JP2004536062A - 反応性酸素種およびフリーラジカルの効力を中和するためのペプチド化合物 - Google Patents
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Abstract
スーパーオキシドジスムターゼやカタラーゼのような抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートして、反応性酸素種やその他のフリーラジカルの有害な酸化作用を中和するための単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。該組成物を用いて、反応性酸素種や他のフリーラジカルのレベルの望ましくない上昇を特徴とする疾患および状態を治療または予防することができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、抗酸化化合物の分野に関し、特に、反応性酸素種およびフリーラジカルの望ましくないレベルを特徴とする、疾病および状態の治療および予防処置に用いられる医薬品および機能性食品の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生物は、正常な代謝活動の過程で、それらの細胞および組織中に有害な反応性酸素種（ROS）や様々なフリーラジカルを発生している（Halliwell, B.およびGutteridge, J.M.C.編、Free Radicals in Biology and Medicine, (Oxford: Clarendon Press, 1989)）。最も反応性が高い、従って、有毒のROSおよびフリーラジカルとして、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、一重項酸素、過酸化水素（H2O2）、過酸化脂質、ペルオキシニトライト、およびヒドロキシルラジカルが挙げられる。細胞中のROSまたはフリーラジカルレベルがわずかに上がるだけでも損傷を与える恐れがある。同様に、細胞外の体液中へのROSまたはフリーラジカルの放出もしくは増加は、周囲の組織を危険にさらし、組織破壊や壊死を引き起こす恐れがある。実際に、スーパーオキシドアニオンよりいくらか反応性が低い過酸化水素は、よく知られた広範なスペクトルの防腐剤化合物である。真核生物において、スーパーオキシドアニオンの主な供給源は、ミトコンドリアに存在する呼吸中の電子伝達系である。スーパーオキシドアニオンの大部分は、還元当量の２つの主な蓄積部位、すなわち、電子伝達機構におけるユビキノンが媒介する段階とNADH脱水素酵素が媒介する段階で発生する。過酸化水素は、小胞体では代謝により、ペルオキシソームでは金属触媒による酸化で、ミトコンドリアでは酸化的リン酸化で、また、キサンチンの細胞質ゾル酸化で、発生する（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答 (Response of Antioxidant System to Physical and Chemical Stress)」, Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章、pp. 125-141, Baskin, S.I.およびH. Salem編（TaylorおよびFrancis、ワシントンD.C.、1997）を参照）。
【０００３】
正常かつ健康な個体では、複数の天然の抗酸化防御系が、様々なROSまたはフリーラジカルを解毒し、これによって、正常な細胞および組織の統合性および機能を保存する。これらの解毒系は、特定の抗酸化酵素の協奏的活性により、ROSまたはフリーラジカルを、毒性が低い化学種へと段階的に変換する。これらの抗酸化酵素は、ROSまたはフリーラジカルを除去および解毒する能力を有する「酸素ラジカルスカベンジャー」もしくは「ラザロイド」として知られる大きいクラスの分子のメンバーである。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、ならびに、βカロチンやレチノイドのような関連する抗酸化化合物もこの大きいクラスのメンバーである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素およびその他のラザロイドが、細胞内および細胞外の両方に存在し、これによって、細胞および組織に対する酸化による深刻な損傷を防ぐのに十分な量のROSおよびフリーラジカルが効率的に除去される。
【０００４】
抗酸化酵素の中でも、最も重要で、研究されているものとして、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）が挙げられる。これらの酵素は、協奏的にROSおよびフリーラジカルを解毒する機能を有する。SODは、実質的にあらゆる酸素呼吸生物に存在し、そこでのその主な機能は、スーパーオキシドアニオンを過酸化水素へと不均化（分解）することである。過酸化水素それ自体も、高度に反応性かつ酸化性の分子であり、これをさらに還元することにより、細胞および組織に対する損傷を防がなければならない。好適な電子受容体（水素供与体）の存在下で、CATは、過酸化水素の水へのさらなる還元を触媒する。還元型グルタチオン（GSH）の存在下で、GSH-Pxも、別の経路により、過酸化水素の水への還元を媒介する。
【０００５】
上記抗酸化酵素の各々は、各種クラスへとさらに細分することができる。金属イオン含有量に基づき、SODの３つの異なるクラス：銅−亜鉛（Cu-Zn）、マンガン（Mn）および鉄（Fe）が存在する。哺乳動物では、Cu-ZnおよびMn SODクラスだけが存在する。哺乳動物の組織は、細胞質ゾルのCu-Zn SOD、ミトコンドリアのMn SOD、およびES-SODと呼ばれるCu-Zn SODを含み、これは、細胞外体液に分泌される。SODは、自然の速度より1000万倍速い速度で、毒性が極めて高いスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒することができる（Somaniら、p.126を参照）。ほぼすべての哺乳動物細胞に存在するが、最高レベルのSOD活性は、高代謝活性を有する数種の主要臓器、すなわち、肝臓、腎臓、心臓および肺に存在する。SODをコードする遺伝子の発現は組織の酸素化と相関し、酸素テンションが高いと、ラットにおけるSOD生合成が高まる（Toyokuni, S., Pathol. Int., 49:91-102（1999））。
【０００６】
CATは、ほぼすべての哺乳動物細胞に存在する可溶性酵素であるが、CATレベルは、組織および細胞内位置に応じて広範に変動し得る。CATは、主として、肝臓および腎臓細胞中のペルオキシソーム（ミクロボディー）、また、その他の組織のミクロペルオキシソームにも存在する。
【０００７】
GSH-Pxには２つの異なるクラス、すなわち、セレン依存性クラスおよびセレン非依存性クラスがある。さらに、GSH-Px種は、膜結合タンパク質および循環血漿タンパク質として、細胞質ゾルに見出すことができる。
【０００８】
様々な重要な疾病および薬物副作用におけるROSおよびフリーラジカルの役割の認識は、近年になってかなり高まっている。多くの研究から、多数の疾状態態や、治療薬の有害な副作用は、個体の抗酸化防御系が、ROSおよび各種フリーラジカルの発生速度に追いつけないことに関連することが明らかにされている（例えば、Chanら、Adv. Neurol., 71:271-279（1996）；DiGuiseppi, J.およびFridovich, I. Crit, Rev, Toxicol., 12:315-342（1984）を参照）。例えば、発作中に虚血により誘発される無酸素状態、または心筋梗塞中に心筋に発生した無酸素状態においては、異常に高いROSレベルが認められている（例えば、Walton, M.ら、Brain Res. Rev., 29:137-168（1999）；Pulsinelli, W.A.ら、Ann. Neurol., 11:499-502（1982）；Lucchesi, B.R., Am. J. Cardiol., 65:141-231（1990）を参照）。加うるに、ROSおよびフリーラジカルの上昇も、腎移植後の再灌流損傷と関連していた。さらに、酸化組織破壊と加齢に関連する脳機能不全との間の相関を示す研究が増加していて、様々な認知および運動機能、および／もしくは加齢とともに酸化により改変されたDNAおよびタンパク質の漸進的増加の加齢関係喪失によって立証されている（例えば、Coyleら, Science, 262:689-695 (1993)；Halliwell, J. Neurochem., 59:1609-1623 (1992)；Sohalら, Free Radical Biol. Med., 10:495-500 (1990)；Sohalら, Mech.Ageing Dev., 76:215-224 (1994)；Ames, Free Radical Res. Commun., 7:121-128 (1989)；およびStadtman, Science, 257 : 1220-1224 (1992)を参照）。従って、ROSおよびフリーラジカルの上昇は、下記を含む様々な疾病、薬物療法、外傷、および変性状態の進行およびその際に現れる合併症と関連している：加齢に伴なう酸化ストレス誘発性損傷、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、変性眼疾患、敗血症性ショック、頭部および脊髄損傷、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ならびに、糖尿病（例えば、Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp. 74-80（1991、４月）を参照）。
【０００９】
加齢過程における酸化損傷の影響を含む、ROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルの有害な影響を下げる一手法は、ラザロイドの摂取を増やしてROSおよびフリーラジカルをスカベンジするかまたは低下させることである。その結果、抗酸化酵素およびその他のラザロイドの市場は、世界規模で10億ドルを超えると見積もられる。当然、治療薬としての各種ラザロイドの研究および開発は極めて競争の激しい分野となった（Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp.74-80(1991年4月)を参照）。また、治療薬としてSODを開発することへの関心も非常に高まってきた。これは、部分的には、承認された抗炎症薬としてのSODのステータスと、SODが非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）市場に浸透する手段を提供し得るという考えによるものである（Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp.74-80(1991年4月)を参照）。
【００１０】
多年にわたる集中的な研究努力にもかかわらず、SODおよびその他のラザロイドの使用は、ROSおよびフリーラジカルの発生により起こる、もしくはこれを特徴とする疾病、障害およびその他の状態に対処する有効な予防または治療手段を提供していない。明らかに、上昇したレベルのROSおよびフリーラジカルの破壊作用を特徴とする疾病および状態を治療する新たな治療薬および方法が依然として求められている。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
ここに記載の本発明は、ROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルの破壊的酸化作用を如何にして中和するかという問題を、例えばスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)などの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）ペプチド化合物を含んでなる組成物を提供して、細胞および組織中のROSとフリーラジカルのレベルの望ましくない上昇を抑制、排除または防止し、かつ構成的な抗酸化酵素の加齢に伴う減少を回復させることにより解決するものである。さらに、本発明のペプチド化合物は、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激するそれらの能力とは無関係に、抗酸化活性を有するものである。本明細書に記載するペプチド化合物の式および配列においては、当技術分野で公知の標準的な三文字または一文字表記を採用する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、次式：
R1 Asp Gly Xaa3 Xaa4 Xaa5 R2（配列番号１）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa3はGluもしくはLeuであり；Xaa4はAlaもしくはGluであり；Xaa5は存在しないか、Leu、もしくはAlaであり；そしてR2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、次のいずれかの式：
R1 Asp Gly Glu Ala R2（配列番号２）、
R1 Asp Gly Glu Ala Leu R2（配列番号３）、
R1 Asp Gly Leu Glu Ala R2（配列番号４）
［式中、R1は存在しないか、該ペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基であり；R2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］の；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明の組成物は、次のいずれかのアミノ酸配列：
Asp Gly Glu Ala（配列番号２）、
Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、
Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
を有し、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００１５】
本発明のペプチド化合物は、配列番号２、３、および４のアミノ酸配列などのペプチド化合物のアミノ酸の「コア配列」のアミノ末端および／またはカルボキシ末端アミノ酸に結合した１以上のさらなるアミノ酸を含有してもよいが、その際、該ペプチド化合物が細胞もしくは組織中の抗酸化酵素活性を増加する抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をさらにアップレギュレートすることを条件とする。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は式：
R1 Xaa1 Xaa2 Asp Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 R2（配列番号５）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa1は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa2は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa5はGluもしくはLeuであり；Xaa6はAlaもしくはGluであり；Xaa7は存在しないか、LeuもしくはAlaであり；Xaa8は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa9は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa10は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa11は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；そしてR2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００１６】
好ましくは、本発明の組成物はアミノ末端キャッピング基（上記の式でR1と記した）を有する単離されたペプチド化合物を含んでなる。さらに好ましくは、アミノ末端キャッピング基は、リポ酸部分（Lip、還元または酸化された形態）；グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）；1〜6個の天然L-アミノ酸（配列番号６）；式R3-CO-のアシル基（式中、COはカルボニル基であり、R3は炭素数1〜25、好ましくは炭素数1〜22の炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖は飽和または不飽和であってもかつ分枝または非分枝であってもよい）；およびそれらの組合わせからなる群より選択される。アミノ末端キャッピング基がアシル基であるときは、それはアセチルまたは脂肪族アシル基が好ましい。さらにより好ましくは、アミノ末端キャッピング基は、アセチル（酢酸のアシル部分）、パルミトイル（パルミチン酸のアシル部分、Palm）、およびドコサヘキサエノイル（ドコサヘキサエン酸のアシル部分、DHA）からなる群より選択されるアシル基である。さらに別の好ましい実施形態においては、アミノ末端キャッピング基が1〜6個のアミノ酸（配列番号７）であるときは、該アミノ酸はリシン、アルギニン、およびリシンとアルギニンとの組合わせからなる群より選択される。
【００１７】
別の好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、第一級アミンまたは第二級アミンからなる群より選択されるカルボキシ末端キャッピング基（上記の式でR2と記した）を含んでなる単離されたペプチド化合物からなる。
【００１８】
本発明の組成物および方法に有用であるペプチド化合物は、ペプチド化合物の特定の意図する用途に適した、アルカリ金属の塩、アルカリ類金属の塩、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩を含む１以上の様々な塩の形態で調製し使用することができる。
【００１９】
本発明のペプチド化合物を、検出可能な標識として役立つ１以上の他の分子と結合することもできる。かかる標識した化合物は、特に分析または調製方法において方法またはプロトコル中にペプチド化合物を追跡または検出するために有用である。
【００２０】
さらに、特定の用途にとって適当とみなされるその他の化合物が本発明の組成物中に存在してもよい。本発明の組成物中に存在してもよいかかる他の成分としては、限定されることなく、塩、バッファー、還元剤、食品補充物、その他の製薬上の活性化合物、様々な製剤のための１以上の他の製薬上許容される賦形剤もしくは担体、ならびにそれらの組合わせが挙げられる。
【００２１】
さらに本発明は細胞および組織中のROSとフリーラジカルの効力を中和する方法であって、細胞または組織に本発明のペプチド化合物を接触させることを含んでなる上記方法を提供する。本発明の組成物は、ヒトや他の哺乳動物を含めた動物の細胞および組織においてROSとフリーラジカルを解毒する役割を果たす酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）、単離されたペプチド化合物を含んでなる。好ましくは、細胞または組織に本発明のペプチド化合物を接触させることによって、SODとCATの両タンパク質の遺伝子発現がアップレギュレートされる。
【００２２】
細胞および組織のROSおよびフリーラジカルの影響を中和する好ましい方法は、細胞または組織を単離された本発明のペプチド化合物を含んでなる組成物と接触させて、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現を、未処理の細胞または組織と比較して、ROSとフリーラジカルを顕著に解毒するのに十分な高レベルにまで上昇させることを含んでなる。
【００２３】
いろいろな疾病や状態をかかえた患者は、望ましくないROSおよび／またはフリーラジカルレベルを呈することが分かっている。本発明の好ましい実施形態では、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を治療的に用いて体内に含まれるROSとフリーラジカルの効力を無効にしたり、また、かかる組成物を予防的に用いて特定の疾病、状態、薬物療法または障害と関連したROSとフリーラジカルの望ましくないレベル上昇を抑制または防止したりすることができる。詳しくは、本発明は、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSまたはフリーラジカルの毒性レベルを特徴とする疾患または状態を治療または予防する方法を提供し、かかる疾患または状態には、限定するものではないが、加齢による組織変性および／または認知退行（老化）、老衰、遅発性ジスキネジー、大脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、頭部外傷、脳および／または脊髄外傷、再灌流損傷、未熟児の酸素中毒、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、糖尿病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびROSまたはフリーラジカルの上昇を特徴とする他の癌、加齢に関係したROSまたはフリーラジカル上昇、ダウン症、黄斑変性、白内障、精神分裂病、てんかん、敗血症性ショック、多外傷性ショック、熱傷、放射線により誘発されるROSおよびフリーラジカル上昇（UVにより誘発される皮膚損傷を含む）が含まれる。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、本発明は、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSとフリーラジカルを発生する薬物療法により引き起こされる副作用を軽減または排除する方法を提供する。多数の薬物が有害な副作用として望ましくないROSやフリーラジカルを上昇させることは知られている。そのような薬物として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、BCNU（カルムスチン）および関連化合物（メチル-BCNUおよびCCNUなど）、神経弛緩薬（クロザピンなど）が挙げられる。そのような治療の補助剤として本発明のペプチド化合物を用いて、こうした有害な副作用を排除したり、その程度を軽減させたりすることができる。したがって、本発明のペプチドは、例えば遅発性ジスキネジーにおけるような神経弛緩薬による治療中に起こる、薬物により誘発されるROSまたはフリーラジカルの上昇を治療または予防するために投与しうる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、ここに記載のペプチド化合物を非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)の代替品または補助剤として使用し、損傷からの痛み、関節炎、およびROSとフリーラジカルがある役割を担っている他の炎症状態を治療することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、単離された本発明のペプチド化合物を製薬上許容されるバッファー中に含んでなる組成物であって、細胞または組織中の有害なレベルのROSまたはフリーラジカルの発生を排除、抑制、または防止するために、特定の疾患がまだ診断されてないかまたは傷害の全内容がまだ完全に理解されていないときであっても、個人に投与することができる上記組成物を提供する。
【００２７】
本発明の組成物中に存在するある特定の単離されたペプチド化合物はまた、細胞内カルシウムイオンを正常レベルに回復する能力も有しうる。かかるペプチド化合物は発作を治療するのに特に有用である。
【００２８】
図面の説明
図１は、14日間の様々な投与計画でPEP-1（0.25mg/kg体重のPEP-1、経口胃管強制栄養（oral gavage））を受けた18月齢C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。マウス脳からの抽出物をウエスタンイムノブロットにより分析し、SOD発現のレベルをイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。グループ１動物は無処理（対照）であり；グループ２はPEP-1を毎週１回投与され；グループ３はPEP-1を毎週２回投与され；グループ４はPEP-1を隔日投与され；グループ５はPEP-1を毎日投与された。データは、対照グループ１のそれと比較して、それぞれの処理グループの動物（n＝3）に対するSODバンド強度として表示した。「Ｍ」は、イムノブロットのサンプルと並走させたSOD標準である。Ｍ、グループ３、およびグループ４データの棒グラフ上方の数字は選択したグループのSODレベルの倍数増加をグループ１と比較して表示する。詳細は本文参照。
【００２９】
図２は、PEP-1の様々な用量を用いて処理した若（4月齢）および老（18月齢）C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。マウス脳からの抽出物をウエスタンイムノブロットにより分析し、SOD発現のレベルはイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。動物１〜３は無処理若マウス；動物４〜６は無処理老マウス（対照）；７〜９は老マウス、毎日PEP-1（0.33mg/kg）処理；動物10〜12は老マウス、毎日PEP-1（3.3mg/kg）処理である。データは、無処理の老動物４〜６のそれと比較して、それぞれの処理グループのそれぞれの動物に対するSODバンド強度として表示した。「Ｍ」は、イムノブロットのサンプルと並走させたSOD標準である。「SOD関連」はSODの破砕断片である。詳細は本文参照。
【００３０】
図３は、様々な用量のPEP-1を経口胃管強制栄養により70日間（2.5ヶ月）受けた若（4月齢）および老（16月齢）C57BLACKマウスのグループ（n＝10）における動物のパーセント（％）生存率を描く棒グラフを示す。グループ１動物は無処理、若マウスであり；グループ２動物は無処理、老マウスであり；グループ３動物は毎日0.025mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ４動物は毎日0.075mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ５動物は毎日0.25mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ６動物は毎日0.75mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ７動物は毎日2.5mg/kgのPEP-1の用量を受けた。詳細は本文参照。
【００３１】
図４は、図３に記載した様々な経口用量のPEP-1を用いて処理したC57BLACKマウスに対する歩行運動活性スコア（水平カウント数／分）を描く棒グラフを示す。星印（＊）は対照若マウスと比較してP＜0.05（ANOVAによるstudent Ｔ検定）である。詳細は本文参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
詳細な説明
本発明は、反応性酸素種（ROS）およびフリーラジカルを解毒する細胞および組織中の抗酸化防御機構の主成分である酵素、すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）の相補的対をコードする一方または両方の遺伝子の発現を増強するペプチド化合物の発見に基づくものである。ROSおよびフリーラジカルは、電子伝達および正常な呼吸、ならびに各種薬物の代謝のようなその他の代謝過程中に発生するので、速やかに解毒して細胞および組織に対する永続的かつ連続的損傷を防止しなければならない。さらに、加齢過程（老化）を含む多くの疾病または状態は、ROSおよび／またはフリーラジカルが、実際に、細胞または組織を損なう毒性レベルへの増加を特徴とする。従って、本発明に記載したペプチド化合物は、個体における有害レベルのROSおよびフリーラジカルの発生を中和する有用な治療および予防用化合物である。
【００３３】
本発明をさらによく理解できるように、下記のように用語を定義する。
【００３４】
略語：本明細書に記載するアミノ酸残基は、当業者には公知の一般的な三文字または一文字表記によって略記する（例えば、Lehninger, A.L., Biochemistry, 第２版（Worth Publishers, Inc., ニューヨーク、1975）、p.72を参照）。本明細書で用いられるその他の略語として下記のものが挙げられる：ドコサヘキサエン酸部分のアシル型を意味する「DHA」；リポ酸部分のアシル型を意味する「Lip」；パルミチン酸部分のアシル型（すなわち、パルミトリル基）を意味する「Palm」；酢酸のアシル型を意味する「Ac」；グルコース-3-O-グリコール酸部分を意味する「Gga」；スーパーオキシドジスムターゼを意味する「SOD」；カタラーゼ（抗酸化酵素）を意味する「CAT」；グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを意味する「GAPDH」；および反応性酸素種を意味する「ROS」。これ以外にも、本文中必要に応じて他の略語を示す場合がある。
【００３５】
「炭化水素」とは、分枝もしくは非分枝、および飽和または不飽和の炭化水素鎖のいずれも意味する。本明細書に記載するペプチド化合物のいくつかに存在する好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜25を有する。さらに好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜22を有する。
【００３６】
本明細書で理解され、用いられる「反応性酸素種」、すなわち「ROS」は、呼吸中の正常な電子伝達系の過程で発生する、あるいは、疾病において、または特定の障害に対する所定治療薬による治療中に発生する、高度に反応性の酸素化合物である。ROSとしては、限定するものではないが、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、過酸化水素（H2O2）、一重項酸素、過酸化脂質、およびペルオキシニトライトが挙げられる。ROSは分子、細胞、および組織に酸化損傷を起こすことができる。
【００３７】
本明細書で理解され、用いられる「フリーラジカル」は、奇数の（対になっていない）電子を有するあらゆる原子または分子または化合物を意味する。この定義によると、スーパーオキシドアニオンもまた、負に荷電したフリーラジカルと考えられる。本発明で特に関心のあるフリーラジカルは、高反応性で高酸化性の分子であり、このような分子は、正常な代謝中に、疾病状態で、もしくは化学治療薬による治療中に形成または発生する。このようなフリーラジカルは、高度に反応性で、分子、細胞および組織に酸化的損傷を起こすことができる。スーパーオキシドアニオン以外に、最も一般的で、破壊能力のあるタイプのフリーラジカルは、ヒドロキシルラジカルである。典型的には、スーパーオキシドアニオンまたは一重項酸素などのROSの発生により、１以上の他の有害なフリーラジカルも生じる。従って、本明細書で理解され、用いられる「ROSおよびフリーラジカル」または「ROSおよびその他のフリーラジカル」のような用語は、特に細胞および組織の代謝状態で発生する可能性がある、高反応性で酸化性の分子種もしくは化合物の全集団のいずれかまたは全部を包含するものとする（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答（Response of Antioxidant System To Physical and Chemical Stress）」 Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章：125-141（TaylorおよびFrancis, ワシントンD.C.、1997）を参照）。
【００３８】
「酸素ラジカルスカベンジャー」または「ラザロイド(lazaroid)」は、ROSおよびフリーラジカルを除去および解毒する能力を有するクラスの化合物である。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、およびβカロテンやレチノイドのような関連する抗酸化化合物は、SODおよびCATなどの抗酸化酵素のように、この大きなクラスの化合物のメンバーである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素および他のラザロイドが細胞内および細胞外の両方に存在するため、十分な量のROSおよびフリーラジカルを効率的に除去し、細胞および組織に対する深刻な酸化的損傷を防ぐことができる。
【００３９】
本明細書で理解され、用いられる「ペプチド化合物」は、ペプチド結合により結合された少なくとも４個のアミノ酸を含有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする本明細書に記載のあらゆる化合物を意味する。「ペプチド化合物」は、典型的には、約20個より少ない、好ましくは12個より少ないアミノ酸を含む非修飾または非誘導体化ペプチドを含む。本発明のペプチド化合物は、該ペプチドのアミノ末端アミノ酸残基、カルボキシ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に、好ましくは共有結合で結合したアミノ酸以外の１以上の化学的部分を含有するように修飾された本発明の「誘導体」または「誘導体化ペプチド化合物」を含む。かかる修飾は、限定されるものでないが、保存アミノ酸置換、ペプチドの反応性部分への保護もしくはキャッピング基の付加、検出可能な標識の付加、および該ペプチド化合物の活性（すなわち、細胞もしくは組織内の抗酸化活性を増強するSODおよび／もしくはCATなどの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする能力）を破壊して害わないその他の変化を含む。
【００４０】
本発明に記載するペプチド化合物の「アミノ末端キャッピング基」は、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基に共有結合で結合したもしくはコンジュゲートしたあらゆる化学的化合物または化学的部分である。アミノ末端キャッピング基は、分子内環化または分子間重合を阻害または防止するため、血液−脳関門を介したペプチド化合物の輸送を促進するため、アミノ酸末端を他の分子との望ましくない反応から保護するため、さらなる抗酸化活性を与えるため、またはこれらの特性の組合わせを与えるために有用である。アミノ末端キャッピング基を有する本発明のペプチド化合物は、非キャップ付加ペプチドと比較して、その他の有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用などを有しうる。例えば、本明細書に記載するペプチド化合物に用いられるアミノ末端キャッピング基のいくつかはまた、その遊離状態で抗酸化活性も有しうる（例えば、リポ酸、「Lip」、はROSおよびフリーラジカルの公知のスカベンジャーである）、従って、非キャップ付加形態のペプチドにより与えられる抗酸化活性を改良または増強することができる。本発明によるペプチド化合物および組成物を調製する上で有用なアミノ末端キャッピング基の例として、限定されるものでないが、１〜６個の天然のL-アミノ酸残基（配列番号６）、好ましくは１〜６個のリシン残基（配列番号７）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号７）、もしくはリシンとアルギニン残基の組合わせ（配列番号７）；ウレタン、尿素化合物、リポ酸（Lip）；グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）；またはペプチドのアミノ末端アミノ酸残基に共有結合されたアシル基が挙げられ、ここで本発明の組成物に有用なこのようなアシル基はカルボニル基および炭素数１（例えばアセチル部分）から炭素数25まで（例えば、パルミトイル基「Palm」（16：0）およびドコサヘキサエノイル「DHA」（C22:6-3））の炭化水素鎖を有するものであってもよい。さらに、上記アシル基の炭素鎖は、パルミチン酸のように飽和していてもよいし、DHAのように不飽和であってもよい。ドコサヘキサエン酸、パルミチン酸、またはリポ酸などの酸をアミノ末端キャッピング基として記載する場合、得られるペプチド化合物は非キャップ付加ペプチドと酸との縮合生成物であると理解される。
【００４１】
本発明に記載するペプチド化合物の「カルボキシ末端キャッピング基」は、ペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸残基に共有結合で結合したあらゆる化学的化合物または部分である。カルボキシ末端キャッピング基の主な目的は、分子内環化または分子間重合を阻害または防止すること、血液−脳関門を介したペプチド化合物の輸送を促進すること、および、これら特性の組合せを提供することである。カルボキシ末端キャッピング基を有する本発明のペプチド化合物はまた、非キャップ付加ペプチドと比較して、有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用、増強された親水性、増強された疎水性、または増強された抗酸化活性（例えば、カルボキシ末端キャッピング基が、１個以上のスルフヒドリル基のようなそれ自身の還元力源を有する場合には）などを有しうる。本明細書に記載するペプチド化合物において特に有用なカルボキシ末端キャッピング基としては、アミド結合により、ペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基と結合した第一級または第二級アミンが挙げられる。本発明で有用な他のカルボキシ末端キャッピング基は、本明細書に記載するペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボン酸基と結合してエステルを形成する、炭素数1〜26の脂肪族第一級または第二級アルコールおよびフラボノイドを含む芳香族フェノール誘導体を含む。
【００４２】
「有効量」は所望の効果を生じるために必要な化合物の量を意味する。本発明のペプチド化合物の有効量は、抗酸化酵素、例えば、SODおよび／またはCATをコードする１以上の遺伝子の発現をアップレギュレートするために細胞、組織、または個体に投与しなければならないペプチド化合物の量である。
【００４３】
本明細書に用いられかつ理解される「単離されたペプチド化合物」は、本明細書に記載されかつ自然状態では存在しないペプチドを含んでなるペプチド化合物を意味し、例えば、ある単離されたペプチド化合物はさらに大きい天然分子の部分として、生物学的源（例えば、細胞、組織、ウイルス）の自然成分として、または生物学的源からの未分画抽出物中に存在しない。従って、単離された本発明のペプチド化合物は、天然タンパク質の精製された、非天然断片であってもよいし、または完全に合成されたすなわち自然では見出されずペプチド合成方法を用いてのみ生産されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００４４】
「医薬（Pharmaceutical）」、「医薬的活性化合物（pharmaceutically active compound）」、および「医薬品（pharmaceutical drug）」は同義であり、ヒトおよび／または他の動物（すなわち、獣医学において）の疾患または状態を治療するために使用しうるあらゆる組成物または化合物を意味する。かかる公知の医薬活性化合物のグループとしては、限定されるものでないが、向精神薬化合物（気分更新薬）、抗癌化合物、抗生物質、抗潰瘍薬、抗ウイルス薬、免疫刺激化合物、免疫抑制化合物、および抗アテローム性化合物が挙げられる。
【００４５】
本明細書で理解され、用いられる「放射線」とは、あらゆるタイプの伝播または放出エネルギー波、もしくはエネルギーを加えた粒子を意味し、電磁放射線、紫外線（UV）、ならびに、直射日光誘導放射線および放射能性放射線が含まれる。このような放射線の作用は、皮膚の表面または下層に影響を及ぼすか、身体の遠位部位に全身的損傷を生じる恐れがある。
【００４６】
本明細書で理解され、用いられる「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は、一般的に細胞または組織中の遺伝子産物の発現レベルの増加を意味する。本明細書では遺伝子発現の増加を、遺伝子産物、例えば転写物またはタンパク質の発現のより高いレベルと関係付けて検出するので、用語「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は適宜、遺伝子産物の発現レベルの増加を記載するのにも適用することができる。本明細書に記載するペプチド化合物は、該ペプチド化合物で処理（接触）してない細胞または組織に通常存在するレベルを超えて、酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）および／またはカタラーゼ（CAT）をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。従って、SODまたはCAT mRNA転写物のレベル；SODまたはCAT遺伝子産物（タンパク質）合成；SODまたはCAT酵素活性のレベルの増加は、抗酸化酵素をコードする遺伝子発現のアップレギュレーションを示す。SODまたはCAT遺伝子の発現は様々な方法により検出することができ、限定されるものでないが、SODおよび／もしくはCATをコードするmRNA転写物を検出するノーザンブロッティング、遺伝子産物、すなわちSODおよび／もしくはCATタンパク質を検出するウエスタンイムノブロッティング、またはSODもしくはCAT酵素活性の標準的アッセイが含まれる。
【００４７】
その他の用語は、以下の説明で用いるうちに、明らかになるであろう。
【００４８】
ペプチド化合物および組成物
本発明は、真核細胞において、SODおよび／またはCAT遺伝子発現をアップレギュレートする組成物および／または方法で使用するための本明細書に記載の単離されたペプチド化合物を提供する。細胞または組織中のSODおよび／またはCATのレベルをアップレギュレートすると、解毒系が増強され、これによって、ROSおよびフリーラジカルの有害な酸化活性が防止、低減、または排除される。本発明の好ましいペプチドおよびペプチド化合物は、SODおよびCATの両方をアップレギュレートする。
【００４９】
本発明は、式：R1 Asp Gly Xaa3 Xaa4 Xaa5 R2（配列番号１）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa3はGluまたはLeuであり；Xaa4はAlaまたはGluであり；Xaa5は存在しないか、LeuまたはAlaであり；そしてR2は存在しないかまたはペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は次式：
R1 Asp Gly Glu Ala R2（配列番号２）、
R1 Asp Gly Glu Ala Leu R2（配列番号３）、
R1 Asp Gly Leu Glu Ala R2（配列番号４）
［式中、R1は存在しないか、ペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基であり、そしてR2は存在しないか、ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］のいずれかを有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするあらゆる単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００５０】
さらに一般的に、本発明は、次のアミノ酸「コア配列」：
Asp Gly Glu Ala（配列番号２）、
Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、
Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
のいずれかを有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするあらゆる単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。本質的にコア配列を含んでなるかまたはコア配列からなるペプチドは、細胞または組織中の抗酸化酵素活性を増加する各種の組成物および方法に使用してROSおよびフリーラジカルの有害な効果を中和することができる。本発明の組成物および方法に使用される本発明のペプチド化合物は、該ペプチド化合物が細胞または組織中の抗酸化酵素活性を増加する抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をなおアップレギュレートするのであれば、アミノ酸の「コア配列」（例えば、上記配列番号２、３、および４のアミノ酸配列）のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合した１以上のさらなるアミノ酸を含有してもよいと理解される。例えば、本発明の好ましい実施形態は、式：
R1 Xaa1 Xaa2 Asp Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 R2（配列番号５）
［式中、R1は存在しないかアミノ末端キャッピング基であり；Xaa1は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa2は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa5はGluまたはLeuであり；Xaa6はAlaまたはGluであり；Xaa7は存在しないかLeuまたはAlaであり；Xaa8は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa9は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa10は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa11は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；R2は存在しないかペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００５１】
本明細書に記載の単離されたペプチド化合物は、長さで好ましくは約20個より少なく、そして優先度の高い順に、約12、11、10、9、8、7、または6個より少ないアミノ酸であり、細胞または組織中のSODおよび／またはCATの遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
【００５２】
細胞または組織中の抗酸化活性は、in vitro、例えば組織培養中で標準的方法により、または個体から得た組織もしくは細胞サンプルの分析により測定することができる。増加した抗酸化活性を検出する方法としては、限定されるものでないが、SODまたはCAT酵素活性アッセイ；SODおよび／またはCAT産生のイムノブロット（例えば、ウエスタンブロット、ELISA）；およびSODおよび／またはCAT遺伝子のmRNA転写物のレベルを検出するノーザンブロットが挙げられる。
【００５３】
特に好ましい本発明のペプチド化合物は、低濃度で、すなわち１ミリリットル（ml）当たりナノグラム（ng）以下の範囲のペプチドで、アップレギュレーション活性を示す。このような高い能力は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）またはヒト成長ホルモンなどの各種ホルモンにより示されるものと類似している。従って、本明細書に記載するペプチド化合物は、公知の治療ホルモンペプチドの調製、保存および投与にすでに適用されている利用可能な技法の多くを用いて、調製、保存および使用することができる。
【００５４】
本明細書に記載するペプチド化合物は、該ペプチドの所望の活性を破壊しないような追加の修飾、例えば、アミノ末端またはおよび／またはカルボキシ末端アミノ酸残基での化学的成分の付加、保存的アミノ酸置換、あるいは、ペプチドの内部アミノ酸残基の側鎖の修飾などを実施したペプチドを含んでいてもよい。本明細書に記載するペプチドの分子内環化および分子間重合は、ペプチドの活性を不活性化もしくは低下させる傾向があり、その結果、ペプチドがSOD、またはCATを効果的にアップレギュレートすることができなくなることが認められている。従って、最も有用なペプチド化合物は、他のペプチド化合物分子との環化反応または望ましくない重合またはコンジュゲート形成を最も起こしにくいものである。本明細書に記載のペプチド化合物がSODおよび／またはCATの発現をアップレギュレートする能力を維持もしくは増強する以外にも、いくつかの修飾はさらに便益をもたらしうる。例えば、アミノ末端キャッピング基は血液−脳関門（BBB）を介したペプチドの輸送を促進すると考えられる（例えば、PCT国際公開WO99/26620を参照）。この特性は、ペプチド化合物を用いて脳組織および中枢神経系部分におけるSODおよびCATをアップレギュレートする際、特に重要である。血液−脳関門（BBB）を介した輸送を促進するアミノ末端キャッピング基はまた、それらが結合するペプチド化合物の環化を防止したり、あるいは、他のペプチド化合物との重合を防止したりすることができる。
【００５５】
好ましいアミノ末端キャッピング基として、リポ酸部分があり、これは、アミド結合により、ペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。遊離形態のリポ酸（Lip）は独立した抗酸化活性を有し、アミノ末端キャッピング基として用いると、本発明のペプチドの抗酸化活性を増強することができる。アミノ末端に結合したリポ酸部分は、２個のスルフヒドリル基を含む還元形態か、あるいは、スルフヒドリル基が酸化されて分子内ジスルフィド結合、従って、複素環構造を形成する酸化形態をしていると考えられる。上記以外に、本発明のペプチド化合物を調製するのに有用なアミノ末端キャッピング基は、グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）であり、これは、アミド結合で、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。また、グルコース部分は、グルコース部分の１個以上のヒドロキシル基を置換するアルコキシ基のような修飾をさらに含んでもよい。
【００５６】
本明細書に記載するペプチド化合物に有用なアミノ末端キャッピング基の別の例は、アシル基であり、これは、アミド結合で、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基のαアミノ基と結合させることができる。アシル基は、長さが炭素数１〜25で、飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の、分枝または非分枝炭化水素鎖、さらに好ましくは、アシル基の炭化水素鎖は、DHAと同様に、長さが炭素数１〜22である。アシル基は、アセチルまたは脂肪酸であるのが好ましい。アシルアミノ末端キャッピング基として用いられる脂肪酸は、飽和または不飽和で、分枝または非分枝いずれかの炭化水素鎖を含んでいてよい。好ましくは、炭化水素鎖は、長さが炭素数１〜25であり、さらに好ましくは、炭化水素鎖は、長さが炭素数１〜22である。例えば、本発明のペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基として有用な脂肪酸には、限定するものではないが、下記のものがある：カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）。本明細書に記載するペプチド化合物のアシルアミノ末端キャッピング基として用いられる特に好ましい脂肪酸は、パルミチン酸（Palm）とドコサヘキサエン酸（DHA）である。DHAおよびその他の各種脂肪酸部分は、それらが血液−脳関門を介してそれらの結合分子の輸送を促進することがわかっている（例えば、PCT国際公開WO99/40112およびPCT国際公開WO99/26620を参照）。従って、本明細書に記載するペプチド化合物を投与することにより、脳組織および／または中枢神経系のその他の部分におけるROSおよびフリーラジカルの酸化作用を阻止する場合には、このような脂肪族アシル部分が特に好ましい。
【００５７】
さらに、場合によっては、アミノ末端キャッピング基はリシン残基またはポリリシンペプチドでもよく、その際、ポリリシンペプチドは、２、３、４、５または６個のリシン残基からなってペプチド化合物の環化、架橋、もしくは重合を防止できることが好ましい。また、これより長いポリリシンペプチドを用いてもよい。本明細書に記載するペプチド化合物に用いることができる別のアミノ末端キャッピング基は、アルギニン残基またはポリアルギニンペプチドであり、その際、該ポリアルギニンペプチドは、２、３、４、５または６個のアルギニン残基からなるのが好ましいが、これより長いポリアルギニンペプチドを用いることもできる。また、本明細書に記載するペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基は、リシンおよびアルギニンの両方を含むペプチドでもよく、その際、該リシンおよびアルギニン含有ペプチドは、両アミノ酸の２、３、４、５または６残基の組合せ（どんな順序でもよい）からなるのが好ましいが、これより長いリシンおよびアルギニン含有ペプチドを用いることもできる。本明細書に記載するペプチド化合物においてアミノ末端キャッピング基として用いられるリシンおよびアルギニン含有ペプチドは、ペプチド化合物の合成に用いられるあらゆる工程に好都合に組み込むことができ、これによって、アミノ末端キャッピング基を含む誘導体化ペプチド化合物が得られる。
【００５８】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物は、カルボキシ末端キャッピング基を含むことができる。この基の主な目的は、分子内環化の防止、あるいは、分子間架橋または重合の不活性化である。しかし、上記のように、カルボキシ末端キャッピング基は、これに加えて、効力の増強、副作用の低減、抗酸化活性の増強、および／または望ましい生化学的特性などの便益をペプチド化合物にさらに賦与することができる。このような有用なカルボキシ末端キャッピング基の例として、カルボキシ末端アミノ酸残基とのアミド結合による第一級または第二級アミンがある。標準的なアミド化反応化学を用いて、このようなアミンをペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基に付加することもできる。
【００５９】
本明細書に記載するペプチド化合物の環化、架橋または重合は、ペプチド化合物の活性を全部破壊するか、本発明の治療または予防用組成物および方法で使用できなくなる程度にまで破壊する恐れがある。
【００６０】
さらに、本発明に記載するペプチド化合物は、１個以上のL-アミノ酸残基の代わりに、１個以上のD-アミノ酸残基を含んでもよい。ただし、その際、１個以上のD-アミノ酸残基の組込みが、ペプチド化合物の活性を全部もしくは、本発明の治療または予防用組成物および方法で使用できなくなる程度にまで破壊しないことを条件とする。L-アミノ酸の代わりにD-アミノ酸を組み込むと、特にin vivoで、ペプチド化合物にさらに安定性を賦与することができ、有利である。
【００６１】
ペプチド化合物は、標準的方法を用いて調製することもできるし、市販のものから入手することもできる。本発明のペプチド化合物のペプチドの直接合成は、固相ペプチド合成、液相合成などの通常の技法を用いて達成することができる。ペプチドはまた、各種組換え核酸技術を用いて合成してもよいが、ペプチドの比較的小さいサイズと直接ペプチド合成技術の現状を考慮すると、直接合成が好ましく、固相ペプチド合成が最も好ましい。固相合成では、例えば、適切に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を介して、誘導体化された不溶性ポリマー支持体（架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂など）に結合させる。「適切に保護された」とは、アミノ酸のαアミノ基と側鎖官能基の両方に保護基が存在することを意味する。側鎖保護基は、全合成工程を通じて用いられる溶剤、試薬、および反応条件に対して一般に安定であり、最終ペプチド生成物に影響を与えない条件下で除去できるものである。ポリペプチドの段階的合成は、初期（すなわち、カルボキシ末端）アミノ酸からＮ保護基を除去し、そこに、ポリペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル基を結合することにより実施される。このアミノ酸も適切に保護する。反応性の基、例えば、カルボジイミド、対称酸無水物を形成させるか、あるいは、ヒドロキシベンゾトリアゾールやペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基を形成させることにより、導入するアミノ酸のカルボキシル基を活性化し、結合したアミノ酸のＮ末端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法として、BOC法（αアミノ保護基としてtert-ブチルオキシカルボニルを用いる）と、FMOC（9-フルオレニルメトキシカルボニルを用いて、アミノ酸残基のαアミノを保護する）とが挙げられ、両方法とも、当業者にはよく知られている（Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis（W.H. Freeman Co.、サンフランシスコ、1989）；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154（1963）；BodanszkyおよびBodanszky, The Practice of Peptide Synthesis（Springer-Verlag、ニューヨーク、1984）；いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ末端およびカルボキシ末端キャッピング基は、もし所望であれば、キャッピング基として用いる具体的な部分に依存してペプチド合成中にまたは合成後に加えてもよい。例えば、もしキャッピング基が１以上のアミノ酸であれば、そのような残基をペプチドを合成するプロトコル中に簡単に組込むことができる。もしキャッピング基がアシルもしくはアミドのように、アミノ酸でなければ、ペプチド合成後に、標準の縮合またはコンジュゲーションの方法を用いて加えてもよい。
【００６２】
本発明に従うペプチド化合物は、ペプチド合成のサービスを提供する会社（例えば、BACHEM Bioscience, Inc.、ペンシルバニア州キングオブプルシア；AnaSpec, Inc.、カリフォルニア州サンホセ）に商業的に製造させてもよい。また、Perkin-Elmer Applied Biosystemsが製造しているような、自動ペプチド合成機も利用可能である。
【００６３】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物は、塩形態で調製して使用することも可能である。典型的には、ペプチド化合物の塩形態は、特定のpHでペプチド化合物の実効イオン電荷に対する対イオンとして働く１個以上のイオンの存在下で、酸または塩基によりペプチド化合物を含む組成物のpHを調節することによって存在するだろう。本明細書に記載するペプチド化合物の様々な塩形態は、当業者には公知の各種方法、例えば、各種イオン交換クロマトグラフィー方法を用いて、形成または相互交換することができる。本明細書に記載する組成物に用いることができるカチオン性対イオンとして、限定するものではないが、アンモニウムイオンのようなアミン；金属イオン、特にアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム、バリウム）、遷移金属（例えば、鉄、マンガン、亜鉛、カドミウム、モリブデン）、その他の金属（例えば、アルミニウム）の１価、または２価イオン；ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載する組成物に用いることができるアニオン性対イオンとしては、限定するものではないが、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、硫酸、炭酸、クエン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、グルタル酸、ケトグルタル酸の各イオン、ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載するペプチド化合物のトリフルオロ酢酸塩は、典型的には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてトリフルオロ酢酸バッファーで精製する際に形成される。一般にin vivo用途には適していないが、本明細書に記載するペプチド化合物のトリフルオロ酢酸塩形態は、目的とするペプチド化合物の活性または効力を試験するのに実施される各種in vitro細胞培養実験またはアッセイにおいて好適に用いることができる。次に、ペプチド化合物を、トリフルオロ酢酸塩から、医薬品または食物補助剤（機能性食品）組成物に許容できる塩形態に変換する（例えば、イオン交換法により）か、あるいは、そのような塩形態として合成することができる。
【００６４】
産生または合成した後に、本発明の組成物および方法に有用であるペプチド化合物を当技術分野で知られる方法を用いて精製することができる。そのような精製は、有意なまたは検出可能な量の望ましくない副反応生成物；ペプチド化合物を修飾するために用いられた非結合または非反応部分を分離し；そして他の望ましくない分子、例えば、限定されるものでないが、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物などを分離した状態で、本発明のペプチド化合物を提供しなければならない。ペプチド精製の標準方法を利用して、単離された本発明のペプチド化合物を得ることができ、そのような方法としては、限定されるものでないが、各種の高圧（または高性能）液クロマトグラフィ（HPLC）および非HPLCペプチド単離プロトコル、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、相分離法、電気泳動分離、沈降法、塩溶／塩析法、イムノクロマトグラフィ、ならびに／またはその他の方法が挙げられる。
【００６５】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物を単離する特に好ましい方法は、例えば、C4-、C8-またはC18-シリカのようなアルキル化シリカカラムを用いる逆相HPLCを使用する。一般的には有機含量が増加する勾配移動相、例えば通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性バッファー中のアセトニトリルを用いて精製を行う。イオン交換クロマトグラフィーを用いて、電荷に基づいてペプチド化合物を分離することもできる。ペプチド化合物の純度は、様々な方法、例えば、HPLC上の主要ピークの同定などにより、決定することができる。HPLCカラム上で投入材料の95％以上に当たる単一ピークを得るペプチド化合物が好ましい。さらには、HPLCカラム上で投入材料の97％以上、98％以上、99％以上、あるいは、99.5％である単一ピークを得るペプチド化合物がより好ましい。
【００６６】
上記技法のいずれかを用いて、得られるペプチド化合物が、本発明の組成物および方法で用いる所望のペプチド化合物であることを確実にするために、当業者には公知の各種分析方法のいずれかを用いて、ペプチド化合物の組成の分析を実施する。このような組成分析は、高分解質量分析法を用いて実施することにより、ペプチドの分子量を決定することができる。あるいは、水性酸中でペプチドを加水分解した後、HPLCまたはアミノ酸分析装置を用いて、混合物の成分を分離、同定および定量化することにより、ペプチドのアミノ酸含有量を確認することも可能である。また、ペプチドを連続的に分解し、アミノ酸を順に同定するタンパク質シークエネーターを用いて、ペプチドの配列を決定してもよい。一部のペプチド化合物はアミノおよび／またはカルボキシ末端キャッピング基を含むことから、配列分析の前にキャッピング基またはキャップ付加アミノ酸残基を除去しなければならない場合もある。また、薄層クロマトグラフィー法を用いて、所望のペプチド化合物の１個以上の構成成分基または残基の真正を証明してもよい。ペプチド化合物の純度はまた、ペプチド化合物をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した後に、ゲル中の分離したタンパク質成分を染色して検出することにより検定することもできる。
【００６７】
本明細書に記載した様々なペプチド化合物は、本発明の組成物および方法において、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートし、これにより、抗酸化活性を発生させて、例えば、加齢の過程（老化）、疾病および各種薬物治療で生じるようなROSおよびフリーラジカルの望ましくない破壊的酸化活性を阻止するのに有用である。
【００６８】
アミノおよび／またはカルボキシ末端キャッピング基を除外した好ましいペプチド化合物（すなわち、「コア配列」）は、長さが20個のアミノ酸より小さく、さらに好ましくは12アミノ酸より小さい。なお、さらに好ましいこのようなコア配列は、長さが11、10、９、８、７、またはさらに６個のアミノ酸より少ない。最も好ましくは、本発明の組成物および方法において有用な単離されたペプチド化合物は長さが４または５個のアミノ酸のコア配列、例えばAsp Gly Glu Ala（配列番号２）、Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、およびAsp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸コア配列を有する。本明細書に記載のあらゆるアミノ末端および／またはカルボキシ末端キャッピング基をこのような好ましいペプチド化合物に付加することができるが、その際、キャッピング基が細胞または組織中のSODおよび／またはCAT酵素の発現をアップレギュレートする能力を破壊しないこと、およびキャッピング基が該ペプチド中の他の基と反応して有意または有毒な量の望ましくない環化または重合を起こさないことを条件とする。
【００６９】
生物学的および生化学的活性
本発明の組成物および方法で有用なペプチド化合物は、細胞および／または組織、特に哺乳動物細胞において、SODおよび／またはCATをアップレギュレートする能力を有するが、その際、上記細胞は、SODおよび／またはCAT酵素タンパク質をコードする少なくとも１つの機能的遺伝子を含むものとする。機能的遺伝子は、特定の酵素をコードするだけでなく、コード配列内外の必要な遺伝情報を提供し、これにより、遺伝子の転写が起こり、mRNA転写物が機能性遺伝子産物、例えばこの場合は、抗酸化酵素に翻訳されうる。
【００７０】
本明細書に記載したある特定の好ましいペプチド化合物は、SODおよびCATの両酵素の機能的遺伝子が目的とする細胞内に存在するときに、両酵素をアップレギュレートすることができる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーションにより、望ましくないROSおよびフリーラジカルを解毒する効力を増強することができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、SODアップレギュレーションの結果、SODタンパク質のレベルが増加するときに、CATレベルにも増加があると、優れた抗酸化効力が達成されると考えられる。CAT遺伝子のアップレギュレーションにより、増強したSOD活性により発生し得る更なる過酸化水素およびその他のROSまたはフリーラジカルを中和および解毒する能力が高くなる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載されたペプチド化合物は、細胞および組織に、ROSおよびフリーラジカルを解毒する増強された抗酸化酵素活性の完全な相補体を提供する。例えば、組織培養中の哺乳動物細胞に、SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載されたペプチド化合物を接触させると、典型的には、イムノブロッティングにより検出し、未処理細胞と比較して、SODおよびCAT mRNA転写物のレベルが少なくとも約２倍（さらに増加するほど好ましく、少なくとも約３倍、４倍、および６〜８倍）増加するとともに、SODおよびCATタンパク質のレベルが約２倍（さらに増加するほど好ましく、少なくとも約３倍、４倍、６倍、８倍、10倍、および12〜14倍）増加する。このようなSODおよびCAT遺伝子発現の増加により、有害な副作用を伴なうことなく、ROSおよびフリーラジカルの解毒能力が有意に増強された細胞が提供される。
【００７１】
SODおよびCATをコードする遺伝子の発現は、様々な方法により測定することができる。標準的酵素アッセイを用いて、細胞または組織抽出物または生物体液中のSODおよびCATのレベルを検出することができる（Fridovich, Adv. Enzymol., 41:35-97（1974）；BeyerおよびFridovich, Anal. Biochem., 161:559-566（1987））。さらに、SODおよびCATに対する抗体は入手可能であり、容易に作製することもできる。各タンパク質に特異的なこのような抗体を用いて、標準的イムノブロット（例えば、ウエスタンブロット）およびその他の免疫学的技法により、様々な混合物、細胞抽出物、もしくはその他の生物材料のサンプル中のSODおよびCATのレベルを測定することができる。また、目的とする細胞の翻訳機構に欠陥のないことが確かであれば、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現レベルは、特定のmRNA種を測定するための標準的ノーザンブロットまたは標準的ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、RT-PCR）を用いて、mRNA転写物のレベルを検出することにより、測定することも可能である。
【００７２】
治療および予防用途
単離された本発明のペプチド化合物は、ヒトおよびその他の動物などの動物の細胞および組織中のSODおよび／またはCATをアップレギュレートする。好ましくは、単離された本発明のペプチド化合物は、SODおよびCATの両方をアップレギュレートする。前述したように、SODおよびCATは、ROSおよびフリーラジカルを反応性および有害性が低い化合物に還元することにより、これら分子を解毒することができる身体の主要な酵素抗酸化活性の成分である。様々な疾病状態の進行および薬物の副作用に対するROSおよびその他のフリーラジカルの寄与は現在よく知られるところである。
【００７３】
例えば、ROSおよびフリーラジカルのレベル増加が、虚血後の再灌流中に細胞および組織に生じることがわかっている。このようにしてROSおよびフリーラジカルのレベルが増加すると、すでにストレスを受けているか衰弱した臓器または組織に相当の損傷を与える恐れがある。SODおよび／またはCATをアップレギュレートする本発明のペプチド化合物を用いることにより、卒中、心臓発作、腎疾患および腎移植などの疾病や状態に起こる再灌流損傷を治療することができる。卒中や心臓発作のように、虚血がすでに起こっている場合には、本明細書に記載するペプチド化合物を含んでなる組成物を個体に投与することにより、血液や、影響を受けた組織または臓器にすでに存在するまたは現れる増加したROSおよびフリーラジカルを解毒する。あるいは、臓器移植のように、虚血が予想される場合には、手術または虚血事象の前に、予防処置として本明細書に記載するペプチド化合物を含んでなる組成物を投与することができる。
【００７４】
主な用途は、虚血−再灌流損傷の治療であるが、本明細書に記載するペプチド化合物を用いて、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルに関連するあらゆる疾病または状態を治療したり、あるいは、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルによって起こるあらゆる疾病、障害または状態を予防することもできる。さらに、本発明によれば、本明細書に記載するペプチド化合物を投与し、上記以外の様々な疾病および状態に関連する増加したROSおよびフリーラジカルの治療または予防処置を提供することができる。このような疾病および状態として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：早産児における酸素毒、組織および臓器の熱傷および物理的外傷、敗血症性ショック、多外傷性ショック、頭部外傷、脳外傷、脊椎損傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、加齢に関連するROSおよびフリーラジカルの増加、老化、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ダウン症、関節炎、黄斑変性、精神分裂病、てんかん、放射線損傷（紫外線誘発性皮膚損傷など）、ならびに、ROSおよびフリーラジカルの薬物誘発性増加。
【００７５】
ROSおよびフリーラジカルの形成による酸化ストレスは、加齢とともに漸進的に増加する（例えば、Mecocci, P.ら、Free Radic. Biol. Med., 28:1243-1248（2000）を参照）。これは、ラット組織（Erdincler, D.S.ら、Clin. Chim. Acta, 265:77-84（1997））、および高齢のヒト患者の血液細胞（Congi, F.ら、Presse. Med., 24:1115-1118（1995））における過酸化脂質形成の増加を調べることにより、検出されている。近年の研究（Niki, E., Intern, Med., 39:324-326（2000））では、ROSおよびフリーラジカルによる組織の損傷の増加は、加齢の過程で起こる抗酸化酵素SODおよびCATのレベルの減少に起因する可能性があることが報告されている。例えば、マウスのゲノムに余剰SOD遺伝子を挿入することにより作製したトランスジェニック動物は、ROSおよびフリーラジカルによる損傷のレベルが低下していることが認められた。このような動物は、寿命も延びている。さらに近年、SOD活性を模擬する少量のマンガンポルフィリン化合物を投与することにより、線虫Caenorhabditis elegansの寿命が44％延びたことが証明されている（S. Melowら、Science, 289;1567-1569（2000））。従って、SODおよび／またはCAT遺伝子の発現をアップレギュレートして、抗酸化酵素のレベルを増加させることができる本明細書に記載するペプチド化合物は、加齢に伴なって起こるROSおよびフリーラジカルのレベル上昇による組織損傷の増加および寿命の短縮を予防および／または阻止する方法にも十分に適している。
【００７６】
現在の治療用途に用いられる多様な薬物は、組織特異的な有毒副作用を発生するが、これは、ROSおよびその他のフリーラジカルのレベル上昇と相関している。このような薬物として、神経弛緩薬、抗生物質、鎮痛薬、およびその他のクラスの薬物が挙げられる。このような薬物に誘発された毒性の影響を受ける組織には、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓および血液など、１以上の主要臓器および組織が含まれる可能性がある。
【００７７】
薬物の最も危険な副作用の１つが、神経弛緩薬であるクロザピンについて報告されているが、これは、抗精神分裂病治療活性として大きな効能を有する最初の薬物であった（Somaniら、In Oxidants, Antioxidants And Free Radicals（S.I. BaskinおよびH. Salem編）（TaylorおよびFrancis、ワシントンD.C.、1997）、pp.125-136を参照）。クロザピンで治療した患者の約１〜２％が、ROSの生成と相関する無顆粒球症を発現した（Fischerら、Molecular Pharm., 40:846-853, 1991）。本発明によれば、本明細書に記載したペプチド化合物を、クロザピン治療患者に投与することにより、SODおよび／またはCATをアップレギュレートして、ROSおよびその他のフリーラジカルの望ましくない有害な増加を阻止し、これによって、無顆粒球症の発現の危険性を低減することができる。
【００７８】
これ以外に、神経弛緩薬を受ける精神分裂病患者の副作用として、遅発性ジスキネジーがあり、これは、様々な制御不能な口、顔、および／または躯幹運動によって現われる衰弱性疾患である。多くの患者、特に、長期入院患者は、この不運な薬物誘発性疾患により、永続的な障害に苦しむ。遅発性ジスキネジーに関する以前の研究では、ドーパミン作動性ニューロンの欠損に関心が集まった（例えば、MorgansternおよびGlazer, Arch. Gen. Psychiatr., 50: 723-733（1993）を参照）。しかし、さらに近年の研究では、このような患者の脳における主な欠陥は、線状体のドーパミン作動性ニューロンへのシナプス前入力での刺激毒性（excitotoxic）アミノ酸グルタミン酸の過剰生成であることがわかった。注目すべきことに、このグルタミン酸の過剰生成は、ROSおよびフリーラジカルの高増加を引き起こすことにより、ドーパミン細胞に対し刺激毒性作用を発生する（Tsaiら、Am. J. Psychiatr., 155: 1207-1253（1998）を参照）。従って、本発明のペプチド化合物を、神経弛緩薬を受ける患者に投与することにより、SODおよび／またはCATをアップレギュレートして、抗酸化活性を増強し、これによって、増加したレベルのROSおよびその他のフリーラジカルによる酸化作用を阻止することができる。
【００７９】
本発明の方法によれば、ROSおよびその他のフリーラジカルのレベル増加の望ましくない副作用と相関のある治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に、本明細書に記載したペプチド化合物を個体に投与することができる。このような薬物には、限定するものではないが、表１に記載するもの（Somaniら、1971を参照）が挙げられ、同表には、発現される既知の毒性および副作用も併せて載せる。
【表１】
【００８０】
医薬への適用
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の「活性成分」として、単離された本発明のペプチド化合物のいずれか、または製薬上許容されるその塩を含む。本発明の医薬組成物はさらに、１以上の製薬上許容される成分、例えば賦形剤（所望の物性を有するが、活性成分ではない化合物）、担体、アジュバントもしくはビヒクルを含む。
【００８１】
本発明の医薬組成物を、その他の治療用、予防用もしくは診断用薬、特に治療用ホルモンペプチドと同様の手法で、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。投与すべき用量、および投与様式は、年齢、体重、性別、患者の状態および遺伝的因子を含む、各種の要因に応じて異なり、最終的には主治医もしくは獣医によって決定されることとなる。一般的には、診断の感度もしくは治療効能のために必要とされる用量は約0.001〜25.0mg／kg (体重)の範囲となる。
【００８２】
本発明のペプチド化合物の製薬上許容される塩として、例えば製薬上許容される無機および有機の酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。好適な酸の例として以下の酸が含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、パモ酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびベンゼンスルホン酸。シュウ酸などの、それ自体は製薬上許容されないその他の酸でも、本発明の化合物および製薬上許容されるその酸付加塩を取得する際の、中間体として有用な塩の調製において利用することができる。適切な塩基から誘導される塩として、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN-(C1-4アルキル)4 +塩が含まれる。
【００８３】
本発明はまた、本明細書に開示したペプチド化合物の任意の塩基性窒素含有基の「第四級」化も想定しているが、その際、この第四級化が、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、そのペプチド化合物の能力を破壊しないものとする。こうした第四級化は、最終目的が陽性荷電残基のみを含有するペプチド化合物の使用の場合に、特に望ましい。上記のように、荷電アミノ酸残基が本明細書に記載するペプチド化合物中に存在する場合の、最も好ましい本発明の実施形態において、それらはすべて塩基性（正荷電）であるかまたはすべて酸性（負荷電）であって、保存もしくは使用中の環状ペプチドの形成を防止している。典型的には、環状形態のペプチド化合物は不活性で、潜在的に毒性である。したがって、第四級化ペプチド化合物が、塩基性アミノ酸を含有するペプチド化合物の好ましい１形態である。さらにより好ましいのは、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミドに転換されて、このカルボキシル基が任意の遊離アミノ基と反応して環状化合物を形成するのを防止している、第四級化ペプチド化合物である。当業者に知られた任意の薬剤によって、いかなる塩基性窒素でも第四級化することができる。これらとして例えば、以下のものが含まれる：塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどの低級ハロゲン化アルキル；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルを含む硫酸ジアルキル；塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物；ならびに臭化ベンジルおよびフェネチルを含むハロゲン化アラルキル。こうした第四級化、または酢酸および塩酸などの酸によって、水もしくは油に可溶性もしくは分散性の生成物を取得することができる。
【００８４】
選択的生物学的性質、特にSODおよび／またはCATをアップレギュレートする能力を強化するために、適切な機能付加によって、本発明のペプチド化合物を改変してもよいものと理解すべきである。こうした改変は当技術分野で知られており、これらとして以下のものが含まれる：ペプチド化合物の所定の生物学的系（例えば脳、中枢神経系、血液、リンパ系）内への貫通もしくは被輸送能力の増大、経口利用性の増大、注射による投与を可能にするための溶解性の増大、ペプチド化合物の代謝の変更、ならびにペプチド化合物の排出率の変更。その外に、ペプチド化合物をプロドラッグ形態に改造して、そのプロドラッグに関する代謝もしくはその他の生化学的経路の作用の結果として、患者の体内で所望のペプチド化合物が創製されるようにしてもよい。こうしたプロドラッグ形態は典型的にはin vitroアッセイでは活性をほとんどまたは全く表示しない。プロドラッグ形態の例のいくつかとして、ケトンもしくはアルデヒト基を含有する化合物のケタール、アセタール、オキシム、およびヒドラゾン形態が含まれる。プロドラッグ形態のその他の例として、ヘミケタール、ヘミアセタール、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタールおよびアセタール形態が含まれる。
【００８５】
本発明の医薬組成物に使用することができる、製薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとして、限定するわけではないが以下のものが含まれる：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などのバッファー物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素2ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロースを基礎とする物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびラノリンなど。
【００８６】
本発明の医薬組成物を各種の経路もしくは様式によって投与することができる。これらとして、限定するわけではないが、非経口、経口、気管内、舌下、経肺、局所、経直腸、経鼻、バッカル、舌下、経腟、またはインプラントレザバー経由が含まれる。インプラントレザバーは機械的、浸透圧またはその他の手段によって機能させることができる。本明細書で解釈され、かつ使用される用語「非経口」には、静脈内、頭蓋内、腹腔内、脊椎傍、関節周囲、骨膜内、皮下、皮内、動脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄膜内および病変部内注射または注入技法が含まれる。こうした組成物を好ましくは非経口投与用に、最も好ましくは静脈内、頭蓋内もしくは動脈内投与用に製剤化する。一般的に、また特に投与が静脈内もしくは動脈内の場合は、医薬組成物をボーラスとして、時間間隔をとった2回以上の投与として、または一定もしくは非線形流速注入として投与する。
【００８７】
医薬組成物は、例えば注射用の無菌水性もしくは油脂性懸濁液として、無菌の注射用調製品の形態とすることができる。この懸濁液は好適な分散剤もしくは湿潤剤（例えばTween80など）および懸濁剤を使用して、当技術分野で知られた技法にしたがって製剤化することができる。無菌注射用調製品は、非経口的に許容される非毒性の希釈剤もしくは溶媒中の無菌注射液もしくは懸濁液、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としてもよい。使用が可能な許容されるビヒクルおよび溶媒として、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。その外に、溶媒もしくは懸濁用媒質として、無菌の不揮発性油が通常使用される。この目的のためには、合成モノもしくはジグリセリドを含む、いかなるブランドの不揮発性油でも使用することができる。注射剤の調製において、オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体が有用であり、またオリーブ油もしくはひまし油などの天然の製薬上許容される油、特にそのポリオキシエチル化物も有用である。これらの油溶液もしくは懸濁液に、Pharmacoplia Halselicaに記載されたものなどの長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤を含ませてもよい。
【００８８】
本発明の医薬組成物を経口用に許容されるあらゆる投与剤型として経口投与することができる。これらとして限定するわけではないが、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、水性もしくは油脂性懸濁液剤および溶液剤、シロップ剤またはエリキシル剤が含まれる。経口用途の錠剤の場合、普通に使用される担体としてラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与用には、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。カプセル剤、錠剤、丸剤およびカプレット剤を遅延もしくは持続放出用に製剤してもよい。
【００８９】
水性懸濁液を経口投与する場合、ペプチド化合物を乳化剤および／または懸濁剤と配合するのが有利である。所望ならば、ある種の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加してもよい。経口投与用製剤は活性成分を10％〜95％、好ましくは25％〜70％含む。好ましくは、経口投与用の医薬組成物は、消化器系によるペプチド化合物の加水分解は防止または抑制されるが、血流中への吸収は可能になる混合物中の、本発明のペプチド化合物を供給する。
【００９０】
本発明の医薬組成物を膣もしくは直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では固体であるが、体温では液体であることによって、活性成分の放出に関わる身体部域では融解する好適な非刺激性賦形剤と、本発明の化合物とを混合することによって、調製することができる。こうした物質として、限定するわけではないが、カカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。坐薬による投与のための製剤は活性成分を0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％含む。
【００９１】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の処理が、創傷または手術中などの局所適用によって接近し得る部位もしくは器官に関わる場合に有用である。局所適用のためには、担体中に懸濁または溶解させた活性成分を含有する好適な軟膏として、医薬組成物を製剤化することができる。本発明のペプチド化合物の局所投与用の担体として、限定するわけではないが、鉱物油、液状石油(liquid petroleum)、白色石油(white petroleum)、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。あるいは、製薬上好適な担体中に懸濁または溶解させたペプチド化合物を含有する、好適なローションまたはクリームとして、医薬組成物を製剤化することができる。好適な担体として、限定するわけではないが、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれる。適切な場合、医薬組成物をゼリー剤、ゲル剤もしくは軟化剤として、局所またはその他の適用のために製剤化することができる。本発明の医薬組成物を直腸坐剤によるかまたは好適な浣腸剤中で、下部腸管に局所適用することもできる。局所投与は経皮パッチによって達成することもできる。これは健康な皮膚組織を維持し、また酸化による皮膚の損傷（例えばUVもしくは放射線に誘発された皮膚損傷）を回復させるために有用である。
【００９２】
本発明の医薬組成物を経鼻投与することができる。この場合、鼻の粘膜を経由するか、または肺中への吸入によって、吸収が生じる。こうした投与様式には典型的に、組成物を粉末、溶液もしくは液状懸濁物として準備し、次にこれを気体（例えば空気、酸素、窒素その他、またはそれらの組合せ）と混合して、液滴もしくは粒子のエアロゾルもしくは懸濁物を生成させることが必要となる。こうした組成物は医薬製剤の分野で周知の技法にしたがって調製されるが、ベンジルアルコールもしくはその他の好適な保存剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で既知のその他の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【００９３】
本発明の医薬組成物を、その投与剤型および投与様式に適切な各種の方法でパッケージすることができる。これらとして、限定するわけではないが、バイアル、ビン、カン、パケット(packet)、アンプル、カートン、柔軟性容器、吸入器、およびネブライザーが含まれる。これらの組成物を同一の容器から単回または多数回投与するようにパッケージすることができる。投与の直前に混合するようにした、乾燥粉末状または凍結乾燥形態の組成物と適切な希釈剤の両方を含む、１回以上の投与のためのキットを提供することが可能である。医薬組成物を、単回用の充填済み注射器、またはオートインジェクターおよび無針ジェットインジェクター用のカートリッジ中にパッケージすることもできる。
【００９４】
多数回使用用パッケージ製造には、細菌、真菌などの増殖を防止するが、患者に投与したとき毒性ではない濃度での、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムなどの抗微生物剤の添加を必要とする。
【００９５】
製薬業界において現在使用され、また当業者に公知である、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準(GMP)に一致することであるが、医薬品と接触するかこれを含むすべての成分を殺菌しなければならず、また業界基準にしたがって定期的に無菌性について試験しなければならない。殺菌の方法として、限外濾過、オートクレーブ、乾式もしくは湿式加熱、エチレンオキサイドなどの気体への曝露、次亜塩素酸ナトリウム（ブリーチ）を含む酸化剤などの液体への曝露、紫外線光、X線もしくはガンマ線などの高エネルギー電磁放射線への曝露および電離性放射線への曝露が含まれる。所望の生物学的機能、すなわち問題の医薬物質であるSODもしくはCATをアップレギュレートする能力を有意に変更することなく、最も有効な殺菌効果をもたらす、殺菌方法の選択は、当業者がなし得るところである。水溶液もしくは懸濁液である医薬組成物のためには限外濾過が好ましい殺菌方法である。
【００９６】
投与量、投与剤型、投与様式、組成物などの詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版., Alfonso R.Gennaro, 編. (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)などの標準的薬学指導書中で考察されており、これを参照として本明細書に組み入れる。
【００９７】
当技術分野で周知のように、ペプチドの構造および生物学的機能は、温度、pH、酸化および還元剤、凍結、振盪ならびに剪断応力などの化学的および物理的環境条件に対して感受性がある。分解に対するこの固有の感受性のため、薬剤が製造され、パッケージされ、流通され、保存され、調剤されて適格な医師によって投与されるまでの時間、医薬として使用するペプチド化合物の生物学的活性が保持されることを確実にする必要がある。医薬タンパク質を安定化して、その生物学的能力および有効性を保持するために、多くの技術的手法が開発されてきたので、こうした安定化技術を本発明の組成物および方法のペプチド化合物に応用することができる。これらとして、以下のものが含まれる：
a) 凍結乾燥および真空凍結乾燥（本明細書に参照として引用する、Carpenterら、Pharm.Res., 14(8):969(1997)を参照されたい）；
b) ペプチドもしくはタンパク質の水溶液もしくは懸濁液への「安定化剤」の添加。例えば、米国特許第5,096,885号には、ヒト成長ホルモンに、濾過、バイアルへの充填、および冷蔵もしくは真空凍結乾燥の工程中にこのタンパク質を安定化するための手段として、グリシン、マンニトール、pHバッファーおよび非イオン界面活性剤、ポリソルベート80の添加が開示され、米国特許第4,297,344号には、選択されたアミノ酸および炭水化物の添加による、凝固因子IIおよびVIII、抗トロンビンIIIならびにプラスミノーゲンの熱に対する安定化が開示され、米国特許第4,783,441号には、特定のpH範囲内での、界面活性物質の添加による、水溶液中のインスリンなどのタンパク質の界面での変性の防止方法が開示され、そして米国特許第4,812,557号には、ヒト血清アルブミンを使用するインターロイキン-2の安定化方法が開示されている；
c) ペプチド化合物を凍結保護物質と混合して非常に低い温度（例えば-70℃）で凍結保存する、凍結／融解法；
d) 場合によってグリセロールなどの凍結保護性添加剤を含ませた、非凍結冷蔵（例えば4℃未満）；
e) 例えば米国特許第5,098,893号に記載されたような、ガラス化した非晶質状態での保存；
f) 結晶状態での保存；ならびに
g) リポソームまたはその他のミセル中への組み込み。
【００９８】
本発明のその他の態様は、以下の実施例において、さらに理解され、また例示されるであろう。以下の実施例に含まれる特定のパラメーターは本発明およびその各種の様相の実施を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を何らかの意味で限定するために提供するものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１：代表的なペプチド化合物の合成
固相Merrifield合成（Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154(1963)）によって、以下の代表的なペプチド化合物を合成した。
【０１００】
PEP-1：[Ac] Asp Gly Glu Ala（配列番号２）
PEP-2：[Ac] Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）
PEP-3：[Ac] Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
アミノ末端キャッピング基「［Ac]」は表示したペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基のαアミノ基にアシル化によって結合しているアセチル部分を表す（Shashoua and Hesse, Life Sci.58:1347-1357(1996)）。
【０１０１】
これらのペプチドは標準的手法を使用して合成した。簡単に述べると、固相Merrifield工程（Merrifield,R.B., J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154(1963)）を使用して、ペプチド化合物を合成した。この方法で、ポリマー樹脂に結合した特定のアミノ酸配列のペプチドを合成することができる。次に、トリフルオロ酢酸（TFA）での処理によって、新しく合成された各ペプチドを樹脂から遊離させた。生成したトリフルオロ酢酸ペプチド塩を標準的手法にしたがってエーテル沈殿により精製した（E.Groos and Meienhofer,"The peptides, analysis, synthesis, biology, vol.2, (Academic Press, New York 1983)参照）。
【０１０２】
N-末端置換ペプチド（すなわち、アシルアミノ末端キャッピング基を含有するペプチド）については、固相Merrified合成（上記参照）を使用して、ブロックされた側鎖を有するように、各ペプチドを合成した。次に結合したペプチドをアルゴン雰囲気下、4-ジメチルアミノピリジンの存在する中で、当モル量の以下の酸：酢酸、DHAもしくはリポ酸、の１つの無水物で処理した。反応を約3時間実施して、N-末端カップリングを形成させた。ペプチドの単離の前に、完全なN-末端カップリングの確証を得た。これは、標準的手法（E.Kaiserら、Anal.Biochem., 34:595-598(1970)）を使用して、樹脂に結合したペプチドのニンヒドリン染色特性をモニターすることによって、確定した。次にTFAでの処理によって樹脂からN-末端カップリングした（キャップ）ペプチド分子を遊離させ、冷エーテルでの沈殿後、溶離液としてメタノール性HCl（50：50）を使用するHPLCによって、精製した。最終ペプチド製品は凍結乾燥後、白色固体だった。アミノ酸分析、HPLC上での単一ピークとしての泳動、および質量分析による分子量の決定、によって、構造を確認した。大部分の用途のために、ペプチド化合物からTFAを完全に除去することを必須の要件とした。これは、ペプチドを氷酢酸に反復溶解した後、ロータリーエバポレーターによる真空濃縮によって、達成された。TFAの完全な不在は、質量分析によって確定した。
【０１０３】
実施例２：ペプチド化合物 PEP-2 （ [Ac]Asp Gly Glu Ala Leu （配列番号３））による哺乳動物細胞中のスーパーオキシドジスムターゼ（ SOD ）およびカタラーゼ（ CAT ）のアップレギュレーション
100ユニット/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清を補充したDulbecco改変Eagle培地で新生ラット脳皮質細胞を増殖させることによって、皮質初代培養物を取得した。Cornell-Bellら、Science, 247:470-473(1990)およびCell Calcium, 12:185-204(1991)に記載されているように、ラット脳のE21皮質から細胞を単離し、1ｘ105／mlの密度でプレーティングし、そして37℃、空気および5％CO2を含有する雰囲気中で、4〜5日以内に密集化するように増殖させた。培養物を20mlフラスコ中で単層となるように培養し、その後、SODに関する遺伝子のアップレギュレーションに対するPEP-2の影響を研究するために、各種濃度のペプチドに曝露した。ラット脳皮質細胞の培養物を1ng/ml、10ng/ml、および100 ng/mlのペプチド化合物PEP-2とともに5時間インキュベートした。対照培養物はPEP-2を加えずに同じ方法で処理した。
【０１０４】
公表された方法（Adamsら、J.Leukoc.Biol., 62:865-873(1997)）にしたがって、細胞質タンパク質を単離した。20 mM EDTAを含有するリン酸バッファー塩(PBS)溶液で細胞培養物を１回洗浄し、次に用時調製した溶解用バッファー（20 mM Hepes, pH7.9、10 mM KCl、300 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1％ Triton X-100非イオン界面活性剤、20％グリセロール、0.5 mM ジチオトレイトール（DTT）、Adamsら 、J.Biol.Chem., 77:221-233(2000)に記載されたようなインヒビターを用時補充）250μlに懸濁させた。次に、懸濁液を氷上で少なくとも10分間インキュベートして、細胞を溶解させ、その後遠心分離（14,000ｘg、4℃で5分間）して、細胞破砕物をペレット化した。上清の細胞質画分を取り出し、分析のために-80℃でアリコートに分けて保存した。細胞質画分のタンパク質濃度は2〜6μg/μlの範囲で変化した。
【０１０５】
ゲル上で5μg／レーンを使用するSDS-PAGEによって、細胞質タンパク質を分離した。ゲルをウエスタンイムノブロットのために、基本的にAdamsら（General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)）による記載に従って処理し、SODのアップレギュレーションを測定した。SOD発現はウエスタンブロットにおいて抗SODウサギポリクローナル抗体（Rockland, Inc., Gilbertville, PA）を使用して検出した。SODタンパク質のアップレギュレーションを定量するために、さらに、このウエスタンブロットをレーザーデンシトメトリーによっても分析した。これらの実験の対照は、ビヒクル単独（すなわち、ペプチド化合物を含まないバッファー）で処理した同一の培養フラスコとした。結果を下の表２に示す。
【表２】
【０１０６】
ウエスタンブロットは、PEP-2の存在および非存在のもとでインキュベートした培養物からの細胞中に、34kDa（SOD-1の分子量）に移動するバンド、および抗SOD-1抗体により認識される２つのより小さい成分に対応するより低い分子量のバンドと結合する抗体を示した（データは示してない）。しかし、表２に示したように、ラット脳皮質細胞培養物の研究結果は、細胞質中で合成された免疫活性（すなわち、抗SOD抗体活性）タンパク質のレベルは、最低PEP-2濃度（すなわち、1 ng/ml）を用いて処理した細胞中ですら２倍増加した。明らかに、本発明のペプチド化合物は、ラット脳皮質細胞中のSOD-1をアップレギュレートすることができる。
【０１０７】
実施例３： PEP-1 および PEP-3 ペプチド化合物の in vivo 薬理学的活性
Sprague-Dawleyラット（300〜325g）においてペプチド化合物PEP-1およびPEP-3の溶液を用いてin vivo実験を行った。動物の尾静脈に、ペプチド化合物を静脈（iv）注射した。各動物に通常生理食塩水中のペプチド化合物を1.2もしくは2.4mgペプチド化合物/kg体重に等しい全用量にて１回注射を行った。動物を注射後6時間に断頭により動物を屠殺し、解剖して脳および心臓器官を単離し、これらを-70℃で冷凍して後にウエスタンイムノブロットにより分析した。
【０１０８】
各組織を解凍し、10倍量の均質化緩衝液を用いてDown'sホモジェナイザーでホモジェナイズし（Adamsら, General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)を参照されたい；緩衝液はAdamsら, J. Leukoc. Biol., 62:865-875(1967)）に記載されたもの）、粗細胞質画分を得た。Adamsら（J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）に記載されたように、組織ホモジェネートを遠心分離し（14,000×gで4℃にて5分間）、ウエスタンブロット分析用の上清精製細胞質タンパク質画分を得た。次に、10μgの各タンパク質画分のサンプルをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、上記のようにウエスタンブロットアッセイによりSODおよびCAT含有量について分析した。
【０１０９】
SODの非刺激レベルを測定するための対照は、２つのビヒクルのみ（すなわちペプチド化合物なし）を注射し注射後６時間経って屠殺したラットから得た。いずれもほぼ同じ非刺激レベルのSODを有していた。標準的量（10μg）の各細胞質画分をゲルのレーンに載せて電気泳動分離およびウエスタンイムノブロット分析にかけた（Adamsら, J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）。染色したゲルの写真を撮り、レーザーデンシメトリーにより走査して、対照ビヒクル処理ラットの酵素レベルと比べた強度を定量した。
【０１１０】
表３および表４は、それぞれラット脳および心臓におけるSODおよびCATのアップレギュレーションデータを、ペプチド化合物無しのビヒクルのみを注射した対照動物と比較して示す。
【表３】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
表３および４のデータは、ペプチド化合物PEP-1およびPEP-3の2.4 mg/kg体重と等しい用量での投与は、対照と比較して脳にほぼ３倍のSOD産生のアップレギュレーションを、かつ心臓にSOD産生のほぼ２倍のアップレギュレーションをもたらしたことを示す。同じ用量で、CAT産生は脳においてほぼ２倍、そして心臓においてほぼ２〜３倍アップレギュレートされた。
【０１１３】
上記結果は、ペプチド化合物PEP-1およびPEP-3は重要な器官の細胞および組織においてSODおよびCATをin vivoでアップレギュレートする活性を有することを示す。これらの知見は、全生物中の重要な器官のROSおよびフリーラジカルに対する防御を促進する治療用の組成物中に、PEP-1および／またはPEP-3のような化合物を使用する可能性を示す。
【０１１４】
実施例４．「老」 C57BLACK マウスにおける SOD レベルに対する、ペプチド化合物 PEP-1 の in vivo 用量応答効果
本研究は、「老」成熟個体におけるSODレベルに対する、代表的ペプチド化合物PEP-1（実施例１参照）のin vivo用量応答効果を試験することを目的として設計した。
【０１１５】
成熟18月齢老C57BLACKマウス（「老マウス」）を、0.25 mg/kgのPEP-1を用いて胃管強制栄養（gavage）により14日間処理した。動物は次の５処理グループ（1グループ当たり、n＝3）に属した：
グループ１：対照、無処理
グループ２：毎週１回処理
グループ３：毎週２回処理
グループ４：隔日処理
グループ５：毎日処理。
【０１１６】
14日間の終わりに、全ての動物を屠殺し、それらの脳を採集してSODレベルを上記のようにウエスタンイムノブロットにより分析した。SOD標準（「Ｍ」）も、サンプルと並行して試験した。SODレベルをブロットのデンシトメトリーにより定量した。
【０１１７】
図１に棒グラフとして示した結果は、SODレベルは対照グループ動物と比較してPEP-1を用いて毎日（グループ５）または隔日（グループ４）処理した動物において4.5倍以上増加したことを示す。さらに、該ペプチドを用いて毎週２回（グループ３）処理した動物において2.3倍の増加が認められた。
【０１１８】
実施例５ 「老」成熟 C57BLACK マウスにおける SOD に対する、ペプチド化合物 PEP-1 の in vivo 用量応答効果
「老」成熟C57BLACKマウスにおけるSODをアップレギュレートする上での用量応答効果のさらなる試験として、若および老動物を次の処理グループ（n＝3）に区分した：
動物１-３：若、4-月齢マウス、無処理
動物４-６：老、18-月齢マウス、無処理
動物７-９：老、18-月齢マウス、PEP-1の0.33 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
動物10-12：老、18-月齢マウス、PEP-1の3.3 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理。
【０１１９】
30日後に、全動物を屠殺しそれらの脳を採集した。SODレベルをウエスタンイムノブロットにより分析した。SOD標準（「Ｍ」）もサンプルと並んで試験した。SODレベルはイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。
【０１２０】
結果を図２に棒グラフで示した。対照（無処理）若マウス（動物１-３）の脳組織は老マウスに見出されたものの２倍以上のレベルのSODを含有した。本研究の老マウスの脳組織中のSOD発現に対するPEP-1の明確な用量応答効果が観察された。図２のデータは、3.3 mg/kgのPEP-1の経口用量を用いて毎日処理した老マウス（動物10-12）の脳組織中のSOD発現のレベルは、無処理老対象グループ動物（動物４-６）と比較して4.8倍増加することを示した。さらに、0.33 mg/kgのPEP-1の経口用量を用いて毎日処理した動物においてSODレベルの2.9倍増加が認められた。図２に見られるように、SOD関連破砕断片に変化はなかった（「SOD関連」）。
【０１２１】
実施例６ 老 C57BLACK マウスの歩行活性および寿命に対する、 PEP-1 の in vivo 効果
本研究は、代表的ペプチド化合物PEP-1の毎日投与が加齢に関係する自発行動覚醒低下を逆転するin vivo効果を試験することを目的とし、上記効果を「老」成熟個体の歩行活性および寿命に与える影響により測定することとして設計した。本研究において、C57BLACKマウスを次の処理グループ（1グループ当たりn＝10）に区分した：
グループ１：若、4-月齢マウス、無処理
グループ２：老、16-月齢マウス、無処理
グループ３：老、16月齢マウス、PEP-1の0.025 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ４：老、16月齢マウス、PEP-1の0.075 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ５：老、16月齢マウス、PEP-1の0.25 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ６：老、16月齢マウス、PEP-1の0.75 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ７：老、16月齢マウス、PEP-1の2.5 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理。
【０１２２】
70日の処理期間後、無処理若マウス（グループ１）は全て生存した（すなわち、6.5月齢まで）、しかし無処理老マウス（グループ２）の10動物中の３動物は死亡した。またグループ３および４のそれぞれにおいて２動物がこの同じ期間に死亡した。グループ５、６および７においてPEP-1を用いて処理した老マウスは全て70日、すなわち18.5月齢まで生存した（図３参照）。
【０１２３】
用量を課して6週後に、生存動物を標準歩行活性試験で試験し、これを用いて加齢に関係する自発性行動覚醒低下の逆転の確証を検出する試験を行った（Forsterら, 1996；Dubeyら, Arch. Biochem. Biophys., 333:189-197 (1996)）。覚醒レベルはディジスカン（Digiscan）装置（Omnitech, model RXYZCM, Omnitech Electronics, Columbus, Ohio, USA）を用いて測定した。それぞれのマウスを20分間セッションの間、透明アクリル製チャンバー（40.5cm x 40.5cm x 30.5cm）内に置いた。アクリル製チャンバーはフォトセルのアレイを内張りした金属フレーム内に置いた。断熱シートを備えた木製キャビネットがアクリル製チャンバーと金属フレームを囲った。ファンはチャンバー内に80-dbノイズレベルを与えた。水平面内のマウスの運動は光ビームを遮断し、これがコンピューターにより１分間以内の時間サンプルとして自動的に記録された。本研究で使用した基準は、16分間試験セッション全体における1分間当たり平均水平光ビーム遮断数（水平カウント／分）であった。
【０１２４】
用量を課した6週後に、歩行活性試験をブラインドグループ１、２、３、４、５、および６（それぞれ、若の無処理対照、老の無処理対照、老の0.025 mg/kg、0.075 mg/kg、0.25 mg/kg、および0.75 mg/kgのPEP-1を用いて処理した動物）で実施した。結果を図４に示す。若と老の無処理対照グループの間の有意差（p＜0.05）は、加齢に関連する自発性行動覚醒低下の従来の知見を実証した。0.025mg/kg処理動物（グループ３）は老対照と有意差がなくかつ若対照と有意差があった。しかし、0.075〜0.75mg/kgを受けたグループ（グループ４、５、および６）の水平活性は老対照のそれより高く、若対照と有意差がなかった。これらの結果は、0.075〜0.75 mg/kgのPEP-1を用いた処理は６週後の行動覚醒に対して有益な効果を与えたことを示した。
【０１２５】
本研究から得たデータは、PEP-1を用いる処理が老マウスの寿命を増加することを示した。さらに、本データはまた、PEP-1を用いる処理が老動物の歩行行動を有意に改善することも示した。かかる結果は、老いた個体における抗酸化酵素の発現をアップレギュレートすることができる、PEP-1のような本発明のペプチド化合物を用いる治療の有益な抗加齢効果に対する確証を提供する。
【０１２６】
本発明の範囲または特許請求の範囲の精神から逸脱することなく、当業者には、本明細書中に記載された本発明の他のバリエーションおよび実施形態が自明であろう。
【０１２７】
上記に引用した全ての特許、特許出願および刊行物は本明細書中に参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】14日間の様々な投与計画でPEP-1（0.25mg/kg体重のPEP-1、胃管強制栄養）を受けた18月齢C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。
【図２】PEP-1の様々な用量を用いて処理した若（4月齢）および老（18月齢）C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。
【図３】様々な用量のPEP-1を胃管強制栄養により70日間（2.5ヶ月）受けた若（4月齢）および老（16月齢）C57BLACKマウスのグループ（n＝10）における動物のパーセント（％）生存率を描く棒グラフを示す。
【図４】図３に記載した様々な経口用量のPEP-1を用いて処理したC57BLACKマウスに対する歩行運動活性スコア（水平カウント数／分）を描く棒グラフを示す。
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、抗酸化化合物の分野に関し、特に、反応性酸素種およびフリーラジカルの望ましくないレベルを特徴とする、疾病および状態の治療および予防処置に用いられる医薬品および機能性食品の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生物は、正常な代謝活動の過程で、それらの細胞および組織中に有害な反応性酸素種（ROS）や様々なフリーラジカルを発生している（Halliwell, B.およびGutteridge, J.M.C.編、Free Radicals in Biology and Medicine, (Oxford: Clarendon Press, 1989)）。最も反応性が高い、従って、有毒のROSおよびフリーラジカルとして、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、一重項酸素、過酸化水素（H2O2）、過酸化脂質、ペルオキシニトライト、およびヒドロキシルラジカルが挙げられる。細胞中のROSまたはフリーラジカルレベルがわずかに上がるだけでも損傷を与える恐れがある。同様に、細胞外の体液中へのROSまたはフリーラジカルの放出もしくは増加は、周囲の組織を危険にさらし、組織破壊や壊死を引き起こす恐れがある。実際に、スーパーオキシドアニオンよりいくらか反応性が低い過酸化水素は、よく知られた広範なスペクトルの防腐剤化合物である。真核生物において、スーパーオキシドアニオンの主な供給源は、ミトコンドリアに存在する呼吸中の電子伝達系である。スーパーオキシドアニオンの大部分は、還元当量の２つの主な蓄積部位、すなわち、電子伝達機構におけるユビキノンが媒介する段階とNADH脱水素酵素が媒介する段階で発生する。過酸化水素は、小胞体では代謝により、ペルオキシソームでは金属触媒による酸化で、ミトコンドリアでは酸化的リン酸化で、また、キサンチンの細胞質ゾル酸化で、発生する（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答 (Response of Antioxidant System to Physical and Chemical Stress)」, Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章、pp. 125-141, Baskin, S.I.およびH. Salem編（TaylorおよびFrancis、ワシントンD.C.、1997）を参照）。
【０００３】
正常かつ健康な個体では、複数の天然の抗酸化防御系が、様々なROSまたはフリーラジカルを解毒し、これによって、正常な細胞および組織の統合性および機能を保存する。これらの解毒系は、特定の抗酸化酵素の協奏的活性により、ROSまたはフリーラジカルを、毒性が低い化学種へと段階的に変換する。これらの抗酸化酵素は、ROSまたはフリーラジカルを除去および解毒する能力を有する「酸素ラジカルスカベンジャー」もしくは「ラザロイド」として知られる大きいクラスの分子のメンバーである。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、ならびに、βカロチンやレチノイドのような関連する抗酸化化合物もこの大きいクラスのメンバーである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素およびその他のラザロイドが、細胞内および細胞外の両方に存在し、これによって、細胞および組織に対する酸化による深刻な損傷を防ぐのに十分な量のROSおよびフリーラジカルが効率的に除去される。
【０００４】
抗酸化酵素の中でも、最も重要で、研究されているものとして、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）が挙げられる。これらの酵素は、協奏的にROSおよびフリーラジカルを解毒する機能を有する。SODは、実質的にあらゆる酸素呼吸生物に存在し、そこでのその主な機能は、スーパーオキシドアニオンを過酸化水素へと不均化（分解）することである。過酸化水素それ自体も、高度に反応性かつ酸化性の分子であり、これをさらに還元することにより、細胞および組織に対する損傷を防がなければならない。好適な電子受容体（水素供与体）の存在下で、CATは、過酸化水素の水へのさらなる還元を触媒する。還元型グルタチオン（GSH）の存在下で、GSH-Pxも、別の経路により、過酸化水素の水への還元を媒介する。
【０００５】
上記抗酸化酵素の各々は、各種クラスへとさらに細分することができる。金属イオン含有量に基づき、SODの３つの異なるクラス：銅−亜鉛（Cu-Zn）、マンガン（Mn）および鉄（Fe）が存在する。哺乳動物では、Cu-ZnおよびMn SODクラスだけが存在する。哺乳動物の組織は、細胞質ゾルのCu-Zn SOD、ミトコンドリアのMn SOD、およびES-SODと呼ばれるCu-Zn SODを含み、これは、細胞外体液に分泌される。SODは、自然の速度より1000万倍速い速度で、毒性が極めて高いスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒することができる（Somaniら、p.126を参照）。ほぼすべての哺乳動物細胞に存在するが、最高レベルのSOD活性は、高代謝活性を有する数種の主要臓器、すなわち、肝臓、腎臓、心臓および肺に存在する。SODをコードする遺伝子の発現は組織の酸素化と相関し、酸素テンションが高いと、ラットにおけるSOD生合成が高まる（Toyokuni, S., Pathol. Int., 49:91-102（1999））。
【０００６】
CATは、ほぼすべての哺乳動物細胞に存在する可溶性酵素であるが、CATレベルは、組織および細胞内位置に応じて広範に変動し得る。CATは、主として、肝臓および腎臓細胞中のペルオキシソーム（ミクロボディー）、また、その他の組織のミクロペルオキシソームにも存在する。
【０００７】
GSH-Pxには２つの異なるクラス、すなわち、セレン依存性クラスおよびセレン非依存性クラスがある。さらに、GSH-Px種は、膜結合タンパク質および循環血漿タンパク質として、細胞質ゾルに見出すことができる。
【０００８】
様々な重要な疾病および薬物副作用におけるROSおよびフリーラジカルの役割の認識は、近年になってかなり高まっている。多くの研究から、多数の疾状態態や、治療薬の有害な副作用は、個体の抗酸化防御系が、ROSおよび各種フリーラジカルの発生速度に追いつけないことに関連することが明らかにされている（例えば、Chanら、Adv. Neurol., 71:271-279（1996）；DiGuiseppi, J.およびFridovich, I. Crit, Rev, Toxicol., 12:315-342（1984）を参照）。例えば、発作中に虚血により誘発される無酸素状態、または心筋梗塞中に心筋に発生した無酸素状態においては、異常に高いROSレベルが認められている（例えば、Walton, M.ら、Brain Res. Rev., 29:137-168（1999）；Pulsinelli, W.A.ら、Ann. Neurol., 11:499-502（1982）；Lucchesi, B.R., Am. J. Cardiol., 65:141-231（1990）を参照）。加うるに、ROSおよびフリーラジカルの上昇も、腎移植後の再灌流損傷と関連していた。さらに、酸化組織破壊と加齢に関連する脳機能不全との間の相関を示す研究が増加していて、様々な認知および運動機能、および／もしくは加齢とともに酸化により改変されたDNAおよびタンパク質の漸進的増加の加齢関係喪失によって立証されている（例えば、Coyleら, Science, 262:689-695 (1993)；Halliwell, J. Neurochem., 59:1609-1623 (1992)；Sohalら, Free Radical Biol. Med., 10:495-500 (1990)；Sohalら, Mech.Ageing Dev., 76:215-224 (1994)；Ames, Free Radical Res. Commun., 7:121-128 (1989)；およびStadtman, Science, 257 : 1220-1224 (1992)を参照）。従って、ROSおよびフリーラジカルの上昇は、下記を含む様々な疾病、薬物療法、外傷、および変性状態の進行およびその際に現れる合併症と関連している：加齢に伴なう酸化ストレス誘発性損傷、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、変性眼疾患、敗血症性ショック、頭部および脊髄損傷、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ならびに、糖尿病（例えば、Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp. 74-80（1991、４月）を参照）。
【０００９】
加齢過程における酸化損傷の影響を含む、ROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルの有害な影響を下げる一手法は、ラザロイドの摂取を増やしてROSおよびフリーラジカルをスカベンジするかまたは低下させることである。その結果、抗酸化酵素およびその他のラザロイドの市場は、世界規模で10億ドルを超えると見積もられる。当然、治療薬としての各種ラザロイドの研究および開発は極めて競争の激しい分野となった（Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp.74-80(1991年4月)を参照）。また、治療薬としてSODを開発することへの関心も非常に高まってきた。これは、部分的には、承認された抗炎症薬としてのSODのステータスと、SODが非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）市場に浸透する手段を提供し得るという考えによるものである（Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp.74-80(1991年4月)を参照）。
【００１０】
多年にわたる集中的な研究努力にもかかわらず、SODおよびその他のラザロイドの使用は、ROSおよびフリーラジカルの発生により起こる、もしくはこれを特徴とする疾病、障害およびその他の状態に対処する有効な予防または治療手段を提供していない。明らかに、上昇したレベルのROSおよびフリーラジカルの破壊作用を特徴とする疾病および状態を治療する新たな治療薬および方法が依然として求められている。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
ここに記載の本発明は、ROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルの破壊的酸化作用を如何にして中和するかという問題を、例えばスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)などの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）ペプチド化合物を含んでなる組成物を提供して、細胞および組織中のROSとフリーラジカルのレベルの望ましくない上昇を抑制、排除または防止し、かつ構成的な抗酸化酵素の加齢に伴う減少を回復させることにより解決するものである。さらに、本発明のペプチド化合物は、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激するそれらの能力とは無関係に、抗酸化活性を有するものである。本明細書に記載するペプチド化合物の式および配列においては、当技術分野で公知の標準的な三文字または一文字表記を採用する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、次式：
R1 Asp Gly Xaa3 Xaa4 Xaa5 R2（配列番号１）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa3はGluもしくはLeuであり；Xaa4はAlaもしくはGluであり；Xaa5は存在しないか、Leu、もしくはAlaであり；そしてR2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、次のいずれかの式：
R1 Asp Gly Glu Ala R2（配列番号２）、
R1 Asp Gly Glu Ala Leu R2（配列番号３）、
R1 Asp Gly Leu Glu Ala R2（配列番号４）
［式中、R1は存在しないか、該ペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基であり；R2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］の；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明の組成物は、次のいずれかのアミノ酸配列：
Asp Gly Glu Ala（配列番号２）、
Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、
Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
を有し、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００１５】
本発明のペプチド化合物は、配列番号２、３、および４のアミノ酸配列などのペプチド化合物のアミノ酸の「コア配列」のアミノ末端および／またはカルボキシ末端アミノ酸に結合した１以上のさらなるアミノ酸を含有してもよいが、その際、該ペプチド化合物が細胞もしくは組織中の抗酸化酵素活性を増加する抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をさらにアップレギュレートすることを条件とする。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は式：
R1 Xaa1 Xaa2 Asp Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 R2（配列番号５）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa1は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa2は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa5はGluもしくはLeuであり；Xaa6はAlaもしくはGluであり；Xaa7は存在しないか、LeuもしくはAlaであり；Xaa8は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa9は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa10は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；Xaa11は存在しないか、いずれかのアミノ酸であり；そしてR2は存在しないか、該ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００１６】
好ましくは、本発明の組成物はアミノ末端キャッピング基（上記の式でR1と記した）を有する単離されたペプチド化合物を含んでなる。さらに好ましくは、アミノ末端キャッピング基は、リポ酸部分（Lip、還元または酸化された形態）；グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）；1〜6個の天然L-アミノ酸（配列番号６）；式R3-CO-のアシル基（式中、COはカルボニル基であり、R3は炭素数1〜25、好ましくは炭素数1〜22の炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖は飽和または不飽和であってもかつ分枝または非分枝であってもよい）；およびそれらの組合わせからなる群より選択される。アミノ末端キャッピング基がアシル基であるときは、それはアセチルまたは脂肪族アシル基が好ましい。さらにより好ましくは、アミノ末端キャッピング基は、アセチル（酢酸のアシル部分）、パルミトイル（パルミチン酸のアシル部分、Palm）、およびドコサヘキサエノイル（ドコサヘキサエン酸のアシル部分、DHA）からなる群より選択されるアシル基である。さらに別の好ましい実施形態においては、アミノ末端キャッピング基が1〜6個のアミノ酸（配列番号７）であるときは、該アミノ酸はリシン、アルギニン、およびリシンとアルギニンとの組合わせからなる群より選択される。
【００１７】
別の好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、第一級アミンまたは第二級アミンからなる群より選択されるカルボキシ末端キャッピング基（上記の式でR2と記した）を含んでなる単離されたペプチド化合物からなる。
【００１８】
本発明の組成物および方法に有用であるペプチド化合物は、ペプチド化合物の特定の意図する用途に適した、アルカリ金属の塩、アルカリ類金属の塩、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩を含む１以上の様々な塩の形態で調製し使用することができる。
【００１９】
本発明のペプチド化合物を、検出可能な標識として役立つ１以上の他の分子と結合することもできる。かかる標識した化合物は、特に分析または調製方法において方法またはプロトコル中にペプチド化合物を追跡または検出するために有用である。
【００２０】
さらに、特定の用途にとって適当とみなされるその他の化合物が本発明の組成物中に存在してもよい。本発明の組成物中に存在してもよいかかる他の成分としては、限定されることなく、塩、バッファー、還元剤、食品補充物、その他の製薬上の活性化合物、様々な製剤のための１以上の他の製薬上許容される賦形剤もしくは担体、ならびにそれらの組合わせが挙げられる。
【００２１】
さらに本発明は細胞および組織中のROSとフリーラジカルの効力を中和する方法であって、細胞または組織に本発明のペプチド化合物を接触させることを含んでなる上記方法を提供する。本発明の組成物は、ヒトや他の哺乳動物を含めた動物の細胞および組織においてROSとフリーラジカルを解毒する役割を果たす酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）、単離されたペプチド化合物を含んでなる。好ましくは、細胞または組織に本発明のペプチド化合物を接触させることによって、SODとCATの両タンパク質の遺伝子発現がアップレギュレートされる。
【００２２】
細胞および組織のROSおよびフリーラジカルの影響を中和する好ましい方法は、細胞または組織を単離された本発明のペプチド化合物を含んでなる組成物と接触させて、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現を、未処理の細胞または組織と比較して、ROSとフリーラジカルを顕著に解毒するのに十分な高レベルにまで上昇させることを含んでなる。
【００２３】
いろいろな疾病や状態をかかえた患者は、望ましくないROSおよび／またはフリーラジカルレベルを呈することが分かっている。本発明の好ましい実施形態では、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を治療的に用いて体内に含まれるROSとフリーラジカルの効力を無効にしたり、また、かかる組成物を予防的に用いて特定の疾病、状態、薬物療法または障害と関連したROSとフリーラジカルの望ましくないレベル上昇を抑制または防止したりすることができる。詳しくは、本発明は、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSまたはフリーラジカルの毒性レベルを特徴とする疾患または状態を治療または予防する方法を提供し、かかる疾患または状態には、限定するものではないが、加齢による組織変性および／または認知退行（老化）、老衰、遅発性ジスキネジー、大脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、頭部外傷、脳および／または脊髄外傷、再灌流損傷、未熟児の酸素中毒、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、糖尿病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびROSまたはフリーラジカルの上昇を特徴とする他の癌、加齢に関係したROSまたはフリーラジカル上昇、ダウン症、黄斑変性、白内障、精神分裂病、てんかん、敗血症性ショック、多外傷性ショック、熱傷、放射線により誘発されるROSおよびフリーラジカル上昇（UVにより誘発される皮膚損傷を含む）が含まれる。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、本発明は、ここに記載のペプチド化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSとフリーラジカルを発生する薬物療法により引き起こされる副作用を軽減または排除する方法を提供する。多数の薬物が有害な副作用として望ましくないROSやフリーラジカルを上昇させることは知られている。そのような薬物として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、BCNU（カルムスチン）および関連化合物（メチル-BCNUおよびCCNUなど）、神経弛緩薬（クロザピンなど）が挙げられる。そのような治療の補助剤として本発明のペプチド化合物を用いて、こうした有害な副作用を排除したり、その程度を軽減させたりすることができる。したがって、本発明のペプチドは、例えば遅発性ジスキネジーにおけるような神経弛緩薬による治療中に起こる、薬物により誘発されるROSまたはフリーラジカルの上昇を治療または予防するために投与しうる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、ここに記載のペプチド化合物を非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)の代替品または補助剤として使用し、損傷からの痛み、関節炎、およびROSとフリーラジカルがある役割を担っている他の炎症状態を治療することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、単離された本発明のペプチド化合物を製薬上許容されるバッファー中に含んでなる組成物であって、細胞または組織中の有害なレベルのROSまたはフリーラジカルの発生を排除、抑制、または防止するために、特定の疾患がまだ診断されてないかまたは傷害の全内容がまだ完全に理解されていないときであっても、個人に投与することができる上記組成物を提供する。
【００２７】
本発明の組成物中に存在するある特定の単離されたペプチド化合物はまた、細胞内カルシウムイオンを正常レベルに回復する能力も有しうる。かかるペプチド化合物は発作を治療するのに特に有用である。
【００２８】
図面の説明
図１は、14日間の様々な投与計画でPEP-1（0.25mg/kg体重のPEP-1、経口胃管強制栄養（oral gavage））を受けた18月齢C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。マウス脳からの抽出物をウエスタンイムノブロットにより分析し、SOD発現のレベルをイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。グループ１動物は無処理（対照）であり；グループ２はPEP-1を毎週１回投与され；グループ３はPEP-1を毎週２回投与され；グループ４はPEP-1を隔日投与され；グループ５はPEP-1を毎日投与された。データは、対照グループ１のそれと比較して、それぞれの処理グループの動物（n＝3）に対するSODバンド強度として表示した。「Ｍ」は、イムノブロットのサンプルと並走させたSOD標準である。Ｍ、グループ３、およびグループ４データの棒グラフ上方の数字は選択したグループのSODレベルの倍数増加をグループ１と比較して表示する。詳細は本文参照。
【００２９】
図２は、PEP-1の様々な用量を用いて処理した若（4月齢）および老（18月齢）C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。マウス脳からの抽出物をウエスタンイムノブロットにより分析し、SOD発現のレベルはイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。動物１〜３は無処理若マウス；動物４〜６は無処理老マウス（対照）；７〜９は老マウス、毎日PEP-1（0.33mg/kg）処理；動物10〜12は老マウス、毎日PEP-1（3.3mg/kg）処理である。データは、無処理の老動物４〜６のそれと比較して、それぞれの処理グループのそれぞれの動物に対するSODバンド強度として表示した。「Ｍ」は、イムノブロットのサンプルと並走させたSOD標準である。「SOD関連」はSODの破砕断片である。詳細は本文参照。
【００３０】
図３は、様々な用量のPEP-1を経口胃管強制栄養により70日間（2.5ヶ月）受けた若（4月齢）および老（16月齢）C57BLACKマウスのグループ（n＝10）における動物のパーセント（％）生存率を描く棒グラフを示す。グループ１動物は無処理、若マウスであり；グループ２動物は無処理、老マウスであり；グループ３動物は毎日0.025mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ４動物は毎日0.075mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ５動物は毎日0.25mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ６動物は毎日0.75mg/kgのPEP-1の用量を受け；グループ７動物は毎日2.5mg/kgのPEP-1の用量を受けた。詳細は本文参照。
【００３１】
図４は、図３に記載した様々な経口用量のPEP-1を用いて処理したC57BLACKマウスに対する歩行運動活性スコア（水平カウント数／分）を描く棒グラフを示す。星印（＊）は対照若マウスと比較してP＜0.05（ANOVAによるstudent Ｔ検定）である。詳細は本文参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
詳細な説明
本発明は、反応性酸素種（ROS）およびフリーラジカルを解毒する細胞および組織中の抗酸化防御機構の主成分である酵素、すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）の相補的対をコードする一方または両方の遺伝子の発現を増強するペプチド化合物の発見に基づくものである。ROSおよびフリーラジカルは、電子伝達および正常な呼吸、ならびに各種薬物の代謝のようなその他の代謝過程中に発生するので、速やかに解毒して細胞および組織に対する永続的かつ連続的損傷を防止しなければならない。さらに、加齢過程（老化）を含む多くの疾病または状態は、ROSおよび／またはフリーラジカルが、実際に、細胞または組織を損なう毒性レベルへの増加を特徴とする。従って、本発明に記載したペプチド化合物は、個体における有害レベルのROSおよびフリーラジカルの発生を中和する有用な治療および予防用化合物である。
【００３３】
本発明をさらによく理解できるように、下記のように用語を定義する。
【００３４】
略語：本明細書に記載するアミノ酸残基は、当業者には公知の一般的な三文字または一文字表記によって略記する（例えば、Lehninger, A.L., Biochemistry, 第２版（Worth Publishers, Inc., ニューヨーク、1975）、p.72を参照）。本明細書で用いられるその他の略語として下記のものが挙げられる：ドコサヘキサエン酸部分のアシル型を意味する「DHA」；リポ酸部分のアシル型を意味する「Lip」；パルミチン酸部分のアシル型（すなわち、パルミトリル基）を意味する「Palm」；酢酸のアシル型を意味する「Ac」；グルコース-3-O-グリコール酸部分を意味する「Gga」；スーパーオキシドジスムターゼを意味する「SOD」；カタラーゼ（抗酸化酵素）を意味する「CAT」；グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを意味する「GAPDH」；および反応性酸素種を意味する「ROS」。これ以外にも、本文中必要に応じて他の略語を示す場合がある。
【００３５】
「炭化水素」とは、分枝もしくは非分枝、および飽和または不飽和の炭化水素鎖のいずれも意味する。本明細書に記載するペプチド化合物のいくつかに存在する好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜25を有する。さらに好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜22を有する。
【００３６】
本明細書で理解され、用いられる「反応性酸素種」、すなわち「ROS」は、呼吸中の正常な電子伝達系の過程で発生する、あるいは、疾病において、または特定の障害に対する所定治療薬による治療中に発生する、高度に反応性の酸素化合物である。ROSとしては、限定するものではないが、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、過酸化水素（H2O2）、一重項酸素、過酸化脂質、およびペルオキシニトライトが挙げられる。ROSは分子、細胞、および組織に酸化損傷を起こすことができる。
【００３７】
本明細書で理解され、用いられる「フリーラジカル」は、奇数の（対になっていない）電子を有するあらゆる原子または分子または化合物を意味する。この定義によると、スーパーオキシドアニオンもまた、負に荷電したフリーラジカルと考えられる。本発明で特に関心のあるフリーラジカルは、高反応性で高酸化性の分子であり、このような分子は、正常な代謝中に、疾病状態で、もしくは化学治療薬による治療中に形成または発生する。このようなフリーラジカルは、高度に反応性で、分子、細胞および組織に酸化的損傷を起こすことができる。スーパーオキシドアニオン以外に、最も一般的で、破壊能力のあるタイプのフリーラジカルは、ヒドロキシルラジカルである。典型的には、スーパーオキシドアニオンまたは一重項酸素などのROSの発生により、１以上の他の有害なフリーラジカルも生じる。従って、本明細書で理解され、用いられる「ROSおよびフリーラジカル」または「ROSおよびその他のフリーラジカル」のような用語は、特に細胞および組織の代謝状態で発生する可能性がある、高反応性で酸化性の分子種もしくは化合物の全集団のいずれかまたは全部を包含するものとする（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答（Response of Antioxidant System To Physical and Chemical Stress）」 Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章：125-141（TaylorおよびFrancis, ワシントンD.C.、1997）を参照）。
【００３８】
「酸素ラジカルスカベンジャー」または「ラザロイド(lazaroid)」は、ROSおよびフリーラジカルを除去および解毒する能力を有するクラスの化合物である。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、およびβカロテンやレチノイドのような関連する抗酸化化合物は、SODおよびCATなどの抗酸化酵素のように、この大きなクラスの化合物のメンバーである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素および他のラザロイドが細胞内および細胞外の両方に存在するため、十分な量のROSおよびフリーラジカルを効率的に除去し、細胞および組織に対する深刻な酸化的損傷を防ぐことができる。
【００３９】
本明細書で理解され、用いられる「ペプチド化合物」は、ペプチド結合により結合された少なくとも４個のアミノ酸を含有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする本明細書に記載のあらゆる化合物を意味する。「ペプチド化合物」は、典型的には、約20個より少ない、好ましくは12個より少ないアミノ酸を含む非修飾または非誘導体化ペプチドを含む。本発明のペプチド化合物は、該ペプチドのアミノ末端アミノ酸残基、カルボキシ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に、好ましくは共有結合で結合したアミノ酸以外の１以上の化学的部分を含有するように修飾された本発明の「誘導体」または「誘導体化ペプチド化合物」を含む。かかる修飾は、限定されるものでないが、保存アミノ酸置換、ペプチドの反応性部分への保護もしくはキャッピング基の付加、検出可能な標識の付加、および該ペプチド化合物の活性（すなわち、細胞もしくは組織内の抗酸化活性を増強するSODおよび／もしくはCATなどの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする能力）を破壊して害わないその他の変化を含む。
【００４０】
本発明に記載するペプチド化合物の「アミノ末端キャッピング基」は、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基に共有結合で結合したもしくはコンジュゲートしたあらゆる化学的化合物または化学的部分である。アミノ末端キャッピング基は、分子内環化または分子間重合を阻害または防止するため、血液−脳関門を介したペプチド化合物の輸送を促進するため、アミノ酸末端を他の分子との望ましくない反応から保護するため、さらなる抗酸化活性を与えるため、またはこれらの特性の組合わせを与えるために有用である。アミノ末端キャッピング基を有する本発明のペプチド化合物は、非キャップ付加ペプチドと比較して、その他の有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用などを有しうる。例えば、本明細書に記載するペプチド化合物に用いられるアミノ末端キャッピング基のいくつかはまた、その遊離状態で抗酸化活性も有しうる（例えば、リポ酸、「Lip」、はROSおよびフリーラジカルの公知のスカベンジャーである）、従って、非キャップ付加形態のペプチドにより与えられる抗酸化活性を改良または増強することができる。本発明によるペプチド化合物および組成物を調製する上で有用なアミノ末端キャッピング基の例として、限定されるものでないが、１〜６個の天然のL-アミノ酸残基（配列番号６）、好ましくは１〜６個のリシン残基（配列番号７）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号７）、もしくはリシンとアルギニン残基の組合わせ（配列番号７）；ウレタン、尿素化合物、リポ酸（Lip）；グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）；またはペプチドのアミノ末端アミノ酸残基に共有結合されたアシル基が挙げられ、ここで本発明の組成物に有用なこのようなアシル基はカルボニル基および炭素数１（例えばアセチル部分）から炭素数25まで（例えば、パルミトイル基「Palm」（16：0）およびドコサヘキサエノイル「DHA」（C22:6-3））の炭化水素鎖を有するものであってもよい。さらに、上記アシル基の炭素鎖は、パルミチン酸のように飽和していてもよいし、DHAのように不飽和であってもよい。ドコサヘキサエン酸、パルミチン酸、またはリポ酸などの酸をアミノ末端キャッピング基として記載する場合、得られるペプチド化合物は非キャップ付加ペプチドと酸との縮合生成物であると理解される。
【００４１】
本発明に記載するペプチド化合物の「カルボキシ末端キャッピング基」は、ペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸残基に共有結合で結合したあらゆる化学的化合物または部分である。カルボキシ末端キャッピング基の主な目的は、分子内環化または分子間重合を阻害または防止すること、血液−脳関門を介したペプチド化合物の輸送を促進すること、および、これら特性の組合せを提供することである。カルボキシ末端キャッピング基を有する本発明のペプチド化合物はまた、非キャップ付加ペプチドと比較して、有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用、増強された親水性、増強された疎水性、または増強された抗酸化活性（例えば、カルボキシ末端キャッピング基が、１個以上のスルフヒドリル基のようなそれ自身の還元力源を有する場合には）などを有しうる。本明細書に記載するペプチド化合物において特に有用なカルボキシ末端キャッピング基としては、アミド結合により、ペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基と結合した第一級または第二級アミンが挙げられる。本発明で有用な他のカルボキシ末端キャッピング基は、本明細書に記載するペプチド化合物のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボン酸基と結合してエステルを形成する、炭素数1〜26の脂肪族第一級または第二級アルコールおよびフラボノイドを含む芳香族フェノール誘導体を含む。
【００４２】
「有効量」は所望の効果を生じるために必要な化合物の量を意味する。本発明のペプチド化合物の有効量は、抗酸化酵素、例えば、SODおよび／またはCATをコードする１以上の遺伝子の発現をアップレギュレートするために細胞、組織、または個体に投与しなければならないペプチド化合物の量である。
【００４３】
本明細書に用いられかつ理解される「単離されたペプチド化合物」は、本明細書に記載されかつ自然状態では存在しないペプチドを含んでなるペプチド化合物を意味し、例えば、ある単離されたペプチド化合物はさらに大きい天然分子の部分として、生物学的源（例えば、細胞、組織、ウイルス）の自然成分として、または生物学的源からの未分画抽出物中に存在しない。従って、単離された本発明のペプチド化合物は、天然タンパク質の精製された、非天然断片であってもよいし、または完全に合成されたすなわち自然では見出されずペプチド合成方法を用いてのみ生産されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００４４】
「医薬（Pharmaceutical）」、「医薬的活性化合物（pharmaceutically active compound）」、および「医薬品（pharmaceutical drug）」は同義であり、ヒトおよび／または他の動物（すなわち、獣医学において）の疾患または状態を治療するために使用しうるあらゆる組成物または化合物を意味する。かかる公知の医薬活性化合物のグループとしては、限定されるものでないが、向精神薬化合物（気分更新薬）、抗癌化合物、抗生物質、抗潰瘍薬、抗ウイルス薬、免疫刺激化合物、免疫抑制化合物、および抗アテローム性化合物が挙げられる。
【００４５】
本明細書で理解され、用いられる「放射線」とは、あらゆるタイプの伝播または放出エネルギー波、もしくはエネルギーを加えた粒子を意味し、電磁放射線、紫外線（UV）、ならびに、直射日光誘導放射線および放射能性放射線が含まれる。このような放射線の作用は、皮膚の表面または下層に影響を及ぼすか、身体の遠位部位に全身的損傷を生じる恐れがある。
【００４６】
本明細書で理解され、用いられる「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は、一般的に細胞または組織中の遺伝子産物の発現レベルの増加を意味する。本明細書では遺伝子発現の増加を、遺伝子産物、例えば転写物またはタンパク質の発現のより高いレベルと関係付けて検出するので、用語「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は適宜、遺伝子産物の発現レベルの増加を記載するのにも適用することができる。本明細書に記載するペプチド化合物は、該ペプチド化合物で処理（接触）してない細胞または組織に通常存在するレベルを超えて、酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）および／またはカタラーゼ（CAT）をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。従って、SODまたはCAT mRNA転写物のレベル；SODまたはCAT遺伝子産物（タンパク質）合成；SODまたはCAT酵素活性のレベルの増加は、抗酸化酵素をコードする遺伝子発現のアップレギュレーションを示す。SODまたはCAT遺伝子の発現は様々な方法により検出することができ、限定されるものでないが、SODおよび／もしくはCATをコードするmRNA転写物を検出するノーザンブロッティング、遺伝子産物、すなわちSODおよび／もしくはCATタンパク質を検出するウエスタンイムノブロッティング、またはSODもしくはCAT酵素活性の標準的アッセイが含まれる。
【００４７】
その他の用語は、以下の説明で用いるうちに、明らかになるであろう。
【００４８】
ペプチド化合物および組成物
本発明は、真核細胞において、SODおよび／またはCAT遺伝子発現をアップレギュレートする組成物および／または方法で使用するための本明細書に記載の単離されたペプチド化合物を提供する。細胞または組織中のSODおよび／またはCATのレベルをアップレギュレートすると、解毒系が増強され、これによって、ROSおよびフリーラジカルの有害な酸化活性が防止、低減、または排除される。本発明の好ましいペプチドおよびペプチド化合物は、SODおよびCATの両方をアップレギュレートする。
【００４９】
本発明は、式：R1 Asp Gly Xaa3 Xaa4 Xaa5 R2（配列番号１）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa3はGluまたはLeuであり；Xaa4はAlaまたはGluであり；Xaa5は存在しないか、LeuまたはAlaであり；そしてR2は存在しないかまたはペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は次式：
R1 Asp Gly Glu Ala R2（配列番号２）、
R1 Asp Gly Glu Ala Leu R2（配列番号３）、
R1 Asp Gly Leu Glu Ala R2（配列番号４）
［式中、R1は存在しないか、ペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基であり、そしてR2は存在しないか、ペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］のいずれかを有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするあらゆる単離されたペプチド化合物を含んでなる。
【００５０】
さらに一般的に、本発明は、次のアミノ酸「コア配列」：
Asp Gly Glu Ala（配列番号２）、
Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、
Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
のいずれかを有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするあらゆる単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。本質的にコア配列を含んでなるかまたはコア配列からなるペプチドは、細胞または組織中の抗酸化酵素活性を増加する各種の組成物および方法に使用してROSおよびフリーラジカルの有害な効果を中和することができる。本発明の組成物および方法に使用される本発明のペプチド化合物は、該ペプチド化合物が細胞または組織中の抗酸化酵素活性を増加する抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をなおアップレギュレートするのであれば、アミノ酸の「コア配列」（例えば、上記配列番号２、３、および４のアミノ酸配列）のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合した１以上のさらなるアミノ酸を含有してもよいと理解される。例えば、本発明の好ましい実施形態は、式：
R1 Xaa1 Xaa2 Asp Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 R2（配列番号５）
［式中、R1は存在しないかアミノ末端キャッピング基であり；Xaa1は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa2は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa5はGluまたはLeuであり；Xaa6はAlaまたはGluであり；Xaa7は存在しないかLeuまたはAlaであり；Xaa8は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa9は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa10は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa11は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；R2は存在しないかペプチド化合物のカルボキシ末端キャッピング基である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００５１】
本明細書に記載の単離されたペプチド化合物は、長さで好ましくは約20個より少なく、そして優先度の高い順に、約12、11、10、9、8、7、または6個より少ないアミノ酸であり、細胞または組織中のSODおよび／またはCATの遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
【００５２】
細胞または組織中の抗酸化活性は、in vitro、例えば組織培養中で標準的方法により、または個体から得た組織もしくは細胞サンプルの分析により測定することができる。増加した抗酸化活性を検出する方法としては、限定されるものでないが、SODまたはCAT酵素活性アッセイ；SODおよび／またはCAT産生のイムノブロット（例えば、ウエスタンブロット、ELISA）；およびSODおよび／またはCAT遺伝子のmRNA転写物のレベルを検出するノーザンブロットが挙げられる。
【００５３】
特に好ましい本発明のペプチド化合物は、低濃度で、すなわち１ミリリットル（ml）当たりナノグラム（ng）以下の範囲のペプチドで、アップレギュレーション活性を示す。このような高い能力は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）またはヒト成長ホルモンなどの各種ホルモンにより示されるものと類似している。従って、本明細書に記載するペプチド化合物は、公知の治療ホルモンペプチドの調製、保存および投与にすでに適用されている利用可能な技法の多くを用いて、調製、保存および使用することができる。
【００５４】
本明細書に記載するペプチド化合物は、該ペプチドの所望の活性を破壊しないような追加の修飾、例えば、アミノ末端またはおよび／またはカルボキシ末端アミノ酸残基での化学的成分の付加、保存的アミノ酸置換、あるいは、ペプチドの内部アミノ酸残基の側鎖の修飾などを実施したペプチドを含んでいてもよい。本明細書に記載するペプチドの分子内環化および分子間重合は、ペプチドの活性を不活性化もしくは低下させる傾向があり、その結果、ペプチドがSOD、またはCATを効果的にアップレギュレートすることができなくなることが認められている。従って、最も有用なペプチド化合物は、他のペプチド化合物分子との環化反応または望ましくない重合またはコンジュゲート形成を最も起こしにくいものである。本明細書に記載のペプチド化合物がSODおよび／またはCATの発現をアップレギュレートする能力を維持もしくは増強する以外にも、いくつかの修飾はさらに便益をもたらしうる。例えば、アミノ末端キャッピング基は血液−脳関門（BBB）を介したペプチドの輸送を促進すると考えられる（例えば、PCT国際公開WO99/26620を参照）。この特性は、ペプチド化合物を用いて脳組織および中枢神経系部分におけるSODおよびCATをアップレギュレートする際、特に重要である。血液−脳関門（BBB）を介した輸送を促進するアミノ末端キャッピング基はまた、それらが結合するペプチド化合物の環化を防止したり、あるいは、他のペプチド化合物との重合を防止したりすることができる。
【００５５】
好ましいアミノ末端キャッピング基として、リポ酸部分があり、これは、アミド結合により、ペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。遊離形態のリポ酸（Lip）は独立した抗酸化活性を有し、アミノ末端キャッピング基として用いると、本発明のペプチドの抗酸化活性を増強することができる。アミノ末端に結合したリポ酸部分は、２個のスルフヒドリル基を含む還元形態か、あるいは、スルフヒドリル基が酸化されて分子内ジスルフィド結合、従って、複素環構造を形成する酸化形態をしていると考えられる。上記以外に、本発明のペプチド化合物を調製するのに有用なアミノ末端キャッピング基は、グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）であり、これは、アミド結合で、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。また、グルコース部分は、グルコース部分の１個以上のヒドロキシル基を置換するアルコキシ基のような修飾をさらに含んでもよい。
【００５６】
本明細書に記載するペプチド化合物に有用なアミノ末端キャッピング基の別の例は、アシル基であり、これは、アミド結合で、ペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基のαアミノ基と結合させることができる。アシル基は、長さが炭素数１〜25で、飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の、分枝または非分枝炭化水素鎖、さらに好ましくは、アシル基の炭化水素鎖は、DHAと同様に、長さが炭素数１〜22である。アシル基は、アセチルまたは脂肪酸であるのが好ましい。アシルアミノ末端キャッピング基として用いられる脂肪酸は、飽和または不飽和で、分枝または非分枝いずれかの炭化水素鎖を含んでいてよい。好ましくは、炭化水素鎖は、長さが炭素数１〜25であり、さらに好ましくは、炭化水素鎖は、長さが炭素数１〜22である。例えば、本発明のペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基として有用な脂肪酸には、限定するものではないが、下記のものがある：カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）。本明細書に記載するペプチド化合物のアシルアミノ末端キャッピング基として用いられる特に好ましい脂肪酸は、パルミチン酸（Palm）とドコサヘキサエン酸（DHA）である。DHAおよびその他の各種脂肪酸部分は、それらが血液−脳関門を介してそれらの結合分子の輸送を促進することがわかっている（例えば、PCT国際公開WO99/40112およびPCT国際公開WO99/26620を参照）。従って、本明細書に記載するペプチド化合物を投与することにより、脳組織および／または中枢神経系のその他の部分におけるROSおよびフリーラジカルの酸化作用を阻止する場合には、このような脂肪族アシル部分が特に好ましい。
【００５７】
さらに、場合によっては、アミノ末端キャッピング基はリシン残基またはポリリシンペプチドでもよく、その際、ポリリシンペプチドは、２、３、４、５または６個のリシン残基からなってペプチド化合物の環化、架橋、もしくは重合を防止できることが好ましい。また、これより長いポリリシンペプチドを用いてもよい。本明細書に記載するペプチド化合物に用いることができる別のアミノ末端キャッピング基は、アルギニン残基またはポリアルギニンペプチドであり、その際、該ポリアルギニンペプチドは、２、３、４、５または６個のアルギニン残基からなるのが好ましいが、これより長いポリアルギニンペプチドを用いることもできる。また、本明細書に記載するペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基は、リシンおよびアルギニンの両方を含むペプチドでもよく、その際、該リシンおよびアルギニン含有ペプチドは、両アミノ酸の２、３、４、５または６残基の組合せ（どんな順序でもよい）からなるのが好ましいが、これより長いリシンおよびアルギニン含有ペプチドを用いることもできる。本明細書に記載するペプチド化合物においてアミノ末端キャッピング基として用いられるリシンおよびアルギニン含有ペプチドは、ペプチド化合物の合成に用いられるあらゆる工程に好都合に組み込むことができ、これによって、アミノ末端キャッピング基を含む誘導体化ペプチド化合物が得られる。
【００５８】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物は、カルボキシ末端キャッピング基を含むことができる。この基の主な目的は、分子内環化の防止、あるいは、分子間架橋または重合の不活性化である。しかし、上記のように、カルボキシ末端キャッピング基は、これに加えて、効力の増強、副作用の低減、抗酸化活性の増強、および／または望ましい生化学的特性などの便益をペプチド化合物にさらに賦与することができる。このような有用なカルボキシ末端キャッピング基の例として、カルボキシ末端アミノ酸残基とのアミド結合による第一級または第二級アミンがある。標準的なアミド化反応化学を用いて、このようなアミンをペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基に付加することもできる。
【００５９】
本明細書に記載するペプチド化合物の環化、架橋または重合は、ペプチド化合物の活性を全部破壊するか、本発明の治療または予防用組成物および方法で使用できなくなる程度にまで破壊する恐れがある。
【００６０】
さらに、本発明に記載するペプチド化合物は、１個以上のL-アミノ酸残基の代わりに、１個以上のD-アミノ酸残基を含んでもよい。ただし、その際、１個以上のD-アミノ酸残基の組込みが、ペプチド化合物の活性を全部もしくは、本発明の治療または予防用組成物および方法で使用できなくなる程度にまで破壊しないことを条件とする。L-アミノ酸の代わりにD-アミノ酸を組み込むと、特にin vivoで、ペプチド化合物にさらに安定性を賦与することができ、有利である。
【００６１】
ペプチド化合物は、標準的方法を用いて調製することもできるし、市販のものから入手することもできる。本発明のペプチド化合物のペプチドの直接合成は、固相ペプチド合成、液相合成などの通常の技法を用いて達成することができる。ペプチドはまた、各種組換え核酸技術を用いて合成してもよいが、ペプチドの比較的小さいサイズと直接ペプチド合成技術の現状を考慮すると、直接合成が好ましく、固相ペプチド合成が最も好ましい。固相合成では、例えば、適切に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を介して、誘導体化された不溶性ポリマー支持体（架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂など）に結合させる。「適切に保護された」とは、アミノ酸のαアミノ基と側鎖官能基の両方に保護基が存在することを意味する。側鎖保護基は、全合成工程を通じて用いられる溶剤、試薬、および反応条件に対して一般に安定であり、最終ペプチド生成物に影響を与えない条件下で除去できるものである。ポリペプチドの段階的合成は、初期（すなわち、カルボキシ末端）アミノ酸からＮ保護基を除去し、そこに、ポリペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル基を結合することにより実施される。このアミノ酸も適切に保護する。反応性の基、例えば、カルボジイミド、対称酸無水物を形成させるか、あるいは、ヒドロキシベンゾトリアゾールやペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基を形成させることにより、導入するアミノ酸のカルボキシル基を活性化し、結合したアミノ酸のＮ末端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法として、BOC法（αアミノ保護基としてtert-ブチルオキシカルボニルを用いる）と、FMOC（9-フルオレニルメトキシカルボニルを用いて、アミノ酸残基のαアミノを保護する）とが挙げられ、両方法とも、当業者にはよく知られている（Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis（W.H. Freeman Co.、サンフランシスコ、1989）；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154（1963）；BodanszkyおよびBodanszky, The Practice of Peptide Synthesis（Springer-Verlag、ニューヨーク、1984）；いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ末端およびカルボキシ末端キャッピング基は、もし所望であれば、キャッピング基として用いる具体的な部分に依存してペプチド合成中にまたは合成後に加えてもよい。例えば、もしキャッピング基が１以上のアミノ酸であれば、そのような残基をペプチドを合成するプロトコル中に簡単に組込むことができる。もしキャッピング基がアシルもしくはアミドのように、アミノ酸でなければ、ペプチド合成後に、標準の縮合またはコンジュゲーションの方法を用いて加えてもよい。
【００６２】
本発明に従うペプチド化合物は、ペプチド合成のサービスを提供する会社（例えば、BACHEM Bioscience, Inc.、ペンシルバニア州キングオブプルシア；AnaSpec, Inc.、カリフォルニア州サンホセ）に商業的に製造させてもよい。また、Perkin-Elmer Applied Biosystemsが製造しているような、自動ペプチド合成機も利用可能である。
【００６３】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物は、塩形態で調製して使用することも可能である。典型的には、ペプチド化合物の塩形態は、特定のpHでペプチド化合物の実効イオン電荷に対する対イオンとして働く１個以上のイオンの存在下で、酸または塩基によりペプチド化合物を含む組成物のpHを調節することによって存在するだろう。本明細書に記載するペプチド化合物の様々な塩形態は、当業者には公知の各種方法、例えば、各種イオン交換クロマトグラフィー方法を用いて、形成または相互交換することができる。本明細書に記載する組成物に用いることができるカチオン性対イオンとして、限定するものではないが、アンモニウムイオンのようなアミン；金属イオン、特にアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム、バリウム）、遷移金属（例えば、鉄、マンガン、亜鉛、カドミウム、モリブデン）、その他の金属（例えば、アルミニウム）の１価、または２価イオン；ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載する組成物に用いることができるアニオン性対イオンとしては、限定するものではないが、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、硫酸、炭酸、クエン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、グルタル酸、ケトグルタル酸の各イオン、ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載するペプチド化合物のトリフルオロ酢酸塩は、典型的には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてトリフルオロ酢酸バッファーで精製する際に形成される。一般にin vivo用途には適していないが、本明細書に記載するペプチド化合物のトリフルオロ酢酸塩形態は、目的とするペプチド化合物の活性または効力を試験するのに実施される各種in vitro細胞培養実験またはアッセイにおいて好適に用いることができる。次に、ペプチド化合物を、トリフルオロ酢酸塩から、医薬品または食物補助剤（機能性食品）組成物に許容できる塩形態に変換する（例えば、イオン交換法により）か、あるいは、そのような塩形態として合成することができる。
【００６４】
産生または合成した後に、本発明の組成物および方法に有用であるペプチド化合物を当技術分野で知られる方法を用いて精製することができる。そのような精製は、有意なまたは検出可能な量の望ましくない副反応生成物；ペプチド化合物を修飾するために用いられた非結合または非反応部分を分離し；そして他の望ましくない分子、例えば、限定されるものでないが、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物などを分離した状態で、本発明のペプチド化合物を提供しなければならない。ペプチド精製の標準方法を利用して、単離された本発明のペプチド化合物を得ることができ、そのような方法としては、限定されるものでないが、各種の高圧（または高性能）液クロマトグラフィ（HPLC）および非HPLCペプチド単離プロトコル、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、相分離法、電気泳動分離、沈降法、塩溶／塩析法、イムノクロマトグラフィ、ならびに／またはその他の方法が挙げられる。
【００６５】
本発明の組成物および方法に有用なペプチド化合物を単離する特に好ましい方法は、例えば、C4-、C8-またはC18-シリカのようなアルキル化シリカカラムを用いる逆相HPLCを使用する。一般的には有機含量が増加する勾配移動相、例えば通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性バッファー中のアセトニトリルを用いて精製を行う。イオン交換クロマトグラフィーを用いて、電荷に基づいてペプチド化合物を分離することもできる。ペプチド化合物の純度は、様々な方法、例えば、HPLC上の主要ピークの同定などにより、決定することができる。HPLCカラム上で投入材料の95％以上に当たる単一ピークを得るペプチド化合物が好ましい。さらには、HPLCカラム上で投入材料の97％以上、98％以上、99％以上、あるいは、99.5％である単一ピークを得るペプチド化合物がより好ましい。
【００６６】
上記技法のいずれかを用いて、得られるペプチド化合物が、本発明の組成物および方法で用いる所望のペプチド化合物であることを確実にするために、当業者には公知の各種分析方法のいずれかを用いて、ペプチド化合物の組成の分析を実施する。このような組成分析は、高分解質量分析法を用いて実施することにより、ペプチドの分子量を決定することができる。あるいは、水性酸中でペプチドを加水分解した後、HPLCまたはアミノ酸分析装置を用いて、混合物の成分を分離、同定および定量化することにより、ペプチドのアミノ酸含有量を確認することも可能である。また、ペプチドを連続的に分解し、アミノ酸を順に同定するタンパク質シークエネーターを用いて、ペプチドの配列を決定してもよい。一部のペプチド化合物はアミノおよび／またはカルボキシ末端キャッピング基を含むことから、配列分析の前にキャッピング基またはキャップ付加アミノ酸残基を除去しなければならない場合もある。また、薄層クロマトグラフィー法を用いて、所望のペプチド化合物の１個以上の構成成分基または残基の真正を証明してもよい。ペプチド化合物の純度はまた、ペプチド化合物をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した後に、ゲル中の分離したタンパク質成分を染色して検出することにより検定することもできる。
【００６７】
本明細書に記載した様々なペプチド化合物は、本発明の組成物および方法において、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートし、これにより、抗酸化活性を発生させて、例えば、加齢の過程（老化）、疾病および各種薬物治療で生じるようなROSおよびフリーラジカルの望ましくない破壊的酸化活性を阻止するのに有用である。
【００６８】
アミノおよび／またはカルボキシ末端キャッピング基を除外した好ましいペプチド化合物（すなわち、「コア配列」）は、長さが20個のアミノ酸より小さく、さらに好ましくは12アミノ酸より小さい。なお、さらに好ましいこのようなコア配列は、長さが11、10、９、８、７、またはさらに６個のアミノ酸より少ない。最も好ましくは、本発明の組成物および方法において有用な単離されたペプチド化合物は長さが４または５個のアミノ酸のコア配列、例えばAsp Gly Glu Ala（配列番号２）、Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）、およびAsp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸コア配列を有する。本明細書に記載のあらゆるアミノ末端および／またはカルボキシ末端キャッピング基をこのような好ましいペプチド化合物に付加することができるが、その際、キャッピング基が細胞または組織中のSODおよび／またはCAT酵素の発現をアップレギュレートする能力を破壊しないこと、およびキャッピング基が該ペプチド中の他の基と反応して有意または有毒な量の望ましくない環化または重合を起こさないことを条件とする。
【００６９】
生物学的および生化学的活性
本発明の組成物および方法で有用なペプチド化合物は、細胞および／または組織、特に哺乳動物細胞において、SODおよび／またはCATをアップレギュレートする能力を有するが、その際、上記細胞は、SODおよび／またはCAT酵素タンパク質をコードする少なくとも１つの機能的遺伝子を含むものとする。機能的遺伝子は、特定の酵素をコードするだけでなく、コード配列内外の必要な遺伝情報を提供し、これにより、遺伝子の転写が起こり、mRNA転写物が機能性遺伝子産物、例えばこの場合は、抗酸化酵素に翻訳されうる。
【００７０】
本明細書に記載したある特定の好ましいペプチド化合物は、SODおよびCATの両酵素の機能的遺伝子が目的とする細胞内に存在するときに、両酵素をアップレギュレートすることができる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーションにより、望ましくないROSおよびフリーラジカルを解毒する効力を増強することができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、SODアップレギュレーションの結果、SODタンパク質のレベルが増加するときに、CATレベルにも増加があると、優れた抗酸化効力が達成されると考えられる。CAT遺伝子のアップレギュレーションにより、増強したSOD活性により発生し得る更なる過酸化水素およびその他のROSまたはフリーラジカルを中和および解毒する能力が高くなる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載されたペプチド化合物は、細胞および組織に、ROSおよびフリーラジカルを解毒する増強された抗酸化酵素活性の完全な相補体を提供する。例えば、組織培養中の哺乳動物細胞に、SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載されたペプチド化合物を接触させると、典型的には、イムノブロッティングにより検出し、未処理細胞と比較して、SODおよびCAT mRNA転写物のレベルが少なくとも約２倍（さらに増加するほど好ましく、少なくとも約３倍、４倍、および６〜８倍）増加するとともに、SODおよびCATタンパク質のレベルが約２倍（さらに増加するほど好ましく、少なくとも約３倍、４倍、６倍、８倍、10倍、および12〜14倍）増加する。このようなSODおよびCAT遺伝子発現の増加により、有害な副作用を伴なうことなく、ROSおよびフリーラジカルの解毒能力が有意に増強された細胞が提供される。
【００７１】
SODおよびCATをコードする遺伝子の発現は、様々な方法により測定することができる。標準的酵素アッセイを用いて、細胞または組織抽出物または生物体液中のSODおよびCATのレベルを検出することができる（Fridovich, Adv. Enzymol., 41:35-97（1974）；BeyerおよびFridovich, Anal. Biochem., 161:559-566（1987））。さらに、SODおよびCATに対する抗体は入手可能であり、容易に作製することもできる。各タンパク質に特異的なこのような抗体を用いて、標準的イムノブロット（例えば、ウエスタンブロット）およびその他の免疫学的技法により、様々な混合物、細胞抽出物、もしくはその他の生物材料のサンプル中のSODおよびCATのレベルを測定することができる。また、目的とする細胞の翻訳機構に欠陥のないことが確かであれば、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現レベルは、特定のmRNA種を測定するための標準的ノーザンブロットまたは標準的ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、RT-PCR）を用いて、mRNA転写物のレベルを検出することにより、測定することも可能である。
【００７２】
治療および予防用途
単離された本発明のペプチド化合物は、ヒトおよびその他の動物などの動物の細胞および組織中のSODおよび／またはCATをアップレギュレートする。好ましくは、単離された本発明のペプチド化合物は、SODおよびCATの両方をアップレギュレートする。前述したように、SODおよびCATは、ROSおよびフリーラジカルを反応性および有害性が低い化合物に還元することにより、これら分子を解毒することができる身体の主要な酵素抗酸化活性の成分である。様々な疾病状態の進行および薬物の副作用に対するROSおよびその他のフリーラジカルの寄与は現在よく知られるところである。
【００７３】
例えば、ROSおよびフリーラジカルのレベル増加が、虚血後の再灌流中に細胞および組織に生じることがわかっている。このようにしてROSおよびフリーラジカルのレベルが増加すると、すでにストレスを受けているか衰弱した臓器または組織に相当の損傷を与える恐れがある。SODおよび／またはCATをアップレギュレートする本発明のペプチド化合物を用いることにより、卒中、心臓発作、腎疾患および腎移植などの疾病や状態に起こる再灌流損傷を治療することができる。卒中や心臓発作のように、虚血がすでに起こっている場合には、本明細書に記載するペプチド化合物を含んでなる組成物を個体に投与することにより、血液や、影響を受けた組織または臓器にすでに存在するまたは現れる増加したROSおよびフリーラジカルを解毒する。あるいは、臓器移植のように、虚血が予想される場合には、手術または虚血事象の前に、予防処置として本明細書に記載するペプチド化合物を含んでなる組成物を投与することができる。
【００７４】
主な用途は、虚血−再灌流損傷の治療であるが、本明細書に記載するペプチド化合物を用いて、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルに関連するあらゆる疾病または状態を治療したり、あるいは、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルによって起こるあらゆる疾病、障害または状態を予防することもできる。さらに、本発明によれば、本明細書に記載するペプチド化合物を投与し、上記以外の様々な疾病および状態に関連する増加したROSおよびフリーラジカルの治療または予防処置を提供することができる。このような疾病および状態として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：早産児における酸素毒、組織および臓器の熱傷および物理的外傷、敗血症性ショック、多外傷性ショック、頭部外傷、脳外傷、脊椎損傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、加齢に関連するROSおよびフリーラジカルの増加、老化、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ダウン症、関節炎、黄斑変性、精神分裂病、てんかん、放射線損傷（紫外線誘発性皮膚損傷など）、ならびに、ROSおよびフリーラジカルの薬物誘発性増加。
【００７５】
ROSおよびフリーラジカルの形成による酸化ストレスは、加齢とともに漸進的に増加する（例えば、Mecocci, P.ら、Free Radic. Biol. Med., 28:1243-1248（2000）を参照）。これは、ラット組織（Erdincler, D.S.ら、Clin. Chim. Acta, 265:77-84（1997））、および高齢のヒト患者の血液細胞（Congi, F.ら、Presse. Med., 24:1115-1118（1995））における過酸化脂質形成の増加を調べることにより、検出されている。近年の研究（Niki, E., Intern, Med., 39:324-326（2000））では、ROSおよびフリーラジカルによる組織の損傷の増加は、加齢の過程で起こる抗酸化酵素SODおよびCATのレベルの減少に起因する可能性があることが報告されている。例えば、マウスのゲノムに余剰SOD遺伝子を挿入することにより作製したトランスジェニック動物は、ROSおよびフリーラジカルによる損傷のレベルが低下していることが認められた。このような動物は、寿命も延びている。さらに近年、SOD活性を模擬する少量のマンガンポルフィリン化合物を投与することにより、線虫Caenorhabditis elegansの寿命が44％延びたことが証明されている（S. Melowら、Science, 289;1567-1569（2000））。従って、SODおよび／またはCAT遺伝子の発現をアップレギュレートして、抗酸化酵素のレベルを増加させることができる本明細書に記載するペプチド化合物は、加齢に伴なって起こるROSおよびフリーラジカルのレベル上昇による組織損傷の増加および寿命の短縮を予防および／または阻止する方法にも十分に適している。
【００７６】
現在の治療用途に用いられる多様な薬物は、組織特異的な有毒副作用を発生するが、これは、ROSおよびその他のフリーラジカルのレベル上昇と相関している。このような薬物として、神経弛緩薬、抗生物質、鎮痛薬、およびその他のクラスの薬物が挙げられる。このような薬物に誘発された毒性の影響を受ける組織には、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓および血液など、１以上の主要臓器および組織が含まれる可能性がある。
【００７７】
薬物の最も危険な副作用の１つが、神経弛緩薬であるクロザピンについて報告されているが、これは、抗精神分裂病治療活性として大きな効能を有する最初の薬物であった（Somaniら、In Oxidants, Antioxidants And Free Radicals（S.I. BaskinおよびH. Salem編）（TaylorおよびFrancis、ワシントンD.C.、1997）、pp.125-136を参照）。クロザピンで治療した患者の約１〜２％が、ROSの生成と相関する無顆粒球症を発現した（Fischerら、Molecular Pharm., 40:846-853, 1991）。本発明によれば、本明細書に記載したペプチド化合物を、クロザピン治療患者に投与することにより、SODおよび／またはCATをアップレギュレートして、ROSおよびその他のフリーラジカルの望ましくない有害な増加を阻止し、これによって、無顆粒球症の発現の危険性を低減することができる。
【００７８】
これ以外に、神経弛緩薬を受ける精神分裂病患者の副作用として、遅発性ジスキネジーがあり、これは、様々な制御不能な口、顔、および／または躯幹運動によって現われる衰弱性疾患である。多くの患者、特に、長期入院患者は、この不運な薬物誘発性疾患により、永続的な障害に苦しむ。遅発性ジスキネジーに関する以前の研究では、ドーパミン作動性ニューロンの欠損に関心が集まった（例えば、MorgansternおよびGlazer, Arch. Gen. Psychiatr., 50: 723-733（1993）を参照）。しかし、さらに近年の研究では、このような患者の脳における主な欠陥は、線状体のドーパミン作動性ニューロンへのシナプス前入力での刺激毒性（excitotoxic）アミノ酸グルタミン酸の過剰生成であることがわかった。注目すべきことに、このグルタミン酸の過剰生成は、ROSおよびフリーラジカルの高増加を引き起こすことにより、ドーパミン細胞に対し刺激毒性作用を発生する（Tsaiら、Am. J. Psychiatr., 155: 1207-1253（1998）を参照）。従って、本発明のペプチド化合物を、神経弛緩薬を受ける患者に投与することにより、SODおよび／またはCATをアップレギュレートして、抗酸化活性を増強し、これによって、増加したレベルのROSおよびその他のフリーラジカルによる酸化作用を阻止することができる。
【００７９】
本発明の方法によれば、ROSおよびその他のフリーラジカルのレベル増加の望ましくない副作用と相関のある治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に、本明細書に記載したペプチド化合物を個体に投与することができる。このような薬物には、限定するものではないが、表１に記載するもの（Somaniら、1971を参照）が挙げられ、同表には、発現される既知の毒性および副作用も併せて載せる。
【表１】
医薬への適用
本発明の医薬組成物は、医薬組成物の「活性成分」として、単離された本発明のペプチド化合物のいずれか、または製薬上許容されるその塩を含む。本発明の医薬組成物はさらに、１以上の製薬上許容される成分、例えば賦形剤（所望の物性を有するが、活性成分ではない化合物）、担体、アジュバントもしくはビヒクルを含む。
【００８１】
本発明の医薬組成物を、その他の治療用、予防用もしくは診断用薬、特に治療用ホルモンペプチドと同様の手法で、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。投与すべき用量、および投与様式は、年齢、体重、性別、患者の状態および遺伝的因子を含む、各種の要因に応じて異なり、最終的には主治医もしくは獣医によって決定されることとなる。一般的には、診断の感度もしくは治療効能のために必要とされる用量は約0.001〜25.0mg／kg (体重)の範囲となる。
【００８２】
本発明のペプチド化合物の製薬上許容される塩として、例えば製薬上許容される無機および有機の酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。好適な酸の例として以下の酸が含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、パモ酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびベンゼンスルホン酸。シュウ酸などの、それ自体は製薬上許容されないその他の酸でも、本発明の化合物および製薬上許容されるその酸付加塩を取得する際の、中間体として有用な塩の調製において利用することができる。適切な塩基から誘導される塩として、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN-(C1-4アルキル)4 +塩が含まれる。
【００８３】
本発明はまた、本明細書に開示したペプチド化合物の任意の塩基性窒素含有基の「第四級」化も想定しているが、その際、この第四級化が、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、そのペプチド化合物の能力を破壊しないものとする。こうした第四級化は、最終目的が陽性荷電残基のみを含有するペプチド化合物の使用の場合に、特に望ましい。上記のように、荷電アミノ酸残基が本明細書に記載するペプチド化合物中に存在する場合の、最も好ましい本発明の実施形態において、それらはすべて塩基性（正荷電）であるかまたはすべて酸性（負荷電）であって、保存もしくは使用中の環状ペプチドの形成を防止している。典型的には、環状形態のペプチド化合物は不活性で、潜在的に毒性である。したがって、第四級化ペプチド化合物が、塩基性アミノ酸を含有するペプチド化合物の好ましい１形態である。さらにより好ましいのは、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミドに転換されて、このカルボキシル基が任意の遊離アミノ基と反応して環状化合物を形成するのを防止している、第四級化ペプチド化合物である。当業者に知られた任意の薬剤によって、いかなる塩基性窒素でも第四級化することができる。これらとして例えば、以下のものが含まれる：塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどの低級ハロゲン化アルキル；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルを含む硫酸ジアルキル；塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物；ならびに臭化ベンジルおよびフェネチルを含むハロゲン化アラルキル。こうした第四級化、または酢酸および塩酸などの酸によって、水もしくは油に可溶性もしくは分散性の生成物を取得することができる。
【００８４】
選択的生物学的性質、特にSODおよび／またはCATをアップレギュレートする能力を強化するために、適切な機能付加によって、本発明のペプチド化合物を改変してもよいものと理解すべきである。こうした改変は当技術分野で知られており、これらとして以下のものが含まれる：ペプチド化合物の所定の生物学的系（例えば脳、中枢神経系、血液、リンパ系）内への貫通もしくは被輸送能力の増大、経口利用性の増大、注射による投与を可能にするための溶解性の増大、ペプチド化合物の代謝の変更、ならびにペプチド化合物の排出率の変更。その外に、ペプチド化合物をプロドラッグ形態に改造して、そのプロドラッグに関する代謝もしくはその他の生化学的経路の作用の結果として、患者の体内で所望のペプチド化合物が創製されるようにしてもよい。こうしたプロドラッグ形態は典型的にはin vitroアッセイでは活性をほとんどまたは全く表示しない。プロドラッグ形態の例のいくつかとして、ケトンもしくはアルデヒト基を含有する化合物のケタール、アセタール、オキシム、およびヒドラゾン形態が含まれる。プロドラッグ形態のその他の例として、ヘミケタール、ヘミアセタール、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタールおよびアセタール形態が含まれる。
【００８５】
本発明の医薬組成物に使用することができる、製薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとして、限定するわけではないが以下のものが含まれる：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などのバッファー物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素2ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロースを基礎とする物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびラノリンなど。
【００８６】
本発明の医薬組成物を各種の経路もしくは様式によって投与することができる。これらとして、限定するわけではないが、非経口、経口、気管内、舌下、経肺、局所、経直腸、経鼻、バッカル、舌下、経腟、またはインプラントレザバー経由が含まれる。インプラントレザバーは機械的、浸透圧またはその他の手段によって機能させることができる。本明細書で解釈され、かつ使用される用語「非経口」には、静脈内、頭蓋内、腹腔内、脊椎傍、関節周囲、骨膜内、皮下、皮内、動脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄膜内および病変部内注射または注入技法が含まれる。こうした組成物を好ましくは非経口投与用に、最も好ましくは静脈内、頭蓋内もしくは動脈内投与用に製剤化する。一般的に、また特に投与が静脈内もしくは動脈内の場合は、医薬組成物をボーラスとして、時間間隔をとった2回以上の投与として、または一定もしくは非線形流速注入として投与する。
【００８７】
医薬組成物は、例えば注射用の無菌水性もしくは油脂性懸濁液として、無菌の注射用調製品の形態とすることができる。この懸濁液は好適な分散剤もしくは湿潤剤（例えばTween80など）および懸濁剤を使用して、当技術分野で知られた技法にしたがって製剤化することができる。無菌注射用調製品は、非経口的に許容される非毒性の希釈剤もしくは溶媒中の無菌注射液もしくは懸濁液、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としてもよい。使用が可能な許容されるビヒクルおよび溶媒として、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。その外に、溶媒もしくは懸濁用媒質として、無菌の不揮発性油が通常使用される。この目的のためには、合成モノもしくはジグリセリドを含む、いかなるブランドの不揮発性油でも使用することができる。注射剤の調製において、オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体が有用であり、またオリーブ油もしくはひまし油などの天然の製薬上許容される油、特にそのポリオキシエチル化物も有用である。これらの油溶液もしくは懸濁液に、Pharmacoplia Halselicaに記載されたものなどの長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤を含ませてもよい。
【００８８】
本発明の医薬組成物を経口用に許容されるあらゆる投与剤型として経口投与することができる。これらとして限定するわけではないが、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、水性もしくは油脂性懸濁液剤および溶液剤、シロップ剤またはエリキシル剤が含まれる。経口用途の錠剤の場合、普通に使用される担体としてラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与用には、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。カプセル剤、錠剤、丸剤およびカプレット剤を遅延もしくは持続放出用に製剤してもよい。
【００８９】
水性懸濁液を経口投与する場合、ペプチド化合物を乳化剤および／または懸濁剤と配合するのが有利である。所望ならば、ある種の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加してもよい。経口投与用製剤は活性成分を10％〜95％、好ましくは25％〜70％含む。好ましくは、経口投与用の医薬組成物は、消化器系によるペプチド化合物の加水分解は防止または抑制されるが、血流中への吸収は可能になる混合物中の、本発明のペプチド化合物を供給する。
【００９０】
本発明の医薬組成物を膣もしくは直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では固体であるが、体温では液体であることによって、活性成分の放出に関わる身体部域では融解する好適な非刺激性賦形剤と、本発明の化合物とを混合することによって、調製することができる。こうした物質として、限定するわけではないが、カカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。坐薬による投与のための製剤は活性成分を0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％含む。
【００９１】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の処理が、創傷または手術中などの局所適用によって接近し得る部位もしくは器官に関わる場合に有用である。局所適用のためには、担体中に懸濁または溶解させた活性成分を含有する好適な軟膏として、医薬組成物を製剤化することができる。本発明のペプチド化合物の局所投与用の担体として、限定するわけではないが、鉱物油、液状石油(liquid petroleum)、白色石油(white petroleum)、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。あるいは、製薬上好適な担体中に懸濁または溶解させたペプチド化合物を含有する、好適なローションまたはクリームとして、医薬組成物を製剤化することができる。好適な担体として、限定するわけではないが、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれる。適切な場合、医薬組成物をゼリー剤、ゲル剤もしくは軟化剤として、局所またはその他の適用のために製剤化することができる。本発明の医薬組成物を直腸坐剤によるかまたは好適な浣腸剤中で、下部腸管に局所適用することもできる。局所投与は経皮パッチによって達成することもできる。これは健康な皮膚組織を維持し、また酸化による皮膚の損傷（例えばUVもしくは放射線に誘発された皮膚損傷）を回復させるために有用である。
【００９２】
本発明の医薬組成物を経鼻投与することができる。この場合、鼻の粘膜を経由するか、または肺中への吸入によって、吸収が生じる。こうした投与様式には典型的に、組成物を粉末、溶液もしくは液状懸濁物として準備し、次にこれを気体（例えば空気、酸素、窒素その他、またはそれらの組合せ）と混合して、液滴もしくは粒子のエアロゾルもしくは懸濁物を生成させることが必要となる。こうした組成物は医薬製剤の分野で周知の技法にしたがって調製されるが、ベンジルアルコールもしくはその他の好適な保存剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で既知のその他の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【００９３】
本発明の医薬組成物を、その投与剤型および投与様式に適切な各種の方法でパッケージすることができる。これらとして、限定するわけではないが、バイアル、ビン、カン、パケット(packet)、アンプル、カートン、柔軟性容器、吸入器、およびネブライザーが含まれる。これらの組成物を同一の容器から単回または多数回投与するようにパッケージすることができる。投与の直前に混合するようにした、乾燥粉末状または凍結乾燥形態の組成物と適切な希釈剤の両方を含む、１回以上の投与のためのキットを提供することが可能である。医薬組成物を、単回用の充填済み注射器、またはオートインジェクターおよび無針ジェットインジェクター用のカートリッジ中にパッケージすることもできる。
【００９４】
多数回使用用パッケージ製造には、細菌、真菌などの増殖を防止するが、患者に投与したとき毒性ではない濃度での、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムなどの抗微生物剤の添加を必要とする。
【００９５】
製薬業界において現在使用され、また当業者に公知である、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準(GMP)に一致することであるが、医薬品と接触するかこれを含むすべての成分を殺菌しなければならず、また業界基準にしたがって定期的に無菌性について試験しなければならない。殺菌の方法として、限外濾過、オートクレーブ、乾式もしくは湿式加熱、エチレンオキサイドなどの気体への曝露、次亜塩素酸ナトリウム（ブリーチ）を含む酸化剤などの液体への曝露、紫外線光、X線もしくはガンマ線などの高エネルギー電磁放射線への曝露および電離性放射線への曝露が含まれる。所望の生物学的機能、すなわち問題の医薬物質であるSODもしくはCATをアップレギュレートする能力を有意に変更することなく、最も有効な殺菌効果をもたらす、殺菌方法の選択は、当業者がなし得るところである。水溶液もしくは懸濁液である医薬組成物のためには限外濾過が好ましい殺菌方法である。
【００９６】
投与量、投与剤型、投与様式、組成物などの詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版., Alfonso R.Gennaro, 編. (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)などの標準的薬学指導書中で考察されており、これを参照として本明細書に組み入れる。
【００９７】
当技術分野で周知のように、ペプチドの構造および生物学的機能は、温度、pH、酸化および還元剤、凍結、振盪ならびに剪断応力などの化学的および物理的環境条件に対して感受性がある。分解に対するこの固有の感受性のため、薬剤が製造され、パッケージされ、流通され、保存され、調剤されて適格な医師によって投与されるまでの時間、医薬として使用するペプチド化合物の生物学的活性が保持されることを確実にする必要がある。医薬タンパク質を安定化して、その生物学的能力および有効性を保持するために、多くの技術的手法が開発されてきたので、こうした安定化技術を本発明の組成物および方法のペプチド化合物に応用することができる。これらとして、以下のものが含まれる：
a) 凍結乾燥および真空凍結乾燥（本明細書に参照として引用する、Carpenterら、Pharm.Res., 14(8):969(1997)を参照されたい）；
b) ペプチドもしくはタンパク質の水溶液もしくは懸濁液への「安定化剤」の添加。例えば、米国特許第5,096,885号には、ヒト成長ホルモンに、濾過、バイアルへの充填、および冷蔵もしくは真空凍結乾燥の工程中にこのタンパク質を安定化するための手段として、グリシン、マンニトール、pHバッファーおよび非イオン界面活性剤、ポリソルベート80の添加が開示され、米国特許第4,297,344号には、選択されたアミノ酸および炭水化物の添加による、凝固因子IIおよびVIII、抗トロンビンIIIならびにプラスミノーゲンの熱に対する安定化が開示され、米国特許第4,783,441号には、特定のpH範囲内での、界面活性物質の添加による、水溶液中のインスリンなどのタンパク質の界面での変性の防止方法が開示され、そして米国特許第4,812,557号には、ヒト血清アルブミンを使用するインターロイキン-2の安定化方法が開示されている；
c) ペプチド化合物を凍結保護物質と混合して非常に低い温度（例えば-70℃）で凍結保存する、凍結／融解法；
d) 場合によってグリセロールなどの凍結保護性添加剤を含ませた、非凍結冷蔵（例えば4℃未満）；
e) 例えば米国特許第5,098,893号に記載されたような、ガラス化した非晶質状態での保存；
f) 結晶状態での保存；ならびに
g) リポソームまたはその他のミセル中への組み込み。
【００９８】
本発明のその他の態様は、以下の実施例において、さらに理解され、また例示されるであろう。以下の実施例に含まれる特定のパラメーターは本発明およびその各種の様相の実施を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を何らかの意味で限定するために提供するものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１：代表的なペプチド化合物の合成
固相Merrifield合成（Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154(1963)）によって、以下の代表的なペプチド化合物を合成した。
【０１００】
PEP-1：[Ac] Asp Gly Glu Ala（配列番号２）
PEP-2：[Ac] Asp Gly Glu Ala Leu（配列番号３）
PEP-3：[Ac] Asp Gly Leu Glu Ala（配列番号４）
アミノ末端キャッピング基「［Ac]」は表示したペプチド化合物のアミノ末端アミノ酸残基のαアミノ基にアシル化によって結合しているアセチル部分を表す（Shashoua and Hesse, Life Sci.58:1347-1357(1996)）。
【０１０１】
これらのペプチドは標準的手法を使用して合成した。簡単に述べると、固相Merrifield工程（Merrifield,R.B., J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154(1963)）を使用して、ペプチド化合物を合成した。この方法で、ポリマー樹脂に結合した特定のアミノ酸配列のペプチドを合成することができる。次に、トリフルオロ酢酸（TFA）での処理によって、新しく合成された各ペプチドを樹脂から遊離させた。生成したトリフルオロ酢酸ペプチド塩を標準的手法にしたがってエーテル沈殿により精製した（E.Groos and Meienhofer,"The peptides, analysis, synthesis, biology, vol.2, (Academic Press, New York 1983)参照）。
【０１０２】
N-末端置換ペプチド（すなわち、アシルアミノ末端キャッピング基を含有するペプチド）については、固相Merrified合成（上記参照）を使用して、ブロックされた側鎖を有するように、各ペプチドを合成した。次に結合したペプチドをアルゴン雰囲気下、4-ジメチルアミノピリジンの存在する中で、当モル量の以下の酸：酢酸、DHAもしくはリポ酸、の１つの無水物で処理した。反応を約3時間実施して、N-末端カップリングを形成させた。ペプチドの単離の前に、完全なN-末端カップリングの確証を得た。これは、標準的手法（E.Kaiserら、Anal.Biochem., 34:595-598(1970)）を使用して、樹脂に結合したペプチドのニンヒドリン染色特性をモニターすることによって、確定した。次にTFAでの処理によって樹脂からN-末端カップリングした（キャップ）ペプチド分子を遊離させ、冷エーテルでの沈殿後、溶離液としてメタノール性HCl（50：50）を使用するHPLCによって、精製した。最終ペプチド製品は凍結乾燥後、白色固体だった。アミノ酸分析、HPLC上での単一ピークとしての泳動、および質量分析による分子量の決定、によって、構造を確認した。大部分の用途のために、ペプチド化合物からTFAを完全に除去することを必須の要件とした。これは、ペプチドを氷酢酸に反復溶解した後、ロータリーエバポレーターによる真空濃縮によって、達成された。TFAの完全な不在は、質量分析によって確定した。
【０１０３】
実施例２：ペプチド化合物 PEP-2 （ [Ac]Asp Gly Glu Ala Leu （配列番号３））による哺乳動物細胞中のスーパーオキシドジスムターゼ（ SOD ）およびカタラーゼ（ CAT ）のアップレギュレーション
100ユニット/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清を補充したDulbecco改変Eagle培地で新生ラット脳皮質細胞を増殖させることによって、皮質初代培養物を取得した。Cornell-Bellら、Science, 247:470-473(1990)およびCell Calcium, 12:185-204(1991)に記載されているように、ラット脳のE21皮質から細胞を単離し、1ｘ105／mlの密度でプレーティングし、そして37℃、空気および5％CO2を含有する雰囲気中で、4〜5日以内に密集化するように増殖させた。培養物を20mlフラスコ中で単層となるように培養し、その後、SODに関する遺伝子のアップレギュレーションに対するPEP-2の影響を研究するために、各種濃度のペプチドに曝露した。ラット脳皮質細胞の培養物を1ng/ml、10ng/ml、および100 ng/mlのペプチド化合物PEP-2とともに5時間インキュベートした。対照培養物はPEP-2を加えずに同じ方法で処理した。
【０１０４】
公表された方法（Adamsら、J.Leukoc.Biol., 62:865-873(1997)）にしたがって、細胞質タンパク質を単離した。20 mM EDTAを含有するリン酸バッファー塩(PBS)溶液で細胞培養物を１回洗浄し、次に用時調製した溶解用バッファー（20 mM Hepes, pH7.9、10 mM KCl、300 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1％ Triton X-100非イオン界面活性剤、20％グリセロール、0.5 mM ジチオトレイトール（DTT）、Adamsら 、J.Biol.Chem., 77:221-233(2000)に記載されたようなインヒビターを用時補充）250μlに懸濁させた。次に、懸濁液を氷上で少なくとも10分間インキュベートして、細胞を溶解させ、その後遠心分離（14,000ｘg、4℃で5分間）して、細胞破砕物をペレット化した。上清の細胞質画分を取り出し、分析のために-80℃でアリコートに分けて保存した。細胞質画分のタンパク質濃度は2〜6μg/μlの範囲で変化した。
【０１０５】
ゲル上で5μg／レーンを使用するSDS-PAGEによって、細胞質タンパク質を分離した。ゲルをウエスタンイムノブロットのために、基本的にAdamsら（General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)）による記載に従って処理し、SODのアップレギュレーションを測定した。SOD発現はウエスタンブロットにおいて抗SODウサギポリクローナル抗体（Rockland, Inc., Gilbertville, PA）を使用して検出した。SODタンパク質のアップレギュレーションを定量するために、さらに、このウエスタンブロットをレーザーデンシトメトリーによっても分析した。これらの実験の対照は、ビヒクル単独（すなわち、ペプチド化合物を含まないバッファー）で処理した同一の培養フラスコとした。結果を下の表２に示す。
【表２】
ウエスタンブロットは、PEP-2の存在および非存在のもとでインキュベートした培養物からの細胞中に、34kDa（SOD-1の分子量）に移動するバンド、および抗SOD-1抗体により認識される２つのより小さい成分に対応するより低い分子量のバンドと結合する抗体を示した（データは示してない）。しかし、表２に示したように、ラット脳皮質細胞培養物の研究結果は、細胞質中で合成された免疫活性（すなわち、抗SOD抗体活性）タンパク質のレベルは、最低PEP-2濃度（すなわち、1 ng/ml）を用いて処理した細胞中ですら２倍増加した。明らかに、本発明のペプチド化合物は、ラット脳皮質細胞中のSOD-1をアップレギュレートすることができる。
【０１０７】
実施例３： PEP-1 および PEP-3 ペプチド化合物の in vivo 薬理学的活性
Sprague-Dawleyラット（300〜325g）においてペプチド化合物PEP-1およびPEP-3の溶液を用いてin vivo実験を行った。動物の尾静脈に、ペプチド化合物を静脈（iv）注射した。各動物に通常生理食塩水中のペプチド化合物を1.2もしくは2.4mgペプチド化合物/kg体重に等しい全用量にて１回注射を行った。動物を注射後6時間に断頭により動物を屠殺し、解剖して脳および心臓器官を単離し、これらを-70℃で冷凍して後にウエスタンイムノブロットにより分析した。
【０１０８】
各組織を解凍し、10倍量の均質化緩衝液を用いてDown'sホモジェナイザーでホモジェナイズし（Adamsら, General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)を参照されたい；緩衝液はAdamsら, J. Leukoc. Biol., 62:865-875(1967)）に記載されたもの）、粗細胞質画分を得た。Adamsら（J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）に記載されたように、組織ホモジェネートを遠心分離し（14,000×gで4℃にて5分間）、ウエスタンブロット分析用の上清精製細胞質タンパク質画分を得た。次に、10μgの各タンパク質画分のサンプルをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、上記のようにウエスタンブロットアッセイによりSODおよびCAT含有量について分析した。
【０１０９】
SODの非刺激レベルを測定するための対照は、２つのビヒクルのみ（すなわちペプチド化合物なし）を注射し注射後６時間経って屠殺したラットから得た。いずれもほぼ同じ非刺激レベルのSODを有していた。標準的量（10μg）の各細胞質画分をゲルのレーンに載せて電気泳動分離およびウエスタンイムノブロット分析にかけた（Adamsら, J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）。染色したゲルの写真を撮り、レーザーデンシメトリーにより走査して、対照ビヒクル処理ラットの酵素レベルと比べた強度を定量した。
【０１１０】
表３および表４は、それぞれラット脳および心臓におけるSODおよびCATのアップレギュレーションデータを、ペプチド化合物無しのビヒクルのみを注射した対照動物と比較して示す。
【表３】
【表４】
表３および４のデータは、ペプチド化合物PEP-1およびPEP-3の2.4 mg/kg体重と等しい用量での投与は、対照と比較して脳にほぼ３倍のSOD産生のアップレギュレーションを、かつ心臓にSOD産生のほぼ２倍のアップレギュレーションをもたらしたことを示す。同じ用量で、CAT産生は脳においてほぼ２倍、そして心臓においてほぼ２〜３倍アップレギュレートされた。
【０１１３】
上記結果は、ペプチド化合物PEP-1およびPEP-3は重要な器官の細胞および組織においてSODおよびCATをin vivoでアップレギュレートする活性を有することを示す。これらの知見は、全生物中の重要な器官のROSおよびフリーラジカルに対する防御を促進する治療用の組成物中に、PEP-1および／またはPEP-3のような化合物を使用する可能性を示す。
【０１１４】
実施例４．「老」 C57BLACK マウスにおける SOD レベルに対する、ペプチド化合物 PEP-1 の in vivo 用量応答効果
本研究は、「老」成熟個体におけるSODレベルに対する、代表的ペプチド化合物PEP-1（実施例１参照）のin vivo用量応答効果を試験することを目的として設計した。
【０１１５】
成熟18月齢老C57BLACKマウス（「老マウス」）を、0.25 mg/kgのPEP-1を用いて胃管強制栄養（gavage）により14日間処理した。動物は次の５処理グループ（1グループ当たり、n＝3）に属した：
グループ１：対照、無処理
グループ２：毎週１回処理
グループ３：毎週２回処理
グループ４：隔日処理
グループ５：毎日処理。
【０１１６】
14日間の終わりに、全ての動物を屠殺し、それらの脳を採集してSODレベルを上記のようにウエスタンイムノブロットにより分析した。SOD標準（「Ｍ」）も、サンプルと並行して試験した。SODレベルをブロットのデンシトメトリーにより定量した。
【０１１７】
図１に棒グラフとして示した結果は、SODレベルは対照グループ動物と比較してPEP-1を用いて毎日（グループ５）または隔日（グループ４）処理した動物において4.5倍以上増加したことを示す。さらに、該ペプチドを用いて毎週２回（グループ３）処理した動物において2.3倍の増加が認められた。
【０１１８】
実施例５ 「老」成熟 C57BLACK マウスにおける SOD に対する、ペプチド化合物 PEP-1 の in vivo 用量応答効果
「老」成熟C57BLACKマウスにおけるSODをアップレギュレートする上での用量応答効果のさらなる試験として、若および老動物を次の処理グループ（n＝3）に区分した：
動物１-３：若、4-月齢マウス、無処理
動物４-６：老、18-月齢マウス、無処理
動物７-９：老、18-月齢マウス、PEP-1の0.33 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
動物10-12：老、18-月齢マウス、PEP-1の3.3 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理。
【０１１９】
30日後に、全動物を屠殺しそれらの脳を採集した。SODレベルをウエスタンイムノブロットにより分析した。SOD標準（「Ｍ」）もサンプルと並んで試験した。SODレベルはイムノブロットのデンシトメトリーにより定量した。
【０１２０】
結果を図２に棒グラフで示した。対照（無処理）若マウス（動物１-３）の脳組織は老マウスに見出されたものの２倍以上のレベルのSODを含有した。本研究の老マウスの脳組織中のSOD発現に対するPEP-1の明確な用量応答効果が観察された。図２のデータは、3.3 mg/kgのPEP-1の経口用量を用いて毎日処理した老マウス（動物10-12）の脳組織中のSOD発現のレベルは、無処理老対象グループ動物（動物４-６）と比較して4.8倍増加することを示した。さらに、0.33 mg/kgのPEP-1の経口用量を用いて毎日処理した動物においてSODレベルの2.9倍増加が認められた。図２に見られるように、SOD関連破砕断片に変化はなかった（「SOD関連」）。
【０１２１】
実施例６ 老 C57BLACK マウスの歩行活性および寿命に対する、 PEP-1 の in vivo 効果
本研究は、代表的ペプチド化合物PEP-1の毎日投与が加齢に関係する自発行動覚醒低下を逆転するin vivo効果を試験することを目的とし、上記効果を「老」成熟個体の歩行活性および寿命に与える影響により測定することとして設計した。本研究において、C57BLACKマウスを次の処理グループ（1グループ当たりn＝10）に区分した：
グループ１：若、4-月齢マウス、無処理
グループ２：老、16-月齢マウス、無処理
グループ３：老、16月齢マウス、PEP-1の0.025 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ４：老、16月齢マウス、PEP-1の0.075 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ５：老、16月齢マウス、PEP-1の0.25 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ６：老、16月齢マウス、PEP-1の0.75 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理
グループ７：老、16月齢マウス、PEP-1の2.5 mg/kg胃管強制栄養により毎日処理。
【０１２２】
70日の処理期間後、無処理若マウス（グループ１）は全て生存した（すなわち、6.5月齢まで）、しかし無処理老マウス（グループ２）の10動物中の３動物は死亡した。またグループ３および４のそれぞれにおいて２動物がこの同じ期間に死亡した。グループ５、６および７においてPEP-1を用いて処理した老マウスは全て70日、すなわち18.5月齢まで生存した（図３参照）。
【０１２３】
用量を課して6週後に、生存動物を標準歩行活性試験で試験し、これを用いて加齢に関係する自発性行動覚醒低下の逆転の確証を検出する試験を行った（Forsterら, 1996；Dubeyら, Arch. Biochem. Biophys., 333:189-197 (1996)）。覚醒レベルはディジスカン（Digiscan）装置（Omnitech, model RXYZCM, Omnitech Electronics, Columbus, Ohio, USA）を用いて測定した。それぞれのマウスを20分間セッションの間、透明アクリル製チャンバー（40.5cm x 40.5cm x 30.5cm）内に置いた。アクリル製チャンバーはフォトセルのアレイを内張りした金属フレーム内に置いた。断熱シートを備えた木製キャビネットがアクリル製チャンバーと金属フレームを囲った。ファンはチャンバー内に80-dbノイズレベルを与えた。水平面内のマウスの運動は光ビームを遮断し、これがコンピューターにより１分間以内の時間サンプルとして自動的に記録された。本研究で使用した基準は、16分間試験セッション全体における1分間当たり平均水平光ビーム遮断数（水平カウント／分）であった。
【０１２４】
用量を課した6週後に、歩行活性試験をブラインドグループ１、２、３、４、５、および６（それぞれ、若の無処理対照、老の無処理対照、老の0.025 mg/kg、0.075 mg/kg、0.25 mg/kg、および0.75 mg/kgのPEP-1を用いて処理した動物）で実施した。結果を図４に示す。若と老の無処理対照グループの間の有意差（p＜0.05）は、加齢に関連する自発性行動覚醒低下の従来の知見を実証した。0.025mg/kg処理動物（グループ３）は老対照と有意差がなくかつ若対照と有意差があった。しかし、0.075〜0.75mg/kgを受けたグループ（グループ４、５、および６）の水平活性は老対照のそれより高く、若対照と有意差がなかった。これらの結果は、0.075〜0.75 mg/kgのPEP-1を用いた処理は６週後の行動覚醒に対して有益な効果を与えたことを示した。
【０１２５】
本研究から得たデータは、PEP-1を用いる処理が老マウスの寿命を増加することを示した。さらに、本データはまた、PEP-1を用いる処理が老動物の歩行行動を有意に改善することも示した。かかる結果は、老いた個体における抗酸化酵素の発現をアップレギュレートすることができる、PEP-1のような本発明のペプチド化合物を用いる治療の有益な抗加齢効果に対する確証を提供する。
【０１２６】
本発明の範囲または特許請求の範囲の精神から逸脱することなく、当業者には、本明細書中に記載された本発明の他のバリエーションおよび実施形態が自明であろう。
【０１２７】
上記に引用した全ての特許、特許出願および刊行物は本明細書中に参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】14日間の様々な投与計画でPEP-1（0.25mg/kg体重のPEP-1、胃管強制栄養）を受けた18月齢C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。
【図２】PEP-1の様々な用量を用いて処理した若（4月齢）および老（18月齢）C57BLACKマウスから得た脳組織抽出物における用量依存性SOD発現を描く棒グラフを示す。
【図３】様々な用量のPEP-1を胃管強制栄養により70日間（2.5ヶ月）受けた若（4月齢）および老（16月齢）C57BLACKマウスのグループ（n＝10）における動物のパーセント（％）生存率を描く棒グラフを示す。
【図４】図３に記載した様々な経口用量のPEP-1を用いて処理したC57BLACKマウスに対する歩行運動活性スコア（水平カウント数／分）を描く棒グラフを示す。
Claims (19)
- 次式：
R1 Asp Gly Xaa3 Xaa4 Xaa5 R2（配列番号１）
［式中、R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；Xaa3はGluまたはLeuであり；Xaa4はAlaまたはGluであり；Xaa5は存在しないか、LeuまたはAlaであり；そしてR2は存在しないかまたはカルボキシ末端キャッピング基である］で表され；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物。 - R1 Asp Gly Glu Ala R2（配列番号２）、
R1 Asp Gly Glu Ala Leu R2（配列番号３）、および
R1 Asp Gly Leu Glu Ala R2（配列番号４）
［式中、R1は存在しないか、該ペプチド化合物のアミノ末端キャッピング基でありかつR2は存在しないか、カルボキシ末端キャッピング基である］からなる群より選択される式で表され；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物。 - 次式：
R1 Xaa1 Xaa2 Asp Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 R2（配列番号５）
［式中、R1は存在しないかアミノ末端キャッピング基であり；Xaa1は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa2は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa5はGluまたはLeuであり；Xaa6はAlaまたはGluであり；Xaa7は存在しないかLeuまたはAlaであり；Xaa8は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa9は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa10は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；Xaa11は存在しないかいずれかのアミノ酸であり；R2は存在しないかカルボキシ末端キャッピング基である］で表され；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物。 - Asp Gly Glu Ala （配列番号２）、
Asp Gly Glu Ala Leu （配列番号３）、および
Asp Gly Leu Glu Ala （配列番号４）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単離されたペプチド化合物を含んでなる組成物。 - 抗酸化酵素がスーパーオキシドジムスターゼまたはカタラーゼである、請求項１、２、３、および４のいずれか１項に記載の組成物。
- R1が還元または酸化されたリポ酸部分；グルコース-3-O-グリコール酸部分；１〜６個のリシン残基（配列番号７）；１〜６個のアルギニン残基（配列番号７）；アシル基R3-CO-［ここで、COはカルボニル基を表し、R3は炭素数１〜25の飽和または不飽和の炭化水素鎖である］、およびこれらの組合せからなる群より選択されるアミノ末端キャッピング基である、請求項１、２、および３のいずれか１項に記載の組成物。
- アミノ末端キャッピング基がR3-CO-アシル基［式中、R3は炭素数１〜22の飽和または不飽和の炭化水素鎖である］である、請求項６に記載の組成物。
- アミノ末端キャッピング基R1がアセチル、パルミトイル(Palm)、およびドコサヘキサエノイル(DHA)からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
- R2が第一級アミンおよび第二級アミンからなる群より選択されるカルボキシ末端キャッピング基である、請求項１、２、および３のいずれか１項に記載の組成物。
- 細胞または組織中のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、またはその両方の発現レベルをアップレギュレートする方法であって、細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる、上記方法。
- 哺乳動物細胞または組織中の反応性酸素種およびフリーラジカルの酸化効果を中和する方法であって、細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる、上記方法。
- 細胞または組織中の反応性酸素種およびその他のフリーラジカルの望ましくないレベル上昇を低下または防止する方法であって、該細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる、上記方法。
- その細胞または組織中の反応性酸素種およびその他のフリーラジカルのレベルに望ましくない上昇を示す哺乳動物の疾患または状態を治療する方法であって、上記哺乳動物に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含んでなる、上記方法。
- 上記疾患または状態が脳虚血、心筋梗塞、腎再灌流、アテローム性動脈硬化症、頭部外傷、脳外傷、脊髄外傷、未熟児の酸素中毒、神経変性疾患、関節炎、炎症、糖尿病、潰瘍性大腸炎、癌、ダウン症、黄斑変性症、白内障、精神分裂病、てんかん、敗血症性ショック、多外傷性ショック、熱傷、放射線により誘発される反応性酸素種または他のフリーラジカル上昇、および薬物により誘発される反応性酸素種または他のフリーラジカル上昇からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
- 上記疾患または状態が神経変性疾患である、請求項１４に記載の方法。
- 上記神経変性疾患がハンチントン舞踏病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- 上記疾患または状態が加齢過程に関係する疾患または状態である、請求項１３に記載の方法。
- 加齢過程に関係する上記疾患または状態が認知機能低下、運動機能低下、老化、アルツハイマー病、早老、および平均余命低下からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
- 個体の疼痛を治療する方法であって、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を個体に投与することを含んでなる上記方法。
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