JP2004534632A

JP2004534632A - 合成装置およびその製造方法

Info

Publication number: JP2004534632A
Application number: JP2002567462A
Authority: JP
Inventors: ラウ、ハラルド; フランク、ミヒャエル; シュミット、クリスティーナ; ディックコプフ、シュテファン; ブルケルト、クラウス
Original assignee: グラフィニティー、ファーマスーティカルスアーゲー
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2004-11-18
Also published as: HUP0401128A2; DE10108892A1; US20040131510A1; CA2439102A1; WO2002068113A1; ATE327825T1; EP1361920B1; DE10108892B4; EP1361920A1; WO2002068113A8; DE50206996D1; HUP0401128A3

Abstract

本発明は、特にコンビナトリアルケミストリー（例えば、固相合成）において使用される合成装置、およびその製造方法に関する。本発明にかかる合成装置は、壁および／または底部を備えた容器、例えばマイクロタイタープレートと、固相合成に使用するのに好適な固相担体、例えば膜とを実質的に含む。固相担体のある領域、好ましくは非常に限定された領域における熱的作用によって、担体は、容器の少なくとも一部に固定される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、コンビナトリアルケミストリー（例えば、固相合成）のための合成装置、および、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種の化学製品を製造するために、この多種の化学化合物の合成時間を最小化し、可能であれば同時に全ての手順を自動化し、装置のサイズを小型化するような、様々な方法および装置が過去に開発されている。ここでは、種々の化学製品のための合成手順のパラレル化が重要な役割を果たし、すなわち、全ての合成が、一つの合成プロトコルに従って進められなければならない。
【０００３】
固相での合成は、特によく適合して上記要求を満足することが明らかになってきた。メリフィールド（Merrifield）等によって、固相合成の分野での最初の開発がなされた（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)）。
【０００４】
多種の化学化合物を生成するために用いられる合成コンセプトは、いわゆるコンビナトリアルケミストリーである。これは、少数の、しばしば自動化された反応系列で、多種の異なる化合物（いわゆる、化合物ライブラリ）を生成し得る技術の全範囲を含む（例えば、M.A: Gallop et al, J. Med. Chem. 37 (1994), 1233-1251; E.M. Gorden et al, J. Med. Chem. 37 (1994), 1385-1401を参照されたい。）。ここでは、実用上の理由から、反応は固相で実施されることが好ましい。担体物質は、通常、横方向にインターレース状に配された粒子状のポリマー（いわゆる、ポリスチロール、またはポリエチレングリコール／ポリスチレン樹脂のビーズ）である。所望の構造は、官能化された表面から始まり、複数の合成工程で作り上げられる。固相および溶液での化合物ライブラリの合成の概略が、L.A. Thompson and J.A. Ellman, Chem. Rev. 96 (1996), 555-600にある。固相コンビナトリアル合成が終了した後、一般に、最終生成物と担体樹脂との間の不安定な結合を分離することによって、生成物が固相から切り離される。ここでは、しばしばリンカーが使用され、これは、担体樹脂と所望の化学化合物との間の結合要素として機能する（固相担体、リンカーおよび好適な反応については、Florenzio Zaragoza Dorwald, Organic Synthesis on Solid Phase, Supports, Linkers, Reactions, Wiley-VCH, Weinheim 2000を参照されたい。）。
【０００５】
既に述べたビーズに加えて、平面状担体もまた、固相合成のおいて重要な役割を果たしている。ここで最も重要な物質は、ガラス、セルロースおよびその他のポリマー物質の膜である。合成目的においては、できるだけ高い単位（表）面積当りの合成容量を達成し、共通の処理を保証するため、物質は多孔性で、機械的および化学的に安定であり、容易に切り離しできなければならない。これらの条件は、（セルロースのような）天然物および合成物由来の膜のみが満足する。後者は、例えば、順にアミノメチル化によって官能化されるポリスチレンと積層したポリエチレン、架橋したポリヒドロキシプロピルアクリレートで被覆されたポリプロピレンによって作製される（Michal Lebl, Biopolymers (Peptide Science) 47, 397-404 (1998)）。また、コンビナトリアルライブラリ合成のため、横方向にインターレース状に官能化されたテフロン（登録商標）膜を使用することが知られている（M. Stankova, S. Wade, K.S. Lam, M. Lebl, Peptide Research 7, 292-298 (1994)）。更に、オリゴペプチドおよびヌクレオチド合成のためのポリマー化合物膜が、米国特許第４９２３９０１号に記載されている。
【０００６】
固相合成に使用される担体に加えて、合成反応器の幾何学的形状の選択もまた、自動化および小型化において重要な役割を果たす。ここで反応領域は、一般に、均一な格子状に配置され、位置合わせされなければならない。通常は、固相物質（ビーズ、膜片など）が導入された容器が使用され、容器は、成形よって互いにしっかりと結合されている。ピペット操作などに有効なロボットの使用を促進するため、容器は、その上部で開口していなければならない。例えばマイクロタイタープレートが、これらの条件に見合っている。膜が使用される場合、膜シート全体を、平面状合成反応器とみなすことができる。
【０００７】
後者の場合においては、特にスポット合成が適用可能であり、これは、セルロースの場合にも適用される（Michal Lebl, Biopolymers (Peptide Science) 47, 397-404 (1998)）。スポッティング法においは、移送ピン（transfer pins）またはマルチピペット（multiple pipetter）によって、試験物質がマイクロタイタープレートから担体上に移される。ここで、移送ピンは試験液に浸され、その後、移送ピンの先端に付着した試験液の液滴が担体上に置かれる。ピンのサイズを変化させることにより、移送させ得る試験液の量を変化させることができる。シャーン（Sharn）等は、様々に官能化したポリプロピレン膜における、１，3，５−トリアジンのコンビナトリアル化合物ライブラリのスポット合成を記載している（D. Scharn, H. Wenschuh, U. Reineke, J. Schneider-Mergener, L. Germeroth, J.Comb. Chem. 2, 361-369 (2000)）。
【０００８】
スポッティング法の利点は、液を付着させる間、スポットの周囲から濃度を変化させることができることである。更に、複数の試薬が均一な反応混合物を形成するのであれば、一つの反応工程に対して複数の試薬を連続的に添加することが可能である。また、洗浄溶液などのバッチ試薬による、単一の反応スポット（膜領域）の個々の（スポット様）処理は、不可能または非常に困難である。
【０００９】
例えばマイクロタイタープレートなどの反応器を使用すると、担体物質を反応器内に固定できるという利点がある。これは、制御不能な試薬溶液中での浮遊を防ぐことができる。固定は、担体が全体的に浸され、よって全体に渡って同一の試薬濃度となることを保証する。減圧下での操作においても、いわゆるプレートウォッシャーの使用においても、固定は有効である。ここで、絶対的な合成容量に基づくと、一つの膜ユニットと多数のビーズユニットとが等しい、すなわち、マイクロタイタープレートのキャビティ底部のサイズの膜片に匹敵する合成容量を達成するためには、非常に多量のビーズが必要であるため、通常、膜片はビーズよりも好ましい。このようなビーズは取扱いが困難であり、その固定は非常に扱い難い。
【００１０】
ＷＯ９４／０５３９４Ａには、固相担体の固定の様々な可能性が記載されている。一方では、最上層の対応する開口によって反応器が形成されている、反応多層担体（３つのプレート）が示唆されている。底部領域には、適当な接着剤によってビーズが固定されている。既に述べたように、非常に小さい粒子を取り扱う必要があるため、これは非常に不便である。更に、合成条件および使用される試薬を、使用される接着剤に適応させなければならない。また、ビーズの合成特性に接着剤が悪影響を及ぼすことを無視することはできない。
【００１１】
ＷＯ９４／０５３９４Ａに記載された別の案は、多層反応器の底部領域にポリマーフィルムを積層することを示唆している。ここで、ポリエチレンである下層には、複数の工程で酸塩化物官能性が付与されており、これには、例えばメタクリルアミドポリマーが適用され、ポリアミドゲルが順に積層され、ビスアクリルアミドと横方向に交錯し、例えば、適当なリンカーまたはスペーサーを固相合成のため化学的に結合するために、更に官能化される。このような固相合成に好適なポリマーフィルムの構成は、幾つかの化学的工程を包含し、強く求められている。更に、多層反応器を構成する間、各プレート間の中間領域の十分な気密性に注意を払わなければならない。
【００１２】
ＷＯ９４／０５３９４Ａに記載された更なる可能性は、直径１／４”、厚さ１／８”の焼成ポリエチレンディスクの形態の基板の使用に始まる。これは、薄く、疎水性で、極性の、多官能化されたポリマーフィルム（ＨＰＭＰ）で被覆されており、反応空間全体が満たされるように、プレートの凹部にプレスされている。凹部へのフィルムのプレスは、フィルムが離脱することを防ぎ、一方で、底面のテーパーは、フィルムが下方に滑るのを防ぐ。更に、真空状態を作り出すための１以上の溝が設けられており、液輸送が促進される。ディスクのサイズは装置小型化の障害となり、吸引による液輸送は、装置側に困難であり、相当な努力がなければ小型化できない。
【００１３】
米国特許第６０６３３３８号は、分光法的目的のためにシクロオレフィンを含み、固相合成に好適であると言われる、マイクロタイタープレートを開示している。この文献は、すなわち、キャビティの内壁および底は、固相合成のために成分を固定するために官能化されなければならないこと示唆している。このようなアプローチの欠点は、表面処理によってのみ達成される、低い合成容量である。
【００１４】
ＷＯ９９／３２２１９Ａには、パラレル式で働く固相システムが記載されており、これは、膜全体が、互いに積層され、上側から下側に流れるポンプシステムを実現するために上側および下側にシリンダーノズルを有する、開口を備えたプレート間にプレスされている。更に、一体化されフリット化された底部を有するプレートの凹部によって形成された容器に導入される固相担体として、ビーズが示唆されている。液体のポンピングは、底部領域における確かな固定が可能であること、すなわち、粒子の連続的な浮遊が防止されることを、少なくとも保証する。しかし、このようなポンプシステムがまさに必要とされ、小型化の達成が非常に困難である。特に、膜シートが使用される場合、一つの流れチャネルの、隣接するチャネルに対する封止が達成されることに注意を払う必要がある。また、バルブの使用は、装置側に追加の負担を招くことが示唆されている。
【００１５】
ＥＰ０６０８７７９Ａには、個々のキャビティに膜片が締付けられ、これによって固定されている、マイクロタイタープレートを備えた、ペプチド合成のための装置が開示されている。締付けは、膜片の直径を、キャビティの直径よりも幾分大きくなるように選択することにより達成される。ここでは、特に、膜とマイクロタイタープレート底部との間のマージン領域において、空洞空間が形成され、これは妨げられない流体交換の障害であるという不都合がある。更に、特定の操作の間、例えば真空乾燥の間、膜片がキャビティから脱離するのを防止できない。また、例えば９６マイクロタイタープレートにおいて必要とされるように、小さく薄い膜片が使用される場合、膜片の縁端は、液体と接触するように巻き上げ可能であり、よって、固定作用が取り除かれるため、このような固定のためには、一定の膜厚が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、固相担体が反応容器内に固定された、改良された合成装置またはデバイス、並びにその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的は、独立クレームの特徴によって達成される。好ましい形態は、従属クレームに記載される。
【００１８】
本発明は、容器の壁面および／または底面領域を有する容器、および、好ましくは、固相担体の相対的に限定された領域に対する熱的作用によって、少なくとも１つの容器領域において担体の固定が達成される固相合成において使用される固相担体とを実質的に備えた合成装置を用いるという基本アイデアから発している。
【００１９】
本発明の好ましい形態によれば、ポリマーを有する化学的に官能化された膜を、固相担体として使用する。好ましくは、多数の容器は、均一な格子状に配列され、キャスティングまたはインテグラルハウジングによって互いに結合されている。この配列はプラスチックに有利であり、特に好ましくはマイクロタイタープレートである。膜と容器の内表面との結合は、好ましくは点溶接法により達成され、すなわち、両方の材料は、理想的には熱可塑性を有し、溶融プロセスによって互いに安定な結合を形成するものである。しかしながら、例えば、テフロン膜およびセルロースの場合、驚くべきことに、プラスチック容器が熱可塑性を有してさえいれば十分である。貼合または溶接（固定）は、機械的または化学的衝撃の両方に対して非常に安定であり、膜が破壊しない限り、通常の脱離は不可能である。更に、使用されるプラスチックは、化学合成のために使用される化学種および溶媒に対して安定でなければならない。更に、一定の熱的安定性が有利である。
【００２０】
ポリプロピレンは、プラスチック容器に特によく適することが示された。ポリプロピレンは、ほぼ全ての有機溶媒に対して不活性であり、攻撃性試薬に対しても安定である。有用な温度範囲は、通常、約−８０℃〜１００℃である。容器として、様々なサイズの標準化ポリプロピレンマイクロタイタープレート（ＰＰ−ＭＴＰ）が入手可能である。これらは、種々のキャビティ数および大縮尺の容積で得られる。このとき、ポリプロピレンＭＴＰは、２４，９６，３８４または１５３６個のキャビティ、８μｌ〜２．７ｍｌの容積、キャビティ１個当り１．５６ｍｍ²〜７００ｍｍ²の底面積で、入手可能である。種々の多孔性吸収性ポリプロピレンおよびテフロン膜が、反応相として好適であることが明らかになった。種々の反応性官能性の装填密度（８０〜２５００ｎｍｏｌ／ｃｍ²）を有するポリプロピレン膜が入手可能である。これらの膜は、官能基として水酸基およびアミノ基を有するものが入手できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明に好ましい形態を、図面を用いてより詳細に説明する。
【００２２】
図１に示す本発明にかかる実施形態においては、容器の底部領域に膜が固定されている。しかしながら、膜は、容器またはキャビティの壁部領域に固定されていても、壁部領域に追加的に固定されていてもよい。膜片の幾何学形状は、キャビティに、特にキャビティの底部に対して、形状が実質的に同じ（例えば、円形のキャビティに対しては円形の膜片）であり、壁部が殆どまたは全く膜と接触しないように、適合されていることが有利である。
【００２３】
上記合成容器の本発明にかかる製造方法の好ましい形態は、膜をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に打ち抜くことから始まる。ここで、例えば、ＭＴＰが型打ちブレードの下方に配置された、型打ち機が使用できる。このような型打ち機は、例えば、ＵＳ５１４６７９４Ａに記載されている。型打ちの間、膜の切り抜き（または膜片）は、好ましくは、直接ＭＴＰのキャビティ内に落ちる。膜の切り抜きは、キャビティ内で傾かないだけでなく、キャビティの内側のサイズよりも僅かに小さくなるように、寸法が決められる。
【００２４】
膜片が配されるＭＴＰに、適当な液体、例えばエタノールを噴霧することが有用であることが明らかとなった。そうでなければ、膜片は−おそらく静電気によって−部分的にキャビティの底部ではなく壁に付着するからである。
【００２５】
膜のＭＴＰへの固定には、驚くべきことに熱的方法が特に有利である。ここで、好ましくは、（例えば、電気で）４５０℃に加熱され、約０．３ｍｍの直径を有する金属先端が、０．８秒間、ＭＴＰのキャビティの底に配された膜に押し付けられる。この操作は、一般的なロボットで自動化してもよい。溶接の間、（ポリプロピレン膜の場合）膜、および、その下のＭＴＰ材料（例えば、ＰＰ−ＭＴＰ）の点状の溶融が生じる。続く硬化の間、２つの部材間で安定な結合が形成される。
【００２６】
膜は、材料の熱的溶融により、溶接点周辺の比較的小さい領域で、その多孔性を失う。相当の合成収率をもはや期待できない熱可塑性変形の領域は、溶融または溶接点の中心周辺の約０．７ｍｍである。しかしながら、驚くべきことに、認められる収率損失は、固定されていない小サイズの膜の切り抜きと比較して、無視できるほどに小さい。これは、通常、使用されるＭＴＰおよび膜片のサイズから依存している。市販の１５３６ＭＴＰに対して、幾何学的に決定される損失は、好ましくは５％以下である。
【００２７】
このように作製された複合成プレートは、適当な有機溶媒で洗浄し、その後、使用前に乾燥させせることができる。洗浄工程の間に、溶融中に生成された熱分解生成物は除去される。
【００２８】
本発明にかかる固体担体を備えた合成装置の使用によれば、一般的なピペッティングロボット、ディスペンジングオートマットおよびプレートウォッシャー、並びに真空乾燥の使用が可能である。更に、試薬溶液の多重添加および吸収が可能である。点溶接のため、膜片は、洗浄液およびその他の溶液によって非常によく洗浄され、固相担体と底部領域との間に液溜りは形成されない。更に、本発明にかかる装置は、種々のＭＴＰまたは膜を使用することによって、所望の合成量に対して非常に変化させることができる。合成量は、膜の面積によって非常によく調節することができる。膜の溶接における接触点のガラス化により、ＭＴＰの裏側において有利に、溶接の品質を視覚的に制御することが可能である。更なる利点は、膜を、打ち抜き前に、バッチ式で官能化することができる。
【００２９】
本発明にかかる合成装置の好ましい使用は、多数の様々な化合物を、非常に短期間で、且つ、比較的単純な手段で得ることができるため、コンビナトリアルケミストリーの分野における使用である。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）固定されていない膜と比較した、固定された膜の合成量の損失
ａ）幾何学的損失（金属針での固定によるガラス化面積の、図２の全面積に対する比）を、３８４ＰＰ−ＭＴＰについて、ＡＩＭＳサイエンティフィックプロダクツゲーベーアール（AIMS Scientific Products GbR）社製、ブラウンシュバイク（Braunschweig）（８００ｎｍｏｌ／ｃｍ²）のアミノ基官能化膜を用いて測定したところ、５％以下であった。
【００３１】
ｂ）ａ）と同条件下での化学収率の損失を、標準的なペプチド合成によるアミノ酸の結合と、それに続くＦｍｏｃ分析により測定した。ここでは、直径３ｍｍの円形の膜または辺長１．０５ｍｍの正方形の膜を、グライナー（Greiner）社の３８４ＭＴＰ、または、１５３６ＭＴＰに配し、熱い金属針で固定または溶接した。標準的な合成プロトコル（フィールズ（Fields）等、１９９０年）に従って、膜領域にＦｍｏｃ−アラニンを結合し、Ｆｍｏｃ分析によって膜の負荷（loading）を測定した。Ｆｍｏｃ保護基は、２０％ピペリジンによって分離され、Ｆｍｏｃ基の量は測光器で測定される（吸光係数Ｍ^−１ｃｍ^−１）。２８４ＭＴＰの膜領域においては、平均負荷は５２ｎｍｏｌと測定された。物質量の計算値は５７ｎｍｏｌであった。１５３６ＭＴＰの膜領域においては、平均８．５ｎｍｏｌ、計算値８．６ｎｍｏｌと測定された。
【００３２】
（実施例２）試薬残留物の除去
洗浄サイクルの間、試薬溶液（フルオレシン）に浸漬された膜領域を洗浄した。直径０．３ｍｍの膜を、グライナーバイオ−ワン（Greiner Bio-one）社（フリッケンハウゼン（Frickenhausen)）の３８４ＰＰ−ＭＴＰの８個のウェルに固定し、０．１ｍｇ／ｍｌのフルオレシン溶液３μｌ（＝２２０ｎｍｏｌ、０．０７３ｍｏｌ／ｌ）を添加し、蛍光（５０ｍｓ、５６０ｎｍ）を、ロッシュディアグノスティクスゲーエムベーハー（Roche Diagnostics GmbH）、マンハイム（Mannheim）のＬＵＭＩイメージャー（LUMI-Imager：登録商標）によって測定した。そして、モルキュラーデバイス（Molecular Devices）社（イスメニンゲン（Ismaningen））のエンブラ３８４プレートウォッシャーによって、エタノール（＋０．１％ＴＦＡ）で洗浄し、すぐに再び蛍光をＬＵＭＩイメージャーで測定した。下記の洗浄プログラムを使用した：
・溶液２０μｌを添加
・洗浄時間１０秒
・吸引（上昇（advance）２ｍｍ／秒、待機時間２秒）
最大で４回のこのような洗浄サイクルの後、図３に示すように、処理していない膜と何ら変わるところは検出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明にかかる合成装置の概略断面図である。
【図２】図２は、全面積に対するガラス化領域の比で表される、固定した膜の、固定されていない膜を比較した合成量の損失を示す。
【図３】図３は、試薬残留物の除去の種々のサイクルの間における３８４マイクロタイタープレートを示す。

Claims

少なくとも１つのキャビティを有する基板と、前記キャビティ内に配置された固相担体とを備え、前記固相担体は、全面積と比較して少なくとも相対的に小面積の部分で、前記キャビティの対応する部分に固定されている合成装置。
基板がマイクロタイタープレートであり、キャビティが、前記マイクロタイタープレートに設けられたウェルに相当する請求項１に記載の合成装置。
キャビティが、少なくとも１つの壁部と、１つの底部とを含む請求項１または２に記載の合成装置。
固相担体が、キャビティの底部および／または壁部に固定されている請求項３に記載の合成装置。
固相担体が、キャビティの少なくとも一部分に、熱エネルギーの作用によって固定されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の合成装置。
固相担体が、キャビティ毎に少なくとも１つの溶接点で、基板に固定されている請求項５に記載の合成装置。
固相担体が、化学的に官能化された膜である請求項１〜６のいずれか一項に記載の合成装置。
基板が、熱可塑特性を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の合成装置。
基板および固相担体の両方が、熱可塑特性を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の合成装置。
固相体が、テフロン膜、セルロース、ポリプロピレンを含む群より選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載の合成装置。
基板が、ポリプロピレン製である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の合成装置。
固相担体の形状が、底部に関して実質的にキャビティの形状である請求項１〜１１に記載の合成装置。
固相担体が、キャビティの壁部に殆ど接触しないように形成されている請求項３〜１２のいずれか一項に記載の合成装置。
合成装置、特に請求項１〜１３のいずれか一項に記載の合成装置の製造方法であって、
ａ）基板に、少なくとも１つのキャビティを設ける工程と、
ｂ）前記キャビティに固相担体を導入する工程と、
ｃ）前記固相担体を、全面積と比較して相対的に小面積の部分を、前記キャビティの対応する部分に結合させることによって、前記キャビティ内に固定する工程とを含む方法。
ｃ）工程における固定が、熱エネルギーの作用によって実施される請求項１４に記載の方法。
ｃ）工程における固定が、点溶接によって実施される請求項１５に記載の方法。
固相担体が、キャビティ毎に単一の点で固定されている請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
ｂ）工程における導入が、固相担体をシートから打ち抜くことにより実施され、打ち抜かれた固相担体がキャビティ内に落ちる請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
固相担体の形状が、底部に関してキャビティの形状と実質的に対応する請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
固相担体が、壁に接触しないでキャビティに導入可能なように形成される請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
ｂ）工程において固相担体を導入する前に、キャビティを、少なくともその壁部において、液体で湿らせる請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
ｃ）工程における固定が、約４５０℃に加熱され、約０．３ｍｍの直径を有する少なくとも１つの金属の先端で、約０．８秒間、固相担体をキャビティに押し付けることによって実施される請求項１５〜２１に記載の方法。
ｃ）工程における固定の間、結合領域のガラス化が生じる請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
コンビナトリアルケミストリー、特に固相合成における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の合成装置、または、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法の使用。