JP2005162714A - グリシンnメチルトランスフェラーゼモノクローナル抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】悪性疾患の検出および監視における前記モノクローナル抗体の使用方法とを提供する。
【解決手段】ヒトのグリシンNメチルトランスフェラーゼの一部に対する2種類のユニークなモノクローナル抗体と、それを用いて血液全体、血清、血漿、及び組織のグリシンNメチルトランスフェラーゼの発現の下向き調節または不適切な発現によって肝癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌等の悪性疾患の検出および監視する。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトのグリシンNメチルトランスフェラーゼの一部に対する2種類のユニークなモノクローナル抗体と、それを用いて血液全体、血清、血漿、及び組織のグリシンNメチルトランスフェラーゼの発現の下向き調節または不適切な発現によって肝癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌等の悪性疾患の検出および監視する。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、グリシンNメチルトランスフェラーゼの発現の下向き調節または不適切な発現によって特徴付けられる悪性疾患の検出、監視および診断の分野に関する。
肝細胞性癌(hepatocellular carcinoma、HCC)は、世界で最もありふれた悪性疾患の1つで、毎年ほぼ100万人の死亡原因である。肝細胞性癌は不均一な地理的分布を示すので、世界の地域間で優勢なリスク因子が異なることとおそらく関係がある。肝細胞性癌はアジア、アフリカおよび地中海沿岸では最も高頻度で発生する新生物である。
肝細胞性癌の発症頻度は、B型及びC型の肝炎ウイルス感染者の頻度が高い地域とヘモクロマトーシス患者とでより高い。80%を超える肝細胞性癌は肝硬変の患者で発症する。いったんウイルス感染が成立すると、患者が慢性肝炎を発症するのに約10年を要し、肝硬変を発症するのに20年を要し、肝細胞性癌を発症するのに30年を要する。アフリカおよびアジアの諸国では、貯蔵が不完全な主食用作物へのアスペルギルス・フラーブス(Aspergillus flavus)による汚染の結果産生されたアフラトキシンが、おそらくp53抑制遺伝子の突然変異を通じて、肝細胞性癌の発症の独立したリスク因子となるようである。
肝硬変の患者では、肝機能の低下、急性合併症(腹水、脳症、静脈瘤出血および黄疸)または上腹部の痛みおよび発熱があるときに肝細胞性癌の診断が疑われるべきである。超音波診断法はたいていの腫瘍を同定し、約500ng/mlを超える濃度のα−フェトプロテインを伴う硬変した肝臓内の不連続な塊の存在が診断基準である。生検は不要で、腫瘍の転移(tumor seeding)のリスクを低減するために避けるべきである。外科的切除は治癒の可能性がある唯一の治療である。しかし、腫瘍の部域的な広がりと、既存の硬変の重篤性のために、かかる治療は患者の20%未満でしか実行できない。平均手術死亡率は硬変患者で12%で、5年生存率は約15%である。
硬変および(5cm以下の)小さな腫瘍を有する患者は肝臓移植を受けるべきである。アルコール注入または高周波(radio frequency)切除は、移植に適さない小さな腫瘍を有する患者の生存率を改善することができる。より大きな腫瘍には、リピオドール(lipiodol)および細胞毒性薬(シスプラチン(cisplatin)またはドクソルビシン(doxorubicin))を併用する経動脈塞栓術(trans−arterial embolization)が一部の患者で腫瘍の壊死を誘発する場合がある。
腫瘍の悪性度を診断し、または評価するための絶対的な方法はない。しかし、利用可能な方法のなかで、組織の鏡検がいまだに最も信頼できる常用方法である。ある病理的研究では、腫瘍は、当該組織の切片を顕微鏡で検査することにより、組織学的および細胞学的な基準に基づいて構造的な脱分化(退形成(anaplasia))の程度の大まかな評価をすることによって等級付けをすることができる。しかし一方では、一部の細胞は特異的な構造上の特徴を失っても生化学的な特性はいまだ保持するが、他の細胞は構造としては一見して分化しているようにみえても多くの正常な機能特性を失っている。他方では、腫瘍は均一的ではなく、複数の腫瘍等級の領域を含む場合がある。そこで、進行した腫瘍は、構造、機能、増殖能、薬剤またはX線に対する耐性および浸潤および転移の能力に違いがある細胞の混合集団からなる場合がある。これら2つの限界が腫瘍の鏡検の有効性を減少させる。別の面では、標本の試料作成によりかかる検査を行うことは大規模な調査には適さない。
悪性度の絶対的なマーカーを見つけるための多くの試みが行われてきた。腫瘍特異的タンパク質または腫瘍関連タンパク質を、直接測定することにより、または、これらのタンパク質に対する特異的抗体を開発することにより同定する他の試みはいまだに行われている。これらは、診察だけでなく、癌細胞を破壊する戦略を提供するうえでも有望なアプローチのようである。例えばα−フェトプロティンのような癌胎児抗原や、例えばフェリチンのような血清タンパク質や、酵素や、ポリアミンや、異所的ホルモンや、細胞マーカーや、レセプターや、腫瘍関連ウイルス抗原のようなさまざまな物質であって、その物質の生体内での存在または濃度がある種の癌を示す場合がある物質が報告されてきた。しかし、最も慣用される癌の診断法は、上記の物質のいずれよりも組織学に依存する。絶対的なマーカーがないことは癌研究の大きな欠陥である。
最近の観察は、発癌に密接に関連する物質の探索にいささかの期待を与える。癌は、オンコジーンの活性化と腫瘍抑制遺伝子の不活性化との両方を起こす多発的な遺伝子異常の結果として理解される。さらに、オンコジーンと関連するこれらの重要な遺伝子の差次的発現は、細胞内のメッセンジャーRNA(mRNA)レベルに反映する場合がある。非常に大量のmRNAの中から興味のある変化したものを有効にスクリーニングするために、強力なツール、具体的には、ディフェレンシャル・ディスプレイ法が確立され、腫瘍細胞と正常細胞との間で差次的に発現する少数の遺伝子を同定し単離された(非特許文献1)。
Liangら、Cancer Research、52巻、6966−6968頁、1992年
Liangら、Cancer Research、52巻、6966−6968頁、1992年
本発明は、GNMTのレベルが低下した細胞の異常を検出するモノクローナル抗体を提供する。肝細胞性癌(HCC)患者由来の細胞株および組織中のGNMTの発現を評価するために、我々は、2つの組み換えGNMT融合タンパク質を用いて、GRL7およびGRL1という2つのモノクローナル抗体を作製した。M13ファージペプチドディスプレイは、モノクローナル抗体GRL7およびGRL1の反応エピトープがそれぞれヒトGNMTのアミノ酸配列の10−15番および272−278番のアミノ酸残基であることを証明した。
GNMTとモノクローナル抗体との結合の解離定数は、モノクローナル抗体GRL7については1.7x10−8Mで、GRL1については1.8x10−9Mであった。これらのモノクローナル抗体の両方とも、ウェスタンブロッティング(WB)および免疫組織化学染色アッセイ(IHC)を用いて正常なヒトおよびマウスの肝臓組織中に存在するGNMTを同定することができる。さらに、GRL1でのウェスタンブロッティングは、2つの肝芽細胞腫株および5つの肝細胞性癌株がGNMTを発現していないことを示した。両方のモノクローナル抗体での免疫組織化学染色アッセイは、非腫瘍性の肝臓組織の50%(13/26)および肝細胞性癌組織の96%(24/25)はGNMTを発現していないことを示した。したがって、我々は、GNMTの発現はヒトの肝細胞性癌では下向き調節されているという結論を得た。
前記モノクローナル抗体はヒトGNMTのアミノ酸残基10から15または272から278までと反応するモノクローナル抗体のグループから選択されることが好ましい。前記抗体はGRL1またはGRL7であることが好ましい。特異抗体GRL7に係る生物材料は出願人により2003年5月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、特許受託指定PTA−5191を受けた。特異抗体GRL1に係る生物材料は出願人により2003年7月14日にATCCに寄託され、特許寄託指定PTA−5319を受けた。
ヒト血清中のGNMTの測定のための定量的な酵素免疫アッセイが確立された。健常者413名、慢性肝炎患者90名、肝硬変患者20名および肝細胞性癌患者22名を調べた。結果は、これら4つのグループの患者のGNMTの血清レベルがそれぞれ11.04±16.24(健常者)、7.19±9.25(慢性肝炎)、3.14±3.38(肝硬変)および2.19±2.54ng/ml(肝細胞性癌)であることを示した(ANOVAテスト、p<0.05)。
図面の説明
図1Aおよび1Bは、2つの組み換えGNMT発現プラスミドpGEX−GNMTおよびpGNMT−Hisの構築ダイアグラムである。
図1Aおよび1Bは、2つの組み換えGNMT発現プラスミドpGEX−GNMTおよびpGNMT−Hisの構築ダイアグラムである。
図2Aから2Dは、モノクローナル抗体GRL1およびGRL7を用いたGNMTの組み換え型及び天然型の同定を示す電気泳動結果である。パネルAは、IPTG誘導前(レーン1、6)および後(レーン2、7)のpGEX−GNMTを含む大腸菌JM109またはpGNMT−Hisを含む大腸菌BL−21由来の溶菌液(lysate)を含むSDS−ポリアクリルアミドゲルのクーマジー・ブリリアント・ブルーR250染色である。Hisタグ精製法用のグルタチオン・アガロース・ビーズおよびニッケルアフィニティカラム由来の非結合分画(レーン3、9)および結合分画の溶出物がそれぞれレーン4およびレーン8に泳動された。パネルBは、GST−GNMTおよびGNMT−His組み換えタンパク質のストリップに対してモノクローナル抗体を反応させたウェスタンブロッティングである。ストリップは、未免疫ウサギ血清(レーン1)、ウサギ抗GST−GNMT抗血清R4(レーン2)、正常マウス血清(レーン3)、モノクローナル抗体GRL1(レーン4)およびモノクローナル抗体GRL7(レーン5)と反応させられた。これらのストリップは間接法を用い、基質3−3’ジアミノベンジジンで発色させられた。パネルCはpCMV−GNMTプラスミドDNAでトランスフェクションされた293T細胞の細胞溶解物を用いるストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイである。パネルDは、GSTおよびGNMTのストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイである。パネルCおよびDに用いられた抗体は、レーン1が未免疫ウサギ血清、レーン2がR4で、レーン3が正常マウス血清で、レーン4がモノクローナル抗体GRL7で、レーン5がモノクローナル抗体GRL1である。分子量マーカーはパネルA(レーン5)を除いて左端に標識された(単位はkd)。
図3Aおよ3Bは、キュベットに結合されたGNMTの応答プロットである。AはGNMTの結合に対する酢酸ナトリウムバッファーの条件のテストで、1はpH4,2はpH4.5で、3および5はpH5.0で、4および6はpH5.5で、7はpH6である。BはGNMTの結合反応で、ステージ1はPBSTの基線で、2はEDC/NHS200μl 3X6分、3はPBST洗浄3回、4はpH5.0の酢酸ナトリウムバッファー200μl、5は50μlGNMT(9μg)+150μlpH5.0酢酸ナトリウムバッファー5分間、6は結合反応を停止するため200μlの1MエタノールアミンpH8.5を5分間、7は10mMのHClおよびPBST洗浄3回による再生反応2サイクルである。
図4Aおよび4Bは、組み換えGNMTと結合されたキュベットに対するモノクローナル抗体GRL1およびGRL7の応答プロットである。200μlの培養上清をPBSTで2倍希釈した液が前記キュベットに添加され、応答がIAsys制御ソフトウェアのバージョン3.01により測定された。得られたこれら2つのモノクローナル抗体の解離定数はFAST fitにより計算された。GRL1の免疫グロブリン濃度は、Aの(1)4x10−11M、(2)8x10−11M、(3)1.6x10−10M、(4)3.2x10−10M、(5)6.3x10−10M、(6)1.3x10−9M、(7)2.5x10−9M、(8)5.1x10−9M、(9)1.0x10−8Mであった。GRL7の免疫グロブリン濃度は、Bの(1)4.7x10−11M、(2)9.4x10−11M、(3)1.9x10−10M、(4)3.8x10−10M、(5)7.5x10−10M、(6)1.5x10−9M、(7)3x10−9M、(8)6x10−9M、(9)1.2x10−8Mであった。
図5Aおよび5Bは、ヒト肝臓、マウス肝臓、肝芽細胞種株細胞(HepG2およびHuh6)および肝細胞性癌株細胞(PLC/PRF/5、Huh7、HA22T、Hep3BおよびSk−Hep1)中のGNMTの存在をモノクローナル抗体GRL1(パネルA)またはGRL7(パネルB)を用いてウェスタンブロッティング法で分析した結果である。レーン1は肝癌患者由来の非腫瘍性組織で、レーン2はC57/BLマウス由来の肝臓で、レーン3はHepG2で、レーン4はPLC/PRF/5で、レーン5はHuh6で、レーン6はHuh7で、レーン7はHA22Tで、レーン8はHep3Bで、レーン9はSk−Hep1である。下のパネルは同一のレーンを抗β−アクチン抗体と反応させた結果である。分子量マーカーは各パネルの左端に標識された(単位kd)。
図6Aから6Dは、モノクローナル抗体GRL7またはGRL1を用いる肝細胞性癌患者2名由来のパラフィン固定肝臓組織切片中でのGNMT発現の免疫組織化学的な分析結果である。前記切片は、1:25希釈のモノクローナル抗体GRL7(パネルA、B)または1:100希釈のモノクローナル抗体GRL1(パネルC、D)と反応させられ、標識ストレプトアビジン−ビオチン法により可視化された。パネルA(非腫瘍性)およびパネルB(腫瘍組織)は肝細胞性癌患者H126に由来した(100倍拡大)。パネルC(非腫瘍性)およびパネルD(腫瘍組織)は別の肝細胞性癌患者H146に由来した(400倍拡大)。
図7Aおよび7Bは、GNMTの定量的酵素免疫アッセイの結果の分布についての平均(mean)プロットおよびボックス・プロットである。ジェン・イ(Jen−I)病院で健康診断を受診した健常者由来の健常血清413検体、慢性肝炎患者由来の90検体、確認された肝硬変患者由来の20検体および肝細胞性癌患者由来の22検体を含む総数545検体の血清試料が我々の研究室で収集された。これらの血清の予備的スクリーニングでは、健常者と、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞性癌の患者の平均値および標準偏差は、それぞれ11.04±16.24ng/ml、7.19±9.25ng/ml、3.14±3.38ng/mlおよび2.19±2.54ng/mlであった。
グリシンNメチルトランスフェラーゼ(GNMT、EC2.1.1.20)は、もともとグリシンおよびS−アデノシルメチオニン(SAM)からのサルコシンの合成を触媒することによりS−アデノシルホモシステインに対するS−アデノシルメチオニンの比を調整する酵素であることが見つけられた(非特許文献2、3)。GNMTは異なる動物種間で保存されている(非特許文献4、5、6および7)。好塩性メタン古細菌では、GNMTは浸透圧調節に主要な役割を果たす(非特許文献8)。ウサギおよびラットの肝臓では、GNMTは細胞質タンパク質の1−3%を含み、メチオニン代謝で重要な役割を果たすことが示唆されている(非特許文献3、10および11)。
Kerr、S.J.、J.Biol.Chem.、247巻、4248−4252頁、1972年 Ogawa、H.、Fujioka、M.、J.Biol.Chem.、257巻、3447−3452頁、1982年 Bork、P.ら、Protein Sci.、1巻、1677−1690頁、1992年 Chen、Y.M.ら、Int.J.Cancer、75巻、787−793頁、1998年 Lai、M.C.ら、米国微生物学会年会(要約I17)、ワシントンD.C.、1999年 Ogawa、H.ら、Comp.Biochem.Phys.B、106巻、601−611頁、1993年 Lai、M.C.ら、Appl.Environ.Microbiol.、65巻、828−33頁、1999年 Cook、R.J.、Wagner、C.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻、3631−3634頁、1984年 Heady、J.E.、Kerr、S.J.、Cancer Res.35巻、640−3、1975年
Kerr、S.J.、J.Biol.Chem.、247巻、4248−4252頁、1972年 Ogawa、H.、Fujioka、M.、J.Biol.Chem.、257巻、3447−3452頁、1982年 Bork、P.ら、Protein Sci.、1巻、1677−1690頁、1992年 Chen、Y.M.ら、Int.J.Cancer、75巻、787−793頁、1998年 Lai、M.C.ら、米国微生物学会年会(要約I17)、ワシントンD.C.、1999年 Ogawa、H.ら、Comp.Biochem.Phys.B、106巻、601−611頁、1993年 Lai、M.C.ら、Appl.Environ.Microbiol.、65巻、828−33頁、1999年 Cook、R.J.、Wagner、C.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻、3631−3634頁、1984年 Heady、J.E.、Kerr、S.J.、Cancer Res.35巻、640−3、1975年
我々は、以前、ヒトの肝細胞性癌(HCC)患者由来の肝臓の腫瘍と非腫瘍性肝臓組織とのmRNAディフェレンシャルディスプレイ法およびノザンブロット法の分析を通じて、GNMTの発現レベルが腫瘍組織および肝細胞性癌株細胞では低下していることを報告した(非特許文献5)。その後、ヒトのGNMT遺伝子が単離され、配列決定され、6p12染色体にマップされた(非特許文献11)。さらに、ヒトGNMT遺伝子の異なる多型の遺伝子型解析は、遺伝マーカーの36−47%は肝細胞性癌患者の腫瘍組織においてヘテロ接合性の喪失(loss of heterozygocity)を示すことを証明した(非特許文献12)。GNMTの機能的特徴付けは、GNMTがベンゾ[a]ピレン(benzo(a)pyrene (BaP))と結合することができ、BaP−DNA付加体(adduct)形成を減少させることを示した(非特許文献13および14)。したがって、GNMTは発癌感受性遺伝子(tumor susceptibility gene)に分類することができる。
Chen、Y.M.ら、Genomics、66巻、43−47頁、2000年 Tseng、T.L.ら、「発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの遺伝子型および表現型の特徴付け(Genotypic and Phenotypic Characterization of a Putative Tumor Susceptibility Gene,GNMT)」、Liver Cancer、(投稿中) Chen、S.Y.ら、「ベンゾ[a]ピレン解毒経路における発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの機能的特徴付け(Functional characterization of a putative tumor susceptibility gene−GNMT in the Benzo[a]pyrene− detoxification pathway)」、(投稿中) Raha、A.ら、J.Biol.Chem.、269巻、5750−5756頁、1994年
Chen、Y.M.ら、Genomics、66巻、43−47頁、2000年 Tseng、T.L.ら、「発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの遺伝子型および表現型の特徴付け(Genotypic and Phenotypic Characterization of a Putative Tumor Susceptibility Gene,GNMT)」、Liver Cancer、(投稿中) Chen、S.Y.ら、「ベンゾ[a]ピレン解毒経路における発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの機能的特徴付け(Functional characterization of a putative tumor susceptibility gene−GNMT in the Benzo[a]pyrene− detoxification pathway)」、(投稿中) Raha、A.ら、J.Biol.Chem.、269巻、5750−5756頁、1994年
さらにGNMTは、多様な機能と、ベンゾ[a]ピレン(BaP)との結合についてAh(ダイオキシン)レセプターと競合して、BaP依存性のシトクロムP4501A1の発現を下向き調節し、BaP−DNA付加体形成を減少させる能力とを有することが示された(非特許文献13、15)。GNMT活性がラット肝癌では著しく低下していることが示された(非特許文献16)。さらに、N−2−フルオレニルアセトアミド(fluorenylacetamide)で誘発されたラット肝癌モデルでは、GNMT酵素活性は次第に低下して、処理の8ヶ月後の肝臓腫瘍では検出不可能になった(非特許文献17)。これらの研究から、GNMT遺伝子発現の下向き調節は、自然発症および人工発癌の両方の肝癌で存在すると結論することができる。
Krupenko、N.I.、Wagner、C.、J.Biol.Chem.272巻、27140−27146頁、1997年 Houser、W.H.ら、Biochemistry、24巻、7839−7845頁、1985年 Zhang、Y.J.ら、Cancer Res.、51巻、1720−1725頁、1991年
Krupenko、N.I.、Wagner、C.、J.Biol.Chem.272巻、27140−27146頁、1997年 Houser、W.H.ら、Biochemistry、24巻、7839−7845頁、1985年 Zhang、Y.J.ら、Cancer Res.、51巻、1720−1725頁、1991年
最近、Muddらは、軽度の肝腫(hepatomegaly)と血清トランスアミナーゼの慢性亢進とを有するイタリア人の同胞(siblings)の2人がGNMT欠損と診断されたという報告をした(非特許文献18)。子供は両方ともミスセンス突然変異を有するGNMT遺伝子の複合ヘテロ接合であった(非特許文献19)。
Mudd、S.H.ら、J.Inherit.Metab.Dis.24巻、448−64頁、2001年 Luka、Z.ら、Hum.Genet.110巻、68−74頁、2002年
Mudd、S.H.ら、J.Inherit.Metab.Dis.24巻、448−64頁、2001年 Luka、Z.ら、Hum.Genet.110巻、68−74頁、2002年
したがって、本発明は、免疫組織化学およびEIA法によりGNMTのレベルの低下を検出し監視するためのモノクローナル抗体を提供する。
本文中に引用された全ての文書または刊行物は、引用によりここに取り込まれる。
gnmt遺伝子は正常細胞と腫瘍細胞とで発現が異なり、著しい相違があることは、本発明において驚くべきこととして見つけられた。本発明の目的は、GNMTの遺伝子発現の相対的レベルを決定することにより細胞の異常を検出する方法を提供することである。
本発明では、血清または血漿中のGNMTと肝細胞性癌の発生との相関関係を監視する敏感な方法を確立するために、我々は抗GNMTモノクローナル抗体を用いた。捕捉抗体(capture antibody)としての抗ヒトGNMTポリクローナル抗体が、血清または血漿中の前記ヒトGNMTを捕捉し、指示抗体(indicating antibody)としてのモノクローナル抗体GRL1によりさらに解析を行うために用いられた。我々は、血中のヒトGNMT量を測定するための定量的酵素免疫アッセイ法を確立した。
さらに、前記モノクローナル抗体は、抗血清の作製またはその他の診断アッセイの作成に用いる合成ペプチドを製造するための参考として用いることができる免疫原性のあるエピトープを有する。
本発明の更なる詳細は以下の実施例に示されている。
gnmt発現ベクターの構築
1.1.pGEX−gnmt
pGEX−gnmtの構築のため、gnmtの完全長cDNA断片は制限酵素SmaIおよびSalI(ストラタジーン、米国、カリフォルニア州、ラホヤ)を用いてpBluescript−GNMT−9−1−2(非特許文献5)ファージミドDNAから切断された。この1.2kbDNA断片はSmaIおよびXhoIで予め消化されたベクターpGEX−KG(非特許文献20)に連結された。
Guan、K.L.、Dixon、J.E.、Anal.Biochem.、192巻、262−267頁、1991年
1.1.pGEX−gnmt
pGEX−gnmtの構築のため、gnmtの完全長cDNA断片は制限酵素SmaIおよびSalI(ストラタジーン、米国、カリフォルニア州、ラホヤ)を用いてpBluescript−GNMT−9−1−2(非特許文献5)ファージミドDNAから切断された。この1.2kbDNA断片はSmaIおよびXhoIで予め消化されたベクターpGEX−KG(非特許文献20)に連結された。
Guan、K.L.、Dixon、J.E.、Anal.Biochem.、192巻、262−267頁、1991年
1.2.pGNMT−Hisの構築
pGNMT−Hisの構築のために、図1Bに示すとおり、プラスミドpCMV−gnmt(非特許文献13)がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いられた。gnmtcDNA配列と両端の制限酵素切断部位とを含む1.2kbのDNA断片が増幅された。20回のPCRサイクルがDNAサーマルサイクラー(パーキン・エルマー・シータス、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ)でパーキン・エルマー・シータスのアンプリタック・ゴールド(Amplitaq Gold)TaqDNAポリメラーゼを用いて実行された。上流プライマー(5’−GAGGAATTCATGGTGGACAGCGTGTAC)は、5’末端の3塩基対の「クランプ(GCG)」と、これに続く1個の制限酵素部位(EcoRI)と、gnmtcDNA配列とからなる。下流プライマー(5’−GCGCTCGAGGTCTGTCCTCTTGAGCAC)は、gnmtcDNAの相補鎖の配列と、異なる制限酵素部位(XhoI)とから成ることを除いて、前記上流プライマーとお同様の構造的な配列モチーフを含む。前記PCRの後、前記1.2kbDNA断片はゲルで精製され、EcoRIおよびXhoIで消化されて、同じ組み合わせの制限酵素で消化されたベクターpET29a(ノバジェン社、米国、ウィスコンシン州、マジソン)に連結された。両方のプラスミドのDNA配列はABIプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット(パーキン・エルマー・シータス)を用いる自動DNA配列決定により確認された。
pGNMT−Hisの構築のために、図1Bに示すとおり、プラスミドpCMV−gnmt(非特許文献13)がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いられた。gnmtcDNA配列と両端の制限酵素切断部位とを含む1.2kbのDNA断片が増幅された。20回のPCRサイクルがDNAサーマルサイクラー(パーキン・エルマー・シータス、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ)でパーキン・エルマー・シータスのアンプリタック・ゴールド(Amplitaq Gold)TaqDNAポリメラーゼを用いて実行された。上流プライマー(5’−GAGGAATTCATGGTGGACAGCGTGTAC)は、5’末端の3塩基対の「クランプ(GCG)」と、これに続く1個の制限酵素部位(EcoRI)と、gnmtcDNA配列とからなる。下流プライマー(5’−GCGCTCGAGGTCTGTCCTCTTGAGCAC)は、gnmtcDNAの相補鎖の配列と、異なる制限酵素部位(XhoI)とから成ることを除いて、前記上流プライマーとお同様の構造的な配列モチーフを含む。前記PCRの後、前記1.2kbDNA断片はゲルで精製され、EcoRIおよびXhoIで消化されて、同じ組み合わせの制限酵素で消化されたベクターpET29a(ノバジェン社、米国、ウィスコンシン州、マジソン)に連結された。両方のプラスミドのDNA配列はABIプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット(パーキン・エルマー・シータス)を用いる自動DNA配列決定により確認された。
大腸菌JM109またはBL21株が、pGST−gnmtの形質転換および発現の実験の受容体として用いられた。さらにプラスミドpGEX−KG(非特許文献21)が酵素免疫アッセイの平行対照実験の役割を果たすグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)タンパク質の誘導および精製に用いられた。
Guan、K.L.、Dixon、J.E.、Anal.Biochem.192巻、262−267頁、1991年
Guan、K.L.、Dixon、J.E.、Anal.Biochem.192巻、262−267頁、1991年
1.3.異なるGNMT組み換えタンパク質の発現および精製
GST、GST−GNMTおよびGNMT−His組み換えタンパク質(RPs)の全てがイソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)によりJM109またはBL21細胞内で誘導された。GST−GNMTおよびGNMT−Hisの形質転換体は、それぞれ0.6−0.7および0.7−0.8が誘導光学濃度であった。これらの誘導時間は、それぞれ3.5時間および1時間であった。GSTおよびGST−GNMTの組み換えタンパク質は、Guanら(非特許文献21)に記載のとおり、グルタチオン−セファロース4Bビーズ(ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ)を用いて精製された。GNMT−Hisの組み換えタンパク質は、製造者(ノバジェン)によって提供される手法により、Ni2+−を付加したヒスチジン(His)結合樹脂カラムを用いて精製された。結合したGST−GNMT組み換えタンパク質は、5mMの還元グルタチオンバッファーを用いてグルタチオン−セファロース4Bビーズから溶出された。トロンビン消化法が、上記のビーズに結合したGST−GNMT融合タンパク質からGNMT組み換えタンパク質を精製するのに用いられた。前記組み換えタンパク質の濃度はピアース社のBCAタンパク質アッセイ試薬(ピアース、米国、イリノイ州、ロックフォード)を用いて測定され、純度は12.5%のSDS−ポリアクリルアミドミニゲル(バイオラッド・ラボラトリーズ、米国、カリフォルニア州、リッチモンド)上でサンプルを泳動することにより解析された。
GST、GST−GNMTおよびGNMT−His組み換えタンパク質(RPs)の全てがイソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)によりJM109またはBL21細胞内で誘導された。GST−GNMTおよびGNMT−Hisの形質転換体は、それぞれ0.6−0.7および0.7−0.8が誘導光学濃度であった。これらの誘導時間は、それぞれ3.5時間および1時間であった。GSTおよびGST−GNMTの組み換えタンパク質は、Guanら(非特許文献21)に記載のとおり、グルタチオン−セファロース4Bビーズ(ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ)を用いて精製された。GNMT−Hisの組み換えタンパク質は、製造者(ノバジェン)によって提供される手法により、Ni2+−を付加したヒスチジン(His)結合樹脂カラムを用いて精製された。結合したGST−GNMT組み換えタンパク質は、5mMの還元グルタチオンバッファーを用いてグルタチオン−セファロース4Bビーズから溶出された。トロンビン消化法が、上記のビーズに結合したGST−GNMT融合タンパク質からGNMT組み換えタンパク質を精製するのに用いられた。前記組み換えタンパク質の濃度はピアース社のBCAタンパク質アッセイ試薬(ピアース、米国、イリノイ州、ロックフォード)を用いて測定され、純度は12.5%のSDS−ポリアクリルアミドミニゲル(バイオラッド・ラボラトリーズ、米国、カリフォルニア州、リッチモンド)上でサンプルを泳動することにより解析された。
1.4.ウサギ抗GNMT抗血清
GNMTに対するウサギ抗体を作成するために、精製されたGST−GNMT組み換えタンパク質がフロイントの完全(最初の免疫用)または不完全(ブースター注射用)アジュバント(シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス)と混合され、得られた混合物が免疫原として8週齢のNZWウサギに皮下接種するのに用いられた(ウサギ1羽あたり組み換えタンパク質150−200μg)。ウサギは最初の注射の後3週間ごとに同一の組み換えタンパク質の追加の投与量でブースター注射を受けた。ウサギの血清は免疫前および各回の注射の1週間後に採取された。全ての血清は56°C30分間熱非動化処理され、−20°Cで保存された。
GNMTに対するウサギ抗体を作成するために、精製されたGST−GNMT組み換えタンパク質がフロイントの完全(最初の免疫用)または不完全(ブースター注射用)アジュバント(シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス)と混合され、得られた混合物が免疫原として8週齢のNZWウサギに皮下接種するのに用いられた(ウサギ1羽あたり組み換えタンパク質150−200μg)。ウサギは最初の注射の後3週間ごとに同一の組み換えタンパク質の追加の投与量でブースター注射を受けた。ウサギの血清は免疫前および各回の注射の1週間後に採取された。全ての血清は56°C30分間熱非動化処理され、−20°Cで保存された。
1.5.GNMTに対するモノクローナル抗体の作成
マウスのモノクローナル抗体は、我々の研究室で慣用するハイブリドーマ技術により作成された。簡単には、BALB/cマウスが、完全アジュバント(最初の免疫用)または不完全(ブースター注射用)アジュバント(シグマ)と混合されたGST−GNMTおよびGNMT−His組み換えタンパク質を投与量1回あたり25μg10日間隔の腹腔内注射(i.p.)で免疫された。血清サンプルは、免疫前および各回の注射の1週間後に尾の静脈から採取された。最後の組み換えタンパク質の静脈内注射(i.v.)の3日後、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマNS1細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州、ロックビル)とがPEG1500(ロッシュ・ダイアグノスティクスGmbH、ドイツ、マンハイム)を用いて融合され、96穴プレート上で培養された(非特許文献22)。培養上清が、GST/GNMTのEIA法と、GST、GST−GNMT、GNMT−Hisをブロッティングしたウェスタンブロッティング・ストリップとを用いてスクリーニングされた。選択されたハイブリドーマ細胞は、エキスパンドされ、限界希釈法で少なくとも2回クローニングされ、0.5mlのプリスタン(シグマ)で刺激されたBALB/cマウス内の腹水腫瘍として増殖された。モノクローナル抗体は、プロティンA抗体精製キット(プロケム社(Pro−Chem Inc.)米国、マサチューセッツ州、アクトン)およびセントリコン・プラス−80カラム(ミリポア、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード)で精製され濃縮された。
Chu、T.M.、Hybridoma、12巻、417−429頁、1993年
マウスのモノクローナル抗体は、我々の研究室で慣用するハイブリドーマ技術により作成された。簡単には、BALB/cマウスが、完全アジュバント(最初の免疫用)または不完全(ブースター注射用)アジュバント(シグマ)と混合されたGST−GNMTおよびGNMT−His組み換えタンパク質を投与量1回あたり25μg10日間隔の腹腔内注射(i.p.)で免疫された。血清サンプルは、免疫前および各回の注射の1週間後に尾の静脈から採取された。最後の組み換えタンパク質の静脈内注射(i.v.)の3日後、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマNS1細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州、ロックビル)とがPEG1500(ロッシュ・ダイアグノスティクスGmbH、ドイツ、マンハイム)を用いて融合され、96穴プレート上で培養された(非特許文献22)。培養上清が、GST/GNMTのEIA法と、GST、GST−GNMT、GNMT−Hisをブロッティングしたウェスタンブロッティング・ストリップとを用いてスクリーニングされた。選択されたハイブリドーマ細胞は、エキスパンドされ、限界希釈法で少なくとも2回クローニングされ、0.5mlのプリスタン(シグマ)で刺激されたBALB/cマウス内の腹水腫瘍として増殖された。モノクローナル抗体は、プロティンA抗体精製キット(プロケム社(Pro−Chem Inc.)米国、マサチューセッツ州、アクトン)およびセントリコン・プラス−80カラム(ミリポア、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード)で精製され濃縮された。
Chu、T.M.、Hybridoma、12巻、417−429頁、1993年
1.6.細胞株および細胞培養
ハイブリドーマ細胞株および培養法
前記ハイブリドーマ細胞株は、非特許文献22に記載のとおり10%熱非動化ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、ペニシリン(100IU/ml)およびストレプトマイシン(100IU/ml)を添加したRPMI1640培地(GIBCO−BRL、米国、メリーランド州、ゲイザースバーグ)中で培養された。
ハイブリドーマ細胞株および培養法
前記ハイブリドーマ細胞株は、非特許文献22に記載のとおり10%熱非動化ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、ペニシリン(100IU/ml)およびストレプトマイシン(100IU/ml)を添加したRPMI1640培地(GIBCO−BRL、米国、メリーランド州、ゲイザースバーグ)中で培養された。
1.7.肝芽細胞腫および肝細胞性癌細胞株および培養法
2種類のヒト肝芽細胞腫細胞株HepG2(非特許文献23および24)およびHuh6(非特許文献25)と、5種類の肝細胞性癌細胞株Huh7(非特許文献25)、HA22T(非特許文献26)、PLC/PRF/5(非特許文献19)、Hep3BおよびSk−Hep1(非特許文献23、27および28)とが本研究に用いられた。これらの細胞は、5%CO2の加湿インキュベーター中で、10%の熱非動化ウシ胎児血清(ハイクローン(HyClone)、ユタ州、ローガン)と、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、非必須アミノ酸(0.1mM)、ファンジゾン(fungizone、2.5mg/ml)およびL−グルタミン(2mM)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(GIBCO−BRL、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド)で培養された。
Aden、D.P.ら、Nature、282巻、615−616頁、1979年 Javitt、N.B.、FASEB J.、4巻、161−168頁、1990年 Nakabayashi、H.ら、Cancer Res.42巻、3858−3862頁、1982年 Chang、C.ら、Mol.Cell.Biol.3巻、1133−1137頁、1983年 Fogh、J.、Trempe、G.、分担執筆、Fogh、J.編、Human tumor cell in vitro(ニューヨーク、Plenum社刊)、115−119頁、1976年 Fogh、J.ら、J.Nat.Cancer Inst.41巻、209−214頁、1977年
2種類のヒト肝芽細胞腫細胞株HepG2(非特許文献23および24)およびHuh6(非特許文献25)と、5種類の肝細胞性癌細胞株Huh7(非特許文献25)、HA22T(非特許文献26)、PLC/PRF/5(非特許文献19)、Hep3BおよびSk−Hep1(非特許文献23、27および28)とが本研究に用いられた。これらの細胞は、5%CO2の加湿インキュベーター中で、10%の熱非動化ウシ胎児血清(ハイクローン(HyClone)、ユタ州、ローガン)と、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、非必須アミノ酸(0.1mM)、ファンジゾン(fungizone、2.5mg/ml)およびL−グルタミン(2mM)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(GIBCO−BRL、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド)で培養された。
Aden、D.P.ら、Nature、282巻、615−616頁、1979年 Javitt、N.B.、FASEB J.、4巻、161−168頁、1990年 Nakabayashi、H.ら、Cancer Res.42巻、3858−3862頁、1982年 Chang、C.ら、Mol.Cell.Biol.3巻、1133−1137頁、1983年 Fogh、J.、Trempe、G.、分担執筆、Fogh、J.編、Human tumor cell in vitro(ニューヨーク、Plenum社刊)、115−119頁、1976年 Fogh、J.ら、J.Nat.Cancer Inst.41巻、209−214頁、1977年
1.8.GNMTモノクローナル抗体をスクリーニングするための酵素免疫アッセイ(EIA)
EIA法は、上記の免疫された動物の抗体力価を監視するためと、異なるハイブリドーマの上清中のモノクローナル抗体をスクリーニングするためとに用いられた。濃度1μg/ml(ウェルあたり100μl)のGST−GNMTまたはGNMT−Hisのいずれかでコーティングされた96穴プレートが用いられた。ウサギまたはマウスの血清の抗体力価は、10倍希釈系列で決定された。GST−GNMT組み換えタンパク質で免疫された動物由来のハイブリドーマをスクリーニングするために、GSTでコーティングされたEIAプレートがGSTと反応するモノクローナル抗体を除外するために用いられた。
EIA法は、上記の免疫された動物の抗体力価を監視するためと、異なるハイブリドーマの上清中のモノクローナル抗体をスクリーニングするためとに用いられた。濃度1μg/ml(ウェルあたり100μl)のGST−GNMTまたはGNMT−Hisのいずれかでコーティングされた96穴プレートが用いられた。ウサギまたはマウスの血清の抗体力価は、10倍希釈系列で決定された。GST−GNMT組み換えタンパク質で免疫された動物由来のハイブリドーマをスクリーニングするために、GSTでコーティングされたEIAプレートがGSTと反応するモノクローナル抗体を除外するために用いられた。
さらに、GNMT−His組み換えタンパク質で免疫された動物由来のハイブリドーマをスクリーニングするため、GNMT−Hisでコーティングされたプレートでスクリーニングされた陽性クローンを確認するのにGST−GNMTでコーティングされたプレートが用いられた。ウサギ抗GNMT抗血清(R4)と複数のマウス抗GNMT抗血清が前記EIA法の陽性対照として用いられた。上記の手法の詳細は以前に説明されている(非特許文献29)。
Chen、Y.M.ら、J.Immunol.147巻、2368−2376頁、1991年
Chen、Y.M.ら、J.Immunol.147巻、2368−2376頁、1991年
1.9.IgGのEIA定量キットによるモノクローナル抗体のIgG濃度の決定
モノクローナル抗体の濃度はマウスIgGのEIA定量キット(ベチル・ラボラトリー(Bethyl laboratory)、米国、テキサス州、モンゴメリー)により決定され、免疫グロブリン濃度は4パラメータロジスティック回帰仕様のEIA EIX808リーダー(バイオテック(Bio−Tek instruments、米国、バーモント州、ウィノスキー(Winooski))を用いて解析された。。アイソタイプ決定および軽鎖決定は、マウス免疫グロブリンアイソタイピングELISAキット(BDバイオサイエンシズ ファーミンゲン、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ)を用いて行われた。
モノクローナル抗体の濃度はマウスIgGのEIA定量キット(ベチル・ラボラトリー(Bethyl laboratory)、米国、テキサス州、モンゴメリー)により決定され、免疫グロブリン濃度は4パラメータロジスティック回帰仕様のEIA EIX808リーダー(バイオテック(Bio−Tek instruments、米国、バーモント州、ウィノスキー(Winooski))を用いて解析された。。アイソタイプ決定および軽鎖決定は、マウス免疫グロブリンアイソタイピングELISAキット(BDバイオサイエンシズ ファーミンゲン、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ)を用いて行われた。
モノクローナル抗体の特徴付け
2.1.M13ファージペプチドディスプレイ法によるエピトープマッピング
抗体は0.1M NaHCO3(pH8.6)で100μg/mlの濃度に希釈され、5mlの無菌ポリスチレンペトリディッシュに添加された。保湿容器内で終夜4°Cでコーティングした後、上記のプレートはブロッキングバッファー(0.1M NaHCO3 pH8.6、5mg/ml BSA、0.02% NaN3、無菌フィルター処理、4°C保存)でブロッキングされ、4°Cで少なくとも1時間インキュベーションされた。マイナー・コートタンパク質(pIII)のN末端にランダムなヘプタペプチドをディスプレイするM13ファージが用いられた(Ph.D.−7TMファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリ、ニュー・イングランド・バイオラブ社、米国、マサチューセッツ州、ビバリー(Beverly))。特異的に結合したファージの選択は製造者の指示書に従って行われた。選ばれたファージ由来の5’末端ヌクレオチドが配列決定され、エンコードされたペプチドが表1に示すとおり推定された(非特許文献30)。
Cortese、R.ら、Curr.Opin.Biotech.7巻、616−621頁、1996年
2.1.M13ファージペプチドディスプレイ法によるエピトープマッピング
抗体は0.1M NaHCO3(pH8.6)で100μg/mlの濃度に希釈され、5mlの無菌ポリスチレンペトリディッシュに添加された。保湿容器内で終夜4°Cでコーティングした後、上記のプレートはブロッキングバッファー(0.1M NaHCO3 pH8.6、5mg/ml BSA、0.02% NaN3、無菌フィルター処理、4°C保存)でブロッキングされ、4°Cで少なくとも1時間インキュベーションされた。マイナー・コートタンパク質(pIII)のN末端にランダムなヘプタペプチドをディスプレイするM13ファージが用いられた(Ph.D.−7TMファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリ、ニュー・イングランド・バイオラブ社、米国、マサチューセッツ州、ビバリー(Beverly))。特異的に結合したファージの選択は製造者の指示書に従って行われた。選ばれたファージ由来の5’末端ヌクレオチドが配列決定され、エンコードされたペプチドが表1に示すとおり推定された(非特許文献30)。
Cortese、R.ら、Curr.Opin.Biotech.7巻、616−621頁、1996年
結果は、モノクローナル抗体GRL1が配列DFKPYKP(配列番号1)および変性配列(degenerate sequence)に特異的に結合することを示す。
結果は、モノクローナル抗体GRL7がコンセンサス配列SLGVAA(配列番号2)および変性配列に特異的に結合することを示す。
2.2.GNMTのバイオセンサー表面への結合
カルボキシメチルデキストラン(CMD)サンプル用キュベットはテルモ・ラブシステムズ(Thermo Labsystems)から購入された。初期の実験では、コーティングの条件はpHに関して最適化された。前記表面は、pH4から6までの範囲で0.5単位ごとのステップのpHの10mM酢酸ナトリウムバッファーに6分間平衡化された。同一のバッファー中の9μgの(トロンビン切断された)ヒトGNMT組み換えタンパク質のサンプルが前記キュベットに添加された。テストするために、最適化されたpH条件が作成された。前記デキストランの負に荷電したカルボキシル基と正に荷電したタンパク質との間の静電引力による前記組み換えタンパク質のキュベットへの結合は6分間行われた。最適化された応答は、図3Aに示すとおり、pH5.0の10mM酢酸ナトリウムバッファーの条件下で起こった。トロンビンで切断された9μgのGNMTが、図3Bに示される1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(1−ethyl−3− (3−dimethylaminopropyl) carbodiimide、EDC)/N−ヒドロキシスクシニミド(N−hydroxysuccinimide、NHS)法によって、最適化されたpH条件下の10mM酢酸ナトリウムバッファー中で前記CMD表面キュベットをコーティングするために用いられた。
カルボキシメチルデキストラン(CMD)サンプル用キュベットはテルモ・ラブシステムズ(Thermo Labsystems)から購入された。初期の実験では、コーティングの条件はpHに関して最適化された。前記表面は、pH4から6までの範囲で0.5単位ごとのステップのpHの10mM酢酸ナトリウムバッファーに6分間平衡化された。同一のバッファー中の9μgの(トロンビン切断された)ヒトGNMT組み換えタンパク質のサンプルが前記キュベットに添加された。テストするために、最適化されたpH条件が作成された。前記デキストランの負に荷電したカルボキシル基と正に荷電したタンパク質との間の静電引力による前記組み換えタンパク質のキュベットへの結合は6分間行われた。最適化された応答は、図3Aに示すとおり、pH5.0の10mM酢酸ナトリウムバッファーの条件下で起こった。トロンビンで切断された9μgのGNMTが、図3Bに示される1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(1−ethyl−3− (3−dimethylaminopropyl) carbodiimide、EDC)/N−ヒドロキシスクシニミド(N−hydroxysuccinimide、NHS)法によって、最適化されたpH条件下の10mM酢酸ナトリウムバッファー中で前記CMD表面キュベットをコーティングするために用いられた。
2.3.IAsysアフィニティセンサーを用いる解離定数の決定
2.3.1.モノクローナル抗体のKdの決定
GNMTの不動化につづいて、PBST/ツイーン20(PBST)の基線が確立され、前記キュベットの撹拌速度が全ての反応について100rpmで一定に維持された。2倍希釈系列(200μlのPBST)の培養上清由来のモノクローナル抗体が前記キュベットに添加され、応答が図4A、Bに示すとおり、IAsys制御ソフトウェア3.01を用いて測定された。結合データの速度論的な解析は、IAsys用に設計された曲線適合速度論解析ソフトウェアFASTfit(テルモ・ラボシステムズ、アフィニティセンサー部門、英国、ケンブリッジ)を用いて実行され、以下の非特許文献31に記載のとおりKdが決定された。
Morgan、C.L.ら、J.Immunol.Methods、217巻、51−60頁、1998年
2.3.1.モノクローナル抗体のKdの決定
GNMTの不動化につづいて、PBST/ツイーン20(PBST)の基線が確立され、前記キュベットの撹拌速度が全ての反応について100rpmで一定に維持された。2倍希釈系列(200μlのPBST)の培養上清由来のモノクローナル抗体が前記キュベットに添加され、応答が図4A、Bに示すとおり、IAsys制御ソフトウェア3.01を用いて測定された。結合データの速度論的な解析は、IAsys用に設計された曲線適合速度論解析ソフトウェアFASTfit(テルモ・ラボシステムズ、アフィニティセンサー部門、英国、ケンブリッジ)を用いて実行され、以下の非特許文献31に記載のとおりKdが決定された。
Morgan、C.L.ら、J.Immunol.Methods、217巻、51−60頁、1998年
3.1.ウェスタンブロッティング法アッセイ(WB)
ウェスタンブロッティング法がGNMTに対するモノクローナル抗体の確認に用いられた。GST−GNMT(サイズ58kd)、His−GNMT(サイズ37.4kd)およびGST(サイズ26kd)という3種類の組み換えタンパク質と、ヒトおよびマウスの肝臓タンパク質とがウェスタンブロッティングの抗原として用いられた。ストリップ実験において、モノクローナル抗体GRL1、GRL7およびR4、正常マウス血清および未免疫ウサギ血清のインキュベーションの後、前記ストリップは洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(シグマ)と反応させられた。最後に、得られた血清は3,3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液(ザイメッド・ラボラトリーズ社(Zymed Laboratories Inc)、米国、カリフォルニア州)で発色させた。ニトロセルロース膜の実験では、モノクローナル抗体GRL1およびGRL7、抗βアクチン(シグマ)のインキュベーションの後、前記膜は洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(シグマ)と反応され、最後に以下の非特許文献32に記載のとおりECL試薬(アマシャム)で発光させた。結果は図5A、Bに示された。
Chen、Y.M.ら、Hepatology、8巻、547−552頁、1988年
ウェスタンブロッティング法がGNMTに対するモノクローナル抗体の確認に用いられた。GST−GNMT(サイズ58kd)、His−GNMT(サイズ37.4kd)およびGST(サイズ26kd)という3種類の組み換えタンパク質と、ヒトおよびマウスの肝臓タンパク質とがウェスタンブロッティングの抗原として用いられた。ストリップ実験において、モノクローナル抗体GRL1、GRL7およびR4、正常マウス血清および未免疫ウサギ血清のインキュベーションの後、前記ストリップは洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(シグマ)と反応させられた。最後に、得られた血清は3,3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液(ザイメッド・ラボラトリーズ社(Zymed Laboratories Inc)、米国、カリフォルニア州)で発色させた。ニトロセルロース膜の実験では、モノクローナル抗体GRL1およびGRL7、抗βアクチン(シグマ)のインキュベーションの後、前記膜は洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(シグマ)と反応され、最後に以下の非特許文献32に記載のとおりECL試薬(アマシャム)で発光させた。結果は図5A、Bに示された。
Chen、Y.M.ら、Hepatology、8巻、547−552頁、1988年
3.2.GNMTに対する抗体による免疫組織化学
肝細胞性癌患者由来の腫瘍性および非腫瘍性の肝臓組織の2セットがモノクローナル抗体およびR4での免疫組織化学的手法に用いられた。第1のセットは13個の非腫瘍性組織および9個の腫瘍性組織(7対)を含み、第2のセットは13個の非腫瘍性組織および16個の腫瘍性組織(9対)を含む。前記癌組織および非癌組織の標本の全ては病理学的検査により確認され、表2A、Bに示された。パラフィンに固定された組織ブロックは6μm厚の切片に薄切され、脱パラフィン処理され、内在性ペロキシダーゼ反応を消去するために蒸留水中に過酸化水素を3%含む溶液中に5分間浸漬された。1次抗体であるモノクローナル抗体GRL1(腹水の1:100希釈)またはモノクローナル抗体GRL7(腹水の1:25希釈)またはR4(1:200希釈)が前記組織に適用された。調製済みのビオチン化2次抗体前記1次抗体と結合するために適用された。ストレプトアビジン−ペロキシダーゼのコンジュゲートが、図6に示すとおり同一の組織のスライドに適用された(HistoST5050検出キット、ザイメッド・ラボラトリーズ)。ペロキシダーゼの存在は非特許文献5に記載のとおり発色用の3、3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液の添加により明らかにされた。
肝細胞性癌患者由来の腫瘍性および非腫瘍性の肝臓組織の2セットがモノクローナル抗体およびR4での免疫組織化学的手法に用いられた。第1のセットは13個の非腫瘍性組織および9個の腫瘍性組織(7対)を含み、第2のセットは13個の非腫瘍性組織および16個の腫瘍性組織(9対)を含む。前記癌組織および非癌組織の標本の全ては病理学的検査により確認され、表2A、Bに示された。パラフィンに固定された組織ブロックは6μm厚の切片に薄切され、脱パラフィン処理され、内在性ペロキシダーゼ反応を消去するために蒸留水中に過酸化水素を3%含む溶液中に5分間浸漬された。1次抗体であるモノクローナル抗体GRL1(腹水の1:100希釈)またはモノクローナル抗体GRL7(腹水の1:25希釈)またはR4(1:200希釈)が前記組織に適用された。調製済みのビオチン化2次抗体前記1次抗体と結合するために適用された。ストレプトアビジン−ペロキシダーゼのコンジュゲートが、図6に示すとおり同一の組織のスライドに適用された(HistoST5050検出キット、ザイメッド・ラボラトリーズ)。ペロキシダーゼの存在は非特許文献5に記載のとおり発色用の3、3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液の添加により明らかにされた。
注記 a モノクローナル抗体GRL1およびGRL7(腹水)の希釈倍率はそれぞれ1:100および1:25であった。
3.3.血清および血漿GNMT定量EIA法の確立
3.3.1患者および正常血清
台北市ジェン・アイ(Jen−Ai)病院からの血清または血漿サンプル合計545サンプルが2000年8月から2002年2月までの間に我々の研究室で収集されたが、このうち413サンプルは健常者由来で、90サンプルはウイルス性の慢性肝炎患者由来で、20サンプルは病理学的方法により肝硬変と診断された患者由来で、22サンプルは生理学的、超音波的および病理学的方法により確認された肝細胞性癌患者由来であった。
3.3.1患者および正常血清
台北市ジェン・アイ(Jen−Ai)病院からの血清または血漿サンプル合計545サンプルが2000年8月から2002年2月までの間に我々の研究室で収集されたが、このうち413サンプルは健常者由来で、90サンプルはウイルス性の慢性肝炎患者由来で、20サンプルは病理学的方法により肝硬変と診断された患者由来で、22サンプルは生理学的、超音波的および病理学的方法により確認された肝細胞性癌患者由来であった。
3.3.2.GNMT定量酵素免疫アッセイ(EIA)法
非特許文献血清および血漿中のGNMT濃度は間接EIA法で測定された。簡潔には、96穴プレート(コースター(Costar)3590、96穴アッセイプレート、米国、ニューヨーク州、コーニング)が、ウェルあたり0.1μl(濃度7.13mg/mL)の0.02M炭酸ナトリウムバッファー(pH9.6)中の硫安沈殿されたウサギ抗GNMT血清(R4)で37°C1時間コーティングされた。ウェルは5%スキムミルク添加TBS(50mMトリス、0.14M NaCl)で37°C2時間ポスト・コーティングされた。標準およびサンプルはサンプル希釈液(0.05ツイーン−20および1%BSA添加TBS)に添加された。プレートは500ng/mlから7.8ng/mlまでの標準の2倍希釈と、血清サンプルの2倍希釈とを37°C1時間添加された。ヤギ抗マウスペロキシダーゼ1:3000倍希釈が37°C1時間前記プレートに添加された。洗浄後OPDが添加され、室温30分間反応させた。反応は100μlの3M H2SO4を添加して停止させた。490nmの吸光度はEIAリーダーのBioTek Elx808によって測定された。標準の結果は2−パラメーターロジスティック曲線当て嵌め法により計算され、血清サンプルの濃度に外挿された。
非特許文献血清および血漿中のGNMT濃度は間接EIA法で測定された。簡潔には、96穴プレート(コースター(Costar)3590、96穴アッセイプレート、米国、ニューヨーク州、コーニング)が、ウェルあたり0.1μl(濃度7.13mg/mL)の0.02M炭酸ナトリウムバッファー(pH9.6)中の硫安沈殿されたウサギ抗GNMT血清(R4)で37°C1時間コーティングされた。ウェルは5%スキムミルク添加TBS(50mMトリス、0.14M NaCl)で37°C2時間ポスト・コーティングされた。標準およびサンプルはサンプル希釈液(0.05ツイーン−20および1%BSA添加TBS)に添加された。プレートは500ng/mlから7.8ng/mlまでの標準の2倍希釈と、血清サンプルの2倍希釈とを37°C1時間添加された。ヤギ抗マウスペロキシダーゼ1:3000倍希釈が37°C1時間前記プレートに添加された。洗浄後OPDが添加され、室温30分間反応させた。反応は100μlの3M H2SO4を添加して停止させた。490nmの吸光度はEIAリーダーのBioTek Elx808によって測定された。標準の結果は2−パラメーターロジスティック曲線当て嵌め法により計算され、血清サンプルの濃度に外挿された。
3.3.3.統計解析
統計解析はSPSS統計ソフトウェア(SPSS社、イリノイ州、シカゴ)を用いて行われた。一元配置分散分析が、正常、慢性肝炎患者、肝硬変患者および肝細胞性癌患者という4つのグループの血清中のGNMTタンパク質濃度の違いの統計的有意性を決定するために実行された。p値が0.5付近の場合に多重比較(post hoc test)が用いられ、LSDが図7に示されるグループ間の有意性を証明するために用いられた。
統計解析はSPSS統計ソフトウェア(SPSS社、イリノイ州、シカゴ)を用いて行われた。一元配置分散分析が、正常、慢性肝炎患者、肝硬変患者および肝細胞性癌患者という4つのグループの血清中のGNMTタンパク質濃度の違いの統計的有意性を決定するために実行された。p値が0.5付近の場合に多重比較(post hoc test)が用いられ、LSDが図7に示されるグループ間の有意性を証明するために用いられた。
引用文献
1.Aden DP、Fogel H、Plotkin S、Damjanov I、Knowles BB、Nature、282巻、615−616頁、1979年
2.Bork P、Ouzounis C、Sander C、Scharf M、Schneider R、Sonnhammer E、Protein Sci.、1巻、1677−1690頁、1992年
3.Chang C、Lin Y、O−Lee T、Chou C、Lee T、Liu T、P’Eng F、Chen T、Hu C、Mol.Cell.Biol.、3巻、1133−1137頁、1983年
4.Chen SY、Wong FH、Lin JR、Liu TY、Lin CH、Lin PP、Hsieh JT、Chen YM、「ベンゾ[a]ピレン解毒経路における発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの機能的特徴付け(Functional characterization of a putative tumor susceptibility gene−GNMT in the Benzo[a]pyrene− detoxification pathway)」、(投稿中)
5.Chen YM、Hu CP、Chen PH、Chu MH、Tsai YT、Lee SD、Chang CM、Hepatology、8巻、547−552頁、1988年
6.Chen YM、Shiu JY、Tzeng SJ、Shih LS、Chen YJ、Lui WY、Chen PH、Int.J.Cancer、75巻、787−793頁、1998年
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14.Guan KL、Dixon JE、Anal.Biochem.、192巻、262−267頁、1991年
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21.Lai MC、Yang DR、Chuang MJ、Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.、(予稿I17)、ワシントンDC、1999年b
22.Luka Z、Cerone R、III、Phillips JA、Mudd HS, Wagner C、Hum.Genet.、110巻、68−74頁、2002年
23.Morgan CL、Newman DJ、Burrin JM、Price CP、J.Immunol.Methods、217巻、51−60頁、1998年
24.Mudd SH、Cerone R、Schiaffino MC、Fantasia AR、Minniti G、Caruso U、Lorini R、Watkins D、Matiaszuk N、Rosenblatt DS、Schwahn B、Rozen R、LeGros L、Kotb M、Capdevila A、Luka Z、Finkelstein JD、Tangerman A、Stabler SP、Allen RH、Wagner C、J.Inherit.Metab.Dis.24巻、448−64頁、2001年
25.Nakabayashi H、Taketa K、Miyano K、Yamane T、Sato J、Cancer Res.、42巻、3858−3862頁、1982年
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27.Ogawa H、Gom T、Fujioka M、Comp.Biochem.Phys.B、106巻、601−611頁、1993年
28.Ogawa H、Gomi T、Takusagawa F、Fujioka M、Int.J.Biochem.Cell.B、30巻、13−26頁、1998年
29.Raha A、Wagner C、MacDonald RG、Bresnick E、J.Biol.Chem.269巻、5750−5756頁、1994年
30.Tseng TL、Shih YP、Huang YC、Wang CK、Chen PH、Chang JG、Yeh KT、Struewing JP、Chen YM、Buetow KH、「発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの遺伝子型および表現型の特徴付け(Genotypic and Phenotypic Characterization of a Putative Tumor Susceptibility Gene, GNMT)」、Liver Cancer、(投稿中)
31.Zhang YJ、Chen CJ、Haghighi B、Yang GY、Hsieh LL、Wang LW、Santella RM、Cancer Res.51巻、1720−1725頁、1991年
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28.Ogawa H、Gomi T、Takusagawa F、Fujioka M、Int.J.Biochem.Cell.B、30巻、13−26頁、1998年
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30.Tseng TL、Shih YP、Huang YC、Wang CK、Chen PH、Chang JG、Yeh KT、Struewing JP、Chen YM、Buetow KH、「発癌感受性遺伝子と推定されるGNMTの遺伝子型および表現型の特徴付け(Genotypic and Phenotypic Characterization of a Putative Tumor Susceptibility Gene, GNMT)」、Liver Cancer、(投稿中)
31.Zhang YJ、Chen CJ、Haghighi B、Yang GY、Hsieh LL、Wang LW、Santella RM、Cancer Res.51巻、1720−1725頁、1991年
配列表の配列番号1:ヒト(Homo sapiens)
配列表の配列番号2:ヒト(Homo sapiens)
配列表の配列番号2:ヒト(Homo sapiens)
Claims (16)
- グリシンNメチルトランスフェラーゼ(GNMT)の状態のレベルの検出方法であって、(a)生物学的サンプルを用意すること、(b)GRL1ハイブリドーマ細胞(PTA−5191)又はGRL7ハイブリドーマ細胞(PTA−5319)から産生されるモノクローナル抗体を用意すること、(c)前記サンプルを前記モノクローナル抗体に接触させること、および(d)前記サンプル中のGNMTのレベルを決定することによる、検出方法。
- 前記生物学的サンプルは、血液全体、血清、血漿および組織からなるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルは、肝癌、前立腺癌、乳癌および腎臓癌からなるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
- GRL1ハイブリドーマ細胞(PTA−5191)のグリシンNメチルトランスフェラーゼ抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項4に記載の抗体。
- 配列番号1がヒトGNMTのアミノ酸配列の272から278番までのアミノ酸残基である、請求項5に記載の抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項6に記載の抗体。
- 配列番号2はヒトGNMTのアミノ酸配列の10から15番までのアミノ酸残基である、請求項7に記載の抗体。
- GRL7ハイブリドーマ細胞(PTA−5319)のグリシンNメチルトランスフェラーゼ抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項6に記載の抗体。
- 配列番号1はヒトGNMTのアミノ酸配列の272から278番までのアミノ酸残基である、請求項10に記載の抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項11に記載の抗体。
- 配列番号2はヒトGNMTのアミノ酸配列の10から15番までのアミノ酸残基である、請求項12に記載の抗体。
- GRL1ハイブリドーマ細胞(PTA−5191)から分泌される少なくとも1の抗体を含む、サンプル中のGNMTのレベルを決定するためのキット。
- 2以上の抗体を含む、請求項14に記載のキット。
- GRL7ハイブリドーマ細胞(PTA−5319)から分泌される抗体を含む、請求項15に記載のキット。
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JP2010537170A (ja) * | 2007-08-16 | 2010-12-02 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 前立腺癌の代謝プロファイリング法 |
WO2022039348A1 (ko) * | 2020-08-18 | 2022-02-24 | 서울대학교 산학협력단 | 13c 또는 2h 동위원소로 표지된 글라이신을 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물 |
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- 2003-12-05 JP JP2003407591A patent/JP2005162714A/ja active Pending
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KR102379017B1 (ko) | 2020-08-18 | 2022-03-28 | 서울대학교 산학협력단 | 13c 또는 2h 동위원소로 표지된 글라이신을 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물 |
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