【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌類遺伝子発現のレギュレータならびに商業および医療適用分野におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、酵素、二次代謝産物および他の有用な産物の生産に関与する菌類遺伝子のレギュレータならびに菌類の侵入に関与する遺伝子のレギュレータに関する。
【背景技術】
【０００２】
菌類は、商業および医療適用分野にとって有用な物質の最も一般的な天然供給源である。これらの有用な物質の多くは、二次代謝産物である。
【０００３】
種々の菌類による二次代謝産物の生産は、治療上重要な様々な医薬品の極めて重要な供給源である。ペニシリンおよびセファロスポリンのようなβ−ラクタム抗菌剤は、それぞれペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）により生産されるが、これらの化合物は圧倒的高頻度で使用されている抗菌剤である（ルエンゴおよびペナルバ（Ｌｕｅｎｇｏ ａｎｄ Ｐｅｎａｌｖａ）、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第２９巻、６０３〜３８ページ（１９９４年）；ジェンセンおよびデマイン（Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｍａｉｎ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２８巻、２３９〜６８ページ（１９９５年）；ブラクヘージ（Ｂｒａｋｈａｇｅ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第６２巻、５４７〜８５ページ（１９９８年）にレビューされている）。環状ウンデカペプチド類のメンバーであるシクロスポリンＡは、トリポクラジウム・インフラタム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ）により生産される。シクロスポリンＡは、移植患者における罹患率を劇的に低減し、生存率を増大させる（ボレル（Ｂｏｒｅｌ）、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、第３８巻、９〜１８ページ（１９８６年））。さらに、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）および他のいくつかの菌類により生産されるロバスタチンを始めとするいくつかの菌類二次代謝産物は、コレステロール低下薬である（アルバーツら（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻、３９５７〜３９６１ページ（１９８０年））。これらおよび他の多くの菌類二次代謝産物は、世界的に医療に大きく貢献してきた（デマイン（Ｄｅｍａｉｎ）、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ、第１７１巻、３〜１６ページ（１９９２年）；ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１９巻、１〜４０ページ（１９９９年）を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
残念ながら、二次代謝産物の活性を検出することと純粋な薬物を十分量生産することとの間には多くの課題が存在する。そのため、菌類による二次代謝産物の生産を向上させるために努力がなされてきた。最近、二次代謝産物の生産に必要な反応を触媒する生合成酵素をコードする遺伝子を操作することにより、菌株が改善された。ペナルバら（Ｐｅｎａｌｖａ ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１６巻、４８３〜４８９ページ（１９９８年）は、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の生産株のペニシリン合成構造遺伝子のコピー数を増大させたことを開示している。他の研究では、他の生合成酵素をコードする遺伝子の発現を変動させ、それにより、菌類の代謝全体に影響を及ぼしている。ミンゴら（Ｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２１巻、１４５４５〜１４５５０ページ（１９９９年）は、フェニル酢酸の２−ヒドロキシル化を触媒する、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）の酵素ｐｈａｃＡをコードする遺伝子の破壊が、おそらく基質であるフェニル酢酸に対する競合の消失により、ペニシリン生産の増大をもたらすことを示している。同様に、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるアミノアジピン酸レダクターゼをコードする遺伝子の破壊が、おそらく基質α−アミノアジピン酸塩に対する競合の消失により、ペニシリンの生産を増大させた（カスキエロら（Ｃａｓｑｕｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１８１巻、１１８１〜１１８８ページ（１９９９年））。
【０００５】
したがって、遺伝子操作は、二次代謝産物の生産を向上させるのに有望である。二次代謝産物生産の生合成酵素の活性を増大させる、あるいは競合する生合成経路の活性を低減する遺伝子操作は、生産向上に有効であることが立証されている。最大の効果は、いくつかの遺伝子操作戦略の組合せによって達成されると思われる。例えば、生合成酵素をコードする遺伝子を制御する遺伝子の発現を変動させること、あるいは代謝前駆物質の濃度を変化させることにより、生産が向上すると思われる。さらに、遺伝子操作は、発酵槽の運転または下流の処理において遭遇する問題（例えば、エネルギーコスト、所望の代謝産物の特異的生産、代謝産物の最大限の回収、発酵廃棄物の処理コスト）に対して大きな効果を与えるために用いることができると思われる。したがって、菌類における二次代謝産物の生産を向上させ得るレギュレータ遺伝子（制御遺伝子）が必要とされている。
【０００６】
酵素は、他の商業的に重要な菌類産物である。近年、遺伝子操作により菌類の酵素生産を向上させる努力がなされている。ノイエルら（Ｎｏｅｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２７巻、１３１〜１４２ページ（１９９８年）は、ＺＢＣタンパク質であるｘｌｎＲがアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）においてキシラン分解性細胞外酵素の発現を誘導することを教示している。ハスパーら（Ｈａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３６巻、１９３〜２００ページ（２０００年）は、ｘｌｎＲがアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）におけるＤ−キシロースレダクターゼ遺伝子の発現も制御することを教示している。菌類によって生産される多くの有用な酵素を考えると、これらの酵素の生産を向上させ得るレギュレータ遺伝子が依然として必要とされている。
【０００７】
菌類の侵入に関連する遺伝子を識別するレギュレータも必要である。菌類の侵入は菌類の病原性に必要であり、その制御は二次代謝産物および酵素の生産に関連していると思われる。菌類感染は、特に免疫不全の患者においては重大な健康上の問題である。ハーおよびホワイト（Ｈａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第４３巻、７６３〜７６８ページ（１９９９年）は、病原性の酵母カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）により引き起こされるカンジダ症がＡＩＤＳおよび他の免疫不全状態に伴って最も高頻度にみられる菌類感染であることを教示している。ウエイグら（Ｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、４６８〜４７０ページ（１９９８年）は、カンジダ感染の頻度が近年増加し、かつ罹患率および死亡率の有意な上昇を伴っていることを開示している。これらの感染の多くは、病院内の環境において発生している。バイリーおよびダグラス（Ｂａｉｌｌｉｅ ａｎｄ Ｄｏｕｇｌａｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３１０巻、６４４〜６５６ページ（１９９９年）は、カンジダ種により引き起こされる院内敗血症の大部分がカテーテルおよびシャント上のバイオフィルム形成に由来することを教示している。侵入またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子に関してはほとんど知られていない。したがって、抗真菌薬開発の標的として作用する、菌類の侵入を制御する新たな遺伝子を特定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、新規な菌類レギュレータ遺伝子ならびに商業および医療適用分野においてレギュレータ遺伝子を使用する方法を提供する。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、二次代謝産物の生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御するタンパク質をコードすることが示されている、新規な単離遺伝子または組換え遺伝子を提供する。特定の好ましい実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体（ホモログ）を提供する。これらの遺伝子およびその相同体は、二次代謝産物または酵素の生産を向上させるのに、あるいは新規抗真菌薬を発見するための標的として有用である。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御するタンパク質をコードすることが示されている遺伝子に対して特異的に相補的である単離核酸および組換え核酸を提供する。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御することが示されている精製タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのようなタンパク質の相同体を提供する。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御することが示されているタンパク質に特異的に結合する新規な結合物質を提供する。
【００１３】
第５の態様において、本発明は、菌類の侵入に必要な菌類遺伝子であって、かつ、その発現が二次代謝産物の生産も変動させる因子によって制御されると考えられる菌類遺伝子ＦＬＯ１１の発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な組換え遺伝子を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。これらの遺伝子は、抗真菌薬の開発の標的として有用であり、また、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、二次代謝産物ロバスタチンの生産に関与する菌類遺伝子ｌｏｖＦの発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な組換え遺伝子を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。
【００１５】
第７の態様において、本発明は、二次代謝産物ロバスタチンの生産に関与する菌類遺伝子ｌｏｖＥの発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な組換え遺伝子を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。
【００１６】
第８の態様において、本発明は、二次代謝産物ペニシリンの生産に関与する菌類遺伝子ａｃｖＡの発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な組換え遺伝子を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。
【００１７】
第９の態様において、本発明は、新規な菌類レギュレータ遺伝子を菌類において発現させることからなる、二次代謝産物または酵素の生産を変動させる方法を提供する。
【００１８】
第１０の態様において、本発明は、新規なキメラの菌類レギュレータ遺伝子を提供する。
【００１９】
第１１の態様において、本発明は、新規なキメラの菌類レギュレータ遺伝子を菌類において発現させることからなる、二次代謝産物または細胞外酵素の生産を変動させる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、菌類遺伝子発現のレギュレータならびに商業および医療適用分野におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、酵素、二次代謝産物および他の有用な産物の生産に関与する菌類遺伝子のレギュレータならびに菌類の侵入に関与する遺伝子のレギュレータに関する。本願明細書に引用した特許および刊行物は、この分野における知識水準を反映するものであり、それら全部を本願明細書に援用する。引用文献の教示と本明細書との間に不一致があった場合には、後者を優先すべきである。
【００２１】
本発明は、菌類遺伝子発現の新規レギュレータならびに商業および医療適用分野においてレギュレータ遺伝子を使用する方法を提供する。
【００２２】
第１の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御するタンパク質をコードすることが示されている新規な単離遺伝子または組換え遺伝子を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。これらの遺伝子およびその相同体は、二次代謝産物または酵素の生産を向上させるのに、あるいは新たな抗真菌薬を発見するための標的として有用である。
【００２３】
本明細書において、「組換え遺伝子」とは、タンパク質をコードする核酸配列であって、線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、共有結合により閉じた環状ＤＮＡもしくはＲＮＡの形態で、または染色体の一部として存在していてよく、ただし、遺伝子が通常自然状態で存在する天然の染色体遺伝子座の単一コピーではあり得ない。したがって、本発明のこの態様は、そのような組換え遺伝子を含む、遺伝的に修飾された生物体を含む。
【００２４】
本明細書において、遺伝子の「相同体」は、対照標準遺伝子と比較したとき、表Ｉに示す値よりも低いＥ値を有するか、あるいは相同領域においてより高い同一性の割合の値を有する遺伝子である。表Ｉに対照標準遺伝子、それらのＥ値、および適用可能な場合、それらの同一性の割合の一覧を示す。対照標準遺伝子と公開遺伝子データベース由来の配列との間に同一性を有する領域が存在する場合は、その同一性を有する領域を示す。そのような場合、部位１を、配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）に示す対照標準遺伝子の最初のヌクレオチドと定義する。
【００２５】
特定の好ましい実施形態において、相同体は新規な対照標準遺伝子の優性突然変異体である。「優性（ドミナント）突然変異体」は、非突然変異型の遺伝子の存在を越えて生物体の表現型を変化させることができるタンパク質をコードする対立遺伝子である。優性突然変異体には、この遺伝子の非突然変異型（またはその相同体）が生物体に存在する場合でさえも生物体の表現型を変化させることができるタンパク質をコードする突然変異体が含まれるが、限定はされない。好ましい優性突然変異体としては、優性負（ドミナントネガティブ）突然変異体、優性正（ドミナントポジティブ）突然変異体および優性ネオモルフ変異体が挙げられる。「優性負突然変異体」は、同変異体が派生したもとの遺伝子もしくは遺伝子産物またはその相同体の、一部の機能を妨害することにより、その表現型上の効果を達成する優性突然変異体である。「優性正突然変異体」は、同変異体が派生したもとの遺伝子もしくは遺伝子産物またはその相同体の、一部の機能を活性化することにより、その表現型上の効果を達成する優性突然変異体である。「優性ネオモルフ変異体」は、同変異体が派生したもとの遺伝子もしくは遺伝子産物またはその相同体に、新規または異なる機能を与えることにより表現型上の効果を達成する優性突然変異体である。
【００２６】
【表１】
表Ｉに示すデータは、新規な対照標準遺伝子を利用可能な遺伝子データベースと比較することにより得られる。本発明者らは、http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/blast/にて公的に利用可能であるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）ツールを利用した。これは、配列データベースを探索するために設計された類似性検索プログラムのセットである。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴの現行バージョンであるＢＬＡＳＴ２．１．２には、ＮＣＢＩウェブサイトから直接アクセスした。ＢＬＡＳＴプログラムの出力の１つが期待値（Ｅ値）であり、これは、ある特定の大きさのデータベースを検索するとき、偶然に起きることが予想できる「ヒット」の数を表すパラメータである。
【００２７】
本発明の新規なレギュレータ遺伝子のヌクレオチドコーディング配列のＥ値を決定するために、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いた。このプログラムは、ヌクレオチド問い合わせ（クエリ）配列（対照標準配列）をヌクレオチド配列データベースに対して比較する。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴサイトで利用可能な次のデータベースを用いた。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＰＤＢのすべての配列を含むｎｒ、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））ゲノムヌクレオチド配列、特許、および非ヒト／マウスＥＳＴ（発現配列タグ）配列を用いた。http://www.mips.biochem.mpg.de/egi-bin/blast/blast_page?genus=neurosporaにおいて入手可能なニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）の部分ゲノム配列を用いたＢＬＡＳＴ解析も行った。表Ｉは、これらの５つのデータベースにおける最も低いＥ値を示している。
【００２８】
ギャップアライメント解析には、ｂｌａｓｔｎアルゴリズムのデフォルト設定を用いた。これらは、−Ｇ（ギャップ開始コスト）、デフォルト値＝５；−Ｅ（ギャップ延長コスト）、デフォルト値＝２；−ｑ（塩基ミスマッチに対するペナルティ）、デフォルト値＝−３；−ｒ（塩基マッチに対するスコア（ｒｅｗａｒｄ））、デフォルト値＝１；−ｅ（期待値）、デフォルト値＝１０．０；および−Ｗ（ワードサイズ）、デフォルト値＝１１である。
【００２９】
データベース中に関連配列を有さない新規な対照標準遺伝子については、推測に基づく関連遺伝子について妥当なＥ値を定義する方法として、Ｅ値を１ｅ−５と「仮に設定」した。データベース中に同一ではないが関連する配列を有する遺伝子については、Ｅ値は最も近い「関係のある」遺伝子のＥ値である。データベース中の遺伝子と広範な相同領域を有する遺伝子については、アルゴリズムにより得られる同一性の割合の値（％）を同一性を有する領域とともに表Ｉに含める。
【００３０】
表ＩＩに、遺伝子配列の一部はデータベースにあるが、本発明者らが今回より完全な配列を提供する、本発明の新規なレギュレータ遺伝子を示す。
【００３１】
【表２】
本発明のこの態様による好ましい遺伝子は、Ｐｃ８０４（配列番号１）、Ａｎ０１（配列番号３）、Ａｎ０５（配列番号５）、Ａｎ０９（配列番号７）、Ａｎ１０（配列番号９）、Ａｎ１３（配列番号１１）、Ａｎ１７（配列番号１３）、Ａｎ２０（配列番号１５）、Ａｎ２８（配列番号１７）、Ａｎ３４（配列番号１９）、Ａｔ０１−１（配列番号２１）、Ａｔ０１−２（配列番号２３）、Ａｔ０３（配列番号２５）、Ａｔ０５（配列番号２７）、Ａｔ０７（配列番号２９）、Ａｔ０８（配列番号３１）、Ａｔ１１（配列番号３３）、Ａｔ１４（配列番号３５）、Ａｔ１６（配列番号３７）、Ａｔ１８（配列番号３９）、Ａｔ１９（配列番号４１）、Ａｔ２０（配列番号４３）、Ａｔ２２（配列番号４５）、Ａｔ２４（配列番号４７）、Ａｔ２７（配列番号４９）、Ａｔ３２（配列番号５１）、Ｐｃ０５（配列番号５３）、Ｐｃ０６（配列番号５５）、Ｐｃ０７（配列番号５７）、Ｐｃ０８（配列番号５９）、Ｐｃ０９（配列番号６１）、Ｐｃ１０（配列番号６３）、Ｐｃ１８（配列番号６５）、Ｐｃ２４（配列番号６９）、Ｐｃ２５（配列番号７１）、Ｐｃ３３（配列番号７３）、Ｐｃ３４（配列番号７５）、Ａｔ５０１（配列番号７７）、Ａｔ５７４（配列番号７９）、Ａｔ２７９（配列番号８１）、Ａｔ２８６（配列番号８３）、Ａｔ２９１（配列番号８５）、Ａｔ３２０（配列番号８７）、Ａｔ３２２（配列番号８９）、Ａｎ１０００（配列番号９１）、Ａｔ１６７（配列番号９３）、Ａｔ２２１（配列番号９５）、Ａｔ２３３（配列番号９７）、Ａｔ２３９（配列番号９９）、Ａｔ２４０（配列番号１０１）、Ａｔ２７４（配列番号１０３）、Ｐｃ１０００（配列番号１０５）、Ｐｃ１００１（配列番号１０７）からなる群から選択される。
【００３２】
第２の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御するタンパク質をコードすることが示されている遺伝子に対して特異的に相補的である単離核酸または組換え核酸を提供する。「組換え」という用語は、先に使用されているとおりである。
【００３３】
ある配列が他の配列と特異的にハイブリッド形成するに十分に相同であるならば、その配列は前記他の配列に対して「特異的に相補的」である。ある配列が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはイオン強度に関して生理的条件に近い条件、例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２のような条件下でハイブリダイズしてワトソン・クリック型塩基対またはフーグスティン型塩基対を形成するならば、その配列は前記他の配列に「特異的にハイブリダイズする」。そのような特異的なハイブリッド形成は、ストリンジェントな条件下、例えば、６８℃で０．２×ＳＳＣ中で維持されることが好ましい。
【００３４】
第３の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御することが示されている精製タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのようなタンパク質の相同体を提供する。本明細書において、タンパク質の「相同体」とは、対照標準タンパク質と比較したとき、表ＩＩＩに示す値よりも低いＥ値を有するか、あるいは類似性の領域においてより高い正の割合の値を有するタンパク質である。表ＩＩＩに対照標準タンパク質、それらのＥ値、および適用可能な場合はそれらの正の割合の一覧を示す。対照標準タンパク質とタンパク質配列データベース由来の配列との間に同一性の領域が存在する場合、正の領域が示される。そのような場合、部位１を、配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）に示す対照標準タンパク質の最初のアミノ酸と定義する。正の割合の値は、ＢＬＡＳＴ２．１．２アルゴリズムにより規定される。
【００３５】
【表３】
表ＩＩＩに示す値を得るために、各ｎｒ、酵母データベースおよび特許データベースに対してｂｌａｓｔｐアライメントを実施した。このアルゴリズムは、アミノ酸問い合わせ（クエリ）配列（対照標準配列）をタンパク質配列データベースに対して比較する。この解析には、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムに次のデフォルト設定を用いた。すなわち、−Ｇ（ギャップ開始コスト）、デフォルト値＝１１；−Ｅ（ギャップ延長コスト）、デフォルト値＝１；−ｅ（期待値）、デフォルト値＝１０．０；および−Ｗ（ワードサイズ）、デフォルト値＝３であった。さらに、アミノ酸残基の対合の可能性のある対を全てアラインするために、デフォルト置換行列ＢＬＯＳＵＭ−６２を用いてスコアを割り当てた。この行列の適切な設定は、ギャップ存在コスト＝１１；残基当たりのギャップコスト＝１；およびラムダ比＝０．８５であった。Ｅ値が１ｅ−２５より低い場合、正の割合の値をこの値が発生する領域とともに示す。さらに、部分的配列のみが以前に知られていたタンパク質について、コーディング配列データを表ＩＩに示す。本発明のこの態様による好ましいタンパク質は、Ｐｃ８０４（配列番号２）、Ａｎ０１（配列番号４）、Ａｎ０５（配列番号６）、Ａｎ０９（配列番号８）、Ａｎ１０（配列番号１０）、Ａｎ１３（配列番号１２）、Ａｎ１７（配列番号１４）、Ａｎ２０（配列番号１６）、Ａｎ２８（配列番号１８）、Ａｎ３４（配列番号２０）、Ａｔ０１−１（配列番号２２）、Ａｔ０１−２（配列番号２４）、Ａｔ０３（配列番号２６）、Ａｔ０５（配列番号２８）、Ａｔ０７（配列番号３０）、Ａｔ０８（配列番号３２）、Ａｔ１１（配列番号３４）、Ａｔ１４（配列番号３６）、Ａｔ１６（配列番号３８）、Ａｔ１８（配列番号４０）、Ａｔ１９（配列番号４２）、Ａｔ２０（配列番号４４）、Ａｔ２２（配列番号４６）、Ａｔ２４（配列番号４８）、Ａｔ２７（配列番号５０）、Ａｔ３２（配列番号５２）、Ｐｃ０５（配列番号５４）、Ｐｃ０６（配列番号５６）、Ｐｃ０７（配列番号５８）、Ｐｃ０８（配列番号６０）、Ｐｃ０９（配列番号６２）、Ｐｃ１０（配列番号６４）、Ｐｃ１８（配列番号６６）、Ｐｃ２３（配列番号６８）、Ｐｃ２４（配列番号７０）、Ｐｃ２５（配列番号７２）、Ｐｃ３３（配列番号７４）、Ｐｃ３４（配列番号７６）、Ａｔ５０１（配列番号７８）、Ａｔ５７４（配列番号８０）、Ａｔ２７９（配列番号８２）、Ａｔ２８６（配列番号８４）、Ａｔ２９１（配列番号８６）、Ａｔ３２０（配列番号８８）、Ａｔ３２２（配列番号９０）、Ａｎ１０００（配列番号９２）、Ａｔ１６７（配列番号９４）、Ａｔ２２１（配列番号９６）、Ａｔ２３３（配列番号９８）、Ａｔ２３９（配列番号１００）、Ａｔ２４０（配列番号１０２）、Ａｔ２７４（配列番号１０４）、Ｐｃ１０００（配列番号１０６）、Ｐｃ１００１（配列番号１０８）からなる群から選択される。
【００３６】
本明細書中の「精製」は、他のタンパク質の混入が約２５重量％より低い、好ましくは約１０重量％より低いことを意味する。そのような精製タンパク質は、天然供給源から、組換え発現から、または化学合成により得ることができる。「タンパク質」は、本明細書では少なくとも１０アミノ酸残基を有する任意のポリペプチドを含むことを意味する。
【００３７】
第４の態様において、本発明は、二次代謝産物生産、酵素生産または菌類の侵入に関与する菌類遺伝子を制御することが示されているタンパク質に特異的に結合する新規な結合物質を提供する。当業者によく知られている多くの方法を用いて、新規な結合物質を単離することが可能である。結合物質が他の無関係なタンパク質に対するよりも大きい親和力でタンパク質に結合するならば、その結合物質はそのタンパク質に「特異的に結合する」。好ましくは、その分子の結合親和力は、無関係なタンパク質に対する親和力よりも少なくとも５倍大きく、より好ましくは少なくとも１０倍大きく、さらに好ましくは少なくとも５０倍大きく、最も好ましくは少なくとも１００倍大きい。特定の好ましい実施形態において、そのような結合物質はタンパク質の生物学的機能を低下させる。他の好ましい実施形態において、結合物質はタンパク質の生物学的機能を増大させる。他の好ましい実施形態において、結合物質は、菌類のレギュレータ遺伝子によりコードされるタンパク質に対して新規または異なる生物学的機能を付与する。これらの効果は、２次構造または３次構造の変化によりタンパク質活性を増大または低下させること、２次構造または３次構造の変化により新規なタンパク質活性を発生させること、転写を増大または低下させること、翻訳を増大または低下させること、翻訳後修飾を増大または低下させること、細胞内の局在状態を変化させること、ある細胞位置から他への移動を増大または低下させること、タンパク質と他の分子との相互作用によりタンパク質活性を増大または低下させること、またはタンパク質と他の分子との相互作用により新規なタンパク質活性を発生させることにより、達成可能である。
【００３８】
第５の態様において、本発明は、菌類の侵入に必要な菌類遺伝子であって、かつ、その発現が二次代謝産物生産も変動させる因子によって制御されると考えられている菌類遺伝子ＦＬＯ１１の発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な単離遺伝子または組換え遺伝子ならびにそれらのコードタンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子またはタンパク質の相同体を提供する。「相同体」という用語は、先に定義されている。これらの遺伝子は、抗真菌薬の開発の標的として有用であり、また、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。それらは、菌類代謝におけるＦＬＯ１１の役割を研究するためのツールとしても有用である。
【００３９】
本発明のこの態様による好ましい遺伝子は、Ａｎ０１（配列番号３）、Ａｎ０５（配列番号５）、Ａｎ０９（配列番号７）、Ａｎ１０（配列番号９）、Ａｎ１３（配列番号１１）、Ａｎ１７（配列番号１３）、Ａｎ２０（配列番号１５）、Ａｎ２８（配列番号１７）、Ａｎ３４（配列番号１９）、Ａｔ０１−１（配列番号２１）、Ａｔ０１−２（配列番号２３）、Ａｔ０３（配列番号２５）、Ａｔ０５（配列番号２７）、Ａｔ０７（配列番号２９）、Ａｔ０８（配列番号３１）、Ａｔ１１（配列番号３３）、Ａｔ１４（配列番号３５）、Ａｔ１６（配列番号３７）、Ａｔ１８（配列番号３９）、Ａｔ１９（配列番号４１）、Ａｔ２０（配列番号４３）、Ａｔ２２（配列番号４５）、Ａｔ２４（配列番号４７）、Ａｔ２７（配列番号４９）、Ａｔ３２（配列番号５１）、Ｐｃ０５（配列番号５３）、Ｐｃ０６（配列番号５５）、Ｐｃ０７（配列番号５７）、Ｐｃ０８（配列番号５９）、Ｐｃ０９（配列番号６１）、Ｐｃ１０（配列番号６３）、Ｐｃ１８（配列番号６５）、Ｐｃ２３（配列番号６７）、Ｐｃ２４（配列番号６９）、Ｐｃ２５（配列番号７１）、Ｐｃ３３（配列番号７３）、Ｐｃ３４（配列番号７５）からなる群から選択される。
【００４０】
本発明のこの態様による好ましいタンパク質は、Ａｎ０１（配列番号４）、Ａｎ０５（配列番号６）、Ａｎ０９（配列番号８）、Ａｎ１０（配列番号１０）、Ａｎ１３（配列番号１２）、Ａｎ１７（配列番号１４）、Ａｎ２０（配列番号１６）、Ａｎ２８（配列番号１８）、Ａｎ３４（配列番号２０）、Ａｔ０１−１（配列番号２２）、Ａｔ０１−２（配列番号２４）、Ａｔ０３（配列番号２６）、Ａｔ０５（配列番号２８）、Ａｔ０７（配列番号３０）、Ａｔ０８（配列番号３２）、Ａｔ１１（配列番号３４）、Ａｔ１４（配列番号３６）、Ａｔ１６（配列番号３８）、Ａｔ１８（配列番号４０）、Ａｔ１９（配列番号４２）、Ａｔ２０（配列番号４４）、Ａｔ２２（配列番号４６）、Ａｔ２４（配列番号４８）、Ａｔ２７（配列番号５０）、Ａｔ３２（配列番号５２）、Ｐｃ０５（配列番号５４）、Ｐｃ０６（配列番号５６）、Ｐｃ０７（配列番号５８）、Ｐｃ０８（配列番号６０）、Ｐｃ０９（配列番号６２）、Ｐｃ１０（配列番号６４）、Ｐｃ１８（配列番号６６）、Ｐｃ２３（配列番号６８）、Ｐｃ２４（配列番号７０）、Ｐｃ２５（配列番号７２）、Ｐｃ３３（配列番号７４）、およびＰｃ３４（配列番号７６）からなる群から選択される。
【００４１】
第６の態様において、本発明は、二次代謝産物ロバスタチンの生産に関与すると考えられている菌類遺伝子ｌｏｖＦの発現の直接的または間接的なレギュレータである、新規な組換え遺伝子およびそれらのコードタンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子またはタンパク質の相同体を提供する。「相同体」という用語は、先に定義されている。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。それらは、菌類代謝におけるｌｏｖＦの役割を研究するためのツールとしても有用である。
【００４２】
本発明のこの態様による好ましい遺伝子は、Ａｔ２７９（配列番号８１）、Ａｔ２８６（配列番号８３）、Ａｔ２９１（配列番号８５）、Ａｔ３２０（配列番号８７）、Ａｔ３２２（配列番号８９）、Ａｎ１０００（配列番号９１）、Ａｔ１６７（配列番号９３）、Ａｔ２２１（配列番号９５）、Ａｔ２３３（配列番号９７）、Ａｔ２３９（配列番号９９）、Ａｔ２４０（配列番号１０１）、Ａｔ２７４（配列番号１０３）、Ｐｃ１０００（配列番号１０５）およびＰｃ１００１（配列番号１０７）からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のこの態様による好ましいタンパク質は、Ａｔ２７９（配列番号８２）、Ａｔ２８６（配列番号８４）、Ａｔ２９１（配列番号８６）、Ａｔ３２０（配列番号８８）、Ａｔ３２２（配列番号９０）、Ａｎ１０００（配列番号９２）、Ａｔ１６７（配列番号９４）、Ａｔ２２１（配列番号９６）、Ａｔ２３３（配列番号９８）、Ａｔ２３９（配列番号１００）、Ａｔ２４０（配列番号１０２）、Ａｔ２７４（配列番号１０４）、Ｐｃ１０００（配列番号１０６）およびＰｃ１００１（配列番号１０８）からなる群から選択される。
【００４４】
第７の態様において、本発明は、二次代謝産物ロバスタチンの生産に関与すると考えられている菌類遺伝子ｌｏｖＥの発現の直接的または間接的なレギュレータである、新規な組換え遺伝子およびそれらのコードタンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子またはタンパク質の相同体を提供する。「相同体」という用語は、先に定義されている。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。それらは、菌類代謝におけるｌｏｖＥの役割を研究するためのツールとしても有用であると思われる。
【００４５】
本発明のこの態様による好ましい遺伝子は、Ａｔ５０１（配列番号７７）、Ａｔ５７４（配列番号７９）からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のこの態様による好ましいタンパク質は、Ａｔ５０１（配列番号７８）、Ａｔ５７４（配列番号８０）からなる群から選択される。
【００４７】
第８の態様において、本発明は、二次代謝産物ペニシリンの生産に関与する菌類遺伝子ａｃｖＡの発現の直接的または間接的なレギュレータである新規な組換え遺伝子およびそれらのコードタンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明はさらにそのような遺伝子の相同体を提供する。「相同体」という用語は、先に定義されている。これらの遺伝子は、二次代謝産物または菌類酵素の生産を向上させるのに有用であると予想される。それらは、菌類代謝におけるａｃｖＡの役割を研究するためのツールとしても有用であると思われる。
【００４８】
本発明のこの態様による好ましい遺伝子は、Ｐｃ８０４（配列番号１）である。本発明のこの態様による好ましいタンパク質は、Ｐｃ８０４（配列番号２）である。
【００４９】
第９の態様において、本発明は、新規な菌類レギュレータ遺伝子を菌類において発現させることからなる、二次代謝産物または細胞外酵素の生産を変動させる方法を提供する。そのような発現は、他の遺伝子の発現、薬物または小分子との相互作用、または例えば実施例に記載のような遺伝子形質転換により、達成かつ／または変動させることができる。さらにそのような発現は、遺伝子全体またはその遺伝子の生物学的に活性な一部分もしくはフラグメントの発現、あるいは、遺伝子または遺伝子の一部もしくはフラグメントの融合産物を含んでいてよい。特定の好ましい実施形態では、本発明の複数の新規なレギュレータ遺伝子の組合せを同時または順次発現させることができる。
【００５０】
本明細書中の「二次代謝産物または細胞外酵素の生産を変動させる」という用語は、菌類の発酵における二次代謝産物または細胞外酵素の生産プロセスに影響する１つ以上の変数に明確に影響を及ぼすことを意味する。これらの変数としては、生産される二次代謝産物または細胞外酵素の量（絶対量または発酵ブロスの単位体積当たりもしくは固形物の単位質量当たりの量）、十分な量の生産に必要な体積、原料コストおよびエネルギーコスト、発酵槽の運転時間または培養実施時間、発酵槽の運転後に処理しなければならない廃棄物の量、所望の代謝産物または細胞外酵素の特異的生産（菌類により生産されるすべての二次代謝産物および副産物の総量として、ならびにその一部分として）、発酵ブロスまたは培養物から回収可能な最終的な二次代謝産物または細胞外酵素産物の割合、および、二次代謝産物または細胞外酵素を生産する微生物の二次代謝産物または細胞外酵素との接触により受ける可能性のある悪影響に対する抵抗性が含まれるが、限定はされない。また、「二次代謝産物」という用語は、一次代謝産物から誘導される化合物であって、生物体により生産され、一次代謝物ではなく、エタノールまたはフーゼルアルコールでなく、標準的条件下での生育には必要でない化合物を意味する。二次代謝産物は、多くの一次代謝経路の中間体から誘導される。これらの経路には、アミノ酸の生合成経路、芳香族アミノ酸の生合成のシキミ酸経路、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）からのポリケチド生合成経路、アセチルＣｏＡからのメバロン酸経路ならびに多糖およびペプチド多糖の生合成経路が含まれるが、限定はされない。全体として、二次代謝は炭素代謝のすべての一次代謝経路に伴って生じる（菌類生理学（Ｆｕｎｇａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第９章、２４６〜２７４ページ、ディー エイチ グリフィン（ＤＨ Ｇｒｉｆｆｉｎ）編（１９９４年））。「二次代謝産物」はまた、二次代謝産物の合成経路に割り当てられる、二次代謝産物の生合成経路における中間化合物も含む。「二次代謝産物の合成経路に割り当てられる」とは、中間体が一旦細胞により合成されたならば、細胞はその中間体を一次代謝産物に変換しないことを意味している。「中間化合物」には、後続の化学変換または後続の生物変換により有用な化合物に変換可能な二次代謝中間化合物も含まれる。したがって、そのような中間化合物の利用可能性を改善することにより、最終的な有用化合物の生産がさらに向上すると思われ、本明細書では最終的な有用化合物自体を二次代謝産物と称しうる。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、二次代謝産物を生産することは知られていない。「一次代謝産物」という用語は、ほぼすべての生物の機能に明確な役割を有する天然の産物を意味する。一次代謝産物には、脂質、炭水化物、タンパク質および核酸の生合成に関与する化合物が含まれるが、限定はされない。「二次代謝産物の収量を増加させる」という用語は、全発酵ブロス中に存在する二次代謝産物の量を発酵ブロスの単位体積あたり、または固体培地の単位質量あたり増加させることを意味する。「細胞外酵素」は、菌類によりその周囲の培地中に分泌される酵素である。
【００５１】
第１０の態様において、本発明は、新規なキメラの菌類レギュレータ遺伝子を提供する。本発明の意味において、「キメラの菌類レギュレータ遺伝子」とは、自然状態では融合されない核酸配列に融合されている菌類レギュレータ遺伝子またはその一部である。そのような融合の目的のための好ましい核酸には、菌類レギュレータ遺伝子またはその一部ならびに遺伝子の制御領域が含まれるが、限定はされない。
【００５２】
いくつかの好ましいキメラの菌類レギュレータ遺伝子の非限定的な例を、下表ＩＶに、また配列番号として配列表中に示す。
【００５３】
【表４】
第１１の態様において、本発明は、新規なキメラの菌類レギュレータ遺伝子を菌類において発現させることからなる、二次代謝産物または細胞外酵素の生産を変動させる方法を提供する。そのような発現は、他の遺伝子の発現、薬物または小分子との相互作用、または例えば実施例に記載のような遺伝子形質転換により、達成かつ／または変動させることができる。特定の好ましい実施形態において、本発明の複数の新規レギュレータ遺伝子および／またはキメラレギュレータ遺伝子の組合せを同時または順次発現させることができる。
【００５４】
本明細書中の「二次代謝産物または細胞外酵素の生産を変動させる」という用語は、菌類発酵における二次代謝産物または細胞外酵素の生産プロセスに影響する１つまたは複数の変数に明確に影響を及ぼすことを意味する。これらの変数としては、生産される二次代謝産物または細胞外酵素の量（絶対量または発酵ブロスの単位体積当たりもしくは固形物の単位質量当たりの量）、十分な量の生産に必要な体積、原料コストおよびエネルギーコスト、発酵槽の運転時間または培養実施時間、発酵槽の運転後に処理しなければならない廃棄物の量、所望の代謝産物または細胞外酵素の特異的生産（菌類により生産されるすべての二次代謝産物および副産物の総量として、ならびにその一部分として）、発酵ブロスまたは培養物から回収可能な最終的な二次代謝産物または細胞外酵素産物の割合、および、二次代謝産物または細胞外酵素を生産する微生物の二次代謝産物または細胞外酵素との接触により受ける可能性のある悪影響に対する抵抗性が含まれるが、限定はされない。また、「二次代謝産物」という用語は、一次代謝産物から誘導される化合物であって、生物体により生産され、一次代謝物ではなく、エタノールまたはフーゼルアルコールでなく、標準的条件下での生育には必要でない化合物を意味する。二次代謝産物は、多くの一次代謝経路の中間体から誘導される。これらの経路には、アミノ酸の生合成経路、芳香族アミノ酸の生合成のシキミ酸経路、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）からのポリケチド生合成経路、アセチルＣｏＡからのメバロン酸経路ならびに多糖およびペプチド多糖の生合成経路が含まれるが、限定はされない。全体として、二次代謝は炭素代謝のすべての一次代謝経路に伴って生じる（菌類生理学（Ｆｕｎｇａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第９章、２４６〜２７４ページ、ディー エイチ グリフィン（ＤＨ Ｇｒｉｆｆｉｎ）編（１９９４年））。「二次代謝産物」はまた、二次代謝産物の合成経路に割り当てられる、二次代謝産物の生合成経路における中間化合物も含む。「二次代謝産物の合成経路に割り当てられる」とは、中間体が一旦細胞により合成されたならば、細胞はその中間体を一次代謝産物に変換しないことを意味している。「中間化合物」は、後続の化学変換または後続の生物変換により有用な化合物に変換可能な二次代謝中間化合物も含む。したがって、そのような中間化合物の利用可能性を改善することにより、最終的な有用化合物の生産がさらに向上すると思われ、本明細書では最終的な有用化合物自体を二次代謝産物と称しうる。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、二次代謝産物を生産することは知られていない。「一次代謝産物」という用語は、ほぼすべての生物の機能に明確な役割を有する天然の産物を意味する。一次代謝産物には、脂質、炭水化物、タンパク質および核酸の生合成に関与する化合物が含まれるが、限定はされない。「二次代謝産物の収量を増加させる」という用語は、全発酵ブロス中に存在する二次代謝産物の量を発酵ブロスの単位体積あたり、または固体培地の単位質量あたり増加させることを意味する。「細胞外酵素」は、菌類によりその周囲の培地中に分泌される酵素である。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の特定の特に好ましい実施形態をさらに例示することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００５６】
（糸状菌の形質転換）
プロトプラストを次のように生成させた。富栄養培地に胞子を接種し、約２０時間または発芽管が５〜１０胞子長になるまで、胞子を発芽させた。菌が胞子形成しない場合（いくつかのタキソール生産菌類は胞子形成しない）、菌糸を超音波処理して小断片とし、これらの菌糸小断片を接種物として使用することが可能である。他の選択肢は、菌が胞子形成する培地を見つけることである。例えば、タキソール生産菌類の胞子形成は、ガンマ線照射したカーネーション葉を含む水寒天プレート上で生育させることにより誘発可能である。さらに、胞子形成の遅いペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株においては高塩類の培地により胞子形成を促進し得る。発芽胞子（ｇｅｒｍｌｉｎｇ）を遠心分離し、無菌蒸留水で２回、１Ｍ硫酸マグネシウムで１回洗浄した。次いで、発芽胞子を約２ｍｇ／ｍｌのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ、登録商標）を含む１Ｍ硫酸マグネシウムに再懸濁した。次いで、試験管を８０ｒｐｍで振とうしながら約２時間または大部分の菌糸が消化されてプロトプラストが十分多くなるまで、３０℃でインキュベートした。プロトプラストを１層のミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ、登録商標）でろ過した。少なくとも１容量のＳＴＣを加え、プロトプラストを遠心により沈殿させた。プロトプラストをＳＴＣで２回洗浄した。次いでプロトプラストを１ｍｌのＳＴＣに再懸濁し、血球計数器で計数した。ＳＴＣ、ＳＰＴＣおよびＤＭＳＯが９：１：０．１の溶液中にプロトプラストが約５×１０７個／ｍｌの最終濃度とし、これをナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ、登録商標）クリオ（Ｃｒｙｏ）冷却器で−８０℃で凍結した（−１℃／分で冷却）。
【００５７】
形質転換用溶液は次のとおりであった。すなわち、ＳＴＣ（０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＣａＣｌ２）およびＳＰＴＣ（０．８Ｍソルビトール、４０％ＰＥＧ４０００、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）。
【００５８】
菌類発現ベクター中に本発明の新規なレギュレータ遺伝子を含む１〜５μｇのＤＮＡを５０ｍＬ容ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ、登録商標）チューブに入れた。凍結されていた１００μｌのプロトプラストをＤＮＡに加え、緩やかに混合し、次いで氷上で３０分間インキュベートした。１５μｌのＳＰＴＣを加えた後、タッピングにより混合し、室温で１５分間インキュベートした。５００μｌのＳＰＴＣを加え、タッピングおよびローリングにより十分に混合し、次いで室温で１５分間インキュベートした。２５ｍｌの再生最少培地を加え、十分に混合し、２倍濃度の選択薬を添加した２５ｍｌの再生最少培地を含むプレート上に注いだ。形質転換用プレートを２６℃で５〜６日間またはコロニーが出現し始めるまでインキュベートした。再生最少培地は、ｐＨ６．５で微量元素、塩類、２５ｍＭ硝酸ナトリウム、０．８Ｍスクロースおよび１％アガロースを含む。ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびアスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）とともに使用して成功した選択薬は、広域スペクトルのグリコペプチド系抗生物質であるフレオマイシンである。形質転換体をつま楊枝（菌が胞子形成した場合）または無菌の鉗子（菌が胞子形成しなかった場合）を用いて採取し、新しいプレート上にのせた。精製用プレートは、最少培地（再生最少培地と同じであるが、０．８Ｍスクロースの代わりに２％スクロースを含む）および１倍濃度の薬物を含む。採取した形質転換体を２６℃で５〜６日間インキュベートした。
【実施例２】
【００５９】
（生産培地における形質転換体の増殖）
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびペニシリン生産の場合には、胞子および菌糸体を含むプラグを接種物として用いた。用いた培地は、３０％ラクトース、５×ファーマメディア（ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ、登録商標）綿実粉末、硫酸アンモニウム、炭酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸カリウムおよびフェノキシ酢酸ｐＨ７を含む、公開されているＰ２生産培地であった。フラスコを２２５ｒｐｍで振とうしながら２６℃でインキュベートした。
【００６０】
アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）およびロバスタチン生産の場合には、胞子を接種物として用いた。胞子を、木製接種スティックを用いて精製用プレートから採取した。培地は、トウモロコシ浸漬液、硝酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、Ｐ２０００（ダウケミカル（Ｄｏｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ））、微量元素および炭素源としてラクトースまたはグルコースを含むＲＰＭであった。培地はｐＨ６．５であった。フラスコを２２５ｒｐｍで振とうしながら２６℃でインキュベートした。９６ウエルの静置培養の場合には、同じ培地を用い、胞子は木製のつま楊枝を用いて精製用プレートから採取した。９６ウエルプレートを振とうせずに２６℃でインキュベートした。
【００６１】
サンプリングは、ペニシリンについては６日間インキュベーションした後に、ロバスタチンについては５日間後に、タキソールについては２１日間後に行った。振とうフラスコ実験の場合、１〜１．５ｍｌの上清を９６ウエルプレートに入れ、遠心分離し、上清を新しい９６ウエルプレートに移した。保存のため、または後のアッセイに備えて、試料を−８０℃で凍結した。
【００６２】
９６ウエルプレートに放置して増殖させた培養物を遠心分離し、上清を新しい９６ウエルプレートに移した。試料を−８０℃で凍結した。
【００６３】
ハワイバイオテクノロジーグループ（Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）製のアッセイキットのタキソール検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬである。２５ｎｇ／Ｌのレベルでタキソールを生産する菌を仮定すると、タキソール生産培養物を２０〜２５倍に濃縮した段階がこのキットを用いて達成可能な標準曲線内（＞０．６２５ｎｇ／ｍＬ）にあるべきである。２連の試験に十分な量の各試料を得るために、最小限１５ｍＬの培養容量が必要である。試料は、２１日間インキュベートした後に採取する。
【実施例３】
【００６４】
（ペニシリン濃度の測定）
１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中のフェノキシメチルペニシリン（ナトリウム塩）溶液を０、２５、５０、１００、２００、３００、４００および５００μｇ／ｍＬに調製した。イミダゾール試薬を次のように調製した。８．２５ｇのイミダゾールを６０ｍＬの水に溶解し、１０ｍＬの５Ｍ ＨＣｌを加え、次いで、１０ｍＬの塩化第二水銀溶液（０．２７ｇを１００ｍＬの水に溶解）を加えた。ｐＨを５Ｍ ＨＣｌで６．８０±０．０５に調整し、この溶液を水で１００ｍＬに希釈した。
【００６５】
４０００ｇで１０分間遠心分離して、発酵ブロスを清澄化した。４０μＬの清澄発酵ブロスとペニシリン標準溶液を９６ウエルＵＶコレクションプレートの個々のウエルにピペットで注入した。２００μＬのイミダゾール試薬を９６ウエルフィルタープレート（０．４５ミクロン）にピペットで注入した。分割した試料および標準溶液の入ったコレクションプレートにイミダゾール試薬を真空ろ過して添加することにより、ペニシリンの誘導体化反応を開始させた。コレクションプレートを４５℃の９６ウエルプレートリーダーに入れ、３２５ｎｍにおける増加を２０分間にわたりモニターした。
【００６６】
すべての分光光度検出にモレキュラーデバイセズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製９６ウエルＵＶ／Ｖｉｓプレートリーダーを用いた。これは、例えばブンドガードおよびイルバー（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ ａｎｄ Ｉｌｖｅｒ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃ、第２４巻、７９０〜７９４ページ（１９７２年）に記載されている、通常のアッセイである。
【実施例４】
【００６７】
（ロバスタチン濃度の測定）
１０μＬの試料を取り出し、Ｈ２Ｏで１：１００に希釈した。１０μＬのこの希釈ブロスを１ｍＭ ＨＭＧＣｏＡ、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．００５ｍＭ ＤＴＴおよび５μＬの（Ｈｉｓ）６ＨＭＧＲを含む反応液（全量２００μＬ）中でアッセイした。３４０ｎｍにおける吸光度の消失を経時的に観察した。これはＮＡＤＰＨの消失を表すが、ロバスタチンはこの反応を阻害する。試料を含む反応について初期速度を計算し、希釈率で補正し、ロバスタチン標準品を含む反応と比較して、生成した代謝産物の濃度を測定した。（Ｈｉｓ）６ＨＭＧＲは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で発現させ、ニッケルカラムで精製した。
【実施例５】
【００６８】
（タキソール濃度の測定）
アッセイ１：少なくとも１５ｍＬの静止培養からのブロスをｐＨ７に中性化し（タキソールは非中性条件で不安定）、液体窒素を用いて凍結し、全試料を一晩凍結乾燥して（細胞塊とブロスとを一緒に）乾固させる。乾燥物質をガラスビーズを用いた激しい振とうにより粉砕する。１０ｍＬの塩化メチレンを用いて各試料（乾燥物質１ｇと推定）を抽出する。６時間後に、塩化メチレン抽出物を綿栓に通し、一晩凍結乾燥して乾固させる。５０μＬのメタノールをすべての試料に添加し、溶解したらすぐに、４５０μＬの適切な緩衝液または水を加え、イムノアッセイにより試験する。約２５ｎｇ／Ｌを生産する菌類由来の開始試料１５ｍＬが存在すると仮定すると、最終濃度は約０．７５ｎｇ／ｍＬであると予想される。
【００６９】
アッセイ２：少なくとも１５ｍＬの静止培養からのブロスをｐＨ７に中性化し、４層のチーズクロスでろ過する。ブロスを１５ｍＬの塩化メチレンを用いて２回抽出し、有機層を合わせる。バイオマスをほぐし、各１０ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１）で３回抽出する。ほぐした菌糸体の抽出物を抽出済のブロスと合わせ、試料当たり６０ｍＬの有機抽出物を一晩凍結乾燥して乾固させる。５０μＬのメタノールをすべての試料に添加し、溶解したらすぐに、４５０μＬの適切な緩衝液または水を加え、イムノアッセイにより試験する。約２５ｎｇ／Ｌを生産する菌類由来の開始試料１５ｍＬが存在すると仮定すると、最終濃度は約０．７５ｎｇ／ｍＬであると予想される。
【００７０】
アッセイキットは、抗タキサン抗体により検出されるタキソールタンパク質抗原を含む。被検単離物にタキソールが存在すると、タキソールタンパク質抗原の検出が競合的に阻害される。イムノアッセイは１００μＬの試料を必要とし、キット中のプロトコールに準拠する。９６ウエルプレートを用いてイムノアッセイを行い、アッセイには約８〜９時間を要する。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to regulators of fungal gene expression and their use in commercial and medical applications. More specifically, the present invention relates to regulators of fungal genes involved in the production of enzymes, secondary metabolites and other useful products, and regulators of genes involved in fungal invasion.
[Background Art]
[0002]
Fungi are the most common natural source of useful substances for commercial and medical applications. Many of these useful substances are secondary metabolites.
[0003]
The production of secondary metabolites by various fungi is a crucial source of various therapeutically important drugs. Beta-lactam antibacterial agents such as penicillin and cephalosporin are produced by Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum, respectively, but these compounds are used at an overwhelmingly high frequency. (Lengo and Penalva, Prog. Ind. Microbiol. 29, 603-38 (1994); Jensen and Demain, Biotechnology, 28, 239). ６８68 (1995); Brakage, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62. , It has been reviewed in 547-85 page (1998)). Cyclosporin A, a member of the cyclic undecapeptides, is produced by Tolypocladium inflatum. Cyclosporin A dramatically reduces morbidity and increases survival in transplant patients (Borel, Prog. Allergy, 38, 9-18 (1986)). In addition, some fungal secondary metabolites, including lovastatin produced by Aspergillus terreus and some other fungi, are cholesterol-lowering drugs (Alberts et al.) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3957-3961 (1980)). These and many other fungal secondary metabolites have contributed significantly to medicine worldwide (Demain, Ciba Found Symp, Vol. 171, 3-16 (1992); Bentley, Crit. Rev. Biotechnol., Vol. 19, pp. 1-40 (1999)).
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0004]
Unfortunately, there are many challenges between detecting the activity of secondary metabolites and producing sufficient quantities of pure drug. Therefore, efforts have been made to improve the production of secondary metabolites by fungi. Recently, strains have been improved by manipulating genes encoding biosynthetic enzymes that catalyze the reactions required for the production of secondary metabolites. Penalva et al., Trends Biotechnol. Vol. 16, pages 483-489 (1998) disclose that the penicillin synthesis structural gene copy number of a production strain of Penicillium chrysogenum was increased. Other studies have altered the expression of genes encoding other biosynthetic enzymes, thereby affecting the overall metabolism of fungi. (Mingo et al.), J. Mol. Biol. Chem. 21, pp. 14545-14550 (1999) disclose that the disruption of the gene encoding the enzyme phacA of Aspergillus nidulans, which catalyzes the 2-hydroxylation of phenylacetic acid, is likely due to the substrate phenyl It has been shown that loss of competition for acetic acid results in increased penicillin production. Similarly, disruption of the gene encoding aminoadipate reductase in Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) increased penicillin production, presumably due to loss of competition for the substrate α-aminoadipate (Casquiero et al. et al.), J. Bacteriol., 181, pp. 1181-1188 (1999)).
[0005]
Therefore, genetic engineering holds promise for improving the production of secondary metabolites. Genetic engineering that increases the activity of biosynthetic enzymes for secondary metabolite production or reduces the activity of competing biosynthetic pathways has proven to be effective in improving production. The maximum effect is likely to be achieved by a combination of several genetic engineering strategies. For example, it appears that altering the expression of the gene that controls the gene encoding the biosynthetic enzyme, or altering the concentration of metabolic precursors, would increase production. In addition, genetic engineering can address the problems encountered in fermenter operation or downstream processing (eg, energy costs, specific production of desired metabolites, maximal recovery of metabolites, cost of treating fermentation waste). Could be used to provide significant effects. Therefore, there is a need for a regulator gene (control gene) that can improve the production of secondary metabolites in fungi.
[0006]
Enzymes are other commercially important fungal products. In recent years, efforts have been made to improve fungal enzyme production by genetic manipulation. Noel et al., Molecular Microbiology, Vol. 27, pp. 131-142 (1998) describe that the ZBC protein xlnR induces the expression of xylan-degrading extracellular enzymes in Aspergillus niger. Teach you to Hasper et al., Molecular Microbiology, 36, 193-200 (2000) teach that xlnR also regulates the expression of the D-xylose reductase gene in Aspergillus niger. ing. Given the many useful enzymes produced by fungi, there remains a need for regulator genes that can enhance the production of these enzymes.
[0007]
There is also a need for regulators that identify genes associated with fungal invasion. Fungal invasion is required for fungal virulence, and its regulation appears to be related to the production of secondary metabolites and enzymes. Fungal infections are a significant health problem, especially in immunocompromised patients. Ha and White (Ha and White), Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 43, pp. 763-768 (1999) describe that Candida albicans caused by the pathogenic yeast Candida albicans is immunized by AID with Candida albicans. It teaches that this is the most frequent fungal infection associated with insufficiency. Weig et al., Trends in Microbiology, Vol. 6, pp. 468-470 (1998), show that the frequency of Candida infections has increased in recent years and is accompanied by a significant increase in morbidity and mortality. It is disclosed that. Many of these infections occur in hospital settings. Bailey and Douglas, Methods in Enzymology, Vol. 310, pp. 644-656 (1999) state that the majority of nosocomial sepsis caused by Candida species is derived from biofilm formation on catheters and shunts. Is taught. Little is known about the genes required for invasion or biofilm formation. Therefore, there is a need to identify new genes that control fungal invasion, which act as targets for antifungal drug development.
[Means for Solving the Problems]
[0008]
The present invention provides novel fungal regulator genes and methods of using the regulator genes in commercial and medical applications.
[0009]
In a first aspect, the present invention provides a novel isolated or recombinant gene that has been shown to encode a protein that controls a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. Provide the gene. In certain preferred embodiments, the invention further provides homologs of such genes. These genes and their homologs are useful for enhancing the production of secondary metabolites or enzymes, or as targets for discovering new antifungal agents.
[0010]
In a second aspect, the invention relates to a gene that is specifically complementary to a gene that has been shown to encode a protein that controls a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. Certain isolated and recombinant nucleic acids are provided.
[0011]
In a third aspect, the invention provides a purified protein that has been shown to regulate fungal genes involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such proteins.
[0012]
In a fourth aspect, the invention provides a novel binding substance that specifically binds to a protein that has been shown to regulate a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. .
[0013]
In a fifth aspect, the present invention relates to the expression of the fungal gene FLO11, which is a fungal gene required for fungal invasion and whose expression is thought to be regulated by factors which also alter the production of secondary metabolites. A novel recombinant gene which is a direct or indirect regulator is provided. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. These genes are useful as targets for antifungal drug development and are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes.
[0014]
In a sixth aspect, the present invention provides a novel recombinant gene that is a direct or indirect regulator of the expression of the fungal gene lovF involved in the production of the secondary metabolite lovastatin. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes.
[0015]
In a seventh aspect, the present invention provides a novel recombinant gene that is a direct or indirect regulator of the expression of the fungal gene lovE involved in the production of the secondary metabolite lovastatin. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes.
[0016]
In an eighth aspect, the present invention provides a novel recombinant gene that is a direct or indirect regulator of the expression of the fungal gene acvA involved in the production of the secondary metabolite penicillin. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes.
[0017]
In a ninth aspect, the invention provides a method of altering the production of a secondary metabolite or enzyme, comprising expressing a novel fungal regulator gene in a fungus.
[0018]
In a tenth aspect, the invention provides a novel chimeric fungal regulator gene.
[0019]
In an eleventh aspect, the invention provides a method of altering the production of secondary metabolites or extracellular enzymes, comprising expressing a novel chimeric fungal regulator gene in a fungus.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0020]
The present invention relates to regulators of fungal gene expression and their use in commercial and medical applications. More specifically, the present invention relates to regulators of fungal genes involved in the production of enzymes, secondary metabolites and other useful products, and regulators of genes involved in fungal invasion. The patents and publications cited in this specification reflect the level of knowledge in this field, and are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict between the teachings of the cited references and the present specification, the latter should take precedence.
[0021]
The present invention provides novel regulators of fungal gene expression and methods of using regulator genes in commercial and medical applications.
[0022]
In a first aspect, the present invention provides a novel isolated or recombinant gene that has been shown to encode a protein that controls a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. provide. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. These genes and their homologs are useful for enhancing the production of secondary metabolites or enzymes or as targets for discovering new antifungal agents.
[0023]
As used herein, a “recombinant gene” is a nucleic acid sequence that encodes a protein and exists in the form of linear DNA or RNA, circular DNA or RNA closed by a covalent bond, or as part of a chromosome. However, the gene may not be a single copy of the natural chromosomal locus where the gene normally exists in nature. Thus, this aspect of the invention includes genetically modified organisms containing such recombinant genes.
[0024]
As used herein, a "homolog" of a gene is a gene having a lower E value than the value shown in Table I, or a value having a higher percentage of identity in the homologous region, when compared to a reference gene. It is. Table I lists the reference genes, their E values, and where applicable, their percent identity. When there is a region having identity between the reference gene and the sequence derived from the public gene database, the region having the identity is indicated. In such a case, site 1 is defined as the first nucleotide of the reference gene as shown in the sequence listing.
[0025]
In certain preferred embodiments, the homologue is a dominant mutant of the novel reference gene. A "dominant (dominant) mutant" is an allele that encodes a protein capable of altering the phenotype of an organism beyond the presence of a non-mutated gene. Dominant mutants include mutants that encode proteins that are capable of altering the phenotype of an organism, even when a non-mutated version of this gene (or a homologue thereof) is present in the organism. But not limited to. Preferred dominant mutants include dominant negative (dominant negative) mutants, dominant positive (dominant positive) mutants and dominant neomorph mutants. A "dominant negative mutant" is a dominant mutation that achieves its phenotypic effect by disrupting some functions of the gene or gene product or homologue from which the variant was derived. Body. A "dominant positive mutant" is a dominant mutant that achieves its phenotypic effect by activating some function of the gene or gene product or homologue from which the variant was derived. Mutant. A “dominant neomorph variant” is a dominant mutant that achieves a phenotypic effect by imparting a new or different function to the gene or gene product or homologue from which the variant was derived.
[0026]
[Table 1]
[0027]
The blastn program was used to determine the E value of the nucleotide coding sequence of the novel regulator gene of the present invention. This program compares nucleotide query sequences (control sequences) against a nucleotide sequence database. The following databases available on the NCBI BLAST site were used. That is, nr including all sequences of GenBank, EMBL, DDBJ and PDB, yeast (Saccharomyces cerevisiae) genomic nucleotide sequence, patent, and non-human / mouse EST (expression sequence tag) sequence were used. BLAST analysis was also performed using the partial genome sequence of Neurospora crassa available at http://www.mips.biochem.mpg.de/egi-bin/blast/blast_page?genus=neurospora. Table I shows the lowest E values in these five databases.
[0028]
The default setting of the blastn algorithm was used for the gap alignment analysis. These are -G (gap start cost), default value = 5; -E (gap extension cost), default value = 2; -q (penalty for base mismatch), default value = -3; -r (base match). Score (reward)), default value = 1; -e (expected value), default value = 10.0; and -W (word size), default value = 11.
[0029]
For new reference genes that have no related sequence in the database, the E value was "tentatively set" to 1e-5 as a way to define a reasonable E value for the related gene based on inference. For genes having non-identical but related sequences in the database, the E value is the E value of the closest "relevant" gene. For genes that have extensive regions of homology with the genes in the database, the percent identity value (%) obtained by the algorithm is included in Table I along with the regions of identity.
[0030]
Table II shows the novel regulator genes of the present invention, although some of the gene sequences are in the database, but we now provide more complete sequences.
[0031]
[Table 2]
[0032]
In a second aspect, the invention relates to a gene that is specifically complementary to a gene that has been shown to encode a protein that controls a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. Certain isolated or recombinant nucleic acids are provided. The term "recombinant" is as used above.
[0033]
A sequence is "specifically complementary" to another sequence if it is sufficiently homologous to specifically hybridize to the other sequence. Certain sequences are close to physiological conditions for in vivo or ionic strength, eg, 140 mM NaCl, 5 mM MgCl. 2 The sequence "hybridizes specifically" with the other sequence if it hybridizes under such conditions to form a Watson-Crick base pair or a Hoogsteen base pair. Such specific hybridization is preferably maintained under stringent conditions, for example, at 68 ° C. in 0.2 × SSC.
[0034]
In a third aspect, the invention provides a purified protein that has been shown to regulate fungal genes involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such proteins. As used herein, a "homolog" of a protein refers to a protein having a lower E value than the value shown in Table III or a higher positive percentage value in the region of similarity when compared to a control protein. Protein. Table III lists the reference proteins, their E values, and their positive proportions where applicable. If regions of identity exist between the control protein and sequences from the protein sequence database, a positive region is indicated. In such a case, site 1 is defined as the first amino acid of the control protein shown in the sequence listing. Positive percentage values are defined by the BLAST 2.1.2 algorithm.
[0035]
[Table 3]
A blastp alignment was performed on each nr, yeast database and patent database to obtain the values shown in Table III. This algorithm compares an amino acid query sequence (control sequence) against a protein sequence database. For this analysis, the following default settings were used for the blastp algorithm: -G (gap start cost), default value = 11; -E (gap extension cost), default value = 1; -e (expected value), default value = 10.0; and -W (word size); Default value = 3. In addition, scores were assigned using the default substitution matrix BLOSUM-62 to align all possible pairs of amino acid residues. Proper settings for this matrix were: gap existence cost = 11; gap cost per residue = 1; and lambda ratio = 0.85. If the E value is lower than 1e-25, a positive percentage value is shown along with the region where this value occurs. In addition, coding sequence data is shown in Table II for proteins for which only a partial sequence was previously known. Preferred proteins according to this aspect of the invention are Pc804 (SEQ ID NO: 2), An01 (SEQ ID NO: 4), An05 (SEQ ID NO: 6), An09 (SEQ ID NO: 8), An10 (SEQ ID NO: 10), An13 (SEQ ID NO: 12). ), An17 (SEQ ID NO: 14), An20 (SEQ ID NO: 16), An28 (SEQ ID NO: 18), An34 (SEQ ID NO: 20), At01-1 (SEQ ID NO: 22), At01-2 (SEQ ID NO: 24), At03 ( SEQ ID NO: 26), At05 (SEQ ID NO: 28), At07 (SEQ ID NO: 30), At08 (SEQ ID NO: 32), At11 (SEQ ID NO: 34), At14 (SEQ ID NO: 36), At16 (SEQ ID NO: 38), At18 (Sequence) No. 40), At19 (SEQ ID NO: 42), At20 (SEQ ID NO: 44), At22 (SEQ ID NO: 46), At24 (SEQ ID NO: 48) , At27 (SEQ ID NO: 50), At32 (SEQ ID NO: 52), Pc05 (SEQ ID NO: 54), Pc06 (SEQ ID NO: 56), Pc07 (SEQ ID NO: 58), Pc08 (SEQ ID NO: 60), Pc09 (SEQ ID NO: 62), Pc10 (SEQ ID NO: 64), Pc18 (SEQ ID NO: 66), Pc23 (SEQ ID NO: 68), Pc24 (SEQ ID NO: 70), Pc25 (SEQ ID NO: 72), Pc33 (SEQ ID NO: 74), Pc34 (SEQ ID NO: 76), At501 (SEQ ID NO: 78), At574 (SEQ ID NO: 80), At279 (SEQ ID NO: 82), At286 (SEQ ID NO: 84), At291 (SEQ ID NO: 86), At320 (SEQ ID NO: 88), At322 (SEQ ID NO: 90), An1000 ( SEQ ID NO: 92), At167 (SEQ ID NO: 94), At221 (SEQ ID NO: 96), At233 (SEQ ID NO: 96) Issue 98), At239 (SEQ ID NO: 100), At240 (SEQ ID NO: 102), At274 (SEQ ID NO: 104), PC 1000 (SEQ ID NO: 106), is selected from the group consisting of PC 1001 (SEQ ID NO: 108).
[0036]
By "purified" herein is meant less than about 25% by weight of other proteins, preferably less than about 10% by weight. Such a purified protein can be obtained from natural sources, from recombinant expression, or by chemical synthesis. "Protein" is meant herein to include any polypeptide having at least 10 amino acid residues.
[0037]
In a fourth aspect, the invention provides a novel binding substance that specifically binds to a protein that has been shown to regulate a fungal gene involved in secondary metabolite production, enzyme production or fungal invasion. . Many methods well known to those skilled in the art can be used to isolate new binding agents. A binding substance "specifically binds" to a protein if the binding substance binds to the protein with greater affinity than for other unrelated proteins. Preferably, the binding affinity of the molecule is at least 5-fold, more preferably at least 10-fold, even more preferably at least 50-fold, and most preferably at least 100-fold greater than its affinity for unrelated proteins. In certain preferred embodiments, such binding agents reduce the biological function of the protein. In another preferred embodiment, the binding agent increases the biological function of the protein. In another preferred embodiment, the binding agent confers a new or different biological function on the protein encoded by the fungal regulator gene. These effects include increasing or decreasing protein activity by altering the secondary or tertiary structure, generating new protein activity by altering the secondary or tertiary structure, increasing or decreasing transcription. Increasing or decreasing translation, increasing or decreasing post-translational modifications, altering localization within a cell, increasing or decreasing movement from one cell location to another, proteins and other molecules This can be achieved by increasing or decreasing protein activity by interacting with, or by generating new protein activity by interacting with the protein and other molecules.
[0038]
In a fifth aspect, the present invention relates to the expression of the fungal gene FLO11, which is a fungal gene required for fungal invasion and whose expression is believed to be regulated by factors which also alter secondary metabolite production Novel isolated or recombinant genes that are direct or indirect regulators of the present invention, as well as their encoded proteins. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes or proteins. The term "homolog" has been defined above. These genes are useful as targets for antifungal drug development and are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes. They are also useful as tools for studying the role of FLO11 in fungal metabolism.
[0039]
Preferred genes according to this aspect of the invention are An01 (SEQ ID NO: 3), An05 (SEQ ID NO: 5), An09 (SEQ ID NO: 7), An10 (SEQ ID NO: 9), An13 (SEQ ID NO: 11), An17 (SEQ ID NO: 13). ), An20 (SEQ ID NO: 15), An28 (SEQ ID NO: 17), An34 (SEQ ID NO: 19), At01-1 (SEQ ID NO: 21), At01-2 (SEQ ID NO: 23), At03 (SEQ ID NO: 25), At05 ( SEQ ID NO: 27), At07 (SEQ ID NO: 29), At08 (SEQ ID NO: 31), At11 (SEQ ID NO: 33), At14 (SEQ ID NO: 35), At16 (SEQ ID NO: 37), At18 (SEQ ID NO: 39), At19 (SEQ ID NO: 29) No. 41), At20 (SEQ ID NO: 43), At22 (SEQ ID NO: 45), At24 (SEQ ID NO: 47), At27 (SEQ ID NO: 49), A 32 (SEQ ID NO: 51), Pc05 (SEQ ID NO: 53), Pc06 (SEQ ID NO: 55), Pc07 (SEQ ID NO: 57), Pc08 (SEQ ID NO: 59), Pc09 (SEQ ID NO: 61), Pc10 (SEQ ID NO: 63), Pc18 (SEQ ID NO: 65), Pc23 (SEQ ID NO: 67), Pc24 (SEQ ID NO: 69), Pc25 (SEQ ID NO: 71), Pc33 (SEQ ID NO: 73), and Pc34 (SEQ ID NO: 75).
[0040]
Preferred proteins according to this aspect of the invention are An01 (SEQ ID NO: 4), An05 (SEQ ID NO: 6), An09 (SEQ ID NO: 8), An10 (SEQ ID NO: 10), An13 (SEQ ID NO: 12), An17 (SEQ ID NO: 14). ), An20 (SEQ ID NO: 16), An28 (SEQ ID NO: 18), An34 (SEQ ID NO: 20), At01-1 (SEQ ID NO: 22), At01-2 (SEQ ID NO: 24), At03 (SEQ ID NO: 26), At05 ( SEQ ID NO: 28), At07 (SEQ ID NO: 30), At08 (SEQ ID NO: 32), At11 (SEQ ID NO: 34), At14 (SEQ ID NO: 36), At16 (SEQ ID NO: 38), At18 (SEQ ID NO: 40), At19 (Sequence) No. 42), At20 (SEQ ID NO: 44), At22 (SEQ ID NO: 46), At24 (SEQ ID NO: 48), At27 (SEQ ID NO: 50) , At32 (SEQ ID NO: 52), Pc05 (SEQ ID NO: 54), Pc06 (SEQ ID NO: 56), Pc07 (SEQ ID NO: 58), Pc08 (SEQ ID NO: 60), Pc09 (SEQ ID NO: 62), Pc10 (SEQ ID NO: 64), It is selected from the group consisting of Pc18 (SEQ ID NO: 66), Pc23 (SEQ ID NO: 68), Pc24 (SEQ ID NO: 70), Pc25 (SEQ ID NO: 72), Pc33 (SEQ ID NO: 74), and Pc34 (SEQ ID NO: 76).
[0041]
In a sixth aspect, the present invention relates to novel recombinant genes and their encoded proteins, which are direct or indirect regulators of the expression of the fungal gene lovF, which is thought to be involved in the production of the secondary metabolite lovastatin I will provide a. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes or proteins. The term "homolog" has been defined above. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes. They are also useful as tools for studying the role of lovF in fungal metabolism.
[0042]
Preferred genes according to this aspect of the invention are At279 (SEQ ID NO: 81), At286 (SEQ ID NO: 83), At291 (SEQ ID NO: 85), At320 (SEQ ID NO: 87), At322 (SEQ ID NO: 89), An1000 (SEQ ID NO: 91). ), At167 (SEQ ID NO: 93), At221 (SEQ ID NO: 95), At233 (SEQ ID NO: 97), At239 (SEQ ID NO: 99), At240 (SEQ ID NO: 101), At274 (SEQ ID NO: 103), Pc1000 (SEQ ID NO: 105) And Pc1001 (SEQ ID NO: 107).
[0043]
Preferred proteins according to this aspect of the invention are At279 (SEQ ID NO: 82), At286 (SEQ ID NO: 84), At291 (SEQ ID NO: 86), At320 (SEQ ID NO: 88), At322 (SEQ ID NO: 90), An1000 (SEQ ID NO: 92). ), At167 (SEQ ID NO: 94), At221 (SEQ ID NO: 96), At233 (SEQ ID NO: 98), At239 (SEQ ID NO: 100), At240 (SEQ ID NO: 102), At274 (SEQ ID NO: 104), Pc1000 (SEQ ID NO: 106) And Pc1001 (SEQ ID NO: 108).
[0044]
In a seventh aspect, the present invention relates to novel recombinant genes and their encoded proteins, which are direct or indirect regulators of the expression of the fungal gene lovE, which is thought to be involved in the production of the secondary metabolite lovastatin I will provide a. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes or proteins. The term "homolog" has been defined above. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes. They also appear to be useful as tools to study the role of lovE in fungal metabolism.
[0045]
Preferred genes according to this aspect of the invention are selected from the group consisting of At501 (SEQ ID NO: 77), At574 (SEQ ID NO: 79).
[0046]
Preferred proteins according to this aspect of the invention are selected from the group consisting of At501 (SEQ ID NO: 78), At574 (SEQ ID NO: 80).
[0047]
In an eighth aspect, the present invention provides novel recombinant genes and their encoded proteins that are direct or indirect regulators of the expression of the fungal gene acvA involved in the production of the secondary metabolite penicillin. In certain embodiments, the present invention further provides homologs of such genes. The term "homolog" has been defined above. These genes are expected to be useful for enhancing the production of secondary metabolites or fungal enzymes. They also appear to be useful as tools for studying the role of acvA in fungal metabolism.
[0048]
A preferred gene according to this aspect of the invention is Pc804 (SEQ ID NO: 1). A preferred protein according to this aspect of the invention is Pc804 (SEQ ID NO: 2).
[0049]
In a ninth aspect, the present invention provides a method for altering the production of secondary metabolites or extracellular enzymes, comprising expressing a novel fungal regulator gene in a fungus. Such expression can be achieved and / or varied by expression of other genes, interaction with drugs or small molecules, or gene transformation, eg, as described in the Examples. Further, such expression may include expression of the entire gene or a biologically active portion or fragment of the gene, or a fusion product of the gene or a portion or fragment of the gene. In certain preferred embodiments, combinations of multiple novel regulator genes of the present invention can be expressed simultaneously or sequentially.
[0050]
As used herein, the term "varies the production of secondary metabolites or extracellular enzymes" specifically refers to one or more variables that affect the production process of secondary metabolites or extracellular enzymes in fungal fermentation. Means to influence. These variables include the amount of secondary metabolites or extracellular enzymes produced (absolute or per unit volume of fermentation broth or unit mass of solids), the volume required to produce a sufficient amount, Raw material and energy costs, fermenter operating or cultivation time, amount of waste that must be processed after fermenter operation, specific production of desired metabolites or extracellular enzymes (all produced by fungi) The total amount of secondary metabolites and by-products of, and as part of) the percentage of final secondary metabolites or extracellular enzyme products that can be recovered from the fermentation broth or culture, and secondary metabolites or extracellular Includes resistance to adverse effects that may be experienced by contact with secondary metabolites or extracellular enzymes of the microorganism producing the enzyme, including but not limited to It is not. Also, the term "secondary metabolite" is a compound derived from a primary metabolite, produced by an organism, and not a primary metabolite, but not ethanol or fusel alcohol, but grown under standard conditions. Means a compound that is not required. Secondary metabolites are derived from intermediates of many primary metabolic pathways. These pathways include amino acid biosynthetic pathways, shikimate pathway of aromatic amino acid biosynthesis, polyketide biosynthetic pathway from acetyl coenzyme A (CoA), mevalonic acid pathway from acetyl CoA, and polysaccharide and peptide Includes, but is not limited to, biosynthetic pathways. Overall, secondary metabolism occurs with all primary metabolic pathways of carbon metabolism (Fungal Physiology, Chapter 9, pages 246-274, edited by DH Griffin, 1994). "Secondary metabolites" also include intermediate compounds in secondary metabolite biosynthetic pathways that are assigned to secondary metabolite synthesis pathways. By "assigned to a secondary metabolite synthesis pathway" is meant that once the intermediate is synthesized by the cell, the cell does not convert the intermediate to a primary metabolite. "Intermediate compounds" also include secondary metabolic intermediate compounds that can be converted to useful compounds by subsequent chemical or subsequent biotransformation. Thus, by improving the availability of such intermediate compounds, it is believed that the production of the final useful compound will further increase, and the final useful compound itself may be referred to herein as a secondary metabolite. The yeast Saccharomyces cerevisiae is not known to produce secondary metabolites. The term "primary metabolite" refers to a natural product that has a clear role in the function of almost all living organisms. Primary metabolites include, but are not limited to, compounds involved in the biosynthesis of lipids, carbohydrates, proteins and nucleic acids. The term "increases the yield of secondary metabolites" means to increase the amount of secondary metabolites present in the whole fermentation broth per unit volume of fermentation broth or per unit mass of solid medium. "Extracellular enzymes" are enzymes secreted by the fungus into the surrounding medium.
[0051]
In a tenth aspect, the invention provides a novel chimeric fungal regulator gene. In the sense of the present invention, a "chimeric fungal regulator gene" is a fungal regulator gene or a part thereof fused to a nucleic acid sequence which is not naturally fused. Preferred nucleic acids for the purpose of such fusions include, but are not limited to, the fungal regulator gene or a portion thereof as well as the regulatory region of the gene.
[0052]
Non-limiting examples of some preferred chimeric fungal regulator genes are shown in Table IV below and in the sequence listing as SEQ ID NOs.
[0053]
[Table 4]
In an eleventh aspect, the invention provides a method of altering the production of secondary metabolites or extracellular enzymes, comprising expressing a novel chimeric fungal regulator gene in a fungus. Such expression can be achieved and / or varied by expression of other genes, interaction with drugs or small molecules, or gene transformation, eg, as described in the Examples. In certain preferred embodiments, a combination of multiple novel and / or chimeric regulator genes of the invention can be expressed simultaneously or sequentially.
[0054]
The term "varies the production of secondary metabolites or extracellular enzymes" herein is specifically defined as one or more variables that affect the production process of secondary metabolites or extracellular enzymes in fungal fermentation. Means to influence. These variables include the amount of secondary metabolites or extracellular enzymes produced (absolute or per unit volume of fermentation broth or unit mass of solids), the volume required to produce a sufficient amount, Raw material and energy costs, fermenter operating or cultivation time, amount of waste that must be processed after fermenter operation, specific production of desired metabolites or extracellular enzymes (all produced by fungi) The total amount of secondary metabolites and by-products of, and as part of) the percentage of final secondary metabolites or extracellular enzyme products that can be recovered from the fermentation broth or culture, and secondary metabolites or extracellular Includes resistance to adverse effects that may be experienced by contact with secondary metabolites or extracellular enzymes of the microorganism producing the enzyme, including but not limited to It is not. Also, the term "secondary metabolite" is a compound derived from a primary metabolite, produced by an organism, and not a primary metabolite, but not ethanol or fusel alcohol, but grown under standard conditions. Means a compound that is not required. Secondary metabolites are derived from intermediates of many primary metabolic pathways. These pathways include amino acid biosynthetic pathways, shikimate pathway of aromatic amino acid biosynthesis, polyketide biosynthetic pathway from acetyl coenzyme A (CoA), mevalonic acid pathway from acetyl CoA, and polysaccharide and peptide polysaccharide. Includes, but is not limited to, biosynthetic pathways. Overall, secondary metabolism occurs with all primary metabolic pathways of carbon metabolism (Fungal Physiology, Chapter 9, pages 246-274, edited by DH Griffin, 1994). "Secondary metabolites" also include intermediate compounds in secondary metabolite biosynthetic pathways that are assigned to secondary metabolite synthesis pathways. By "assigned to a secondary metabolite synthesis pathway" is meant that once the intermediate is synthesized by the cell, the cell does not convert the intermediate to a primary metabolite. "Intermediate compounds" also include secondary metabolic intermediate compounds that can be converted to useful compounds by subsequent chemical or biological conversion. Thus, by improving the availability of such intermediate compounds, it is believed that the production of the final useful compound will further increase, and the final useful compound itself may be referred to herein as a secondary metabolite. The yeast Saccharomyces cerevisiae is not known to produce secondary metabolites. The term "primary metabolite" refers to a natural product that has a distinct role in the function of almost all organisms. Primary metabolites include, but are not limited to, compounds involved in the biosynthesis of lipids, carbohydrates, proteins and nucleic acids. The term "increases the yield of secondary metabolites" means to increase the amount of secondary metabolites present in the whole fermentation broth per unit volume of fermentation broth or per unit mass of solid medium. "Extracellular enzymes" are enzymes secreted by the fungus into the surrounding medium.
[0055]
The following examples are intended to further illustrate certain particularly preferred embodiments of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
Embodiment 1
[0056]
(Transformation of filamentous fungi)
Protoplasts were generated as follows. The spores were inoculated in a rich medium and allowed to germinate for about 20 hours or until the germ tubes were 5-10 spores long. If the fungus does not sporulate (some taxol-producing fungi do not sporulate), it is possible to sonicate the mycelium into small fragments and use these small mycelial fragments as inoculum. Another option is to find a medium in which the fungus sporulates. For example, sporulation of taxol-producing fungi can be induced by growing on water agar plates containing gamma-irradiated carnation leaves. Furthermore, in a Penicillium chrysogenum strain with a slow sporulation, sporulation can be promoted by using a high-salt medium. Germinated spores were centrifuged and washed twice with sterile distilled water and once with 1M magnesium sulfate. The germinated spores were then resuspended in 1 M magnesium sulfate containing about 2 mg / ml Novozyme (Novozyme®). The tubes were then incubated at 30 ° C. with shaking at 80 rpm for about 2 hours or until most of the mycelium had been digested and the protoplasts were sufficiently enriched. The protoplasts were filtered through one layer of Miracloth®. At least one volume of STC was added and the protoplasts were sedimented by centrifugation. The protoplasts were washed twice with STC. The protoplasts were then resuspended in 1 ml STC and counted on a hemocytometer. About 5 × 10 5 protoplasts in a 9: 1: 0.1 solution of STC, SPTC and DMSO 7 A final concentration of cells / ml was frozen at −80 ° C. (cooled at −1 ° C./min) in a Nalgene® Cryo cooler.
[0057]
The transformation solution was as follows. That is, STC (0.8 M sorbitol, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 25 mM CaCl 2 2 ) And SPTC (0.8 M sorbitol, 40% PEG 4000, 25 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM CaCl 2 ).
[0058]
1-5 μg of DNA containing the novel regulator gene of the present invention in a fungal expression vector was placed in a 50 mL Falcon (registered trademark) tube. 100 μl of frozen protoplasts were added to the DNA, mixed gently, and then incubated on ice for 30 minutes. After adding 15 μl of SPTC, they were mixed by tapping and incubated at room temperature for 15 minutes. 500 μl SPTC was added, mixed well by tapping and rolling, then incubated for 15 minutes at room temperature. 25 ml of regeneration minimal medium was added, mixed well and poured onto a plate containing 25 ml of regeneration minimal medium supplemented with a 2 × concentration of selective agent. Transformation plates were incubated at 26 ° C for 5-6 days or until colonies began to appear. Regeneration minimal medium at pH 6.5 contains trace elements, salts, 25 mM sodium nitrate, 0.8 M sucrose and 1% agarose. A successful drug of choice for use with Penicillium chrysogenum and A. terreus is phleomycin, a broad spectrum glycopeptide antibiotic. Transformants were harvested using a toothpick (if the fungus sporulated) or sterile forceps (if the fungus did not sporulate) and mounted on a new plate. The purification plate contains minimal medium (same as regeneration minimal medium, but with 2% sucrose instead of 0.8M sucrose) and one-fold concentration of drug. The collected transformants were incubated at 26 ° C. for 5 to 6 days.
Embodiment 2
[0059]
(Growth of transformant in production medium)
In the case of P. chrysogenum and penicillin production, plugs containing spores and mycelium were used as inoculum. The medium used was a publicly available P2 production medium containing 30% lactose, 5 × Pharmamedia® cotton seed powder, ammonium sulfate, calcium carbonate, potassium phosphate, potassium sulfate and phenoxyacetic acid pH7. Was. The flask was incubated at 26 ° C. with shaking at 225 rpm.
[0060]
In the case of A. terreus and lovastatin production, spores were used as inoculum. Spores were collected from the purification plate using a wooden inoculation stick. The medium was corn steep liquor, sodium nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, P2000 (Dow chemical), RPM with trace elements and lactose or glucose as a carbon source. The medium was at pH 6.5. The flask was incubated at 26 ° C. with shaking at 225 rpm. In the case of 96-well stationary culture, the same medium was used, and spores were collected from a purification plate using a wooden toothpick. The 96-well plate was incubated at 26 ° C. without shaking.
[0061]
Sampling was performed after 6 days of incubation for penicillin, 5 days for lovastatin, and 21 days for taxol. For shake flask experiments, 1-1.5 ml of supernatant was placed in a 96 well plate, centrifuged, and the supernatant was transferred to a new 96 well plate. Samples were frozen at -80 ° C for storage or for later assays.
[0062]
The culture grown on the 96-well plate was centrifuged, and the supernatant was transferred to a new 96-well plate. Samples were frozen at -80 <0> C.
[0063]
The detection limit for taxol in the assay kit manufactured by the Hawaii Biotechnology Group is 0.5 ng / mL. Assuming bacteria producing taxol at a level of 25 ng / L, the step of enriching the taxol production culture 20- to 25-fold is within the standard curve (> 0.625 ng / mL) achievable with this kit. Should. A minimum of 15 mL culture volume is required to obtain a sufficient amount of each sample for duplicate testing. Samples are taken after 21 days of incubation.
Embodiment 3
[0064]
(Measurement of penicillin concentration)
Phenoxymethylpenicillin (sodium salt) solutions in 10 mM potassium phosphate (pH 7.0) were prepared at 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 and 500 μg / mL. The imidazole reagent was prepared as follows. 8.25 g of imidazole was dissolved in 60 mL of water, 10 mL of 5 M HCl was added, and then 10 mL of mercuric chloride solution (0.27 g in 100 mL of water) was added. The pH was adjusted to 6.80 ± 0.05 with 5M HCl, and the solution was diluted to 100 mL with water.
[0065]
The fermentation broth was clarified by centrifugation at 4000 g for 10 minutes. 40 μL of the clear fermentation broth and penicillin standard solution were pipetted into individual wells of a 96-well UV collection plate. 200 μL of the imidazole reagent was pipetted into a 96-well filter plate (0.45 micron). The derivatization reaction of penicillin was started by adding the imidazole reagent to the collection plate containing the divided sample and standard solution by vacuum filtration. The collection plate was placed in a 96 well plate reader at 45 ° C. and the increase at 325 nm was monitored for 20 minutes.
[0066]
A 96 well UV / Vis plate reader manufactured by Molecular Devices was used for all spectrophotometric detections. This is a conventional assay, for example as described in Bundgaard and Ilver, Journal of Pharm Pharmac, 24, 790-794 (1972).
Embodiment 4
[0067]
(Measurement of lovastatin concentration)
Remove 10 μL of sample, 2 Diluted 1: 100 with O. 10 μL of this diluted broth was mixed with 1 mM HMGCoA, 1 mM NADPH, 0.005 mM DTT and 5 μL of (His) 6 Assay was performed in a reaction solution containing HMGR (200 μL in total volume). The disappearance of the absorbance at 340 nm was observed over time. This represents a loss of NADPH, whereas lovastatin inhibits this reaction. Initial rates were calculated for reactions containing the sample, corrected for dilution, and compared to reactions containing lovastatin standards to determine the concentration of metabolites produced. (His) 6 HMGR was expressed in Saccharomyces cerevisiae and purified on a nickel column.
Embodiment 5
[0068]
(Measurement of taxol concentration)
Assay 1: At least 15 mL of broth from static culture was neutralized to pH 7 (Taxol is unstable in non-neutral conditions), frozen using liquid nitrogen, and all samples were lyophilized overnight (cell mass and Dry together with the broth). The dried material is ground by vigorous shaking using glass beads. Extract each sample (assuming 1 g dry matter) with 10 mL methylene chloride. After 6 hours, the methylene chloride extract is passed through a cotton plug and lyophilized overnight to dryness. Add 50 μL of methanol to all samples and, once dissolved, add 450 μL of the appropriate buffer or water and test by immunoassay. Assuming that there is a 15 mL starting sample from the fungus producing about 25 ng / L, the final concentration is expected to be about 0.75 ng / mL.
[0069]
Assay 2: At least 15 mL of broth from static culture is neutralized to pH 7 and filtered through four layers of cheesecloth. The broth is extracted twice with 15 mL of methylene chloride and the organic layers are combined. The biomass is loosened and extracted three times with 10 mL each of chloroform / methanol (1: 1). The loosened mycelium extract is combined with the extracted broth, and 60 mL of the organic extract per sample is lyophilized to dryness overnight. Add 50 μL of methanol to all samples and, once dissolved, add 450 μL of the appropriate buffer or water and test by immunoassay. Assuming that there is a 15 mL starting sample from the fungus producing about 25 ng / L, the final concentration is expected to be about 0.75 ng / mL.
[0070]
The assay kit contains a taxol protein antigen detected by an anti-taxane antibody. The presence of taxol in the test isolate competitively inhibits the detection of taxol protein antigen. The immunoassay requires 100 μL of sample and complies with the protocol in the kit. The immunoassay is performed using a 96-well plate, and the assay takes about 8 to 9 hours.