EP3917941A1 - Fluorescent gtp analogues and use - Google Patents

Fluorescent gtp analogues and use

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Publication number
EP3917941A1
EP3917941A1 EP20707504.5A EP20707504A EP3917941A1 EP 3917941 A1 EP3917941 A1 EP 3917941A1 EP 20707504 A EP20707504 A EP 20707504A EP 3917941 A1 EP3917941 A1 EP 3917941A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gtp
gamma
group
compound according
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20707504.5A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Laurent Lamarque
Emmanuel Bourrier
Thomas ROUX
Eric Trinquet
Elodie DUPUIS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cisbio Bioassays SAS
Original Assignee
Cisbio Bioassays SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cisbio Bioassays SAS filed Critical Cisbio Bioassays SAS
Publication of EP3917941A1 publication Critical patent/EP3917941A1/en
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic System

Definitions

  • the present invention relates to fluorescent GTP analogs useful for detecting, by energy transfer techniques, molecules capable of modulating the activation of a receptor coupled to G proteins.
  • G proteins are heterotrimeric proteins (3 subunits: alpha, beta and gamma) which are activated by RCPGs.
  • GPCRs Through GPCRs, G proteins play a role in transducing a signal from outside the cell to inside the cell (i.e. cellular response to an external stimulus). Their commonly described mechanism of action is presented in Figure 1 and summarized below:
  • the alpha subunit of the G protein is bound to the nucleotide GDP (full G protein bound to GDP);
  • the latter binds to the alpha subunit of the G protein and initiates a process of activation of the G protein consisting of two steps:
  • GTP form full G protein bound to GTP
  • GTP form full G protein bound to GTP
  • the G protein bound to the receptor is in a form called “empty form”. This state is described in the literature as being transient since it is described that the GTP nucleotide binds rapidly to the alpha subunit of the G protein.
  • the beta / gamma subunits of the activated G protein dissociate. alpha subunit;
  • the alpha subunit of the full G protein bound to GTP then binds to the effectors to activate them.
  • the effectors in turn activate signaling pathways leading to a cellular response;
  • G alpha proteins There are several subtypes of G alpha proteins with different selectivity profiles for different effectors (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) and thus induce the activation of preferential signaling pathways.
  • GPCRs are associated with many important physiological functions and are considered to be one of the preferred therapeutic targets for a large number of pathologies.
  • numerous in vitro screening tests have been developed to identify molecules capable of modulating RCPGs. The tests developed exploit different mechanisms for activating G proteins and use various technologies (Zhang et al .; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372).
  • GTP gamma-S GTP weakly or not hydrolyzable such as GTPyS
  • the object of the present invention is to provide new molecules of GTP or of its derivatives, coupled to lanthanide complexes and represented by general formula (I):
  • X 0, NH or CH 2 ;
  • Y 0, NH or CH 2 ;
  • L is a divalent linking group
  • Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 (as defined below);
  • Ln 3+ is not the ⁇ 2,2 ', 2 ", 2'" - ⁇ [[2- (4-isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis ⁇ 4- ⁇ [4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl ⁇ pyridin-6,2-diyl ⁇ bis- (methylenenitrilo) ⁇ - tetrakis (acetato) ⁇ - europium (III).
  • FIG. 1 illustrates the mechanism of action of G proteins.
  • Figure 2 illustrates the assay format used to detect binding of the compounds of the invention to the G protein.
  • Figure 3 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
  • Figure 4 illustrates a binding assay of a compound of the invention to the Gai protein.
  • Figure 5 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
  • Figure 6 illustrates a test for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
  • Figure 7 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
  • Figure 8 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
  • Figure 9 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
  • Figure 10 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
  • FIGS 11 A and 11 B illustrate the effect of the concentration of membranes and test compound on the binding of said compound to the Ga protein.
  • Figure 12 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
  • the present invention relates to compounds of formula (I):
  • X 0, NH or CH 2 ;
  • Y 0, NH or CH 2 ;
  • L is a divalent linking group
  • Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 (as defined below);
  • Ln 3+ is not the ⁇ 2,2 ', 2 ", 2"' - ⁇ [[2- (4-isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis ⁇ 4- ⁇ [4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl ⁇ pyridin-6,2-diyl ⁇ bis- (methylenenitrilo) ⁇ - tetrakis (acetato) ⁇ europium (III).
  • lanthanide complex is understood to mean a chelate, a macrocycle, a cryptate or any organic species capable of complexing an atom of the lanthanide family, the lanthanide (Ln) being chosen from: Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, preferably the lanthanide is Tb, Sm or Eu and even more preferably Eu or Tb.
  • a first family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ia), (Id) and (If). This family is known as the GTP-gamma-0 family (because the divalent linking group is linked to the phosphate in the gamma position of GTP via an oxygen atom).
  • a second family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ib), (le) and (Ig). This family is called the GTP-gamma-N family (because the divalent linking group is linked to the phosphate in the gamma position of GTP via a nitrogen atom).
  • a third family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ie). This family is called the GTP-gamma-C family (because the divalent linking group is bonded to the phosphate in the gamma position of GTP via a carbon atom).
  • X is O. In another embodiment X is NH. In another embodiment X is CH 2 .
  • the divalent linking group L is chosen from:
  • said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 14 aryl, sulfonate or oxo groups.
  • n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer ranging from 1 to 6, preferably from 1 to 4.
  • the divalent linking group L is chosen from a direct bond, a linear or branched C 1 -C 8 alkylene group or a group of formula:
  • the divalent linking group L is preferably chosen from:
  • the divalent linking group L is a group of formula:
  • n and p are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
  • the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes below:
  • the groups -S0 3 H, -C0 2 H and -PO (OH) 2 are in deprotonated form or not. These groups therefore also denote the groups -S0 3 -, -C0 2 - and -P0 (OH) 0-.
  • the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17, C24 to C32 and C36 to C44. More advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17 and C36 to C44. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17.
  • the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C1 1 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C1 1. Very advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is the C2 complex or the C3 complex.
  • the lanthanide complexes C1 to C90 are described in the publications below. These complexes are either commercially available or can be obtained by the synthetic routes described in said publications.
  • GTP-gamma-O compounds GTP is first reacted with a compound of formula G 2 -LG 1 , and the intermediate compound thus formed is conjugated with the lanthanide complex.
  • G 2 -LG 1 a compound of formula G 2 -LG 1 :
  • L is the divalent linking group as defined above;
  • G 1 is an electrophilic reactive group capable of reacting with the OH function of the phosphate in the gamma position of GTP;
  • G 2 is a reactive group capable of reacting with a reactive group (G 3 ) carried by the lanthanide complex Ln 3+ .
  • the conjugation reaction between the intermediate compound (comprising a reactive group G 2 ) and the lanthanide complex (comprising a reactive group G 3 ) results in the formation of a covalent bond comprising one or more atoms of the reactive group.
  • the electrophilic group Gi is:
  • a reactive group of the leaving group type such as for example an aliphatic chloride, an aliphatic bromide, an aliphatic iodide, an aliphatic mesylate, an aliphatic tosylate, an aliphatic triflate, etc.
  • the reactive groups G 2 and G 3 are independently of one another chosen from one of the following groups: an acrylamide, an optionally activated amine (for example a cadaverine or an ethylenediamine), a activated ester, aldehyde, alkyl halide, anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide, halotriazine, such as monochlorotriazine, dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), an imido ester, an isocyanate, an isothiocyanate, a maleimide, a sulfonyl halide, a thiol, a ketone, an acid halide, a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester , an azidonitropheny
  • Ar is a 5 or 6 membered saturated or unsaturated heterocycle, comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
  • G 2 and G 3 can originate from their form protected by a compatible protective group.
  • the reactive groups G 2 and G 3 are independently of one another chosen from an amine (optionally protected in the -NHBoc form), a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, a halotriazine, an isothiocyanate, a maleimide group, or a carboxylic acid (optionally protected in the form of a -C0 2 Me, -C0 2 tBu group).
  • the acid must be activated in ester form in order to be able to react with a nucleophilic species.
  • GTP can be reacted directly with a lanthanide complex when the latter has an NH 2 group.
  • GTP can also be reacted with a compound of formula 2 HN- (CH 2 ) n -NH 2 in which n is as defined above and one of the amino groups is optionally protected by a protecting group, then coupling the intermediate compound obtained with a lanthanide complex functionalized with a reactive group G 3 as defined above.
  • the compounds according to the invention are capable of binding to protein G. This property is demonstrated by an immunoassay based on a FRET principle, by incubating a membrane preparation comprising RCPG and a Ga protein in the presence of a pair of FRET partners consisting of a compound according to the invention and of an anti-Ga protein antibody labeled with an acceptor fluorophore. Incubation is carried out in the presence or absence of a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP analogue, such as GTPyS. When the partners of the FRET pair bind to the same Ga protein, a FRET signal appears, thereby demonstrating the binding of the compound of the invention to the Ga protein.
  • the compounds of the invention can therefore advantageously be used for identify, by the FRET technique, molecules capable of modulating the activation of a receptor coupled to G proteins.
  • the acetylenic group can be introduced in a first step on the GTP leading to the compounds of series 6.
  • An example of coupling on other nucleotides is available in the literature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125 , 9588). Then the cycloaddition reaction can be carried out with a lanthanide complex functionalized in azide form to lead to the compounds
  • the GTP-gamma-N compounds can be prepared according to an analogous strategy.
  • the NH 2 functionalized lanthanide complex is condensed directly on the GTP molecule without intercalating a linker (scheme 4).
  • the lanthanide complexes can be coupled using a GTP-gamma-N molecule already comprising a terminal NH 2 linking group 9a-e previously introduced.
  • Diagram 5 To avoid using several equivalents of a di-amino linkage group, one of the functions is protected, for example, by a Cbz or else a trifluoroacetate group (COCF 3 ). The protective groups are then removed (under conditions avoiding chemical hydrolysis of GTP) thus leading to the same 9a-e compounds to which the lanthanide complexes are coupled using conventional techniques known to those skilled in the art. (diagram 6).
  • the gamma-C GTP series is synthesized by condensation of GDP (guanosine di-phosphate) with phosphonic acids whose terminal position can be substituted differently.
  • the terminal position is a protected amine function (trifluoroacetamide 15a-f or CBz, 16a-f)
  • these compounds are prepared using the method described in the literature (EP0959077 (TFA); WO 2012/150866 and The journal of Organic Chemistry , 1984, 49, 1158 (Cbz)).
  • the N-phthalimide alkyl bromides (12a-f) are condensed on triethylphosphite in a first step, then followed by treatment with hydrazine to deprotect the amine function.
  • Ethyl phosphonates are hydrolyzed in the presence of hydrobromic acid to yield compounds 14a-f.
  • the primary amine function is protected either by a CBz or by a trifluoroacetamide in order to avoid a self-condensation reaction during the reaction of coupling with the GDP. This reaction sequence makes it possible to obtain the intermediate compounds 15a-f and 16a-f.
  • GTP-gamma-C the terminal part of the linker of which is an acetylenic unit.
  • This function makes it possible to carry out a “Click Chemistry” reaction between the acetylenic GTP-gamma-C and a lanthanide complex carrying an azide function available for a coupling reaction.
  • Scheme 8 briefly describes the various intermediates prepared according to the protocols available in the literature (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2018, 26, 191 and Angewandte Chemie International Edition, 201 1, 50, 10699). The commercial acetylenic alkyl bromide derivatives are condensed on trimethylsilyl phosphonite, then hydrolyzed to yield the 18a-f series.
  • the azido group is introduced on the phosphonic acid using the sequence described in scheme 9.
  • the protocols are described in the literature, for example in Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010 , 26, 10725, or even in The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450.
  • the dibromo derivatives react with triethylphosphonite to give compounds 20a-f.
  • the azido function is then introduced by a simple nucleophilic substitution with sodium azide.
  • the di-esters are then hydrolyzed in the presence of TMS-Br which leads to the 22a-f derivatives.
  • the analog GPPNHP (commercial, CAS: 64564-03-0) can be coupled with lanthanide complexes in the gamma position using the same synthetic strategies.
  • the synthesis is described for example in scheme 14.
  • the syntheses are described in schemes 15 and 16. These couplings were also exemplified in application WO 2009 / 068751 which uses analogues of ATP.
  • the analog GPPCH 2 P (commercial, CAS: 13912-93- 1 or 10470-57-2 in the form of Na salt)) can be coupled with lanthanide complexes in the gamma position using the same synthetic strategies.
  • the synthesis is described for example in scheme 17.
  • the syntheses are described in schemes 18 and 19. These couplings were also exemplified in application WO
  • BSA Bovine serum albumin
  • FRET Forster resonance energy transfer GDP: guanosine diphosphate
  • GTP guanosine triphosphate
  • GTPyS Guanosine 5 '- [g-thio] triphosphate
  • GPCR G protein-coupled receptors
  • Analytical HPLC ThermoScientific, P4000 quaternary pump, UV 1000 deuterium lamp detector (190-350 nm), Waters XBridge C 18 analytical column, 3.5 mm, 4.6 c 100 mm.
  • Preparative HPLC Shimadzu, 2 LC-8A pumps, Varian ProStar diode array UV detector, Waters XBridge prep. C18, 5 mm: 19 c 100 mm or 50 x 150 mm.
  • UPLC Ultra-High Performance Liquid Chromatography
  • the C2 complex (0.366 mg, 2 mmol) was solubilized in 500 mM MES buffer pH 5.5 (150 mL) to give a yellow solution.
  • GTP 1.32 mg, 2.4 mmol
  • EDO 1.92 mg, 10 mmol
  • the C3 complex (0.366 mg, 480 nmol) was solubilized in 500 mM MES buffer pH 5.5 (150 mL) to give a yellow solution.
  • GTP 0.317 mg, 576 nmol
  • EDO 0.460 mg, 2.4 mmol
  • the mixture was stirred at RT overnight.
  • the progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was partial and no longer progressed.
  • Cisbio Bioassays on request under the reference DSV36S.
  • the antibody was labeled with the fluorescent d2 probe (red acceptor) compatible for TR-FRET detection.
  • the DSV36S antibody binds to switch II of the Gai protein.
  • GTP and GTPyS nucleotides were purchased from Sigma Aldrich (respective catalog references G8877 and G8634).
  • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues labeled with donor fluorophores of the lanthanide complex type were synthesized at Cisbio Bioassays.
  • the nonspecific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing an excess of GTPyS (10 or 100 mM).
  • the plates were incubated at 21 ° C for 20 h then the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
  • the HTRF Ratio was calculated according to the following formula:
  • Figure 2 illustrates the assay format used to detect the binding of compounds of formula (I) to protein G.
  • a membrane preparation comprising RCPG and Ga proteins is incubated in the presence of the compounds to be tested and an anti antibody - Ga protein labeled with an acceptor fluorophore, in the presence or absence of a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP analogue (typically GTPyS).
  • GTPyS non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP analogue
  • a FRET signal appears (left part of the figure: “Total signal”) and stands out from the non-specific signal ( background noise corresponding to the right part of the figure: “Non-Specific Signal”) which comprises a strong excess of unlabeled GTPyS (displacement of the fluorescent GTP analog).
  • GTPgN-C2 preparation 2
  • anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO-K1 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (10 mg per well).
  • GTPgN-C2 has been used at a final concentration of 6nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgN-C3 preparation 5
  • anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing RCPG Delta Opioid and Gai protein (1 mg per well).
  • GTPgN-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgN-octyl-C2 preparation 6
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells.
  • GTPgN-octyl-C2 was used at a final concentration of 6nM in the wells.
  • the membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 pM).
  • GTPgN-octyl-C1 1 (preparation 9) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO cells. -K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the GaI protein (10 mg per well). GTPgN-octyl-C1 1 was used at a final concentration of 6 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgN-octyl-C3 preparation 7
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (1 mg per well).
  • GTPgN-octyl-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgO-hexyl-C2 preparation 2
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells.
  • GTPgO-hexyl-C2 was used at a final concentration of 6 nM in the wells.
  • the membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgO-hexyl-C3 preparation 3
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (1 mg per well).
  • GTPgO-hexyl-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgN-octyl-C2 preparation 6
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells.
  • GTPgN-octyl-C2 has been used at a final concentration of 6 nM in the wells.
  • the membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM).
  • Example 9 Effect of the concentration of membranes and GTP-lanthanide analog on the binding test of the GTPgN-octyl-C2 analog
  • GTPgN-octyl-C2 preparation 6
  • anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells.
  • K1 expressing Delta Opioid GPCR and GaI protein (1 or 10 mg / well).
  • GTPgN-octyl-C2 was used at a final concentration of 2 or 6 nM in the wells.
  • the membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM).
  • GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 (preparation 10) / anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO cells. -K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the GaI protein (10 mg per well). The reagents were diluted in 50 mM Tris HCl buffer pH 7.4, 60 mM MgCl 2 , 0.1% BSA, 150 mM NaCl. GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 was used at a final concentration of 7.5 nM in the wells.

Abstract

The invention relates to compounds of formula (I), in which X, Y, L and Ln3+ are as defined in the description.

Description

Analogues de GTP fluorescents et utilisation Domaine de l’invention Fluorescent GTP analogs and use Field of the invention
La présente invention a pour objet des analogues de GTP fluorescents utiles pour détecter, par des techniques de transfert d’énergie, des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. The present invention relates to fluorescent GTP analogs useful for detecting, by energy transfer techniques, molecules capable of modulating the activation of a receptor coupled to G proteins.
Etat de la technique State of the art
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, beta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d’un signal de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule (i.e. réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d’action communément décrit, est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après : Receptors coupled to G proteins (RCPG or GPCR in English) are a family of membrane receptors in mammals and throughout the animal kingdom. G proteins are heterotrimeric proteins (3 subunits: alpha, beta and gamma) which are activated by RCPGs. Through GPCRs, G proteins play a role in transducing a signal from outside the cell to inside the cell (i.e. cellular response to an external stimulus). Their commonly described mechanism of action is presented in Figure 1 and summarized below:
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP); - in its inactive, resting state, the alpha subunit of the G protein is bound to the nucleotide GDP (full G protein bound to GDP);
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : - after activation of the RCPG, the latter binds to the alpha subunit of the G protein and initiates a process of activation of the G protein consisting of two steps:
1 ) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 1) the release of GDP from G protein to give empty G protein, and formation of an inactive GPCR / empty protein-G-complex, and
2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu’il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous- unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous-unités beta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous-unité alpha; 2) the binding of GTP which leads to the formation of an active G protein, in GTP form (full G protein bound to GTP). In the first step, the G protein bound to the receptor is in a form called “empty form”. This state is described in the literature as being transient since it is described that the GTP nucleotide binds rapidly to the alpha subunit of the G protein. In addition, the beta / gamma subunits of the activated G protein dissociate. alpha subunit;
- la sous-unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire; - the alpha subunit of the full G protein bound to GTP then binds to the effectors to activate them. The effectors in turn activate signaling pathways leading to a cellular response;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous-unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous-unités beta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif). - GTP is then hydrolyzed to GDP by the alpha subunit of the G protein and the alpha subunit reassociates with the beta / gamma subunits to reform the full G protein bound to GDP (inactive state).
Il existe plusieurs sous-types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité différents pour les différents effecteurs (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) et induisant ainsi l’activation de voies de signalisation préférentielles. Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d’activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). On peut citer notamment les tests d’affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l’affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS (GTP gamma-S). Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membranes qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). D’autres tests ont été développés pour mettre en évidence l’activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d’énergie (RET - acronyme anglais de « Résonance Energy Transfer »), comme le FRET (acronyme anglais de « Fluorescence Résonance Energy Transfer ») - voir Clinical Chemistry, 1995, 41 , 1391 ou le BRET (acronyme anglais de « Bioluminescence Résonance Energy Transfer ») - voir Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1 ), 151. Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l’énergie (on parle de donneurs) ou d’accepter de l’énergie (on parle d’accepteurs) - voir Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847. On peut citer par exemple les techniques de transfert d’énergie mettant en évidence l’interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur conjugué au RCPG et un accepteur conjugué à la protéine G (WO 2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur conjugué à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur conjugué à la sous-unité beta et/ou gamma de la protéine G (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu’elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d’étudier les RCPG et les protéines G exprimées de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiées et non surexprimées). D’autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d’échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). Les techniques de transfert d’énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut citer par exemple les demandes WO 2006/035208 et US 2007/0287162 dans lesquelles on met en œuvre un analogue du GTP couplé à une molécule de type cyanine. There are several subtypes of G alpha proteins with different selectivity profiles for different effectors (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) and thus induce the activation of preferential signaling pathways. GPCRs are associated with many important physiological functions and are considered to be one of the preferred therapeutic targets for a large number of pathologies. Thus, numerous in vitro screening tests have been developed to identify molecules capable of modulating RCPGs. The tests developed exploit different mechanisms for activating G proteins and use various technologies (Zhang et al .; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). Mention may in particular be made of affinity tests which use radiolabeled ligands to measure the affinity of the ligand for RCPG, proximity scintigraphy tests which use scintigraphy beads on which RCPGs have been attached or functional tests using GTP weakly or not hydrolyzable such as GTPyS (GTP gamma-S). These tests are nonetheless difficult to perform and sometimes require membrane filtration steps which can limit their use as high throughput screening tests (HTS). Other tests have been developed to demonstrate the activation of GPCRs. These tests are based in particular on energy transfer techniques (RET - acronym for “Resonance Energy Transfer”), such as FRET (acronym for “Fluorescence Resonance Energy Transfer”) - see Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391 or BRET (acronym for “Bioluminescence Resonance Energy Transfer”) - see Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96 (1), 151. These two techniques call upon notions of molecules capable of giving energy (we speak of donors) or of accepting energy (we speak of acceptors) - see Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847. We can cite, for example, energy transfer techniques highlighting the 'interaction between a RCPG and the G protein using either a donor conjugated to the RCPG and an acceptor conjugated to the G protein (WO 2006/086883 and WO 2003/008435) or an acceptor conjugated to the alpha subunit of the G protein and a donor conjugated to the beta and / or gam subunit ma of the G protein (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). These techniques are nevertheless restrictive since they require the preparation of fusion proteins and they do not make it possible to study the RCPGs and the G proteins expressed endogenously by the cells (ie unmodified and not overexpressed). On the other hand, in order to discriminate between the different subtypes of G alpha proteins that can be activated by the receptor, these techniques require the preparation of multiple membrane samples (a specific preparation for each subtype of G alpha protein). Energy transfer techniques have also been used for the development of tests aimed at visualizing the modulation of the GTP (active) form of the G protein or of the GDP (inactive) form of the G protein. for example applications WO 2006/035208 and US 2007/0287162 in which a GTP analogue coupled to a cyanine-type molecule is used.
La demande WO 2009/068751 décrit une méthode dans laquelle un signal de transfert d’énergie est détecté à l’aide de dérivés d’ATP marqués ; ces dérivés ne peuvent toutefois pas se lier à la protéine G. Un analogue du GTP est décrit dans la revue « Drug Discovery Today, 2002, 7(18), S150) » comme susceptible d’être utilisé dans une technique de détection par fluorescence en temps résolu. Cet analogue est constitué d’un chélate d’europium couplé à l’atome de phosphate en position gamma du GTP via un atome d’azote. La structure du chélate d’europium n’est toutefois pas divulguée, pas plus que la méthode utilisée pour synthétiser l’analogue en question. Un autre analogue de GTP est décrit dans Analytical Chemistry, 2009, 81 , 5033, qui résulte du couplage du gamma-[(8-aminooctyl)imido]guanosine-5'-triphosphate et de {2,2',2",2"'-{[[2-(4- isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl] éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}tétrakis(acétato)}europium(lll) dont la synthèse a été décrite dans Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193. Application WO 2009/068751 describes a method in which an energy transfer signal is detected using labeled ATP derivatives; these derivatives cannot, however, bind to the G protein. An analogue of GTP is described in the journal “Drug Discovery Today, 2002, 7 (18), S150)” as capable of being used in a fluorescence detection technique. in time resolved. This analogue consists of a europium chelate coupled to the phosphate atom at the gamma position of GTP via a nitrogen atom. However, the structure of the europium chelate is not disclosed, nor is the method used to synthesize the analogue in question. Another GTP analogue is described in Analytical Chemistry, 2009, 81, 5033, which results from the coupling of gamma - [(8-aminooctyl) imido] guanosine-5'-triphosphate and {2,2 ', 2 ", 2 "'- {[[2- (4- isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis {4 - {[4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl} pyridin-6,2-diyl} bis- ( methylenenitrilo)} tetrakis (acetato)} europium (III), the synthesis of which has been described in Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193.
Il existe donc un réel besoin de disposer de composés capables de se lier à la protéine G et pouvant de facto être utilisés dans une méthode de détection, par des techniques de transfert d’énergie, de molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. There is therefore a real need to have compounds capable of binding to the G protein and which can de facto be used in a method for detecting, by energy transfer techniques, molecules capable of modulating the activation of a. receptor coupled to proteins G.
Résumé de l’invention Summary of the invention
La présente invention a pour objet la mise à disposition de nouvelles molécules de GTP ou de ses dérivés, couplées à des complexes de lanthanide et représentées par la formule générale (I) : The object of the present invention is to provide new molecules of GTP or of its derivatives, coupled to lanthanide complexes and represented by general formula (I):
dans laquelle : in which :
X = 0, NH ou CH2 ; X = 0, NH or CH 2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ; Y = 0, NH or CH 2 ;
L est un groupe de liaison divalent ; Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 (tel que défini ci-après) ; L is a divalent linking group; Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 (as defined below);
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n’est pas le {2,2',2",2'"-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4- {[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}- tétrakis(acétato)}-europium(lll). it being understood that when X represents NH and LY represents an octylamino group then Ln 3+ is not the {2,2 ', 2 ", 2'" - {[[2- (4-isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis {4- {[4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl} pyridin-6,2-diyl} bis- (methylenenitrilo)} - tetrakis (acetato)} - europium (III).
Brève description des dessins Brief description of the drawings
La figure 1 illustre le mécanisme d’action des protéines G. Figure 1 illustrates the mechanism of action of G proteins.
La figure 2 illustre le format d’essai utilisé pour détecter la liaison des composés de l’invention à la protéine G. Figure 2 illustrates the assay format used to detect binding of the compounds of the invention to the G protein.
La figure 3 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 3 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
La figure 4 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 4 illustrates a binding assay of a compound of the invention to the Gai protein.
La figure 5 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 5 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
La figure 6 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 6 illustrates a test for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
La figure 7 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 7 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
La figure 8 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 8 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
La figure 9 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 9 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
La figure 10 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 10 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to Gai protein.
Les figures 1 1 A et 1 1 B illustrent l’effet de la concentration en membranes et en composé à tester sur la liaison dudit composé à la protéine Gai. Figures 11 A and 11 B illustrate the effect of the concentration of membranes and test compound on the binding of said compound to the Ga protein.
La figure 12 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gai. Figure 12 illustrates an assay for binding of a compound of the invention to the Gai protein.
Description de l’invention Description of the invention
Selon un aspect la présente invention concerne des composés de formule (I) : According to one aspect, the present invention relates to compounds of formula (I):
dans laquelle : in which :
X = 0, NH ou CH2 ; X = 0, NH or CH 2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ; Y = 0, NH or CH 2 ;
L est un groupe de liaison divalent ; Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 (tel que défini ci-après) ; L is a divalent linking group; Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 (as defined below);
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n’est pas le {2,2',2",2"'-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4- {[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}- tétrakis(acétato)}europium(lll). it being understood that when X represents NH and LY represents an octylamino group then Ln 3+ is not the {2,2 ', 2 ", 2"' - {[[2- (4-isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis {4- {[4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl} pyridin-6,2-diyl} bis- (methylenenitrilo)} - tetrakis (acetato)} europium (III).
On entend par « complexe de lanthanide » un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb. The term “lanthanide complex” is understood to mean a chelate, a macrocycle, a cryptate or any organic species capable of complexing an atom of the lanthanide family, the lanthanide (Ln) being chosen from: Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, preferably the lanthanide is Tb, Sm or Eu and even more preferably Eu or Tb.
Les familles des différents composés de formule (I) sont représentées par les formules (la) à (Ig) : The families of the various compounds of formula (I) are represented by formulas (Ia) to (Ig):
dans lesquelles L et Ln3+ ont les significations indiquées ci-dessus. in which L and Ln 3+ have the meanings given above.
Une première famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (la), (Id) et (If). Cette famille est dite famille GTP-gamma-0 (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d’oxygène). Une deuxième famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (Ib), (le) et (Ig). Cette famille est dite famille GTP-gamma-N (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d’azote). Une troisième famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (le). Cette famille est dite famille GTP-gamma-C (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome de carbone). A first family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ia), (Id) and (If). This family is known as the GTP-gamma-0 family (because the divalent linking group is linked to the phosphate in the gamma position of GTP via an oxygen atom). A second family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ib), (le) and (Ig). This family is called the GTP-gamma-N family (because the divalent linking group is linked to the phosphate in the gamma position of GTP via a nitrogen atom). A third family of compounds according to the invention consists of compounds of formulas (Ie). This family is called the GTP-gamma-C family (because the divalent linking group is bonded to the phosphate in the gamma position of GTP via a carbon atom).
Dans un mode de réalisation X est O. Dans un autre mode de réalisation X est NH. Dans un autre mode de réalisation X est CH2. In one embodiment X is O. In another embodiment X is NH. In another embodiment X is CH 2 .
Dans un mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi : In one embodiment, the divalent linking group L is chosen from:
- une liaison directe; - a direct link;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ; - a linear or branched C 1 -C 20 , preferably C 1 -C 8 , alkylene group optionally containing one or more double or triple bonds;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; ou - a C 5 -C 8 cycloalkylene group; or
un groupe arylène en C6-C14 ; a C 6 -C 14 arylene group;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l’oxygène, l’azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 14 aryl, sulfonate or oxo groups.
Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi les groupes suivants : The divalent linking group L is advantageously chosen from the following groups:
dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. in which n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer ranging from 1 to 6, preferably from 1 to 4.
De manière particulièrement avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C8 ou un groupe de formule : Particularly advantageously, the divalent linking group L is chosen from a direct bond, a linear or branched C 1 -C 8 alkylene group or a group of formula:
Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi : The divalent linking group L is preferably chosen from:
le groupe -(CH2)n- étant tout particulièrement préféré. the group - (CH 2 ) n - being very particularly preferred.
Selon un autre mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est un groupe de formule : According to another embodiment, the divalent linking group L is a group of formula:
dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. wherein m, n and p are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
Dans un mode de réalisation, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes ci-après : In one embodiment, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes below:
C73a, Ln = Eu C73b, Ln = Tb C73a, Ln = Eu C73b, Ln = Tb
C75a, Ln = Eu C75b, Ln = Tb C75a, Ln = Eu C75b, Ln = Tb
C76a, Ln = Eu C76b, Ln = Tb C76a, Ln = Eu C76b, Ln = Tb
C77a, Ln = Eu C77b, Ln = Tb C77a, Ln = Eu C77b, Ln = Tb
C79a, Ln = Eu C79b, Ln = Tb C81a, Ln = Eu C81b, Ln = Tb C79a, Ln = Eu C79b, Ln = Tb C81a, Ln = Eu C81b, Ln = Tb
En fonction du pH, les groupes -S03H, -C02H et -PO(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc également les groupes -S03-, -C02- et -P0(0H)0-. Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17, C24 à C32 et C36 à C44. De manière plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17 et C36 à C44. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C1 1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C1 1 . De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est le complexe C2 ou le complexe C3. Les complexes de lanthanide C1 à C90 sont décrits dans les publications ci-après. Ces complexes soit sont disponibles dans le commerce, soit peuvent être obtenus par les voies de synthèses décrites dans lesdites publications. Depending on the pH, the groups -S0 3 H, -C0 2 H and -PO (OH) 2 are in deprotonated form or not. These groups therefore also denote the groups -S0 3 -, -C0 2 - and -P0 (OH) 0-. Advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17, C24 to C32 and C36 to C44. More advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17 and C36 to C44. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C1 1 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C1 1. Very advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is the C2 complex or the C3 complex. The lanthanide complexes C1 to C90 are described in the publications below. These complexes are either commercially available or can be obtained by the synthetic routes described in said publications.
C1 : WO 03/076938 C1: WO 03/076938
C2 : EP-A-0 203 047 C2: EP-A-0 203 047
C3-C4 : WO 2008/025886 C3-C4: WO 2008/025886
C5 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001 , 57(1 1 ), 2197. C5: Spectrochimica Acta; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57 (11), 2197.
C6 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001 , 57(1 1 ), 2197. C6: Spectrochimica Acta; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57 (11), 2197.
C7 : Analytical Biochemistry, 2000, 286(1 ), 17. C7: Analytical Biochemistry, 2000, 286 (1), 17.
C8 : WO 01/96877 C8: WO 01/96877
C9 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001 , 57(1 1 ), 2197. C9: Spectrochimica Acta; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57 (11), 2197.
C10 : WO 01/96877 C10: WO 01/96877
C1 1 : WO 2008/063721 C1 1: WO 2008/063721
C12- C17 : WO 2017/098180. C12- C17: WO 2017/098180.
C18- C20 : WO 2013/01 1236 C18- C20: WO 2013/01 1236
C21 -C35 : WO 2014/1 1 1661 C21 -C35: WO 2014/1 1 1661
C36-C44 : WO 2018/229408 C36-C44: WO 2018/229408
C45-C47 : Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 8509. C45-C47: Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 8509.
C48 : WO 2010/084090 C48: WO 2010/084090
C49 : WO 2009/010580 C49: WO 2009/010580
C50-C51 : Chemical Communications, 2007, 3841 C50-C51: Chemical Communications, 2007, 3841
C52 : WO 2006/120444 C52: WO 2006/120444
C53 : European Journal of Inorganic Chemistry, 2010, 3961 . C53: European Journal of Inorganic Chemistry, 2010, 3961.
C54 : Bioconjugate Chemistry, 2009, 20(3), 625. C54: Bioconjugate Chemistry, 2009, 20 (3), 625.
C55 : EP-A-0 770 610 C55: EP-A-0 770 610
C56 : WO 2016/106241 C56: WO 2016/106241
C57-C58 : EP-A-0 770 610 C57-C58: EP-A-0 770 610
C59-C60 : Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193-3201 C59-C60: Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193-3201
C61 : Bioconjugate Chemistry, 1997, 8(2), 127 C61: Bioconjugate Chemistry, 1997, 8 (2), 127
C62 : WO 93/1 1433 C62: WO 93/1 1433
C63 : US5696240 C63: US5696240
C64a -C81 b : WO 2018/22932 C64a -C81 b: WO 2018/22932
C82 : WO 2010/070232 C86a-b : Analyst, 2010, 135(1 ), 42 C82: WO 2010/070232 C86a-b: Analyst, 2010, 135 (1), 42
C87-C89 : Chemistry - A European Journal, 201 1 , 17, 9164 C87-C89: Chemistry - A European Journal, 201 1, 17, 9164
C90: Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(15), 4888 C90: Journal of the American Chemical Society, 2004, 126 (15), 4888
La synthèse des composés de formule (I) est décrite plus en détail ci-après dans les schémas 1 à 19. Typiquement ces composés sont obtenus par des techniques de conjugaison de deux molécules organiques basées sur l’utilisation de groupes réactifs, techniques qui relèvent des connaissances générales de l’homme du métier et qui sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academie Press, The synthesis of the compounds of formula (I) is described in more detail below in schemes 1 to 19. Typically these compounds are obtained by techniques of conjugation of two organic molecules based on the use of reactive groups, techniques which fall within general knowledge of those skilled in the art and which are described for example in Bioconjugate Techniques, GT Hermanson, Academie Press,
Second Edition 2008, p. 169-21 1. Pour obtenir les composés GTP-gamma-O, on fait tout d’abord réagir le GTP avec un composé de formule G2-L-G1, et le composé intermédiaire ainsi formé est conjugué avec le complexe de lanthanide. Dans cette formule G2-L-G1 :Second Edition 2008, p. 169-21 1. To obtain the GTP-gamma-O compounds, GTP is first reacted with a compound of formula G 2 -LG 1 , and the intermediate compound thus formed is conjugated with the lanthanide complex. In this formula G 2 -LG 1 :
L est le groupe de liaison divalent tel que défini ci-dessus ; L is the divalent linking group as defined above;
G1 est un groupe réactif électrophile capable de réagir avec la fonction OH du phosphate en position gamma du GTP ; G 1 is an electrophilic reactive group capable of reacting with the OH function of the phosphate in the gamma position of GTP;
G2 est un groupe réactif capable de réagir avec un groupe réactif (G3) porté par le complexe de lanthanide Ln3+. G 2 is a reactive group capable of reacting with a reactive group (G 3 ) carried by the lanthanide complex Ln 3+ .
La réaction de conjugaison entre le composé intermédiaire (comportant un groupe réactif G2) et le complexe de lanthanide (comportant un groupe réactif G3), entraîne la formation d’une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. The conjugation reaction between the intermediate compound (comprising a reactive group G 2 ) and the lanthanide complex (comprising a reactive group G 3 ) results in the formation of a covalent bond comprising one or more atoms of the reactive group.
Dans un mode de réalisation, le groupe électrophile Gi est : In one embodiment, the electrophilic group Gi is:
- soit un groupe OH activé par un réactif formant de façon intermédiaire une espèce réactive pouvant réagir avec la fonction hydroxyle du phosphate en position gamma, - either an OH group activated by a reagent intermediate forming a reactive species capable of reacting with the hydroxyl function of the phosphate in the gamma position,
- soit un groupement réactif de type groupement partant, comme par exemple un chlorure aliphatique, un bromure aliphatique, un iodure aliphatique, un mésylate aliphatique, un tosylate aliphatique, un triflate aliphatique, etc. - or a reactive group of the leaving group type, such as for example an aliphatic chloride, an aliphatic bromide, an aliphatic iodide, an aliphatic mesylate, an aliphatic tosylate, an aliphatic triflate, etc.
Dans un mode de réalisation, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l’un de l’autre choisi parmi l’un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d’acide, un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules : In one embodiment, the reactive groups G 2 and G 3 are independently of one another chosen from one of the following groups: an acrylamide, an optionally activated amine (for example a cadaverine or an ethylenediamine), a activated ester, aldehyde, alkyl halide, anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide, halotriazine, such as monochlorotriazine, dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), an imido ester, an isocyanate, an isothiocyanate, a maleimide, a sulfonyl halide, a thiol, a ketone, an acid halide, a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester , an azidonitrophenyl, a azidophenyl, a 3- (2-pyridyldithio) -propionamide, a glyoxal, a triazine, an acetylenic group, and in particular a group chosen from the groups of formulas:
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. in which w varies from 0 to 8 and v is equal to 0 or 1, and Ar is a 5 or 6 membered saturated or unsaturated heterocycle, comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
G2 et G3 peuvent provenir de leur forme protégée par un groupe protecteur compatible.G 2 and G 3 can originate from their form protected by a compatible protective group.
De manière préférée, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l’un de l’autre choisis parmi une amine (éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d’un groupe -C02Me, -C02tBu). Dans ce dernier cas, l’acide devra être activé sous forme d’ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile. Preferably, the reactive groups G 2 and G 3 are independently of one another chosen from an amine (optionally protected in the -NHBoc form), a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, a halotriazine, an isothiocyanate, a maleimide group, or a carboxylic acid (optionally protected in the form of a -C0 2 Me, -C0 2 tBu group). In the latter case, the acid must be activated in ester form in order to be able to react with a nucleophilic species.
Pour obtenir les composés GTP-gamma-N, on peut faire réagir le GTP directement avec un complexe de lanthanide lorsque ce dernier possède un groupe NH2. On peut également faire réagir le GTP avec un composé de formule 2HN-(CH2)n-NH2 dans laquelle n est tel que défini ci-dessus et l’un des groupes amino est éventuellement protégé par un groupe protecteur, puis coupler le composé intermédiaire obtenu avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé par un groupe réactif G3 tel que défini ci-dessus. To obtain the GTP-gamma-N compounds, GTP can be reacted directly with a lanthanide complex when the latter has an NH 2 group. GTP can also be reacted with a compound of formula 2 HN- (CH 2 ) n -NH 2 in which n is as defined above and one of the amino groups is optionally protected by a protecting group, then coupling the intermediate compound obtained with a lanthanide complex functionalized with a reactive group G 3 as defined above.
Les composés selon l’invention sont capables de se lier à la protéine G. Cette propriété est mise en évidence par un immuno-essai basé sur un principe de FRET, en incubant une préparation membranaire comportant des RCPG et une protéine Ga en présence d’un couple de partenaires de FRET constitué d’un composé selon l’invention et d’un anticorps anti-protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur. L’incubation est effectuée en présence ou en absence d’un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que du GTPyS. Lorsque les partenaires du couple de FRET se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparaît, démontrant par la même la liaison du composé de l’invention à la protéine Ga. Les composés de l’invention peuvent donc avantageusement être utilisés pour identifier, par la technique de FRET, des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Synthèse The compounds according to the invention are capable of binding to protein G. This property is demonstrated by an immunoassay based on a FRET principle, by incubating a membrane preparation comprising RCPG and a Ga protein in the presence of a pair of FRET partners consisting of a compound according to the invention and of an anti-Ga protein antibody labeled with an acceptor fluorophore. Incubation is carried out in the presence or absence of a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP analogue, such as GTPyS. When the partners of the FRET pair bind to the same Ga protein, a FRET signal appears, thereby demonstrating the binding of the compound of the invention to the Ga protein. The compounds of the invention can therefore advantageously be used for identify, by the FRET technique, molecules capable of modulating the activation of a receptor coupled to G proteins. Synthesis
Les synthèses des GTP couplés en position gamma à des complexes de lanthanide sont décrites dans les schémas 1 à 19. The syntheses of GTPs coupled in the gamma position to lanthanide complexes are described in schemes 1 to 19.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-0 (GTPyO) Synthesis of compounds of the GTP-gamma-0 (GTPyO) family
Le composé 2, précurseur des composés de l’invention (complexe de lanthanide GTP) peut être synthétisé en suivant les protocoles connus de l’homme du métier. A partir du GTP disponible commercialement, le groupe de liaison « L1 » est introduit en position gamma du GTP par substitution nucléophile entre le GTP et le groupe de liaison possédant un groupement partant (I, Br, mésyle, tosyle) en position alpha et un groupement amino protégé sur sa position oméga conduisant ainsi au composé 1. Des exemples analogues de couplage sont disponibles lorsque P = CBz ou COCF3 (cf. WO 2009/105077 ou WO 2009/091847). Le groupement protecteur est supprimé en utilisant les conditions de déprotection correspondantes aux groupements protecteurs (cf. WO 2009/014612). Le composé 2 est alors couplé de façon covalente via une liaison amide au complexe de lanthanide en utilisant les méthodes classiques connues de l’homme de l’art (schéma 1 ). Compound 2, a precursor of the compounds of the invention (GTP lanthanide complex) can be synthesized by following protocols known to those skilled in the art. From commercially available GTP, the "L1" linking group is introduced in the gamma position of GTP by nucleophilic substitution between GTP and the linking group having a leaving group (I, Br, mesyl, tosyl) in the alpha position and a amino group protected at its omega position thus leading to compound 1. Analogous coupling examples are available when P = CBz or COCF 3 (cf. WO 2009/105077 or WO 2009/091847). The protective group is removed using the deprotection conditions corresponding to the protective groups (cf. WO 2009/014612). Compound 2 is then covalently coupled via an amide bond to the lanthanide complex using standard methods known to those skilled in the art (scheme 1).
Schéma 1 Diagram 1
Une autre alternative pour coupler le complexe de lanthanide en position gamma du GTP est l’utilisation de la « click chemistry ». Pour cela il faut dans un premier temps introduire soit un groupement azido (schéma 2) ou un groupement acétylénique (schéma 3). Comme précédemment, ces groupements sont introduits via une réaction de substitution nucléophile entre le groupe de liaison L2 ou L3 avec le GTP (schémas 2 et 3). Des exemples de couplages entre un nucléotide et un groupe de liaison sont décrits par exemple par Hacker et al. (The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77(22), 17450). Another alternative for coupling the lanthanide complex in the gamma position of GTP is the use of "click chemistry". For this, it is first necessary to introduce either an azido group (scheme 2) or an acetylenic group (scheme 3). As previously, these groups are introduced via a nucleophilic substitution reaction between the L2 or L3 linking group with GTP (schemes 2 and 3). Examples of couplings between a nucleotide and a linking group are described, for example, by Hacker et al. (The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77 (22), 17450).
Schéma 2 Diagram 2
Schéma 3 Diagram 3
A l’inverse, le groupement acétylénique peut être introduit dans une première étape sur le GTP conduisant aux composés de la série 6. Un exemple de couplage sur d’autres nucléotides est disponible dans la littérature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125, 9588). Puis la réaction cycloaddition peut être mise en œuvre avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé sous forme azide pour conduire aux composés Conversely, the acetylenic group can be introduced in a first step on the GTP leading to the compounds of series 6. An example of coupling on other nucleotides is available in the literature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125 , 9588). Then the cycloaddition reaction can be carried out with a lanthanide complex functionalized in azide form to lead to the compounds
CLn3+-7a-d. CLn 3+ -7a-d.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-N Synthesis of compounds of the GTP-gamma-N family
De la même façon que pour la famille GTP-gamma-O, les composés GTP-gamma-N peuvent être préparés selon une stratégie analogue. Le complexe de lanthanide fonctionnalisé NH2 est condensé directement sur la molécule de GTP sans intercaler de linker (schéma 4). Schéma 4 In the same way as for the GTP-gamma-O family, the GTP-gamma-N compounds can be prepared according to an analogous strategy. The NH 2 functionalized lanthanide complex is condensed directly on the GTP molecule without intercalating a linker (scheme 4). Diagram 4
Les complexes de lanthanide peuvent être couplés en utilisant une molécule de GTP- gamma-N comportant déjà un groupe de liaison NH2 terminal 9a-e préalablement introduit. The lanthanide complexes can be coupled using a GTP-gamma-N molecule already comprising a terminal NH 2 linking group 9a-e previously introduced.
Schéma 5 Pour éviter d’utiliser plusieurs équivalents de groupe de liaison di-amino, l’une des fonctions est protégée par exemple par un Cbz ou bien un groupement trifluoroacétate (COCF3). Les groupements protecteurs sont ensuite éliminés (dans des conditions évitant l’hydrolyse par voie chimique du GTP) conduisant ainsi aux mêmes composés 9a-e sur lesquels sont couplés les complexes de lanthanide en utilisant les techniques classiques connues de l’homme de l’art (schéma 6). Diagram 5 To avoid using several equivalents of a di-amino linkage group, one of the functions is protected, for example, by a Cbz or else a trifluoroacetate group (COCF 3 ). The protective groups are then removed (under conditions avoiding chemical hydrolysis of GTP) thus leading to the same 9a-e compounds to which the lanthanide complexes are coupled using conventional techniques known to those skilled in the art. (diagram 6).
Schéma 6 Diagram 6
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-C Synthesis of compounds of the GTP-gamma-C family
La série des GTP gamma-C est synthétisée par condensation du GDP (guanosine di- phosphate) avec les acides phosphoniques dont la position terminale peut être différemment substitués. Lorsque la position terminale est une fonction amine protégée (trifluoroacétamide 15a-f ou CBz, 16a-f), ces composés sont préparés en utilisant la méthode décrite dans la littérature (EP0959077 (TFA) ; WO 2012/150866 et The journal of Organic Chemistry, 1984, 49, 1 158 (Cbz)). Les bromures d’alkyles N-phthalimides (12a-f), sont condensés sur le triéthylphosphite dans une première étape, suivie ensuite par un traitement à l’hydrazine pour déprotéger la fonction amine. Les phosphonates d’éthyle sont hydrolysés en présence d’acide bromhydrique pour conduire aux composés 14a-f. La fonction amine primaire est protégée soit par un CBz soit par un trifluoroacétamide afin d’éviter une réaction d’auto-condensation lors de la réaction de couplage avec le GDP. Cette séquence réactionnelle permet d’obtenir les composés intermédiaires 15a-f et 16a-f. The gamma-C GTP series is synthesized by condensation of GDP (guanosine di-phosphate) with phosphonic acids whose terminal position can be substituted differently. When the terminal position is a protected amine function (trifluoroacetamide 15a-f or CBz, 16a-f), these compounds are prepared using the method described in the literature (EP0959077 (TFA); WO 2012/150866 and The journal of Organic Chemistry , 1984, 49, 1158 (Cbz)). The N-phthalimide alkyl bromides (12a-f) are condensed on triethylphosphite in a first step, then followed by treatment with hydrazine to deprotect the amine function. Ethyl phosphonates are hydrolyzed in the presence of hydrobromic acid to yield compounds 14a-f. The primary amine function is protected either by a CBz or by a trifluoroacetamide in order to avoid a self-condensation reaction during the reaction of coupling with the GDP. This reaction sequence makes it possible to obtain the intermediate compounds 15a-f and 16a-f.
Schéma 7 Diagram 7
Au lieu d’introduire une fonction amine primaire masquée, il est également possible de disposer de GTP-gamma-C dont la partie terminale du linker est un motif acétylénique. Cette fonction permet de réaliser une réaction de « Click Chemistry » entre le GTP- gamma-C acétylénique et un complexe de lanthanide portant une fonction azide disponible pour une réaction de couplage. Le schéma 8 décrit brièvement les différents intermédiaires préparés selon les protocoles disponibles dans la littérature (Bioorganic Médicinal Chemistry, 2018, 26, 191 et Angewandte Chemie International Edition, 201 1 , 50, 10699). Les dérivés bromures d’alkyle acétylénique commerciaux sont condensés sur du triméthylsilyl phosphonite, puis hydrolysés pour conduire à la série 18a-f. Instead of introducing a masked primary amine function, it is also possible to have GTP-gamma-C, the terminal part of the linker of which is an acetylenic unit. This function makes it possible to carry out a “Click Chemistry” reaction between the acetylenic GTP-gamma-C and a lanthanide complex carrying an azide function available for a coupling reaction. Scheme 8 briefly describes the various intermediates prepared according to the protocols available in the literature (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2018, 26, 191 and Angewandte Chemie International Edition, 201 1, 50, 10699). The commercial acetylenic alkyl bromide derivatives are condensed on trimethylsilyl phosphonite, then hydrolyzed to yield the 18a-f series.
Schéma 8 Figure 8
Une autre option est possible pour introduire sur le linker des GTP-gamma-C une fonction permettant la bioconjugaison. Dans cette approche, le groupement azido est introduit sur l’acide phosphonique en utilisant la séquence décrite dans le schéma 9. Les protocoles sont décrits dans la littérature, par exemple dans Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010, 26, 10725, ou bien encore dans The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. Les dérivés dibromés réagissent avec le triéthylphosphonite pour donner les composés 20a-f. La fonction azido est ensuite introduite par une simple substitution nucléophile avec l’azoture de sodium. Les di-esters sont ensuite hydrolysés en présence de TMS-Br ce qui conduit aux dérivés 22a-f. Another option is possible to introduce on the GTP-gamma-C linker a function allowing bioconjugation. In this approach, the azido group is introduced on the phosphonic acid using the sequence described in scheme 9. The protocols are described in the literature, for example in Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010 , 26, 10725, or even in The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. The dibromo derivatives react with triethylphosphonite to give compounds 20a-f. The azido function is then introduced by a simple nucleophilic substitution with sodium azide. The di-esters are then hydrolyzed in the presence of TMS-Br which leads to the 22a-f derivatives.
Schéma 9 Figure 9
Le couplage des composés 15a-f, 16a-f, 18a-f ou 22a-f avec les complexes de lanthanide est réalisé en utilisant les techniques classiques connues de l’homme de l’art (schémas The coupling of the compounds 15a-f, 16a-f, 18a-f or 22a-f with the lanthanide complexes is carried out using standard techniques known to those skilled in the art (diagrams
10 à 13). 10 to 13).
Schéma 13 Figure 13
De la même façon que pour les GTP, l’analogue GPPNHP (commercial, CAS : 64564-03- 0) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse. Pour les dérivés substitués en gamma O, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 14. Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 15 et 16. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WO 2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP. In the same way as for the GTPs, the analog GPPNHP (commercial, CAS: 64564-03-0) can be coupled with lanthanide complexes in the gamma position using the same synthetic strategies. For derivatives substituted in gamma O, the synthesis is described for example in scheme 14. For derivatives substituted in gamma N, the syntheses are described in schemes 15 and 16. These couplings were also exemplified in application WO 2009 / 068751 which uses analogues of ATP.
Schéma 14 Figure 14
Schéma 16 Figure 16
De la même façon que pour les GTP, l’analogue GPPCH2P (commercial, CAS : 13912-93- 1 ou 10470-57-2 sous forme de sel de Na)) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse. Pour les dérivés substitués en gamma O, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 17. Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 18 et 19. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WOIn the same way as for the GTPs, the analog GPPCH 2 P (commercial, CAS: 13912-93- 1 or 10470-57-2 in the form of Na salt)) can be coupled with lanthanide complexes in the gamma position using the same synthetic strategies. For derivatives substituted in gamma O, the synthesis is described for example in scheme 17. For derivatives substituted in gamma N, the syntheses are described in schemes 18 and 19. These couplings were also exemplified in application WO
2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP. Schéma 17 2009/068751 which uses analogs of ATP. Figure 17
Schéma 19 Figure 19
L’invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre illustratif. The invention is illustrated by the examples below, given by way of illustration.
Abréviations utilisées Abbreviations used
BRET : Bioluminescence résonance Energy Transfer BRET: Bioluminescence resonance Energy Transfer
BSA : Albumine de sérum bovin BSA: Bovine serum albumin
DMSO : diméthylsulfoxyde DMSO: dimethyl sulfoxide
EDO : N-(3-diméthylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide EDO: N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide
éq : équivalent eq: equivalent
ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif. ESI +: ionization by electrospray in positive mode.
FRET : Forster résonance energy transfer (transfert d’énergie par résonance de type Forster GDP : guanosine diphosphate FRET: Forster resonance energy transfer GDP: guanosine diphosphate
GPCR (RCPG) : G protein-coupled receptors GPCR (RCPG): G protein-coupled receptors
GTP : guanosine triphosphate GTP: guanosine triphosphate
GTPyS : guanosine 5’-[g-thio]triphosphate GTPyS: Guanosine 5 '- [g-thio] triphosphate
h : heure h: hour
HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthanesulfonique HEPES: 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine ethanesulfonic acid
HPLC : chromatographie liquide à haute performance HPLC: high performance liquid chromatography
LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse LC-MS: high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry
LRMS : spectrométrie de masse à faible résolution LRMS: low resolution mass spectrometry
MES : acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid
MOPS : acide 3-morpholino-1 -propanesulfonique MOPS: 3-morpholino-1 -propanesulfonic acid
NOS : isothiocyanate NOS: isothiocyanate
NHS : N-hydroxysuccinimide NHS: N-hydroxysuccinimide
Py : pyridine Py: pyridine
RCPG : récepteurs couplés aux protéines G GPCR: G protein-coupled receptors
TA : température ambiante TA: ambient temperature
TEA : triéthylamine TEA: triethylamine
TRIS : trishydroxyméthylaminométhane TRIS: trishydroxymethylaminomethane
UPLC : chromatographie liquide à ultra haute performance UPLC: ultra high performance liquid chromatography
UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse UPLC-MS: ultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry
UV : Ultraviolet UV: Ultraviolet
Chromatographie Chromatography
Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils : The analytical and preparative high performance liquid chromatographies (HPLC) were performed on two devices:
HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3,5 mm, 4,6 c 100 mm. Analytical HPLC: ThermoScientific, P4000 quaternary pump, UV 1000 deuterium lamp detector (190-350 nm), Waters XBridge C 18 analytical column, 3.5 mm, 4.6 c 100 mm.
HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. C18, 5 mm: 19 c 100 mm ou 50 x 150 mm. Preparative HPLC: Shimadzu, 2 LC-8A pumps, Varian ProStar diode array UV detector, Waters XBridge prep. C18, 5 mm: 19 c 100 mm or 50 x 150 mm.
Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été réalisées sur un appareil Waters Acquity HCIass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barrette de diode de type PDA, soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à 3,2 KV - tension de cône à 30 V. Analytical Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UPLC) was performed on a Waters Acquity HCIass apparatus with either a PDA-type diode array UV detector or a single quadrupole mass detector of type SQD2. The probe used is an electro-spray in positive mode: capillary voltage at 3.2 KV - cone voltage at 30 V.
Gradient A : Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 10 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 - B/ acétonitrile - 1 = 0 à 5 min 1 % B - 1 = 10 min 10 % Gradient A: Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 10 x 100 mm, A / water 25 mM triethylammonium acetate pH 7 - B / acetonitrile - 1 = 0 to 5 min 1% B - 1 = 10 min 10%
B - 20 mL.min-1 à 260 nm. B - 20 mL.min -1 at 260 nm.
Gradient B Gradient B
Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 - B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 40 % B. 1 mL.min-1. Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 4.6 x 100 mm, A / water 25 mM triethylammonium acetate pH 7 - B / acetonitrile - t = 0 to 2 min 2% B - t = 19 min 40% B. 1 mL.min -1 .
Gradient C Gradient C
Colonne Waters Xbridge C18, 3,5 mm, 4,6 x 100 mm - A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - 1 = 1 min 2 % B - 1 = 15 min 40 % B - 1 mL.min 1 Waters Xbridge C column 18 , 3.5 mm, 4.6 x 100 mm - A / water 5 mM ammonium acetate pH 5 B / acetonitrile t = 0 min 2% B - 1 = 1 min 2% B - 1 = 15 min 40% B - 1 mL.min 1
Gradient D Gradient D
Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 19 x 100 mm - A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 6,6 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - 1 = 2,5 min 2 % B - 1 = 27 min 40 % B - 12 mL.min-1 à 280 et 320 nm. Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 19 x 100 mm - A / water 5 mM ammonium acetate pH 6.6 B / acetonitrile t = 0 min 2% B - 1 = 2.5 min 2% B - 1 = 27 min 40% B - 12 mL.min -1 at 280 and 320 nm.
Gradient E Gradient E
Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 19 x 100 mm - A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - 1 = 2 min 2 % B - 1 = 20 min 50 % B - 20 mL.min-1 à 280 et 320 nm. Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 19 x 100 mm - A / water 25 mM triethylammonium acetate pH 7 B / acetonitrile t = 0 min 2% B - 1 = 2 min 2% B - 1 = 20 min 50% B - 20 mL.min -1 at 280 and 320 nm.
Gradient F Gradient F
Colonne Waters Acquity C18, 300 À, 1 ,7 mm, 2,1 x 50 mm - A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - 1 = 0,2 min 2 % B - 1 = 5 min 40 % B - 0,6 mL.min-1 Waters Acquity C column 18 , 300 Å, 1.7 mm, 2.1 x 50 mm - A / water 5 mM ammonium acetate pH 5 B / acetonitrile t = 0 min 2% B - 1 = 0.2 min 2 % B - 1 = 5 min 40% B - 0.6 mL.min -1
Gradient G Gradient G
Colonne Waters XBridge C18, 300 À, 5 mm, 10 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - 1 = 19 min 20 % B - 5 mL.min-1 Waters XBridge C column 18 , 300 Å, 5 mm, 10 x 100 mm - water 25 mM triethylammonium acetate B / acetonitrile t = 0 min 2% B - B - 1 = 19 min 20% B - 5 mL.min -1
Gradient H Gradient H
Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 - B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 50 % B - 1 mL.min-1. Gradient I Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 4.6 x 100 mm, A / water 25 mM triethylammonium acetate pH 7 - B / acetonitrile - t = 0 to 2 min 2% B - t = 19 min 50% B - 1 mL.min -1 . Gradient I
Colonne Waters Xbridge C18, 5 mm, 10 x 100 mm - A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - 1 = 2 min 2 % B - 1 = 27 min 50 % B - 3,5 mL.min-1 à 280 nm. Column Waters Xbridge C 18, 5 mm, 10 x 100 mm - A / water 25 mM triethylammonium acetate pH 7 B / acetonitrile t = 0 min 2% B - 1 = 2 min 2% B - 1 = 27 min 50% B - 3.5 mL.min -1 at 280 nm.
Gradient J Gradient J
Colonne Waters XBridge C18, 5 mm, 19 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - B - 1 = 17 min 45 % B - 20 mL.min-1 Column Waters XBridge C 18, 5 mm, 19 x 100 mm - water 25 mM triethylammonium acetate B / acetonitrile t = 0 min 5% B - B - 1 = 17 min 45% B - 20 mL.min -1
Gradient K Gradient K
Colonne Waters XBridge C18, 300 À, 5 mm, 10 x 100 mm - eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B - 1 = 19 min 40 % B - 5 mL.min 1 Waters XBridge C column 18 , 300 Å, 5 mm, 10 x 100 mm - water 25 mM triethylammonium acetate B / acetonitrile t = 0 min 2% B - B - 1 = 19 min 40% B - 5 mL.min 1
Préparation des composés Preparation of compounds
Préparation 1 : GTP gamma-N-pentyl-NH2 (9c) Preparation 1: GTP gamma-N-pentyl-NH 2 (9c)
Dans un ballon contenant le GTP (10 mg ; 19,1 mmol, 1 éq) en solution dans de l’eau (500 mL), a été ajouté de l’EDC (40 mg ; 210 mmol, 1 1 éq) et une solution de cadavérine (58 mg, 573 mmol, 30 éq) dans du MOPS à pH 8. Le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit à TA avant d’être purifié par HPLC préparative (Gradient A). Un solide blanc est obtenu correspondant au composé 9c (5 mg). (ESI+) : calculée C15H28N7O13P3 [M+H]+, m/z = 608,10 trouvée 608,55. In a flask containing GTP (10 mg; 19.1 mmol, 1 eq) dissolved in water (500 mL), was added EDC (40 mg; 210 mmol, 1 1 eq) and a solution of cadaverine (58 mg, 573 mmol, 30 eq) in MOPS at pH 8. The reaction mixture was stirred overnight at RT before being purified by preparative HPLC (Gradient A). A white solid is obtained corresponding to compound 9c (5 mg). (ESI +): calculated C 15 H 28 N 7 O 13 P 3 [M + H] + , m / z = 608.10 found 608.55.
Préparation 2 : GTP gamma-0-hexyl-C2 Preparation 2: GTP gamma-0-hexyl-C2
A une solution de composé 2c (0,454 mg, 700 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (500 mL) a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NCS (isothiocyanate) (473 mg, 700 nmol) en solution dans du DMSO (200 mL) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant une nuit. L’avancement de la réaction a été suivi par HPLC (gradient B) et UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient D) pour conduire au composé GTP gamma-0 hexyl-C2 (125 mg, 96 nmol, 14%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C40H47EuN10O22P3S- [M+3H]2+, m/z = 650,06 trouvée 650,32. To a solution of compound 2c (0.454 mg, 700 nmol) in 100 mM carbonate buffer pH 9 (500 mL) was added the C2 complex functionalized in its NCS form. (isothiocyanate) (473 mg, 700 nmol) dissolved in DMSO (200 mL) all at once. The mixture was stirred at RT overnight. The progress of the reaction was followed by HPLC (gradient B) and UPLC-MS (Gradient C), after this period, the reaction was complete. The reaction mixture was directly purified by semi-preparative HPLC (Gradient D) to yield the compound GTP gamma-0 hexyl-C2 (125 mg, 96 nmol, 14%) in the form of a white powder LRMS (ESI +): calculated for C 40 H 47 EuN 10 O 22 P 3 S- [M + 3H] 2+ , m / z = 650.06 found 650.32.
Préparation 3 : GTP gamma-O-hexyl-C3 Preparation 3: GTP gamma-O-hexyl-C3
A une solution de composé 2c (0,442 mg, 710 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 mL) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (0,647 mg, 708 nmol) en solution dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 mL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 4 °C pendant une nuit. L’avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient E) pour conduire au composé GTP gamma-0-hexyl-C3 (0,1 1 mg, 70 nmol, 10%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C5oH53CIEuN15022P3- [M+3H]2+, m/z = 749,59 trouvée 750,29. To a solution of compound 2c (0.442 mg, 710 nmol) in 100 mM carbonate buffer pH 9 (200 mL) was added the functionalized C3 complex in its dichlorotriazine form (0.647 mg, 708 nmol) in solution in 100 carbonate buffer. mM pH 9 (200 mL) all at once. The mixture was stirred at 4 ° C overnight. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient C), after this period the reaction was complete. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient E) to yield the compound GTP gamma-0-hexyl-C3 (0.11 mg, 70 nmol, 10%) in the form of a white powder LRMS (ESI +): calculated for C 5 oH 53 CIEuN 15 0 22 P 3 - [M + 3H] 2+ , m / z = 749.59 found 750.29.
Préparation 4: GTP gamma-N-C2 Preparation 4: GTP gamma-N-C2
Le complexe C2 (0,366 mg, 2 mmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM pH 5,5 (150 mL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté le GTP (1 ,32 mg, 2,4 mmol) puis le EDO (1 ,92 mg, 10 mmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 40 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-C2 (60 nmol, 3%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C H N O P EU [M]-, m/z = 1 137,6, trouvée 1 138,2. The C2 complex (0.366 mg, 2 mmol) was solubilized in 500 mM MES buffer pH 5.5 (150 mL) to give a yellow solution. To the reaction mixture was added GTP (1.32 mg, 2.4 mmol) followed by EDO (1.92 mg, 10 mmol) all at once. The mixture was stirred at RT for 40 h. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was partial and no longer progressed. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient G) to yield GTP gamma-N-C2 (60 nmol, 3%) in the form of colorless oil LRMS (ESI +): calculated for CHNOP EU [M] -, m / z = 1137.6, found 1138.2.
Préparation 5: GTP-gamma-N-C3 Preparation 5: GTP-gamma-N-C3
Le complexe C3 (0,366 mg, 480 nmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM pH 5,5 (150 mL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté le GTP (0,317 mg, 576 nmol) puis le EDO (0,460 mg, 2,4 mmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-C3 (45,6 nmol, 9,5%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C4 H4oN1102i P3Eu- [M+2H]+, m/z = 1269,7, trouvée 1269. The C3 complex (0.366 mg, 480 nmol) was solubilized in 500 mM MES buffer pH 5.5 (150 mL) to give a yellow solution. To the reaction mixture was added GTP (0.317 mg, 576 nmol) followed by EDO (0.460 mg, 2.4 mmol) all at once. The mixture was stirred at RT overnight. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was partial and no longer progressed. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient G) to yield GTP gamma-N-C3 (45.6 nmol, 9.5%) in the form of a colorless LRMS oil (ESI +): calculated for C 4 H 4 oN 11 0 2i P 3 Eu- [M + 2H] + , m / z = 1269.7, found 1269.
Préparation 6: GTP-gamma-N-octyl-C2 Preparation 6: GTP-gamma-N-octyl-C2
Le composé 9e (50,0 mL, 500 nmol) a été solubilisé dans de l'eau (100 mL). Au mélange réactionnel a été ajouté de la pyridine (300 mL) et de la triéthylamine (6 mL). Le mélange réactionnel a été ajouté dans un tube contenant le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NOS (isothiocyanate) (0,438 mg, 650 nmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP-gamma-N- octyl-C2 (16,9 nmol, 3,4%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C42H52N11021P3SEu- [M+3H]2+, m/z = 663,5, trouvée 663,9. Compound 9e (50.0 mL, 500 nmol) was solubilized in water (100 mL). To the reaction mixture was added pyridine (300 mL) and triethylamine (6 mL). The reaction mixture was added to a tube containing the functionalized C2 complex in its NOS (isothiocyanate) form (0.438 mg, 650 nmol) all at once. The mixture was stirred at 24 ° C for 12 h. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was partial. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient G) to yield GTP-gamma-N-octyl-C2 (16.9 nmol, 3.4%) as a colorless LRMS oil (ESI +): calculated for C 42 H 52 N 11 0 21 P 3 on ONLY [m + 3H] 2+, m / z = 663.5, found 663.9.
Préparation 7: GTP-gamma-N-octyl-C3 Preparation 7: GTP-gamma-N-octyl-C3
A une solution de composé 9e (0,545 mg, 840 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (500 mL) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (400 mg, 438 nmol) en solution dans de l’eau (200 mL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 20°C pendant une nuit. L’avancement de la éaction a été suivi par HPLC (Gradient H) et UPLC-MS (Gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient I) pour conduire au composé GTP gamma-N octyl C3 (7,6 mg, 5 nmol, 1 %) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C52H58CIEuN1602i P3- [M+3H]2+, m/z = 763,1 1 trouvée 763,29. To a solution of compound 9e (0.545 mg, 840 nmol) in 100 mM carbonate buffer pH 9 (500 mL) was added the functionalized C3 complex in its dichlorotriazine form (400 mg, 438 nmol) dissolved in water. (200 mL) all at once. The mixture was stirred at 20 ° C overnight. The progress of the reaction was followed by HPLC (Gradient H) and UPLC-MS (Gradient C). After this period, the reaction was complete. The reaction mixture was directly purified by semi-preparative HPLC (Gradient I) to yield the compound GTP gamma-N octyl C3 (7.6 mg, 5 nmol, 1%) in the form of a white powder LRMS (ESI +): calculated for C 52 H 58 CIEuN 16 0 2i P 3 - [M + 3H] 2+ , m / z = 763.1 1 found 763.29.
Préparation 8: GTP-gamma-N-hexyl-C11 Preparation 8: GTP-gamma-N-hexyl-C11
A une solution de composé 9d (0,62 mg, 1 mmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (900 mL) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS (1 ,47 mg, 1 mmol) en solution dans du DMSO anhydre (122 mL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 1 h. L’avancement de la réactbn a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient J) pour conduire au composé GTP-gamma-N- hexyl-C1 1 (0,52 mg, 258 nmol, 26%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C80H109N20O27P3Tb3+ [M-H]2+, m/z = 1018,9, trouvée 1019,6, [M+2Na+- 3H]2+, m/z = 1040,8, trouvée 1041 ,6. To a solution of compound 9d (0.62 mg, 1 mmol) in 50 mM HEPES buffer pH 8 (900 mL) was added the functionalized C11 complex in the form of an NHS ester (1.47 mg, 1 mmol) in solution. in anhydrous DMSO (122 mL) all at once. The mixture was stirred at 24 ° C for 1 h. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was complete. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient J) to yield the compound GTP-gamma-N- hexyl-C 1 1 (0.52 mg, 258 nmol, 26%) as white powder LRMS (ESI +): calculated for C 80 H 109 N 20 O 27 P 3 Tb 3+ [MH] 2 + , m / z = 1018.9, found 1019.6, [M + 2Na + - 3H] 2 + , m / z = 1040.8, found 1041.6.
Préparation 9: GTP-gamma-N-octyl-C1 1 Preparation 9: GTP-gamma-N-octyl-C 1 1
A une solution de composé 9e (0,32 mg, 500 nmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (300 mL) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS (0,76 mg, 500 nmol) en solution dans du DMSO anhydre (102 mL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 1 h. L’avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient K) pour conduire au composé GTP- gamma N-octyl C1 1 (0,22 mg, 105 nmol, 21%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C82H117N20O27P3Tb3+ [M-2H]+, m/z = 2064,8, trouvée 2064,1. To a solution of compound 9e (0.32 mg, 500 nmol) in 50 mM HEPES buffer pH 8 (300 mL) was added the C11 complex functionalized in the form of NHS ester (0.76 mg, 500 nmol) in solution. in anhydrous DMSO (102 mL) all at once. The mixture was stirred at 24 ° C for 1 h. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient F), after this period the reaction was complete. The reaction mixture was directly purified by preparative HPLC (Gradient K) to yield the compound GTP-gamma N-octyl C1 1 (0.22 mg, 105 nmol, 21%) in the form of a white powder LRMS (ESI +): calculated for C 82 H 117 N 20 O 27 P 3 Tb 3+ [M-2H] + , m / z = 2064.8, found 2064.1.
Préparation 10: GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2 Preparation 10: GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2
Le composé 9e (0,649 mg, 1 mmol) en solution dans de l'eau (100 mL) a été dilué dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (757 mL) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NHS (ester de N- hydroxysuccinimide) (750 mL, 1 mmol) en solution dans du DMSO anhydre (143 mL) en une seule fois. La réaction a été agitée à 25 °C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient B). Après cette période, la réaction n’était pas totale. Malgré cela, le mélange réactionnel a été purifié 2 fois par HPLC préparative (Gradient E). Les fractions correspondant au produit attendu ont été collectées puis concentrées sous pression réduite pour conduire au composé GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (0,241 mmol, 24%) sous forme d'une solution incolore. LRMS (ESI+) : calculée pour C51H68EuN 3024P3S2 + [M+H]+, m/z = 1555.8, trouvée 1555.8. Compound 9e (0.649 mg, 1 mmol) dissolved in water (100 mL) was diluted in 50 mM HEPES buffer pH 8 (757 mL) to give a colorless solution. To the reaction mixture was added the functionalized C2 complex in its NHS (N-hydroxysuccinimide ester) form (750 mL, 1 mmol) dissolved in anhydrous DMSO (143 mL) all at once. The reaction was stirred at 25 ° C for 1 h. The progress of the reaction was followed by UPLC-MS (Gradient B). After this period, the reaction was not complete. Despite this, the reaction mixture was purified twice by preparative HPLC (Gradient E). The fractions corresponding to the expected product were collected and then concentrated under reduced pressure to yield the compound GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (0.241 mmol, 24%) in the form of a colorless solution. LRMS (ESI +): calculated for C 51 H 68 EuN 3 0 24 P 3 S 2 + [M + H] + , m / z = 1555.8, found 1555.8.
Tests de liaison Link tests
Matériels Materials
- les préparations membranaires de cellules exprimant des RCPG et la protéine G-alpha-i (Gai) ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés : - membrane preparations of cells expressing RCPGs and the G-alpha-i protein (Gai) were purchased from Perkin Elmer or Euroscreen. The table below lists the cell backgrounds and references of the different samples used:
[Tableau 1] [Table 1]
Cisbio Bioassays sur demande (sous la référence DSV36S). L’anticorps a été marqué avec la sonde fluorescente d2 (accepteur rouge) compatible pour une détection TR- FRET. L’anticorps DSV36S se lie au niveau du switch II de la protéine Gai. Cisbio Bioassays on request (under the reference DSV36S). The antibody was labeled with the fluorescent d2 probe (red acceptor) compatible for TR-FRET detection. The DSV36S antibody binds to switch II of the Gai protein.
- les nucléotides GTP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877 et G8634). - the GTP and GTPyS nucleotides were purchased from Sigma Aldrich (respective catalog references G8877 and G8634).
- les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075). - the 384-well Low-volume, white plates with a white background were purchased from Greiner Bio One (Catalog reference 784075).
- les analogues de GTP non hydrolysables / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs de type complexes de lanthanides ont été synthétisés à Cisbio Bioassays. - Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues labeled with donor fluorophores of the lanthanide complex type were synthesized at Cisbio Bioassays.
Méthodes Methods
Préparation des réactifs Preparation of reagents
Hormis autre mention spécifique, tous les réactifs ont été dilués dans du tampon Tris HCl 50 mM pH 7,4, MgCI2 10 mM, BSA 0,1%, NaCI 10 mM. Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 10mg/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPyS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 mM. L’anticorps anti Gai DSV36S-d2 utilisé pour la détection a été préparé 4X pour viser la concentration finale dans les puits de 10 nM. Les analogues GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables marqués avec des sondes fluorescentes donneur (complexes de lanthanides) ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure. Except for other specific mention, all reagents were diluted in 50 mM Tris HCl buffer pH 7.4, 10 mM MgCl 2 , 0.1% BSA, 10 mM NaCl. The membranes were prepared 4X to dispense 1 or 10 mg / well (amount specified in the legend of each figure). The GTPyS nucleotide (non-specific signal condition) was prepared 6.67X to obtain a final concentration in the wells of 100 mM. Anti Ga DSV36S-d2 antibody used for detection was prepared 4X to aim for the final concentration in the 10 nM wells. Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogs labeled with fluorescent donor probes (lanthanide complexes) were prepared 4X to target the final concentrations in the wells mentioned in the captions of each figure.
Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits : Distribution of reagents in 384-well plates:
Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 mL Membranes expressing RCPG and G protein: 5 mL
- Tampon ou nucléotide GTPyS (pour la condition signal non spécifique) : 3 mL - GTPyS buffer or nucleotide (for the non-specific signal condition): 3 mL
- Analogue GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables - donneur : 5 mL - Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analog - donor: 5 mL
- Anticorps anti Gai -accepteur (DSV36S-d2) : 5 mL - Anti Gay antibody -acceptor (DSV36S-d2): 5 mL
- Tampon : 2 mL - Buffer: 2 mL
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPyS (10 ou 100 mM). The nonspecific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing an excess of GTPyS (10 or 100 mM).
Lecture du signal HTRF Reading the HTRF signal
Les plaques ont été incubées à 21 °C pendant 20 h puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante : The plates were incubated at 21 ° C for 20 h then the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
- Module : HTRF (Excitation 337 nm, Emission 665 nm et 620 nm) - Module: HTRF (Excitation 337 nm, Emission 665 nm and 620 nm)
- Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs - Excitation: laser, 40 flashes or lamp, 100 flashes
- Fenêtre de lecture : délais : 60 ms - Intégration : 400 ps - Reading window: delays: 60 ms - Integration: 400 ps
Traitement du signal Signal processing
A partir des signaux bruts à 665 nm et 620 nm, le Ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante : From the raw signals at 665 nm and 620 nm, the HTRF Ratio was calculated according to the following formula:
Ratio HTRF = [(Signal à 665nm) / (Signal à 620nm)] x 10 000 HTRF Ratio = [(Signal at 665nm) / (Signal at 620nm)] x 10,000
Format de l’essai Test format
La figure 2 illustre le format d’essai utilisé pour détecter la liaison des composés de formule (I) à la protéine G. Une préparation membranaire comportant des RCPG et des protéines Gai est incubée en présence des composés à tester et d’un anticorps anti- protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur, en présence ou en absence d’un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (typiquement, du GTPyS). Lorsque les deux partenaires de FRET (composé à tester et anticorps anti-protéine Ga) se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparaît (partie gauche de la figure : « Signal Total ») et se démarque du signal non spécifique (bruit de fond correspondant à la partie droite de la figure : « Signal Non Spécifique ») qui comporte un fort excès de GTPyS non marqué (déplacement de l’analogue GTP fluorescent). Figure 2 illustrates the assay format used to detect the binding of compounds of formula (I) to protein G. A membrane preparation comprising RCPG and Ga proteins is incubated in the presence of the compounds to be tested and an anti antibody - Ga protein labeled with an acceptor fluorophore, in the presence or absence of a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP analogue (typically GTPyS). When the two FRET partners (compound to be tested and anti-Ga protein antibody) bind to the same Ga protein, a FRET signal appears (left part of the figure: “Total signal”) and stands out from the non-specific signal ( background noise corresponding to the right part of the figure: “Non-Specific Signal”) which comprises a strong excess of unlabeled GTPyS (displacement of the fluorescent GTP analog).
Exemple 1 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-C2 Example 1 - Binding test of the GTPgN-C2 analog
La capacité du couple GTPgN-C2 (préparation 2) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 mg par puits). Le GTPgN-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 16,6) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 3). The ability of the GTPgN-C2 (preparation 2) / anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO-K1 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (10 mg per well). GTPgN-C2 has been used at a final concentration of 6nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / non-specific signal = 16.6) observed between these two conditions shows that the GTPgN-C2 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR-FRET signal. with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 3).
Exemple 2 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-C3 Example 2 - Binding test of the GTPgN-C3 analog
La capacité du couple GTPgN-C3 (préparation 5) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 mg par puits). Le GTPgN-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1 ,7) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-C3 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Ga-accepteur (Figure 4). The ability of the GTPgN-C3 (preparation 5) / anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing RCPG Delta Opioid and Gai protein (1 mg per well). GTPgN-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / nonspecific signal = 1.7) observed between these two conditions shows that the GTPgN-C3 analog is able to bind to the Gai protein and generate a TR-FRET signal. with an anti Ga-acceptor antibody (Figure 4).
Exemple 3 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2 Example 3 - Binding test of the GTPgN-octyl-C2 analog
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 mg par puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 pM). La différence de signal TR- FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 12,4) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 5). The ability of the GTPgN-octyl-C2 (preparation 6) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells. K1 expressing Delta Opioid GPCR and GaI protein (10 mg per well). GTPgN-octyl-C2 was used at a final concentration of 6nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 pM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / nonspecific signal = 12.4) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C2 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR signal. -FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 5).
Exemple 4 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C11 Example 4 - Binding test of the GTPgN-octyl-C11 analog
La capacité du couple GTPgN-octyl-C1 1 (préparation 9) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 mg par puits). Le GTPgN-octyl-C1 1 a été utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,6) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C1 1 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 6). Exemple 5 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C3 The ability of the GTPgN-octyl-C1 1 (preparation 9) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO cells. -K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the GaI protein (10 mg per well). GTPgN-octyl-C1 1 was used at a final concentration of 6 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / non-specific signal = 7.6) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C1 1 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a signal TR-FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 6). Example 5 - GTPgN-octyl-C3 Analog Binding Assay
La capacité du couple GTPgN-octyl-C3 (préparation 7) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 mg par puits). Le GTPgN-octyl-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR- FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1 ,4) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C3 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 7). The ability of the GTPgN-octyl-C3 (preparation 7) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (1 mg per well). GTPgN-octyl-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / nonspecific signal = 1, 4) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C3 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR signal. -FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 7).
Exemple 6 - Test de liaison de l’analogue GTPgO-hexyl-C2 Example 6 - Binding test of the GTPgO-hexyl-C2 analog
La capacité du couple GTPgO-hexyl-C2 (préparation 2) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 mg par puits). Le GTPgO-hexyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR- FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,1 ) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgO-hexyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 8). The ability of the GTPgO-hexyl-C2 (preparation 2) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells. K1 expressing Delta Opioid GPCR and GaI protein (10 mg per well). GTPgO-hexyl-C2 was used at a final concentration of 6 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / nonspecific signal = 7.1) observed between these two conditions shows that the GTPgO-hexyl-C2 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR signal. -FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 8).
Exemple 7 - Test de liaison de l’analogue GTPgO-hexyl-C3 Example 7 - Binding test of the GTPgO-hexyl-C3 analog
La capacité du couple GTPgO-hexyl-C3 (préparation 3) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 mg par puits). Le GTPgO-hexyl-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR- FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1 ,3) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgO-hexyl-C3 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 9). The ability of the GTPgO-hexyl-C3 (preparation 3) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the GaI protein (1 mg per well). GTPgO-hexyl-C3 was used at a final concentration of 1 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / nonspecific signal = 1, 3) observed between these two conditions shows that the GTPgO-hexyl-C3 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR signal. -FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 9).
Exemple 8 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2 Example 8 - Binding test of the GTPgN-octyl-C2 analog
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti-Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Gai (10 mg par puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 3,8) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 10). The ability of the GTPgN-octyl-C2 (preparation 6) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells. K1 expressing Dopamine D2S GPCR and Ga1 protein (10 mg per well). GTPgN-octyl-C2 has been used at a final concentration of 6 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a strong excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / non-specific signal = 3.8) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C2 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a TR signal. -FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 10).
Exemple 9 - Effet de la concentration en membranes et en analogue GTP- lanthanide sur le test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2 Example 9 - Effect of the concentration of membranes and GTP-lanthanide analog on the binding test of the GTPgN-octyl-C2 analog
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 ou 10 mg / puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 2 ou 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPyS (100 mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total (S) / signal non spécifique (B)) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figures 1 1 A et 1 1 B). Par ailleurs, il ressort de la figure 1 1 A qu’une augmentation de l’amplitude de signal (S/B) est observée en augmentant la quantité de membrane de 1 à 10 mg par puits. Il ressort de la figure 1 1 B qu’une augmentation de l’amplitude du signal (S/B) est observée en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6 nM. Exemple 10 - Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 The ability of the GTPgN-octyl-C2 (preparation 6) / anti-Ga DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells. K1 expressing Delta Opioid GPCR and GaI protein (1 or 10 mg / well). GTPgN-octyl-C2 was used at a final concentration of 2 or 6 nM in the wells. The membranes were incubated in the absence or presence of a large excess of GTPyS (100 mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal (S) / non-specific signal (B)) observed between these two conditions shows that the analog GTPgN-octyl-C2 is capable of binding to the Gai protein and generating a TR-FRET signal with an anti Ga1-acceptor antibody (Figures 11 A and 11 B). Furthermore, it emerges from Figure 11A that an increase in the signal amplitude (S / N) is observed by increasing the amount of membrane from 1 to 10 mg per well. It can be seen from Figure 11B that an increase in the signal amplitude (S / N) is observed by increasing the concentration of GTPgN-octyl-C2 from 2 to 6 nM. Example 10 - Binding test of the GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 analog
La capacité du couple GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 (préparation 10) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 mg par puits). Les réactifs ont été dilués en tampon Tris HCl 50 mM pH 7,4, MgCI2 60 mM, BSA 0,1%, NaCI 150 mM. Le GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 a été utilisé à une concentration finale de 7,5 nM dans les puits. Les conjugués fluorescents ont été incubées en absence ou en présence de préparation membranaire. La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 2,8) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 12). The ability of the GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 (preparation 10) / anti-Gai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO cells. -K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the GaI protein (10 mg per well). The reagents were diluted in 50 mM Tris HCl buffer pH 7.4, 60 mM MgCl 2 , 0.1% BSA, 150 mM NaCl. GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 was used at a final concentration of 7.5 nM in the wells. The fluorescent conjugates were incubated in the absence or in the presence of membrane preparation. The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF total signal / non-specific signal = 2.8) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 analog is capable of binding to the Gai protein and generating a signal. TR-FRET with an anti Ga1-acceptor antibody (Figure 12).

Claims

Revendications Claims
1. Composé de formule (I) : 1. Compound of formula (I):
dans laquelle : in which :
X = 0, NH ou CH2 ; X = 0, NH or CH 2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ; Y = 0, NH or CH 2 ;
L est un groupe de liaison divalent ; L is a divalent linking group;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 ; Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n’est pas le {2,2',2",2"'-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4- {[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}- tétrakis(acétato)}europium(lll). it being understood that when X represents NH and LY represents an octylamino group then Ln 3+ is not the {2,2 ', 2 ", 2"' - {[[2- (4-isothiocyanatophenyl) -ethyl] imino] bis (methylene) bis {4- {[4- (R-Dglucopyranoxy) phenyl] ethynyl} pyridin-6,2-diyl} bis- (methylenenitrilo)} - tetrakis (acetato)} europium (III).
2. Composé selon la revendication 1 , dans lequel Y = O. 2. A compound according to claim 1, wherein Y = O.
3. Composé selon la revendication 1 , dans lequel Y = NH. 3. A compound according to claim 1, wherein Y = NH.
4. Composé selon la revendication 1 , dans lequel Y = CH2. 4. A compound according to claim 1, wherein Y = CH 2 .
5. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L est choisi parmi : 5. A compound according to any preceding claim, wherein L is selected from:
- une liaison directe ; - a direct link;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ; - a linear or branched C 1 -C 20 , preferably C 1 -C 8 , alkylene group optionally containing one or more double or triple bonds;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; ou - a C 5 -C 8 cycloalkylene group; or
- un groupe arylène en C6-C14 ; - a C 6 -C 14 arylene group;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l’oxygène, l’azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more several carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 14 aryl, sulfonate or oxo.
6. Composé selon la revendication 5, dans lequel L est choisi parmi l’un des groupes suivants : 6. A compound according to claim 5, wherein L is selected from one of the following groups:
— (CH2)n— . — (CH2)n-0- (CH2)m-0-(CH2)p— ; - (CH 2 ) n -. - (CH 2 ) n -0- (CH 2 ) m -0- (CH 2 ) p - ;
dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. in which n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer ranging from 1 to 6, preferably from 1 to 4.
7. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l’un quelconque des complexes C1 à C90. 7. A compound according to any one of the preceding claims, in which Ln 3+ is chosen from any one of the complexes C1 to C90.
8. Composé selon la revendication 7, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17, C24 à C32 et C36 à C44. 8. A compound according to claim 7, wherein Ln 3+ is selected from one of the complexes C1 to C17, C24 to C32 and C36 to C44.
9. Composé selon la revendication 8, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C1 1 . 9. A compound according to claim 8, in which Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C1 1.
10. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe G3 est un groupe de formule : 10. A compound according to any one of the preceding claims, in which the group G 3 is a group of formula:
où w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. where w varies from 0 to 8 and v is equal to 0 or 1, and Ar is a saturated or unsaturated 5 or 6 membered heterocycle, comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
1 1. Composé selon la revendication 1 , qui est choisi parmi le GTP gamma-O-hexyl-1 1. A compound according to claim 1, which is selected from GTP gamma-O-hexyl-
C2, le GTP gamma-0-hexyl-C3, le GTP gamma-N-C2, le GTP-gamma-N-C3, le GTP- gamma-N-octyl-C2, le GTP-gamma-N-octyl-C3, le GTP-gamma-N-hexyl-C11 , le GTP- gamma-N-octyl-C11 et le GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2. C2, GTP gamma-0-hexyl-C3, GTP gamma-N-C2, GTP-gamma-N-C3, GTP-gamma-N-octyl-C2, GTP-gamma-N-octyl-C3 , GTP-gamma-N-hexyl-C11, GTP-gamma-N-octyl-C11 and GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2.
12. Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 1 1 pour identifier des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. 12. Use of a compound according to any one of claims 1-1 to identify molecules capable of modulating the activation of a receptor coupled to G proteins.
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