JP2005075993A - 水系におけるデンドリマー合成法 - Google Patents
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- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
Abstract
【課題】 水溶液中で生体膜が破損されない穏和な条件下でデンドリマーを合成する方法を提供すること。
【解決手段】 ２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつアミノ酸、これらから構成されるペブチド、もしくは、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつペブチドをビルディングブロックとして用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることによりデンドリマーを製造する方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 ２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつアミノ酸、これらから構成されるペブチド、もしくは、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつペブチドをビルディングブロックとして用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることによりデンドリマーを製造する方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は水系でのデンドリマー分子の作成方法に関する。
デンドリマーとは、中心核のまわりにビルディングブロックを順次結合させて枝分かれ構造を形成させることにより得られる樹木状多分岐高分子である。デンドリマー分子の合成方法としては、従来から多くの方法が知られている。しかしながら、従来のデンドリマー合成方法では、有機溶媒中で合成反応を行うため、生体膜等を中心核として用いた場合には、膜構造が破壊されてしまうためにデンドリマーの形成を行うことができなかった。したがって、水溶液中で生体膜が破損されない穏和な条件下でデンドリマーを合成する方法が求められている。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
特開２００１−１０６９４０
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９４（２００２）２１７−２２４
本発明は、水溶液中においてデンドリマーを形成させる方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、水溶性または水分散性のモノマーと、水溶性の架橋剤を用いることにより、水溶液中の穏和な条件下において、生体膜等が破損されずにデンドリマーの合成が可能であることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつアミノ酸、これらから構成されるペブチド、もしくは、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつペブチドをビルディングブロックとして用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることによりデンドリマーを製造する方法を提供する。
好ましくは、本発明の方法においては、官能基Ａがアミノ基でありかつ官能基Ｂがカルボキシル基であるか、または官能基Ａがカルボキシル基でありかつ官能基Ｂがアミノ基である。また好ましくは、官能基Ａがアミノ基でありかつ官能基Ｂがチオール基であるか、または官能基Ａがチオール基でありかつ官能基Ｂがアミノ基である。
また好ましくは、本発明の方法においては、中心核として、リン脂質膜、無機粒子、または有機粒子を用いる。
本発明の２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることにより、水系におけるデンドリマー合成ができる方法を発明した。
本発明の方法は、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつアミノ酸等をビルディングブロックとして用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることを特徴とする。このようにして、表面に多数の官能基Ａを有するデンドリマーを製造することができる。デンドリマー表面の官能基Ａは、所望により、さらに他の官能基に変換することができる。
本発明の方法においては、官能基Ａと官能基Ｂとの組み合わせは、アミノ基とカルボキシル基との組み合わせ、あるいはアミノ基とチオール基との組み合わせであることが好ましい。このような官能基の組み合わせを有するビルディングブロックとしては、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）また、酸性アミノ酸である、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）また、これらのアミド誘導体であるアスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）を用いることができる。また、これらのアミノ酸から構成されるペブチド、たとえば、―（Ｌｙｓ）ｎ−等の単一アミノ酸によるペブチド、および塩基性アミノ酸もしくは、酸性アミノ酸、およびその誘導体を１個以上含むペプチドを用いてもよい。さらに、システインと、塩基性アミノ酸もしくは、酸性アミノ酸、およびその誘導体を１個以上含むペプチドを用いてもよい。本発明において用いるビルディングブロックは、水溶性であることが好ましいが、水に対して難溶性であっても、分散性を有するものであれば、反応溶液中で激しく分散することにより使用することができる。
本発明の方法においては、中心核として、リン脂質膜、および各種の無機粒子および有機粒子を用いることができる。本発明の方法は水溶液中で行うため、中心核として使用する粒子は水不溶性であるべきである。好ましい中心核としては、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などが挙げられる。
リン脂質膜の例としては、リン脂質の有機薄膜で被覆された磁性細菌由来の磁気微粒子が挙げられる。磁性細菌から得られる磁性細菌粒子は、磁性細菌を培養後、微生物中から抽出することにより調製することができる。抽出方法としては、フレンチプレス等の物理的圧力によって微生物を破砕する方法やアルカリ煮沸、酵素処理、超音波破砕処理といった方法が採用できる。また、無機または有機粒子の表面に、例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等の結合性官能基を有するリン脂質を結合させたものを用いてもよい。このようなリン脂質としては、例えばホオスファチジルエタノールアミン、ホオスファチジルセリン、ホオスファチジルイノシトール、ホオスファチジル−Ｎ−メチルエタノールアミン等を用いることができる。
水不溶性の有機粒子の例としては、ポリスチレンビーズ、ナイロンビーズなどの有機ポリマーが挙げられる。
無機粒子の例としては、鉄粉や磁性微粒子等の金属粉が挙げられる。磁気微粒子としては、例えば、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｃｏ・γ−Ｆｅ２Ｏ３、（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ２Ｏ３、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ２Ｏ３、ＳｉＯ２で被覆したＦｅ３Ｏ４、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、タンパク質）とフェライトとの複合微粒子等を用いることができる。バクテリア由来の磁性体は、大きさが５０−６０ｎｍの酸化鉄の単磁区でできており磁気特性が優れているため特に好ましい。磁気感受性微粒子としてのフェライト系の粒子は、公知の方法によって製造できる。また、フェライト系以外の粒子としては、磁性金属粒子やその複合体でもよい。さらに、ＳｉＯ２で被覆したＦｅ３Ｏ４粒子、γ−Ｆｅ２Ｏ３粒子や炭素が共存する液相中で熱プラズマ法により製造される鉄を主成分とし、Ｎｉ、Ｃｏを含有する微粒子も挙げられる。これらの粒子は、公知の方法で容易に製造可能である。
本発明の方法において用いる中心核は、ビルディングブロック中の官能基Ｂと結合しうる官能基Ａを有する。既にその表面に官能基Ａを有する粒子を中心核として用いてもよく、あるいは、当該技術分野においてよく知られる方法により二官能性反応基等を用いて中心核上に官能基Ａを導入してもよい。例えば、表面にカルボキシル基を有する微粒子であるＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０等を好適に用いることができる。
本発明の方法においては、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることにより、中心核にビルディングブロックを順次結合させて分枝鎖構造を形成し、デンドリマーを製造する。官能基Ａと官能基Ｂとの結合反応は、水溶性の架橋剤を用いて行う。例えば、カルボキシル基とアミノ基を結合させる場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、もしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）の組み合わせを用いることができる。また、チオール基とアミノ基を結合させる場合には、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）などのヘテロ架橋剤を用いることができる。この反応を数世代行うことにより、中心核上にデンドリマーを成長させることができる。
本発明の方法により得られるデンドリマーは、その表面上に多数の官能基、例えば、カルボキシル基またはアミノ基を有している。さらに、これらの表面上の官能基を適当な架橋剤で誘導化することにより、所望の官能基を導入することができる。例えば、エチレンジアミンを用いることにより、カルボキシル基をアミノ基に誘導化することができる。したがって、本発明の方法により得られるデンドリマーは、種々の物質の吸着剤、触媒の担体、遺伝子および蛋白質の分離用担体、および酵素や抗体の固定化担体等として有用である。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１．磁気微粒子デンドリマーの製造
Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１は、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（２００３）６５１−６５５に記載されるようにして培養した。菌体を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、フレンチプレスに３回通して破砕した。次に、フレンチプレス破砕試料から磁気を用いて磁気微粒子を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１は、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（２００３）６５１−６５５に記載されるようにして培養した。菌体を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、フレンチプレスに３回通して破砕した。次に、フレンチプレス破砕試料から磁気を用いて磁気微粒子を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
得られた磁気微粒子（ＢＭＰ）１ｍｇを、１ｍｌの２．５％グルタルアルデヒドまたは５ｍＭ スベリン酸ビス（スルホサクシンイミドイル）（ＢＳ３）の溶液中に分散させ、室温で２時間インキュベートした。磁気を用いて磁気微粒子を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に１ｍｌの１ｍＭ Ａｓｐ溶液を加え、室温で２時間インキュベートすることにより、第１世代の磁気微粒子デンドリマーＢＭＰ−Ａｓｐを製造した。
得られたデンドリマーをＭＥＳバッファー（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０））で３回洗浄し、２ｍＭ ＥＤＣおよび５ｍＭ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で２時間インキュベートした。次にこれをＭＥＳバッファーで３回洗浄し、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ Ａｓｐを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で４時間インキュベートすることにより、第２世代の磁気微粒子デンドリマーＢＭＰ−Ａｓｐ−Ａｓｐを製造した。
同様にして、アミノ酸モノマーとしてＡｓｐの代わりにＧｌｕを用いて、デンドリマーＢＭＰ−ＧｌｕおよびＢＭＰ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを製造した（図１）。
実施例２．デンドリマー表面のカルボキシル基の定量
デンドリマー表面のカルボキシル基は、カルボキシル基にＬｙｓをペプチド結合させた後に表面のアミノ基を測定することにより定量した。実施例１で得られた４種類の磁気微粒子デンドリマー１ｍｇを、それぞれＭＥＳバッファーで３回洗浄し、２ｍＭ ＥＤＣおよび５ｍＭ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で２時間インキュベートした。次にＭＥＳバッファーで３回洗浄し、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ Ｌｙｓを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で４時間インキュベートした。次にこれをＰＢＳで洗浄しそれぞれの磁気微粒子デンドリマー１００μｇに対し、２００μｌの５ｍＭ スルホスクシンイミジルピリジルジチオプロピオンアミドヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）溶液に懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。磁気微粒子デンドリマーをＰＢＳで３回洗浄し、次に２００μｌの２０ｍＭジチオスレイトール中で２５℃で３０分間インキュベートした。上清を回収し、２−スルフィドリルピリジンの３４３ｎｍの吸収を測定することにより、磁気微粒子デンドリマー表面の１級アミン分子数を定量した。対照としては、アミノ酸を付加させていない磁気微粒子を用いた。結果を図２に示す。磁気微粒子数を算出するために、粒子を直径１００ｎｍの球形のマグネタイトとした時の粒子１個の重量、２．７２ｘ１０−１５ｇを基に、乾燥重量から換算した。
デンドリマー表面のカルボキシル基は、カルボキシル基にＬｙｓをペプチド結合させた後に表面のアミノ基を測定することにより定量した。実施例１で得られた４種類の磁気微粒子デンドリマー１ｍｇを、それぞれＭＥＳバッファーで３回洗浄し、２ｍＭ ＥＤＣおよび５ｍＭ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で２時間インキュベートした。次にＭＥＳバッファーで３回洗浄し、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ Ｌｙｓを含む溶液１ｍｌ中に分散させ、室温で４時間インキュベートした。次にこれをＰＢＳで洗浄しそれぞれの磁気微粒子デンドリマー１００μｇに対し、２００μｌの５ｍＭ スルホスクシンイミジルピリジルジチオプロピオンアミドヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）溶液に懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。磁気微粒子デンドリマーをＰＢＳで３回洗浄し、次に２００μｌの２０ｍＭジチオスレイトール中で２５℃で３０分間インキュベートした。上清を回収し、２−スルフィドリルピリジンの３４３ｎｍの吸収を測定することにより、磁気微粒子デンドリマー表面の１級アミン分子数を定量した。対照としては、アミノ酸を付加させていない磁気微粒子を用いた。結果を図２に示す。磁気微粒子数を算出するために、粒子を直径１００ｎｍの球形のマグネタイトとした時の粒子１個の重量、２．７２ｘ１０−１５ｇを基に、乾燥重量から換算した。
本発明の方法により得られるデンドリマーは、種々の物質の吸着剤、触媒の担体、遺伝子および蛋白質の分離用担体、および酵素や抗体の固定化担体等として有用である。また磁気ビーズはタイタープレートのような平板を固相とする方法と比べ、反応効率が良く、磁力によって外部からビーズの回収、離脱が可能であることから核酸抽出・精製や免疫測定などのバイオテクノロジー研究における機能性磁性担体としての汎用性が高い。
Claims (6)
- ２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつアミノ酸、これらから構成されるペブチド、もしくは、２つの官能基Ａとそれと反応し結合することのできる官能基Ｂを１つもつペブチドをビルディングブロックとして用い、官能基Ａを有する物質を中心核として用いて、水系で官能基ＡとＢの結合反応を行わせることによりデンドリマーを製造する方法。
- 請求項１記載の方法において、官能基Ａがアミノ基でありかつ官能基Ｂがカルボキシル基であるか、または官能基Ａがカルボキシル基でありかつ官能基Ｂがアミノ基であることを特徴とする方法。
- 請求項１記載の方法において、官能基Ａがアミノ基でありかつ官能基Ｂがチオール基であるか、または官能基Ａがチオール基でありかつ官能基Ｂがアミノ基であることを特徴とする方法。
- 請求項１ないし３に記載の方法において、リン脂質膜を中心核として用いることを特徴とする方法。
- 請求項１ないし３に記載の方法において、無機粒子を中心核として用いることを特徴とする方法。
- 請求項１ないし３に記載の方法において、有機粒子を中心核として用いることを特徴とする方法。
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