JP2005089335A

JP2005089335A - 固定化レセプタータンパク質

Info

Publication number: JP2005089335A
Application number: JP2003322132A
Authority: JP
Inventors: Chikako Ito; 千嘉子伊藤; Shuichi Oka; 修一岡; Toru Imamura; 亨今村
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2005-04-07

Abstract

【課題】
レセプタータンパク質に対するアンタゴニスト、アゴニスト等のレセプタータンパク質結合物質を検出、あるいはその結合活性を測定する手段であって、使用するレセプタータンパク質あるいはリガンドの種類に限定されることなく、極めて広範な種類のレセプタータンパク質に対して適用可能であるとともに、しかも、迅速、簡便、かつ高精度に上記検出あるいは測定しうる手段を提供する。
【課題解決手段】
【請求項１】固体支持体に、イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質が固定化され、さらに該タンパク質を介して、上記Ｆc部分とレセプタータンパク質とからなるキメラタンパク質が結合せしめられている固定化レセプタータンパク質を用いて、レセプタータンパク質結合物質を検出、あるいはその結合活性を測定する。

Description

本発明は、固定化レセプタータンパク質、並びに該タンパク質を使用して、アンタゴニスとアゴニスト等のレセプタータンパク質に対し結合活性を有する物質の検出および／又はその結合活性を測定する方法に関する。

サイトカインや成長因子に代表される、レセプターを介して生物機能を発現するリガンドとなるアゴニストやアンタゴニストの探索は医薬品の開発にとって重要であり、アゴニストやアンタゴニストは主に検体のレセプター結合活性を直接測定する方法と、リガンドが細胞のレセプターに結合しておこす生物活性（細胞内変化）を測定して求める方法によって探索されている。直接測定する方法としては主に、レセプターの存在する細胞、その細胞膜あるいは細胞膜から精製したレセプターかその組み換え体（リコンビナント）を用い、アイソトープや蛍光化合物で化学的に標識したリガンドのレセプターへの結合活性に対する検体の阻害活性から求めるものであるが、この方法では化学標識に不安定なリガンドは使用できないので、測定対象物の範囲は限定されてしまう。

また、アイソトープを使用する場合は特別な設備が必要である等の問題点がある。後者の生物活性を測定する方法としては、増殖因子による細胞増殖活性を測定する方法や増殖因子やサイトカインによる細胞内特定蛋白のリン酸化反応を測定したり、その他さまざまな特定の反応を測定する方法があるが、この場合、生物活性は検体のレセプター結合活性と該検体の細胞への作用が複合した結果として現れるので、この結合活性と細胞作用とを区別をする必要があるが、細胞内の反応の多くは複雑にリンクしており、区別が困難な場合が多々ある。

他方、検体のレセプター結合活性を直接測定する方法において、マイクロプレートやビーズに代表される固体支持体に直接あるいは中間結合物を介してレセプターあるいはリガンドを固定し、レセプターあるいはリガンドの抗体を用いてレセプターに結合したリガンド量をアイソトープや蛍光化合物で化学的に標識することなく測定する方法が最近開発され始めている。

その一つに、streptavidinを固定化したマイクロプレートに、biotinを結合したIL-2, IL-6, TNFをそのサイトカインレセプターとともに接触せしめstreptavidinとbiotinの結合を介してマイクロプレートにサイトカインとそのレセプター結合物を固定化しマイクロプレートに結合したレセプターをレセプター特異抗体で検出する方法 (Roche Diagnostics社のキット)が知られている。この方法においては、サイトカインと該レセプターをマイクロプレートに接触せしめるときに同時に検体を加えれば検体のアゴニストあるいはアンタゴニスト活性を測定できるが、リガンドがbiotin化によりレセプターへの結合活性を失うものは測定できない。

また、サイトカイン（IL-4）レセプター蛋白あるいはそのFcキメラ蛋白をマイクロプレートに直接固定化する方法も知られているが（特許文献１参照）、個体支持体へレセプターが一様な状態で固定化されないため、リガンドが結合できないあるいはできにくい状態でレセプターが固定化される恐れがある。
さらに、抗Fc抗体を固定化したマイクロプレートにサイトカイン（IL-4）レセプター−Fcキメラ蛋白を固定化されている抗体を介して固定化する方法も知られているが（特許文献２参照）、この方法では、用いる抗体によってレセプターの固定化状態は異なるため、リガンドが結合できないあるいはできにくい状態でレセプターが固定化される恐れがある。
以上の点から、すべてのリガンドやレセプターに応用可能な簡便で迅速な測定法が望まれている。

米国特許第6475717号明細書米国特許第5639597号明細書

したがって、本発明の課題は、従来技術の問題点を解消するため、化学標識に不安定なリガンドであっても、アイソトープを使用せずに、検出、測定系に組み込むことが可能となるものであって、一度に多種の検体試料を処理可能で、該検体中のアンタゴニスあるいはアゴニスト等のレセプタータンパク質結合活性を有する物質を検出できるとともに、これらのレセプタータンパク質に対する結合活性を測定するための、簡便でかつ高精度の手段を提供しようとするものである。

本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、固体支持体に、イムノグロブリンＦｃ部分と特異的に結合するタンパク質を固定化し、さらに該タンパク質を介して、イムノグロブリンFc部分と、少なくともリガンド結合部位を有するレセプタータンパク質とからなるキメラタンパク質を結合させることにより固定化レセプタータンパク質を作製した。そして、該固定化レセプタータンパク質を用いて、検体試料中の該レセプタータンパク質に対するアゴニストあるいはアンタゴニストの検出及びレセプターに対する結合活性を測定したところ、極めて優れた性能を示し、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。すなわち本発明は以下に示すとおりである。

（１）固体支持体に、イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質が固定化され、さらに該タンパク質を介して、イムノグロブリンFc部分と、少なくともリガンド結合部位を有するレセプタータンパク質とからなるキメラタンパク質が結合せしめられていることを特徴とする、固定化レセプタータンパク質。
（２）イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質がプロテインＡであることを特徴とする、上記（１）に記載の固定化レセプタータンパク質。
（３）イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質がプロテインＧであることを特徴とする、請求項１に記載の固定化レセプタータンパク質。
（４）検体試料中に含有されるレセプタータンパク質に対する結合活性を有する物質の検出及び／または該物質のレセプタータンパク質に対する結合活性を測定する方法であって、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の固定化レセプタータンパク質に検体試料および該レセプタータンパク質に対するリガンドを接触させ、固定化レセプタータンパク質に対するリガンドの結合量を測定することを特徴とする、上記方法。
（５）上記固定化レセプタータンパク質に対するリガンドの結合量の測定が、標識抗体を用いて行うことを特徴とする、上記（４）に記載の方法。

本発明の固定化レセプタータンパク質を使用する上記検出、測定法においては、従来技術のように、アイソトープの使用や蛍光標識やbiotin化等でリガンドを化学修飾をする必要がなく、極めて広い範囲のリガンドを使用できるとともに、これに伴い極めて多くの種類のレセプタータンパク質に対する結合活性を有する物質の探索及びその評価が可能となる。しかもこれらの測定においては、タンパク質、ペプチドの他、多糖類あるいは低分子化合物であっても、レセプタータンパク質に結合する活性を有する限り、いかなるものも、精度よくかつ迅速に、しかも多数の検体を同時に測定することを可能にするものである。
したがって、本発明の固定化レセプタータンパク質およびこれを用いた上記検出、測定法は、アゴニストやアンタゴニストあるいはその他のレセプタータンパク質結合物質の探索に極めて有用であり、例えばレセプターが関与する疾病の原因解明あるいは疾病の治療、診断等のための医薬品開発等において、大いに貢献するものである。

本発明における固定化レセプタータンパク質は、固体支持体に、イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質が固定化され、さらに該タンパク質を介して、イムノグロブリンFc部分と、少なくともリガンド結合部位を有するレセプタータンパク質とからなるキメラタンパク質が結合せしめられているものである。この固定化レセプタータンパク質の構築に使用するレセプタータンパク質あるいはリガンドについては特に特定のものに限定されない。

本発明の固定化レセプタータンパク質を製造する場合、まず、固体支持体上に、イムノグロブリンFc部分に高い親和性を持ち生理的条件で安定な結合体をつくるタンパク質を固定する。このようなイムノグロブリンFc部分と高い親和性を有するタンパク質としては、例えばStaphylococcus aureus由来のプロテインＡあるいはStreptococcus sp．由来のプロテインＧが挙げられるが、これらのタンパク質は、これら微生物から得たものに限らず、遺伝子組換え技術を使用し、大腸菌等の他の微生物を宿主として得られたものであってもよい。この遺伝子組換え技術を使用して得られたプロテインＡあるいはＧはすでにSigma社等より市販されている（プロテインＡ；米国特許第5151350号明細書、プロテインＧ；Biochem J. 267 171 (1990)）。

一方、少なくともリガンドとの結合部分を含むレセプタータンパク質をイムノグロブリンFc部分と結合したリコンビナントキメラ蛋白質を調製し、上記イムノグロブリンFc部分と親和性を有するタンパク質を固定化した固体支持体と接触せしめ、固体支持体にイムノグロブリンＦｃ部分と、該イムノグロブリンに対して親和性を有するタンパク質を結合させることにより、少なくともリガンドとの結合部分を有するレセプタータンパク質を固定化して、固定化レセプタータンパク質を得る。

本発明においては、上記固定化レセプタータンパク質と、検体試料と既知のリガンドとが共存する溶液とを接触させ、該リガンドの競合的結合量を測定することにより、検体試料中のアゴニストあるいはアンタゴニスト若しくは他のレセプタータンパク質に対して結合活性を有する物質を検出し、さらに、その結合活性を測定する。このリガンドの結合量の測定は、例えば、上記既知のリガンドに特異的に結合する抗体を用いて行うが、これには、リガンドに直接結合する一次抗体を標識して行ってもよく、リガンドに一次抗体を結合せしめた後、一次抗体に対する抗体すなわち２次抗体を標識して、該リガンドに結合する一次抗体に結合せしめることにより行ってもよい。この場合、直接リガンドが結合した量を測定してもよいが、結合しなかったリガンドの量を標識抗体を用いて測定し、この測定値から上記結合量を求めてもよい。

したがって、本発明の測定法はリガンド及びレセプターのいずれに対しても、アイソトープ、蛍光化合物あるいはビオチン等の化学標識を行わないので、リガンドとレセプタータンパク質の結合を阻害することがなく、また、精度が安定で、かつ簡便、迅速に、上記検体試料中のアゴニストあるいはアンタゴニストあるいはその他のレセプタータンパク質に対する結合活性を有する物質の検出、あるいはレセプターに対する結合活性を測定することが可能となる。

さらに、本発明の固定化レセプタータンパク質の製造及びこれを用いた測定法について、図１を参照して、さらに詳細に説明する。
1．固定化レセプタータンパク質の製造。
本発明の固定化レセプタータンパク質を得るには、まず、固体支持体上に、イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質として、例えばプロテインＡあるいはＧを固定化する（図１（１））。この固体支持体としては、マイクロタイタープレート、各種のビーズ状の例えばポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック製や金属セラミックス等の無機物質製等の免疫測定法において常用されている支持体を用いることができる。プロテイン AあるいはプロテインGの固定は常法に従って行うことができる。これには例えばDDWにこれらの蛋白質を例えば、5 μg/mlの濃度で溶解し、プレートのウエルに50μlずつ加え、一晩静置しておけばよい。

次にこの固定されたプロテイン Aあるいはプロテイン Gに、少なくともリガンド結合部位を有するレセプタータンパク質とイムノグロブリンFc部分が結合したキメラ体を例えば1% BSAを含むPBS液で一定濃度に溶解したものを接触せしめ、レセプター蛋白−Fcキメラ体を固体支持体に固定化して、固定化レセプタータンパク質を得る（図１（２））。
この場合、上記固体支持体上に固定化されたプロテインAあるいはプロテイン Gと、このレセプター−Fcキメラ体とを該キメラ体のＦｃ部分を介して結合することが重要であるため、固体支持体は予め、例えばBSAやSkim Milk等のブロッキング蛋白質例えば1%を含むPBS液と接触せしめ、固体支持体のプロテイン Aあるいはプロテイン G以外の非特異的蛋白結合部位をブロックしておくのが望ましい。また、レセプター−Fcキメラ体を、固定化されたプロテイン Aあるいはプロテイン Gと接触せしめるときにも、例えば同じブロッキング液にレセプター−Fcキメラ体を溶解して用いるのが好ましい。

２．固定化レセプタータンパク質を使用する検体中のアンタゴニスト及びアゴニスト等の検出及びこれらの結合活性の測定
本発明における検出あるいは測定の対象となるアンタゴニストあるいはアゴニストに関わらずレセプタータンパク質と結合する物質であれば、特に限定されない（以下、単にアンタゴニストあるいはアゴニスト等という）。その分子種としては、例えば、タンパク質、ペプチドが挙げられるが、多糖類あるいは低分子化合物等であってもよく、特に制限はない。また、本発明の検出あるいは測定の対象となるアンタゴニストあるいはアゴニスト等は、既知あるいは未知を問わない。例えば、特定のレセプター蛋白に結合して医薬効果を発揮することが知られているタンパク質あるいはペプチドにおいて、アミノ酸配列を変異させた組み換えタンパク質あるいはペプチド、さらに、低分子化合物の置換基等を改変した化合物等についてもそのレセプター結合活性を測定するおことにより、医薬効果を推定することも可能となる。また、例えば、天然物抽出液中の未知のアンタゴニストあるいはアゴニスト等の検出あるいは結合活性の測定も可能である。

上記工程で得られた固定化レセプタータンパク質を用いて、検体試料中のアンタゴニストあるいはアゴニスト等の検出あるいはそれらの結合活性を測定する場合においては、
（１）まず、該固定化レセプタータンパク質に、検体試料と該レセプタータンパク質に対する既知のリガンドとを一定の割合で混合した溶液を接触させる（図１（３））。
（２）この場合、上記検体試料中にアゴニストあるいはアンタゴニスト等が存在すれば、これらは、リガンドと競合的に該レセプターに結合する（図１（４））。したがって、レセプターに結合したリガンドの量（あるいは結合しなかった量）を測定し、この結合量が、上記検定試料を加えない場合のリガンドの結合量と差がある場合は、検体試料中にアンタゴニストあるいはアゴニスト等が存在し、これらがレセプタータンパク質と結合することにより、リガンドのレセプタータンパク質に対する結合を阻害していることを意味する。

つまり、上記結合量の差をみることにより、検体試料中のアンタゴニスとあるいはアゴニスト等を検出することが可能となる。また、その阻害の程度を求めれば、検体試料中のアゴニストあるいはアンタゴニスト等が未知あるいは既知物質に関わらずあるいは天然物中に単離されずに含有されているアンタゴニストあるいはアゴニスト等であっても、その検出およびレセプタータンパク質に対する結合活性を測定できる。

（３）固体支持体に結合したリガンドの量の測定は、常法による。これには、例えば、一次抗体を固体支持体に結合したリガンドと接触せしめ、次に用いた一次抗体に対する標識二次抗体を、固体支持体に結合した一次抗体と結合せしめる（図１（５））。次いで、結合しなかったリガンド、及びアンタゴニストあるいはアゴニスト等を洗浄除去し、その標識の発現量に基づき、レセプタータンパク質に対するリガンドの結合量（結合しなかった量）を測定する（図１（６））。もちろん、このような２次抗体を使用せずに一次抗体を標識して、その結合量を測定してもよい。
これら抗体の標識は、抗体の標識手段としてそれ自体公知の手段が用いられるが、具体的には西洋わさびパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−D-ガラクトシダーゼ等の酵素、ビオチンあるいは蛍光化合物等を用いることができ、これらの標識の検出のためには標識の種類に応じて既知の検出方法を用いることができ、また、これらの標識物質の検出方法としては、例えば免疫測定法において知られる任意の方法を用いることができる。

以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下に、マイクロタイタープレートを用いたヒト繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプターの一つであるFGFR-1(III)cの細胞外ドメインをイムノグロブリンFc部分と結合したリコンビナントキメラ蛋白と該レセプターに結合活性のあるヒトリコンビナントFGF-5をリガンドに用い、検体としてFGF-5に対してアンタゴニスト活性のあるペプチドや天然物エタノール抽出液や、アゴニスト活性のあるリコンビナントFGF-1やFGF-2蛋白を用いたレセプター結合活性の化学的測定法を示す。

FGF-5リガンドのFGFR-1(III)c-Fc-キメラ体への結合活性の化学的測定法
5 μg/mlのProtein Aを含むDDWを96穴のマイクロタイタープレートにウエルあたり50 μl加え、一晩4℃で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄し100 μl の1% BSA/PBSを加え二時間室温で放置後、50 μlの0.5 μg/mlのFGFR-1(III)c-Fc-キメラ体/1% BSA/PBSを加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、濃度既知のFGF-5と5 μg/mlのheparin/10% FBS/RPMI培地を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、2 μg/mlのヒツジ由来抗ヒトFGF-５ポリクローナル抗体を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、500倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウマ由来抗ヒツジイムノグロブリン抗体（フナコシ）を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、3 mg/mlのペルオキシダーゼ基質（シグマ）と0.01% H₂O₂を含む0.1M クエン酸緩衝液(pH5.2)を１ウエルあたり50 μl加え、30分間室温で放置した後1M H₂SO₄を１ウエルあたり50 μl加え、492 nmの発色を測定した。
図2は、リガンドFGF-5の濃度の増加に伴うペルオキシダーゼ基質の492 nmの発色を示す。加えたFGF-5の増加に伴い、発色量が増加しているのがわかる。

FGF-5に対するアンタゴニストペプチドのレセプター結合活性の化学的測定法
実施例１．に従いマイクロタイタープレートにFGFR-1(III)c-Fc-キメラ体を固定洗浄後、1.54x10^-9MのFGF-5と5 μg/mlのheparin/10% FBS/RPMI培地を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、実施例１．に従いマイクロタイタープレートに結合しているFGF-5結合量に伴うペルオキシダーゼ基質の発色を測定し、ペプチドを加えないときの発色量を100%コントロールとして加えたペプチド既知濃度毎のコントロールに対する発色量を％で求めた。
図3は、ペプチド添加濃度に伴う発色量変化を示した。グラフより50%阻害を示すペプチド濃度483 μMを求めた。

乾燥植物50%エタノール抽出液のレセプター結合活性の化学的測定法
実施例１．に従いマイクロタイタープレートにFGFR-1(III)c-Fc-キメラ蛋白を固定し洗浄後、1.54x10^-9MのFGF-5と5 μg/mlのheparinと50%エタノールで抽出した植物エキスを含む10% FBS/RPMI培地を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、実施例１．に従いマイクロタイタープレートに結合しているFGF-5量の変化に伴うペルオキシダーゼ基質の発色量を測定した。エタノールのみを加えたときの発色量を100%コントロールとして加えた植物エキス添加濃度毎のコントロールに対する発色量を％で求めた（図4）。グラフより50%阻害を示す植物エキス濃度13.4%を求めた。

アゴニスト蛋白FGF-1やFGF-2のレセプター結合活性の化学的測定法
実施例１に従いマイクロタイタープレートにFGFR-1(III)c-Fc-キメラ蛋白を固定し洗浄後、1.54x10^-9MのFGF-5と5 μg/mlのheparinを濃度既知のFGF-1やFGF-2を含む10% FBS/RPMI培地を１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、実施例１．に従いマイクロタイタープレートに結合しているFGF-5量の変化に伴うペルオキシダーゼ基質の発色量を測定した。FGF-1やFGF-2を加えないコントロールの発色量を100%としてFGF-1やFGF-2の添加濃度毎のコントロールに対する発色量を％で求めた（図5）。グラフより50%阻害を示すFGF-1やFGF-2の添加濃度12.3 nMと7.1 nMをそれぞれ求めた。

固体支持体に結合したプロテイン Aを介してレセプタータンパク質を固体支持体に固定するための手順、および固定化レセプタータンパク質を使用してアンタゴニストのレセプター結合活性を測定する方法の概略を示す。ヒトリコンビナントFGF-5リガンドのFGFR-1 (III)c-Fc-キメラ体への結合活性を、実施例１に示す方法で測定したときの、FGF-5の添加量に伴うペルオキシダーゼ基質の発色量を示す。レセプター結合活性物質を含まない検体を、実施例２に示す方法で測定したときに、個体支持体に結合したリガンドFGF-5を免疫測定法で測定したペルオキシダーゼ基質の発色量を100として、FGF-5のアンタゴニストペプチドを多種濃度で含む検体を、同方法で測定したときのペルオキシダーゼ基質の発色量を示す。レセプター結合活性物を含まない検体を、実施例３に示す方法で測定したときに、固体支持体に結合したリガンドFGF-5を免疫測定法で測定し、ペルオキシダーゼ基質の発色量を100として、乾燥植物50%エタノール抽出液検体多種濃度で含む検体を、同方法で測定したときのペルオキシダーゼ基質の発色量を示す。レセプター結合活性物を含まない検体を、実施例４示す方法で測定したときに、固体支持体に結合したリガンドFGF-5を免疫測定法で測定し、ペルオキシダーゼ基質の発色量を100として、ヒトリコンビナントFGF-1やFGF-2を多種濃度で含む検体を、同方法で測定したときのペルオキシダーゼ基質の発色量を示す。

Claims

固体支持体に、イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質が固定化され、さらに該タンパク質を介して、イムノグロブリンFc部分と、少なくともリガンド結合部位を有するレセプタータンパク質とからなるキメラタンパク質が結合せしめられていることを特徴とする、固定化レセプタータンパク質。
イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質がプロテインＡであることを特徴とする、請求項１に記載の固定化レセプタータンパク質。
イムノグロブリンFc部分と結合するタンパク質がプロテインＧであることを特徴とする、請求項１に記載の固定化レセプタータンパク質。
検体試料中に含有されるレセプタータンパク質に対する結合活性を有する物質の検出及び／または該物質のレセプタータンパク質に対する結合活性を測定する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化レセプタータンパク質に検体試料および該レセプタータンパク質に対するリガンドを接触させ、固定化レセプタータンパク質に対するリガンドの結合量を測定することを特徴とする、上記方法。
上記固定化レセプタータンパク質に対するリガンドの結合量の測定が、標識抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。