JP2004535820A5

JP2004535820A5 -

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Publication number: JP2004535820A5
Application number: JP2003515654A
Authority: JP
Filing date: 2002-07-23
Publication date: 2011-06-02
Anticipated expiration: 2022-07-23

Description

本発明は、幹細胞の分化を誘導する方法に関する。特に、本発明は、胚性幹細胞の筋細胞または血管内皮細胞への分化を誘導する方法に関する。本発明は、また、本発明の方法で用いられる細胞、細胞株、試験モデルおよび培養システム、およびそこから生成された分化した細胞にも関する。本発明は、また、治療の目的で、本発明の分化細胞を用いる方法も提供する。

特に、幹細胞の筋細胞への分化の誘導は、筋肉の移植および治療の目的に有用であり、培養中での潜在的ヒト疾患モデルを提供する（例えば、薬剤試験）のに有用である。幹細胞において心筋細胞分化を誘導することは、心臓疾患および異常心臓症状のための治療法および治療製品を開発するのに特に有用である。しかしながら、発生中に胚性幹細胞から筋細胞のような特定の細胞型を特定化し最終的に分化させる分子経路は、完全には明らかでない。

好ましくは、幹細胞が、胚性内胚葉細胞および／または胚性内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に増殖され、幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する。より好ましくは、胚細胞は胚体外由来である。胚細胞は、好ましくは、内臓内胚葉に由来し、内臓内胚葉様特性を有する細胞であるまたは内臓内胚葉の特性を有する胚細胞株に由来する。より好ましくは、幹細胞は、胚細胞の存在下に共培養される。

本発明のもう一つの態様は、本発明の方法で用いるための胚細胞である。好ましくは、胚細胞は、胚性または胚体外の内胚葉または外胚葉に由来する。好ましくは、胚細胞は、内臓内胚葉に由来するかまたは、内臓内胚葉様特性を有する細胞である。より好ましくは、胚細胞は、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、ＤｅｖＢｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来する。

幹細胞は、好ましくは、胚に由来するまたは、胚性幹細胞の培養から直接に由来するヒト胚性幹細胞である。例えば、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．第１６巻：３９９〜４０４頁、２０００年）のような細胞培養から得ることができる。幹細胞は他の動物に由来することができるが、これらは、最も好ましくはヒト胚性幹細胞である。幹細胞は、胚細胞株または胚組織に由来することができる。胚性幹細胞は、培養され未分化状態に維持されている細胞であり得る。そのような細胞が、ＰＣＴ／ＡＵ９９／００９９０、ＰＣＴ／ＡＵ００／０１５１０、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７３５およびＰＣＴ／ＡＵ０１／００２７８に開示されており、その内容を参照することにより本明細書に取り込む。

胚細胞は、培養中の細胞株または細胞に由来することができる。胚細胞は、胚細胞株、好ましくは、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、ＤｅｖＢｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来することができる。ＥＮＤ−２細胞株は、懸濁液中においてレチン酸で凝集体（胚様体）として処理されたＰ１９ＥＣ細胞の培養からクローニングすることにより得られ、次に、再び平板培養した（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、ＤｅｖＢｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）。ＥＮＤ−２細胞株は、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および細胞骨格タンパク質ＥＮＤＯ−Ａを発現している内臓内胚葉（ＶＥ）の特徴を有する。従って、胚細胞がＥＮＤ−２細胞株に由来することが最も好ましい。これらの細胞は、ヒト幹細胞の心筋細胞への分化を誘導するのに特に有用であると分かった。

本発明および先に記載の方法において、幹細胞および胚細胞が培養されて、特定の細胞型への分化が誘導される。好ましくは、幹細胞および胚細胞が、インビトロで共培養される。これは、典型的には、培養中において胚細胞を増幅することにより生成される胚細胞単層に幹細胞を導入することを含む。好ましくは、胚細胞単層は増殖して実質的集密性になり、幹細胞は、胚細胞の細胞外培地の存在下に、幹細胞から特定の細胞型への分化を誘導するのに充分な時間培養される。また、胚細胞の細胞外培地を含むが胚細胞は存在しない培地において幹細胞を増殖させることができる。胚細胞と幹細胞とは、フィルターまたは、寒天のような非細胞質マトリクスにより互いに分離することができる。

本発明のさらに好ましい実施形態において、胚細胞は、内臓内胚葉に由来する内胚葉細胞であるまたは、内臓内胚葉特性を有する胚細胞である。より好ましくは、内臓内胚葉細胞は、Ｅ７．５マウス胚に由来する。胚細胞は、胎児性癌細胞、好ましくは、内臓内胚葉特性を有する細胞であってよい。より好ましくは、胚細胞は、培養中の細胞株または細胞に由来する。胚細胞は、胚細胞株、好ましくは、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、ＤｅｖＢｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来することができる。より好ましくは、胚細胞は胚体外組織に由来し、より好ましくは、内臓内胚葉に由来する。内胚葉細胞は、典型的には、脊椎動物の心臓形成部位に隣接する。内胚葉分化が欠損または存在していない個体において、心臓は異常に発生する。

また、幹細胞を、内胚葉細胞の細胞外培地を含むが内胚葉細胞が存在しない培養中で成長させることができる。従って、幹細胞を、胚性内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に成長させて、幹細胞の、心筋細胞のような筋細胞への分化を誘導させることができる。

外胚葉細胞は、Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁に記載の方法に従って単離することができる。外胚葉細胞はｏｃｔ−４を発現しアルカリホスファターゼ活性を有することが知られており、これらは、その細胞表面上にＳＳＥＡ−１も有する。従って、外胚葉細胞は、前記特性に基づいて同定および単離することができる。外胚葉細胞は、骨格筋への分化を誘導する分泌（成長）因子を分泌することができる。外胚葉細胞は、Ｅ７．５胚性マウス組織に由来することが好ましい。より好ましくは、外胚葉細胞は、先に記載したものと類似の方法を用いて幹細胞と共培養される。外胚葉単層は、好ましくは、培養中で形成され、好ましくは、解離した幹細胞が、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導するのに充分な時間、培養に導入される。

本発明の方法により生成された分化細胞は、クローン的に増幅することができる。特定の分化細胞型を、他の細胞型の混合物から選択的に培養し、続いて増殖させることができる。クローン的に増幅した特定の分化細胞型は、移植治療用の充分な細胞の生成、遺伝子発見研究用の充分なＲＮＡの生成、等のような種々の用途に有用であり得る。分化細胞は、従来法に従って細胞株を作るのに用いることができる。

本発明の方法により生成された分化細胞は、生物学的材料の貯蔵に適した任意の方法により保蔵または維持することができる。分化細胞の効果的保存は、将来の種々の用途のために細胞を連続的に貯蔵させることができるので高度に重要である。細胞株の凍結保存に一般的に用いられている伝統的緩慢凍結法を用いて分化細胞を凍結保存することができる。

［ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の心筋細胞への分化］
（ａ）ｈＥＳ細胞とＥＮＤ−２細胞との共培養
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．第１６巻：３９９〜４０４頁）を、ＥＮＤ−２細胞（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、ＤｅｖＢｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）と共培養した。１：１比のダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２培地（ＤＦ）（ＦＣＳ７．５％含む）とにおいてＥＮＤ−２細胞を増殖させた。次に、細胞を、１：５のトリプシン／ＥＤＴＡ（０．１２５％ｗ／ｖ；５０ｍＭｒｅｓｐ）中で１週間に２回、継代培養した。ｈＥＳ細胞を、ＤＭＥＭにおいて、２０％のＦＣＳ、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン＋抗生物質（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）と共に、マイトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）処理胚のフィーダー細胞上で培養した。ＨＥＳを、ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）で処理し、個々のコロニーを６〜１０枚の断片に機械的にスライスし、続いて断片を新しいフィーダー細胞に移すことにより二次培養した。

（ｂ）ｈＥＳ細胞と内臓内胚葉細胞との共培養
内臓内胚葉細胞を、ジスパーゼを用いて前述のようにＥ７．５（Ｅ０．５は、膣栓の日正午である）にて、原腸形成しているマウス胚の３つの胚葉から単離した（Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁）。分離した胚葉を、Ｍ１６培地におけるポリ−Ｌ−リシン被覆培養皿上に乗せ、一晩付着させた。翌日、Ｍ１６をｈＥＳ完全培地に置換し、胚細胞単離後３日目に、未分化細胞塊「移植片」を、マウス胚からの付着した内胚葉および外胚葉細胞上で培養した。次に、培地を２〜３週間増殖させ、培地を５〜６日毎に新しくした。

（ｃ）共培養実験（ａ）および（ｂ）の分析
前記（ａ）および（ｂ）に記載した培養を、１０日後の収縮筋の領域の存在について評価した。

（ｉ）免疫蛍光
次に、収縮筋の領域が明らかになった後、培養を、２％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、３回洗い、使用するまでＰＢＳ中に貯蔵した。次に、培地を、α−アクチニン抗体（モノクローナル抗体−α−アクチニン（筋節）クローンＥＡ−５３、１：１０００希釈、Ｓｉｇｍａ製；二次抗体：ヤギ抗マウス−ＩｇＧ−Ｃｙ３）を用いて、筋肉表現型を確認するために染色した。

（ｉｉ）ｈＥＳ−Ｅ７．５内胚葉共培養
培養の第１週中、ｈＥＳ断片を内胚葉の上で培養し、これは徐々に広がり平らになり、１２日目に、収縮している筋細胞の第１の領域が明らかになる。これは、ＥＮＤ−２共培養において観察される強度の嚢胞形成を伴わないが、血管内皮細胞ネットワークに似ている領域は、培養の端部に現れない。

［ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の骨格筋細胞への分化］
実施例１で用いたヒト幹細胞（ｈＥＳ）を、Ｅ７．５日胚（Ｅ０．５は栓の日）から単離された外胚葉上に乗せた。鋭いピンセットとタングステン針を用いて、脱落膜から胚を取り出し、１０％ＦＣＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ中で氷上に維持した。ライヘルト膜を除去した後、受胎産物の胚と胚体外部分を、タングステン針で分離した。結節と原始線条を取り出し、胚部分を、氷上のＰＢＳ中の２．５％パンクレアチンおよび０．５％トリプシン中で８分間インキュベートした。インキュベーション後、胚を、氷上の１０％ＦＣＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭに移した。次に、外胚葉、内胚葉および中胚葉を、タングステン針を用いてきれいに単離することができた。

［内臓内胚葉細胞およびｈＥＳおよび分化心筋細胞の共培養］
ａ）共培養
ＥＮＤ−２細胞、Ｐ１９ＥＣ、ｈＥＣおよびｈＥＳ細胞を、前述のように培養した（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、１９９１年；ｖａｎｄｅｎＥｉｊｎｄｅｎ−ｖａｎＲａａｉｊら著、１９９１年；Ｓｌａｇｅｒら著、１９９３年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆら著、２０００年）。全ての実験において、ＥＳＩ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆら著、２０００年）からのｈＥＳ２細胞株を用いた。共培養を開始するために、実施例１に記載のようにマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した有糸分裂不活性のＥＮＤ−２細胞培養で、ｈＥＣ、ｍＥＳおよびｈＥＳ用のフィーダーであるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を置き換えた。フィーダーに依存しないＰ１９ＥＣとの共培養を、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように開始し維持した。次に、培地を２〜３週間成長させ、５日目からの収縮筋肉の領域の存在について評価した。

（ｂ）一次ヒト成人心臓細胞の単離
手術生検からのヒト心房細胞が、抗体染色、電気生理学およびＲＴ−ＰＣＲによるイオンチャンネルの特徴付け用の対照として使用された。心臓手術を受ける患者からの同意を得た心臓組織を得た。手術中に定法で除去された心房付属器を、直ちに、氷冷クレープス−リンガー（ＫＲ）食塩水に移した。過剰結合組織および脂肪組織を切り取り、滅菌ＫＲ溶液で２回洗った。心筋組織を、滅菌鋏で切り刻み、次に、公開された方法（Ｐｅｅｔｅｒｓら著、（１９９５年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６８巻、Ｈ１７５７〜Ｈ１７６４）を用いて３段階酵素的単離手順により分離して個々の細胞を放出した。第１の段階は、３７℃で４．０Ｕ／ｍＬプロテアーゼ型ＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ製、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて１５分間インキュベートすることを含む。次に、組織を、１．０ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼおよび０．５ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼを含む溶液に移し、続いて、コラーゲナーゼ（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いてさらに３回、各々３７℃で２０分間インキュベートした。組織抽出物を一緒にし、カルシウム濃度を１．７９ｍｍｏｌ／Ｌに回復させた。心筋細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、２．０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−カルニチン、５．０ｍｍｏｌ／のクレアチン、５．０ｍｍｏｌ／Ｌのタウリンを加えた組織培養培地Ｍ１９９に移し、５０μｇ／ｍＬのポリＬ−リシンを被覆したガラスカバースリップ上に直接接種し、一晩培養した。

（ｃ）免疫細胞化学
付着した一次心筋細胞、ｍＥＳ（Ｅ１４およびＲ１）およびｈＥＳ誘導心筋細胞を、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＰＢＳ中の３．０％パラホルムアルデヒドで室温にて３０分間固定し、次に、ＰＢＳ中の０．１％トライトンＸ１００で４分間透過性にした。α−アクチニンおよびトロポミオシン（Ｓｉｇｍａ製）を含む筋節タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて標準的方法により免疫細胞化学を実施した。ミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ａ／２ｖ）のアイソフォームに特異的な抗体を用いて、心房細胞と心室細胞（ＤｒＫｅｎＣｈｉｅｎから戴いた）とを区別した（表１）。二次抗体は、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。培養した心臓線維芽細胞は、筋節タンパク質用のネガティブコントロールとして役立ち、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５Ｍエピ蛍光顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ製、ＪｅｎａＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を可視化した。画像処理ソフトウェアを用いて画像を擬似着色した。

（ｉｉ）ｍＥＳ−ＥＮＤ−２共培養
２つの独立したマウスＥＳ細胞株（Ｅ１４およびＲ１）を、それらの共培養条件への反応について試験した。培養は単一細胞懸濁液として開始されなかったが、３日以内に、最初に接種したよりも大きな凝集塊が、両方の細胞株について明らかとなった（図３ｂ、ｃ）。殆ど同時に、自発的収縮心筋細胞の著しい領域がＲ１ＥＳ細胞培地において明らかとなったが、僅か７日後には、収縮筋肉の（より小さな）領域がＥ１４ＥＳ細胞中において見つかった。収縮領域中の細胞は、α−アクチニンで染色した場合に、筋細胞の特徴的筋節バンドパターンを示した（図６ｄ参照）。

（ｉｉｉ）ｈＥＣ−およびＥＮＤ−２共培養
ヒトＥＣ細胞株ＧＣＴ２７Ｘは、フィーダーに依存する全能ＥＣ細胞株であり、ヒトＥＳ細胞（Ｐｅｒａら著、（１９８９年）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第４２巻、１０〜２３頁）に類似の特徴を有する。ＥＮＤ−２細胞との共培養において、大きな凝集塊の形成が観察された（図３ｄ）。しかしながら、３週間後でも、収縮筋肉の証拠は無かった。

（ｉｖ）ｈＥＳ−ＥＮＤ−２共培養
共培養の第１週中に、細胞の小さな塊が徐々に広がり分化して、混合形状を有するが上皮様細胞の割合が比較的高い細胞を得る。第２週までに、これらは膨張して流体を満たした嚢胞になる（図示せず）。これらの間に、細胞の異なる区画が明らかになり、数日後に収縮するようになる。１２〜２１日の間に、これらの収縮している区画が次第に多く現れる（例えば、図３ｅ）。全体では、１５〜２０％のウェルが収縮筋肉の１または２以上の領域を含む。収縮速度は１分当たり約６０回であり、マウスＥＳ誘導心筋細胞と比べて高度に温度感受性である。これらの細胞は、α−アクチニンで陽性に染まり、その筋肉表現型が確認される（図６ｅ）。しかしながら、ｍＥＳおよびＰ１９ＥＣ誘導心筋細胞と対照的に、筋節バンドパターンはあまり定まらないが、培養中で２日しか増殖していない一次ヒト心筋細胞と充分に匹敵している（図５および６ａ〜ｃ）。一次ヒト心筋細胞は初期に筋節構造を維持するが、標準的培養条件により、劣化が迅速になることが明らかである（図５）。ｈＥＳ培養条件は、心筋細胞に最適ではなく、そのために、ｈＥＳ誘導心筋細胞はその特徴的表現型において同様に劣化を示すことが推定される。培地中の幹細胞から充分に機能的な心筋細胞を得るために、これらの条件を最適化することが必要である。筋節構造における劣化にも拘わらず、ｈＥＳ誘導心筋細胞は数週間にわたって周期的に収縮を続け、活動電位は、図４（ｃ）に示すように電極を凝集塊に導入することにより行われる電流固定電気生理学により検出することができる（図４ｂ）。しかしながら、このように電気生理学を行う、すなわち、単一細胞よりも凝集塊において電気生理学を行うことにより、細胞の群の蓄積された結果である活動電位が得られる。従って、これらは理解が困難であり、心室細胞、心房細胞またはペースメーカー細胞のいずれに帰することが困難である。単一細胞について決めるために凝集塊を分離し再培養する作業が現在進行中である。

（ｖ）幹細胞分化中の心臓イオンチャンネル発現
心臓発育中に、成体活動電位のその後の相の原因となるイオン電流が生じる順番が、電気生理学的研究において確立された（Ｄｖｉｅｓら著、（１９９６年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第７８巻、１５〜２５頁）。内向きＬ型Ｃａ²⁺電流は、初期心臓胚形成において重要な役割を果たすが、内向きＮａ²⁺電流は、出産直前にしか上昇しない（Ｄａｖｉｅｓら著、１９９６年）。マウスＥＳおよびＰ１９ＥＣ細胞は、イオン電流発現において同様のタイミングを示す（Ｗｏｂｕｓら著、（１９９４年）、ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅ．Ｂｉｏｌ．第３０Ａ巻、４２５〜４３４頁）。Ｐ１９ＥＣ細胞の分化中の分子水準でのイオンチャンネル発現の順序を解明するために、我々は、未分化かつ１６日齢の、−４０〜−６０ｍＶの比較的陽性の膜電位（ＩＫ１が無いまたは少し）であるＰ１９誘導心筋細胞の収縮塊から単離されたＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを行った。これらの結果は、ｍＥＳ誘導心筋細胞について先に記載（Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓら著、（１９９８年）、ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．第３９巻、３４〜３９頁）したように、１６日齢のＰ１９心筋細胞がイオンチャンネル発現に関して胎児心筋細胞に似ていることを示している。

［内臓内胚葉様細胞との共培養により誘導されるヒト胚性幹細胞の心筋細胞分化］
（ａ）方法
ｉ）細胞培養
ＥＮＤ−２細胞およびｈＥＳを、実施例１に記載のように培養した。全ての実験において、ＥＳＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｔｅＬｔｄからのｈＥＳ２細胞株を用いた。共培養を開始するために、マイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した有糸分裂不活性のＥＮＤ−２細胞培養で、ｈＥＣ細胞用のフィーダーとして、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を置き換えた。次に、共培地を６週間まで成長させ、５日目からの収縮筋肉の領域の存在について評価した。肝臓実質細胞に似ている癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（Ｋｎｏｗｌｅｓら著、（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９巻：４９７〜９頁）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、１週間に２回継代培養した。ＥＮＤ−２細胞のように共培養を開始したが、ＨｅｐＧ２は集密性単層として成長せず、ｈＥＳ細胞がＨｅｐＧ２に選択的に付着した。Ｐ１９ＥＣ細胞の懸滴培養を開始し、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように通常のＦＣＳを用いて、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２（１：１）中に維持し、一方、ノーザンブロット用のＲＮＡを単離するためのＥＮＤ−２調整培地の存在または不存在下におけるＰ１９胚体のバルク生成を、前述（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように活性炭処理したＦＣＳの存在下に行って、ＦＣＳ中にレチノイド様活性を有する可能性のある親油性物質により引き起こされる心筋細胞分化の背景水準を低下させた。電気生理学のために、コラーゲナーゼを用いて収縮性凝集塊を分解し、ゼラチン被覆オーバースリップ上に乗せた。

ｉｉ）免疫組織化学
付着した一次心筋細胞ｈＥＳ誘導心筋細胞を、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＰＢＳ中の３．０％パラホルムアルデヒドで室温にて３０分間固定し、次に、ＰＢＳ中の０．１％トライトンＸ１００で４分間透過性にした。α−アクチニンおよびトロポミオシン（Ｓｉｇｍａ製）を含む筋節タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて標準的方法により免疫細胞化学を実施した。ミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ａ／２ｖ）のアイソフォームに特異的な抗体を用いて、心房細胞と心室細胞（ＤｒＫｅｎＣｈｉｅｎから戴いた）とを区別した。Ｏｃｔ−４およびα１ｃ抗体はＳｉｇｍａ製である。二次抗体は、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ．製である。

ｖ）ノーザンブロット
ＲＮＡは、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９０年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１４２巻：４０６〜４１３頁）のようにＰ１９凝集塊から単離され、ポリＡ＋ＲＮＡが選択された。

（ｂ）ヒトＥＳ細胞の心筋細胞分化
本明細書で記載の実験の大部分は、ｈＥＳ２細胞株（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、２０００年）を用いて行った。細胞を、前述（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、２００２年）のように血清含有培地においてマイトマイシンＣ処理ＭＥＦ「フィーダー細胞」と共培養することにより未分化状態に維持した。これらの条件下において、培養の塊中の全ての細胞が、ｏｃｔ−４について核染色を示すが、培養の端部における平坦細胞は陰性であった。Ｏｃｔ−４発現は、未分化細胞の表現型特性に関連する。未分化細胞の小さい塊を、新しいマイトマイシンＣ処理ＭＥＦに、またはマイトマイシンＣ処理ＥＮＤ−２細胞の集密性培養に移すことによりｈＥＳを二次培養した。これらの条件下で約５日後、上皮細胞が明白になり、次の数日で、流体で満たされた嚢胞になった（図１Ａ）。これらはαフェトプロテインを染色し、胚体外内臓内胚葉であることが分かる。さらに、１０日までに、より固体の凝集塊中で周期的に収縮している種々の全体形状（図１Ｂ、３ｅ）の細胞の領域が明らかになった（図１Ａ、３ｅ）。１２ウェルプレートのウェルの１６〜３５％が収縮領域を含み、各々を分解し置き換えることにより、３次元構造よりも２次元構造を有する収縮細胞の１２個までの新しいコロニーが産生され；これにより、パッチ−クランプ電気生理学によるさらなる特徴付けのために細胞に接触することが容易になる（図４、図９；以下参照）。分解の前後において、ｈＥＳ誘導心筋細胞は１分当たり４５〜６０回収縮し、時には不規則に収縮し；収縮は、カルバコール、イソプレナリンおよびフェニレフリンのような薬理学的作動薬に反応してアップレギュレーションされる。

（ｃ）ｈＥＳ／ＥＮＤ−２共培養における心臓イオンチャンネルおよび幹細胞／筋節マーカーの発現
心臓特異的イオンチャンネルの発現を、未分化ｈＥＳ細胞および、ＥＮＤ−２細胞との共培養の９日および１４日後の分化細胞において判定した（図８）。先に他で示されている（Ｋｅｈａｔら著、２００１年）ように、収縮しているｈＥＳに由来する心筋細胞の領域はＡＮＦを発現する。心臓特異的Ｌ型カルシウムチャンネル（α１ｃ）および一時的外向きカルシウムチャンネル（Ｋｖ４．３）のα−サブユニットの発現も検出され、Ｋｖ４．３の発現は、収縮の開始より数日間早い。遅延整流カリウムチャンネルＫｖＬＱＴ１用のＲＮＡは、未分化細胞において見られ、これは、初期分解中に消滅し、やや後の段階において再び現れる。

（ｄ）電気生理学
ｈＥＳ心筋細胞の解離し再培養した凝集塊のパッチクランプ電気生理学は、胎児起源の一次ヒト心筋細胞（図９Ｂ）に匹敵する範囲の（電気的）表現型が培養中に存在する（図９Ａ）ことを示した。心室様活動電位が主要であった（３１決定のうち２８）が、心房細胞とペースメーカー様細胞の両方共が存在した（それぞれ、３１決定のうち２および１）。注目すべきは、比較的遅い上昇速度（７．０＋／−０．８Ｖ／ｓ）および低い膜電位（図９Ａ）であり、これは、細胞が、妊娠１７週の胎児ヒト心筋細胞と比較しても比較的未熟であったことを示している。細胞が収縮していないが収縮領域から区別できない形状を有する共培養の領域において、電流注入は、繰り返し活動電位および持続する規則的収縮を誘導するのに充分であった。さらに、ｈＥＳ細胞とＨｅｐＧ２細胞との共培養により、ｈＥＳ−ＥＮＤ−２共培養におけるものと類似の活動電位を有する心筋細胞が得られた。

従って、マウスからの内臓内胚葉様細胞と共にｈＥＳ細胞を共培養すると、分化プログラムが始まり、収縮筋細胞が形成されることが示されている。筋節マーカータンパク質およびイオンチャンネルの発現は、これらの細胞が心筋細胞であることを示しており、単一細胞についてのパッチ−クランプ電気生理学は、大部分が心室の表現型であることを示している。この系は、通常達成が困難である、培地におけるヒト心筋細胞の研究のためのモデルを提供し、虚血性心臓疾患において失われた心室細胞の置換が心臓機能の回復を補助すると想像される場合の心筋細胞移植治療の可能性を提供する。これは、体細胞系への自発的分化を起こさないｈＥＳ細胞株における心筋細胞分化の誘導を始めて示すものである。

図１Ａは、１３日後のＥＮＤ−２細胞と共培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の位相差顕微鏡写真を示す図である。分化した幹細胞は、混合形状を有するが、上皮様細胞の割合が比較的高い。上皮細胞は膨張して流体充填嚢胞になり、これらの細胞の間に心筋細胞のパッチがある。示されるコロニーの断面は約２ｍｍ（対物レンズ４０×）である。目盛り棒＝１００μｍ。図１Ｂは、２〜３週間後のＥＮＤ−２細胞と共培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の位相差顕微鏡写真を示す図である。収縮心筋細胞（心筋細胞；ｂｍ）のパッチの増加がある。観察された収縮速度は、１分当たり約６０回収縮である（対物レンズ２０×）である。目盛り棒＝１００μｍ。 α−アクチニンで陽性染色された細胞を示し、本当の筋細胞であることを確認する図である。目盛り棒＝１００μｍ。マウス内臓内胚葉様細胞系ＥＮＤ−２と幹細胞との共培養を示す図である。（ａ）正常単層培地におけるＰ１９ＥＣ、ＥＮＤ−２細胞との共培養の開始から３日後および、収縮筋肉（Ｂ．Ｍ．）が明らかな場合には１０日後。（ｂ）正常「フィーダー」細胞上の単層におけるｍＥＳ細胞株Ｒ１（ＳＮＬ）、共培養の開始から３日後および、収縮筋肉が明らかな場合には２日後。（ｃ）は凝集から７日後にＢ．Ｍ．が明らかであることを除いて（ｂ）と同様。（ｄ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）供給細胞上のＧＣＴ２７ＸヒトＥＣ細胞株、共培養の開始から３日後および、１６日後。収縮筋肉が存在しない。（ｅ）ＭＥＦフィーダー上のｈＥＳ細胞、ＥＮＤ−２共培養の開始から３日後および、１１日後に収縮筋肉が形成。幹細胞からの心筋細胞の電気生理学的特性を示す図である。自発的に収縮している領域から記録された繰り返し活動電位。（ａ）マウスＰ１９ＥＣ細胞誘導心筋細胞。（ｂ）ｈＥＳ誘導心筋細胞の凝集塊。（ｃ）（ｂ）に示す記録が由来するｈＥＳ培地の収縮領域の位相差像。（収縮領域が配される突起構造の高さに注目、対物レンズ２０×）。単離心筋細胞を示す図である。（ａ）２日間培養した細胞と比較して鋭い端部および良好に形成された筋節を示す。（ｂ）筋節パターンを崩した。（ａ）は単離および固定後の複数細胞の位相差像。（ｂ）は、（ａ）と比べて２倍にデジタル的に拡大した単一細胞。成人ヒト一次心房心筋細胞および幹細胞誘導心筋細胞についての免疫細胞化学を示す図である。一次心房心筋細胞は、（緑色）αアクチン、（赤色）ｍｌｃ−２ａ（ａ）およびトロポミオシン（ｂ）を含む筋節タンパク質について陽性に染色された。細胞ＤＮＡを、Ｈｏｅｃｈｓｔで（青色に）染色して、正常細胞とアポトーシス細胞とを区別した。２日間培養した細胞は、崩れたトロポミオシン筋節パターニングおよび散漫な抗体染色を示した（ｃ）。ｍＥＳ誘導心筋細胞も、αアクチンで染色した場合に鋭いバンドを示す（ｄ）が、ｈＥＳ誘導心筋細胞では、α−アクチニンが散漫で、あまりバンド形成していない（図示せず）。（ｅ）は、低倍率で、ｈＥＳ誘導心筋細胞における全体としての強度のα−アクチニン染色を示す。マウスにおける左心室機能の血行力学的査定を示す図である。（ａ）正常ループは、マウス心臓における体積変化と圧力変化との間の関係を表し、収縮および弛緩の１サイクル中の弁に関する事項および段階が示される。（ｂ）心筋梗塞の４週間後の圧力体積関係：ループの形状の相違、および収縮と弛緩とにおける変化に注目。ＲＴ−ＰＣＲによるｈＥＳとＥＮＤ−２細胞の共培養における心筋細胞マーカーｍＲＮＡの発現を示す図である。Ａ．パッチクランプ電気生理学による活動電位およびイオンチャンネルおよびＢ．Ｃａ²⁺の実時間分析の分析を示す図である。Ｐ１９胎児性癌細胞へのＥＮＤ−２調整培地の効果を示す図である。Ａ．Ｐ１９ＥＣ凝集塊における収縮筋肉の誘導。７日目および８日目における２つの独立クローン（Ｐ１９ＥＣおよびＰ１９クローン６ＥＣ）からの結果を示す。全ての凝集塊は、１０日目にＤＭＳＯの存在下に収縮する。Ｂ．Ｐ１９ＥＣ凝集塊におけるＥＮＤ−２調節培地によるＢｒａｃｈｙｕｒｙＴの誘導を示すノーザンブロット。ＤＭＳＯは心筋細胞分化も誘導し、対照として示される。ＥＮＤ−２ＣＭとＤＭＳＯの両方が誘導したＢｒａｃｈｙｕｒｙＴ発現はアクチビンにより阻害される。

Claims

未分化のｈＥＳ細胞を心筋細胞へと分化させる方法であって、
ｈＥＳ細胞の未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞への分化を誘導するために、内胚葉細胞の存在下に、ｈＥＳ細胞を培養すること
を含む方法。
未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞を含む細胞集団を得る方法であって、前記未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞は細胞集団における未分化のｈＥＳ細胞に由来するものであり、前記方法は、請求項１の未分化ｈＥＳ細胞の分化を誘導することを含む、方法。
前記内胚葉細胞が、内胚葉様ＥＮＤ−２細胞株である請求項１又は２の方法。
内胚葉の組織が、原腸形成胚に由来する請求項１の方法。
前記内胚葉細胞が、マウス７．５日胚に由来する請求項１〜４のいずれか１項の方法。
内胚葉細胞を実質的に集密な単層にまで予備培養することと、
内胚葉細胞単層の存在下で、ｈＥＳ細胞を共培養することと
をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項の方法。
細胞集団が未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞からなる請求項２〜６のいずれか１項の方法。
未成熟心筋細胞を含む単離細胞集団であって、前記未成熟心筋細胞又はその祖先細胞が、内胚葉細胞の存在下で共培養された前記細胞集団中の未分化ｈＥＳ細胞に由来する、単離細胞集団。
未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞は、細胞集団中の５％より多い請求項８の単離細胞集団。
未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞からなる請求項８の単離細胞集団。
請求項２〜１０のいずれか１項の方法により調製された単離細胞集団。
請求項１〜７のいずれか１項の方法により調製した単離未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞。
患者の心臓疾患又は心臓の状態の治療又は予防に使用するための請求項１１の単離細胞集団。
心臓疾患又は心臓の状態が、心筋梗塞又は心臓肥大からなる群から選択される請求項１３に記載の単離細胞集団。
損傷した心臓組織を修復するために使用する請求項１３の単離細胞集団。
損傷した心臓組織が、心臓の虚血の結果によるものである請求項１５に記載の単離細胞集団。
請求項１２の心筋細胞祖先細胞を移植により受容した、心機能の測定可能なパラメーターを有する非ヒト免疫不全動物と、
心筋細胞の移植の前後に前記動物の心機能を決定する手段と
を含む、心臓移植のための心筋細胞の適合性を試験するための動物モデル。
免疫不全動物が、梗塞後の心筋変性のモデルとして作成された請求項１７のモデル。
心機能のパラメーターが収縮機能である請求項１７又は１８に記載のモデル。
測定可能な心機能を有する非ヒト免疫不全動物に移植され、前記動物の心機能が心筋細胞の移植の前後に測定される、心臓移植のための心筋細胞の適合性を試験する方法に使用するための請求項１２の未成熟心筋細胞及び／又は心筋細胞祖先細胞。