JP2005104936A - Canine tarc antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗イヌTARC抗体を用いたイヌTARCの定量方法、イヌアトピー性皮膚炎の診断方法、イヌアトピー性皮膚炎の診断薬、イヌアトピー性皮膚炎の治療剤及び治療方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying canine TARC using an anti-canine TARC antibody, a diagnostic method for canine atopic dermatitis, a diagnostic agent for canine atopic dermatitis, a therapeutic agent for canine atopic dermatitis, and a therapeutic method.
アトピー性皮膚炎は、しばしばアトピー素因を有し、慢性の湿疹性皮膚病変を長期にわたって繰り返す病気である。また、血液学的所見として、しばしば末梢血の好酸球数増多、血清IgE値の高値などの異常が認められる。アトピー性皮膚炎の主な要因として、免疫学的異常と非免疫学的異常が報告されている。近年、ヒトばかりではなくイヌ等の愛玩動物においてもアトピー性皮膚炎が増えており、その検出、治療法の確立が望まれている。 Atopic dermatitis is a disease that often has an atopic predisposition and repeats chronic eczema skin lesions over a long period of time. Hematologic findings often include abnormalities such as increased eosinophil count in peripheral blood and high serum IgE levels. Immunological abnormalities and non-immunological abnormalities have been reported as the main causes of atopic dermatitis. In recent years, atopic dermatitis is increasing not only in humans but also in pets such as dogs, and the detection and establishment of treatment methods are desired.
アトピー性皮膚炎と関連している物質としてケモカインがある。マクロファージ由来のケモカインについて報告されている（特許文献１および特許文献２参照）。ケモカインは、分子量が約8〜14kDaの白血球に走化作用を有するサイトカインの総称で、炎症細胞間の連絡を担当するメディエーターとして、種々の炎症の発生、進展に中心的な役割を果たす。ケモカインは構造上４個のシステイン配列の違いによりC、CC、CXC、CX3Cの４つに大別される。ケモカインにはそれぞれ受容体が存在し、CケモカインにはCケモカイン受容体（XCR）、CCケモカインにはCCケモカイン受容体（CCR）、CXCケモカインにはCXCケモカイン受容体（CXCR）、CX3CケモカインにはCX3Cケモカイン受容体（CX3CR）とに大別され、ケモカインと受容体の相互作用により、それぞれのケモカインに対応した受容体をもつ細胞が遊走し病態の形成・維持に重要な役割を果たすと考えられている。このうち、ヘルパーＴ細胞Th2特異的に発現されるCCケモカイン受容体４（CCR4）に結合するとされているTARC(Thymus Activation-Regulated Chemokine)が特にアトピー性皮膚炎と関連が深いと考えられている。例えば、アトピー性皮膚炎患者の罹患部に浸潤しているCD4陽性Ｔ細胞は、CCR4陽性であり、末梢血中のCCR4陽性メモリーＴ細胞も、アトピー性皮膚炎の患者では健常人に比べ優位に増加しているという報告がある。さらに、末梢血中のCCR4陽性細胞数と好酸球数、IgE値、および臨床的な重症度が相関していることも報告されている。さらに、ヒトアトピー性皮膚炎患者において、血中TARC値が高値を示し、罹患部におけるTARCの産生も亢進しているという報告もある（特許文献３および特許文献４参照）。 Chemokines are substances that are associated with atopic dermatitis. Macrophage-derived chemokines have been reported (see Patent Document 1 and Patent Document 2). Chemokines are generic names for cytokines that have a chemotactic effect on leukocytes with a molecular weight of about 8-14 kDa, and play a central role in the development and progression of various inflammations as mediators in charge of communication between inflammatory cells. Chemokines are roughly divided into four groups, C, CC, CXC, and CX3C, depending on the structure of the four cysteine sequences. Each chemokine has a receptor, C chemokine has C chemokine receptor (XCR), CC chemokine has CC chemokine receptor (CCR), CXC chemokine has CXC chemokine receptor (CXCR), CX3C chemokine has CX3C chemokine receptor (CX3CR) is broadly classified, and it is thought that cells with receptors corresponding to each chemokine migrate and play an important role in the formation and maintenance of disease states due to the interaction between chemokines and receptors. ing. Among them, TARC (Thymus Activation-Regulated Chemokine), which is said to bind to CC chemokine receptor 4 (CCR4) expressed specifically in helper T cell Th2, is considered to be particularly related to atopic dermatitis. . For example, CD4-positive T cells infiltrating the affected area of patients with atopic dermatitis are CCR4-positive, and CCR4-positive memory T cells in peripheral blood are also superior to healthy individuals in patients with atopic dermatitis. There are reports that it has increased. Furthermore, it has been reported that the number of CCR4-positive cells in peripheral blood correlates with the number of eosinophils, IgE levels, and clinical severity. Furthermore, in human atopic dermatitis patients, there are reports that the TARC level in blood is high and the production of TARC in the affected area is also increased (see Patent Document 3 and Patent Document 4).
これらの報告はTARCがアトピー性皮膚炎の疾患マーカーとなり得ること、TARCがアトピー性皮膚炎の治療標的となり得ることを示唆しているものの、TARCが健常部でも発現が認められるという報告もあり、TARCの有用性についての検討は未だ十分ではない。 Although these reports suggest that TARC can be a disease marker for atopic dermatitis and that TARC can be a therapeutic target for atopic dermatitis, there are also reports that TARC is also expressed in the healthy part, Consideration about the usefulness of TARC is still not enough.
さらに、これまでの報告は、アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いた検討およびヒトを用いた検討であったが、アトピー性皮膚炎の発症機構が動物間で同じとは限らず、イヌに特異的な診断法、治療法の確立が望まれていた。 Furthermore, previous reports were studies using atopic dermatitis model mice and studies using humans, but the onset mechanism of atopic dermatitis is not always the same among animals, and is specific to dogs. Establishment of a new diagnostic method and treatment method has been desired.
イヌTARCについては、前田ら(J. Vet. Med. Sci. 63(9):1035-1038, 2001)がアミノ酸配列、mRNAのDNA配列を決定しているが、イヌTARC抗体については得られていなかった。一方、ヒト等の他種の抗TARC抗体は市販されていたが、イヌTARCとは反応しないという問題をかかえており、また、市販のTARC抗体はTARCとの親和性が不十分で、特に細胞組織の免疫染色時に染色像が明瞭に得られないなどの問題が指摘されていた(代表的な染色像、Vestergaardら；J. Invest. Dermatol.115(4):640-646, 2000、 Uchidaら；International Immunology. 14(12):1431-1438, 2002)。 For canine TARC, Maeda et al. (J. Vet. Med. Sci. 63 (9): 1035-1038, 2001) have determined the amino acid sequence and the DNA sequence of the mRNA, but the canine TARC antibody has not been obtained. There wasn't. On the other hand, other types of anti-TARC antibodies such as humans are commercially available, but have a problem that they do not react with canine TARC. Also, commercially available TARC antibodies have insufficient affinity with TARC, especially for cells. Problems such as the inability to clearly obtain stained images during immunostaining of tissues have been pointed out (typical stained images, Vestergaard et al .; J. Invest. Dermatol. 115 (4): 640-646, 2000, Uchida et al. International Immunology. 14 (12): 1431-1438, 2002).
本発明は、イヌ等の愛玩動物におけるアトピー性皮膚炎の診断法、治療剤および治療法に関し、具体的にはケモカインの一種であるイヌTARCに対する親和性に優れたモノクローナル抗体を用いたイヌアトピー性皮膚炎の検出法、イヌTARC治療剤並びにイヌTARC治療法に関し、さらにイヌTARCを標的としたイヌTARCの治療剤および治療法に関する。 The present invention relates to a diagnostic method, a therapeutic agent, and a therapeutic method for atopic dermatitis in pets such as dogs, and specifically, canine atopic property using a monoclonal antibody having excellent affinity for canine TARC, which is a kind of chemokine. The present invention relates to a detection method for dermatitis, a therapeutic agent for canine TARC and a therapeutic method for canine TARC, and further relates to a therapeutic agent and a therapeutic method for canine TARC targeting canine TARC.
本発明者は、イヌのアトピー性皮膚炎にもTARCが関与していると考え、既に知られているイヌTARC遺伝子配列をもとに作製されたリコンビナントイヌTARCを用い、抗イヌTARC抗体を作製し、イヌアトピー性皮膚炎の検出、治療について鋭意検討を行い、本発明を完成させるに至った。 The present inventor considered that TARC is also involved in canine atopic dermatitis, and produced an anti-canine TARC antibody using recombinant canine TARC prepared based on the already known canine TARC gene sequence. The present inventors have intensively studied the detection and treatment of canine atopic dermatitis and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 高次構造を保持しているイヌTARCにのみ親和性を示すモノクローナル抗体、
[２] 高次構造を保持しているイヌTARCが有するエピトープに結合する[１]のモノクローナル抗体、
[３] [１]または[２]のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
[４] [１]または[２]の抗体とイヌ生体試料中のTARCを接触させることを含む、イヌTARCの免疫学的測定方法、
[５] ELISAである[４]のイヌTARCの免疫学的測定方法、
[６] [１]または[２]の抗体を有効成分として含む、イヌのアトピー性皮膚炎治療剤、ならびに
[７] [１]または[２]に記載の抗体をイヌのアトピー性皮膚炎罹患部に適用することを含む、イヌアトピー性皮膚炎の治療法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A monoclonal antibody having affinity only for canine TARC retaining a higher-order structure,
[2] The monoclonal antibody according to [1] that binds to an epitope possessed by canine TARC having a higher-order structure,
[3] A hybridoma producing the monoclonal antibody of [1] or [2],
[4] An immunoassay method for canine TARC, which comprises contacting the antibody of [1] or [2] with TARC in a canine biological sample,
[5] The immunological assay method for canine TARC according to [4], which is an ELISA,
[6] A therapeutic agent for canine atopic dermatitis comprising the antibody of [1] or [2] as an active ingredient, and
[7] A method for treating canine atopic dermatitis, comprising applying the antibody according to [1] or [2] to an affected part of dog atopic dermatitis.
本発明のイヌTARCモノクローナル抗体は、市販のTARCモノクローナル抗体がイヌTARCに反応しないという問題を解決する。さらに、イヌのTARCの高次構造を特異的に認識するため、既に知られているTARC抗体と比較し、細胞組織の免疫染色像が明瞭に得られ、また高感度のELISAが構築できるためにイヌアトピー性皮膚炎の診断に有効な手段を提供することが出来る。また、該モノクローナル抗体は、イヌのアトピー性皮膚炎治療のためにも有効である。 The canine TARC monoclonal antibody of the present invention solves the problem that a commercially available TARC monoclonal antibody does not react with canine TARC. Furthermore, because it specifically recognizes the higher-order structure of TARC in dogs, compared to the already known TARC antibody, immunostained images of cell tissues can be clearly obtained, and a highly sensitive ELISA can be constructed. An effective means for diagnosing canine atopic dermatitis can be provided. The monoclonal antibody is also effective for treating atopic dermatitis in dogs.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、前田(J. Vet. Med. Sci. 63(9):1035-1038, 2001)らの決定した塩基配列をもとに、組換えベクターを調製し、リコンビナントイヌTARCを発現させ、該タンパク質を精製後、マウスに免疫し細胞融合により、ハイブリドーマを作製した。作製されたハイブリドーマについて高次構造を認識しかつ親和性の高いクローンを選択することによりスクリーニングし、目的のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択した。該モノクローナル抗体を用い、イヌTARC測定用のELISAを構築すると共に、組織免疫の染色像から高次構造を保持しているイヌTARCに対する親和性を確認した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present inventors prepared a recombinant vector based on the nucleotide sequence determined by Maeda (J. Vet. Med. Sci. 63 (9): 1035-1038, 2001) and expressed recombinant dog TARC. After purifying the protein, mice were immunized and cell hybrids produced hybridomas. The prepared hybridomas were screened by recognizing higher-order structures and selecting clones with high affinity, and hybridomas producing the desired monoclonal antibodies were selected. Using this monoclonal antibody, an ELISA for canine TARC measurement was constructed, and the affinity for canine TARC retaining a higher-order structure was confirmed from a stained image of tissue immunity.
１． 組換えベクター及び形質転換体の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターにイヌTARCの遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。該遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ、公知のものを用いることができる。
(2) 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを、公知の手法により目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
(3) 抗原タンパク質の生産
抗原となるタンパク質は、前田らの報告しているイヌTARC遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつイヌTARC活性を有するものである。
1. Production of recombinant vectors and transformants
(1) Preparation of recombinant vector The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating (inserting) a canine TARC gene into an appropriate vector. The vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and the like, and known ones can be used.
(2) Production of transformant The transformant of the present invention can be obtained by introducing the above recombinant vector into a host so that the target gene can be expressed by a known technique.
(3) Production of antigen protein The antigen protein has an amino acid sequence encoded by the canine TARC gene reported by Maeda et al., Or the mutation is introduced into at least one amino acid in the amino acid sequence. It has an amino acid sequence and has canine TARC activity.
抗原となるイヌTARCタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。 Canine TARC protein as an antigen can be obtained by culturing the transformant and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells or cultured cells, or disrupted cells or cells.
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。 The method for culturing the transformant of the present invention is carried out according to a usual method used for culturing a host. As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, a generally used RPMI1640 medium, DMEM medium, a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums, or the like is used.
培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 The culture is usually performed at 37 ° C. for 1 to 30 days in the presence of 5% CO 2 . During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as necessary.
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりイヌTARCタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。 After culturing, when the protein of the present invention is produced in cells or cells, canine TARC protein is extracted by disrupting the cells or cells. When the protein of the present invention is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, From the above, the protein of the present invention can be isolated and purified.
２． モノクローナル抗体の作製
本発明のイヌTARCモノクローナル抗体は、1.(3)に記載した方法により作製された抗原を用い、哺乳動物を免疫するかあるいはインビトロ法により免疫したリンパ球細胞を、哺乳動物の骨髄腫細胞（ミエローマ） などと融合させ、ハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマ培養液について、高度に精製されたイヌTARCを抗原として用いて、高次構造を保持した状態のイヌTARCに反応し、2-メルカプトエタノールやジチオスレイトールのような還元剤処理により、S-S が開裂され立体構造のみが破壊されたTARC には全く反応しないものをスクリーニングすることで、高次構造を保持したイヌTARCのみに反応するモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを選択し、このクローンを培養することにより目的とする抗体を得ることが出来る。
2. Production of Monoclonal Antibody The canine TARC monoclonal antibody of the present invention uses the antigen produced by the method described in 1. (3) and immunizes a mammal or lymphocytes immunized by an in vitro method. Fused with myeloma cells (myeloma), etc. to produce a hybridoma, and this hybridoma culture solution reacts with highly purified canine TARC as an antigen and reacts with canine TARC in a state of maintaining higher-order structure. -Reactants treated with reducing agents such as mercaptoethanol and dithiothreitol react only with canine TARC that retains higher order structure by screening for those that do not react at all with TARC that has been cleaved by SS and only the three-dimensional structure is destroyed. A monoclonal antibody producing hybridoma to be obtained and culturing this clone to obtain the desired antibody Can.
(1) ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製にあたっては哺乳動物を使用する場合、どのような系も使用可能であるがマウスやラットなどの小動物を使用した例が一般的である。免疫は、イヌTARCを生理食塩水等により適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じて免疫アジュバントを併用投与し、動物に2-20日毎に2 から5 回投与する。このようにして免疫された動物を最終免疫後3 日目に解剖し、脾臓を摘出し、脾臓細胞を免疫細胞として使用する。細胞腫細胞としては、例えばp3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1,MPC-11, SP-2/0, FO, P3 x 63 Ag 8. 653, S194などが例示できる。またラット由来の細胞としてはR-210 などの細胞株を例示できる。免疫細胞と形質転換細胞株又はミエローマとの融合は公知の方法、例えばKoehler とMilsteinらの方法(Koehler, G. et al. Nature vol.256, 495-497,1975)が一般的であるが、電気パルスを使用した電気パルス法なども使用可能である。免疫細胞と形質転換細胞は通常行われている細胞数の比に混合し、通常用いられる細胞培養用培地(FCS不含) にポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、FCS 添加HAT 選択培地で培養を行い、融合細胞を選別する。
(1) Preparation of hybridoma When preparing a hybridoma, when using a mammal, any system can be used, but an example using a small animal such as a mouse or a rat is common. For immunization, dilute canine TARC to an appropriate concentration with physiological saline, etc., and administer this solution intravenously or intraperitoneally. Administer 2 to 5 times. Animals thus immunized are dissected 3 days after the final immunization, the spleen is removed, and the spleen cells are used as immune cells. Examples of celloma cells include p3 / x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2 / 0, FO, P3 x 63 Ag 8.653, S194, and the like. Examples of rat-derived cells include cell lines such as R-210. Fusion of an immune cell and a transformed cell line or myeloma is generally performed by a known method such as the method of Koehler and Milstein et al. (Koehler, G. et al. Nature vol. 256, 495-497, 1975). An electric pulse method using an electric pulse can also be used. Immune cells and transformed cells are mixed in the usual ratio of the number of cells, and polyethylene glycol is added to the usual cell culture medium (without FCS) for fusion treatment, and then FCS-added HAT selection medium is used. Incubate and select fused cells.
(2) 抗体産生ハイブリドーマの選別
本発明のイヌTARCに対する抗体は、高次構造を保持したイヌTARCにのみに反応し、高次構造が失われたイヌTARCには全く反応しない。該抗体はイヌTARCが天然状態における完全な高次構造を保持しているときにのみ有しており、高次構造が失われたときに消失するエピトープを認識する。該エピトープは連続したまたは不連続のアミノ酸数個からなり、高次構造が保持されているときにTARC分子の外側に露出している。また、TARC分子から一部アミノ酸が欠失等したTARCの部分ペプチドであっても、高次構造の保持に関与するアミノ酸を有しているときには、完全な高次構造が保持されているときに有しているエピトープを有し得る。本発明の抗体は、このようにエピトープを認識し、結合する抗体も含む。
(2) Selection of antibody-producing hybridoma The antibody against canine TARC of the present invention reacts only with canine TARC retaining the higher order structure, and does not react at all with canine TARC in which the higher order structure is lost. The antibody possesses only when canine TARC retains the full conformation in the natural state and recognizes an epitope that disappears when the conformation is lost. The epitope consists of several consecutive or discontinuous amino acids and is exposed outside the TARC molecule when a higher order structure is retained. In addition, even if the partial peptide of TARC has a partial deletion of amino acids from the TARC molecule, when it has an amino acid involved in maintaining a higher-order structure, the complete higher-order structure is maintained. It may have an epitope that it has. The antibodies of the present invention also include antibodies that recognize and bind to epitopes in this way.
高次構造を保持したイヌTARCにのみに反応し、高次構造が失われたイヌTARCには全く反応しない抗体生産ハイブリドーマを選別するにはELISA法、プラーク法、オクタロニー法、凝集法などとウエスタンブロッティング法との組合せが原理的に使用可能である。 To select antibody-producing hybridomas that react only with canine TARC that retains higher-order structure but do not react at all with canine TARC that has lost higher-order structure, ELISA, plaque method, octalony method, aggregation method, etc. A combination with a blotting method can be used in principle.
その中でも、ELISA 法が簡便で、かつ精度が良いため一般的に良く用いられているが、通常の抗体検出に用いられる方法を採用するだけでは本発明の高次構造を保持したタンパク質のみを認識する抗体産生ハイブリドーマを選別することは困難で成功しない。従来技術において組織の免疫染色像などが明瞭に得られなかったのは、この細胞選別に問題があったからである。これは、TARCは高次構造が保持され、はじめて生物活性が発揮されるのに対し、適当な高次構造部位を認識する抗体が得られていなかったからである。また、生物活性を発揮しているTARCのみを検出することによりイヌのアトピー性皮膚炎病態を反映した診断結果を得ることができる。 Among them, the ELISA method is generally used because it is simple and accurate, but only the protein having the higher-order structure of the present invention is recognized only by adopting the method used for normal antibody detection. It is difficult and unsuccessful to select antibody-producing hybridomas. The reason why the immunostained image of the tissue could not be clearly obtained in the prior art is because of this cell sorting problem. This is because TARC retains its higher-order structure and exhibits biological activity for the first time, whereas an antibody that recognizes an appropriate higher-order structure site has not been obtained. Further, by detecting only TARC exhibiting biological activity, a diagnostic result reflecting the pathological condition of atopic dermatitis in dogs can be obtained.
そこで発明者らは、選抜方法を工夫し、2-メルカプトエタノールやジチオスレイトールのような還元剤処理により、S-S が開裂され立体構造のみが破壊されたイヌTARCには反応せず、高次構造が保持されているイヌTARCに反応するハイブリドーマを選別した。すなわち、固相化した高次構造保持イヌTARCに反応し、2-メルカプトエタノールやジチオスレイトールのような還元剤処理により、S-S が開裂され立体構造のみが破壊されたイヌTARCに反応しないようなハイブリドーマを選別した。 Therefore, the inventors devised a selection method and did not react with canine TARC in which SS was cleaved and the steric structure was destroyed only by treatment with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol, but the higher order structure was not reacted. Hybridomas that react with canine TARCs that are retained are selected. In other words, it reacts with a solid-stated higher-order structure-retained canine TARC and does not react with canine TARC in which SS is cleaved due to treatment with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol and only the steric structure is destroyed. Hybridomas were selected.
本発明の改良された選抜方法は、ELISA法と還元処理を行ったイヌTARCのSDS-PAGEを用いたウエスタンブロッティング法との組合わせによる選抜方法である。該選抜方法により選別に成功したハイブリドーマを本発明におけるELISA を用いながら、限界希釈法により3 - 5 回クローニングし安定な抗体生産株として樹立する。このようにして樹立されたハイブリドーマは通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイブリドーマは常法により培養するか、または哺乳動物の腹腔内に移植し、腹水として培養液を回収する。回収した培養液は塩析法、ゲル濾過法、プロテインA またはG アフィニティークロマトグラフィーなどの通常の方法により精製できる。得られた抗体は高次構造を保持しているイヌTARCにのみ反応する抗体でイヌTARCの測定や精製に使用できる。イヌTARCの測定に使用する場合は、放射性アイソトープや酵素によりラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)やエンザイムイムノアッセイ(EIA) として知られている測定系においてイヌTARC定量用特異的抗体として使用するこができる。 The improved selection method of the present invention is a selection method by a combination of the ELISA method and the Western blotting method using SDS-PAGE of canine TARC subjected to reduction treatment. Hybridomas that have been successfully selected by the selection method are cloned 3-5 times by the limiting dilution method using the ELISA of the present invention to establish a stable antibody-producing strain. The hybridoma thus established can be subcultured by an ordinary culture method, and can be stored frozen as necessary. The hybridoma is cultured by a conventional method or transplanted into the abdominal cavity of a mammal, and the culture solution is collected as ascites. The collected culture can be purified by conventional methods such as salting out, gel filtration, protein A or G affinity chromatography. The obtained antibody reacts only with canine TARC having a higher-order structure and can be used for measurement and purification of canine TARC. When used for measurement of canine TARC, it can be used as a specific antibody for canine TARC quantification in a measurement system known as radioimmunoassay (RIA) or enzyme immunoassay (EIA) by labeling with a radioisotope or enzyme. Can do.
本発明のイヌTARCモノクローナル抗体は、イヌのアトピー性皮膚炎の検出およびイヌのアトピー性皮膚炎の治療の両方に用いることができるが、治療剤として用いる場合は、イヌの体内に投与した場合に免疫反応を惹起しないものが望ましい。このような抗体として、抗体の定常領域をイヌの定常領域に置き換えたキメラ抗体、定常領域および超可変領域を除く全ての可変領域をイヌの配列に置き換えたイヌ化抗体等が挙げられる。 The canine TARC monoclonal antibody of the present invention can be used for both the detection of canine atopic dermatitis and the treatment of canine atopic dermatitis, but when used as a therapeutic agent, Those that do not elicit an immune response are desirable. Such antibodies include chimeric antibodies in which the constant region of the antibody is replaced with a canine constant region, and canine antibodies in which all variable regions except the constant region and the hypervariable region are replaced with canine sequences.
本発明の組換えイヌTARCに対するモノクローナル抗体は、ネフロメトリー、競合法、サンドイッチ法等により、本発明の組換えイヌTARCの定量に使用できる。 The monoclonal antibody against the recombinant canine TARC of the present invention can be used for quantification of the recombinant canine TARC of the present invention by nephrometry, competition method, sandwich method or the like.
本発明の抗イヌTARC抗体を用いてイヌ生体試料中のTARCを免疫学的に検出することができる。ここで、イヌ生体試料とは、血清、血漿、尿、髄液、病変部組織等の体液または組織をいう。 TARC in canine biological samples can be detected immunologically using the anti-canine TARC antibody of the present invention. Here, the canine biological sample refers to bodily fluids or tissues such as serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, and lesioned tissue.
また、酵素免疫測定法（EIA）においては、抗イヌTARC抗体をマイクロプレート、樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等の担体に物理吸着や化学結合により固相化する。固相化量は、特に限定されないが担体がマイクロプレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべき抗体を適切な緩衝液に溶解し、担体と接触させることにより行うことができる。例えば、マイクロタイターウエルを用いる場合、適当な濃度に調製した抗体溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。抗体を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。次いで、固相化担体と試料を反応させ、洗浄後、標識抗イヌTARC抗体を反応させる。標識はβ−D−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼやグルコースオキシダーゼ等の酵素を用いて行うことができる。例えば、酵素免疫測定法(EIA)においては、多数のウエル（例えば、96穴）を有するマイクロタイタープレートに抗体を固相化させ、ウエル中で抗原抗体反応を行わせることにより一度に大量測定が可能になる。また用いる抗体及び試料の使用量を非常に少なくすることも可能である。さらに、全自動EIA測定装置などの自動測定機器を用いることも可能になる。 In enzyme immunoassay (EIA), an anti-canine TARC antibody is immobilized on a carrier such as a microplate, resin beads, or magnetized beads by physical adsorption or chemical bonding. The amount of the solid phase is not particularly limited, but when the carrier is a microplate, it is preferably several ng to several tens of μg per well. The immobilization can be performed by dissolving the antibody to be immobilized in an appropriate buffer and bringing it into contact with a carrier. For example, when a microtiter well is used, the antibody solution prepared to an appropriate concentration can be dispensed into a well of a microtiter plate and allowed to stand for a certain period of time. After immobilizing the antibody, it is preferable to perform blocking using a blocking solution containing bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin and the like in order to prevent non-specific binding during the assay. Next, the immobilized carrier and the sample are reacted, and after washing, a labeled anti-canine TARC antibody is reacted. The labeling can be performed using an enzyme such as β-D-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase. For example, in enzyme immunoassay (EIA), a large amount of measurement can be performed at once by immobilizing an antibody on a microtiter plate having a large number of wells (eg, 96 wells) and causing an antigen-antibody reaction in the well. It becomes possible. It is also possible to reduce the amount of antibody and sample used. Furthermore, it is possible to use an automatic measuring device such as a fully automatic EIA measuring device.
本発明は、イヌ生体試料中のイヌTARCの検出を可能にするキットの提供をも目的とするが、該キットは少なくとも抗イヌTARC抗体を含む。該キットが酵素免疫測定法に基づく場合は、抗体を固相化した担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。また、該キットは適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。 The present invention also aims to provide a kit that enables detection of canine TARC in a canine biological sample, the kit comprising at least an anti-canine TARC antibody. When the kit is based on an enzyme immunoassay, an antibody-immobilized carrier may be included, and the antibody may be bound to the carrier in advance. The kit may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating the sample, and the like.
本発明の抗体をアトピー性皮膚炎の治療に用いることも可能である。
本発明の抗体を含む製剤の投与形態は限定されず、経口、非経口、経粘膜（例えば舌下または口腔投与）、局所、経皮、直腸、吸入（例えば鼻または肺奥吸入）等により投与することができる。非経口投与として、静脈内、皮下、筋肉内注射等が挙げられる。局所または経皮製剤は粉末、エマルジョン、懸濁液、スプレー、クリーム、軟膏、ローションおよびペースト等の形態で用いられ、または薬用膏薬、パッチまたは膜の形で用いられる。さらにシャンプー、リンスに本発明の抗体を含有させてもよい。治療に用いるに必要な本発明の抗体の量は、治療する病状の性質、被験体の年齢と状態で変わり、最終的には担当獣医が決めることができる。例えば、軟膏等の局所適用形態では、抗体を、例えば０．１〜９９％の濃度で含有し、１日あたり０．０５〜２ｍｇの抗体を投与すればよい。所定の投与量は一回の投与で与えてもよいし、１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の分割投与の適当な間隔で与えてもよい。
さらに、イヌTARCを分子標的とした治療剤も本発明の範囲に含まれる。
The antibody of the present invention can also be used for the treatment of atopic dermatitis.
The administration mode of the preparation containing the antibody of the present invention is not limited, and it is administered orally, parenterally, transmucosally (for example, sublingual or buccal administration), topical, transdermal, rectal, inhalation (for example, nasal or pulmonary inhalation), etc. can do. Parenteral administration includes intravenous, subcutaneous, intramuscular injection and the like. Topical or transdermal formulations are used in the form of powders, emulsions, suspensions, sprays, creams, ointments, lotions and pastes, or in the form of medicated salves, patches or films. Further, the antibody of the present invention may be contained in shampoo and rinse. The amount of the antibody of the present invention required for treatment will vary depending on the nature of the condition being treated, the age and condition of the subject, and can ultimately be determined by the attending veterinarian. For example, in a topical application form such as an ointment, the antibody may be contained at a concentration of 0.1 to 99%, for example, and 0.05 to 2 mg of antibody may be administered per day. The predetermined dose may be given in a single dose or may be given at appropriate intervals of 2, 3, 4 or more divided doses per day.
Furthermore, therapeutic agents targeting canine TARC as a molecular target are also included in the scope of the present invention.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
〔実施例1〕大腸菌による抗原用組換えイヌTARCタンパク質の作出
前田ら(J. Vet. Med. Sci. 63(9):1035-1038, 2001)が論文中で報告しているイヌTARCのタンパク質翻訳領域を全長を含むプラスミドDNAを鋳型とし、PCR法によりイヌTARCタンパクをコードするDNA断片を調製した。こDNA断片を大腸菌発現ベクターであるpGEX4T-1（Amersham Bioscience社）に連結した。大腸菌の形質転換を行い、イヌTARC遺伝子が含まれる大腸菌クローンを選択しプラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドDNAを大腸菌BL21株（TaKaRa社）に形質転換した。形質転換された大腸菌をLB培地（50μg/mlアンピシリン含）で培養し、培養液に100mM IPTGを添加して発現を誘導し、37℃でさらに3時間培養した。培養液を遠心管に移し、4℃で6,000rpm、10分間遠心して集菌した。
[Example 1] Production of recombinant canine TARC protein for antigen by Escherichia coli Canine TARC protein reported in a paper by Maeda et al. (J. Vet. Med. Sci. 63 (9): 1035-1038, 2001) A DNA fragment encoding canine TARC protein was prepared by PCR using plasmid DNA containing the entire translation region as a template. This DNA fragment was ligated to pGEX4T-1 (Amersham Bioscience) which is an E. coli expression vector. E. coli was transformed, an E. coli clone containing the canine TARC gene was selected, and the plasmid DNA was purified. The obtained plasmid DNA was transformed into E. coli BL21 strain (TaKaRa). The transformed E. coli was cultured in LB medium (containing 50 μg / ml ampicillin), and 100 mM IPTG was added to the culture to induce expression, followed by further cultivation at 37 ° C. for 3 hours. The culture solution was transferred to a centrifuge tube, and collected by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.
上清を除去し、沈殿を氷冷しておいたソニケーションバッファー（50mM Tris-HCl、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT；pH8.0）に懸濁し、超音波処理を行い、大腸菌を破壊した。冷却しておいた10% Triton X-100を終濃度1%になるように添加し、4℃で18,000rpm、30分間遠心した。上清をグルタチオンセファロース4Bカラム(Amersham Bioscience社)および、ゲル濾過カラムSuperrose12HR10/30（Amersham Bioscience社）を用いたFPLCファルマシアFPLCシステムを用い、抗原として使用するイヌTARCタンパク質を精製した。 The supernatant was removed, and the precipitate was suspended in ice-cooled sonication buffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT; pH 8.0), and sonicated to destroy E. coli. . Chilled 10% Triton X-100 was added to a final concentration of 1%, and centrifuged at 18,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. The canine TARC protein used as an antigen was purified from the supernatant using an FPLC Pharmacia FPLC system using a glutathione sepharose 4B column (Amersham Bioscience) and a gel filtration column Superrose 12HR10 / 30 (Amersham Bioscience).
〔実施例２〕ハイブリドーマの作製と選別
実施例１で得た精製イヌTARCを100 μg/100 μｌの濃度に精製水に溶解し、この溶液を2 週おきにBALB/cマウスの腹腔内に投与し免疫を行った。初回および2 回目の免疫においては等容量のフロイントコンプリートアジュバントとのエマルジョンを投与した。最終の免疫から3 日目に脾臓を摘出し、B リンパ球を分離し、マウスミエローマ細胞とをKoehler とMilsteinらの方法(Koehler, G., et al. Nature vol. 256, 495-497, 1975) に従って細胞融合させた。ついで融合細胞を選択するためにHAT 培地で培養することによりセレクションを行った。
[Example 2] Production and selection of hybridoma The purified canine TARC obtained in Example 1 was dissolved in purified water at a concentration of 100 µg / 100 µl, and this solution was administered into the abdominal cavity of BALB / c mice every 2 weeks. And immunized. In the first and second immunizations, an emulsion of an equal volume of Freund's complete adjuvant was administered. On the third day after the final immunization, the spleen was removed, B lymphocytes were isolated, and mouse myeloma cells were combined with the method of Koehler and Milstein et al. (Koehler, G., et al. Nature vol. 256, 495-497, 1975). ) Cell fusion was performed. Subsequently, selection was performed by culturing in HAT medium in order to select fused cells.
次にセレクションした細胞の中から高次構造を保持しているイヌTARCにのみ反応し、高次構造が失われたイヌTARCには全く反応しない抗イヌTARC抗体を産生しているハイブリドーマを、ソリッドフェーズELISA と還元処理後のウエスタンブロッティングの組合わせにより選抜し取得した。 Next, the hybridoma producing an anti-canine TARC antibody that reacts only with canine TARC retaining the higher order structure among the selected cells and does not react at all with canine TARC that has lost the higher order structure is solid. Selected and acquired by a combination of phase ELISA and Western blotting after reduction treatment.
即ち、固相抗原（イヌTARC）にハイブリドーマの培養液を直接反応させ、反応性を確認する通常のソリッドフェーズELISA で陽性となり、かつ、還元処理後のウエスタンブロッティングにおいて陰性を示すようなハイブリドーマを選択した。 That is, a hybridoma culture solution is directly reacted to a solid phase antigen (canine TARC), and a hybridoma that is positive in a normal solid phase ELISA for confirming the reactivity and negative in Western blotting after reduction treatment is selected. did.
実施例 1で得た精製イヌTARC 100μｌ（10μg/ml 0.1 M NaHCO3）を96ウエルイムノプレート(Nunc 社) に添加し、室温で一夜固相化した。固相化後、それぞれのウエルを1％BSA-PBS100 μｌで、37℃、1 時間ブロックした。ウエルを0.05% Tween 20 を含むPBS(洗浄バッファー) で3 回洗浄した後、各ハイブリドーマの培養液について、その50 μｌづつをそれぞれイヌTARCを固相化したウエルに添加し37℃で１時間インキュベートした。１時間の反応後、各ウエルを洗浄バッファーで5 回洗浄した。イヌTARC結合した抗体（マウスIgG）を検出するために、パーオキシダーゼ(POD) 標識されたヤギ抗マウスIgG （γ） ポリクローナル抗体(Zymet社) を1% BSA-PBSで2000倍に希釈し、その50 μｌを96- ウエルイムノプレートの各ウエルに添加し、37℃で1 時間反応させた。各ウエルを洗浄バッファーで5 回洗浄後、酵素基質溶液(ABTS液) 50μｌを各ウエルに添加、37℃、10 分間反応させた。酵素反応は各ウエルに50μl の0.32％フッ化ナトリウム溶液を添加して停止させた。各ウエルの414 nmの吸光度をイムノリーダー（BioRad社）で測定した。ソリッドフェーズELISA 各ハイブリドーマに対して行うことで、ハイブリドーマを選択した。得られたハイブリドーマについて3 回クローニングを行い、6つのハイブリドーマを樹立した。 100 μl (10 μg / ml 0.1 M NaHCO 3 ) of purified canine TARC obtained in Example 1 was added to a 96-well immunoplate (Nunc) and immobilized at room temperature overnight. After immobilization, each well was blocked with 100 μl of 1% BSA-PBS at 37 ° C. for 1 hour. After the wells were washed three times with PBS containing 0.05% Tween 20 (wash buffer), 50 μl of each hybridoma culture was added to each well where dog TARC was immobilized and incubated at 37 ° C. for 1 hour. did. After the reaction for 1 hour, each well was washed 5 times with a washing buffer. To detect canine TARC-bound antibody (mouse IgG), peroxidase (POD) -labeled goat anti-mouse IgG (γ) polyclonal antibody (Zymet) was diluted 2000 times with 1% BSA-PBS. 50 μl was added to each well of a 96-well immunoplate and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. After washing each well 5 times with a washing buffer, 50 μl of enzyme substrate solution (ABTS solution) was added to each well and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The enzymatic reaction was stopped by adding 50 μl of 0.32% sodium fluoride solution to each well. The absorbance at 414 nm of each well was measured with an immunoreader (BioRad). Solid phase ELISA Hybridomas were selected by performing for each hybridoma. The obtained hybridomas were cloned three times to establish six hybridomas.
実施例1の精製TARCにメルタプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファー(BioRad社)で還元した後に、ポリアクリルアミドゲル（パジェル5-20％グラジェントゲル；ATTO社）を用いてSDS-PAGEを行った。得られたゲルをPVDFメンブランフィルター(Amersham Bioscience社製)に転写した。クローニングを終えたハイブリドーマクローンの培養上精を精製し、ビオチン標識したものをプローブとしてウエスタンブロッティングを行った。ECLプラスウエスタンブロッティングディテクションリージェント（Amersham Bioscience社）を加え、イヌTARCタンパク質と各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体との反応性について調査した。その結果、上記6つのクローン中還元処理後のウエスタンブロッティングで陽性反応を示さない抗体産生ハイブリドーマを1クローン取得し、CTA-1と名づけた。 The purified TARC of Example 1 was reduced with Laemmli sample buffer (BioRad) containing meltapethanol, and then subjected to SDS-PAGE using polyacrylamide gel (Pagel 5-20% gradient gel; ATTO). The resulting gel was transferred to a PVDF membrane filter (Amersham Bioscience). The culture supernatant of the hybridoma clone that had been cloned was purified and subjected to Western blotting using a biotin-labeled probe as a probe. ECL plus western blotting detection reagent (Amersham Bioscience) was added, and the reactivity between the canine TARC protein and the monoclonal antibody produced by each hybridoma was investigated. As a result, one clone of an antibody-producing hybridoma that did not show a positive reaction in Western blotting after the reduction treatment in the above 6 clones was obtained and named CTA-1.
以上のように、ソリッドフェーズELISAと還元処理後のウエスタンブロッティングを使用し、高次構造が保持されたイヌTARCにのみ親和性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択した結果、目的とする抗体を産生するハイブリドーマの出現率は約17% 程度で、他はすべてウエスタンブロッティングにおいても反応し、高次構造の有無に関わらず抗体を認識するモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマであった。 As described above, using a solid phase ELISA and Western blotting after reduction, a monoclonal antibody-producing hybridoma that has affinity only for the canine TARC retaining the higher-order structure is selected, and as a result, the desired antibody is produced. The appearance rate of hybridomas was about 17%, and all others reacted even in Western blotting, and were hybridomas that recognize monoclonal antibodies that recognize antibodies regardless of the presence or absence of higher-order structures.
〔実施例３〕モノクローナル抗体を用いた病変組織の免疫染色
アトピー性皮膚炎のイヌの患部組織から凍結切片を作製し、冷風ドライヤーにて風乾した。パップペンで切片の周りを囲み、４％パラフォルムアルデヒドを用いて15分間反応させ固定した。TBSTで5分間3回洗浄を行った後、ブロッキング用希釈正常馬血清を滴下して20分間室温にてブロッキングを行った。実施例２で得られたCTA-1の培養上清液を精製したモノクローナル抗体を一次抗体とし、ブロッキング液で適切に希釈し、一晩室温で反応させた。TBSTで５分間３回洗浄を行い、ビオチン標識された二次抗体を滴下して30分間反応させた。TBSTで５分間３回洗浄した後に、ABC-AP試薬を滴下して30分間反応させ、TBSTで５分間３回洗浄後、暗所にてAP基質溶液を滴下して30分間反応させた。TBSTで５分間洗浄後、更に水道水で洗浄し、切片をヘマトキシリンで核染色した。流水で水が透明になるまで水洗した後、酢酸でリンスし、水道水で水洗し、アンモニア水でbluingし、水道水で水洗した後マウントして、観察した（図１）。その結果、既に知られているTARC抗体を用いた場合と比較して細胞組織の免疫染色像が明瞭に得られた。
[Example 3] Immunostaining of a diseased tissue using a monoclonal antibody A frozen section was prepared from the affected tissue of a dog with atopic dermatitis and air-dried with a cold air dryer. The area around the section was covered with a patch pen, and the mixture was reacted and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. After washing with TBST three times for 5 minutes, diluted normal horse serum for blocking was added dropwise and blocking was performed for 20 minutes at room temperature. The monoclonal antibody obtained by purifying the CTA-1 culture supernatant obtained in Example 2 was used as a primary antibody, which was appropriately diluted with a blocking solution and allowed to react overnight at room temperature. After washing with TBST three times for 5 minutes, a biotin-labeled secondary antibody was added dropwise and allowed to react for 30 minutes. After washing 3 times with TBST for 5 minutes, ABC-AP reagent was added dropwise to react for 30 minutes. After washing 3 times with TBST for 5 minutes, AP substrate solution was added dropwise in the dark to react for 30 minutes. After washing with TBST for 5 minutes, the cells were further washed with tap water, and the sections were nuclear-stained with hematoxylin. After rinsing with running water until the water became transparent, it was rinsed with acetic acid, rinsed with tap water, blued with ammonia water, rinsed with tap water, mounted, and observed (FIG. 1). As a result, an immunostained image of the cell tissue was clearly obtained as compared with the case where the already known TARC antibody was used.
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