JP2004538240A - Phosphoramidate and method therefor - Google Patents

Abstract

Novel phosphoramidate derivatives of compounds having a hydroxyl or amino function, including amino acids, peptides, peptidomimetics, and nucleotide analogs are described. This compound may enhance the intracellular delivery of the drug as the corresponding phosphate ester or amide. Phosphoramidate compounds show antiproliferative activity. A pharmaceutical preparation is provided for treating cancer.

Description

簡単に説明すると、細胞内で輸送されるリン酸塩に置換された化合物が合成され（上記スキーム１において付加されたリン酸を有するＲ）、輸送基（ＤＥＬＩＶＥＲＹ）およびマスキング基（ＭＡＳＫ）と結合している。マスキング基は、細胞内において加水分解され輸送基が完全である限り安定であるが輸送基の細胞内活性化で解離される中間体を生成するハロアルキルアミンの成分からなる。輸送基は、ニトロフリル基またはペルヒドロオキサジンのように、細胞内で加水分解して中間体を生成し、細胞内環境でその中間体を環化しＰ−Ｎ結合を切断して（すなわち、自発的加水分解）、望ましいリン酸含有化合物を放出する基であってもよい。
【０００７】
前記スキーム１に記載されたものに関連する化学的作用を利用するアルキル化剤とヌクレオチドの細胞内デリバリーシステムは、以前開発されている。しかしながら、以前の方法では、生物学的に不活性な加溶媒分解生産物として５０％のプロドラッグは“失われ”、望ましいヌクレオチドへの細胞内転化率は、およそ５０％しかなかった。本発明は、上記化学的作用の新たに発見された改良を対象とし、これは、チロシンリン酸ペプチドおよびペプチドミメティックに必須の構成要素であるヌクレオチドアナログやフェノールリン酸基の両方に適用を広げる。本発明は、ハロエチルからハロブチル（又は、ハロペンチル）基にマスキング基の構造を変更すると、望まれるヌクレオチドまたはリン酸含有ペプチドに対して、迅速でかつ定量的な細胞内転化（例えば、およそ１００％の転化率）が生じるという発見に基づく。本発明の新たな化学的作用は、ヌクレオチドアナログ、リン酸チロシンペプチド、およびペプチドミメティックに適用でき、リン酸成分を含有する幅広い他の医薬的に重要な化合物にも適用できる。
【０００８】
保護されたリン酸チロシン前駆体のホスホラミデートの開発により、ホスホチロシンペプチドおよびペプチドミメティックの合成を容易に行うことができるようになる。したがって、本発明は、保護されたリン酸チロシン前駆体や、例えば、Ｎ−ＢＯＣおよびフルオレニルメタオキシカルボニル基を有する保護された関連ペプチドをも対象とする。
【０００９】
本発明の一実施態様において、ホスホラミデートプロドラッグ化合物が提供され、水酸基の官能基を有する生物学的に活性な化合物が、その水酸基の官能基と共有結合し、細胞内において対応する薬剤のリン酸塩に転換する生物学上不安定なホスホラミデート基を形成する。生物学上不安定なホスホラミデート基は、薬剤物質のより効率的な細胞内デリバリーを可能にし、対応するリン酸エステルの形状で薬剤物質の生物学上重要な細胞内濃度を達成するための手段となる。他の実施態様では、生物学上活性のある化合物がアミノ官能基を有し、それは、そのアミノ官能基と共有結合して、細胞内でホスホラミドに（−ＯＰＯ_２ＮＨ−Ｄｒｕｇ）転換する生物学上不安定なホスホラミデートを形成する。
【００１０】
本発明は、他の実施態様では、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の中間体ハロホスホラミダイトを提供する。式中、ｎは４または５であり、Ｒは低級アルキル又は（ＣＨ_２）_ｎＸであり、Ｘは結合している炭素原子から求核的に置換されることができる求電子基であり、Ｒ_ｒＣＨ_２−基は生物学上不安定なエステル形成基であり、特に、細胞内で容易に加水分解されるエステル形成基である。この化合物は、本発明の方法の実施態様を用いて、前記記載のホスホラミデートプロドラッグ化合物を調製するための中間体薬剤として用いることができる。この本発明の実施態様においては、生物学的に活性のある化合物（Ｄｒｕｇ−ＯＨ）は、ハロホスホラミダイト中間体と反応し、対応する薬剤薬剤と反応した中間体である
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
を形成し、その後、酸化してホスホラミデートプロドラッグを形成する。この方法は、標準の保護基で保護された、カルボキシル官能基およびアミノ官能基を有する水酸基を持つ官能アミノ酸で始めたり、活性ペプチド、ペプチドミメティック、又はヌクレオチドアナログから始めたりして、細胞内薬剤のリン酸塩のホスホラミダイト前駆体を形成するために用いることができる。本発明に従って、ホスホラミデートプロドラッグは、Ｒ_ｒＣＨ_２−エステル形成基の加水分解の後、対応するリン酸塩に転化される。ひきつづき、環化された５員環又は６員環の（−Ｎ（ＣＨ_２）_ｎＸ基の環化で生成された）両性中間体の加水分解により、唯一のリン含有生成物として、対応するリン酸塩が生じる。類似した合成手順が、本明細書中では一般にＤｒｕｇＮＨ_２として表されるアミノ官能基を有する活性化合物で行うことができる。
【００１１】
＜発明の詳細な説明＞
本発明は、ペプチド、ペプチドミメティックリン酸塩、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを、細胞膜を透過して細胞内に移行する新規プロドラッグの化学的作用を対象とする。本発明の一実施態様は、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の中間体化合物を提供することにある。
【００１２】
式中の
Ｒは、Ｃ_１−Ｃ_４のアルキル又は（ＣＨ_２）_ｎＸであり；
ｎは、４または５であり；
Ｘは、Ｘに結合している炭素原子から求核的に置換され得る求電子基であり；
ｈａｌｏは、塩素、臭素、またはヨウ素であり；および
Ｒ_ｒＣＨ_２−基は、生物学上不安定なエステル形成基である。
【００１３】
求電子基Ｘはハロゲンが好ましく、例えば、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。しかしながら、本発明によるホスホラミダイトプロドラッグの投与後、ｉｎ ｖｉｖｏでリン結合窒素原子の環化や同時に起こる四分割を可能にする優れた離脱基になるのであれば、その基の性質は重要ではない。他の求電子離脱基としては、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフロロメタンスルホン酸塩、ハロ酢酸塩、などを用いることができる。
【００１４】
本発明を定義する際用いられる用語“生物学上不安定なエステル形成基”とは、エステル誘導体を形成するアルコールに由来するエステル形成基を意味し、薬剤製造や保存状態において安定なものであるが、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的状態にさらされるときには、加水分解される。特に、本発明に従って用いられるエステル形成基は、細胞外の体液中では加水分解に対し最低限の感受性しか示さないが、エステルを分解する還元状態が顕著な細胞内では加水分解されるのが好ましい。従って、本発明の一実施態様において、本発明のホスホラミデートプロドラッグ上の生物学上不安定なエステル形成基は、Ｒ_ｒがニトロフリル、ニトロチエニル、ニトロピローイル（ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｙｌ）、ニトロイミダゾール、およびその類似体、インダニル、ナフトクイノリル（ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｌｙｌ）、並びにペルヒドロオキサジンなどの基を含むニトロアリルである基を含む弱い還元状態において加水分解されやすいエステル形成基である。エステル形成基Ｒ_ｒＣＨ_２−としては、その基が細胞内において加水分解されやすければ、つまり典型的には、還元能を示す生物学的状態であれば、その基の性質は重要ではない。
【００１５】
治療用化合物は、ホスホラミデートプロドラッグ化合物を生成できるように、本発明に従って変化できるものであって、必ず二重に保護された（カルボキシル基の保護およびアミノ基の保護）形状のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、ヌクレオチドアナログ、および、対応するリン酸塩としての生物学的活性を示す他の水酸基を含む機能的薬剤化合物を含む。本発明の好ましい一実施態様としては、本発明による、対応するホスホラミデートに変化する薬剤は、フルオロデオキシウリジンのようなヌクレオチドアナログであり、それは、対応するモノリン酸塩誘導体として抗癌活性を示す。その他の実施態様においては、薬剤はアミノ酸、ペプチド、ペプチドミメティックなどである。
【００１６】
本発明によるホスホラミデートプロドラッグ化合物は、いくつかの合成手順により、対応する水酸基を含む機能的薬剤から調製することができる。好ましい一実施態様において、ホスホラミデートプロドラッグは、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の中間化合物の生成につながる条件下で、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の化合物に対して水酸基を含む機能性薬剤を反応させ、その後、その中間体を酸化して、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
のホスホラミデートプロドラッグを生成する。式中のＲ_ｒ，Ｒ，ｎ，およびＸは、前記定義と同じである。化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の中間化合物を形成する条件は、さまざまな条件をとることができるが、反応を第３アミン塩基のような酸捕捉剤（ａｃｉｄ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）の存在下で低温度にて行うことが好ましい。一実施態様として、反応媒体として無水ピリジンを用いて低温度（−７０℃から−１０℃ぐらい）で反応が行われる。化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
中間体化合物の、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
のホスホラミデートプロドラッグ化合物への酸化は、様々な弱い酸化状態の下で同様に行うことができる。リン原子を＋５の酸化状態にするという、要求される酸化に影響することができるものであれば、酸化剤の性質は、重要ではない。酸化剤としては、例えば、過酸、過酸化物、ヒドロペルオキシド、等が含まれる。酸化は、通常、約０℃以下の温度で行うが、それほど重要ではない。
【００１７】
化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の中間体ハロホスホラミダイトは、通常、第三アミン塩基の存在下で不活性の有機溶媒中で、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＨ
のアルコールと共に低温度でホスホラストリクロライドを反応させることにより調製することができ、その生成物を、化学式
ＨＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
のアミンと反応させる。本件のホスホラミデートプロドラッグを形成するために、通常は、酸スカベンジャーの存在下で、水酸基を含む機能的薬剤化合物との反応の前に、直ちに中間体を生成することが好ましい。
【００１８】
本発明のホスホラミデートプロドラッグの調製の他の方法において、水酸基を含む機能的薬剤化合物を、同様の一般的反応物を用いて、最後の酸化ステップを省略する他は前記記載の条件で、（ホスホラストリクロライドに対するものとして）ホスホラスオキシトリクロライドで反応を開始することから得られるクロロホスホラミデート中間体と反応させる。
【００１９】
前述した各反応は、対応する化合物
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（ＮＨ Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
を提供するために、アミノ官能基を含む薬剤（Ｄｒｕｇ ＮＨ_２）を用いて同様の手順で行うことができる。
【００２０】
本発明の他の実施態様において、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）_ｍ（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の化合物を調製方法し、それぞれ酸スカベンジャーの存在下で、１）化学式Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＨのアルコールと、２）化学式ＨＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸのアミンと、 化学式
Ｐ（Ｏ）_ｍｈａｌｏ_３
の化合物との反応ステップを含む方法を提供する。ここで、上記化学式中、
ｍは０または１であり；
ＲはＣ_１−Ｃ_４アルキル又は（ＣＨ_２）_ｎＸであり；
ｎは４または５であり；
Ｘは、Ｘに結合している炭素原子から求核的に置換され得る求電子基であり；
ｈａｌｏは、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｒ_ｒＣＨ_２−基は、生物学上不安定なエステル形成基である。
【００２１】
また、本発明の他の実施態様において、一般式Ｄｒｕｇ−ＯＰＯ_３の化合物の細胞内薬剤デリバリーを増強させるための化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
のホスホラミデートプロドラッグの調製方法を提供する。この方法は、プロドラッグの形成を誘導する条件の下で、化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の化合物と化学式Ｄｒｕｇ−ＯＨの治療用の化合物とを反応するステップを含む。
【００２２】
ここで、上記化学式中、
ＲはＣ_１−Ｃ_４アルキル又は（ＣＨ_２）_ｎＸ；
ｎは４または５であり；
Ｘは、Ｘに結合している炭素原子から求核的に置換され得る求電子基であり；
ｈａｌｏは、塩素、臭素、またはヨウ素であり；
Ｒ_ｒＣＨ_２−基は、生物学上不安定なエステル形成基である。
【００２３】
上記に述べたように、ここに記載された化学作用は、一般式Ｄｒｕｇ−ＮＨ_２の生物学的に活性のある化合物と中間化合物
Ｒ_ｒＣＨＯＰ（Ｏ）（ｈａｌｏ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
との反応による、化学式
Ｒ_ｒＣＨＯＰ（Ｏ）（ＮＨ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
のプロドラッグホスホラミデートの調製に、同じまたは同様の条件を用いて適用することができる。なお、式中のＲｒ，ｈａｌｏ，Ｒ，ｎ，およびＸは前記記載で定義されたものである。この化学作用は、化学式Ｄｒｕｇ−ＮＨＰＯ_３の治療用上の化合物の細胞内デリバリーのための方法を提供する。したがって、例えば、５′−アミノ ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、対応する５’−ＮＨＰＯ_３誘導体の高効率細胞内デリバリーのための、対応するプロドラッグホスホラミデートとして誘導することができる。
【００２４】
本件発明のホスホラミダイト化合物はそれ自身プロドラッグか、または、例えば、チロシンホスホラミデートの場合には、ペプチドまたはペプチドミメティックプロドラッグの合成に用いることができる。本件発明のホスホラミダイトの合成に関与する化学作用は、ホスホラミデート合成の化学作用に関与するようには意図されていない反応開始薬剤化合物上に存在するヒドロキシ、カルボキシ、チオール、アミンの官能基が、当業者が認める保護基で保護されるべきであるというようなものであるということは、当業者には認識されるだろう。そのような保護基、さまざまな官能基保護するための応用およびこれらの除去条件に対する参考文献は満ちあふれている。そのような保護基の使用は、当業者によく知られており、ホスホラミダイトプロドラッグおよび中間体の合成を実行する際に保護基を使用することは本件発明に含まれない。
【００２５】
本件発明に従って調製されるホスホラミダイトプロダクトは、その分野で認められている技術を用いて、誘導されない薬剤化合物と同じまたは同様の調剤形で調剤し、用いることができる。
【００２６】
本発明の一実施態様において、スキーム２に示された反応を行う。
【００２７】
【式２】

この反応では、プロドラッグ３Ａを、ホスホラミディックジクロロライド１に、ニトロフリルアルコールとｐ−クレゾールを順次加えることにより合成した。それから、プロドラッグ３を、エタノール／水溶液バッファー中、亜ジオチン酸ナトリウムで還元することにより活性化したが、そこではニトロフリル基が還元され、ホスホラミデートアニオン４Ａが放出されることになる。この中間体の次に続く反応を^３１ＰＮＭＲによりモニターした。中間体４Ａは、スムーズに環化して５員環の両性中間体になり、水に攻撃されることにより、唯一のリン含有生成物としてのリン酸クレゾールを得たことが、ＮＭＲによりわかった。
【００２８】
本発明の他の実施態様をスキーム３に示す。
【００２９】
【式３】

この反応は、ホスホラミデート１１Ａの合成を目的とし、ｐ−ヒドロキシ安息香酸９Ａのニトロフリルホスホラミデートの調製、および５−アセチルサリチルアミドから調製したベンジルアミン１０Ａとこの生成物とのカップリングを含む。簡単に説明すると、安息香酸誘導体９Ａを合成するために、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を、そのカリウム塩とアリルブロマイドとの反応により、アリルエステル６Ａに転化した。アリルエステルを、ＰＯＣｌ_３と反応させ、中間体ホスホリルジクロライドを、トリエチルアミンの存在下で、メチルクロロブチルアミンで処理し、ホスホラミディッククロライド７Ａを得た。５−ニトロ−２ヒドロキシメチルフランのリチウム塩と７Ａとの反応により、ホスホラミデート８Ａを得た。アリルエステルの脱保護が、Ｐｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４／ｐ−トルエンスルフィン酸ナトリウムとの反応で行われ、安息香酸ホスホラミデート９Ａを得た。トリエチルアミンの存在下で、クロロギ酸イソブチルと９Ａを反応させ、続いて、ベンジルアミン１０Ａを添加し、望んでいたペプチドミメティックプロドラッグ１１Ａを作製した。１２Ａへの１１Ａの活性化化学作用が、予測どおりに進行することを確認するために、１１Ａをエタノール／水中で、次亜硫酸塩ナトリウムによって還元し、反応を^３１ＰＮＭＲによりモニターした。１１からホスホラミデート陰イオンへの転化は数分以内で完了した；ホスホラミデートアニオンを、スムーズに、かつ、排他的に３７℃で２１分の半分の時間でリン酸塩１２Ａに転化した。１１Ａの活性化に対応するリン酸塩１２Ａを合成し、５．６μＭの結合親和性でｐｐ６０^ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合することを示した。
【００３０】
本発明のさらに他の実施態様において、異なる中間体を、チロシンリン酸塩ホスホラミデートを形成するためのスキーム３に示した一連の反応に組み込むために用いた。スキーム３で示された反応が行われたとき、その結果として生じる生成物とともに、中間体１７Ａを以下に示した。
【００３１】
【式４】

中間体１７Ａを、反応系の３番目のステップにおいて５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルフランの代わりに２−ヒドロキシメチル−１，４−ジメトキシナフタレンを用いるほかは、スキーム３で化合物９Ａに対して記載したように調製した。それから、化合物１７Ａをアミン１０Ａ（スキーム３）と結合させ、数分で精製物が高収率で得られる新たな条件を用いて、アミド１８Ａを得た。最後に、ジメトキシナフタレン１８Ａを、硝酸セリウムアンモニウムで酸化させることにより、ナフトキノン１９Ａにスムーズに転化した。
【００３２】
さらに、本発明の他の実施態様においては、マスクされたホスホチロシン含有ペプチドを、スキーム化学式４に示したように合成した：
【００３３】
【式５】

Ｎ−ＢＯＣ−チロシンカリウム塩をアリルブロマイドと反応させ、ＢＯＣ−チロシンアリルエステル１３Ａを得た。エステルをそのセリウムフェノール塩に転化し，Ｎ−メチル−Ｎ−クロロブチルホスホラミディックジクロライドと反応させ、アダクト（ａｄｄｕｃｔ）１４Ａを得た。最後に、ホスホラミディッククロライドを５−ニトロ−２−ヒドロキシメチルフランのリチウム塩と反応させ、チロシンホスホラミデートエステル１５Ａを得た。アリル保護基の除去により、優秀な純収率でＢＯＣ−保護されたチロシンホスホラミデート１６Ａを得た。このアナログは、全体的にさまざまなアミンをカップリングするのに適しているであろうし、自動化されたペプチド合成における試薬としても有用であるだろう。
【００３４】
スキーム４で示された合成反応は、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基で保護されたチロシンホスホラミデートの開発にまで広げられた。ＦＯＭＣで保護されたアミノ酸は、ペプチド合成で広く用いられ、保護基を塩基で触媒されるする条件のもとで迅速にかつきれいに取り除くことができるという利点がある。チロシンホスホラミデート１６ＡのＦＭＯＣアナログ、すなわちスキーム４の上記化合物２０Ａは、スキーム４と同様な反応系により調製することができる。ＦＭＯＣ保護基は、ジクロロメタン中で、ジアザビシクロアンデカン（ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏｕｎｄｅｃａｎｅ）と５分間反応させることにより、迅速にかつきれいに取り除くことができる。最後に、１６Ａと２０Ａをメチルグリシン酸塩とカップリング反応が行われ、これらの化合物をペプチド合成反応に用いることができることを明らかにした。
【００３５】
本件発明の他の実施態様において、ニトロフリルクロロブチルヌクレオシド３の合成が、スキーム５に示すように中間体の単離なしで、１つの操作で行われた。
【００３６】
【式６】

メチレンクロライド中のホスホラストリクロライドを、−７８℃において１等量のニトロフリルアルコールと反応させ、中間体ジクロライドを、Ｎ−メチル−Ｎ−クロロブチルアミンの塩酸塩で処理し、モノクロライド中間体Ａを得た。この中間体に５−フルオロ−２’−デオキシウリジンを含むピリジン溶液を添加した。その結果として生じるホスホラミデートを、ｔ−ブチルヒドロペルオキサイドで酸化し、ヌクレオシドホスホラミデート３を得た。この合成の収率は低く、また値にばらつきがあった（２０−６０％）。
【００３７】
本発明の代替実施態様において、類似したチミジン化合物質を調製した（即ち、３においてＦ＝ＣＨ_３）。チミジンホスホラミデートを、３７℃で水系バッファー／アセトニトリル中、亜ジチオン酸ナトリウムでニトロフリル基を還元することにより活性化し、反応物を^３１ＰＮＭＲでモニターした。１０分以内でホスホラミデートアニオンに対する共鳴が消失し、^３１ＰＮＭＲにより唯一のリン含有生成物としてのチミジン−５’−ホスフェートに対応する新たなピークが現れた。それから、ヌクレオシドホスホラミデート３を、ｉｎ ｖｉｖｏでＬ１２１０白血病細胞の増殖阻害能に対して評価した。細胞は、２，８，２４，および４８時間、薬剤にさらされた；結果を以下に要約する：
【表１】

クロロブチルホスホラミデート３は、類似したブロモエチル化合物に比べ、有意に効き目がよく、調製したヌクレオチドプロドラックで最も効き目のよい１つである。
【００３８】
本発明の関連ある実施態様において、中間体４を前記記載の反応スキーム中に組み込み、新たな薬剤５を製造した：
【００３９】
【式７】

ジメトキシナフタレン類似体４を、最初のステップにおいて２−ヒドロキシメチル−１，４−ジメトオキシナフアレンアナログ４を、５−ニトロ−２−ヒドロオキシメチルフランに代えて用いるほかは、スキーム５で示される方法と同様の方法で合成した。ジメトオキシナフタレン４を硝酸セリウムアンモニウムで酸化することにより、スムーズにナフトキノン５に転化した。化合物５を前記化合物３と比較して、Ｌ１２１０白血病細胞増殖阻害剤として評価した。
【００４０】
【表２】

両方の化合物は、Ｌ１２１０細胞の増殖の非常によい阻害剤であり、化合物５は、この分析で化合物３よりおよそ３倍の効能を示した。
【００４１】
本発明の一態様において、ホスホラミデートプロドラッグは、化学式
【化８】

の化合物であり、 化学式
Ｒ_ｒＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）（Ｚ−Ｄｒｕｇ）ＮＲ（ＣＨ_２）_ｎＸ
の水酸官能基またはアミノ官能基を含むペプチドミメティック（Ｄｒｕｇ ＺＨ）を用いて形成した。
【００４２】
なお、式中のＺは、ＯまたはＮであり；
ｑおよびｋは、独立に選ばれた１または０であり、そして
Ｂは、Ｈ，アミノ，保護されたアミノ，またはＣ_１−Ｃ_４のアルカノイルアミノである。
【００４３】
前記化合物の１群は式中のｑおよびｋがそれぞれ０であるベンズアミド化合物であり、例えば、以下のものがある。
【化９】

【００４４】
前記化合物の他の群はｑが１でｋが０のフェニルアセチル化合物であり、例えば、以下のものがある。
【化１０】

【００４５】
また、ペプチドミメティック（ＤｒｕｇＺＨ）の他の群はｑが１でｋが１のチロシル誘導体であり、例えば、以下のものがある。
【化１１】

【００４６】
前記化合物のいくつかは、抗増殖活性が予測され、トランスフェクトしたＪ７７細胞においてルシフェラーゼ発現の阻害を著しく示すことがわかった。
【００４７】
本発明に従って、”ＤｒｕｇＺＨ”をヌクレオチドアナログとしたいくつかのホスホラミデート化合物を調製し、Ｌ１２１０マウス白血病細胞において、著しく増殖抑制を示すことを見い出した。前記化合物は、本発明の抗増殖性物質の好ましい一群の一部である。多数のヌクレオチドアナログは抗増殖性活性を示すことが文献で報告されており、本件のホスホラミデートと、水酸官能基またはアミノ官能基によって共有結合することができるものを含め、それらどの化合物も、本件化合物の調製に用いることができる。
【００４８】
また、本発明の他の実施態様において、ホスホラミデート化合物はアミノ酸または化学式
【化１２】

のアミノ酸エステルの誘導体である。ここで、式中のＺ，ｑ，ｋ，およびＢは、前記記載で定義され、Ｒは水素またはカルボキシルの保護基、特にエステル形成基を意味する。前記チロシンまたはチロシンアナログは、ペプチドリン酸塩またはペプチドミメティックリン酸塩の細胞内での材料として、容易な膜輸送が可能なペプチドまたはペプチドミメティック化合物の調製に役立つ。もう１つの方法として、前記化合物は、対応するアミノ酸またはアミノ酸アナログを細胞内に提供することができる。
【００４９】
例えば、以下の化合物がある。
【化１３】

【００５０】
さらに、本件発明は癌治療のためのプロドラッグホスホラミデート化合物の有効量を含有する医療調剤を提供する。ここで用いられるプロドラッグ化合物の有効量は、患者に投与する際に、腫瘍細胞の成長／増殖を阻害するか、悪性細胞を殺すか、腫瘍の量若しくはサイズを減少させるか、または治療を受けた患者において腫瘍を完全に除去する化合物の量として定義される。
【００５１】
患者に投与する有効量は、通常、身体表面積、患者の体重、および患者の状態に基づく。動物およびヒトの投与量の相互関係（身体表面積の平方メー トルあたりのミリグラムに基づく）は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ， Ｅ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，５０（４）：２１９（１９６６）に記載されている。身体表面積は、患者の身長および体重からおおよそ決定してもよい（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ， Ｇｅｉｇｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ａｒｄｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ５３７−５３８ページ（１９７０）参照）。本件発明のホスホラミデート化合物の有効量は、一投与量当たり、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、約０．２５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、最も典型的には、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。また、有効量は、当業者に認識されているように、投与ルート、賦形剤の使用、他の化学療法薬および放射線療法を含む他の治療処置を併用する可能性に依存して変わる。
【００５２】
治療調剤は、皮下注射、腹腔内投与、筋肉内投与、および静脈注射を含む非経口ルートで投与してもよい。非経口投与形態の例としては、等張食塩水、５％のグルコースまたは他のよく知られた医薬上許容可能な液体キャリアー中の活性薬剤の水溶液または懸濁液が挙げられる。本件医薬組成の一態様においては、ホスホラミデート化合物を５％のジメチルスルホキシドおよび約１０％のＣｒｅｍｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を含有する食塩水に溶解する。より可溶性の本件化合物との複合体を形成することができるシクロデキストリンのような可溶化剤や、あるいは、当業者によく知られた他の可溶化剤を癌治療のための本件化合物のデリバリーに医薬賦形剤として用いることもできる。
【００５３】
あるいは、本件化合物は、よく知られた方法を用いて、他の投与ルートのための投与形態形状に製剤化することもできる。医薬組成物は、例えば、カプセル、ゲルシール，または錠剤といった経口投与のための投与形態で調剤されることもできる。カプセルは、ゼラチンまたはセルロース誘導体のようなよく知られている医薬上許容可能などんな材料を含んでいてもよい。錠剤は、活性ホスホラミデート、および当業者によく知られた固形キャリアーや潤滑剤の混合物を圧縮することにより、従来の方法に従って、製剤化することとしてもよい。固形キャリアーの例としては、でんぷん、糖、ベントナイトなどを挙げることができる。本発明の化合物は、また、例えば、結合剤としてのラクトース若しくはマンニトール、および従来の増量剤および錠剤化剤を含有する硬殻錠剤またはカプセルの形態で投与することもできる。
【００５４】
＜実験手順および実施例＞
【化１４】

５−フルオロ−２’−デオキシウラジル５−ニトロフルフリルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（３）：
ホスホラストリクロライド（２Ｍ ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液；０．８１ ｍＬ；１．６３ ｍｍｏｌ）をアルゴンの下で−７８℃に冷却した。５−ニトロフルフリルアルコール（２３３ ｍｇ；１．６３ ｍｍｏｌ）を無水のＣＨ_２Ｃｌ_２ １２ ｍＬに溶解し、冷やしたＰＣｌ_３を加えた後、純粋でかつ無水のｉＰｒ_２Ｎｅｔ（０．．５７ ｍＬ； ３．２５ ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応は−７８℃ から−７０℃の間で１５分間攪拌して行った。無水のＣＨ_２Ｃｌ_２ １６ ｍＬにＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）アミンヒドロクロライド（２５７ ｍｇ； １．６３ ｍｍｏｌ）を溶解し、反応混合物に加えた後、上記無水でかつ純粋なｉＰｒ_２Ｎｅｔ（１．１３ ｍＬ； ６．５０ ｍｍｏｌ）を滴下添加し、この反応混合物を−７８℃ から−７０℃の間で３０分間攪拌した。この反応混合物を、あらかじめ−６５℃で冷やした、２ ｍＬの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２と２ ｍＬの無水ピリジンに溶解した５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（２００ ｍｇ； ０．８１２ ｍｍｏｌ）溶液に、カニューレで注入した。反応は、−６５℃ から−６０℃の間で１時間攪拌して行った。この反応混合物にｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６分 ｄｅｃａｎｅ； ０．４４ ｍＬ）を、−６５℃で攪拌しながら加えた。温度を−４０℃まで上昇させ、３０分以上−４０℃から０℃まで上昇させながら攪拌した。この反応混合物をセライトに流し込み、減圧濃縮した。粗生成物（１：１のＣＨ_２Ｃｌ_２／アセトン）のカラムクロマトグラフィーにより、黄色の泡状の物質１（１５５ ｍｇ； ３４％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ９．６８ （ｍ， １Ｈ）； ７．８０ ａｎｄ ７．７４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．２２ Ｈｚ ａｎｄ ６．４１ Ｈｚ）； ７．３０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．４８ Ｈｚ）； ６．７１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．３０）； ６．２２ （ｍ， １Ｈ）； ５．０３ （ｍ， ２Ｈ）； ４．５２ （ｍ， １Ｈ）； ４．２４ （ｍ， ２Ｈ）； ４．０７ （ｍ， １Ｈ）； ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）； ３．０７ （ｍ， ２Ｈ）； ２．６８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １０．２５ Ｈｚ）； ２．４９ （ｍ， １Ｈ）； ２．１８ （ｍ， １Ｈ）， １．７４ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１５．５９ ａｎｄ −１５．７８．
ＨＰＬＣ （３５：６５ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］）： ８．６６７分．， ９２％．
ＥＳＩ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_１９Ｈ_３５ＣｌＦＮ_４Ｏ_１０Ｐについて計測： ｍ／ｚ ５５５．１０５９ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ５５５．１０５９．
【００５５】
【化１５】

５−フルオロ−２’−デオキシウリジル２−（１，４−ジメタオキシナフチル）メチルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（４）：
ホスホラミデート４を、前記コンパウンド３と同様に無水のトリクロライド（２分 ＣＨ_２Ｃｌ_２； ０．４１ ｍＬ； ０．８１２ ｍｍｏｌ）、１，４−ジメタオキシ−２−ヒドロキシメチルナフタレン（１７７ ｍｇ， ０．８２３ ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）アミンヒドロクロライド（１２８ ｍｇ， ０．８１２ ｍｍｏｌ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（１００ ｍｇ， ０．４０６ ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６分 ｄｅｃａｎｅ； ０．２３ ｍＬ）から調製した。粗生成物（１：１のＣＨ_２Ｃｌ_２／アセトン）のカラムクロマトグラフィーにより、薄いオレンジ色の泡状の物質４（１３４ ｍｇ； ５２％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．２２ （ｄｄ， １Ｈ）； ８．０４ （ｄｄ， １Ｈ）； ７．７４ ａｎｄ ７．６６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．２３ ＆ ６．３９）； ７．５５ （ｍ， ２Ｈ）； ６．８３ （ｓ， １Ｈ）； ６．１６ （ｍ， １Ｈ）； ５．２６ （ｍ， ２Ｈ）； ４．５１ （ｍ， １Ｈ）； ４．２３ （ｍ， ２Ｈ）； ４．０５ （ｍ， １Ｈ）； ３．９９ （ｓ， ３Ｈ）； ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）； ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）； ３．０８ （ｍ， ２Ｈ）； ２．６５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ９．７０ Ｈｚ）； ２．４２ （ｍ， ２Ｈ）； １．６６ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１２．８２ ａｎｄ −１２．９０
ＨＰＬＣ （５０：５０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］）： ７．０１７分．； ９５％．
ＦＡＢ ＭＳ （ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）： Ｃ_２７Ｈ_３４ＣｌＦＮ_３Ｏ_４Ｐについて計測： ｍ／ｚ ６３０．１７８４ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ６３０．１７６０．
【００５６】
【化１６】

５−フルオロ−２’−デオキシウリジル２−（１，４−ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｙｌ）メチル Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（５）：
硝酸セリウムアンモニウム（２２５ ｍｇ， ０．４１ ｍｍｏｌ）水溶液（３ ｍＬ）を、４（１００ ｍｇ， ０．１６ ｍｍｏｌ）のＣＨ_３ＣＮ溶液 （３ ｍＬ）に１５分間以上かけて滴下添加した。反応は室温で１時間攪拌して行い、ＣＨＣｌ_３ で３回抽出した。有機層を一つにまとめ、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ_３）により精製し、黄色の泡状の物質５（８７．６ ｍｇ， ９３％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．１０ （ｍ， ２Ｈ）； ７．７７ （ｍ， ２Ｈ）； ７．７２ （ｍ， １Ｈ）； ７．０３ （ｓ， １Ｈ）； ６．１８ （ｍ， １Ｈ）； ５．０２ （ｍ， ２Ｈ）； ４．５８ （ｍ， １Ｈ）； ４．２９ （ｍ， ２Ｈ）； ４．０５ （ｍ， １Ｈ）； ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７３ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １０．０７ Ｈｚ）； ２．４７ （ｍ， １Ｈ）； ２．３１ （ｍ， １Ｈ）； １．７５ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１２．６７ ａｎｄ −１２．９９．
ＨＰＬＣ （５０：５０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］）： ４．６５０分．； １００％．
ＦＡＢ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_２５Ｈ_２８ＣｌＦＮ_３Ｏ_９Ｐについて計測： ｍ／ｚ ６００．１３１４ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ６００．１３２７．
【００５７】
【化１７】

５−フルオロ−２’−デオキシウリジル２−（５−メタオキシ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｏｑｕｉｎｏｎｅ）メチルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（６）：
ホスホラストリクロライド（２Ｍ ＣＨ_２Ｃｌ_２ 溶液； ０．１３ ｍＬ； ０．２５８ ｍｍｏｌ）をアルゴン中で−６０℃に冷却した。２−ヒドロキシメチル−５−メタオキシ−Ｎ−メチルインドロキノン（５７ ｍｇ； ．２５８ ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_３ＣＮ １ ｍＬを添加した無水ＣＨ_２Ｃｌ_２ ６ ｍＬに溶解し、あらかじめ冷却したＰＣｌ_３に加えた後、純粋なｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ（０．０７ ｍＬ； ０．３８６ ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応は−６０℃で２５分間攪拌して行った。 無水のＣＨ_２Ｃｌ_２ １ ｍＬに、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）アミンヒドロクロライド（４０．７ ｍｇ； ０．２５８ ｍｍｏｌ）を溶解させ、反応混合物に添加した後、純粋なｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ（０．１４ ｍＬ； ０．７７３ ｍｍｏｌ） を滴下添加し、−６０℃で２５分間攪拌した。５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（３１．７ ｍｇ； ０．１２９ ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと共に蒸発させ、無水のピリジン ２ ｍＬ中に溶解し、−４５℃に冷却した。ＦＵｄＲが消失するまで、このピリジン溶液を、以前に作成した混合液で滴定した。ＦＵｄＲの消失は、３０％のメタノールを含むクロロホルムを用いてＴＬＣによりモニターした。１時間後、反応を−４０℃でｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６ Ｍ ｄｅｃａｎｅ 溶液； ０．０６ ｍＬ）により酸化させ、３０分以上かけて−４０℃から０℃まで上昇させながら攪拌した。飽和させたＮＨ_４Ｃｌ（３ ｍＬ）を加え、いくつかの層を分離させ、無水の層をＣＨＣｌ_３（５回 ５ｍＬ）で抽出した。有機層を一つに混合し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧濃縮した。この粗反応混合物を、１５％のメタノールを含むクロロホルムを用いてシリカゲルのプラグを通過させた。シリカゲル（１：９ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）クロマトグラフィーにより、さらに精製し、黄オレンジ色の泡状の物質６（３３ ｍｇ； ４１％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．９９ （ｂｒ， １Ｈ）； ７．６２ （ｍ， １Ｈ）； ６．６２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．７６ Ｈｚ）； ６．１１ （１Ｈ， Ｊ ＝ ４．３０）； ５．６４ （ｓ， １Ｈ）； ４．９５ （ｍ， ２Ｈ）； ４．４６ （ｍ， １Ｈ）； ４．１３ （ｍ， ２Ｈ）； ３．９５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４．０３ Ｈｚ）； ３．８６ （ｍ， １Ｈ）； ３．７６ （ｓ， ３Ｈ）； ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）； ３．９５ （ｍ， ２Ｈ）； ２．５８ （ｍ， ３Ｈ）； ２．４１ （ｍ， １Ｈ）； ２．１１ （ｍ， １Ｈ）； １．６５ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１４．６５ 及び −１４．７１．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントで３０分以上）：２０．３２分．； ８０％．
ＦＡＢ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_２５Ｈ_３１ＣｌＦＮ_４Ｏ_１０Ｐについて測定： ｍ／ｚ ６３３．１５２９ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ６３３．１５０６．
【００５８】
【化１８】

Ｎ−アリルオキシカルボニルアラビノシルサイトシン（７）：
ピロ炭酸ジエチル（８６．８ ｍｇ， ０．４５２ ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（５ ｍＬ）で希釈し、室温でアラビノシルシトシン（１００ ｍｇ， １．６１ ｍｍｏｌ）の水溶液 （ｄｄＨ_２Ｏ １ ｍＬ）に加えた。この反応混合物をオイルバスに浸し、２時間還流した後、溶媒を減圧除去し、得られた白い残留物に無水のピリジン（３回、 ５ｍＬ）を加え、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３中１５％ ＭｅＯＨ ）により精製し、白い泡状物質７（９１ ｍｇ， 出発原料を基準にした回収率７６％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ_６）： ｄ １０．７５ （ｂｒ， １Ｈ）； ８．０４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．５１ Ｈｚ）； ７．００ （ｄ， １ｈ， Ｊ ＝ ７．５１ Ｈｚ）； ６．０４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．８５ Ｈｚ）； ５．９５ （ｍ， １Ｈ）； ５．４６ （ｍ， １Ｈ）； ５．３９ ＆ ５．２５ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １．４７ ＆ ３５．３４ Ｈｚ）； ５．３２ ＆ ５．２１ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １．１ ＆ ２３．３２ Ｈｚ）， ５．１１ （ｍ， １Ｈ）； ４．６２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．３１ Ｈｚ）； ４．０４ （ｍ， １Ｈ）； ３．９１ （ｍ， １Ｈ）； ３．８１ （ｍ， １Ｈ）； ３．６０ （ｍ， ２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントで３０分以上）：１２．１８分．； ９９％． ＥＳＩ ＭＳ （低分解能）： （Ｍ＋Ｈ） ＝ ３２８ ｍ／ｚ； Ｃ_１３Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ_７のＭＷ ＝ ３２７．
【００５９】
【化１９】

Ｎ−アリルオキシカルボニルアラビノシルサイトシル５−ニトロフルフリルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（８）：
ホスホラミデート８を、前記記載のコンパウンド６と同様に、ホスホラストリクロライド（２Ｍ ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液； １．１４ ｍＬ； ２．２８ ｍｍｏｌ）、５−ニトロフルフリルアルコール（３２６ ｍｇ， ２．２８ ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチルアミン）ヒドロクロライド（３６０ ｍｇ， ２．２８ ｍｍｏｌ）、Ｎ−アリルオキシカルボニルアラビノシルサイトシン（２４０ ｍｇ， ０．７３３ ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６ Ｍ デカン 溶液； ０．４８ ｍＬ）から調製した。粗生産物（１０％ メタノールを含むＣＨＣｌ_３）のカラムクロマトグラフィーを行い、薄黄色の泡状物質８（２２７ ｍｇ； ５０％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．２３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．３３ Ｈｚ）； ７．２３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １．３３ Ｈｚ）； ６．６９ （ｍ， １Ｈ）； ６．１５ （１Ｈ）； ５．９１ （ｍ， １Ｈ）； ５．３４ （ｍ， ３Ｈ）； ５．０２ （ｍ， ２Ｈ）； ４．５５ （ｍ， ４Ｈ）； ４．２３ （ｍ， ２Ｈ）； ３．５５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６８ Ｈｚ）； ３．０３ （ｍ， ２Ｈ）； ２．６７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １０．２６ Ｈｚ）； １．７３ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１５．５４ および −１５．７６．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントで３０分以上）： ２０．０１分．； ９５％．
ＥＳＩ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_２３Ｈ_３１ＣｌＮ_５Ｏ_１２Ｐについて計測： ｍ／ｚ ６３６．１４７４ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ６３６．１４７４．
【００６０】
【化２０】

アラビノシルサイトシル５−ニトロフルフリルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート：
テトラキス（トリフェニルフォスフィリン）パラジウム（３．４５ ｍｇ， ２９．９ ｍｍｏｌ）を、 にホスホラミデート８（３８ ｍｇ， ５９．８ ｍｍｏｌ） のＴＨＦ溶液（４００ ｍＬ）に加え、続いてにｐ−トルエンスルフィン酸（１１．７１ ｍｇ， ６５．７ ｍｍｏｌ）水溶液 （ｄｄＨ_２Ｏ、２４０ ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で２．５時間攪拌し、その後、それをシリカゲル（２０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）のプラグを通過させ、薄黄色の泡状物質（２５．１ ｍｇ， ７６％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ）： ｄ ７．８５ （ｍ， ２Ｈ）； ７．４９ （ｍ， １Ｈ）； ６．８９ （ｍ， １Ｈ）； ６．５７ （ｍ， １Ｈ）； ５．９５ （ｍ， １Ｈ）； ５．１１ （ｍ， ２Ｈ）； ４．１９ （ｍ， ５Ｈ）； ３．６６ （ｍ， ２ Ｈ）； ３．１１ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７２ （ｍ， ３Ｈ）； １．７９ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ， ＴＰＰＯ）： ｄ −１４．１８ ａｎｄ −１４．３７
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントで３０分以上）：２１．４３ 分．； ９５％．
ＥＳＩ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_１９Ｈ_２７ＣｌＮ_５Ｏ_１０Ｐについて計測： ｍ／ｚ ５５２．１２６２ （Ｍ＋Ｈ）^＋； Ｆｏｕｎｄ： ５５２．１２５１．
【００６１】
【化２１】

２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジル５−ニトロフルフリルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（１０）：
ホスホラミデート１０を前記記載のコンパウンド６と同様に、ホスホラストリクロライド（２分 ＣＨ_２Ｃｌ_２； ０．４５ ｍＬ； ０．８９２ ｍｍｏｌ）、５−ニトロフルフリルアルコール（１２８ ｍｇ， ０．８９２ ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチルアミン）ヒドロクロライド（１４１ ｍｇ， ０．８９２ ｍｍｏｌ）、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジル（１００ ｍｇ， ０．４４６ ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６ Ｍ デカン溶液； ０．４８ ｍＬ）から調製した。粗生産物（５％ メタノール含有ＣＨＣｌ_３）のカラムクロマトグラフィーにより、白い泡状物質１０（８０．５ ｍｇ； 出発原料を基準にした回収率４８％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．１９ （ｓ， １Ｈ）； ７．２９ （ｍ， １Ｈ）； ７．１９ （ｓ， １Ｈ）； ６．９８ （ｍ， １Ｈ）； ６．６６ （ｍ， １Ｈ）； ６．３４ （ｍ， １Ｈ）； ５．９１ （ｍ， １Ｈ）； ４．９９ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ９．９７ Ｈｚ）； ４．１６ （ｍ， ２Ｈ）； ３．５６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．５９ ＆ ６．１３ Ｈｚ）； ３．０６ （ｍ， ２Ｈ）； ２．６３ （ｍ， ３Ｈ）； １．８７ （２ｓ， ３Ｈ）； １．７１ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１３．５８および−１３．９９．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントを３０分以上）：２２．７５および２３．１８分．； ９０％．
ＥＳＩ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_２０Ｈ_２６ＣｌＮ_４Ｏ_９Ｐについて計測： ｍ／ｚ ５３３．１３５８ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ５３３．１３５０．
【００６２】
【化２２】

２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジル２−（１，４−ジメタオキシナフチル）メチルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（１１）：
ホスホラミデート１１を前記記載のコンパウンド６と同様に、ホスホラストリクロライド（２分 ＣＨ_２Ｃｌ_２； ０．４５ ｍＬ； ０．８９２ ｍｍｏｌ）、１，４−ジメタオキシ−２−ヒドロオキシメチルナフタレン（１９５ ｍｇ， ０．８９２ ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチルアミン）ヒドロクロライド（１４１ ｍｇ， ０．８９２ ｍｍｏｌ）、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジル（１００ ｍｇ， ０．４４６ ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルヒドロペルオキサイド（４．６分 ｄｅｃａｎｅ； ０．４５ ｍＬ）から調製した。粗生産物（５％ ｍｅｔｈａｎｏｌ 含有ＣＨＣｌ_３）のカラムクロマトグラフィーにより、白い泡状物質１１（１２１ ｍｇ； 出発原料を基準にした回収率５６％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．２４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．０６ Ｈｚ）； ８．０５ （ ｍ， ２Ｈ）； ７．５４ （ｍ， ２Ｈ）； ７．１９ （ｓ， １Ｈ）； ６．９８ （ｓ， １Ｈ）； ６．８４ （ｓ， １Ｈ）； ６．３１ （ｍ， １Ｈ）； ５．５８ （ｍ， １Ｈ）； ５．２４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．６９ Ｈｚ）； ４．９８ （ｍ， １Ｈ）； ４．１５ （ｍ， ２Ｈ）； ４．９８ （ｍ， ６Ｈ）； ３．５０ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８６ ＆ ６．３１ Ｈｚ）； ３．０４， ｍ， ２Ｈ）； ２．６１ （ｍ， ３Ｈ）； １．８６ （ｓ， ３Ｈ）； １．７１ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１３．４４および−１３．８８．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］のグラジエントで３０分以上）：２８．０８および２８．３０ 分．； ８７％．
ＥＳＩ ＭＳ（低分解能）： Ｃ_２８Ｈ_３５ＣｌＮ_３Ｏ_８Ｐについて計測： ６０８ （Ｍ＋Ｈ）^＋； 実測値： ６３０ （Ｎａ付加）．
【００６３】
【化２３】

２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロチミジル ２−（１，４−ナプトキノニル）メチルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミデート（１２）：
硝酸セリウムアンモニウム（２２５ ｍｇ， ０．．４１１ ｍｍｏｌ）水溶液（３ ｍＬ）を、１１（１００ ｍｇ， ０．１６４ ｍｍｏｌ）のＣＨ_３ＣＮ溶液（３ ｍＬ）に１５分以上かけて滴下添加した。反応を１時間、室温で攪拌して行い、ＣＨＣｌ_３で抽出した（３回）。有機層を一つに混合し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ_３）による精製を行い、黄色の泡状物質１２（７８ ｍｇ， ８２％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ８．０９ （ｍ， ２Ｈ）； ８．０１ （ｓ， １Ｈ）； ７．７９ （ｍ， ２Ｈ）； ７．１７ （ｓ， １Ｈ）； ６．９９ （ｍ， ２Ｈ）； ６．３５ （ｍ， １Ｈ）； ５．９３ （ｍ， １Ｈ）； ５．００ （ｍ， ３Ｈ）； ４．２４ （ｍ， ２Ｈ）； ３．５６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８６ ＆ ６．３１ Ｈｚ）； ３．１１ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １０．０７ Ｈｚ）； １．９０ （ｓ， ３Ｈ）； １．７４ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −１３．４９および−１３．８４．
ＨＰＬＣ（０％から７０％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ ［０．１％ＴＦＡ］を３０分以上かけたグラジエント）：２４．８２および２５．０２ 分．； ９５％．
ＦＡＢ ＭＳ（高分解能）： Ｃ_２５Ｈ_２９ＣｌＮ_３Ｏ_８Ｐについて計測： ｍ／ｚ ６００．１２７９ （Ｎａ^＋ ａｄｄｕｃｔ）； 実測値： ６００．１２９７ （Ｎａ^＋付加）．
【００６４】
【化２４】

Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ブロモブチル）アミンヒドロブロマイド：
臭化水素酸（２０ ｍＬ， ０．３８ ｍｍｏｌ， ４８重量％）を０℃でＮ−メチル−Ｎ−ブタン−４−オル（４．０ ｇ， ０．３９ ｍｍｏｌ）にゆっくりと攪拌しながら加えた。この反応混合物を２時間、還流して温めた。蒸留装置を設置し、蒸留物１０ ｍＬを回収し、４８％ ＨＢｒを１０ ｍＬ（０．１８ ｍｍｏｌ）加えた。４時間還流した後、蒸留によって１０ ｍＬ減少したため、４８％ ＨＢｒを１０ ｍＬ（０．１８ ｍｍｏｌ）加え、反応を一晩還流して行った。この反応混合物を蒸留し（およそ２０ ｍＬの蒸留物）、蒸留容器の残留物を−７８℃のアセトンを注いだ。白い沈殿物が形成され、濾過により回収した（４．２４ ｇ， ４４％）。
^１Ｈ ＮＭＲ： ＣＤＣｌ_３： ｄ ９．０８ （ｓ， １Ｈ）； ３．４６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９５ Ｈｚ）； ３．０４ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７２ （ｔ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ５．６７ Ｈｚ）； ２．０５ （ｍ， ４Ｈ）； １．７０ （ｓ， １Ｈ）．
Ｄ_２Ｏ： ２．８４ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．１３ Ｈｚ）； ２．３９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．３２ Ｈｚ）； ２．０４ （ｓ， ３Ｈ）； １．２３ （ｍ， ４Ｈ）．
【００６５】
【化２５】

Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）アミンヒドロクロライド：
室温で攪拌しながらの、Ｎ−メチル−Ｎ−ブタン−４−オル（２．０ ｇ， １９．３８ ｍｍｏｌ）の ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液１０ ｍＬ に、リトマス紙が赤（ｐＨ＝２）に変わるまでＨＣｌガスを泡立たせた。この反応混合物を０℃に冷却し、塩化チオニル（１．４１ ｍＬ， １９．３８ ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応を室温で一晩攪拌して行った。溶媒を減圧除去して白い固体（２．９ ｇ， ９５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ： ＣＤＣｌ_３： ｄ ８．７９ （ｓ， １Ｈ）； ３．５９ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９５）； ２．９７ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７０ （ｓ， ３Ｈ）； ２．０６ （ｍ， ２Ｈ）； １．９５ （ｍ， ２Ｈ）； １．６３ （ｓ， １Ｈ）．
Ｄ_２Ｏ： ｄ ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７５ （ｍ， ２Ｈ）； ２．５５ （ｓ， ３Ｈ）； １．７０ （ｍ， ４Ｈ）．
ＣＩ ＭＳ（低分解能）： （Ｍ＋Ｈ）^＋ ＝ １２２ ｍ／ｚ； Ｃ_５Ｈ_１２ＮＣｌ についてのＭＷ ＝ １２１．
【００６６】
【化２６】

Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミディックジクロライド：
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）アミンヒドロクロライド（２．０ ｇ， １２．７３ ｍｍｏｌ）を２０ ｍＬの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解して−４０℃に冷却した。ホスホラスオキシクロライド（１．２ ｍＬ， １２．７３ ｍｍｏｌ）を適当に加えた後、トリエチルアミン（３．６ ｍＬ， ２５．４６ ｍｍｏｌ） のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液５ ｍＬを添加した。この反応物を０℃に加温し、室温までゆっくりと戻した。そして、室温で６時間、攪拌しながら反応させた。この反応混合物を氷に注ぎ、飽和塩化物アンモニウムを加えて層を分離した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、有機層を一つに混合し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（３：１ Ｈｅｘ／ ＥｔＯＡｃ）により精製し、透明なオイル（２．５７ ｇ， ８５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ３．５８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９５ Ｈｚ）； ３．２９ （ｍ， ２Ｈ）； ２．８４ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １５．９３ Ｈｚ）； １．７９ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −６．６．
【００６７】
【化２７】

Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ブロモブチル）ホスホラミディックジブロマイド：
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ブロモブチル）アミンヒドロブロミド（２．０ ｇ， ８．０９ ｍｍｏｌ）を用いて、前記記載のように（一晩攪拌して反応を行うことを除いて）同様の手順を行った。シリカゲルクロマトグラフィー（３：１ Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、透明なオイル（２．０ ｇ， ９２％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ３．４６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０５ Ｈｚ）； ３．３０ （ｑ， ２Ｈ）； ２．８５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １６．１１ Ｈｚ）； １．８８ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −６．７５．
【００６８】
【化２８】

５−ニトロ−２−フリルメチルＮ−メチル−Ｎ−（４−クロロブチル）ホスホラミディッククロライド：
テトラヒドロフルフリルアルコール（２４０ ｍｇ， １．６８ ｍｍｏｌ）を無水のＴＨＦ １０ ｍＬ中に溶解し、−７８℃に冷却した。リチウムヘキサメチルジシラザン（１．８４ ｍＬ， １．８４ ｍｍｏｌ）を滴下添加し、−７８℃で１０分間攪拌して反応を行った。この反応混合物に、ホスホラミディックジクロライド（４００ ｍｇ， １．６８ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液１０ ｍＬ を滴下添加した。−７８℃から−６０℃までゆっくりと加温して反応を行い、−６０℃で１時間攪拌した。飽和ＮＨ_４Ｃｌで急冷し、層を分離し、水層を３回ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を一つに混合し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（１０：１ ＣＨ_２Ｃｌ_２／アセトン）を用いて精製し、薄茶色のオイル（３２０ ｍｇ， ５５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ７．２９， （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）； ６．７２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）； ５．１４ （ｄｄ， ２Ｈ）； ３．５６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８６）； ３．２０ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １３．５８ Ｈｚ）， １．７９ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −７．８８ ．
【００６９】
【化２９】

５−ニトロ−２−フリルメチルＮ−メチル−Ｎ−（４−ブロモブチル）ホスホラミディッククロライド：
出発原料としてニトロフルフリルアルコール（２４５ ｍｇ， １．７８ ｍｍｏｌ）およびホスホラミディックジクロライド（５００ ｍｇ， １．７８ ｍｍｏｌ）を用いて、前記記載と同様の手順を行った。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（１０：１， ＣＨ_２Ｃｌ_２／アセトン）を用いて精製し、薄茶色のオイル（３６０ ｍｇ， ５２％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）： ｄ ７．２９， （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）； ６．７２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）； ５．１４ （ｄｄ， ２Ｈ）； ３．４３ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．３２）； ３．１９ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １３．７３ Ｈｚ）， １．７９ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ）： ｄ −７．８８．
【００７０】
【化３０】

ホスホラミディックジクロライドの合成．
ジイソプロピルアミン（８．８２ ｍＬ， ５０．６１ ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン２０ ｍＬで希釈し、あらかじめ冷やした、ＰＯＣｌ_３（２．３６ ｍＬ， ２５．３１ ｍｍｏｌ）とＮ−メチル−４−クロロブチルアミンヒドロクロライド（４ｇ， ２４．３１ ｍｍｏｌ）とを含む 無水ジクロロメタン 溶液４０ ｍＬに、−２０℃でゆっくりと加えた。反応混合物を１０℃に徐々に加温しながら、３．５時間攪拌した。反応混合物を飽和塩化物アンモニウムで急冷させ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を回収し、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水して、蒸発乾固し、黄色の液体を回収した。粗生成物を３：１ Ｈｅｘａｎｅｓ／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、透明な液体としてのホスホラミディックジクロライド（５．０７ｇ， 回収率８４％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ３．５９ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８５ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １６．１１ Ｈｚ）， １．８０ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ） ｄ： −６．６３ ｐｐｍ．
【００７１】
【化３１】

１−プロペニルベンゾエート１２ａの合成．
４−ヒドロキシ安息香酸（５ｇ， ３６．２０ ｍｍｏｌ） の臭化アリル懸濁液 ８６ ｍＬに、ジイソプロピルアミン（６．３１ ｍＬ， ３６．２０ ｍｍｏｌ）を適当に添加した。この反応混合物を２時間還流しながら攪拌し、室温に冷却した。過剰な臭化アリルを減圧蒸留して取り除き、残ったオイルをＥｔＯＡｃで希釈し、水、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して黄色のオイルを回収した。 粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、白い固体物である安息香酸エステル（５．０３ｇ， 回収率７８ ％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７９ Ｈｚ）， ６．８６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７９ Ｈｚ）， ６．０ （ｍ， １Ｈ）， ５．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．６８ Ｈｚ）．
ＨＰＬＣ （５０：５０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ６．１７ 分 （９７．２％）．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ：１７９ （Ｍ＋Ｈ）
ＧＣＭＳ ｍ／ｚ： １７９ （Ｍ＋Ｈ）．
【００７２】
【化３２】

１−プロペニルエステル１２ｂの合成．
エステル１２ｂを１２ａについての記載と同様に合成し、白い固体として得た（回収率７８％）。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４１ Ｈｚ）， ７．５６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４１ Ｈｚ）， ７．４３−７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．２８ Ｈｚ）， ６．７３ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．２８ Ｈｚ）， ５．９４−５．８０ （ｍ， １Ｈ）， ５．３５−５．２４ （ｍ， ３Ｈ）， ４．９１ （ｓ， １Ｈ）， ４．６２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．４８−４．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０ （ｔ， １Ｈ）， ３．０６ （ｔ， ２Ｈ）．
ＨＰＬＣ （５０：５０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： １１．７５ 分 （９９．９９％）
【００７３】
【化３３】

１−プロペニルエステル１２ｃの合成．
エステル１２ｃを１２ａについての記載と同様に合成し、白い固体として得た（回収率８０ ％）。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ６．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．４２ Ｈｚ）， ６．７３ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．４２ Ｈｚ）， ５．８４ （ｍ， １Ｈ）， ５．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．８６ Ｈｚ）， ３．０２ （ｍ， １Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）．
ＨＰＬＣ （３０：７０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ８．９５ 分 （９７％）．
【００７４】
【化３４】

１−プロペニルエステル１２ｄの合成．
エステル１２ｄを１２ａについての記載と同様に合成し、白い固体として得た（回収率８０％）。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２０−７．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ５．９９−５．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３５−５．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９３−４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．６１ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．８６ Ｈｚ）， ３．２６−３．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０：７０， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ５．６３， ５．８ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２８６ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００７５】
【化３５】

１−プロペニルエステル１２ｅの合成．
エステル１２ｅを１２ａについての記載と同様に合成し、緑色のオイルとして得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．３２−７．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ５．９８−５．８２ （ｍ， １Ｈ）， ５．３１−５．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．６８ Ｈｚ）， ３．６４ （ｓ， ２Ｈ） ｐｐｍ．ｂ
ＨＰＬＣ （３０：７０， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ４．３３ 分．
【００７６】
【化３６】

１−プロペニルエステル１３の合成．
ｐ−アミノ安息香酸カリウム（２ｇ， １１．４１ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ 懸濁液４０ ｍＬ に、臭化アリル（０．９９ ｍＬ， １１．４１ ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一晩攪拌して行い、それから水で急冷し、数回ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物を一つに混合し、塩水で洗浄して、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して黄色液体を回収した。 粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、 黄色の固体物として１３を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ７．０８ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ６．０５−５．９７ （ｍ， １Ｈ）， ５．５１−５．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８２−４．７８ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （グラジエント ３０−１００％ ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ ３５ 分以上）： ７．６８ 分
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： １７８ （Ｍ＋Ｈ）， ２００ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００７７】
【化３７】

ホスホラミディックモノクロライド１４ａの合成．
ホスホラミディックジクロライド（０．２ ｇ， ０．８４ ｍｍｏｌ）とエステルアリル１２ａ（０．１５ｇ， ０．８４ ｍｍｏｌ）を含む、あらかじめ冷やした無水ＤＣＭ溶液 ３ ｍＬ に、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ ｍＬ， １．６８ ｍｍｏｌ）を−１５℃で適当に添加した。反応は、−１５℃で１時間、−５℃で３時間攪拌して行い、飽和塩化アンモニウムで急冷した。得られた層を分離した。それから、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して黄色の液体を回収した。粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、透明の液体として１４ａを回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．１０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．３３ Ｈｚ）， ７．３４ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．３３ Ｈｚ）， ６．０９−５．９８ （ｍ， １Ｈ）， ５．４５−５．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８４−４．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｔ， ２Ｈ）， ３．３５−３．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８４ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １３．５５）， １．８２−１．７９ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１３．０７ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （グラジエント ３０−１００％， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １６．０５ 分．
【００７８】
【化３８】

ホスホラミディックモノクロライド１４ｂの合成．
ホスホラミディックジクロライド１１（０．４５ｇ， １．８９ ｍｍｏｌ）を無水のＴＨＦ ２ ｍＬ中に溶解させ、−２０℃であらかじめ冷やした、 １２ｂ（０．８４ｇ， １．８９ ｍｍｏｌ）とＬｉＨＭＤＳ（２．０８ ｍｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ溶液２ ｍＬにカニューレで添加した。反応を０℃まで加温し、５時間攪拌して行った。続いて、反応を飽和塩化アンモニウムで急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一つに混合し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水して蒸発乾固し黄色のオイルを回収した。 粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、黄色のオイルとして１４ｂ（０．８５ｇ， 回収率７０％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４２ Ｈｚ）， ７．５７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４２ Ｈｚ）， ７．４４−７．２９ （ｍ， ４Ｈ）， ７．１９−７．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ５．９１−５．８１ （ｍ， １Ｈ）， ５．３４−５．２５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．６６−４．６０ （ｍ， ３Ｈ）， ４．４９−４．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２１ （ｔ， １Ｈ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２７−３．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１７−３．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８２ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １３．５４ Ｈｚ）， １．８１−１．７８ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ） ｄ： −１２．６４ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （７０：３Ｏ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ溶液）： ６．８３３ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ６４５／６４７ （Ｍ＋Ｈ）， ６６７／６６９ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００７９】
【化３９】

ホスホラミディックモノクロライド１４ｃの合成．
１４ｃを１４ｂについての記載と同様に合成し薄黄色のオイルとして得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．１６ （ｍ， ４Ｈ）， ５．８ （ｍ， １Ｈ）， ５．３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．６８ Ｈｚ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．８２ （ｄ， ３Ｈ）， １．７９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＯ） ｄ： −１２．５ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （ｇｒａｄｉｅｎｔ ３０−１００％， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ｏｖｅｒ ３５ 分）： ９．８３ 分．
【００８０】
【化４０】

ホスホラミディックモノクロライド１４ｄの合成．
１４ｄを１４ａと同様の手順で合成した。この反応混合物を一晩攪拌し、薄黄色のオイルを回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２０−７．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ５．９９−５．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３５−５．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９３−４．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．６１ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．８６ Ｈｚ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２６−３．１３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８３ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １３．５５ Ｈｚ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ）， １．９６−１．７５ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： １２．７１
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ４６５／４６７ （Ｍ＋Ｈ）．
【００８１】
【化４１】

ホスホラミディックモノクロライド１４ｅの合成．
１４ｅを１３ａと同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．３２−７．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ５．９８−５．８２ （ｍ， １Ｈ）， ５．３１−５．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．６８ Ｈｚ）， ３．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２５−３．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８３ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １３．５５ Ｈｚ）， １．８０−１．７８ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１２．６６ ｐｐｍ．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３９４／３９６ （Ｍ＋Ｈ）．
【００８２】
【化４２】

ホスホラミディックモノクロライド１５の合成．
ホスホラミディックジクロライド１１（０．７ ｇ， ２．９４ ｍｍｏｌ）とエステルアリル１３（０．５２ ｇ， ２．９４ ｍｍｏｌ）を含む無水ジクロロメタン溶液１０ ｍＬ に、ジイソプロピルエチルアミン（０．５１ｍＬ， ２．９４ ｍｍｏｌ）を適当に添加した。反応を１０日間還流しながら攪拌し、室温まで冷却し、ジクロロメタンで希釈して飽和塩化アンモニウムで急冷した。層を分離して、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水して、蒸発乾固して黄色のオイルを回収した。 粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、 薄緑色のオイル（０．２２ ｇ， 回収率２０％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ７．０８ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ６．０５−５．９７ （ｍ， １Ｈ）， ５．５７ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ２．２９ Ｈｚ）， ５．５１−５．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８２−４．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｔ， ２Ｈ）， ３．３６−３．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７４ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １４．３７ Ｈｚ）， １．８７−１．６４ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１１．２８ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １２．６０ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ３７９／３８１ （Ｍ＋Ｈ）， ４０１／４０３ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００８３】
【化４３】

ホスホラミデート１６の合成．
ホスホラミディックモノクロライド１４ａ（０．６３ｇ， １．２１ ｍｍｏｌ）を無水のＴＨＦ ２ ｍＬ中に溶解し、−７８℃であらかじめ冷却したニトロフリルアルコール（０．１９ｇ， １．３３ ｍｍｏｌ）とＬｉＨＭＤＳ（１．４６ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液 ２ ｍＬ にカニューレで添加した。反応を−４０℃にし、５．５時間攪拌して行った。飽和塩化アンモニウムを反応混合物に加え、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一つに混合し、塩水で洗浄し、過剰のＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して黒っぽいオイルを回収した。 粗生産物を１０：１ ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、 濃いオレンジ色のオイルとしてホスホラミデート１６（０．３０ｇ， 回収率５２％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．０５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｍ， ３Ｈ）， ６．６４ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．４８ Ｈｚ）， ６．０５ （ｍ， １Ｈ）， ５．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１５ Ｈｚ）， ４．８２ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ５．４９ Ｈｚ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ）， ３．１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７２ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２５ Ｈｚ）， １．６７ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −２１．７
ＨＰＬＣ （６０：４Ｏ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＦＡ）： ７．１１７ 分．
【００８４】
【化４４】

ホスホラミデート１７の合成．
ホスホラミデート１７を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．２３ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ７．１４ Ｈｚ）， ８．０７−７．９１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６６−７．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ６．８０ （ｓ， １Ｈ）， ６．１９−５．８８ （ｍ， １Ｈ）， ５．４４−５．２０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．９２−４．７９ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２４−２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２５ Ｈｚ）， ２．８４−１．８３ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．９４ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （７０：３０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．０１％ ＴＦＡ 溶液）： ７．９６７ 分
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ５８４／５８６ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００８５】
【化４５】

ホスホラミデート１８の合成．
ホスホラミデート１８を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４２ Ｈｚ）， ７．５７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．４２ Ｈｚ）， ７．４４−７．２４ （ｍ， ５Ｈ）， ７．１３−６．９３ （ｍ， ４Ｈ）， ６．５９ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ６．０７−５．７０ （ｍ， １Ｈ）， ５．４７−５．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ５．０５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１６ Ｈｚ）， ４．７４−４．６１ （ｍ， ３Ｈ）， ４．５６−４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０ （ｔ， １Ｈ）， ３．５１ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２０−２．９９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７０ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．３４ Ｈｚ）， １．８２−１．５３ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．９２
ＨＰＬＣ （７０：３０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ溶液）： ６．１２ 分．
【００８６】
ホスホラミデート１９の合成．
【化４６】

ホスホラミデート１９を１６と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２８ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）， ７．１６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．６３ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）， ５．８ （ｍ， １Ｈ）， ５．３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．９８ Ｈｚ）， ４．６ （ｄ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．８２ （ｄ， ３Ｈ）， １．７９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２
ＨＰＬＣ （６０：４０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ８．２ 分．
【００８７】
【化４７】

ホスホラミデート２０の合成．
ホスホラミデート２０を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２８ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．７５ Ｈｚ）， ７．２１−６．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ６．６３ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．７５ Ｈｚ）， ６．０５−５．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４４−５．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１５ Ｈｚ）， ５．０１−４．７８ （ｍ， １Ｈ）， ４．７２−４．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６６−３．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２３−２．９９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．３４ Ｈｚ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ）， １．８３−１．６０ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．０３ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １５．７０ 分
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５７２／５７４ （Ｍ＋Ｈ）．
【００８８】
【化４８】

ホスホラミデート２１の合成．
ホスホラミデート２１を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．８１ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ７．２２−７．０５ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ６．０２−５．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４５−５．１０ （ｍ， ４Ｈ）， ５．００−４．７９ （ｍ， １Ｈ）， ４．６３−４．４９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２３−２．９５ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７２ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．３５ Ｈｚ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ）， １．８５−１．５８ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２１ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １７．２０ 分
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５８８／５９０ （Ｍ＋Ｈ）， ６１０／６１２ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００８９】
【化４９】

ホスホラミデート２２の合成．
ホスホラミデート２２を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２６−７．０４ （ｍ， ５Ｈ）， ６．６０ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．５８ Ｈｚ）， ５．９９−５．７５ （ｍ， １Ｈ）， ５．４３−５．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１６ Ｈｚ）， ４．７２−４．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｔ， ２Ｈ）， ３．１８−２．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２６ Ｈｚ）， １．７７−１．５５ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．０１ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １５．５０ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５０１／５０３ （Ｍ＋Ｈ）， ５２３／５２５ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００９０】
【化５０】

ホスホラミデート２３の合成．
ホスホラミデート２３を１６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．８０ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ７．３３−７．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ６．０８−５．６８ （ｍ， １Ｈ）， ５．４６−５．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ４．７８−４．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｔ， ２Ｈ）， ３．３０−２．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７２ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．３４ Ｈｚ）， １．８７−１．４８ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２１ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （グラジエント ３０−１００％， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２０．１７ 分．
【００９１】
【化５１】

ホスホラミデート２４の合成．
ホスホラミデート２４を１６についての記載と同様の手順で合成した。
【００９２】
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．９６ ９ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ６．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．６５ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ６．１６−５．８４ （ｍ， １Ｈ）， ５．５１−５．１９ （ｍ， ３Ｈ）， ５．０９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．４３ Ｈｚ）， ４．９２−４．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５２ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２２−２．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．５３ Ｈｚ）， １．８５−１．６１ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１５．６０ ｐｐｍ
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １２．６０ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ４８６／４８８ （Ｍ＋Ｈ）， ５０８／５１０ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００９３】
【化５２】

ホスホラミデート２５の合成．
ＴｏｌＳＯ_２Ｎａ（０．２９ｇ， １．６１ ｍｍｏｌ）を水 ２．５ ｍＬ中に溶解し、ホスホラミデート１６（０．７１ｇ， １．４７ ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．０８ｇ， ７３．４１ｍｍｏｌ） のＴＨＦ 溶液６ｍＬに加えた。反応を室温で３０分間攪拌して行った。ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、水で数回洗浄した。水性の抽出物を一つに混合し、エーテルで洗浄し、２％のＨＣｌでｐＨ ３に酸性にしてＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物を混合し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水して、蒸発乾固してオレンジ色の泡状物質としてホスホラミデート２５（０．５１ｇ， 回収率７８％）を回収した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．０８ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６Ｈｚ）， ７．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．６６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ５．１１ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１６ Ｈｚ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ）， ３．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７４ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．４４ Ｈｚ）， １．７ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −２０．４
ＨＰＬＣ （６０：４０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ溶液）： ４．０１７ 分．
【００９４】
【化５３】

ホスホラミデート２６の合成．
ホスホラミデート２６を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．３２−８．２２ （ｍ， １Ｈ）， ８．１３−７．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６４−７．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ６．８１ （ｓ， １Ｈ）， ５．３５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．０５ Ｈｚ）， ３．９５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４９ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２５−２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２５ Ｈｚ）， １．８０−１．５２ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．９９ ｐｐｍ
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １８．６０ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ５４４／５４６ （Ｍ＋Ｎａ）．
【００９５】
【化５４】

ホスホラミデート２７の合成．
ホスホラミデート２７を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．２３ Ｈｚ）， ７．５８ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ７．２３ Ｈｚ）， ７．４３−７．２３ （ｍ， ５Ｈ）， ７．１８−６．８９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．６７−６．４７ （ｍ， １Ｈ）， ５．４８−５．３０ （ｍ， １Ｈ）， ５．１８−４．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７９−４．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６０−３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２７−２．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８２−２．５９ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．５６ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．４４， −１９．６３ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １７．９３ 分．
【００９６】
【化５５】

ホスホラミデート２８の合成．
ホスホラミデート２８を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２８ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）， ７．１６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．６３ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６６ Ｈｚ）， ５．０５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．９８ Ｈｚ）， ３．５８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．８２ （ｄ， ３Ｈ）， １．７９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （６０：４０ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ）： ４．６５ 分．
【００９７】
【化５６】

ホスホラミデート２９の合成．
ホスホラミデート２９を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．３０−７．２５ （ｍ， １Ｈ）， ７．２３−６．８３ （ｍ， ４Ｈ）， ６．８０−６．４７ （ｍ， １Ｈ）， ５．０９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．２５ Ｈｚ）， ５．０１−４．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６−３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３６−２．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９８−２．５５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１４−１．７７ （ｄ， ３Ｈ）， １．８９−１．５５ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２５， −１９．４３ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １１．６８ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ５５４／５５６ （Ｍ＋Ｎａ）， ５３２／５３４ （Ｍ＋Ｈ）．
【００９８】
【化５７】

ホスホラミデート３０の合成．
ホスホラミデート３０を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．８７−７．７３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１４−７．０４ （ｍ， ４Ｈ）， ７．０３−６．９５ （ｍ， １Ｈ）， ５．３４−５．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１１−４．９６ （ｍ， １Ｈ）， ４．９５−４．８１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６０−３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２６−３．０３ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８５−２．６７ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０５−１．９２ （ｍ， ３Ｈ）， １．８４−１．６２ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．４１， −１９．６１ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １３．１０ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ５４８／５５０ （Ｍ＋Ｈ）．
【００９９】
【化５８】

ホスホラミデート３１の合成．
ホスホラミデート３１を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．２６−７．０４ （ｍ， ５Ｈ）， ６．６０ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．５８ Ｈｚ）， ５．４３−５．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１６ Ｈｚ）， ３．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｔ， ２Ｈ）， ３．１８−２．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７１ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２６ Ｈｚ）， １．７７−１．５５ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．０１ ｐｐｍ．
【０１００】
【化５９】

ホスホラミデート３２の合成．
ホスホラミデート３２を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．８０ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ７．３３−７．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９９ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ）， ５．２２ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．５２ Ｈｚ）， ３．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．３０−２．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．２５ Ｈｚ）， １．９２−１．４０ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２９ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １５．１３ 分．
【０１０１】
【化６０】

ホスホラミデート３３の合成．
ホスホラミデート３３を２５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ７．９６ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ６．９９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．６５ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６７ Ｈｚ）， ６．４５−６．２５ （ｍ， １Ｈ）， ５．０９ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．４３ Ｈｚ）， ３．５２ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２２−２．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．５３ Ｈｚ）， １．８５−１．６１ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１５．４０ ｐｐｍ
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ９．１３， ９．３７ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ４４４／４４６ （Ｍ−Ｈ）．
【０１０２】
【化６１】

プロドラッグ３５の合成．
ホスホラミデート２５（０．１０５ｇ， ０．２３ ｍｍｏｌ）を２ ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、ベンジルアミン３４（０．０７３５ｇ， ０．２３ ｍｍｏｌ）、４−メチルモルフォリン（０．０６ ｍＬ， ０．５８８ ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢＴ（０．０３８２ｇ， ０．２８ ｍｍｏｌ）を含む無水ＤＭＦ溶液３ ｍｌ に０℃でカニューレで添加した後、ＥＤＣＩ（０．０５４１ｇ， ０．２８ ｍｍｏｌ）を添加した。反応は、室温まで加温し、一晩攪拌して行った。この反応混合液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出した有機物を一つに混合し、飽和重炭酸ナトリウム、水、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して濃いオレンジ色のオイルを回収した。生成物を、ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏが７５：２５の混合溶液を用いて逆相シリカでクロマトグラフィーにかけ、 白い泡状の３５を得た（５８．７ ｍｇ ，回収率３５％）。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．２５ （ｄ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．４２Ｈｚ）， ７．５０ （ｄ， １Ｈ）， ７．２４ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．４２Ｈｚ）， ６．６３ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ３．６６Ｈｚ）， ５．２８ （ｔ， １Ｈ）， ５．０７ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ９．１６ Ｈｚ）， ３．９３ （ｄ， ２Ｈ）， ３．５２ （ｔ， ２Ｈ）， ３．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７０ （ｄ， ３Ｈ）， １．８７−１．５８ （ｍ， １４Ｈ）， １．４８−０．８５ （ｍ， ４Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −２１．２ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （６０：４Ｏ ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＦＡ）： ８．８１７ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７２７／７２９ （Ｍ＋Ｎａ）， ７０５／７０７ （Ｍ＋Ｈ）．
ＭＳ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７０５．２４５６； 実測値： ７０５．２４３２．
【０１０３】
【化６２】

ホスホラミデート３６の合成．
ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ ｍＬ， ０．６１ ｍｍｏｌ）をあらかじめ冷却した、ホスホラミデート２６（０．１４ｇ， ０．２８ ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン３４（０．０８ｇ， ０．３１ ｍｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（０．１４ｇ， ０．２８ ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ溶液２ ｍＬ に０℃で加えた。反応は、０℃で１０分間、および室温で３０分間攪拌して行った。反応を、飽和塩化アンモニウムおよびＤＣＭで急冷した。層を分離し、有機層は塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して薄黄色いオイルを回収した。粗生成物を９：１ ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、白い泡状の３６（０．１６ｇ， ７５％ ｙｉｅｌｄ）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．３４−８．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１−８．０４ （ｍ， １Ｈ）， ７．９２−７．７８ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６０ Ｈｚ）， ７．６３−７．４３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２８−７．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．８ （ｓ， １Ｈ）， ６．２７ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ７．７９ Ｈｚ）， ５．８４−５．６７ （ｂｓ， １Ｈ）， ５．４３−５．１６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４７ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２１−２．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．５２ Ｈｚ）， １．９６−１．４９ （ｍ， １４Ｈ）， １．４１−０．９３ （ｍ， ５Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．８２ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２４．０５ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ８０２／８０４ （Ｍ＋Ｎａ）， ７８０／７８２ （Ｍ＋Ｈ）．
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７８０．３１８１； 実測値： ７８０．３１６８．
【０１０４】
【化６３】

プロドラッグ３７の合成．
硝酸セリウムアンモニウム（０．１１ｇ， ０．２１ ｍｍｏｌ）を１ ｍＬのＨ_２Ｏ中に溶解し、３．７ ｍＬのアセトニトリルおよび１．９ ｍＬのＨ_２Ｏにホスホラミデート３６（０．０８ｇ， ９９．８３ ｕｍｏｌ）を含有した溶液をゆっくりと加えた。反応を１．５時間攪拌して行い、それから飽和塩化アンモニウムを加えて急冷し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を一つにまとめ、食塩水で洗浄して、ＭｇＳＯ_４で脱水し、蒸発乾固して薄黄色いオイルを回収した。粗生成物を９：１ ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨの混合液を用いてクロマトグラフィーにかけ、薄黄色い泡状の３７を得た（０．０３ｇ， 回収率６５％）。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．３４−８．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１−８．０４ （ｍ， １Ｈ）， ７．９２−７．７８ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６０ Ｈｚ）， ７．２８−７．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９５ （ｄ， ２Ｈ， ｊ ＝ ８．６０ Ｈｚ）， ６．９４ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．９ （ｓ， １Ｈ）， ６．４１ （ｄ， １Ｈ， ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ５．８４−５．６７ （ｂｓ， １Ｈ）， ５．４３−５．１６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９１ （ｓ， ５Ｈ）， ３．４７ （ｔ， ２Ｈ）， ３．２１−２．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｄ， ３Ｈ， ｊ ＝ １０．５２ Ｈｚ）， １．９６−１．４９ （ｍ， １４Ｈ）， １．４１−０．９３ （ｍ， ５Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．０
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２１．４５ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７７２／７７４ （Ｍ＋Ｎａ）， ７５０／７５２ （Ｍ＋Ｈ）．
ＭＳ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７５０．２７１１； 実測値： ７５０．２７０８．
【０１０５】
【化６４】

プロドラッグ３８の合成．
プロドラッグ３８を３６についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．２６−８．１１ （ｍ， １Ｈ）， ８．０９−７．９９ （ｍ， １Ｈ）， ７．９５−７．７６ （ｍ， １Ｈ）， ７．２４−７．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０８−６．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９６−６．８２ （ｍ， １Ｈ）， ６．７２−６．５５ （ｍ， １Ｈ）， ６．５０−６．２０ （ｍ， １Ｈ）， ６．１８−６．５４ （ｍ， １Ｈ）， ５．１６−４．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．７９−４．４６ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３−３．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２−３．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１５−２．８１ （ｍ， ５Ｈ）， ２．８０−２．５１ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０４−１．８９ （ｍ， ３Ｈ）， １．８７−１．５６ （ｍ， １０Ｈ）， １．４９−０．９０ （ｍ， ８Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．９４ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％グラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １９．０３， １９．２５ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７９０／７９２ （Ｍ＋Ｈ）， ８１２／８１４ （Ｍ＋Ｎａ）
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７９０．２９８４； 実測値： ７９０．２９８１．
【０１０６】
【化６５】

プロドラッグ３９の合成．
プロドラッグ３９を３５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．２１−８．０９ （ｍ， １Ｈ）， ８．０８−７．９８ （ｍ， １Ｈ）， ７．９３−７．７１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２３−７．０４ （ｍ， ６Ｈ）， ６．６６−６．４７ （ｍ， １Ｈ）， ６．３６−６．１６ （ｍ， １Ｈ）， ６．１１−５．８０ （ｍ， １Ｈ）， ５．３０−５．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１４−４．８１ （ｍ， １Ｈ）， ４．７５−４．４８ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２−３．８５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２−３．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１３−２．８２ （ｍ， ５Ｈ）， ２．８２−２．５８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０４−１．９２ （ｍ， ３Ｈ）， １．８４−１．５３ （ｍ， ９Ｈ）， １．５１−０．８７ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．１６ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％グラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２０．１７， ２０．３５ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ８０６／８０８ （Ｍ＋Ｈ）， ８２８／８３０ （Ｍ＋Ｎａ）
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ８０６．２７５５； 実測値： ８０６．２７５８．
【０１０７】
【化６６】

プロドラッグ４０の合成．
プロドラッグ４０を３５についての記載と同様の手順で合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．１０−８．００ （ｍ， １Ｈ）， ７．９９−７．８６ （ｍ， １Ｈ）， ７．４５−７．０９ （ｍ， ７Ｈ）， ６．９８−６．８５ （ｍ， １Ｈ）， ６．６９−６．５６ （ｍ， １Ｈ）， ６．０５−５．８９ （ｍ， １Ｈ）， ５．８７−５．６９ （ｍ， １Ｈ）， ５．１９−４．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．０２−３．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６４−３．２９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２６−２．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８７−２．５２ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０２−１．５７ （ｍ， １１Ｈ）， １．５４−０．８９ （ｍ， ６Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＴＰＰＯ） ｄ： −１８．９１， −１８．９９ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２０．６５ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７１９／７２１ （Ｍ＋Ｈ）， ７４１／７４３ （Ｍ＋Ｎａ）
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７１９．２６１３； 実測値： ７１９．２６００．
【０１０８】
【化６７】

プロドラッグ４１の合成．
プロドラッグ４１を３５についての記載と同様に合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．１４−８．００ （ｍ， １Ｈ）， ７．９３−７．８０ （ｍ， １Ｈ）， ７．８１−７．６９ （ｍ， １Ｈ）， ７．４２−７．３０ （ｍ， １Ｈ）， ７．２７−７．０６ （ｍ， ５Ｈ）， ７．０４−６．９３ （ｍ， １Ｈ）， ６．９３−６．８１ （ｍ， １Ｈ）， ６．２３−５．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２７−５．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１３−４．９３ （ｍ， １Ｈ）， ３．９９−３．８１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０−３．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２１−２．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８５−２．６２ （ｍ， ３Ｈ）， １．９２−１．５９ （ｍ， １１Ｈ）， １．５０−０．９７ （６Ｈ）．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ） ｄ： −１９．２６
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： ２１．７７ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７３５／７３７ （Ｍ＋Ｈ）， ７５７／７５９ （Ｍ＋Ｎａ）．
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７３５．２３８４； 実測値： ７３５．２３５８．
【０１０９】
【化６８】

プロドラッグ４２の合成．
プロドラッグ４２を３５についての記載と同様に合成した。
^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＭＳ） ｄ： ８．２２ （ｄ ， １Ｈ， ｊ ＝ ２．０１ Ｈｚ）， ７．９６−７．８１ ９ｍ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， ２Ｈ， ｊ＝ ８．１５ Ｈｚ）， ７．５６−７．４０ （ｍ， １Ｈ）， ７．２５−７．１３ （ｍ， １Ｈ）， ６．９２ （ｄ， ２Ｈ， ｊ＝ ８．１５ Ｈｚ）， ６．８２−６．６６ （ｍ， １Ｈ）， ６．６６−６．５３ （ｍ， １Ｈ）， ６．２７−６．００ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３５−５．１０ （ｍ， １Ｈ）， ５．０３ （ｄ， ２Ｈ， ｊ＝９．２５ Ｈｚ）， ３．９０ （ｄ， ２Ｈ， ｊ＝ ５．８６ Ｈｚ）， ３．４８ （ｔ， ２Ｈ）， ３．１８−２．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｄ， ３Ｈ， ｊ＝ １０．５３ Ｈｚ）， １．９４−１．４７ （ｍ， １０Ｈ）， １．３８−０．９８ （ｍ， ７Ｈ） ｐｐｍ．
^３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ＴＰＰＯ） ｄ： −１４．９６ ｐｐｍ．
ＨＰＬＣ （３０−１００％のグラジエント， ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ−０．１％ ＴＦＡ， ３５ 分以上）： １７．２８ 分．
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ： ７０４／７０６ （Ｍ＋Ｈ）， ７２６／７２８ （Ｍ＋Ｎａ）．
ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値： ７０４．２６１６； 実測値： ７０４．２６３３．
Ｌ１２１０マウス白血病細胞の増殖抑制
薬剤の原液を無水エタノールで調製し、段階的に希釈された薬剤をエタノールで調製した。また、Ｌ１２１０細胞を、１０％のウマ血清、１％のグルタミン、および１％の抗生物質溶液を添加したＦｉｓｈｅｒ’ｓ培地に懸濁し、最終濃度３−６×１０^４細胞／ｍＬの細胞懸濁液１０ｍＬを作製した。薬剤溶液の適切な量を細胞懸濁液に加え、２、８、２４、または４８時間インキュベートした。この細胞を遠心機で沈降させ、薬剤を添加していない新たな培地で再び懸濁し、インキュベーターに戻した。薬剤で処理開始後、４８時間後に最終の細胞数を測定した。このデータを細胞数 ｖｓ ． Ｌｏｇ（薬剤の濃度）のＳ字形カーブフィットにより分析し、その結果をＩＣ_５０（コントロール値に対し、５０％まで細胞増殖を阻害するのに必要な薬剤濃度）で表した。
【０１１０】
【表３】

【０１１１】
トランスフェクトされたＪ７７細胞におけるルシフェラーゼ阻害
Ｊ７７細胞（５００ ｍＬのＦＢＳを含まないＲＰＭＩ培地中、２×１０^７個の細胞）に、１５ ｍｇのＮＦ−ＡＴ−ルシフェラーゼ・プラスミドをトランスフェクトした。細胞を、１０ ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地の入ったフラスコに移し、２４時間インキュベートした。その後、細胞を遠心機で沈降させ、１２ ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地で再び懸濁し、６−ウエルプレート（２ ｍＬ／ウエル）に分割した。ＤＭＳＯに溶解した薬剤の原液を調製し、異なった濃度で各ウエルを処理し、２時間インキュベートした。それから、各ウエルを、１．２５ ｍｇのＰＭＡおよび９ ｍｇのイオノマイシンを加えたＦＢＳ を含まないＲＰＭＩ １１５ ｍＬのうちの１０ ｍＬで処理し、その後、２ ｍｇの抗ＣＤ３抗体を添加した。細胞を６時間インキュベートし、遠心機で沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、１５分間溶解し、遠心した。上澄み液を回収し、−７８℃で一晩保存した。５０ ｍＬのルシフェラーゼ基質と１０ ｍＬの上澄み液との混合液に対してルミノメーターを用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１１２】
【表４】

【０１１３】
Ｌ１２１０、ＬＭ、およびＬＭ（ ＴＫ −）細胞のトリチウムアッセイ
薬剤の原液を無水エタノールで調製した。Ｌ１２１０細胞をＦｉｓｈｅｒ’ｓ培地に懸濁し、ＬＭおよびＬＭ（ＴＫ−）細胞を、ＭＥＭ（分ｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁し、最終濃度１１．２４×１０^６細胞／ｍＬになるように調製した。この細胞懸濁液（４４５ μＬ）をエッペンドルフチューブに入れた後、５ μＬの薬剤溶液を加え、３７℃で２時間インキュベートした。トリチウム放出反応（Ｔｒｉｔｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、１ ｍＣｉ ［５−^３Ｈ］ｄＣｙｔを添加した０．５ ｍＭのｄＣｙｔ溶液を含む無血清培地 ５０ μＬを加えて開始した。その後、３７℃の撹拌装置付きウォーターバス（ｓｈａｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で、６０分間インキュベートした。４％の過塩素酸溶液に活性炭を懸濁した２０％の混合液 １００ μＬを含むエッペンドルフチューブに、反応混合液 １００ μＬを添加して反応を終了させた。そのチューブを激しくボルテックスし、それから小型遠心機で遠心した。
【０１１４】
その後、上澄み液 １００ μＬの放射能を、シンチエレーション・スペクトロメーターを用いて測定した。このデータをＣＭＰ ｖｓ ． Ｌｏｇ（薬剤の濃度）のＳ字形カーブフィットにより分析し、その結果をＩＣ_５０（コントロール値の５０％まで細胞増殖を阻害する薬剤濃度）で表した。
【０１１５】
【表５】

【０１１６】
医薬調剤
癌治療に用いるために以下の非経口調剤を調製した。
【０１１７】

[0001]
<Technical field to which the invention belongs>
The present invention relates to intracellular delivery of therapeutic compounds substituted for phosphate. In particular, the present invention is directed to certain phosphate precursors and methods and intermediates therefor.
[0002]
<Background and Summary of the Invention>
Significant research efforts have been directed at developing systems to enhance the intracellular delivery of phosphate-substituted compounds such as biologically active peptides and nucleotides, but with high levels of these compounds. Due to the negative charge, cell penetration is very low. For example, there is great interest in intracellular delivery of tyrosine phosphopeptides and peptidomimetics for use in inhibiting the unregulated growth of cancer cells. In this regard, protein tyrosine kinases are important regulators of cell cycle progression and represent attractive targets for the theoretical design of new anticancer agents. Protein tyrosine kinases are activated by phosphorylation of tyrosine residues specific for the kinase, and the phosphorylated tyrosine residues, along with three adjacent amino acids (pY-EEI), are responsible for the intracellular signaling protein Serves as a binding site for the Src homology 2 (SH2) domain. Interactions between the SH2 domain of intracellular signaling molecules and activated protein tyrosine kinases are essential for effective cell cycle progression. Therefore, molecules that mimic the phosphate tyrosine component of protein tyrosine kinases and inhibit protein tyrosine kinase binding to the SH2 domain are representative of potential anti-proliferative agents for cancer therapy.
[0003]
The phosphate dianion in tyrosine phosphorylated protein tyrosine kinases is important for the interaction of the kinase with the SH2 domain. The crystal structures of many ligand-SH2 domains have been reported, their interactions modeled, and many different inhibitors have been synthesized. In all of these phosphotyrosine peptides and peptidomimetic inhibitors, the phosphotyrosine residue is a complex network between hydrogen bonds and charges required for the broad interaction of the phosphate dianion of the tyrosine phosphate component with the SH2 domain. Are involved in The importance of this dianion interaction is that replacing the phosphate group with a wide variety of other anions or neutral hydrogen bond substituents results in a significant loss of binding affinity. Therefore, intracellular delivery of tyrosine phosphopeptides and peptidomimetics in which phosphate is in the form of an important dianion is important.
[0004]
Nucleotide analogs represent another class of potential agents for use in treating diseases caused by unregulated virus or cell replication. Like tyrosine phosphopeptide mimetics, the phosphate dianion of the nucleotide analog is important for the ability of these compounds to inhibit viral and cellular replication. The most widely used method of using nucleotide analogs as therapeutic agents is to transport nucleotide analogs as prodrugs across cell membranes and to form the corresponding nucleoside analog, depending on the intracellular mechanism, purine or purine. In this method, a phosphate group is bonded to pyrimidine. However, many nucleosides with therapeutic promise cannot be modified to the corresponding nucleotide by existing intracellular communication. In addition, cancer cells or virus-infected cells may become resistant to treatment by reducing the activity of nucleoside kinases, and for many previously developed nucleotide prodrugs, the effective concentration of nucleotides in the cell may be reduced. The less efficient it is, the less efficient the intracellular activation process is.
[0005]
A general method for intracellular delivery of a phosphate-containing compound utilized in the present invention is outlined in Scheme 1.
[0006]
(Equation 1)

Briefly, a compound substituted with a phosphate that is transported intracellularly is synthesized (R with an added phosphate in Scheme 1 above) and coupled with a transport group (DELIVERY) and a masking group (MASK). are doing. The masking group consists of a haloalkylamine component that hydrolyzes in the cell and produces an intermediate that is stable as long as the transport group is intact but is dissociated by intracellular activation of the transport group. The transport group, like a nitrofuryl group or perhydrooxazine, hydrolyzes intracellularly to form an intermediate, cyclizes the intermediate in the intracellular environment and cleaves the PN bond (ie, spontaneous). Hydrolytic hydrolysis) to release the desired phosphoric acid-containing compound.
[0007]
Intracellular delivery systems for alkylating agents and nucleotides utilizing the chemistry associated with those described in Scheme 1 above have been previously developed. However, in the previous method, 50% of the prodrug was "lost" as a biologically inactive solvolysis product, and the intracellular conversion to the desired nucleotide was only about 50%. The present invention is directed to newly discovered improvements in the above chemistry, which extends its application to both nucleotide analogs and phenolic phosphate groups that are essential components of tyrosine phosphopeptides and peptidomimetics. . The present invention provides a method for changing the structure of a masking group from a haloethyl to a halobutyl (or halopentyl) group to achieve rapid and quantitative intracellular conversion (eg, approximately 100%) of the desired nucleotide or phosphate-containing peptide. Conversion) occurs. The novel chemistry of the present invention is applicable to nucleotide analogs, tyrosine phosphate peptides, and peptidomimetics, as well as a wide range of other pharmaceutically important compounds that contain a phosphate moiety.
[0008]
The development of protected phosphotyrosine precursor phosphoramidates facilitates the synthesis of phosphotyrosine peptides and peptidomimetics. Thus, the present invention is also directed to protected tyrosine phosphate precursors and related protected peptides having, for example, N-BOC and fluorenyl metaoxycarbonyl groups.
[0009]
In one embodiment of the present invention, there is provided a phosphoramidate prodrug compound, wherein a biologically active compound having a hydroxyl functional group is covalently bonded to the hydroxyl functional group to form a corresponding drug in a cell. Forms a biologically unstable phosphoramidate group that converts to phosphate. Biologically labile phosphoramidate groups enable more efficient intracellular delivery of drug substances and achieve the biologically important intracellular concentrations of drug substances in the corresponding phosphate ester form. Means. In another embodiment, the biologically active compound has an amino function, which is covalently linked to the amino function to allow the phosphoramide to become (-OPO) intracellularly.₂NH-Drug) forms a converting biologically unstable phosphoramidate.
[0010]
The invention provides, in another embodiment, a compound of the formula
R_rCH₂OP (halo) NR (CH₂)_nX
To provide an intermediate halophosphoramidite. Wherein n is 4 or 5, and R is lower alkyl or (CH₂)_nX is an electrophilic group that can be nucleophilically displaced from the carbon atom to which it is attached,_rCH₂The group is a biologically labile ester-forming group, in particular an ester-forming group which is easily hydrolyzed in cells. This compound can be used as an intermediate drug to prepare a phosphoramidate prodrug compound as described above using embodiments of the method of the present invention. In this embodiment of the invention, the biologically active compound (Drug-OH) is an intermediate that has reacted with the halophosphoramidite intermediate and has reacted with the corresponding drug agent.
R_rCH₂OP (O-Drug) NR (CH₂)_nX
And then oxidized to form the phosphoramidate prodrug. This method starts with a functional amino acid having a hydroxyl group with carboxyl and amino functions, protected with standard protecting groups, or starting with an active peptide, peptidomimetic, or nucleotide analog, to produce an intracellular drug. Can be used to form a phosphoramidite precursor of phosphate. In accordance with the present invention, the phosphoramidate prodrug comprises R_rCH₂-After hydrolysis of the ester-forming group, it is converted to the corresponding phosphate. The cyclized 5- or 6-membered ring (-N (CH₂)_nHydrolysis of the amphoteric intermediate (formed by cyclization of the X group) gives the corresponding phosphate as the only phosphorus-containing product. A similar synthetic procedure is generally described herein for DrugNH.₂Can be carried out with active compounds having an amino function represented by
[0011]
<Detailed Description of the Invention>
The present invention is directed to the chemical action of novel prodrugs that transfer peptides, peptidomimetic phosphates, nucleotides or nucleotide analogs across cell membranes and into cells. One embodiment of the present invention is a compound of the formula
R_rCH₂OP (halo) NR (CH₂)_nX
To provide an intermediate compound.
[0012]
In the formula
R is C₁-C₄Alkyl or (CH₂)_nX;
n is 4 or 5;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically displaced from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine, or iodine; and
R_rCH₂A group is a biologically labile ester-forming group.
[0013]
The electrophilic group X is preferably a halogen, and examples thereof include chlorine, bromine and iodine. However, if the phosphoramidite prodrug according to the present invention results in a superior leaving group that allows in vivo cyclization of the phosphorus-bonded nitrogen atom and concomitant quadrant splitting, the nature of the group is not critical. Absent. As other electrophilic leaving groups, acetate, methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, haloacetate and the like can be used.
[0014]
The term "biologically unstable ester-forming group" used in defining the present invention means an ester-forming group derived from an alcohol forming an ester derivative, which is stable in drug production and storage conditions. Are hydrolyzed when exposed to biological conditions in vivo. In particular, the ester-forming groups used in accordance with the present invention exhibit minimal sensitivity to hydrolysis in extracellular body fluids, but are preferably hydrolyzed in cells where the reduced state of degrading the ester is significant. . Thus, in one embodiment of the present invention, the biologically labile ester forming group on the phosphoramidate prodrug of the present invention is_rHydrolyzing in the weakly reduced state comprising a group in which is a nitroallyl containing group such as nitrofuryl, nitrothienyl, nitropyrroyl, nitroimidazole and analogs thereof, indanyl, naphthoquinolyl, and perhydrooxazine This is an ester-forming group that is apt to be used. Ester forming group R_rCH₂The nature of the group is not critical as long as the group is susceptible to hydrolysis in the cell, ie, typically in a biological state that exhibits reducing ability.
[0015]
Therapeutic compounds can be modified in accordance with the present invention to produce phosphoramidate prodrug compounds, and are necessarily double protected (carboxyl group protected and amino group protected) forms of amino acids, peptides. , Proteins, peptidomimetics, nucleotide analogs, and the corresponding drug compounds containing other hydroxyl groups that exhibit biological activity as phosphate. In a preferred embodiment of the invention, the agent which converts to the corresponding phosphoramidate according to the invention is a nucleotide analogue such as fluorodeoxyuridine, which exhibits anti-cancer activity as the corresponding monophosphate derivative . In other embodiments, the agent is an amino acid, peptide, peptidomimetic, and the like.
[0016]
Phosphoramidate prodrug compounds according to the present invention can be prepared from the functional agent containing the corresponding hydroxyl group by several synthetic procedures. In one preferred embodiment, the phosphoramidate prodrug has the formula
R_rCH₂OP (O-Drug) NR (CH₂)_nX
Under conditions that lead to the formation of an intermediate compound of the formula
R_rCH₂OP (O) (O-Drug) NR (CH₂)_nX
Is reacted with a functional agent containing a hydroxyl group, and then the intermediate is oxidized to give a chemical formula
R_rCH₂OP (halo) NR (CH₂)_nX
To produce a phosphoramidate prodrug. R in the formula_r, R, n, and X are the same as defined above. Chemical formula
R_rCH₂OP (O-Drug) NR (CH₂)_nX
The conditions for forming the intermediate compound can vary, but it is preferable to carry out the reaction at a low temperature in the presence of an acid scavenger such as a tertiary amine base. In one embodiment, the reaction is carried out at a low temperature (about -70 ° C to about -10 ° C) using anhydrous pyridine as a reaction medium. Chemical formula
R_rCH₂OP (O-Drug) NR (CH₂)_nX
Chemical formula of the intermediate compound
R_rCH₂OP (O) (O-Drug) NR (CH₂)_nX
Oxidation to a phosphoramidate prodrug compound can be similarly performed under various weak oxidation conditions. The nature of the oxidizing agent is not critical, as long as it can affect the required oxidation of the phosphorus atom to the +5 oxidation state. Oxidizing agents include, for example, peracids, peroxides, hydroperoxides, and the like. The oxidation is usually performed at a temperature of about 0 ° C. or less, but is not critical.
[0017]
Chemical formula
R_rCH₂OP (O-Drug) NR (CH₂)_nX
The intermediate halophosphoramidite of the general formula is typically prepared in an organic solvent inert in the presence of a tertiary amine base,
R_rCH₂OH
Can be prepared by reacting phosphorous trichloride at low temperature with an alcohol of the formula
HNR (CH₂)_nX
With amine. To form the phosphoramidate prodrugs of the present invention, it is preferred to generate the intermediate immediately prior to reaction with the functional drug compound containing a hydroxyl group, usually in the presence of an acid scavenger.
[0018]
In another method of preparing the phosphoramidate prodrug of the present invention, a functional drug compound containing a hydroxyl group is prepared using the same general reactants and omitting the last oxidation step, except that the preceding oxidation step is omitted. Reaction with a chlorophosphoramidate intermediate resulting from initiating the reaction with phosphorous oxytrichloride (as opposed to phosphorous trichloride).
[0019]
Each of the above reactions is performed by the corresponding compound
R_rCH₂OP (O) (NH Drug) NR (CH₂)_nX
To provide a drug containing an amino function (Drug NH₂) Can be performed in a similar procedure.
[0020]
In another embodiment of the present invention,
R_rCH₂OP (O)_m(Halo) NR (CH₂)_nX
To prepare a compound of formula 1) in the presence of an acid scavenger,_rCH₂OH alcohol and 2) a chemical formula HNR (CH₂)_nAn amine of X and a chemical formula
P (O)_mhalo₃
A reaction step with a compound of formula (I). Here, in the above chemical formula,
m is 0 or 1;
R is C₁-C₄Alkyl or (CH₂)_nX;
n is 4 or 5;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically displaced from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
R_rCH₂A group is a biologically labile ester-forming group.
[0021]
In another embodiment of the present invention, a compound of the general formula Drug-OPO₃Formula for Enhancing Intracellular Drug Delivery of a Compound of Formula
R_rCH₂OP (O) (O-Drug) NR (CH₂)_nX
The present invention provides a method for preparing a phosphoramidate prodrug. This method is based on the chemical formula under conditions that induce the formation of a prodrug.
R_rCH₂OP (O) (halo) NR (CH₂)_nX
Reacting a compound of formula with a therapeutic compound of the formula Drug-OH.
[0022]
Here, in the above chemical formula,
R is C₁-C₄Alkyl or (CH₂)_nX;
n is 4 or 5;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically displaced from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
R_rCH₂A group is a biologically labile ester-forming group.
[0023]
As mentioned above, the chemistry described herein has the general formula Drug-NH₂Biologically active compounds and intermediate compounds
R_rCHOP (O) (halo) NR (CH₂)_nX
By the reaction with
R_rCHOP (O) (NH-Drug) NR (CH₂)_nX
The same or similar conditions can be applied to the preparation of the prodrug phosphoramidate. Here, Rr, halo, R, n, and X in the formula are as defined above. This chemistry is represented by the chemical formula Drug-NHPO₃Methods for intracellular delivery of therapeutic compounds of the invention. Thus, for example, a 5'-amino nucleotide or nucleotide analog would have the corresponding 5'-NHPO₃The derivative can be derived as the corresponding prodrug phosphoramidate for highly efficient intracellular delivery of the derivative.
[0024]
The phosphoramidite compounds of the present invention can be used as prodrugs themselves or, for example, in the case of tyrosine phosphoramidates, for the synthesis of peptides or peptidomimetic prodrugs. The chemistry involved in the synthesis of the phosphoramidite of the present invention may be a hydroxy, carboxy, thiol, amine functional group present on the initiator drug compound that is not intended to be involved in the chemistry of phosphoramidate synthesis. It will be appreciated by those skilled in the art that such should be protected with protecting groups recognized by those skilled in the art. References to such protecting groups, applications for protecting various functional groups and their removal conditions are abundant. The use of such protecting groups is well known to those skilled in the art, and the use of protecting groups in performing the synthesis of phosphoramidite prodrugs and intermediates is not included in the present invention.
[0025]
The phosphoramidite product prepared in accordance with the present invention can be formulated and used in the same or similar dosage form as the non-derived drug compound using art-recognized techniques.
[0026]
In one embodiment of the present invention, the reaction shown in Scheme 2 is performed.
[0027]
[Equation 2]

In this reaction, prodrug 3A was synthesized by sequentially adding nitrofuryl alcohol and p-cresol to phosphoramidic dichlorolide 1. The prodrug 3 was then activated by reduction with sodium diotinate in an ethanol / water buffer, where the nitrofuryl group was reduced and the phosphoramidate anion 4A was released. The reaction following this intermediate follows³¹Monitored by PNMR. NMR showed that Intermediate 4A smoothly cyclized to a five-membered amphoteric intermediate and was attacked by water to give cresol phosphate as the only phosphorus-containing product.
[0028]
Another embodiment of the present invention is shown in Scheme 3.
[0029]
[Equation 3]

This reaction was aimed at the synthesis of phosphoramidate 11A and involved the preparation of nitrofuryl phosphoramidate of p-hydroxybenzoic acid 9A and coupling of this product with benzylamine 10A prepared from 5-acetylsalicylamido. Including. Briefly, to synthesize benzoic acid derivative 9A, p-hydroxybenzoic acid was converted to allyl ester 6A by reaction of its potassium salt with allyl bromide. Allyl ester is converted to POCl₃And the intermediate phosphoryl dichloride was treated with methylchlorobutylamine in the presence of triethylamine to give phosphoramidic chloride 7A. Reaction of the lithium salt of 5-nitro-2-hydroxymethylfuran with 7A yielded phosphoramidate 8A. The deprotection of the allyl ester is carried out by Pd (Ph₃P)₄/ Sodium p-toluenesulfinate to give phosphoramidate benzoate 9A. 9A was reacted with isobutyl chloroformate in the presence of triethylamine, followed by the addition of benzylamine 10A to produce the desired peptidomimetic prodrug 11A. To confirm that the activation chemistry of 11A to 12A proceeds as expected, reduce 11A with sodium hyposulfite in ethanol / water and allow the reaction to proceed.³¹Monitored by PNMR. The conversion of 11 to the phosphoramidate anion was completed within minutes; the phosphoramidate anion was smoothly and exclusively converted to phosphate 12A at 37 ° C. in half the time of 21 minutes. Phosphate 12A corresponding to the activation of 11A was synthesized and pp60 with a binding affinity of 5.6 μM.^src It was shown to bind to the SH2 domain.
[0030]
In yet another embodiment of the present invention, different intermediates were used to incorporate into the sequence of reactions shown in Scheme 3 for forming tyrosine phosphate phosphoramidate. When the reaction shown in Scheme 3 was performed, Intermediate 17A was shown below, along with the resulting product.
[0031]
(Equation 4)

Intermediate 17A was described in Scheme 3 for compound 9A except that in the third step of the reaction system, 2-hydroxymethyl-1,4-dimethoxynaphthalene was used instead of 5-nitro-2-hydroxymethylfuran. Prepared as described. Compound 17A was then coupled with amine 10A (Scheme 3) to give amide 18A using new conditions that provide a high yield of purified product in minutes. Finally, dimethoxynaphthalene 18A was smoothly converted to naphthoquinone 19A by oxidizing it with cerium ammonium nitrate.
[0032]
Further, in another embodiment of the present invention, a masked phosphotyrosine-containing peptide was synthesized as shown in Scheme 4:
[0033]
(Equation 5)

N-BOC-tyrosine potassium salt was reacted with allyl bromide to obtain BOC-tyrosine allyl ester 13A. The ester was converted to its cerium phenol salt and reacted with N-methyl-N-chlorobutyl phosphoramidic dichloride to give adduct 14A. Finally, phosphoramidic chloride was reacted with lithium salt of 5-nitro-2-hydroxymethylfuran to obtain tyrosine phosphoramidate ester 15A. Removal of the allyl protecting group provided BOC-protected tyrosine phosphoramidate 16A in excellent net yield. This analog would be suitable for coupling a variety of amines overall, and would also be useful as a reagent in automated peptide synthesis.
[0034]
The synthetic reaction shown in Scheme 4 was extended to the development of tyrosine phosphoramidates protected with a fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) protecting group. FOMC protected amino acids are widely used in peptide synthesis and have the advantage that protecting groups can be quickly and cleanly removed under base catalyzed conditions. The FMOC analog of tyrosine phosphoramidate 16A, ie, the above compound 20A in Scheme 4, can be prepared by a reaction system similar to that in Scheme 4. The FMOC protecting group can be quickly and cleanly removed by reacting with diazabicycloclonedecane in dichloromethane for 5 minutes. Finally, coupling reactions of 16A and 20A with methyl glycinate were performed, revealing that these compounds can be used in peptide synthesis reactions.
[0035]
In another embodiment of the present invention, the synthesis of nitrofurylchlorobutyl nucleoside 3 was performed in one operation without isolation of the intermediate as shown in Scheme 5.
[0036]
(Equation 6)

Phosphorus trichloride in methylene chloride is reacted at −78 ° C. with one equivalent of nitrofuryl alcohol, the intermediate dichloride is treated with the hydrochloride salt of N-methyl-N-chlorobutylamine to give the monochloride intermediate A. Obtained. A pyridine solution containing 5-fluoro-2'-deoxyuridine was added to this intermediate. The resulting phosphoramidate was oxidized with t-butyl hydroperoxide to give the nucleoside phosphoramidate 3. The yield of this synthesis was low and the values varied (20-60%).
[0037]
In an alternative embodiment of the invention, a similar thymidine compound was prepared (ie, F = CH at 3).₃). The thymidine phosphoramidate was activated by reducing the nitrofuryl group with sodium dithionite in aqueous buffer / acetonitrile at 37 ° C.³¹Monitored by PNMR. Within 10 minutes the resonance for the phosphoramidate anion disappears,³¹PNMR revealed a new peak corresponding to thymidine-5'-phosphate as the only phosphorus-containing product. The nucleoside phosphoramidate 3 was then evaluated for its ability to inhibit the growth of L1210 leukemia cells in vivo. Cells were exposed to the drug for 2, 8, 24, and 48 hours; the results are summarized below:
[Table 1]

Chlorobutyl phosphoramidate 3 is significantly more potent than similar bromoethyl compounds and is one of the most effective nucleotide prodrugs prepared.
[0038]
In a related embodiment of the invention, Intermediate 4 was incorporated into the reaction scheme described above to produce a new drug 5:
[0039]
[Equation 7]

The dimethoxynaphthalene analog 4 is shown in Scheme 5 except that in the first step 2-hydroxymethyl-1,4-dimethoxynaphthalene analog 4 is used in place of 5-nitro-2-hydroxymethylfuran. It was synthesized in the same manner as described above. Dimethoxynaphthalene 4 was smoothly oxidized with cerium ammonium nitrate to smoothly convert to naphthoquinone 5. Compound 5 was evaluated as an L1210 leukemia cell growth inhibitor in comparison with Compound 3 described above.
[0040]
[Table 2]

Both compounds are very good inhibitors of the growth of L1210 cells, with compound 5 showing approximately 3 times the potency of compound 3 in this assay.
[0041]
In one aspect of the invention, the phosphoramidate prodrug has the formula
Embedded image

Is a compound of the formula
R_rCH₂OP (O) (Z-Drug) NR (CH₂)_nX
Formed using a peptidomimetic containing a hydroxyl or amino functional group (Drug ZH).
[0042]
Z in the formula is O or N;
q and k are independently selected 1 or 0; and
B is H, amino, protected amino, or C₁-C₄Is alkanoylamino.
[0043]
One group of the compounds is a benzamide compound in which q and k are each 0, and examples thereof include the following.
Embedded image

[0044]
Another group of said compounds are phenylacetyl compounds wherein q is 1 and k is 0, for example:
Embedded image

[0045]
Another group of peptidomimetics (Drug ZH) is a tyrosyl derivative in which q is 1 and k is 1, and examples thereof include the following.
Embedded image

[0046]
Some of the compounds were predicted to have antiproliferative activity and were found to show significant inhibition of luciferase expression in transfected J77 cells.
[0047]
In accordance with the present invention, several phosphoramidate compounds using "DrugZH" as a nucleotide analog were prepared and found to exhibit remarkable growth inhibition in L1210 mouse leukemia cells. Said compounds are part of a preferred group of antiproliferative substances of the present invention. A number of nucleotide analogs have been reported in the literature to exhibit antiproliferative activity, and any of these compounds, including those that can be covalently linked to the phosphoramidates of the present invention by a hydroxyl or amino function, can be used. Can be used for preparing the present compound.
[0048]
In another embodiment of the present invention, the phosphoramidate compound is an amino acid or a compound of the formula
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Is a derivative of the amino acid ester. Here, Z, q, k, and B in the formula are defined as above, and R means a hydrogen or carboxyl protecting group, particularly an ester forming group. The tyrosine or tyrosine analog is useful as an intracellular material of peptide phosphate or peptidomimetic phosphate for preparing a peptide or peptidomimetic compound capable of easy membrane transport. Alternatively, the compound can provide the corresponding amino acid or amino acid analog into a cell.
[0049]
For example, there are the following compounds.
Embedded image

[0050]
Further, the present invention provides a medical preparation containing an effective amount of a prodrug phosphoramidate compound for treating cancer. An effective amount of a prodrug compound as used herein, when administered to a patient, inhibits the growth / proliferation of tumor cells, kills malignant cells, reduces the amount or size of tumors, or receives treatment. Is defined as the amount of compound that completely eliminates the tumor in a patient.
[0051]
The effective amount to administer to a patient is usually based on body surface area, patient weight, and patient condition. The interrelationship of animal and human doses (based on milligrams per square meter of body surface area) is described by Freireich, E. et al. J. , Et al. , Cancer Chemother. Rep. , 50 (4): 219 (1966). Body surface area may be approximately determined from height and weight of the patient (see, eg, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, pages 537-538 (1970)). Effective amounts of the phosphoramidate compounds of the present invention per dose range from about 0.05 mg / kg to about 100 mg / kg, from about 0.25 mg / kg to about 50 mg / kg, Typically, it will range from about 0.1 to about 10 mg / kg. The effective amount will also vary depending on the route of administration, the use of excipients, the possibility of using other therapeutic treatments including other chemotherapeutic agents and radiation therapy, as will be recognized by those skilled in the art.
[0052]
Therapeutic preparations may be administered by parenteral routes, including subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, and intravenous injections. Examples of parenteral dosage forms include aqueous solutions or suspensions of the active agents in isotonic saline, 5% glucose or other well-known pharmaceutically acceptable liquid carriers. In one embodiment of the present pharmaceutical composition, the phosphoramidate compound is dissolved in saline containing 5% dimethyl sulfoxide and about 10% Cremphor EL (Sigma Chemical Company). Solubilizing agents such as cyclodextrin, which can form complexes with the more soluble compounds, or other solubilizing agents well known to those skilled in the art, can be used to deliver the compounds for the treatment of cancer. It can also be used as a pharmaceutical excipient.
[0053]
Alternatively, the compounds can be formulated into dosage forms for other routes of administration using well known methods. Pharmaceutical compositions can also be formulated in dosage forms for oral administration such as capsules, gel seals, or tablets. Capsules may contain any of the well-known pharmaceutically acceptable materials such as gelatin or cellulose derivatives. Tablets may be formulated in accordance with conventional practice by compressing a mixture of active phosphoramidate and a solid carrier or lubricant well known to those skilled in the art. Examples of solid carriers include starch, sugar, bentonite, and the like. The compounds of the present invention can also be administered in the form of hard shell tablets or capsules containing, for example, lactose or mannitol as a binder and conventional bulking and tableting agents.
[0054]
<Experimental procedures and examples>
Embedded image

5-Fluoro-2'-deoxyurazyl 5-nitrofurfuryl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (3):
Phosphorus trichloride (2M CH₂Cl₂Solution; 0.81 mL; 1.63 mmol) was cooled to -78 C under argon. 5-Nitrofurfuryl alcohol (233 mg; 1.63 mmol) was added to anhydrous CH.₂Cl₂ Dissolved in 12 mL and cooled PCl₃After addition of pure and anhydrous iPr₂Net (0.57 mL; 3.25 mmol) was added dropwise. The reaction was carried out between -78 ° C and -70 ° C with stirring for 15 minutes. Anhydrous CH₂Cl₂ N-methyl-N- (4-chlorobutyl) amine hydrochloride (257 mg; 1.63 mmol) was dissolved in 16 mL and added to the reaction mixture, followed by the addition of the anhydrous and pure iPr.₂Net (1.13 mL; 6.50 mmol) was added dropwise and the reaction mixture was stirred between -78 ° C and -70 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was cooled to −65 ° C. beforehand with 2 mL of anhydrous CH.₂Cl₂And a solution of 5-fluoro-2'-deoxyuridine (200 mg; 0.812 mmol) in 2 mL of anhydrous pyridine was injected by cannula. The reaction was carried out between -65 ° C and -60 ° C with stirring for 1 hour. To this reaction mixture was added t-butyl hydroperoxide (4.6 minutes decane; 0.44 mL) at −65 ° C. with stirring. The temperature was raised to −40 ° C., and the mixture was stirred while being raised from −40 ° C. to 0 ° C. over 30 minutes. The reaction mixture was poured into Celite and concentrated under reduced pressure. Crude product (1: 1 CH₂Cl₂/ Acetone) to give a yellow foamy substance 1 (155 mg; 34%).
¹H NMR (CDCl₃): D 9.68 (m, 1H); 7.80 and 7.74 (d, 1H, J = 6.22 Hz and 6.41 Hz); 7.30 (d, 1H, J = 3.48). Hz); 6.71 (d, 1H, J = 3.30); 6.22 (m, 1H); 5.03 (m, 2H); 4.52 (m, 1H); 4.24 (m 4.07 (m, 1H); 3.57 (m, 2H); 3.07 (m, 2H); 2.68 (d, 3H, J = 10.25 Hz); 2.49 (M, 1H); 2.18 (m, 1H), 1.74 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-15.59 and-15.78.
HPLC (35:65 CH₃CN / H₂O [0.1% TFA]): 8.667 min. , 92%.
ESI MS (high resolution): C₁₉H₃₅ClFN₄O₁₀Measured for P: m / z 555.159 (M + H)⁺Found: 555.1509.
[0055]
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5-Fluoro-2'-deoxyuridyl 2- (1,4-dimethaoxynaphthyl) methyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (4):
Phosphoramidate 4 was converted to anhydrous trichloride (2 min CH 2) in the same manner as Compound 3.₂Cl₂0.41 mL; 0.812 mmol), 1,4-dimethoxy-2-hydroxymethylnaphthalene (177 mg, 0.823 mmol), N-methyl-N- (4-chlorobutyl) amine hydrochloride (128 mg) , 0.812 mmol), 5-fluoro-2'-deoxyuridine (100 mg, 0.406 mmol) and t-butyl hydroperoxide (4.6 minutes decane; 0.23 mL). Crude product (1: 1 CH₂Cl₂/ Acetone) column chromatography gave pale orange foam 4 (134 mg; 52%).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.22 (dd, 1H); 8.04 (dd, 1H); 7.74 and 7.66 (d, 1H, J = 6.23 &6.39); 7.55 (m, 6.83 (s, 1H); 6.16 (m, 1H); 5.26 (m, 2H); 4.51 (m, 1H); 4.23 (m, 2H); 3.99 (s, 3H); 3.93 (s, 3H); 3.50 (m, 2H); 3.08 (m, 2H); 2.65 (d, 3H) , J = 9.70 Hz); 2.42 (m, 2H); 1.66 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-12.82 and -12.90.
HPLC (50:50 CH₃CN / H₂O [0.1% TFA]): 7.017 min. 95%.
FAB MS (high resolution): C₂₇H₃₄ClFN₃O₄Measured for P: m / z 630.1784 (M + H)⁺Found: 630.1760.
[0056]
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5-Fluoro-2'-deoxyuridyl 2- (1,4-napthoquinonyl) methyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (5):
Cerium ammonium nitrate (225 mg, 0.41 mmol) aqueous solution (3 mL) was added to 4 (100 mg, 0.16 mmol) of CH₃It was added dropwise over 15 minutes to the CN solution (3 mL). The reaction is carried out with stirring for 1 hour at room temperature and CHCl₃ And extracted three times. Combine the organic layers and add Na₂SO₄And concentrated under reduced pressure. Silica gel chromatography (5% MeOH: CHCl₃) To give yellow foamy substance 5 (87.6 mg, 93%).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.10 (m, 2H); 7.77 (m, 2H); 7.72 (m, 1H); 7.03 (s, 1H); 6.18 (m, 1H); 4.5 (m, 1H); 4.29 (m, 2H); 4.05 (m, 1H); 3.57 (m, 2H); 2.73 (d, 3H) , J = 10.07 Hz); 2.47 (m, 1H); 2.31 (m, 1H); 1.75 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-12.67 and-12.99.
HPLC (50:50 CH₃CN / H₂O [0.1% TFA]): 4.650 min. 100%.
FAB MS (high resolution): C₂₅H₂₈ClFN₃O₉Measured for P: m / z 600.1314 (M + H)⁺Found: 600.1327.
[0057]
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5-Fluoro-2'-deoxyuridyl 2- (5-methoxy-N-methylindoloquinone) methyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (6):
Phosphorus trichloride (2M CH₂Cl₂ Solution; 0.13 mL; 0.258 mmol) was cooled to −60 ° C. in argon. 2-hydroxymethyl-5-metaoxy-N-methylindoloquinone (57 mg; .258 mmol) was treated with anhydrous CH.₃Anhydrous CH with addition of 1 mL CN₂Cl₂ 6 mL dissolved and pre-cooled PCl₃After addition to pure i-Pr₂NEt (0.07 mL; 0.386 mmol) was added dropwise. The reaction was carried out with stirring at -60 ° C for 25 minutes. Anhydrous CH₂Cl₂ N-methyl-N- (4-chlorobutyl) amine hydrochloride (40.7 mg; 0.258 mmol) was dissolved in 1 mL and added to the reaction mixture, followed by pure i-Pr₂NEt (0.14 mL; 0.773 mmol) was added dropwise and stirred at −60 ° C. for 25 minutes. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (31.7 mg; 0.129 mmol) was co-evaporated with anhydrous pyridine, dissolved in 2 mL of anhydrous pyridine and cooled to -45 <0> C. The pyridine solution was titrated with the previously prepared mixture until the FUdR disappeared. The disappearance of FUdR was monitored by TLC using chloroform containing 30% methanol. After 1 hour, the reaction was oxidized with t-butyl hydroperoxide (4.6 M decane solution; 0.06 mL) at -40 ° C and stirred while increasing from -40 ° C to 0 ° C over 30 minutes or more. . Saturated NH₄Cl (3 mL) was added, some layers were separated and the anhydrous layer was CHCl₃(5 times 5 mL). Combine the organic layers and add Na₂SO₄And concentrated under reduced pressure. The crude reaction mixture was passed through a plug of silica gel with chloroform containing 15% methanol. Silica gel (1: 9 MeOH / CHCl₃) Further purification by chromatography to give a yellow-orange foam-like substance 6 (33 mg; 41%).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.99 (br, 1H); 7.62 (m, 1H); 6.62 (d, 1H, J = 3.76 Hz); 6.11 (1H, J = 4.30); 5.64 (s, 1H); 4.95 (m, 2H); 4.46 (m, 1H); 4.13 (m, 2H); 3.95 (d, 3H, J = 4.03 Hz). ); 3.86 (m, 1H); 3.76 (s, 3H); 3.47 (m, 2H); 3.95 (m, 2H); 2.58 (m, 3H); (M, 1H); 2.11 (m, 1H); 1.65 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d -14.65 and -14.71.
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 20.32 min. 80%.
FAB MS (high resolution): C₂₅H₃₁ClFN₄O₁₀Measured for P: m / z 633.1529 (M + H)⁺Found: 633.1506.
[0058]
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N-allyloxycarbonylarabinosyl cytosine (7):
Diethyl pyrocarbonate (86.8 mg, 0.452 mmol) was diluted with 1,4-dioxane (5 mL) and an aqueous solution of arabinosylcytosine (100 mg, 1.61 mmol) (ddH) was added at room temperature.₂O 1 mL). After the reaction mixture was immersed in an oil bath and refluxed for 2 hours, the solvent was removed under reduced pressure, anhydrous pyridine (3 times, 5 mL) was added to the obtained white residue, and the mixture was evaporated. Silica gel chromatography (CHCl₃(15% MeOH in) to give a white foam 7 (91 mg, 76% recovery based on starting material).
¹H NMR (DMSO₆): D 10.75 (br, 1H); 8.04 (d, 1H, J = 7.51 Hz); 7.00 (d, 1h, J = 7.51 Hz); 6.04 (d, 1H). 5.95 (m, 1H); 5.46 (m, 1H); 5.39 & 5.25 (dd, 1H, J = 1.47 & 35.34 Hz). ); 5.32 & 5.21 (dd, 1H, J = 1.1 & 23.32 Hz), 5.11 (m, 1H); 4.62 (d, 2H, J = 5.31 Hz). 4.04 (m, 1H); 3.91 (m, 1H); 3.81 (m, 1H); 3.60 (m, 2H).
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 12.18 min. 99%. ESI MS (low resolution): (M + H) = 328 m / z; C_ThirteenH₁₇N₃O₇MW = 327.
[0059]
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N-allyloxycarbonylarabinosyl cytosyl 5-nitrofurfuryl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (8):
Phosphoramidate 8 was converted to phosphorous trichloride (2M CH 2) in the same manner as Compound 6 described above.₂Cl₂Solution; 1.14 mL; 2.28 mmol), 5-nitrofurfuryl alcohol (326 mg, 2.28 mmol), N-methyl-N- (4-chlorobutylamine) hydrochloride (360 mg, 2.28) mmol), N-allyloxycarbonylarabinosylcytosine (240 mg, 0.733 mmol) and t-butyl hydroperoxide (4.6 M decane solution; 0.48 mL). Crude product (CHCl containing 10% methanol)₃)), And a pale yellow foam 8 (227 mg; 50%) was obtained.
¹H NMR (CDCl₃): D 8.23 (d, 1H, J = 7.33 Hz); 7.23 (d, 1H, J = 1.33 Hz); 6.69 (m, 1H); 6.15 (1H) 5.91 (m, 1H); 5.34 (m, 3H); 5.02 (m, 2H); 4.55 (m, 4H); 4.23 (m, 2H); 3.55 ( t, 2H, J = 5.68 Hz); 3.03 (m, 2H); 2.67 (d, 3H, J = 10.26 Hz); 1.73 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d -15.54 and -15.76.
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 20.01 min. 95%.
ESI MS (high resolution): C₂₃H₃₁ClN₅O₁₂Measured for P: m / z 636.1474 (M + H)⁺Found: 636.1474.
[0060]
Embedded image

Arabinosyl cytosyl 5-nitrofurfuryl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate:
Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (3.45 mg, 29.9 mmol) was added to a solution of phosphoramidate 8 (38 mg, 59.8 mmol) in THF (400 mL) followed by p- Toluenesulfinic acid (11.71 mg, 65.7 mmol) aqueous solution (ddH₂O, 240 mL). The reaction mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours, after which it was passed through a plug of silica gel (20% methanol in chloroform) to give a pale yellow foam (25.1 mg, 76%).
¹H NMR (CD₃OD): d 7.85 (m, 2H); 7.49 (m, 1H); 6.89 (m, 1H); 6.57 (m, 1H); 5.95 (m, 1H); 4.11 (m, 2H); 4.19 (m, 5H); 3.66 (m, 2H); 3.11 (m, 2H); 2.72 (m, 3H); 1.79 (m , 4H).
³¹P NMR (CD₃OD, TPPO): d -14.18 and -14.37
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 21.43 min. 95%.
ESI MS (high resolution): C₁₉H₂₇ClN₅O₁₀Measured for P: m / z 552.1262 (M + H)⁺Found: 552.1251.
[0061]
Embedded image

2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-didehydrothymidyl 5-nitrofurfuryl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (10):
Phosphoramidate 10 was converted to phosphorous trichloride (2 min CH 2) in the same manner as Compound 6 described above.₂Cl₂0.45 mL; 0.892 mmol), 5-nitrofurfuryl alcohol (128 mg, 0.892 mmol), N-methyl-N- (4-chlorobutylamine) hydrochloride (141 mg, 0.892 mmol) ) Prepared from 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydrothymidyl (100 mg, 0.446 mmol) and t-butyl hydroperoxide (4.6 M solution in decane; 0.48 mL) did. Crude product (CHCl containing 5% methanol)₃) Gave a white foam 10 (80.5 mg; 48% recovery based on starting material).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.19 (s, 1H); 7.29 (m, 1H); 7.19 (s, 1H); 6.98 (m, 1H); 6.66 (m, 1H); 4.91 (m, 1H); 5.91 (m, 1H); 4.99 (d, 3H, J = 9.97 Hz); 4.16 (m, 2H); 3.56 (t, 2H, J = 5.59 & 6.13 Hz); 3.06 (m, 2H); 2.63 (m, 3H); 1.87 (2s, 3H); 1.71 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d -13.58 and -13.99.
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 22.75 and 23.18 min. 90%.
ESI MS (high resolution): C₂₀H₂₆ClN₄O₉Measured for P: m / z 533.1358 (M + H)⁺Found: 533.1350.
[0062]
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2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-didehydrothymidyl 2- (1,4-dimethoxynaphthyl) methyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (11):
Phosphoramidate 11 was converted to phosphorous trichloride (2 min CH 2) in the same manner as Compound 6 described above.₂Cl₂0.45 mL; 0.892 mmol), 1,4-dimethoxy-2-hydroxymethylnaphthalene (195 mg, 0.892 mmol), N-methyl-N- (4-chlorobutylamine) hydrochloride (141) mg, 0.892 mmol), 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydrothymidyl (100 mg, 0.446 mmol) and t-butyl hydroperoxide (4.6 minutes decane; 45 mL). Crude product (CHCl containing 5% methanol)₃)) Gave a white foam 11 (121 mg; 56% recovery based on starting material).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.24 (d, 1H, J = 8.06 Hz); 8.05 (m, 2H); 7.54 (m, 2H); 7.19 (s, 1H); 6.98 ( 6.84 (s, 1H); 6.31 (m, 1H); 5.58 (m, 1H); 5.24 (d, 2H, J = 7.69 Hz); 4.15 (m, 2H); 4.98 (m, 6H); 3.50 (t, 2H, J = 5.86 & 6.31 Hz); 3.04, m 2.61 (m, 3H); 1.86 (s, 3H); 1.71 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d -13.44 and -13.88.
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] gradient over 30 min): 28.08 and 28.30 min. 87%.
ESI MS (low resolution): C₂₈H₃₅ClN₃O₈Measured for P: 608 (M + H)⁺Found: 630 (with Na added).
[0063]
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2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-didehydrothymidyl 2- (1,4-naptoquinonyl) methyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidate (12):
An aqueous solution (3 mL) of cerium ammonium nitrate (225 mg, 0.411 mmol) was added to 11 (100 mg, 0.164 mmol) of CH.₃It was added dropwise over 15 minutes to the CN solution (3 mL). The reaction is carried out for 1 hour with stirring at room temperature and CHCl₃(3 times). Combine the organic layers and add Na₂SO₄And concentrated under reduced pressure. Silica gel chromatography (5% MeOH: CHCl₃) To give a yellow foam 12 (78 mg, 82%).
¹H NMR (CDCl₃): D 8.09 (m, 2H); 8.01 (s, 1H); 7.79 (m, 2H); 7.17 (s, 1H); 6.99 (m, 2H); 5.93 (m, 1H); 5.00 (m, 3H); 4.24 (m, 2H); 3.56 (t, 2H, J = 5.86 & 6. 3.11 (m, 2H); 2.71 (d, 3H, J = 10.07 Hz); 1.90 (s, 3H); 1.74 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d -13.49 and -13.84.
HPLC (0 to 70% CH₃CN / H₂O [0.1% TFA] over 30 minutes gradient): 24.82 and 25.02 minutes. 95%.
FAB MS (high resolution): C₂₅H₂₉ClN₃O₈Measurement for P: m / z 600.1279 (Na⁺ add); found: 600.1297 (Na⁺Addition).
[0064]
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N-methyl-N- (4-bromobutyl) amine hydrobromide:
Hydrobromic acid (20 mL, 0.38 mmol, 48% by weight) is added to N-methyl-N-butan-4-ol (4.0 g, 0.39 mmol) at 0 ° C. with slow stirring. Was. The reaction mixture was warmed to reflux for 2 hours. A distillation apparatus was installed, 10 mL of distillate was collected, and 10 mL (0.18 mmol) of 48% HBr was added. After refluxing for 4 hours, 10 mL (0.18 mmol) of 48% HBr was added because the distillation reduced by 10 mL, and the reaction was refluxed overnight. The reaction mixture was distilled (approximately 20 mL of distillate) and the residue in the distillation vessel was poured into acetone at -78 ° C. A white precipitate formed and was collected by filtration (4.24 g, 44%).
¹1 H NMR: CDCl₃: D 9.08 (s, 1H); 3.46 (t, 2H, J = 5.95 Hz); 3.04 (m, 2H); 2.72 (t, 3H, J = 5.67 Hz). ); 2.05 (m, 4H); 1.70 (s, 1H).
D₂O: 2.84 (t, 2H, J = 6.13 Hz); 2.39 (t, 2H, J = 7.32 Hz); 2.04 (s, 3H); 1.23 (m, 4H) ).
[0065]
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N-methyl-N- (4-chlorobutyl) amine hydrochloride:
With stirring at room temperature, N-methyl-N-butan-4-ol (2.0 g, 19.38 mmol) in CH₂Cl₂HCl gas was bubbled through 10 mL of the solution until the litmus paper turned red (pH = 2). The reaction mixture was cooled to 0 ° C., thionyl chloride (1.41 mL, 19.38 mmol) was added dropwise and the reaction was stirred at room temperature overnight. The solvent was removed under reduced pressure to give a white solid (2.9 g, 95%).
¹1 H NMR: CDCl₃: D 8.79 (s, 1H); 3.59 (t, 2H, J = 5.95); 2.97 (m, 2H); 2.70 (s, 3H); 2.06 (m, 1.95 (m, 2H); 1.63 (s, 1H).
D₂O: d 3.50 (m, 2H); 2.75 (m, 2H); 2.55 (s, 3H); 1.70 (m, 4H).
CI MS (low resolution): (M + H)⁺ = 122 m / z; C₅H₁₂MW for NCl = 121.
[0066]
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N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidic dichloride:
N-methyl-N- (4-chlorobutyl) amine hydrochloride (2.0 g, 12.73 mmol) was added to 20 mL of anhydrous CH.₂Cl₂And cooled to -40 ° C. After appropriately adding phosphorous oxychloride (1.2 mL, 12.73 mmol), triethylamine (3.6 mL, 25.46 mmol) in CH was added.₂Cl₂5 mL of the solution was added. The reaction was warmed to 0 ° C. and slowly returned to room temperature. Then, the mixture was reacted at room temperature for 6 hours with stirring. The reaction mixture was poured on ice, saturated ammonium chloride was added and the layers were separated. CH layer₂Cl₂, And the organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. Purification by flash chromatography on silica gel (3: 1 Hex / EtOAc) provided a clear oil (2.57 g, 85%).
¹H NMR (CDCl₃): D 3.58 (t, 2H, J = 5.95 Hz); 3.29 (m, 2H); 2.84 (d, 3H, J = 15.93 Hz); 1.79 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-6.6.
[0067]
Embedded image

N-methyl-N- (4-bromobutyl) phosphoramidic dibromide:
As described above (except that the reaction was stirred overnight) using N-methyl-N- (4-bromobutyl) amine hydrobromide (2.0 g, 8.09 mmol). Performed the procedure. Purification using silica gel chromatography (3: 1 Hex / EtOAc) provided a clear oil (2.0 g, 92%).
¹H NMR (CDCl₃): D 3.46 (t, 2H, J = 6.05 Hz); 3.30 (q, 2H); 2.85 (d, 3H, J = 16.11 Hz); 1.88 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-6.75.
[0068]
Embedded image

5-Nitro-2-furylmethyl N-methyl-N- (4-chlorobutyl) phosphoramidic chloride:
Tetrahydrofurfuryl alcohol (240 mg, 1.68 mmol) was dissolved in 10 mL of anhydrous THF and cooled to -78 ° C. Lithium hexamethyldisilazane (1.84 mL, 1.84 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred at -78 ° C for 10 minutes to perform a reaction. To this reaction mixture, 10 mL of a solution of phosphoramidic dichloride (400 mg, 1.68 mmol) in anhydrous THF was added dropwise. The reaction was carried out by slowly heating from −78 ° C. to −60 ° C., followed by stirring at −60 ° C. for 1 hour. Saturated NH₄Quenched with Cl, the layers were separated and the aqueous layer was extracted three times with EtOAc. The organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Flash silica gel chromatography (10: 1 CH₂Cl₂/ Acetone) to give a light brown oil (320 mg, 55%).
¹H NMR (CDCl₃): D 7.29, (d, 1H, J = 3.66 Hz); 6.72 (d, 1H, J = 3.66 Hz); 5.14 (dd, 2H); 3.56 (t) , 2H, J = 5.86); 3.20 (m, 2H); 2.71 (d, 3H, J = 13.58 Hz), 1.79 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-7.88.
[0069]
Embedded image

5-Nitro-2-furylmethyl N-methyl-N- (4-bromobutyl) phosphoramidic chloride:
The same procedure as described above was performed using nitrofurfuryl alcohol (245 mg, 1.78 mmol) and phosphoramidic dichloride (500 mg, 1.78 mmol) as starting materials. Flash silica gel chromatography (10: 1, CH₂Cl₂/ Acetone) to recover a light brown oil (360 mg, 52%).
¹H NMR (CDCl₃): D 7.29, (d, 1H, J = 3.67 Hz); 6.72 (d, 1H, J = 3.66 Hz); 5.14 (dd, 2H); 3.43 (t) , 2H, J = 6.32); 3.19 (m, 2H); 2.72 (d, 3H, J = 13.73 Hz), 1.79 (m, 4H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO): d-7.88.
[0070]
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Synthesis of phosphoramidic dichloride.
Diisopropylamine (8.82 mL, 50.61 mmol) was diluted with 20 mL of anhydrous dichloromethane and cooled with POCl₃(2.36 mL, 25.31 mmol) and N-methyl-4-chlorobutylamine hydrochloride (4 g, 24.31 mmol) in 40 mL of an anhydrous dichloromethane solution were slowly added at -20 ° C. The reaction mixture was stirred for 3.5 hours while gradually warming to 10 ° C. The reaction mixture was quenched with saturated ammonium chloride and extracted with dichloromethane. Collect the organic layer and wash with brine, MgSO₄, And evaporated to dryness to recover a yellow liquid. The crude product was chromatographed using a 3: 1 Hexanes / EtOAc mixture to recover phosphoramidic dichloride (5.07 g, 84% recovery) as a clear liquid.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 3.59 (t, 2H), 3.29 (m, 2H), 2.85 (d, 3H, j = 16.11 Hz), 1.80 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO) d: -6.63 ppm.
[0071]
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Synthesis of 1-propenyl benzoate 12a.
To 86 mL of an allyl bromide suspension of 4-hydroxybenzoic acid (5 g, 36.20 mmol) was appropriately added diisopropylamine (6.31 mL, 36.20 mmol). The reaction mixture was stirred at reflux for 2 hours and cooled to room temperature. Excess allyl bromide was removed by distillation under reduced pressure, and the remaining oil was diluted with EtOAc, washed with water, brine, MgSO 4₄, And evaporated to dryness to recover a yellow oil. Crude product is 10: 1 CHCl₃Chromatography was carried out using a mixture of MeOH / EtOAc to recover the benzoate (5.03 g, 78% recovery) as a white solid.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.99 (d, 2H, j = 8.79 Hz), 6.86 (d, 2H, j = 8.79 Hz), 6.0 (m, 1H), 5.30 ( m, 2H), 4.80 (d, 2H, j = 5.68 Hz).
HPLC (50:50 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 6.17 min (97.2%).
MS (ESI) m / z: 179 (M + H)
GCMS m / z: 179 (M + H).
[0072]
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Synthesis of 1-propenyl ester 12b.
Ester 12b was synthesized as described for 12a and was obtained as a white solid (78% recovery).
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.77 (d, 2H, j = 7.41 Hz), 7.56 (d, 2H, j = 7.41 Hz), 7.43-7.28 (m, 4H), 6.96 (d, 2H, j = 8.28 Hz), 6.73 (d, 2H, j = 8.28 Hz), 5.94-5.80 (m, 1H), 5.35-5 .24 (m, 3H), 4.91 (s, 1H), 4.62 (m, 3H), 4.48-4.31 (m, 2H), 4.20 (t, 1H), 06 (t, 2H).
HPLC (50:50 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 11.75 minutes (99.99%)
[0073]
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Synthesis of 1-propenyl ester 12c.
Ester 12c was synthesized as described for 12a and was obtained as a white solid (80% recovery).
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 6.99 (d, 2H, j = 8.42 Hz), 6.73 (d, 2H, j = 8.42 Hz), 5.84 (m, 1H), 5.27 ( m, 2H), 4.60 (d, 2H, j = 5.86 Hz), 3.02 (m, 1H), 1.42 (s, 9H).
HPLC (30:70 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 8.95 minutes (97%).
[0074]
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Synthesis of 1-propenyl ester 12d.
Ester 12d was synthesized as described for 12a and was obtained as a white solid (80% recovery).
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.20-7.09 (m, 4H), 5.99-5.78 (m, 2H), 5.35-5.25 (m, 2H), 4.93-4. 85 (m, 1H), 4.61 (d, 2H, j = 5.86 Hz), 3.26-3.13 (m, 2H), 2.00 (s, 3H) ppm.
HPLC (30:70, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 5.63, 5.8 min.
MS (ESI) m / z: 286 (M + Na).
[0075]
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Synthesis of 1-propenyl ester 12e.
Ester 12e was synthesized as described for 12a to give a green oil.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.32-7.19 (m, 4H), 5.98-5.82 (m, 1H), 5.31-5.20 (m, 2H), 4.60 (d, 2H, j = 5.68 Hz), 3.64 (s, 2H) ppm. b
HPLC (30:70, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 4.33 min.
[0076]
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Synthesis of 1-propenyl ester 13.
To a 40 mL suspension of potassium p-aminobenzoate (2 g, 11.41 mmol) in DMF was added allyl bromide (0.99 mL, 11.41 mmol). The reaction was stirred overnight, then quenched with water and extracted several times with EtOAc. Combine the organic extracts together, wash with brine, and add MgSO 4₄, And evaporated to dryness to recover a yellow liquid. Crude product is 10: 1 CHCl₃Chromatography using a mixture of / EtOAc recovered 13 as a yellow solid.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.99 (d, 2H, j = 8.7 Hz), 7.08 (d, 2H, j = 8.7 Hz), 6.05-5.97 (m, 1H), 5.51-5.30 (m, 2H), 4.82-4.78 (m, 2H) ppm.
HPLC (Gradient 30-100% CH₃CN: H₂O-0.1% TFA 35 min or more): 7.68 min
MS (ESI) m / z: 178 (M + H), 200 (M + Na).
[0077]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 14a.
Diisopropylethylamine (0.3 mL, 0.3 mL, (1.68 mmol) at -15 ° C. The reaction was stirred at -15 ° C for 1 hour and at -5 ° C for 3 hours and quenched with saturated ammonium chloride. The resulting layers were separated. The organic layer is then washed with brine, MgSO₄, And evaporated to dryness to recover a yellow liquid. Crude product is 10: 1 CHCl₃Chromatography using a mixture of / EtOAc recovered 14a as a clear liquid.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.10 (d, 2H, j = 8.33 Hz), 7.34 (d, 2H, j = 8.33 Hz), 6.09-5.98 (m, 1H), 5.45-5.28 (m, 2H), 4.84-4.81 (m, 2H), 3.57 (t, 2H), 3.35-3.17 (m, 2H), 2. 84 (d, 3H, j = 13.55), 1.82-1.79 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -13.07 ppm.
HPLC (Gradient 30-100%, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 16.05 min.
[0078]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 14b.
Phosphoramidic dichloride 11 (0.45 g, 1.89 mmol) was dissolved in 2 mL of anhydrous THF and pre-cooled at -20 ° C. 12b (0.84 g, 1.89 mmol) and LiHMDS (2. 08 mmol) in 2 mL of anhydrous THF solution. The reaction was warmed to 0 ° C. and stirred for 5 hours. Subsequently, the reaction was quenched with saturated ammonium chloride and extracted with ethyl acetate. Combine the organic extracts together, wash with brine, and add MgSO 4₄And evaporated to dryness to recover a yellow oil. Crude product is 10: 1 CHCl₃Chromatography was performed using a mixture of / EtOAc to recover 14b (0.85 g, 70% recovery) as a yellow oil.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.77 (d, 2H, j = 7.42 Hz), 7.57 (d, 2H, j = 7.42 Hz), 7.44-7.29 (m, 4H), 7.19-7.08 (m, 4H), 5.91-5.81 (m, 1H), 5.34-5.25 (m, 3H), 4.66-4.60 (m, 3H) ), 4.49-4.33 (m, 2H), 4.21 (t, 1H), 3.58 (t, 2H), 3.27-3.20 (m, 2H), 3.17- 3.10 (m, 2H), 2.82 (d, 3H, j = 13.54 Hz), 1.81-1.78 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO) d: -12.64 ppm.
HPLC (70: 3O CH₃CN / H₂O-0.1% TFA solution): 6.833 min.
MS (ESI) m / z: 645/647 (M + H), 667/669 (M + Na).
[0079]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 14c.
14c was synthesized as described for 14b to give a pale yellow oil.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.16 (m, 4H), 5.8 (m, 1H), 5.3 (m, 2H), 4.6 (d, 2H, j = 5.68 Hz), 3. 58 (t, 2H), 3.2 (m, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.82 (d, 3H), 1.79 (m, 4H), 1.42 (s, 9H) ).
³¹P NMR (CDCl₃, TPO) d: -12.5 ppm.
HPLC (gradient 30-100%, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 9.83 min.
[0080]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 14d.
14d was synthesized in the same procedure as 14a. The reaction mixture was stirred overnight and a pale yellow oil was collected.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.20-7.09 (m, 4H), 5.99-5.78 (m, 2H), 5.35-5.25 (m, 2H), 4.93-4. 85 (m, 1H), 4.61 (d, 2H, j = 5.86 Hz), 3.58 (t, 2H), 3.26-3.13 (m, 4H), 2.83 (d , 3H, j = 13.55 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.96-1.75 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: 12.71
MS (ESI) m / z: 465/467 (M + H).
[0081]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 14e.
14e was synthesized in the same procedure as 13a.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.32-7.19 (m, 4H), 5.98-5.82 (m, 1H), 5.31-5.20 (m, 2H), 4.60 (d, 2H, j = 5.68 Hz), 3.64 (s, 2H), 3.58 (t, 2H), 3.25-3.18 (m, 2H), 2.83 (d, 3H, j) = 13.55 Hz), 1.80-1.78 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -12.66 ppm.
MS (ESI) m / z: 394/396 (M + H).
[0082]
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Synthesis of phosphoramidic monochloride 15.
Diisopropylethylamine (0.51 mL, 2.94) was added to 10 mL of an anhydrous dichloromethane solution containing phosphoramidic dichloride 11 (0.7 g, 2.94 mmol) and allyl ester 13 (0.52 g, 2.94 mmol). mmol) was added as appropriate. The reaction was stirred at reflux for 10 days, cooled to room temperature, diluted with dichloromethane and quenched with saturated ammonium chloride. Separate the layers and wash the organic layer with brine, MgSO 4₄, And evaporated to dryness to recover a yellow oil. Crude product is 10: 1 CHCl₃A light green oil (0.22 g, 20% recovery) was collected by chromatography using a mixture of / EtOAc.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.99 (d, 2H, j = 8.7 Hz), 7.08 (d, 2H, j = 8.7 Hz), 6.05-5.97 (m, 1H), 5.57 (d, 1H, j = 2.29 Hz), 5.51-5.30 (m, 2H), 4.82-4.78 (m, 2H), 3.54 (t, 2H) , 3.36-3.13 (m, 2H), 2.74 (d, 3H, j = 14.37 Hz), 1.87-1.64 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -11.28 ppm.
HPLC (30-100%, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 12.60 min.
MS (ESI) m / z: 379/381 (M + H), 401/403 (M + Na).
[0083]
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Synthesis of phosphoramidate 16.
Phosphoramidic monochloride 14a (0.63 g, 1.21 mmol) was dissolved in 2 mL of anhydrous THF, nitrofuryl alcohol (0.19 g, 1.33 mmol) precooled at -78 ° C and LiHMDS ( (1.46 mmol) in 2 mL of anhydrous THF solution via cannula. The reaction was brought to −40 ° C. and stirred for 5.5 hours. Saturated ammonium chloride was added to the reaction mixture and extracted with ethyl acetate. Combine the organic extracts together, wash with brine, and add excess MgSO₄And evaporated to dryness to recover a dark oil. Crude product is 10: 1 CHCl₃Chromatography using a mixture of / EtOAc recovered phosphoramidate 16 (0.30 g, 52% recovery) as a dark orange oil.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.05 (d, 2H, j = 8.6 Hz), 7.26 (m, 3H), 6.64 (d, 1H, j = 3.48 Hz), 6.05 ( m, 1H), 5.31 (m, 2H), 5.09 (d, 2H, j = 9.15 Hz), 4.82 (d, 2H, j = 5.49 Hz), 3.53 ( t, 2H), 3.1 (m, 2H), 2.72 (d, 3H, j = 10.25 Hz), 1.67 (m, 4H).
³¹P NMR (TPPO) d: -21.7
HPLC (60:40 CH₃CN / H₂O-0.1% solution of TFA): 7.117 min.
[0084]
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Synthesis of phosphoramidate 17.
Phosphoramidate 17 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.23 (d, 1H, j = 7.14 Hz), 8.07-7.91 (m, 3H), 7.66-7.50 (m, 2H), 7.30 (D, 2H, j = 8.7 Hz), 6.80 (s, 1H), 6.19-5.88 (m, 1H), 5.44-5.20 (m, 4H), 4. 92-4.79 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.48 (t, 2H), 3.24-2.97 (m, 2H) ), 2.71 (d, 3H, j = 10.25 Hz), 2.84-1.83 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -18.94 ppm.
HPLC (70:30 CH₃CN / H₂O-0.01% TFA solution): 7.967 minutes
MS (ESI) m / z: 584/586 (M + Na).
[0085]
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Synthesis of phosphoramidate 18.
Phosphoramidate 18 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.77 (d, 2H, j = 7.42 Hz), 7.57 (d, 2H, j = 7.42 Hz), 7.44-7.24 (m, 5H), 7.13-6.93 (m, 4H), 6.59 (d, 1H, j = 3.67 Hz), 6.07-5.70 (m, 1H), 5.47-5.23 ( m, 4H), 5.05 (d, 2H, j = 9.16 Hz), 4.74-4.61 (m, 3H), 4.56-4.28 (m, 2H), 4.20 (T, 1H), 3.51 (t, 2H), 3.20-2.99 (m, 4H), 2.70 (d, 3H, j = 10.34 Hz), 1.82-1. 53 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -18.92
HPLC (70:30 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA solution): 6.12 min.
[0086]
Synthesis of phosphoramidate 19.
Embedded image

Phosphoramidate 19 was synthesized in the same procedure as 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.28 (d, 1H, j = 3.66 Hz), 7.16 (m, 4H), 6.63 (d, 1H, j = 3.66 Hz), 5.8 ( m, 1H), 5.3 (m, 2H), 5.05 (d, 2H, j = 8.98 Hz), 4.6 (d, 2H), 3.58 (t, 2H), 3. 2 (m, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.82 (d, 3H), 1.79 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
³¹P NMR (TPPO) d: -19.2
HPLC (60:40 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 8.2 min.
[0087]
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Synthesis of phosphoramidate 20.
Phosphoramidate 20 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.28 (d, 1H, j = 3.75 Hz), 7.21-6.98 (m, 4H), 6.63 (d, 1H, j = 3.75 Hz), 6.05-5.77 (m, 2H), 5.44-5.19 (m, 2H), 5.06 (d, 2H, j = 9.15 Hz), 5.01-4.78 (m m, 1H), 4.72-4.52 (m, 2H), 3.66-3.42 (m, 2H), 3.23-2.99 (m, 4H), 2.71 (d, 3H, j = 10.34 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.83-1.60 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.03 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 minutes or more): 15.70 minutes
MS (ESI) m / z: 572/574 (M + H).
[0088]
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Synthesis of phosphoramidate 21.
Phosphoramidate 21 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.81 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 7.22-7.05 (m, 4H), 6.99 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 6.02-5.72 (m, 2H), 5.45-5.10 (m, 4H), 5.00-4.79 (m, 1H), 4.63-4.49 (m, 2H) ), 3.53 (t, 2H), 3.23-2.95 (m, 4H), 2.72 (d, 3H, j = 10.35 Hz), 2.00 (s, 3H), 1 .85-1.58 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.21 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 minutes or more): 17.20 minutes
MS (ESI) m / z: 588/590 (M + H), 610/612 (M + Na).
[0089]
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Synthesis of phosphoramidate 22.
Phosphoramidate 22 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.26-7.04 (m, 5H), 6.60 (d, 1H, j = 3.58 Hz), 5.99-5.75 (m, 1H), 5.43 −5.19 (m, 2H), 5.06 (d, 2H, j = 9.16 Hz), 4.72-4.48 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 51 (t, 2H), 3.18-2.96 (m, 2H), 2.71 (d, 3H, j = 10.26 Hz), 1.77-1.55 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.01 ppm.
HPLC (30-100%, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 15.50 min.
MS (ESI) m / z: 501/503 (M + H), 523/525 (M + Na).
[0090]
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Synthesis of phosphoramidate 23.
Phosphoramidate 23 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.80 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 7.33-7.09 (m, 4H), 6.99 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 6.08-5.68 (m, 1H), 5.46-5.07 (m, 4H), 4.78-4.39 (m, 2H), 3.63 (s, 2H), 3. 51 (t, 2H), 3.30-2.96 (m, 2H), 2.72 (d, 3H, j = 10.34 Hz), 1.87-1.48 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.21 ppm.
HPLC (Gradient 30-100%, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 20.17 min.
[0091]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 24.
Phosphoramidate 24 was synthesized by a procedure similar to that described for 16.
[0092]
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.969d, 2H, j = 8.6 Hz), 7.26 (d, 1H, j = 3.67 Hz), 6.99 (d, 2H, j = 8.6 Hz) ), 6.65 (d, 1H, j = 3.67 Hz), 6.16-5.84 (m, 1H), 5.51-5.19 (m, 3H), 5.09 (d, 2H, j = 9.43 Hz), 4.92-4.73 (m, 2H), 3.52 (t, 2H), 3.22-2.99 (m, 2H), 2.69 (d , 3H, j = 10.53 Hz), 1.85-1.61 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -15.60 ppm
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 12.60 min.
MS (ESI) m / z: 486/488 (M + H), 508/510 (M + Na).
[0093]
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Synthesis of phosphoramidate 25.
TolSO₂Na (0.29 g, 1.61 mmol) was dissolved in 2.5 mL of water, and phosphoramidate 16 (0.71 g, 1.47 mmol) and Pd (PPh₃)₄(0.08 g, 73.41 mmol) in 6 mL of a THF solution. The reaction was carried out with stirring at room temperature for 30 minutes. Diethyl ether was added to the reaction mixture and washed several times with water. The aqueous extracts were combined, washed with ether, acidified to pH 3 with 2% HCl and extracted with EtOAc. Combine the organic extracts, wash with brine, MgSO₄, And evaporated to dryness to recover phosphoramidate 25 (0.51 g, 78% recovery) as an orange foam.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.08 (d, 2H, j = 8.6 Hz), 7.31 (m, 3H), 6.66 (d, 1H, J = 3.67 Hz), 5.11 (d , 2H, j = 9.16 Hz), 3.53 (t, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.74 (d, 3H, j = 10.44 Hz), 1.7 (m , 4H).
³¹P NMR (TPPO) d: -20.4
HPLC (60:40 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA solution): 4.017 min.
[0094]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 26.
Phosphoramidate 26 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.32-8.22 (m, 1H), 8.13-7.98 (m, 3H), 7.64-7.45 (m, 2H), 7.33 (d, 2H, j = 8.7 Hz), 6.81 (s, 1H), 5.35 (d, 2H, j = 8.05 Hz), 3.95 (s, 3H), 3.93 (s, 1H) 3H), 3.49 (t, 2H), 3.25-2.97 (m, 2H), 2.73 (d, 3H, j = 10.25 Hz), 1.80-1.52 (m , 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -18.99 ppm
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 18.60 min.
MS (ESI) m / z: 544/546 (M + Na).
[0095]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 27.
Phosphoramidate 27 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.77 (d, 2H, j = 7.23 Hz), 7.58 (d, 2H, j = 7.23 Hz), 7.43-7.23 (m, 5H), 7.18-6.89 (m, 4H), 6.67-6.47 (m, 1H), 5.48-5.30 (m, 1H), 5.18-4.97 (m, 2H) ), 4.79-4.07 (m, 4H), 3.60-3.37 (m, 2H), 3.27-2.98 (m, 4H), 2.82-2.59 (m , 3H), 1.79-1.56 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.44, -19.63 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 17.93 min.
[0096]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 28.
Phosphoramidate 28 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.28 (d, 1H, j = 3.66 Hz), 7.16 (m, 4H), 6.63 (d, 1H, j = 3.66 Hz), 5.05 ( d, 2H, j = 8.98 Hz), 3.58 (t, 2H), 3.2 (m, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.82 (d, 3H), 1. 79 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
³¹P NMR (TPPO) d: -19.2 ppm.
HPLC (60:40 CH₃CN / H₂O-0.1% TFA): 4.65 min.
[0097]
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Synthesis of phosphoramidate 29.
Phosphoramidate 29 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.30-7.25 (m, 1H), 7.23-6.83 (m, 4H), 6.80-6.47 (m, 1H), 5.09 (d, 2H, j = 9.25 Hz), 5.01-4.59 (m, 2H), 3.76-3.33 (m, 2H), 3.36-2.98 (m, 4H), 2 .98-2.55 (m, 3H), 2.14 1.77 (d, 3H), 1.89-1.55 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.25, -19.43 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 minutes): 11.68 minutes.
MS (ESI) m / z: 554/556 (M + Na), 532/534 (M + H).
[0098]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 30.
Phosphoramidate 30 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.87-7.73 (m, 1H), 7.14-7.04 (m, 4H), 7.03-6.95 (m, 1H), 5.34-5. 18 (m, 2H), 5.11-4.96 (m, 1H), 4.95-4.81 (m, 1H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.26- 3.03 (m, 4H), 2.85-2.67 (m, 3H), 2.05-1.92 (m, 3H), 1.84-1.62 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.41, -19.61 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 minutes): 13.10 minutes.
MS (ESI) m / z: 548/550 (M + H).
[0099]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 31.
Phosphoramidate 31 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.26-7.04 (m, 5H), 6.60 (d, 1H, j = 3.58 Hz), 5.43-5.19 (m, 2H), 5.06 (D, 2H, j = 9.16 Hz), 3.62 (s, 2H), 3.51 (t, 2H), 3.18-2.96 (m, 2H), 2.71 (d, 3H, j = 10.26 Hz), 1.77-1.55 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.01 ppm.
[0100]
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Synthesis of phosphoramidate 32.
Phosphoramidate 32 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.80 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 7.33-7.09 (m, 4H), 6.99 (d, 1H, j = 4.12 Hz), 5.22 (d, 2H, j = 8.52 Hz), 3.63 (s, 2H), 3.48 (t, 2H), 3.30-2.96 (m, 2H), 2.73 (D, 3H, j = 10.25 Hz), 1.92-1.40 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.29 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 15.13 min.
[0101]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 33.
Phosphoramidate 33 was synthesized by a procedure similar to that described for 25.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 7.96 (d, 2H, j = 8.6 Hz), 7.26 (d, 1H, j = 3.67 Hz), 6.99 (d, 2H, j = 8.6). Hz), 6.65 (d, 1H, j = 3.67 Hz), 6.45-6.25 (m, 1H), 5.09 (d, 2H, j = 9.43 Hz), 52 (t, 2H), 3.22-2.99 (m, 2H), 2.69 (d, 3H, j = 10.53 Hz), 1.85-1.61 (m, 4H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -15.40 ppm
HPLC (30-100% gradient CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 9.13, 9.37 min.
MS (ESI) m / z: 444/446 (M-H).
[0102]
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Synthesis of prodrug 35.
Phosphoramidate 25 (0.105 g, 0.23 mmol) was dissolved in 2 mL of anhydrous DMF, and benzylamine 34 (0.0735 g, 0.23 mmol), 4-methylmorpholine (0.06 mL, 0 .588 mmol) and HOBT (0.0382 g, 0.28 mmol) in 3 ml of anhydrous DMF at 0 ° C. via cannula, followed by EDCI (0.0541 g, 0.28 mmol). The reaction was warmed to room temperature and stirred overnight. Water was added to the reaction mixture, and extracted with ethyl acetate. Combine the extracted organics and wash with saturated sodium bicarbonate, water, brine, MgSO₄, And evaporated to dryness to recover a dark orange oil. The product was washed with MeOH: H₂Chromatography on reversed phase silica using a 75:25 mixed solution of O gave 35 as a white foam (58.7 mg, 35% recovery).
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.25 (d, 1H), 7.72 (d, 2H, j = 8.42 Hz), 7.50 (d, 1H), 7.24 (m, 3H), 6.95 (D, 2H, j = 8.42 Hz), 6.63 (d, 1H, j = 3.66 Hz), 5.28 (t, 1H), 5.07 (d, 2H, j = 9.16 Hz) ), 3.93 (d, 2H), 3.52 (t, 2H), 3.09 (m, 2H), 2.70 (d, 3H), 1.87-1.58 (m, 14H). , 1.48-0.85 (m, 4H).
³¹P NMR (TPPO) d: -21.2 ppm.
HPLC (60:40 CH₃CN / H₂O-0.1% solution of TFA): 8.817 min.
MS (ESI) m / z: 727/729 (M + Na), 705/707 (M + H).
MS high resolution (ESI) m / z: Calculated: 705.2456; Found: 705.2432.
[0103]
Embedded image

Synthesis of phosphoramidate 36.
Phosphoramidate 26 (0.14 g, 0.28 mmol), benzylamine 34 (0.08 g, 0.31 mmol) and PyBOP (pre-cooled diisopropylethylamine (0.11 mL, 0.61 mmol)) (0.14 g, 0.28 mmol) in 2 mL of anhydrous DCM at 0 ° C. The reaction was carried out with stirring at 0 ° C. for 10 minutes and at room temperature for 30 minutes. The reaction was quenched with saturated ammonium chloride and DCM. The layers were separated and the organic layer was washed with brine, MgSO₄, And evaporated to dryness to recover a pale yellow oil. The crude product was chromatographed using a 9: 1 EtOAc / MeOH mixture to give 36 (0.16 g, 75% yield) as a white foam.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.34-8.20 (m, 2H), 8.11-8.04 (m, 1H), 7.92-7.78 (bs, 1H), 7.71 (d, 2H, j = 8.60 Hz), 7.63-7.43 (m, 3H), 7.28-7.24 (m, 2H), 6.95 (d, 1H, j = 8.6 Hz) ), 6.8 (s, 1H), 6.27 (d, 1H, j = 7.79 Hz), 5.84-5.67 (bs, 1H), 5.43-5.16 (m, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.47 (t, 2H), 3.21-2.94 (m, 2H), 2.69 (d, 3H) , J = 10.52 Hz), 1.96-1.49 (m, 14H), 1.41-0.93 (m, 5H).
³¹P NMR (TPPO) d: -18.82 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 24.05 min.
MS (ESI) m / z: 802/804 (M + Na), 780/782 (M + H).
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 780.3181; Found: 780.3168.
[0104]
Embedded image

Synthesis of prodrug 37.
Cerium ammonium nitrate (0.11 g, 0.21 mmol) was added to 1 mL of H₂Dissolve in O, 3.7 mL of acetonitrile and 1.9 mL of H₂A solution of phosphoramidate 36 (0.08 g, 99.83 umol) in O was added slowly. The reaction was stirred for 1.5 hours, then quenched by the addition of saturated ammonium chloride and extracted with EtOAc. Combine the organic layers, wash with brine, and add MgSO₄, And evaporated to dryness to recover a pale yellow oil. The crude product was chromatographed using a mixture of 9: 1 EtOAc / MeOH to give 37 as a pale yellow foam (0.03 g, 65% recovery).
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.34-8.21 (m, 2H), 8.11-8.04 (m, 1H), 7.92-7.78 (bs, 1H), 7.72 (d, 2H, j = 8.60 Hz), 7.28-7.24 (m, 2H), 6.95 (d, 2H, j = 8.60 Hz), 6.94 (d, 1H, j = 8) 6.6 (s, 1H), 6.41 (d, 1H, j = 8.6 Hz), 5.84-5.67 (bs, 1H), 5.43-5.16 (M, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.91 (s, 5H), 3.47 (t, 2H), 3.21-2.94 (m, 2H), 2.69 ( d, 3H, j = 10.52 Hz), 1.96-1.49 (m, 14H), 1.41-0.93 (m, 5H).
³¹P NMR (TPPO) d: -19.0
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, over 35 min): 21.45 min.
MS (ESI) m / z: 772/774 (M + Na), 750/752 (M + H).
MS high resolution (ESI) m / z: calc .: 750.2711; found: 750.2708.
[0105]
Embedded image

Synthesis of prodrug 38.
Prodrug 38 was synthesized by a procedure similar to that described for 36.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.26-8.11 (m, 1H), 8.09-7.99 (m, 1H), 7.95-7.76 (m, 1H), 7.24--7. 09 (m, 2H), 7.08-6.99 (m, 2H), 6.96-6.82 (m, 1H), 6.72-6.55 (m, 1H), 6.50- 6.20 (m, 1H), 6.18-6.54 (m, 1H), 5.16-4.82 (m, 3H), 4.79-4.46 (m, 1H), 4. 03-3.78 (m, 2H), 3.62-3.43 (m, 2H), 3.15-2.81 (m, 5H), 2.80-2.51 (m, 3H), 2.04-1.89 (m, 3H), 1.87-1.56 (m, 10H), 1.49-0.90 (m, 8H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -18.94 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 19.03, 19.25 min.
MS (ESI) m / z: 790/792 (M + H), 812/814 (M + Na)
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 790.2984; Found: 790.2981.
[0106]
Embedded image

Synthesis of prodrug 39.
Prodrug 39 was synthesized by a procedure similar to that described for 35.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.21-8.09 (m, 1H), 8.08-7.98 (m, 1H), 7.93-7.71 (m, 2H), 7.23-7. 04 (m, 6H), 6.66-6.47 (m, 1H), 6.36-6.16 (m, 1H), 6.11-5.80 (m, 1H), 5.30- 5.15 (m, 2H), 5.14-4.81 (m, 1H), 4.75-4.48 (m, 1H), 4.02-3.85 (m, 2H), 3. 62-3.42 (m, 2H), 3.13-2.82 (m, 5H), 2.82-2.58 (m, 3H), 2.04-1.92 (m, 3H), 1.84-1.53 (m, 9H), 1.51-0.87 (m, 9H) ppm.
³¹P NMR (TPPO) d: -19.16 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 minutes or more): 20.17, 20.35 minutes.
MS (ESI) m / z: 806/808 (M + H), 828/830 (M + Na)
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 806.2755; Found: 806.2758.
[0107]
Embedded image

Synthesis of prodrug 40.
Prodrug 40 was synthesized by a procedure similar to that described for 35.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.10-8.00 (m, 1H), 7.99-7.86 (m, 1H), 7.45-7.09 (m, 7H), 6.98-6. 85 (m, 1H), 6.69-6.56 (m, 1H), 6.05-5.89 (m, 1H), 5.87-5.69 (m, 1H), 5.19- 4.95 (m, 3H), 4.02-3.81 (m, 2H), 3.64-3.29 (m, 4H), 3.26-2.92 (m, 2H), 2. 87-2.52 (m, 3H), 2.02-1.57 (m, 11H), 1.54-0.89 (m, 6H).
³¹P NMR (TPPO) d: -18.91, -18.99 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 20.65 min.
MS (ESI) m / z: 719/721 (M + H), 741/743 (M + Na)
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 719.2613; Found: 719.2600.
[0108]
Embedded image

Synthesis of prodrug 41.
Prodrug 41 was synthesized as described for 35.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.14-8.00 (m, 1H), 7.93-7.80 (m, 1H), 7.81-7.69 (m, 1H), 7.42-7. 30 (m, 1H), 7.27-7.06 (m, 5H), 7.04-6.93 (m, 1H), 6.93-6.81 (m, 1H), 6.23- 5.99 (m, 2H), 5.27-5.15 (m, 2H), 5.13-4.93 (m, 1H), 3.99-3.81 (m, 2H), 3. 60-3.38 (m, 4H), 3.21-2.98 (m, 2H), 2.85-2.62 (m, 3H), 1.92-1.59 (m, 11H), 1.50-0.97 (6H).
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO) d: -19.26
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 21.77 min.
MS (ESI) m / z: 735/737 (M + H), 757/759 (M + Na).
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 735.2384; Found: 735.2358.
[0109]
Embedded image

Synthesis of prodrug 42.
Prodrug 42 was synthesized as described for 35.
¹H NMR (CDCl₃, TMS) d: 8.22 (d, 1H, j = 2.01 Hz), 7.96-7.89 m, 1H), 7.61 (d, 2H, j = 8.15 Hz), 7 .56-7.40 (m, 1H), 7.25-7.13 (m, 1H), 6.92 (d, 2H, j = 8.15 Hz), 6.82-6.66 (m , 1H), 6.66-6.53 (m, 1H), 6.27-6.00 (m, 2H), 5.35-5.10 (m, 1H), 5.03 (d, 2H). , J = 9.25 Hz), 3.90 (d, 2H, j = 5.86 Hz), 3.48 (t, 2H), 3.18-2.92 (m, 2H), 2.64 (D, 3H, j = 10.53 Hz), 1.94-1.47 (m, 10H), 1.38-0.98 (m, 7H) ppm.
³¹P NMR (CDCl₃, TPPO) d: -14.96 ppm.
HPLC (30-100% gradient, CH₃CN / H₂O-0.1% TFA, 35 min or more): 17.28 min.
MS (ESI) m / z: 704/706 (M + H), 726/728 (M + Na).
MS High Resolution (ESI) m / z: Calculated: 704.2616; Found: 704.2633.
L1210 Murine leukemia cell growth inhibition
Stock solutions of drug were prepared in absolute ethanol, and serially diluted drug was prepared in ethanol. Also, L1210 cells were suspended in Fisher's medium supplemented with 10% horse serum, 1% glutamine, and 1% antibiotic solution to a final concentration of 3-6 × 10⁴10 mL of cell / mL cell suspension was made. Appropriate amounts of drug solution were added to the cell suspension and incubated for 2, 8, 24, or 48 hours. The cells were spun down in a centrifuge, resuspended in fresh medium without drug and returned to the incubator. 48 hours after the start of the treatment with the drug, the final cell number was measured. This data is expressed as the cell number vs.. Log (drug concentration) was analyzed by an S-shaped curve fit, and the results were analyzed by IC.₅₀(Drug concentration required to inhibit cell growth by 50% relative to control value).
[0110]
[Table 3]

[0111]
Luciferase inhibition in transfected J77 cells
J77 cells (2 × 10 5 in 500 mL of RPMI medium without FBS)⁷Cells) were transfected with 15 mg of NF-AT-luciferase plasmid. Cells were transferred to flasks containing 10 mL of complete RPMI medium and incubated for 24 hours. The cells were then spun down in a centrifuge, resuspended in 12 mL complete RPMI medium and split into 6-well plates (2 mL / well). Stock solutions of drug dissolved in DMSO were prepared, and each well was treated with different concentrations and incubated for 2 hours. Each well was then treated with 10 mL of 115 mL of FBS-free RPMI plus 1.25 mg of PMA and 9 mg of ionomycin before adding 2 mg of anti-CD3 antibody. Cells were incubated for 6 hours, spun down, washed with PBS, lysed for 15 minutes, and centrifuged. The supernatant was collected and stored at -78 C overnight. Luciferase activity was measured on a mixture of 50 mL of luciferase substrate and 10 mL of supernatant using a luminometer.
[0112]
[Table 4]

[0113]
L1210, LM, and LM ( TK −) Cell tritium assay
Stock solutions of drug were prepared in absolute ethanol. L1210 cells were suspended in Fisher's medium, LM and LM (TK-) cells were suspended in MEM (min essential medium) to a final concentration of 11.24 × 10⁶It was prepared to be cells / mL. After placing this cell suspension (445 μL) in an Eppendorf tube, 5 μL of the drug solution was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. Tritium release reaction is 1 mCi [5-³[H] The procedure was started by adding 50 μL of a serum-free medium containing a 0.5 mM dCyt solution to which dCyt was added. Thereafter, the mixture was incubated for 60 minutes in a shaking water bath with a stirring device at 37 ° C. The reaction was terminated by adding 100 μL of the reaction mixture to an Eppendorf tube containing 100 μL of a 20% mixture in which activated carbon was suspended in a 4% perchloric acid solution. The tube was vortexed vigorously and then centrifuged in a small centrifuge.
[0114]
Thereafter, the radioactivity of 100 μL of the supernatant was measured using a scintillation spectrometer. This data is referred to as CMP vs. Log (drug concentration) was analyzed by an S-shaped curve fit, and the results were analyzed by IC.₅₀(Concentration of drug that inhibits cell growth to 50% of control value).
[0115]
[Table 5]

[0116]
Pharmaceutical preparation
The following parenteral preparations were prepared for use in treating cancer.
[0117]

Claims (20)

Chemical formula R _r CH ₂ OP (halo) NR (CH ₂ ) _n X
A compound that is
(In the above formula,
R is C ₁ -C ₄ alkyl or (CH ₂ ) _n X;
n is 4 or 5;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) The compound according to claim 1, wherein n is 4. The compound according to claim 1, wherein n is 5. The compound according to claim 1, wherein R is a methyl group. The compound of claim 1, wherein halo is chlorine. The compound of claim 1, wherein X is chlorine or bromine. A method of preparing a phosphoramidate prodrug to enhance intracellular delivery of a drug, as a phosphate ester or amide,
Formula _{R r CH 2 OP (Z-} Drug) NR (CH 2) X
Under conditions that lead to the formation of an intermediate compound of formula R _r CH ₂ OP (halo) NR (CH ₂ ) _n X
Reacting a compound of formula (I) with a drug compound having a hydroxyl or amino functional group (Drug-ZH);
The intermediate is oxidized to form the chemical formula R _r CH ₂ OP (O) (Z-Drug) NR (CH ₂ ) _n X
A method of forming a phosphoramidate prodrug of
(In the above formula,
R _is alkyl or C 1 -C ₄ - be _{(CH 2) n} X;
n is 4 or 5;
Z is O or N;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) The method of claim 7, wherein said Drug-ZH is an amino acid, or an active peptide or peptidomimetic. The Drug-ZH has the chemical formula

The method according to claim 8, wherein the peptide mimetic is
(In the above formula,
Z is O or N;
q and k are each independently selected from 1 or 0;
B is, H, amino, protected amino or alkanoylamino of _C 1 -C _4,. ) The method of claim 7, wherein said Drug-ZH is a biologically active nucleotide analog. A phosphoramidate compound formed from a hydroxyl function or an amino function of the general formula Drug-ZH,
The prodrug has the chemical formula R _r CH ₂ OP (O) (Z-Drug) NR (CH ₂ ) _n X
A phosphoramidate compound, which is a compound of the formula:
(In the above formula,
R _is alkyl or C 1 -C ₄ - be _{(CH 2) n} X;
n is 4 or 5;
Z is O or N;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) The prodrug of claim 11, wherein the Drug is an amino acid, or an active peptide or peptidomimetic. The Drug-ZH has the chemical formula

The method according to claim 12, wherein the peptide mimetic is
(In the above formula,
Z is O or N;
q and k are independently selected from 1 or 0;
B is, H, amino, protected amino or alkanoylamino of _C 1 -C _4,. ) 12. The prodrug of claim 11, wherein said Drug is a biologically active nucleotide analog. Chemical formula R _r CH ₂ OP (O) _m (halo) NR (CH ₂ ) _n X
A method for preparing a compound of the formula
In each case in the presence of an acid scavenger, the chemical formula P (O) _m halo ₃
A compound of formula 1) with 1) an alcohol of formula R _r CH ₂ OH and 2) an amine of formula HNR (CH ₂ ) _n X.
(In the above formula,
m is 0 or 1;
R _is alkyl or C 1 -C ₄ - be _{(CH 2) n} X;
n is 4 or 5;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) Formula Drug-ZPO ₃ ^- formula _R r _CH 2 OP for enhancing intracellular delivery of compounds (O) (Z-Drug) NR (CH 2) n X
A method for preparing a phosphoramidate prodrug of
Under the conditions leading to the formation of the prodrug, the chemical formula R _r CH ₂ OP (O) (halo) NR (CH ₂ ) _n X
And a drug compound having a hydroxyl or amino functional group of the formula Drug-ZH.
(In the above formula,
R _is alkyl or C 1 -C ₄ - be _{(CH 2) n} X;
n is 4 or 5;
Z is O or N;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) A pharmaceutical composition comprising a phosphoramidate compound formed from a drug compound having a hydroxyl or amino function of the general formula Drug-ZH, and a pharmaceutically acceptable carrier therefor,
The prodrug has the formula R _r CH ₂ OP (O) (Z-Drug) NR (CH ₂ ) _n X
A pharmaceutical composition, which is a compound of the formula:
(In the above formula,
R _is alkyl or C 1 -C ₄ - be _{(CH 2) n} X;
n is 4 or 5;
Z is O or N;
X is an electrophilic group that can be nucleophilically substituted from the carbon atom attached to X;
halo is chlorine, bromine or iodine;
The R _r CH ₂ — group is a biologically unstable ester forming group. ) 18. The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein Drug-ZH is an amino acid, or a biologically active peptide or peptidomimetic. Drug-ZH has the chemical formula:

The pharmaceutical composition according to claim 18, which is a peptidomimetic of the formula: (In the above formula,
Z is O or N;
q and k are independently selected from 1 or 0;
B is, H, amino, protected amino or alkanoylamino of _C 1 -C _4,. ) 18. The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein said Drug-ZH is a nucleotide analog.