納豆菌としては、特に制限はない。
納豆菌は、枯草菌であるバシルス・サチリス（Bacillus subtilis）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシルス・ナットウ（Bacillus natto）として分類されたり、枯草菌の変種としてBacillus subtilis var. nattoあるいはBacillus subtilis（natto）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
First, the present invention according to
The present invention according to
In the present invention according to
Bacillus natto is classified into Bacillus subtilis, which is a Bacillus subtilis, but it can produce the characteristics of natto such as mucilage (stringent material) and is the main bacterium in natto fermentation. In addition, it is classified as Bacillus natto because it has characteristics such as requiring biotin for growth, and Bacillus subtilis var. Natto or Bacillus subtilis (natto) as a variant of Bacillus subtilis. ) And Bacillus subtilis.
このような納豆菌としては、納豆工業で通常使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、改良を重ねて得られた優れた納豆菌を用いることができる。例えば、バシルス・ナットウ（Bacillus natto）ＩＦＯ３００９株、バシルス・サチリス（Bacillus subtilis）ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などが挙げられる。
具体的には例えば、市販納豆から分離したＯ−２株や、該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）、市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）、宮城野菌（宮城野納豆製作所）、ＯＵＶ２３４８１株など各種の納豆菌が適宜使用可能である。尚、ＯＵＶ２３４８１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５９である。
As such Bacillus natto, Bacillus natto excellent in fermentation ability usually used in natto industry, Bacillus natto isolated and obtained from nature, and Bacillus natto obtained through repeated improvements can be used. . Examples thereof include Bacillus natto IFO3009 strain, Bacillus subtilis IFO3335 strain, IFO3336 strain, IFO3936 strain, and IFO13169 strain.
Specifically, for example, the O-2 strain isolated from commercial natto, the r22 strain which is a transformation efficiency improving mutant of the strain (see, for example, JP 2000-224982 A), and a commercial natto inoculum. Takahashi bacteria (T 3 strains, TUA culture collection chamber), Miyagino bacteria (Miyagino natto Seisakusho), a variety of Bacillus natto such OUV23481 strain can be suitably used. The OUV23481 strain is deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and the deposit number is FERM BP-6659.
請求項１に係る本発明の納豆菌は、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させてなるものである。グルタミン酸ポリペプチド分解酵素は、ネバの構成成分であるグルタミン酸ポリペプチドを分解する酵素であることから、該酵素に関与するグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させてなる本発明の納豆菌は、糸切れのよい納豆を製造する能力に優れるものとなっている。
The Bacillus natto of the present invention according to
このような優れた性質を有する請求項１に係る本発明の納豆菌は、例えば、上述したような元の納豆菌において、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子を高発現させ、該酵素を高活性化させるような環境で育種することにより、得ることができる。
この場合の育種方法として、遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、菌をプロトプラスト化することにより、特定の遺伝子を導入する導入法（例えば、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」参照）が採用可能である。本育種方法によれば、狙いを定めた遺伝子をプラスミドベクターにクローニングして、導入し、発現させることが可能であるので、納豆のネバ成分に関与するグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子を納豆菌に導入し、発現させて、ネバの性質を改良することができる。
The Bacillus natto of the present invention according to claim 1 having such an excellent property causes, for example, high expression of a glutamate polypeptide degrading enzyme gene in the original Bacillus natto as described above, and activates the enzyme highly. It can be obtained by breeding in such an environment.
A genetic recombination technique can be used as a breeding method in this case. For example, an introduction method for introducing a specific gene by protoplastizing a bacterium (see, for example, “Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979”). ) Can be adopted. According to this breeding method, a targeted gene can be cloned, introduced and expressed in a plasmid vector, so that the glutamate polypeptide-degrading enzyme gene involved in the natto Neva component is introduced into Bacillus natto. And can be expressed to improve the properties of the neva.
上記の育種方法を利用した場合、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子を、プラスミドベクター上の、アルカリプロテアーゼをコードしている遺伝子であるａｐｒＥのプロモーター領域の下流域にクローニングして、これを納豆菌で高発現させることにより、目的のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性化納豆菌を作製することができる。
ここで、納豆菌に関して、アルカリプロテアーゼをコードしている遺伝子やグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子についての詳細な情報は知られていない。
しかし、枯草菌バシルス・サチリス（Bacillus subtilis）に関しては、近年完成した総ゲノム情報（例えば、ネイチャー（Nature）、３９０巻、ｐ．２４９−２５６、１９９７年）参照）などから推定した結果、エンド型グルタミン酸ポリペプチド分解酵素であるγ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ（γ-D，L-glutamyl hydrolase）（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１８５巻、７号、ｐ．２３７９−２３８２、２００３年参照）の遺伝子（以下、ｙｗｔＤ遺伝子ともいう。）及びエクソ型グルタミン酸ポリペプチド分解酵素であるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ-glutamyltranspeptidase）（例えば、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１７８巻、１４号、ｐ．４３１９−４３２２、１９９６年参照）の遺伝子（以下、ｇｇｔ遺伝子ともいう。）が、可能性のある遺伝子として推定された。
したがって、納豆菌についてもｙｗｔＤ遺伝子及びｇｇｔ遺伝子、あるいはこれらと相同性の高い遺伝子が、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子として存在する可能性が高い。尚、ｙｗｔＤ遺伝子やｇｇｔ遺伝子と相同性があり、γ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼやγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性を持つタンパク質をコードする遺伝子であれば、枯草菌や納豆菌以外の他の微生物由来の遺伝子であっても利用可能である。
When the above breeding method is used, the glutamate polypeptide degrading enzyme gene is cloned into a plasmid vector downstream of the promoter region of aprE, which is a gene encoding alkaline protease, By expressing it, the target glutamic acid polypeptide degrading enzyme highly activated natto can be produced.
Here, with regard to Bacillus natto, detailed information on genes encoding alkaline protease and glutamate polypeptide degrading enzyme genes is not known.
However, with respect to Bacillus subtilis, as a result of estimation from recently completed total genome information (see, for example, Nature, 390, p.249-256, 1997), etc., the end type Gamma-D, L-glutamyl hydrolase (gamma-D, L-glutamyl hydrolase) (for example, Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 7, p. 2379- 2382, 2003) (hereinafter also referred to as ywtD gene) and γ-glutamyltranspeptidase (eg, Journal of Bacteriology), which is an exo-type glutamate polypeptide degrading enzyme. 178, 14, p.4319-4322, 199 Year reference) gene (hereinafter also referred to as ggt gene.) It was estimated as a gene that might.
Therefore, there is a high possibility that the natto bacteria also have the ywtD gene and the ggt gene or genes having high homology with them as glutamate polypeptide degrading enzyme genes. Any microorganism other than Bacillus subtilis or Bacillus natto can be used as long as it is homologous to the ywtD gene and ggt gene and encodes a protein having the activity of γ-D, L-glutamyl hydrolase or γ-glutamyl transpeptidase. Even genes derived can be used.
納豆菌のｙｗｔＤ遺伝子及びｇｇｔ遺伝子、あるいはこれらと相同性の高い遺伝子は、上記枯草菌について明らかにされているアルカリプロテアーゼをコードしている遺伝子、ｙｗｔＤ遺伝子及びｇｇｔ遺伝子の塩基配列の両末端から設計したプライマー、例えば後述の実施例で利用するプライマー１〜６（それぞれ配列表の配列番号１〜６記載の塩基配列からなる。）を利用して納豆菌から抽出したゲノムＤＮＡを増幅して得ることができる。
本発明者らは、このプライマー１〜６（それぞれ配列表の配列番号１〜６記載の塩基配列からなる。）を利用して納豆菌から抽出したゲノムＤＮＡを増幅して得た増幅産物を、枯草菌プラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫやｐＵＢ１１０に挿入してγ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ高発現株用ベクターｐｙｔＤＮ及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ高発現株用ベクターｐｇｔＮを構築し、それぞれを用いて納豆菌ｒ２２株を形質転換することにより、請求項３に係る本発明の納豆菌ｙｗｔＤ１株及び請求項４に係る本発明の納豆菌ｇｇｔ５株を得た。
このような請求項３に係る本発明の納豆菌及び請求項４に係る本発明の納豆菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８０である。
The ywtD gene and the ggt gene of Bacillus natto, or genes with high homology with them, are designed from both ends of the base sequences of the alkaline protease gene, the ywtD gene and the ggt gene that have been clarified for the Bacillus subtilis. And amplifying genomic DNA extracted from Bacillus
The present inventors obtained amplification products obtained by amplifying genomic DNA extracted from Bacillus natto using these
The Bacillus natto of the present invention according to
また、請求項１に係る本発明の納豆菌は、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、すなわち、既に目的遺伝子の発現が増強している納豆菌を自然界から選抜する、いわゆるスクリーニング法や、ニトロソ化合物等を用いた薬剤変異法などによってこれらの遺伝子の発現を増強させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても、育種が可能である。
本発明者らは、ＯＵＶ２３４８１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５９）をＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いて突然変異処理することにより、請求項５に係る本発明の納豆菌Ｄ８６株を得た。
このような請求項５に係る本発明の納豆菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６４である。
Further, the natto bacterium of the present invention according to
The present inventors mutated the OUV23481 strain (FERM BP-6659) with N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine to thereby produce the Bacillus natto strain D86 of the present invention according to
Such Bacillus natto of the present invention according to
グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性化納豆菌の分離方法としては、例えば、グルタミン酸ポリペプチドを含有する培地で納豆菌を生育させ、グルタミン酸ポリペプチドの分解活性を指標として変異株を選抜する方法などによって分離可能である。 Examples of the method for isolating glutamate polypeptide-degrading enzyme highly activated natto bacteria include, for example, a method in which natto bacteria are grown in a medium containing a glutamate polypeptide and mutants are selected using the degradation activity of the glutamate polypeptide as an indicator. Is possible.
このような請求項１に係る本発明の納豆菌は、納豆生産に応用することができる。特に、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させたものであるから、糸切れのよい納豆を製造する能力に優れるものとなっており、そのため、糸切れのよい納豆の製造に好適に用いることができる。このような納豆の製造方法を提供するのが、請求項６に係る本発明である。
すなわち、請求項６に係る本発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の納豆菌を用いることを特徴とする糸切れのよい納豆の製造方法を提供するものである。
Such Bacillus natto of the present invention according to
That is, the present invention according to
請求項１に係る本発明のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
例えば、製造される納豆としては、丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もあり、それぞれの一般的な条件・手順に従うことができる。
丸大豆納豆の製造方法は、一般に、原料である丸大豆を冷水に一晩程度浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２Ｋｇ／ｃｍ２・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させることができる。
また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
請求項６に係る製造方法においては、上述のような従来から実施されている納豆の製造方法において、一般的な納豆菌に代えて請求項１に係る本発明のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌を用いることができる。
The use of the glutamic acid polypeptide-degrading enzyme highly active natto of the present invention according to
For example, as natto to be produced, so-called whole soybean natto produced using whole soybeans is common, but there is also some ground natto made from soybeans that have been ground beforehand. Can follow general conditions and procedures.
In general, the whole soybean natto is produced by immersing the whole soybean, which is the raw material, in cold water for about one night, and then using the steam in a steaming pot under pressure steaming (1.5-2 Kg / cm 2 · 128-133). ℃), and after inoculating and mixing natto bacteria in a high temperature state (70 to 100 ° C), filling in a predetermined container and then carrying it into a fermentation chamber, a relatively high temperature ( After fermentation for about a predetermined time (about 12 to 48 hours) at about 40 to 55 ° C.), it can be completed by refrigeration and aging (about 12 to 72 hours) at around 5 ° C.
Further, in the case of ground natto, it is produced in the same manner as in the case of ordinary round soybean natto, except that the previously ground soybean is soaked in water.
In the production method according to
請求項６に係る製造方法により、請求項１に係る本発明のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌を用いて生産された納豆は、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆と比較して、糸切れがよく、その他納豆としての官能的な品質は同等である。この点については、後述の実施例に示す通りである。
ここで、納豆の糸切れの良さの官能評価は、例えば、納豆を攪拌し、まとまった納豆塊を３０ｃｍ持ち上げて、そこで生じる納豆のネバの切れる時間の長さを、コントロールの納豆と比較して行うことができる。
By the production method according to
Here, the sensory evaluation of the goodness of thread breakage of natto is, for example, stirring natto, lifting the whole natto lump by 30 cm, and comparing the length of time that the natto neva breaks up with that of control natto It can be carried out.
このように、請求項６に係る本発明の製造方法によれば、請求項１に係る本発明のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌を用いることにより、糸切れのよい納豆を製造することが可能になる。
ここで、生産された納豆の糸切れ性は、２価カチオンの含量を特定割合以上に調整したたれを混合すると一層よくなることが明らかであり、このような容器入り納豆を提供するのが請求項７に係る本発明である。
Thus, according to the production method of the present invention according to
Here, it is clear that the thread breakage of the produced natto is better when the divalent cation content is adjusted to a specific ratio or more, and it is better to provide such containered natto. 7 according to the present invention.
すなわち、請求項７に係る発明は、請求項６記載の製造方法で得られる納豆と、２価カチオンの濃度が１．２重量／容量％以上のたれとからなる容器入り納豆を提供するものである。ここで、請求項６記載の製造方法で得られる納豆については、上記請求項６記載の製造方法において説明した通りである。
That is, the invention according to claim 7 provides natto in a container comprising natto obtained by the production method according to
たれに使用する２価カチオンとしては、請求項８に記載するようにカルシウムやマグネシウムなどが挙げられる。これらの２価カチオンは、塩化物や水酸化物の形の精製物や、にがりなどの他の成分を含有する形で使用してもよい。また、複数の種類の２価カチオンを混合して使用することも可能である。
このような２価カチオンの濃度は、たれに対し１．２重量／容量％以上とする必要がある。２価カチオン濃度が１．２重量／容量％未満であると、糸切れ性が低下し、所望の糸切れが得られないので好ましくない。また、２．０重量／重量％以上では、２価カチオンの苦味が感じられるため、好ましくは、１．２重量／重量％から２．０重量／重量％の範囲が望ましい。
Examples of the divalent cation used for the sauce include calcium and magnesium as described in claim 8. These divalent cations may be used in the form containing a purified product in the form of chloride or hydroxide, or other components such as bittern. It is also possible to use a mixture of plural kinds of divalent cations.
The concentration of such a divalent cation needs to be 1.2 weight / volume% or more with respect to the sagging. If the divalent cation concentration is less than 1.2% by weight / volume, the yarn breakability is lowered, and the desired yarn breakage cannot be obtained, which is not preferable. Moreover, since the bitterness of a divalent cation is felt at 2.0 wt / wt% or more, the range of 1.2 wt / wt% to 2.0 wt / wt% is desirable.
また、高糸切れ納豆用たれの２価カチオンがカルシウム及び／又はマグネシウムの場合、その濃度は、請求項９に記載するように、納豆当たり０．１４重量／重量％以上、好ましくはカルシウムの場合０．１６〜０．２７重量／重量％、マグネシウムの場合０．１４〜０．２４重量／重量％となるように納豆に添加されることが好ましい。
Further, when the divalent cation of the high thread cut natto sauce is calcium and / or magnesium, the concentration is 0.14 wt / wt% or more per natto, preferably calcium, as described in
なお、高糸切れ納豆用たれを製造する際には、２価カチオンの濃度が１．２重量／容量％以上であれば、その他の成分として、例えば鰹節のだしや梅肉エキスなどを好みに応じて添加して、調味機能を同時に果たさせることもできる。
納豆を市販する際には、通常、発泡スチロール製などの納豆容器に納豆が所定量ずつ分納されると共に、所定量の調味用たれが納豆容器に添付される場合が殆どであり、請求項６に係る本発明の容器入り納豆も同様の形態で市販することができる。この場合、納豆の重量と高糸切れ納豆用たれの添加量については、たれに含まれる２価カチオンの濃度が納豆当たり所定濃度となるように調整することが便利である。
In addition, when manufacturing high thread cut natto sauce, if the concentration of the divalent cation is 1.2 wt / vol% or more, other ingredients such as bonito soup stock and plum extract are preferred. Depending on the addition, the seasoning function can be fulfilled simultaneously.
When natto is marketed, natto is usually dispensed into a natto container made of foamed polystyrene or the like in a predetermined amount, and a predetermined amount of seasoning sauce is usually attached to the natto container. Such containered natto of the present invention can also be marketed in the same form. In this case, it is convenient to adjust the weight of natto and the amount of added high-thread-cut natto so that the concentration of divalent cations contained in the sauce becomes a predetermined concentration per natto.
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１〔グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌（ｙｗｔＤ遺伝子高発現納豆菌）の作製〕
（１）基本条件
ｙｗｔＤ遺伝子を高発現させる親株としては、納豆菌バシルス・サチリスｒ２２（Bacillus subtilis r22）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。
ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、以下のようにしてニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
Example 1 [Production of Glutamic Acid Polypeptide Degrading Enzyme Highly Active Natto (yatD Gene Highly Expressing Natto)]
(1) Basic conditions As a parent strain for highly expressing the ywtD gene, a Bacillus subtilis r22 strain (hereinafter also referred to as r22 strain) may be used (for example, see JP 2000-224982 A). Was used.
The r22 strain is a mutation with enhanced transformation ability obtained by chemically mutating the O-2 strain, which is Bacillus natto isolated from commercial natto, using nitrosoguanidine (NTG) as follows. Is a stock.
すなわち、Ｏ−２株を常法に準じＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３０℃、１時間、生存率７．３％）して、得られた変異菌５×１０６個を、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」に記載されているバシルス・サチリス（Bacillus subtilis）の方法に準じたプロトプラスト法により、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。形質転換後のプロトプラスト培地としてＮＰ培地（下記の表１参照）を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十株の形質転換株を得た。形質転換株のうち３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた胞子を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの保持の有無を調べ、得られた２１株のベクター除去株について、プロトプラストを形成し、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換能が向上しているもの１５株を選抜した。さらに、これら１５株について常法による納豆製造試験を行ない、発酵能や品質評価を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造できる４株のうち、品質の悪いものや糸引きが極端に悪くなったものを除いた１株をｒ２２株として得た。 That is, according to a conventional method, the O-2 strain was subjected to NTG mutation treatment (NTG concentration 160 μg / ml, 30 ° C., 1 hour, survival rate 7.3%), and 5 × 10 6 mutant bacteria obtained were Bacillus subtilis by the protoplast method according to the method of Bacillus subtilis described in "Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979". Transformation with vector pHY300PLK. An NP medium (see Table 1 below) was used as a protoplast medium after transformation, and several tens of transformants were obtained using tetracycline resistance as an index. Thirty strains were selected from the transformed strains and cultured in a sporulation medium to form spores. Thereafter, after spore obtained from each transformant was cultured, the presence or absence of retention of vector pHY300PLK was examined, protoplasts were formed for the 21 vector-removed strains, transformed again with vector pHY300PLK, and the parent strain Fifteen strains having improved transformation ability over O-2 were selected. Furthermore, the natto production test was conducted on these 15 strains by a conventional method, and the fermentability and quality evaluation were compared. As a result, among the 4 strains that could produce natto on the appearance, those with poor quality and stringing were extreme. One strain excluding those that became worse was obtained as r22 strain.
プラスミドベクターとしては、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）を用いた。
また、再生培地としてＮＰ培地を用いた。ＮＰ培地の組成を以下の表１に示す。
As a plasmid vector, pHY300PLK (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
Further, NP medium was used as the regeneration medium. The composition of the NP medium is shown in Table 1 below.
また、基本的な培養は、以下の表２に示す組成からなるＮＢ培地を用いて行った。 Further, basic culture was performed using an NB medium having the composition shown in Table 2 below.
納豆菌の胞子を調製するための胞子形成培地は、以下の表３に示す組成から成るＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて行った。 The spore formation medium for preparing Bacillus natto spores was performed using a Sterlini-Madelsham replacement medium having the composition shown in Table 3 below.
納豆菌の染色体ＤＮＡの調製には、市販のキットを使用した。
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、Ｔａｑポリメラーゼに添付のマニュアルに従った反応条件下で行った。
形質転換は、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」の方法に従った。
A commercially available kit was used to prepare the chromosomal DNA of Bacillus natto.
Amplification of the DNA fragment by PCR was performed using Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) under reaction conditions according to the manual attached to Taq polymerase.
The transformation followed the method of “Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979”.
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子導入技術は、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」の記載に従った。但し、納豆菌の形質転換における再生培地にはＮＰ培地「納豆試験法、第１版（１９９０）、光琳、東京」を用いた。 Unless otherwise specified, culture conditions, culture media and other gene transfer techniques are described in “Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979”. I followed. However, the NP medium “Natto Test Method, 1st Edition (1990), Korin, Tokyo” was used as the regeneration medium in the transformation of Bacillus natto.
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１及び図２に示した。
すなわち、ｒ２２株のａｐｒＥ遺伝子プロモーター領域の増幅のためのプライマーとして、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を、ｙｗｔＤ遺伝子の増幅のためのプライマーとして、プライマー３（配列表の配列番号３に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を使用した。
それぞれのプライマーは、枯草菌バシルス・サチリス（Bacillus subtilis）のｙｗｔＤ遺伝子の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベースの受理番号ＡＢ０８０７４８の塩基配列参照）を基にして設計し合成した。
(2) Vector construction An outline of production of each DNA fragment used for vector construction is shown in FIGS.
That is, as a primer for amplifying the aprE gene promoter region of the r22 strain, primer 1 (described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and primer 2 (described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) were used for amplification of the ywtD gene. As primers, primer 3 (described in SEQ ID NO: 3) and primer 4 (described in SEQ ID NO: 4) were used.
Each primer was designed and synthesized based on the nucleotide sequence of the ywtD gene of Bacillus subtilis (see, for example, the nucleotide sequence of the accession number AB080748 in databases such as GenBank, EMBL, and DDBJ).
これらのプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
すなわち、まず、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いａｐｒＥ遺伝子プロモーター領域（aprE promotor）を増幅するとともに、ＸｂａＩ及びＳａｌＩを用いて制限酵素サイトを両端に導入した（ＤＮＡ断片１（DNA Fragment 1））（図１）。
また、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を用いｙｗｔＤ遺伝子を増幅するとともにＳａｌＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素サイトを両端に導入した（ＤＮＡ断片２（DNA Fragment 2））（図２）。
PCR was performed using these primers.
That is, first, the aprE gene promoter region (aprE promoter) is amplified using primer 1 (described in SEQ ID NO: 1) and primer 2 (described in SEQ ID NO: 2) using the total DNA of the r22 strain as a template. At the same time, restriction enzyme sites were introduced at both ends using XbaI and SalI (DNA Fragment 1) (FIG. 1).
In addition, the ywtD gene was amplified using primer 3 (described in SEQ ID NO: 3) and primer 4 (described in SEQ ID NO: 4) using the total DNA of the r22 strain as a template and restricted using SalI and BamHI. Enzyme sites were introduced at both ends (DNA Fragment 2) (FIG. 2).
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いて枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫからベクターを構築した。その概略は図３に示す通りとした。
すなわち、ＤＮＡ断片１（DNA Fragment 1）を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩで、ＤＮＡ断片２（DNA Fragment 2）をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで処理した。得られた断片を枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）上のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ間にＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片２の順に順次導入し、プラスミドｐｙｔＤＮを得た。プラスミドｐｙｔＤＮ構築の概略を図４に示す。
Subsequently, a vector was constructed from the Bacillus subtilis vector pHY300PLK using the above DNA fragment. The outline was as shown in FIG.
Specifically, DNA fragment 1 (DNA Fragment 1) was treated with restriction enzymes XbaI and SalI, and DNA fragment 2 (DNA Fragment 2) was treated with SalI and BamHI. The obtained fragment was sequentially introduced in the order of
（３）形質転換
前記（２）で得られたプラスミドｐｙｔＤＮを用いてｒ２２株を形質転換した。
形質転換株の選択は、テトラサイクリン２μｇ／ｍｌを添加したＮＰ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシルス・サチリスｙｗｔＤ１（Bacillus subtilis ｙｗｔＤ１）株（以下、ｙｗｔＤ１株と称する場合もある）〔ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８１〕について、プラスミド抽出、制限酵素処理、アガロース電気泳動を行ない、その泳動パターンにより目的のプラスミドを保持していることが確認された。
(3) Transformation The r22 strain was transformed with the plasmid pytDN obtained in (2) above.
The transformant was selected by culturing at 37 ° C. for 18 hours in an NP medium supplemented with 2 μg / ml of tetracycline. The obtained transformant Bacillus subtilis ywtD1 (hereinafter sometimes referred to as ywtD1 strain) [FERM BP-08581] is subjected to plasmid extraction, restriction enzyme treatment, agarose electrophoresis, and electrophoresis The pattern confirmed that the target plasmid was retained.
また、以下の方法によって、ｙｗｔＤ１株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を親株ｒ２２株のそれと比較した。
すなわち、ｙｗｔＤ１株ならびにｒ２２株を、表４に示すＰ培地により培養し、３７℃で４８時間培養し、遠心して菌体を除き、培養上清を採取した。
Moreover, the glutamate polypeptide degrading enzyme activity of the ywtD1 strain was compared with that of the parent strain r22 by the following method.
That is, the ywtD1 strain and the r22 strain were cultured in the P medium shown in Table 4, cultured at 37 ° C. for 48 hours, centrifuged to remove the cells, and the culture supernatant was collected.
採取した培養上清をＭＩＣＲＯＣＯＮ ＹＭ−３（ミリポア社製）で限外濾過することにより、培養液中に含まれるタンパクを１０倍程度濃縮し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液１００μｌを、０．３５％グルタミン酸ポリペプチド含有１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌに添加して、３７℃で１時間反応させ、トリクロロ酢酸溶液（トリクロロ酢酸５．４４ｇ、酢酸ナトリウム５．４６ｇ、酢酸６．０ｇを脱イオン水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして作製）を０．３ｍｌ添加して、酵素反応を停止した。
反応液を遠心（１００００ｇ、５分間）して、上清を０．１ｍｌ採取した。脱イオン水これに０．４ｍｌ、０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ及びニンヒドリン試薬（５％ニンヒドリン含有２−メトキシエタノールと０．２ｍＭＫＣｌメトキシエタノール溶液を５：１で混合して作製）１ｍｌを添加して混合し、ヒートブロックを用いて１００℃、１５分間保温した後、氷上で冷却した。
５７０ｎｍの吸光度を測定して、酵素反応中の露出するＮ末端アミノ基を測定した。１分間に１μｍｏｌのアミノ基（グルタミン酸を基準物質として換算）を露出させるグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を１Ｕ（酵素単位）として、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を測定した。また、粗酵素液中のタンパク量については、ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ社製）で測定した。
The collected culture supernatant was ultrafiltered with MICROCON YM-3 (Millipore) to concentrate the protein contained in the culture solution about 10 times, and this was used as a crude enzyme solution.
100 μl of this crude enzyme solution was added to 100 μl of 1M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.35% glutamic acid polypeptide, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and trichloroacetic acid solution (5.44 g of trichloroacetic acid, The enzyme reaction was stopped by adding 0.3 ml of sodium acetate 5.46 g and acetic acid 6.0 g dissolved in deionized water and making up to 100 ml.
The reaction solution was centrifuged (10000 g, 5 minutes), and 0.1 ml of the supernatant was collected. 0.4 ml of deionized water, 0.5 ml of 0.2M citrate buffer (pH 5.0) and ninhydrin reagent (2-methoxyethanol containing 5% ninhydrin and 0.2 mM KCl methoxyethanol solution were mixed at a ratio of 5: 1. 1 ml was added and mixed, and the mixture was kept at 100 ° C. for 15 minutes using a heat block, and then cooled on ice.
The absorbance at 570 nm was measured to measure the exposed N-terminal amino group during the enzyme reaction. The glutamate polypeptide-degrading enzyme activity was measured with 1 U (enzyme unit) as the glutamate polypeptide-degrading enzyme activity that exposes 1 μmol of amino group (converted with glutamic acid as a reference substance) per minute. The amount of protein in the crude enzyme solution was measured with protein assay (manufactured by BioRad).
ｙｗｔＤ１株ならびにｒ２２株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を、タンパク質１ｍｇ当りの活性（比活性）で表した結果を表５に示した。
尚、培地に添加したグルタミン酸ポリペプチド及び活性測定に用いたグルタミン酸ポリペプチドは、納豆から抽出した粘物質から以下の手順でレバンを分解、除去したものを用いた。すなわち、納豆に２倍量の５％ＮａＣｌ水溶液を添加して粘物質を抽出した。抽出した粘物質溶液を遠心して菌体を除去し、２倍量の特級エタノールを添加してエタノール沈殿を行ない、納豆の粘物質を採取した。採取された粘物質を、５％ＮａＣｌ水溶液に溶解し、溶液中の塩酸濃度が１％になるように塩酸を添加して３７℃で３時間保温し、レバンを分解した。更に３倍量のエタノールを添加してエタノール沈殿を行ない、レバンを除去した。続いて、再び５％ＮａＣｌ水溶液に溶解し、流水で１晩透析して、低分子の夾雑物を除いてグルタミン酸ポリペプチドを調製した。
Table 5 shows the results obtained by expressing the glutamate polypeptide-degrading enzyme activities of the ywtD1 strain and the r22 strain in terms of activity (specific activity) per 1 mg of protein.
In addition, the glutamic acid polypeptide added to the medium and the glutamic acid polypeptide used for activity measurement were obtained by decomposing and removing levan from mucus extracted from natto by the following procedure. That is, a viscous substance was extracted by adding twice the amount of 5% NaCl aqueous solution to natto. The extracted viscous substance solution was centrifuged to remove the cells, and twice the amount of special grade ethanol was added to perform ethanol precipitation, and the natto viscous substance was collected. The collected viscous substance was dissolved in 5% NaCl aqueous solution, hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration in the solution was 1%, and the mixture was kept at 37 ° C. for 3 hours to decompose levan. Further, 3 times the amount of ethanol was added and ethanol precipitation was performed to remove levan. Subsequently, it was dissolved again in 5% NaCl aqueous solution and dialyzed against running water overnight to prepare a glutamic acid polypeptide by removing low molecular impurities.
その結果、表５に示すように、ｙｗｔＤ１株のグルタミン酸ポリペプチド分解活性は、親株ｒ２２株のそれより２倍以上増強されていることが確認された。 As a result, as shown in Table 5, it was confirmed that the glutamic acid polypeptide degrading activity of the ywtD1 strain was enhanced 2 times or more than that of the parent strain r22.
（４）納豆試作と品質評価
常法に従い、ｒ２２株、及びｙｗｔＤ１株の胞子液を調製した。
すなわち、ｒ２２株又はｙｗｔＤ１株を表２に示したＮＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表３に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
(4) Natto Trial Production and Quality Evaluation According to a conventional method, spore solutions of r22 strain and ywtD1 strain were prepared.
That is, the r22 strain or ywtD1 strain was inoculated with 1 white fungus in the NB medium shown in Table 2 and cultured at 37 ° C. overnight, and the culture solution was inoculated with 1% in the spore-forming medium shown in Table 3. The spore solution was prepared by culturing at 37 ° C. for 24 hours.
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。
すなわち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧２ｋｐａで８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株又はｙｗｔＤ１株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
Hereinafter, each spore solution was used as an inoculum, and natto was prototyped according to a conventional method.
That is, very small soybeans were immersed in tap water at 4 ° C. overnight, and then steamed in a pressure steamer at a steam pressure of 2 kpa for 8 minutes. The spore solution of the above-mentioned r22 strain or ywtD1 strain was diluted 100-fold with sterilized water to the cooked soybean thus prepared, seeded with 0.8 ml per 100 g of cooked soybean, and fermented at 39 ° C. for 18 hours. After fermentation, it was stored at 4 ° C. for 24 hours to prepare natto.
試作の結果、ｙｗｔＤ１株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られなかった。このことから、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素（γ−Ｄ，Ｌ−グルタミルヒドロラーゼ）の活性増強操作が、納豆菌の生育に対し影響を及ぼさないことが分かった。 As a result of trial production, when fermentation was performed using the ywtD1 strain, there was no delay in fermentation time, a decrease in natto product temperature during fermentation, or the like, compared to the case where fermentation was performed using the r22 strain. From this, it was found that the operation for enhancing the activity of glutamate polypeptide degrading enzyme (γ-D, L-glutamyl hydrolase) does not affect the growth of Bacillus natto.
続いて、親株（ｒ２２株）から試作された納豆と、変異株（ｙｗｔＤ１株）から試作された納豆とで、納豆の糸切れを比較する官能評価（糸切れ評価）を行なった。
納豆の糸切れの官能評価は、納豆を攪拌し、まとまった納豆塊を３０ｃｍ持ち上げて、そこで生じる納豆のネバの切れる時間の長さをコントロールの納豆と比較して行なった。糸切れは、○、△、×の３段階で評価し、コントロールの市販納豆もよりも糸切れに要した時間が短い場合は○；コントロールよりも糸切れに要した時間がやや短い場合は△；コントロールよりも糸切れに要した時間が同じ若しくは長い場合は×、と評価した。
その結果、親株（ｒ２２株）は×と評価されたのに対して変異株（ｙｗｔＤ１株）△と評価されたことから、変異株（ｙｗｔＤ１株）から試作された納豆のほうが親株（ｒ２２株）から試作された納豆よりもややネバの糸切れがよいことが確認できた。
Subsequently, sensory evaluation (yarn breakage evaluation) was performed to compare natto yarn breakage between natto prototyped from the parent strain (r22 strain) and natto prototyped from the mutant strain (ywtD1 strain).
The sensory evaluation of natto thread breakage was performed by stirring the natto and lifting the whole natto lump by 30 cm, and comparing the length of time that the natto neva breaks up with the control natto. Thread breakage is evaluated in three stages: ◯, △, and ×. If the time required for thread breakage is shorter than that of control commercial natto, ○: If the time required for yarn breakage is slightly shorter than control, △ When the time required for thread breakage was the same or longer than the control, it was evaluated as x.
As a result, the parent strain (r22 strain) was evaluated as x, whereas the mutant strain (ywtD1 strain) was evaluated as Δ. Therefore, the natto prototyped from the mutant strain (ywtD1 strain) was the parent strain (r22 strain). It was confirmed that the thread breakage of the Neva was slightly better than the natto prototyped from
一方、納豆の糸切れ以外の品質、すなわち菌膜の厚さ、豆色、香り及び熟度について比較する官能検査を行った。得られた評価結果を表６に示す。 On the other hand, a sensory test was conducted to compare the quality of natto other than thread breakage, that is, the thickness of the fungus membrane, the bean color, the aroma, and the maturity. Table 6 shows the obtained evaluation results.
表６の結果から明らかなように、親株（ｒ２２株）から試作された納豆と、変異株（ｙｗｔＤ１株）から試作された納豆とは、各品質において違いが見られなかった。
このことから、ｙｗｔＤ１株を種菌に用いて作製した納豆は、糸切れがよいほかに、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
As is clear from the results in Table 6, there was no difference in quality between natto prototyped from the parent strain (r22 strain) and natto prototyped from the mutant strain (ywtD1 strain).
From this, it was confirmed that natto produced using the ywtD1 strain as an inoculum had good quality as natto in addition to good thread breakage.
実施例２〔グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌（ｇｇｔ遺伝子高発現納豆菌）の作製〕
（１）基本条件
ｇｇｔ遺伝子を高発現させる親株としてｒ２２株を用いた。
プラスミドベクターとしては、ｐＵＢ１１０（ＡＴＣＣ３７０１５）を用いた。
また、再生培地としてＮＰ培地（表１）を用い、基本的な培養にはＮＢ培地（表２）を用い、納豆菌の胞子を調製するための胞子形成培地としては、Ｓｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地（表３）を用いた。
納豆菌の染色体ＤＮＡの調製には、市販のキットを使用した。
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、Ｔａｑポリメラーゼに添付のマニュアルに従った反応条件下で行った。
形質転換は、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」の方法に従った。
Example 2 [Production of Glutamate Polypeptide Degrading Enzyme Highly Active Bacillus Natto (gnat Gene Highly Expressing Bacillus natto)]
(1) Basic conditions The r22 strain was used as a parent strain for highly expressing the ggt gene.
As the plasmid vector, pUB110 (ATCC 37015) was used.
In addition, NP medium (Table 1) is used as a regeneration medium, NB medium (Table 2) is used for basic culture, and a Sterini-Madelstam replacement medium (Table 1) is used as a spore formation medium for preparing Bacillus natto spores. Table 3) was used.
A commercially available kit was used to prepare the chromosomal DNA of Bacillus natto.
Amplification of the DNA fragment by PCR was performed using Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) under reaction conditions according to the manual attached to Taq polymerase.
The transformation followed the method of “Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979”.
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子導入技術は、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular and General Genetics）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」の記載に従った。但し、納豆菌の形質転換における再生培地にはＮＰ培地「納豆試験法、第１版（１９９０）、光琳、東京」を用いた。 Unless otherwise specified, culture conditions, culture media and other gene transfer techniques are described in “Molecular and General Genetics, 168, p. 111-115, 1979”. I followed. However, the NP medium “Natto Test Method, 1st Edition (1990), Korin, Tokyo” was used as the regeneration medium in the transformation of Bacillus natto.
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１及び図４に示した。
すなわち、ｒ２２株のａｐｒＥ遺伝子プロモーター領域の増幅のためのプライマーとして、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を、ｇｇｔ遺伝子の増幅のためのプライマーとして、プライマー５（配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を使用した。
それぞれのプライマーは、枯草菌バシルス・サチリス（Bacillus subtilis）のｇｇｔ遺伝子の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベースの受理番号ＡＢ０９５９８４の塩基配列参照）を基にして設計し合成した。
(2) Vector construction The outline of production of each DNA fragment used for vector construction is shown in FIGS.
That is, as a primer for amplifying the aprE gene promoter region of the r22 strain, primer 1 (described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and primer 2 (described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) were used for amplification of the ggt gene. As primers, primer 5 (described in SEQ ID NO: 5) and primer 6 (described in SEQ ID NO: 6) were used.
Each primer was designed and synthesized based on the base sequence of the ggt gene of Bacillus subtilis Bacillus subtilis (see, for example, the base sequence of the accession number AB095984 in databases such as GenBank, EMBL and DDBJ).
これらのプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
すなわち、まず、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いａｐｒＥ遺伝子プロモーター領域（aprE promotor）を増幅するとともにＸｂａＩ及びＳａｌＩを用いて制限酵素サイトを両端に導入した（ＤＮＡ断片１（DNA Fragment 1））（図１）。
また、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしプライマー５（配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を用いｇｇｔ遺伝子を増幅するとともにＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩを用いて制限酵素サイトを両端に導入した（ＤＮＡ断片３（DNA Fragment 3））（図５）。
PCR was performed using these primers.
That is, first, the aprE gene promoter region (aprE promoter) is amplified using primer 1 (described in SEQ ID NO: 1) and primer 2 (described in SEQ ID NO: 2) using the total DNA of the r22 strain as a template. At the same time, restriction enzyme sites were introduced at both ends using XbaI and SalI (DNA Fragment 1) (FIG. 1).
In addition, the ggt gene was amplified using primer 5 (described in SEQ ID NO: 5) and primer 6 (described in SEQ ID NO: 6) using the total DNA of r22 strain as a template, and restricted using SalI and EcoRI. Enzyme sites were introduced at both ends (DNA Fragment 3) (FIG. 5).
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いて枯草菌ベクターｐＵＢ１１０からベクターを構築した。その概略は図６に示す通りとした。
すなわち、ＤＮＡ断片１（DNA Fragment 1）を制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩで、ＤＮＡ断片３（DNA Fragment 3）をＳａｌＩで処理した。得られた断片を枯草菌ベクターｐＵＢ１１０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ間にＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片３を導入し、プラスミドｐｇｔＮを得た。プラスミドｐｇｔＮ構築の概略を図７に示す。
Subsequently, a vector was constructed from the Bacillus subtilis vector pUB110 using the above DNA fragment. The outline was as shown in FIG.
That is, DNA fragment 1 (DNA Fragment 1) was treated with restriction enzymes XbaI and SalI, and DNA fragment 3 (DNA Fragment 3) was treated with SalI. The obtained fragment was introduced with
（３）形質転換
前記（２）で得られたプラスミドｐｇｔＮを用いてｒ２２株を形質転換した。
形質転換株の選択は、カナマイシン５μｇ／ｍｌを添加したＮＰ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られたバシルス・サチリスｇｇｔ５（Bacillus subtilis ｇｇｔ５）株（以下、ｇｇｔ５株と称する場合もある）〔ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５８０〕は、プラスミド抽出、制限酵素処理、アガロース電気泳動を行ない、その泳動パターンにより目的のプラスミドを保持していることが確認された。
(3) Transformation The r22 strain was transformed with the plasmid pgtN obtained in (2) above.
The transformant was selected by culturing at 37 ° C. for 18 hours in an NP medium supplemented with 5 μg / ml kanamycin. The obtained Bacillus subtilis ggt5 strain (hereinafter sometimes referred to as ggt5 strain) [FERM BP-08580] was subjected to plasmid extraction, restriction enzyme treatment, and agarose electrophoresis. It was confirmed that this plasmid was retained.
また、実施例１で示した方法によって、ｇｇｔ５株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を親株ｒ２２株のそれと比較した。
ｇｇｔ５株ならびにｒ２２株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性を、タンパク質１ｍｇ当りの活性（比活性）で表した結果を、表７に示した。
Further, the glutamate polypeptide degrading enzyme activity of the ggt5 strain was compared with that of the parent strain r22 by the method shown in Example 1.
Table 7 shows the results obtained by expressing the glutamate polypeptide-degrading enzyme activities of the ggt5 strain and the r22 strain in terms of activity (specific activity) per 1 mg of protein.
その結果、表７に示すように、ｇｇｔ５株のグルタミン酸ペプチド分解活性は、親株ｒ２２株のそれよりやや増強されていることが確認された。 As a result, as shown in Table 7, it was confirmed that the glutamic acid peptide degrading activity of the ggt5 strain was slightly enhanced than that of the parent strain r22.
（４）納豆試作と品質評価
常法に従い、ｒ２２株、及びｇｇｔ５株の胞子液を調製した。
すなわち、ｒ２２株又はｇｇｔ５株を表２に示したＮＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表３に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
(4) Natto Trial Production and Quality Evaluation According to a conventional method, spore solutions of r22 strain and ggt5 strain were prepared.
That is, the r22 strain or the ggt5 strain was inoculated with 1 white fungus into the NB medium shown in Table 2 and cultured overnight at 37 ° C., and the culture solution was inoculated with 1% into the spore-forming medium shown in Table 3. The spore solution was prepared by culturing at 37 ° C. for 24 hours.
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。
すなわち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧２ｋｐａで８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株又はｇｇｔ５株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
Hereinafter, each spore solution was used as an inoculum, and natto was prototyped according to a conventional method.
That is, very small soybeans were immersed in tap water at 4 ° C. overnight, and then steamed in a pressure steamer at a steam pressure of 2 kpa for 8 minutes. The spore solution of the above-mentioned r22 strain or ggt5 strain was diluted 100 times with sterilized water to the steamed soybean prepared as described above, seeded with 0.8 ml per 100 g of steamed soybean, and fermented at 39 ° C. for 18 hours. After fermentation, it was stored at 4 ° C. for 24 hours to prepare natto.
試作の結果、ｇｇｔ５株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）の高活性が納豆菌の活性増強操作が、納豆菌の生育に対し影響を及ぼさないことが分かった。 As a result of trial production, when fermenting using the ggt5 strain, compared with the case of fermenting using the r22 strain, no delay in fermentation time, lowering of the natto product temperature during fermentation, etc. were observed, and glutamic acid polypeptide degradation It was found that the high activity of the enzyme (γ-glutamyl transpeptidase) has no effect on the growth of Bacillus natto.
続いて試作により得られた納豆を官能検査に供した。
親株（ｒ２２株）から試作された納豆と、変異株（ｇｇｔ５株）から試作された納豆とで、実施例１と同様な方法でネバの糸切れを比較する官能評価（糸切れ評価）を行なった。
その結果、親株（ｒ２２株）から試作された納豆は×と評価されたのに対して、変異株（ｇｇｔ５株）から試作された納豆は△と評価されたことから、変異株のほうが親株よりもややネバの糸切れがよいことが確認できた。
Subsequently, natto obtained by trial manufacture was subjected to a sensory test.
Sensory evaluation (yarn breakage evaluation) is performed by comparing the yarn breakage of Neva in the same manner as in Example 1 with natto prototyped from the parent strain (r22 strain) and natto prototyped from the mutant strain (ggt5 strain). It was.
As a result, natto prototyped from the parent strain (r22 strain) was evaluated as x, whereas natto prototyped from the mutant strain (ggt5 strain) was evaluated as △. It was confirmed that the thread breakage was slightly better.
一方、実施例１と同様に糸切れ以外の形質について比較する官能検査を行った。得られた評価結果を表８に示す。 On the other hand, the sensory test which compares about traits other than thread breakage like Example 1 was performed. Table 8 shows the obtained evaluation results.
表８の結果から明らかなように、親株（ｒ２２株）から試作された納豆と、変異株（ｇｇｔ５株）から試作された納豆とは、各品質において違いが見られなかった。
このことから、ｇｇｔ５株を種菌に用いて作製した納豆は、糸切れがよいほかに、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
As is clear from the results in Table 8, there was no difference in quality between natto prototyped from the parent strain (r22 strain) and natto prototyped from the mutant strain (ggt5 strain).
From this, it was confirmed that natto produced using the ggt5 strain as an inoculum had good quality as natto in addition to good thread breakage.
実施例３〔ｒ２２株及びグルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性株（ｙｗｔＤ１株、ｇｇｔ５株）により作製した納豆の糸切れ〕
納豆の通常たれ（醤油３０重量％、味りん５重量％、かつおエキス１０重量％、食塩５重量％、水５０重量％）６ｇにＣａＣｌ２・２水和物０．３ｇ（納豆当たりのカルシウム濃度：０．１６重量／重量％）を混合したたれを作製した。このたれを、ｒ２２株及びｙｗｔＤ１株、ｇｇｔ５株を用いて実施例１又は２記載の方法に従って作製した納豆５０ｇに添加して、実施例１と同様な方法で、ネバの糸切れを比較する官能評価を行なった。糸切れの官能評価を行なった。
各菌株を用いて作製された納豆の糸切れの結果を表９に示す。
Example 3 [Nato breakage of natto prepared by r22 strain and glutamate polypeptide degrading enzyme highly active strain (ywtD1 strain, ggt5 strain)]
Ordinary sauce of natto (30% by weight of soy sauce, 5% by weight of taste phosphorus, 10% by weight of bonito extract, 5% by weight of salt, 50% by weight of water) and 0.3 g of CaCl 2 dihydrate (concentration of calcium per natto) : 0.16 wt / wt%) was prepared. This sauce is added to 50 g of natto prepared according to the method described in Example 1 or 2 using the r22 strain, the ywtD1 strain, and the ggt5 strain, and the sensor is used to compare the yarn breakage of Neva in the same manner as in Example 1. Evaluation was performed. Sensory evaluation of thread breakage was performed.
Table 9 shows the results of thread breakage of natto prepared using each strain.
表９に示すように、ｙｗｔＤ１株やｇｇｔ５株を用いて作製した納豆は、ｒ２２株を用いて作製した納豆に比べて糸切れがよいことが明らかとなった。
このことから、納豆の糸切れを向上させるには、グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性化株であるｙｗｔＤ１株、ｇｇｔ５株で納豆を作製することが必要であると共に、所定の２価カチオンを含むたれを添加することにより納豆の糸切れの良さが一層向上することが分かった。
As shown in Table 9, it was revealed that natto produced using the ywtD1 strain and ggt5 strain had better thread breakage than natto produced using the r22 strain.
From this, in order to improve the thread breakage of natto, it is necessary to prepare natto with ywtD1 and ggt5 strains, which are glutamate polypeptide-degrading enzyme highly activated strains, and contains a predetermined divalent cation. It was found that the yarn breakage of natto was further improved by adding.
実施例４〔ｙｗｔＤ１株で作製した納豆における、糸切れをよくするのに必要な２価カチオンの添加量の検討〕
納豆の通常たれ（実施例３で用いたのと同様の組成からなるもの）６ｇに、２価カチオンであるカルシウム又はマグネシウムを表１０に示す種種の濃度で溶解して、種種の２価カチオン濃度のたれを調製した。
これらのたれをｙｗｔＤ１株を用いて実施例１記載の方法に従って作製した納豆５０ｇに添加して、実施例１と同様な方法で、納豆の糸切れを比較する官能評価（糸切れ評価）を行なった。
各２価カチオン濃度のたれを添加した場合の納豆の糸切れの結果を表１０に示す。
Example 4 [Examination of the amount of divalent cation added to improve yarn breakage in natto prepared with the ywtD1 strain]
Divalent cation concentration of various species shown in Table 10 is obtained by dissolving divalent cation calcium or magnesium in 6 g of normal natto sauce (comprising the same composition as used in Example 3). A sauce was prepared.
These sauces are added to 50 g of natto prepared according to the method described in Example 1 using the ywtD1 strain, and sensory evaluation (yarn breakage evaluation) is performed to compare natto yarn breakage in the same manner as in Example 1. It was.
Table 10 shows the results of natto yarn breakage when each divalent cation concentration dripping was added.
表１０に示すように、カルシウムを納豆当たり０．１６重量／重量％以上、マグネシウムを０．１４重量／重量％以上添加した場合、それ以外の濃度の場合と比較して糸切れがよいことが分かった。
以上の結果から、ｙｗｔＤ１で作製した納豆において、２価カチオンとしてカルシウムやマグネシウムを、納豆当たり０．１４重量／重量％以上添加した場合、納豆の糸切れの良さが一層向上することが分かった。
As shown in Table 10, when calcium is added at 0.16 wt / wt% or more per natto and magnesium is added at 0.14 wt / wt% or more, thread breakage may be better than other concentrations. I understood.
From the above results, it was found that when natto produced with ywtD1 was added with calcium or magnesium as a divalent cation in an amount of 0.14 wt / wt% or more per natto, the yarn breakage of natto was further improved.
実施例５〔ｇｇｔ５株で作製した納豆における、糸切れをよくするのに必要な２価カチオンの添加量の検討〕
納豆の通常たれ（実施例３で用いたのと同様の組成からなるもの）６ｇに、２価カチオンを表１１に示す種種の濃度で溶解して、種種の２価カチオン濃度のたれを調製した。
これらのたれをｇｇｔ５株を用いて、常法で作製した納豆５０ｇに添加して、実施例１と同様な方法で、納豆の糸切れを比較して官能評価（糸切れ評価）を行なった。
各２価カチオン濃度のたれを添加した場合の納豆の糸切れの結果を表１１に示す。
Example 5 [Study on the amount of divalent cation added to improve thread breakage in natto prepared with the ggt5 strain]
Divalent cations were dissolved in various concentrations shown in Table 11 in 6 g of natto's normal sauce (consisting of the same composition as used in Example 3) to prepare various types of divalent cation concentrations. .
These sauces were added to 50 g of natto prepared by a conventional method using the ggt5 strain, and in the same manner as in Example 1, natto yarn breakage was compared and sensory evaluation (yarn breakage evaluation) was performed.
Table 11 shows the results of natto yarn breakage when each divalent cation concentration was added.
表１１に示すように、カルシウムを納豆当り０．１６重量／重量％以上、マグネシウムを０．１４重量／重量％以上添加した場合、それ以外の濃度の場合と比較して糸切れがよいことが分かった。
以上の結果から、ｇｇｔ５株で作製した納豆において、２価のカチオンとしてカルシウムやマグネシウムを、納豆当り０．１４重量／重量％以上添加した場合、納豆の糸切れの良さが一層向上することが分かった。
As shown in Table 11, when calcium is added at 0.16 wt / wt% or more per natto and magnesium is added at 0.14 wt / wt% or more, thread breakage may be better than other concentrations I understood.
From the above results, in natto produced with the ggt5 strain, it was found that when calcium or magnesium was added as a divalent cation in an amount of 0.14 wt / wt% or more per natto, the yarn breakage of natto was further improved. It was.
実施例６〔納豆の食味に対するカルシウム及びマグネシウムの添加量の影響〕
納豆の通常たれ（実施例３で用いたのと同様の組成からなるもの）６ｇに、２価カチオンであるカルシウム又はマグネシウムを表１２に示す種種の濃度で溶解して、種々の２価カチオン濃度のたれを調製した。
これらのたれを市販納豆（ミツカン社製）５０ｇに添加して、試食を行い、それぞれ○、△、×の３段階にて官能評価（味評価）を行なった。まったく苦味を感じない場合は○；やや苦味を感じる場合は△；はっきり苦味を感じる場合は×、と評価した。
各２価カチオン濃度のたれを添加した場合の納豆の食味の結果を表１２に示す。
Example 6 [Effect of the addition amount of calcium and magnesium on the taste of natto]
Various divalent cation concentrations are obtained by dissolving divalent cation calcium or magnesium in 6 g of normal natto sauce (comprising the same composition as used in Example 3) at various concentrations shown in Table 12. A sauce was prepared.
These sauces were added to 50 g of commercially available natto (manufactured by Mitsukan Co., Ltd.) and sampled, and sensory evaluation (taste evaluation) was performed in three stages of ◯, Δ, and X, respectively. A case where no bitterness was felt was evaluated as ◯; a case where slight bitterness was felt;
Table 12 shows the taste results of natto when each divalent cation concentration was added.
表１２に示すように、カルシウムを納豆当たり０．２７％以下、マグネシウムを０．２４％以下添加した場合、それ以外の濃度の場合と比較して苦味を感じないことが分かった。
このことから、カルシウムの濃度を納豆当たり０．２７重量／重量％以下、また、マグネシウムの濃度を納豆当たり０．２４重量／重量％以下とした場合には、これを市販納豆に欠けた場合にも苦味を感じないことが明らかとなった。
As shown in Table 12, it was found that when calcium was added in an amount of 0.27% or less per natto and magnesium was added in an amount of 0.24% or less, no bitterness was felt as compared with the other concentrations.
From this, when the calcium concentration is 0.27 wt / wt% or less per natto and the magnesium concentration is 0.24 wt / wt% or less per natto, this is lacking in commercial natto It became clear that no bitterness was felt.
実施例７〔グルタミン酸ポリペプチド分解酵素高活性納豆菌（突然変異株）の作製〕
（１）突然変異株の取得
突然変異株を取得するための親株としては、ＯＵＶ２３４８１株を用いた。
また、納豆菌の培養は、前記表２に記載のＮＢ培地を用い、常法に従って実施した。
Example 7 [Production of Glutamic Acid Polypeptide Degrading Enzyme Highly Active Natto (Mutant)]
(1) Acquisition of mutant strain OUV23481 strain was used as a parent strain for acquiring a mutant strain.
Moreover, culture | cultivation of natto bacteria was implemented according to the conventional method using the NB culture medium of the said Table 2.
ＯＵＶ２３４８１株を３７℃で一晩振とう培養した後、遠心分離し、滅菌生理食塩水で洗浄した。
この約１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌体に、２０ｍｇ／ｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、３０分間振とうして、変異処理を行った。この時の生存率は２％前後であった。
変異処理した菌体を上記ＮＢ培地で培養して形質を発現させ、その後に滅菌生理食塩水で洗浄し、ＧＳ培地に塗抹した。
ＧＳ培地の組成を、以下の表１３に示す。
The OUV23481 strain was cultured with shaking at 37 ° C. overnight, then centrifuged and washed with sterile physiological saline.
N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine was added to the washed cells having a concentration of about 10 7 cfu / ml to a concentration of 20 mg / l, and the mixture was shaken for 30 minutes for mutation treatment. It was. The survival rate at this time was around 2%.
The mutated bacterial cells were cultured in the above NB medium to express their traits, and then washed with sterilized physiological saline and smeared on the GS medium.
The composition of the GS medium is shown in Table 13 below.
ＧＳ培地にて３７℃で一晩培養した後、実施例１で取得したｙｗｔＤ１株のコロニーと同様に、コロニーがしわしわになって盛り上がる形態の株を約１０００株取得した。取得した約１０００株を、グルタミン酸ポリペプチドを含有するＰＧＡ培地にレプリカし、３７℃で２４時間培養した。グルタミン酸ポリペプチドは、実施例１のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性の測定に用いられたものと同様のものを用いた。
Ｐ培地の組成を、以下の表１４に示す。
After culturing overnight in GS medium at 37 ° C., about 1000 strains in a form in which the colonies wrinkled and swelled were obtained in the same manner as the ywtD1 strain colonies obtained in Example 1. About 1000 strains obtained were replicated in PGA medium containing glutamic acid polypeptide and cultured at 37 ° C. for 24 hours. The same glutamic acid polypeptide as that used in the measurement of glutamic acid polypeptide degrading enzyme activity in Example 1 was used.
The composition of P medium is shown in Table 14 below.
培養後、そのまま２０℃で２４時間保存して、形成するハローの大きさが親株（ＯＵＶ２３４８１株）より大きい株を約２００株取得した。
ここで得られた約２００株について、実際に納豆を作製して、納豆の品質として問題がなく、親株と比較して糸切れの良い株を選抜し、Ｄ８６（Bacillus subtilis D86）株（以下、Ｄ８６株と称する場合もある）〔ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６６４〕を取得した。
After culturing, the strain was stored as it was at 20 ° C. for 24 hours, and about 200 strains having a larger halo size than the parent strain (OUV23481 strain) were obtained.
About 200 strains obtained here, natto was actually produced, and there was no problem with the quality of natto, and a strain with better thread breakage than the parent strain was selected, and the strain D86 (Bacillus subtilis D86) (Sometimes referred to as D86 strain) [FERM BP-08664].
また、実施例１で示した方法によって、Ｄ８６株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性と親株ＯＵＶ２３４８１株のそれと比較した。
Ｄ８６株ならびにＯＵＶ２３４８１株のグルタミン酸ポリペプチド分解酵素活性をタンパク質１ｍｇ当りの活性（比活性）で表した結果を、表１５に示した。
Further, the glutamate polypeptide degrading enzyme activity of the D86 strain was compared with that of the parent strain OUV23481 by the method shown in Example 1.
Table 15 shows the results obtained by expressing the glutamate polypeptide-degrading enzyme activities of the D86 strain and OUV23481 strain in terms of activity (specific activity) per 1 mg of protein.
その結果、表１５に示すように、Ｄ８６株のグルタミン酸ペプチド分解活性は、親株ＯＵＶ２３４８１株のそれより約１．４倍増強されていることが確認された。 As a result, as shown in Table 15, it was confirmed that the glutamic acid peptide degrading activity of the D86 strain was enhanced about 1.4 times that of the parent strain OUV23481.
（２）納豆試作と品質評価
常法に従い、ＯＵＶ２３４８１株、及びＤ８６株の胞子液を調製した。
すなわち、ＯＵＶ２３４８１株又はＤ８６株を表２に示したＮＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表３に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
(2) Natto Trial Production and Quality Evaluation According to a conventional method, spore solutions of OUV23481 strain and D86 strain were prepared.
That is, one strain of OUV23481 strain or D86 strain was inoculated in the NB medium shown in Table 2 and cultured at 37 ° C. overnight, and the culture solution was inoculated 1% in the spore-forming medium shown in Table 3. The spore solution was prepared by culturing at 37 ° C. for 24 hours.
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。
すなわち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧２ｋｐａで８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のＯＵＶ２３４８１株又はＤ８６株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
Hereinafter, each spore solution was used as an inoculum, and natto was prototyped according to a conventional method.
That is, very small soybeans were immersed in tap water at 4 ° C. overnight, and then steamed in a pressure steamer at a steam pressure of 2 kpa for 8 minutes. The spore solution of the above-mentioned OUV23481 strain or D86 strain was diluted 100-fold with sterilized water to the cooked soybean thus prepared, seeded with 0.8 ml per 100 g of cooked soybean, and fermented at 39 ° C. for 18 hours. After fermentation, it was stored at 4 ° C. for 24 hours to prepare natto.
試作の結果、Ｄ８６株を用いて発酵を行った場合、ＯＵＶ２３４８１株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られなかった。このことから、突然変異処理によるグルタミン酸ポリペプチド分解酵素の活性増強効果が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。 As a result of trial production, when fermentation was carried out using the D86 strain, the fermentation time was not delayed and the temperature of the natto product during the fermentation was not reduced as compared with the case where the fermentation was carried out using the OUV23481 strain. From this, it was found that the activity enhancing effect of glutamate polypeptide degrading enzyme by mutation treatment does not affect the growth of Bacillus natto.
続いて、親株（ＯＵＶ２３４８１株）から試作された納豆と、変異株（Ｄ８６株）から試作された納豆とで、実施例１と同様の方法で納豆の糸切れの比較する官能評価（糸切れ評価）を行なった。
その結果、親株が×であったのに対して、変異株は△であったことから、変異株から試作された納豆の方が、親株から試作された納豆よりも、ややネバの糸切れが良いことが確認できた。
Subsequently, sensory evaluation (yarn breakage evaluation) for comparing the natto yarn breakage in the same manner as in Example 1 with natto prototyped from the parent strain (OUV23481 strain) and natto prototyped from the mutant strain (D86 strain) ).
As a result, since the parent strain was ×, the mutant strain was △, so the natto prototyped from the mutant strain was slightly more broken than the natto prototyped from the parent strain. It was confirmed that it was good.
一方、納豆の糸切れ以外の品質、すなわち菌膜の厚さ、豆色、香り及び熟度について比較する官能評価を行なった。得られた評価結果を表１６に示す。 On the other hand, sensory evaluation was performed to compare natto quality other than thread breakage, that is, the thickness of the fungus membrane, bean color, aroma, and ripeness. Table 16 shows the obtained evaluation results.
表１６の結果から明らかなように、親株（ＯＵＶ２３４８１株）から試作された納豆と変異株（Ｄ８６株）から試作された納豆とは、各品質において違いが見られなかった。
このことから、Ｄ８６株を種菌に用いて作製した納豆は、糸切れがよいほかに、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
As is apparent from the results in Table 16, there was no difference in quality between natto produced from the parent strain (OUV23481 strain) and natto produced from the mutant strain (D86 strain).
From this, it was confirmed that natto produced using the D86 strain as an inoculum had good quality as natto in addition to good thread breakage.
実施例８〔Ｄ８６株で作製した納豆における、糸切れを良くするのに必要な２価カチオンの添加量の検討〕
納豆の通常たれ（実施例３で用いたのと同様の組成からなるもの）６ｇに、２価カチオンを表１７に示す種種の濃度で溶解して、種種の２価カチオン濃度のたれを調製した。
これらのたれをＤ８６株を用いて、常法で作製した納豆５０ｇに添加して、実施例１と同様な方法で、納豆の糸切れを比較する官能評価（糸切れ評価）を行なった。
各２価カチオン濃度のたれを添加した場合の納豆の糸切れの結果を表１７に示す。
Example 8 [Examination of the amount of divalent cation added to improve yarn breakage in natto prepared with the D86 strain]
Divalent cations were dissolved in various concentrations of divalent cations shown in Table 17 in 6 g of natto's normal drip (consisting of the same composition as used in Example 3) to prepare various divalent cation concentration sacks. .
These sauces were added to 50 g of natto prepared by a conventional method using the D86 strain, and sensory evaluation (yarn breakage evaluation) was performed in the same manner as in Example 1 to compare natto yarn breakage.
Table 17 shows the results of natto yarn breakage when each divalent cation concentration was added.
表１７に示すように、カルシウムを納豆当り０．１６重量／重量％以上、マグネシウム０．１４重量／重量％以上添加した場合、それ以外の濃度の場合と比較して糸切れがよいことが分かった。
以上の結果から、Ｄ８６株で作製した納豆において、２価のカチオンとしてカルシウムやマグネシウムを納豆当り０．１４重量／重量％以上添加した場合、納豆の糸切れの良さが一層向上することが分かった。
As shown in Table 17, it was found that when calcium was added in an amount of 0.16 wt / wt% or more per natto and 0.14 wt / wt% or more of magnesium, the yarn breakage was better than in other concentrations. It was.
From the above results, it was found that in the natto produced with the D86 strain, when calcium or magnesium was added as a divalent cation in an amount of 0.14 wt / wt% or more per natto, the natto thread breakage was further improved. .
本発明によれば、納豆のネバを構成しているグルタミン酸ポリペプチドに作用するグルタミン酸ポリペプチド分解酵素が高活性化された納豆菌が提供される。該納豆菌を用いることにより、糸切れがよく、かつ官能的にも良好な納豆を製造することができる。
さらに、本発明によれば、このようにグルタミン酸ポリペプチド分解酵素遺伝子の発現を増強させた納豆菌が製造した納豆と、２価カチオンの含量を特定割合以上に高めたたれとからなる容器入り納豆が提供される。該容器入り納豆によれば、たれを添加することにより、糸切れが一層よくなり、かつ納豆としての官能的な品質に影響を与えないことから、納豆の消費拡大に貢献することが明らかである。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the Bacillus natto in which the glutamate polypeptide degrading enzyme which acts on the glutamate polypeptide which comprises the natto neva is highly activated is provided. By using the Bacillus natto, it is possible to produce natto with good thread breakage and good sensory properties.
Furthermore, according to the present invention, natto in a container comprising natto produced by natto bacteria with enhanced expression of the glutamate polypeptide degrading enzyme gene as described above, and a product obtained by increasing the content of divalent cations to a specific ratio or more. Is provided. According to the natto contained in the container, by adding dripping, the yarn breakage is further improved and the sensory quality as natto is not affected, so it is clear that it contributes to the expansion of consumption of natto. .
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007143467A (en) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Mitsukan Group Honsha:Kk | Glutamine synthase gene, bacillus natto enhanced in expression of the gene, and natto of reduced ammonia content which is produced using the bacillus natto |
| JP2014023449A (en) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | Unitika Ltd | Production method of sulfur-containing cysteine compound |
| WO2015163120A1 (en) * | 2014-04-24 | 2015-10-29 | 茨城県 | Reduced-stringiness bacillus subtilis natto strain, method for producing natto using said bacillus subtilis natto strain, and natto |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6019466A (en) * | 1983-07-13 | 1985-01-31 | Agumin:Kk | Natto (fermented soybean) or mucous product of bacillus natto free from stringiness |
| JPS61162149A (en) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Osamu Uchi | Preparation of processed natto food |
| JPH04141061A (en) * | 1990-10-02 | 1992-05-14 | Kikkoman Corp | Agent for lowering threading property of fermented soybean and production of fermented soybean free from threading property using the same agent |
| JPH04166055A (en) * | 1990-10-29 | 1992-06-11 | Kikkoman Corp | Production of fermented soybean |
| JP2003235566A (en) * | 2002-02-08 | 2003-08-26 | Ajinomoto Co Inc | POLY-gamma-GLUTAMIC ACID DEGRADATION ENZYME GENE AND METHOD FOR PRODUCING POLY-gamma-GLUTAMIC ACID |
-
2004
- 2004-03-18 JP JP2004078137A patent/JP2005211068A/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6019466A (en) * | 1983-07-13 | 1985-01-31 | Agumin:Kk | Natto (fermented soybean) or mucous product of bacillus natto free from stringiness |
| JPS61162149A (en) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Osamu Uchi | Preparation of processed natto food |
| JPH04141061A (en) * | 1990-10-02 | 1992-05-14 | Kikkoman Corp | Agent for lowering threading property of fermented soybean and production of fermented soybean free from threading property using the same agent |
| JPH04166055A (en) * | 1990-10-29 | 1992-06-11 | Kikkoman Corp | Production of fermented soybean |
| JP2003235566A (en) * | 2002-02-08 | 2003-08-26 | Ajinomoto Co Inc | POLY-gamma-GLUTAMIC ACID DEGRADATION ENZYME GENE AND METHOD FOR PRODUCING POLY-gamma-GLUTAMIC ACID |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007143467A (en) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Mitsukan Group Honsha:Kk | Glutamine synthase gene, bacillus natto enhanced in expression of the gene, and natto of reduced ammonia content which is produced using the bacillus natto |
| JP2014023449A (en) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | Unitika Ltd | Production method of sulfur-containing cysteine compound |
| WO2015163120A1 (en) * | 2014-04-24 | 2015-10-29 | 茨城県 | Reduced-stringiness bacillus subtilis natto strain, method for producing natto using said bacillus subtilis natto strain, and natto |
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