JP2005097237A - Gonadal function improving agent - Google Patents

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Hisanori Matsui
久典 松井
Hirokazu Matsumoto
寛和 松本
Chieko Kitada
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a gonadal function improving agent, more particularly, gonadal function improving agent such as an agent for the prevention and treatment of infertility, ovulation inducing and promoting agent, gonadotropic secretion promoting agent, and the like. <P>SOLUTION: Metastin and a compound promoting the metastin activity, or the like, are useful as an excellent gonadal function improving agent, an ovulation inducing and promoting agent, a gonadotropic secretion promoting agent or a sex hormone secretion promoting agent and effective for the safe prevention and treatment of infertility, hormone-sensitive cancer, endometriosis, or the like. Metastin and metastin receptor are useful for the screening of these medicines. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、性腺機能改善剤に関する。詳しくは、不妊症の予防・治療剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進または阻害剤、性ホルモン分泌促進または阻害剤、ホルモン感受性癌の予防・治療剤およびこれら剤のスクリーニング、不妊症の診断などに関する。   The present invention relates to a gonad function improving agent. In detail, prophylactic / therapeutic agents for infertility, ovulation inducers or promoters, gonadotropin secretion promoters / inhibitors, sex hormone secretagogue promoters / inhibitors, hormone-sensitive cancer prophylactic / therapeutic agents, screening of these agents, infertility Related to the diagnosis of

結婚年齢の遅延に伴う不妊率の上昇や少子化は、今日の先進国において世界的な問題であり、不妊症治療に対する関心は、今後ますます高まるものと考えられる。
女性の排卵障害に起因する不妊症に対しては、レコンビナントFSH（卵胞刺激ホルモン）やヒト下垂体性性腺刺激ホルモン（hMG製剤）による卵胞の発育刺激、およびヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（hCG）による排卵の誘発などが挙げられる。また、人工授精も最近では頻繁に行われるようになり、hMG-hCG療法による過排卵処理は、より広く適用されるようになった。排卵は、正常な性周期においては、脳下垂体から黄体ホルモン（LH）が大量に放出され、これが成熟した卵胞顆粒膜細胞のLH受容体に受容されることで誘発される。上記のhCGは、この内因性のLHサージを模倣することを基盤としており、hCGがLHに代わってLH受容体を刺激することが、排卵誘発機序である。また最近、レコンビナントヒトLH（rhLH）の産生技術が開発され、rhLHによる排卵誘発療法も始まっている（J. Clin. Endocrinol. Metab. 86巻, 2607-2618頁, 2001年）。LHを受容した卵巣内では、数多くの遺伝子の発現が誘導され、その後の排卵へと続く。排卵現象に直接関与しているのは、LHそのものと言うよりむしろ、LHによって誘導される遺伝子産物である。例えばプロゲステロン受容体やシクロオキシゲナーゼ−2など、LHの下流遺伝子をノックアウトすると、排卵が阻害されることが報告されている（総説、Steroids、65巻、559-570頁、2000年；Endocrinology、143巻、2823-2835頁、2002年）。hMG-hCG療法の拡大に伴い、合併症を発症する患者が増加し、臨床上の大きな問題となっている。最も発生頻度の高い合併症の一つに、卵巣過剰刺激症候群（OHSS）が挙げられる。OHSSは医原性疾患であり、hMG、hCGの投与、またはその後の妊娠の成立に伴う母体でのhCG産生の亢進が発症の原因となる。重症例では卵巣腫大や腹水貯留を来たし、患者の生命に危険が及ぶことすらある。そのため臨床では、OHSSを予防する様々な診断方法が存在し、血中エストロゲン濃度が高値を示した場合や、超音波診断により卵巣に多くの嚢胞を認めた場合などには、排卵誘発を中止するなどの策がとられている（Acta Obstet. Gynecol. Scand. 80巻、878-882頁、2001年）。
男性側に起因する不妊症に対しては、精索静脈瘤や精路の閉塞などの物理的要因が存在する場合には、内科的または外科的治療が施されるが、造精機能異常や射精障害などの生殖機能に原因が存在する場合には、有効な治療法はほとんど確立されていない。
卵子や精子の成熟には、脳下垂体から放出されるFSH、LHなどのゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）が大きく関与している。これらゴナドトロピンの放出は、視床下部から放出されるGnRH（ゴナドトロピン放出ホルモン）によって誘発される。通常GnRHの放出は、ある一定の間隔ごとに行われ、その結果、FSHおよびLHは一定の間隔で放出される。GnRHのパルス状放出は、ある一定レベルの血中ゴナドトロピンを維持するのに重要であり、GnRHの持続的投与は、逆に血中ゴナドトロピン濃度の低下を引き起こす（Science、202巻、631-633頁、1978年）。パルス状に放出されたFSHおよびLHは、卵巣や精巣において、それぞれ卵子や精子の成熟、性ホルモンの合成などを促す。また、幼少期における生殖器官の発達や、思春期における生殖器官の成熟にも、GnRHおよびゴナドトロピンのパルス状放出が関与している。また、排卵は、排卵直前にLHおよびFSHが大量に放出されることで誘発され、この際にもGnRHの大量分泌が起こるとされている。このように、GnRH、ゴナドトロピンは、雌雄いずれの個体においても生殖機能を支える重要な因子であり、これらの機能異常は、不妊を主調とした生殖機能の異常として反映される（Endocrinology、143巻、2823-2835頁、2002年）。
一方、ヒトメタスチン（ヒトKiSS-1ペプチド）は、ヒト胎盤から精製された54アミノ酸を有するペプチドであり、Gタンパク質共役受容体ヒトOT7T175に対するリガンドである（特許文献１ WO 00/24890号公報）。ヒトメタスチンのラット型（ラットメタスチン）およびマウス型（マウスメタスチン）も報告されている（特許文献２ WO 01/75104号公報）。メタスチンは、癌転移抑制活性を有し、癌（例、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、脳腫瘍等）の予防・治療に、膵臓機能調節作用を有し、膵臓疾患（例えば、急性または慢性膵炎、膵癌等）の予防・治療に、胎盤機能調節作用を有し、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩異常の予防・治療に有用である（WO 00/24890号公報、WO 01/75104号公報等）。さらに、メタスチンを含有する徐放製剤も報告されている（WO 02/85399号公報）。また最近、妊婦の血中メタスチン濃度が、妊娠の開始と共に急激に上昇し、出産まで高い発現が維持されることが示された（J. Clin. Endocrinol Metab.、88巻、914-919頁、2003年）。
WO 00/24890号公報 WO 01/75104号公報 Increasing infertility and declining birth rates due to delayed marriage age are global problems in today's developed countries, and interest in infertility treatment is expected to increase in the future.
For infertility caused by female ovulation disorders, follicular developmental stimulation with recombinant FSH (follicle stimulating hormone) or human pituitary gonadotropin (hMG preparation), and human placental gonadotropin (hCG) Examples include induction of ovulation. In addition, artificial insemination has recently been performed frequently, and superovulation treatment by hMG-hCG therapy has become more widely applied. Ovulation is triggered by the release of a large amount of luteinizing hormone (LH) from the pituitary gland during the normal sexual cycle, which is received by the LH receptor of mature follicular granulosa cells. The above hCG is based on mimicking this endogenous LH surge, and hCG stimulates the LH receptor instead of LH is the mechanism of inducing ovulation. Recently, a technique for producing recombinant human LH (rhLH) has been developed, and ovulation induction therapy using rhLH has begun (J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 2607-2618, 2001). In the ovary that has received LH, the expression of a number of genes is induced, followed by subsequent ovulation. It is the gene product induced by LH rather than LH itself that is directly involved in the ovulation phenomenon. For example, it has been reported that knocking out LH downstream genes such as progesterone receptor and cyclooxygenase-2 inhibits ovulation (Review, Steroids, 65, 559-570, 2000; Endocrinology, 143, 2823-2835, 2002). With the expansion of hMG-hCG therapy, the number of patients who develop complications is increasing, which is a major clinical problem. One of the most common complications is ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS). OHSS is an iatrogenic disease, which is caused by administration of hMG, hCG, or increased hCG production in the mother following the establishment of pregnancy. Severe cases may cause ovarian enlargement or ascites retention, and may even endanger the patient's life. Therefore, there are various diagnostic methods to prevent OHSS in the clinical setting, and ovulation induction is stopped when the blood estrogen concentration is high or when many cysts are found in the ovary by ultrasonic diagnosis. (Acta Obstet. Gynecol. Scand. 80, 878-882, 2001).
For infertility caused by the male side, if there are physical factors such as varicocele or sperm tract obstruction, medical or surgical treatment is given. When a cause exists for reproductive functions such as ejaculation disorders, few effective treatments have been established.
Gonadotropins (gonadotropins) such as FSH and LH released from the pituitary gland are greatly involved in the maturation of eggs and sperm. The release of these gonadotropins is triggered by GnRH (gonadotropin releasing hormone) released from the hypothalamus. Normally, GnRH is released at regular intervals, and as a result, FSH and LH are released at regular intervals. Pulsed release of GnRH is important to maintain a certain level of blood gonadotropin, and continuous administration of GnRH conversely causes a decrease in blood gonadotropin concentration (Science, 202, 631-633) 1978). FSH and LH released in a pulsed manner promote ovum and sperm maturation and sex hormone synthesis in the ovary and testis, respectively. In addition, the pulmonary release of GnRH and gonadotropin is also involved in the development of reproductive organs in early childhood and the maturation of reproductive organs in adolescence. Ovulation is induced by the release of a large amount of LH and FSH just before ovulation, and it is also said that massive secretion of GnRH occurs at this time. Thus, GnRH and gonadotropin are important factors that support reproductive function in both male and female individuals, and these functional abnormalities are reflected as abnormal reproductive functions mainly infertility (Endocrinology, Vol.143, 2823-2835, 2002).
On the other hand, human metastin (human KiSS-1 peptide) is a peptide having 54 amino acids purified from human placenta, and is a ligand for the G protein-coupled receptor human OT7T175 (Patent Document 1 WO 00/24890). A rat type (rat metastin) and a mouse type (mouse metastin) of human metastin have also been reported (Patent Document 2 WO 01/75104). Metastin has cancer metastasis inhibitory activity, and cancer (eg, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, It has a pancreatic function regulating action in the prevention and treatment of brain tumors, etc., and it has a placental function regulating action in prevention and treatment of pancreatic diseases (eg, acute or chronic pancreatitis, pancreatic cancer, etc.), choriocarcinoma, hydatidiform mole It is useful for the prevention and treatment of invading moles, miscarriages, fetal growth failure, abnormal sugar metabolism, abnormal lipid metabolism or abnormal labor (WO 00/24890, WO 01/75104, etc.). Furthermore, a sustained-release preparation containing metastin has also been reported (WO 02/85399). Recently, it was shown that the blood metastin concentration in pregnant women increased rapidly with the onset of pregnancy and maintained high expression until delivery (J. Clin. Endocrinol Metab., 88, 914-919, 2003).
WO 00/24890 WO 01/75104 Publication

上記のOHSS発症機構そのものが未解明であること、また重症の不妊女性にはhMG-hCG療法を施さざるを得ないことなどから、現在の不妊治療においてOHSSは避けることのできない疾患であると言える。hCGを代表とする従来の排卵誘発剤と同程度の排卵促進効果を有し、かつOHSSを誘発しない排卵誘発剤の開発が望まれている。さらには、男性の不妊症に有効な薬剤も望まれている。   OHSS is an unavoidable disease in current infertility treatment because the mechanism of OHSS development itself is unclear and hMG-hCG therapy must be given to severely infertile women. . Development of an ovulation inducing agent that has the same degree of ovulation promoting effect as conventional ovulation inducing agents typified by hCG and does not induce OHSS is desired. Furthermore, a drug effective for male infertility is also desired.

本発明者らは、このような現状に鑑み、鋭意検討した結果、ヒトメタスチンがゴナドトロピン放出促進作用、性腺機能改善作用、排卵促進作用などを有することを見出した。また、メタスチンによる排卵は、エストロゲン産生性顆粒膜細胞からプロゲステロン産生性黄体細胞への正常な分化を介した排卵現象であること、更に、メタスチンを持続投与することにより、ゴナドトロピンの放出および精巣におけるテストステロンの産生が低下することも明らかにし、更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies in view of the present situation, the present inventors have found that human metastin has a gonadotropin release promoting action, a gonadal function improving action, an ovulation promoting action, and the like. In addition, ovulation by metastin is an ovulation phenomenon through normal differentiation from estrogen-producing granulosa cells to progesterone-producing luteal cells, and further, by continuous administration of metastin, release of gonadotropin and testosterone in the testis As a result of further research, it has been completed that the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、
（１） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を含有してなる性腺機能改善剤、
（２） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる上記（１）記載の性腺機能改善剤、
（２ａ）配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる上記（１）記載の性腺機能改善剤、
（３） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列である上記（１）記載の性腺機能改善剤、
（３ａ）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる上記（１）記載の性腺機能改善剤、
（３ｂ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる上記（１）記載の性腺機能改善剤、
（４） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる性腺機能改善剤、
（４ａ） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：１９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有してなる性腺機能改善剤、
（５） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤、
（５ａ） 化合物が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物である上記（５）記載の性腺機能改善剤、
（６） 配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤、
（７） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤、
（８） 不妊症の予防・治療剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（９） 排卵誘発または促進剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１０） 性腺刺激ホルモン分泌促進剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１１） 性腺刺激ホルモン分泌抑制剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１２） 性ホルモン分泌促進剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１２ａ） 性ホルモンが、アンドロゲン（テストステロン、アンドロステンジオンなど）、エストロゲン（エストラジオール、エストロンなど）またはプロゲステロンである上記（１２）記載の性腺機能改善剤、
（１３） 性ホルモン分泌抑制剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１３ａ） 性ホルモンが、アンドロゲン（テストステロン、アンドロステンジオンなど）、エストロゲン（エストラジオール、エストロンなど）またはプロゲステロンである上記（１３）記載の性腺機能改善剤、
（１４） ホルモン感受性癌の予防・治療剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１５） 子宮内膜症の予防・治療剤である上記（１）〜（７）記載の性腺機能改善剤、
（１６） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる不妊症の診断薬、
（１７） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対する抗体、または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる不妊症の診断薬、
（１８） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング方法、
（１９） 性腺機能改善剤が、性ホルモン分泌抑制剤または性ホルモン分泌促進剤である上記（１８）記載のスクリーニング方法、
（２０） 性腺機能改善剤が、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤または性腺刺激ホルモン分泌促進剤である上記（１８）記載のスクリーニング方法、
（２１） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング用キット、
（２２） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング方法、
（２３） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング用キット、
（２３ａ） 上記（１８）もしくは上記（２２）記載のスクリーニング方法または上記（２１）もしくは上記（２３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる性腺機能改善剤、
（２３ｂ） 不妊症の予防・治療剤である上記（２３ａ）記載の性腺機能改善剤、
（２３ｃ） 排卵誘発または促進剤である上記（２３ａ）記載の性腺機能改善剤、
（２３ｄ） 性腺刺激ホルモン分泌促進または阻害剤である上記（２３ａ）記載の性腺機能改善剤、
（２３ｅ） 性ホルモン分泌促進または阻害剤である上記（２３ａ）記載の性腺機能改善剤、
（２４） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする、性腺機能改善法、
（２５） （i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を促進する、（ii）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する、または（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進することを特徴とする、性腺機能改善法、
（２６） 性腺機能改善剤を製造するための（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の使用、
（２７） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法および／または性ホルモン分泌抑制法、
（２７ａ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、性腺刺激ホルモン分泌が抑制されるに十分な有効量を投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法、
（２７ｂ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、性ホルモン分泌が抑制されるに十分な有効量を投与することを特徴とする、性ホルモン分泌抑制法、
（２７ｃ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、性腺刺激ホルモン分泌が抑制されるに十分な有効量を投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法、
（２７ｄ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、性ホルモン分泌が抑制されるに十分な有効量を投与することを特徴とする、性ホルモン分泌抑制法、
（２７ｅ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法、
（２７ｆ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、性ホルモン分泌抑制法、
（２７ｇ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法、
（２７ｈ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、性ホルモン分泌抑制法、
（２８） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法、
（２８ａ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療効果が得られるに十分な有効量を投与することを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法、
（２８ｂ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療効果が得られるに十分な有効量を投与することを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法、
（２８ｃ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法、
（２８ｄ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法、
（２９） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法、
（２９ａ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、卵胞成熟を阻害させるに、および／または性周期を停止させるに十分な有効量を投与することを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法、
（２９ｂ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、卵胞成熟を阻害させるに、および／または性周期を停止させるに十分な有効量を投与することを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法、
（２９ｃ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法、
（２９ｄ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法、
（３０） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を単回投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌促進法および／または性ホルモン分泌促進法、
（３０ａ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、性腺刺激ホルモン分泌を促進させる、および／または性ホルモン分泌を促進させるに十分な有効量を投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌促進法および／または性ホルモン分泌促進法、
（３０ｂ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌促進法および／または性ホルモン分泌促進法、
（３１） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を単回投与することを特徴とする、排卵誘発または促進法、
（３１ａ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、排卵を誘発または促進させるに十分な有効量を投与することを特徴とする、排卵誘発または促進法、
（３１ｂ） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を、薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることを特徴とする、排卵誘発または促進法、
（３２） 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩に対する抗体、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチド、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、（v）上記ポリペプチドまたはその塩に対する抗体、または（vi）上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、排卵抑制法、卵巣機能調節法、ホルモン感受性癌の予防・治療法、または子宮内膜症の予防・治療法、
（３２ａ） 哺乳動物に対して、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする、排卵抑制法、卵巣機能調節法、ホルモン感受性癌の予防・治療法、または子宮内膜症の予防・治療法などに関する。 That is, the present invention
(1) A gonadal function improving agent comprising a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof,
(2) The gonad function improving agent according to (1) above, comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof,
(2a) The gonadal function improving agent according to (1) above, comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 or a salt thereof. ,
(3) The gonad function improving agent according to (1) above, wherein the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3a) The gonad function improving agent according to the above (1), comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a salt thereof,
(3b) The gonad function improving agent according to the above (1), comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or a salt thereof,
(4) A gonadal function improving agent comprising a polynucleotide containing a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof,
(4a) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: : A gonad function improving agent comprising a polynucleotide having the base sequence represented by 19;
(5) A gonadal function improving agent comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof,
(5a) The gonad function improving agent according to the above (5), wherein the compound is a compound that promotes the activity of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof,
(6) Gonadal function comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, or a partial peptide thereof, or a salt thereof. Improver,
(7) The same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 of a polypeptide or salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A gonad function improving agent comprising a compound containing the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a compound that promotes activation thereof or a salt thereof,
(8) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a preventive / therapeutic agent for infertility,
(9) The gonad function improving agent according to (1) to (7), which is an ovulation inducing or promoting agent,
(10) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a gonadotropin secretion promoter,
(11) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a gonadotropin secretion inhibitor,
(12) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a sex hormone secretion promoter,
(12a) The gonad function improving agent according to (12) above, wherein the sex hormone is androgen (testosterone, androstenedione, etc.), estrogen (estradiol, estrone, etc.) or progesterone,
(13) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a sex hormone secretion inhibitor,
(13a) The gonad function improving agent according to the above (13), wherein the sex hormone is androgen (testosterone, androstenedione, etc.), estrogen (estradiol, estrone, etc.) or progesterone,
(14) The gonad function improving agent according to the above (1) to (7), which is a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer,
(15) The gonad function improving agent according to (1) to (7) above, which is a preventive / therapeutic agent for endometriosis,
(16) A polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, or the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. Or a diagnostic agent for infertility comprising a polynucleotide encoding a protein containing substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(17) An antibody against a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A diagnostic agent for infertility comprising an antibody against a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(18) A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. A method for screening a gonad function improving agent, characterized by using a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(19) The screening method according to the above (18), wherein the gonad function improving agent is a sex hormone secretion inhibitor or a sex hormone secretion promoter,
(20) The screening method according to the above (18), wherein the gonad function improving agent is a gonadotropin secretion inhibitor or a gonadotropin secretion promoter,
(21) A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. A kit for screening a gonad function improving agent, comprising a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(22) a polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A method for screening a gonad function improving agent, comprising using a polynucleotide encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as described above or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(23) a polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A kit for screening a gonad function improving agent, comprising a polynucleotide encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as described above or a partial peptide thereof or a salt thereof;
(23a) a gonadal function improving agent obtained using the screening method according to (18) or (22) above or the screening kit according to (21) or (23) above,
(23b) The gonad function improving agent according to (23a), which is a preventive / therapeutic agent for infertility,
(23c) The gonad function improving agent according to the above (23a), which is an ovulation inducing or promoting agent,
(23d) The gonad function improving agent according to the above (23a), which is a gonadotropin secretion promoting or inhibiting agent,
(23e) The gonad function improving agent according to the above (23a), which is a sex hormone secretion promoting or inhibiting agent,
(24) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method for improving gonadal function, characterized by administering an effective amount of salt,
(25) (i) Promotes the activity of a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, (ii) represented by SEQ ID NO: 20 Or (iii) promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, or (iii) the protein or a partial peptide thereof or the A method for improving gonadal function, characterized by promoting activation to salt,
(26) (i) a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof for producing a gonad function improving agent, (ii) the above polypeptide Or a polynucleotide encoding the salt thereof, (iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the polypeptide or salt thereof, and (iv) an amino acid that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof; or (v) the activation of the polypeptide or a salt thereof into the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof. Use of a compound or salt thereof,
(27) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method for suppressing gonadotropin secretion and / or sex, characterized by continuous or continuous administration of an effective amount of salt Hormone secretion suppression methods,
(27a) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Gonadotropin, characterized in that salt is administered in an effective amount sufficient to inhibit gonadotropin secretion Secretion control,
(27b) for mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method of inhibiting sex hormone secretion, comprising administering an effective amount of salt sufficient to inhibit sex hormone secretion,
(27c) Inhibition of gonadotropin secretion of a mammal or an agonist of a protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 for mammals A method of inhibiting gonadotropin secretion, characterized by administering an effective amount sufficient to be
(27d) A sex hormone secretion is suppressed with respect to a mammal, which comprises an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof. A method of suppressing sex hormone secretion, characterized by administering an effective amount sufficient to
(27e) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A gonad-stimulating hormone characterized in that a salt is present in a necessary amount or more in a site or tissue where a drug effect is to be exerted. Mon secretion suppression method,
(27f) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A sex hormone component characterized by having a salt present in an amount more than necessary in a site or tissue where a drug effect is to be exerted. Suppression method,
(27g) A site where an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof is intended to exert its medicinal effect on mammals Or a method of suppressing gonadotropin secretion, characterized by being present in an amount more than necessary in tissue,
(27h) A site where an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof is exerted on a mammal against a mammal Or a method of suppressing sex hormone secretion, characterized by being present in an amount more than necessary in the tissue,
(28) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Prevention or treatment of hormone-sensitive cancer or endometriosis characterized by continuous or continuous administration of an effective amount of salt Therapy,
(28a) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof The salt should be administered in an effective amount sufficient to obtain a preventive / therapeutic effect on hormone-sensitive cancer or endometriosis. To prevent or treat hormone-sensitive cancer or endometriosis,
(28b) An agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, for a mammal, A prophylactic / therapeutic method for hormone-sensitive cancer or endometriosis, characterized by administering an effective amount sufficient to obtain a prophylactic / therapeutic effect on membranous disease,
(28c) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Hormonal sensation, characterized by having a salt present in an amount more than necessary in the site or tissue where the drug effect is to be exerted. Prevention / treatment of sex cancer or endometriosis,
(28d) A site where an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof is exerted on mammals Or a method for preventing / treating hormone-sensitive cancer or endometriosis, characterized by being present in an amount more than necessary in the tissue,
(29) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method for inhibiting follicular maturation and / or sexual cycle arrest, characterized by comprising administering an effective amount of a salt continuously or continuously,
(29a) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Administering the salt in an effective amount sufficient to inhibit follicular maturation and / or to stop the sexual cycle Follicle maturation inhibition method and / or sexual cycle arrest method,
(29b) Inhibiting follicular maturation with respect to a mammal, an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, or a partial peptide thereof, or a salt thereof And / or a follicle maturation inhibition method and / or a sexual cycle arrest method, characterized by administering an effective amount sufficient to stop the sexual cycle,
(29c) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Inhibition of follicular maturation, characterized by the presence of a salt in an amount more than necessary at the site or tissue where it is desired to exert its medicinal effects Law and / or sexual cycle arrest,
(29d) A site where an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof is exerted on mammals Or a method for inhibiting follicular maturation and / or sexual cycle arrest, characterized by being present in an amount more than necessary in a tissue,
(30) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method of promoting gonadotropin secretion and / or sex hormone secretion characterized by a single administration of an effective amount of salt Decimal,
(30a) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A sufficient amount of salt to promote gonadotropin secretion and / or promote sex hormone secretion A method of promoting gonadotropin secretion and / or sex hormone secretion,
(30b) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A gonad-stimulating hormone characterized in that a salt is present in a necessary amount or more in a site or tissue where a drug effect is to be exerted. Mon secretion promotion method and / or sex hormone secretion promotion method,
(31) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method of inducing or promoting ovulation characterized by a single administration of an effective amount of salt;
(31a) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A method of inducing or promoting ovulation characterized by administering an effective amount of salt sufficient to induce or promote ovulation;
(31b) For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Ovulation induction or ovulation characterized in that salt is present in an amount more than necessary in a site or tissue where drug efficacy is desired. Is the promotion law,
(32) A compound that inhibits the activity of a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or a salt thereof, against a mammal, (Ii) an antibody against the polypeptide or a salt thereof, (iii) an antisense nucleotide against a polynucleotide encoding the polypeptide or a salt thereof, (iv) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, (v) an antibody against the polypeptide or a salt thereof, or (vi) the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof An effective amount of an antisense polynucleotide relative to a polynucleotide encoding Wherein the Azukasuru, ovulation suppression method, ovarian function regulating method, the prevention and treatment of hormone-sensitive cancer or prophylaxis and treatment of endometriosis,
(32a) administering an effective amount of an antagonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a partial peptide thereof or a salt thereof to a mammal; It relates to ovulation suppression method, ovarian function regulation method, prevention / treatment method of hormone sensitive cancer, or prevention / treatment method of endometriosis.

本発明のポリペプチド（配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド）および受容体（配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質）、本発明のＤＮＡなどは、例えば、性腺機能改善剤、不妊症の予防・治療剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤または性ホルモン分泌促進剤などのスクリーニングに有用である。
本発明のポリペプチドおよび受容体、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドまたは受容体の機能・活性を促進する化合物またはその塩は、優れた性腺刺激ホルモン分泌促進活性、性ホルモン分泌促進活性、排卵誘発または促進作用等を有し、低毒性で安全な、例えば、性腺機能改善剤、不妊症の予防・治療剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤または性ホルモン分泌促進剤などとして有用である。さらに、本発明のポリペプチドおよび受容体、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドまたは受容体の機能・活性を促進する化合物またはその塩は、性腺刺激ホルモンや、性ホルモンの分泌が抑制されるに十分な有効量を対象に投与（例、連続投与、持続投与など）、あるいは薬効を発揮させたい部位または組織において必要量以上存在させることにより、性腺刺激ホルモン抑制剤、性ホルモン分泌抑制剤、ホルモン感受性癌や子宮内膜症の予防・治療剤などとして有用である。 Polypeptide of the present invention (polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) and receptor (identical or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20) A protein containing the same amino acid sequence, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 A protein containing an amino acid sequence), the DNA of the present invention, and the like include, for example, a gonad function improving agent, a prophylactic / therapeutic agent for infertility, an ovulation inducing or promoting agent, a gonadotropin secretion promoter, or a sex hormone secretion promoter. Useful for screening.
The polypeptide and receptor of the present invention, the DNA of the present invention, the compound that promotes the function / activity of the polypeptide or receptor of the present invention or a salt thereof are excellent gonadotropin secretion promoting activity, sex hormone secretion promoting activity, Has ovulation induction or promotion action, etc., low toxicity and safe, for example, gonad function improving agent, infertility prevention / treatment agent, ovulation induction or promotion agent, gonadotropin secretion promoter or sex hormone secretion promoter, etc. Useful as. Furthermore, the polypeptide and receptor of the present invention, the DNA of the present invention, the compound or its salt that promotes the function or activity of the polypeptide or receptor of the present invention, suppresses gonadotropin and sex hormone secretion. A sufficient effective amount to the subject (eg, continuous administration, continuous administration, etc.), or by making it exist in a necessary amount or more in the site or tissue where the drug effect is to be exerted, a gonadotropin inhibitor, sex hormone secretion inhibitor, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hormone sensitive cancer and endometriosis.

配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K562、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-102、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-01など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。   A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter sometimes referred to as the polypeptide of the present invention) is a human or a warm-blooded animal (for example, guinea pig, Rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, Epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, Eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or before these cells Cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which those cells exist, such as the brain, brain regions (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, Medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, Spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or cells of the blood system or cultured cells thereof (eg, MEL, M1, CTLL-2, HT-2 , WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37 SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01, etc.) It may be a polypeptide.

配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、(i) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜３個（好ましくは１〜２個、好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１〜３個（好ましくは１〜２個、好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１〜３個（好ましくは１〜２個、好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜３個（好ましくは１〜２個、好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。 The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence having homology of about 95% or more, more preferably about 98% or more is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes (i) 1 to 3 (preferably 1 to 2, preferably 1) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence in which one amino acid has been deleted,
(ii) an amino acid sequence in which 1 to 3 (preferably 1 to 2, preferably 1) amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(iii) an amino acid sequence in which 1 to 3 (preferably 1 to 2, preferably 1) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(iv) an amino acid sequence in which 1 to 3 (preferably 1 to 2, preferably 1) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids;
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).

配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性（例、受容体との結合活性または細胞刺激活性、排卵促進作用、性腺刺激ホルモン分泌促進活性、性腺刺激ホルモン分泌抑制活性、性ホルモン分泌促進活性、性ホルモン分泌抑制活性など）などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
受容体との結合活性または細胞刺激活性の測定は、公知の方法に準じて行う。
排卵促進作用の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、European Journal of Endocrinology、第138巻、594-600頁、1998年に記載の方法またはそれに準じた方法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
性腺刺激ホルモン分泌促進活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、Toxicology, 第147巻、15-22頁、2000年に記載の方法またはそれに準じた方法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：２、配列番号：１１、配列番号：１３、または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１または配列番号：９で表されるアミノ酸配列などがあげられる。 Examples of the polypeptide containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
Examples of substantially the same activity include, for example, the activity of the polypeptide of the present invention (eg, receptor binding activity or cell stimulating activity, ovulation promoting activity, gonadotropin secretion promoting activity, gonadotropin secretion inhibiting activity) , Sex hormone secretion promoting activity, sex hormone secretion inhibiting activity, etc.). Substantially homogeneous activity indicates that the activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous.
The receptor binding activity or cell stimulation activity is measured according to a known method.
Measurement of the ovulation promoting action can be carried out according to a known method, for example, the method described in the European Journal of Endocrinology, Vol. 138, pp. 594-600, 1998 or a method analogous thereto, Examples described later It can be measured according to the method described in the above.
The measurement of gonadotropin secretion promoting activity can be performed according to a known method, for example, the method described in Toxicology, Vol. 147, pp. 15-22, 2000, or a method analogous thereto, Examples described later It can be measured according to the method described in the above.
Specific examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are represented by, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 15. Examples include amino acid sequences.
Specific examples of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 9.

本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチン(45-54)と称する場合もある〕、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、マウスメタスチン(43-52)またはラットメタスチン(43-52)と称する場合もある〕、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチンまたはヒトメタスチン(1-54)と称する場合もある〕、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、マウスメタスチンと称する場合もある〕、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ラットメタスチンと称する場合もある〕、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチン(40-54)と称する場合もある〕、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチン(46-54)と称する場合もある〕、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチン(47-54)と称する場合もある〕、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔以下、ヒトメタスチン(48-54)と称する場合もある〕などがあげられる。   Specific examples of the polypeptide of the present invention include, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter sometimes referred to as human metastin (45-54)), represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide having the amino acid sequence [hereinafter also referred to as mouse metastin (43-52) or rat metastin (43-52)], a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 [hereinafter human Metastin or human metastin (1-54) may be referred to], polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (hereinafter also referred to as mouse metastin), SEQ ID NO: 7 A polypeptide having an amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as rat metastin), a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 [hereinafter, Tometastin (sometimes referred to as 40-54)], a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (hereinafter sometimes referred to as human metastin (46-54)), represented by SEQ ID NO: 13 A polypeptide having the amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as human metastin (47-54)), a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 [hereinafter, human metastin (48-54) and May be referred to)].

本発明のポリペプチドに対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のポリペプチドと結合活性を有し、本発明のポリペプチドにより該受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）が観察されるものなどがあげられる。例えば、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質などがあげられる。 Among the various receptors, the receptor for the polypeptide of the present invention has a binding activity with the polypeptide of the present invention, and the polypeptide of the present invention causes cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) of the receptor-expressing cells. Release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation / suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction , Activity for promoting GTPγS binding activity, etc.) are observed. For example, a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, : A protein containing substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 24, and the like.

配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質（以下、これらを本発明の受容体と称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K562、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-102、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-01など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。   A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 24 (hereinafter sometimes referred to as the receptor of the present invention) is a human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat). , Mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermis Cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells) B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, Hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells exist, such as the brain, each part of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, cerebral base) Sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (example) , Large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell line or cultured cells thereof (eg , MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML- 1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01, etc.) or a synthetic protein may be used.

配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドとの結合活性などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、(i) 配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列中の例えば１〜１００個（好ましくは１〜５０個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) 配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列に例えば１〜１００個（好ましくは１〜５０個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii) 配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列に例えば１〜１００個（好ましくは１〜５０個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv) 配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列中の例えば１〜１００個（好ましくは１〜５０個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明の受容体の具体例としては、例えば、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（以下、ヒトOT7T175と称する場合もある）、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（以下、ラットOT7T175と称する場合もある）、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（以下、マウスOT7T175と称する場合もある）などが用いられる。 The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24. Examples include amino acid sequences having homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more.
Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 include SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: The amino acid sequence substantially the same as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 A protein having the same is preferred.
Examples of substantially the same activity include binding activity with the polypeptide of the present invention. Substantially homogeneous activity indicates that the activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous.
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 is (i) represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24. An amino acid sequence in which, for example, 1 to 100 (preferably 1 to 50, preferably 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably 1 to 3) amino acids are deleted from the amino acid sequence (ii) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 is, for example, 1 to 100 (preferably 1 to 50, preferably 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably Is an amino acid sequence to which 1 to 3 amino acids are added, (iii) for example, 1 to 100 (preferably 1 to 50) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 Good Or an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably 1 to 3 amino acids are inserted, (iv) represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 An amino acid in which, for example, 1 to 100 (preferably 1 to 50, preferably 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence are substituted with other amino acids Sequence, (v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
Specific examples of the receptor of the present invention include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 (hereinafter sometimes referred to as human OT7T175), and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22. For example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 (hereinafter also referred to as mouse OT7T175) or the like may be used.

本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよいが、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。本発明の受容体の構成アミノ酸配列のうち２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。（i）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ii）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（iii）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。   The partial peptide of the receptor of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the partial peptide of the present invention) may be any partial peptide as long as it can be used in a screening method for pharmaceuticals described below. However, preferably, a partial peptide having binding ability to the polypeptide of the present invention, a partial peptide containing an amino acid sequence corresponding to the extracellular domain, and the like are used. Peptides having an amino acid sequence of 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the receptor of the present invention are preferred. (I) One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are deleted in the amino acid sequence, and (ii) 1 is added to the amino acid sequence. Or two or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids, or (iii) in the amino acid sequence One or more amino acids (preferably about 1 to 10, more preferably about several, and more preferably about 1 to 5) may be substituted with other amino acids.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、または糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 In the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention, the C-terminus may be any of carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO − ), amide (—CONH 2 ) or ester (—COOR). Good.
Here, R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, for example, phenyl. C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, C 7- such as phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl In addition to the 14 aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group, which is widely used as an oral ester, is used.
When the polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the polypeptide of the present invention. included. As the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) has a protecting group (eg, C 1-6 such as formyl group, acetyl group). C 1-6 acyl groups such as alkanoyl), N-terminal glutamine residues generated by cleavage in vivo are pyroglutamine oxidized, substituents on the side chain of amino acids in the molecule (Eg, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (eg, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl groups such as formyl group, acetyl group, etc.) Etc.) or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、WO 00/24890号公報、WO 01/75104号公報、WO02/072816号公報などに記載の方法に準じて製造することができる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 As a salt of the polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal) is used. Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known polypeptide purification method, or can be a DNA encoding a polypeptide described later. It can also be produced by culturing a transformed transformant. Moreover, it can also manufacture according to the below-mentioned peptide synthesis method. For example, it can be produced according to the methods described in WO 00/24890, WO 01/75104, WO02 / 072816 and the like.
When producing from human or mammalian tissue or cells, the human or mammalian tissue or cells are homogenized and then extracted with acid, etc., and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.

本発明のポリペプチド、受容体、その部分ペプチド、もしくはそれらの塩の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドを取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 For the synthesis of the polypeptide, receptor, partial peptide thereof, or salt thereof of the present invention, a commercially available polypeptide synthesis resin can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, etc. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target polypeptide. At the end of the reaction, the polypeptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and an intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide, receptor, and partial peptide.
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. It can later be added to the resin.
The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, etc. Examples include sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for polypeptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even if the reaction is repeated, acetylation of the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.

原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。 Examples of the protective group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
The hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include groups derived from carbonic acid such as lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.

原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。 Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro. Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4- Addition of a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。 As another method for obtaining the amide form of the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (polypeptide is added to the amino group side. Peptide) After extending the chain to the desired chain length, a polypeptide excluding only the N-terminal α-amino protecting group and a polypeptide from which only the C-terminal carboxyl protecting group has been removed And both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by condensation, all the protecting groups can be removed by the above method to obtain the desired crude polypeptide. This crude polypeptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the desired polypeptide, receptor or amide form of the partial peptide thereof.
To obtain an ester of the polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention, for example, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the polypeptide, receptor or In the same manner as the partial peptide amide, a desired polypeptide, receptor or ester of the partial peptide can be obtained.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（a）〜（e）に記載された方法があげられる。
（a）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（b）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（c）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（d）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
（e）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 The polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method, or the partial peptide of the receptor can be produced by cleaving the receptor with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide, receptor or partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide of the present invention is condensed with the remaining part, and when the product has a protective group, the target peptide is eliminated by removing the protective group. Can be manufactured. Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in the following (a) to (e).
(A) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(B) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(C) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(D) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(E) Supervised by Yajima Haruaki, Development of follow-up medicines, Volume 14, Peptide synthesis, Hirokawa Shoten Also, after the reaction, usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. Can be combined to purify and isolate the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention. When the polypeptide, receptor, or partial peptide thereof obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely It can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。なかでもＤＮＡが好ましい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotal RNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。 The polynucleotide encoding the polypeptide, receptor or its partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the aforementioned polypeptide, receptor or its partial peptide of the present invention. May be. Of these, DNA is preferable. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、例えば（a）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、（b）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：１９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：１９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 Examples of the polynucleotide (eg, DNA) encoding the polypeptide of the present invention include (a) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 14, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, (b) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, sequence SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 under highly stringent conditions Any DNA may be used as long as it has a base sequence to hybridize and encodes a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide of the present invention.
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19 Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented under highly stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 14. , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, and the base sequence represented by about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about DNA containing a base sequence having a homology of 95% or more is used.

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、(i) 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(ii) 配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(iii) 配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(iv) 配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(v) 配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(vi) 配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(vii) 配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(viii) 配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
(ix) 配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
More specifically, (i) as a DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, etc.,
(ii) DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 19. DNA etc.
(iii) The DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(iv) The DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(v) DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8,
(vi) The DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 10,
(vii) As a DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, etc.,
(viii) DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 14,
(ix) As the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is used.

本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、（i）配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または（ii）配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表される塩基配列を含有するＤＮＡで表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、（ii）配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 Examples of the DNA encoding the receptor of the present invention include (i) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25, or (ii) SEQ ID NO: 21. A base sequence that hybridizes with a base sequence represented by DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 under highly stringent conditions, (ii) SEQ ID NO: 20, Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24.
Examples of DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 under highly stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, or SEQ ID NO: A DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more with the base sequence represented by 25 is used.

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 is the amino acid represented by SEQ ID NO: 22. Examples of DNA encoding the protein containing the sequence include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23, and DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 include SEQ ID NO: : DNA containing the base sequence represented by 25 is used.

本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。 The DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
As the DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention, for example, DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: : 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 has a base sequence that hybridizes under highly stringent conditions, and is represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24. DNA having a partial base sequence of DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid to be used is used.
The DNA capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 has the same significance as described above.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、公知の方法で標識化されていてもよい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などが用いられる。好ましくは放射性同位元素が用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチド（以下、これらポリペプチド等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチド等を単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 The DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide of the present invention may be labeled by a known method. Examples of the labeling agent include radioisotopes (eg, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C], [ 32 P], [ 33 P], [ 35 S], etc.) Fluorescent substances (eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences), etc.), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.), enzymes (eg, β-galactosidase) , Β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), biotin, lanthanide elements, etc. are used. Preferably, a radioisotope is used.
Polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNA encoding these polypeptides etc., these polypeptides etc. may be simply abbreviated as polypeptides of the present invention) As a means for cloning DNA that completely encodes DNA, the DNA of the present invention is amplified by a known PCR method using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the polypeptide of the present invention, or DNA incorporated into an appropriate vector is used in the present invention. Can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the polypeptide or labeled with a synthetic DNA. The method of hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.

ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。 The DNA base sequence is converted using a known kit such as Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), etc. The method can be carried out according to a known method such as the Kunkel method or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.

本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。 Examples of the expression vector for the polypeptide of the present invention include (a) excising a target DNA fragment from the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (b) placing the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. It can manufacture by connecting.
Examples of the vector include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, the CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and when the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampr), neomycin resistance gene ( Hereinafter, G418 resistance, which may be abbreviated as “Neor”, may be mentioned. In particular, when a dhfr gene-deficient Chinese hamster cell is used and the dhfr gene is used as a selection marker, the target gene can also be selected by a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention. When the host is Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, MFα • signal sequence, SUC2 • signal sequence, etc., when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using a vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention thus constructed.
As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.

エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60巻，160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Researc），9巻，309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology，120巻，517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology，41巻，459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics，39巻，440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry，95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。 Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 / DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Researc], 9 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]. ] Is used.
Examples of the Bacillus bacterium include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Used.

昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、In Vivo, 13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Nature，315巻，592(1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻，2110(1972)やGene，17巻，107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics，168巻，111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology，194巻，182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。 As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five ™ derived from eggs of Trichoplusia ni Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, sputum-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (above, In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like.
As insects, for example, silkworm larvae are used [Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
In order to transform yeast, for example, the method described in Methods in Enzymology, 194, 182-287 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) and the like can be performed. it can.

昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology，52巻，456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Vol. 52, 456 (1973).
In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the polypeptide can be obtained.
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of the inorganic or organic substance and inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
As the medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferable. In order to make the promoter work efficiently here, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.

宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122巻，501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology，8巻，396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻，519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73巻，1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。 When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include Burkholder minimum medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and 0.5%. SD medium containing casamino acid [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the medium includes Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962), etc., to which an additive such as 10% bovine serum that has been immobilized is appropriately added) The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4 The culture is usually carried out at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, with aeration and agitation as necessary.
When culturing a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include MEM medium [Science, Vol. 122, 501 (1952)] containing about 5 to 20% fetal bovine serum, DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
As described above, the polypeptide of the present invention can be produced in the cell, cell membrane or extracellular region of the transformant.
Separation and purification of the polypeptide of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.

本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。 When the polypeptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw. For example, a method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifugation or filtration after destroying cells or cells by, for example, is suitably used. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the polypeptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected.
Purification of the polypeptide contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining known separation / purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used.
When the polypeptide thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, by a known method or a method analogous thereto. Can be converted to the free form or other salts.
The polypeptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.

本発明のポリペプチドまたは受容体に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のポリペプチドまたは受容体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドまたは受容体に対する抗体は、本発明のポリペプチドまたは受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたは受容体は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1：1〜20：1程度であり、PEG（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が10〜80％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識された抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識されたポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20％、好ましくは10〜20％の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10％の牛胎児血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。 An antibody against the polypeptide or receptor of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) is any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as the antibody can recognize the polypeptide or receptor of the present invention. It may be.
The antibody against the polypeptide or receptor of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the polypeptide or receptor of the present invention as an antigen.
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Production of Monoclonal Antibody-Producing Cells The polypeptide or receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with allogeneic or xenogeneic myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled polypeptide described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes.
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a polypeptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier. Add anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substance or enzyme (if the cell used for cell fusion is mouse, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A, and detect monoclonal antibody bound to solid phase A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding a polypeptide labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. Etc.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20-40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
(B) Purification of monoclonal antibody Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a known method, for example, separation and purification of immunoglobulin [eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger. Specific, for example, by collecting only antibodies with an adsorption / desorption method (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the binding to obtain the antibody Purification method].

〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キャリアー蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアー蛋白質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。 [Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (polypeptide antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting the antibody-containing material and separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier protein and hapten are such that antibodies against hapten immunized by cross-linking to carrier protein Any one can be crosslinked at any ratio as long as it can be efficiently performed. A method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling of the hapten and the carrier protein, but an active ester reagent containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks and about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.

本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）（以下、アンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明のアンチセンスＤＮＡは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスＤＮＡの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のペプチドまたは受容体の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 It has a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention). An antisense polynucleotide (preferably DNA) (hereinafter sometimes abbreviated as antisense DNA) has a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention, Any antisense DNA may be used as long as it has an action capable of suppressing expression.
The base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70 of the total base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of a base sequence having homology. In particular, of the total base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, about 70% or more of the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal site of the polypeptide of the present invention (eg, the base sequence near the start codon) Antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
The antisense DNA of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases, bonds, provided in special forms such as liposomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, the additional form can be used as a polycationic substance such as polylysine that works to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, or a lipid that enhances the interaction with the cell membrane or increases the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterols). Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid, which prevents degradation by a nuclease such as exonuclease or RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of antisense DNA should be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide or receptor of the present invention. Can do.

以下に、（a）本発明のポリペプチド、（b）本発明の受容体（以下、その部分ペプチドも含む）、（c）本発明のＤＮＡ、（d）本発明の抗体および（e）本発明のアンチセンスＤＮＡなどの用途を説明する。
（１）本発明のポリペプチドが関与する疾患の予防・治療剤
本発明のポリペプチドは、本発明の受容体の発現細胞の細胞刺激活性を有し、本発明の受容体の内因性リガンドであり、性腺刺激ホルモン（例、FSH、LHなど）分泌促進または抑制作用、性ホルモン〔例、アンドロゲン（例、テストステロン、アンドロステンジオンなど）、エストロゲン（例、エストラジオール、エストロンなど）、プロゲステロンなど〕分泌促進または抑制作用、性腺機能改善作用、排卵誘発または促進作用、性成熟作用などを有する。
本発明のポリペプチドまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、または本発明の受容体または該受容体をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、性腺機能不全・機能低下、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、人工授精治療などとなる可能性が高い。
従って、本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、性腺機能改善剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などとして、例えば、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用することができる。また、本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、薬効を発揮させたい部位、組織などにおいて必要量以上存在させた場合（例、好ましくは、連続投与、持続投与等）、性腺刺激ホルモン分泌抑制（阻害）剤および（または）性ホルモン分泌抑制剤として、例えば、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用できる。また、例えば単回投与することにより、性腺刺激ホルモン分泌促進剤および（または）性ホルモン分泌促進剤として、例えば、排卵誘発または促進剤などとして用いられる。上記連続投与、持続投与には、単回投与で薬効成分を徐放させる投与方法も含まれる。
本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的（好ましくは皮下または静脈内投与に、または（必要に応じて糖衣を施した）錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。さらに、本発明のポリペプチドは、WO 02/85399号公報記載のように、徐放製剤としても使用できる。 The following are (a) the polypeptide of the present invention, (b) the receptor of the present invention (hereinafter also including partial peptides thereof), (c) the DNA of the present invention, (d) the antibody of the present invention, and (e) the present invention. The use of the antisense DNA of the invention will be described.
(1) Prophylactic / Therapeutic Agent for Diseases Involving the Polypeptide of the Present Invention The polypeptide of the present invention has cell stimulating activity for cells expressing the receptor of the present invention, and is an endogenous ligand of the receptor of the present invention. Yes, gonadotropin (eg, FSH, LH, etc.) secretion promoting or suppressing action, sex hormone (eg, androgen (eg, testosterone, androstenedione, etc.), estrogen (eg, estradiol, estrone, etc.), progesterone, etc. It has an effect of promoting or suppressing, an effect of improving gonadal function, an effect of inducing or promoting ovulation, an effect of sexual maturation and the like.
When the polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention is abnormal or defective, or when the receptor of the present invention or the DNA encoding the receptor is abnormal or defective, For example, gonadal dysfunction / hypofunction, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism , Spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence, etc.), genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone-sensitive cancer (eg, hormone-sensitive prostate cancer) , Hormone-sensitive breast cancer, etc.), and artificial insemination treatment is likely.
Therefore, the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, a gonad function improving agent, an ovulation induction or promoter, a gonadotropin secretion promoter, a gonadotropin secretion inhibitor, a sex hormone secretion promoter, a sex hormone secretion. Examples of inhibitors include infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, Spermatogenesis disorder, hyposexuality (eg, impotence), genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone sensitive cancer (eg, hormone sensitive prostate cancer, hormone) It can be used as a prophylactic / therapeutic agent such as sensitive breast cancer, endometriosis, follicular maturation inhibitor, sexual cycle arrest agent and the like. In addition, when the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention are present in a necessary amount or more in a site or tissue where drug efficacy is to be exerted (eg, preferably continuous administration, continuous administration, etc.), suppression of gonadotropin secretion As the (inhibition) agent and / or sex hormone secretion inhibitor, for example, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer or endometriosis, a follicle maturation inhibitor, a sexual cycle arrest agent, and the like. Further, for example, by a single administration, it is used as a gonadotropin secretion promoter and / or sex hormone secretion promoter, for example, as an ovulation inducer or promoter. The continuous administration and the continuous administration include an administration method in which a medicinal component is gradually released by a single administration.
The polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, when there is a patient in whom the polypeptide of the present invention is reduced or deficient in a living body. By expressing the polypeptide of the present invention in the body, (b) inserting the DNA of the present invention into a cell and expressing the polypeptide of the present invention, and then transplanting the cell into a patient, or (c) The role of the polypeptide of the present invention in the patient can be fully or normally exerted by administering the polypeptide of the present invention to the patient.
When the DNA of the present invention is used as the above agent, the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. Can be administered to blood animals. The DNA of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an auxiliary agent for promoting ingestion, and administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the polypeptide of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, a product purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, further preferably 99% or more is used. Is preferred.
The polypeptide of the present invention is administered parenterally (preferably for subcutaneous or intravenous administration, for example, in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection such as a suspension. Or, it can be used orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. (for example, sugar-coated as necessary) For example, the polypeptide of the present invention can be used as a physiologically recognized carrier, flavor, It can be manufactured by mixing in a unit dosage form required for the practice of the formulation generally accepted together with the form, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. The amount of the active ingredient in these formulations is in the indicated range. In addition, the polypeptide of the present invention can be used as a sustained-release preparation as described in WO 02/85399.

注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、不妊症の治療の目的で本発明のポリペプチドを皮下投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につき該ポリペプチドを約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
また、本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。本発明のポリペプチドまたは本発明のＤＮＡおよび上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。 Examples of aqueous solutions for injection include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and appropriate solubilizing agents. For example, you may use together with alcohol (for example, ethanol etc.), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethyleneglycol, etc.), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80 ™ , HCO-50 etc.), etc. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with preservatives (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
A vector into which the DNA of the present invention has been inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
The preparations thus obtained are safe and have low toxicity, so that, for example, humans or warm-blooded animals (eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys) , Etc.).
The dosage of the polypeptide of the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously for the purpose of treating infertility, (With a body weight of 60 kg), the polypeptide is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
In addition, the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention may contain other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer agents, etc. It may be used in combination with a natural antibiotic (eg, mitomycin, adriamycin, etc.), a plant-derived anticancer agent (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide and the like. The polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention and the drug may be administered to the patient at the same time or at different times.

（２）性腺機能改善作用、不妊症の予防・治療作用、排卵誘発または促進作用、性腺刺激ホルモン分泌促進または抑制作用、性ホルモン分泌促進または抑制作用を有する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドは、性腺刺激ホルモン（例、FSH、LHなど）分泌促進または抑制作用、性ホルモン〔例、アンドロゲン（例、テストステロン、アンドロステンジオンなど）、エストロゲン（例、エストラジオール、エストロンなど）、プロゲステロンなど〕分泌促進または抑制作用、性腺機能改善作用、排卵誘発または促進作用、性成熟作用などを有するため、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、性腺機能改善剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などとして有用であり、例えば、性腺機能不全・機能低下の改善剤、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用できる。また、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩は、薬効を発揮させたい部位、組織などにおいて必要量以上存在させた場合（例、好ましくは、連続投与、持続投与等）、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤および（または）性ホルモン分泌抑制剤として、例えば、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用できる。また、例えば単回投与することにより、性腺刺激ホルモン分泌促進剤および（または）性ホルモン分泌促進剤として、例えば、排卵誘発または促進剤などとして用いられる。上記連続投与、持続投与には、単回投与で薬効成分を徐放させる投与方法も含まれる。
一方、本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば排卵抑制剤、卵巣機能調節剤などとして、例えば避妊剤、思春期早発症、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤として使用できる。
該スクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、または組換え型本発明のポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、本発明のポリペプチドとその受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（即ち本発明のポリペプチドの受容体アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ち本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト）などが含まれる。「本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる」とは、本発明のポリペプチドとの結合を阻害する場合と本発明のポリペプチドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。 (2) Screening for drug candidate compounds having gonad function improving action, infertility prevention / treatment action, ovulation induction or promotion action, gonadotropin secretion promotion or suppression action, sex hormone secretion promotion or suppression action polypeptide of the present invention Gonadotropin (eg, FSH, LH, etc.) secretion promoting or suppressing action, sex hormone (eg, androgen (eg, testosterone, androstenedione, etc.), estrogen (eg, estradiol, estrone, etc.), progesterone, etc. A compound or a salt thereof that promotes the activity of the polypeptide of the present invention because it has a promoting or suppressing action, a gonad function improving action, an ovulation inducing or promoting action, a sexual maturation action, etc. is, for example, a gonad function improving agent, ovulation inducing or Promoter, Gonadotropin secretion promoter, Gonadotropin secretion suppression It is useful as a sex hormone secretagogue, sex hormone secretion inhibitor, etc., for example, an agent for improving gonadal dysfunction / hypofunction, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, Menstruation, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence), genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, Azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone-sensitive cancer (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), preventive and therapeutic agents for endometriosis, follicular maturation inhibitor, sexual cycle arrest, etc. Can be used. In addition, when the compound or salt thereof that promotes the activity of the polypeptide of the present invention is present in a necessary amount or more in a site or tissue where a drug effect is to be exerted (eg, preferably continuous administration, continuous administration, etc.), the gonadal As a stimulating hormone secretion inhibitor and / or sex hormone secretion inhibitor, for example, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer or endometriosis, a follicle maturation inhibitor, a sexual cycle arrest agent and the like. Further, for example, by a single administration, it is used as a gonadotropin secretion promoter and / or sex hormone secretion promoter, for example, as an ovulation inducer or promoter. The continuous administration and the continuous administration include an administration method in which a medicinal component is gradually released by a single administration.
On the other hand, a compound or a salt thereof that inhibits the function of the polypeptide of the present invention can be used as, for example, an ovulation inhibitor, an ovarian function regulator, etc. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive breast cancer and the like, and endometriosis.
The screening uses the polypeptide of the present invention by using the polypeptide of the present invention or constructing a recombinant expression system of the polypeptide of the present invention and using a receptor binding assay system using the expression system. A compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) (for example, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.) or a salt thereof Can be screened. Such compounds include cell stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production / suppression, intracellular cGMP production, inositol phosphate via the receptor of the present invention. A compound having production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, etc. (ie, receptor agonist of the polypeptide of the present invention) A compound having no cell stimulating activity (that is, a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention) and the like are included. “Change the binding property to the polypeptide of the present invention” includes both the case of inhibiting the binding to the polypeptide of the present invention and the case of promoting the binding to the polypeptide of the present invention. .

本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法の具体例としては、（i）本発明の受容体またはその部分ペプチド（以下、これらを単に本発明の受容体と略称する場合がある）に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、（i）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明の受容体に対する該ポリペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。 Specific examples of the screening method for a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, characterized by using the polypeptide of the present invention, include (i) the receptor of the present invention or a partial peptide thereof ( Hereinafter, these may be simply referred to as the receptor of the present invention), when the polypeptide of the present invention is contacted, and (ii) the receptor of the present invention described above, the polypeptide of the present invention and the test compound A compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention), or a method thereof Examples thereof include a salt screening method.
In the screening method described above, (i) the above-described receptor of the present invention is contacted with the polypeptide of the present invention, and (ii) the above-described receptor of the present invention is loaded with the polypeptide of the present invention and the test compound. For example, the amount of binding of the polypeptide to the receptor of the present invention, cell stimulating activity, and the like when contacted are measured and compared.

上記スクリーニング方法のさらなる具体例としては、
（a）標識された本発明のポリペプチドを、上記した本発明の受容体に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
（b）標識された本発明のポリペプチドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
（c）標識された本発明のポリペプチドを、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポリペプチドの受容体に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、 As a further specific example of the screening method,
(A) When the labeled polypeptide of the present invention is contacted with the receptor of the present invention described above, and when the labeled polypeptide of the present invention and a test compound are contacted with the receptor of the present invention A compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring the amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the receptor of the present invention (Comparison) A compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the invention) or a salt thereof,
(B) The case where the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with the cell containing the receptor of the present invention or the membrane fraction of the cell, and the labeled polypeptide of the present invention and the test compound according to the present invention. The amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the cell or the membrane fraction when contacted with the cell containing the receptor or the membrane fraction of the cell is measured and compared, A method for screening a compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention,
(C) when the labeled polypeptide of the present invention is contacted with the receptor of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention; When the labeled polypeptide of the present invention and the test compound are contacted with the receptor for the polypeptide of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the receptor of the present invention. In which the binding amount of the labeled polypeptide of the present invention to the receptor of the present invention is measured and compared, and the compound that changes the binding property of the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention ( A compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof,

（d）本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
（e）本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドなど）を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。
標識された本発明のポリペプチドの好ましい具体例は、〔125I〕でそれぞれ標識された配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。 (D) a compound that activates the receptor of the present invention (eg, a polypeptide of the present invention) in contact with a cell containing the receptor of the present invention, and a compound that activates the receptor of the present invention and When the test compound is contacted with a cell containing the receptor of the present invention, the cell stimulating activity via the receptor of the present invention (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP release) Production / inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity promoting activity or inhibiting activity, etc.) A compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (promoting or inhibiting the activity of the polypeptide of the present invention) And (e) a compound that activates the receptor of the present invention (for example, the polypeptide of the present invention) and a transformant containing a DNA encoding the receptor of the present invention And a compound that activates the receptor of the present invention and a test compound are transformed into a trait containing DNA encoding the receptor of the present invention. Cell stimulation activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release) via the receptor of the present invention when contacted with the receptor of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant Intracellular cAMP production / suppression, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, A compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (this book), which measures and compares H decrease, GTPγS binding activity promoting activity or inhibiting activity, etc. For example, a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the invention) or a salt thereof.
Preferred specific examples of the labeled polypeptide of the present invention include SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: labeled with [ 125 I], respectively. : Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 and the like.

上記スクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の受容体としては、本発明のポリペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、本発明の受容体を発現した宿主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、1細胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105〜107分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。 A specific description of the screening method will be given below.
First, the receptor of the present invention used in the screening method of the present invention may be any receptor that recognizes the polypeptide of the present invention as a ligand. A fraction or the like is preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, the receptor of the present invention expressed in large quantities using a recombinant is suitable for use in screening.
In order to produce the receptor of the present invention, the above-described production method and the like are used.
In the screening method of the present invention, when the cell containing the receptor of the present invention or the cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
When cells containing the receptor of the present invention are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
The cell containing the receptor of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor of the present invention, and examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. . Examples of the host cell expressing the receptor of the present invention include the same methods as those for producing a transformant transformed with the above-described expression vector containing the polypeptide of the present invention.
The membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, or pressurizing with a French press, etc. Crushing. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed receptor of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. Is preferred. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system but also to measure a large amount of samples in the same lot. .

本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の（a）〜（c）を実施するためには、適当な本発明の受容体画分と、標識された本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識されたポリペプチドとしては、例えば〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識されたポリペプチドなどを利用することができる。このうち好ましくは、〔125I〕で標識されたポリペプチドである。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより受容体標品を調製する。バッファーには、pH4〜10（望ましくはpH6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのポリペプチドと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E-64（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。0.01〜10mlの該受容体溶液に、一定量（5000〜500000cpm）の標識された本発明のポリペプチドを添加し、同時に10-10〜10-7Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（NSB）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は0〜50℃、望ましくは4〜37℃で20分〜24時間、望ましくは30分〜3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B0）から非特異的結合量（NSB）を引いたカウント（B0-NSB）を100％とした時、特異的結合量（B-NSB）が例えば50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 In order to carry out the above (a) to (c) for screening for a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) For this, a suitable receptor fraction of the present invention, a labeled polypeptide of the present invention, and the like are used. The receptor fraction of the present invention is preferably a natural fraction of the receptor of the present invention or a recombinant fraction of the present invention having an equivalent activity. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled polypeptide, for example, a polypeptide labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like can be used. Of these, a polypeptide labeled with [ 125 I] is preferable.
Specifically, in order to screen for a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention, first the cell or the membrane fraction of the cell containing the receptor of the present invention is screened. Prepare the receptor preparation by suspending in a suitable buffer. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the polypeptide and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a Tris-HCl buffer. For the purpose of reducing non-specific binding, a surfactant such as CHAPS, Tween-80 ™ (Kao-Atlas), digitonin, deoxycholate, etc. may be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor of the present invention and the polypeptide of the present invention by protease. A fixed amount (5000 to 500,000 cpm) of the labeled polypeptide of the present invention is added to 0.01 to 10 ml of the receptor solution, and at the same time, 10 −10 to 10 −7 M test compound is allowed to coexist. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled polypeptide of the present invention is added is also prepared. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably 4 to 37 ° C. for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the solution is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. When the count (B 0 -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B 0 ) when there is no antagonist is 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, 50 % Or less test compound can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.

本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の（d）〜（e）の方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。 The above-described methods (d) to (e) for screening for a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) are performed. In order to achieve this, cell stimulation activity via the receptor of the present invention (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation / suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane) (Measurement of potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity of promoting or inhibiting GTPγS binding activity, etc.) using a known method or a commercially available measurement kit. be able to. Specifically, first, cells containing the receptor of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on the cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
In order to carry out screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing an appropriate receptor of the present invention are required. As the cell expressing the receptor of the present invention, the above-described receptor-expressing cell line of the present invention is desirable.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.

本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体またはその塩、本発明の受容体の部分ペプチドまたはその塩、本発明の受容体を含有する細胞、あるいは本発明の受容体を含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（a）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05％ ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（b）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたCHO細胞を、12穴プレートに5×105個／穴で継代し、37℃、5％ CO2、95％ airで2日間培養したもの。
（c）標識リガンド
〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識された本発明のポリペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを4℃または-20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。
（d）リガンド標準液
本発明のポリペプチドを0.1％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで1mMとなるように溶解し、-20℃で保存する。 A screening kit for a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof is the receptor for the present invention or its A salt, a partial peptide of the receptor of the present invention or a salt thereof, a cell containing the receptor of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the receptor of the present invention, and a polypeptide of the present invention is there.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent (a) Measurement buffer and Wash buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution is sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(B) Receptor preparation of the present invention CHO cells expressing the receptor of the present invention are subcultured at 5 × 10 5 cells / well in a 12-well plate, 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air Cultured for 2 days.
(C) labeled ligand [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like, which is obtained by dissolving the polypeptide of the present invention in an appropriate solvent or buffer, Store at 20 ° C and dilute to 1 µM with buffer for measurement.
(D) Ligand standard solution The polypeptide of the present invention is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.

２．測定法
（a）12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
（b）10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、標識された本発明のペプチドを5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに10-3Mの本発明のポリペプチドを5μl加えておく。
（c）反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを0.2N NaOH-1％SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（d）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0 ：最大結合量 2. Measurement method (a) After washing the cells expressing the receptor of the present invention cultured in a 12-well tissue culture plate twice with 1 ml of the measurement buffer, 490 μl of the measurement buffer is added to each hole. .
(B) After 5 μl of a test compound solution of 10 −3 to 10 −10 M is added, 5 μl of the labeled peptide of the present invention is added and reacted at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, 5 μl of 10 −3 M polypeptide of the present invention is added instead of the test compound.
(C) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled polypeptide of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
(D) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and the percent maximum binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B−NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added NSB: Non-specific binding (non-specific binding amount)
B 0 : Maximum amount of binding

上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）であり、具体的には本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明の受容体アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明の受容体アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記本発明の受容体アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（i）または（ii）に従えばよい。
（i）前記（a）〜（c）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、上記本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
(b) 本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体アゴニストなど）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
上記本発明の受容体アゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に、性腺機能改善剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などとして有用であり、安全で低毒性な、例えば不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用することができる。人工授精治療に用いる排卵誘発剤などとしても使用することができる。また、受容体アゴニストは、薬効を発揮させたい部位、組織などにおいて必要量以上存在させた場合（例、好ましくは、連続投与、持続投与等）、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤および（または）性ホルモン分泌抑制剤として、例えば、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用できる。また、例えば単回投与することにより、性腺刺激ホルモン分泌促進剤および（または）性ホルモン分泌促進剤として、例えば、排卵誘発または促進剤などとして用いられる。上記連続投与、持続投与には、単回投与で薬効成分を徐放させる投与方法も含まれる。
上記本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、例えば排卵抑制剤、卵巣機能調節剤などとして、例えば避妊剤、思春期早発症、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤として使用できる。 A compound obtained by using the above screening method or screening kit or a salt thereof is a compound that changes (inhibits or promotes binding) between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (polypeptide of the present invention). Specifically, a compound having a cell stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (so-called receptor agonist of the present invention) or not having the stimulating activity. Compound (so-called receptor antagonist of the present invention). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
The specific evaluation method of whether it is the receptor agonist or the antagonist of the present invention may be according to the following (i) or (ii).
(I) A compound that changes the binding property (especially, inhibits binding) between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention by performing the binding assay shown in the screening methods of (a) to (c) above. Then, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via the receptor of the present invention described above. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a receptor agonist of the present invention, and a compound having no such activity or a salt thereof is a receptor antagonist of the present invention.
(Ii) (a) A test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor of the present invention is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
(b) a compound that activates the receptor of the present invention (for example, the polypeptide of the present invention or the receptor agonist of the present invention) is contacted with a cell containing the receptor of the present invention; The cell-stimulating activity via the receptor of the present invention when a compound that activates the receptor and a test compound are contacted with a cell containing the receptor of the present invention is measured and compared. A compound or a salt thereof that can reduce the cell-stimulating activity of a compound that activates the receptor of the present invention is the receptor antagonist of the present invention.
Since the receptor agonist of the present invention has the same action as the physiological activity of the polypeptide of the present invention for the receptor of the present invention, the gonad function improving agent and ovulation are the same as the polypeptide of the present invention. It is useful as an inducer or promoter, gonadotropin secretion promoter, gonadotropin secretion inhibitor, sex hormone secretion promoter, sex hormone secretion inhibitor, etc., and is safe and low toxic, such as infertility (eg, irregular menstruation) Dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence) Genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone sensitive cancer (eg, hormone sensitive prostate cancer, hormone sensitive breast cancer, etc.), endometriosis, etc. Anti-therapeutic agent, follicular maturation inhibitors, can be used as such as sexual cycle arrest agent. It can also be used as an ovulation inducer used for artificial insemination treatment. In addition, when a receptor agonist is present in a necessary amount or more in a site or tissue where a drug effect is to be exerted (eg, preferably continuous administration, continuous administration, etc.), a gonadotropin secretion inhibitor and / or a sex hormone As a secretion inhibitor, for example, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer or endometriosis, a follicular maturation inhibitor, a sexual cycle arrester and the like. Further, for example, by a single administration, it is used as a gonadotropin secretion promoter and / or sex hormone secretion promoter, for example, as an ovulation inducer or promoter. The continuous administration and the continuous administration include an administration method in which a medicinal component is gradually released by a single administration.
Since the receptor antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention for the receptor of the present invention, for example, as an ovulation inhibitor, an ovarian function regulator, etc., for example, a contraceptive, adolescent It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for early onset, hormone sensitive cancer (eg, hormone sensitive prostate cancer, hormone sensitive breast cancer, etc.), endometriosis and the like.

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの活性または機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、不妊症の治療の目的で本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重60kg当たり）においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。また、例えば、避妊剤の目的で本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重60kg当たり）においては、一日につき該化合物を約0.1〜100ｍｇ、好ましくは約1.0〜50ｍｇ、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体アゴニストなど）は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。上記化合物またはその塩および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。 The compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract. A compound selected from plasma and the like, which promotes or inhibits the activity or function of the polypeptide of the present invention.
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salt of the polypeptide of the present invention can be used.
When the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, it can be a tablet, capsule, elixir, microcapsule, aseptic solution, suspension or the like in the same manner as the pharmaceutical containing the polypeptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) ).
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc. For example, for the purpose of treating infertility, the compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously. When administered, generally for adults (per 60 kg body weight), the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered. In addition, for example, when a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously for the purpose of a contraceptive agent, generally in an adult (per body weight of 60 kg), the compound is preferably about 0.1 to 100 mg per day, preferably Is administered at about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
A compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention or a salt thereof (for example, the polypeptide of the present invention or the receptor agonist of the present invention) is another agent, such as an alkylating agent (eg, cyclophosphamide, ifosfamide). Etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide You may use together. The compound or salt thereof and the drug may be administered to the patient at the same time or at different times.

（３）本発明のポリペプチドの定量
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドまたは受容体を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドまたは受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
本発明は、
（i）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドまたは受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドまたは受容体の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドまたは受容体のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドまたは受容体のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドまたは受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは受容体の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドまたは受容体の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 (3) Quantification of the polypeptide of the present invention Since the antibody of the present invention can specifically recognize the polypeptide or receptor of the present invention, the quantification of the polypeptide or receptor of the present invention in a test solution. In particular, it can be used for quantification by sandwich immunoassay.
The present invention
(I) The ratio of the labeled polypeptide of the present invention bound to the antibody by competitively reacting the antibody of the present invention with the test solution and the labeled polypeptide or receptor of the present invention A method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution characterized by measuring, and (ii) an antibody of the present invention insolubilized on the test solution and a carrier and another antibody of the present invention labeled A method for quantifying the polypeptide or receptor of the present invention in a test solution, characterized in that the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier is measured after reacting simultaneously or continuously.
In the quantification method (ii) above, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the polypeptide or receptor of the present invention, and the other antibody reacts with the C-terminal part of the polypeptide or receptor of the present invention. It is desirable that it is an antibody.
In addition to quantification of the polypeptide or receptor of the present invention using a monoclonal antibody against the polypeptide or receptor of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying the polypeptide or receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody corresponding to the amount of antigen (eg, amount of polypeptide) in the solution to be measured. -Any measurement method can be used as long as it is a measurement method in which the amount of antigen complex is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. Also good. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes (eg, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C], [ 32 P], [ 33 P]. ], [ 35 S], etc.), fluorescent substances (eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences)), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc. ], Enzymes (eg, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), biotin, lanthanide elements, etc. Used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a polypeptide or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the polypeptide of the present invention in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilization method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.

本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドまたは受容体を感度良く定量することができる。 In the method for measuring the polypeptide of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the polypeptide of the present invention binds. It is done. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody used in the primary reaction when, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the polypeptide of the present invention. For example, an antibody that recognizes the N end other than the C end is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble method is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of the polypeptide of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Sequel Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (3rd edition) (Medical Shoin, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid. )) (From Academic Press Line).
As described above, the polypeptide or receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.

本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度の減少が検出された場合、例えば、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度の増加が検出された場合には、例えば、思春期早発症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドまたは受容体を検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドまたは受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドまたは受容体の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドまたは受容体の挙動の分析などのために使用することができる。 When a decrease in the concentration of the polypeptide or receptor of the present invention is detected by quantifying the concentration of the polypeptide or receptor of the present invention using the antibody of the present invention, for example, infertility [eg, irregular menstruation] Dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence) Genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone-sensitive cancer (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), endometriosis, etc. Or can be diagnosed as likely to be affected in the future.
When an increase in the concentration of the polypeptide or receptor of the present invention is detected, it can be diagnosed that the disease is, for example, a disease such as precocious puberty or is likely to be affected in the future.
The antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide or receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide or receptor of the present invention, detection of the polypeptide or receptor of the present invention in each fraction at the time of purification, polymorphism of the present invention in a test cell. It can be used for analysis of peptide or receptor behavior.

（４）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。 (4) Gene diagnostic agent The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to allow humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs). , Monkeys, etc.) can detect an abnormality (gene abnormality) in the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention. For example, the DNA or mRNA is damaged, mutated or decreased in expression, It is useful as a gene diagnostic agent for increased mRNA or excessive expression.

本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR-SSCP法（Genomics，5巻，874−879頁（1989年）、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），86巻，2766−2770頁（1989年）などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のポリペプチドまたは受容体の遺伝子の発現低下または遺伝子の欠損が検出された場合は、 例えば、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの疾病である可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のポリペプチドまたは受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、思春期早発症などの疾病である可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 The gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. of America), 86, 2766-2770 (1989).
For example, when a decrease in gene expression or gene deletion of the polypeptide or receptor of the present invention is detected by Northern hybridization, for example, infertility [eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss] Sexual amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence), genital atrophy, testicular atrophy, testicular function Disorders, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone-sensitive cancers (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), diseases such as endometriosis, or may be affected in the future Can be diagnosed as high.
When excessive expression of the polypeptide of the present invention or the gene of the receptor is detected by Northern hybridization, for example, it is highly possible that the disease is a disease such as early onset of puberty or is likely to be affected in the future. Can be diagnosed.

（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体（例、活性化抗体）は、例えば性腺機能改善剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などとして使用することができ、例えば、不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして有用である。また、本発明の抗体（例、活性化抗体）は、薬効を発揮させたい部位、組織などにおいて必要量以上存在させた場合（例、好ましくは、連続投与、持続投与等）、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤および（または）性ホルモン分泌抑制剤として、例えば、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用できる。また、例えば単回投与することにより、性腺刺激ホルモン分泌促進剤および（または）性ホルモン分泌促進剤として、例えば、排卵誘発または促進剤などとして用いられる。上記連続投与、持続投与には、単回投与で薬効成分を徐放させる投与方法も含まれる。
本発明の中和抗体は、例えば排卵抑制剤、卵巣機能調節剤などとして、例えば避妊剤、思春期早発症、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤として使用できる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の不妊症の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。 (5) Pharmaceutical containing the antibody of the present invention The antibody of the present invention (eg, activated antibody) is, for example, a gonad function improving agent, an ovulation inducing or promoting agent, a gonadotropin secretion promoter, a gonadotropin secretion inhibitor, It can be used as a sex hormone secretion promoter, sex hormone secretion inhibitor, etc., for example, infertility (eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea, weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, Anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence), genital atrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), endometriosis, follicular maturation inhibitor, sexual cycle arrest agent, and the like. In addition, when the antibody (eg, activated antibody) of the present invention is present in a necessary amount (eg, preferably, continuous administration, continuous administration, etc.) in a site or tissue where drug efficacy is to be exerted (eg, continuous administration, continuous administration, etc.), gonadotropin secretion As an inhibitor and / or sex hormone secretion inhibitor, for example, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for hormone-sensitive cancer or endometriosis, a follicle maturation inhibitor, a sexual cycle arrester, and the like. Further, for example, by a single administration, it is used as a gonadotropin secretion promoter and / or sex hormone secretion promoter, for example, as an ovulation inducer or promoter. The continuous administration and the continuous administration include an administration method in which a medicinal component is gradually released by a single administration.
The neutralizing antibody of the present invention can be used as, for example, an ovulation inhibitor, an ovarian function regulator, etc., for example, a contraceptive, early puberty, hormone sensitive cancer (eg, hormone sensitive prostate cancer, hormone sensitive breast cancer, etc.) It can be used as a preventive / therapeutic agent.
The agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey). Etc.) orally or parenterally. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, and the like. For example, when used for the treatment of infertility in adults, the antibody of the present invention is usually administered at a dose of 0.01 to About 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day It is convenient to do. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules). Syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。 As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous infusions, and the like. Is included. Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with a normal suppository base.
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg for each dosage unit dosage form, especially 5 to 100 mg for injections. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the antibody.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
Furthermore, the antibody of the present invention may be used for other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, Mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide and the like. The antibody of the present invention and the drug may be administered to the patient at the same time or at different times.

（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、例えば例えば排卵抑制剤、卵巣機能調節剤などとして、例えば避妊剤、思春期早発症、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤として使用できる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 (6) Medicament containing antisense DNA The antisense DNA of the present invention can be used, for example, as an ovulation inhibitor, ovarian function regulator, etc., for example, as a contraceptive, precocious puberty, hormone sensitive cancer (eg, hormone sensitive prostate cancer). , Hormone-sensitive breast cancer, etc.) and can be used as a preventive / therapeutic agent for endometriosis.
For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA can be carried out according to conventional means after being inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.

（７）ＤＮＡ転移動物
外来性の本発明のポリペプチドまたは受容体をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物も、排卵誘発または促進剤などをスクリーニングするために用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。 (7) DNA-transferred animal A DNA encoding an exogenous polypeptide or receptor of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (abbreviated as exogenous mutant DNA of the present invention) Non-human mammals having a) are also used to screen for ovulation-inducing or promoting agents and the like.
A non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as a DNA-transferred animal of the present invention) can be used for embryos including unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and primordial cells thereof. Preferably, at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally prior to the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, It can be produced by transferring the target DNA by the microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like. Further, by the DNA transfer method, the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and can be used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a known cell fusion method.
Examples of non-human mammals include cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like. Among them, rodents, especially mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains, etc.) that are relatively short in ontogenesis and biological cycle from the viewpoint of creating a disease animal model system and that are easy to reproduce. As the system, B6C3F 1 system, BDF 1 system, B6D2F 1 system, BALB / c system, ICR system, etc.) or rats (for example, Wistar, SD, etc.) are preferable.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include humans and the like in addition to the above non-human mammals.
The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation or the like) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. The resulting DNA is used, and abnormal DNA is also included.
The abnormal DNA means DNA that expresses an abnormal polypeptide of the present invention, and for example, DNA that expresses a polypeptide that suppresses the function of the normal polypeptide of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, the expression of DNA derived from various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology with this. The DNA of the present invention is highly expressed by microinjecting a DNA construct (eg, a vector) conjugated with the human DNA of the present invention downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA transfer mammals can be created.

本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（a）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（b）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。 Examples of the expression vector for the polypeptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animals such as vaccinia virus and baculovirus. Viruses are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
Examples of promoters that regulate DNA expression include (a) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidity Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, liquor Acid-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin , Pre Russia enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, a human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters, and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of a target messenger RNA in a DNA-transferred mammal. For example, the sequence of each DNA derived from viruses and various mammals The SV40 terminator of simian virus or the like is preferably used.

その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５´上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３´下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。 In addition, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or the translation region It is also possible to connect it 3 ′ downstream of the other.
The normal translation region of the polypeptide of the present invention includes DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and Complementary DNA prepared by a known method can be obtained as a raw material from all commercially available genomic DNA libraries as all or part of genomic DNA or from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblasts. In addition, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
The transfer of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the foreign DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the foreign DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the foreign DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. .
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the germ cells of the produced animal after DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.

本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。 In the non-human mammal having the normal DNA of the present invention, the normal DNA of the present invention is highly expressed, and finally the function of the endogenous normal DNA is promoted to finally promote hyperfunction of the polypeptide of the present invention. Can be used as a model animal of the disease state. For example, by using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the hyperfunction of the polypeptide of the present invention and the pathological mechanism of the disease associated with the polypeptide of the present invention, and examination of a treatment method for these diseases It is possible.
In addition, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention, it is also used in screening tests for therapeutic agents for diseases related to the polypeptide of the present invention. Is possible.
On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material. A DNA construct with a promoter can be prepared by a normal DNA engineering technique. The abnormal DNA transfer of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA.

本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（a）組織培養のための細胞源としての使用、
（b）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
（c）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（d）上記（c）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（e）本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。 In the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and finally the function of the polypeptide of the present invention is inactivated by inhibiting the function of the endogenous normal DNA. It can become type refractory and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the polypeptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific applicability, the abnormally high-expressing animal of the present invention is capable of inhibiting the function of the normal polypeptide (dominant negative) by the abnormal polypeptide of the present invention in the functional inactive refractory of the polypeptide of the present invention. Model).
Further, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention, it is suitable for a therapeutic drug screening test for the functional inactive refractory of the polypeptide of the present invention. Is also available.
Further, as other applicability of the above-mentioned two kinds of DNA transfer animals of the present invention, for example,
(A) use as a cell source for tissue culture,
(B) Specific expression or activation by the polypeptide of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing the polypeptide tissue expressed by the DNA Analysis of the relationship to the polypeptide
(C) culturing cells of a tissue having DNA by a standard tissue culture technique, and using these, studying the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
(D) Screening for drugs that enhance the function of cells by using the cells described in (c) above, and (e) isolating and purifying the mutant polypeptides of the present invention and producing antibodies thereof are conceivable.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of diseases associated with the polypeptide of the present invention, including functional inactive refractories of the polypeptide of the present invention, can be examined. More detailed pathological findings in each organ of a disease model related to the polypeptide can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
Further, each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain a free DNA-transferred cell, culture it, or systematize the cultured cell with a protease such as trypsin. . Furthermore, the polypeptide of the present invention and its action can be examined by specifying the polypeptide-producing cells of the present invention, examining the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and examining their abnormalities. It becomes an effective research material for elucidation.
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease related to the polypeptide of the present invention, including the functionally inactive refractory of the polypeptide of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, In addition, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease using a quantitative method and the like. Moreover, it is possible to examine and develop a DNA therapy for a disease associated with the polypeptide of the present invention using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.

（８）ノックアウト動物
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物も、性腺機能改善剤、不妊症の予防・治療剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤または性ホルモン分泌促進剤をスクリーニングするために用いられる。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。 (8) Knockout animal A non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in the expression of the DNA of the present invention are also a gonad function improving agent, a prophylactic / therapeutic agent for infertility, ovulation induction or It is used for screening a promoter, a gonadotropin secretagogue, or a sex hormone secretagogue.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the polypeptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the polypeptide of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). And non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted and another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.

本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Inserting a reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the function of the exon, or inserting a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates the transcription of the gene into an intron between the exons, By preventing the synthesis of complete messenger RNA As a result, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cell Southern hybridization analysis using the DNA sequence of the present invention or the vicinity thereof as a probe, or PCR method using the DNA sequence of the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers And can be obtained by sorting the knockout ES cells of the present invention.
In addition, as the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative purely immunologically genetic background For example, C57BL / 6 mice and BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2, which have improved the number of eggs collected from C57BL / 6 mice by crossing with DBA / 2) are obtained. Those established using F 1 ) can be used well. BDF 1 mice have the advantage of having a large number of eggs collected and strong eggs, and since C57BL / 6 mice are used as background, ES cells obtained using these mice can be used to produce pathological model mice. The genetic background can be advantageously replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
When establishing ES cells, blastocysts on the third day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting eggs and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.

ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Nature、第292巻、154頁、1981年； Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第78巻、7634頁、1981年；ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用である。 One example of a method for determining the sex of an ES cell is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. If this method is used, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is required, whereas about 10 6 cells were conventionally required for karyotype analysis. It is possible to perform primary selection of ES cells in the early stage by discriminating between males and females, and by allowing male cells to be selected at an early stage, labor in the initial stage of culture can be greatly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations during establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5%) in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast. Culturing is carried out by a method such as culturing at about 37 ° C. with carbon dioxide gas, 90% air, and at the time of passage, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, the cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, the cells are observed, and if morphologically abnormal cells are observed, the cultured cells are preferably discarded.
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [Nature, 292, 154, 1981; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981; Journal of Embrology and Experience] (Mental Morphology, 87, 27, 1985), a DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is a cell of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention in vitro. Useful in biological studies.

本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。 The DNA expression deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is a DNA in which, for example, a targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individual thus obtained is usually an individual with deficient hetero-expression of the polypeptide of the present invention, and the individual with deficient hetero-expression of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention is crossed and their offspring From the above, an individual with a homo-expression deficiency of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention can be obtained.

卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。 In the case of using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having mutations in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the animal individual obtained by mating has also been knocked out.
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and a plurality of homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
Further, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention, the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the cause of these diseases and for examining therapeutic methods.

（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。 (8a) Screening method of compound having therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of DNA of the present invention The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be deficient or damaged of the DNA of the present invention. It can be used for screening for compounds having a therapeutic / prophylactic effect on diseases caused by.
That is, the present invention results from the deficiency or damage of the DNA of the present invention, characterized by administering a test compound to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal. Provided is a screening method for a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like, and these compounds are novel compounds. It may be a known compound.
Specifically, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / prophylactic effect of the compound can be tested.
As a method for treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.

例えば、性腺機能改善剤、不妊症の予防・治療剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などをスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物にPMS処置を行ない、PMS処置後48時間後に試験化合物を投与し、さらに24時間後に該動物の排卵数、血中ホルモン濃度などを経時的に測定する。   For example, screening for agents for improving gonad function, agents for preventing or treating infertility, ovulation inducers or promoters, gonadotropin secretion promoters, gonadotropin secretion inhibitors, sex hormone secretion promoters, sex hormone secretion inhibitors, etc. In this case, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with PMS, and the test compound is administered 48 hours after the PMS treatment, and the ovulation number, blood hormone concentration, etc. of the animal are measured over time after 24 hours. To do.

該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の排卵数が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）の患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）の不妊症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。 In the screening method, when the test compound is administered to the test animal, the test compound is added to the test compound when the ovulation number of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. It can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against other diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and has a therapeutic / prophylactic effect on diseases caused by deletion or damage of the polypeptide of the present invention. It can be used as a medicine such as a safe and low toxic preventive / therapeutic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
A pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the polypeptide of the present invention described above.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered subcutaneously, it is generally one in an adult patient (with a body weight of 60 kg). The compound is administered at about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection (in adults) When administered to an infertility patient (with a body weight of 60 kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. It is. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 (8b) Method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention The present invention comprises administering a test compound to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention to detect the expression of a reporter gene. The screening method of the compound or its salt which promotes or inhibits the activity of the promoter with respect to DNA of this invention characterized by these is provided.
In the screening method described above, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene among the DNA expression-deficient non-human mammals of the present invention described above, A gene capable of expressing the reporter gene under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene, or the like is preferable.
In the non-human mammal of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced because the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the polypeptide of the present invention is substituted with the β-galactosidase gene (lacZ) derived from E. coli, the tissue of the present invention is originally expressed in the tissue expressing the polypeptide of the present invention. Β-galactosidase is expressed instead of the peptide. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate of β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), the present invention can be easily performed. The expression state of the polypeptide in an animal can be observed. Specifically, the polypeptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or 37 ° C. After reacting in the vicinity for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.

本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、性腺機能改善剤、排卵誘発または促進剤、性腺刺激ホルモン分泌促進剤、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤、性ホルモン分泌促進剤、性ホルモン分泌抑制剤などとして有用であり、例えば不妊症〔例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症、無排卵症、卵巣機能低下症、性腺機能低下症、精子形成障害、性機能低下症（例、インポテンスなど）、性器萎縮症、精巣萎縮症、精巣機能障害、無精子症、低アンドロゲン血症など〕、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤、卵胞成熟阻害剤、性周期停止剤などとして使用することができる。また人工授精時における排卵誘発剤などとして使用することもできる。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば排卵抑制剤、卵巣機能調節剤などとして、例えば避妊剤、思春期早発症、ホルモン感受性癌（例、ホルモン感受性前立腺癌、ホルモン感受性乳癌など）、子宮内膜症などの予防・治療剤として使用できる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the polypeptide of the present invention and promote the function of the polypeptide, for example, a gonad function improving agent, ovulation induction or It is useful as a promoter, gonadotropin secretion promoter, gonadotropin secretion inhibitor, sex hormone secretion promoter, sex hormone secretion inhibitor, etc., for example, infertility [eg, irregular menstruation, dysmenorrhea, amenorrhea Weight loss amenorrhea, secondary amenorrhea, anovulation, ovarian hypofunction, hypogonadism, spermatogenesis disorder, hypogonadism (eg, impotence), genital atrophy, testicular atrophy , Testicular dysfunction, azoospermia, hypoandrogenemia, etc.), hormone-sensitive cancer (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), prevention of endometriosis, etc. Therapeutic agents, follicular maturation inhibitors, can be used as such as sexual cycle arrest agent. It can also be used as an ovulation inducer during artificial insemination.
In addition, the compound or its salt that inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention can inhibit the expression of the polypeptide of the present invention and inhibit the function of the polypeptide. Examples of such agents include contraceptives, precocious puberty, hormone-sensitive cancers (eg, hormone-sensitive prostate cancer, hormone-sensitive breast cancer, etc.), and preventive and therapeutic agents for endometriosis.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.

該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）の患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）の患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。 The medicament containing the compound or salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the medicament containing the polypeptide of the present invention or salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered, generally the adult (body weight) In patients (as 60 kg), the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection (in adults) When administered to a patient having a body weight of 60 kg, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. . In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered, generally in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0, per day. -50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc. For example, a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection (in adults) When administered to a patient having a body weight of 60 kg, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. . In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
Thus, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic drugs.
In addition, by using DNA containing the promoter region of the polypeptide of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal so-called transgenic animal (gene transfer animal). It is possible to specifically synthesize the polypeptide and examine its action in the living body. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter part and a cell line that expresses it is established, a small molecule having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the polypeptide itself of the present invention in the body. It can be used as a compound search system.

本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく
はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−
１−プロパンスホナート
Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ： ２,２,４,６,７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン
−５−スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕt ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine I: inosine R: adenine (A) or guanine (G)
Y: Thymine (T) or cytosine (C)
M: adenine (A) or cytosine (C)
K: Guanine (G) or thymine (T)
S: Guanine (G) or cytosine (C)
W: adenine (A) or thymine (T)
B: Guanine (G), guanine (G) or thymine (T)
D: adenine (A), guanine (G) or thymine (T)
V: adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
N: adenine (A), guanine (G), cytosine (C)
Is thymine (T) or unknown or other base RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid dATP: Deoxyadenosine triphosphate dTTP: Deoxythymidine triphosphate dGTP: Deoxyguanosine triphosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate BHA: benzhydrylamine pMBHA: p-methylbenzhydrylamine Tos: p-toluenesulfonyl Bzl: benzyl Bom: benzyloxymethyl Boc: t-butyloxycarbonyl DCM: Dichloromethane HOBt: 1-hydroxybenztriazole DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide TFA: trifluoroacetic acid DIEA: Isopropylethylamine BSA: bovine serum albumin CHAPS: 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethyl ammonio] -
1-propanesulfonate Gly or G: glycine Ala or A: alanine Val or V: valine Leu or L: leucine Ile or I: isoleucine Ser or S: serine Thr or T: threonine Cys or C: cysteine Met or M: methionine Glu or E: glutamic acid Asp or D: aspartic acid Lys or K: lysine Arg or R: arginine His or H: histidine Phe or F: phenylalanine Tyr or Y: tyrosine Trp or W: tryptophan Pro or P: proline Asn or N: Asparagine Gln or Q: glutamine pGlu: pyroglutamic acid Tyr (I): 3-iodotyrosine DMF: N, N-dimethylformamide Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycal Bonyl Trt: Trityl Pbf: 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran
-5-sulfonyl Clt: 2-chlorotrityl But: t -butyl Met (O): methionine sulfoxide

本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトメタスチン(45-54)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
マウスメタスチン(43-52)およびラットメタスチン(43-52)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトメタスチンのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトメタスチンをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
マウスメタスチンのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
マウスメタスチンをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ラットメタスチンのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ラットメタスチンをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ヒトメタスチン(40-54)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトメタスチン(40-54)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ヒトメタスチン(46-54)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトメタスチン(46-54)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒトメタスチン(47-54)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ヒトメタスチン(47-54)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ヒトメタスチン(48-54)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ヒトメタスチン(48-54)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ヒトメタスチン(45-54)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
マウスメタスチン(43-52)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ラットメタスチン(43-52)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ヒトOT7T175のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ヒトOT7T175をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ラットOT7T175のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ラットOT7T175をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
マウスOT7T175のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
マウスOT7T175をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The amino acid sequence of human metastin (45-54) is shown.
[SEQ ID NO: 2]
The amino acid sequences of mouse metastin (43-52) and rat metastin (43-52) are shown.
[SEQ ID NO: 3]
The amino acid sequence of human metastin is shown.
[SEQ ID NO: 4]
The nucleotide sequence of DNA encoding human metastin is shown.
[SEQ ID NO: 5]
The amino acid sequence of mouse metastin is shown.
[SEQ ID NO: 6]
The nucleotide sequence of cDNA encoding mouse metastin is shown.
[SEQ ID NO: 7]
The amino acid sequence of rat metastin is shown.
[SEQ ID NO: 8]
The nucleotide sequence of cDNA encoding rat metastin is shown.
[SEQ ID NO: 9]
The amino acid sequence of human metastin (40-54) is shown.
[SEQ ID NO: 10]
This shows the base sequence of DNA encoding human metastin (40-54).
[SEQ ID NO: 11]
The amino acid sequence of human metastin (46-54) is shown.
[SEQ ID NO: 12]
The nucleotide sequence of DNA encoding human metastin (46-54) is shown.
[SEQ ID NO: 13]
The amino acid sequence of human metastin (47-54) is shown.
[SEQ ID NO: 14]
The nucleotide sequence of DNA encoding human metastin (47-54) is shown.
[SEQ ID NO: 15]
The amino acid sequence of human metastin (48-54) is shown.
[SEQ ID NO: 16]
This shows the base sequence of DNA encoding human metastin (48-54).
[SEQ ID NO: 17]
This shows the base sequence of DNA encoding human metastin (45-54).
[SEQ ID NO: 18]
The nucleotide sequence of DNA encoding mouse metastin (43-52) is shown.
[SEQ ID NO: 19]
This shows the base sequence of DNA encoding rat metastin (43-52).
[SEQ ID NO: 20]
The amino acid sequence of human OT7T175 is shown.
[SEQ ID NO: 21]
The nucleotide sequence of cDNA encoding human OT7T175 is shown.
[SEQ ID NO: 22]
The amino acid sequence of rat OT7T175 is shown.
[SEQ ID NO: 23]
The nucleotide sequence of cDNA encoding rat OT7T175 is shown.
[SEQ ID NO: 24]
The amino acid sequence of mouse OT7T175 is shown.
[SEQ ID NO: 25]
The nucleotide sequence of DNA encoding mouse OT7T175 is shown.

以下に実施例および製剤例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ヒトメタスチンを用いた未成熟ラットでの排卵誘発
equine chorionic gonadotropin（eCG、セロトロピン、大日本製薬）を100 IU/mLで生理食塩水（大塚製薬）に溶解し、生後23日齢の雌性Wistarラット（日本チャールズリバー）の背部皮下に、1個体当たり10 IUのeCGを、午前9時30分から10時の間に、容量1mLのツベルクリン用注射筒と26ゲージ注射針（いずれもテルモ）を用いて投与した。eCG投与後47〜48時間後に以下に示す群分けを行い、それぞれの薬剤投与を行った。
グループＡ（ラット5匹）：human chorionic gonadotropin（hCG、ゴナトロピン、大日本製薬）を100 IU/mLで生理食塩水に溶解し、1個体当たり20 IUを背部皮下に投与した。
グループＢ（ラット5匹）：ヒトメタスチンを100nmol/mLで生理食塩水に溶解し、1個体当たり20nmolを背部皮下に皮下投与した。
グループＣ（ラット5匹）：ヒトメタスチンを33.3nmol/mLで生理食塩水に溶解し、1個体当たり6.67nmolを背部皮下に投与した。
グループＤ（ラット6匹）：1個体当たり200μLの生理食塩水を背部皮下に投与した。
上記の薬剤の投与後、さらに24〜25時間後に断頭し、血液、両側卵管および子宮を回収した。血液回収に際しては、血液凝固を防止するために、回収する遠心チューブにはあらかじめ3mg/mL EDTAを含む10KIU/mLのアプロチニン溶液（トラジロール、バイエル）を90μL入れておいた。血液回収後は、よく混和し、2,000Gで25分間遠心し、上清を回収して血漿サンプルとした。
排卵数の計数は、次のようにして行った。
実体顕微鏡下での卵管の観察により、卵管膨大部における卵の滞留が確認された場合には、同部位を27ゲージの注射針（テルモ）によって切開して卵を取り出し、トリプシン処理によって卵を取り囲む顆粒膜細胞を除去した後、卵を計数した。実体顕微鏡下での卵管の観察で、卵管膨大部での卵が確認できなかった場合には、先端を研磨した27ゲージの注射針を卵管口に挿入し、卵管および子宮内を400μL以上の生理食塩水で洗浄した後、流出液中の卵の有無を観察した。
得られた排卵数を表１に示す。

Figure 2005097237
表中、１〜５はラットの個体番号を示す。
汎用の過排卵処理群であるグループＡでは、ラット1匹あたり平均37.6個の排卵が確認された。メタスチンを投与したグループＢ、グループＣでは、それぞれ平均31.8個、27.6個の排卵が確認された。一方、生理食塩水を投与したグループＤでは、排卵数の平均は0.6個であり、排卵刺激非存在下での自発的排卵はほとんどなかった。
表１に示すラットから採取した血漿中に含まれるエストラジオール濃度を、ラジオイムノアッセイ（DPC・エストラジオール キット；Diagnostic Products Corporation）により測定した結果を図１に示す。
これより、グループＡ、グループＢおよびグループＣ間で、血漿中に含まれるエストラジオールの濃度差は無く、生理食塩水を投与したグループＤでのみ、エストラジオールの濃度が非常に高かったことがわかる。
血漿中に含まれるプロゲステロン濃度を、ラジオイムノアッセイ（DPC・プロゲステロン；Diagnostic Products Corporation）により測定した結果を図２に示す。
これより、プロゲステロン濃度はグループＡが最も高く、グループＢおよびグループＣは、グループＡの約半分の血漿濃度であったことが、また、グループＤのプロゲステロン濃度は非常に低かったことがわかる。
一般に、ラット、マウスおよびヒトの卵巣において産生される主なステロイドホルモンは、卵胞の成熟期ではエストロゲンであり、一方、排卵を誘発された後はプロゲステロンである。実際、図１および図２の結果でも、生理食塩水を投与したグループＤでは、排卵が誘発されていないためにエストロゲン産生が高い状態にあり、一方hCGを投与したグループＡでは、エストロゲン産生が低下し、プロゲステロンの産生が上昇していることがわかる。メタスチン投与群であるグループＢおよびグループＣでは、血漿中エストロゲン濃度は非常に低く、逆にプロゲステロン濃度が上昇していることから、メタスチンはラット卵巣に対して、正常な過程を経て排卵を誘発していることがわかる。また、グループＡよりもグループＢ、グループＣのプロゲステロン濃度が低いことから、hCGと比べてメタスチンは、より穏やかな卵巣刺激作用を有していると考えられる。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples and formulation examples below, but these do not limit the scope of the present invention.
Example 1
Induction of ovulation in immature rats using human metastin
Equine chorionic gonadotropin (eCG, cellotropin, Dainippon Pharmaceutical) dissolved in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) at 100 IU / mL, and subcutaneously on the back of 23-day-old female Wistar rats (Nihon Charles River) 10 IU eCG was administered between 9:30 am and 10 am using a 1 mL tuberculin syringe and a 26 gauge needle (both Terumo). 47 to 48 hours after eCG administration, the following grouping was performed, and each drug was administered.
Group A (5 rats): human chorionic gonadotropin (hCG, gonatropin, Dainippon Pharmaceutical) was dissolved in physiological saline at 100 IU / mL, and 20 IU per individual was subcutaneously administered to the back.
Group B (5 rats): Human metastin was dissolved in physiological saline at 100 nmol / mL, and 20 nmol per animal was subcutaneously administered to the back of the skin.
Group C (5 rats): Human metastin was dissolved in physiological saline at 33.3 nmol / mL, and 6.67 nmol per individual was subcutaneously administered to the back.
Group D (6 rats): 200 μL of physiological saline was administered subcutaneously to the back of each animal.
After administration of the above drugs, the mice were decapitated 24-25 hours later, and blood, bilateral fallopian tubes and uterus were collected. At the time of blood collection, in order to prevent blood coagulation, 90 μL of a 10 KIU / mL aprotinin solution (Tradilol, Bayer) containing 3 mg / mL EDTA was placed in advance in the collected centrifuge tube. After blood collection, the mixture was mixed well and centrifuged at 2,000 G for 25 minutes, and the supernatant was collected to obtain a plasma sample.
The number of ovulations was counted as follows.
When observation of the fallopian tube under a stereomicroscope confirms that the egg stays in the huge portion of the fallopian tube, the egg is removed by incising the site with a 27-gauge injection needle (Terumo), and trypsinization to remove the egg. After removing the granulosa cells that surround the eggs, the eggs were counted. If observation of the oviduct under a stereomicroscope did not confirm an egg in the tubal enormous area, insert a 27-gauge injection needle with a polished tip into the oviduct mouth, After washing with 400 μL or more of physiological saline, the presence or absence of eggs in the effluent was observed.
Table 1 shows the number of ovulation obtained.
Figure 2005097237
 In the table, 1 to 5 represent rat individual numbers.
In group A, a general-purpose superovulation treatment group, an average of 37.6 ovulations were confirmed per rat. In group B and group C to which metastin was administered, an average of 31.8 and 27.6 ovulations were confirmed, respectively. On the other hand, in group D to which physiological saline was administered, the average number of ovulations was 0.6, and there was almost no spontaneous ovulation in the absence of ovulation stimulation.
FIG. 1 shows the results of measuring the concentration of estradiol contained in plasma collected from the rats shown in Table 1 by radioimmunoassay (DPC / estradiol kit; Diagnostic Products Corporation).
This shows that there is no difference in the concentration of estradiol contained in plasma among group A, group B and group C, and that the concentration of estradiol was very high only in group D to which physiological saline was administered.
FIG. 2 shows the results of measuring the concentration of progesterone contained in plasma by radioimmunoassay (DPC / progesterone; Diagnostic Products Corporation).
This shows that the progesterone concentration was highest in group A, group B and group C had about half the plasma concentration of group A, and group D had a very low progesterone concentration.
In general, the main steroid hormone produced in rat, mouse and human ovaries is estrogen during follicular maturation, while progesterone is induced after ovulation is induced. In fact, even in the results of FIGS. 1 and 2, in group D administered with physiological saline, estrogen production was high because ovulation was not induced, whereas in group A administered with hCG, estrogen production decreased. It can be seen that progesterone production is increased. In group B and group C, which are metastin-administered groups, plasma estrogen levels are very low and conversely progesterone levels are increased, so metastin induces ovulation through normal processes in rat ovaries. You can see that In addition, since group B and group C have lower progesterone concentrations than group A, metastin is considered to have a milder ovarian stimulating action than hCG.

実施例２
ヒトメタスチンの未成熟ラットでのゴナドトロピン放出作用
生後25日齢の雌性Wistarラット（日本チャールズリバー）に対し、午前9時から10時の間に、生理食塩水に33.3 nmol/mLの濃度で溶解したヒトメタスチンを、１個体当たり200μL、すなわちヒトメタスチン6.67nmolを背部皮下に投与した。メタスチンを投与する前、および投与してから1、2、4時間後に断頭し、血液を回収した。血液回収に際しては、血液凝固を防止するために、回収する遠心チューブにはあらかじめ3 mg/mLのEDTAを含む10 KIU/mLのアプロチニン溶液（トラジロール、バイエル）を90μL入れておいた。また回収後は、よく混和した後、2,000Gで25分間遠心し、上清を回収して血漿サンプルとした。血漿中に含まれるFSH（卵胞刺激ホルモン）、LH（黄体刺激ホルモン）、およびプロゲステロン濃度は、ラジオイムノアッセイ（Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH)[125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、Rat Luteinizing Hormone (rLH)[125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、いずれもアマシャムバイオサイエンス、およびDPC・プロゲステロン、Diagnostic Products Corporation）を用いて測定した。
メタスチン投与による未成熟ラット血漿FSH濃度の変動を測定した結果を、図３に示す。メタスチン投与後1時間から、血漿FSH濃度は有意に上昇を始め、2時間後で最も高くなっていた。4時間後では血漿FSH濃度の低下が認められたが、投与前に比べると高い状態を維持していた。
メタスチン投与による未成熟ラット血漿LH濃度の変動を測定した結果を、図４に示す。FSHの場合と同様に、メタスチン投与後1時間から、血漿LH濃度は有意に上昇を始め、2時間後で最も高くなっていた。4時間後では血漿LH濃度の低下が認められたが、投与前に比べると、高い状態を維持していた。
メタスチン投与による未成熟ラット血漿プロゲステロン濃度の変動を測定した結果を、図５に示す。血漿LH濃度の上昇を反映して、血漿プロゲステロン濃度はメタスチン投与後1時間から穏やかな上昇を始め、2時間後は投与前に比べて有意に高い値を示した。
図３および図４の結果より、メタスチンを末梢投与すると、FSH、LHなどのゴナドトロピンの放出が誘導されることがわかる。実施例１で示したメタスチンによる排卵誘発は、このゴナドトロピン放出、特にLHの放出を介したものであると推察される。
なお、実施例１で示した排卵誘発作用はeCGを投与したラットでの作用であるが、本実施例の作用は未処置のラットを用いた結果であり、メタスチンによるゴナドトロピン放出作用にはeCGの前処理は必要としない。
図５の結果は、メタスチンの投与によるゴナドトロピンの放出が、卵巣にも生理的な刺激を与え、プロゲステロンの産生を亢進することを意味している。 Example 2
Gonadotropin-releasing action of human metastin in immature rats Human metastin dissolved in physiological saline at a concentration of 33.3 nmol / mL between 9 am and 10 am in female Wistar rats (Nippon Charles River) aged 25 days Was administered subcutaneously in the back at 200 μL per individual, ie, 6.67 nmol of human metastin. Before administration of metastin and 1, 2, and 4 hours after administration, it was decapitated and blood was collected. At the time of blood collection, in order to prevent blood coagulation, 90 μL of 10 KIU / mL aprotinin solution (Tradilol, Bayer) containing 3 mg / mL EDTA was placed in advance in the collected centrifuge tube. After collection, the mixture was mixed well and centrifuged at 2,000 G for 25 minutes, and the supernatant was collected to obtain a plasma sample. Plasma FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH (Luteinizing Hormone), and Progesterone Concentrations can be measured using the Radio Immunoassay (Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH) [125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, Rat Luteinizing Hormone (rLH) [ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, all measured using Amersham Biosciences, DPC Progesterone, Diagnostic Products Corporation).
FIG. 3 shows the results of measuring the fluctuation of plasma immature rat plasma FSH concentration due to administration of metastin. At 1 hour after metastin administration, plasma FSH levels began to rise significantly and were highest after 2 hours. After 4 hours, a decrease in plasma FSH concentration was observed, but it remained high compared to before administration.
FIG. 4 shows the results of measuring the fluctuation of plasma LH concentration in immature rat by administration of metastin. As in the case of FSH, the plasma LH concentration began to rise significantly from 1 hour after metastin administration, and was highest after 2 hours. After 4 hours, a decrease in plasma LH concentration was observed, but it remained high compared to before administration.
FIG. 5 shows the results of measuring changes in plasma concentrations of progesterone in immature rats due to administration of metastin. Reflecting the increase in plasma LH concentration, plasma progesterone concentration started to increase moderately from 1 hour after metastin administration, and showed a significantly higher value after 2 hours than before administration.
From the results of FIG. 3 and FIG. 4, it can be seen that peripheral administration of metastin induces the release of gonadotropins such as FSH and LH. It is presumed that the induction of ovulation by metastin shown in Example 1 is mediated by this gonadotropin release, in particular LH release.
In addition, although the ovulation inducing action shown in Example 1 is an action in a rat administered with eCG, the action in this example is a result of using an untreated rat, and the action of eCG on the release of gonadotropin by metastin is shown in FIG. No pretreatment is required.
The result of FIG. 5 means that the release of gonadotropin by administration of metastin gives physiological stimulation to the ovary and enhances the production of progesterone.

実施例３
ヒトメタスチンによる成熟雄性ラットのゴナドトロピン放出作用
生後11週齢の雄性Wistarラット（日本チャールズリバー）に対し、午前10時30分から11時30分の間に、生理食塩水に175 nmol/mLの濃度で溶解したヒトメタスチンを、1個体当たり200μL、すなわちヒトメタスチン35 nmolを背部皮下に投与した。メタスチンを投与する前、および投与してから1、2、4時間後に断頭し、血液を回収した。血液回収に際しては、血液凝固を防止するために、回収する遠心チューブにはあらかじめ3 mg/mLのEDTAを含む10 KIU/mLのアプロチニン溶液（トラジロール、バイエル）を300μL入れておいた。また回収後は、よく混和した後、2,000Gで25分間遠心し、上清を回収して血漿サンプルとした。血漿中に含まれるFSH（卵胞刺激ホルモン）、LH（黄体刺激ホルモン）、およびテストステロン濃度は、ラジオイムノアッセイ（Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH)[125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、Rat Luteinizing Hormone (rLH)[125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、いずれもアマシャムバイオサイエンス、およびDPC・トータルテストステロン キット、Diagnostic Products Corporation）を用いて測定した。
メタスチン投与によるラット血漿FSH濃度の変動を測定した結果を、図６に示す。メタスチン投与後1時間から、血漿FSH濃度は有意に上昇を始め、2時間後で最も高く、4時間後でも高い状態を維持していた。
メタスチン投与によるラット血漿LH濃度の変動を測定した結果を、図７に示す。FSHの場合と同様に、メタスチン投与後1時間から、血漿LH濃度は有意に上昇を始め、2時間後で最も高くなっていた。4時間後では血漿LH濃度の低下が認められたが、投与前に比べると、高い状態を維持していた。
メタスチン投与によるラット血漿テストステロン濃度の変動を測定した結果を、図８に示す。血漿テストステロン濃度はメタスチン投与後1時間に急激な上昇を示し、2時間後、4時間後では低下が認められたが、投与前に比べるといずれの時点でも有意に高い値を示した。
図６および図７の結果より、メタスチンを末梢投与すると、雄性ラットにおいてFSH、LHなどのゴナドトロピンの放出が誘導されることがわかる。実施例１の結果を考慮すると、メタスチンはゴナドトロピンの放出を促す上で、雌雄いずれにおいても非常に重要な因子であると考えられる。
図８の結果は、メタスチンの投与によるゴナドトロピンの放出が、精巣にも生理的な刺激を与え、テストステロンの産生を亢進することを意味している。
これらの結果から、メタスチンの投与は、ゴナドトロピンの放出を介して精巣を刺激すると考えられる。メタスチンは、精子の成熟やホルモンの分泌など、男性生殖機能にも影響を及ぼしうることが示唆された。 Example 3
Release of gonadotropin in adult male rats by human metastin From 10:30 am to 11:30 am in male Wistar rats aged 11 weeks old at a concentration of 175 nmol / mL in physiological saline Dissolved human metastin was administered subcutaneously in the back at 200 μL per individual, ie, human metastin 35 nmol. Before administration of metastin and 1, 2, and 4 hours after administration, it was decapitated and blood was collected. At the time of blood collection, in order to prevent blood coagulation, 300 μL of 10 KIU / mL aprotinin solution (Tradilol, Bayer) containing 3 mg / mL EDTA was placed in advance in the collected centrifuge tube. After collection, the mixture was mixed well and centrifuged at 2,000 G for 25 minutes, and the supernatant was collected to obtain a plasma sample. Plasma concentrations of FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH (Luteinizing Hormone), and Testosterone are determined by the radioimmunoassay (Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH) [ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, Rat Luteinizing Hormone (rLH ) [ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, all measured using Amersham Biosciences, DPC Total Testosterone Kit, Diagnostic Products Corporation).
FIG. 6 shows the result of measuring the fluctuation of rat plasma FSH concentration by administration of metastin. From 1 hour after metastin administration, plasma FSH concentration began to increase significantly, being highest after 2 hours and remained high even after 4 hours.
FIG. 7 shows the results of measuring changes in rat plasma LH concentration due to administration of metastin. As in the case of FSH, the plasma LH concentration began to rise significantly from 1 hour after metastin administration, and was highest after 2 hours. After 4 hours, a decrease in plasma LH concentration was observed, but it remained high compared to before administration.
FIG. 8 shows the result of measuring the change in rat plasma testosterone concentration due to administration of metastin. Plasma testosterone concentration showed a rapid increase 1 hour after metastin administration, and decreased after 2 hours and 4 hours, but was significantly higher at any time point than before administration.
From the results of FIGS. 6 and 7, it can be seen that peripheral administration of metastin induces the release of gonadotropins such as FSH and LH in male rats. Considering the results of Example 1, metastin is considered to be a very important factor in both sexes in promoting the release of gonadotropin.
The result of FIG. 8 means that the release of gonadotropin by administration of metastin gives physiological stimulation to the testis and enhances the production of testosterone.
From these results, administration of metastin appears to stimulate the testis through the release of gonadotropins. It was suggested that metastin may affect male reproductive functions, such as sperm maturation and hormone secretion.

実施例４
ヒトメタスチンペプチドを用いた成熟雄性ラットでのテストステロンダウンレギュレーション作用
生後8週齢の雄性Copenhagenラット（米国チャールズリバー）に対し、ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール、大日本製薬）を体重1 kgあたり50 mgとなるように腹腔内投与し、麻酔を施した後、3 mMの濃度で蒸留水に溶解したヒトメタスチン（メタスチン投与群）または蒸留水を封入したALZET浸透圧ポンプ（Model 2001、容量 200 μL、速度 1.0 μL/hr）2個（蒸留水投与群）を、背部皮下に移植した（各群5匹）。これにより、メタスチン投与群では 6.0 nmol/hrの速度でヒトメタスチンが持続的に投与される。ペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与には、容量1 mLのツベルクリン用注射筒および26ゲージ注射針（いずれもテルモ）を用いた。その後、ポンプの移植から7日後に体重を測定後、断頭し、血液を回収した。また、同時に精巣重量を測定した。血漿中のヒトメタスチン濃度は、エンザイムイムノアッセイ（EIA）により測定した（J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(2): 914-919 (2003)）。また、血漿中に含まれるFSH（卵胞刺激ホルモン）、LH（黄体刺激ホルモン）およびテストステロン濃度は、ラジオイムノアッセイ（Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH)[125I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、Rat Luteinizing Hormone (rLH)[ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation、いずれもアマシャムバイオサイエンス、およびDPC・トータルテストステロン キット、Diagnostic Products Corporation）を用いて測定した。
測定結果を図９〜図１２に示す。
ヒトメタスチン持続投与後の、ヒトメタスチン濃度の平均値は、およそ3.2 pmol/mLであった。
ヒトメタスチン持続投与後の、ラット血漿FSH濃度、LH濃度およびテストステロン濃度、を図９、図１０および図１１にそれぞれ示す。FSHおよびテストステロンは、ヒトメタスチンの持続投与により有意に低下していることが分かる。LHに関しては有意な変動を認めることができなかった。
ヒトメタスチン持続投与後の、ラット精巣重量（体重に占める割合、％）を図１２に示す。ヒトメタスチン持続投与により、精巣重量が有意に低下していることが分かる。
以上の結果より、ヒトメタスチンを持続投与することにより、ゴナドトロピンの放出および精巣におけるテストステロンの産生が低下することがわかった。また、一般にテストステロン産生刺激が低下すると精巣重量は低下するが、今回のヒトメタスチン持続投与による精巣重量の低下は、テストステロン産生刺激が低下したことを反映していると考えられる。 Example 4
Testosterone down-regulation in adult male rats using human metastin peptide Pentobarbital sodium (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical) is 50 mg / kg body weight in male 8 week old male Copenhagen rats (US Charles River) After intraperitoneal administration and anesthesia, human metastin (metastin administration group) dissolved in distilled water at a concentration of 3 mM or ALZET osmotic pump encapsulating distilled water (Model 2001, volume 200 μL, rate 1.0) (μL / hr) 2 (distilled water administration group) were transplanted subcutaneously in the back (5 animals in each group). As a result, human metastin is continuously administered at a rate of 6.0 nmol / hr in the metastin administration group. For intraperitoneal administration of pentobarbital sodium, a 1 mL tuberculin syringe and a 26 gauge needle (both Terumo) were used. Thereafter, the body weight was measured 7 days after the transplantation of the pump, and then decapitated to collect blood. At the same time, the testis weight was measured. Human metastin concentration in plasma was measured by enzyme immunoassay (EIA) (J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (2): 914-919 (2003)). Plasma FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH (Luteinizing Hormone), and Testosterone Concentrations are also measured using a radioimmunoassay (Rat Follicle Stimulating Hormone (rFSH) [ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, Rat Luteinizing Hormone ( rLH) [ 125 I] Biotrack Assay System with Magnetic Separation, both of which were measured using Amersham Bioscience, DPC Total Testosterone Kit, and Diagnostic Products Corporation).
The measurement results are shown in FIGS.
The average value of human metastin concentration after continuous administration of human metastin was approximately 3.2 pmol / mL.
The rat plasma FSH concentration, LH concentration and testosterone concentration after continuous administration of human metastin are shown in FIG. 9, FIG. 10 and FIG. 11, respectively. It can be seen that FSH and testosterone are significantly reduced by continuous administration of human metastin. There was no significant change in LH.
FIG. 12 shows rat testis weight (ratio to body weight,%) after continuous administration of human metastin. It can be seen that testicular weight is significantly reduced by continuous administration of human metastin.
From the above results, it was found that continuous administration of human metastin decreases the release of gonadotropin and the production of testosterone in the testis. In general, when testosterone production stimulation decreases, testis weight decreases, but this decrease in testicular weight due to continuous administration of human metastin is considered to reflect a decrease in testosterone production stimulation.

製剤例１
（1）ヒトメタスチン 5.0mg
（2）食塩 20.0mg
（3）蒸留水 全量2mlとする
ヒトメタスチン5.0mgおよび食塩20.0mgを蒸留水に溶解させ、水を加えて全量2.0mlとする。溶液をろ過し、無菌条件下に2mlのアンプルに充填する。アンプルを滅菌した後、密封し注射用溶液を得る。 Formulation Example 1
(1) Human metastin 5.0mg
(2) Salt 20.0mg
(3) Distilled water Make a total volume of 2 ml. Dissolve 5.0 mg of human metastin and 20.0 mg of sodium chloride in distilled water, and add water to make a total volume of 2.0 ml. The solution is filtered and filled into 2 ml ampoules under aseptic conditions. The ampoule is sterilized and then sealed to obtain an injection solution.

ラットの血漿中に含まれるエストラジオールの濃度を表す図である。図中、縦軸はエストラジオールの濃度を、横軸は薬剤投与群のグループをそれぞれ示す。It is a figure showing the density | concentration of the estradiol contained in the plasma of a rat. In the figure, the vertical axis indicates the concentration of estradiol, and the horizontal axis indicates the group of the drug administration group. ラットの血漿中に含まれるプロゲステロンの濃度を表す図である。図中、縦軸はプロゲステロンの濃度を、横軸は薬剤投与群のグループをそれぞれ示す。It is a figure showing the density | concentration of the progesterone contained in rat plasma. In the figure, the vertical axis represents the concentration of progesterone, and the horizontal axis represents the group of the drug administration group. メタスチン投与による未成熟ラット血漿FSH濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the immature rat plasma FSH density | concentration by metastin administration. メタスチン投与による未成熟ラット血漿LH濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the immature rat plasma LH density | concentration by metastin administration. メタスチン投与による未成熟ラット血漿プロゲステロン濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the immature rat plasma progesterone density | concentration by metastin administration. メタスチン投与によるラット血漿FSH濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the rat plasma FSH density | concentration by metastin administration. メタスチン投与によるラット血漿LH濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the rat plasma LH density | concentration by metastin administration. メタスチン投与によるラット血漿テストステロン濃度の変動を表す図である。It is a figure showing the fluctuation | variation of the rat plasma testosterone density | concentration by metastin administration. ヒトメタスチン持続投与後のラット血漿FSH濃度を示した図である。It is the figure which showed the rat plasma FSH density | concentration after a human metastin continuous administration. ヒトメタスチン持続投与後のラット血漿LH濃度を示した図である。It is the figure which showed the rat plasma LH density | concentration after human metastin continuous administration. ヒトメタスチン持続投与後のラット血漿テストステロン濃度を示した図である。It is the figure which showed the rat plasma testosterone density | concentration after human metastin continuous administration. ヒトメタスチン持続投与後のラット精巣重量（体重に占める割合、％）を示した図である。It is the figure which showed the rat testis weight (ratio to body weight,%) after continuous administration of human metastin.

Claims (31)

配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を含有してなる性腺機能改善剤。 A gonadal function improving agent comprising a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof. 配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる請求項１記載の性腺機能改善剤。 The gonadal function improving agent according to claim 1, comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列である請求項１記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, wherein the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる性腺機能改善剤。 A gonad function improving agent comprising a polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤。 A gonadal function improving agent comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof. 配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤。 A gonadal function improving agent comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, or a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩を含有してなる性腺機能改善剤。 A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a partial peptide thereof, or a compound that promotes activation to a salt thereof, or a salt thereof. 不妊症の予防・治療剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a prophylactic / therapeutic agent for infertility. 排卵誘発または促進剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is an ovulation inducing or promoting agent. 性腺刺激ホルモン分泌促進剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a gonadotropin secretion promoter. 性腺刺激ホルモン分泌抑制剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a gonadotropin secretion inhibitor. 性ホルモン分泌促進剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a sex hormone secretion promoter. 性ホルモン分泌抑制剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1 which is a sex hormone secretion inhibitor. ホルモン感受性癌の予防・治療剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a prophylactic / therapeutic agent for hormone sensitive cancer. 子宮内膜症の予防・治療剤である請求項１〜７記載の性腺機能改善剤。 The gonad function improving agent according to claim 1, which is a prophylactic / therapeutic agent for endometriosis. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる不妊症の診断薬。 A polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A diagnostic agent for infertility comprising a polynucleotide encoding a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対する抗体、または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる不妊症の診断薬。 An antibody against a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 A diagnostic agent for infertility comprising an antibody against a protein containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング方法。 A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. A screening method for a gonad function improving agent, which comprises using a protein containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 性腺機能改善剤が、性ホルモン分泌抑制剤または性ホルモン分泌促進剤である請求項１８記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 18, wherein the gonad function improving agent is a sex hormone secretion inhibitor or a sex hormone secretion promoter. 性腺機能改善剤が、性腺刺激ホルモン分泌抑制剤または性腺刺激ホルモン分泌促進剤である請求項１８記載のスクリーニング方法。 19. The screening method according to claim 18, wherein the gonad function improving agent is a gonadotropin secretion inhibitor or a gonadotropin secretion promoter. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング用キット。 A polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. A kit for screening a gonad function improving agent, comprising a protein containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング方法。 A polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or A screening method for a gonad function improving agent, characterized by using a polynucleotide encoding a protein containing a substantially identical amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および／または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする性腺機能改善剤のスクリーニング用キット。 A polynucleotide encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and / or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or A kit for screening a gonad function improving agent, comprising a polynucleotide encoding a protein containing substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする、性腺機能改善法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for improving gonadal function, comprising administering an amount. （i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を促進する、（ii）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する、または（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進することを特徴とする、性腺機能改善法。 (I) Promoting the activity of a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, (ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or (iii) promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof; or (iii) applying the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof. A method for improving gonadal function, characterized by promoting activation. 性腺機能改善剤を製造するための（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の使用。 (I) a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof for producing a gonad function improving agent, (ii) the above polypeptide or a salt thereof (Iii) a compound or salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Or a salt thereof, or (v) a compound that promotes the activation of the polypeptide or a salt thereof to the protein or a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof Use of salt. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌抑制法および／または性ホルモン分泌抑制法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for suppressing gonadotropin secretion and / or a sex hormone, characterized in that the amount is continuously or continuously administered泌抑 system method. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、ホルモン感受性癌または子宮内膜症の予防・治療法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for the prophylaxis or treatment of hormone-sensitive cancer or endometriosis, characterized by administering the dose continuously or continuously. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を持続投与または連続投与することを特徴とする、卵胞成熟阻害法および／または性周期停止法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for inhibiting follicular maturation and / or a method for arresting the sexual cycle, characterized in that the amount is administered continuously or continuously. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を単回投与することを特徴とする、性腺刺激ホルモン分泌促進法および／または性ホルモン分泌促進法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for promoting gonadotropin secretion and / or a method for promoting sex hormone secretion, characterized by administering a single dose. 哺乳動物に対して、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、（ii）上記ポリペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、（iii）上記ポリペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、（iv）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、または（v）上記ポリペプチドまたはその塩の、上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩への活性化を促進する化合物またはその塩の有効量を単回投与することを特徴とする、排卵誘発または促進法。 For mammals, (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, (ii) encoding the above polypeptide or a salt thereof A polynucleotide, (iii) a compound or a salt thereof that promotes the activity of the above polypeptide or a salt thereof, and (iv) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or Compound or salt thereof that promotes activity of partial peptide or salt thereof, or (v) Effectiveness of compound or salt thereof that promotes activation of polypeptide or salt thereof to protein or partial peptide or salt thereof A method for inducing or promoting ovulation, characterized in that a single dose is administered.
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