JP2004537265A - Oxazolidinone photoaffinity probes, their uses and compounds - Google Patents

Abstract

A novel method for identifying a biological target of a compound having antimicrobial activity is disclosed. In addition, novel methods for identifying compounds that may have antimicrobial activity are also disclosed.

Description

【００３０】
ＬｅｐＡのフラグメントは、長さにおいて、約１０〜約５５０のアミノ酸、より好ましくは約２５〜約５００のアミノ酸、より好ましくは約５０〜約４００のアミノ酸、より好ましくは約１００〜約３００のアミノ酸およびより好ましくは約１５０〜約２５０のアミノ酸であり得る。好ましくは、フラグメントはＬｅｐＡのアミノ酸配列の近接のアミノ酸を含む。ＬｅｐＡは、上述した方法により単離されうるものであり、または上述の生物のいずれかから単離されうるものである。ＬｅｐＡは、例えば、Ｍａｒｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、７２０６−１３に記載されているように単離されうる。この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的はＬ２７（１１ｋＤａリボソームタンパク質）またはそれらのフラグメントである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３２】
【化２】

【００３３】
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３４】
【化３】

【００３５】
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３６】
【化４】

【００３７】
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含む。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３８】
【化５】

【００３９】
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む。Ｌ２７を記載した代表的な参考文献は、Ｃｈｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９７５、５９、９６−９９であり、本文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。Ｌ２７のフラグメントは、長さにおいて、約１０〜約９０のアミノ酸、より好ましくは約１５〜約７５のアミノ酸、より好ましくは約２０〜約５０のアミノ酸、より好ましくは約２５〜約４０のアミノ酸、そしてより好ましくは約３０〜約３５のアミノ酸であり得る。好ましくは、フラグメントはＬ２７のアミノ酸配列の近接のアミノ酸を含む。Ｌ２７は上記の方法により単離されうるものであり、または標準的方法により単離または製造されうるものであり、および上記の生物のいずれかから単離されうるものである。
【００４０】
本発明のいくつかの実施態様において、プローブは、上記の生物学上の標的のいずれかの組み合わせを含む、複数の異なる生物学上の標的と接触させられる。
生物学上の標的は、試験化合物とも接触させられる。試験化合物の存在下および非存在下でのプローブと生物学上の標的の間の結合の量が比較される。結合は
、当該技術分野の当業者に知られている多数の方法により、定量的または定性的に測定されうる。試験化合物の存在下でのプローブと生物学上の標的の間の結合の量の減少は、プローブの生物学上の標的に対する結合を試験化合物が阻害することを示している。複数の試験化合物を一度にスクリーニングすることも可能である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施態様において、試験化合物は、哺乳類の細胞を用いてさらに試験されうる。非哺乳類の細胞（例えば、細菌、菌類など）における生物学上の標的に対するプローブの結合を阻害することができるが、哺乳類の細胞における生物学上の標的に対するプローブの結合を阻害しえないか、または阻害してもとるに足らない程度である試験化合物は、哺乳類の治療における理想的な候補となりうる。このような場合には、試験化合物は、宿主の哺乳類の細胞に対して、たとえあるとしてもほんのわずかな影響しか与えない一方で、微生物または細菌に対して活性を有する化合物であろう。本明細書に記載した方法は、特に、真核細胞における抗生物質としての活性のある化合物の毒性の性質についての分子的説明に有用である。特別な場合においては、感受性の真核細胞または細胞内器官が、細菌細胞について定義したのと同様にインキュベートおよび処理され、関連する標的が特定される。このことにより、活性のある抗生物質の発見のための、以下に述べるスクリーニング、アッセイおよび構造に基づく設計の限定が可能となり、否定的な選択を行うための手法（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）として使用される場合は、新しい抗細菌剤またはその他の治療剤の最適化が可能になる。
【００４２】
本明細書に記載されるいずれかの方法において使用されうるフォトアフィニティープローブは以下に示され、限定はされないが、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩ、またはそれらの任意の組み合わせを含むフォトアフィニティープローブを包含する。Ｃ−５における好ましい立体配置は（Ｓ）である。本発明の化合物が更なる不斉中心を有しうること、および光学活性体として、またはラセミ体として単離されうることは、当該技術分野の当業者には理解されるであろう。本発明は、本発明の化合物のいかなるラセミ体、光学活性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマーなど）互変異性体、立体異性体、またはそれらの混合物をも包含する。本発明の好ましい化合物としては、³Ｈ（Ｔ₃）、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉのいずれかひとつの放射性元素を有する。しかし、化学構造式は描かれる化合物のすべての同位体型を含むものと理解される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式Ｉを含む。
【００４４】
【化６】

【００４５】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃である。好ましい化合物は、１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ¹は、Ｈ、ＦまたはＩである。Ｒ²は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ¹⁶は、ＨまたはＦである。Ｒ¹⁷は、ＨまたはＦである。Ｒ³は、ＨまたはＣ₁−Ｃ₈アルキルである。Ｌは結合または−ＯＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）である。Ｑは、
【００４６】
【化７】

【００４７】
であり、式中、Ｒ⁴は、Ｈ、ＣＨ₃，ＣＨ₂ＣＨ₃またはシクロプロピルである。Ｚは、ＯまたはＳである。式Ｉを含む化合物には、その薬学的に許容な塩も含まれる。
式Ｉを含む好ましい化合物は次のような置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、Ｒ³はＨ、Ｒ⁴はＣＨ₃である。より好ましくは、式Ｉの化合物は、限定はされないが、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル ４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−^l25Ｉ−ベンゾエート、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−ｌ−ピペラジニル］−２−オキソエチル ４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾエート、およびＮ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドを含む。
【００４８】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＩを含む。
【００４９】
【化８】

【００５０】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃である。好ましい化合物は、１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ¹は、Ｈ、ＦまたはＩである。Ｒ²は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ¹⁶は、ＨまたはＦである。Ｒ¹⁷は、ＨまたはＦである。Ｑは、
【００５１】
【化９】

【００５２】
である。式中、Ｒ⁴は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃またはシクロプロピルである。Ｚは、ＯまたはＳである。式ＩＩを含む化合物は、その薬学的に許容な塩もまた含む。
式ＩＩを含む好ましい化合物は、次のような置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、およびＲ⁴はＣＨ₃である。より好ましくは、式ＩＩの化合物は、限定はされないが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ₃−アセトアミド、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ₃−アセトアミド、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］エタン−³⁵Ｓ−チオアミド、およびＮ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード−¹²⁵Ｉ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドを含む。
【００５３】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＩＩを含む。
【００５４】
【化１０】

【００５５】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃である。好ましい化合物は１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ⁵は、
【００５６】
【化１１】

【００５７】
である。式中、Ｒ⁶は、Ｈ、Ｎ₃、ハロゲン、ＮＨ₂，ＯＨ、ＳＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₄ジアルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ニトリル、カルボキサミド、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルチオ、またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシカルボニルである。Ｐは、
【００５８】
【化１２】

【００５９】
である。式中、ＺはＯまたはＳである。Ｒ⁷は、
【００６０】
【化１３】

【００６１】
である。式中、Ｒ¹はＨ、ＦまたはＩである。Ｒ²は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ¹⁶は、ＨまたはＦである。Ｒ¹⁷は、ＨまたはＦである。式ＩＩＩを含む化合物は、その薬学的に許容な塩をもまた含む。
【００６２】
式ＩＩＩを含む好ましい化合物は、次の置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、およびＲ⁶はＨである。より好ましくは、式ＩＩＩの化合物は、限定はされないが、（２Ｅ）−３−（４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−フェニル）−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−プロペンアミド、４−アジド−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−ヒドロキシ−５−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンズアミド］、およびＮ−（４−アジドフェニル）−Ｎ’−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−³⁵Ｓ−チオウレアを含む。
【００６３】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＶ：
【００６４】
【化１４】

【００６５】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃であり；Ｒ⁸はＨ、ＦまたはＩであり；Ｒ⁹はＨ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ¹⁸は、ＨまたはＦであり；Ｒ¹⁹は、ＨまたはＦであり；Ｒ¹⁰は、ＨまたはＣ₁−Ｃ₈アルキルであり；Ｌは結合または−ＯＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）であり；Ｑは、
【００６６】
【化１５】

【００６７】
（式中、Ｒ¹¹は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃またはシクロプロピルであり；およびＺは、ＯまたはＳである。）である。）、もしくは、その薬学的に許容な塩を含む。
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式Ｖ：
【００６８】
【化１６】

【００６９】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃であり；Ｒ¹²はＮ₃または
【００７０】
【化１７】

【００７１】
（式中、Ｒ⁸は、Ｈ、ＦまたはＩであり；Ｒ⁹は、Ｈ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ¹⁸は、ＨまたはＦであり；Ｒ¹⁹は、ＨまたはＦである。）であり；およびＱは
【００７２】
【化１８】

【００７３】
（式中、Ｒ¹¹は、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃またはシクロプロピルであり；Ｚは、ＯまたはＳである。）である。）、もしくはその薬学的に許容な塩を含む。
本発明のいくつかの実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＶＩ：
【００７４】
【化１９】

【００７５】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ₃であり；Ｒ¹³は、
【００７６】
【化２０】

【００７７】
（式中、Ｒ¹⁴は、Ｈ、Ｎ₃、ハロゲン、ＮＨ₂，ＯＨ、ＳＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₄ジアルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ニトリル、カルボキサミド、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルチオ、またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシカルボニルである。）であり；およびＰは、
【００７８】
【化２１】

【００７９】
（式中、Ｚは、ＯまたはＳであり；およびＲ¹⁵は、
【００８０】
【化２２】

【００８１】
（式中、Ｒ⁸は、Ｈ、ＦまたはＩであり；およびＲ⁹は、Ｈ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ¹⁸は、ＨまたはＦであり；およびＲ¹⁹は、ＨまたはＦである。）である。）である。）、もしくはその薬学的に許容な塩を含む。
【００８２】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩで示されるフォトアフィニティープローブを調製する方法は、以下の合成式で表される。示される合成方法は、事実上単なる代表例にすぎず、別法も存在し、場合によってはより好ましい場合もあり得ることは、当該技術分野の当業者には明らかであろう。
【００８３】
式ＩおよびＩＶの非放射性化合物は、反応式ＡおよびＢに示される方法により調製される。反応式Ａに示されるように、安息香酸部分（Ａ₁）の適当なヒドロキシアセチルピペラジンフラグメント（Ａ₂）とのカップリングにより、式ＩにおいてＬが−ＯＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）である化合物Ａ₃が合成されうる。カップリングは、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または当該技術分野の当業者によく知られているそのほかの試薬により達成される。適当な安息香酸フラグメントは文献において既知の方法で製造されうる（Ｄｕｐｕｉｓ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、６５、２４５０−２４５３；Ｓｈｕ、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７。これらの文献の各々はその全体を参照することにより本明細書に援用される。）。適当なヒドロキシアセチルピペラジンフラグメントもまた、文献において既知の方法で製造されうる（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，５４７，９５０；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；Ｓｎｙｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１。これらの文献の各々はその全体を参照することにより本明細書に援用される。）。化合物Ａ₃への¹²⁵Ｉの取り込みのための方法は、反応式ＣおよびＤに示される。化合物Ａ₁およびＡ₃が、酸の置換基のオルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷の置換基を有する場合（式Ｉおよび式ＩＶのように）にも、反応式Ａは用いることができる。
【００８４】
反応式Ａ：
【００８５】
【化２３】

【００８６】
式中のＬが結合である、式ＩおよびＩＶの非放射性化合物は、反応式Ｂに示す合成経路によって調製される。適当な安息香酸フラグメント（反応式ＡのＡ₁）は、適当なピペラジン（Ｂ₂）とテトラヒドロフラン中で１，１−カルボニルジイミダゾールを用いてカップリングされ、目的の化合物（Ｂ₃）を与える。当該技術分野の当業者によって知られているその他のカップリングの方法も使用可能である。ピペラジンフラグメントは、文献既知の方法により作られる（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、米国特許Ｎｏ．５，７００，７９９、この文献は全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｎｙｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１。）。化合物Ｂ₃への¹²⁵Ｉの取り込みのための方法は、反応式ＣおよびＤに示される。化合物Ｂ₃が、アミド置換基のオルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷の置換基を有する場合（式Ｉおよび式ＩＶのように）にも、反応式Ｂは用いることができる。
【００８７】
反応式Ｂ：
【００８８】
【化２４】

【００８９】
放射性ヨウ素は、反応式ＣおよびＤに示される方法により、式ＩおよびＩＶの化合物に取り込まれる。式Ｉの化合物Ｃ₂（式中、Ｒ¹はＯＨであり、およびＲ²は¹²⁵Ｉである。）は、式Ｉの化合物Ｃ₁（反応式ＡおよびＢの方法に従って調製される。）とＮａ¹²⁵Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により調製される。
【００９０】
反応式Ｃ：
【００９１】
【化２５】

【００９２】
あるいは、式ＩおよびＩＶの化合物Ｄ₃（式中、Ｒ¹はＨであり、およびＲ²は¹²⁵Ｉである。）は、反応式Ｄに示されるように調製される。化合物Ｄ₁（反応式ＡおよびＢに示される方法により調製される）のヘキサメチルジチンとの反応により、スタナンＤ₂が得られる。Ｄ₂とＮａ¹²⁵Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応によりＤ₃が導かれる。
【００９３】
反応式Ｄ：
【００９４】
【化２６】

【００９５】
式ＩＩおよびＶの非放射性化合物は、反応式Ｅに示される方法により調製される。適当なビフェニルニトロフラグメント（Ｅ₁）は、水素ガスおよびパラジウム触媒存在下還元され、適当なビフェニルアニリンフラグメント（Ｅ₂）を与える。当該技術分野の当業者によく知られている他の還元方法もまた使用できる。アジド部分（Ｅ₃）への変換は、当該技術分野の当業者によく知られた条件を用いての、適当なジアゾニウム塩のアジ化ナトリウムによる置換反応によって達成される。適当なニトロフラグメント（Ｅ₁）は、文献において既知の方法（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，６５４，４３５、この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｙｎｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１）、または当該技術分野の当業者によく知られた他の方法により調製されうる。式ＩＩおよびＶの化合物への放射性元素の導入は、反応式Ｆ、ＧおよびＨに示される。化合物Ｅ₁、Ｅ₂およびＥ₃が、オルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷、またはＲ¹⁸およびＲ¹⁹の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｅは用いることができる。
【００９６】
反応式Ｅ：
【００９７】
【化２７】

【００９８】
反応式Ｆは、式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ⁴はＣＨ₃である。）へのトリチウムの取り込みのための方法を示す。Ｆ₁（反応式Ｅに従って調製される）と６Ｎ ＨＣｌおよびメタノールとの反応により、遊離のアミンＦ₂が得られる。Ｆ₂と、トリチウム化した酢酸ナトリウムおよびカップリング試薬との反応により、トリチウム化アセトアミドＦ₃が得られる。適したカップリング試薬は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフホスフェートおよびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサホスフェートを含む。他の許容なカップリング試薬は、当該技術分野の当業者によって知られている。あるいは、トリチウム化された無水酢酸および適当な塩基は、トリチウム化された酢酸ナトリウムおよびカップリング試薬の代わりに使用することができる。式ＩＩおよびＶ（式中、Ｑはイソキサゾールである。）の化合物へのトリチウムの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｆ₁、Ｆ₂およびＦ₃が、オルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷、またはＲ¹⁸およびＲ¹⁹の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｆは用いることができる。
【００９９】
反応式Ｆ：
【０１００】
【化２８】

【０１０１】
反応式Ｇは、式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＳであり、およびＲ⁴はＣＨ₃である。）への³⁵Ｓの取り込みのための方法を示す。Ｆ₂（反応式Ｆ由来）と、エチル ³⁵Ｓ−ジチオアセテートとの反応により、³⁵Ｓ−チオアセトアミド、Ｇ₂が得られる。式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはイソキサゾールである。）への³⁵Ｓの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｇ₂が、オルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷、またはＲ¹⁸およびＲ¹⁹の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｇは用いることができる。
【０１０２】
反応式Ｇ
【０１０３】
【化２９】

【０１０４】
放射性ヨウ素は、反応式Ｈに示した方法により、式ＩＩおよびＶの化合物へ取り込まれうる。Ｈ₁（反応式Ｅに示した経路に従って調製される）とヘキサメチルジチンとの反応により、有機スタナンＨ₂が得られる。Ｈ₂とＮａ¹²⁵Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｈ₃が得られる。
【０１０５】
反応式Ｈ：
【０１０６】
【化３０】

【０１０７】
式Ｖ（式中、Ｒ¹²はＮ₃である。）の化合物は、米国特許Ｎｏ．５，９１０，５０４、実施例１７に記載された方法に従って作成される。当該文献は、その全体を参照することにより本明細書に援用される。
【０１０８】
反応式Ｉは、式ＩＩＩおよびＶＩ（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ⁷は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）の非放射性化合物の調製のための合成方法を示す。適当なアセトアミドフラグメント（Ｉ₁）を、塩化水素メタノール溶液中で還流することにより、遊離のアミンＩ₂が得られる。当該アセトアミドフラグメント（Ｉ₁）は、文献既知の方法（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，５６５，５７１、この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｙｎｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１）により調製される。Ｉ₂と、適当な安息香酸フラグメント（Ｉ₃、ｎ＝０）またはケイ皮酸フラグメント（Ｉ₃、ｎ＝１）とのカップリングにより、アミドＩ₄へと導かれる。カップリングは、ＥＤＣまたは当該技術分野の当業者によく知られた他の試薬を用いて達成される。適当な安息香酸フラグメント（Ｉ₃、ｎ＝０）は、反応式ＡのＡ₁を調製するために用いたのと同じ方法で調製される。適当なケイ皮酸フラグメント（Ｉ₃、ｎ＝１）は、適当なベンズアルデヒドとウィッテッィヒ−ホルナー（Ｗｉｔｔｉｇ−Ｈｏｒｎｅｒ）試薬とのカップリングにより調製されうる。ベンズアルデヒドフラグメントは、文献既知の方法（Ｓｈｕ、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７）または当該技術分野の当業者によく知られた他の方法により調製されうる。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはイソオキサゾリンまたはイソオキサゾリノンである。）は同様の方法により作成される。化合物Ｉ₃およびＩ₄が、オルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷、またはＲ¹⁸およびＲ¹⁹の置換基を有する場合（式ＩＩＩおよび式ＶＩのように）にも、反応式Ｉは用いることができる。
【０１０９】
反応式Ｉ：
【０１１０】
【化３１】

【０１１１】
式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ⁷は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）への¹²⁵Ｉの取り込みは、反応式Ｊに示した方法により達成される。Ｉ₄（反応式Ｉ（式中、Ｒ¹はＨであり、およびＲ²はＯＨである。）由来）とＮａ¹²⁵Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｊ₂が得られる。¹²⁵Ｉの式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐは、イソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）への取り込みは、同様の方法により達成される。
【０１１２】
反応式Ｊ：
【０１１３】
【化３２】

【０１１４】
あるいは、式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ⁷は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）への¹²⁵Ｉの取り込みは、反応式Ｋに示した方法により達成される。Ｉ₄（反応式Ｉ（式中、Ｒ¹はＩであり、およびＲ²はＨである。）由来）とヘキサメチルジチンとの反応により、有機スタナンＫ₂が得られる。Ｋ₂とＮａ¹²⁵Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｋ₃が得られる。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐは、イソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）の放射性ヨウ素化は、同様の方法により達成される。
【０１１５】
反応式Ｋ：
【０１１６】
【化３３】

【０１１７】
反応式Ｌは、式ＩＩＩおよびＶＩの放射性化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、Ｚは³⁵Ｓであり、およびＲ⁷は場合によっては置換されていてもよいアジドアニリンである。）の調製のための合成方法を示す。適当な³⁵Ｓ−イソチオシアネートＬ₂を、ＴＨＦ還流下、適当なアミノメチルフラグメントＩ₂（反応式Ｉ）と反応させることにより、目的の³⁵Ｓ−チオウレア（Ｌ₃）が得られる。必要となる³⁵Ｓ−イソチオシアネートＬ₂は、適当なアニリンと³⁵Ｓ−チオホスゲンとの反応により調製される。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはイソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）への³⁵Ｓの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｌ₂およびＬ₃が、オルト位にＲ¹⁶およびＲ¹⁷、またはＲ¹⁸およびＲ¹⁹の置換基を有する場合（式ＩＩＩおよび式ＶＩのように）にも、反応式Ｌは用いることができる。
【０１１８】
反応式Ｌ：
【０１１９】
【化３４】

【０１２０】
本発明は、当該発明を明らかにすることを意図された以下の実施例により、さらに説明される。これらの実施例は、開示の範囲を制限するものとは意図されていないし、そのように解されるべきでもない。
【０１２１】
実施例
実施例１：合成
２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル ４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾエート（反応式Ｃの化合物Ｃ₂（式中、Ｌは−ＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ⁴はＣＨ₃である。）は、以下のように調製される。
【０１２２】
【化３５】

【０１２３】
工程１
ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）およびピリジン（１ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−［４−（ヒドロキシアセチル）−１−ピペラジニル］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（５１５．８ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１−［３−ジメチルアミノ］プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５０９．９ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）を加え、続いて４−アジドサリチル酸（Ｄｕｐｕｉｓ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、６５、２４５０−２４５３）および触媒量の４−ジメチルアミノピリジンを加える。反応混合物を室温で７２時間攪拌し、その後濃縮する。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）で希釈し、Ｈ₂Ｏ（２ｘ３０ｍｌ）、１Ｎ ＨＣｌ（２ｘ３０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃（１ｘ３０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムで、２．５％ＣＨ₃ＯＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として精製し、１８６．５ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ、２５％）の安息香酸エステルを得る。融点１７７−１７８℃（分解）。
【０１２４】
【化３６】

【０１２５】
工程２
別段の特定がなければ、すべての試薬は、０．１Ｎ ＮａＰＯ₄バッファー中で調製される。バッファー（７０μｌ）、クロラミン−Ｔ（１ｍＭの原液の７０μｌ）、および工程１のアジドフェノール（ＤＭＳＯ中の５０μＭの原液の１０μｌ）を、１．５ｍｌガラス反応容器に加える。ゴム製のセプタムキャップで反応容器にふたをし、１ｍＣｉを含む、水酸化ナトリウム中の¹²⁵Ｉ₂の溶液（１０μｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＃ＩＭＳ３０）を加える。反応は、室温で２時間暗所にて緩やかに攪拌され、その後亜硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液（１００μｌ）によりクエンチする。クエンチ後、反応をバッファー（８００μｌ）で希釈し、１８ゲージの針を装着した１ｍｌのツベルクリンシリンジ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて、反応容器から移す。反応液（１ｍｌ）を調整前のＣ１８ ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に注入し、取り込まれなかった¹²⁵Ｉ₂を、ＨＰＬＣグレードの０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水（２０ｍｌ）を用いてＣ１８樹脂から洗い流す。生成物は、８０％ＣＨ₃ＣＮ／０．１ ＴＦＡ（３ｍｌ）を使用して溶出する。ヨウ素化された生成物の典型的な収率は、反応に加えた全¹²⁵Ｉ₂の約３０％である。
【０１２６】
実施例２：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｃの化合物Ｃ₂（式中、Ｌは結合であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ⁴はＣＨ₃である。））は、以下のように調製される。
【０１２７】
【化３７】

【０１２８】
工程１
ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（４９８．０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．７０ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＣＨ₂Ｃｌ₂（７ｍｌ）中の４−アジドサリコイルクロリド（４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（３４２．６ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、その後ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）およびＨ₂Ｏ（１０ｍｌ）の間で分配する。層を分離する。有機層を、Ｈ₂Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムで、３％ＣＨ₃ＯＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として精製し、４１２．３ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ、６２％）の目的のベンズアミドを黄褐色の固体として得る。融点１８８−１８９℃（分解）。
【０１２９】
【化３８】

【０１３０】
工程２
工程１で調製したフェノールを用いて出発し、実施例１の工程２に記載の方法に従って、¹²⁵Ｉを導入する。
【０１３１】
実施例３：合成
２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル ４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾエート（反応式Ｄの化合物Ｄ₃（式中、Ｌは−ＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ⁴はＣＨ₃である。））
【０１３２】
【化３９】

【０１３３】
工程１
無水ＴＨＦ（２．０ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨード安息香酸（１０３．８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ（Ｓｈｕ、Ｊ．ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７））の攪拌中の溶液に、１，１−カルボニルジイミダゾール（５８．２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−［４−（ヒドロキシアセチル）−１−ピペラジニル］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（１４１．９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、その後触媒量のＤＭＡＰを加える。反応混合物を７２時間加熱還流する。反応混合物を室温まで冷却し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ₂Ｏ（１５ｍｌ）、１Ｎ ＨＣｌ（１５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（１５ｍｌ）、食塩水（１５ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮した。残渣を、２％ＣＨ₃ＯＨを含むＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として用いて、Ｂｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムにより精製し、１１９．６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ、５０％）の安息香酸エステルを得る。融点１３７−１３９℃。
【０１３４】
【化４０】

【０１３５】
工程２
無水ＴＨＦ（３ｍｌ）中の工程１で調製したヨードベンゾエート（６２．７ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（４６．３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（２．０ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、３時間加熱還流する。反応混合物を冷却し、セライトの一塊りを通してろ過する。濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、２％ＣＨ₃ＯＨのＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムで精製し、２８．６ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、４３％）のスタナンを得る。
【０１３６】
【化４１】

【０１３７】
工程３
無水アセトニトリル中の工程２で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ¹²⁵Ｉ水溶液を、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１３８】
実施例４：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｄの化合物Ｄ₃（式中、Ｌは結合であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ⁴はＣＨ₃である。））
【０１３９】
【化４２】

【０１４０】
工程１
無水ＴＨＦ（４ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨード安息香酸（２７２．０ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１，１−カルボニルジイミダゾール（１５２．６ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（３１５．９ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加え、その後ＤＭＦ（２ｍｌ）を加える。反応混合物を１８時間加熱還流する。反応混合物を冷却し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（４０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ₂Ｏ（２０ｍｌ）、１Ｎ ＨＣｌ（２０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣を、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、２．５％ＣＨ₃ＯＨのＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として用いて、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムにより精製し、３７６．７ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）のベンズアミドを黄色の固体として得る。
【０１４１】
【化４３】

【０１４２】
工程２
無水ＴＨＦ（６ｍｌ）中の工程１で調製したヨードベンズアミド（８２．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（７１．１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を加える。反応混合物を脱気し、１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を、詰め込んだセライトを通してろ過し、濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、２％ＣＨ₃ＯＨの４９％ＣＨ₂Ｃｌ₂および４９％ＥｔＯＡｃを溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムで精製し、２８．２ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ、３４％）のスタナンを得る。
【０１４３】
【化４４】

【０１４４】
工程３
無水アセトニトリル中の工程２で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ¹²⁵Ｉ水溶液を加え、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１４５】
実施例５：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ₃−アセトアミド（反応式Ｆの化合物Ｆ₃（式中、Ｒ¹はＨであり、Ｒ²はＨであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１４６】
【化４５】

【０１４７】
工程１
無水ＤＭＦ（２３０ｍｌ）中の４−ヨードニトロベンゼン（６．８６ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ビス（ピナコレート）ジボロン（８．２４ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）を加え、続いて酢酸カリウム（８．６８ｇ、８８．５ｍｍｏｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６２４．６ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、２時間８５℃に加熱する。冷却した黒っぽい反応混合物に、（Ｓ）−Ｎ−［［３−（３−フルオロ−４−ヨードフェニル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（５．８ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）を加え、続いて２Ｎ Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液（１４３ｍｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（３１２．０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、３時間８５℃に加熱する。冷却した反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）およびＨ₂Ｏ（３００ｍｌ）間で分配する。層を分離する。水層をＥｔＯＡｃ（３００ｍｌ）で抽出する。有機層をあわせ、Ｈ₂Ｏ（５００ｍｌ）、食塩水（５００ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｍカラム（２ロット）で、７５％ＥｔＯＡｃを含むＣＨ₂Ｃｌ₂から１００％ＥｔＯＡｃを溶離液として精製し、３．７４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ、６５％）の目的のニトロビフェニル化合物を得る。
【０１４８】
【化４６】

【０１４９】
工程２
ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（１００ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）中の、工程１で調製したニトロビフェニル化合物（３．７４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、１０％のカーボン上担持のパラジウムの混合物を、水素風船下、１８時間水素化する。反応混合物は、セライトの一塊りを通してろ過し、ろ液を濃縮し、２．５０ｇ（７．３ｍｍｏｌ、７３％）の目的のアミノビフェニルを得る。
【０１５０】
【化４７】

【０１５１】
工程３
ＣＨ₃ＯＨ（４０ｍｌ）および１Ｍ ＨＣｌ（４０ｍｌ）中の、工程２で調製したアミノビフェニル（５０８．９３ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、０℃の冷却しながら、１．２Ｍ ＮａＮＯ₂水溶液（１．４８ｍｌ、１．７８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を０℃で９０分間攪拌し、その後スルファミン酸（１４３．５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＨ₂Ｏ（１．５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（１１５．４ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を０℃で４５分間攪拌し、その後ＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）希釈する。層を分離する。水層をＣＨ₂Ｃｌ₂（７５ｍｌ）で抽出する。あわせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、１０％ＣＨ₃ＯＨのＣＨ₂Ｃｌ₂を溶離液として用いて、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムにより精製し、２６２．９ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ、４８％）の目的のアジドビフェニルを淡黄色の固体として得る。
【０１５２】
【化４８】

【０１５３】
工程４
６Ｎ ＨＣｌ（２ｍｌ）およびＣＨ₃ＯＨ（６ｍｌ）中の工程３で調製したアジドビフェニル（１０２．４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を１８時間加熱還流する。ＣＨ₃ＯＨを減圧下除去し、固体の沈殿物をろ過により単離し、Ｈ₂Ｏ（１０ｍｌ）、エーテル（２ｘ１５ｍｌ）で連続的に洗浄し、その後乾燥することにより、８２．１ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ、８２％）の目的のアミン塩酸塩を得る。
【０１５４】
【化４９】

【０１５５】
工程５
１ｍｌの乾燥ＤＭＦおよび２．７１ｍｇ（２１μｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン中のトリチウム化された酢酸ナトリウム塩（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロット番号ＡＲＣ９９０５１９）０．５７ｍｇ（６．９４μｍｏｌ、２５０ｍＣｉ）の攪拌中の溶液に、室温で、無水ＤＭＦ中の０．４５ＭのＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）６．９４μｍｏｌを加える。溶液はすぐに淡黄色に変化する。そして、１０分間室温で攪拌する。その後、活性化した［³Ｈ］酢酸ナトリウム塩を、２ｍｌの無水ＤＭＦ中の２．７３ｍｇ（７．５μｍｏｌ）の工程４で調製したアミン塩酸塩の攪拌中の溶液に加える。反応を室温で４．５時間攪拌し、その後すべての溶媒を室温での減圧蒸留で除去する。反応混合物を、８％のメタノールのジクロロメタン溶液を用いて溶離する分取ＴＬＣプレート（Ａｎａｌｔｅｃｈ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ＧＦ、５００ミクロン、２０ｃｍｘ２０ｃｍ）により精製する。目的のバンドをかき取りする。２０％のメタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルから生成物を溶出し、ろ過する。減圧下、ろ液を濃縮し、残渣を６５．５ｍｌのメタノールに溶解し、９４．４ｍＣｉの目的のトリチウム化物質（１．４４ｍＣｉ／ｍｌメタノール、比放射能５７．３７ｍＣｉ／ｍｇ（５７．３７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＨＰＬＣによる放射化学純度９９．５％）を得る。
【０１５６】
実施例６：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ₃−アセトアミド（反応式Ｆの化合物Ｆ₃（式中、Ｒ¹はＨであり、Ｒ²はＩであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１５７】
【化５０】

【０１５８】
工程１
酢酸３ｍｌ中の実施例５の工程２で調製したアニリン（２８４．９ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、酢酸（０．２５ｍｌ）中の一塩化ヨウ素（１３４．５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１．５時間攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃとＮａ₂Ｓ₂Ｏ₃水溶液の間で分配する。層を分離する。水層をＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で抽出する。あわせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨに溶解し、シリカゲル上に吸着させ、１０−２５％のアセトンのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムにより精製し、４８．４ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、１２％）の目的のヨードアニリンを黄色の油状物として得る。
【０１５９】
【化５１】

【０１６０】
工程２
０℃に冷却したＣＨ₃ＯＨ（２ｍｌ）および１Ｎ ＨＣｌ（２ｍｌ）中の工程１で調製したヨードアニリン（４７．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、Ｈ₂Ｏ（１ｍｌ）中のＮａＮＯ₂（８．５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液を加える。黄色の反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、その後、Ｈ₂Ｏ（１ｍｌ）中のＮａＮ₃（８．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液を加える。反応溶液を０℃で１時間攪拌し、その間に黄色の沈殿が形成する。固体をろ過により単離し、Ｈ₂Ｏで洗浄し、乾燥することにより、４１．０ｍｇ（０．０８３ｍｍｏｌ、８３％）の目的のヨードアジドビフェニルを黄色の固体として得る。融点１７３−１７５℃（分解）。
【０１６１】
【化５２】

【０１６２】
工程３
工程２で調製したヨードアジドビフェニル（１２９．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（６ｍｌ）および１Ｎ ＨＣｌ（２ｍｌ）の混合物を４８時間加熱還流する。冷却した反応混合物を濃縮し、定量的収率で目的のアミン塩酸塩を黄褐色の固体として得る。
【０１６３】
【化５３】

【０１６４】
工程４
５．１ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、２５ｍＣｉ）のトリチウム化された無水酢酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂａｔｃｈ Ｂ７７、同位体＃００−０３１６）に、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の２Ｎ ＰＣｌ₃（２５μｌ）を加える。反応混合物を室温で５時間断続的な攪拌を加えながら放置する。この混合物に、ピリジン（０．２５ｍｌ）中の工程３で調製したアミン塩酸塩（４７．７ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）の溶液を加え、続いてＤＭＡＰ（４．６ｍｇ）を加える。３０分後、反応混合物をＨ₂ＯおよびＣＨ₂Ｃｌ₂の間で分配する。層を分離する。水層をＣＨ₂Ｃｌ₂で徹底的に抽出し、その後濃縮する。残渣を、２０％アセトンを含むトルエンを溶離液として用いてシリカゲル（４ｇ）で精製し、３８．２ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ、７４％）の目的のトリチウム化されたアセトアミドを得る。
【０１６５】
実施例７：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］エタン−³⁵Ｓ−チオアミド（反応式Ｇの化合物Ｇ₂（式中、Ｒ¹はＨであり、Ｒ²はＩであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１６６】
【化５４】

【０１６７】
工程１
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のメチルマグネシウムクロリドを４０℃で³⁵Ｓ標識化二硫化炭素により処理し、続いてヨウ化エチルにより処理する。反応を６０℃で１．５時間攪拌する。水およびエチルエーテルで後処理をした後に、目的のエチル ³⁵Ｓ−ジチオアセテートを得る。
【０１６８】
工程２
実施例６の工程３で調製したアミン塩酸塩および工程１で調製したエチル ［³⁵Ｓ］ジチオアセテートを、塩化メチレン、メタノールおよびトリエチルアミン中で攪拌し、目的の³⁵Ｓ標識化チオアミドを得る。
【０１６９】
実施例８：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード−¹²⁵Ｉ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｈの化合物Ｈ₃（式中、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ⁴はＣＨ₃である。））
【０１７０】
【化５５】

【０１７１】
工程１
トルエン（５ｍｌ）中の実施例６の工程２で調製したヨードビフェニル（５６．２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（７３．９ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリフェニルホスフィン（６．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、８０℃で２０時間加熱する。冷却した反応混合物を容積で半分に濃縮し、その後、１０−２０％アセトンのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ １２Ｓカラムで精製し、５３．５ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、８９％）の目的のスタナンを得る。
【０１７２】
【化５６】

【０１７３】
工程２
無水アセトニトリルおよびｐＨ７のリン酸バッファー中の工程１で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、クロラミン−Ｔを加え、続いて１ＭのＮａ¹²⁵Ｉ水溶液を加える。３０分後、反応混合物を飽和Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃水溶液でクエンチし、精製し、表題の化合物を得る。
【０１７４】
実施例９：合成
（２Ｅ）−３−（４−アジド−３−ヨード−¹²⁵Ｉ−フェニル）−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−プロペンアミド（反応式Ｉの化合物Ｉ₄（式中、Ｒ⁵は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、ｎは１であり、Ｒ¹は¹²⁵Ｉであり、およびＲ²はＨである。））
【０１７５】
【化５７】

【０１７６】
工程１
ＣＨ₂Ｃｌ₂（１．５ｍｌ）中の塩化オキサリル（０．１０ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液を、−７８℃まで冷却し、無水ＤＭＳＯ（０．１４ｍｌ、１．９７ｍｍｏｌ）を加える。１０分後、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２．５ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨードベンジルアルコール（２１７．０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ（Ｓｈｕ、Ｊ．ｏｆ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７））を加える。１５分後、トリエチルアミン（０．３３ｍｌ、２．３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで昇温する。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ₂Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＢｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムで、１０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンを用いて精製し、１９５．５ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ、９１％）の目的のアルデヒドを得る。
【０１７７】
【化５８】

【０１７８】
工程２
無水ＴＨＦ（１ｍｌ）中の工程１で調製したアルデヒド（１９０．０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、トリエチルホスホノアセテート（０．１５ｍｌ、０．７６ｍｍｏｌ）を加え、水酸化リチウム１水和物（３２．１ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で４８時間攪拌する。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（４０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ₂Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用いてＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムで、５％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンを溶離液として使用して精製し、１６５．１ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ、７０％）の目的のエステルを得る。融点９３−９４℃。
【０１７９】
【化５９】

【０１８０】
工程３
ＣＨ₃ＯＨ（２ｍｌ）中の工程２で調製したエステル（６６．７ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１Ｎ ＬｉＯＨ（０．１９ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を濃縮し、すぐに使用する。
【０１８１】
工程４
ＣＨ₃ＯＨ（６２ｍｌ）および６Ｎ ＨＣｌ（３１ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（１．４０ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を１８時間加熱還流する。反応混合物を濃縮し、１．４８ｇのアミン二塩酸塩を得る。
【０１８２】
【化６０】

【０１８３】
工程５
アミン二塩酸塩（工程４由来）（６８．２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、工程３で調製したカルボン酸リチウム、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（７２．８ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール水和物（３０．８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｍｌ）中に溶解し、室温で７２時間攪拌する。反応混合物を濃縮する。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（４０ｍｌ）に溶解し、Ｈ₂Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、２％のＣＨ₃ＯＨ（ＮＨ₃により飽和されている）のＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムにより精製し、５６．２ｍｇ（０．０９６ｍｍｏｌ、５１％）の目的のシンナミド得る。
【０１８４】
【化６１】

【０１８５】
工程６
無水ＴＨＦ（６ｍｌ）中の工程４で調製したヨードシンナミドおよびヘキサメチルジチン（７１．１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を加える。反応混合物を脱気し、１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を、詰め込んだセライトを通してろ過し、濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、Ｂｉｏｔａｇｅ １２Ｍカラムで精製し、スタナンを得る。
【０１８６】
工程７
無水アセトニトリル中の工程５で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ¹²⁵Ｉ水溶液を、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１８７】
実施例１０：合成
４−アジド−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−ヒドロキシ−５−ヨード−¹²⁵Ｉ−ベンズアミド（反応式Ｊの化合物Ｊ₂（式中、Ｒ⁵は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、およびｎは０である。））
【０１８８】
【化６２】

【０１８９】
工程１
ピリジン（４ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍｌ）中の実施例９の工程４で調製したアミン二塩酸塩（１７２．４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の攪拌中の懸濁液に、４−アジドサリチル酸（１２８．９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、続いて１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１８４．０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール水和物（７７．８ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で７２時間し、その後濃縮する。残渣をＣＨ₃ＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（４０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＥｔＯＡｃを溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ ４０Ｓカラムにより精製し、４４．８ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、２１％）のベンズアミドを黄褐色の固体として得る。融点２００−２０２℃（分解）。
【０１９０】
【化６３】

【０１９１】
工程２
工程１で調製したフェノールより出発して、実施例１の工程２に記載した方法に従って、¹²⁵Ｉを導入する。
【０１９２】
実施例１１：合成
Ｎ−（４−アジドフェニル）−Ｎ’−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−³⁵Ｓ−チオウレア（反応式Ｌの化合物Ｌ₃（式中、Ｒ⁵は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｒ¹はＨでありおよびＲ²はＨである。））
【０１９３】
【化６４】

【０１９４】
無水ＴＨＦ中のアミン二塩酸塩（実施例９の工程４由来）の攪拌中の溶液に、ヒューニッヒ塩基（Ｈｕｎｉｇ‘ｓ ｂａｓｅ）を加え、続いてＴＨＦ中の³⁵Ｓ−４−アジドフェニルイソチオシアネートを加える。反応混合物を１時間加熱還流する。冷却した反応混合物を精製し、目的のチオウレアを得る。
【０１９５】
実施例１２：生物学上の標的の特定
もとの抗生物質に対して感受性を有する細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓもしくは他の感受性のグラム陽性またはグラム陰性細菌）を、ミュラー−ヒントン完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）において指数期の半ば（ｍｉｄ−ｅｘｐｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）まで増殖させる。培養物の適当な部分の一部をとって、ＲＮアーゼを除去したチューブ（１．５ｍｌの容量）の中で簡単に沈降させ、その後、新たなミュラー−ヒントン培地中に再び懸濁させる。競争的化合物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（抗生物質としては活性または不活性）を、ＤＭＳＯを含む保存液（全体の最終濃度＝０．２％）から加える。活性なフォトアフィニティープローブ（例えば、明細書中の式で表される化合物などの化合物；非標識化および¹²⁵Ｉ−標識化、³Ｈ−標識化、またはその他の適当な放射性標識化または非放射性標識化で検出可能な任意の化合物の混合物）を、抗細菌作用についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）付近の最終濃度となるまで加える。この露光は３７℃で暗所にて３０分間続けられる。
【０１９６】
その後細菌を、フォトプローブを活性化するために、紫外線光に直接さらすか、または簡単に沈降させリン酸緩衝食塩水中（ＰＢＳ）に再懸濁させその後紫外線にさらす（エネルギー設定を１８０，０００マイクロジュールとしたＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。その後標識化細胞をＰＢＳで洗浄し、バッファーＡ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ₂）に再懸濁し、リソスタフィンにより溶解する（３７℃で１５分間、リソスタフィンの最終濃度は５μｇ／ｍｌ）。その後、細胞壁および大型の膜のフラグメントを、１５分間１８，０００ｘｇの遠心分離で除去する。得られた上澄み液を６０分間、４５０，０００ｘｇで沈降させ、細胞膜およびリボソームを含むペレットを得る。当該ペレットをバッファーＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５％のＳＤＳおよび６ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、標準的なフェノール抽出法によりＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ抽出物は、エタノールにより沈殿させ、ＲＮＡの電気泳動のために適当なバッファーに再懸濁させる。粗物のペレットはタンパク質についての電気泳動に付す。例えば、リボソームＲＮＡ（２３Ｓ、１６Ｓ、５ＳサイズのリボソームＲＮＡ）またはトランスファーＲＮＡとの標識化フォトプローブの架橋結合は、ＲＮアーゼ Ｈ 消化およびそれに続くプライマー伸長法アッセイにより検出され、架橋結合が生じた正確な塩基が得られる。特異的な架橋結合の発生は、生物学上活性な抗生物質である化合物の使用を通して、架橋結合の量の減少という結果により、確認されうる。架橋結合の発生のさらなる確認は、生物学上不活性な（抗生物質としての活性に欠けている）競争的抗生物質が、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の標的との特異的な架橋結合の量を減少させないことを観察することにより達成される。
【０１９７】
この手法の使用により、ＲＮＡ（Ａ２６０２、Ｕ２５０６、Ａ２４５１を含む２３Ｓ ＲＮＡペプチジルトランスフェラーゼ領域）の部分、６４ｋＤａ ＬｅｐＡおよび１１ｋＤａ Ｌ２７と一緒になったｔＲＮＡは、生物学上の標的と特定された。そしてこれらはこの機構に基づくタンパク質翻訳のユニークな阻害剤の発見において使用されうる。
【０１９８】
実施例１３：抗生物質活性を有する化合物の特定
放射性または非放射性（例えば、酵素的、化学発光または蛍光）のどちらかの手段により標識化されている、例えばオキサゾリジノンフォトアフィニティープローブまたは等価の化合物などの代表的なフォトアフィニティープローブの結合の検出のための認識アッセイにおいて、タンパク質（例えば、６４ｋＤａおよび１１ｋＤａタンパク質（各々ＬｅｐＡおよびＬ２７））および／またはＲＮＡの構成要素は、単独または組み合わせのどちらかで使用される。試験化合物の相互作用についての妨害の能力を測定する。潜在的な治療薬の最適化において、これらの部位における相互作用の増加は、正の選択基準として用いられ、それに対して、真核細胞の部位における相互作用は負の選択基準として用いられる。
【０１９９】
リボソームＲＮＡは、例えば、シンチレーション近接ビーズ（ＳＰＡ）などの固体表面に電荷相互作用により結合させられる。当該アッセイにおけるそれとは別の添加物には、上述した方法により特定された他の生物学上の標的と同様に、ｔＲＮＡおよび会合した６４ｋＤａ ＬｅｐＡおよびＬ２７タンパク質が含まれる。生物学上の標的および／または試験化合物は、単独でまたは任意の組み合わせにおいて試験されうる。代表的なオキサゾリジノンまたは等価の化合物（例えば、エペレゾリド）は上述したような標識体（例えば、³Ｈ−エペレゾリド）として加えられ、試験化合物の標識化化合物の結合と拮抗する、または結合を減少させる能力を測定する。トリチウム化ＳＰＡの例においては、液体シンチレーションによる測定が可能である。しかしながら、その他の測定方法（例えば、連結酵素活性（ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、化学シフト／測定、蛍光）を伴う他のプローブも使用可能である。上述のように特定される標的との結合を特異的に減少させる化合物の効果的な濃度は、潜在的な治療薬についての肯定的な選択条件として解釈される。そのようにして特定される興味ある化合物については、その後、真核細胞の標的分子を用いる以外は同様の技術による、標的の真核細胞中において特定された毒性についての標的に関する選抜のための試験がなされる。これらの目的のために、特定された標的に取り付けられた抗体または周知の化学タグ（例えば、ヒスチジン−金属、ストレプトアビジン−ビオチン、など）によって、タンパク質もまた、選抜のための基質（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘｅｓ）に結合させられうる。
【０２００】
特に、エペレゾリドの活性および非活性の両方のエナンチオマーによる架橋結合との拮抗を伴うヨウ素化プローブは、この特別な実施態様を説明するのに使用されうる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株を指数的増加率で生育する。細胞の一定量（１ｍｌ／１．５ｍｌチューブ）を穏やかに沈殿させ、３０分間、４０μＭの活性なエペレゾリド（Ｓ）または非活性なエナンチオマー（Ｒ）および８μＭの¹²⁵Ｉ−プローブ（２μＣｉ／チューブ）をふくむ、もしくは含まない新鮮な培地中に再懸濁させる。その後サンプルを実施例１２において上述した様に処理する。そのような方法によるＲＮＡの検定は、２３Ｓ ＲＮＡが特異的な様式、例えば、架橋結合は活性なエナンチオマー（Ｓ）によって妨害されるが、不活性なエナンチオマーによっては妨害されないことが示される。１％アガロースゲル上のＲＮＡの分離により、２３Ｓ ＲＮＡが特異的に架橋結合を形成することが示される（データ非開示）。１０％ＴＢＥウレア電気泳動ゲル上の分離により、ｔＲＮＡもまた架橋結合を形成することが示される（データ非開示）。リボソーム沈殿の１０−２０％トリストリシンポリアクリルアミド分析のオートラジオグラムにより、６４ｋＤａタンパク質（ＬｅｐＡ）および１１ｋＤａタンパク質（Ｌ２７）の架橋結合形成が示される（データ非開示）。
【０２０１】
架橋結合形成についての研究により得られる情報は、構造に基づいたデザインのために使用することもできる。つまり、オキサゾリジノンまたは等価体分子と共に、特定されたまたは上述した相互作用の１またはそれ以上の鍵構成要素を伴う共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｓ）を調製する。関連する結合部位との直接的な相互作用の概要は、新たな潜在的治療剤の構築において肯定的な指針として使用される。同じ試験化合物の真核細胞の標的との共結晶は否定的な選択として使用されうる。
【０２０２】
同様の原理により、ＮＭＲは、架橋結合形成研究によって特定された対応する標的分子のいずれかまたはすべてに対して、適した試験化合物（オキサゾリジノンまたは等価の分子）の相互作用を研究するために使用されうる。この場合、試験化合物および／または生物学上の標的のいずれかは、標準的な技術により相互作用の部位の測定を可能にするために、適切な修飾がなされる。
【０２０３】
当該技術分野の当業者であれば認識するように、無数の変法および改良法が、本発明の要点から逸脱することなく、本発明の好ましい実施態様として作成されうる。そのようなすべての変法は本発明の技術範囲に属することを意図する。本明細書で引用した各刊行物の開示全体は、参照することにより本明細書に援用される。DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0001]
Field of the invention
The present invention is directed, in part, to a novel method of using a photoaffinity probe to locate relevant antibiotic binding sites in susceptible cells. In particular, the photoaffinity probe is an oxazolidinone photoaffinity probe that is used to identify the biological targets of the antibiotic oxazolidinones. The present invention is also directed, in part, to a method of identifying a compound that inhibits binding of a probe to a biological target.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
In recent years, several compounds have been developed and have shown action as antimicrobial agents or antibacterial agents. International Publication WO 99/41244 discloses substituted aminophenyl isoxazoline compounds useful as antimicrobial agents. U.S. Pat. No. 5,910,504 describes phenyloxazolidinone antimicrobial agents substituted with a heteroaromatic ring. Furthermore, WO 00/10566 discloses isoxazolinone antibacterial agents. One of the key steps in the development of new antimicrobial or antibacterial agents as discussed here is the determination of the mechanism of action. Specific sites of non-selective antibiotic / anti-tumor drug interactions that inhibit protein translation by different, less useful, and direct mechanisms, such as sparsomycin, have been reported ( Porse et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1999, 96, 9003-9008). Previous studies with chemical probes using isolated cell-free systems have failed to reveal the relevant sites of these types of interactions for compounds that are oxazolidinones antibiotics (Matassova et al.). , RNA, 1999, 5, 939-946). This is due, in part, to the fact that previous methods have failed to reveal the site of this unique class of antibiotics, a special and unique mechanism of action. There is a strong need for probes to aid in determining the mechanism of action of antimicrobial and / or antibacterial agents, and methods using the same.
[0003]
The present invention is particularly directed to novel methods of identifying oxazolidinone-type antibiotics as well as methods of identifying compounds that inhibit the binding of probes to biological targets, as well as to such biological targets. . The present invention involves the use of compounds / probes by a novel mechanism of study that allows the identification of specific oxazolidinone interaction sites in sensitive cells. Applicants' method involves the use of a particular compound in intact cells and the competition for cross-linking to a particular site by the active and inactive enantiomers of the compound. These and other aspects of the invention are described below.
[0004]
Summary of the Invention
The invention is particularly directed to the identification of oxazolidinone binding sites in, for example, mammalian cells and cells such as Gram-positive and Gram-negative bacteria. The present invention is also directed to screening compounds for antimicrobial activity.
[0005]
In particular, the invention relates to the steps of contacting an oxazolidinone photoaffinity probe with a susceptible cell, illuminating a photoaffinity label to form a complex of the photoaffinity probe with at least one biological target, and detecting the complex. A method for identifying a biological target of an oxazolidinone-type antibiotic, comprising the steps of:
[0006]
Another embodiment of the invention is a step of contacting the probe with a biological target, wherein the biological target is ribosomal RNA, tRNA, LepA, L27, or any combination thereof, Contacting the test compound with a biological target and comparing the amount of binding between the probe and the biological target in the presence and absence of the test compound, wherein the probe and the biological A decrease in the amount of binding between the targets indicates that the test compound inhibits binding of the probe to the biological target, including identification of compounds that inhibit binding of the probe to the biological target. Oriented way.
[0007]
Detailed Description of the Preferred Embodiment
Various definitions have been made throughout this specification. Most words have the meaning that those skilled in the art would consider these words to have. Words hereinafter or specifically defined elsewhere in this specification have the meanings arising as a whole and in the context of the invention as commonly understood by one of ordinary skill in the art.
[0008]
The present invention describes the specific site of interaction of these particular antibiotics near the peptidyl transfer reaction center of the ribosome, with a different mode of interaction than has been reported for other inhibitors of protein translation. It was specified that. The interaction of these oxazolidinone antibiotics is associated with the central region V of 23S RNA, along with tRNA and two proteins, 64 kDa (LepA) and 11 kDa (L27). The identification of such sites by this novel approach (compounds and techniques) just enables a direct exploration method using structure-based design involving screening for interactions with these specific targets. . In particular, the methods of the present invention can be used to bind to oxazolidinone-type antibiotics and identify cellular components that are targeted by oxazolidinone-type antibiotics. In addition, the methods of the present invention can be used, for example, in screening libraries of compounds, for example, to identify compounds that inhibit the binding of a photoaffinity probe to the biological target described above. Such compounds may themselves have antibacterial or antimicrobial activity, or may be used in the design of compounds having antibacterial or antimicrobial activity.
[0009]
As used herein, the phrase "biological target" refers to any protein, nucleic acid, lipid, etc. in a cell. Biological targets include, but are not limited to, the contents of the cytoplasm, nucleus, cell membrane, cell wall, and the like. In particular, biological targets include, but are not limited to, ribosomal RNA, tRNA, LepA protein and L27. Biological targets are capable of binding probes.
[0010]
As used herein, the term "contacting" refers to intracellularly, on a cell or to a cell, or to a biological target derived from a cell in vitro or in vivo or ex vivo. Direct or indirect application of the probe or test compound. Test compounds and probes can be in buffers, salts, solutions, and the like.
[0011]
As used herein, the term "cross-linking" or "binding" refers to the physical relationship between the probe and at least one of the intracellular or cell-derived biological target or a combination thereof. Means interaction. Binding includes ionic, non-ionic, hydrogen bonding, van der Waals, hydrophobic interactions, and the like. Binding, which is a physical interaction, can be direct or indirect through or for another protein or compound. Direct binding refers to interactions that do not occur through or for other proteins or compounds, but occur without substantial chemical intermediates.
[0012]
As used herein, the term "oxazolidinone" is defined in U.S. Ser. Nos. 07 / 438,759, 07 / 553,795, 07 / 786,107, 07 / 831,213, 08 / 329,717, 07 / 909,387. 60/015, 499, 09/138, 209, 60/008, 554, 60/064, 738, 60/065, 376, 60/067, 830, 60/089, 498, 60/100, 185, 60 / 088,283, 60 / 092,765, 07 / 244,988, 07 / 253,850; European Patents EP0500686, EP0610265, EP0673370; PCT Application Nos. PCT / US90 / 06220, PCT / US94 / 08904, PCT / US94 / 10582, PCT / US95 / 02972, P T / US95 / 10992, PCT / US93 / 04850, PCT / US95 / 12751, PCT / US96 / 00718, PCT / US93 / 03570, PCT / US93 / 09589, PCT / US96 / 05202, PCT / US97 / 03458, PCT / US96 / 12766, PCT / US97 / 01970, PCT / US96 / 14135, PCT / US96 / 19149, PCT / US96 / 17120, PCT / US98 / 09889, PCT / US98 / 13437; and US Patent Nos. 5,700,799, 5,719,154, 5,547,950, 5,523,403, 5,668,286, 5,652,238, 5,688,792, 5,247,090, 5,231,188, 5, 654,428, 5,654,435, 5,756,732, 5,164,510, 5,182,403, 5,225,565, 5,618,949, 5,627,197, 5,534,636, 5,532 , 261,5,776,937,5,529,998,5,684,023,5,627,181,5,698,574,5,220,011,5,208,329,5,036,092. 4,965,268,4,921,869,4,948,801,5,043,443,5,130,316,5,254,577,4,877,892,4,791,207,4 , 642,351, 4,665,171, 4,734,495, 4,775,752, 4,870,169, 4,668,517, 4,340,606, 4,362,866, 4,19. 3,918, 4,000,293, 3,947,465, 4,007,168, 3,674,780, 3,686,170, 3,906,101, 3,678,040, 3,177, 114, 3,141,889, 3,149,119, 3,117,122, 5,719,154, 5,254,577, 4,801,600, 4,705,799, 4,461,773, 4,243,801,3,794,665,3,632,577,3,598,830,3,513,238,3,598,812,3,546,241,3,318,878,3 322,712, 5,565,571, 5,880,118, 5,952,324, 5,910,504, 6,166,056, 5,968,962, 6,090,820, 5,736 5 5, 6,277,985, 5,955,460, 5,922,707, 6,255,304, 6,218,413, 5,977,373, 6,251,869, 5,929,248, And compounds of the class known as oxazolidinones, including the compounds described in US Pat. The disclosures of each of these applications are all incorporated herein by reference. Preferred oxazolidinones include linezolid and eperezolid.
[0013]
As used herein, the term "oxazolidinone-type antibiotic" refers to any compound that has antimicrobial activity and binds or interacts with a biological target (protein, nucleic acid, etc.) of an oxazolidinone antibiotic. I do. Thus, oxazolidinone-type antibiotics may have the same mechanism of action as oxazolidinone antibiotics. Alternatively, oxazolidinone-type antibiotics, like oxazolidinone antibiotics, may interact or bind to some of the same biological targets. Further, oxazolidinone-type antibiotics may have a different chemical structure than oxazolidinone antibiotics.
[0014]
The term "probe" as used herein refers to any compound, protein, nucleic acid molecule, small organic molecule, etc., that can bind to a biological target. Probes include, but are not limited to, photoaffinity compounds, antibodies, oligonucleotides, oxazolidinone antibiotics, and the like. Probes can be labeled or unlabeled.
[0015]
As used herein, the phrase "sensitive cell" refers to any cell in which a photoaffinity probe can bind to a biological target. Sensitive cells include, but are not limited to, bacteria, fungi, and mammalian cells.
[0016]
As used herein, the term "test compound" is any identifiable, putatively interacting or potentially cross-linking probe with a biological target in or from a cell. Chemical or molecule, small molecule, peptide, sugar, natural or synthetic.
[0017]
The present invention is directed to methods of using oxazolidinone photoaffinity probes to determine and / or identify biological targets of oxazolidinone antibiotics. The present invention is also directed to in vitro assays for determining whether a particular test compound is capable of interacting with the biological target of an oxazolidinone antibiotic. Such a method enables the creation of molecular-based drug discovery methods, especially for novel antibiotics based on the mechanism of antibacterial activity of oxazolidinone antibiotics.
[0018]
One embodiment of the present invention is directed to a method for identifying a biological target of an oxazolidinone-type antibiotic. Sensitive cells are contacted with a probe, such as an oxazolidinone photoaffinity probe. Sensitive cells of the present invention include, but are not limited to, for example,Staphylococcus  aureus;Staphylococcus  epidermidis(A, B, C biotypes);Staphylococcus  caseolyticus;Staphylococcus  gallinarum;Staphylococcus  haemolyticus;Staphylococcus  hominis;Staphylococcus  saprophyticus;Streptococcus  agalactiae(Group B);Streptococcus  mutans/rattus;Streptococcus  pneumoniae;Streptococcus  pyogenes(Group A);Streptococcus  salivarius;Streptococcus  sanguis;Streptococcus  sobrinus;Actinomyces  spps.;Arthrobacter  histidinolovorans;Corynebacterium  diptheriae;Clostridium  difficule;Clostridium  spps.;Enterococcus  casseliflavus;Enterococcus  durans;Enterococcus  faecalis;Enterococcus  faecium;Enterococcus  gallinarum;Erysipelothrix  rhusiopathiae;Fusobacterium  spps.;Listeria  monocytogenes;Prevotella  spps.;Propionobacterium  acnesandPorphyromonas  gingivalisIncluding pathogens of Gram-positive bacteria.
[0019]
Sensitive cells include, but are not limited to, for example,Acinetobacter  calcoaceticus;Acinetobacter  haemolyticus;Aero monas  hydrophila;Bordetella  pertussis;Bordetella  parapertussis;Bordetella  bronchiseptica;Bacteroides  fragilis;Bartonella  bacilliformis;Brucella  abortus;Brucella  melitensis;Campylobacter  fetus;Campylobacter  jejuni;Chlamydia  pneumoniae;Chlamydia  psittaci;Chlamydia  trachomatis;Citrobacter  freundii;Coxiella  burnetti;Edwardsiella  tarda;Edwardsiella  hoshinae;Enterobacter  aerogenes;Enterobacter  cloacae  (Groups A and B);Escherichia  coli(Including all pathogenic subtypes);Ehrlicia  spps.;Francisella  tularensis;Haemophilus  actinomycetemocomitans;Haemophilus  ducreyi;Haemophilus  haemolyticus;Haemophilus  influenzae;Haemophilus  parahaemolyticus;Haemophilus  paraitifluenzae;Hafnia  alvei;Helicobacter  pylori;Kingella  kingae;Klebsiella  oxytoca;Klebsiella  pneumoniae;Legionella  pneumophila;Legionella  spps.;Morganella  spps.;Moraxella  cattarhalis;Neisseria  gonorrhoeae;Neisseria  meningitidis;Plesiomonas  shigelloides;Proteus  mirabilis;Proteus  penneri;Providencia  spps.;Pseudomonas  aeruginosa;Pseudomonas  species;Rickettsia  prowazekii;Rickettsia  rickettsii;Rickettsia  tsutsugamushi;Rocharimaea  spps.; Salmonella subgroup 1 serotype (S.  paratyphiandS.  typhi); Salmonella subgroups 2, 3a, 3b, 4, and 5;Serratia  marcesans;Serratia  spps.;Shigella  boydii;Shigella  flexneri;Shigella  dysenteriae;Shigella  sonnei;Yersinia  enterocolitica;Yersinia  pestis;Yersinia  pseudotuberculosis;Vibrio  cholerae;Vibrio  vulnificus;andVibrio  parahaemolyticusAlso included are pathogens of Gram-negative bacteria, including
[0020]
Sensitive cells include, but are not limited to, for example,Mycobacterium  tubeculosis;Mycobacterium  aviumAnd otherMycobacterium  sppsAlso included are Mycobacterial species comprising:
[0021]
Sensitive cells include, but are not limited to, for example,Mycoplasma  gentaliium;Mycoplasma  pneumoniaeAnd otherMycoplasma  spps(Or pleuropneumonia-like organisms) comprising
[0022]
Sensitive cells include, but are not limited to, for example,Borrelia  burgdorferi;OtherBorreliaSpecies;Leptospira  spps.;Treponema  pallidumAlso included are Treponemaceae (Spiral organisms), including:
[0023]
Sensitive cells also include, but are not limited to, mammalian cells.
After the susceptible cells have been contacted with the photoaffinity probe, a complex between the photoaffinity probe and the biological target may be formed, e.g., by photo-sensitizing the at least one biological target in the susceptible cells. The photoaffinity probe is exposed to light, preferably ultraviolet light, so that the affinity probe forms a crosslink. The complex formed between the photoaffinity probe and the biological target is detected by standard methodology. Preferably, the photoaffinity probe is detectably labeled. Detectable labels include, but are not limited to, enzymatic, fluorescent, chemiluminescent, or radioactive labels, many of which are commercially available. Preferably, the radiolabel is, but is not limited to,^ThreeH,³⁵S, and¹²⁵I. Complexes between the photoaffinity probe and the biological target can be detected using, for example, autoradiography, enzyme activity detection, chemical shift / measurement, fluorescence intensity, ELISA using anti-photoaffinity probe antibodies, and the like. It is detected by any number of well-known detection methods corresponding to a particular label. Multiple photoaffinity probes can be used at the same time. Applicants have identified several biological targets for oxazolidinone compounds, including 23S RNA, tRNA, LepA and L27, by the methods described above.
[0024]
Another embodiment of the invention is directed to specific methods of compounds that inhibit the binding of a probe to its biological target. The method can be used, for example, to identify antimicrobial compounds that have a similar mechanism of action to oxazolidinone. The biological target is contacted with a probe, such as, for example, an oxazolidinone compound, preferably in vitro. Preferably, the probe is linezolid or eperezolide, or a derivative thereof. The biological target is a ribosomal RNA, tRNA, LepA protein, L27 ribosomal protein, or any combination thereof. A biological target is also contacted with the test compound. The amount of binding between the probe and the biological target in the presence and absence of the test compound is compared. A decrease in the amount of binding between the probe and the biological target in the presence of the test compound indicates that the test compound inhibits binding of the probe to the biological target.
[0025]
In some embodiments of the invention, the biological target is a solid layer comprising, but not limited to, controlled pore glass, microtiter plates, columns, scintillation proximity beads, sepharose, polyacrylamide, and the like. Be combined. Thus, for example, LepA from a sensitive source, or a biologically active fragment of LepA, is attached to a scintillation proximity bead (SPA bead), for example, by an antibody attached to the bead, and recognizes the LepA peptide sequence. Induced by antibodies. The test target is also attached by other standard methods such as histidine-copper (His-copper), streptavidin, and the like. Thereafter, the microtiter plate containing the SPA beads, with or without additional targets (as described herein),^ThreeIncubate with a labeled reference probe such as H-eperezolid. Test compounds are evaluated for their ability to reduce the binding of the labeled probe to the target or set of targets for the oxazolidinone antibiotic. Compounds that can recognize the same site on the target may have useful antibiotic or antimicrobial activity. Similarly, other targets described herein (eg, ribosomal RNA, tRNA or L27) can be first attached to SPA beads, and assays can be constructed and performed in a similar manner. Can be implemented. In a manner similar to the unlabeled probe (eg, eperezolide in this example), the labeled probe (eg, in this example)^ThreeCompounds that decrease the binding of (H-eperezolid) may have useful antibiotic or antimicrobial activity.
[0026]
In some embodiments of the invention, the biological target is 23S ribosomal RNA or a fragment thereof. Preferably, the fragment of 23S RNA comprises the central peptidyl transferase loop. A fragment of 23S RNA is about 10 to about 1000 nucleotides in length, more preferably about 25 to about 750 nucleotides, more preferably about 50 to 500 nucleotides, and more preferably about 100 to 250 nucleotides in length. obtain. Preferably, the fragment comprises nucleotides adjacent to the nucleotide sequence of the 23S ribosomal RNA. RNA comprising a central peptidyltransferase region and the contacts identified in the art include a similar 23S RNA region with the corresponding sequence, isolated from any of the above organisms. 23S ribosomal RNA can be isolated by the methods described above, or can be isolated or constructed by standard methods. For example,S. aureusThe nucleotide sequence of the 23S RNA of Ludwig et al., Syst. Appl. Microbiol. , 1992, 15, 487-501 and Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 201-4, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. 23S RNA is described, for example, in Moazed et al. Mol. Biol. , 1986, 187, 399-416. This document is incorporated herein by reference in its entirety.
[0027]
In some embodiments of the invention, the biological target is a tRNA molecule. Preferably, the tRNA is a tRNA^fMetIt is. The tRNA can be isolated by the methods described above or, for example, E. coli. It can be isolated from cells such as E. coli or can be constructed by standard methods. The nucleotide sequence and isolation of fMet tRNA is described, for example, in Seong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 334-8, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
[0028]
In some embodiments of the invention, the biological target is a LepA protein, or a fragment thereof. LepA is also known as a protein product of the YqeQ gene. The amino acid sequence of LepA (SEQ ID NO: 1) is as shown below.
[0029]
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[0030]
Fragments of LepA have a length of about 10 to about 550 amino acids, more preferably about 25 to about 500 amino acids, more preferably about 50 to about 400 amino acids, more preferably about 100 to about 300 amino acids and More preferably, it can be from about 150 to about 250 amino acids. Preferably, the fragment comprises amino acids contiguous to the amino acid sequence of LepA. LepA can be isolated by the methods described above, or can be isolated from any of the organisms described above. LepA is described, for example, in March et al. Biol. Chem. , 1985, 260, 7206-13. This document is incorporated herein by reference in its entirety.
[0031]
In some embodiments of the invention, the biological target is L27 (11 kDa ribosomal protein) or a fragment thereof.S. aureusWherein L27 is the following representative amino acid sequence:
[0032]
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[0033]
(SEQ ID NO: 2).Bacillus  subtilisWherein L27 is the following representative amino acid sequence:
[0034]
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[0035]
(SEQ ID NO: 3).E. FIG. coliWherein L27 is the following representative amino acid sequence:
[0036]
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[0037]
(SEQ ID NO: 4).Haemophilus  influenzaeWherein L27 is the following representative amino acid sequence:
[0038]
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[0039]
(SEQ ID NO: 5). Representative references describing L27 can be found in Chen et al., FEBS Lett. , 1975, 59, 96-99, which is hereby incorporated by reference in its entirety. The fragment of L27 has a length of about 10 to about 90 amino acids, more preferably about 15 to about 75 amino acids, more preferably about 20 to about 50 amino acids, more preferably about 25 to about 40 amino acids, And more preferably about 30 to about 35 amino acids. Preferably, the fragment comprises contiguous amino acids of the amino acid sequence of L27. L27 can be isolated by the methods described above, or can be isolated or produced by standard methods, and can be isolated from any of the above organisms.
[0040]
In some embodiments of the present invention, the probe is contacted with a plurality of different biological targets, including combinations of any of the above biological targets.
The biological target is also contacted with a test compound. The amount of binding between the probe and the biological target in the presence and absence of the test compound is compared. Join
Can be measured quantitatively or qualitatively by a number of methods known to those skilled in the art. A decrease in the amount of binding between the probe and the biological target in the presence of the test compound indicates that the test compound inhibits binding of the probe to the biological target. It is also possible to screen more than one test compound at a time.
[0041]
In some embodiments of the present invention, test compounds may be further tested using mammalian cells. Can inhibit binding of the probe to a biological target in a non-mammalian cell (eg, bacteria, fungi, etc.), but cannot inhibit binding of the probe to a biological target in a mammalian cell; Alternatively, test compounds that are insignificant to inhibition may be ideal candidates for treatment of mammals. In such a case, the test compound will be one that has little, if any, effect on the mammalian cells of the host, while having activity against microorganisms or bacteria. The methods described herein are particularly useful for molecular explanations of the toxic nature of antibiotically active compounds in eukaryotic cells. In special cases, susceptible eukaryotic cells or intracellular organs are incubated and treated as defined for bacterial cells, and relevant targets are identified. This allows for the screening, assay and structure-based design limitations described below for the discovery of active antibiotics and is used as a negative selection technique. In some cases, optimization of new antibacterial or other therapeutic agents is possible.
[0042]
Photoaffinity probes that can be used in any of the methods described herein are shown below, but are not limited to Formula I, Formula II, Formula III, Formula IV, Formula V, or Formula VI, or a compound thereof. And photoaffinity probes comprising any combination of the above. The preferred configuration at C-5 is (S). It will be understood by those skilled in the art that the compounds of the present invention may have additional asymmetric centers and may be isolated as optically active forms or as racemates. The present invention includes any racemates, optically active (eg, enantiomers, diastereomers, etc.) tautomers, stereoisomers, or mixtures thereof of the compounds of the present invention. Preferred compounds of the present invention include:^ThreeH (T_Three),³⁵S, or¹²⁵I has any one radioactive element. However, it is understood that the chemical formulas include all isotopic forms of the depicted compounds.
[0043]
In some embodiments of the present invention, the photoaffinity probe comprises Formula I shown below.
[0044]
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[0045]
Wherein X and Y are independently F, H or CH in various substitution modes._ThreeIt is. Preferred compounds have one fluorine atom and one H. R¹Is H, F or I. R^TwoIs H, F or OH. R¹⁶Is H or F. R¹⁷Is H or F. R^ThreeIs H or C₁-C₈Alkyl. L is a bond or -OCH_TwoC (= O). Q is
[0046]
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[0047]
Where R^FourIs H, CH_Three, CH_TwoCH_ThreeOr cyclopropyl. Z is O or S. Compounds comprising Formula I also include pharmaceutically acceptable salts thereof.
Preferred compounds comprising Formula I have the following substituents: X is F, Y is H, R^ThreeIs H, R^FourIs CH_ThreeIt is. More preferably, compounds of Formula I include, but are not limited to, 2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluoro Phenyl] -1-piperazinyl] -2-oxoethyl 4-azido-2-hydroxy-5-iodo-^l25I-benzoate, N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-2-hydroxy-5-iodo-¹²⁵I-benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide, 2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluorophenyl] -1-piperazinyl] -2-oxoethyl 4-azido-3-iodo-¹²⁵I-benzoate, and N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-3-iodo-¹²⁵I-benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide.
[0048]
In another embodiment of the present invention, the photoaffinity probe comprises Formula II shown below.
[0049]
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[0050]
Wherein X and Y are independently F, H or CH in various substitution modes._ThreeIt is. Preferred compounds have one fluorine atom and one H. R¹Is H, F or I. R^TwoIs H, F or OH. R¹⁶Is H or F. R¹⁷Is H or F. Q is
[0051]
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[0052]
It is. Where R^FourIs H, CH_Three, CH_TwoCH_ThreeOr cyclopropyl. Z is O or S. Compounds comprising Formula II also include pharmaceutically acceptable salts thereof.
Preferred compounds comprising Formula II have the following substituents: X is F, Y is H, and R^FourIs CH_ThreeIt is. More preferably, compounds of Formula II include, but are not limited to, N-[[(5S) -3- (4′-azido-2-fluoro [1,1′-biphenyl] -4-yl) -2-yl. Oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -T_Three-Acetamide, N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl ] -T_Three-Acetamide, N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl Ethane³⁵S-thioamide, and N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo-¹²⁵I- [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide.
[0053]
In another embodiment of the present invention, the photoaffinity probe comprises Formula III shown below.
[0054]
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[0055]
Wherein X and Y are independently F, H or CH in various substitution modes._ThreeIt is. Preferred compounds have one fluorine atom and one H. R^FiveIs
[0056]
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[0057]
It is. Where R⁶Is H, N_Three, Halogen, NH_Two, OH, SH, C₁-C_FourAlkylamino, C₁-C_FourDialkylamino, C₁-C_FourAlkyl, nitrile, carboxamide, C₁-C_FourAlkoxy, C₁-C_FourAlkylthio, or C₁-C_FourAlkoxycarbonyl. P is
[0058]
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[0059]
It is. Wherein Z is O or S. R⁷Is
[0060]
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[0061]
It is. Where R¹Is H, F or I. R^TwoIs H, F or OH. R¹⁶Is H or F. R¹⁷Is H or F. Compounds comprising Formula III also include pharmaceutically acceptable salts thereof.
[0062]
Preferred compounds comprising Formula III have the following substituents: X is F, Y is H, and R⁶Is H. More preferably, compounds of formula III include, but are not limited to, (2E) -3- (4-azido-3-iodo-¹²⁵I-phenyl) -N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-propenamide, 4-azido- N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-hydroxy-5-iodo-¹²⁵I-benzamide] and N- (4-azidophenyl) -N '-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl ]-³⁵Includes S-thiourea.
[0063]
In another embodiment of the present invention, the photoaffinity probe has the formula IV shown below:
[0064]
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[0065]
Wherein X and Y are independently F, H or CH_ThreeAnd R⁸Is H, F or I; R⁹Is H, F or OH; R¹⁸Is H or F; R¹⁹Is H or F; R^TenIs H or C₁-C₈L is a bond or -OCH_TwoC (= O); Q is
[0066]
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[0067]
(Where R¹¹Is H, CH_Three, CH_TwoCH_ThreeOr cyclopropyl; and Z is O or S. ). ) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
In another embodiment of the present invention, the photoaffinity probe has the formula V shown below:
[0068]
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[0069]
Wherein X and Y are independently F, H or CH_ThreeAnd R¹²Is N_ThreeOr
[0070]
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[0071]
(Where R⁸Is H, F or I; R⁹Is H, F or OH; R¹⁸Is H or F; R¹⁹Is H or F. And Q is
[0072]
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[0073]
(Where R¹¹Is H, CH_Three, CH_TwoCH_ThreeOr cyclopropyl; Z is O or S. ). ) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
In some embodiments of the present invention, the photoaffinity probe has Formula VI shown below:
[0074]
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[0075]
Wherein X and Y are independently F, H or CH_ThreeAnd R¹³Is
[0076]
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[0077]
(Where R¹⁴Is H, N_Three, Halogen, NH_Two, OH, SH, C₁-C_FourAlkylamino, C₁-C_FourDialkylamino, C₁-C_FourAlkyl, nitrile, carboxamide, C₁-C_FourAlkoxy, C₁-C_FourAlkylthio, or C₁-C_FourAlkoxycarbonyl. And P is
[0078]
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[0079]
Wherein Z is O or S; and R¹⁵Is
[0080]
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[0081]
(Where R⁸Is H, F or I; and R⁹Is H, F or OH; R¹⁸Is H or F; and R¹⁹Is H or F. ). ). ) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0082]
The method for preparing the photoaffinity probes represented by Formulas I, II, III, IV, V, and VI is represented by the following synthetic formula. It will be apparent to those skilled in the art that the synthetic methods shown are merely representative in nature; alternatives may exist and in some cases may be more preferred.
[0083]
Non-radioactive compounds of Formulas I and IV are prepared by the methods shown in Schemes A and B. As shown in Reaction Scheme A, the benzoic acid moiety (A₁) Suitable hydroxyacetyl piperazine fragment (A_Two), L is -OCH in formula I_TwoCompound A which is C (= O)_ThreeCan be synthesized. Coupling is accomplished with 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride or other reagents well known to those skilled in the art. Suitable benzoic acid fragments may be prepared by methods known in the literature (Dupuis, Can. J. Chem., 1987, 65, 2450-2453; Shu, J. Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1996, 38, 227-237. Each of these references is incorporated herein by reference in its entirety.) Suitable hydroxyacetyl piperazine fragments can also be prepared by methods known in the literature (Barbachyn, US Pat. No. 5,547,950; Barbachyn, US Pat. No. 5,990,136; Snyder, WO 00/10566). -A1, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.) Compound A_ThreeTo¹²⁵Methods for incorporation of I are shown in Schemes C and D. Compound A₁And A_ThreeIs R at the ortho position of the acid substituent.¹⁶And R¹⁷(As in Formulas I and IV), can also be used.
[0084]
Reaction formula A:
[0085]
Embedded image

[0086]
Non-radioactive compounds of Formulas I and IV, wherein L is a bond, are prepared by the synthetic route shown in Scheme B. Suitable benzoic acid fragments (A in Scheme A)₁) Is a suitable piperazine (B_Two) And 1,1-carbonyldiimidazole in tetrahydrofuran to give the desired compound (B_Three)give. Other coupling methods known by those skilled in the art can also be used. Piperazine fragments are made by methods known in the literature (Hutchinson, US Patent No. 5,700,799, which is incorporated herein by reference in its entirety; Barbachyn, US Patent No. 5,990). , 136; and Snyder, International Publication WO 00 / 10566-A1.). Compound B_ThreeTo¹²⁵Methods for incorporation of I are shown in Schemes C and D. Compound B_ThreeHas R at the ortho position of the amide substituent¹⁶And R¹⁷(As in Formulas I and IV), can also be used.
[0087]
Reaction formula B:
[0088]
Embedded image

[0089]
Radioactive iodine is incorporated into compounds of Formulas I and IV by the methods shown in Schemes C and D. Compound C of formula I_Two(Where R¹Is OH, and R^TwoIs¹²⁵I. ) Is a compound C of the formula I₁(Prepared according to the methods of Schemes A and B) and Na¹²⁵Prepared by reaction with I and chloramine-T.
[0090]
Reaction formula C:
[0091]
Embedded image

[0092]
Alternatively, compounds D of formulas I and IV_Three(Where R¹Is H, and R^TwoIs¹²⁵I. Is prepared as shown in Scheme D. Compound D₁Reaction with hexamethylditin (prepared by the methods shown in Schemes A and B) gives stannane D_TwoIs obtained. D_TwoAnd Na¹²⁵I and D by reaction with chloramine-T_ThreeIs led.
[0093]
Reaction formula D:
[0094]
Embedded image

[0095]
Non-radioactive compounds of Formulas II and V are prepared by the method shown in Scheme E. A suitable biphenylnitro fragment (E₁) Is reduced in the presence of hydrogen gas and a palladium catalyst to give the appropriate biphenylaniline fragment (E_Two)give. Other reduction methods well known to those skilled in the art can also be used. Azide moiety (E_ThreeThe conversion to) is accomplished by displacement of the appropriate diazonium salt with sodium azide using conditions well known to those skilled in the art. The appropriate nitro fragment (E₁) Is a method known in the literature (Barbachyn, US Patent No. 5,654,435, which is incorporated herein by reference in its entirety; Barbachyn, US Patent No. 5,990,136). And Synder, WO 00 / 10566-A1), or other methods well known to those skilled in the art. The introduction of radioactive elements into compounds of formulas II and V is shown in Schemes F, G and H. Compound E₁, E_TwoAnd E_ThreeBut in the ortho position R¹⁶And R¹⁷Or R¹⁸And R¹⁹(Eqs. II and V) can also be used.
[0096]
Reaction formula E:
[0097]
Embedded image

[0098]
Scheme F shows compounds of formulas II and V, wherein Q is oxazolidinone, Z is O, and R^FourIs CH_ThreeIt is. 3) shows a method for the incorporation of tritium into). F₁(Prepared according to Scheme E) with 6N HCl and methanol to give free amine F_TwoIs obtained. F_TwoWith tritiated sodium acetate and a coupling reagent to form tritiated acetamide F_ThreeIs obtained. Suitable coupling reagents are O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate and O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N , N, N ', N'-tetramethyluronium hexaphosphate. Other acceptable coupling reagents are known by those skilled in the art. Alternatively, tritiated acetic anhydride and a suitable base can be used in place of tritiated sodium acetate and the coupling reagent. Incorporation of tritium into compounds of Formulas II and V, where Q is isoxazole, is performed similarly. Compound F₁, F_TwoAnd F_ThreeBut in the ortho position R¹⁶And R¹⁷Or R¹⁸And R¹⁹Embedded image (as in Formulas II and V), can also be used.
[0099]
Reaction formula F:
[0100]
Embedded image

[0101]
Scheme G describes compounds of Formulas II and V, where Q is oxazolidinone, Z is S, and R^FourIs CH_ThreeIt is. To)³⁵1 shows a method for the incorporation of S. F_Two(From Reaction Formula F) and ethyl³⁵By reaction with S-dithioacetate,³⁵S-thioacetamide, G_TwoIs obtained. To compounds of formulas II and V, wherein Q is isoxazole³⁵The capture of S is performed similarly. Compound G_TwoBut in the ortho position R¹⁶And R¹⁷Or R¹⁸And R¹⁹(As in Formulas II and V) can also be used.
[0102]
Reaction formula G
[0103]
Embedded image

[0104]
Radioactive iodine can be incorporated into compounds of Formulas II and V by the method shown in Scheme H. H₁(Prepared according to the route shown in Reaction Scheme E) and hexamethylditin give the organic stannane H_TwoIs obtained. H_TwoAnd Na¹²⁵I and radioiodinated compound H by reaction with chloramine-T_ThreeIs obtained.
[0105]
Reaction formula H:
[0106]
Embedded image

[0107]
Formula V (where R¹²Is N_ThreeIt is. The compounds of US Pat. 5,910,504, according to the method described in Example 17. This document is incorporated herein by reference in its entirety.
[0108]
Scheme I comprises the formulas III and VI, where P is oxazolidinone, Z is O, and R⁷Is optionally substituted azidophenyl or azidocinnamoyl. 2) shows a synthetic method for the preparation of a non-radioactive compound of (1). The appropriate acetamide fragment (I₁) Is refluxed in a methanol solution of hydrogen chloride to give the free amine I_TwoIs obtained. The acetamide fragment (I₁) Is a method known in the literature (Barbachyn, US Patent No. 5,565,571, which is incorporated herein by reference in its entirety; Barbachyn, US Patent No. 5,990,136; And Synder, International Publication WO 00 / 10566-A1). I_TwoAnd a suitable benzoic acid fragment (I_Three, N = 0) or cinnamic acid fragment (I_Three, N = 1) to give the amide I_FourIt is led to. Coupling is accomplished using EDC or other reagents well known to those skilled in the art. Suitable benzoic acid fragments (I_Three, N = 0) is the A of the reaction formula A₁Are prepared in the same manner as used to prepare Suitable cinnamic acid fragments (I_Three, N = 1) can be prepared by coupling the appropriate benzaldehyde with a Wittig-Horner reagent. Benzaldehyde fragments can be prepared by methods known in the literature (Shu, J. Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1996, 38, 227-237) or other methods well known to those skilled in the art. Compounds of formulas III and VI, wherein P is isoxazoline or isoxazolinone, are made in a similar manner. Compound I_ThreeAnd I_FourBut in the ortho position R¹⁶And R¹⁷Or R¹⁸And R¹⁹(As in Formulas III and VI) can also be used.
[0109]
Reaction formula I:
[0110]
Embedded image

[0111]
Compounds of formulas III and VI, wherein P is oxazolidinone, Z is O, and R⁷Is optionally substituted azidophenyl or azidocinnamoyl. To)¹²⁵Incorporation of I is achieved by the method shown in Scheme J. I_Four(Reaction formula I (wherein, R¹Is H, and R^TwoIs OH. ) Origin) and Na¹²⁵I and radioiodinated compound J by reaction with chloramine-T_TwoIs obtained.¹²⁵Incorporation of I into compounds of formulas III and VI, wherein P is isoxazoline or isoxazolinone, is achieved by a similar method.
[0112]
Reaction formula J:
[0113]
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[0114]
Alternatively, compounds of formulas III and VI, wherein P is oxazolidinone, Z is O, and R⁷Is optionally substituted azidophenyl or azidocinnamoyl. To)¹²⁵Incorporation of I is achieved by the method shown in Scheme K. I_Four(Reaction formula I (wherein, R¹Is I, and R^TwoIs H. ) And hexamethylditin to give organic stannane K_TwoIs obtained. K_TwoAnd Na¹²⁵I and radioiodinated compound K by reaction with chloramine-T_ThreeIs obtained. Radioiodination of compounds of formulas III and VI, wherein P is isoxazoline or isoxazolinone, is achieved by a similar method.
[0115]
Reaction formula K:
[0116]
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[0117]
Scheme L is a radioactive compound of Formulas III and VI wherein P is oxazolidinone and Z is³⁵S and R⁷Is an optionally substituted azidoaniline. 1) shows a synthetic method for the preparation of Appropriate³⁵S-isothiocyanate L_TwoWith the appropriate aminomethyl fragment I under THF reflux._Two(Reaction Formula I)³⁵S-thiourea (L_Three) Is obtained. Need³⁵S-isothiocyanate L_TwoIs a suitable aniline³⁵Prepared by reaction with S-thiophosgene. To compounds of formulas III and VI, wherein P is isoxazoline or isoxazolinone.³⁵The capture of S is performed similarly. Compound L_TwoAnd L_ThreeBut in the ortho position R¹⁶And R¹⁷Or R¹⁸And R¹⁹(As in Formula III and Formula VI), the reaction formula L can be used.
[0118]
Reaction formula L:
[0119]
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[0120]
The present invention is further described by the following examples which are intended to clarify the invention. These examples are not intended to, and should not be construed, as limiting the scope of the disclosure.
[0121]
Example
Example 1: Synthesis
2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluorophenyl] -1-piperazinyl] -2-oxoethyl 4-azido- 2-hydroxy-5-iodo-¹²⁵I-benzoate (compound C of Reaction Formula C)_Two(Wherein L is -CH_TwoC (= O), X is F, Y is H, Q is oxazolidinone, Z is O and R^FourIs CH_ThreeIt is. Is prepared as follows.
[0122]
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[0123]
Step 1
(S) -N-[[3- [3-fluoro-4- [4- (hydroxyacetyl) -1-piperazinyl] phenyl] -2-oxo-5 in dimethylformamide (10 ml) and pyridine (1 ml). To a stirring solution of oxazolidinyl] methyl] acetamide (515.8 mg, 1.31 mmol) was added 1- [3-dimethylamino] propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (509.9 mg, 2.66 mmol), Subsequently, 4-azidosalicylic acid (Dupuis, Can. J. Chem., 1987, 65, 2450-2453) and a catalytic amount of 4-dimethylaminopyridine are added. The reaction mixture is stirred at room temperature for 72 hours and then concentrated. CH residue_TwoCl_Two(100 ml) and diluted with H_TwoO (2 × 30 ml), 1N HCl (2 × 30 ml), saturated NaHCO_Three(1 × 30 ml) and dried (MgSO 4)_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_TwoIn a Biotage 40S column with SIM and 2.5% CH._ThreeCH containing OH_TwoCl_TwoIs purified as eluent to give 186.5 mg (0.33 mmol, 25%) of benzoate. 177-178 ° C (decomposition).
[0124]
Embedded image

[0125]
Step 2
Unless otherwise specified, all reagents were 0.1 N NaPO_FourPrepared in buffer. Add buffer (70 μl), chloramine-T (70 μl of a 1 mM stock solution), and the azidophenol from step 1 (10 μl of a 50 μM stock solution in DMSO) to a 1.5 ml glass reaction vessel. The reaction vessel was capped with a rubber septum cap and contained 1 mCi in sodium hydroxide.¹²⁵I_Two(10 μl) (Amersham # IMS30). The reaction is gently stirred at room temperature for 2 hours in the dark and then quenched with a 10% aqueous solution of sodium bisulfite (100 μl). After quenching, the reaction is diluted with buffer (800 μl) and transferred from the reaction vessel using a 1 ml tubeculin syringe fitted with an 18 gauge needle. The reaction solution (1 ml) was injected into a C18 sep-pak cartridge (Millipore Corporation) before adjustment, and was not taken up.¹²⁵I_TwoIs washed from the C18 resin with HPLC grade water containing 0.1% trifluoroacetic acid (20 ml). The product is 80% CH_ThreeElute using CN / 0.1 TFA (3 ml). The typical yield of the iodinated product is the total yield added to the reaction.¹²⁵I_TwoAbout 30%.
[0126]
Example 2: Synthesis
N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-2-hydroxy-5-iodo-¹²⁵I-benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (Compound C of Reaction Formula C_TwoWherein L is a bond, X is F, Y is H, Q is oxazolidinone, Z is O and R^FourIs CH_ThreeIt is. )) Is prepared as follows.
[0127]
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[0128]
Step 1
CH_TwoCl_Two(S) -N-[[3- [4- [3-Fluoro-4- (1-piperazinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (498.0 mg, 0.3 mmol) to a stirring solution of diisopropylethylamine (0.70 ml, 4.0 mmol) followed by CH_TwoCl_Two4-Azidosalicoyl chloride (342.6 mg, 1.7 mmol) in (7 ml) is added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours before CH_TwoCl_Two(50 ml) and H_TwoPartition between O (10 ml). Separate the layers. The organic layer is_TwoWash with O (10 ml) and dry (MgSO_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_TwoIn a Biotage 40S column with SIM and 3% CH._ThreeCH containing OH_TwoCl_TwoIs purified as an eluent to give 412.3 mg (0.83 mmol, 62%) of the desired benzamide as a tan solid. 188-189 ° C (decomposition).
[0129]
Embedded image

[0130]
Step 2
Starting with the phenol prepared in step 1, according to the method described in step 2 of Example 1,¹²⁵Introduce I.
[0131]
Example 3: Synthesis
2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluorophenyl] -1-piperazinyl] -2-oxoethyl 4-azido- 3-Iodine-¹²⁵I-benzoate (compound D of formula D)_Three(Wherein L is -CH_TwoC (= O), X is F, Y is H, Q is oxazolidinone, Z is O and R^FourIs CH_ThreeIt is. ))
[0132]
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[0133]
Step 1
During stirring of 4-azido-3-iodobenzoic acid (103.8 mg, 0.36 mmol (Shu, J. of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1996, 38, 227-237)) in anhydrous THF (2.0 ml). To the solution is added 1,1-carbonyldiimidazole (58.2 mg, 0.36 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour, after which (S) -N-[[3- [3-fluoro-4- [4- (hydroxyacetyl) -1-piperazinyl] phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl. [Methyl] acetamide (141.9 mg, 0.36 mmol) is added, followed by a catalytic amount of DMAP. The reaction mixture is heated at reflux for 72 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and CH_TwoCl_Two(30 ml), add H_TwoO (15 ml), 1N HCl (15 ml), saturated NaHCO_ThreeWash successively with aqueous solution (15 ml), brine (15 ml) and dry (MgSO 4)_Four), Filtered and concentrated. The residue was washed with 2% CH_ThreeCH containing OH_TwoCl_TwoPurify on a Biotage 12M column using as eluent to give 119.6 mg (0.18 mmol, 50%) of the benzoate. 137-139 ° C.
[0134]
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[0135]
Step 2
To a stirring solution of iodobenzoate (62.7 mg, 0.094 mmol) and hexamethylditin (46.3 mg, 0.14 mmol) prepared in step 1 in anhydrous THF (3 ml) was added dichlorobis (triphenylphosphine). Palladium (II) (2.0 mg, 0.003 mmol) is added. The reaction mixture is degassed and heated at reflux for 3 hours. The reaction mixture is cooled and filtered through a celite pad. The filtrate was adsorbed on silica gel and 2% CH_ThreeOH CH_TwoCl_TwoPurify on a Biotage 12M column using as eluent to give 28.6 mg (0.04 mmol, 43%) of stannane.
[0136]
Embedded image

[0137]
Step 3
To a stirring solution of the stannane prepared in step 2 in anhydrous acetonitrile was added 1M Na¹²⁵Aqueous I solution is added, followed by chloramine-T hydrate. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction mixture was_TwoS_TwoO_ThreeQuench with aqueous solution and purify to obtain radioiodinated material.
[0138]
Example 4: Synthesis
N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-3-iodo-¹²⁵I-benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (compound D of formula D_ThreeWherein L is a bond, X is F, Y is H, Q is oxazolidinone, Z is O and R^FourIs CH_ThreeIt is. ))
[0139]
Embedded image

[0140]
Step 1
To a stirring solution of 4-azido-3-iodobenzoic acid (272.0 mg, 0.94 mmol) in anhydrous THF (4 ml) is added 1,1-carbonyldiimidazole (152.6 mg, 0.94 mmol). . The reaction mixture is stirred at room temperature for 1 hour, after which (S) -N-[[3- [4- [3-fluoro-4- (1-piperazinyl)] phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] methyl] Acetamide (315.9 mg, 0.94 mmol) is added, followed by DMF (2 ml). The reaction mixture is heated at reflux for 18 hours. The reaction mixture was cooled and CH_TwoCl_Two(40 ml), add H_TwoO (20 ml), 1N HCl (20 ml), saturated NaHCO_ThreeWash successively with aqueous solution (20 ml), brine (20 ml) and dry (MgSO 4)_Four), Filter and concentrate. Residue, CH_TwoCl_TwoAnd adsorbed on silica gel, 2.5% CH_ThreeOH CH_TwoCl_TwoPurify by Biotage 40S column by SIM using as eluent to obtain 376.7 mg (0.62 mmol) of benzamide as a yellow solid.
[0141]
Embedded image

[0142]
Step 2
To a stirring solution of iodobenzamide (82.4 mg, 0.13 mmol) prepared in step 1 and hexamethylditin (71.1 mg, 0.22 mmol) in anhydrous THF (6 ml) was added tetrakis (triphenylphosphine). Add palladium (0). The reaction mixture is degassed and heated at reflux for 12 hours. The cooled reaction mixture was filtered through a plug of celite, the filtrate was adsorbed on silica gel and 2% CH_ThreeOH 49% CH_TwoCl_TwoPurify on a Biotage 12M column using and 49% EtOAc as eluent to give 28.2 mg (0.044 mmol, 34%) of stannane.
[0143]
Embedded image

[0144]
Step 3
To a stirring solution of the stannane prepared in step 2 in anhydrous acetonitrile was added 1M Na¹²⁵An aqueous solution I is added, followed by chloramine-T hydrate. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction mixture was_TwoS_TwoO_ThreeQuench with aqueous solution and purify to obtain radioiodinated material.
[0145]
Example 5: Synthesis
N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro- [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -T_Three-Acetamide (compound F of formula F)_Three(Where R¹Is H and R^TwoIs H, X is F, and Y is H. ))
[0146]
Embedded image

[0147]
Step 1
To a stirring solution of 4-iodonitrobenzene (6.86 g, 27.5 mmol) in anhydrous DMF (230 ml) was added bis (pinacolato) diboron (8.24 g, 32.4 mmol) followed by potassium acetate (8. .68 g, 88.5 mmol) and [1,1′-bis (diphenylphosphino) ferrocene] dichloropalladium (II) (624.6 mg, 0.76 mmol). The reaction mixture is degassed and heated to 85 ° C. for 2 hours. (S) -N-[[3- (3-Fluoro-4-iodophenyl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (5.8 g, 15.3 mmol) was added to the cooled dark reaction mixture. Followed by 2N Na_TwoCO_ThreeAn aqueous solution (143 ml) and [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] dichloropalladium (II) (312.0 mg, 0.38 mmol) are added. The reaction mixture is degassed and heated to 85 ° C. for 3 hours. Cool the reaction mixture with EtOAc (500 ml) and H_TwoPartition between O (300 ml). Separate the layers. The aqueous layer is extracted with EtOAc (300ml). Combine the organic layers and add H_TwoO (500 ml), washed successively with brine (500 ml) and dried (MgSO_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_TwoIn a Biotage 40M column (2 lots) by SIM and 75% EtOAc in CH._TwoCl_TwoFrom 100% EtOAc as eluent to give 3.74 g (10.0 mmol, 65%) of the desired nitrobiphenyl compound.
[0148]
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[0149]
Step 2
THF (100 ml), CH_ThreeOH (100 ml) and CH_TwoCl_TwoA mixture of the nitrobiphenyl compound prepared in step 1 (3.74 g, 10.0 mmol) and 10% palladium on carbon in (100 ml) is hydrogenated under a balloon of hydrogen for 18 hours. The reaction mixture is filtered through a mass of celite and the filtrate is concentrated to give 2.50 g (7.3 mmol, 73%) of the desired aminobiphenyl.
[0150]
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[0151]
Step 3
CH_ThreeTo a stirring solution of the aminobiphenyl (508.93 mg, 1.48 mmol) prepared in step 2 in OH (40 ml) and 1 M HCl (40 ml) was added 1.2 M NaNO with cooling at 0 ° C._TwoAn aqueous solution (1.48 ml, 1.78 mmol) is added. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 90 minutes, after which sulfamic acid (143.5 mg, 1.48 mmol) was added, followed by H_TwoAdd sodium azide (115.4 mg, 1.78 mmol) in O (1.5 ml). The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 45 minutes before_TwoCl_TwoDilute (200 ml). Separate the layers. CH layer_TwoCl_Two(75 ml). Dry the combined organic layers (MgSO 4_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_TwoAnd adsorbed on silica gel, 10% CH_ThreeOH CH_TwoCl_TwoPurify by Biotage 40S column by SIM using as eluent to obtain 262.9 mg (0.71 mmol, 48%) of the desired azidobiphenyl as a pale yellow solid.
[0152]
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[0153]
Step 4
6N HCl (2 ml) and CH_ThreeThe azidobiphenyl (102.4 mg, 0.27 mmol) prepared in step 3 in OH (6 ml) is heated at reflux for 18 hours. CH_ThreeThe OH was removed under reduced pressure and the solid precipitate was isolated by filtration,_TwoWash successively with O (10 ml), ether (2 × 15 ml) and then dry to obtain 82.1 mg (0.23 mmol, 82%) of the desired amine hydrochloride.
[0154]
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[0155]
Step 5
To a stirring solution of 0.57 mg (6.94 μmol, 250 mCi) of 1 mL of dry DMF and 2.71 mg (21 μmol) of tritiated sodium acetate salt (American Radiolabeled Chemicals, Lot No. ARC990519) in diisopropylethylamine was added at room temperature. Add 6.94 μmol of 0.45 M O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) in anhydrous DMF. The solution immediately turns pale yellow. Then, it is stirred at room temperature for 10 minutes. Then activated [^Three[H] Sodium acetate is added to a stirring solution of 2.73 mg (7.5 μmol) of the amine hydrochloride prepared in step 4 in 2 ml of anhydrous DMF. The reaction is stirred at room temperature for 4.5 hours, after which all solvent is removed by vacuum distillation at room temperature. The reaction mixture is purified by preparative TLC plates (Analtech Silica gel GF, 500 microns, 20 cm × 20 cm) eluting with 8% methanol in dichloromethane. Scrape off the desired band. The product is eluted from the silica gel using a 20% methanol in dichloromethane solution and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, the residue was dissolved in 65.5 ml of methanol, and 94.4 mCi of the desired tritiated substance (1.44 mCi / ml methanol, specific activity 57.37 mCi / mg (57.37 Ci / mmol), 99.5% radiochemical purity by HPLC).
[0156]
Example 6: Synthesis
N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -T_Three-Acetamide (compound F of formula F)_Three(Where R¹Is H and R^TwoIs I, X is F, and Y is H. ))
[0157]
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[0158]
Step 1
To a stirring solution of the aniline (284.9 mg, 0.83 mmol) prepared in Step 2 of Example 5 in 3 ml of acetic acid was added iodine monochloride (134.5 mg, 0.83 mmol) in acetic acid (0.25 ml). Add. The reaction mixture is stirred at room temperature for 1.5 hours. The reaction mixture is washed with EtOAc and Na_TwoS_TwoO_ThreePartition between aqueous solutions. Separate the layers. The aqueous layer is extracted with EtOAc (20ml). Dry the combined organic layers (MgSO 4_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeDissolved in OH, adsorbed on silica gel and 10-25% acetone in CH_TwoCl_TwoPurify by Biotage 40S column by SIM, using the solution as eluent, to give 48.4 mg (0.10 mmol, 12%) of the desired iodoaniline as a yellow oil.
[0159]
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[0160]
Step 2
CH cooled to 0 ° C_ThreeTo a stirring solution of the iodoaniline (47.2 mg, 0.10 mmol) prepared in step 1 in OH (2 ml) and 1N HCl (2 ml) was added H_TwoNaNO in O (1 ml)_Two(8.5 mg, 0.12 mmol) is added. The yellow reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes,_TwoNaN in O (1 ml)_Three(8.0 mg, 0.12 mmol) is added. The reaction solution is stirred at 0 ° C. for 1 hour, during which a yellow precipitate forms. The solid is isolated by filtration and H_TwoWash with O and dry to give 41.0 mg (0.083 mmol, 83%) of the desired iodoazidobiphenyl as a yellow solid. 173-175 [deg.] C (decomposition).
[0161]
Embedded image

[0162]
Step 3
Iodoazidobiphenyl prepared in step 2 (129.0 mg, 0.26 mmol), CH_ThreeA mixture of OH (6 ml) and 1N HCl (2 ml) is heated at reflux for 48 hours. The cooled reaction mixture is concentrated to give the desired amine hydrochloride in quantitative yield as a tan solid.
[0163]
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[0164]
Step 4
5.1 mg (0.05 mmol, 25 mCi) of tritiated acetic anhydride (Amersham Batch B77, isotope # 00-0316) was added to CH_TwoCl_Two2N PCl in_Three(25 μl). The reaction mixture is left at room temperature for 5 hours with intermittent stirring. To this mixture is added a solution of the amine hydrochloride prepared in step 3 (47.7 mg, 0.104 mmol) in pyridine (0.25 ml), followed by DMAP (4.6 mg). After 30 minutes, the reaction mixture is_TwoO and CH_TwoCl_TwoDistribute between Separate the layers. CH layer_TwoCl_TwoExtract thoroughly, then concentrate. The residue is purified on silica gel (4 g) using 20% acetone in toluene as eluent to give 38.2 mg (0.077 mmol, 74%) of the desired tritiated acetamide.
[0165]
Example 7: Synthesis
N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] ethane-³⁵S-thioamide (compound G of reaction formula G)_Two(Where R¹Is H and R^TwoIs I, X is F, and Y is H. ))
[0166]
Embedded image

[0167]
Step 1
Methyl magnesium chloride in tetrahydrofuran (THF) at 40 ° C³⁵Treat with S-labeled carbon disulfide followed by treatment with ethyl iodide. The reaction is stirred at 60 ° C. for 1.5 hours. After work-up with water and ethyl ether, the desired ethyl³⁵This gives S-dithioacetate.
[0168]
Step 2
Amine hydrochloride prepared in Step 3 of Example 6 and ethyl prepared in Step 1 [³⁵[S] dithioacetate is stirred in methylene chloride, methanol and triethylamine,³⁵S-labeled thioamide is obtained.
[0169]
Example 8: Synthesis
N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo-¹²⁵I- [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (Compound H of Reaction Formula H_ThreeWherein X is F, Y is H, Q is oxazolidinone, Z is O, and R is^FourIs CH_ThreeIt is. ))
[0170]
Embedded image

[0171]
Step 1
To a stirring solution of iodobiphenyl (56.2 mg, 0.11 mmol) and hexamethylditin (73.9 mg, 0.22 mmol) prepared in step 2 of Example 6 in toluene (5 ml) was added palladium acetate ( II) (2.6 mg, 0.011 mmol) is added, followed by triphenylphosphine (6.5 mg, 0.022 mmol). The reaction mixture is degassed and heated at 80 ° C. for 20 hours. The cooled reaction mixture was concentrated in half by volume and then 10-20% acetone in CH_TwoCl_TwoPurify on a Biotage 12S column using the solution as eluent to give 53.5 mg (0.10 mmol, 89%) of the desired stannane.
[0172]
Embedded image

[0173]
Step 2
To a stirring solution of the stannane prepared in step 1 in anhydrous acetonitrile and pH 7 phosphate buffer was added chloramine-T, followed by 1 M Na¹²⁵Add I aqueous solution. After 30 minutes, the reaction mixture was washed with saturated Na_TwoS_TwoO_ThreeQuench with aqueous solution and purify to give the title compound.
[0174]
Example 9: Synthesis
(2E) -3- (4-azido-3-iodo-¹²⁵I-phenyl) -N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-propenamide (of the reaction formula I Compound I_Four(Where R^FiveIs 4-pyridyl, X is F, Y is H, n is 1, R¹Is¹²⁵I and R^TwoIs H. ))
[0175]
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[0176]
Step 1
CH_TwoCl_TwoA stirring solution of oxalyl chloride (0.10 ml, 1.2 mmol) in (1.5 ml) is cooled to −78 ° C. and anhydrous DMSO (0.14 ml, 1.97 mmol) is added. 10 minutes later, CH_TwoCl_Two4-Azido-3-iodobenzyl alcohol (217.0 mg, 0.79 mmol (Shu, J. of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1996, 38, 227-237)) (2.5 ml) is added. After 15 minutes, triethylamine (0.33 ml, 2.37 mmol) is added and the reaction mixture is warmed to room temperature. The reaction mixture is CH_TwoCl_Two(30 ml), add H_TwoWash successively with O (20 ml), brine (20 ml) and dry (MgSO_Four), Filter and concentrate. The residue is purified on a Biotage 12M column using hexane containing 10% EtOAc to give 195.5 mg (0.72 mmol, 91%) of the desired aldehyde.
[0177]
Embedded image

[0178]
Step 2
To a stirring solution of the aldehyde (190.0 mg, 0.69 mmol) prepared in step 1 in anhydrous THF (1 ml) was added triethylphosphonoacetate (0.15 ml, 0.76 mmol) and lithium hydroxide 1 water Add the hydrate (32.1 mg, 0.76 mmol). The reaction mixture is stirred at room temperature for 48 hours. The reaction mixture is CH_TwoCl_Two(40 ml), add H_TwoWash successively with O (20 ml), brine (20 ml) and dry (MgSO_Four), Filter and concentrate. CH residue_TwoCl_TwoAnd purified on a Biotage 40S column using a SIM using 5% EtOAc in hexane as eluent to give 165.1 mg (0.48 mmol, 70%) of the desired ester Get. 93-94 ° C.
[0179]
Embedded image

[0180]
Step 3
CH_ThreeTo a stirring solution of the ester prepared in step 2 (66.7 ml, 0.19 mmol) in OH (2 ml) is added 1N LiOH (0.19 ml, 0.19 mmol). The reaction mixture is heated at reflux for 12 hours. The cooled reaction mixture is concentrated and used immediately.
[0181]
Step 4
CH_Three(S) -N-[[3- [3-Fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide (1) in OH (62 ml) and 6N HCl (31 ml) .40 g, 4.25 mmol) is heated at reflux for 18 hours. Concentrate the reaction mixture to obtain 1.48 g of amine dihydrochloride.
[0182]
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[0183]
Step 5
Amine dihydrochloride (from Step 4) (68.2 mg, 0.19 mmol), lithium carboxylate prepared in Step 3, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (72.8 mg) , 0.38 mmol) and 1-hydroxybenztriazole hydrate (30.8 mg, 0.23 mmol) are dissolved in pyridine (2 ml) and stirred at room temperature for 72 hours. Concentrate the reaction mixture. CH residue_TwoCl_Two(40 ml) and dissolved in H_TwoO (20 ml), brine (20 ml) and dried (MgSO_Four), Filter and concentrate. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_TwoAnd adsorbed on silica gel, 2% CH_ThreeOH (NH_ThreeCH)_TwoCl_TwoPurify by Biotage 12M column by SIM, using the solution as eluent, to obtain 56.2 mg (0.096 mmol, 51%) of the desired cinnamide.
[0184]
Embedded image

[0185]
Step 6
To a stirring solution of iodocinnamide prepared in step 4 and hexamethylditin (71.1 mg, 0.22 mmol) in anhydrous THF (6 ml) is added tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0). The reaction mixture is degassed and heated at reflux for 12 hours. The cooled reaction mixture is filtered through a plug of celite, the filtrate is adsorbed on silica gel and purified on a Biotage 12M column using a SIM to give stannane.
[0186]
Step 7
To a stirring solution of the stannane prepared in step 5 in anhydrous acetonitrile was added 1M Na¹²⁵Aqueous I solution is added, followed by chloramine-T hydrate. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction mixture was_TwoS_TwoO_ThreeQuench with aqueous solution and purify to obtain radioiodinated material.
[0187]
Example 10: Synthesis
4-azido-N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-hydroxy-5-iodo-¹²⁵I-benzamide (Compound J of Reaction Formula J_Two(Where R^FiveIs 4-pyridyl, X is F, Y is H, and n is 0. ))
[0188]
Embedded image

[0189]
Step 1
Pyridine (4 ml) and CH_TwoCl_TwoTo a stirring suspension of the amine dihydrochloride (172.4 mg, 0.48 mmol) prepared in Step 4 of Example 9 in (1 ml) was added 4-azidosalicylic acid (128.9 mg, 0.72 mmol). In addition, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (184.0 mg, 0.96 mmol) and 1-hydroxybenztriazole hydrate (77.8 mg, 0.58 mmol) were added. Add. The reaction mixture is left at room temperature for 72 hours and then concentrated. CH residue_ThreeOH / CH_TwoCl_Two(40 ml), adsorbed on silica gel and purified by Biotage 40S column by SIM using EtOAc as eluent to give 44.8 mg (0.10 mmol, 21%) of benzamide as a tan solid. . 200-202 ° C (decomposition).
[0190]
Embedded image

[0191]
Step 2
Starting from the phenol prepared in Step 1, according to the method described in Step 2 of Example 1,¹²⁵Introduce I.
[0192]
Example 11: Synthesis
N- (4-azidophenyl) -N '-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl]-³⁵S-thiourea (compound L of formula L)_Three(Where R^FiveIs 4-pyridyl, X is F, Y is H, R¹Is H and R^TwoIs H. ))
[0193]
Embedded image

[0194]
To a stirring solution of the amine dihydrochloride (from step 4 of Example 9) in anhydrous THF was added Hunig's base, followed by the addition of THF in THF.³⁵Add S-4-azidophenyl isothiocyanate. The reaction mixture is heated at reflux for 1 hour. The cooled reaction mixture is purified to obtain the desired thiourea.
[0195]
Example 12: Identification of biological targets
Bacteria that are sensitive to the original antibiotic (eg,S. aureusOr other susceptible Gram-positive or Gram-negative bacteria) are grown in complete Mueller-Hinton medium to mid-exponential phase. An aliquot of the culture is taken, briefly sedimented in RNase-depleted tubes (1.5 ml volume), and then resuspended in fresh Mueller-Hinton medium. A competitor compound (active or inactive as an antibiotic) is added from a stock solution containing DMSO (total final concentration = 0.2%). Active photoaffinity probes (eg, compounds such as compounds represented by the formulas herein; unlabeled and¹²⁵I-labeling,^ThreeH-labeled, or any other radioactively labeled or non-radioactively detectable mixture of compounds) is added to a final concentration near the minimum inhibitory concentration (MIC) for antibacterial action. This exposure is continued at 37 ° C. in the dark for 30 minutes.
[0196]
The bacteria are then exposed directly to ultraviolet light to activate the photoprobe, or simply settled and resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and then exposed to ultraviolet light (energy setting 180,000 micron). Joule's Stratalinker). Thereafter, the labeled cells are washed with PBS, and then buffer A (10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 30 mM NH 3_FourCl, 30 mM MgCl_Two) And dissolved with lysostaphin (15 min at 37 ° C, final concentration of lysostaphin 5 μg / ml) The cell wall and large membrane fragments are then removed by centrifugation at 18,000 xg for 15 minutes. The resulting supernatant is sedimented at 450,000 × g for 60 minutes to obtain a pellet containing cell membranes and ribosomes. The pellet is resuspended in buffer B (10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.5% SDS and 6 mM EDTA), and RNA is extracted by a standard phenol extraction method. The RNA extract is precipitated with ethanol and resuspended in a suitable buffer for RNA electrophoresis. The crude pellet is subjected to electrophoresis for proteins. For example, cross-linking of a labeled photoprobe with ribosomal RNA (23S, 16S, 5S-sized ribosomal RNA) or transfer RNA is detected by RNase H digestion followed by a primer extension assay and the exact cross-linking that occurred Base is obtained. The occurrence of specific cross-links can be confirmed through the use of compounds that are biologically active antibiotics, resulting in a reduced amount of cross-links. Further confirmation of the occurrence of cross-linking is that competitive antibiotics that are biologically inactive (lack of activity as antibiotics) reduce the amount of specific cross-linking of RNA and / or protein to the target Achieved by observing what is not done.
[0197]
Using this approach, a portion of the RNA (23S RNA peptidyl transferase region including A2602, U2506, A2451), the tRNA combined with 64 kDa LepA and 11 kDa L27, was identified as a biological target. And they can be used in the discovery of unique inhibitors of protein translation based on this mechanism.
[0198]
Example 13: Identification of compound having antibiotic activity
For the detection of binding of a typical photoaffinity probe, such as, for example, an oxazolidinone photoaffinity probe or equivalent compound, which has been labeled by either radioactive or non-radioactive (eg, enzymatic, chemiluminescent or fluorescent) means. In proteins, the components of the protein (eg, 64 kDa and 11 kDa proteins (LepA and L27, respectively)) and / or RNA are used either alone or in combination. The ability of the test compound to interfere with the interaction is determined. In optimizing potential therapeutics, increased interactions at these sites are used as positive selection criteria, whereas interactions at eukaryotic cell sites are used as negative selection criteria.
[0199]
Ribosomal RNA is bound by charge interaction to a solid surface, such as, for example, a scintillation proximity bead (SPA). Additional additives in the assay include tRNA and associated 64 kDa LepA and L27 proteins, as well as other biological targets identified by the methods described above. Biological targets and / or test compounds can be tested alone or in any combination. Representative oxazolidinones or equivalent compounds (e.g., eperezolid) are labeled as described above (e.g.,^ThreeH-eperezolid) and measures the ability of the test compound to antagonize or reduce the binding of the labeled compound. In the example of tritiated SPA, measurement by liquid scintillation is possible. However, other probes with other methods of measurement (eg, coupled enzymatic activity, chemical shift / measurement, fluorescence) can also be used. An effective concentration of a compound that specifically reduces binding to a target identified as described above is interpreted as a positive selection criterion for a potential therapeutic. For those compounds of interest identified in that manner, subsequent tests for selection for the target for toxicity identified in the target eukaryotic cell by similar techniques, but using the eukaryotic target molecule. Is made. For these purposes, proteins are also selected by means of antibodies or well-known chemical tags (eg, histidine-metal, streptavidin-biotin, etc.) attached to identified targets, for selection matrices. Can be combined.
[0200]
In particular, iodinated probes with antagonism of cross-linking by both active and inactive enantiomers of eperezolide can be used to illustrate this particular embodiment.S. aureusGrow at an exponential rate. An aliquot of the cells (1 ml / 1.5 ml tube) was gently settled, and 30 minutes of 40 μM active eperezolide (S) or inactive enantiomer (R) and 8 μM¹²⁵Resuspend in fresh medium with or without I-probe (2 μCi / tube). The sample is then processed as described above in Example 12. Assaying RNA by such methods indicates that 23S RNA is inhibited in a specific manner, eg, cross-linking is inhibited by the active enantiomer (S), but not by the inactive enantiomer. Separation of RNA on a 1% agarose gel shows that 23S RNA specifically forms crosslinks (data not shown). Separation on a 10% TBE urea electrophoresis gel shows that tRNA also forms crosslinks (data not shown). Autoradiograms of 10-20% tris-tolysine polyacrylamide analysis of ribosome precipitation show cross-link formation of 64 kDa protein (LepA) and 11 kDa protein (L27) (data not shown).
[0201]
The information gained from studies on crosslink formation can also be used for structure-based design. That is, co-crystals are prepared with the oxazolidinone or equivalent molecule together with one or more key components of the identified or described interactions. A summary of the direct interactions with the relevant binding sites is used as a positive guide in the construction of new potential therapeutics. Co-crystals of the same test compound with a eukaryotic cell target can be used as a negative selection.
[0202]
By a similar principle, NMR is used to study the interaction of a suitable test compound (oxazolidinone or equivalent molecule) with any or all of the corresponding target molecules identified by cross-link formation studies. sell. In this case, either the test compound and / or the biological target are appropriately modified to allow the site of interaction to be determined by standard techniques.
[0203]
As will be appreciated by those skilled in the art, numerous modifications and improvements may be made to the preferred embodiments of the present invention without departing from the gist of the invention. All such variations are intended to fall within the scope of the invention. The entire disclosure of each publication cited herein is hereby incorporated by reference.

Claims (34)

A method for identifying a biological target of an oxazolidinone-type antibiotic, comprising:
Contacting the susceptible cells with an oxazolidinone photoaffinity probe;
Exposing the photoaffinity probe to light to form a complex between the photoaffinity probe and the biological target; and detecting the complex. The method of claim 1, wherein the photoaffinity probe is detectably labeled. 3. The method of claim 2, wherein said detectable label is enzymatic, chemiluminescent, fluorescent, or radioactive. The method according to claim 1, wherein the detection of the complex is by autoradiography. The photoaffinity probe has the formula

[Where,
X and Y are independently, F, H or CH _3;
R ⁸ is H, F or I;
R ⁹ is H, F or OH;
R ¹⁸ is H or F;
R ¹⁹ is H or F;
R ¹⁰ is H or C ₁ -C ₈ alkyl;
L is a bond or —OCH ₂ C (＝ O); and Q is

Wherein R ¹¹ is H, CH ₃ , CH ₂ CH ₃ or cyclopropyl; and Z is O or S. ]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. X is F, Y is H, R ¹⁰ is H, and R ¹¹ is CH _3, The method of claim 5. The photoaffinity probe is 2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluorophenyl] -1-piperazinyl] -2 The method according to claim 5, which is -oxoethyl 4-azido-2-hydroxy-5-iodo- ^125I- benzoate. The photoaffinity probe is selected from N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-2-hydroxy-5-iodo- ^125I- benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl ] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide. The photoaffinity probe is 2- [4- [4-[(5S) -5-[(acetylamino) methyl] -2-oxo-3-oxazolidinyl] -2-fluorophenyl] -1-piperazinyl] -2 6. The method according to claim 5, which is -oxoethyl 4-azido-3-iodo- ^125I- benzoate. The photoaffinity probe is N-[[(5S) -3- [4- [4- (4-azido-3-iodo- ^125I- benzoyl) -1-piperazinyl] -3-fluorophenyl] -2-. The method according to claim 5, which is oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide. The photoaffinity probe has the formula

[Where,
X and Y are independently, F, H or CH _3;
R ¹² is N ₃ or

Wherein R ⁸ is H, F or I;
R ⁹ is H, F or OH;
R ¹⁸ is H or F;
R ¹⁹ is H or F. And Q is

Wherein R ¹¹ is H, CH ₃ , CH ₂ CH ₃ or cyclopropyl; and Z is O or S. ]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. X is F, Y is H, R ¹¹ is CH ₃ , and R ¹² is

The method of claim 11, wherein The photoaffinity probe is N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl]- T ₃ - acetamide the method of claim 11. The photoaffinity probe may be N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-. oxazolidinyl] methyl] -T ₃ - acetamide the method of claim 11. The photoaffinity probe is N-[[(5S) -3- (4'-azido-2-fluoro-3'-iodo [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2-oxo-5-. oxazolidinyl] methyl] ethane - ³⁵ is a S- thioamide the method of claim 11. The photoaffinity probes, N - [[(5S) -3- (4'- azido-2-fluoro-3'-iodo - ¹²⁵ I- [1,1'-biphenyl] -4-yl) -2- 12. The method according to claim 11, which is oxo-5-oxazolidinyl] methyl] acetamide. The photoaffinity probe has the formula

[Where,
X and Y are independently, F, H or CH _3;
R ¹³ is

(Wherein R ¹⁴ is H, N ₃ , halogen, NH ₂ , OH, SH, C ₁ -C ₄ alkylamino, C ₁ -C ₄ dialkylamino, C ₁ -C ₄ alkyl, nitrile, carboxamide, C ₁ -C ₄ alkoxy, a C ₁ -C ₄ alkylthio or C ₁ -C ₄ alkoxycarbonyl,);. and P,

Wherein Z is O or S; and R ¹⁵ is

Wherein R ⁸ is H, F or I;
R ⁹ is H, F or OH;
R ¹⁸ is H or F; and R ¹⁹ is H or F. ). ]. ]
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. X is F, Y is H, R ¹⁴ is H, A method according to claim 17. The photoaffinity probe is (2E) -3- (4-azido-3-iodo- ¹²⁵ I-phenyl) -N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl ] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-propenamide. The photoaffinity probe is 4-azido-N-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl] -2-hydroxy- 18. The method according to claim 17, which is 5-iodo- ^125I- benzamide. The photoaffinity probe is N- (4-azidophenyl) -N ′-[[(5S) -3- [3-fluoro-4- (4-pyridinyl) phenyl] -2-oxo-5-oxazolidinyl] methyl - ³⁵ a S- thiourea the method of claim 17. A method for identifying a compound that inhibits binding of a probe to its biological target, comprising:
Contacting a probe with the biological target, wherein the biological target is ribosomal RNA, tRNA, LepA protein, L27 protein, or any combination thereof;
Contacting a test compound with the biological target; and comparing the amount of binding between the probe and the biological target in the presence and absence of the test compound, wherein: A decrease in the amount of binding between the probe and the biological target in the presence of the test compound means that the test compound inhibits binding of the probe to the biological target.) The above method comprising the step of: 23. The method of claim 22, wherein said biological target is bound to a solid phase. 24. The method of claim 23, wherein said solid phase is a scintillation proximity bead. 23. The method of claim 22, wherein said biological target is 23S ribosomal RNA. 26. The method of claim 25, wherein the biological target is a fragment of 23S ribosomal RNA that includes a peptidyl transferase region. 23. The method of claim 22, wherein said biological target is a tRNA. 28. The method of claim 27, wherein said biological target is tRNA ^fMet . 23. The method of claim 22, wherein said biological target is a LepA protein. 23. The method of claim 22, wherein said biological target is an L27 ribosomal protein. 23. The method of claim 22, wherein said probe is detectably labeled. 32. The method of claim 31, wherein said detectable label is enzymatic, chemiluminescent, fluorescent, or radioactive. 23. The method according to claim 22, wherein said probe is an oxazolidinone compound. 34. The method according to claim 33, wherein the oxazolidinone compound is linezolid or eperezolide.