JP2005027513A

JP2005027513A - Method for expressing homoiothermism

Info

Publication number: JP2005027513A
Application number: JP2003193176A
Authority: JP
Inventors: Kikuichi Ito; 菊一伊藤
Original assignee: Iwate University
Current assignee: Iwate University
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2005-02-03

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a more effective system of expressing homoiothermism by utilizing a protein related to an exothermic reaction of a plant. <P>SOLUTION: A method for expressing the homoiothermism in an animal or a plant individual or an animal or a plant cell is provided. In the method, an exogenous AOX [alternative oxidase (a cyanide-resistant respiratory enzyme)] and an exogenous 5-pass transmembrane type uncoupling protein are co-expressed. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、動植物細胞または動植物個体に恒温性を発現させる方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、恒温性機能発現による低温回避植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満の治療に関する医学分野、植物由来の温度制御素材開発等を含む工学分野、環境浄化微生物開発のための遺伝子工学分野において有用な恒温性の発現方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
一般に植物は発熱あるいは恒温維持能力がなく、その体温は気温の変化とともに変動するものと考えられているが、ある種の植物には自ら発熱し、その体温を外気温より高い温度に保つことができるものがある。特に、我が国に自生し、早春に開花するザゼンソウは、氷点下を含む外気温の変動にもかかわらず、その肉穂花序の温度を２５℃程度に維持できることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。このようなザゼンソウに見られる体温維持現象は、植物における恒温性維持メカニズムの存在を明示しており、近年、ザゼンソウを模倣した発熱制御デバイスの開発への期待が高まっている。従来、発熱能力を持たない作物においては、低温障害あるいは凍結障害がその生産性を制限する最も重要な因子であるとされており（非特許文献３）、熱産生および恒温性発現に関わる遺伝子を用いた、“恒温性維持能力を有する低温回避作物の開発”は、農業分野における食糧問題に対する多大な貢献が予想される。
【０００３】
このような発熱植物の恒温性の維持メカニズムについては、恒温植物自体が極めて例外的な存在であるため、関連する遺伝子等に関わる研究は多くはない。これまで報告されている植物界における恒温植物は、ザゼンソウとハスの２つの植物種のみであり（非特許文献１、非特許文献４）、解析が進んでいる発熱関連遺伝子も限定されている。一方、ザゼンソウの恒温性に関わる生理学的研究からは、そのメカニズムには、発熱部位である肉穂花序における呼吸が重要であるとされてきた（非特許文献１）。ザゼンソウの肉穂花序における呼吸量は、外気温の変動と逆相関の関係にあることから、発熱細胞内のミトコンドリアにおける呼吸活性の調節がその体温維持に密接に関連するものと推定されている（非特許化文献１）。
【０００４】
このような呼吸活性の調節に関わる因子としては、哺乳動物における非ふるえ熱産生の主たる原因因子である脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ：ＵＣＰ）の重要性が指摘されている（非特許文献５）。ＵＣＰはミトコンドリア内膜内外に生じたＨ^＋をＡＴＰ合成と共役することなく、マトリックス内に流入させる機能を有する。哺乳動物におけては、少なくとも５種類のＵＣＰ（ＵＣＰ１〜ＵＣＰ４およびＢＭＣＰ１）の存在が報告されているが（非特許文献６）、この出願の発明者はザゼンソウが少なくとも２種類のＵＣＰ関連タンパク質（ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ）を持つことを明らかにし、それれらを特許出願している（特許文献１）。ザゼンソウが持つ２つのＵＣＰ因子のうちの１種であるＳｆＵＣＰｂは、植物および哺乳動物において従来知られているいずれのＵＣＰとも異なるトポロジーを有している（図１、非特許文献５）。一方、ＳｆＵＣＰａと命名した哺乳動物および非発熱植物に広く分布する６回膜貫通型タイプのＵＣＰ因子の発現は極めて微少であり、かつ、その発現分布にも明確な組織特異性が観察されないことから（図３）、その熱産生への寄与は小さいことが推定されている。一方、ＤｅａｄＨｏｒｓｅと呼ばれる発熱植物からもザゼンソウのＳｆＵＣＰａに相当する因子（ＨｍＵＣＰａ）が同定されているが（特許文献３）、その転写産物は、発熱組織において特異的な発現が認められないことから（非特許文献７）、植物においては、哺乳動物で重要な働きを有している６回膜貫通型ＵＣＰ因子は直接あるいは単独でその熱産生あるいは恒温性の維持に関与している可能性は低い。
【０００５】
一方、ミトコンドリアで機能する熱産生因子として、脱共役タンパク質以外に、代替酸化酵素（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｏｘｉｄａｓｅ：ＡＯＸ）の関与も示唆されている（非特許文献８）。ＡＯＸは、ミトコンドリアにおいてユビキノンから供与された電子用いて酸素を還元することにより呼吸活性を上昇させる機能を持つ因子である（非特許文献９）。ＡＯＸによる酸化反応は、シアンなどのチトクロームｃ酸化経路の阻害剤に耐性をもつことから、シアン耐性呼吸酵素とも呼称されている。このＡＯＸは、ヨーロッパに自生するＶｏｏｄｏｏｌｉｌｙと呼ばれる発熱植物において顕著にその活性が増大することが報告されており、植物の主たる発熱因子であると考えられていた（非特許文献１０）。一方、恒温動物においてはＡＯＸに相当する因子の存在は確認されておらず、ＡＯＸは植物独自の発熱関連因子であるとされている。しかしながらこれまでの研究により、非発熱植物であるタバコやシロイヌナズナにおいてもＡＯＸタンパク質が存在していることが示され、さらに、タバコＡＯＸタンパク質を過剰発現させるタバコが作成されているが、この形質転換タバコにおける発熱現象は確認できなかった旨の報告がなされている（非特許文献８）。なお、この出願の発明者は、ザゼンソウ由来のＡＯＸタンパク質とその遺伝子を同定し、特許出願している（特願２００３−０３８８７４号）。また発明者は、ＤｅａｄＨｏｒｓｅ由来のＡＯＸタンパク質とその遺伝子を同定し、特許出願している（特願２００３−９５７９９号）。
【０００６】
このように、それぞれの作用機構が異なるＵＣＰおよびＡＯＸについては、それぞれ、恒温動物および発熱植物における発熱因子として個別に位置づけられており、両者を同一の恒温植物種で詳細に解析した事例はこれまで存在していなかった。
【０００７】
さらに、哺乳動物の恒温性の維持には、神経系を介したアドレナリンを含む各種ホルモンの作用が密接に関与していることが知られているが、神経系を有さない植物における恒温性のメカニズムには、植物独自の制御システムが存在するものと考えられていた。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４４８９号公報
【非特許文献１】
Ｋｎｕｔｓｏｎ（１９７４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１８６−１８７．
【非特許文献２】
Ｉｔｏｅｔａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｉｎｐｒｅｓｓ．
【非特許文献３】
Ｌｅｖｉｔｔ（１９８０）Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｐｌａｎｔｓｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ．２^ｎｄｅｎｄ
【非特許文献４】
Ｓｅｙｍｏｕｒ＆Ｓｃｈｕｌｔｚｅ−Ｍｏｔｅｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ２８３，３０５．
【非特許文献５】
Ｉｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．（１９９９）ＰｌａｎｔＳｃｉ．１４２，５７−６５．
【非特許文献６】
Ｂｏｕｉｌｌａｕｄｅｔａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１５０４，１０７−１１９．
【非特許文献７】
Ｉｔｏｅｔａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５４，１１１３−１１１４．
【非特許文献８】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ＆ＭｃＩｎｔｏｓｈ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，７０３−７３４．
【非特許文献９】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ（１９９４）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０５，７８１−７８６．
【非特許文献１０】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅｅｔａｌ．（１９９４）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０６，１５０３−１５１０．
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
植物の発熱反応を利用した恒温性維持に関わるシステムは、低温環境下においても、目的とする個体組織あるいは器官の温度を発熱により一定に保温することを可能とする技術である。これは、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた低温回避作物の開発などに極めて有用な手段を提供する。この出願の発明者が既に発明したザゼンソウ由来の脱共役タンパク質ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ（特許文献１）、ザゼンソウ由来のＳｆ−ＡＯＸ（特願２００３−０３８８７４号）さらに、新規発熱植物であるＤｅａｄＨｏｒｓｅ由来のＨｍ−ＡＯＸ（特願２００３−９５７９９号）は、恒温性発現システムを構築するための有力な材料である。
【００１０】
この出願の発明は、この出願の発明者による前記の先願発明をさらに発展させ、より有効な恒温性発現システムを提供することを課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するためのものとして、以下の（１）〜（８）の発明を提供する。
（１）動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法であって、外来性シアン耐性呼吸酵素および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現させることを特徴とする方法。
（２）外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆ−ＡＯＸである前記発明（１）の方法。
（３）外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＤｅａｄＨｏｒｓｅ由来シアン耐性呼吸酵素Ｈｍ−ＡＯＸである前記発明（１）の方法。
（４）外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質が、ザゼンソウ由来脱共役タンパク質ＳｆＵＣＰｂである前記発明（１）の方法。
（５）シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドおよび５回膜貫通型脱共役タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを保有し、シアン耐性呼吸酵素および５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現する発現ベクター。
（６）シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである前記発明（５）の発現ベクター。
（７）シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである前記発明（５）の発現ベクター。
（８）前記発明（１）から（４）のいずれかの方法によって恒温性を獲得した動植物個体または動植物細胞。
【００１２】
すなわち、この出願の発明者は、発熱中のザゼンソウ個体から、葉、仏炎苞、肉穂花序、および、根を採取し、それぞれの全ＲＮＡを調製し、ＳｆＡＯＸならびにＳｆＵＣＰｂ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして公知の方法によりｍＲＮＡの発現量をノーザン解析した結果、図３に示したおり、ザゼンソウの発熱部位である肉穂花序における両遺伝子の発現が最も高いことを明らかにした。そしてこの結果から、ザゼンソウの肉穂花序における恒温発熱特性においては、二種類の作用機作の異なる因子であるＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂの共発現が重要であることを見出し、前記の発明を完成させた。
【００１３】
なお、前記発明において、恒温性の発現対象である「動植物個体または動植物細胞」とは、例えば、恒温性を持たない動植物個体やその細胞、あるいは低温環境下でその機能を低下させる動植物個体等である。また、低温保存によってその機能を低下される動植物培養細胞や、組織および器官等も含まれる。「外来性」とは、前記の動植物個体やその細胞には内在しないことを意味する。例えば、ザゼンソウ由来の脱共役タンパク質（ＵＣＰｂ）を用いる場合は、ザゼンソウ以外の動植物個体や細胞が対象となる。
【００１４】
また、この発明において、「酵素」、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジン糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個結合した分子を言う。
【００１６】
また、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、外来性のシアン耐性呼吸酵素（ＡＯＸ）および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質（ＵＣＰｂ）を共発現させることによって、動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法である。
【００１８】
ＵＣＰｂは特許文献１の配列番号３に示されているＳｆＵＣＰｂ、ＡＯＸとしては配列番号２のアミノ酸配列からなるザゼンソウ由来Ｓｆ−ＡＯＸまたは配列番号４のアミノ酸配列からなるＤｅａｄＨｏｒｓｅ由来Ｈｍ−ＡＯＸを使用することができる。
【００１９】
具体的な方法は、例えば、前記のＵＣＰｂをコードするポリヌクレオチド（特許文献１の配列番号１）と、Ｓｆ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）またはＨｍ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を動植物個体または動植物細胞に導入し、両者を共発現させる。また、配列番号１および３のポリヌクレオチドは、その一部連続配列であってもよい。すなわち、それぞれのタンパク質コード領域を構成する配列（配列番号１の１０３−１１５２ｎｔ、配列番号３の１３４−１１７１ｎｔ）である。またＳｆ−ＡＯＸおよびＨｍ−ＡＯＸは、ミトコンドリア移行シグナルペプチドとミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能する成熟タンパク質領域からなっている。従って、この発明の方法では、ＡＯＸの成熟タンパク質領域のみを発現させるようにしてもよい。その場合のポリヌクレオチドは、Ｓｆ−ＡＯＸの場合は配列番号１の１６６−１５２２ｎｔ、Ｈｍ−ＡＯＸの場合は、配列番号３の３１７−１１６８ｎｔである。
【００２０】
動植物細胞にポリヌクレオチドを導入する場合には、動植物種に応じたプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターにポリヌクレオチドを挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いて細胞に導入すればよい。
【００２１】
また、動物個体にポリヌクレオチドを導入する場合には、例えば、前記の発現ベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込み、動物個体内に導入する方法を採用することもできる。また、非ヒト動物個体の場合には、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ７７；７３８０−７３８４，１９８０）に従って、動物個体の全ての体細胞においてＵＣＰｂおよびＡＯＸを共発現させるようにしてもよい。
【００２２】
さらに、植物個体にポリヌクレオチドを導入する場合には、植物の種類等に応じて、公知の方法を適宜に採用して行うことができる。すなわち、リーフディスク共存培養法（ＥＭＢＯＪ．６：２５３１，１９８７）、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ３３８：２７４，１９８９、ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ１１：１９９，１９９４、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１０：１０６，１９９１）、アグロバクテリウム法（ＰｌａｎｔＪ．６：２７１，１９９４、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１１１５，１９９４、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１５，１９８８）、パーティクルガン法（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１４：５８６，１９９５、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｎｅｔ．７９：３３７，１９９０）等である。
【００２３】
以上の方法によって、ＵＣＰｂおよびＡＯＸを共発現する動植物個体または動植物細胞（発明（８））が得られる。
【００２４】
なお、ＵＣＰｂポリヌクレオチドとＡＯＸポリヌクレオチドは、それぞれ別個の発現ベクターに組み込み、それらはコトランスフェクションすることもできる。あるいは発明（５）〜（７）の発現ベクターを使用することもできる。すなわち発明（５）の発現ベクターは、１個のベクター内にＵＣＰｂポリヌクレオチドとＡＯＸポリヌクレオチドを保有している。この場合に、両ポリヌクレオチドは、それぞれのリーディングフレームを一致させてＵＣＰｂおよびＡＯＸを融合タンパク質として発現させるようにしてもよく、あるいはＵＣＰｂおよびＡＯＸをそれぞれ別個の成熟タンパク質として発現させるものであってもよい。
【００２５】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】
以下は、恒温性を示すザゼンソウ肉穂花序におけるＳｆＡＯＸおよびＳｆＵＣＰｂのより詳細な発現例を記述したものである。ザゼンソウの花が密集している器官である肉穂花序は、雌雄異熟と呼ばれる特性を示し、その分化の過程において、雌期から両生期を経て雄期へと変化する。一般的に、雌期は肉穂花序表面に多数のめしべが観察される時期であり、両生期は、その表面の一部に花粉が認められ始める時期を指す。その後、肉穂花序には、花粉が出現し、雄期と呼ばれる時期に入る。興味深いことに、ザゼンソウで見られる恒温性は、その発熱部位である肉穂花序が雌期においてのみ特徴的に観察される。この肉穂花序の組織切片を拡大した画像が図４である。肉穂花序表面により近いところに小花と呼ばれる部分があり、その内側には、維管束が存在している。発熱中の肉穂花序断片を用いてｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果が図５である。アンチセンスプローブで検出されるそれぞれの遺伝子の転写産物の分布は、小花に限定されていることが明らかである（図５）。さらに、図５の枠の部分をより拡大した結果が図６である。ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂは雄蘂を除く小花で特異的に発現している。一方、発熱が終了した肉穂花序断片では、両遺伝子の発現はほぼ完全に抑制されている（図７）。従って、発熱中の肉穂花序においては、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂが共に発現している細胞群は小花であり、しかも、その発現は、発熱後の肉穂花序においては、ほぼ消失することになる（図８）。
【００２７】
次いで、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂが共発現している小花が実際に発熱細胞として機能するか否かを解析した結果が図９である。図９左は、高感度赤外線カメラにて肉穂花序そのものを画像解析した結果であり、図９右は、肉穂花序縦断面を赤外線カメラにて画像解析した結果である。この図から明らかなように、肉穂花序の発熱細胞群は、その最表面にある小花で特異的である。
【００２８】
従って、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂを共発現している肉穂花序小花細胞群がザゼンソウの発熱細胞であると結論することができる（図１０）。また、これらの遺伝子が共発現している小花を含む肉穂花序温度を連続的にモニタリングした結果が図１１である。両遺伝子が発現している発熱中（雌期）の肉穂花序温度は、外気温度の変動にもかかわらずほぼ一定温度を維持している。より具体的には、野外の外気温が例えば１５℃程度から氷点下まで大幅に変動しても群落地に自生している雌期のザゼンソウの肉穂花序の温度は精度よく２３℃程度に維持される（図１１）。一方、このような恒温性は、両生期で崩壊しはじめ、花粉が肉穂花序表面を覆う雄期になるとその体温維持能力はほぼ完全に失われてしまう（図１１）。このような恒温性が失われる時期は、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂの発現がほぼ完全に消失する時期と照合する。
【００２９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、植物の発熱関連遺伝子をより効率よく発現させる方法が提供される。これによって、ザゼンソウ等の発熱植物と同様のメカニズムにより恒温性を発現する低温耐性植物の開発等が可能となる。
【００３０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ザゼンソウから得られた２種類のＵＣＰ因子の構造（左図）およびその疎水性プロット（右図）。ＳｆＵＣＰａは哺乳動物および非発熱植物に広く分布する６回膜貫通型の脱共役タンパク質であり、発現量は少ない。ＳｆＵＣＰｂは５回膜貫通型の脱共役タンパク質であり、ザゼンソウ以外に報告例のない新規の因子で、発現量が多い。また、発熱中の肉穂花序における両因子の転写産物の発現量は、ＳｆＵＣＰｂが主体を占める。
【図２】ＳｆＵＣＰａｍＲＮＡの発現を発熱中および発熱後のザゼンソウ肉穂花序で解析したノーザンブロットの結果。ＳｆＵＣＰａの転写産物は、葉、仏炎苞、肉穂花序および根において、極めて少なく、また、その発現分布も明確な組織特異性を示さない。
【図３】発熱中のザゼンソウ各組織におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現パターンをノーザンブロットにより解析した結果。発熱中の肉穂花序においてＳｆＵＣＰｂとＳｆＡＯＸの発現が最も高いことが明らかである。
【図４】群落地にて自生しているザゼンソウとその肉穂花序の横断面写真。肉穂花序横断面には、その表面近傍に小花が存在し、中心部には、維管束などを含む組織が観察される。
【図５】Ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発熱中の肉穂花序断面におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸｍＲＮＡの発現分布。それぞれのアンチセンスおよびセンスプローブを作成し、肉穂花序横断面由来の組織切片とハイブリダイズした。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、ｓは雄ずい、バーは２ｍｍである。
【図６】図５の四角で囲まれた部分の拡大図。ＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸアンチセンスプローブで検出されるシグナルは、肉穂花序の雄蘂を除く小花で特異的である。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、ｓは雄ずい、バーは０．５ｍｍである。
【図７】発熱後の肉穂花序横断面におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸｍＲＮＡの発現分布。両遺伝子の転写産物の発現はほとんど検出されないことが明らかである。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、バーは２ｍｍである。
【図８】肉穂花序におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸ遺伝子の発現分布のまとめ。左図に示した発熱中（雌期）の肉穂花序における両遺伝子の発現は、小花で特異的である。しかし、右図に示した発熱後（雄期）の肉穂花序においては、両遺伝子の発現はほぼ消失している。
【図９】赤外線熱画像解析による肉穂花序組織における発熱細胞群の同定。肉穂花序の横断面をサーモグラフィーにより解析すると、その発熱細胞群は、小花に特異的であることが明らかである。
【図１０】ザゼンソウ肉穂花序におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現部位と赤外線画像解析で得られた発熱細胞群との関係。発熱細胞群は、小花に限定され、かつ、小花細胞群が発熱細胞でもあることが明らかである。またＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現も小花に局在している。
【図１１】群落地に自生するザゼンソウの肉穂花序および外気温の変動を示したグラフである。氷点下を含む外気温の変動にもかかわらず雌期の肉穂花序の温度はほぼ２３℃内外に維持されている。このような恒温性は、肉穂花序が両性期および雄期に移行すると失われることが明らかである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a method for expressing isothermal properties in an animal or plant cell or an animal or plant individual. More specifically, the invention of this application is related to the field of plant breeding such as the development of low temperature avoidance plants by the development of thermostatic functions, the medical field related to the treatment of diabetes and obesity, the engineering field including the development of temperature control materials derived from plants, the environmental purification, etc. The present invention relates to a thermostatic expression method useful in the field of genetic engineering for the development of microorganisms.
[0002]
[Prior art and its problems]
In general, plants do not have heat generation or constant temperature maintenance, and their body temperature is thought to fluctuate with changes in temperature. However, certain plants generate heat by themselves and can maintain their body temperature higher than the outside temperature. There is something you can do. In particular, it is known that Zazenso, which grows naturally in Japan and blooms in the early spring, can maintain the temperature of its inflorescences at about 25 ° C., despite fluctuations in outside air temperature including below freezing (Non-patent Document 1, Non-patent document 2). The body temperature maintenance phenomenon observed in such sensation clearly demonstrates the existence of a thermostatic maintenance mechanism in plants, and in recent years, there is an increasing expectation for the development of a heat generation control device that imitates sensation. Conventionally, in crops that do not have heat-generating ability, low-temperature damage or freezing damage is considered to be the most important factor limiting the productivity (Non-patent Document 3), and genes related to heat production and thermostatic expression are identified. The “development of low-temperature avoidance crops having the ability to maintain thermostability” used is expected to contribute greatly to food problems in the agricultural field.
[0003]
As for the maintenance mechanism of the thermogenicity of such a fever plant, since the thermostatic plant itself is extremely exceptional, there are not many studies on related genes and the like. The somatothermal plants in the plant kingdom that have been reported so far are only two plant species, zazensou and lotus (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 4), and fever-related genes that have been analyzed are limited. On the other hand, from physiological studies related to the homeostatic property of sensation, respiration in the inflorescences, which is a fever site, has been considered to be important for the mechanism (Non-patent Document 1). Respiratory volume in the inflorescence of genus buds is inversely correlated with fluctuations in outside air temperature, and it is estimated that the regulation of respiratory activity in mitochondria in fever cells is closely related to its maintenance of body temperature ( Non-patent document 1).
[0004]
The importance of uncoupling protein (UCP), which is the main causative factor of non-shivering heat production in mammals, has been pointed out as such a factor involved in the regulation of respiratory activity (Non-patent Document 5). UCP has a function of allowing H ⁺ produced inside and outside the mitochondrial inner membrane to flow into the matrix without being coupled to ATP synthesis. In mammals, the presence of at least 5 types of UCP (UCP1-UCP4 and BMCP1) has been reported (Non-Patent Document 6). SfUCPa and SfUCPb) have been clarified and patent applications have been filed for them (Patent Document 1). SfUCPb, which is one of the two UCP factors possessed by Zazensou, has a topology that is different from any UCP conventionally known in plants and mammals (FIG. 1, Non-Patent Document 5). On the other hand, the expression of the 6-transmembrane type UCP factor widely distributed in mammals and non-pyrogenic plants named SfUCPa is extremely small, and no clear tissue specificity is observed in the expression distribution. (FIG. 3), it is estimated that the contribution to the heat production is small. On the other hand, although a factor (HmUCPa) corresponding to SafUCPa of Zazensou has been identified from a fever plant called Dead Horse (Patent Document 3), the transcript is not specifically expressed in the fever tissue. (Non-patent document 7) In plants, there is a possibility that the 6-transmembrane UCP factor having an important function in mammals is directly or singly involved in the production of heat or maintaining the thermostat. Low.
[0005]
On the other hand, the involvement of alternative oxidase (Alternative oxidase: AOX) as a heat production factor that functions in mitochondria is also suggested in addition to the uncoupling protein (Non-patent Document 8). AOX is a factor having a function of increasing respiratory activity by reducing oxygen using electrons donated from ubiquinone in mitochondria (Non-patent Document 9). The oxidation reaction by AOX is also referred to as cyan resistant respiratory enzyme because it is resistant to inhibitors of cytochrome c oxidation pathway such as cyan. This AOX has been reported to have a markedly increased activity in a pyrogenic plant called Voodoo lily that grows naturally in Europe, and was considered to be the main pyrogenic factor of the plant (Non-patent Document 10). On the other hand, the presence of a factor corresponding to AOX has not been confirmed in thermostat animals, and AOX is considered to be a fever-related factor unique to plants. However, previous studies have shown that non-pyrogenic plants such as tobacco and Arabidopsis thaliana have AOX protein, and tobacco that overexpresses tobacco AOX protein has been prepared. It has been reported that the exothermic phenomenon was not confirmed (Non-patent Document 8). In addition, the inventor of this application has identified and applied for a patent for the AOX protein derived from sasenso and its gene (Japanese Patent Application No. 2003-038874). Further, the inventor has identified and filed a patent application for Dead Horse-derived AOX protein and its gene (Japanese Patent Application No. 2003-95799).
[0006]
In this way, UCP and AOX, which have different mechanisms of action, are individually positioned as fever factors in thermostats and pyrogens, respectively. It did not exist.
[0007]
Furthermore, it is known that the maintenance of mammalian thermostatism is closely related to the action of various hormones including adrenaline via the nervous system. The mechanism was thought to have a plant-specific control system.
[0008]
[Patent Document 1]
JP 2000-354489 A [Non-Patent Document 1]
Knutson (1974) Science 186-187.
[Non-Patent Document 2]
Ito et al. (2003) Plant, Cell & Environment, in press.
[Non-Patent Document 3]
Levitt (1980) Responses of plants to environmental stresses. 2 ^nd end
[Non-Patent Document 4]
Seymour & Schultze-Motel (1996) Nature 283, 305.
[Non-Patent Document 5]
Ito, K.K. et al. (1999) Plant Sci. 142, 57-65.
[Non-Patent Document 6]
Bouillaud et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1504, 107-119.
[Non-Patent Document 7]
Ito et al. (2003) J. Org. Exp. Bot. 54, 1113-1114.
[Non-Patent Document 8]
Vanerberghe & McIntosh (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 703-734.
[Non-patent document 9]
McIntosh (1994) Plant Physiol. 105, 781-786.
[Non-Patent Document 10]
Vanlerberghe et al. (1994) Plant Physiol. 106, 1503-1510.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
A system related to maintaining isothermal properties using an exothermic reaction of a plant is a technique that makes it possible to keep the temperature of a target individual tissue or organ constant by heat generation even in a low temperature environment. This provides a very useful means for developing, for example, low temperature avoidance crops using genetic recombination technology. Unexploited proteins SfUCPa and SfUCPb (Patent Document 1) derived from zazenou, which have already been invented by the inventors of the present application, Sf-AOX derived from zazenou (Japanese Patent Application No. 2003-038874), and Dem Horse-derived Hm derived from Dead Horse -AOX (Japanese Patent Application No. 2003-95799) is an influential material for constructing a thermostatic expression system.
[0010]
An object of the invention of this application is to further develop the above-mentioned prior invention by the inventor of this application and provide a more effective constant temperature expression system.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
This application provides the following inventions (1) to (8) as means for solving the above-mentioned problems.
(1) A method for expressing an isothermal property in an animal or plant individual or an animal or plant cell, wherein the exogenous cyanogen-resistant respiratory enzyme and an exogenous 5-transmembrane uncoupling protein are co-expressed.
(2) The method according to the invention (1), wherein the exogenous cyanogen-resistant respiratory enzyme is zelkova-derived cyanogenic respiratory enzyme Sf-AOX having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(3) The method according to the invention (1), wherein the exogenous cyanogen resistant respiratory enzyme is Dead Horse-derived cyanogenic respiratory enzyme Hm-AOX having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
(4) The method according to the invention (1), wherein the exogenous five-transmembrane uncoupling protein is a zelkova-derived uncoupling protein SfUCPb.
(5) An expression vector comprising a polynucleotide encoding a cyan resistant respiratory enzyme and a polynucleotide encoding a 5-times transmembrane uncoupling protein and co-expressing the cyan resistant respiratory enzyme and the 5-times transmembrane uncoupling protein .
(6) The expression vector according to the invention (5), wherein the polynucleotide encoding the cyanogen resistant respiratory enzyme is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial continuous sequence thereof.
(7) The expression vector according to the invention (5), wherein the polynucleotide encoding a cyan resistant respiratory enzyme is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a partial continuous sequence thereof.
(8) An animal or plant individual or animal or plant cell that has acquired isothermal properties by any of the methods of the inventions (1) to (4).
[0012]
That is, the inventor of this application collects leaves, Buddha buds, inflorescences, and roots from a fevered sensation individual, prepares each total RNA, and uses the cDNAs of SfAOX and SfUCPb genes as probes. As a result of Northern analysis of the mRNA expression level by a known method, as shown in FIG. 3, it was clarified that the expression of both genes in the spike inflorescence, which is the fever site of zelkova, is the highest. From this result, it was found that the co-expression of SfAOX and SfUCPb, which are different factors of two kinds of action mechanisms, is important in the constant temperature exothermic characteristics of the paniculata inflorescence, and the present invention was completed.
[0013]
In the above-mentioned invention, the “animal or plant individual or animal and plant cell” that is the subject of constant temperature expression is, for example, an animal or plant individual that does not have isothermal properties, its cell, or an animal or plant individual that reduces its function in a low-temperature environment. is there. Also included are animal and plant culture cells, tissues and organs whose function is reduced by low-temperature storage. “Exogenous” means not endogenous to the animal or plant individual or its cells. For example, when using uncoupled protein (UCPb) derived from primrose, animal and plant individuals and cells other than primrose are targeted.
[0014]
In the present invention, “enzyme”, “protein” and “peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by an amide bond (peptide bond).
[0015]
“Polynucleotide” refers to a molecule in which 100 or more phosphoric acid esters (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) linked to a purine or pyrimidine sugar are linked to β-N-glycosides. As used herein, “oligonucleotide” refers to a molecule having 2-99 bonds.
[0016]
Other terms and concepts used in the present invention will be described in the description of the embodiments and examples of the present invention. Various genetic manipulation techniques and molecular biological techniques used for carrying out the present invention are not limited to known techniques (for example, Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning, except for techniques that clearly indicate the source). -Based on A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wol. A person skilled in the art can easily and surely implement it.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The invention (1) is a method for expressing an isothermal property in an animal or plant individual or an animal or plant cell by co-expressing an exogenous cyanogen-resistant respiratory enzyme (AOX) and an exogenous five-transmembrane uncoupling protein (UCPb). is there.
[0018]
UCPb uses SfUCPb shown in SEQ ID NO: 3 of Patent Document 1, and as AOX, Saf-AOX derived from Zazenso consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or Dead Horse derived Hm-AOX consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is used. be able to.
[0019]
Specific methods include, for example, the polynucleotide encoding UCPb (SEQ ID NO: 1 of Patent Document 1), the polynucleotide encoding Sf-AOX (SEQ ID NO: 1), or the polynucleotide encoding Hm-AOX ( SEQ ID NO: 3) is introduced into an animal or plant individual or an animal or plant cell, and both are coexpressed. The polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 3 may be partially continuous. That is, it is a sequence (103-1152 nt of SEQ ID NO: 1, 134-1171 nt of SEQ ID NO: 3) constituting each protein coding region. Sf-AOX and Hm-AOX consist of a mitochondrial translocation signal peptide and a mature protein region that migrates to the inner mitochondrial membrane and functions as a cyanide-resistant respiratory enzyme. Therefore, in the method of the present invention, only the mature protein region of AOX may be expressed. In this case, the polynucleotide is 166-1522 nt of SEQ ID NO: 1 in the case of Sf-AOX, and 317-1168 nt of SEQ ID NO: 3 in the case of Hm-AOX.
[0020]
When introducing a polynucleotide into an animal or plant cell, a recombinant vector is prepared by inserting the polynucleotide into an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. according to the animal or plant species. The vector may be introduced into cells using a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method.
[0021]
When introducing a polynucleotide into an animal individual, for example, the expression vector is incorporated into a hollow nanoparticle displaying a biorecognition molecule, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, etc., and introduced into the animal individual. It is also possible to adopt a method to do this. In the case of a non-human animal individual, UCPb and in all somatic cells of the animal individual according to a known transgenic animal production method (for example, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77; 7380-7384, 1980). AOX may be co-expressed.
[0022]
Furthermore, when introducing a polynucleotide into a plant individual, a known method can be appropriately employed depending on the type of plant and the like. That is, leaf disk co-cultivation method (EMBO J. 6: 2531, 1987), electroporation method (Nature 338: 274, 1989, Plant Tissue Culture Letters 11: 199, 1994, Plant Cell Rep. 10: 106, 1991), Agrobacterium method (Plant J. 6: 271, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 1115, 1994, Bio / technology 6: 915, 1988), particle gun method (Plant Cell Rep. 14: 586, 1995, Theor). Appl.Gnet.79: 337, 1990).
[0023]
By the above method, an animal or plant individual or an animal or plant cell (invention (8)) co-expressing UCPb and AOX can be obtained.
[0024]
The UCPb polynucleotide and the AOX polynucleotide can be incorporated into separate expression vectors, and they can be co-transfected. Alternatively, the expression vectors of inventions (5) to (7) can also be used. That is, the expression vector of the invention (5) has a UCPb polynucleotide and an AOX polynucleotide in one vector. In this case, both polynucleotides may be made to express UCPb and AOX as a fusion protein by matching their reading frames, or UCPb and AOX may be expressed as separate mature proteins. Good.
[0025]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples. However, the invention of this application is not limited to the following examples.
[0026]
【Example】
The following describes a more detailed example of the expression of SfAOX and SfUCPb in the genus Paso inflorescence showing thermostatic properties. Spike inflorescences, an organ in which zensensou flowers are dense, show a characteristic called male-female ripening, and in the process of differentiation, changes from female stage to bisexual stage to male stage. In general, the female stage is the time when a large number of pistils are observed on the surface of the inflorescence, and the amphibian stage is the time when pollen begins to be recognized on a part of the surface. After that, pollen appears in the inflorescence and enters a period called male period. Interestingly, the thermostability seen in the primrose is characteristically observed only in the female stage, with the inflorescence, the fever site. FIG. 4 is an enlarged image of the tissue section of this spike. There is a part called floret that is closer to the surface of the inflorescence, and a vascular bundle exists inside. FIG. 5 shows the result of in situ hybridization performed using the inflorescence fragment in the fever. It is clear that the transcript distribution of each gene detected by the antisense probe is limited to florets (FIG. 5). Further, FIG. 6 shows the result of further enlarging the frame portion of FIG. SfAOX and SfUCPb are specifically expressed in florets excluding stamens. On the other hand, the expression of both genes is almost completely suppressed in the inflorescence fragment of which the fever has ended (FIG. 7). Therefore, in the spike inflorescence during fever, the cell group in which both SfAOX and SfUCPb are expressed is florets, and the expression is almost lost in the spike inflorescence after fever (Fig. 8).
[0027]
Next, FIG. 9 shows the result of analyzing whether or not the floret co-expressing SfAOX and SfUCPb actually functions as a fever cell. The left side of FIG. 9 shows the result of image analysis of the spikes themselves with a high-sensitivity infrared camera, and the right side of FIG. 9 shows the results of image analysis of the longitudinal sections of the spikes with an infrared camera. As is clear from this figure, the fever cells of the inflorescence are specific for the florets on the outermost surface.
[0028]
Therefore, it can be concluded that the inflorescence floret cell group co-expressing SfAOX and SfUCPb is fever cells of sensation (FIG. 10). In addition, FIG. 11 shows the result of continuously monitoring the inflorescence temperature including florets in which these genes are co-expressed. The inflorescence temperature during fever (female stage) in which both genes are expressed is maintained at a substantially constant temperature despite fluctuations in the outside air temperature. More specifically, even if the outdoor outdoor temperature fluctuates from about 15 ° C. to below freezing point, the temperature of the inflorescences of the female genus genus growing in the community is accurately maintained at about 23 ° C. (FIG. 11). On the other hand, such a thermostatic property begins to collapse in the bisexual period, and when the pollen becomes a male period covering the surface of the inflorescence, its ability to maintain body temperature is almost completely lost (FIG. 11). The time when such isothermal properties are lost is collated with the time when the expression of SfAOX and SfUCPb almost completely disappears.
[0029]
【The invention's effect】
As described above in detail, the invention of this application provides a method for efficiently expressing a fever-related gene in a plant. This makes it possible to develop a low temperature tolerant plant that exhibits constant temperature by a mechanism similar to that of exothermic plants such as zelkova.
[0030]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structures of two UCP factors (left figure) and their hydrophobicity plots (right figure) obtained from Zazensou. SfUCPa is a 6-transmembrane uncoupling protein widely distributed in mammals and non-pyrogenic plants, and its expression level is small. SfUCPb is a five-transmembrane uncoupling protein, and is a novel factor that has not been reported other than Zazensou and has a high expression level. Moreover, SfUCPb mainly occupies the expression level of the transcription products of both factors in the inflorescence inflorescence.
FIG. 2 shows the northern blotting result of analyzing the expression of SfUCPa mRNA in the inflorescences of the genus paniculata during and after fever. The transcripts of SfUCPa are extremely small in leaves, Buddha buds, spikes and roots, and their expression distribution does not show clear tissue specificity.
FIG. 3 shows the results of Northern blot analysis of the expression patterns of SfUCPb and SfAOX in each tissue of genus genus during fever. It is clear that the expression of SfUCPb and SfAOX is the highest in the inflorescence inflorescence.
FIG. 4 is a cross-sectional photograph of a genus genus growing naturally in a community and its spikes. A floret is present in the vicinity of the surface of the inflorescence cross section, and a tissue including vascular bundles is observed in the center.
FIG. 5 shows the expression distribution of SfUCPb and SfAOX mRNA in the inflorescence cross-section during fever by in situ hybridization. Each antisense and sense probe was prepared and hybridized with a tissue section derived from the cross-section of the panicle. The left is an antisense probe, the right is a sense probe. f is a floret, s is a stamen, and a bar is 2 mm.
6 is an enlarged view of a portion surrounded by a square in FIG. 5; The signals detected with the SfUCPb and SfAOX antisense probes are specific for florets except the stamens of the spikes. The left is an antisense probe, the right is a sense probe. f is a floret, s is stadium, and a bar is 0.5 mm.
FIG. 7 is an expression distribution of SfUCPb and SfAOX mRNA in the cross-section of the inflorescence after fever. It is clear that almost no expression of transcripts of both genes is detected. The left is an antisense probe, the right is a sense probe. f is a floret, and a bar is 2 mm.
FIG. 8: Summary of expression distribution of SfUCPb and SfAOX genes in the inflorescence inflorescence. The expression of both genes in the inflorescence (female) inflorescence shown in the left figure is specific for florets. However, in the inflorescence after fever (male stage) shown in the right figure, the expression of both genes is almost lost.
FIG. 9 shows the identification of fever cells in the inflorescence organization by infrared thermal image analysis. When the cross-section of the spikes is analyzed by thermography, it is clear that the fever cells are specific to florets.
FIG. 10 shows the relationship between the expression sites of SfUCPb and SfAOX in the genus Paso inflorescence and the fever cell group obtained by infrared image analysis. It is clear that the fever cell group is limited to florets, and the floret cell group is also a fever cell. SfUCPb and SfAOX expression is also localized in florets.
FIG. 11 is a graph showing changes in the spikes and the outside air temperature of genus genus that grows naturally in the community. Despite fluctuations in the outside air temperature including below freezing point, the temperature of the inflorescence in the female stage is maintained at about 23 ° C. inside and outside. It is clear that this isothermality is lost when the spikes invade into the bisexual and male stages.

Claims

A method for expressing an isothermal property in an animal or plant individual or an animal or plant cell, wherein the exogenous cyanogen-resistant respiratory enzyme and an exogenous 5-transmembrane uncoupling protein are co-expressed.

The method according to claim 1, wherein the exogenous cyanogen-resistant respiratory enzyme is zelkova-derived cyanogenic respiratory enzyme Sf-AOX having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

The method of claim 1, wherein the exogenous cyanogen resistant respiratory enzyme is Dead Horse-derived cyanogenic respiratory enzyme Hm-AOX having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

The method according to claim 1, wherein the exogenous five-transmembrane uncoupling protein is zelkova-derived uncoupling protein SfUCPB.

An expression vector comprising a polynucleotide encoding a cyan resistant respiratory enzyme and a polynucleotide encoding a 5-times transmembrane uncoupling protein and co-expressing the cyan resistant respiratory enzyme and the 5-times transmembrane uncoupling protein.

6. The expression vector according to claim 5, wherein the polynucleotide encoding the cyanogen resistant respiratory enzyme is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partially continuous sequence thereof.

6. The expression vector according to claim 5, wherein the polynucleotide encoding the cyanogen resistant respiratory enzyme is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a partially continuous sequence thereof.

An animal or plant individual or animal or plant cell that has acquired isothermal properties by the method according to any one of claims 1 to 4.