【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大きな混合比率で液体の混合を行うことが可能な混合機構に係り、特に、微量試料の分析，検出を簡便に行う分析装置等に好適な混合機構に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療診断に必要な測定を患者近傍で行うベッドサイド診断用の分析（ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ）分析）や、河川や廃棄物中の有害物質の分析を河川や廃棄物処理場等の現場で行うこと（ＰＯＵ（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｕｓｅ）分析）や、食品の調理，収穫，輸入の各現場における汚染検査等のような、分析・計測が必要とされる現場もしくは現場の近傍で分析・計測を行うこと（以下、「ＰＯＣ分析等」と総称する）の重要性が注目されている。そして、近年、このようなＰＯＣ分析等に適用される検出法や装置の開発が重要視されつつある。このようなＰＯＣ分析等は、簡便に短時間で、且つ低コストで行われることが要求される。
【０００３】
従来、微量分析には、試料をキャピラリガスクロマトグラフィー（ＣＧＣ），キャピラリ液体クロマトグラフィー（ＣＬＣ）等で分離した後、質量分析計で定量するＧＣ−ＭＳ装置やＬＣ−ＭＳ装置が広く使用されてきた。しかしながら、これらの分析装置は質量分析計が大型であることと操作が煩雑であることから、患者のベッドサイドや汚染河川，廃棄物処理場近辺等の現場での測定に使用することには適していない。さらに、血液等を試料とする医療診断用途の分析装置は、試料が触れる部分を使い捨てにすることが望ましい。
【０００４】
そこで、これらの問題点を解決するために、従来利用されてきた分析装置を小型化し、極微量の液体試薬を反応させるμＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ ｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ）の技術をＰＯＣ分析等へ応用する検討が進んできた。μＴＡＳでは、血液に限らず試料量を微量にするために、１０ｃｍから数ｃｍ角程度以下のガラス製やシリコン製のチップの表面に溝を形成して、その溝中に試薬溶液や試料を流して分離，反応を行って、微量試料の分析を行っている（特開平２−２４５６５５号公報、特開平３−２２６６６６号公報、特開平８−２３３７７８号公報、Ｒ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ６９， ２６２６−２６３０ （１９９７） Ａｃｌａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ等）。この技術においては、試料量，検出に必要な試薬量，検出に用いた消耗品等の廃棄物，廃液の量がいずれも少なくなる上、検出に必要な時間もおおむね短時間で済むという利点がある。
【０００５】
本願出願人も、特願平１０−１８１５８６号明細書（「混合分析装置及び混合分析方法」）、特開２０００−２６７５号公報（「キャピラリ光熱変換分析装置」）、国際公開ＷＯ９９／６４８４６号公報（「分析装置」）、国際公開ＷＯ０１／１３１２７号公報（「分析用カートリッジ及び送液制御装置」）等のμＴＡＳ関係の発明を出願している。
これらの公報及び出願明細書には、チップとして樹脂製のマイクロチップを用いることや、微量成分の検出法として熱レンズ検出法を用いることなども記載されている。
【０００６】
熱レンズ検出法は、励起光により液体中の試料を励起して、いわゆる熱レンズを形成させ、検出光によりその熱レンズの変化を測定する光熱変換検出法であり、その原理等は以前から知られている（特開昭６０−１７４９３３号公報、Ａ．Ｃ．Ｂｏｃｃａｒａ ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３６，１３０，１９８０ 、Ｃ．Ｗ．Ｅａｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １２， ２５７５−２５８５（１９８９）、特開平１０−１４２１７７号公報、特開平４−３６９４６７号公報、木村博子ら，ぶんせきＮｏ．４，２８０−２８４，１９９７、Ｍ．Ｈａｒａｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６５，２９３８−２９４０，１９９３ 、川西，他 日本分析化学会第４４年会講演要旨集，ｐ１１９，１９９５等）。
【０００７】
キャピラリ中の成分を測定する方法としては、熱レンズ検出法の他に蛍光法や吸光度法等も用いることができるが、光路長が短いキャピラリでは、蛍光標識物質の導入等の操作を行うことなく高い感度が実現できるので、熱レンズ検出法が適している。
一方、平板型キャピラリチップ上で微量試料の分析等を行う場合には、試料，試薬の定量的な取り扱い手段のうち、混合・希釈などのような液体同士を混ぜ合わせる技術は重要な技術の一つである。
【０００８】
従来、試料や試薬の混合・希釈は、必要量を量り取って混合槽に相当する流路内に導入し、送液を止め拡散により液体を均一化する方法や、機械的攪拌により液体を均一化する方法等により行われていた。特に、機械的に攪拌する方法（例えば、磁力で攪拌バーを回転させることにより撹拌する方法）は、均一化に時間を要しないので好ましかった。しかし、幅及び深さが数十μｍ以下である流路内での機械的撹拌は、現実的には困難が伴う。また、超音波振動子等を用いてチップ外部から流路内の液体を能動的に動かして撹拌する方法や、磁気ビーズを外部の磁石等で移動させることによって撹拌する方法等が提案されているが、それぞれ駆動回路及び流路内へのビーズの封入等が必要となる。
【０００９】
また、２液の混合を一定の比率で精密且つ継続的に行うためには、様々な困難を伴う。例えば、量り取った２液を混合する場合には、それぞれ量り取った液体を混合槽に導入する必要があるが、その際に周辺流路との間で漏れ込みや漏れ出しなどが発生して、混合比率の精密さが低下する可能性が高い。周辺からの漏れ込みや漏れ出しを防ぐ目的で、キャピラリ内の試料，試薬の前後を空気層で区切り、液プラグの形状を保ったまま空気圧により移動させた後、混合させる手段も提案されているが（Ｔ． Ｓ． Ｓａｍｍａｒｃｏら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ μＴＡＳ ’９６， ｐ１５０−１５２ ）、液プラグ同士を合体させるタイミング合わせや、液プラグ間の空気を除去するためのＴ字型エアベント流路（Ｒ．Ｃ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ ら，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（１９９８）ｐ７−１０ ）の問題に加え、複雑な手順を要するなど欠点も多い。また、混合槽を用いずにダブルＴ流路等を用いて量り取った液体同士を混合するため、量り取った液体同士が混合の行われる流路内に同時に導入される必要があり、タイミング合わせ等が難しく、技術的困難を伴う。従来、サンプルの分取は、試料に含まれる微量成分の分離のために電気泳動等によって行われることが多く、精密な混合を行うために行われる例は一般的でないのが実状である。
【００１０】
２液の混合を混合槽を用いることなく行う手段としては、例えばＳ．Ｃ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ ら（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ， ７０， １５８−１６２， １９９８ ）が示したような流路内での拡散による混合が一般的であり、本願出願人出願の国際公開ＷＯ９９／６４８４６号公報においても同様の手法が用いられている。２液間の拡散を用いて混合を行う場合には、後述するように拡散距離に対する時間の影響が大きいので、拡散のみにより大量の液体同士の混合を行うことは困難であり、その場合は検出法にも様々な制約が発生する。
【００１１】
２液を流路内での拡散を用いて混合する方法として、Ａ． Ｍａｎｚ ら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ μＴＡＳ’９８ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，ｐ２３５−２４０（１９９８）（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））は、２液を合流させるためのＹ字流路を多数並列に並べ、その最下流側に全てのＹ字合流後の流路が一体となる形の流路を構成し、最終的に２液が横方向に短い距離で互い違いに流れるようにすることにより、拡散距離を短く且つ液量を増やすことを実現している。
【００１２】
しかしながら、上記のような流路構成では、液の導入のためにチップ上で流路を立体的に形成することが必要となるので、チップの製作が複雑となる。さらに、この構成では、３液以上の多種類の液体を混合させるチップの構造はさらに複雑になってしまい、実用に適するチップを製作することは現実的ではない。
また、流路の幅を比較的広くし、混合する２液のうち１液は予め流路内を一定速度で流し、他の１液は流路途中の底面に開けられたスリット又は多数開けたれた孔から導入し、流路の深さ方向に２液を平行に流すことによって拡散する方法が提案されている（例えば、Ａ． Ｙｏｔｓｕｍｏｔｏ他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ μＴＡＳ’９８ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，ｐ１８５−１８８（１９９８）（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））。しかし、この場合も流路の底面から液を導入する手段を設けなければならないため、チップ構造が複雑となる。
【００１３】
さらに、キャピラリ内での混合を拡散により行う場合には、時間当たりの拡散距離を考慮する必要がある。拡散は、ｔ＝Ｌ２ ／Ｄ（ｔ：拡散時間、Ｌ：拡散距離、Ｄ：拡散係数）という式で表わされるように濃度勾配の関数であり、距離の二乗に反比例するとともに分子量が大きいものほど一般に拡散速度が遅い。例えば、アセトンのように比較的小さい分子が２００μｍ拡散するために必要な時間は１０秒以下程度であるが、血液に含まれる分子としては比較的大きいウレアーゼが同じ２００μｍ拡散するためには数百秒（キャピラリ内での濃度分布が何％以下であれば均一であると考えるのかでこの値は変化するが、ここでは５％以下とした）が必要とされ、このような場合には、自然の拡散にまかせて混合を行うことは現実的とは言えないことは明らかである。
【００１４】
また、２液を混合する場合に平板型チップを用いている従来技術では、その混合比率が１：１又はそれに近い低い混合比率であることが通常である。しかし、現実の化学反応等においては、１：１以外の比率で混合が行われることが一般的であるので、このような場合には混合比率に応じて流路幅等を調整しないと、合流する際に流速の違いによる不規則な撹乱が発生する可能性があり、流れ方向での均一性に悪影響を与えるおそれがある。
【００１５】
しかし、流速を合わせる場合は流量の多い側の流路幅が広くなり、仮に合流後の流路幅も広いままに保つと、拡散に必要な時間が現実的なものでなくなってしまう。逆に、合流後の流路幅を細く絞ると流速がそれに応じて早くなるため、十分な拡散に必要な流路長が長くなって広くチップ面積を占有するという不具合が発生する。このように、拡散のみによって混合を行う場合は、通常の手段のみを用いるだけでは不具合が発生するため、その混合比率はさほど高く設定することはできなかった。
【００１６】
【特許文献１】
特開平２−２４５６５５号公報
【特許文献２】
特開平３−２２６６６６号公報
【特許文献３】
特開平８−２３３７７８号公報
【特許文献４】
特願平１０−１８１５８６号明細書
【特許文献５】
特開２０００−２６７５号公報
【特許文献６】
国際公開ＷＯ９９／６４８４６号公報
【特許文献７】
国際公開ＷＯ０１／１３１２７号公報
【特許文献８】
特開昭６０−１７４９３３号公報
【特許文献９】
特開平１０−１４２１７７号公報
【特許文献１０】
特開平４−３６９４６７号公報
【非特許文献１】
Ｒ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ６９， ２６２６−２６３０ （１９９７） Ａｃｌａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
【非特許文献２】
Ａ．Ｃ．Ｂｏｃｃａｒａ ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３６，１３０，１９８０
【非特許文献３】
Ｃ．Ｗ．Ｅａｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １２， ２５７５−２５８５（１９８９）
【非特許文献４】
木村博子ら，ぶんせきＮｏ．４，２８０−２８４，１９９７
【非特許文献５】
Ｍ．Ｈａｒａｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６５，２９３８−２９４０，１９９３
【非特許文献６】
川西ら，日本分析化学会第４４年会講演要旨集，ｐ１１９，１９９５
【非特許文献７】
Ｔ．Ｓ．Ｓａｍｍａｒｃｏら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ μＴＡＳ ’９６， ｐ１５０−１５２
【非特許文献８】
Ｒ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（１９９８）ｐ７−１０
【非特許文献９】
Ｓ．Ｃ．Ｊａｃｏｂｓｏｎら，Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ， ７０， １５８−１６２， １９９８
【非特許文献１０】
Ａ．Ｍａｎｚら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ μＴＡＳ’９８ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，ｐ２３５−２４０（１９９８）（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）
【非特許文献１１】
Ａ．Ｙｏｔｓｕｍｏｔｏ 他，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ μＴＡＳ’９８ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，ｐ１８５−１８８（１９９８）（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ＰＯＣ分析等において流路内で液体の混合・希釈を行う技術は、従来多数提案されているが、いずれも前述のような問題点を有していた。
そこで、本発明は、上記のような従来技術が有する問題点を解決し、微量試料の分析，検出を簡便に行う分析装置（例えばＰＯＣ分析等を行う分析装置）等に好適であり、大きな混合比率で液体の混合を行うことが可能な混合機構を提供することを課題とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明は次のような構成からなる。すなわち、本発明に係る請求項１の混合機構は、液体が流れる３本以上の流路を合流させて前記液体を混合する混合機構であって、前記３本以上の流路のうちの一部の流路が合流して１本の合流路となり、前記合流路はその下流側端部において２本以上の分岐路に分岐し、この２本以上の分岐路のうちの少なくとも１本に、前記３本以上の流路のうちの他部の流路が合流することを特徴とする。
【００１９】
このような合流−分岐−合流が連続した構成の混合機構であれば、従来のような合流１回のみの構成の混合機構では達成困難な大きな混合比率での混合が可能である。また、その構造が単純であるため、小型化及び低コスト化が可能である。よって、ＰＯＣ分析等を行う分析装置のような、微量試料の分析，検出を簡便に行う分析装置等に好適に適用可能である。
【００２０】
例えば、２本の流路が合流し、該流路を流れる液体が流量比１：Ｘで混合される場合には、合流後に流速の変化を発生させないためには流路幅を（１＋Ｘ）倍にする必要があり、拡散のみで混合を行う場合は最終的な流路幅を所定値以下に抑える必要がある。この所定値は最大でも５００μｍ〜１ｍｍ程度であり、より望ましくは３００〜５００μｍ程度である。そのため、仮に混合前の流路幅の最小値が１００μｍであるとすると、混合比率は自ずと５〜１０程度との制限を受けてしまうこととなる。
【００２１】
一方、流路幅を拡散による混合にとって好ましい値とした場合には、合流に伴い流量が増加するため流速が増加することとなる。よって、大きな混合比率での混合を行うためには、非常に長い流路を限られたスペースに形成する必要があるという困難が生じる。
しかしながら、前述のような混合機構であれば、第１の合流及び第２の合流における混合比率が従来と同程度であったとしても、大きな混合比率での混合を行うことが可能となる。すなわち、第１の合流により希釈された液体の一部を分岐により取り出して第２の合流に導き、さらに希釈を加えることによって、全体の液量の増大を抑えるとともに、第１及び第２の合流（混合）の相乗効果によって、大きな混合比率での混合を行うことが可能となる。例えば、第１の合流と分岐とを同じ比率で行った場合は、第１の合流における混合比率に第２の合流における混合比率を乗じた値が、全体の混合比率となる。
【００２２】
また、本発明に係る請求項２の混合機構は、請求項１に記載の混合機構において、前記一部の流路のうちの少なくとも１本に流れる液体と、前記他部の流路のうちの少なくとも１本に流れる液体とが、同種の液体であることを特徴とする。
前述のように大きな混合比率で混合を行うためには、前記一部の流路のうちの少なくとも１本に流れる液体と、前記他部の流路のうちの少なくとも１本に流れる液体とが、同種の液体であることが好ましい。
【００２３】
さらに、本発明に係る請求項３の混合機構は、請求項２に記載の混合機構において、前記一部の流路には、前記同種の液体が流れる流路と他種の液体が流れる流路とが含まれており、前記一部の流路における前記同種の液体の総流量をｘ１ 、前記他種の液体の総流量をｙとして、前記一部の流路が合流する際の液体の混合比率ｘ１ ／ｙは１以上であるとともに、前記他部の流路における前記同種の液体の総流量をｘ２ 、前記他部の流路が合流する前記分岐路における混合液の総流量をｚとして、前記他部の流路が前記分岐路に合流する際の液体の混合比率ｘ２ ／ｚは１以上であることを特徴とする。
【００２４】
前述のように大きな混合比率で混合を行うためには、第１の合流における混合比率と第２の合流における混合比率とは、いずれも１以上であることが好ましい。前述したように、拡散のみにより混合を行う場合には、流路幅の最小値が例えば１００μｍに制限されていると、混合比率にも自ずと制限が生じることとなる。基本的には拡散は距離のみの影響を受け混合比率の影響は受けないので、仮に流路幅の最小値を小さく取ることが可能であれば、１回の合流のみで大きな混合比率での混合を行うことが可能となる。本発明によれば、より高度な技術を要する微細な流路を形成することなく、より大きな混合比率での混合を行うことが可能である。
【００２５】
さらに、本発明に係る請求項４の混合機構は、請求項１〜３のいずれかに記載の混合機構において、前記合流路に、合流した液体を均一に混合する混合手段を設けたことを特徴とする。
流路が合流した後に行われる液体の混合は、混合機構の構造を単純にできることから、拡散のみによって行われることが好ましいが、積極的に混合を促進するための混合手段を合流路に設けることもできる。そうすれば、合流路における液体の均一な混合が、より確実に達成される。
【００２６】
さらに、本発明に係る請求項５の混合機構は、請求項１〜４のいずれかに記載の混合機構において、前記他部の流路が合流する前記分岐路の幅及び深さは、いずれも５００μｍ以下であることを特徴とする。
さらに、本発明に係る請求項６の混合機構は、請求項１〜５のいずれかに記載の混合機構において、前記３本以上の流路は、少なくとも一方がその板面に溝を備えた一対の平板状部材を、前記溝を備えた板面を内側にして張り合わせることにより形成されることを特徴とする。
このような構成の混合機構であれば、ＰＯＣ分析等を行う分析装置のような、微量試料の分析，検出を簡便に行う分析装置等に、より好適である。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明に係る混合機構の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。各図においては、同一又は相当する部分には同一の符号を付してある。なお、本実施形態は本発明の一例を示したものであって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
ＰＯＣ分析等を行う分析装置に用いるチップは、試料，試薬等の液体が流れる複数の流路を内部に有しており、これらの流路が合流することによって前記液体が混合されるようになっている。このチップは一対の平板状部材から構成されており、一対の平板状部材のうち少なくとも一方には板面に溝が形成されていて、この平板状部材の前記溝を内側にして２つの平板状部材を張り合わせることによって、流路をなすキャピラリがチップの内部に形成される。
【００２８】
このようなチップは、シリコン，ガラス等の無機材料や有機ポリマーで製造することができる。また、チップの製造方法は特に限定されるものではないが、例えば、国際公開ＷＯ９９／６４８４６号公報に記載されている方法を用いることができる。なお、本実施形態においては、流路がチップ内に形成された混合機構について説明するが、本発明の混合機構は、チップ内に形成されたキャピラリで構成されるものに限定されるものではなく、例えば、チップ外に存在するチューブ等の管状部材で構成されるものでもよい。
【００２９】
平板状部材の板面に形成されている溝の断面形状は、特に限定されるものではないが、四角形，三角形等の多角形の形状、半円形、半楕円形等があげられる。また、チップが、何種類かの異なった形状の溝を組み合わせてなる流路を有していてもよい。さらに、溝の上面（開放面）の幅は、溝の下面（底）の幅と同じであるか、又は広くてもよい。
【００３０】
なお、後述する光熱変換法による検出手段による検出を、より簡便に精度良く行うためには、溝の断面形状は四角形であることが好ましい。また、溝の断面の大きさが小さすぎると、微粒子によって液体の流れが乱れるおそれがある。逆に大きすぎると、多くの流路を１つの平板状部材の板面に形成する場合に、平板状部材の板面の面積を大きくしなければならないことに加えて、拡散による混合を行う場合に拡散距離の点で問題が生じる。
【００３１】
チップにおいては、平板状部材に溝を形成する際の加工性も重要な要素である。従来、平板型のキャピラリチップの基材としてシリコン，ガラス等が使用されて来たが、これはＬＳＩに代表される半導体加工技術をそのまま流用できることに負うところが多い。さらに、近年はシリコン，ガラスに加えて有機ポリマーも基材として使用されるようになってきている。チップに使用される有機ポリマーの種類は特に限定されるものではないが、本出願人出願の国際公開ＷＯ９９／６４８４６号公報に記載されているものが好適である。
【００３２】
前述のような、溝を有する有機ポリマー製の平板状部材は、平板からの切削加工やレーザー等によるエッチング加工、型内でのモノマーやマクロモノマーのＵＶ硬化や熱硬化、熱可塑性樹脂の溶融加工や塑性加工等の方法により成形できる。良好に使用できる成形加工法としては、前記平板状部材を大量に且つ安価に成形加工できることから、熱可塑性樹脂の溶融加工や塑性加工があげられる。より良好に使用できるのは、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形法及び／又は圧縮成形法、エンボス成形法である。
【００３３】
また、チップは２枚の平板状部材を張り合わせて製造するが、その際には、超音波融着、熱融着、ホットメルト接着剤やＵＶ接着剤等の接着剤による接着、粘着剤による粘着、直接圧接、薄い弾性シート，両面テープ等を介しての圧接等の方法により、２枚の平板状部材を一体化する。
２枚の平板状部材のうち少なくとも一方は前述のような溝を有していて、該溝を有する板面を内側にして他方の平板状部材と張り合わせるが、溝を有していない平板状部材（以降は、カバーシートと記すことがある）の材質は、溝を有する平板状部材に用いられる材質の中から選ぶことができる。２つの平板状部材の材質は、同じでもよいし異なっていてもよい。
【００３４】
平板状部材の厚さは、検出の障害にならなければ特に限定されるものではないが、０．０５ｍｍから数ｍｍ程度までが好ましい。
また、チップの構成は、加工生産性の点からは、前述のように２枚の平板状部材からなり、その少なくとも一方は溝を有していて、該溝を有する板面を内側にして他方の平板状部材と張り合わせた構成をとることが好ましいが、貫通溝を有する平板状部材を、他の平板状部材２枚で挟んで溝を形成させた３枚構成とすることも可能である。
空気抜きのための小穴や、液体の導入孔及び導出孔は、前記カバーシートや溝を有する平板状部材に貫通孔を設けることで形成するとよい。特に、カバーシートや溝を有する平板状部材が数ｍｍ程度の厚さを有する場合には、該貫通孔を液溜めとして使用することができる。
【００３５】
試料と希釈溶液との混合、又は、試料と試薬との反応等をチップ内で行う際には、希釈溶液や試薬溶液はチップの外部から供給してもよい。あるいは、希釈溶液や試薬溶液を封入した袋等の小さい容器（材質はポリエチレン，ポリプロピレン，ポリエステル，ポリアミド，ポリ塩化ビニル等の樹脂であり、試薬と相互作用しないもの）をチップ内にセットしておき、チップ内に配置した針を袋に外側から押しつけるなどして該袋を破って、希釈溶液や試薬溶液を液溜めに移送してもよい。さらには、固体状の試薬をチップ内に封入しておき、チップ内又は外部の液溜めからの水又は緩衝液を、試薬の封入箇所に所定量導入して溶解し、所定の濃度の試薬溶液とする方法もある。
【００３６】
また、試料はそのままチップに入れてもよい。また、河川の汚濁分析や尿分析等においては、分子量により分画可能な膜フィルター等を用いた試料の濃縮を前処理として行ってもよい。また、チップにフィルターを設け、試料中のゴミや血球などを除去してから、試料をキャピラリに導いてもよい。
【００３７】
チップ内のキャピラリは、試薬や試料の混合を主な目的とした流路部分であるが、チップ全体としての流路構成は、一定量の試料のサンプリングを主な目的とした流路部分、試薬や試料の移送を主な目的とした流路部分、検出を行う流路部分など、部分毎に異なった操作を主な目的とした流路部分からなる。すなわち、本実施形態のチップは、混合・希釈という１つの操作を主な目的とする流路部分のみを有していてもよいが、各々異なった操作を主な目的とする複数の流路部分を有していてもよい。このことにより、単なる定性分析ではなく、定量分析や反応などを伴うような高度な分析が可能となる。
【００３８】
特に、生化学検査項目のように、試料と試薬とを反応させた後に分離することなく検出ができる場合は、分離のために一定量を秤取することなく混合から反応，検出まで一貫した流路で連続的に処理することが可能である。例えば、吸収波長の関係で検出すべき成分を他の夾雑物の妨害なく検出できる場合や、試料中の水酸基を酸化して生成したカルボニル基を分光光度計で検出するなどのように、検出する物質が変化する場合においては、一般に、分離することなく所定の流量比での混合，反応から検出まで一貫した流路で処理することができる。
【００３９】
また、本発明のような試料や試薬の混合や希釈を主な目的とする流路の形状としては、１本の流路に複数の他の流路を合流させた形状や、複数本の流路を同時に合流させた形状等をあげることができる。１本の流路に他の流路を合流させたり、複数の流路を合流させ一本の流路とすることにより、流路形状のみによって混合操作や希釈操作を行うことができる。
【００４０】
また、合流させる際に各々の液体の流量を変えることにより、異なった比率での混合や希釈を行うことが可能である。この場合に、合流部分に邪魔板構造を設けたり、能動的に液体を均一化するような構造を有する流路を設けたりすると、混合が促進されるため好ましい。ただし、チップの構造が複雑になるという欠点がある。
【００４１】
能動的に液体を均一化するような構造を有する流路の形状としては、蛇行状，渦巻き状等があげられる。加えて、混合した液体が反応するために必要且つ十分な時間が確保される必要があるが、合流点から次の合流点又は検出部に至るまでの流路の距離を、混合後に得られる流速に応じて適切に設定することにより、反応時間を計測する手段を別途用いることなく必要な反応を行うことができる。もちろん、液体の流れを停止させて反応に必要な時間を確保することによっても、必要な反応を行うことは可能であるが、液体の流れを停止させている時間を何らかの手段で測る必要が生じる。
【００４２】
さらに、１本の流路が複数に分岐する流路を設けることにより、分流を行うことも可能であり、希釈，反応を行った後の混合溶液の分配を行うことができる。本発明においては、分岐した流路に対してさらに希釈溶液等を合流させることにより、大きな混合比率での混合を実現している。
【００４３】
本実施形態のチップにおいては、試料は適当な手段により制御されて、希釈や他の試薬との反応が行なわれる。また、これらの液体の合流などの操作は、通常は、そのタイミングも精度良く制御しなければならない。これらの操作を精度良く簡便に且つ外部タイマー等の追加の装置を用いることなく行うことを、それぞれの液体を所定の流量比で混合，反応させること、及び、所定の流速で流れる合流後の液体を、混合，反応に必要な時間を確保するために必要且つ十分な長さのキャピラリに流すこと、によって実現できる。なお、本発明においては、流量とは、キャピラリ中を一定時間内に移動する液体の量（体積）を意味する。
【００４４】
バッチ反応における混合比率は、流量比に置き換えることができる。流量比は、例えば液を押し流す圧力が一定であるならば、溝の圧損を調整することにより制御可能であり、溝の断面積と長さとを変える等の手段により容易に設計できるので好ましい。溝があまり細いと、平板状部材の張り合わせの際に接着剤等が溝内に入って流路が閉塞したり、小さな不溶物や気泡によって液体の流れが乱れたりするので好ましくない。また、溝の長さも、チップの面積から自ずと限界が生じる。
【００４５】
このようなチップの流路内に所定量の液体を流す方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特願２００１−３６７３２５号公報に記載の方法、すなわち、液体槽の壁体の一部を構成するダイアフラム膜をプランジャー等で押圧して液体槽の容積を変化させることによって、液体槽に満たされた液体を液体槽に連結された流路に送って流路内の液体を流す方法を採用することも可能である。
【００４６】
ここで、２種類の液体を混合するための混合機構の一例を、図１を参照しながら説明する。図１においては、アルファベットの大文字によって流路の種類を示し、小文字によってその流路を流れる液体の流量を示す。なお、送液方法は、前述のダイアフラム膜を押圧する方法でもよいし、シリンジポンプを用いる方法のような従来から慣用される方法でも差し支えない。
【００４７】
図１の混合機構は、液体αが流量ａで流れる流路Ａと、液体βが流量ｂで流れる流路Ｂと、液体βが流量ｅで流れる流路Ｅと、を合流させて、液体αと液体βとを混合するものである。
まず、流路Ａと流路Ｂとが第一合流点において合流して１本の第一合流路となり、液体αと液体βとが混合される。そして、第一合流路に設けられた第一混合手段によって、液体αと液体βとの混合液がより均一に混合される。第一合流路は、その下流側端部の分岐点において分岐路Ｃ及び分岐路Ｄに分岐しているので、前記混合液は流量ｃ， 流量ｄの比率で分流される。
【００４８】
このうち前記混合液が流量ｄで流れる分岐路Ｄに、第二合流点において流路Ｅが合流して１本の第二合流路となり、前記混合液と液体βとが混合される。そして、第二合流路に設けられた第二混合手段によって、前記混合液と液体βとの混合液がより均一に混合され、液溜めＷに貯留される。
このような混合機構の液溜めＷにおける液体αの液体βによる希釈率を計算すると、下記の式（１）のようになる。
【００４９】
｛ａ／（ａ＋ｂ）｝×｛ｄ／（ｄ＋ｅ）｝ …（１）
例えばａ＝１，ｂ＝４，ｄ＝１，ｅ＝４の場合の希釈率は、１／２５となる（ただし、ａ＋ｂ＝ｃ＋ｄとした）。つまり、従来技術でも十分可能な１／４という希釈率の混合２回と、分流とを組み合わせることによって、１／２５という高い希釈率（大きな混合比率）の混合を実現することができる。
【００５０】
次に、２種類の液体を混合するための混合機構の別の例を、図２を参照しながら説明する。図１の混合機構との相違点は、第一合流点及び第二合流点において、液体βの流れる流路が他の流路に対して２本合流するようになっている点である。
このような構成であれば、混合手段として拡散を用いる場合には、必要な拡散距離は流路幅の１／２であるので、図１の混合機構の場合の１／２の距離で十分となる。拡散に必要な時間は距離の二乗に比例するため、拡散距離が１／２になれば拡散に必要な時間は１／４となり、その効果が大きいことが分かる。
【００５１】
このような混合機構の液溜めＷにおける液体αの液体βによる希釈率を計算すると、下記の式（２）のようになる。
｛ａ／（ａ＋ｂ１＋ｂ２）｝×｛ｄ／（ｄ＋ｅ１＋ｅ２）｝ …（２）
例えばａ＝１，ｂ１＝ｂ２＝４，ｄ＝１，ｅ１＝ｅ２＝４の場合の希釈率は、１／８１となる（ただし、ａ＋ｂ１＋ｂ２＝ｃ＋ｄとした）。このような高い希釈率は、液体が流路内を連続的に流れる従来の混合機構では、実現することは極めて困難な値であると言うことができる。
【００５２】
液体同士の混合に伴う希釈，反応の程度を検出する方法としては、光熱変換法，蛍光法，吸光度法，化学発光法等の光学的検出方法や、検出用電極を用いた電気化学的方法などを用いることができる。
光学的検出方法においては、チップ面の上下方向（角度は必ずしもチップ面に垂直である必要はない）の光路長、つまり液体の流れ方向に対して垂直方向又は斜め方向の光路長は、流路の深さ程度しか取れないので、測定部の流路の幅及び深さが１〜１０００μｍ程度の場合は、光熱変換法，蛍光法，化学発光法等が適している。吸光度法は一般には感度は低いが、十分高濃度のものであれば、流路の深さ程度の光路長（チップ面に垂直方向の光路など）でも検出可能である。また、液体の流れ方向に光路をとれば（チップ面内での光路）、１〜１０ｍｍの光路長を確保できるので、低濃度物質でも検出可能である。
【００５３】
電気化学的方法においては、グルコース電極等の物質特異的な酸化還元電位を利用した電極が用いられる。
前述したように、流路の幅及び深さが１〜１０００μｍ程度の場合は、チップ面の上下方向（角度は必ずしもチップ面に垂直である必要はない）の光路長、つまり液体の流れ方向に対して垂直又は斜め方向の光路長は、流路の深さ程度までしか取れないが、光熱変換法、特に熱レンズ法を用いれば、この程度の光路長で十分高感度に対象物質の検出が可能である。光熱変換法は、光路長を長く取るための複雑な流路構造を採用する必要がないので、チップを安価に製造することができる。また、半導体レーザーとフォトダイオードとの組み合わせなど、安価で簡単な光学系の検出装置で検出が可能である。
【００５４】
以上説明した本実施形態のチップを用いれば、医療現場でのベッドサイド診断が可能となり、また、外来患者に受診当日に検査結果を知らせることが可能となる。よって、治療薬及び治療方法の選択を迅速に行うことができる。また、河川の汚濁の分析や、廃棄物中の有害物質の定量定性分析等も、汚染現場において容易に行うことができる。さらには、輸入食品の通関時の汚染検査や、調理現場での即時的な分析も可能となる。
【００５５】
検出対象物質は特に限定されるものではなく、化学物質，蛋白，核酸等があげられるが、環境汚染化学物質、血液，髄液，唾液，尿に含まれる生体成分、臓器，組織，粘膜由来の生体成分、感染源となる菌，ウィルス等の蛋白、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アレルゲン、種々の抗原等が対象となりうる。
〔実施例〕
以下に、さらに具体的な実施例を示して、本発明を説明する。本実施例においては、混合機構を備えるチップ内において、試料（キシレンシアノール色素をＰＢＳバッファー（リン酸緩衝液）に４００μＭの濃度で溶解した溶液）を希釈用溶液であるＰＢＳバッファーで希釈する例を説明する。
【００５６】
（チップの作製について）
板面に溝を有する平板状部材を、メタクリル樹脂（旭化成株式会社製デルペット ８０ＮＨ）を射出成形することにより成形した。
射出成形の方法としては、樹脂を金型キャビティへ充填する工程中に、キャビティー内に炭酸ガスを存在させ、金型に接する樹脂表面の固化温度を低下させつつ射出成形する射出成形法（特開平１０−１２８７８３号公報、特開平１０−５０７１９号公報）を用いた。ガスとしては、純度９９％以上の二酸化炭素を使用した。成形機は、住友重機械工業株式会社製ＳＧ５０を使用した。
【００５７】
金型表面は、入れ子又はスタンパーで形成され、該入れ子又はスタンパーの表面には微細な溝の形状が加工されている。このスタンパーは、以下のようにして作製したものである。すなわち、必要とする溝を射出成形した際に形成できるパターンのマスクを、シリコンウェハー上に５０μｍの厚みでコートしたドライフィルムレジスト（ＤＦＲ）に乗せて露光し、シリコン上にＤＦＲのパターンを形成した。このシリコンウェハーに対してニッケル電鋳を行い、得られた電鋳品をヤスリで研磨して、電鋳品の厚さ，幅，及び長さを金型内に収まるように微調整した。
【００５８】
金型の表面状態の転写性は、光学顕微鏡による観察及びレーザー顕微鏡による形状測定で評価する。また、成形品も、光学顕微鏡による観察、切断断面の溝形状の光学顕微鏡や電子顕微鏡での観察、レーザー顕微鏡による形状測定等で評価する。
チップの構成部材である、板面に溝を有する平板状部材は、以下のようにして射出成形により成形した。金型キャビティの表面温度が８０℃の金型内に、二酸化炭素を満たし（圧力は１ＭＰａ）、樹脂温度２４０℃のメタクリル樹脂を射出した。そして、シリンダ内樹脂圧力８０ＭＰａで１０秒間保圧し、２０秒間冷却した後、成形品を取り出した。金型に満たした二酸化炭素は、樹脂充填完了と同時に大気中に開放した。
【００５９】
（混合機構の構造及び液溜めの形成について）
前記チップに備えられた混合機構は、図３に示すように、流路Ａと流路Ｂと流路Ｅとを合流させて、各流路を流れる液体を混合する構造である。すなわち、流路Ａと流路Ｂとが第一合流点において合流して１本の合流路Ｆとなり、合流路Ｆはその下流側端部の分岐点において分岐路Ｃ及び分岐路Ｄに分岐し、第二合流点において分岐路Ｄに流路Ｅが合流して１本の合流路Ｇとなる。
【００６０】
ここで、各流路の幅は、流路Ａが５０μｍ、流路Ｂが４５０μｍ、合流路Ｆが５００μｍ、分岐路Ｃが４５０μｍ、分岐路Ｄが５０μｍ、流路Ｅが４５０μｍ、合流路Ｇが５００μｍである。また、各流路Ａ〜Ｇの深さは、全て５０μｍである。
合流路Ｆの幅は、第一合流点での合流前後において液体の流速が変化しないような幅とした。本実施例においては液体の混合は拡散のみによって行われるので、拡散に必要な時間を合流後に十分に確保する必要がある点に配慮しなければならない。本実施例においては、拡散定数が比較的大きい色素を試料として用いるとともに、流速を十分小さくとることとし、液体が合流路Ｆを流れる間に十分均一に混合されるような流速及び合流路Ｆの長さを設計した。この点に関しては、合流路Ｇについても同様である。
【００６１】
また、分岐路Ｃ，Ｄへの分岐に偏り等が発生しないように、分岐後の圧損を考慮して分岐路Ｃ，Ｄの設計を行った。
合流路Ｇで均一に混合された液体は、測定点において後述する検出手段で分析され、所定の比率で希釈されたか否かが評価される。
なお、流路Ａ，Ｂ，Ｅの上流側端部と、分岐路Ｃ及び合流路Ｇの下流側端部とには、チップの両板面を貫通する貫通孔が形成されていて、前記各流路を流れる液体の液溜めとして使用される。図３に示された貫通孔の直径は、全て１５００μｍである。
【００６２】
このような構成の混合機構を備えるチップは、板面に溝を有する平板状部材とメタクリル樹脂シートとを、溝を有する板面を内側にして張り合わせることにより得られる。この平板状部材は、前述の射出成形法で成形される。そして、ドリル等を用いて前記貫通孔を形成し、十分にバリ取りを施した後に、厚さ３００μｍのメタクリル樹脂シートを、メタアクリレートモノマーで溶解したアクリル系光硬化性接着剤を用いて接着してチップを完成した。
完成したチップの貫通孔には、液体を送液するシリンジポンプを連結するためのコネクタを取り付けた。
【００６３】
（送液手段について）
本実施例においては、送液手段としてシリンジポンプを採用した。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製ＰＨＤ２０００）をチップ外部に３台用意し、流路Ａ，Ｂ，Ｅの上流側端部に連続する貫通孔にコネクタを介して接続した。
【００６４】
（光熱変換検出系の構成）
図４に、分析に使用した光熱変換原理に基づく検出系の構成を示す。
顕微鏡は、ステージ上での試料の取り扱いの容易さを勘案し、倒立型顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＩＸ７０）を使用したが、落射型の顕微鏡であっても差し支えない。この顕微鏡は、顕微鏡外の光学系で同軸にされたレーザー光を導入できるように改造を施してある。レーザーは、励起用にはＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ、１０ｍＷ、エドモントサイエンティフィック製）を、検出用のプローブ光には半導体レーザー（７８０ｎｍ、５０ｍＷ、フォトテクニカ株式会社製ＰＳ０２６−００）を採用し、ペルチェ付ＬＤマウント（日本科学エンジニアリング株式会社製ＴＣ−０５）に組み込んで使用した。ミラー，ビームエクスパンダー等の光学系は、メレスグリオ株式会社製品で統一した。
【００６５】
これらのレーザーの周波数は、使用する試薬や生成する反応物の吸収スペクトルによって適宜選択すればよい。また、レーザーの種類は特に限定されるものではなく、ガスレーザー，固体レーザー，半導体レーザー等があげられる。
励起用のレーザー光はライトチョッパーにより変調された後、ダイクロイックミラーにより検出用のレーザー光と同軸にされ、顕微鏡に導かれ試料に照射される。試料に照射した後、同軸にされたレーザー光のうち励起光のみを選択的にフィルターで除去しフォトセンサーに導く。
【００６６】
レーザー光受光部分の素子には、取り扱いの簡便性を考えて、ファイバー付きのフォトセンサーアンプ（浜松ホトニクス株式会社製Ｃ６３８６）を使用した。このフォトセンサーの受光部は、ピンホールを有するカバーで覆われている。フォトセンサー及びフォトセンサーアンプからの出力は、低雑音プリアンプ（株式会社エヌエフ回路ブロック製ＬＩ−７５Ａ）で増幅した後、ロックインアンプに導かれ信号処理が行われる。
【００６７】
このような光熱変換検出系により分析を行った。その手順は以下の通りである。前述のチップを倒立顕微鏡のステージ上に載置した。そして、対物レンズの焦点合わせは、励起用レーザーを使用し、モニター画面を参照しつつ、流路の上辺，下辺の位置での焦点合わせを実施した後に、その中間点を流路の中心位置として行った。
【００６８】
焦点合わせを実施した後、チップ内において前述の試料と希釈用溶液との混合を行い、混合液を測定点に導いた。そして、ライトチョッパーにより１０９５Ｈｚに変調された励起用のレーザー光を、測定点の混合液に照射して、試料中のキシレンシアノール色素を励起し発熱を生じさせた。このライトチョッパーによる変調の周波数は、ＳＮ比等の影響により変更することも有り得る。
【００６９】
この発熱により発生した熱レンズによって検出用のレーザー光の焦点位置がずれるため、その結果ピンホールを通したフォトセンサーの受光量が、発熱量に応じて変化することとなる。測定は、混合液の流れを停止させた状態で行ってもよいし、流れている状態で行ってもよいが、本実施例では流れている状態で測定を行った。フォトセンサーからの信号はロックインアンプにより処理されるが、ここでは時定数として１秒を用い、ライトチョッパーと同じ周波数１０９５Ｈｚの信号のみを選択的に出力として用いた。ロックインアンプの出力電圧は、励起光により励起されるキシレンシアノール色素の濃度に比例するため、キシレンシアノール色素の定量が可能である。
【００７０】
（分析結果について）
流路Ａに試料、流路Ｂ及び流路Ｅに希釈用溶液を流して混合を行うに先だって、試料のみを測定点に流した場合の熱レンズ信号を測定した。その結果は１８０ｍＶであった。
次に、貫通孔に接続された３台のシリンジポンプを駆動して、試料を０．４５μＬ／ｈの流量で流路Ａに流し、希釈用溶液を４．０５μＬ／ｈの流量で流路Ｂ及び流路Ｅに流した。この時、流路Ａ，Ｂ，Ｅにおける流速は５０μｍ／ｓとなる。第一合流点から分岐点までの合流路Ｆの長さ、及び、第二合流点から測定点までの合流路Ｇの長さはそれぞれ３ｃｍとしてあるので、１０分間の拡散時間が確保されることとなる。
【００７１】
混合された溶液が測定点に達したら、熱レンズ法により測定を行った。その結果、熱レンズ信号は１．７０〜１．８５ｍＶであった。試料のみの場合の熱レンズ信号と比較すると、おおよそ１／９７〜１／１０６倍であるので、大きな混合比率で混合が行われたことが確認された。また、設計値の１／１００倍に極めて近い希釈率で、混合が行われたことが分かった。
【００７２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の混合機構は、大きな混合比率で液体の混合を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る混合機構の一実施形態の構成を説明する図である。
【図２】本発明に係る混合機構の別の実施形態の構成を説明する図である。
【図３】実施例のチップに備えられた混合機構の構成を説明する図である。
【図４】実施例において分析に使用した光熱変換検出系の構成を示す図である。
【符号の説明】
Ａ，Ｂ，Ｅ 流路
Ｃ，Ｄ 分岐路
Ｆ，Ｇ 合流路[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a mixing mechanism capable of mixing liquids with a large mixing ratio, and more particularly, to a mixing mechanism suitable for an analyzer or the like that easily analyzes and detects a trace amount of sample.
[0002]
[Prior art]
Analysis for bedside diagnosis (POC (point of care) analysis) that performs measurements necessary for medical diagnosis near the patient, and analysis of harmful substances in rivers and wastes at rivers and waste disposal sites (POU (point of use) analysis), and analysis / measurement at or near the site where analysis / measurement is required, such as contamination inspection at food cooking / harvesting / importing sites The importance of (hereinafter collectively referred to as “POC analysis, etc.”) is attracting attention. In recent years, the development of detection methods and apparatuses applied to such POC analysis and the like is being emphasized. Such POC analysis and the like are required to be performed simply in a short time and at a low cost.
[0003]
Conventionally, for microanalysis, a GC-MS apparatus or an LC-MS apparatus, in which a sample is separated by capillary gas chromatography (CGC), capillary liquid chromatography (CLC), etc. and then quantified by a mass spectrometer, has been widely used. It was. However, these analyzers are suitable for use in on-site measurements such as patient bedsides, contaminated rivers, waste disposal sites, etc., due to the large mass spectrometer and complicated operation. Not. Furthermore, it is desirable that an analyzer for medical diagnosis using blood or the like as a sample should be disposable at the part touched by the sample.
[0004]
Therefore, in order to solve these problems, studies have been made to reduce the size of a conventionally used analyzer and to apply the μTAS (micro total analysis system) technology for reacting an extremely small amount of liquid reagent to POC analysis and the like. did it. In μTAS, in order to reduce the amount of sample, not only blood, a groove is formed on the surface of a glass or silicon chip of about 10 cm to several cm square and a reagent solution or sample is allowed to flow in the groove. The sample is separated and reacted to analyze a small amount of sample (JP-A-2-245655, JP-A-3-226666, JP-A-8-233778, RM McCorick, et al. , Analytical Chem., 69, 2626-2630 (1997) Acara Biosciences et al.). This technology has the advantage that the amount of sample, the amount of reagent necessary for detection, the amount of waste such as consumables used for detection, and the amount of waste liquid are all reduced, and the time required for detection can be reduced to a short time. is there.
[0005]
The applicant of the present application is also disclosed in Japanese Patent Application No. 10-181586 (“Mixing Analyzer and Mixing Analysis Method”), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-2675 (“Capillary Photothermal Conversion Analyzer”), International Publication WO99 / 64846. ("Analyzer"), International Publication No. WO01 / 13127 ("Analytical Cartridge and Liquid Feed Control Device") and other inventions relating to μTAS have been filed.
These publications and application specifications also describe using a resin microchip as a chip and using a thermal lens detection method as a trace component detection method.
[0006]
The thermal lens detection method is a photothermal conversion detection method in which a sample in a liquid is excited by excitation light to form a so-called thermal lens, and changes in the thermal lens are measured by the detection light. (JP-A-60-174933, A.C. Boccara et.al., Appl.Phys.Lett.36, 130, 1980, C.W. Earle, et al., J. Liquid Chromatography 12). , 2575-2585 (1989), JP-A-10-142177, JP-A-4-369467, Hiroko Kimura et al., Bunkeki No. 4,280-284, 1997, M. Harada, et.al., Anal. Chem.Vol.65, 2938-2940, 1993, Kawanishi, et al. 44th Annual Meeting of the Analytical Society of Japan演要 fact collection, p119,1995, etc.).
[0007]
As a method for measuring the components in the capillary, in addition to the thermal lens detection method, a fluorescence method, an absorbance method, or the like can be used. However, in a capillary having a short optical path length, an operation such as introduction of a fluorescent labeling substance is not performed. The thermal lens detection method is suitable because high sensitivity can be realized.
On the other hand, when analyzing a small amount of sample on a flat capillary chip, a technique for mixing liquids such as mixing / dilution is one of important techniques among quantitative means for handling samples and reagents. One.
[0008]
Conventionally, mixing and dilution of samples and reagents is performed by measuring the required amount and introducing it into the flow channel corresponding to the mixing tank, stopping the liquid feeding and making the liquid uniform by diffusion, or by homogenizing the liquid by mechanical stirring. It was done by the method of making it. In particular, a mechanical stirring method (for example, a method of stirring by rotating a stirring bar with a magnetic force) is preferable because it does not require time for homogenization. However, mechanical stirring in a flow channel having a width and depth of several tens of μm or less is actually difficult. In addition, a method of actively moving the liquid in the flow channel from the outside of the chip using an ultrasonic vibrator or the like, a method of stirring by moving the magnetic beads with an external magnet, etc. have been proposed. However, it is necessary to enclose the beads in the drive circuit and the flow path, respectively.
[0009]
In addition, various difficulties are involved in accurately and continuously mixing the two liquids at a constant ratio. For example, when mixing two weighed liquids, it is necessary to introduce each weighed liquid into the mixing tank, but at that time, leakage or leakage occurs between the surrounding flow paths. There is a high possibility that the precision of the mixing ratio will decrease. In order to prevent leakage and leakage from the surroundings, a means has also been proposed in which the sample and reagent in the capillary are separated by an air layer, moved by air pressure while maintaining the shape of the liquid plug, and then mixed. (T. S. Sammarco et al., Analytical Methods & Instrumentation. Special Issue μTAS '96, p150-152), a T-shaped air vent channel for merging the liquid plugs and removing air between the liquid plugs (see FIG. In addition to the problems of RC Anderson et al., Technical Digest of Solid-State Sensor and Actuator Workshop (1998) p7-10), there are many drawbacks such as requiring complicated procedures. Moreover, in order to mix the liquids weighed using a double T channel etc. without using a mixing tank, it is necessary that the weighed liquids be introduced simultaneously into the channel where the mixing is performed. Etc. are difficult and involve technical difficulties. Conventionally, the separation of a sample is often performed by electrophoresis or the like for separating a trace component contained in a sample, and an example of performing a precise mixing is not common.
[0010]
Examples of means for mixing the two liquids without using a mixing tank include S.I. C. Mixing by diffusion in a flow path as shown by Jacobson et al. (Anal. Chem, 70, 158-162, 1998) is common, and the same applies to International Publication WO99 / 64846 filed by the present applicant. The method is used. When mixing using diffusion between two liquids, since the influence of time on the diffusion distance is large as described later, it is difficult to mix a large amount of liquids only by diffusion. The law also has various restrictions.
[0011]
As a method of mixing the two liquids using diffusion in the flow path, A. Manz et al. (Proceedings of the μTAS'98 Worksshop, p235-240 (1998) (Kluwer Academic Publishers)) arranges many Y-shaped flow paths for merging two liquids in parallel, and all By forming a flow path in which the flow paths after joining the characters are integrated, and finally allowing the two liquids to flow alternately at short distances in the lateral direction, the diffusion distance is shortened and the liquid volume is increased. Realized.
[0012]
However, in the flow path configuration as described above, since it is necessary to form the flow path three-dimensionally on the chip for introducing the liquid, the manufacture of the chip becomes complicated. Furthermore, in this configuration, the structure of a chip that mixes many types of liquids of three or more liquids is further complicated, and it is not realistic to manufacture a chip suitable for practical use.
In addition, the width of the flow path is relatively wide, and one of the two liquids to be mixed flows in the flow path at a constant speed in advance, and the other liquid is opened by a slit or a large number of holes opened on the bottom surface in the middle of the flow path. A method of diffusing by introducing two liquids in parallel in the depth direction of the flow path has been proposed (for example, A. Yotsumoto et al., Proceedings of the μTAS '98 Workshop, p185-188 (1998). ) (Kluwer Academic Publishers)). However, in this case as well, since a means for introducing the liquid from the bottom surface of the flow path must be provided, the chip structure becomes complicated.
[0013]
Furthermore, when mixing in the capillary is performed by diffusion, it is necessary to consider the diffusion distance per time. Diffusion is t = L 2 / D (t: diffusion time, L: diffusion distance, D: diffusion coefficient) is a function of the concentration gradient, and the inversely proportional to the square of the distance and the larger the molecular weight, the slower the diffusion rate. For example, the time required for a relatively small molecule such as acetone to diffuse 200 μm is about 10 seconds or less, but as a molecule contained in blood, a relatively large urease needs several hundred seconds to diffuse the same 200 μm. (This value changes depending on what percentage of the concentration distribution in the capillary is considered to be uniform, but here it is 5% or less). Obviously, mixing by diffusion is not practical.
[0014]
Moreover, in the prior art which uses a flat type chip | tip when mixing two liquids, it is normal that the mixing ratio is 1: 1 or a low mixing ratio close | similar to it. However, in an actual chemical reaction or the like, mixing is generally performed at a ratio other than 1: 1. In such a case, if the flow path width or the like is not adjusted according to the mixing ratio, In this case, irregular disturbance due to the difference in flow velocity may occur, which may adversely affect the uniformity in the flow direction.
[0015]
However, when the flow rates are matched, the flow path width on the side with a larger flow rate becomes wider, and if the flow path width after the merge is kept wide, the time required for diffusion becomes impractical. Conversely, if the flow path width after merging is narrowed down, the flow velocity increases accordingly, so that the length of the flow path necessary for sufficient diffusion becomes longer and occupies a large chip area. As described above, when mixing is performed only by diffusion, a problem occurs only by using only ordinary means. Therefore, the mixing ratio cannot be set so high.
[0016]
[Patent Document 1]
JP-A-2-245655
[Patent Document 2]
JP-A-3-226666
[Patent Document 3]
JP-A-8-233778
[Patent Document 4]
Japanese Patent Application No. 10-181586
[Patent Document 5]
JP 2000-2675 A
[Patent Document 6]
International Publication No. WO99 / 64846
[Patent Document 7]
International Publication No. WO01 / 13127
[Patent Document 8]
JP 60-174933 A
[Patent Document 9]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-142177
[Patent Document 10]
JP-A-4-369467
[Non-Patent Document 1]
R. M.M. McCorick, et al. , Analytical Chem. 69, 2626-2630 (1997) Acara Biosciences
[Non-Patent Document 2]
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[Non-Patent Document 3]
C. W. Earle, et al. , J .; Liquid Chromatography 12, 2575-2585 (1989)
[Non-Patent Document 4]
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[Non-Patent Document 5]
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[Non-Patent Document 7]
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[Non-Patent Document 8]
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[Non-patent document 9]
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[Non-Patent Document 10]
A. Manz et al., Proceedings of the μTAS '98 Workshop, p235-240 (1998) (Kluwer Academic Publishers)
[Non-Patent Document 11]
A. Yotsumoto et al., Proceedings of the μTAS '98 Workshop, p185-188 (1998) (Kluwer Academic Publishers)
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, many techniques for mixing and diluting a liquid in a flow path in POC analysis and the like have been proposed in the past, but all of them have the problems described above.
Therefore, the present invention solves the problems of the prior art as described above, and is suitable for an analysis apparatus (for example, an analysis apparatus for performing POC analysis, etc.) that can easily analyze and detect a small amount of sample. It is an object to provide a mixing mechanism capable of mixing liquids at a ratio.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention has the following configuration. That is, the mixing mechanism according to the first aspect of the present invention is a mixing mechanism that mixes three or more flow paths through which liquid flows and mixes the liquid, and a part of the three or more flow paths. Are merged into one merged flow path, and the merged flow path branches into two or more branch paths at the downstream end thereof, and at least one of the two or more branch paths has the above-mentioned Of the three or more channels, the other channels merge.
[0019]
If the mixing mechanism is configured such that such merging-branching-merging is continuous, it is possible to perform mixing at a large mixing ratio that is difficult to achieve with a conventional mixing mechanism having only one merging structure. In addition, since the structure is simple, it is possible to reduce the size and cost. Therefore, the present invention can be suitably applied to an analyzer that simply analyzes and detects a small amount of sample, such as an analyzer that performs POC analysis and the like.
[0020]
For example, when two flow paths merge and the liquid flowing through the flow path is mixed at a flow ratio of 1: X, the flow path width is increased by (1 + X) in order not to cause a change in flow rate after the merge. When mixing is performed only by diffusion, it is necessary to suppress the final channel width to a predetermined value or less. The predetermined value is about 500 μm to 1 mm at the maximum, and more preferably about 300 to 500 μm. Therefore, if the minimum value of the channel width before mixing is 100 μm, the mixing ratio is naturally limited to about 5 to 10.
[0021]
On the other hand, when the flow path width is set to a value preferable for mixing by diffusion, the flow rate increases because the flow rate increases with the merge. Therefore, in order to perform mixing at a large mixing ratio, it becomes difficult to form a very long flow path in a limited space.
However, with the mixing mechanism as described above, it is possible to perform mixing at a large mixing ratio even if the mixing ratio in the first merging and the second merging is about the same as the conventional one. That is, a part of the liquid diluted by the first merging is taken out by branching and led to the second merging, and further dilution is added to suppress an increase in the total liquid volume and the first and second merging. Due to the synergistic effect of (mixing), it is possible to perform mixing at a large mixing ratio. For example, when the first merging and the branching are performed at the same ratio, a value obtained by multiplying the mixing ratio in the first merging by the mixing ratio in the second merging is the entire mixing ratio.
[0022]
A mixing mechanism according to a second aspect of the present invention is the mixing mechanism according to the first aspect, wherein the liquid flowing in at least one of the partial flow paths and the flow path of the other part The liquid flowing in at least one is the same kind of liquid.
In order to perform mixing at a large mixing ratio as described above, a liquid flowing in at least one of the partial flow paths and a liquid flowing in at least one of the other flow paths are: The same kind of liquid is preferable.
[0023]
Furthermore, a mixing mechanism according to a third aspect of the present invention is the mixing mechanism according to the second aspect, wherein the partial flow path includes a flow path through which the same kind of liquid flows and a flow path through which another type of liquid flows. And x represents the total flow rate of the same kind of liquid in the partial flow path. 1 , Where y is the total flow rate of the other types of liquids, and the mixing ratio x of the liquids when the partial flow paths merge 1 / Y is 1 or more, and the total flow rate of the same kind of liquid in the flow path of the other part is x 2 , Where z is the total flow rate of the mixed liquid in the branch path where the flow path of the other part joins, and the mixing ratio x of the liquid when the flow path of the other part joins the branch path 2 / Z is 1 or more.
[0024]
In order to perform mixing at a large mixing ratio as described above, it is preferable that the mixing ratio in the first merging and the mixing ratio in the second merging are both 1 or more. As described above, when mixing is performed only by diffusion, if the minimum value of the channel width is limited to, for example, 100 μm, the mixing ratio is naturally limited. Basically, diffusion is affected only by the distance and not by the mixing ratio, so if the minimum value of the channel width can be made small, mixing at a large mixing ratio with only one merge. Can be performed. According to the present invention, it is possible to perform mixing at a larger mixing ratio without forming a fine flow path that requires more advanced technology.
[0025]
Furthermore, a mixing mechanism according to a fourth aspect of the present invention is the mixing mechanism according to any one of the first to third aspects, wherein a mixing means for uniformly mixing the merged liquid is provided in the combined flow path. And
The liquid mixing performed after the flow paths merge is preferably performed only by diffusion because the structure of the mixing mechanism can be simplified. However, a mixing means for actively promoting mixing is provided in the combined flow path. You can also. By doing so, uniform mixing of the liquid in the combined flow path is more reliably achieved.
[0026]
Furthermore, the mixing mechanism according to claim 5 of the present invention is the mixing mechanism according to any one of claims 1 to 4, wherein the width and the depth of the branch path where the flow path of the other part merges are both It is characterized by being 500 μm or less.
Furthermore, the mixing mechanism according to a sixth aspect of the present invention is the mixing mechanism according to any one of the first to fifth aspects, wherein at least one of the three or more flow paths has a pair of grooves on the plate surface. The flat plate member is formed by pasting together the plate surface provided with the groove facing inside.
The mixing mechanism having such a configuration is more suitable for an analyzer that simply analyzes and detects a small amount of sample, such as an analyzer that performs POC analysis and the like.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An embodiment of a mixing mechanism according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In the drawings, the same or corresponding parts are denoted by the same reference numerals. In addition, this embodiment shows an example of this invention and this invention is not limited to this embodiment.
A chip used in an analyzer for performing POC analysis or the like has a plurality of flow paths through which liquids such as samples and reagents flow, and the liquids are mixed when these flow paths merge. ing. This chip is composed of a pair of flat plate-like members, and at least one of the pair of flat plate-like members has a groove formed on the plate surface. By attaching the members together, a capillary forming a flow path is formed inside the chip.
[0028]
Such a chip can be made of an inorganic material such as silicon or glass or an organic polymer. Moreover, the manufacturing method of a chip | tip is not specifically limited, For example, the method described in international publication WO99 / 64846 can be used. In the present embodiment, the mixing mechanism in which the flow path is formed in the chip will be described. However, the mixing mechanism of the present invention is not limited to the one configured by the capillary formed in the chip. For example, it may be constituted by a tubular member such as a tube existing outside the chip.
[0029]
The cross-sectional shape of the groove formed on the plate surface of the flat plate member is not particularly limited, and examples thereof include a polygonal shape such as a quadrangle and a triangle, a semicircular shape, and a semielliptical shape. Further, the chip may have a flow path formed by combining several types of grooves having different shapes. Furthermore, the width of the upper surface (open surface) of the groove may be the same as or wider than the width of the lower surface (bottom) of the groove.
[0030]
Note that the cross-sectional shape of the groove is preferably a quadrangle in order to perform detection by the detection means by the photothermal conversion method described later more simply and accurately. Moreover, if the cross-sectional size of the groove is too small, the flow of liquid may be disturbed by the fine particles. On the other hand, if too large, when many flow paths are formed on the plate surface of one flat plate member, the area of the plate surface of the flat plate member must be increased, and when mixing by diffusion is performed Problems arise in terms of diffusion distance.
[0031]
In the chip, workability when forming the groove in the flat plate member is also an important factor. Conventionally, silicon, glass, and the like have been used as a base material for a flat capillary chip, but this often depends on the fact that a semiconductor processing technique represented by LSI can be used as it is. Furthermore, in recent years, in addition to silicon and glass, organic polymers have been used as substrates. The type of organic polymer used for the chip is not particularly limited, but those described in International Publication WO99 / 64846 filed by the present applicant are suitable.
[0032]
As described above, flat plate members made of organic polymer having grooves include cutting from flat plates, etching using lasers, UV curing and thermosetting of monomers and macromonomers in the mold, and melt processing of thermoplastic resins. Or can be formed by a method such as plastic working. As a molding method that can be used satisfactorily, the flat plate member can be molded in a large amount and at a low cost, and therefore melt processing and plastic processing of a thermoplastic resin can be mentioned. What can be used better is the injection molding method and / or compression molding method and emboss molding method of a thermoplastic resin using a mold.
[0033]
In addition, the chip is manufactured by bonding two flat members, and in that case, ultrasonic fusion, thermal fusion, adhesion with an adhesive such as a hot melt adhesive or UV adhesive, and adhesion with an adhesive. The two flat members are integrated by a method such as direct pressure welding, pressure welding via a thin elastic sheet, double-sided tape, or the like.
At least one of the two flat plate-like members has the groove as described above, and the plate surface having the groove is inwardly bonded to the other flat plate-like member, but the flat plate has no groove. The material of the member (hereinafter may be referred to as a cover sheet) can be selected from materials used for the flat plate-like member having a groove. The materials of the two flat members may be the same or different.
[0034]
The thickness of the flat plate member is not particularly limited as long as it does not hinder detection, but is preferably from 0.05 mm to about several mm.
In addition, from the viewpoint of processing productivity, the chip configuration is composed of two flat plate members as described above, at least one of which has a groove, and the other has the plate surface having the groove on the other side. However, it is also possible to adopt a three-plate configuration in which a flat plate member having a through groove is sandwiched between two other flat plate members to form a groove.
A small hole for venting air, a liquid introduction hole, and a lead-out hole may be formed by providing a through-hole in the flat plate member having the cover sheet and the groove. In particular, when a flat plate member having a cover sheet or a groove has a thickness of about several mm, the through hole can be used as a liquid reservoir.
[0035]
When mixing the sample and the diluted solution or reacting the sample and the reagent in the chip, the diluted solution or the reagent solution may be supplied from the outside of the chip. Alternatively, a small container such as a bag enclosing a diluted solution or reagent solution (material is a resin such as polyethylene, polypropylene, polyester, polyamide, polyvinyl chloride, etc. that does not interact with the reagent) is set in the chip. The diluted solution or the reagent solution may be transferred to the liquid reservoir by breaking the bag by pressing a needle arranged in the chip against the bag from the outside. Furthermore, a solid reagent is sealed in the chip, and a predetermined amount of water or buffer from the liquid reservoir in the chip or outside is introduced into the reagent sealing portion and dissolved to obtain a reagent solution having a predetermined concentration. There is also a method.
[0036]
Further, the sample may be put in the chip as it is. In river pollution analysis, urine analysis, and the like, sample concentration using a membrane filter that can be fractionated by molecular weight may be performed as a pretreatment. In addition, a filter may be provided on the chip, and dust or blood cells in the sample may be removed before the sample is guided to the capillary.
[0037]
The capillary in the chip is a channel part mainly for the purpose of mixing reagents and samples, but the channel configuration of the entire chip is a channel part and reagent mainly for sampling a certain amount of sample. And a flow path portion mainly for the transfer of a sample and a flow path portion for detection, and a flow path portion mainly intended for different operations. That is, the chip of the present embodiment may have only a flow channel portion whose main purpose is one operation of mixing / dilution, but a plurality of flow channel portions whose main purposes are different operations. You may have. This makes it possible to perform not only qualitative analysis but also advanced analysis involving quantitative analysis and reaction.
[0038]
In particular, when detection is possible without separation after reacting the sample and reagent, as in biochemical test items, a consistent flow from mixing to reaction and detection without weighing a certain amount for separation. It is possible to process continuously on the road. For example, if the component to be detected can be detected without interference by other impurities due to the absorption wavelength, or the carbonyl group generated by oxidizing the hydroxyl group in the sample is detected with a spectrophotometer. When the substance changes, generally, it can be processed in a consistent flow path from mixing, reaction to detection at a predetermined flow rate ratio without separation.
[0039]
In addition, as the shape of the channel mainly for mixing and dilution of the sample and the reagent as in the present invention, a shape in which a plurality of other channels are joined to one channel, The shape etc. which merged the path simultaneously can be raised. A mixing operation or a dilution operation can be performed only by the shape of the flow path by joining another flow path to one flow path or joining a plurality of flow paths to form a single flow path.
[0040]
In addition, mixing and dilution at different ratios can be performed by changing the flow rates of the respective liquids when they are merged. In this case, it is preferable to provide a baffle plate structure at the joining portion or to provide a flow path having a structure that actively equalizes the liquid because mixing is promoted. However, there is a drawback that the structure of the chip becomes complicated.
[0041]
Examples of the shape of the flow path having a structure that actively equalizes the liquid include a meandering shape and a spiral shape. In addition, it is necessary to secure a necessary and sufficient time for the mixed liquid to react, but the distance of the flow path from the merging point to the next merging point or the detection unit is determined by the flow velocity obtained after mixing. By appropriately setting according to the above, it is possible to perform a necessary reaction without separately using a means for measuring the reaction time. Of course, it is possible to perform the necessary reaction by stopping the flow of the liquid and securing the time required for the reaction, but it is necessary to measure the time during which the flow of the liquid is stopped by some means. .
[0042]
Furthermore, by providing a flow path in which one flow path is branched into a plurality of flow paths, it is possible to perform a diversion, and it is possible to distribute the mixed solution after performing dilution and reaction. In the present invention, mixing at a large mixing ratio is realized by further combining a dilute solution or the like with the branched flow path.
[0043]
In the chip of this embodiment, the sample is controlled by an appropriate means to perform dilution and reaction with other reagents. In addition, operations such as merging of these liquids usually have to control the timing with high accuracy. Performing these operations accurately and simply without using an additional device such as an external timer, mixing and reacting the respective liquids at a predetermined flow rate ratio, and the combined liquid flowing at a predetermined flow rate Is allowed to flow through a capillary having a length that is necessary and sufficient to ensure the time required for mixing and reaction. In the present invention, the flow rate means the amount (volume) of the liquid that moves in the capillary within a predetermined time.
[0044]
The mixing ratio in the batch reaction can be replaced with a flow ratio. For example, if the pressure for flowing the liquid is constant, the flow rate ratio can be controlled by adjusting the pressure loss of the groove, and can be easily designed by means such as changing the cross-sectional area and length of the groove. If the groove is too thin, an adhesive or the like enters the groove when the flat plate members are pasted together to block the flow path, or the liquid flow is disturbed by small insoluble matter or bubbles, which is not preferable. Further, the length of the groove is naturally limited by the area of the chip.
[0045]
A method for flowing a predetermined amount of liquid into the flow path of the chip is not particularly limited. For example, the method described in Japanese Patent Application No. 2001-367325, that is, one of the walls of the liquid tank. The diaphragm membrane constituting the unit is pressed with a plunger or the like to change the volume of the liquid tank, so that the liquid filled in the liquid tank is sent to the flow path connected to the liquid tank to flow the liquid in the flow path It is also possible to adopt a method.
[0046]
Here, an example of a mixing mechanism for mixing two types of liquids will be described with reference to FIG. In FIG. 1, the type of the flow path is indicated by uppercase letters of the alphabet, and the flow rate of the liquid flowing through the flow path is indicated by lowercase letters. The liquid feeding method may be a method of pressing the above-described diaphragm membrane, or a conventionally used method such as a method using a syringe pump.
[0047]
The mixing mechanism of FIG. 1 joins a flow path A in which the liquid α flows at a flow rate a, a flow path B in which the liquid β flows at a flow rate b, and a flow path E in which the liquid β flows at a flow rate e. And liquid β.
First, the flow channel A and the flow channel B merge at the first merge point to form one first merge channel, and the liquid α and the liquid β are mixed. And the liquid mixture of the liquid (alpha) and the liquid (beta) is mixed more uniformly by the 1st mixing means provided in the 1st combined flow path. Since the first combined flow path branches into the branch path C and the branch path D at the branch point at the downstream end thereof, the mixed liquid is divided at a ratio of the flow rate c and the flow rate d.
[0048]
Of these, the flow path E merges with the branch path D through which the mixed liquid flows at the flow rate d at the second merge point to form one second merge flow path, and the mixed liquid and the liquid β are mixed. And the liquid mixture of the said liquid mixture and the liquid (beta) is mixed more uniformly by the 2nd mixing means provided in the 2nd combined flow path, and is stored in the liquid reservoir W. FIG.
When the dilution rate of the liquid α by the liquid β in the liquid reservoir W of such a mixing mechanism is calculated, the following equation (1) is obtained.
[0049]
{A / (a + b)} × {d / (d + e)} (1)
For example, when a = 1, b = 4, d = 1, and e = 4, the dilution ratio is 1/25 (provided that a + b = c + d). In other words, mixing with a dilution ratio as high as 1/45 (a large mixing ratio) can be realized by combining two times of mixing at a dilution ratio of 1/4, which is sufficiently possible with the prior art, and diversion.
[0050]
Next, another example of a mixing mechanism for mixing two kinds of liquids will be described with reference to FIG. The difference from the mixing mechanism in FIG. 1 is that two flow paths in which the liquid β flows are merged with respect to other flow paths at the first merge point and the second merge point.
With such a configuration, when diffusion is used as the mixing means, the required diffusion distance is ½ of the channel width, so that a ½ distance in the case of the mixing mechanism of FIG. 1 is sufficient. Become. Since the time required for diffusion is proportional to the square of the distance, the time required for diffusion becomes ¼ when the diffusion distance becomes ½, which shows that the effect is great.
[0051]
When the dilution rate of the liquid α in the liquid reservoir W of such a mixing mechanism by the liquid β is calculated, the following equation (2) is obtained.
{A / (a + b1 + b2)} × {d / (d + e1 + e2)} (2)
For example, when a = 1, b1 = b2 = 4, d = 1, and e1 = e2 = 4, the dilution ratio is 1/81 (where a + b1 + b2 = c + d). It can be said that such a high dilution rate is an extremely difficult value to achieve with a conventional mixing mechanism in which liquid continuously flows in the flow path.
[0052]
Methods for detecting the degree of dilution and reaction associated with the mixing of liquids include optical detection methods such as photothermal conversion, fluorescence, absorbance, and chemiluminescence, and electrochemical methods using detection electrodes. Can be used.
In the optical detection method, the optical path length in the vertical direction of the chip surface (the angle does not necessarily need to be perpendicular to the chip surface), that is, the optical path length perpendicular or oblique to the liquid flow direction Therefore, when the width and depth of the flow path of the measurement unit is about 1 to 1000 μm, a photothermal conversion method, a fluorescence method, a chemiluminescence method, or the like is suitable. The absorbance method is generally low in sensitivity, but can be detected even with an optical path length (such as an optical path perpendicular to the chip surface) about the depth of the flow path if the concentration is sufficiently high. Further, if an optical path is taken in the liquid flow direction (optical path in the chip surface), an optical path length of 1 to 10 mm can be secured, so even a low-concentration substance can be detected.
[0053]
In the electrochemical method, an electrode using a substance-specific redox potential such as a glucose electrode is used.
As described above, when the width and depth of the flow path are about 1 to 1000 μm, the optical path length in the vertical direction of the chip surface (the angle does not necessarily have to be perpendicular to the chip surface), that is, the liquid flow direction. On the other hand, the optical path length in the vertical or oblique direction can be taken only up to the depth of the flow path, but if the photothermal conversion method, particularly the thermal lens method is used, the target substance can be detected with sufficiently high sensitivity with this optical path length. Is possible. In the photothermal conversion method, it is not necessary to employ a complicated flow path structure for taking a long optical path length, so that a chip can be manufactured at a low cost. Further, the detection can be performed with an inexpensive and simple optical system detection device such as a combination of a semiconductor laser and a photodiode.
[0054]
If the chip of this embodiment described above is used, bedside diagnosis at a medical site can be performed, and an outpatient can be notified of a test result on the day of the medical examination. Therefore, it is possible to quickly select a therapeutic agent and a treatment method. In addition, analysis of river pollution and quantitative qualitative analysis of hazardous substances in waste can be easily performed at the pollution site. In addition, it is possible to check the contamination of imported foods at the time of customs clearance and to analyze immediately at the cooking site.
[0055]
Substances to be detected are not particularly limited and include chemical substances, proteins, nucleic acids, etc., but they are derived from environmental pollutants, blood, cerebrospinal fluid, saliva, urine, biological components, organs, tissues, and mucous membranes. Biological components, proteins such as bacteria and viruses that cause infection, DNA, RNA, allergens, various antigens, and the like can be targeted.
〔Example〕
Hereinafter, the present invention will be described with reference to more specific examples. In this example, a sample (a solution in which xylene cyanol dye is dissolved in PBS buffer (phosphate buffer solution) at a concentration of 400 μM) is diluted with a PBS buffer, which is a dilution solution, in a chip having a mixing mechanism. Will be explained.
[0056]
(About chip fabrication)
A flat plate-like member having a groove on the plate surface was molded by injection molding methacrylic resin (Delpet 80NH manufactured by Asahi Kasei Corporation).
As an injection molding method, during the process of filling the resin into the mold cavity, carbon dioxide gas is present in the cavity, and injection molding is performed while lowering the solidification temperature of the resin surface in contact with the mold (special feature). No. 10-128783 and JP-A-10-50719) were used. As the gas, carbon dioxide having a purity of 99% or more was used. As the molding machine, SG50 manufactured by Sumitomo Heavy Industries, Ltd. was used.
[0057]
The mold surface is formed by a nest or a stamper, and the surface of the nest or stamper is processed with a fine groove shape. This stamper was produced as follows. That is, a mask of a pattern that can be formed when the required groove is injection-molded is placed on a dry film resist (DFR) coated with a thickness of 50 μm on a silicon wafer and exposed to form a DFR pattern on the silicon. . Nickel electroforming was performed on the silicon wafer, and the obtained electroformed product was polished with a file, and the thickness, width, and length of the electroformed product were finely adjusted so as to be within the mold.
[0058]
The transferability of the surface state of the mold is evaluated by observation with an optical microscope and shape measurement with a laser microscope. Further, the molded product is also evaluated by observation with an optical microscope, observation with a groove-shaped optical microscope or electron microscope of a cut section, shape measurement with a laser microscope, and the like.
A flat plate member having a groove on the plate surface, which is a constituent member of the chip, was formed by injection molding as follows. A mold having a mold cavity surface temperature of 80 ° C. was filled with carbon dioxide (pressure was 1 MPa), and a methacrylic resin having a resin temperature of 240 ° C. was injected. Then, the pressure in the cylinder was maintained at 80 MPa for 10 seconds, and after cooling for 20 seconds, the molded product was taken out. The carbon dioxide filled in the mold was released into the atmosphere as soon as the resin filling was completed.
[0059]
(About structure of mixing mechanism and formation of liquid reservoir)
As shown in FIG. 3, the mixing mechanism provided in the chip has a structure in which the flow path A, the flow path B, and the flow path E are merged to mix the liquid flowing in each flow path. That is, the flow path A and the flow path B merge at the first merge point to form one merge flow path F, and the merge flow path F branches to the branch path C and the branch path D at the branch point at the downstream end thereof. The flow path E merges with the branch path D at the second merge point to form a single merge flow path G.
[0060]
Here, the width of each channel is 50 μm for channel A, 450 μm for channel B, 500 μm for combined channel F, 450 μm for branched channel C, 50 μm for branched channel D, 450 μm for channel E, and 450 μm for combined channel G. 500 μm. Moreover, all the depth of each flow path AG is 50 micrometers.
The width of the combined flow path F was set such that the liquid flow rate did not change before and after the merge at the first merge point. In the present embodiment, since mixing of the liquid is performed only by diffusion, it is necessary to consider that it is necessary to ensure a sufficient time for the diffusion after joining. In the present embodiment, a dye having a relatively large diffusion constant is used as a sample, and the flow rate is sufficiently small, so that the liquid is sufficiently uniformly mixed while flowing through the combined channel F and the combined channel F. Designed length. The same applies to the joint channel G.
[0061]
Further, the branch paths C and D were designed in consideration of the pressure loss after branching so that no deviation or the like occurs in the branch to the branch paths C and D.
The liquid uniformly mixed in the combined flow path G is analyzed by a detection means described later at the measurement point, and it is evaluated whether or not it has been diluted at a predetermined ratio.
The upstream ends of the channels A, B, and E and the downstream ends of the branch channel C and the combined channel G are formed with through holes that penetrate both plate surfaces of the chip. Used as a reservoir for liquid flowing through the flow path. The diameters of the through holes shown in FIG. 3 are all 1500 μm.
[0062]
A chip having a mixing mechanism having such a structure can be obtained by laminating a flat plate member having a groove on a plate surface and a methacrylic resin sheet with the plate surface having the groove on the inside. This flat member is formed by the above-described injection molding method. And after forming the said through-hole using a drill etc. and fully deburring, the 300-micrometer-thick methacrylic resin sheet was adhere | attached using the acrylic type photocurable adhesive agent melt | dissolved with the methacrylate monomer. To complete the chip.
A connector for connecting a syringe pump for feeding a liquid was attached to the through-hole of the completed chip.
[0063]
(About liquid feeding means)
In this example, a syringe pump was employed as the liquid feeding means. Three syringe pumps (PHD2000 manufactured by Harvard Apparatus) were prepared outside the chip, and connected to through-holes continuing to the upstream ends of the flow paths A, B, and E through connectors.
[0064]
(Configuration of photothermal conversion detection system)
FIG. 4 shows the configuration of a detection system based on the photothermal conversion principle used for the analysis.
The microscope used an inverted microscope (IX70 manufactured by Olympus Optical Co., Ltd.) in consideration of the ease of handling of the sample on the stage, but it may be an episcopic microscope. This microscope has been modified so that laser light that is coaxial with an optical system outside the microscope can be introduced. The laser employs a He-Ne laser (633 nm, 10 mW, manufactured by Edmont Scientific) for excitation, and a semiconductor laser (780 nm, 50 mW, PS026-00 manufactured by Phototechnica Co., Ltd.) for the probe light for detection. Incorporated into an LD mount with Peltier (TC-05 manufactured by Nihon Kagaku Engineering Co., Ltd.). Optical systems such as mirrors and beam expanders were unified by products of Melles Griot.
[0065]
The frequency of these lasers may be appropriately selected according to the absorption spectrum of the reagent used and the reaction product to be generated. The type of laser is not particularly limited, and examples include a gas laser, a solid laser, and a semiconductor laser.
The laser beam for excitation is modulated by a light chopper, is made coaxial with the laser beam for detection by a dichroic mirror, is guided to a microscope, and is irradiated on a sample. After irradiating the sample, only the excitation light out of the coaxial laser light is selectively removed by a filter and guided to a photosensor.
[0066]
In consideration of the ease of handling, a photosensor amplifier with a fiber (C6386 manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) was used for the element of the laser light receiving portion. The light receiving portion of this photosensor is covered with a cover having a pinhole. The output from the photosensor and the photosensor amplifier is amplified by a low noise preamplifier (LI-75A manufactured by NF Circuit Block Co., Ltd.) and then guided to a lock-in amplifier for signal processing.
[0067]
Analysis was performed using such a photothermal conversion detection system. The procedure is as follows. The above chip was placed on the stage of an inverted microscope. For the focusing of the objective lens, using an excitation laser and focusing on the upper and lower sides of the flow path while referring to the monitor screen, the intermediate point is set as the central position of the flow path. went.
[0068]
After focusing, the above-described sample and the diluting solution were mixed in the chip, and the mixed solution was guided to the measurement point. Then, a laser beam for excitation modulated at 1095 Hz by a light chopper was applied to the liquid mixture at the measurement point to excite the xylene cyanol dye in the sample to generate heat. The frequency of modulation by the light chopper may be changed due to the influence of the SN ratio or the like.
[0069]
The focus position of the laser beam for detection is shifted by the thermal lens generated by this heat generation, and as a result, the amount of light received by the photosensor through the pinhole changes according to the heat generation amount. The measurement may be performed in a state where the flow of the mixed liquid is stopped or may be performed in a flowing state, but in the present example, the measurement was performed in a flowing state. The signal from the photosensor is processed by a lock-in amplifier. Here, 1 second is used as a time constant, and only a signal having the same frequency of 1095 Hz as that of the light chopper is selectively used as an output. Since the output voltage of the lock-in amplifier is proportional to the concentration of the xylene cyanol dye excited by the excitation light, the xylene cyanol dye can be quantified.
[0070]
(About analysis results)
Prior to mixing by flowing the sample through the channel A and the diluting solution through the channel B and E, the thermal lens signal was measured when only the sample was passed through the measurement point. The result was 180 mV.
Next, the three syringe pumps connected to the through holes are driven, the sample is flowed into the flow path A at a flow rate of 0.45 μL / h, and the dilution solution is flowed at the flow rate of 4.05 μL / h. And flowed to channel E. At this time, the flow velocity in the flow paths A, B, and E is 50 μm / s. Since the length of the merge channel F from the first merge point to the branch point and the length of the merge channel G from the second merge point to the measurement point are each 3 cm, a diffusion time of 10 minutes should be ensured. It becomes.
[0071]
When the mixed solution reached the measurement point, the measurement was performed by the thermal lens method. As a result, the thermal lens signal was 1.70-1.85 mV. Compared with the thermal lens signal in the case of only the sample, it is about 1/97 to 1/106 times, so it was confirmed that the mixing was performed at a large mixing ratio. It was also found that mixing was performed at a dilution rate very close to 1/100 times the design value.
[0072]
【The invention's effect】
As described above, the mixing mechanism of the present invention can mix liquids with a large mixing ratio.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration of an embodiment of a mixing mechanism according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of another embodiment of a mixing mechanism according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration of a mixing mechanism provided in the chip of the example.
FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of a photothermal conversion detection system used for analysis in an example.
[Explanation of symbols]
A, B, E channel
C, D branch
F, G joint flow path
