JP2005198546A - Vector incorporated with reporter gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子治療等における外来性遺伝子の生体内における発現を非侵襲的にモニタリングするためのレポーター遺伝子を組み込んだベクターに関する。 The present invention relates to a vector incorporating a reporter gene for noninvasive monitoring of the expression of an exogenous gene in vivo in gene therapy or the like.
遺伝子治療のように外来遺伝子をヒトの生体内で発現させる場合において、また基礎研究において動物の生体内で外来遺伝子を発現する場合についても、目的遺伝子の発現を非侵襲的に体外から検出し、遺伝子発現の時間的、空間的変化をモニタリングすることは重要である。従来のルシフェラーゼ（luciferase）やGFP(Green Fluorescent Protein)などのレポータージーンを用いるシステムでは小動物や体表部での遺伝子発現のモニタリングは可能である（非特許文献１および２）が、中、大動物の体深部での遺伝子発現のモニタリングは検出感度、定量性が不十分となるため難しく、安全性、定量性に優れて、人体にも適用可能な遺伝子発現のモニタリングシステムの開発が望まれている。
PET（Positron Emission Tomography）やSPECT(Single Photon Emission Computed Tomography)などの手法は、体内深部での遺伝子発現を検出しようとする場合、ルシフェラーゼやGFPに比べ大変有利である。特にPETは検出感度、定量性に優れ、生体内での遺伝子発現を検出するに望ましい手法である。 Methods such as PET (Positron Emission Tomography) and SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) are very advantageous compared to luciferase and GFP when trying to detect gene expression deep in the body. In particular, PET is excellent in detection sensitivity and quantification and is a desirable technique for detecting gene expression in vivo.
生体内で用いるレポーターに望まれる性質としては、毒性がないこと、またその発現が細胞や個体に強い生理作用をあたえないこと、抗原性がないまたは非常に低いこと、内因性の発現が見られる場合はその発現部位が限定され、かつレポーターの発現を検出しようとする領域と重ならないこと、などがあげられる。さらに発現効率がよく、翻訳後の修飾やフォールディングに問題がおこりにくく、かつ遺伝子の取扱いが容易な分子量の小さな蛋白の方が好ましい。 Properties desired for in vivo reporters include non-toxicity, lack of strong physiological effects on cells and individuals, lack of antigenicity or very low, and endogenous expression. In some cases, the expression site is limited and it does not overlap with the region where reporter expression is to be detected. Furthermore, a protein having a small molecular weight is preferable because it has high expression efficiency, is less likely to cause problems in post-translational modification and folding, and can easily handle genes.
PETを用いてレポータージーンの発現を検出しようとするとき、そのトレーサー（検出用薬剤）に必要とされる性質としては、生体に悪影響をおよぼさないこと、全身またはレポータージーンの発現を検出したい部位に分布することなどが求められる。特に脳内での発現を検出したい場合には、トレーサーが脳血液関門を透過することが重要な要件となる。 When trying to detect the expression of a reporter gene using PET, the necessary properties of its tracer (detection drug) are that it does not adversely affect the living body, and the system or the site where the expression of the reporter gene is to be detected. Distribution is required. In particular, when it is desired to detect expression in the brain, it is an important requirement that the tracer penetrates the brain blood barrier.
このような観点から本発明者らはレポータージーンとそれを検出するPETトレーサーの組み合わせとして、野生型または変異型エストロゲンレセプターのリガンド結合領域をレポーターとして、エストロゲンレセプターリガンド結合領域と親和性を持つF-18で標識したエストロゲンやエストロゲンアゴニストまたはアンタゴニストをトレーサーとして、生体内での目的遺伝子の発現を体外より非侵襲的にモニタリングするシステムを開発し、野生型または変異型エストロゲンレセプターのリガンド結合領域を治療遺伝子と同時に発現するベクターの作製に成功した。 From this point of view, the present inventors have used a reporter gene and a PET tracer for detecting it as a reporter, using a ligand binding region of a wild type or mutant estrogen receptor as a reporter, and F-18 having an affinity for the estrogen receptor ligand binding region. Developed a system to monitor the expression of target genes in vivo non-invasively using estrogen labeled with estrogen, estrogen agonist or antagonist as a tracer, and the ligand binding region of wild type or mutant estrogen receptor as therapeutic gene We have succeeded in creating a vector that can be expressed simultaneously.
常発現型ベクターのプロモーター／エンハンサーとしてはヒトや動物の体内で効率良く治療遺伝子およびレポーター遺伝子を発現できるよう、哺乳類の広汎な細胞で高い活性を持つことが知られるプロモーター、例えば、アクチンプロモーター、サイトメガロウィルス(CMV)プロモーター、EF-1αプロモーター、ラウス肉腫ウィルス(RSV)プロモーター、シミアンウィルス(SV40)の初期若しくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウィルス(MMTV)プロモーターなどの常発現系プロモーターを利用することができる。遺伝子治療や基礎研究において、量的、時間的に遺伝子の発現量をコントロールすることでより質の高い結果が期待される場合には、薬剤の投与によって遺伝子の発現量をコントロールすることができるGAL4-UAS、Tetオペレーター、エクジソン応答要素を含むプロモーター等の誘導型遺伝子発現プロモーターを用いることもできる。誘導型遺伝子発現プロモーター、プロモーターに結合して転写活性を上昇させる調節タンパク質、誘導を誘起する薬剤からなる遺伝子発現調節システムはすでに数種類が市販されており、容易に利用することができる。 As a promoter / enhancer of a normal expression vector, a promoter known to have high activity in a wide range of mammalian cells so that a therapeutic gene and a reporter gene can be efficiently expressed in humans and animals, such as an actin promoter, a site It is possible to use normal expression promoters such as megalovirus (CMV) promoter, EF-1α promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, simian virus (SV40) early or late promoter, mouse papilloma virus (MMTV) promoter, etc. it can. In gene therapy and basic research, if higher quality results are expected by controlling the gene expression level quantitatively and temporally, GAL4 can control the gene expression level by administering a drug. -Inducible gene expression promoters such as UAS, Tet operators, promoters containing ecdysone response elements can also be used. Several gene expression regulation systems comprising an inducible gene expression promoter, a regulatory protein that binds to the promoter to increase transcription activity, and a drug that induces induction are already commercially available and can be easily used.
合成ノルステロイドのミフェプリストンを使用したシステム（インビトロゲン社）はミフェプリストンがすでに海外では臨床薬として用いられるなど人体への適用に実績があること、ミフェプリストンが脳内を含め広範囲の組織に分布すること、調節タンパク質の大部分が哺乳類のタンパクで構成され、抗原性が低いと期待されることなどから、本願の実施例においてもこのシステムをもちいたベクターを作製したが、他のシステムの利用も可能である。また、特定の組織でのみ治療遺伝子を発現させたい場合には、特定の組織でのみ活性を示す組織特異的プロモーターを使用することも可能である。 The system using the synthetic norsteroid mifepristone (Invitrogen) has been proven to be applied to the human body, such as that mifepristone has already been used as a clinical drug overseas. In the examples of the present application, a vector using this system was prepared because it is distributed in tissues, and most of the regulatory proteins are composed of mammalian proteins and expected to have low antigenicity. The system can also be used. In addition, when it is desired to express a therapeutic gene only in a specific tissue, it is also possible to use a tissue-specific promoter that shows activity only in the specific tissue.
ヒトやマウスのエストロゲンレセプターは哺乳類のタンパク質であり、ヒトにとっては抗原性が低く、生体内で用いるレポータージーンとして好ましい。また、リガンド結合領域のみを使用することにより、レセプターが本来持つ転写活性化因子としての機能は失われ、リガンドと結合しても下流遺伝子の転写活性化などの生理作用は示さない。また内在性のエストロゲンレセプターが高濃度に発現するのは子宮、乳腺など特定の組織に限られているため、内在性タンパクによりレポータージーンの検出が困難となる状況はごく限られた場合にのみである。 Human and mouse estrogen receptors are mammalian proteins and have low antigenicity for humans and are preferred as reporter genes for use in vivo. Further, by using only the ligand binding region, the function as a transcription activator inherent in the receptor is lost, and even when bound to the ligand, physiological functions such as transcriptional activation of downstream genes are not exhibited. Endogenous estrogen receptors are expressed at high concentrations only in certain tissues such as the uterus and mammary gland, so the endogenous protein is difficult to detect for the reporter gene only in very limited circumstances. .
リガンド結合領域内（525番目のアミノ酸）にGlyからArgへのLアミノ酸変異を持つマウスの変異型エストロゲンレセプター(MER)はリガンド結合特異性が変化し、天然のエストロゲンとの結合能を失っているが、合成ステロイドであり、部分アゴニスト（partial agonist）として作用するタモキシフェン（tamoxifen）との結合能を持つ。このため、この変異型エストロゲンレセプター（Ｍｅｒ）は内在性のエストロゲンのレベルに影響されることなく、投与されたタモキシフェンを結合する。 Mutant estrogen receptor (MER) in mice with L amino acid mutation from Gly to Arg within the ligand binding region (525th amino acid) has altered ligand binding specificity and has lost its ability to bind natural estrogen. Is a synthetic steroid and has the ability to bind tamoxifen, which acts as a partial agonist. Thus, this mutant estrogen receptor (Mer) binds administered tamoxifen without being affected by endogenous estrogen levels.
野生型のエストロゲンレセプターリガンド結合領域をレポータージーンとして利用する場合は、F-18標識エストラジオールやF-18標識タモキシフェンなどが、また変異型エストロゲンレセプターリガンド結合領域ではF-18標識タモキシフェンなどをトレーサーとして、PETを用いて体外から非侵襲的にレポータージーンの発現を検出することができる。F-18標識エストラジオールやF-18標識タモキシフェンをはじめとする放射性標識合成ステロイドは、ステロイドの高い脂溶性を反映して脳血液関門の透過性が高いため脳内へも十分に到達し、ほぼ全身に分布すると期待される。F-18標識エストラジオールやF-18標識タモキシフェンは乳癌の診断やタモキシフェンを用いる治療に対する乳癌の反応性を予測するなどの目的で、PETによる体内診断放射性医薬品としてすでにヒトに投与されている実績を持ち、安全性が確認されているうえ、体内動態などの情報も豊富に存在する。 When using wild-type estrogen receptor ligand binding region as a reporter gene, PET is used as tracer such as F-18-labeled estradiol or F-18-labeled tamoxifen in the mutant-type estrogen receptor ligand binding region. Can be used to detect reporter gene expression non-invasively from outside the body. Radiolabeled synthetic steroids such as F-18-labeled estradiol and F-18-labeled tamoxifen reflect the high lipid solubility of steroids, so they reach the brain sufficiently because of the high permeability of the brain blood barrier. It is expected to be distributed. F-18-labeled estradiol and F-18-labeled tamoxifen have already been administered to humans as in-vivo diagnostic radiopharmaceuticals using PET for the purpose of diagnosing breast cancer and predicting breast cancer responsiveness to treatment with tamoxifen. In addition, safety has been confirmed, and there is a wealth of information on pharmacokinetics.
遺伝子治療などにおいて治療遺伝子の発現をレポータージーンを用いて検出する場合、治療遺伝子とレポータージーンを同時に発現することになる。この時、二つの遺伝子を融合蛋白（fusion protein）として発現させるか、独立して発現させるかの選択枝がある。融合蛋白として発現させた場合、二つの蛋白に由来する部分は一つの蛋白として全く同じ挙動を示すため、レポータージーンはより正確に治療遺伝子の発現の情報を伝えることができるが、両者の機能を十分に保持させるためには個々の遺伝子について個別に接続の条件を検討することが必要となる。IRESを用いて二つの遺伝子を同時に発現させようとする場合、両者は一つのmRNAに転写された後、二つの蛋白に翻訳される。この方法では両者の発現量はかならずしも同じとはいえないが、組織、細胞種によってほぼ一定の量比で発現する。この場合二つの蛋白は独立して存在するため、融合蛋白をつくる場合と違い、各タンパク質の活性への影響などを考慮する必要がなく、より汎用性の高い方法と考えられる。 When the expression of a therapeutic gene is detected using a reporter gene in gene therapy or the like, the therapeutic gene and the reporter gene are expressed simultaneously. At this time, there is a choice between expressing the two genes as a fusion protein or expressing them independently. When expressed as a fusion protein, the part derived from two proteins behaves exactly the same as a single protein, so the reporter gene can convey the expression information of the therapeutic gene more accurately, but the functions of both are sufficient. Therefore, it is necessary to examine the connection conditions for each gene individually. When two genes are expressed simultaneously using IRES, both genes are transcribed into one mRNA and then translated into two proteins. In this method, the expression levels of both are not necessarily the same, but they are expressed at a substantially constant ratio depending on the tissue and cell type. In this case, since the two proteins exist independently, unlike the case of creating a fusion protein, it is not necessary to consider the influence on the activity of each protein, and it is considered to be a more versatile method.
本研究のベクターは、各社より市販されている、CMVプロモーターや誘導発現型プロモーターなどの動物細胞で機能するプロモーターをもった動物細胞発現用プラスミドやウィルスベクターを基に作製することができる。また、このような市販のベクターのプロモーターを使用目的にあったプロモーターに置き換えることも可能である。治療遺伝子（目的遺伝子、モデル遺伝子）をコードする遺伝子配列、IRESや融合蛋白をつくるためのリンカーペプチド（linker peptide）をコードする配列、レポータージーンとして使用するエストロゲンレセプターリガンド結合領域をコードする遺伝子配列などは市販のプラスミドや他の研究者から供与を受けたプラスミド、市販のcDNAライブラリーなどを鋳型にしたPCR、細胞や組織から抽出したRNAを用いたRT-PCRなどによって、両端に制限酵素の認識配列を付加した形で増幅し、定法のライゲイションによりベクターに組み込むことができる。
作製したプラスミドやウィルスは、プラスミドのばあいは大腸菌を宿主として増幅して十分な量を生産し、また、ウィルスベクターの場合は宿主細胞をもちいて増幅して十分な量を生産したのち、精製して、培養細胞や動物に適用する。
The vectors of this study can be prepared based on animal cell expression plasmids or viral vectors having promoters that function in animal cells such as CMV promoters and inducible expression promoters, which are commercially available from various companies. It is also possible to replace the promoter of such a commercially available vector with a promoter suitable for the purpose of use. Gene sequences that encode therapeutic genes (target genes, model genes), sequences that encode linker peptides for creating IRES and fusion proteins, gene sequences that encode estrogen receptor ligand binding regions used as reporter genes, etc. Restriction enzyme recognition sequences at both ends by commercially available plasmids, plasmids donated by other researchers, PCR using commercially available cDNA libraries, etc., and RT-PCR using RNA extracted from cells and tissues Can be amplified and added to the vector by standard ligation.
In the case of a plasmid, the produced plasmid or virus is amplified using Escherichia coli as a host to produce a sufficient amount. In the case of a viral vector, a host cell is used to amplify and produce a sufficient amount, followed by purification. And applied to cultured cells and animals.
作製したベクターが機能するかは、リポソームやポリマーを用いる培養細胞への一過性トランスフェクションの後、それぞれのタンパク質に対する抗体を用いたイムノ・ブロット法（Immunoblotting）のほか、個別のタンパク質に適した方法により、治療遺伝子（目的遺伝子）とエストロゲンレセプターリガンド結合領域が同時に発現し、また、後者の発現量が前者の発現量の変化に伴っているかを調べることで確認することができる。またエストロゲンレセプターリガンド結合領域を発現する培養細胞が、これを発現しない細胞に比べ、F-18で標識したリガンドをより多く取り込むかを調べることにより、レポータージーンの検出にふさわしいトレーサーを選択することができる。 The prepared vector is functionally suitable for individual proteins in addition to transient transfection into cultured cells using liposomes and polymers, followed by immunoblotting using antibodies against the respective proteins. The method can be confirmed by examining whether the therapeutic gene (target gene) and the estrogen receptor ligand-binding region are simultaneously expressed, and whether the latter expression level is accompanied by a change in the expression level of the former. In addition, by examining whether cultured cells that express the estrogen receptor ligand binding region take in more ligand labeled with F-18 than cells that do not express this, it is possible to select a tracer suitable for detecting the reporter gene. .
生体内への適用に際しては、例えばプラスミドの場合は、プラスミド単独で、またはリポソーム、ポリマーなど細胞への取り込みを促進するための試薬と混合して目的の組織に注射する、または静脈内注射するなどの方法を用いて投与する。ウィルスベクターの場合は、例えば直接目的組織に注射する、または血流を介して目的組織に到達するよう投与する。常発現系を用いたベクターの場合は投与後適当な時間の後、誘導型のベクターを用いた場合は発現誘導のための薬剤を投与して適当な時間をおいた後、エストロゲンレセプターリガンド結合領域の発現を検出するための放射能標識リガンドを静脈内より投与する。 For application in vivo, for example, in the case of a plasmid, the plasmid alone, or mixed with a reagent for promoting uptake into cells such as liposomes and polymers, is injected into a target tissue, or is injected intravenously, etc. The method of administration is used. In the case of a viral vector, for example, it is injected directly into the target tissue or administered so as to reach the target tissue via the bloodstream. In the case of a vector using a normal expression system, after an appropriate time after administration, in the case of using an inducible vector, after a suitable time after administering an agent for inducing expression, the estrogen receptor ligand binding region A radiolabeled ligand for detecting the expression of is administered intravenously.
野生型のエストロゲンレセプターリガンド結合領域を発現するベクターの場合は例えば放射能標識リガンドとして18F-フルオロタモキシフェン（18F-fluoro tamoxifen）や18F-フルオロエストラジオール（18F-fluoroestradiol）を用いることができる。変異型のエストロゲンレセプターリガンド結合領域を発現するベクターの場合は例えば放射能標識リガンドとして18F-フルオロタモキシフェンを用いることができる。静脈内注射などの方法により放射能標識リガンド投与の後、適当な時間をおいてPETなどの装置を用いてエストロゲンレセプターリガンド結合領域の発現を検出し、画像化および定量するなどして、エストロゲンレセプターリガンド結合領域とともに発現している目的遺伝子の発現を推定することができる。 If vector expressing the estrogen receptor ligand binding region of the wild type can be used, for example radiolabeled ligand as 18 F- fluoro tamoxifen (18 F-fluoro tamoxifen) and 18 F- fluoro-estradiol (18 F-fluoroestradiol) . In the case of a vector that expresses a mutant estrogen receptor ligand-binding region, for example, 18 F-fluoro tamoxifen can be used as a radiolabeled ligand. Establish the estrogen receptor by detecting the expression of the estrogen receptor ligand-binding region using a device such as PET, imaging and quantifying it after administration of the radiolabeled ligand by a method such as intravenous injection. Expression of the target gene expressed together with the ligand binding region can be estimated.
本発明に用いるレポーター遺伝子は、毒性がなく、その発現が細胞や個体に強い生理作用を与えず、抗原性がないかまたは非常に低く、内因性の発現が見られる場合はその発現部位が限定され、かつレポーターの発現を検出しようとする領域と重ならず、さらに発現効率がよく、翻訳後の修飾やフォールディングに問題がおこり難く、かつ遺伝子の取扱いが容易な低分子量蛋白である。したがって、この遺伝子を組み込んだ本発明のベクターは、遺伝子治療のように外来遺伝子をヒトの生体内で発現させる場合において、また基礎研究において動物の生体内で外来遺伝子を発現する場合おいて、目的遺伝子の発現を非侵襲的に体外から容易に検出し、遺伝子発現の時間的、空間的変化をモニタリングするシステムに応用することができる。 The reporter gene used in the present invention is not toxic, its expression does not give a strong physiological effect to cells or individuals, has no or very low antigenicity, and its expression site is limited when endogenous expression is observed. It is a low molecular weight protein that does not overlap with the region where reporter expression is to be detected, has high expression efficiency, is less susceptible to post-translational modifications and folding, and is easy to handle genes. Therefore, the vector of the present invention in which this gene is incorporated is used for the purpose of expressing a foreign gene in a human body as in gene therapy, or in the case of expressing a foreign gene in an animal body in basic research. The present invention can be applied to a system that easily detects gene expression from outside the body non-invasively and monitors temporal and spatial changes in gene expression.
以下に実施例及び試験例をあげて、本発明をより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples.
GFPとMERをコードする遺伝子配列をIRESで結合してGAL4-UASを含むプロモーターの下流に接続したプラスミド
MERを含むcDNA配列を、pAN-Mer-Cre-Merを鋳型としてPCRにより5'端にSpe1、3'端にEcoR1の制限酵素認識部位を付加して増幅し、pGEM-T easy(プロメガ社)に導入してDNA配列に間違いのないことを確認した。このプラスミドをSpe1とEcoE1で消化して得られるフラグメントを、誘導型哺乳類発現用プラスミドpGene/V5-His(インビトロゲン社)のGAL4-UASを含むプロモーターの下流にあるマルチクローニングサイトに導入しpGene/Merを作製した。pIRES-hrGFP-1a(ストラタジーン社)を鋳型として、PCRにより、5'端にBamH1、3'端にMfe1の制限酵素認識部位を付加してIRESの遺伝子配列を増幅し、また、5'端にMfe1、3'端にSpe1の制限酵素認識部位を付加してGFPをコードする配列を増幅し、両者をpGEM-T easy(プロメガ社)に導入してDNA配列に間違いのないことを確認した。GFPをコードする配列を導入したpGEMをMfe1とSpe1で消化し、ここにIRESを導入したpGEMをMfe1とSpe1で消化して得られたフラグメントを挿入してプラスミドpGEM/GIを作製した。pGene/MerをBamH1とMfe1で消化し、ここにpGEM/GIをBamH1とMfe1で消化してえられたフラグメントを挿入して、GAL4-UASを含むプロモーターの下流にGFPをコードする遺伝子配列、IRES、MERをコードする遺伝子配列が順にならぶプラスミド、pGene/GIMを作製した。(図１a)
A plasmid in which the gene sequences encoding GFP and MER are joined by IRES and connected downstream of a promoter containing GAL4-UAS
A cDNA sequence containing MER is amplified using pAN-Mer-Cre-Mer as a template by adding a restriction enzyme recognition site of Spe1 at the 5 'end and EcoR1 at the 3' end, and pGEM-T easy (Promega) It was confirmed that the DNA sequence was correct. A fragment obtained by digesting this plasmid with Spe1 and EcoE1 was introduced into the multiple cloning site downstream of the promoter containing GAL4-UAS of the inducible mammalian expression plasmid pGene / V5-His (Invitrogen). Mer was produced. pIRES-hrGFP-1a (Stratagene) was used as a template to amplify the IRES gene sequence by adding a restriction enzyme recognition site of BamH1 at the 5 ′ end and Mfe1 at the 3 ′ end, and 5 ′ end. Mfe1 and Spe1 restriction enzyme recognition site was added to the 3 'end to amplify the sequence encoding GFP, and both were introduced into pGEM-T easy (Promega) to confirm that the DNA sequence was correct. . PGEM in which a sequence encoding GFP was introduced was digested with Mfe1 and Spe1, and a fragment obtained by digesting pGEM into which IRES was introduced with Mfe1 and Spe1 was inserted to prepare a plasmid pGEM / GI. pGene / Mer is digested with BamH1 and Mfe1, and a fragment obtained by digesting pGEM / GI with BamH1 and Mfe1 is inserted, and a gene sequence encoding GFP downstream of a promoter containing GAL4-UAS, IRES Then, a plasmid, pGene / GIM, in which the gene sequences encoding MER are arranged in order was prepared. (Figure 1a)
ヒトチミジンホスホリラーゼ（thymidine phosphorylase）(TP)とMERをコードする遺伝子配列をIRESで結合してCMVプロモーターの下流に接続したプラスミド
ヒトTPをコードするcDNAの開始コドンからストップコドンまでを含む領域を、福井医科大学外科学Dr.Riより譲り受けたプラスミド（pCIhTP）を鋳型に、PCRにより5'端EcoR1,3'端にMlu1の制限酵素認識部位をつけて増幅、pGEM-T easy(プロメガ社)に導入してDNA配列に間違いのないことを確認した後、EcoR1で消化し、得られたフラグメントをほ乳類発現用プラスミドpCI(プロメガ社)のCMVプロモーターの下流にあるマルチクローニングサイトに挿入した。実施例１で作製したpGene/GIMを鋳型として、PCRにより、5'端にMlu1の制限酵素認識部位が付加されるようIRESとMERをコードする配列を含むフラグメントを増幅し、pGEM-T easy(プロメガ社)に導入してDNA配列に間違いのないことを確認した後、Mlu1とNot1で消化してIRESとMERをコードする配列を含むフラグメントを得た。このフラグメントを、上記のTPを導入したプラスミドをMlu1とNot1で消化した位置に挿入し、TPをコードする配列の下流に導入し、CMVプロモーターの下流に、TPをコードする配列、IRES、MERをコードする配列がこの順にならぶプラスミド、pTIMを作製した。（図1b）
A plasmid in which the gene sequence encoding human thymidine phosphorylase (TP) and MER is linked by IRES and connected downstream of the CMV promoter. The region from the start codon to the stop codon of cDNA encoding human TP is defined as Fukui. Using plasmid (pCIhTP) inherited from Dr. Ri of Medical University Surgery as a template, PCR amplified the 5 'end EcoR1, 3' end with Mlu1 restriction enzyme recognition site and introduced it into pGEM-T easy (Promega) After confirming that the DNA sequence was correct, it was digested with EcoR1, and the resulting fragment was inserted into the multicloning site downstream of the CMV promoter of the mammalian expression plasmid pCI (Promega). Using pGene / GIM prepared in Example 1 as a template, a fragment containing sequences encoding IRES and MER was amplified by PCR so that a restriction enzyme recognition site of Mlu1 was added to the 5 ′ end, and pGEM-T easy ( (Promega) and the DNA sequence was confirmed to be correct, and then digested with Mlu1 and Not1 to obtain a fragment containing sequences encoding IRES and MER. This fragment is inserted into the above TP-introduced plasmid at the position digested with Mlu1 and Not1, and introduced downstream of the TP-encoding sequence. The TP-encoding sequence, IRES and MER are inserted downstream of the CMV promoter. A plasmid, pTIM, in which coding sequences are arranged in this order was prepared. (Figure 1b)
TPとヒト野生型エストロゲンレセプターリガンド結合領域(hERL)をコードする遺伝子配列をIRESで結合してCMVプロモーターの下流に接続したプラスミド ニューヨーク大学医学部（New York University Medical School）のDr. Taneseより譲り受けたプラスミド（pcDNA/hER）を鋳型に、ヒト野生型エストロゲンレセプターをコードするcDNAのリガンド結合領域をコードする部分をPCRにより5'端にMlu1の制限酵素認識部位とスタートコドンをつけて増幅して、pGEM-T easy(プロメガ社)に導入し、DNA配列に間違いのないことを確認した後Mlu1とNot1で消化した。実施例２で作製したpTIMをMlu1とNot1で消化し、これと上記で得られた野生型エストロゲンレセプターのリガンド結合領域をコードする部分を含むフラグメントのライゲーションにより、CMVプロモーターの下流に、TPをコードする配列、IRES、hERLをコードする配列がこの順にならぶプラスミド、pTIERを作製した。(図1c)。
〔試験例１〕
A plasmid in which the gene sequence encoding TP and human wild-type estrogen receptor ligand-binding region (hERL) is linked by IRES and connected downstream of the CMV promoter. Plasmid inherited from Dr. Tanese of New York University Medical School Using the template (pcDNA / hER) as a template, the portion encoding the ligand binding region of the cDNA encoding human wild-type estrogen receptor was amplified by PCR with the Mlu1 restriction enzyme recognition site and start codon at the 5 'end, and pGEM -Introduced into T easy (Promega) and confirmed that the DNA sequence was correct, then digested with Mlu1 and Not1. PTIM prepared in Example 2 was digested with Mlu1 and Not1, and ligation was performed with a fragment containing a portion encoding the ligand binding region of the wild-type estrogen receptor obtained above to encode TP downstream of the CMV promoter. PTIER, a plasmid in which the sequences encoding IRES and the sequence encoding hERL are arranged in this order, was prepared. (Figure 1c).
[Test Example 1]
発現調節タンパク質(Switch protein)を発現するGS3T3細胞(インビトロゲン社より購入)を60mmのプレートに播き、10%のFCSを含むDMEMで培養した。およそ40% コンフルエントになった時点で、FuGene6 (Rosche社)を用いて2μgのpGene/GIMを一過性にトランスフェクトし、8時間後、培養液に最終濃度10nMになるようミフェプリストンを添加したものと、添加しないものにわけ、一夜培養した。コントロールとしてインサートをもたないpGene/5V-HisAも同様にトランスフェクトし、ミフェプリストンで処理した。GFPの発現を蛍光顕微鏡下で観察した後、細胞を集め、可溶化した上清を抗マウスER抗体(MC-20, サンタクルズ社)、およびECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いるイムノ・ブロット法に供した。pGene/GIMをトランスフェクトし、ミフェプリストンを添加した群でのみGFPとMERの発現が観察され、ミフェプリストンを添加しなかった群およびpGene/5V-HisAをトランスフェクトした群ではGFPとMERの発現は観察されず、ミフェプリストンによるコントロール下GFPとMERが同時発現することが確かめられた。（図2）
〔試験例２〕
GS3T3 cells (purchased from Invitrogen) expressing expression protein (Switch protein) were seeded on a 60 mm plate and cultured in DMEM containing 10% FCS. When approximately 40% confluent, 2 μg of pGene / GIM was transiently transfected using FuGene6 (Rosche), and 8 hours later, mifepristone was added to the culture solution to a final concentration of 10 nM. The cultures were divided into those that were not added and those that were not added. As a control, pGene / 5V-HisA without an insert was similarly transfected and treated with mifepristone. After GFP expression was observed under a fluorescence microscope, cells were collected and the solubilized supernatant was used with anti-mouse ER antibody (MC-20, Santa Cruz) and ECL Plus Western blotting detection system (Amersham Biosciences) The sample was subjected to immunoblotting. Expression of GFP and MER was observed only in the group transfected with pGene / GIM and added with mifepristone, and GFP and MER were observed in the group not added with mifepristone and the group transfected with pGene / 5V-HisA. No GFP expression was observed, confirming that GFP and MER were co-expressed under the control of mifepristone. (Figure 2)
[Test Example 2]
サルの腎臓に由来するCos7細胞(ATCCより購入)を60mmのプレートに播き、10%のFCSを含むDMEMで培養した。およそ40%confluentになった時点で、FuGene6 (Rosche社)を用いて0.5-3.0μgのpTIMを一過性にトランスフェクトし、24時間培養した後、細胞を集めた。可溶化した細胞の上清を抗ヒトTP抗体(オンコジーン社)と抗マウスER抗体(MC-20、サンタクルズ社)、およびECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いるイムノ・ブロット法に供した。pTIMの一過性トランスフェクトによりTPとMERが同時に発現し、両者の発現量が平行して増減することが確かめられた。（図3）
〔試験例３〕
Cos7 cells derived from monkey kidney (purchased from ATCC) were seeded on a 60 mm plate and cultured in DMEM containing 10% FCS. When it became approximately 40% confluent, 0.5-3.0 μg of pTIM was transiently transfected using FuGene6 (Rosche) and cultured for 24 hours, and then cells were collected. The solubilized cell supernatant was subjected to immunoblotting using anti-human TP antibody (Oncogene), anti-mouse ER antibody (MC-20, Santa Cruz), and ECL Plus Western blotting detection system (Amersham Biosciences). Provided. It was confirmed that TP and MER were expressed simultaneously by transient transfection of pTIM, and the expression levels of both increased and decreased in parallel. (Figure 3)
[Test Example 3]
試験例２と同様の方法でpTIERを一過性にトランスフェクトしたCos7細胞とトランスフェクトしていないコントロールのCos7細胞について、トランスフェクトの24時間後、200倍の4-ヒドロキシタモキシフェン（4-hydroxytamoxifene）の存在・非存在下で培養液に0.5μCiの3H-4-ヒドロキシタモキシフェンを加えて１時間培養した後、新しい培地に交換し１時間培養した。培地の交換をさらに２回繰り返した後、PBSで１回洗浄し、0.２NのNaOH 1mlを加えて細胞を溶解し、細胞内に取り込まれた3H-4-ヒドロキシタモキシフェンの放射能を液体シンチレイションカウンター(LSC-5100、Aloka社)により測定した。200倍の4-ヒドロキシタモキシフェンの存在・非存在下での取り込みの差を3H-4-ヒドロキシタモキシフェン の特異的な取り込みとして計算したところ、hERLをトランスフェクトしていないコントロールのCos7細胞に比べトランスフェクトした細胞では数倍高い3H-4-ヒドロキシタモキシフェンの細胞内への特異的な取り込みが観察された（図4）。 For Cos7 cells transiently transfected with pTIER in the same manner as in Test Example 2 and control Cos7 cells not transfected, 200 times 4-hydroxytamoxifene 24-hours after transfection After adding 0.5 μCi of 3 H-4-hydroxy tamoxifen to the culture solution in the presence or absence of and culturing for 1 hour, the medium was replaced with a new medium and cultured for 1 hour. The medium was changed twice more, then washed once with PBS, 1 ml of 0.2N NaOH was added to lyse the cells, and the radioactivity of 3 H-4-hydroxy tamoxifen incorporated into the cells was liquid. It measured with the scintillation counter (LSC-5100, Aloka company). The difference in uptake in the presence or absence of 200-fold 4-hydroxy tamoxifen was calculated as specific uptake of 3 H-4-hydroxy tamoxifen and was found to be higher than that in control Cos7 cells not transfected with hERL. In the infected cells, specific uptake of 3 H-4-hydroxytamoxifen into the cells was observed several times higher (FIG. 4).
また、このとき、pTIERを一過性にトランスフェクトしたCos7細胞ではヒトTPとhERLが発現していることが抗ヒトTP抗体(オンコジーン社)と抗ヒトER抗体(HC-20, サンタクルズ社)、およびECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いるイムノ・ブロット法により確認された。 In addition, at this time, in Cos7 cells transiently transfected with pTIER, human TP and hERL are expressed as anti-human TP antibody (Oncogene) and anti-human ER antibody (HC-20, Santa Cruz), And an immunoblotting method using an ECL Plus Western blotting detection system (Amersham Biosciences).
本発明により、遺伝子治療のように外来遺伝子をヒトの生体内で発現させる場合において、また基礎研究において動物の生体内で外来遺伝子を発現する場合についても、目的遺伝子の発現を非侵襲的に体外から検出し、遺伝子発現の時間的、空間的変化をモニタリングすることが可能となった。 According to the present invention, when a foreign gene is expressed in a human body as in gene therapy, or in a case where a foreign gene is expressed in an animal body in basic research, the expression of the target gene is non-invasively in vitro. It was possible to monitor temporal and spatial changes in gene expression.
Claims (5)
The vector according to claim 1, wherein the vector is a plasmid or a viral vector.
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