JP2005200377A - New tripeptide and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なトリペプチドおよびその製造方法に関する。より具体的にいえば、本発明は一分子のβ−アラニンと、二分子のオルニチンからなるトリペプチドに関し、またそのトリペプチドをシジミエキスより製造する方法に関する。 The present invention relates to a novel tripeptide and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a tripeptide composed of one molecule of β-alanine and two molecules of ornithine, and also relates to a method for producing the tripeptide from a shijimi extract.
本発明者等は、従来より、シジミの有効成分に関する研究を続けてきている。
シジミは、古来より滋養強壮食品等として国民に利用されてきた。近年その有効成分についての研究が進展して、その成分の解明も進んでいる。シジミには特にビタミンB12等の各種ビタミン類をはじめ、重要な生理活性を示す有用成分、例えば、脂質代謝改善作用をもつα、β−不飽和脂肪酸、尿素サイクルを活性化させ、肝機能を改善する作用や成長ホルモン分泌促進作用によるダイエット作用を有するオルニチン等のアミノ酸が含まれている。その他、シジミに含まれるメチオニン、シスチン等のアミノ酸も肝機能亢進作用を示すとする報告もある。
これら等シジミエキス中の有用成分の中でも特に注目されているのが、オルニチンである。シジミは古くからいわゆる二日酔いに効く、あるいはその症状を軽減するものとして知られているが、その作用には、オルニチンの前記生理活性作用が関与していると考えられる。本発明者も、この有用なオルニチンのシジミ生体内での合成作用を助長、促進させてその生体内含有量を増大化させる方法についてすでに提案している(特許文献1、2)。
Shijimi has been used by the public since ancient times as a nourishing tonic food. In recent years, research on the active ingredients has progressed, and the elucidation of the ingredients has also progressed. Corbicula in particular including various vitamins such as vitamin B 12 is useful components indicating the important physiological activities, for example, alpha with lipid metabolism improving action, beta-unsaturated fatty acids, activate the urea cycle, liver function It contains amino acids such as ornithine that have a dieting action by improving action and growth hormone secretion promoting action. In addition, there is a report that amino acids such as methionine and cystine contained in swordfish also show liver function enhancing action.
Among the useful components in these similar extracts, ornithine is attracting particular attention. Shijimi has long been known to be effective for so-called hangovers or to reduce the symptoms thereof, and it is considered that the physiologically active action of ornithine is involved in the action. The present inventor has also already proposed a method for increasing the in vivo content by promoting and promoting the useful action of ornithine in the living body (
しかしながら、シジミ中には未だ未知の有用な物質が存在していると思われ、その物質の解明が待たれている。
本発明は、こうした状況の下で、新規な有用物質である特定のトリペプチドおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。
However, it seems that there are still unknown useful substances in Shijimi, and the elucidation of these substances is awaited.
Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a specific tripeptide which is a novel useful substance and a method for producing the same.
本発明者等は、シジミエキス中の有用成分の研究を進めた結果、β−アラニンとオルニチンが前述のとおりシジミエキス中に含まれていることはよく知られているが、これらのアミノ酸が遊離のアミノ酸形態とは別に、ペプチドの形態でも存在していることを究明した。そして、さらに研究を進めた結果、このペプチドが前記二つのアミノ酸が特定の結合構造にてペプチドを形成する新規なトリペプチドであることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
(1) N末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチド、
(2) シジミエキスを水で希釈し、分画することを特徴とするN末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法、
(3) α−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン及びβ−アミノ基を保護したβ−アラニンを用いて化学的に合成することを特徴とするN−末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを製造する方法、
に関する。
As a result of advancing research on useful components in shijimi extract, the present inventors are well known that β-alanine and ornithine are contained in shijimi extract as described above, but these amino acids are free. In addition to the amino acid form, it was also found that the peptide form exists. As a result of further research, it was found that this peptide is a novel tripeptide in which the two amino acids form a peptide with a specific binding structure, and the present invention has been achieved.
That is, the present invention
(1) A tripeptide in which β-alanine, ornithine, ornithine are peptide-bonded in this order from the N-terminus,
(2) A method for producing a tripeptide having peptide bonds in the order of β-alanine, ornithine, ornithine from the N-terminus, wherein the swordfish extract is diluted with water and fractionated,
(3) β-alanine, ornithine from the N-terminus, which is chemically synthesized using ornithine in which α-amino group and δ-amino group are protected and β-alanine in which β-amino group is protected, A method for producing a tripeptide having peptide bonds in the order of ornithine,
About.
本発明に係る一分子のβ−アラニンと二分子のオルニチンから構成されるトリペプチドは新規なペプチドである。そして、このペプチドは、食品であるシジミエキスから容易に製造することができ、安全性が高く、またその構成アミノ酸から少なくともオルニチンが示す生理活性作用類似の作用を期待することができる。さらに少なくともその構成アミノ酸の製造原料として有用である。 The tripeptide composed of one molecule of β-alanine and two molecules of ornithine according to the present invention is a novel peptide. This peptide can be easily produced from a swordfish extract as a food, has high safety, and can be expected to have at least a physiologically active action similar to that exhibited by ornithine from its constituent amino acids. Furthermore, it is useful as a raw material for producing at least its constituent amino acids.
本発明の新規トリペプチドは、一分子のβ−アラニンと二分子のオルニチンとから構成され、その構造は、N末端からβ−アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合した下記式で表されるトリペプチドである。
本発明のトリペプチドは、シジミエキスの濃縮物あるいはその乾燥粉末を水に希釈してゲルろ過法あるいはイオン交換法などのクロマトグラフィーにより分画(精製)して製造することができる。
すなわち、シジミエキスを水で固形分に対して20〜50倍程度に希釈してゲルろ過法、イオン交換法を用いて分画することができる。しかし、シジミエキスは、シジミの種類や季節によりその成分組成は変動するが、概ね約50%のグリコーゲンを主成分とする糖質、約35%のタンパク質、約10%の灰分、及び約5%の水からなり、その中で本発明のトリペプチドは分子量が317と低分子で、かつそのシジミエキス固形分中の含有量は少量であるから、まず、前処理として、分画分子量1,000から10,000程度の膜を用いて限外ろ過や透析を行うことにより、高分子量の糖質やタンパク質を除去し、次いで得られた低分子画分をゲルろ過法あるいはイオン交換法などによりさらに分画することにより目的のトリペプチドを得ることが好ましい。
The tripeptide of the present invention can be produced by diluting a concentrate of a rainbow trout extract or a dried powder thereof in water and fractionating (purifying) it by chromatography such as gel filtration or ion exchange.
That is, the swordfish extract can be diluted with water to about 20 to 50 times the solid content and fractionated by gel filtration or ion exchange. However, although the composition of the shijimi extract varies depending on the kind and season of shijimi, it is roughly about 50% glycogen-based carbohydrate, about 35% protein, about 10% ash, and about 5%. Among them, the tripeptide of the present invention has a low molecular weight of 317, and its content in the solid content of the swordfish extract is small. The high molecular weight carbohydrates and proteins are removed by performing ultrafiltration and dialysis using a membrane of about 10,000 to 10,000, and the resulting low molecular fraction is further purified by gel filtration or ion exchange. It is preferable to obtain the target tripeptide by fractionation.
本発明のトリペプチドは、上述のように、シジミエキスから分画することによって製造することができるが、他のペプチドと同様に化学的に合成することもできる。
操作のし易さから、各社から市販されているペプチドシンセサイザーを用いて固相法により合成することが好ましい。すなわち、使用する装置のプログラムに従ってC末端より逐次Fmoc法によりペプチド鎖を延長する。固相法ペプチド合成用支持体である担体を使用し、副反応を防止するために、あらかじめFmocおよびBocによりα−アミノ基とδ−アミノ基を保護したオルニチン[Fmoc−0rn(Boc)]とFmocによりβ−アミノ基を保護したβ−アラニン[Fmoc−β−Ala]のFmocアミノ誘導体を用いる。Fmoc−Orn(Boc)を担体に結合させ、ピペリジンなどを用いてα−アミノ基を脱保護後、Fmoc−Orn(Boc)のC末端をカップリング剤を用いてカップリングさせ、再びピペリジンなどで二つ目のオルニチンのα−アミノ基を脱保護し、Fmoc−β−AlaのC末端を同様にカップリングさせる。最後にトリフルオロ酢酸などの酸を用いて全ての脱保護と担体除去を行い、0.1%トリフルオロ酢酸水を用いて抽出したものを凍結乾燥することで本発明のトリペプチドを製造することができ、必要に応じて逆相高速液体クロマトグラフィーなどで精製する。
As described above, the tripeptide of the present invention can be produced by fractionation from a shijimi extract, but can also be chemically synthesized in the same manner as other peptides.
From the viewpoint of ease of operation, it is preferable to synthesize by a solid phase method using a peptide synthesizer commercially available from each company. That is, the peptide chain is sequentially extended from the C-terminal by the Fmoc method according to the program of the apparatus to be used. Ornithine [Fmoc-0rn (Boc)] in which the α-amino group and the δ-amino group were previously protected with Fmoc and Boc in order to use the carrier as a support for solid phase peptide synthesis and prevent side reactions. An Fmoc amino derivative of β-alanine [Fmoc-β-Ala] in which the β-amino group is protected with Fmoc is used. Fmoc-Orn (Boc) is bound to the carrier, the α-amino group is deprotected using piperidine or the like, and then the C-terminus of Fmoc-Orn (Boc) is coupled using a coupling agent, and again with piperidine or the like. The α-amino group of the second ornithine is deprotected and the C-terminus of Fmoc-β-Ala is coupled in the same manner. Finally, all the deprotection and carrier removal are carried out using an acid such as trifluoroacetic acid, and the tripeptide of the present invention is produced by lyophilizing the one extracted with 0.1% aqueous trifluoroacetic acid. It can be purified by reverse-phase high performance liquid chromatography if necessary.
本発明の前記トリペプチドは、β−アラニンとオルニチンとから構成されるものである。したがって、本発明のトリペプチドには、これらのアミノ酸を含むペプチドと類似の生理機能を期待することができる。
例えば、β−アラニンを含有するペプチドとして、カルノシン(β−アラニン−ヒスチジン)およびアンセリン(β−アラニン−メチルヒスチジン)が知られている。これらは多くの脊椎動物の骨格筋組織に含まれる主要なペプチドであり、強力な細胞内pH緩衝、抗酸化作用、酵素の活性化、および神経伝達物質としての生理機能が知られている。本発明のトリペプチドは、分子中にアミノ基が3つあり、極めて特徴的であることから、カルノシンやアンセリン同様、生理機能を発現するに十分な構造を有していると考えられる。
また、オルニチンは前述のとおりの生理機能を有するものであり、本発明のトリペプチドも同様な肝機能亢進作用を期待することができる。
The tripeptide of the present invention is composed of β-alanine and ornithine. Therefore, the tripeptide of the present invention can be expected to have physiological functions similar to those of peptides containing these amino acids.
For example, carnosine (β-alanine-histidine) and anserine (β-alanine-methylhistidine) are known as peptides containing β-alanine. These are the main peptides contained in many vertebrate skeletal muscle tissues, and are known to have strong intracellular pH buffering, antioxidant activity, enzyme activation, and physiological functions as neurotransmitters. Since the tripeptide of the present invention has three amino groups in the molecule and is extremely characteristic, it is considered that the tripeptide has a structure sufficient to express physiological functions like carnosine and anserine.
In addition, ornithine has the physiological function as described above, and the tripeptide of the present invention can be expected to have a similar liver function enhancing action.
実施例
以下に本発明を実施例により、具体的に説明する。
(1)シジミエキスの遊離アミノ酸組成および加水分解物のアミノ酸組成の解明
シジミエキスの加水分解は、タンパク質の構成アミノ酸の測定に一般的に用いられている方法に従い、シジミエキス粉末1mgを試験管にとり、20%塩酸を1ml加え、減圧封管後110℃で20時間加水分解した。その後減圧乾固し、全自動アミノ酸分析装置(日本電子、JLC−500/V)を用いて、遊離アミノ酸の分析条件でオルニチンを含む各種アミノ酸含量を測定した。シジミエキスの遊離アミノ酸組成及び加水分解物のアミノ酸組成の結果を表1に示した。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
(1) Elucidation of free amino acid composition of shijimi extract and amino acid composition of hydrolyzate Shijimi extract is hydrolyzed according to a method generally used for measurement of protein constituent amino acids. 1 ml of 20% hydrochloric acid was added, and the mixture was hydrolyzed at 110 ° C. for 20 hours after sealed under reduced pressure. Thereafter, the mixture was dried under reduced pressure, and various amino acid contents including ornithine were measured under free amino acid analysis conditions using a fully automatic amino acid analyzer (JEOL, JLC-500 / V). The results of the free amino acid composition of the shijimi extract and the amino acid composition of the hydrolyzate are shown in Table 1.
オルニチン含量は、加水分解前、すなわち、遊離の状態では5.9(nmol/mg)、加水分解物では66.4(nmol/mg)であった。加水分解物(B)の値から遊離アミノ酸(A)の値を減じた(B)−(A)値はタンパク質あるいはペプチドを構成するアミノ酸量と考えられる。したがって、遊離ではなくタンパク質あるいはペプチドを構成するオルニチンがエキス中に60.5(nmol/mg)存在することが明らかになった。
表1に示したオルニチンとβ−アラニンを除くアミノ酸は、タンパク質を構成するアミノ酸であることから、加水分解によりエキスに含まれるタンパク質が分解されてアミノ酸となり、加水分解物のアミノ酸含量が増えるのは当然のことである。
しかしながら、一般にオルニチンとβ−アラニンはタンパク質を構成するアミノ酸ではないことから、これらがどのような構造の化合物か大変興味が持たれた。
The ornithine content was 5.9 (nmol / mg) before hydrolysis, that is, in the free state, and 66.4 (nmol / mg) in the hydrolyzate. The value (B)-(A) obtained by subtracting the value of the free amino acid (A) from the value of the hydrolyzate (B) is considered to be the amount of amino acids constituting the protein or peptide. Therefore, it was revealed that ornithine that is not free but constitutes a protein or peptide is present in the extract at 60.5 (nmol / mg).
The amino acids other than ornithine and β-alanine shown in Table 1 are amino acids that constitute the protein, so that the protein contained in the extract is decomposed into hydrolyzed amino acids by hydrolysis, and the amino acid content of the hydrolyzate increases. Of course.
However, in general, ornithine and β-alanine are not amino acids that constitute proteins, so it was very interesting to see what structure they are.
(2)シジミエキス中に含まれるオルニチン含有物質の構造解明
そこで、本発明者らは、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質の分子量に関する知見を得るために、シジミエキスの限外ろ過膜を用いた分画を試みた。シジミエキス溶液を分画分子量10,000の透析膜(PIERCE社製、Slide−A−Lyzer)を用いて水に対して十分透析し、透析内液は分子量10,000以上の高分子画分、透析外液は分子量10,000以下の低分子画分として回収し、それぞれ減圧濃縮後、凍結乾燥により粉末化した。
(2) Structure elucidation of ornithine-containing substance contained in shijimi extract Therefore, in order to obtain knowledge about the molecular weight of the ornithine-containing substance contained in shijimi extract, the present inventors used an ultrafiltration membrane of shijimi extract. Tried fractionation. The shijimi extract solution was sufficiently dialyzed against water using a dialysis membrane having a fractional molecular weight of 10,000 (manufactured by PIERCE, Slide-A-Lyzer), and the dialysis internal solution was a polymer fraction having a molecular weight of 10,000 or more, The dialyzed external solution was recovered as a low molecular fraction having a molecular weight of 10,000 or less, concentrated under reduced pressure, and then powdered by lyophilization.
これらの画分について、前述と同様に加水分解前後におけるアミノ酸組成を比較し、オルニチン含有物質がどちらの画分に分画されているかを検討した。その結果、オルニチン含有物質は、分子量10,000以下の低分子画分に分画されていることが分かった。さらに、分画分子量3,500の透析膜(PIERCE社製、Slide−A−Lyzer)を用いて同様に調べた結果、オルニチン含有物質は透析外液画分、すなわち分子量3,500以下の低分子画分に分画されることが分かった。このことから、オルニチン含有物質は分子量3,500以下のペプチドと考えられた。 About these fractions, the amino acid composition before and after hydrolysis was compared in the same manner as described above, and it was examined in which fraction the ornithine-containing substance was fractionated. As a result, it was found that the ornithine-containing substance was fractionated into a low molecular fraction having a molecular weight of 10,000 or less. Furthermore, as a result of examining in the same manner using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 3,500 (manufactured by PIERCE, Slide-A-Lyzer), the ornithine-containing substance was a fraction of the outer dialysate, that is, a low molecular weight having a molecular weight of 3,500 or less. It was found that it was fractionated into fractions. From this, the ornithine-containing substance was considered to be a peptide having a molecular weight of 3,500 or less.
次に、ペプチドの研究によく用いられているSep−Pac tC18(Waters社製)及び「Develosil RPAQUEOUS(野村化学社製)などの逆相カラムを用いて、移動相を0.1%トリフルオロ酢酸とアセトニトリルによる濃度勾配により、オルニチン含有物質の精製を試みたが、オルニチン含有物質は非吸着画分に溶出され、精製できなかった。そこで、上記により調製した分子量3,500以下の低分子画分を試料として塩及び遊離アミノ酸を除去後、HPLCを用いたゲルろ過による精製を試みた。 Next, using a reverse phase column such as Sep-Pac tC18 (manufactured by Waters) and “Develosil RPAQUEOUS (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.), which is often used for peptide research, the mobile phase was 0.1% trifluoroacetic acid. Attempts were made to purify the ornithine-containing substance using a concentration gradient of nitrite and acetonitrile, but the ornithine-containing substance was eluted in the non-adsorbed fraction and could not be purified. After removing salts and free amino acids from the sample, purification by gel filtration using HPLC was attempted.
HPLCの条件は、カラムはSuperdex Peptide HR 10/30(Amersham Pharmacia Biotech社製)、移動相は250mM Naclを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.2)、流速は0.25ml/minとし、検出は205nmでの吸光度を測定した。
そして、フラクションコレクタを用いて500μlずつ分取した。
各フラクションから20μlを試験管に取り凍結乾燥後、20%塩酸を1ml加え、減圧封管後110℃で20時間加水分解した。その後減圧乾固し、全自動アミノ酸分析装置(日本電子、JLC−500/V)を用いて、遊離アミノ酸の分析条件でオルニチンを含む各種アミノ酸含量を測定した。
The HPLC conditions were
And 500 microliters was fractionated using the fraction collector.
20 μl from each fraction was placed in a test tube, freeze-dried, 1 ml of 20% hydrochloric acid was added, and the tube was sealed under reduced pressure and hydrolyzed at 110 ° C. for 20 hours. Thereafter, the mixture was dried under reduced pressure, and various amino acid contents including ornithine were measured under free amino acid analysis conditions using a fully automatic amino acid analyzer (JEOL, JLC-500 / V).
図1には、HPLCにより得られた205nmの吸光度と分取した各フラクションの加水分解後のオルニチン含量を示した。その結果、フラクションナンバー30から36にオルニチンが対称なピークとして検出され、単一化合物であると考えられた。
オルニチン含有物質のリテンションボリウムは17mlで あったが、ゲルろ過においては、分子量の分かっている標品のリテンションボリウムとの比較から、目的物質の分子量を推定することが可能である。そこで、今回使用したゲルろ過カラムにおける標品の溶出位置(表2)からオルニチン含有物質の分子量を推定したところ、約300であることが分かった(図2)。
FIG. 1 shows the absorbance at 205 nm obtained by HPLC and the ornithine content after hydrolysis of each fraction. As a result, ornithine was detected as a symmetrical peak in
The retention volume of the ornithine-containing substance was 17 ml, but in gel filtration, it is possible to estimate the molecular weight of the target substance from comparison with the retention volume of a standard preparation whose molecular weight is known. Thus, when the molecular weight of the ornithine-containing substance was estimated from the elution position (Table 2) of the sample in the gel filtration column used this time, it was found to be about 300 (FIG. 2).
また、フラクションナンバー30から36の加水分解物のアミノ酸分析からはβ−アラニンとオルニチンのみが検出され、その比は1対2であった。β−アラニンの分子量は89、オルニチンの分子量は132であることから、β−アラニン1分子とオルニチン2分子がペプチド結合した化合物の分子量は317となり、ゲルろ過から推定された分子量とほぼ一致した。すなわち、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質は、β−アラニン1分子とオルニチン2分子がペプチド結合した化合物と考えられた。以下、シジミエキスに含まれるオルニチン含有物質をオルニチン含有化合物という。
In addition, only β-alanine and ornithine were detected from the amino acid analysis of the hydrolyzate of
(3)シジミエキス中に含まれるオルニチン含有化合物の構造解明
次に、HPLCにより得られたフラクションナンバー30〜36を回収し、脱塩後、重水置換し1H−NMRを測定した。その結果、炭素に結合した全てのプロトンが帰属された。4.15ppm及び4.00ppm付近のシグナルはオルニチン2分子のアルファ炭素に結合したプロトン1個分ずつの2個分、2.56及び3.07ppm付近のシグナルはβ−アラニンのアルファ及びベータ炭素に結合したプロトン2個分ずつの4個分、2.83ppm付近のシグナルはオルニチン2分子のデルタ炭素に結合したプロトン2個分ずつの4個分、1.5ppmから1,7ppm付近のシグナルは、オルニチン2分子のベータ及びガンマ炭素に結合したプロトン4個分ずつの8個分に由来し、炭素に結合した18個全てのプロトンが帰属され、β−アラニン1分子とオルニチン2分子がペプチド結合していることが確認された(図3)。
(3) Structure elucidation of ornithine-containing compound contained in shijimi extract Next,
以上の結果から、オルニチン含有化合物の構造は、N−末端からβ−アラニン−オルニチン−オルニチン、オルニチン−β−アラニン−オルニチン、オルニチン−オルニチン−β−アラニンの3通りが考えれる。そこで、C−末端を決定するために、ヒドラジン分解を試みた。ペプチドを無水ヒドラジンと反応させるとペプチド結合が切断されて、C−末端アミン酸を除く全てのアミノ酸はアミノ酸ヒドラジドになる。そこで、オルニチン含有化合物を無水ヒドラジンと100℃で2時間反応させた後、アミノ酸分析装置に供した。その結果、オルニチンが検出され、β−アラニンは検出されなかった。このことから、C−末端アミノ酸はオルニチンであり、オルニチン含有化合物の構造は、N−末端からβ−アラニン−オルニチン−オルニチンか、オルニチン−β−アラニン−オルニチンのどちらかである。 From the above results, there are three possible structures of ornithine-containing compounds from the N-terminus: β-alanine-ornithine-ornithine, ornithine-β-alanine-ornithine, ornithine-ornithine-β-alanine. Therefore, hydrazine degradation was attempted to determine the C-terminus. When the peptide is reacted with anhydrous hydrazine, the peptide bond is cleaved and all amino acids except the C-terminal amine acid become amino acid hydrazide. Therefore, the ornithine-containing compound was reacted with anhydrous hydrazine at 100 ° C. for 2 hours, and then subjected to an amino acid analyzer. As a result, ornithine was detected and β-alanine was not detected. From this, the C-terminal amino acid is ornithine, and the structure of the ornithine-containing compound is either β-alanine-ornithine-ornithine or ornithine-β-alanine-ornithine from the N-terminus.
次に本発明者らは、加水分解により遊離されてくるβ−アラニン及びオルニチンの経時変化を測定した。すなわち、凍結乾燥したオルニチン含有化合物約50μgに20%塩酸500μl加え、減圧封管後、110℃で0,1,2,4,8,20時間加水分解し、アミノ酸分析装置を用いて遊離されてくるβ−アラニン及びオルニチンを測定した。その結果、β−アラニンは加水分解処理1時間後にはほとんど全てが遊離されており、一方オルニチンは20時間後まで徐々に加水分解が進んでいくことが分かった(図4)。このことは、オルニチン−β−アラニン−オルニチンの構造では起こり得ず、β−アラニンが末端にあることが必須である。すなわち、N−末端は、β−アラニンであり、オルニチン含有化合物の構造は、下記に示す構造を有するβ−アラニン−オルニチン−オルニチンであると決定した。 Next, the present inventors measured changes with time of β-alanine and ornithine released by hydrolysis. That is, about 50 μg of ornithine-containing compound that has been lyophilized is added with 500 μl of 20% hydrochloric acid, sealed in a vacuum, hydrolyzed at 110 ° C. for 0, 1, 2, 4, 8, 20 hours, and released using an amino acid analyzer. Crude β-alanine and ornithine were measured. As a result, it was found that β-alanine was almost completely released after 1 hour of hydrolysis treatment, while ornithine gradually hydrolyzed until 20 hours later (FIG. 4). This cannot occur in the structure of ornithine-β-alanine-ornithine, and it is essential that β-alanine is at the end. That is, the N-terminal was β-alanine, and the structure of the ornithine-containing compound was determined to be β-alanine-ornithine-ornithine having the structure shown below.
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