JP2004536310A - 診断マーカー - Google Patents
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Abstract
本発明は、非ヒト動物ライフステージ分類システムに関するものであり、より詳細には、限定はされないが、非ヒト動物個体の生理学的マーカーを用いるライフステージ分類システムに関する。当該ライフステージ分類は、コンパニオン動物のライフステージをより正確に定義するのに用いることができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト動物ライフステージ分類システムに関するものであり、より詳細には、限定はされないが、非ヒト動物個体の生理学的マーカーを用いるライフステージ分類システムに関する。
【０００２】
当該ライフステージ分類は、コンパニオン動物のライフステージをより正確に定義するのに用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
現在、動物はヒトとほぼ同等の年齢を用いて「加齢」する。ヒトにおける研究は、ヒトを幼児期、成人期、老年期のライフステージ群に分けるが、これらの分割がどのように行われるかの明瞭な定義は無い。同様に、イヌの研究は平均年齢２．４歳のラブラドル犬を若年、同じく平均年齢５．８歳を壮年、同じく平均年齢７．１歳を老年と定義している。あるいは、ジャーマンシェパード犬について、若年、成年および老年という定義が、これらの群がどのように定義されたのかの明瞭な指針無しに示されている。
【０００４】
この「加齢」は恣意的であり、動物のライフステージにおける変化を表す生理学的変化を反映しない。哺乳類の免疫系の機能は年齢に伴って非常に劇的に変化するという意見の一致がある。最近のデータは、免疫老化が以前に認識されていたよりも複雑な過程であることを示唆する。胸腺退縮は、年齢に関連する免疫不全の主要な原因因子と一般に考えられているが、当初思われていたほどには中心的役割を果たしていない可能性がある。ある研究は、免疫機能の一部の側面、特により進化的に隔たった先天性反応は、老年期で保存されているかまたはおそらくよくアップレギュレートされているように思われることを示している。このことは、免疫老化は単なる劣化でなく、より正確には、免疫再構成過程として考え得ることを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、非ヒト動物についてライフステージ分類を定義する必要がある。そのような分類システムは、加齢に及ぼすさまざまな因子の影響を特定するのに用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
どのようなライフステージ分類でも、変化のマーカーが必要である。本発明者らは、特定のマーカーがライフステージを定義するための良好な尺度であることを見出した。このマーカーは、体重または他の身体的測定値といった以前のマーカーよりも良好なライフステージ分類を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、第１の態様によると、非ヒト動物のライフステージを特定するための生理学的マーカーの使用を提供する。
【０００８】
本発明者らは、いくつかの生理学的パラメータにおける年齢に関連する有意な変化が、イヌ科またはネコ科動物の機能状態の変化を反映することを見出した。これらの変化を用いて、ライフステージ分類を定義した。これは、ライフステージ分類の基礎を生理学的マーカーに置いた最初の報告であり、年齢に伴って変化する生理学的状態に基づいた特定のライフステージの食餌を設計する可能性を開く。本発明は、イヌまたはネコの生理学的システムの年齢に伴う発達、維持および調節を監視するための基盤を提供する。
【０００９】
本発明は、（特に、栄養的な介入を利用して）生理学的システムがストレッサー（酸化的ストレスの要素を有する疾患）に対処する能力を高める新規の戦略を提供する。
【００１０】
これらの疾患は、癌、加齢、心疾患、アテローム性動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎疾患、腎不全、神経変性疾患または免疫不全を含み、たとえば感染症に罹患した動物である。
【００１１】
ライフステージ群（幼犬／幼猫、成体および老年）を定義するために生理学的機能変化の１または複数の指標を用いて、最適な生理学的機能の維持を助けるかまたは、最適に満たない生理学的システムを向上させて、加齢に伴うストレッサーの発生を潜在的に減少させるのを助ける、特定のライフステージのための栄養所要量のバランスを取ることができる。
【００１２】
本発明者らは、免疫状態における変化が、イヌ科およびネコ科動物の生涯の明瞭な時期に生じることを発見した。
【００１３】
本発明では、生理学的マーカーは、免疫状態の１または複数の指標であってよい。そのような指標は、１または複数の細胞媒介性免疫マーカー、１または複数の抗体媒介性免疫マーカーあるいは１または複数の先天性免疫マーカーを含む。
【００１４】
特定の細胞媒介性免疫マーカーは、本発明によると、ＣＤ３細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、ＣＤ２１細胞、ＣＤ１１ｂ細胞、顆粒球およびリンパ球の集団のようなＴ細胞マーカーを含む。ＣＤ４：ＣＤ８細胞の比もまた有用なマーカーである。
【００１５】
本発明の第１の態様では、ライフステージは任意の方法によって定義することができる。それは時間（すなわち年齢）によって定義してもよく、または幼犬／幼猫、成体および老年期（またはその他）への分割によって定義してもよい。
【００１６】
本発明は、主に非ヒト動物、特にコンパニオン動物に適用される。典型的なコンパニオン動物は、たとえば家イヌ（Ｃａｎｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）および家ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）といった犬猫を含む。すべての系統が本発明に包含される。任意のライフステージ分類は、全動物種を対象とするかまたは種（すなわち系統）特異的である。たとえば、ライフステージ分類は、特にラブラドル犬またはジャーマンシェパード用であってもよい。ライフステージ分類はまた、たとえば、大型犬種対小型犬種に関するものであってよい。
【００１７】
本発明の第２の態様は、非ヒト動物のライフステージを特定する方法であって、動物個体における下記のＴ細胞のうち１つの集団を測定し、指定の図を参照して、当該動物のライフステージを特定する、各工程を含む方法に関する：
イヌ科動物については；
ＣＤ３：図１ａまたは図２ａ
ＣＤ４：図１ｂまたは図２ｂ
ＣＤ８：図１ｃまたは図２ｃ
ＣＤ４：ＣＤ８比：図１ｄまたは図２ｄ
ＣＤ２１：図１ｅまたは図２ｅ
ネコ科動物については；
ＣＤ４：図３
ＣＤ８：図４または図９
ＣＤ４：ＣＤ８比：図５
顆粒球：図６
リンパ球：図７
ＣＤ１１ｂ細胞：図８
【００１８】
測定したＴおよびＢパラメータに、年齢に関連する有意な変化が生じるのが認められた。ＣＤ３およびＣＤ８は、最も顕著に影響を受けたパラメータであった。非常に有意な変化が、８〜１２ヶ月齢未満、１〜８歳の間、および８歳を超える動物の間で測定された。したがって、本発明によって下記のライフステージ分類が提示される：
【表１】
【００１９】
これらのライフステージは下記の免疫マーカーに基づいて定められている：
【表２】
【００２０】
第１の態様のすべての好ましい特徴はまた、第２の態様にも適用される。
【００２１】
本発明の第３の態様は、動物個体の生理学的マーカーのレベルを当該動物についての特定のライフステージに関連づける図、グラフまたは表を含む、非ヒト動物ライフステージ分類システムを提供する。
【００２２】
図の例は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９のいずれにも見ることができる。
【００２３】
本発明のすべての態様に関して、生理学的マーカーは加齢過程に関連することが示されている任意のものであってよい。免疫状態を反映するマーカーと同様に、適当なマーカーとして、細胞周期、ＤＮＡ修復を反映するマーカー、抗酸化マーカーなどを含む。
【００２４】
第１および第２の態様のすべての好ましい特徴はまた、第３の態様にも適用される。
【００２５】
本発明の第４の態様は、生理学的マーカーに及ぼす１または複数の因子の影響を特定するための、本発明の第３の態様に基づくライフステージ分類の使用を提供する。生理学的マーカーは、任意のものであってよく、特に、本発明の第１から第３の態様について記載されたものであってよい。
【００２６】
特定される因子は制限されない。適当な因子は：食品、医薬品、環境変化（季節または地理的変化）、ストレス、などを含む。
【００２７】
本発明の第４の態様の特定の特徴は、食餌の影響を特定することである。「食餌」の語はここでは栄養を含み動物が摂取するすべての食品を対象とする。食餌は従来の基礎食品、ならびに栄養補助食品、飲料、スナック、おやつなどを含む。食品は湿性食品、乾性食品、半湿性食品を含む。
【００２８】
本発明に基づいて、ライフステージ分類を用いて食餌の効果を特定することができる。この方法では、動物に有益な効果を有する食餌を特定することができる。したがって、低下している免疫状態を回復する食餌を特定することができる。
【００２９】
有益な効果のためにこのように食餌による介入を提供することができる。当該食餌は、ライフステージ特異的であることを要する。あるいは、当該食餌は、たとえばラブラドル犬または大型種対小型種特異的といったように、種特異的（系統特異的）であってもよい。当該食餌は、ライフステージおよび種（またはその他）の両方に特異的であってもよい。寿命の種間差は、年齢に伴う免疫状態に大きな影響を及ぼすと思われ、異なる種には異なる食餌を提案しまたは支持する。イヌおよびネコの集団において、栄養補助食品（たとえばビタミンＣ）または栄養補助食品とその他の食品の組合せを用いて、最適の免疫力を維持するか、もしくは年齢に関連する低下または抑制された免疫機能を若返らせることができる。臨床的視点から、治療食の有効性を評価するために、健常集団のベースラインデータを、臨床的に免疫抑制された集団との比較するために用いてもよい。
【００３０】
第１から第３の態様のすべての好ましい特徴はまた、第４の態様にも適用される。
【００３１】
本発明の第５の態様は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の任意の１つに示すコンパニオン動物ライフステージ分類に関する。
【００３２】
本発明の第６の態様は：
（ａ）動物の生理学的マーカーを測定し；
（ｂ）前記測定に基づいて当該動物についてライフステージ分類を特定し；さらに
（ｃ）ライフステージ分類によって変化する食餌を当該動物に与える、各工程を含む、非ヒト動物に給餌する方法を提供する。
【００３３】
第１から第４の態様のすべての好ましい特徴はまた、第５の態様にも適用される。
【００３４】
本発明の第７の態様は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の１または複数を参照して、非ヒト動物に給餌する、実質的に上に記載した通りの方法を提供する。
【００３５】
本発明の第８の態様は、非ヒト動物のライフステージ分類に最適化された動物用の食品であって、前記分類が当該食品を消費する種または系統の動物の集団について測定された生理学的マーカーの平均測定値に従って特定されたものであることを特徴とする食品を提供する。
【００３６】
本発明の第８の態様において言及された生理学的マーカーの平均測定値は、前記生理学的マーカーの典型的または代表的測定値を含む。
【００３７】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、前記分類の動物の栄養について最適化されている。
【００３８】
本発明の第８の態様の動物用の食品は、前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化されていてもよい。生理機能の向上は、当該動物が前記分類に典型的なストレスに対処することを可能にする。
【００３９】
動物の生理機能を向上させることは、前記動物の代表的な生理学的マーカーを向上させることを含むであろう。
【００４０】
本発明の第８の態様は、前記分類に典型的な疾患に対処するために前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化された動物用の食品を構成し得る。
【００４１】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、イヌ用の食品またはネコ用の食品を構成し得る。
【００４２】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、特定のサイズ範囲、特定の体重または特定の系統の動物用に、最適化されるか、またはさらに最適化され得る。
【００４３】
本発明の第８の態様の動物用の食品は、その食品が最適化されている前記分類の目に見える指標を有する容器内に包装された食品を構成し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明によると、非ヒト動物用の食品は、非ヒト動物が食餌で消費する任意の工夫を包含する。具体的には、コンパニオン動物または動物用の食品が含まれる。このように、本発明は、標準的な食品ならびにスナック食品（たとえば、スナックバー、シリアルバー、スナック、ビスケット、甘味類）を対象とする。そのようなスナック食品はペット用スナック食品であってよい。当該食品は、調理済み製品であってもよい。その食品は、肉または動物由来材料（たとえば牛肉、鶏、七面鳥、子羊、魚、血漿、骨髄などまたはその１つ以上）を加えることができる。あるいは、当該食品は、タンパク源を供給するのに肉を含まないものであってもよい（好ましくは大豆、トウモロコシグルテンまたは大豆製品といった肉の代用物を含む）。当該食品は、たとえば大豆タンパク濃縮物、牛乳、タンパク質、グルテンなどのような、追加のタンパク源を含んでいてよい。当該食品はまた、１または複数の穀類（たとえば小麦、トウモロコシ、米、カラス麦、大麦など）のような、デンプン源を含んでいてよく、あるいはデンプンを含まなくてもよい。当該食品は、ゼラチン化デンプン質を含むか、またはゼラチン化デンプン質であってよい。当該食品は、たとえばビートパルプ、チコリ、ココナツ内胚乳繊維、小麦繊維などといった、１または複数の種類の繊維を含んでいてよい。
【００４５】
当該食品は、乾性、半湿性、湿性（モイスト）製品であってよい。湿性食品は、通常は缶詰で販売され、含水量が７０％から９０％であるものを含む。乾性食品は、同様の成分を有するが、水分が５％から１５％であり、しばしば小さなビスケット様の粗粒として提示される食品を含む。半湿性食品は、１５％を超えて最大７０％までの含水量を有する食品を含む。どのような製品でも、水分の量は、使用できるまたは必要な包装の種類に影響を与えるであろう。
【００４６】
当該食品は、好ましくは包装されている。この態様で、消費者は、包装から食品の成分を識別することができ、その食品が問題の特定の非ヒト動物に適していることを確認することができる。包装は、金属（通常は缶詰または可塑箔包装の形で）、プラスチック（通常はパウチまたは瓶の形で）、紙またはボール紙であってよい。任意の製品中の水分の量は、使用することができるまたは必要な包装の種類に影響を与えるであろう。
【００４７】
本発明を下記の図面を参照して記載する。
【実施例】
【００４８】
本発明を下記の実施例を参照して記載する。
【００４９】
実施例１
材料および方法
動物
末梢血白血球部分集合における年齢に関連する変化についての免疫学的ベースラインを設定するために、０．６歳から１４．２歳の範囲の１２２頭のラブラドル犬（雌７１頭および雄５１頭）から全血標本を採取した。
【００５０】
試料採取
すべての血液試料は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析用に、１ｍＬのＥＤＴＡカリウム試験管に採取した。
【００５１】
白血球プロファイル測定
免疫反応は、異なる機能を有するさまざまな細胞型（白血球）から構成される。これらの異なる白血球集団の同定は、免疫反応の基礎を理解する基盤を提供する。白血球集団に対する反応性を有するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の開発に伴い、すべてのＴ細胞（ＣＤ３）、Ｔ細胞部分集合（ＣＤ４およびＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ２１）および単球（ＣＤ１４）に対するマーカーが、測定可能な集団の一部を担う。
【００５２】
ＦＡＣＳ分析は、白血球の生きている部分集合を特徴づけおよび定量するのに広く用いられている。ＦＡＣＳ分析は、３つの段階を含む；最初に、細胞を調製し、特定の表面マーカーに対する該当Ｍａｂとインキュベートし、さらに蛍光試薬（たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））で標識する；次に、染色した細胞をＦＡＣＳによって同定および分離し、データを集める；３番目に、集めたデータを分析して、該当する細胞集団に関する定量的情報を得る。
【００５３】
イヌの白血球集団
細胞溶解した全血の染色と三重染色ＦＡＣＳ分析を用いることによって、下記の免疫学的細胞表面マーカーの相対的発現レベルおよび白血球集団を測定した：
ＣＤ３−全Ｔ細胞マーカー
ＣＤ４−ヘルパーＴ細胞マーカー
ＣＤ８−細胞毒性Ｔ細胞マーカー
ＣＤ４：ＣＤ８比−細胞毒性Ｔ細胞に対するヘルパーＴ細胞の相対レベル
ＣＤ２１−Ｂ細胞マーカー
ＣＤ１４−単球マーカー
リンパ球−白血球の部分集合
顆粒球−白血球の部分集合
単球−白血球の部分集合
リンパ球生存可能性−死細胞に対する生細胞の割合
Ｃ１１ｂ−細胞表面マーカー
統計分析
数値は、動物個体それぞれについて、細胞集団のパーセンテージとして表した。結果は年齢範囲全体にわたる傾向を特定するために直線回帰によって統計的に評価した。判別分析を用いて、導き出されたライフステージの群分け間を最もうまく区別する細胞表面マーカーの部分集合を特定した。ライフステージ間の差については、個々の細胞集団それぞれについて独立標本のｔ検定を実施し、ライフステージ間の有意差を確認した。
【００５４】
結果
イヌの白血球集団
下記の散布図は、さまざまな白血球集団の相対的割合を年齢（年単位）に対して示す。得られたデータにおいて有意な傾向を特定するために、直線回帰分析を用いた。分析によって、加齢に伴いＣＤ３の有意な増加（Ｒ２＝０．０６、ｐ＜０．００８；図１ａ）,ＣＤ４の有意な減少（Ｒ２＝０．０３、ｐ＜０．０５；図１ｂ）、ＣＤ８の有意な増加（Ｒ２＝０．２４、ｐ＜０．００１；図１ｃ）とともに、ＣＤ４：ＣＤ８比の対応する減少（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図１ｄ）が検出された。
【００５５】
判別分析のための年齢群は８歳である。
【００５６】
イヌのライフステージ群
これらの結果は、ラブラドル犬集団において、加齢といくつかの白血球集団の相対的割合の変化との間に有意な相関が明らかにされた。判別分析を用いて、導き出されたライフステージの群分け間を最もうまく区別する白血球集団を特定し、ＣＤ３（図２ａ）およびＣＤ８（図２ｃ）は、両方のマーカーに関して全体の正確な分類が８３％（交差確認）で、２つの統計的に区別可能な群、すなわち成犬（０．６から８歳）および老犬（８歳を超える）を定義した。
【００５７】
考察
イヌの白血球集団
我々の検討は、イヌ集団由来の末梢血において、ＣＤ３およびＣＤ８Ｔ細胞の相対的割合における年齢に関連する有意な増加、ならびに、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ４：ＣＤ８比における年齢に関連する有意な減少を示した。
【００５８】
本研究において観察された有意な変化は、Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４：ＣＤ８比）に関するものであり、そのすべてが後天性免疫系（免疫記憶の発生を含む、抗体特異的Ｔ細胞の抗体に対する反応）の細胞成分に関連する。ある場合に、いくつかのＲ２値が特に低いが（図１ａ、１ｂ）、これらのデータは、０．６歳から１４．２歳の年齢範囲にわたる健康なイヌの独立検体を採取する場合に集団に見られる自然の変動を表すため、これは予想外のことではない。
【００５９】
ＣＤ３Ｔ細胞マーカーは、すべてのＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞部分集合の両方を包含する）を特徴づけるが、年齢に伴って相対的割合に有意な増加を示した（図１ａ）。このことは、ＣＤ３マーカーを同時発現するＣＤ８Ｔ細胞の相対的増加が、同じマーカーを発現するＣＤ４Ｔ細胞の相対的減少より大きいことが原因の一部であろう。ヒトにおける研究はまた、ＣＤ８Ｔ細胞のレベルの年齢に伴う増加を示しており、これらの細胞型が、上記に強調する加齢に伴う過程が原因で、完全な成熟機能状態に到達できない未熟Ｔ細胞に相当することを示唆する。また、総Ｔ細胞部分集合の絶対値および相対値を検討した他のイヌおよびヒトの研究からのデータの解釈と組み合わせた場合、そのＴ細胞部分集合の絶対数がより遅い速度で減少しているため、総Ｔ細胞の割合における増加が明らかであることが示された。
【００６０】
ＣＤ３マーカーが、一般にＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に共有されているが、それらの機能は互いに非常に異なる。ＣＤ８Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞）の機能は、細胞内病原体（たとえばウイルス）を含む宿主細胞を識別し、破壊することである。ＣＤ４Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）は、細胞外病原体（たとえば細菌および寄生虫）を破壊するために、他の細胞を活性化することに特化しており、２つの機能的分類に分けられる：取り込んだ細菌を殺す単球／マクロファージを活性化するＴへルパー１（ＴＨ１）細胞、および抗体を産生するＢ細胞を活性化するＴＨ２細胞である。
【００６１】
イヌのＣＤ８Ｔ細胞の相対的割合において観察された有意な増加（図１ｃ）は、「記憶」Ｔ細胞集団と呼ばれるものに含まれる。上述の通り、記憶Ｔ細胞の産生は、体が個々の抗原刺激に反応し、その特定の感染を抑制するかまたは排除するための反応を起こしていることを示す。やがて、これらの同じ生理学的反応は、その特定の抗原に再度遭遇した場合に、個体がより速やかに感染に反応することを可能にする記憶Ｔ細胞の（拡大した）クローンの発展的な蓄積に繋がる。このことは、ＣＤ８Ｔ細胞のレベルが年齢に伴って上昇するという知見を支持する。
【００６２】
結論として、加齢する個体内での細胞の分析と組み合わせた機能的細胞老化の測定に関する研究は、免疫系の調節が年齢に伴ってどのように発達するかについての新たな見識を提供する。イヌ集団からの証拠は、末梢血中の白血球集団の相対的割合における年齢に関連する変化を実証している。これらの研究は、区別可能な白血球集団で連続的な再構成が起こっていて、加齢するイヌの免疫系の機能状態を潜在的に変化させていることを示唆する。そのような研究からの情報は、免疫系の可塑性、長期にわたる基礎免疫の全体的な維持、代償機能の調節および長期記憶の調節を監視するための基盤を提供する。この情報は疑いなく、動物の一生の間、特に動物の一生の後期段階の間に、（ここで前述したような）そのようなストレッサーに対処するための免疫系の能力を向上させる新規の戦略（特に栄養的介入を利用する）を開発する助けとなる。
【００６３】
示された情報から、イヌの免疫状態に有意な変化が実際起こっていることは明らかであり、年齢に伴う免疫状態の調節が存在することを示唆する。白血球の各群についての散布図情報に関する判別分析を用いて、ＣＤ３およびＣＤ８Ｔ細胞マーカーの両方が、２つの統計的に区別可能なライフステージ群、すなわち８歳未満の成犬および８歳を超える老犬を定義した（図２ａ、ｃ）。ＣＤ４：ＣＤ８比（図２ｄ）およびＣＤ２１（図２ｅ）は有意差を示したが、その分類はＣＤ３およびＣＤ８ほど高くなかった。
【００６４】
ＣＤ４：ＣＤ８比の分類レベルがより低いことの理由として、２つのライフステージ群間で、ＣＤ４細胞の割合の差が無視しうるものであることが考えられる（図２ｂ）。このことは、年齢尺度の高い側の限界（＞８歳）でイヌの数が少ないことに起因する可能性もあるが、また、老年群でのＣＤ４細胞の割合が、成年群のレベルのすぐ下の基底レベルに達していて、そのため８歳を超える年齢での有意な減少を見えなくしている可能性もある。
【００６５】
ＣＤ２１細胞の割合の低下は有意でなかったが（図１ｅ）、成年および老年ライフステージ群間の有意差（図２ｅ）は、より低い分類レベルではあるが、ＣＤ２１細胞の割合のより大きな低下が８歳レベル付近で起こり、それが今度は年齢散布図プロファイルの全体の状況に置かれると覆い隠されることを示唆するであろう。
【００６６】
異なるライフステージ間で変化する免疫状態のそのような指標は、感染および年齢の上昇に伴う潜在的な発癌因子についての免疫監視の低下を伴って、動物が免疫機能障害を被っているかどうかを特定するのに用いることができる。この種の情報は、最適な免疫機能を維持するかまたは、最適に満たない免疫系を向上させ変性疾患の発生を潜在的に低減させるのを助ける、特定のライフステージのための栄養所要量を定義するのに有用である。
【００６７】
実施例２
材料および方法
雄１２１匹および雌１６７匹の０．２から１５．９歳の範囲の２８８頭の短毛家ネコから全血標本を採取した。すべてのネコを、ペットネコ用と類似の条件下で飼育し、市販の完全食品を与えた。
【００６８】
細胞溶解した全血の染色と二重染色フローサイトメトリー分析を用いて試料を分析した。市販のモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞（ＣＤ２１様）、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂについて細胞表面マーカーを同定した。リンパ球、単球および顆粒球の相対レベルも計算した。
【００６９】
数値は、動物個体それぞれについて細胞集団のパーセンテージとして表した。年齢に関連する傾向は、直線回帰分析を用いて評価した。判別分析および独立標本のｔ検定を用いて、ライフステージ群分けを定義するための細胞集団を特定した。
【００７０】
結果
直線回帰分析は以下のように同定した：
・ＣＤ４の有意な減少（Ｒ２＝０．１２、ｐ＜０．００１；図３）
・ＣＤ８の有意な増加（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図４）
・ＣＤ４：ＣＤ８比の有意な減少（Ｒ２＝０．２３、ｐ＜０．００１；図５）
・顆粒球の相対レベルの有意な減少（Ｒ２＝０．１６、ｐ＜０．００１；図６）
・リンパ球の相対レベルの有意な減少（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図７）
・ＣＤ１１ｂの有意な増加（Ｒ２＝０．２１、ｐ＜０．００１；図８）
【００７１】
ＣＤ４：ＣＤ８比データの判別分析（図８）は、全体の正確な分類が７１％（交差確認）で、ネコの２つの統計的に区別可能な群、すなわち幼猫（０．２から０．８歳）および成猫（０．８歳を超える）の識別を可能にした。
【００７２】
考察
この試験からの結果を下記に示す：
・ＣＤ４の相対的割合における年齢に関連する有意な減少
・ＣＤ８の相対的割合における年齢に関連する有意な増加
・ＣＤ４：ＣＤ８比における年齢に関連する有意な減少
・ＣＤ１１ｂの相対的割合における年齢に関連する有意な増加
結論
これらの試験は、健常なネコにおいて、白血球部分集合に及ぼす加齢の影響を総合的に調査し、さらに免疫学的状態に基づいてライフステージを定義した最初のものである。本試験で特定されたライフステージは、短毛家ネコにおいて、年齢によって免疫学的状態が実際変化するという事実を強調する。したがって、白血球部分集合データの解釈が利用されているどの試験でも年齢を考慮することが必須である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】図１ａは、ＣＤ３細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｂ】図１ｂは、ＣＤ４細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｃ】図１ｃは、ＣＤ８細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｄ】図１ｄは、ＣＤ４：ＣＤ８比の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｅ】図１ｅは、ＣＤ２１細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図２ａ】図２ａは、イヌ由来ＣＤ３細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｂ】図２ｂは、イヌ由来ＣＤ４細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｃ】図２ｃは、イヌ由来ＣＤ８細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｄ】図２ｄは、イヌ由来ＣＤ４：ＣＤ８比の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｅ】図２ｅは、イヌ由来ＣＤ２１細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図３】図３は、ＣＤ４細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図４】図４は、ＣＤ８細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図５】図５は、ＣＤ４：ＣＤ８比の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図６】図６は、顆粒球の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図７】図７は、リンパ球の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図８】図８は、ＣＤ１１ｂ細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図９】図９は、最大８ヶ月齢までのデータと８ヶ月齢を超えるもののデータに分割された、ＣＤ４：ＣＤ８比データの判別分析を示す図である。
【０００１】
本発明は、非ヒト動物ライフステージ分類システムに関するものであり、より詳細には、限定はされないが、非ヒト動物個体の生理学的マーカーを用いるライフステージ分類システムに関する。
【０００２】
当該ライフステージ分類は、コンパニオン動物のライフステージをより正確に定義するのに用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
現在、動物はヒトとほぼ同等の年齢を用いて「加齢」する。ヒトにおける研究は、ヒトを幼児期、成人期、老年期のライフステージ群に分けるが、これらの分割がどのように行われるかの明瞭な定義は無い。同様に、イヌの研究は平均年齢２．４歳のラブラドル犬を若年、同じく平均年齢５．８歳を壮年、同じく平均年齢７．１歳を老年と定義している。あるいは、ジャーマンシェパード犬について、若年、成年および老年という定義が、これらの群がどのように定義されたのかの明瞭な指針無しに示されている。
【０００４】
この「加齢」は恣意的であり、動物のライフステージにおける変化を表す生理学的変化を反映しない。哺乳類の免疫系の機能は年齢に伴って非常に劇的に変化するという意見の一致がある。最近のデータは、免疫老化が以前に認識されていたよりも複雑な過程であることを示唆する。胸腺退縮は、年齢に関連する免疫不全の主要な原因因子と一般に考えられているが、当初思われていたほどには中心的役割を果たしていない可能性がある。ある研究は、免疫機能の一部の側面、特により進化的に隔たった先天性反応は、老年期で保存されているかまたはおそらくよくアップレギュレートされているように思われることを示している。このことは、免疫老化は単なる劣化でなく、より正確には、免疫再構成過程として考え得ることを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、非ヒト動物についてライフステージ分類を定義する必要がある。そのような分類システムは、加齢に及ぼすさまざまな因子の影響を特定するのに用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
どのようなライフステージ分類でも、変化のマーカーが必要である。本発明者らは、特定のマーカーがライフステージを定義するための良好な尺度であることを見出した。このマーカーは、体重または他の身体的測定値といった以前のマーカーよりも良好なライフステージ分類を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、第１の態様によると、非ヒト動物のライフステージを特定するための生理学的マーカーの使用を提供する。
【０００８】
本発明者らは、いくつかの生理学的パラメータにおける年齢に関連する有意な変化が、イヌ科またはネコ科動物の機能状態の変化を反映することを見出した。これらの変化を用いて、ライフステージ分類を定義した。これは、ライフステージ分類の基礎を生理学的マーカーに置いた最初の報告であり、年齢に伴って変化する生理学的状態に基づいた特定のライフステージの食餌を設計する可能性を開く。本発明は、イヌまたはネコの生理学的システムの年齢に伴う発達、維持および調節を監視するための基盤を提供する。
【０００９】
本発明は、（特に、栄養的な介入を利用して）生理学的システムがストレッサー（酸化的ストレスの要素を有する疾患）に対処する能力を高める新規の戦略を提供する。
【００１０】
これらの疾患は、癌、加齢、心疾患、アテローム性動脈硬化、関節炎、白内障、炎症性腸疾患、腎疾患、腎不全、神経変性疾患または免疫不全を含み、たとえば感染症に罹患した動物である。
【００１１】
ライフステージ群（幼犬／幼猫、成体および老年）を定義するために生理学的機能変化の１または複数の指標を用いて、最適な生理学的機能の維持を助けるかまたは、最適に満たない生理学的システムを向上させて、加齢に伴うストレッサーの発生を潜在的に減少させるのを助ける、特定のライフステージのための栄養所要量のバランスを取ることができる。
【００１２】
本発明者らは、免疫状態における変化が、イヌ科およびネコ科動物の生涯の明瞭な時期に生じることを発見した。
【００１３】
本発明では、生理学的マーカーは、免疫状態の１または複数の指標であってよい。そのような指標は、１または複数の細胞媒介性免疫マーカー、１または複数の抗体媒介性免疫マーカーあるいは１または複数の先天性免疫マーカーを含む。
【００１４】
特定の細胞媒介性免疫マーカーは、本発明によると、ＣＤ３細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、ＣＤ２１細胞、ＣＤ１１ｂ細胞、顆粒球およびリンパ球の集団のようなＴ細胞マーカーを含む。ＣＤ４：ＣＤ８細胞の比もまた有用なマーカーである。
【００１５】
本発明の第１の態様では、ライフステージは任意の方法によって定義することができる。それは時間（すなわち年齢）によって定義してもよく、または幼犬／幼猫、成体および老年期（またはその他）への分割によって定義してもよい。
【００１６】
本発明は、主に非ヒト動物、特にコンパニオン動物に適用される。典型的なコンパニオン動物は、たとえば家イヌ（Ｃａｎｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）および家ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）といった犬猫を含む。すべての系統が本発明に包含される。任意のライフステージ分類は、全動物種を対象とするかまたは種（すなわち系統）特異的である。たとえば、ライフステージ分類は、特にラブラドル犬またはジャーマンシェパード用であってもよい。ライフステージ分類はまた、たとえば、大型犬種対小型犬種に関するものであってよい。
【００１７】
本発明の第２の態様は、非ヒト動物のライフステージを特定する方法であって、動物個体における下記のＴ細胞のうち１つの集団を測定し、指定の図を参照して、当該動物のライフステージを特定する、各工程を含む方法に関する：
イヌ科動物については；
ＣＤ３：図１ａまたは図２ａ
ＣＤ４：図１ｂまたは図２ｂ
ＣＤ８：図１ｃまたは図２ｃ
ＣＤ４：ＣＤ８比：図１ｄまたは図２ｄ
ＣＤ２１：図１ｅまたは図２ｅ
ネコ科動物については；
ＣＤ４：図３
ＣＤ８：図４または図９
ＣＤ４：ＣＤ８比：図５
顆粒球：図６
リンパ球：図７
ＣＤ１１ｂ細胞：図８
【００１８】
測定したＴおよびＢパラメータに、年齢に関連する有意な変化が生じるのが認められた。ＣＤ３およびＣＤ８は、最も顕著に影響を受けたパラメータであった。非常に有意な変化が、８〜１２ヶ月齢未満、１〜８歳の間、および８歳を超える動物の間で測定された。したがって、本発明によって下記のライフステージ分類が提示される：
【表１】
これらのライフステージは下記の免疫マーカーに基づいて定められている：
【表２】
第１の態様のすべての好ましい特徴はまた、第２の態様にも適用される。
【００２１】
本発明の第３の態様は、動物個体の生理学的マーカーのレベルを当該動物についての特定のライフステージに関連づける図、グラフまたは表を含む、非ヒト動物ライフステージ分類システムを提供する。
【００２２】
図の例は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９のいずれにも見ることができる。
【００２３】
本発明のすべての態様に関して、生理学的マーカーは加齢過程に関連することが示されている任意のものであってよい。免疫状態を反映するマーカーと同様に、適当なマーカーとして、細胞周期、ＤＮＡ修復を反映するマーカー、抗酸化マーカーなどを含む。
【００２４】
第１および第２の態様のすべての好ましい特徴はまた、第３の態様にも適用される。
【００２５】
本発明の第４の態様は、生理学的マーカーに及ぼす１または複数の因子の影響を特定するための、本発明の第３の態様に基づくライフステージ分類の使用を提供する。生理学的マーカーは、任意のものであってよく、特に、本発明の第１から第３の態様について記載されたものであってよい。
【００２６】
特定される因子は制限されない。適当な因子は：食品、医薬品、環境変化（季節または地理的変化）、ストレス、などを含む。
【００２７】
本発明の第４の態様の特定の特徴は、食餌の影響を特定することである。「食餌」の語はここでは栄養を含み動物が摂取するすべての食品を対象とする。食餌は従来の基礎食品、ならびに栄養補助食品、飲料、スナック、おやつなどを含む。食品は湿性食品、乾性食品、半湿性食品を含む。
【００２８】
本発明に基づいて、ライフステージ分類を用いて食餌の効果を特定することができる。この方法では、動物に有益な効果を有する食餌を特定することができる。したがって、低下している免疫状態を回復する食餌を特定することができる。
【００２９】
有益な効果のためにこのように食餌による介入を提供することができる。当該食餌は、ライフステージ特異的であることを要する。あるいは、当該食餌は、たとえばラブラドル犬または大型種対小型種特異的といったように、種特異的（系統特異的）であってもよい。当該食餌は、ライフステージおよび種（またはその他）の両方に特異的であってもよい。寿命の種間差は、年齢に伴う免疫状態に大きな影響を及ぼすと思われ、異なる種には異なる食餌を提案しまたは支持する。イヌおよびネコの集団において、栄養補助食品（たとえばビタミンＣ）または栄養補助食品とその他の食品の組合せを用いて、最適の免疫力を維持するか、もしくは年齢に関連する低下または抑制された免疫機能を若返らせることができる。臨床的視点から、治療食の有効性を評価するために、健常集団のベースラインデータを、臨床的に免疫抑制された集団との比較するために用いてもよい。
【００３０】
第１から第３の態様のすべての好ましい特徴はまた、第４の態様にも適用される。
【００３１】
本発明の第５の態様は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の任意の１つに示すコンパニオン動物ライフステージ分類に関する。
【００３２】
本発明の第６の態様は：
（ａ）動物の生理学的マーカーを測定し；
（ｂ）前記測定に基づいて当該動物についてライフステージ分類を特定し；さらに
（ｃ）ライフステージ分類によって変化する食餌を当該動物に与える、各工程を含む、非ヒト動物に給餌する方法を提供する。
【００３３】
第１から第４の態様のすべての好ましい特徴はまた、第５の態様にも適用される。
【００３４】
本発明の第７の態様は、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の１または複数を参照して、非ヒト動物に給餌する、実質的に上に記載した通りの方法を提供する。
【００３５】
本発明の第８の態様は、非ヒト動物のライフステージ分類に最適化された動物用の食品であって、前記分類が当該食品を消費する種または系統の動物の集団について測定された生理学的マーカーの平均測定値に従って特定されたものであることを特徴とする食品を提供する。
【００３６】
本発明の第８の態様において言及された生理学的マーカーの平均測定値は、前記生理学的マーカーの典型的または代表的測定値を含む。
【００３７】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、前記分類の動物の栄養について最適化されている。
【００３８】
本発明の第８の態様の動物用の食品は、前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化されていてもよい。生理機能の向上は、当該動物が前記分類に典型的なストレスに対処することを可能にする。
【００３９】
動物の生理機能を向上させることは、前記動物の代表的な生理学的マーカーを向上させることを含むであろう。
【００４０】
本発明の第８の態様は、前記分類に典型的な疾患に対処するために前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化された動物用の食品を構成し得る。
【００４１】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、イヌ用の食品またはネコ用の食品を構成し得る。
【００４２】
本発明の第８の態様に基づく動物用の食品は、特定のサイズ範囲、特定の体重または特定の系統の動物用に、最適化されるか、またはさらに最適化され得る。
【００４３】
本発明の第８の態様の動物用の食品は、その食品が最適化されている前記分類の目に見える指標を有する容器内に包装された食品を構成し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明によると、非ヒト動物用の食品は、非ヒト動物が食餌で消費する任意の工夫を包含する。具体的には、コンパニオン動物または動物用の食品が含まれる。このように、本発明は、標準的な食品ならびにスナック食品（たとえば、スナックバー、シリアルバー、スナック、ビスケット、甘味類）を対象とする。そのようなスナック食品はペット用スナック食品であってよい。当該食品は、調理済み製品であってもよい。その食品は、肉または動物由来材料（たとえば牛肉、鶏、七面鳥、子羊、魚、血漿、骨髄などまたはその１つ以上）を加えることができる。あるいは、当該食品は、タンパク源を供給するのに肉を含まないものであってもよい（好ましくは大豆、トウモロコシグルテンまたは大豆製品といった肉の代用物を含む）。当該食品は、たとえば大豆タンパク濃縮物、牛乳、タンパク質、グルテンなどのような、追加のタンパク源を含んでいてよい。当該食品はまた、１または複数の穀類（たとえば小麦、トウモロコシ、米、カラス麦、大麦など）のような、デンプン源を含んでいてよく、あるいはデンプンを含まなくてもよい。当該食品は、ゼラチン化デンプン質を含むか、またはゼラチン化デンプン質であってよい。当該食品は、たとえばビートパルプ、チコリ、ココナツ内胚乳繊維、小麦繊維などといった、１または複数の種類の繊維を含んでいてよい。
【００４５】
当該食品は、乾性、半湿性、湿性（モイスト）製品であってよい。湿性食品は、通常は缶詰で販売され、含水量が７０％から９０％であるものを含む。乾性食品は、同様の成分を有するが、水分が５％から１５％であり、しばしば小さなビスケット様の粗粒として提示される食品を含む。半湿性食品は、１５％を超えて最大７０％までの含水量を有する食品を含む。どのような製品でも、水分の量は、使用できるまたは必要な包装の種類に影響を与えるであろう。
【００４６】
当該食品は、好ましくは包装されている。この態様で、消費者は、包装から食品の成分を識別することができ、その食品が問題の特定の非ヒト動物に適していることを確認することができる。包装は、金属（通常は缶詰または可塑箔包装の形で）、プラスチック（通常はパウチまたは瓶の形で）、紙またはボール紙であってよい。任意の製品中の水分の量は、使用することができるまたは必要な包装の種類に影響を与えるであろう。
【００４７】
本発明を下記の図面を参照して記載する。
【実施例】
【００４８】
本発明を下記の実施例を参照して記載する。
【００４９】
実施例１
材料および方法
動物
末梢血白血球部分集合における年齢に関連する変化についての免疫学的ベースラインを設定するために、０．６歳から１４．２歳の範囲の１２２頭のラブラドル犬（雌７１頭および雄５１頭）から全血標本を採取した。
【００５０】
試料採取
すべての血液試料は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析用に、１ｍＬのＥＤＴＡカリウム試験管に採取した。
【００５１】
白血球プロファイル測定
免疫反応は、異なる機能を有するさまざまな細胞型（白血球）から構成される。これらの異なる白血球集団の同定は、免疫反応の基礎を理解する基盤を提供する。白血球集団に対する反応性を有するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の開発に伴い、すべてのＴ細胞（ＣＤ３）、Ｔ細胞部分集合（ＣＤ４およびＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ２１）および単球（ＣＤ１４）に対するマーカーが、測定可能な集団の一部を担う。
【００５２】
ＦＡＣＳ分析は、白血球の生きている部分集合を特徴づけおよび定量するのに広く用いられている。ＦＡＣＳ分析は、３つの段階を含む；最初に、細胞を調製し、特定の表面マーカーに対する該当Ｍａｂとインキュベートし、さらに蛍光試薬（たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））で標識する；次に、染色した細胞をＦＡＣＳによって同定および分離し、データを集める；３番目に、集めたデータを分析して、該当する細胞集団に関する定量的情報を得る。
【００５３】
イヌの白血球集団
細胞溶解した全血の染色と三重染色ＦＡＣＳ分析を用いることによって、下記の免疫学的細胞表面マーカーの相対的発現レベルおよび白血球集団を測定した：
ＣＤ３−全Ｔ細胞マーカー
ＣＤ４−ヘルパーＴ細胞マーカー
ＣＤ８−細胞毒性Ｔ細胞マーカー
ＣＤ４：ＣＤ８比−細胞毒性Ｔ細胞に対するヘルパーＴ細胞の相対レベル
ＣＤ２１−Ｂ細胞マーカー
ＣＤ１４−単球マーカー
リンパ球−白血球の部分集合
顆粒球−白血球の部分集合
単球−白血球の部分集合
リンパ球生存可能性−死細胞に対する生細胞の割合
Ｃ１１ｂ−細胞表面マーカー
統計分析
数値は、動物個体それぞれについて、細胞集団のパーセンテージとして表した。結果は年齢範囲全体にわたる傾向を特定するために直線回帰によって統計的に評価した。判別分析を用いて、導き出されたライフステージの群分け間を最もうまく区別する細胞表面マーカーの部分集合を特定した。ライフステージ間の差については、個々の細胞集団それぞれについて独立標本のｔ検定を実施し、ライフステージ間の有意差を確認した。
【００５４】
結果
イヌの白血球集団
下記の散布図は、さまざまな白血球集団の相対的割合を年齢（年単位）に対して示す。得られたデータにおいて有意な傾向を特定するために、直線回帰分析を用いた。分析によって、加齢に伴いＣＤ３の有意な増加（Ｒ２＝０．０６、ｐ＜０．００８；図１ａ）,ＣＤ４の有意な減少（Ｒ２＝０．０３、ｐ＜０．０５；図１ｂ）、ＣＤ８の有意な増加（Ｒ２＝０．２４、ｐ＜０．００１；図１ｃ）とともに、ＣＤ４：ＣＤ８比の対応する減少（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図１ｄ）が検出された。
【００５５】
判別分析のための年齢群は８歳である。
【００５６】
イヌのライフステージ群
これらの結果は、ラブラドル犬集団において、加齢といくつかの白血球集団の相対的割合の変化との間に有意な相関が明らかにされた。判別分析を用いて、導き出されたライフステージの群分け間を最もうまく区別する白血球集団を特定し、ＣＤ３（図２ａ）およびＣＤ８（図２ｃ）は、両方のマーカーに関して全体の正確な分類が８３％（交差確認）で、２つの統計的に区別可能な群、すなわち成犬（０．６から８歳）および老犬（８歳を超える）を定義した。
【００５７】
考察
イヌの白血球集団
我々の検討は、イヌ集団由来の末梢血において、ＣＤ３およびＣＤ８Ｔ細胞の相対的割合における年齢に関連する有意な増加、ならびに、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ４：ＣＤ８比における年齢に関連する有意な減少を示した。
【００５８】
本研究において観察された有意な変化は、Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４：ＣＤ８比）に関するものであり、そのすべてが後天性免疫系（免疫記憶の発生を含む、抗体特異的Ｔ細胞の抗体に対する反応）の細胞成分に関連する。ある場合に、いくつかのＲ２値が特に低いが（図１ａ、１ｂ）、これらのデータは、０．６歳から１４．２歳の年齢範囲にわたる健康なイヌの独立検体を採取する場合に集団に見られる自然の変動を表すため、これは予想外のことではない。
【００５９】
ＣＤ３Ｔ細胞マーカーは、すべてのＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞部分集合の両方を包含する）を特徴づけるが、年齢に伴って相対的割合に有意な増加を示した（図１ａ）。このことは、ＣＤ３マーカーを同時発現するＣＤ８Ｔ細胞の相対的増加が、同じマーカーを発現するＣＤ４Ｔ細胞の相対的減少より大きいことが原因の一部であろう。ヒトにおける研究はまた、ＣＤ８Ｔ細胞のレベルの年齢に伴う増加を示しており、これらの細胞型が、上記に強調する加齢に伴う過程が原因で、完全な成熟機能状態に到達できない未熟Ｔ細胞に相当することを示唆する。また、総Ｔ細胞部分集合の絶対値および相対値を検討した他のイヌおよびヒトの研究からのデータの解釈と組み合わせた場合、そのＴ細胞部分集合の絶対数がより遅い速度で減少しているため、総Ｔ細胞の割合における増加が明らかであることが示された。
【００６０】
ＣＤ３マーカーが、一般にＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に共有されているが、それらの機能は互いに非常に異なる。ＣＤ８Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞）の機能は、細胞内病原体（たとえばウイルス）を含む宿主細胞を識別し、破壊することである。ＣＤ４Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）は、細胞外病原体（たとえば細菌および寄生虫）を破壊するために、他の細胞を活性化することに特化しており、２つの機能的分類に分けられる：取り込んだ細菌を殺す単球／マクロファージを活性化するＴへルパー１（ＴＨ１）細胞、および抗体を産生するＢ細胞を活性化するＴＨ２細胞である。
【００６１】
イヌのＣＤ８Ｔ細胞の相対的割合において観察された有意な増加（図１ｃ）は、「記憶」Ｔ細胞集団と呼ばれるものに含まれる。上述の通り、記憶Ｔ細胞の産生は、体が個々の抗原刺激に反応し、その特定の感染を抑制するかまたは排除するための反応を起こしていることを示す。やがて、これらの同じ生理学的反応は、その特定の抗原に再度遭遇した場合に、個体がより速やかに感染に反応することを可能にする記憶Ｔ細胞の（拡大した）クローンの発展的な蓄積に繋がる。このことは、ＣＤ８Ｔ細胞のレベルが年齢に伴って上昇するという知見を支持する。
【００６２】
結論として、加齢する個体内での細胞の分析と組み合わせた機能的細胞老化の測定に関する研究は、免疫系の調節が年齢に伴ってどのように発達するかについての新たな見識を提供する。イヌ集団からの証拠は、末梢血中の白血球集団の相対的割合における年齢に関連する変化を実証している。これらの研究は、区別可能な白血球集団で連続的な再構成が起こっていて、加齢するイヌの免疫系の機能状態を潜在的に変化させていることを示唆する。そのような研究からの情報は、免疫系の可塑性、長期にわたる基礎免疫の全体的な維持、代償機能の調節および長期記憶の調節を監視するための基盤を提供する。この情報は疑いなく、動物の一生の間、特に動物の一生の後期段階の間に、（ここで前述したような）そのようなストレッサーに対処するための免疫系の能力を向上させる新規の戦略（特に栄養的介入を利用する）を開発する助けとなる。
【００６３】
示された情報から、イヌの免疫状態に有意な変化が実際起こっていることは明らかであり、年齢に伴う免疫状態の調節が存在することを示唆する。白血球の各群についての散布図情報に関する判別分析を用いて、ＣＤ３およびＣＤ８Ｔ細胞マーカーの両方が、２つの統計的に区別可能なライフステージ群、すなわち８歳未満の成犬および８歳を超える老犬を定義した（図２ａ、ｃ）。ＣＤ４：ＣＤ８比（図２ｄ）およびＣＤ２１（図２ｅ）は有意差を示したが、その分類はＣＤ３およびＣＤ８ほど高くなかった。
【００６４】
ＣＤ４：ＣＤ８比の分類レベルがより低いことの理由として、２つのライフステージ群間で、ＣＤ４細胞の割合の差が無視しうるものであることが考えられる（図２ｂ）。このことは、年齢尺度の高い側の限界（＞８歳）でイヌの数が少ないことに起因する可能性もあるが、また、老年群でのＣＤ４細胞の割合が、成年群のレベルのすぐ下の基底レベルに達していて、そのため８歳を超える年齢での有意な減少を見えなくしている可能性もある。
【００６５】
ＣＤ２１細胞の割合の低下は有意でなかったが（図１ｅ）、成年および老年ライフステージ群間の有意差（図２ｅ）は、より低い分類レベルではあるが、ＣＤ２１細胞の割合のより大きな低下が８歳レベル付近で起こり、それが今度は年齢散布図プロファイルの全体の状況に置かれると覆い隠されることを示唆するであろう。
【００６６】
異なるライフステージ間で変化する免疫状態のそのような指標は、感染および年齢の上昇に伴う潜在的な発癌因子についての免疫監視の低下を伴って、動物が免疫機能障害を被っているかどうかを特定するのに用いることができる。この種の情報は、最適な免疫機能を維持するかまたは、最適に満たない免疫系を向上させ変性疾患の発生を潜在的に低減させるのを助ける、特定のライフステージのための栄養所要量を定義するのに有用である。
【００６７】
実施例２
材料および方法
雄１２１匹および雌１６７匹の０．２から１５．９歳の範囲の２８８頭の短毛家ネコから全血標本を採取した。すべてのネコを、ペットネコ用と類似の条件下で飼育し、市販の完全食品を与えた。
【００６８】
細胞溶解した全血の染色と二重染色フローサイトメトリー分析を用いて試料を分析した。市販のモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞（ＣＤ２１様）、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂについて細胞表面マーカーを同定した。リンパ球、単球および顆粒球の相対レベルも計算した。
【００６９】
数値は、動物個体それぞれについて細胞集団のパーセンテージとして表した。年齢に関連する傾向は、直線回帰分析を用いて評価した。判別分析および独立標本のｔ検定を用いて、ライフステージ群分けを定義するための細胞集団を特定した。
【００７０】
結果
直線回帰分析は以下のように同定した：
・ＣＤ４の有意な減少（Ｒ２＝０．１２、ｐ＜０．００１；図３）
・ＣＤ８の有意な増加（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図４）
・ＣＤ４：ＣＤ８比の有意な減少（Ｒ２＝０．２３、ｐ＜０．００１；図５）
・顆粒球の相対レベルの有意な減少（Ｒ２＝０．１６、ｐ＜０．００１；図６）
・リンパ球の相対レベルの有意な減少（Ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１；図７）
・ＣＤ１１ｂの有意な増加（Ｒ２＝０．２１、ｐ＜０．００１；図８）
【００７１】
ＣＤ４：ＣＤ８比データの判別分析（図８）は、全体の正確な分類が７１％（交差確認）で、ネコの２つの統計的に区別可能な群、すなわち幼猫（０．２から０．８歳）および成猫（０．８歳を超える）の識別を可能にした。
【００７２】
考察
この試験からの結果を下記に示す：
・ＣＤ４の相対的割合における年齢に関連する有意な減少
・ＣＤ８の相対的割合における年齢に関連する有意な増加
・ＣＤ４：ＣＤ８比における年齢に関連する有意な減少
・ＣＤ１１ｂの相対的割合における年齢に関連する有意な増加
結論
これらの試験は、健常なネコにおいて、白血球部分集合に及ぼす加齢の影響を総合的に調査し、さらに免疫学的状態に基づいてライフステージを定義した最初のものである。本試験で特定されたライフステージは、短毛家ネコにおいて、年齢によって免疫学的状態が実際変化するという事実を強調する。したがって、白血球部分集合データの解釈が利用されているどの試験でも年齢を考慮することが必須である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】図１ａは、ＣＤ３細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｂ】図１ｂは、ＣＤ４細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｃ】図１ｃは、ＣＤ８細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｄ】図１ｄは、ＣＤ４：ＣＤ８比の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図１ｅ】図１ｅは、ＣＤ２１細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図２ａ】図２ａは、イヌ由来ＣＤ３細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｂ】図２ｂは、イヌ由来ＣＤ４細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｃ】図２ｃは、イヌ由来ＣＤ８細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｄ】図２ｄは、イヌ由来ＣＤ４：ＣＤ８比の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図２ｅ】図２ｅは、イヌ由来ＣＤ２１細胞集団の判別分析プロットを示す図であり、８歳までと８歳超に分けられている。
【図３】図３は、ＣＤ４細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図４】図４は、ＣＤ８細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図５】図５は、ＣＤ４：ＣＤ８比の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図６】図６は、顆粒球の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図７】図７は、リンパ球の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図８】図８は、ＣＤ１１ｂ細胞の相対的割合の年齢（年単位）に対する散布プロットを示す図である。直線回帰分析が与えられている。
【図９】図９は、最大８ヶ月齢までのデータと８ヶ月齢を超えるもののデータに分割された、ＣＤ４：ＣＤ８比データの判別分析を示す図である。
Claims (36)
- 非ヒト動物のライフステージを特定するための生理学的マーカーの使用法。
- 前記生理学的マーカーが、免疫状態の１または複数の指標であることを特徴とする請求項１記載の使用法。
- 前記免疫状態の指標が、細胞媒介性免疫マーカー、抗体媒介性免疫マーカーまたは先天性免疫マーカーの１または複数であることを特徴とする請求項２記載の使用法。
- 前記生理学的マーカーが、動物個体の下記のＴ細胞集団の１または複数であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の使用法：
ＣＤ３
ＣＤ８
ＣＤ４
ＣＤ４：ＣＤ８比
ＣＤ２１
顆粒球
リンパ球
ＣＤ１１ｂ。 - ライフステージが年齢として表されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１記載の使用法。
- 前記動物が、コンパニオン動物であることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の使用法。
- 前記コンパニオン動物が、ネコまたはイヌであることを特徴とする請求項６記載の使用法。
- 非ヒト動物のライフステージを特定する方法であって、動物個体における下記の細胞集団のうち１または複数の集団を測定し、指定の図を参照してライフステージを特定する、各工程を含む方法：
イヌ科動物については；
ＣＤ３：図１ａまたは２ａ
ＣＤ４：図１ｂまたは２ｂ
ＣＤ８：図１ｃまたは２ｃ
ＣＤ４：ＣＤ８比：図１ｄまたは２ｄ
ＣＤ２１：図１ｅまたは２ｅ
ネコ科動物については；
ＣＤ４：図３
ＣＤ８：図４または９
ＣＤ４：ＣＤ８比：図５
顆粒球：図６
リンパ球：図７
ＣＤ１１ｂ細胞：図８。 - ライフステージが、年齢として表されることを特徴とする請求項８記載の方法。
- 動物個体の生理学的マーカーのレベルを、該動物についての特定のライフステージに関連づけるグラフまたは表を含む、非ヒト動物ライフステージ分類システム。
- 前記非ヒト動物がコンパニオン動物であることを特徴とする請求項１０記載のライフステージ分類システム。
- 前記コンパニオン動物が、ネコまたはイヌであることを特徴とする請求項１１記載のライフステージ分類システム。
- 前記生理学的マーカーが、免疫状態の指標であることを特徴とする請求項１０から１２いずれか１項記載のライフステージ分類システム。
- 前記免疫状態の指標が、細胞媒介性免疫マーカー、抗体媒介性免疫マーカーまたは先天性免疫マーカーの１または複数であることを特徴とする請求項１３記載のライフステージ分類システム。
- 前記免疫状態の指標が、下記の細胞集団の１または複数であることを特徴とする請求項１０から１４いずれか１項記載のライフステージ分類システム：
ＣＤ３
ＣＤ４
ＣＤ８
ＣＤ４：ＣＤ８比
ＣＤ２１
顆粒球
リンパ球
ＣＤ１１ｂ。 - １または複数の因子が生理学的マーカーに及ぼす影響を特定するための、請求項１０から１５記載のライフステージ分類システムの使用法。
- 前記因子が食品であることを特徴とする請求項１６記載の使用法。
- 図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の１または複数を参照することを特徴とする、請求項１０から１７いずれか１項記載のコンパニオン動物のライフステージ分類システム。
- 非ヒト動物に給餌する方法であって：
（ａ）前記動物の生理学的マーカーを測定し；
（ｂ）前記測定に基づいて該動物についてライフステージ分類を特定し；さらに
（ｃ）ライフステージ分類によって変化する食餌を前記動物に与える；各工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記生理学的マーカーが、免疫状態の１または複数の指標であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
- 前記免疫状態の指標が、細胞媒介性免疫マーカー、抗体媒介性免疫マーカーまたは先天性免疫マーカーの１または複数であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
- 前記生理学的マーカーが、動物個体の下記の細胞集団の１または複数であることを特徴とする、請求項１９から２１いずれか１項記載の方法：
ＣＤ３
ＣＤ８
ＣＤ４
ＣＤ４：ＣＤ８比
ＣＤ２１
顆粒球
リンパ球
ＣＤ１１ｂ。 - 前記動物がコンパニオン動物であることを特徴とする請求項１９から２２いずれか１項記載の方法。
- 前記コンパニオン動物が、ネコまたはイヌであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
- 図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、３、４、５、６、７、８および９の１または複数を参照することを特徴とする、請求項１９から２４いずれか１項記載の非ヒト動物に給餌する方法。
- 非ヒト動物の特定のライフステージ分類に最適化された動物用の食品であって、前記分類が、該食品を消費する種または系統の動物の集団について測定された生理学的マーカーの平均測定値に基づいて決定されたものであることを特徴とする動物用の食品。
- 前記分類の動物の栄養に関して最適化されていることを特徴とする、請求項２６記載の動物用の食品。
- 前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化されていることを特徴とする、請求項２６記載の動物用の食品。
- 前記分類に典型的な疾患に対処するために前記分類の動物の生理機能を向上させるように最適化されていることを特徴とする、請求項２６記載の動物用の食品。
- イヌ用の食品を構成することを特徴とする、請求項２６から２９いずれか１項記載の動物用の食品。
- ネコ用の食品を構成することを特徴とする、請求項２６から２９いずれか１記載の動物用の食品。
- 乾性、湿性または半湿性食品を構成することを特徴とする、請求項２６から２９いずれか１項記載の動物用の食品。
- 特定のサイズ範囲の動物用にさらに最適化されていることを特徴とする、請求項２６から３２いずれか１項記載の動物用の食品。
- 特定の体重の動物用にさらに最適化されていることを特徴とする、請求項２６から３２いずれか１項記載の動物用の食品。
- 特定の系統の動物用にさらに最適化されていることを特徴とする、請求項２６から３２いずれか１項記載の動物用の食品。
- 該食品が最適化されている前記分類の目に見える指標を有する容器内に包装されていることを特徴とする、請求項２６から３５いずれか１項記載の動物用の食品。
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