JP2005117911A

JP2005117911A - Method for producing chloroperoxidase

Info

Publication number: JP2005117911A
Application number: JP2003353726A
Authority: JP
Inventors: Kiichi Higashimura; 紀一東村; Keiichiro Kai; 慶一郎甲斐; Toshihiro Oikawa; 利洋及川
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2003-10-14
Filing date: 2003-10-14
Publication date: 2005-05-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a protein useful for improvement research of an enzyme, industrially practicable and having a chloroperoxidase activity. <P>SOLUTION: A recombinant plasmid comprising a gene of the protein having a base sequence with a reduced GC (guanine-cytosine) content of a DNA region ranging from the 5'-terminus to at least 30 bases of a structural gene of the chloroperoxidase by substitution, deletion or insertion of the DNA region and the chloroperoxidase activity is prepared. A host microorganism is transformed with the recombinant plasmid to afford a transformed microorganism. The resultant transformed microorganism is cultured to thereby produce the protein having the chloroperoxidase activity. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、酸化反応を産業上実用的に実現するために重要なクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子および該遺伝子で形質転換された形質転換微生物を培養することによる該酵素の生産方法に関する。本発明は更に、該生産方法により生産された該酵素による化学反応がアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体からのハロゲン化もしくはハロヒドリン化合物を得るための反応に関する。 The present invention relates to a gene encoding a protein having a chloroperoxidase activity that is important for practically realizing an oxidation reaction industrially and the enzyme produced by culturing a transformed microorganism transformed with the gene. It relates to the production method. The present invention further relates to a reaction for obtaining a halogenated or halohydrin compound from an alkene, alkyne, cyclopropane, β-diketone, phenol derivative, aniline derivative by a chemical reaction by the enzyme produced by the production method.

クロロペルオキシダ−ゼの起源としては、ヘム型である海洋性糸状細菌Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓｆｕｍａｇｏ、および、非ヘム型である糸状菌Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｖｅｒｃｕｒｒｏｓａ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘが報告されている。それらに由来するクロロペルオキシダ−ゼの物理化学的特性、生化学的特性、アミノ酸配列、ＤＮＡ配列などが報告されている（Ｓ．Ｌ．Ｎｅｉｄｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,ＢａｓｉｃＲｏｌｅｓａｎｄＡｐｐｒｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｌｉｓ
ＨｏｒｗｏｏｄＬｉｍｉｔｅｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ．，１９８６、Ｔ．Ｅ．Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２（２），３２９−３３３，１９８７、ＷＯ９７／０４１０２）。また、クロロペルオキシダ−ゼによる工業的試みに関してＣａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓｆｕｍａｇｏ由来クロロペルオキシダ−ゼによるプロピレンオキサイド生産に関して報告されている（米国特許第９１４３８４号公報）。 The origins of chloroperoxidase include heme-type marine filamentous bacterium Caldariomyces fumago and non-heme-type filamentous fungus Curvularia
inaequalis, Curvularia vercurrosa, and Curvularia fallax have been reported. Physicochemical properties, biochemical properties, amino acid sequences, DNA sequences, and the like of chloroperoxidases derived from them have been reported (SL Neidman et al., Biohalogenation: Principles, Basic Roles and Applications, Ellis
Horwood Limited, England. 1986, T.A. E. Liu et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (2), 329-333, 1987, WO 97/04102). In addition, regarding industrial attempts by chloroperoxidase, there has been a report regarding propylene oxide production by chloroperoxidase derived from Caldariomyces fumago (US Pat. No. 914384).

しかしながら、これまでに報告のあったヘム型のクロロペルオキシダ−ゼの酵素安定性はかならずしも高くない。Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓｆｕｍａｇｏ由来のクロロペルオキシダ−ゼも含めてヘム型の酵素は反応溶液中に活性な分子状ハロゲンを生成することにより、酵素自信が簡単に活性を失うことにより、産業上あまり有用性がないことが認められている。（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８(1)，２８２-２８９，１９８７）また、非ヘム型であるクロロペルオキシダ−ゼについても産業上応用された報告は認められない。学術的、及び特許出願としていくつかの報告がみられるのみである。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｖｅｒｃｕｒｒｏｓａ由来のクロロペルオキシダ−ゼが報告されているが、その報告の中のこれらのクロロペルオキシダ−ゼの発現方法は、酵母細胞、糸状菌細胞を用いた方法であり産業上の実用性において必ずしも十分なものではない。（ＷＯ９７／０４１０２、ＷＯ９５／２７０４６）ＷＯ９５／２７０４６では、発現したクロロペルオキシダ−ゼは酵母細胞内に蓄積される為、細胞から抽出しなければならない。一般に酵母細胞は細胞壁の破壊をせねばならず目的の蛋白質の抽出が困難である欠点を有する。ＷＯ９７／０４１０２では、糸状菌によるクロロペルオキシダ−ゼの発現を行っており、大腸菌などの産業的によく用いられている微生物に比較し培養期間が４日間以上と非常に長い欠点を有する。更に、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来クロロペルオキシダ−ゼにおいては、大腸菌による蛋白質発現についてふれられているが、既報の報告者らの発現系により分離されるクロロペルオキシダ−ゼは非常に少ないものであり、組換え酵素の深い解析を妨げたと記述されており、実際の研究報告には、酵母を用いた発現系を使用していた。（Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａｅｔａｌ．，Ｊ.ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９）つまり、酵素の改良研究に使用する程度の少量の大腸菌による発現系すら存在しておらず、まして、大腸菌による産業上実用的なクロロペルオキシダ−ゼを供給する生産方法などまったく報告されていなかった。これらの報告から大腸菌を含めた微生物におけるクロロペルオキシダ−ゼの高生産方法が望まれていた。
ＷＯ９７／０４１０２ＵＳ９１４３８４ＷＯ９５／２７０４６Ｓ．Ｌ．Ｎｅｉｄｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,ＢａｓｉｃＲｏｌｅｓａｎｄＡｐｐｒｉｃａｔｉｏｎｓ，ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄＬｉｍｉｔｅｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ．，１９８６Ｔ．Ｅ．Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２（２），３２９−３３３，１９８７Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８(1)，２８２-２８９，１９８７Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａｅｔａｌ．，Ｊ.ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９ However, the enzyme stability of heme-type chloroperoxidase reported so far is not necessarily high. Heme-type enzymes, including chloroperoxidase from Caldariomyces fumago, are not very useful in industry due to the formation of active molecular halogens in the reaction solution, and the enzyme's confidence is easily lost. It is recognized that (Biochemistry, 28 (1), 282-289, 1987) In addition, no industrially applied report has been found on chloroperoxidase, which is a non-heme type. There are only a few reports on academic and patent applications. Although chloroperoxidases derived from Curvularia inaequalis, Curvularia vercurrosa have been reported, the expression method of these chloroperoxidases in the report is a method using yeast cells and filamentous fungi cells and is industrially This is not always sufficient for practical use. (WO97 / 04102, WO95 / 27046) In WO95 / 27046, the expressed chloroperoxidase accumulates in yeast cells and must be extracted from the cells. In general, yeast cells have the disadvantage that cell walls must be destroyed and extraction of the target protein is difficult. In WO97 / 04102, chloroperoxidase is expressed by filamentous fungi, and has a disadvantage that the culture period is as long as 4 days or more compared to industrially used microorganisms such as Escherichia coli. Furthermore, in the chloroperoxidase derived from Curvularia inaequalis, protein expression by Escherichia coli is mentioned. However, the chloroperoxidase separated by the reported reporter's expression system is very small. It was described that it hindered the deep analysis of the enzyme, and the actual research report used an expression system using yeast. (W. Hemrika et al., J. Biological Chemistry, 274 (34), 23820-23827, 1999) That is, even an expression system with a small amount of E. coli sufficient to be used for enzyme improvement studies does not exist, No production method for supplying industrially practical chloroperoxidase using E. coli has been reported. From these reports, a high production method of chloroperoxidase in microorganisms including E. coli has been desired.
WO97 / 04102 US914384 WO95 / 27046 S. L. Neidman et al. Biohalogenation: Principles, Basic Roles and Applications, Elis Horwood Limited, England. , 1986 T.A. E. Liu et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (2), 329-333, 1987. Biochemistry, 28 (1), 282-289, 1987 W. Hemrika et al. , J. Biological Chemistry, 274 (34), 23820-23827, 1999.

本発明の課題は、酵素の改良研究および産業上実用的なクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を供給する生産方法を提供することにあり、本発明のその他の課題は、本生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とする化学反応による化合物を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a production method for supplying a protein having chloroperoxidase activity that is practical for industrial improvement and an enzyme, and the other object of the present invention is to produce by this production method. Another object of the present invention is to provide a compound by a chemical reaction catalyzed by a protein having a chloroperoxidase activity.

本発明の目的は、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の有効な高生産方法を提供することであり、その一つとして、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼについて活性を保持した状態の酵素蛋白質を提供する方法を提供すること、また該酵素蛋白質の遺伝子を提供すること、該酵素蛋白質の遺伝子を含有するプラスミドを提供すること、該プラスミドで形質転換された大腸菌を含む形質転換微生物、該大腸菌を含む形質転換微生物を使用したクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an effective and high production method of a protein having chloroperoxidase activity, and as one of them, the activity of chloroperoxidase derived from Curvularia fallax (IFO8885) is retained. Providing a method for providing an enzyme protein in a state, providing a gene for the enzyme protein, providing a plasmid containing the gene for the enzyme protein, transformation comprising E. coli transformed with the plasmid An object of the present invention is to provide a method for producing a protein having chloroperoxidase activity using a microorganism and a transformed microorganism containing the Escherichia coli.

本発明のその他の目的は、該生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とした化学反応によりアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体からのハロゲン化もしくはハロヒドリン化化合物を提供することにある。 Another object of the present invention is to provide an alkene, alkyne, cyclopropane, β-diketone, phenol derivative, aniline derivative by a chemical reaction catalyzed by a protein having a chloroperoxidase activity produced by the production method. It is to provide a halogenated or halohydrinated compound.

本発明者らは上記課題を解決すべく、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼについて、産業上実用性が高い大腸菌による生産方法を鋭意検討した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors diligently studied a method for producing chloroperoxidase derived from Curvularia fallax (IFO8885) using Escherichia coli having high industrial utility.

大腸菌による生産方法の有効性を確認するには、検討した大腸菌の発現するクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を確認することが必要である。その方法は、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子を含むプラスミドを構築し、該プラスミドで形質転換された大腸菌を分離し、さらに得られた形質転換微生物を培養して、クロロペルオキシダ−ゼの総活性を測定するという一連の行程よりなる。 In order to confirm the effectiveness of the production method using E. coli, it is necessary to confirm the protein having the chloroperoxidase activity expressed by the examined E. coli. In the method, a plasmid containing a chloroperoxidase gene derived from Curvularia fallax (IFO8885) is constructed, E. coli transformed with the plasmid is isolated, and the resulting transformed microorganism is cultured, It consists of a series of steps to measure the total activity of the doze.

本発明者らは、大腸菌でクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産のため、糸状菌由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をＤＮＡ塩基配列を変化させずに大腸菌発現ベクタ−に導入し発現を試みた。しかし、この方法では、Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａｅｔ
ａｌ．，Ｊ.ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９の報告と同様に検出感度の鋭敏なフェノ−ルレッド検定法によっても微量な発色しか認められなかった。 In order to produce a protein having chloroperoxidase activity in Escherichia coli, the present inventors introduced a chloroperoxidase structural gene derived from a filamentous fungus into an E. coli expression vector without changing the DNA base sequence. Tried. However, with this method, W. Hemrika et al.
al. As described in J. Biological Chemistry, 274 (34), 23820-23827, 1999, only a very small amount of color was observed by the phenol red assay with a sensitive detection sensitivity.

Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子は、全体としてＧＣ含量が高い、構造遺伝子のＮ末端開始１０アミノ部分においてはＧＣ含量が６０％であり、単独のＧ，Ｃ塩基の他、ＧＧＧＧ塩基配列を有する箇所が１箇所、ＣＣＣ塩基配列を有する場所が２箇所、ＣＣＣＣ塩基配列を有する箇所が１箇所存在している。これらの配列によるＮ末端開始部位の２次構造の形成しやすさが、目的遺伝子の転写、翻訳に影響を及ぼして発現を抑制することが大きな要因ではないかと考えた。生来のアミノ酸配列の蛋白質を生産することを目的として、アミノ酸配列を変えることなしに構造遺伝子の２次構造を形成しにくくする為にＧＣ塩基配列の含量を低減させるアミノ酸コドンへの改良がよいという仮設を立て、これを検証した。その結果、Ｎ末端の２、６、７、１０番目のアミノ酸についてＧＣ含量を低減させたアミノ酸コドンへ改良したＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系において、改良を加えていない生来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系に比べて高い生産性が達成された。上記の高い生産性の達成から、生来のアミノ酸配列とは異なる蛋白質として生産する場合においても、組換えクロロペルオキシダ−ゼＮ末端開始部位に２次構造を形成させず、且つクロロペルオキシダ−ゼ酵素活性に影響を及ぼさない、アミノ酸配列へのＮ末端領域の変異、付加、欠失ができるのではないかと仮設を立て、これを検証した。その結果、β―ガラクトシダ−ゼ開始部位由来の９アミノ酸配列をＮ末端に付加して改良したＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来の組換えクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系において、改良を加えていない生来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系に比べて高い生産性が達成された。 The chloroperoxidase gene derived from Curvularia fallax (IFO8885) has a high GC content as a whole, with a GC content of 60% in the N-terminal starting 10 amino part of the structural gene, in addition to a single G and C base, There are one place having a GGGG base sequence, two places having a CCC base sequence, and one place having a CCCC base sequence. It was thought that the ease of forming the secondary structure of the N-terminal start site by these sequences may affect transcription and translation of the target gene and suppress expression. For the purpose of producing a protein having a natural amino acid sequence, it is preferable to improve the amino acid codon to reduce the content of the GC base sequence in order to make it difficult to form the secondary structure of the structural gene without changing the amino acid sequence. A temporary structure was established and verified. As a result, in the expression system using the chloroperoxidase structural gene derived from Curvularia fallax (IFO8885) improved to the amino acid codon with reduced GC content for the N-terminal 2, 6, 7, 10th amino acids, High productivity was achieved as compared with an expression system using a chloroperoxidase structural gene derived from a native Curvularia fallax (IFO8885) without addition of the above. From the achievement of the above high productivity, even when the protein is produced as a protein different from the native amino acid sequence, a secondary structure is not formed at the N-terminal start site of the recombinant chloroperoxidase, and the chloroperoxidase is not formed. A hypothesis was made that the N-terminal region could be mutated, added or deleted in the amino acid sequence without affecting the enzyme activity, and this was verified. As a result, improvements were made in the expression system using the recombinant chloroperoxidase structural gene derived from Curvularia fall (IFO8885), which was improved by adding a 9 amino acid sequence derived from the β-galactosidase start site to the N-terminus. High productivity was achieved as compared to the expression system using the chloroperoxidase structural gene derived from the native Curvularia fallax (IFO8885).

さらに、本発明者らは、培養温度を検討し大腸菌によって発現されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の活性の向上を試みた。蛋白質翻訳が行われるようになったクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を大腸菌から抽出すると不溶性画分に存在しており活性は殆ど認められなかった。そこで、培養温度を３７℃、３０℃、２５℃と低下させることによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が可溶性画分に移行することが判った。それとともに活性の増大することも明らかになった。これにより、これまでの報告では、活性確認が殆どできなかった大腸菌によるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の発現を大幅に向上し、産業上実用的な活性型のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産発現を可能にすることに成功した。 Furthermore, the present inventors examined the culture temperature and tried to improve the activity of a protein having chloroperoxidase activity expressed by Escherichia coli. When a protein having chloroperoxidase activity, which has been subjected to protein translation, was extracted from Escherichia coli, it was present in the insoluble fraction and almost no activity was observed. Thus, it was found that the protein having chloroperoxidase activity was transferred to the soluble fraction by lowering the culture temperature to 37 ° C., 30 ° C., and 25 ° C. It became clear that activity increased with it. As a result, in previous reports, the expression of a protein having chloroperoxidase activity by Escherichia coli, whose activity could hardly be confirmed, was greatly improved, and an industrially practical active chloroperoxidase activity was achieved. We succeeded in enabling the production and expression of the proteins we have.

本発明のその他の課題を解決するために該クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有するプラスミド（組換えプラスミド）で宿主微生物を形質転換した形質転換微生物により生産したクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を用い、ブタジエンからブタジエンハロヒドリンやフェノ−ルからブロモフェノ−ルなどのハロゲン化化合物を生成することに成功し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the other problems of the present invention, chloroperoxidase activity produced by a transformed microorganism obtained by transforming a host microorganism with a plasmid (recombinant plasmid) having a gene of a protein having the chloroperoxidase activity. The present invention was completed by successfully producing halogenated compounds such as butadiene halohydrin from butadiene and bromophenol from phenol.

上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
（１）クロロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子の５’末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域について置換、欠失又は挿入することにより該ＤＮＡ領域のＧＣ含量が低減した塩基配列を有し、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有する組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドによって宿主微生物を形質転換して形質転換微生物を得、該形質転換微生物を培養することによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有す
る蛋白質を生産することを特徴とする、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
（２）置換、欠失又は挿入により構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域のＧＣ含量が６０％未満に低減していることを特徴とする、（１）記載の製造方法。
（３）ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が置換前のクロロペルオキシダ−ゼと同じアミノ酸配列をコードしていることを特徴とする、（２）記載の製造方法。
（４）ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が配列表の配列番号：１記載の１番目から１０番目のアミノ酸配列をコードしていることを特徴とするとする（３）記載の製造方法。
（５）クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列である（４）記載の製造方法。
（６）クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩基配列である（５）記載の製造方法。
（７）組換えクロロペルオキシダ−ゼが、N末端から１０番目のアミノ酸までのペプチド領域に、アミノ酸変異の導入、１アミノ酸以上の任意のアミノ酸配列の付加または欠失により、構造遺伝子のＤＮＡ５‘末端領域の少なくとも３０残基についてＤＮＡ塩基配列のＧＣ含量を６０％未満にしたクロロペルオキシダ−ゼである（１）記載の製造方法。
（８）組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列である組換えクロロペルオキシダ−ゼである（７）記載の製造方法。
（９）組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：３記載のＤＮＡ塩基配列である（８）記載の製造方法。
（１０）宿主微生物が、グラム染色陰性細菌である（１）から（９）の何れか一項に記載の製造方法。
（１１）グラム染色陰性細菌が、大腸菌である（１０）に記載の製造方法。
（１２）形質転換微生物の培養が、２０℃以上３５℃以下の培養温度で実施される培養である（１）から（１１）の何れか一項に記載の製造方法。
（１３）クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１４）クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１５）組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１６）組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：
３記載のＤＮＡ塩基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１７）（１）から（１２）の何れか一項に記載の製造方法により製造されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とすることを特徴とするアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、又はアニリン誘導体をハロゲン化反応もしくはハロヒドリン化反応させて、対応するハロゲン化物又はハロヒドリン化物を製造する方法。
（１８）（１７）記載の製造方法によりブタジエンをハロヒドリン化反応して得られることを特徴とするブタジエンブロモヒドリン。
（１９）（１７）記載の製造方法によりフェノ−ルをハロゲン化反応して得られることを特徴とする２−Ｂｒ−フェノ−ル、４−Ｂｒ−フェノ−ル、２、４、６−Ｂｒ−フェノ−ル。 The present invention based on the above-described new findings by the present inventors includes the following aspects.
(1) having a nucleotide sequence in which the GC content of the DNA region is reduced by substitution, deletion or insertion of a DNA region from the 5 ′ end of the chloroperoxidase structural gene to at least 30 bases; A chloroperoxidase is prepared by preparing a recombinant plasmid having a gene of a protein having a dase activity, transforming a host microorganism with the recombinant plasmid to obtain a transformed microorganism, and culturing the transformed microorganism. A method for producing a protein having chloroperoxidase activity, which comprises producing a protein having activity.
(2) The production method according to (1), wherein the GC content of the DNA region from the 5 ′ end of the structural gene to at least 30 bases is reduced to less than 60% by substitution, deletion or insertion.
(3) The DNA region from the 5 ′ end of the structural gene having a GC content reduced to less than 60% to at least 30 bases encodes the same amino acid sequence as the chloroperoxidase before substitution, The manufacturing method according to (2).
(4) The DNA region from the 5 ′ end of the structural gene having a GC content reduced to less than 60% to at least 30 bases encodes the first to tenth amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. (3) The production method according to (3).
(5) The production method according to (4), wherein the chloroperoxidase is an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(6) The production method according to (5), wherein the chloroperoxidase gene is the DNA base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(7) Recombinant chloroperoxidase is introduced into the peptide region from the N-terminal to the 10th amino acid by introducing an amino acid mutation, adding or deleting any amino acid sequence of one or more amino acids, and then DNA 5 ' The production method according to (1), which is a chloroperoxidase in which the GC content of the DNA base sequence is less than 60% for at least 30 residues in the terminal region.
(8) The production method according to (7), wherein the recombinant chloroperoxidase is a recombinant chloroperoxidase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
(9) The production method according to (8), wherein the recombinant chloroperoxidase gene is the DNA base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(10) The production method according to any one of (1) to (9), wherein the host microorganism is a Gram staining negative bacterium.
(11) The production method according to (10), wherein the Gram staining negative bacterium is Escherichia coli.
(12) The production method according to any one of (1) to (11), wherein the transformed microorganism is cultured at a culture temperature of 20 ° C. or higher and 35 ° C. or lower.
(13) A chloroperoxidase, wherein the chloroperoxidase is an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(14) A chloroperoxidase, wherein the base sequence of the chloroperoxidase gene is the DNA base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
(15) A chloroperoxidase, wherein the recombinant chloroperoxidase has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
(16) The nucleotide sequence of the recombinant chloroperoxidase gene is represented by SEQ ID NO:
A chloroperoxidase which is the DNA base sequence according to 3.
(17) An alkene, alkyne, cyclopropane, β, characterized by using a protein having chloroperoxidase activity produced by the production method according to any one of (1) to (12) as a catalyst. A method for producing a corresponding halide or halohydrin by reacting a diketone, a phenol derivative or an aniline derivative with a halogenation reaction or a halohydrination reaction.
(18) A butadiene bromohydrin obtained by subjecting butadiene to a halohydrin reaction by the production method according to (17).
(19) A 2-Br-phenol, 4-Br-phenol, 2, 4, 6-Br obtained by halogenating phenol with the production method according to (17) -Phenol.

本発明により、酵素の改良研究および産業上実用的な量のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を供給する生産方法を提供することができる。本生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒として使用することによる化学反応による化合物を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide enzyme production research and a production method for supplying an industrially practical amount of protein having chloroperoxidase activity. The compound by the chemical reaction by using the protein which has the chloroperoxidase activity produced by this production method as a catalyst can be provided.

本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を用いることによる酸化反応を産業上実用的に行うことができる。 The oxidation reaction by using the protein having chloroperoxidase activity according to the present invention can be carried out industrially and practically.

本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法は、配列表の配列番号：１記載のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼに対応するアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも１０番目までのアミノ酸配列に対応するコドンのＧＣ含量を低減した配列表の配列番号：２記載のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子及びまたは、請求項１記載のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が配列表の配列番号：１記載のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に対応する配列番号：１記載のアミノ酸配列を基準としたＮ末端領域へのアミノ酸変異の導入、任意のアミノ酸配列の付加または開始アミノ酸領域の欠失を有し、且つ本来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を失わせないようにした塩基配列を有する組換えクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子、を含むプラスミドによって形質転換された形質転換微生物を培養する生産方法により規定することができる。 The method for producing a protein having chloroperoxidase activity according to the present invention is at least 10 from the N-terminal of the amino acid sequence corresponding to chloroperoxidase derived from Curvularia fallax (IFO8885) described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. The chloroperoxidase gene according to SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in which the GC content of the codon corresponding to the amino acid sequence up to the number is reduced and the protein having chloroperoxidase activity according to claim 1 are sequence listing. Introduction of amino acid mutations into the N-terminal region based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, corresponding to the DNA base sequence of the chloroperoxidase gene derived from Curvularia fallax (IFO8885) described in SEQ ID NO: 1; Addition of amino acid sequence or deletion of starting amino acid region Transformed with a plasmid comprising a recombinant chloroperoxidase gene having a nucleotide sequence that has a nucleotide sequence that does not lose chloroperoxidase activity derived from the original Curvularia fallax (IFO8885) It can be defined by the production method for culturing microorganisms.

以下に本発明を詳細に説明するが、本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法は上記の特性を有するものであり、Ｎ末端から少なくとも１０番目までのアミノ酸配列が上記の特性を有するクロロペルオキシダ−ゼであるか、もしくは、対象となる天然のクロロペルオキシダ−ゼ活性が失われない程度に、Ｎ末端領域への変異の導入、任意のアミノ酸配列の付加または開始アミノ酸領域の欠失を施した組換えクロロペルオキシダ−ゼであれば、いかなる生物由来のクロロペルオキシダ−ゼであっても本発明に包含されるものとする。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The method for producing a protein having chloroperoxidase activity according to the present invention has the above-described characteristics, and the amino acid sequence from the N-terminal to at least the 10th amino acid sequence is as described above. Introduction of mutations, addition of any amino acid sequence or starting amino acid to the extent that it is a chloroperoxidase having the characteristics or the natural chloroperoxidase activity of interest is not lost Any recombinant chloroperoxidase having a deleted region is included in the present invention.

（１）クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質
本発明において、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質とは、天然のアミノ酸配列を有する酵素（クロロペルオキシダーゼ）及び組換え酵素（組換えクロロペルオキシダーゼ）の両方を合わせた酵素を指す。ここにおいて、クロロペルオキシダーゼとは、天然物及び天然の酵素と同じアミノ酸配列を有する酵素を指す。さらに、組換えクロロペルオキシダーゼとは、天然とはアミノ酸配列が異なるがクロロペルオキシダーゼの活性を有する酵素を指す。 (1) Protein having chloroperoxidase activity In the present invention, a protein having chloroperoxidase activity refers to an enzyme combining both an enzyme having a natural amino acid sequence (chloroperoxidase) and a recombinant enzyme (recombinant chloroperoxidase). Point to. Here, chloroperoxidase refers to an enzyme having the same amino acid sequence as a natural product and a natural enzyme. Further, recombinant chloroperoxidase refers to an enzyme having an amino acid sequence different from that of nature but having chloroperoxidase activity.

（２）クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子
本発明において、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子とは、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする遺伝子（クロロペルオキシダーゼ遺伝子及び組換えクロロペルオキシダーゼ遺伝子）を指す。ここにおいて、クロロペルオキシダーゼ遺伝子とは、クロロペルオキシダーゼをコードし天然の遺伝子と同じ塩基配列を有する遺伝子（クロロペルオキダーゼ天然型遺伝子）及びクロロペルオキシダーゼをコードし天然と異なる塩基配列を有する遺伝子（クロロペルオキシダーゼ改変型遺伝子）を合わせた遺伝子を指す。さらに、組換えクロロペルオキシダーゼ遺伝子とは、組換えクロロペルオキシダーゼをコードする遺伝子を指す。さらに、本発明におけるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子をコードするポリヌクレオチドには配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、同配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、同配列番号：２に示す塩基配列のみならず、そのアミノ酸配列の１１番目以降に異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログも本発明の範疇に含まれる。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号：１に示すＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子ＤＮＡ塩基配列によりコードされるＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。 (2) Gene of a protein having chloroperoxidase activity In the present invention, the gene of a protein having chloroperoxidase activity refers to a gene encoding a protein having chloroperoxidase activity (chloroperoxidase gene and recombinant chloroperoxidase gene). Point to. Here, the chloroperoxidase gene refers to a gene encoding chloroperoxidase and having the same base sequence as a natural gene (chloroperoxidase natural type gene) and a gene encoding chloroperoxidase and having a base sequence different from natural (chloroperoxidase) It refers to a gene that combines a modified gene). Furthermore, the recombinant chloroperoxidase gene refers to a gene encoding recombinant chloroperoxidase. Furthermore, the polynucleotide encoding the protein gene having chloroperoxidase activity in the present invention includes the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encodes the protein shown in SEQ ID NO: 2. However, the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes not only the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, but also any base sequence based on a different codon after the 11th amino acid sequence. In addition, homologs of polynucleotides are also included in the scope of the present invention by appropriately introducing substitutions, deletions, modifications or insertions or additions. The homologue of the polynucleotide in the present invention is a chloroperoxidase derived from Curvularia fallax (IFO8885) encoded by the DNA base sequence derived from Curvularia fallax (IFO8885) shown in SEQ ID NO: 1. It is obtained by performing substitution, deletion or addition of a base within a range where the activity can be maintained.

（３）組換えプラスミド
このクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする組換えプラスミドを、その宿主中での発現を可能とするプロモ−タ−と組み合わせて、宿主中での複製が可能な複製オリジンを有する、例えば、大腸菌用であるｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等のプラスミドに組み込むことで、本発明のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする組換えプラスミドを得ることができる。プロモ−タ−としては、組換えＤＮＡの宿主大腸菌中での発現を可能とするものであればよい。組換えプラスミドの一例としては、プロモ−タ−、リボゾ−ム結合部位、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡが５‘から３’方向にこの順番に結合された部分を有するものを挙げることができる。 (3) Recombinant plasmid A recombinant plasmid that codes for a protein having chloroperoxidase activity is combined with a promoter that enables expression in the host to replicate in the host. A recombinant plasmid encoding a protein having chloroperoxidase activity derived from Curvularia falla of the present invention is obtained by incorporating it into a plasmid having a possible replication origin, for example, pBR322, pUC18, etc. for Escherichia coli. be able to. Any promoter can be used as long as it allows expression of the recombinant DNA in host E. coli. As an example of the recombinant plasmid, a promoter, a ribosome binding site, and a portion where DNA encoding chloroperoxidase derived from Curvularia falla is bound in this order in the 5 'to 3' direction. The thing which has can be mentioned.

（４）宿主微生物
本発明に使用される宿主微生物は、本発明の形質転換微生物を与え得る限り特にその種類を限定される細菌、カビ、酵母を例示できるが、使用経験豊富で安全性が高い大腸菌が好ましく、そのようなものとして、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株、Ｂ株、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）等が挙げられる。ＡＴＣＣは、アメリカン・タイプカルチャ−・コレクションの番号である。 (4) Host microorganisms As long as the host microorganism used in the present invention can give the transformed microorganism of the present invention, bacteria, molds, and yeasts that are particularly limited in type can be exemplified. E. coli is preferable, and examples thereof include JM109 strain, HB101 strain, DH5α strain, B strain, W3110 strain (ATCC 27325) and the like. ATCC is the number of the American Type Culture Collection.

（５）形質転換微生物
本発明の形質転換微生物は、本発明に係る組換えプラスミドを有する限り特に限定はないが、宿主微生物が大腸菌である場合には上記の組換えプラスミドを大腸菌宿主にそれ自体公知の方法で形質転換により導入すればよい。組換えプラスミドによる宿主の形質転換は、例えば塩化ルビジウム法によりコンピテントセルを調製し、プラスミドを加えて、４２℃、３０秒間のヒ−トショック、および氷冷、２分間のコ−ルドショックを与えることによりプラスミドを宿主菌体内に形質導入する方法など、常法により容易に実施可能である。得られた大腸菌形質転換体においては、細胞質内にＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が蓄積される。 (5) Transformed microorganism The transformed microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it has the recombinant plasmid according to the present invention. When the host microorganism is Escherichia coli, the above recombinant plasmid is used as an E. coli host as such. What is necessary is just to introduce | transduce by transformation by a well-known method. For transformation of the host with the recombinant plasmid, for example, a competent cell is prepared by the rubidium chloride method, the plasmid is added, and a heat shock at 42 ° C. for 30 seconds and an ice-cooled cold shock for 2 minutes are performed. It can be easily carried out by a conventional method such as a method of transducing a plasmid into a host cell by giving. In the obtained E. coli transformant, a protein having chloroperoxidase activity derived from Curvularia fallax is accumulated in the cytoplasm.

（６）形質転換微生物の培養
該プラスミドで形質転換して得られた形質転換微生物の培養は、公知の培養方法に準じて行うことができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を産生できる条件であれば特に制限はない。さらに詳しく述べると使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地のｐＨは、６〜９の範囲で選べばよく、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で好気的に培養を行う。培養期間は１〜７日間の範囲で目的のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。 (6) Culture of transformed microorganisms Culture of transformed microorganisms obtained by transformation with the plasmid can be performed according to known culture methods. As the medium, any of a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, and other nutrients in appropriate amounts. Culturing can be carried out in a liquid medium containing the above-described culture components by using a usual culture method such as shaking culture, aeration and agitation culture, continuous culture, or fed-batch culture. The culture conditions may be appropriately selected depending on the type of culture and the culture method, and are not particularly limited as long as the strain can grow and produce a protein having chloroperoxidase activity. More specifically, the medium used can be a known nutrient source for general microorganisms, such as meat extract, yeast extract, malt extract, peptone, NZ amine, organic nutrient sources, glucose, maltose, sucrose, starch, organic Carbon sources such as acids, nitrogen sources such as ammonium sulfate, urea and ammonium chloride, inorganic nutrient sources such as phosphate, magnesium, potassium and iron, and vitamins can be used in appropriate combination. The pH of the medium may be selected in the range of 6 to 9, and the culture temperature is 20 to 45 ° C, preferably 24 to 37 ° C and aerobically cultured. What is necessary is just to culture | cultivate until the content of the protein which has the target chloroperoxidase activity derived from Curvularia fallax in the range of 1-7 days is maximized.

（７）ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５の培養
ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育し得るものであるならば何でも使用できる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース、シュクロース、マルトース等の糖類、窒素源としてペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。またこの他に、必要に応じて、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が適宜使用される。上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ５〜９、１９〜３４℃、好ましくはｐＨ７．２、２４℃にて好気的に１日〜１４日間培養する。 (7) Cultivation of Curvularia fall IFO8885 As a medium composition for culturing Curvularia fall IFO8885, any medium can be used as long as it can normally grow these microorganisms. For example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, and maltose as a carbon source, and various inorganic and organic acids in addition to natural nitrogen sources such as peptone, meat extract, malt extract, yeast extract, protein hydrolyzate, and amino acids as a nitrogen source An ammonium salt or the like can be used. In addition, inorganic salts, trace metal salts, vitamins and the like are appropriately used as necessary. The microorganism may be cultured by a conventional method, for example, aerobically cultured at pH 5-9, 19-34 ° C., preferably pH 7.2, 24 ° C. for 1 day to 14 days.

（８）クロロペルオキシダ−ゼ酵素の活性測定方法
酵素活性は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１００ｍＭ臭化カリウム、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、６０μＭモノクロロジメドン、５ｍＭ過酸化水素から成る反応組成液に調製したクロロペルオキシダ−ゼ溶液を適当量加えて、３０℃で反応させる。１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量と定義する。 (8) Method for measuring activity of chloroperoxidase enzyme The enzyme activity is determined by measuring the decrease in absorbance at 290 nm from the change of monochlorodimedone to monochloromonobromodimedone. Add an appropriate amount of the chloroperoxidase solution prepared to the reaction composition consisting of 50 mM citrate buffer (pH 6.0), 100 mM potassium bromide, 1 mM sodium vanadate, 60 μM monochlorodimedone, 5 mM hydrogen peroxide, and add 30 React at ℃. The decrease in absorbance at 290 nm for 1 minute is measured, and 1 unit is defined as the amount of enzyme that consumes 1 μmol of monochlorodimedone at 30 ° C. for 1 minute.

（９）クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による化学反応
クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による化学反応は、一般に以下のような条件で行う。ｐＨに関しては、、通常ｐＨ５−８の緩衝液中で行う。使用する緩衝液は、反応を行わせるｐＨで緩衝能を有するものであればいずれのものでも使用可能であるが、通常クエン酸塩を含む緩衝液が好適である。反応温度は、使用するクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が活性を有する範囲であればいずれでもよいが、好ましくは２０℃から７０℃付近である。本発明で使用される基質は、本酵素反応によりハロヒドリン化反応または、ハロゲン化反応を受けるものではあればいずれの化合物でも使用され得るが、一般的には、アルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体である。以上の基質を使用する場合は、反応溶液中に溶解した状態であることが望ましいが、水に難溶性の基質であっても少量のメタノ−ル、エタノ−ル、ジメチル
スルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの極性溶媒に溶解後、これを反応溶液中に入れ、十分に分散させた状態で使用してもかまわない。また、超音波破砕処理等によって分散してもかまわない。使用するハライドイオンの量は、添加した基質（モル量）に対して幾分過剰のモル量存在すればよい。また、添加する過酸化物、あるいは過酸化水素は、反応が十分に進行する量であれば任意の量添加できるが、一般的には存在する基質量に対してモル比で０．１から１０の割合で添加することが好ましい。尚、過酸化水素を添加する場合は、その添加方法として、反応液中にハライドイオン化合物、基質、酵素を添加した後に、徐々に加えて行くことが好ましい。反応時間、添加する酵素量は基質が変換される条件であれば任意の時間、任意の酵素量が選択できる。以上のようにして反応した結果、生成する生成物の確認は、薄層クロマトグラフィ−、高速液体クロマトグラフィ−、ガスクロマトグラフィ−等の常法を使用することが出来る。又、反応生成物は、反応終了後、溶媒で抽出、イオン交換樹脂等やシリカゲルなどを用いるクロマトグラフィ−により分離できる。この他にも本発明により得られた生成物の分離精製には、他の一般的な精製法を組み合わせることも可能である。また、得られた反応生成物の同定は、標準化合物が入手できる場合は、薄層クロマトグラフィ−、高速液体クロマトグラフィ−、ガスクロマトグラフィ−により同定できる。また、更に必要な場合は、質量スペクトル、ＮＭＲスペクトルなどの常法を用いることも可能である。 (9) Chemical reaction with a protein having chloroperoxidase activity A chemical reaction with a protein having chloroperoxidase activity is generally carried out under the following conditions. Regarding pH, it is usually carried out in a buffer solution of pH 5-8. Any buffer can be used as long as it has a buffer capacity at the pH at which the reaction is carried out, but a buffer containing citrate is usually preferred. The reaction temperature may be any as long as the protein having the chloroperoxidase activity to be used is active, but is preferably in the vicinity of 20 ° C to 70 ° C. As the substrate used in the present invention, any compound can be used as long as it undergoes a halohydrination reaction or a halogenation reaction by this enzyme reaction, but in general, alkene, alkyne, cyclopropane, β- Diketones, phenol derivatives, and aniline derivatives. When using the above substrates, it is desirable that they are dissolved in the reaction solution. However, even if the substrate is poorly soluble in water, a small amount of methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, etc. After dissolving in a polar solvent, it may be used in a state where it is placed in a reaction solution and sufficiently dispersed. Further, it may be dispersed by ultrasonic crushing treatment or the like. The amount of halide ion to be used may be a slight excess of molar amount relative to the added substrate (molar amount). The peroxide or hydrogen peroxide to be added can be added in an arbitrary amount as long as the reaction proceeds sufficiently, but is generally 0.1 to 10 in molar ratio to the existing base mass. It is preferable to add in the ratio. In addition, when adding hydrogen peroxide, it is preferable to add gradually, after adding a halide ion compound, a substrate, and an enzyme in the reaction liquid. As long as the reaction time and the amount of enzyme to be added are the conditions under which the substrate is converted, any amount of enzyme can be selected for any time. As a result of the reaction as described above, the product to be produced can be confirmed by a conventional method such as thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, gas chromatography or the like. The reaction product can be separated by extraction with a solvent after completion of the reaction, and chromatography using ion exchange resin or silica gel. In addition to this, other general purification methods can be combined with the separation and purification of the product obtained by the present invention. The obtained reaction product can be identified by thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, or gas chromatography when a standard compound is available. Further, if necessary, conventional methods such as mass spectrum and NMR spectrum can also be used.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例において組換え微生物の作成については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ.、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法に従った。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these Examples. Unless otherwise stated, the preparation of recombinant microorganisms in the following examples is described in Sambrook, J. et al. Et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press New York, published in 1989.

［１］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量低減操作の有用性検討
・Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製
３％グルコース、０．８％酵母エキス、０．２％リン酸水素ニカリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０００１％オルソバナジン酸ナトリウムからなる培地を調製して、１２０℃、２０分間殺菌後、ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５株を接種し、２４℃、１００ｒｐｍで１日間培養した。培養液からろ過により菌体を回収後、クライオプレス（マイクロテック・ニチオン）を用いて菌体を破砕した。破砕した菌体１０ｍｇよりＰＵＲＥＧＥＮＥＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔＤ−７０００Ａ（ＧｅｎｔｒａＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、４．９μｇの染色体ＤＮＡを得た。 [1] Examination of usefulness of GC content reduction operation of N-terminal amino acid region DNA base sequence-Preparation of chloroperoxidase expression plasmid derived from Curvularia fallax 3% glucose, 0.8% yeast extract, 0.2% phosphoric acid A medium composed of dipotassium hydrogen, 0.1% magnesium sulfate, 0.0001% sodium orthovanadate was prepared, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, inoculated with Curvularia fallax IFO8885 strain, and cultured at 24 ° C. and 100 rpm for 1 day. did. The bacterial cells were collected from the culture broth by filtration, and then disrupted using a cryopress (Microtech Nithion). Chromosomal DNA was extracted from 10 mg of disrupted cells using PUREGENE DNA Isolation Kit D-7000A (Gentra Systems) to obtain 4.9 μg of chromosomal DNA.

配列表の配列番号：４及び配列番号：５に記載のオリゴヌクレオチドプライマ−とＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５菌体から抽出した染色体ＤＮＡを用い、以下、１０ｍＭＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭフォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ＵＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡから成る溶液を作成し、９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件であるＰＣＲ法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ法）により増幅２本鎖化した。増幅した２本鎖を、制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断して大腸菌由来プリンヌクレオシドフォスフォリラ−ゼ由来ＳＤ配列及びＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５由来クロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメント（１）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、ベクタ−側フラグメント（２）を得た。これらのフラグメント（１）及び（２）をライゲ−ションすることにより、ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘＩＦＯ８８８５由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドｐＵＦＣ３−７を構築した。 Using oligonucleotide primers described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and chromosomal DNA extracted from Curvularia fall IFO8885 cells, 10 mM KOD-plus buffer, 1.5 μM forward and reverse primers, 1 mM A solution consisting of magnesium sulfate, 0.2 mM dNTPs, 2U KOD-plus polymerase (TOYOBO), 50 ng / μL template DNA was prepared and held at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds and at 65 ° C. for 30 seconds. After 30 cycles of thermal cycle at 68 ° C. for 1.5 minutes, amplification was finally made into double strands by the PCR method (Polymerase Chain Reaction method), which is a reaction condition for holding at 68 ° C. for 5 minutes. The amplified double strand is cleaved with restriction enzymes XbaI and HindIII to obtain a DNA fragment (1) which codes E. coli-derived purine nucleoside phosphorylase-derived SD sequence and Curvularia fall IFO8885-derived chloroperoxidase. It was. Further, the E. coli plasmid pUC18 was cleaved with restriction enzymes XbaI and HindIII to obtain a vector-side fragment (2). By ligating these fragments (1) and (2), a recombinant chloroperoxidase expression plasmid pUFC3-7 derived from Curvularia fallax IFO8885 was constructed.

［２］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製
［１］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７を鋳型として、配列番号：６に示すオリゴヌクレオチドと配列番号：４及び７から１０に示した種々のオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用したＰＣＲ、及び、配列番号：１０及び配列番号：５に示したオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲを行い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼのＮ末端アミノ酸領域２、６、７、１０位までのアミノ酸配列のＧＣ含有量を低減したクロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲは、以下に示す、１０ｍＭＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭフォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ＵＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、１ｎｇ／μＬ鋳型ｐＵＦＣ３−７プラスミドから成る溶液を作成し、９４℃で２分保持した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件で行った。その後、それぞれのフラグメントを、タカラ社製ＢＫＬキットにより平滑末端化、及びリン酸化処理を行い、フラグメント（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、その後、脱リン酸化しベクタ−側フラグメント（９）を得た。その後、フラグメント（３）とフラグメント（９）をライゲ−ション後、大腸菌に形質転換することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ０を得た。同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（４）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ２を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（５）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ６を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（６）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ７を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（７）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ１０を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（８）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣをそれぞれ得た。 [2] Curvularia with reduced GC content of N-terminal amino acid region DNA base sequence
Preparation of fallax-derived chloroperoxidase expression plasmid Using the expression plasmid pUFC3-7 constructed in [1] as a template, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 6 and various oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 4 and 7 to 10 PCR was performed in combination with the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 5, and N-terminal amino acid regions 2, 6, 7, 10 of Curvularia fallax-derived chloroperoxidase were obtained. A DNA fragment encoding chloroperoxidase with a reduced GC content of amino acid sequences up to the position was amplified. PCR consists of the following 10 mM KOD-plus buffer, 1.5 μM forward and reverse primers, 1 mM magnesium sulfate, 0.2 mM dNTPs, 2 U KOD-plus polymerase (TOYOBO), 1 ng / μL template pUFC3-7 plasmid After preparing a solution and holding at 94 ° C. for 2 minutes, after 30 cycles of thermal cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 1.5 minutes, finally, 68 ° C. for 5 minutes The reaction conditions were maintained. Thereafter, each fragment was blunt-ended and phosphorylated using a Takara BKL kit to obtain fragments (3), (4), (5), (6), (7), and (8). It was. Further, the E. coli plasmid pUC118 was cleaved with the restriction enzyme HincII and then dephosphorylated to obtain a vector-side fragment (9). Thereafter, fragment (3) and fragment (9) were ligated and then transformed into E. coli to obtain expression plasmid pU11FCN0. Similarly, the expression plasmid pU11FCN2 is obtained by using the fragment (4) instead of the fragment (3), and the expression plasmid pU11FCN6 is similarly obtained by using the fragment (5) instead of the fragment (3). The expression plasmid pU11FCN7 is replaced by the fragment (6) instead of 3), and the expression plasmid pU11FCN10 is similarly replaced by the fragment (3) by using the fragment (7) instead of the fragment (3). Thus, expression plasmid pU11FCN10ΔC was obtained by using fragment (8).

［３］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価
［１］及び［２］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７、ｐＵ１１ＦＣＮ０、ｐＵ１１ＦＣＮ２、ｐＵ１１ＦＣＮ６、ｐＵ１１ＦＣＮ７、ｐＵ１１ＦＣＮ１０、ｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣにより形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）を形質転換し、大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵＦＣ３−７、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ０、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ２、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ６、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ７、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣをそれぞれ得た。 [3] Curvularia with reduced GC content of N-terminal amino acid region DNA base sequence
Evaluation of Escherichia coli transformants transformed with fallax-derived chloroperoxidase expression plasmids Transformed with the expression plasmids pUFC3-7, pU11FCN0, pU11FCN2, pU11FCN6, pU11FCN7, pU11FCN10, pU11FCN10ΔC constructed in [1] and [2] E. coli strain W3110 (ATCC 27325) was transformed to obtain E. coli transformants W3110 / pUFC3-7, W3110 / pU11FCN0, W3110 / pU11FCN2, W3110 / pU11FCN6, W3110 / pU11FCN7, W3110 / pU11FCN10, and W3110 / pU11FC10.

この形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＶＯ_４）を含有する１００ｍＭクエンサン緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した。結果を、表１に示す。 This transformant was cultured at 37 ° C. for 16 hours on an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours in an LB liquid medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were collected, and a cell disruption solution was prepared with 100 mM citrate buffer (pH 6). The prepared cell disruption solution was measured for protein concentration using a protein assay kit manufactured by Bio-Rad, so as to have an equal protein mass in a 100 mM citrus buffer (pH 6) containing 1 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO ₄ ). Prepared. Thereafter, enzyme activity was measured. The results are shown in Table 1.

表１の結果より、Ｎ末端アミノ酸領域中少なくとも１０アミノ酸位までＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体はモノクロロジメドンを基質とした活性評価において、生来のＤＮＡ塩基配列を有した大腸菌形質転換体およびその他の形質転換体が酵素活性の検出が出来なかったのに対し、著しく向上していることが判明した。また、アミノ酸配列のＣ末端に付加したヒスチジンタグ配列の付加、付加しないことについては、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の発現に関して大きな差異をもたらさないことが明らかになった。 From the results shown in Table 1, E. coli transformants transformed with a chloroperoxidase-derived chloroperoxidase expression plasmid having a reduced GC content of the DNA base sequence up to at least about 10 amino acids in the N-terminal amino acid region were used as a substrate for monocrodimedomone. In the activity evaluation described above, it was found that the E. coli transformant having the native DNA base sequence and other transformants could not detect the enzyme activity, but was significantly improved. Further, it has been clarified that the addition or non-addition of the histidine tag sequence added to the C-terminal of the amino acid sequence does not cause a great difference in the expression of the protein having chloroperoxidase activity.

培養温度のＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ活性発現への有効性検討
実施例１で構築した大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、３０℃、３７℃で２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＶＯ_４）を含有する１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した。結果を、表２に示す。 Examination of effectiveness of culture temperature for expression of chloroperoxidase derived from Curvularia fallax The Escherichia coli transformant W3110 / pU11FCN10 constructed in Example 1 was cultured at 37 ° C. for 16 hours in an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were cultured at 25 ° C., 30 ° C., and 37 ° C. for 24 hours in an LB liquid medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were collected, and a cell disruption solution was prepared with 100 mM citrate buffer (pH 6). The prepared cell lysate is measured for protein concentration using a protein assay kit manufactured by Bio-Rad, and becomes an equal protein mass in a 100 mM citrate buffer (pH 6) containing 1 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO ₄ ). It was prepared as follows. Thereafter, enzyme activity was measured. The results are shown in Table 2.

表２の結果より、２５℃、３０℃で培養した大腸菌形質転換体ではモノクロロジメドンを基質とした活性評価において向上していることが判明した。 From the results in Table 2, it was found that the E. coli transformants cultured at 25 ° C. and 30 ° C. were improved in activity evaluation using monochlorodimedone as a substrate.

Ｎ末端アミノ酸領域へのアミノ酸配列付加の有用性検討
［１］Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製２
配列表の配列番号：１１及び配列番号：１２に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ法）により増幅２本鎖化した。ＰＣＲは、以下に示す、１０ｍＭＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭフォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ＵＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、１ｎｇ／μＬ鋳型ｐＵＦＣ３−７プラスミドから成る溶液を作成し、９４℃で２分保持した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件で行った。その後、増幅２本鎖化断片を、制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断してＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメント（１０）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、ベクタ−側フラグメント（１１）を得た。これらのフラグメント（１０）及び（１１）をライゲ−ションすることにより、β-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加されたＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドｐＵＦＣ３−１を構築した。 Examination of usefulness of amino acid sequence addition to N-terminal amino acid region [1] Preparation of recombinant chloroperoxidase expression plasmid derived from Curvularia fallax 2
The oligonucleotides described in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 in the sequence listing were amplified and double-stranded by the PCR method (Polymerase Chain Reaction method). PCR consists of the following 10 mM KOD-plus buffer, 1.5 μM forward and reverse primers, 1 mM magnesium sulfate, 0.2 mM dNTPs, 2 U KOD-plus polymerase (TOYOBO), 1 ng / μL template pUFC3-7 plasmid After preparing a solution and holding at 94 ° C. for 2 minutes, after 30 cycles of thermal cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 1.5 minutes, finally, 68 ° C. for 5 minutes The reaction conditions were maintained. Thereafter, the amplified double-stranded fragment was cleaved with restriction enzymes KpnI and HindIII to obtain a DNA fragment (10) encoding a chloroperoxidase derived from Curvularia fallax. Further, the E. coli plasmid pUC18 was cleaved with restriction enzymes KpnI and HindIII to obtain a vector-side fragment (11). By ligating these fragments (10) and (11), a recombinant chloroperoxidase expression plasmid pUFC3-1 derived from Curvularia fallax added with 9 amino acid sequences derived from β-galactosidase was constructed. .

［２］Ｎ末端アミノ酸領域にβ-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加したＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価
［１］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−１、実施例１で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７およびｐＵＣ１８により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換株ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−１、ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−７、およびＪＭ１０９／ｐＵＣ１８をそれぞれ得た。 [2] Evaluation of Escherichia coli transformant transformed with Curvularia fallax-derived recombinant chloroperoxidase expression plasmid in which 9 amino acid sequences derived from β-galactosidase are added to the N-terminal amino acid region. Expression constructed in [1] Escherichia coli JM109 strain was transformed with plasmid pUFC3-1, expression plasmids pUFC3-7 and pUC18 constructed in Example 1, and Escherichia coli transformants JM109 / pUFC3-1, JM109 / pUFC3-7, and JM109 / pUC18 were obtained, respectively. It was.

この形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＶＯ_４）を含有する１００ｍＭクエンサン緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した結果、培養液量当りＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−１では０．０２６Ｕ／ｍｌ、ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−７では活性確認できず、およびＪＭ１０９／ｐＵＣ１８では、活性確認できずとなった。本検討結果より、Ｎ末端アミノ酸領域にβ-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加することにより、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来組換えクロロペルオキシダ−ゼの活性型発現が向上することがわかった。 This transformant was cultured at 37 ° C. for 16 hours on an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours in an LB liquid medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were collected, and a cell disruption solution was prepared with 100 mM citrate buffer (pH 6). The prepared cell disruption solution was measured for protein concentration using a protein assay kit manufactured by Bio-Rad, so as to have an equal protein mass in a 100 mM citrus buffer (pH 6) containing 1 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO ₄ ). Prepared. Thereafter, the enzyme activity was measured, and as a result, the activity could not be confirmed with 0.026 U / ml for JM109 / pUFC3-1, JM109 / pUFC3-7, and the activity could not be confirmed with JM109 / pUC18. From the results of this study, it was found that by adding a 9-amino acid sequence derived from β-galactosidase to the N-terminal amino acid region, the active form expression of the recombinant chloroperoxidase derived from Curvularia fallax was improved.

大腸菌形質転換細胞により発現したＣｕｒｖｕｌａｒｉａｆａｌｌａｘ由来クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の種々化学反応に対する有用性検討
・クロロペルオキシダ−ゼサンプルの調製
実施例１で構築した大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌＬＢ液体培地中で、２５℃で２４時間培養した。培養後の菌体を回収しＱＩＡＧＥＮ社製Ｈｉｓ-ｔａｇカラムキットを使用し同キットリシス緩衝液により懸濁後、細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液をニッケルキレ−トカラムにより精製した。精製画分をスピンカラムを用いて脱塩処理し１．３Ｕの酵素調製液を得た。 Examination of the usefulness of a protein having chloroperoxidase activity derived from Curvularia fallax expressed by E. coli transformed cells for various chemical reactions-Preparation of chloroperoxidase sample E. coli transformed strain W3110 / pU11FCN10 constructed in Example 1 was ampicillin The cells were cultured at 37 ° C. for 16 hours on an LB agar medium containing 50 μg / ml. The cultured cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours in a 10 ml LB liquid medium containing 50 μg / ml of ampicillin. The cultured cells were collected and suspended in a lysis buffer using the His-tag column kit manufactured by QIAGEN to prepare a cell disruption solution. The prepared cell lysate was purified with a nickel chelate column. The purified fraction was desalted using a spin column to obtain a 1.3 U enzyme preparation.

［２］クロロペルオキシダ−ゼによるブタジエンブロモヒドリンの生成
ガラスバイアルに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌ中で最終濃度が１００ｍＭＫＢｒ、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）、［１］の方法により調製した１．２Ｕクロロペルオキシダ−ゼになるようにした。反応バイアル中から気相部分を１０ｍｌシリンジで抜き取り、４４６μモル等量の１，３−ブタジエンガス１０ｍｌを加えた。１０分間の保温後、１００ｍＭ過酸化水素を１ｍｌ添加し攪拌しながら反応を開始した。過酸化水素は２時間ごとに１００μモル相当を添加し反応を継続した。反応４時間後、反応液を抜き取り、等量の酢酸エチルで抽出をした。その抽出液を用いてドデカンを内部標準としてガスクロマトグラフィ−分析をした。ガスクロマトグラフィ−は、島津製作所製ＧＣ−９Ａ、分析カラムはＪ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＢ−１７０１を用い３００℃でインジェクション後、４０℃で９分間保持後、毎分１０℃づつ昇温させ２５０℃までの傾斜上昇をするように設定して行った。その結果、標準化合物と同等の保持時間を示した。４時間でのブタジエンブロモヒドリンの生成量は、１０８μモルだった。更に、本ブタジエンブロモヒドリンは、抽出まえの反応液に１０％の水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１０以上にすることによりブタジエンモノエポキシドに変換された。ブタジエンモノエポキシドと同等であることは標準試料とのガスクロマトグラフィ−の比較分析により確かめた。塩基処理後の反応生成物及び標準試料の保持時間は７．７分であり同一であった。 [2] Production of butadiene bromohydrin by chloroperoxidase In a glass vial in 10 ml of 100 mM sodium citrate buffer (pH 5.0), the final concentration is 100 mM KBr, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), [1] Thus, 1.2 U chloroperoxidase prepared by the above method was used. The gas phase portion was extracted from the reaction vial with a 10 ml syringe, and 446 μmol equivalent of 1,3-butadiene gas 10 ml was added. After incubating for 10 minutes, 1 ml of 100 mM hydrogen peroxide was added and the reaction was started with stirring. Hydrogen peroxide was added in an amount equivalent to 100 μmol every 2 hours, and the reaction was continued. After 4 hours of reaction, the reaction solution was extracted and extracted with an equal amount of ethyl acetate. The extract was used for gas chromatography analysis using dodecane as an internal standard. The gas chromatography was GC-9A manufactured by Shimadzu Corporation, and the analytical column was DB & 1701 manufactured by J & W Scientific. After injection at 300 ° C., the sample was held at 40 ° C. for 9 minutes and then heated up to 10 ° C. per minute up to 250 ° C. It was set to tilt up. As a result, a retention time equivalent to that of the standard compound was shown. The amount of butadiene bromohydrin produced in 4 hours was 108 μmol. Furthermore, this butadiene bromohydrin was converted to butadiene monoepoxide by adding 10% sodium hydroxide to the reaction solution before extraction to bring the pH to 10 or higher. Equivalent to butadiene monoepoxide was confirmed by comparative analysis of gas chromatography with a standard sample. The retention time of the reaction product and the standard sample after the base treatment was 7.7 minutes and was the same.

［３］クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による臭化フェノ−ルの生成
ガラスバイアルに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌ中で最終濃度が１００ｍＭＫＢｒ、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄）、［１］の方法により調製した１．２Ｕクロロペルオキシダ−ゼ，５ｍＭフェノ−ルになるように反応液を調製した。１Ｍ過酸化水素を１０μｌ添加し攪拌しながら反応を開始した。過酸化水素は３０分ごとに添加し反応を継続した。反応３時間後、反応液を抜き取り、等量の酢酸エチルで抽出をした。その抽出液を用いてドデカンを内部標準としてガスクロマトグラフィ−分析をした。ガスクロマトグラフィ−は、島津製作所製ＧＣ−１７００、分析カラムはＪ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＢ１７０１を用い３００℃でインジェクション後、１５０℃で１分間保持後、毎分４℃づつ昇温させ２５０℃までの傾斜上昇をするように設定して行った。その結果、２−Ｂｒ−フェノ−ル、４−Ｂｒ−フェノ−ル、２，４，６−Ｂｒ−フェノ−ルの標準化合物と同等の保持時間１１．４分、１８．４分、２５．６分を示し、同化合物が合成されていることが確認された。 [3] Production of phenol bromide by a protein having chloroperoxidase activity In a glass vial, 10 ml of 100 mM sodium citrate buffer (pH 5.0), final concentration of 100 mM KBr, 1 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO ₄ ), and a reaction solution was prepared so as to be 1.2 U chloroperoxidase, 5 mM phenol prepared by the method of [1]. 10 μl of 1M hydrogen peroxide was added and the reaction was started with stirring. Hydrogen peroxide was added every 30 minutes to continue the reaction. After 3 hours of reaction, the reaction solution was taken out and extracted with an equal amount of ethyl acetate. The extract was used for gas chromatography analysis using dodecane as an internal standard. Gas chromatography is GC-1700 manufactured by Shimadzu Corporation, and analysis column is DB 1701 manufactured by J & W Scientific. After injection at 300 ° C., hold at 150 ° C. for 1 minute, then increase the temperature by 4 ° C. per minute and ramp up to 250 ° C. It was set to do. As a result, retention times of 11.4 minutes, 18.4 minutes and 25.2 equivalent to the standard compounds of 2-Br-phenol, 4-Br-phenol and 2,4,6-Br-phenol were obtained. 6 minutes was shown, and it was confirmed that the same compound was synthesized.

Claims

A chloroperoxidase having a nucleotide sequence in which the GC content of the DNA region is reduced by substitution, deletion or insertion of the DNA region from the 5 ′ end of the chloroperoxidase structural gene to at least 30 bases. A recombinant plasmid having a gene for a protein having activity is prepared, a host microorganism is transformed with the recombinant plasmid to obtain a transformed microorganism, and the transformed microorganism is cultured to have chloroperoxidase activity. A method for producing a protein having chloroperoxidase activity, which comprises producing a protein.

The production method according to claim 1, wherein the GC content of the DNA region from the 5 'end of the structural gene to at least 30 bases is reduced to less than 60% by substitution, deletion or insertion.

The DNA region from the 5 'end of the structural gene having a GC content reduced to less than 60% to at least 30 bases encodes the same amino acid sequence as the chloroperoxidase before substitution, Item 3. The production method according to Item 2.

The DNA region from the 5 ′ end of the structural gene having a GC content reduced to less than 60% to at least 30 bases encodes the first to tenth amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The manufacturing method according to claim 3, wherein the manufacturing method is characterized.

The method according to claim 4, wherein the chloroperoxidase is an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

6. The method according to claim 5, wherein the gene for chloroperoxidase is the DNA base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

Recombinant chloroperoxidase is introduced into the peptide region from the N-terminal to the 10th amino acid by introducing an amino acid mutation, adding or deleting any amino acid sequence of one or more amino acids, and The method according to claim 1, wherein the chloroperoxidase is a chloroperoxidase in which the GC content of the DNA base sequence is less than 60% for at least 30 residues.

The method according to claim 7, wherein the recombinant chloroperoxidase is a recombinant chloroperoxidase having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

The production method according to claim 8, wherein the gene of the recombinant chloroperoxidase is a DNA base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

The production method according to any one of claims 1 to 9, wherein the host microorganism is a Gram staining negative bacterium.

The production method according to claim 10, wherein the Gram staining negative bacterium is Escherichia coli.

The production method according to any one of claims 1 to 11, wherein the transformed microorganism is cultured at a culture temperature of 20 ° C or higher and 35 ° C or lower.

A chloroperoxidase, wherein the chloroperoxidase is an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

A chloroperoxidase, wherein the base sequence of the chloroperoxidase gene is the DNA base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.

A chloroperoxidase in which the recombinant chloroperoxidase has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.

A chloroperoxidase in which the base sequence of the recombinant chloroperoxidase gene is the DNA base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.

An alkene, alkyne, cyclopropane, β-diketone, pheno-, characterized by using as a catalyst a protein having a chloroperoxidase activity produced by the production method according to any one of claims 1 to 12. A method for producing a corresponding halide or halohydrin product by subjecting a thiol derivative or an aniline derivative to a halogenation reaction or a halohydrination reaction.

A butadiene bromohydrin obtained by subjecting butadiene to a halohydrination reaction by the production method according to claim 17.

A 2-Br-phenol, 4-Br-phenol, 2,4,6-Br-phenol, which is obtained by halogenating phenol with the production method according to claim 17. Le.