JP2005091353A - Sample-measuring apparatus and sample-measuring method - Google Patents
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Description
本発明は、測定物質に力を付与し、測定物質から発する光を分光して、測定物質を測定する装置及び方法に関するものである。
The present invention relates to an apparatus and a method for measuring a measurement substance by applying a force to the measurement substance and spectroscopically analyzing light emitted from the measurement substance.
試料を原子又は分子オーダーの分解能で画像化する装置として一連の走査型プローブ顕微鏡が知られている。その中で試料と測定プローブの間に働く原子間力によって測定プローブの支持台が撓むことを利用して、試料の形状測定などを様々な測定環境、測定試料を対象に行うことができる原子間力顕微鏡がビニッヒ(Binnig)等によって提案されている。この原子間力顕微鏡は、例えば下記の特許文献１に開示されている。この装置を用いて測定プローブである探針と試料表面との間の垂直方向の距離を変化させて、試料と探針の間の距離に対する探針に働く力を計測する測定をフォースカーブ測定という。この測定によって、試料表面の弾性や電磁気的特性、付着力のような試料の詳細な物性情報を計測することができる。 A series of scanning probe microscopes is known as an apparatus for imaging a sample with atomic or molecular resolution. Atoms that can be used to measure the shape of a sample in various measurement environments and measurement samples by utilizing the bending of the support of the measurement probe due to the atomic force acting between the sample and the measurement probe. An atomic force microscope has been proposed by Binnig et al. This atomic force microscope is disclosed, for example, in Patent Document 1 below. Measurement using this device to measure the force acting on the probe with respect to the distance between the sample and the probe by changing the vertical distance between the probe as the measurement probe and the sample surface is called force curve measurement. . By this measurement, it is possible to measure detailed physical property information of the sample such as elasticity, electromagnetic characteristics, and adhesive force of the sample surface.
このような原子間力顕微鏡のうち試料のその他の情報も測定する試みが報告されている。まず原子間力顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせた測定装置としては，蛍光性試料を選択的に測定するためにプローブと蛍光試料の位置合わせを行う機能を有する装置が例えば非特許文献１に提案されている。またこれに関連した技術として例えば特許文献２に公開されている。
原子間力顕微鏡により計測した形状像とそれに対応した光学像を近接場光を利用して高分解能で同時に計測する装置が、例えば非特許文献２に提案されており、また例えば特許文献３に開示されている。
Attempts have also been made to measure other information of samples among such atomic force microscopes. First, as a measuring device combining an atomic force microscope and an optical microscope, for example, Non-Patent Document 1 proposes an apparatus having a function of aligning a probe and a fluorescent sample in order to selectively measure a fluorescent sample. Yes. Further, for example, Patent Document 2 discloses a technique related to this.
An apparatus for simultaneously measuring a shape image measured by an atomic force microscope and an optical image corresponding to the shape image with high resolution using near-field light has been proposed in Non-Patent Document 2, for example, and disclosed in Patent Document 3, for example. Has been.
従来の原子間力顕微鏡によるフォースカーブ測定では、探針が計測した力とプローブが試料表面に対して動作した距離の情報は取得することができるが、その影響を反映した例えば分子の電子状態変化など試料の状態変化を検出することはできなかった。また、そのために試料の力学的物性と光学情報を同時に測定する装置として利用されている従来の走査型光近接場原子間力顕微鏡では、高分解能の試料表面の形状と光学情報の画像測定には適しているが、光ファイバを原子間力顕微鏡のカンチレバーとして使用する必要があるため、フォースカーブ測定のような微小な力の影響を反映した試料の状態変化を検出することは難しかった。 In a force curve measurement using a conventional atomic force microscope, information on the force measured by the probe and the distance that the probe has moved relative to the sample surface can be acquired, but the change in the electronic state of the molecule, for example, reflects the effect. The change in the state of the sample could not be detected. For this reason, the conventional scanning optical near-field atomic force microscope, which is used as a device for simultaneously measuring the mechanical properties and optical information of a sample, is used for measuring the shape of the sample surface and optical information images with high resolution. Although suitable, since it is necessary to use an optical fiber as a cantilever of an atomic force microscope, it is difficult to detect a change in the state of a sample reflecting the influence of a minute force such as force curve measurement.
また従来の光学顕微鏡と原子間力顕微鏡を組み合わせた測定装置として提案されているものは、光学試料への大まかな原子間力顕微鏡のプローブ調整を行うためのものであり、局所的な原子間力顕微鏡の接触領域の位置合わせを行うことはできず、またプローブの影響による局所スペクトル測定を行うことを目的とした測定装置ではなかった。 In addition, what has been proposed as a measurement device that combines a conventional optical microscope and an atomic force microscope is used to roughly adjust the probe of an atomic force microscope to an optical sample. The position of the contact area of the microscope could not be adjusted, and the measuring apparatus was not intended to perform local spectrum measurement due to the influence of the probe.
本発明は、このような事情をふまえてなされたものであり、原子間力顕微鏡のプローブなどの力付与部材を試料に接触させた際の試料の状態変化を検出するものである。 The present invention has been made in view of such circumstances, and detects changes in the state of a sample when a force applying member such as an atomic force microscope probe is brought into contact with the sample.
本発明は、また、特に原子間力顕微鏡などの力付与装置のフォースカーブ測定に試料の状態変化の情報を付加するものである。
The present invention also adds information on the state change of a sample to force curve measurement of a force applying device such as an atomic force microscope.
＜１＞本発明は、試料の所定位置に力を付与する力付与装置と、力が付与された位置付近に光を照射する第１光源と、力が付与された位置から発する光を分光する分光器と、分光された光を撮像する第１撮像装置とを備える試料測定装置にある。
＜２＞本発明は、また、試料に力付与部材により力を付与し、力が付与された位置付近に光を照射し、力が付与された位置から発する光を分光する、試料測定方法にある。
<1> The present invention splits light emitted from a position where a force is applied, a first light source that irradiates light near the position where the force is applied, and a force applying device that applies a force to a predetermined position of the sample. The sample measuring device includes a spectroscope and a first imaging device that images the dispersed light.
<2> The present invention also provides a sample measurement method in which a force is applied to a sample by a force applying member, light is irradiated near the position where the force is applied, and light emitted from the position where the force is applied is dispersed. is there.
＜１＞本発明は、原子間力顕微鏡のプローブなどの力付与部材を試料に接触させた際の試料の状態変化を検出することができる。
＜２＞本発明は、また、原子間力顕微鏡などの力付与装置のフォースカーブ測定に試料の状態変化の情報を付加することができる。
<1> The present invention can detect a change in the state of a sample when a force applying member such as a probe of an atomic force microscope is brought into contact with the sample.
<2> The present invention can also add information on the state change of a sample to force curve measurement of a force applying device such as an atomic force microscope.
＜１＞試料測定装置
試料測定装置は、試料に力を付与し、その試料から、蛍光スペクトルやラマンスペクトルなどの光学スペクトルを求めるものであり、少なくとも、試料に力を付与する力付与装置と、力が付与された個所付近の物質に光を照射する第１光源と、光が照射された物質から発する光を分光する分光器を備えている。分光器により光学スペクトルが求められる。
<1> Sample measuring device A sample measuring device is for applying force to a sample and obtaining an optical spectrum such as a fluorescence spectrum or a Raman spectrum from the sample, and at least a force applying device for applying force to the sample; A first light source that irradiates light to a substance in the vicinity of a site to which force is applied and a spectroscope that splits light emitted from the substance irradiated with light. An optical spectrum is obtained by a spectroscope.
試料測定装置は、例えば図１に示すように、試料を配置する試料台５と、試料台５の上部に配置した原子間力顕微鏡と、下部に配置した倒立型共焦点光学顕微鏡とで形成することができる。倒立型共焦点光学顕微鏡は、光学スペクトルを求めるために第１光学系を有する。更に、測定位置の位置合わせのために、必要に応じて、第２光学系を配置する。 For example, as shown in FIG. 1, the sample measuring apparatus is formed by a sample stage 5 on which a sample is arranged, an atomic force microscope arranged on the upper part of the sample stage 5, and an inverted confocal optical microscope arranged on the lower side. be able to. The inverted confocal optical microscope has a first optical system for obtaining an optical spectrum. Furthermore, a second optical system is disposed as necessary for alignment of the measurement position.
試料測定装置は、力付与装置を制御する制御装置１７、アナログ-デジタル変換装置１８、試料測定装置を制御する全体制御装置２０、第１光源の光を全体制御装置２０の制御の基に遮断制御する第１光源自動遮断装置を備えている。全体制御装置２０は、フォーカスカーブの測定と同時に光学スペクトルの測定を行うように制御できる。それにより、全体制御装置２０は、光学スペクトルをフォーカスカーブ中に対応付けることを可能とする。 The sample measuring device includes a control device 17 that controls the force applying device, an analog-digital conversion device 18, an overall control device 20 that controls the sample measuring device, and a light blocking control based on the control of the overall control device 20. A first light source automatic shut-off device is provided. The overall control device 20 can be controlled so as to measure the optical spectrum simultaneously with the measurement of the focus curve. Thereby, the overall control device 20 can associate the optical spectrum with the focus curve.
試料測定装置は、具体的には、測定物質間に働く原子間力を利用して、計測物質の形状観察や物質間の相互作用などの測定を行う原子間力顕微鏡と光学顕微鏡を一体化させた光学原子間力顕微鏡である。試料測定装置は、励起光を照射し試料、もしくはプローブなどの力付与部材１から発生した蛍光、散乱光などをピンホール８を用いて局所的に検出し、分光器１０を通して第１撮像装置１１を使い光学スペクトル測定を行うことができる。それにより、原子間力顕微鏡のフォースカーブ測定と同期させて接触領域近傍の局所光学スペクトル測定を行うことができる。
Specifically, the sample measurement device integrates an atomic force microscope and an optical microscope that use the atomic force acting between the measurement materials to measure the shape of the measurement material and measure the interaction between the materials. An optical atomic force microscope. The sample measurement device irradiates excitation light and locally detects fluorescence or scattered light generated from the sample or the force applying member 1 such as a probe using the pinhole 8 and passes through the spectroscope 10 to the first imaging device 11. Can be used to measure the optical spectrum. Thereby, the local optical spectrum measurement in the vicinity of the contact region can be performed in synchronization with the force curve measurement of the atomic force microscope.
＜２＞力付与装置
力付与装置１９は、試料に押圧力、引張力などの力を付与するものであり、例えば、原子間力顕微鏡のプローブなどの構成部材を利用できる。力付与装置１９は、試料に直接力を付与する探針、プローブ、ビーズなどの力付与部材１を有する。特に、先端の鋭い探針を用いると、ナノスケールの測定が可能となる。また、力付与装置１９は、必要に応じて、試料に付与する押圧力、引張力などの力の大きさを求めることができる。力の大きさは、例えば原子間力顕微鏡のプローブを支持しているカンチレバーの撓みにより算出することができる。カンチレバーの撓みは、例えばレーザー２と分割光電変換素子３で求めることができる。また、力付与装置１９は、必要に応じて、試料表面に対する力付与部材１の微小距離変化を求めることができる。力付与部材１の水平方向や垂直方向の微小変位は、微動素子４により行うことができる。力付与装置１９の制御は、原子間力顕微鏡の制御装置、即ち力付与装置制御装置１７で行うことができる。力付与部材１は、少なくとも表面の一部を金属で形成することができる。金属は、金、銀、白金、銅などが使用される。特に、金属からなる探針又は探針の少なくとも一部が金属で被覆された、金属探針を利用すると、表面増強ラマンなどの近接場光を有効に利用することができる。
<2> Force Applying Device The force applying device 19 applies a force such as a pressing force and a tensile force to the sample, and for example, a structural member such as a probe of an atomic force microscope can be used. The force applying device 19 includes a force applying member 1 such as a probe, a probe, or a bead that directly applies a force to a sample. In particular, when a probe having a sharp tip is used, nanoscale measurement is possible. In addition, the force applying device 19 can determine the magnitude of force such as pressing force and tensile force applied to the sample as necessary. The magnitude of the force can be calculated, for example, by the deflection of the cantilever that supports the probe of the atomic force microscope. The bending of the cantilever can be obtained by, for example, the laser 2 and the divided photoelectric conversion element 3. In addition, the force applying device 19 can obtain a minute distance change of the force applying member 1 with respect to the sample surface as necessary. The fine displacement of the force applying member 1 in the horizontal direction and the vertical direction can be performed by the fine movement element 4. The force applying device 19 can be controlled by an atomic force microscope control device, that is, the force applying device control device 17. The force imparting member 1 can be formed of at least a part of the surface with metal. Gold, silver, platinum, copper or the like is used as the metal. In particular, when a metal probe or a metal probe in which at least a part of the probe is coated with metal is used, near-field light such as surface-enhanced Raman can be used effectively.
＜３＞第１光源
第１光源７は、試料に力が付与された個所付近の試料の物質に光を照射するものである。第１光源７の光は、試料の物質に関係するラマンスペクトルや蛍光スペクトルなどの光学スペクトルを生じさせることができる。第１光源から発する光は、第１光学系を通り、試料の所定位置に照射される。照射の結果生じた、力付与部材１９の接触領域から発した光は、第１光学系を通り、分光器１０で分光され、ＣＣＤカメラなどの第１撮像装置１１で光学スペクトルとして撮影され、全体制御装置２０の表示装置で表示することができる。
<3> First Light Source The first light source 7 irradiates light to the material of the sample in the vicinity of the location where force is applied to the sample. The light of the first light source 7 can generate an optical spectrum such as a Raman spectrum or a fluorescence spectrum related to the sample substance. The light emitted from the first light source passes through the first optical system and is irradiated to a predetermined position of the sample. The light emitted from the contact area of the force applying member 19 generated as a result of the irradiation passes through the first optical system, is dispersed by the spectroscope 10, and is photographed as an optical spectrum by the first imaging device 11 such as a CCD camera. It can be displayed on the display device of the control device 20.
第１光学系は、倒立型共焦点光学顕微鏡を利用でき、第１光源７から発した光線は、全体制御装置２０の制御の基に遮断制御する第１光源自動遮断装置を通り、ミラーで反射し、ダイクロイックミラー９で反射し、遮光板のピンホール８を通り、ミラーで反射し、対物レンズ６を通して試料に照射される。力付与部材１９の接触領域から発した光は、第１光学系を戻り、対物レンズ６を通り、第２光学系の一部を通り、ミラーで反射し、遮光板のピンホール８、ダイクロイックミラー９（試料からくる励起光など、試料の光学スペクトルに関係しない光を取り除くミラー）を通り、分光器１０に到達する。分光器１０で分光された光学スペクトルは、第１撮像装置１１で電子データとして取り込まれる。力付与装置１９と第１撮像装置１１は、共に力付与装置制御装置１７で制御され、更に、全体制御装置２０で全体に管理される。
The first optical system can use an inverted confocal optical microscope, and the light emitted from the first light source 7 passes through the first light source automatic shut-off device that controls shut-off based on the control of the overall control device 20, and is reflected by the mirror. Then, the light is reflected by the dichroic mirror 9, passes through the pinhole 8 of the light shielding plate, is reflected by the mirror, and is irradiated onto the sample through the objective lens 6. The light emitted from the contact area of the force applying member 19 returns to the first optical system, passes through the objective lens 6, passes through a part of the second optical system, is reflected by the mirror, and the pinhole 8 of the light shielding plate, dichroic mirror 9 (mirror that removes light not related to the optical spectrum of the sample, such as excitation light coming from the sample), and reaches the spectroscope 10. The optical spectrum split by the spectroscope 10 is captured as electronic data by the first imaging device 11. Both the force applying device 19 and the first imaging device 11 are controlled by the force applying device control device 17 and further managed by the overall control device 20.
＜４＞第２光源
第２光源１２は、試料の位置を確認するものであり、第２光源の光は、第２光学系を通り、試料に照射され、試料から散乱光として反射され、第２撮像装置１６で試料の散乱像として撮像され、散乱画像は、表示装置で表示される。第２光源から発する光は、第２光学系を通り、まず、アイリス１３で正八角形などのパターンが形成され、可動ミラー１４で反射し、可動ミラー１５を通り、対物レンズ６を通り、試料の所定位置にパターンを照射する。試料から反射したパターンは、対物レンズ６を通り、第２光学系を戻り、可動ミラー１５で反射して、ＣＣＤカメラなどの第２撮像装置１６に入力される。第１光学系と第２光学系は、対物レンズ６を含む共通光軸の個所で光軸が一致している。
<4> Second Light Source The second light source 12 is for confirming the position of the sample. The light from the second light source passes through the second optical system, is irradiated on the sample, is reflected from the sample as scattered light, 2 is captured as a scattered image of the sample by the imaging device 16, and the scattered image is displayed on the display device. The light emitted from the second light source passes through the second optical system. First, a pattern such as a regular octagon is formed by the iris 13, is reflected by the movable mirror 14, passes through the movable mirror 15, passes through the objective lens 6, and the sample. A pattern is irradiated to a predetermined position. The pattern reflected from the sample passes through the objective lens 6, returns from the second optical system, is reflected by the movable mirror 15, and is input to the second imaging device 16 such as a CCD camera. The optical axes of the first optical system and the second optical system coincide with each other at the common optical axis including the objective lens 6.
＜５＞試料測定装置の設定例
試料は、例えば結晶を作るような高濃度の蛍光色素溶液を有機溶媒に溶かし、カバーガラス基板表面に垂らし、溶媒を飛ばして形成する。試料が形成されているカバーガラス基板は、試料台５上に配置される。次に、第１光学系からピンホール８と分光器１０を取り除いて、第１光源７の光を試料の下方から照射する。照射の結果、試料の結晶表面から蛍光が発生する。第１光学系を戻ってきた蛍光は、第１撮像装置で撮影され、試料表面の形状が表示装置に映し出される。この撮影画像は、結晶面の形状と対応しており、試料の表面形状を知ることができる。次に、ピンホール８を所定の配置にすると、ピンホール８を通った光スポット、即ち試料の特定位置の光点が第１撮像装置で撮影され、表示装置に表示される。これにより、試料表面の画像とその中のピンホールの光点の位置を知ることができる。
<5> Setting Example of Sample Measuring Device A sample is formed by dissolving a high-concentration fluorescent dye solution that forms crystals, for example, in an organic solvent, hanging the solution on the surface of the cover glass substrate, and removing the solvent. The cover glass substrate on which the sample is formed is placed on the sample stage 5. Next, the pinhole 8 and the spectroscope 10 are removed from the first optical system, and the light from the first light source 7 is irradiated from below the sample. As a result of the irradiation, fluorescence is generated from the crystal surface of the sample. The fluorescence returning from the first optical system is photographed by the first imaging device, and the shape of the sample surface is displayed on the display device. This photographed image corresponds to the shape of the crystal plane, and the surface shape of the sample can be known. Next, when the pinhole 8 is placed in a predetermined arrangement, a light spot passing through the pinhole 8, that is, a light spot at a specific position of the sample is photographed by the first imaging device and displayed on the display device. Thereby, the image of the sample surface and the position of the light spot of the pinhole in it can be known.
また、第２光学系において、第２光源１２の光は、アイリス１３を通過し、八角形のアイリスパターンが作成される。アイリスパターンは、第２光学系を通して、下方から試料へ照射される。照射されたアイリスパターンは、試料面の散乱光として第２光学系を戻り、第２撮像装置１６で撮像され、表示装置に表示される。その表示画像が図２である。図２には、アイリスパターン（八角形）と共に、力付与部材１が試料に当接している位置（１の矢印の位置）、及び、力付与部材１のビーズの形状（２の矢印の位置）が表示されている。第２光学系を利用して同じ試料の散乱画像を取得し、蛍光画像に対する位置との対応から散乱画像中のピンホール検出部位を知ることができる。力付与部材１の試料への当接は、力付与装置制御装置１７が分割光電変換素子３の信号を受信し、微動素子４を制御して行う。 In the second optical system, the light from the second light source 12 passes through the iris 13 to create an octagonal iris pattern. The iris pattern is irradiated onto the sample from below through the second optical system. The irradiated iris pattern returns to the second optical system as scattered light on the sample surface, is imaged by the second imaging device 16, and is displayed on the display device. The display image is shown in FIG. In FIG. 2, together with the iris pattern (octagon), the position where the force applying member 1 is in contact with the sample (position of the arrow 1) and the shape of the beads of the force applying member 1 (position of the arrow 2) Is displayed. A scattered image of the same sample is acquired using the second optical system, and the pinhole detection site in the scattered image can be known from the correspondence with the position with respect to the fluorescence image. The force applying member 1 is brought into contact with the sample by the force applying device controller 17 receiving a signal from the divided photoelectric conversion element 3 and controlling the fine movement element 4.
対物レンズ６と試料の焦点合わせは、試料台５又は対物レンズ６を垂直方向に相対的に移動し、アイリスパターンの鮮明状態で決定する。対物レンズ６の焦点が合えば、第１光学系と第２光学系、共に焦点が合ったことになる。試料台５を水平方向に移動しても、第１光源と第２光源の光軸が一致しているので、ピンホールによる光点と第２光源のパターンとの相対位置は変わらず、試料における光点の照射位置を容易に知ることができる。
The focusing of the objective lens 6 and the sample is determined by moving the sample table 5 or the objective lens 6 relatively in the vertical direction, and in a clear state of the iris pattern. If the objective lens 6 is in focus, the first optical system and the second optical system are both in focus. Even if the sample stage 5 is moved in the horizontal direction, since the optical axes of the first light source and the second light source coincide with each other, the relative position between the light spot by the pinhole and the pattern of the second light source does not change. The irradiation position of the light spot can be easily known.
＜１＞力付与部材の接触領域の蛍光スペクトルの取得
力付与部材１の接触領域の蛍光スペクトルを取得する場合、試料側、もしくは力付与部材１側に蛍光性物質を導入する。その際、力付与部材１の接触領域を例えばシリコンやポリスチレンのような市販されているビーズを力付与部材１の先端に導入して大きくするか、もしくは力付与部材１の試料接触部位にのみ蛍光物質を導入して測定する。試料のラマンスペクトルを測定する場合は、力付与部材１を金、銀といった金属で覆い、表面増強ラマン効果により接触領域のシグナルを増大する。
<1> Acquisition of fluorescence spectrum of contact region of force applying member When acquiring a fluorescence spectrum of the contact region of force applying member 1, a fluorescent substance is introduced on the sample side or the force applying member 1 side. At that time, the contact area of the force applying member 1 is enlarged by introducing a commercially available bead such as silicon or polystyrene into the tip of the force applying member 1 or only the sample contact portion of the force applying member 1 is fluorescent. Introduce substance and measure. When measuring the Raman spectrum of the sample, the force applying member 1 is covered with a metal such as gold or silver, and the signal in the contact region is increased by the surface-enhanced Raman effect.
図２は、半径５μｍのポリスチレンビーズを固定した原子間力顕微鏡プローブを第２光学系を利用して下方から第２光源１２の光を照射して測定した２次元散乱画像である。力付与部材１を基盤に接触させ、対物レンズ６の焦点はカバーガラス基板の試料表面に調整したところ、球状のビーズの一部（（２）の矢印の位置）が円形に見え、円の中心（（１）の矢印の位置）がビーズの接触領域である。 FIG. 2 is a two-dimensional scattering image measured by irradiating the light from the second light source 12 from below with an atomic force microscope probe to which polystyrene beads having a radius of 5 μm are fixed using the second optical system. When the force imparting member 1 is brought into contact with the substrate and the focal point of the objective lens 6 is adjusted to the surface of the sample of the cover glass substrate, a part of the spherical bead (position of the arrow in (2)) looks circular and the center of the circle (The position of the arrow in (1)) is the contact area of the beads.
図３は、図２に示した位置で取得した蛍光スペクトルである。カバーガラス基板表面をシランカップリング法を利用して-SH基が末端官能基となるように被膜し、そこに蛍光性色素であるテトラメチルローダミンを反応させた試料に、力付与部材１に固定されたポリスチレンビーズに同じく蛍光性色素であるフルオレセインを化学結合で固定し、両色素間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察した測定例である。 FIG. 3 is a fluorescence spectrum acquired at the position shown in FIG. The cover glass substrate surface is coated using a silane coupling method so that the —SH group becomes a terminal functional group, and fixed to the force imparting member 1 on a sample in which tetramethylrhodamine, which is a fluorescent dye, is reacted therewith. This is a measurement example in which fluorescein, which is also a fluorescent dye, is fixed to the polystyrene beads by chemical bonding, and fluorescence resonance energy transfer between both dyes is observed.
図２の円形の部分（１）は、カバーガラス基板表面と球状のビーズが接触している部分であり、図３の（１）の測定データに示すように、蛍光エネルギー移動の影響でアクセプタ色素の蛍光強度が増加していることがわかる。図２の円形の部分（２）は、ビーズの部分のドナー色素の蛍光強度のスペクトルを示す。図３の（２）の測定データに示すように、蛍光エネルギー移動が生じていない。図２の部分（３）は、アクセプタ色素の蛍光強度のスペクトルを示すように、図３の（３）の測定データに示すように、蛍光エネルギー移動が生じていない。このように、力付与部材１がカバーガラス基板表面に接触することにより、ドナー色素であるフルオレセインの蛍光強度が減少し、アクセプタ色素の蛍光強度が増加していることがわかる。
The circular part (1) in FIG. 2 is the part where the surface of the cover glass substrate and the spherical beads are in contact. As shown in the measurement data in FIG. 3 (1), the acceptor dye is affected by the fluorescence energy transfer. It can be seen that the fluorescence intensity increases. The circular part (2) in FIG. 2 shows the fluorescence intensity spectrum of the donor dye in the bead part. As shown in the measurement data of (2) in FIG. 3, no fluorescence energy transfer has occurred. As shown in the measurement data of FIG. 3 (3), the portion (3) of FIG. 2 shows no fluorescence energy transfer as shown in the fluorescence intensity spectrum of the acceptor dye. Thus, it turns out that the fluorescence intensity of the fluorescein which is a donor pigment | dye decreases, and the fluorescence intensity | strength of an acceptor pigment | dye increases when the force provision member 1 contacts the cover glass substrate surface.
＜２＞力付与部材と試料表面の接近状態の測定
図４は、力付与部材１表面にｐＨ感受性色素として知られるフルオレセインを化学結合させ、親水性表面、疎水性表面に接近させたときの変化を調べた結果を示す。図４（ａ）、（ｂ）は、親水性表面に接触する場合で、ガラス基板表面をシランカップリング法を利用して-NH２基が末端官能基となるように被膜して親水性とし、溶液中において、力付与部材１をガラス基板表面に接近させたときのデータである。図４（ａ）はフォースカーブを示しており、グラフの右側の白丸の位置は、力付与部材１の先端がガラス基板表面から約２００ｎｍ以内にあり、力が加えられていない状態を示している（横軸の数値は、ガラス基板表面からの距離でなく、単に力付与部材１の変化距離を示すものである。グラフが急に傾斜している個所がガラス基板表面との接触点である。）。グラフの左側の黒丸の位置は、力付与部材１の先端がガラス基板表面に接触している状態を示し、押圧力が約２２ｎＮである（図４（ａ））。図４（ｂ）には、白丸（力付与部材１がガラス基板面から離れている場合の破線グラフ）と黒丸（力付与部材１がガラス基板面に接触している場合の実線グラフ）の測定データがほぼ同一であることを示している。このことは、力付与部材１の先端が白丸の位置でも黒丸の位置でも、力付与部材１の先端の色素が発光する蛍光強度において変化がないことを示している。
<2> Measurement of force-applying member and sample surface approaching state FIG. 4 shows changes when the force-applying member 1 surface is chemically bonded with a fluorescein known as a pH-sensitive dye and brought close to a hydrophilic surface or a hydrophobic surface. The result of having investigated is shown. 4 (a) and 4 (b) show a case where the surface of the glass substrate is brought into contact with a hydrophilic surface, and the glass substrate surface is coated with the silane coupling method so that the —NH 2 group becomes a terminal functional group, thereby making the surface hydrophilic. This is data when the force applying member 1 is brought close to the surface of the glass substrate in the solution. FIG. 4A shows a force curve, and the position of the white circle on the right side of the graph indicates a state where the tip of the force applying member 1 is within about 200 nm from the surface of the glass substrate and no force is applied. (The numerical value on the horizontal axis does not indicate the distance from the glass substrate surface, but merely indicates the change distance of the force applying member 1. The point where the graph is steeply inclined is the contact point with the glass substrate surface. ). The position of the black circle on the left side of the graph indicates a state in which the tip of the force applying member 1 is in contact with the glass substrate surface, and the pressing force is about 22 nN (FIG. 4A). FIG. 4B shows measurement of white circles (broken line graph when the force applying member 1 is separated from the glass substrate surface) and black circles (solid line graph when the force applying member 1 is in contact with the glass substrate surface). It shows that the data is almost identical. This indicates that there is no change in the fluorescence intensity emitted by the dye at the tip of the force applying member 1 regardless of whether the tip of the force applying member 1 is a white circle or a black circle.
図４（ｃ）、（ｄ）は、疎水性表面に接近する場合で、ガラス基板表面をシランカップリング法を利用して−ＣＦ３基が末端官能基となるように被膜して疎水性とし、溶液中において、力付与部材１をガラス基板表面に接近させたときのデータである。図４（ｃ）はフォースカーブを示しており、グラフの右側の白丸の位置は、力付与部材１の先端がガラス基板表面から約２００ｎｍ以内にあることを示している。この白丸の位置では、力が付与されていないが、力付与部材１が一度ガラス基板表面に接してから離す場合、引張力が作用することを示している。グラフの左側の黒丸の位置は、力付与部材１の先端がガラス基板表面に接触していることを示している。この黒丸の位置では、押圧力が約１０ｎＮである。図４（ｄ）の破線データは、白丸（力付与部材１がガラス基板面から離れている状態）でのデータであり、実線データは、黒丸（力付与部材１がガラス基板面に接触している状態）のデータである。破線データは、主に５００ｎｍ〜５５０ｎｍの波長付近で蛍光強度が大きいが、実線データでは、消えている。このことは、力付与部材１の先端が疎水性表面に接近すると、蛍光が消光することを示しており、これは、疎水性表面ではバルクと違い溶媒分子が少なく、その結果安定な結合型を取り蛍光強度が減少したものと考えられる。
4 (c) and 4 (d) show a case where a hydrophobic surface is approached, and the surface of the glass substrate is coated with a silane coupling method so that the —CF 3 group becomes a terminal functional group to be hydrophobic. This is data when the force applying member 1 is brought close to the surface of the glass substrate in the solution. FIG. 4C shows a force curve, and the position of the white circle on the right side of the graph indicates that the tip of the force applying member 1 is within about 200 nm from the surface of the glass substrate. At the position of the white circle, no force is applied, but when the force applying member 1 is once brought into contact with the surface of the glass substrate and then released, a tensile force acts. The position of the black circle on the left side of the graph indicates that the tip of the force applying member 1 is in contact with the glass substrate surface. In this black circle position, the pressing force is about 10 nN. The broken line data in FIG. 4D is data in a white circle (a state where the force applying member 1 is separated from the glass substrate surface), and the solid line data is a black circle (the force applying member 1 is in contact with the glass substrate surface). Data). The broken line data has a high fluorescence intensity mainly in the vicinity of a wavelength of 500 nm to 550 nm, but disappears in the solid line data. This indicates that the fluorescence is quenched when the tip of the force imparting member 1 approaches the hydrophobic surface. This is because the hydrophobic surface has fewer solvent molecules than the bulk, and as a result, a stable binding type is obtained. The fluorescence intensity is considered to have decreased.
＜３＞力付与部材による生体高分子の分子操作
試料測定装置は、全体制御装置２０の制御の基に、力付与装置１のフォースカーブ測定と同期させて第１撮像装置１１で発光スペクトルを測定でき、その発光スペクトルを得られたフォースカーブに対応付けることが可能である。また、第１撮像装置１１が光学スペクトルを撮像する時間内にフォースカーブ測定中の力付与部材１が垂直方向に動作した範囲も対応付けることが可能である。そのため力付与装置１９の力付与部材１が施した力による試料の動的状態変化を詳細に検出することができる。なお、垂直方向に動作した範囲は、図６（ａ）、（ｃ）及び、図８（ｂ）に示されているように番号と対応する線分の範囲である。この番号は、１が１工程操作開始時の非圧縮の状態、２が圧縮の状態、３が伸張の状態、４が伸張後の非圧縮の状態を示している。
<3> Molecular manipulation of biopolymer by force applying member The sample measuring device measures the emission spectrum by the first imaging device 11 in synchronization with the force curve measurement of the force applying device 1 under the control of the overall control device 20. It is possible to associate the emission spectrum with the obtained force curve. It is also possible to associate the range in which the force applying member 1 during the force curve measurement moves in the vertical direction within the time when the first imaging device 11 images the optical spectrum. Therefore, the dynamic state change of the sample due to the force applied by the force applying member 1 of the force applying device 19 can be detected in detail. The range operated in the vertical direction is a range of line segments corresponding to the numbers as shown in FIGS. 6 (a), 6 (c) and 8 (b). In this number, 1 indicates an uncompressed state at the start of one-step operation, 2 indicates a compressed state, 3 indicates an expanded state, and 4 indicates an uncompressed state after expansion.
図５、図６は発光タンパク質であるグリーンフルオレッセント・プロテイン（Green Fluorescent Protein(ＧＦＰ)）をガラス基板表面に固定し、力付与部材１により分子操作を行った際の測定結果を示す。ＧＦＰ分子は、タンパク質の形状が変化すると発する蛍光強度が減少するという特徴がある。ガラス基板表面をシランカップリング法を利用して修飾し、ＧＦＰ分子の末端を化学結合で選択的にガラス基板表面に固定した。図５(a)〜(c)のようにＧＦＰ分子に力付与部材１で圧縮力や固定したビーズ表面を適切に修飾してガラス基板表面とビーズ表面で架橋することで伸張力を施した。図５(a)は、ＧＦＰ分子に圧縮力を付与している状態を示している。図５(b)は、適当な箇所をビーズ表面に結合させ、強い力でＧＦＰ分子に伸張力を付与している状態を示している。図５(c)は、もう一方の末端を選択的にビーズ表面に付着させ、弱い力で伸張力を付与している状態を示している。 FIG. 5 and FIG. 6 show measurement results when the fluorescent protein Green Fluorescent Protein (GFP) is fixed to the glass substrate surface and the molecular operation is performed by the force applying member 1. The GFP molecule is characterized in that the fluorescence intensity emitted decreases when the shape of the protein changes. The glass substrate surface was modified using a silane coupling method, and the ends of the GFP molecules were selectively fixed to the glass substrate surface by chemical bonds. As shown in FIGS. 5 (a) to 5 (c), the GFP molecules were appropriately modified with a compressive force or a bead surface fixed by the force applying member 1 and cross-linked between the glass substrate surface and the bead surface to give an extension force. FIG. 5 (a) shows a state in which a compressive force is applied to the GFP molecule. FIG. 5 (b) shows a state where an appropriate portion is bound to the bead surface and an extension force is applied to the GFP molecule with a strong force. FIG. 5 (c) shows a state in which the other end is selectively attached to the bead surface and an extension force is applied with a weak force.
図６は、力付与装置１９で得られたフォースカーブとＧＦＰ分子に圧縮力や伸張力を施すことで同期させて、第１撮像装置１１で得られた蛍光スペクトルを示している。図６(ｂ)、(ｄ)は、フォースカーブと同期して得られた蛍光スペクトルを示している。蛍光スペクトルは、１から４まで順番に測定されたことを示している。また図６(ｂ)、(ｄ)の蛍光スペクトルの１と４は、力付与部材１が基板から離れている時に測定されたスペクトルである。また図６(ｂ)、(ｄ)の蛍光スペクトルの２は、力付与部材１がＧＦＰ分子に圧縮力を施しているときに測定された結果である。また図６(ｂ)、(ｄ)の蛍光スペクトルの３は、力付与部材１がＧＦＰ分子に伸張力を施しているときに得られた結果である。また図６(ｂ)、(ｄ)の蛍光スペクトルの２、３を測定した際の力付与部材１の状態を同じ番号で、図６(a)、(c)のフォースカーブ中に示した。図６(a)、(ｂ)は、図５(b)のようにＧＦＰ分子の任意の箇所をビーズ表面に結合させて伸張した際の測定結果を示している。また図６(ｃ)、(ｄ)は、図５(c)のように末端を選択的にビーズ表面に付着させて測定された結果を示している。図６(b)、(d)は、力付与部材がＧＦＰ分子に接触させて圧縮力を加える場合、その蛍光強度が減少していることを示している。また、図６(b)は、ＧＦＰ分子を適当な箇所で強く伸張した場合、その蛍光強度が接触により圧縮力を施した場合よりも大きく減少していることがわかる。一方、図６(ｄ)は、ＧＦＰ分子の末端の官能基を選択的にビーズ表面に付着させて架橋して伸張力を加えた場合、ＧＦＰ分子の蛍光強度が力を付与していないときと比較してほとんど変化していないことが示されている。このように通常の原子間力顕微鏡のフォースカーブ測定を利用して行われている生体高分子の分子操作に新たに光学スペクトルの情報を付加して示すことができる。それにより、フォースカーブ測定からでは得られなかった生体高分子の安定性や動的構造情報をより詳細に得ることが可能である。
FIG. 6 shows the fluorescence spectrum obtained by the first imaging device 11 in synchronization with the force curve obtained by the force applying device 19 and the GFP molecule by applying a compressive force or an extension force. FIGS. 6B and 6D show fluorescence spectra obtained in synchronization with the force curve. The fluorescence spectrum shows that 1 to 4 were measured in order. In addition, fluorescence spectra 1 and 4 in FIGS. 6B and 6D are spectra measured when the force applying member 1 is separated from the substrate. Moreover, 2 of the fluorescence spectrum of FIG.6 (b), (d) is the result measured when the force provision member 1 is applying the compressive force to the GFP molecule. Moreover, 3 of the fluorescence spectrum of FIGS. 6B and 6D is a result obtained when the force applying member 1 applies an extension force to the GFP molecule. The states of the force applying member 1 when measuring the fluorescence spectra 2 and 3 of FIGS. 6B and 6D are shown in the force curves of FIGS. 6A and 6C with the same numbers. FIGS. 6 (a) and 6 (b) show measurement results when an arbitrary portion of the GFP molecule is bound to the bead surface and stretched as shown in FIG. 5 (b). 6 (c) and 6 (d) show the results of measurement with the end selectively attached to the bead surface as shown in FIG. 5 (c). FIGS. 6B and 6D show that when the force applying member is brought into contact with the GFP molecule and a compressive force is applied, the fluorescence intensity decreases. FIG. 6 (b) shows that when the GFP molecule is strongly stretched at an appropriate location, the fluorescence intensity is greatly reduced as compared with the case where the compressive force is applied by contact. On the other hand, FIG. 6 (d) shows the case where the functional group at the end of the GFP molecule is selectively attached to the surface of the bead and cross-linked and an extension force is applied, when the fluorescence intensity of the GFP molecule does not give a force. It is shown that there is little change compared. In this manner, optical spectrum information can be newly added to the molecular manipulation of a biopolymer performed by using a force curve measurement of a normal atomic force microscope. Thereby, it is possible to obtain in more detail the stability and dynamic structure information of the biopolymer that could not be obtained from the force curve measurement.
＜４＞金属探針による生体高分子測定
試料をナノスケールで測定するためには、先端の鋭い金属探針を使って測定する。試料測定装置、並びに測定方法をナノスケールに適用する場合、金属が示す表面増強ラマンなどの近接場光を利用することができる。第１光源７の波長に応じて選択された金や銀、白金、銅などの金属により覆われた金属探針を利用することにより、試料の形状と局所的な光学情報を同時に取得することができる。
<4> Biopolymer measurement using a metal probe In order to measure a sample on a nanoscale, measurement is performed using a metal probe having a sharp tip. When the sample measuring device and the measuring method are applied to the nanoscale, near-field light such as surface enhanced Raman exhibited by a metal can be used. By using a metal probe covered with a metal such as gold, silver, platinum, or copper selected according to the wavelength of the first light source 7, the shape of the sample and local optical information can be acquired simultaneously. it can.
図７は、試料測定装置を利用して測定された生体膜の形状像である。これらの生体膜は光駆動プロトンポンプを行うバクテリオロドプシン（bacteriorhodopsine（ｂＲ））を含む紫膜断片である。探針は、シランカップリング法を利用して表面に末端官能基を導入した後に、あらかじめ用意しておいた直径70ｎｍ程度の銀微粒子を吸着させた。図７は多数の膜断片がガラス基板表面に吸着していることを示している。図８は、この膜断片で測定されたフォースカーブと表面増強ラマンスペクトルを示している。図８(a)はラマンスペクトルで、１は銀探針がガラス基板表面にある紫膜断片から離れているとき、２は銀探針がガラス基板表面にある紫膜断片に接触し、力を付与しているときに、それぞれ測定されたラマンスペクトルを表している。１と比較して２は強いラマン信号が検出されていることを示している。この２は紫膜中に含まれているｂＲ分子のラマンスペクトルである。金属探針を利用したラマン測定は、先端に存在している分子のラマンスペクトルのみを検出することができる。このように生体膜などの生体試料の画像測定を生理的条件下においてナノスケールで行い、その画像中の光学情報を局所的に容易に検出することができる。この方法を利用することにより、力学測定に光学分解能を超えた光学情報を同時に対応付けることが可能である。このように生体膜などの生理条件下で測定する必要がある、生体試料の力学的性質と光学的性質を同時に検出することができる。これにより生体試料の動的な構造解析や試料の分子の識別を行うことができる。 FIG. 7 is a shape image of a biological membrane measured using a sample measurement device. These biological membranes are purple membrane fragments containing bacteriorhodopsine (bR) that performs a light-driven proton pump. The probe used a silane coupling method to introduce terminal functional groups on the surface, and then adsorbed silver fine particles having a diameter of about 70 nm prepared in advance. FIG. 7 shows that many film fragments are adsorbed on the glass substrate surface. FIG. 8 shows the force curve and surface enhanced Raman spectrum measured for this membrane fragment. FIG. 8 (a) shows the Raman spectrum, where 1 is when the silver probe is separated from the purple membrane fragment on the glass substrate surface, and 2 is when the silver probe contacts the purple membrane fragment on the glass substrate surface, Each of the measured Raman spectra is shown when it is given. Compared with 1, 2 indicates that a strong Raman signal is detected. This 2 is the Raman spectrum of the bR molecule contained in the purple membrane. Raman measurement using a metal probe can detect only the Raman spectrum of the molecule present at the tip. In this way, image measurement of a biological sample such as a biological membrane can be performed on a nanoscale under physiological conditions, and optical information in the image can be easily detected locally. By using this method, it is possible to simultaneously associate optical information exceeding the optical resolution with the dynamic measurement. Thus, it is possible to simultaneously detect the mechanical properties and optical properties of a biological sample that need to be measured under physiological conditions such as a biological membrane. Thereby, dynamic structural analysis of a biological sample and identification of a sample molecule can be performed.
以上のように、試料測定装置は、力付与部材１を試料の面に接触させたり、離間させることができ、その時々における、力付与部材１の位置における試料の発光変化を的確に測定することができる。特に、試料に押圧力や引張力を付与でき、その力の大きさも測定でき、又は、力付与部材１の微小距離変化による測定も可能である。また、試料測定装置は、試料表面の分子種の同定や力付与部材１と試料表面間の溶媒状態の検出、力付与部材１の摩擦などによる固体表面の状態変化の検出、固体物理・表面科学分野、更に接触領域内の分子の力学的構造変化による電子状態変化の検出、タンパク質など生体高分子の単分子レベルの相互作用解析や構造解析など、幅広い学術分野の新しい測定装置として有用である。試料測定装置は、単体の新たな測定装置の他に、原子間力顕微鏡に機能を付加する形で提供できる。そのため測定対象は固体から生体物質まで幅が広い。一方産業的な価値は高く、例えば、ナノスケールの力学的応答による状態変化を観察することが可能なため、原子間力顕微鏡のようにナノ材料の作成ができ、また、さまざまな産業用チップ等の検査装置として原子間力顕微鏡に新しい機能を提供できる。
As described above, the sample measuring apparatus can bring the force applying member 1 into contact with or away from the surface of the sample, and accurately measure the change in light emission of the sample at the position of the force applying member 1 at that time. Can do. In particular, a pressing force or a tensile force can be applied to the sample, the magnitude of the force can be measured, or measurement by a minute distance change of the force applying member 1 is also possible. In addition, the sample measuring apparatus can identify molecular species on the sample surface, detect the solvent state between the force applying member 1 and the sample surface, detect changes in the state of the solid surface due to friction of the force applying member 1, etc., solid physics / surface science It is useful as a new measuring device in a wide range of academic fields, such as detection of changes in the electronic state due to changes in the mechanical structure of molecules in the field and contact region, and single molecule level interaction analysis and structural analysis of biopolymers such as proteins. The sample measuring device can be provided in a form in which a function is added to the atomic force microscope in addition to a single new measuring device. Therefore, the measurement object has a wide range from solid to biological material. On the other hand, the industrial value is high. For example, it is possible to observe the state change due to the nanoscale mechanical response, so that nanomaterials can be created like an atomic force microscope, and various industrial chips, etc. Can provide a new function for atomic force microscopes.
１・・・力付与部材
２・・・レーザー
３・・・分割光電変換素子
４・・・微動素子
５・・・試料台
６・・・対物レンズ
７・・・第１光源
８・・・ピンホール
９・・・ダイクロイックミラー
１０・・分光器
１１・・第１撮像装置
１２・・第２光源
１３・・アイリス
１４・・可動ミラー
１５・・可動ミラー
１６・・第２撮像装置
１７・・力付与装置制御装置
１８・・アナログ-デジタル変換装置
１９・・力付与装置
２０・・全体制御装置
２１・・第１光源自動遮断装置
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Force provision member 2 ... Laser 3 ... Divided photoelectric conversion element 4 ... Fine movement element 5 ... Sample stand 6 ... Objective lens 7 ... 1st light source 8 ... Pin Hall 9... Dichroic mirror 10 .. Spectrometer 11 .. First imaging device 12 .. Second light source 13 .. Iris 14 .. Movable mirror 15 .. Movable mirror 16 .. Second imaging device 17. Giving device controller 18 ..Analog-to-digital converter 19 ..Force applying device 20 ..Overall control device 21 ..First light source automatic shut-off device
Claims (13)
力が付与された位置付近に光を照射する第１光源と、
力が付与された位置から発する光を分光する分光器と、
分光された光を撮像する第１撮像装置とを備えることを特徴とする試料測定装置。
A force applying device that applies a force to a predetermined position of the sample;
A first light source that irradiates light near a position where force is applied;
A spectroscope that separates light emitted from a position where force is applied;
A sample measurement apparatus comprising: a first image pickup device that picks up the dispersed light.
力付与装置は、試料に付与する力の大きさを求めることができることを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 1,
A sample measuring device, wherein the force applying device can determine the magnitude of the force applied to the sample.
力付与装置は、少なくとも先端表面が金属で形成された探針を備えていることを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 1,
The force applying device includes a probe having at least a tip surface formed of a metal.
力付与装置と分光器を制御する制御装置を備え、
フォーカスカーブと光学スペクトルを同時に測定できることを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 2,
A control device for controlling the force applying device and the spectroscope;
A sample measuring apparatus capable of simultaneously measuring a focus curve and an optical spectrum.
力付与装置は、試料の一面から力を付与し、
第１光源は、試料の他面から光を照射することを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 1,
The force applying device applies force from one side of the sample,
The first light source irradiates light from the other surface of the sample.
第１光源の光線が通過するピンホールを有する遮光板を備えていることを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 1,
A sample measuring apparatus comprising a light shielding plate having a pinhole through which a light beam of a first light source passes.
試料に光を照射する第２光源と、
試料からの散乱光を撮像する第２撮像装置とを備え、
第１光源と第２光源との光軸を試料の照射付近でほぼ一致してあることを特徴とする、試料測定装置。
The sample measurement apparatus according to claim 1,
A second light source for irradiating the sample with light;
A second imaging device for imaging scattered light from the sample,
A sample measuring apparatus characterized in that the optical axes of the first light source and the second light source substantially coincide with each other in the vicinity of irradiation of the sample.
力が付与された位置付近に光を照射し、
力が付与された位置から発する光を分光することを特徴とする試料測定方法。
Applying force to the sample with the force applying member,
Irradiate light near the position where force is applied,
A method for measuring a sample, comprising: dispersing light emitted from a position to which a force is applied.
試料に付与する力の大きさを求めることを特徴とする試料測定方法。
The sample measurement method according to claim 8,
A method for measuring a sample, characterized in that a magnitude of a force applied to the sample is obtained.
試料は生体試料であることを特徴とする試料測定方法。
The sample measurement method according to claim 8,
A sample measurement method, wherein the sample is a biological sample.
光学スペクトルをフォーカスカーブに対応付けることを特徴とする、試料測定方法。
The sample measurement method according to claim 9, wherein
A sample measurement method, wherein an optical spectrum is associated with a focus curve.
試料に力を付与する際、力付与部材と試料の間に溶剤を介在させることを特徴とする試料測定方法。
The sample measurement method according to claim 8,
A method for measuring a sample, comprising applying a solvent between a force applying member and a sample when applying force to the sample.
少なくとも先端表面が金属で形成された探針で試料に力を付与することを特徴とする試料測定方法。
The sample measurement method according to claim 8,
A method for measuring a sample, comprising applying a force to the sample with a probe having at least a tip surface made of metal.
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