JP2005061854A - Mass spectrometry probe for cytosine, its derivative, guanine or its derivative - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a mass spectrometry probe which is used for probing cytosine, its derivative, guanine or its derivative and which has high-selective and high-quantitative properties for a target compound. <P>SOLUTION: The mass spectrometry probe for the cytosine or its derivative has a structure expressed by formula (I) (wherein, R<SB>1</SB>, R<SB>2</SB>and R<SB>3</SB>are independently 1-4C alkyl; and X<SB>1</SB>and X<SB>2</SB>are independently halogen; and n represents an integer of one or four). The probe has the high-selective property for the cytosine, its derivative, the guanine or its derivative, and can accurately carry out a mass spectrometry, and therefore, is useful for the mass spectrometry of a nucleic acid sample or an oxidation stress marker. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【００１０】
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘ_１及びＸ_２は互いに独立にハロゲン、ｎは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、一般式（ＩＩＩ）
【化６】

【００１２】
（式中、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘはハロゲン、ｍは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するグアニン又はその誘導体の質量分析用プローブを提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明のシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブは、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、特に好ましい化合物は、下記式（ＩＩ）で表される構造を有する（以下、式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物を「ＫＡＰ−ＮＢ０１」と呼ぶことがある）。
【００１４】
【化７】

【００１５】
シトシン又はその誘導体と、一般式（Ｉ）で示されるプローブ（以下、便宜的にプローブ（Ｉ）と呼ぶことがある）とは下記スキーム１に示すように反応し、結合する。
【００１６】
【化８】

スキーム１
【００１７】
上記反応式中、式（Ｖ）で示される化合物はシトシン又はその誘導体である。式（Ｖ）中、Ｒは水素又は任意の基である。上記反応式から明らかなように、Ｒは上記結合反応に寄与しないので、水素原子又は任意の基であってよい。Ｒが水素原子の場合は、一般式（Ｖ）で表される化合物はシトシンである。Ｒがリボースの場合、一般式（Ｖ）で表される化合物はシチジンであり、Ｒがデオキシリボースである場合にはデオキシシチジンであり、シチジンのリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがシチジル酸（シチジンモノホスフェート、ＣＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがシチジンジホスフェート（ＣＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、デオキシシチジンのデオキシリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジル酸（デオキシシチジンモノホスフェート、ｄＣＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジンジホスフェート（ｄＣＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）であり、これらは全て、本発明で言うシトシンの誘導体に包含される。さらに、ＣＭＰを含むＲＮＡ、ｄＣＭＰを含むＤＮＡも本発明で言うシトシンの誘導体に包含される。以上のシトシン誘導体が、好ましいシトシン誘導体として挙げられる。これらに加え、さらに、一般式（Ｖ）中のＲに限らず、プローブ（Ｉ）との結合に関与しない、ピリミジン環上の他の炭素原子が任意の置換基で置換されているものも本発明で言う、シトシンの誘導体に包含される。
【００１８】
プローブ（Ｉ）とシトシン又はその誘導体との結合反応は、好ましくは、例えば、０．１〜５．０ μｇの試料を、５０μＬのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解後、２００μＬの１ｍｇ／ｍＬのプローブ／リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、室温で５分間撹拌し、溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とすることにより行うことができるし、下記実施例に具体的に記載されている条件においても好ましく行うことができる。
【００１９】
また、上記の通り、本発明のグアニン又はその誘導体の質量分析用プローブは、上記一般式（ＩＩＩ）で表される構造を有する。一般式（ＩＩＩ）で表される化合物のうち、特に好ましい化合物は、下記式（ＩＶ）で表される構造を有する（以下、式（ＩＶ）で表される構造を有する化合物を「ＫＡＰ−ＮＢ０２」と呼ぶことがある）。
【００２０】
【化９】

【００２１】
グアニン又はその誘導体と、一般式（ＩＩＩ）で示されるプローブ（以下、便宜的にプローブ（ＩＩＩ）と呼ぶことがある）とは下記スキーム２に示すように反応し、結合する。
【００２２】
【化１０】

スキーム２
【００２３】
上記反応式中、式（ＶＩ）で示される化合物はグアニン又はその誘導体である。式（ＶＩ）中、Ｒは水素又は任意の基である。上記反応式から明らかなように、Ｒは上記結合反応に寄与しないので、水素原子又は任意の基であってよい。Ｒが水素原子の場合は、一般式（Ｖ）で表される化合物はグアニンである。Ｒがリボースの場合、一般式（Ｖ）で表される化合物はグアノシンであり、Ｒがデオキシリボースである場合にはデオキシグアノシンであり、グアノシンのリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがグアニル酸（グアノシンモノホスフェート、ＧＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、デオキシグアノシンのデオキシリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアニル酸（デオキシグアノシンモノホスフェート、ｄＧＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアノシンジホスフェート（ｄＧＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）であり、これらは全て、本発明で言うグアニンの誘導体に包含される。さらに、ＧＭＰを含むＲＮＡ、ｄＧＭＰを含むＤＮＡも本発明で言うグアニンの誘導体に包含される。以上のグアニン誘導体が、好ましいグアニン誘導体として挙げられる。さらに、一般式（ＶＩ）中のＲに限らず、プローブ（ＩＩＩ）との結合に関与しない、プリン環上の他の炭素原子が任意の置換基で置換されているものも本発明で言う、グアニンの誘導体に包含される。例えば、酸化ストレスマーカーとして知られている８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）がこの例であり、８−ＯＨｄＧもグアニン誘導体の好ましい例として挙げられる。
【００２４】
プローブ（ＩＩＩ）とグアニン又はその誘導体との結合反応は、好ましくは、例えば、０．１〜５．０μｇの試料を、５０μＬのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解後、２００μＬの１ｍｇ／ｍＬのプローブ／リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、室温で５分間撹拌し、溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とすることにより行うことができるし、下記実施例に具体的に記載されている条件においても好ましく行うことができる。
【００２５】
プローブ（Ｉ）及びプローブ（ＩＩＩ）は、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、これらのプローブの製造方法が具体的に記載されている。
【００２６】
本発明のプローブを用いた質量分析は、試料化合物と本発明のプローブを反応、結合させた後、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、試料のイオン化を伴う、あらゆる液状試料の質量分析方法に適用可能である。好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。
【００２７】
本発明のプローブを用いた場合には、試料化合物がプローブと結合することによって確実にイオン化されており、結合後のプローブ由来部分の質量も既知であるから、通常の質量分析により高感度、高精度に定量することができる。なお、観察されたピーク値（ｍ／ｚ値）からプローブの分子量を差し引くことにより試料化合物の分子量を算出することができる。
【００２８】
質量分析用プローブはヌクレオチドのみでなくポリマー状態の核酸にも有効に用いることができる。例えば数残基の核酸があれば、ｃｔｔａというような配列があれば、ｃまたはａ特異的に質量分析用プローブを付加することにより一価の正電荷を持ったＤＮＡ鎖を作製することができ、効果的に分子量を測定することが可能である。複数の塩基に対するプローブで反応を行なうことも可能であるが、その際は例えばｃｔｔａという配列にｔ特異的プローブを付加した場合は２価の正電荷をもつこととなり、質量を２で除した価が質量分析の結果として得られる。
【００２９】
さらにこれと同様にＰＣＲの際にプライマーに質量分析用プローブをあらかじめ付加しておくことができる。これを用いてＰＣＲを行なえば必ずＰＣＲ産物にはプライマー配列が１つ含まれるため、効果的に１価の正電荷をもつものを作製することができる。シークエンシング解析に主に用いられるダイデオキシＰＣＲ法に関しても同様に用いられると考えられる。分子量レベルで産物の差が観察されれば、一塩基多型の確認にも用いられる（補足：通常の電気泳動法では塩基数のレベルでの分離しかなされないため、同じ塩基数であればその配列中の塩基の構成が異なっても見分けることは困難である。しかし質量分析を用いれば分子量レベルでの差を見分けられるため、構成塩基の違いまで検出できる）。
【００３０】
またヌクレアーゼなどの酵素を用いて末端から一塩基ずつ核酸を切断し、それぞれ切出されてくる断片に質量分析用プローブを付加し順に質量分析により塩基を確認するような方法に基づいたＤＮＡのシークエンス解析も可能であると期待される。
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１ ＫＡＰ−ＮＢ０１の合成
【化１１】

【００３３】
２−アミノ−エチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル （化合物（２））の合成
【００３４】
【化１２】

【００３５】
反応容器を窒素置換し、エタノール２１ ｍｌ を加えてから氷浴につけた。エチレンジアミン（１） ２２．５ ｇ （３７４．４ ｍｍｏｌ， ２３．４ ｅｑ） を反応容器にゆっくりと加え、その後トリエチルアミン１．６２ ｇ （１６．０ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ） を加えて撹拌した。エタノール１０ ｍｌ に溶かしたジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート ３．４９ ｇ （１６．０ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ） を滴下して加えていき、氷浴中で３０ 分間撹拌し、その後室温で２時間反応を行った。反応後エタノールを減圧留去し、残渣を塩化メチレンに溶かした。１Ｎ 酢酸水溶液２００ ｍｌ を伴って３回抽出を行った。得られた水層に１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えｐＨを１０とした。得られた水層を塩化メチレンで再度３回抽出を行った。炭酸カリウムで乾燥後、塩化メチレンを減圧留去し、薄く黄色い透明液体状物質（１．８９ ｇ， ｙｉｅｌｄ ： ７３．８５ ％） を得た。
【００３６】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ １０ ： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．１４
１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ， ｒ．ｔ．， δ／ｐｐｍ） １．３３（ｓ， ２Ｈ， −ＣＨ_２ＮＨ_２） ， １．４５（ｓ， ９Ｈ， ｔ−Ｂｕｔｙｌ） ， ２．８０（ｔ， Ｊ ＝ ６．０Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２） ， ３．１８（ｑ， Ｊ ＝ ５．７Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２） ， ４．９１（ｂｒ， １Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−）ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ ＋ Ｈ ］^＋ ＝ １６１．２３， ［ Ｍ ＋ Ｎａ ］^＋ ＝ １８３．２４
【００３７】
［２−（４−アセチル−ベンゾイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル （化合物（３））の合成
【００３８】
【化１３】

【００３９】
反応容器を窒素置換し、ＤＭＦ ３０ ｍｌ、及び化合物（２） １．５０ ｇ （９．３６ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ）を加えて氷浴においた。ｐ−アセチル安息香酸１．５４ ｇ （９．３６ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ）、ＨＯＢｔ １．４３ ｇ （９．３６ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ）、トリエチルアミン０．９９ ｇ （９．８３ ｍｍｏｌ， １．０５ ｅｑ） を加え攪拌した。ＤＭＦ １０ ｍｌで懸濁したＥＤＣ １．８８ ｇ （９．８３ ｍｍｏｌ， １．０５ ｅｑ） をゆっくり加えた。もう一度ＤＭＦ １０ ｍｌを用いてＥＤＣの残りを加えた。氷浴で３０分、その後室温で３時間反応を行った。反応終了後、反応液に水を加え、ジエチルエーテルを用いて抽出を行った。得られたエーテル層を飽和食塩水で洗い、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ １０ ： １ ｖ／ｖ）で単離精製し、白色の固体状物質（２．０２ ｇ， ｙｉｅｌｄ ： ７０．４０ ％） を得た。
【００４０】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ １０ ： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．５３
１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ， ＴＭＳ， ｒ．ｔ．， δ／ｐｐｍ） １．４１（ｓ， ９Ｈ， ｔ−Ｂｕｔｙｌ） ， ２．６３（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３ＣＯ− ） ， ３．２９（ｔ， Ｊ ＝ １．８Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−） ， ３．４６（ｔ， Ｊ ＝ ６．０Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−） ， ７．９２（ｄ， Ｊ ＝ ８．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＮＨＣＯＡｒＨ ） ， ８．０６（ｄ， Ｊ ＝ ８．７Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ_３ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ ＋ Ｎａ ］^＋ ＝ ３２９．４４
【００４１】
４−アセチル−Ｎ−（２−アミノ−エチル）−ベンズアミド （化合物（４））の合成
【００４２】
【化１４】

【００４３】
反応容器に乾燥塩化メチレン５０ ｍｌ、化合物（３） ４１１．４ ｍｇ （１．３４ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ）を加えて氷浴においた。ＴＦＡ ６．１２ ｇ （５３．７ ｍｍｏｌ， ４０．０ ｅｑ） を加え、氷浴中で１０分、その後室温で１時間反応した。原料の消失確認後、溶媒、ＴＦＡを減圧中で攪拌して取り除き、黄白色の油状物質（２．３３ ｇ， 収率測定不可能）を得た。単離精製は行わずに次の反応に用いた。
【００４４】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ １０ ： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．０８
ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ ＋ Ｈ ］^＋ ＝ ２０７．２８
【００４５】
ヨウ化 ［２−（４−アセチル−ベンゾイルアミノ）−エチル］−トリエチルアンモニウム （化合物（５））の合成
【００４６】
【化１５】

【００４７】
反応容器を窒素置換したのち、アセトン３０ ｍｌ、化合物（４） １．０ ｇ （４．９０ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ）、Ｋ_２ＣＯ_３ ２．７ ｇ （１９．６ ｍｍｏｌ， ４．０ ｅｑ）、ヨウ化エチル１１．５ ｇ （７３．５ ｍｍｏｌ， １５．０ ｅｑ）を順次加えた。オイルバスで還流し、二日間反応を行った。原料の消失を確認後、反応溶液をろ過し、余分なＫ_２ＣＯ_３を取り除いた。残渣をメタノールで洗浄した後溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ ７ ： １ → ３ ： １ ｖ／ｖ） で単離精製し、粘りのある白色の固体状物質（１．５１ ｇ， ｙｉｅｌｄ ： ７３．４５ ％）を得た。
【００４８】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ ７： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．２０
１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ， ＴＭＳ， ｒ．ｔ．， δ／ｐｐｍ） １．３８（ｔ， Ｊ ＝ ７．２Ｈｚ， ９Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_３ ） ， ２．６４（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３ＣＯ− ） ， ３．４６（ｑ， Ｊ ＝ ７．２Ｈｚ， ６Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_３） ， ３．８０（ｔ， Ｊ ＝ ６．９Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−） ， ７．９９（ｄ， Ｊ ＝ １．５Ｈｚ， ２Ｈ， ＮＨＣＯＡｒＨ ） ， ８．０７（ｄ， Ｊ ＝ １．５Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ_３ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ − Ｉ ］^＋ ＝ ２９１．４４
【００４９】
｛２−［４−（２−ブロモ−アセチル）−ベンゾイルアミノ］−エチル｝−トリエチルアンモニウムブロミド （化合物（６）（ＫＡＰ−ＮＢ０１））の合成
【００５０】
【化１６】

【００５１】
反応容器に化合物（５） １００ ｍｇ （０．２３９ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ） と脱水メタノール ２８４．０ μｌ加え高速で攪拌した。Ｂｒ_２をゆっくりと滴下し、室温で１時間反応を行った後５０ ℃で３０分反応を行った。反応物の生成をＭＳで確認後、α−ブロモジエチルケタール体の生成を抑えるために水を１４２．０ μｌ加え，ついで同量のメタノールも加えた。さらにＢｒ_２を２．４ μｌ加えてから５０ ℃で３０分反応を行った。その後、フラスコを０ ℃〜−５ ℃まで冷やし、上澄み液を取り除いた。ＭｅＯＨ ： Ｈ_２Ｏ ＝ ２ ： １の溶液を少量加えてから更に冷やし、上澄み液を取り除いた。高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ， アセトン）で単離精製し、赤色の油状物質（６９．０ ｍｇ， 収率： ６４．１０ ％）を得た。
【００５２】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ ７ ： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．２１
１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ， ＴＭＳ， ｒ．ｔ．， δ／ｐｐｍ） １．３９（ｔ， Ｊ ＝ ７．１Ｈｚ， ９Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_３ ） ， ３．４５（ｑ， Ｊ ＝ ７．１Ｈｚ， ６Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_３） ， ３．８０（ｔ， Ｊ ＝ ７．３Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−） ， ４．７０（ｓ， ２Ｈ， ＢｒＣＨ_２ＣＯ−） ， ７．９９（ｄ， Ｊ ＝ ８．３Ｈｚ， ２Ｈ， ＮＨＣＯＡｒＨ ） ， ８．１２（ｄ， Ｊ ＝ ８．３Ｈｚ， ２Ｈ， ＢｒＣＨ_２ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ − Ｂｒ ］^＋ ＝ ３６９．５５， ３７１．５５
【００５３】
実施例２ ＫＡＰ−ＮＢ０２の合成
【化１７】

【００５４】
化合物（５）の調製までは実施例１と同じ方法で行った。
【００５５】
トリエチル−｛２−［４−（２−オキソ−アセチル）−ベンゾイルアミノ］−エチル｝−アンモニウムブロミド（化合物７）（ＫＡＰ−ＮＢ０２））の合成
【００５６】
【化１８】

【００５７】
反応容器にＤＭＳＯ ０．４ ｍｌ、Ｈ_２Ｏ ４３．３ μｌ、化合物（５） １００ ｍｇ （０．２３９ ｍｍｏｌ， １．０ ｅｑ） を加えて反応容器内をアスピレーターで減圧状態にしながら高速で攪拌した。そこに４８ ％ ＨＢｒ １２２．０ μｌ （１．０８ ｍｍｏｌ， ４．５ ｅｑ）を滴下し、４５ ℃で３時間反応させた。原料の消失を確認後、反応溶液を氷の中に注ぎ込んで反応を停止させた。そこにアセトンを加えて溶かした後、トルエンを加えて共沸させるなどしてＨ_２Ｏを減圧留去した。高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ， アセトニトリル：Ｈ_２Ｏ ＝ ９ ： １ ｖ／ｖ）で単離精製し、粘りのある黄色状物質（７１．３ ｍｇ， 収率： ７４．０６ ％）を得た。
【００５８】
ＴＬＣ （ＳｉＯ_２， クロロホルム：メタノール ＝ １０ ： １ ｖ／ｖ） Ｒｆ ＝ ０．１４
１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＳＯＣＤ_３， ＴＭＳ， ｒ．ｔ．， δ／ｐｐｍ） １．２３（ｔ， Ｊ ＝ ６．９Ｈｚ， ９Ｈ， −ＣＨ_２ＣＨ_３ ） ， ３．６２（ｔ， Ｊ ＝ ６．６Ｈｚ， ２Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−） ， ５．６８（ｔ， Ｊ ＝ ６．９Ｈｚ， １Ｈ， −ＣＯＮＨＣＨ_２−） ， ６．９１（ｄ， Ｊ ＝ ７．２Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ（ＯＨ）_２ ） ， ７．９７（ｄ， Ｊ ＝ ８．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＮＨＣＯＡｒＨ） ， ８．１７（ｄ， Ｊ ＝ ８．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ（ＯＨ）_２ＣＯＡｒＨ） ， ９．０３（ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， １Ｈ， −ＣＨ（ＯＨ）_２）
ＥＳＩ−ＴＯＦ （＋） ： ［ Ｍ ＋ ＣＨ_３ＯＨ − Ｂｒ ］^＋ ＝ ３３７．１４， ［ Ｍ ＋ Ｈ_２Ｏ − Ｂｒ］^＋ ＝ ３２３．１５
【００５９】
実施例３ ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシトシンの質量分析
試料としてシトシンを用い、ＫＡＰ−ＮＢ０１との反応性の評価を行なった。詳しい反応条件を以下に示す。シトシンの６６．６７ｍＭ水溶液３０μｌ （０．２２ｍｇ， ２．０μｍｏｌ） 、ＫＡＰ−ＮＢ０１の２８．５７ｍＭアセトニトリル溶液１７．５μｌ （２．２５ｍｇ， ０．５μｍｏｌ） とアセトニトリル５２．５μｌを豆試験管に加え、８０℃、１３５分間、湯浴で反応させた。反応終了後、２０μｌの反応溶液を取り、５００倍にメタノールで希釈してＥＳＩ−ＭＳ試料とした（１．０×１０−５Ｍ）。
【００６０】
ＥＳＩ−ＭＳに用いた装置及び条件は以下の通りであった。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭａｒｉｎｅｒを用いて測定した。条件は以下のとおりであった。
スプレーチップポテンシャル： ３１７４．６１〔Ｖ〕
ノズルポテンシャル： ６０．０６〔Ｖ〕
Ｑｕａｄ ＲＦ電圧： ９００．１５〔Ｖ〕 （シトシンのみ７００〔Ｖ〕）
検出器電圧： ２１９９．７１〔Ｖ〕
ネブライザー：Ｎ２ Ｇａｓ流速： ０．３９０ ｌ／分
溶媒： メタノール
流速： １１．５μｌ／分
【００６１】
結果を図１に示す。図１に示されるように、分子量である３８２のピークがメインピークとして観察された。これにより、本発明のプローブ（Ｉ）で、シトシンを質量分析できることが明らかになった。
【００６２】
実施例４ ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシチジンの質量分析
シチジンとプローブを反応させ、その反応性を評価した。反応の詳細は次のとおりである。シチジンの６６．６７ｍＭ水溶液もしくはＤＭＦ溶液３０μｌ （０．４９ｍｇ， ２．０μｍｏｌ） 、ＫＡＰ−ＮＢ０１の２８．５７ｍＭアセトニトリル溶液１７．５μｌ （２．２５ｍｇ， ０．５μｍｏｌ） とアセトニトリル５２．５μｌが豆試験管に加え、８０℃、１３５分間、湯浴中で反応させた。
シチジンのＤＭＦ溶液を用いた場合には、８０℃、９０分間反応させた。反応終了後、２０μｌの反応溶液を取り、５００倍にメタノールで希釈してＥＳＩ−ＭＳ試料とした（１．０×１０−５Ｍ）。ＥＳＩ−ＭＳは実施例３と同様にして行った。
【００６３】
結果を図２に示す。図２の（Ａ）は、溶媒がアセトニトリル／水の場合、（Ｂ）は溶媒がアセトニトリル／ＤＭＦの場合の結果を示す。図２に示されるように、いずれの場合も反応物のピークである、５１４のピークがメインピークとして観察された。
これにより、本発明のプローブ（ＩＩ）で、シチジンを質量分析できることが明らかになった。
【００６４】
実施例５ ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシチジンの濃度定量測定
シチジンの濃度を種々変化させたことを除き、実施例４と同様にしてシチジンの質量分析を行った。
【００６５】
結果を図３に示す。なお、図３の縦軸は強度比（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｒａｔｉｏ）である。図３の（Ｂ）は、図３の（Ａ）の５ｍＭから０．１ ｍＭの範囲を拡大して示すものである。図３に示されるように、いずれの溶媒を用いた場合も、濃度に比例した非常に直線性の高い検量線が得られた。このことから、本発明のプローブ（Ｉ）を用いることにより、正確にシチジンの質量分析を行うことができることが明らかになった。
【００６６】
実施例６ ＫＡＰ−ＮＢ０１のシトシン又はシチジンへの選択性
反応時間を種々変えたことを除き、実施例３（シトシンの場合）又は実施例４（シチジン、アデノシン、グアノシン及びチミジンの場合）と同様にして、ＫＡＰ−ＮＢ０１と各試料との結合反応を行い（ただし、溶媒はアセトニトリル／水）、質量分析を行った。
【００６７】
結果を図４に示す。なお、図４の縦軸は強度比である。図４に示されるように、ＫＡＰ−ＮＢ０１は、シトシン及びシチジンのみと結合し、これらの質量分析を行うことができたが、他の３種類のヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン及びチミジンとは全く反応しなかった。このことから、本発明のプローブ（Ｉ）が、シトシン及びその誘導体に対して極めて高い選択性を有していることが確認された。
【００６８】
実施例７ ＫＡＰ−ＮＢ０２を用いたデオキシグアノシン及び８−ＯＨｄＧの質量分析
２’−デオキシグアノシンと酸化ストレスの指標としても用いられている８−ＯＨｄＧを用いてＫＡＰ−ＮＢ０２と反応させ、それらの反応性を評価しピークを比較した。その反応の詳細は次のとおりである。２’−デオキシグアノシン１．１３ ｍｇ もしくは、８−ＯＨｄＧ １．１３ ｍｇ（両４．０ μｍｏｌ） とＫＡＰ−ＮＢ０２ １．６１ ｍｇ （４．０ μｍｏｌ）をサンプル管に加え、そこにアセトニトリル６６．３μｌ、水１３２．５μｌ、５０ｍＭ、ｐＨ６．０に調整したリン酸バッファを６６．３μｌをさらにそれぞれ加えた。攪拌槽を使い湯浴中で４５ ℃で６０分間反応させた。反応液を１５００倍にメスアップして１．０×１０^−５Ｍのメタノール試料溶液とし、実施例３と同様にＥＳＩ−ＭＳ測定を行なった。なお、この二つの試料は、グアニンの８’位が水素かヒドロキシル基かの違いのみである。
【００６９】
結果を図５に示す。図５の左側の図が２’−デオキシグアノシンについての結果、右側の図が８−ＯＨｄＧについての結果を示す。図５の２つの図を比べると分かるとおり、反応物のピークは試料の分子量の差である１６の差でピークが検出されていることが分かる。このことから、本発明のプローブ（ＩＩＩ）により、デオキシグアノシン及びその誘導体を非常に正確に質量分析できることが確認された。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体を、高い選択性を持って正確に質量分析することができる質量分析用プローブが提供された。本発明のプローブは、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体に対して高い選択性を有し、これらを正確に質量分析することができるので、核酸試料の質量分析や、酸化ストレスマーカーの質量分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例のプローブを用い、シトシンを質量分析した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例のプローブを用い、シチジンを質量分析した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例のプローブを用い、シチジンの濃度定量測定を行った結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例のプローブを用い、シトシン及び各種ヌクレオシドの質量分析を、結合反応の時間を変えて行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例のプローブを用い、デオキシグアノシン及び８−ＯＨｄＧの質量分析を行った結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a probe for mass spectrometry of cytosine or a derivative thereof or guanine or a derivative thereof.
[0002]
[Prior art]
Currently, mass spectrometry is a method that can quantify a sample in a specimen with the highest sensitivity and accuracy. When measuring a liquid sample using mass spectrometry, it is important to select an ionization method in accordance with the properties of the compound. For example, when using properly depending on the instability factor of the compound, it can be roughly divided into two types, hard ionization and soft ionization. Examples of the former method include electron ionization, chemical ionization, and atmospheric pressure ionization, and examples of the latter include electrospray ionization, matrix-assisted laser desorption ionization, and fast atom bombardment ionization.
[0003]
On the other hand, recently, a technique (LC / MS) for identifying a sample separated by high performance liquid chromatography using mass spectrometry online is frequently used in the fields of chemistry and biology. In this case, since the ionization method having good compatibility with liquid chromatography is a method of directly ionizing a solution sample flowing out from the capillary tip, the latter method corresponds to the method described above. Among these, electrospray ionization mass spectrometers and high-performance liquid chromatography devices connected on-line are currently the most widely used, and are essential hormones such as proteins and carbohydrates. The power is fully demonstrated to identify.
In the case of electrospray ionization, the molecular ion peak of the sample is very rarely detected and is usually observed as a pseudo-molecular ion peak added with sodium or the like, or in LC / MS, ammonium acetate, formic acid, A method of assisting ionization of a sample by mixing a protic solvent such as acetic acid is employed.
[0004]
As a means for assisting ionization in mass spectrometry of a liquid sample, a technique of adding a protic solvent to a mobile phase of liquid chromatography is generally used in LC / MS. However, i) When ammonium acetate is in the negative ion mode, the sample ion and ammonium ion are paired to reduce the sensitivity. Ii) When trifluoroacetic acid is in the positive ion mode, the sample ion and trifluoroacetate ion are paired. In the negative ion mode, ionization is disturbed with some exceptions. Iii) In acetonitrile, an acid must be added, and in this case, ammonium acetate does not dissolve, so it should be used. Some disadvantages such as inability to do so have been pointed out.
[0005]
In order to solve the above problem, the group of the inventors of the present application uses, as a probe, a compound having a group that ionizes in a solvent and a functional group that reacts with a functional group in a sample compound and covalently bonds in one molecule. The idea is that the sample compound can be efficiently ionized by covalently bonding the probe to the sample compound, and the sample compound ionized by such a probe can be quantified with high sensitivity by electrospray mass spectrometry. Was experimentally confirmed and a patent application was filed (WO 02/04936).
[0006]
[Patent Document 1] International Publication No. WO 02/04936
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Among the probes for mass spectrometry described in Patent Document 1, it is a probe for mass spectrometry of cytosine or a derivative thereof or guanine or a derivative thereof, which is to provide a probe with high selectivity and quantification with respect to a target compound. .
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that when a compound having a specific structure is used as a probe for mass spectrometry of cytosine or a derivative thereof or guanine or a derivative thereof, the selectivity and quantification for the target compound are enhanced. The headline and the present invention were completed.
[0009]
That is, the present invention relates to the general formula (I)
[Chemical formula 5]

[0010]
(Wherein R ₁ , R ₂ And R ₃ Are independently of each other an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, X ₁ And X ₂ Provides a probe for mass spectrometry of cytosine or a derivative thereof having a structure represented by:
[0011]
Furthermore, the present invention provides a compound of the general formula (III)
[Chemical 6]

[0012]
(Wherein R ₄ , R ₅ And R ₆ Provides a probe for mass spectrometry of guanine or a derivative thereof having a structure represented by: an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, X is halogen, and m is an integer of 1 to 4 independently of each other.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As described above, the mass spectrometric probe of cytosine or a derivative thereof of the present invention has a structure represented by the above general formula (I). Among the compounds represented by the general formula (I), a particularly preferable compound has a structure represented by the following formula (II) (hereinafter, a compound having a structure represented by the formula (II) is referred to as “KAP-NB01”. ”).
[0014]
[Chemical 7]

[0015]
Cytosine or a derivative thereof and a probe represented by general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as probe (I) for convenience) react and bind as shown in the following scheme 1.
[0016]
[Chemical 8]

Scheme 1
[0017]
In the above reaction formula, the compound represented by the formula (V) is cytosine or a derivative thereof. In the formula (V), R is hydrogen or an arbitrary group. As is clear from the above reaction formula, R does not contribute to the bonding reaction, and thus may be a hydrogen atom or an arbitrary group. When R is a hydrogen atom, the compound represented by the general formula (V) is cytosine. When R is ribose, the compound represented by the general formula (V) is cytidine, and when R is deoxyribose, it is deoxycytidine, and a phosphate further bound to ribose of cytidine. Cytidyl acid (cytidine monophosphate, CMP), one phosphate ester bound to its phosphate moiety is cytidine diphosphate (CDP), and one phosphate ester bound to its phosphate moiety is cytidine Triphosphate (CTP), deoxycytidine deoxyribose bound with one phosphate ester, deoxycytidylic acid (deoxycytidine monophosphate, dCMP), and further phosphate bound to its phosphate moiety Deoxycytidine diphosphate (dCDP), and Which phosphoric acid ester is bonded one to phosphate moiety is a deoxycytidine triphosphate (dCTP), all of which are encompassed by the derivatives of cytosine in the present invention. Further, RNA containing CMP and DNA containing dCMP are also encompassed by the cytosine derivatives referred to in the present invention. The above cytosine derivatives are mentioned as preferred cytosine derivatives. In addition to these, not only R in the general formula (V) but also other carbon atoms on the pyrimidine ring that are not involved in binding to the probe (I) are substituted with any substituents. Included in the cytosine derivatives referred to in the invention.
[0018]
The binding reaction between the probe (I) and cytosine or a derivative thereof is preferably performed by, for example, dissolving 0.1 to 5.0 μg of a sample in 50 μL of a phosphate buffer solution (pH 7.0) and then 200 μL of 1 mg. / ML probe / phosphate buffer solution (pH 7.0) is added, stirred at room temperature for 5 minutes, the solvent is distilled off under reduced pressure, dissolved in the eluent, and used as a sample solution. It can be preferably carried out even under the conditions specifically described in the examples.
[0019]
As described above, the probe for mass spectrometry of guanine or a derivative thereof of the present invention has a structure represented by the above general formula (III). Among the compounds represented by the general formula (III), a particularly preferable compound has a structure represented by the following formula (IV) (hereinafter, a compound having a structure represented by the formula (IV) is referred to as “KAP-NB02”. ”).
[0020]
[Chemical 9]

[0021]
Guanine or a derivative thereof and a probe represented by the general formula (III) (hereinafter sometimes referred to as probe (III) for convenience) react and bind as shown in Scheme 2 below.
[0022]
[Chemical Formula 10]

Scheme 2
[0023]
In the above reaction formula, the compound represented by the formula (VI) is guanine or a derivative thereof. In the formula (VI), R is hydrogen or an arbitrary group. As is clear from the above reaction formula, R does not contribute to the bonding reaction, and thus may be a hydrogen atom or an arbitrary group. When R is a hydrogen atom, the compound represented by the general formula (V) is guanine. When R is ribose, the compound represented by the general formula (V) is guanosine. When R is deoxyribose, it is deoxyguanosine, and one having a phosphate bound to the ribose of guanosine. Guanylic acid (guanosine monophosphate, GMP), a guanosine diphosphate (GDP) with one phosphate ester bound to its phosphate moiety, and a guanosine with one phosphate ester bound to its phosphate moiety Triphosphate (GTP), deoxyguanosine deoxyribose bound with one phosphate ester, deoxyguanylic acid (deoxyguanosine monophosphate, dGMP), and phosphoric acid moiety bound with one phosphate ester Deoxyguanosine diphosphate (dG P), a further phosphoric acid esters in the phosphate moiety is one bound ones deoxyguanosine triphosphate (dGTP), all of which are encompassed by the derivatives of guanine in the present invention. Furthermore, RNA containing GMP and DNA containing dGMP are also included in the guanine derivative referred to in the present invention. The above guanine derivatives are mentioned as preferable guanine derivatives. Furthermore, not only R in the general formula (VI) but also other carbon atoms on the purine ring that are not involved in the bond with the probe (III) are also substituted in the present invention. Included in derivatives of guanine. For example, 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG), which is known as an oxidative stress marker, is an example of this, and 8-OHdG is also a preferred example of a guanine derivative.
[0024]
The binding reaction between the probe (III) and guanine or a derivative thereof is preferably performed by, for example, dissolving 0.1 to 5.0 μg of a sample in 50 μL of a phosphate buffer solution (pH 7.0), and then adding 200 μL of 1 mg / mg of the sample. It can be carried out by adding mL of probe / phosphate buffer solution (pH 7.0), stirring at room temperature for 5 minutes, distilling off the solvent under reduced pressure, and then dissolving in the eluent to obtain a sample solution. Can also be preferably carried out under the conditions specifically described in.
[0025]
Probe (I) and probe (III) can be easily synthesized by those skilled in the art based on a known method. The following examples also specifically describe the methods for producing these probes.
[0026]
Mass spectrometry using the probe of the present invention can be performed in the same manner as mass spectrometry of a normal liquid sample after reacting and binding the sample compound and the probe of the present invention. The probe of the present invention can be applied to any liquid sample mass spectrometry method involving sample ionization. Examples of preferred liquid sample mass spectrometry methods include electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, thermospray ionization mass spectrometry, particle beam mass spectrometry, frit fast atom bombardment mass spectrometry, and the like. However, it is not limited to these. Further, it can be applied not only to normal mass spectrometry but also to mass spectrometry performed in an analyzer integrated with a reaction vessel. For example, in an analytical apparatus in which a reaction tank or reaction coil is incorporated in an analytical apparatus, such as a post-column reaction type high-performance liquid chromatography apparatus or a flow injection analytical apparatus, for mass spectrometry performed downstream of the reaction tank or reaction coil. The probe of the present invention can be applied. In this case, the probe can be mixed with the sample upstream of the reaction vessel or reaction coil and the binding reaction can be performed in the reaction vessel or reaction coil. In addition, mass spectrometry itself can be easily performed using a commercially available apparatus according to the instructions attached to the apparatus.
[0027]
When the probe of the present invention is used, the sample compound is reliably ionized by binding to the probe, and the mass of the probe-derived portion after binding is also known. Can be quantified with accuracy. The molecular weight of the sample compound can be calculated by subtracting the molecular weight of the probe from the observed peak value (m / z value).
[0028]
The probe for mass spectrometry can be effectively used not only for nucleotides but also for polymer nucleic acids. For example, if there is a nucleic acid of several residues, if there is a sequence such as ctta, a DNA strand having a monovalent positive charge can be prepared by adding a mass spectrometric probe specifically for c or a. It is possible to effectively measure the molecular weight. It is also possible to carry out the reaction with probes for a plurality of bases. In this case, for example, when a t-specific probe is added to the sequence ctta, it has a bivalent positive charge, and the value obtained by dividing the mass by 2 Is obtained as a result of mass spectrometry.
[0029]
Further, in the same manner as this, a probe for mass spectrometry can be added in advance to the primer during PCR. When PCR is carried out using this, a PCR product always contains one primer sequence, so that a product having a monovalent positive charge can be produced effectively. It is considered that the dideoxy PCR method mainly used for sequencing analysis is used in the same manner. If a product difference is observed at the molecular weight level, it can also be used to confirm single nucleotide polymorphisms. (Supplement: normal electrophoresis only separates at the base number level. It is difficult to distinguish even if the base composition in the sequence is different, but the difference in the molecular weight level can be detected by using mass spectrometry, so the difference in the constituent base can be detected).
[0030]
In addition, a DNA sequence based on a method in which a nucleic acid is cleaved one base at a time using an enzyme such as a nuclease, a probe for mass spectrometry is added to each fragment, and the base is confirmed by mass spectrometry in order. Analysis is also expected to be possible.
[0031]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0032]
Example 1 Synthesis of KAP-NB01
Embedded image

[0033]
Synthesis of 2-amino-ethyl) -carbamic acid tert-butyl ester (compound (2))
[0034]
Embedded image

[0035]
The reaction vessel was purged with nitrogen, 21 ml of ethanol was added and then placed in an ice bath. Ethylenediamine (1) 22.5 g (374.4 mmol, 23.4 eq) was slowly added to the reaction vessel, and then triethylamine 1.62 g (16.0 mmol, 1.0 eq) was added and stirred. Di-tert-butyl dicarbonate 3.49 g (16.0 mmol, 1.0 eq) dissolved in 10 ml of ethanol was added dropwise, stirred in an ice bath for 30 minutes, and then reacted at room temperature for 2 hours. Went. After the reaction, ethanol was distilled off under reduced pressure, and the residue was dissolved in methylene chloride. Extraction was performed three times with 200 ml of 1N aqueous acetic acid. A 1N NaOH aqueous solution was added to the obtained aqueous layer to adjust the pH to 10. The resulting aqueous layer was extracted again with methylene chloride three times. After drying with potassium carbonate, methylene chloride was distilled off under reduced pressure to obtain a pale yellow transparent liquid substance (1.89 g, yield: 73.85%).
[0036]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 10: 1 v / v) Rf = 0.14
1H-NMR (300 MHz, CDCl ₃ , TMS, r. t. , Δ / ppm) 1.33 (s, 2H, —CH ₂ NH ₂ ), 1.45 (s, 9H, t-Butyl), 2.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 3.18 (q, J = 5.7 Hz, 2H, -CH ₂ CH ₂ NH ₂ ), 4.91 (br, 1H, -CONHCH ₂ -) ESI-TOF (+): [M + H] ⁺ = 161.23, [M + Na] ⁺ = 183.24
[0037]
Synthesis of [2- (4-acetyl-benzoylamino) -ethyl] -carbamic acid tert-butyl ester (compound (3))
[0038]
Embedded image

[0039]
The reaction vessel was purged with nitrogen, and 30 ml of DMF and 1.50 g (9.36 mmol, 1.0 eq) of compound (2) were added and placed in an ice bath. p-acetylbenzoic acid 1.54 g (9.36 mmol, 1.0 eq), HOBt 1.43 g (9.36 mmol, 1.0 eq), triethylamine 0.99 g (9.83 mmol, 1 .05 eq) was added and stirred. 1.88 g (9.83 mmol, 1.05 eq) of EDC suspended in 10 ml of DMF was slowly added. The remainder of the EDC was added again using 10 ml of DMF. The reaction was performed in an ice bath for 30 minutes and then at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, water was added to the reaction solution, and extraction was performed using diethyl ether. The obtained ether layer was washed with saturated brine, and dried using sodium sulfate. After removing the solvent under reduced pressure, column chromatography (SiO 2 ₂ , Chloroform: methanol = 10: 1 v / v) to obtain a white solid substance (2.02 g, yield: 70.40%).
[0040]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 10: 1 v / v) Rf = 0.53
1H-NMR (300 MHz, CD ₃ OD, TMS, r. t. , Δ / ppm) 1.41 (s, 9H, t-Butyl), 2.63 (s, 3H, CH ₃ CO-), 3.29 (t, J = 1.8 Hz, 2H, -CH ₂ CH ₂ N-), 3.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CONHCH ₂ −), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H, NHCOArH), 8.06 (d, J = 8.7 Hz, 2H, CH ₃ COArH)
ESI-TOF (+): [M + Na] ⁺ = 329.44
[0041]
Synthesis of 4-acetyl-N- (2-amino-ethyl) -benzamide (compound (4))
[0042]
Embedded image

[0043]
To the reaction vessel, 50 ml of dry methylene chloride and 411.4 mg (1.34 mmol, 1.0 eq) of compound (3) were added and placed in an ice bath. 6.12 g (53.7 mmol, 40.0 eq) of TFA was added, and the mixture was reacted in an ice bath for 10 minutes and then at room temperature for 1 hour. After confirming disappearance of the raw materials, the solvent and TFA were removed by stirring under reduced pressure to obtain a yellowish white oily substance (2.33 g, yield measurement impossible). The product was used for the next reaction without isolation and purification.
[0044]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 10: 1 v / v) Rf = 0.08
ESI-TOF (+): [M + H] ⁺ = 207.28
[0045]
Synthesis of [2- (4-acetyl-benzoylamino) -ethyl] -triethylammonium iodide (compound (5))
[0046]
Embedded image

[0047]
After substituting the reaction vessel with nitrogen, 30 ml of acetone, 1.0 g of compound (4) (4.90 mmol, 1.0 eq), K ₂ CO ₃ 2.7 g (19.6 mmol, 4.0 eq) and ethyl iodide 11.5 g (73.5 mmol, 15.0 eq) were sequentially added. The mixture was refluxed in an oil bath and reacted for 2 days. After confirming the disappearance of the raw materials, the reaction solution is filtered to remove excess K ₂ CO ₃ Removed. The residue was washed with methanol and the solvent was distilled off under reduced pressure. Column chromatography (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 7: 1 → 3: 1 v / v) to obtain a sticky white solid substance (1.51 g, yield: 73.45%).
[0048]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 7: 1 v / v) Rf = 0.20
1H-NMR (300 MHz, CD ₃ OD, TMS, r. t. , Δ / ppm) 1.38 (t, J = 7.2 Hz, 9H, −CH ₂ CH ₃ ), 2.64 (s, 3H, CH ₃ CO-), 3.46 (q, J = 7.2 Hz, 6H, -CH ₂ CH ₃ ), 3.80 (t, J = 6.9 Hz, 2H, -CONHCH ₂ -), 7.9 (d, J = 1.5 Hz, 2H, NHCOArH), 8.07 (d, J = 1.5 Hz, 2H, CH ₃ COArH)
ESI-TOF (+): [M-I] ⁺ = 291.44
[0049]
Synthesis of {2- [4- (2-bromo-acetyl) -benzoylamino] -ethyl} -triethylammonium bromide (Compound (6) (KAP-NB01))
[0050]
Embedded image

[0051]
To the reaction vessel, 100 mg (0.239 mmol, 1.0 eq) of compound (5) and 284.0 μl of dehydrated methanol were added and stirred at high speed. Br ₂ Was slowly added dropwise, reacted at room temperature for 1 hour, and then reacted at 50 ° C. for 30 minutes. After confirming the formation of the reaction product by MS, 142.0 μl of water was added to suppress the formation of α-bromodiethyl ketal, followed by the same amount of methanol. Br ₂ After adding 2.4 μl, the reaction was carried out at 50 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the flask was cooled to 0 ° C. to −5 ° C., and the supernatant was removed. MeOH: H ₂ After adding a small amount of the solution of O = 2: 1, the solution was further cooled and the supernatant was removed. The product was isolated and purified by high performance liquid chromatography (ODS, acetone) to obtain a red oily substance (69.0 mg, yield: 64.10%).
[0052]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 7: 1 v / v) Rf = 0.21
1H-NMR (300 MHz, CD ₃ OD, TMS, r. t. , Δ / ppm) 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 9H, −CH ₂ CH ₃ ), 3.45 (q, J = 7.1 Hz, 6H, -CH ₂ CH ₃ ), 3.80 (t, J = 7.3 Hz, 2H, -CONHCH ₂ -), 4.70 (s, 2H, BrCH ₂ CO-), 7.9 (d, J = 8.3 Hz, 2H, NHCOArH), 8.12 (d, J = 8.3 Hz, 2H, BrCH ₂ COArH)
ESI-TOF (+): [M-Br] ⁺ = 369.55, 371.55
[0053]
Example 2 Synthesis of KAP-NB02
Embedded image

[0054]
The same procedure as in Example 1 was performed until the preparation of compound (5).
[0055]
Synthesis of triethyl- {2- [4- (2-oxo-acetyl) -benzoylamino] -ethyl} -ammonium bromide (compound 7) (KAP-NB02))
[0056]
Embedded image

[0057]
DMSO 0.4 ml, H ₂ 43.3 μl of O and 100 mg (0.239 mmol, 1.0 eq) of compound (5) were added, and the reaction vessel was stirred at high speed while being reduced in pressure by an aspirator. Thereto, 122.0 μl (1.08 mmol, 4.5 eq) of 48% HBr was added dropwise and reacted at 45 ° C. for 3 hours. After confirming disappearance of the raw materials, the reaction solution was poured into ice to stop the reaction. Acetone is added and dissolved there, then toluene is added and azeotroped, etc. ₂ O was distilled off under reduced pressure. High performance liquid chromatography (ODS, acetonitrile: H ₂ O = 9: 1 v / v) and purified to obtain a sticky yellow substance (71.3 mg, yield: 74.06%).
[0058]
TLC (SiO ₂ , Chloroform: methanol = 10: 1 v / v) Rf = 0.14
1H-NMR (300 MHz, CD ₃ SOCD ₃ , TMS, r. t. , Δ / ppm) 1.23 (t, J = 6.9 Hz, 9H, -CH ₂ CH ₃ ), 3.62 (t, J = 6.6 Hz, 2H, -CONHCH ₂ −), 5.68 (t, J = 6.9 Hz, 1H, −CONHCH ₂ −), 6.91 (d, J = 7.2 Hz, 2H, CH (OH) ₂ ), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 2H, NHCOArH), 8.17 (d, J = 8.4 Hz, 2H, CH (OH) ₂ COArH), 9.03 (t, J = 5.4 Hz, 1H, —CH (OH) ₂ )
ESI-TOF (+): [M + CH ₃ OH-Br] ⁺ = 337.14, [M + H ₂ O-Br] ⁺ = 323.15
[0059]
Example 3 Mass spectrometry of cytosine using KAP-NB01
Using cytosine as a sample, the reactivity with KAP-NB01 was evaluated. Detailed reaction conditions are shown below. 30 μl (0.22 mg, 2.0 μmol) of a 66.67 mM aqueous solution of cytosine, 17.5 μl (2.25 mg, 0.5 μmol) of 28.57 mM acetonitrile solution of KAP-NB01 and 52.5 μl of acetonitrile were added to the bean test tube. The reaction was carried out in a hot water bath at 80 ° C. for 135 minutes. After completion of the reaction, 20 μl of the reaction solution was taken and diluted with methanol 500 times to obtain an ESI-MS sample (1.0 × 10 −5 M).
[0060]
The apparatus and conditions used for ESI-MS were as follows.
Measurements were made using a Mariner from Applied Biosystems. The conditions were as follows.
Spray tip potential: 3174.61 [V]
Nozzle potential: 60.06 [V]
Quad RF voltage: 900.15 [V] (only cytosine 700 [V])
Detector voltage: 2199.71 [V]
Nebulizer: N2 Gas flow rate: 0.390 l / min
Solvent: methanol
Flow rate: 11.5 μl / min
[0061]
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, a peak of 382 having a molecular weight was observed as a main peak. This revealed that cytosine can be subjected to mass spectrometry with the probe (I) of the present invention.
[0062]
Example 4 Mass Spectrometry of Cytidine Using KAP-NB01
Cytidine and the probe were reacted and their reactivity was evaluated. Details of the reaction are as follows. A bean test tube is 30 μl (0.49 mg, 2.0 μmol) of 66.67 mM aqueous solution of cytidine, 17.5 μl (2.25 mg, 0.5 μmol) of 28.57 mM acetonitrile solution of KAP-NB01 and 52.5 μl of acetonitrile. And reacted in a hot water bath at 80 ° C. for 135 minutes.
When a DMF solution of cytidine was used, the reaction was performed at 80 ° C. for 90 minutes. After completion of the reaction, 20 μl of the reaction solution was taken and diluted with methanol 500 times to obtain an ESI-MS sample (1.0 × 10 −5 M). ESI-MS was performed in the same manner as in Example 3.
[0063]
The results are shown in FIG. 2A shows the results when the solvent is acetonitrile / water, and FIG. 2B shows the results when the solvent is acetonitrile / DMF. As shown in FIG. 2, the peak of 514, which is the peak of the reactant in each case, was observed as the main peak.
Thus, it was revealed that cytidine can be mass-analyzed with the probe (II) of the present invention.
[0064]
Example 5 Quantitative measurement of cytidine concentration using KAP-NB01
Mass spectrometry of cytidine was performed in the same manner as in Example 4 except that the concentration of cytidine was variously changed.
[0065]
The results are shown in FIG. In addition, the vertical axis | shaft of FIG. 3 is an intensity ratio (intensity ratio). FIG. 3B shows an enlarged view of the range of 5 mM to 0.1 mM in FIG. As shown in FIG. 3, a calibration curve with very high linearity proportional to the concentration was obtained when any solvent was used. From this, it became clear that mass spectrometry of cytidine can be performed accurately by using the probe (I) of the present invention.
[0066]
Example 6 Selectivity of KAP-NB01 to cytosine or cytidine
A binding reaction between KAP-NB01 and each sample was performed in the same manner as in Example 3 (in the case of cytosine) or Example 4 (in the case of cytidine, adenosine, guanosine and thymidine), except that the reaction time was varied. (However, the solvent is acetonitrile / water) and mass spectrometry was performed.
[0067]
The results are shown in FIG. In addition, the vertical axis | shaft of FIG. 4 is an intensity ratio. As shown in FIG. 4, KAP-NB01 binds only to cytosine and cytidine and was able to perform mass spectrometry of these, but did not react at all with the other three nucleosides, adenosine, guanosine and thymidine. I did not. From this, it was confirmed that the probe (I) of the present invention has extremely high selectivity for cytosine and its derivatives.
[0068]
Example 7 Mass spectrometry of deoxyguanosine and 8-OHdG using KAP-NB02
2′-deoxyguanosine and 8-OHdG, which is also used as an index of oxidative stress, were reacted with KAP-NB02, their reactivity was evaluated, and peaks were compared. The details of the reaction are as follows. 1.13 mg of 2′-deoxyguanosine or 1.13 mg of 8-OHdG (both 4.0 μmol) and 1.61 mg (4.0 μmol) of KAP-NB02 were added to a sample tube, and acetonitrile 66. Further, 66.3 μl of a phosphate buffer adjusted to 3 μl, water 132.5 μl, 50 mM, and pH 6.0 was added. The mixture was reacted at 45 ° C. for 60 minutes in a hot water bath using a stirring tank. Raise the reaction volume to 1500 times and add 1.0 × 10 ^-5 An MSI methanol sample solution was used, and ESI-MS measurement was performed in the same manner as in Example 3. Note that these two samples differ only in whether the 8 ′ position of guanine is hydrogen or a hydroxyl group.
[0069]
The results are shown in FIG. The left diagram of FIG. 5 shows the results for 2′-deoxyguanosine, and the right diagram shows the results for 8-OHdG. As can be seen from the comparison of the two figures in FIG. 5, it can be seen that the peak of the reactant is detected with a difference of 16 which is the difference in the molecular weight of the sample. From this, it was confirmed that deoxyguanosine and its derivative can be subjected to mass spectrometry very accurately by the probe (III) of the present invention.
[0070]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a probe for mass spectrometry that can accurately perform mass spectrometry of cytosine or a derivative thereof or guanine or a derivative thereof with high selectivity is provided. The probe of the present invention has high selectivity for cytosine or a derivative thereof, or guanine or a derivative thereof, and these can be accurately subjected to mass spectrometry. Therefore, mass analysis of nucleic acid samples and mass spectrometry of oxidative stress markers Useful for.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of mass spectrometry of cytosine using a probe of an example of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the results of mass spectrometry of cytidine using the probe of the example of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing the results of quantitative measurement of cytidine concentration using the probe of the example of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing the results of mass spectrometry of cytosine and various nucleosides using the probe of the example of the present invention while changing the binding reaction time.
FIG. 5 is a diagram showing the results of mass spectrometry of deoxyguanosine and 8-OHdG using the probe of the example of the present invention.

Claims (5)

Formula (I)

(Wherein R ₁ , R ₂ and R ₃ are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, X ₁ and X ₂ are each independently halogen, and n is an integer of 1 to 4) A probe for mass spectrometry of cytosine having a structure or a derivative thereof. Formula (II)

The probe of Claim 1 which has a structure represented by these. Formula (III)

(Wherein R ₄ , R ₅ and R ₆ are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, X is a halogen, and m is an integer of 1 to 4) or a guanine derivative thereof Probe for mass spectrometry. Formula (IV)

The probe of Claim 3 which has a structure represented by these. The probe according to claim 3 or 4, which is used for mass spectrometry of 8'-hydroxydeoxyguanine.

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