JP2004534502A - Methods for changing the sugar moiety - Google Patents

Abstract

Methods are provided for altering the structure of a sugar. The present invention relates to the structural diversity of sugars for specific metabolites through the recruitment and synergism of sugar genes from various saccharide biosynthetic pathways that result in metabolites containing unnatural sugars (eg, novel glycosylated polyketides). Provide a way to make changes. This alteration can be achieved in vivo via genetic engineering. For example, the methods of the present invention provide modified recombinant bacterial host cells that have been genetically engineered to produce novel polyketides having unnatural sugar structures.

Description

が挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドを天然に生成するポリケチド生成微生物の他の例としては、種々のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、ＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍおよびＮｏｃａｒｄｉａ株が挙げられる。好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．としては、
【００１０】
【数２】

が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
さらに、これらの同じ細胞は、本発明の核酸セグメントの好ましい供給源である。従って、糖生合成遺伝子をコードする任意の細胞は、本発明の核酸セグメントの供給源である。例えば、核酸セグメントの供給源は、ストレプトマイシン、カルボマイシン、タイロシン、スピラマイシン、ストレプトスライシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クロロエレマイシン（ｃｈｌｏｒｏｅｒｅｍｙｃｉｎ）、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）、ピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）、ウラマイシン（ｕｒａｍｙｃｉｎ）、グラナチシン（ｇｒａｎａｔｉｃｉｎ）、オレアンドマイシン、ランドマイシン（ｌａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、ミトラマイシン、エピルビシン、およびダウノルビシンを生成する細胞を含むがこれらに限定されない、糖を有する化合物、またはカリチェアミシンまたはナイスタチンのような他の糖含有化合物を生成する細胞である。これらは、本発明の実施における使用のための核酸セグメントの範囲内に含まれる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、デソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）生合成を変更するようにデソサミン生合成における酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列が破壊されており、そしてこの核酸配列の非破壊形態によってコードされている酵素のホモログをコードする核酸セグメントで増強されている組換え宿主細胞は、改変された組換え宿主細胞を生じる。１つの実施形態において、改変された組換え宿主細胞は、ｄｅｓＩにおける破壊を有さず、そしてｃａｌＨ核酸セグメントから構成されない。参照糖生合成酵素の「ホモログ」は、参照生合成酵素の基質を認識し得、そして反応を触媒し得る酵素である。例えば、ＴｙｌＢは、ＤｅｓＩのホモログであり、ＣａｌＨは、ＤｅｓＩのホモログであり、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭは共に、ＤｅｓＩのホモログであり、そしてＴｙｌＭ２は、ＤｅｓＶＩのホモログである。好ましいホモログは、産物（例えば、糖生合成における中間体）（これは、参照酵素の産物と異なる）を生成する反応を触媒する。ホモログは、本明細書中に記載されるような方法を使用して機能的に同定され得る。一般的に、ホモログは、参照酵素に対して少なくとも約２８％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１３】
本発明における使用のための核酸セグメントを同定するための他の方法は、ハイブリダイゼーション、または、例えば、デフォルト設定を使用するコンピューター補助配列整列による。本発明の１つの実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸セグメントにハイブリダイズする。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）の９．４７〜９．５１節を参照のこと。例えば、ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のための低いイオン強度および高温を使用する（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）；０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、または（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使用する（例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ６．５で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％ホルムアミド）。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃で、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、３７℃で、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および５０〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。
【００１４】
本発明の改変された組換え宿主細胞を調製する方法、およびこれらを使用する方法（例えば、生物学的に活性な産物または生物学的に活性な産物に改変され得る産物を調製するための方法）もまた提供される。
【００１５】
本発明はまた、単離されかつ精製された核酸セグメントを提供し、この核酸セグメントは、糖（デソサミン）生合成遺伝子クラスター、生物学的に活性なその改変体またはフラグメントを含む核酸配列を含み、ここで、この核酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣ遺伝子クラスターに由来しない。この遺伝子クラスターを含む単離された核酸セグメントとしては、好ましくは、配列番号３（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１４３９８を参照のこと）またはそのフラグメントもしくは改変体を含む核酸配列が挙げられる。このクラスターは、９個のポリペプチド（ＤｅｓＩ（例えば、配列番号７によってコードされる配列番号８）、ＤｅｓＩＩ（例えば、配列番号９によってコードされる配列番号１０）、ＤｅｓＩＩＩ（例えば、配列番号１１によってコードされる配列番号１２）、ＤｅｓＩＶ（例えば、配列番号１３によってコードされる配列番号１４）、ＤｅｓＶ（例えば、配列番号１５によってコードされる配列番号１６）、ＤｅｓＶＩ（例えば、配列番号１７によってコードされる配列番号１８）、ＤｅｓＶＩＩ（例えば、配列番号１９によってコードされる配列番号２０）、ＤｅｓＶＩＩＩ（例えば、配列番号２１によってコードされる配列番号２２）、およびＤｅｓＲ（例えば、配列番号２３によってコードされる配列番号２４）を含む）をコードすることが見出された（図１を参照のこと）。ＤｅｓＲをコードする本発明の核酸セグメントが、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＢ遺伝子クラスターにもＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのｏｌｅＤ遺伝子にも由来しないこともまた好ましい。好ましくは、デソサミン生合成遺伝子クラスターを含む核酸セグメントは、中程度以上の好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３またはそのフラグメントにハイブリダイズする。
【００１６】
本発明はまた、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４またはこれらのフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％であるが１００％未満の、連続アミノ酸配列同一性を有する改変体ポリペプチドを提供する。本発明の好ましい改変体ポリペプチド、またはポリペプチドのサブユニットもしくはフラグメントとしては、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性の、少なくとも約１％、より好ましくは少なくとも約１０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約５０％を有する改変体ポリペプチドまたはサブユニットポリペプチドが挙げられる。従って、例えば、配列番号２０のポリペプチドのグリコシルトランスフェラーゼ活性は、配列番号２０に対して少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号２０の改変体に匹敵し得る。
【００１７】
本発明の改変体核酸配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３またはこれらのフラグメントを含む核酸配列に対して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％であるが１００％未満の連続核酸配列同一性を有する。
【００１８】
宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結された、デソサミン生合成遺伝子クラスター、その生物学的に活性な改変体もしくはフラグメントを含む核酸配列を含む発現カセット、ならびに本発明の発現カセットを含む宿主細胞もまた提供される。従って、本発明の発現カセットは、クラスター内の個々の遺伝子（例えば、グリコシダーゼをコードするｄｅｓＲ遺伝子、またはポリケチドおよびデスオキシ糖に対する緩和された基質特異性を有する（すなわち、このグリコシルトランスフェラーゼは、ＴＤＰ−デソサミン以外の糖基質をプロセスする）グリコシルトランスフェラーゼをコードするｄｅｓＶＩＩ遺伝子）を発現するために有用である。従って、このｄｅｓＶＩＩ遺伝子は、種々のポリケチド基質およびデスオキシ糖基質を有するマクロライド化合物のライブラリーを合成するための組み合わせ生物学的アプローチにおいて使用され得る。さらに、マクロライド抗生物質を発現する宿主細胞におけるグリコシダーゼの発現は、抗生物質の毒性を減少させる（例えば、不活化する）ための方法において有用であり得る。例えば、抗生物質を産生する宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする発現カセットによって形質転換される。この組換えグリコシルトランスフェラーゼは、抗生物質を可逆的に不活化する量で発現される。抗生物質を不活化するために、この抗生物質は、好ましくは、宿主細胞から回収された単離された抗生物質であり、適切なネイティブまたは組換えのグリコシダーゼと接触される。
【００１９】
好ましくは、本発明の発現カセット中のデソサミンをコードする核酸セグメントは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣ遺伝子クラスターに由来しない。好ましい宿主細胞は、原核生物細胞であるが、真核生物細胞もまた想定される。これらの宿主細胞は、デソサミン、そのアナログもしくは誘導体、ならびにこの宿主細胞から次いで単離され得る個々のポリペプチドを発現するために有用である。デソサミン生合成遺伝子クラスターの少なくとも一部に由来するアンチセンス配列を含む発現カセットまたは宿主細胞もまた提供される。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、組換え宿主細胞（例えば、細菌細胞）であり、この宿主細胞において、デソサミン合成を変更するように、好ましくはデソサミン合成の減少もしくは欠如を生じるように、および／またはデソサミンのアナログもしくは誘導体の合成を生じるように、宿主染色体のデソサミンコード核酸配列の少なくとも一部が、異種配列によって破壊された（例えば、欠失または遮断された（例えば、挿入によって））か、または本発明の改変体核酸配列で置換される。好ましくは、破壊される核酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣに由来しない。従って、本発明の組換え宿主細胞は、破壊された少なくとも１つの遺伝子（すなわち、ｄｅｓＩ、ｄｅｓＩＩ、ｄｅｓＩＩＩ、ｄｅｓＩＶ、ｄｅｓＶ、ｄｅｓＶＩ、ｄｅｓＶＩＩ、ｄｅｓＶＩＩＩまたはｄｅｓＲ）を有する。本発明の１つの実施形態は、組換え宿主細胞を含み、この宿主細胞において、ｄｅｓＶＩ遺伝子（これは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする）が、例えば、抗生物質耐性遺伝子での置換によって破壊されている。好ましくは、このような宿主細胞は、Ｎ−アセチル化アミノデスオキシ糖、１０−デオキシ−メチロニド（ｍｅｔｈｙｌｏｎｉｄｅ）、式（７）の化合物、式（８）の化合物またはこれらの組み合わせを有するアグリコンを産生する。従って、ｄｅｓＶＩ遺伝子の欠失または破壊は、新規糖を調製するための方法において有用であり得る。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態は、組換え細菌宿主細胞であり、この細菌宿主細胞において、ｄｅｓＲ遺伝子（これは、β−グリコシダーゼのようなグリコシダーゼをコードする）が破壊されている。好ましくは、この宿主細胞は、Ｃ−２’β−グリコシル化マクロライド抗生物質（例えば、式（１３）の化合物、式（１４）の化合物またはこれらの組み合わせ）を合成する。従って、本発明はさらに、式（８）、（９）、（１３）または（１４）の化合物を提供する。不斉中心を有する本発明の化合物の各原子が、光学活性形態およびラセミ形態で存在し得、そして単離され得ることが、当業者に明らかである。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明が、本発明の化合物の任意のラセミ形態、光学活性形態、多型形態もしくは立体異性体形態またはこれらの混合物（これらは、本明細書中に記載される有用な特性を有する）を包含し、（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分解によって、光学活性出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）光学活性形態を調製する方法、および本明細書中に記載される標準的試験を使用するか、または当該分野で周知の他の類似の試験を使用することによって、活性を決定するための方法が周知であることが理解される。
【００２２】
ポリケチド産生微生物の遺伝子操作によって、特定のグリコシル化修飾ポリケチドの生合成を指向するための方法もまた、提供される。この方法は、ポリケチド産生微生物に糖生合成（例えば、デソサミン生合成）のための酵素をコードするＤＮＡ配列（例えば、配列番号３、その改変体またはフラグメントを含むＤＮＡ配列を導入して、特定のグリコシル化修飾ポリケチドを産生する微生物を得る工程を包含する。あるいは、本発明のアンチセンスＤＮＡ配列が使用され得る。次いで、このグリコシル化修飾ポリケチドを、微生物から単離する。糖生合成またはポリケチドへの糖の付加における、少なくとも１つの酵素活性の不活化を生じるように、ＤＮＡ配列が改変されることが好ましい。
【００２３】
本発明の組換え宿主細胞によって産生される化合物（産物）および改変された組換え宿主細胞は、生物学的に活性な薬剤として特に有用であり得、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における病理学的状態または症状の処置のための医薬を調整するために有用である。従って、この産物としては、医薬（例えば、化学療法剤、免疫抑制剤、喘息、慢性閉塞性肺疾患ならびに呼吸器炎症を含む他の疾患を処置するための薬剤、コレステロール低下剤、または種々の生物（例えば、多剤耐性肺炎球菌および他の呼吸器病原体、ならびにウイルスおよび寄生生物病原体を含む細菌）に対して活性であるマクロライドベースの抗生物質）；または作物保護剤（例えば、殺菌剤または殺虫剤）が挙げられる。例えば、このような治療を必要とする（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生生物感染、癌、呼吸器疾患を有する患者）か、あるいは免疫抑制を必要とする（例えば、細胞、組織または器官の移植中に）哺乳動物、鳥類または魚類を処置するための、これらの化合物を使用する方法もまた想定される。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、「Ｉ型ポリケチドシンターゼ」は、反復して使用される活性部位の単一セットを有する、単一のポリペプチドである。これは、一連のポリペプチド上の活性部位を使用するＩＩ型ポリケチドシンターゼとは対照的である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「モジュール」は、多機能タンパク質（例えば、Ｉ型ポリケチドシンターゼまたは脂肪酸シンターゼ）中の一連の反復単位の１つである。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「未成熟最終産物」は、非組換え多機能タンパク質によって産生される産物とは異なる、組換え多機能タンパク質によって産生される産物である。一般に、組み換え多機能タンパク質によって産生される産物は、ほとんどアシル基を有さない。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「組換え」核酸またはタンパク質（ポリペプチド）分子は、タンパク質をコードする核酸分子がインビトロで修飾され、その結果、その配列が天然には存在しない分子であるか、または修飾されていないゲノム中に位置するようには位置しない、天然に存在する配列には対応しない分子である。
【００２８】
本発明の「組換え」宿主細胞は、糖生合成経路の少なくとも１つの遺伝子の機能または活性を変更する（例えば、減少もしくは破壊するか、あるいは、増大させる）ように、遺伝子操作されている。この操作は、少なくとも１つの遺伝子を含むか、または細胞のゲノムにおける染色体外遺伝的エレメントを生じ得る。対照的に、「野生型」または「非組換え」細胞は、遺伝子操作されていない。組換え細胞における遺伝子操作は、好ましくは、対応する野生型細胞によって産生される産物（化合物）の非存在または対応する野生型細胞によって産生されない産物の産生を生じる。
【００２９】
本発明の「改変された」組換え宿主細胞は、少なくとも１つの単離された核酸セグメントを発現するように、好ましくはプロモーターを含む発現カセット（これは、組換え細胞に導入されて、改変された組換え宿主細胞を形成する）の形態で遺伝子操作された組換え宿主細胞である。改変された組換え宿主細胞における遺伝子操作は、好ましくは、対応する組換え宿主細胞によっても対応する野生型細胞によっても産生されない産物（化合物）の産生を生じる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、遺伝子または遺伝子クラスターに「由来する」ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡからインビトロで単離および精製されたＤＮＡか、またはゲノムＤＮＡの配列を基礎として合成的に調製されたＤＮＡである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ｐｉｋ」または「ｐｉｋ／ｍｅｔ」遺伝子クラスターは、ポリケチドシンターゼ（ｐｉｋＡ）、デソサミン生合成酵素（ｐｉｋＢ、ｄｅｓとも称される）、チトクロムＰ４５０（ｐｉｋＣ）、調節因子（ｐｉｋＤ）および細胞自己耐性のための酵素（ｐｏｉＲ）をコードする配列を含む。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「単離および／または精製された」とは、その天然の細胞環境から、そして細胞の他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）との会合からの、ＤＮＡまたはポリペプチド分子のインビトロの単離をいい、その結果、これは、配列決定、複製および／または発現され得る。例えば、「デソサミン生合成のための酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子またはそのフラグメント」は、生物学的に活性なポリペプチド、そのフラグメントまたは改変体をコードし、デソサミン生合成の少なくとも１つの酵素をコードするＲＮＡの非コード鎖に相補的であるか、またはコード鎖に相補的であるか、あるいは当業者に周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって定義されるような、低い、中程度もしくは好ましくはストリンジェントな条件下で、デソサミン生合成遺伝子クラスターを含むＲＮＡもしくはＤＮＡにハイブリダイズし、かつ安定な結合を維持する、７より多い、好ましくは１５より多い、そしてより好ましくは２０以上の連続ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００３３】
「抗生物質」は、本明細書中で使用される場合、天然であるか、または限定された化学的修飾を有するかのいずれかである微生物によって産生される物質であり、別の微生物または真核生物細胞の増殖を阻害するか、またはこれらを殺傷する。
【００３４】
「抗生物質生合成遺伝子」は、一次代謝物を抗生物質に変換するプロセスにおける酵素反応に必要な酵素活性をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、セグメントまたは配列）である。
【００３５】
「抗生物質生合成経路」は、一次代謝物を抗生物質に変換するプロセスに必要な抗生物質生合成遺伝子の完全セットを含む。これらの遺伝子は、当該分野で周知の方法によって単離され得る（例えば、米国特許第４，９３５，３４０号を参照のこと）。
【００３６】
抗生物質産生生物としては、任意の生物が挙げられ、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＮｏｃａｒｄｉａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（これらは、いずれも、抗生物質を産生するか、または発現される場合に抗生物質を産生する遺伝子を含む）。
【００３７】
抗生物質耐性を付与する遺伝子は、抗生物質に対する耐性を付与する酵素または他の活性をコードするＤＮＡセグメントである。
【００３８】
用語「ポリケチド」とは、本明細書中で使用される場合、大きい、多様なクラスの天然産物をいい、これには、抗生物質化合物、殺菌化合物、抗癌化合物および抗寄生生物化合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドとしては、マクロライド、アントラサイクリン、アングサイクリン（ａｎｇｕｃｙｃｌｉｎ）、アバメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ミルベマイシン（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン、ポリエン、ポリエーテル、アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）およびイソクロマンキノン（ｉｓｏｃｈｒｏｍａｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチド抗生物質としては、アントラサイクリンおよび異なる型のマクロライド（ポリエンおよびアバマイシンならびにエリスロマイシンのような従来のマクロライド）が挙げられるが、これらに限定されない。マクロライドは、例えば、Ｓ．ｅｒｙｔｈｅｕｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよびＳ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓによって産生される。
【００３９】
用語「グリコシル化」は、別の分子に関して、１以上の糖残基を含む分子をいう。
【００４０】
用語「糖（ｓｕｇａｒ）」または「糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、ポリヒドロキシル化されたアルデヒドまたはケトンをいう。ポリヒドロキシル化されたアルデヒドまたはケトンは、必要に応じて、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質に連結され得る。糖は、炭素−水素−酸素核に加えて、さらなる置換基（例えば、アミノ、硫黄またはリン基）を有し得る。２〜１０個の糖単位から構成されるポリマーは、オリゴ糖（ＯＳ）（例えば、単糖、二糖（例えば、ショ糖）および三糖）と称され、１０個以上の糖単位から構成されるポリマーは、多糖（ＰＳ）と称される。これらの単糖構成ブロックは、少なくとも１０の異なる方法で連結されて、天文学的数の異なる組み合わせおよび順列組み合わせを生じ得る。糖としては、例えば、トリオース、ペントースおよびヘキソース、リボース、グルコース、ならびにデオキシ糖（例えば、フルクトース、ラムノースおよびデオキシリボース、ならびに６−デオキシ糖、２，６−デオキシ糖、３，６−デオキシ糖、４，６−デオキシ糖、２，３，６−デオキシ糖（例えば、オリボース（ｏｌｉｖｏｓｅ）、オリオース（ｏｌｉｏｓｅ）、ミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）、ロジノース（ｒｈｏｄｉｎｏｓｅ）、ミシノース（ｍｙｃｉｎｏｓｅ））および他の修飾糖（例えば、ミカミノース（ｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ）、デソサミン、バンコサミン（ｖａｎｃｏｓａｍｉｎ）およびダウノサミン（ｄａｕｎｏｓａｍｉｎ）を含むアミノ糖）が挙げられる。さらなる適切な糖は、例えば、Ｄ．Ｖｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０；Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（第三版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５；Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、（第二版）、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７７；Ｆ．ＣａｒｅｙおよびＲ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｂａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ Ｂ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（第二版）、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７７；およびこれらにおいて引用される参考文献）に開示される。糖誘導体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３４００５および同ＷＯ９７／０３９９５に記載されるように、簡便に調製され得る。
【００４１】
用語「グリコシル化修飾」とは、特定の分子に関する場合、特定の分子の未修飾状態またはネイティブ状態に対して、変化したグリコシル化パターンまたは構成を有する分子をいう。
【００４２】
用語「ポリケチド産生微生物」は、本明細書中で使用される場合、天然に、または適切に操作（すなわち、遺伝子操作）された後で、ポリケチドを産生し得る任意の微生物を含む。天然にポリケチドを産生する放線菌の例としては、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｅｒｅｔｉｃｕｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｌｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｙｃａｒｏｆａｓｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｔｅｎｅｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｕｒａｃｏｉおよびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉが挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドを天然に産生するポリケチド産生微生物の他の例としては、種々のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、ＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍおよびＮｏｃａｒｄｉａ株が挙げられる。
【００４３】
用語「糖生合成遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、糖生合成酵素をコードする、例えば、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｒｇｉｌｌａｃｅｏｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓのような生物由来の核酸配列またはセグメントをいい、他のポリケチド産生微生物由来の糖生合成ＤＮＡを含むことが意図される。
【００４４】
用語「糖生合成酵素」とは、本明細書中で使用される場合、ポリケチド結合糖ならびにそれらの誘導体および中間体の生合成、および／または結合に関与するポリペプチドをいう。
【００４５】
用語「ポリケチド結合糖」とは、ポリケチドに結合することが既知であるか、またはポリケチドに結合し得る糖をいう。
【００４６】
用語「糖誘導体」とは、ポリケチドと天然に会合するが、非修飾状態またはネイティブ状態に対して変更された糖をいい、Ｎ−３−α−デスジメチルＤ−デソサミンが挙げられるが、これに限定されない。
【００４７】
用語「糖中間体」とは、糖生合成経路で産生される中間体化合物をいう。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」は、本発明の宿主細胞によって産生されるか、または本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドをインビトロで使用して調製される特定の化合物（産物）を意味し、修飾されて、その結果、他の部分（例えば、ペプチドまたはポリペプチド分子（例えば、抗体またはそのフラグメント）、核酸分子、糖、脂質、脂肪、検出可能なシグナル分子（例えば、放射性同位体（例えば、γ放射体）、小化学物質、金属、塩、合成ポリマー（例えば、ポリラクチドおよびポリグリコリド）、界面活性剤およびグリコサミノグリカン（これらは、共有結合または非共有結合によって、この化合物に結合または連結される）を含む。
【００４９】
不斉中心を有する、本発明の化合物の各原子が、光学活性形態およびラセミ形態で存在し得、そして単離され得ることが、当業者に認識される。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明が、本発明の化合物の任意のラセミ形態、光学活性形態、多型形態もしくは立体異性体形態またはこれらの混合物（これらは、本明細書中に記載される有用な特性を有する）を包含し、（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分解によって、光学活性出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）光学活性形態を調製する方法、および本明細書中に記載される標準的試験を使用するか、または当該分野で周知の他の類似の試験を使用することによって、活性を決定するための方法が周知であることが理解される。
【００５０】
用語「配列相同性」または「配列同一性」は、２つの核酸配列の間の塩基の一致の比率または２つのアミノ酸配列の間のアミノ酸一致の比率を意味する。配列相同性を百分率（例えば、５０％）として表す場合、この百分率は、何らかの他の配列に対して比較された、配列の長さ全体についての一致の比率を示す。（２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、一致を最大にするために許容される；１５塩基以下のギャップ長さが通常用いられ、６塩基以下が好ましく、２塩基以下がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は一般に、２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致のうちの、１７以下の標的塩基の一致（８５％）であり；好ましくは１０の可能な塩基対一致のうちの９以下の一致（９０％）であり、そしてより好ましくは２０の可能な塩基対一致のうちの１９以下の一致（９５％）である。
【００５１】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的もしくは完全な同一性が存在する場合、および／または同じもしくは類似の活性を有する場合、相同である。例えば、８５％相同性は、２つの配列を最大に一致するようにアラインメントされた場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（一致させる２つの配列のうちのいずれかにおける）ギャップは、一致を最大にする際に許容される；５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、２つのタンパク質配列（またはこれらから誘導された、少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において用いられる場合、これらが、変異データマトリクスおよび６以上のギャップペナルティーを用い、プログラムＡＬＩＧＮを用いて（標準偏差単位において）５を超えるアラインメントスコアを有するならば、相同である（Ｄａｙｈｏｆｆ，１９７２）。２つの配列またはその一部はより好ましくは、本明細書中で使用される場合、それらのアミノ酸が２９％以上同一であるならな、相同である。
【００５２】
以下の用語は、２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の関係を記載するために用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる規定配列である；参照配列は、配列表に与えられる全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントのような、より長い配列のサブセットであり得るか、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含み得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、頻繁に少なくとも２５ヌクレオチド長であり、そしてしばしば少なくとも５０ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは各々（１）この２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、そして（２）この２つのポリヌクレオチドの間で互いに異なる配列をさらに含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は代表的に、この２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも２０連続したヌクレオチドの概念的セグメントであって、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が、この２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントをいう。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視によって行われ得、そして種々の方法によって作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最大の相同性百分率をもたらす）が選択される。好ましくは、デフォルト設定を用い、コンピュータ化アルゴリズムを用いてホモログを同定する。
【００５４】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチ毎に基づいて）同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチド毎に基づいて）同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較ウィンドウの位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
【００５５】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」または「相同性」は、２つのペプチド配列が、（例えば、デフォルトのギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって）最適にアラインメントされた場合、少なくとも約２９パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも約３５パーセントの配列同一性を共有し、そして／または同じもしくは類似の活性を有する、すなわち、１以上の共通の基質を認識し、それによって産物を生成することを意味する。
【００５６】
本発明に従って、組換え宿主細胞から誘導され、そのゲノムが改変されており、必要に応じて、対応する野生型細胞において生じる糖生合成が破壊されている、改変された組換え宿主細胞が提供される。改変された組換え宿主細胞は、破壊の結果として組換え宿主細胞において存在しないかまたは減少した量で存在する、野生型細胞によってコードされる酵素のホモログである、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする核酸セグメントを用いて増強される。従って、この改変された組換え宿主細胞としては、少なくとも１つの発現カセットを含み、この発現カセットは、少なくとも１つの単離および精製された核酸セグメントを含み、このセグメントは、野生型細胞によってコードされる酵素の基質を認識し、そして組換え細胞中では発現されないかまたは減少した量で発現される、糖生合成酵素をコードする。この核酸セグメントによってコードされる酵素は、別の糖生合成酵素またはグリコシルトランスフェラーゼについての基質を産生する。
【００５７】
本明細書中に記載される発明は、糖生合成ＤＮＡ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．ならびに他のポリケチド産生生物において見出されるもの）の遺伝的再設計を通して、グリコシル化ポリケチドを含め、多様な範囲の新規化合物（例えば、抗生物質）の産生のために用いられ得る。この遺伝子は、新規化合物の産生を含め、特定の化合物の選択的産生を可能にする。例えば、組み合わせ生合成に基づく化合物の改変は、糖遺伝子クラスター内の特定の遺伝子の選択的活性化または破壊、および広範囲な生物学的活性についてアッセイされる生合成ライブラリーへと他の糖生合成遺伝子を発現してさらに大きな科学的多様性を誘導することによって達成され得る。さらなる例としては、特定の宿主細胞へと生合成遺伝子を導入し、その結果、その宿主細胞の他の代謝産物、中間体または成分に対するこの生合成遺伝子の活性に起因して新規化合物の産生をもたらすことが挙げられる。
【００５８】
本発明において用いられる核酸配列およびセグメントとしては、糖生合成酵素（例えば、本明細書中に示される糖生合成酵素）をコードする遺伝子、および／または同じもしくは類似の活性を有する酵素をコードする遺伝子に、低い、中程度の、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、核酸配列およびセグメントが挙げられる。本発明の核酸分子、セグメントまたは配列はまた、本明細書中に記載されるＤＮＡセグメントまたは配列のいずれかに、対応する、相補的である、または低い、中程度の、もしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＲＮＡ分子、セグメントまたは配列であり得る。従って、本発明は、特定の糖生合成酵素のホモログ（野生型ポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸置換（図９；Ａｌｂｅｒｔｓら，１９８９）を有するポリペプチドを含む）をコードする核酸配列およびセグメントを包含する（例えば、ホモログは、そのホモログが、その野生型酵素についての基質を認識し得、そしてこの基質との反応を触媒し得る限り、野生型ポリペプチドに対して少なくとも２９％の同一性を有し得る）。このホモログは、天然に存在する酵素であり得るか、または組換え調製される酵素であり得る。
【００５９】
従って、変異は、本発明のネイティブ（野生型）の核酸のセグメントまたは配列に対してなされて、改変体核酸のセグメントまたは配列を生じ得、そしてこのような改変体は、この改変体が、他の分子と共に機能して、同定可能なグリコシル化分子（例えば、グリコシル化ポリケチドまたはマクロライド）の合成を集合的に触媒する酵素をコードする限り、ネイティブのセグメントまたは配列の代わりに用いら得る。このような変異は、従来の技術（例えば、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、そしてこの変異した配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて遺伝子へと挿入することによって（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、１９８７を参照のこと））を用いて、ネイティブ配列に対してなされ得る。あるいは、この変異は、ミスマッチプライマー（一般的に、１０〜２０のヌクレオチドの長さ）を用いて行われ得、このミスマッチプライマーは、ミスマッチ二重鎖の融解温度未満の温度で、ネイティブヌクレオチドのセグメントまたは配列にハイブリダイズする。このプライマーは、比較的厳密な制限の中で、プライマーの長さおよび塩基組成を維持することによって、ならびに中央に配置した変異塩基を維持することによって、具現化され得る（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９３）。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ得、この産物はクローン化され、変異したＤＮＡ（プライマーが伸長した鎖の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）により誘導される）を含むクローンが選択される。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異プライマーを用いて達成され得る。この技術はまた、複数の点変異を生じさせるために適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）を参照のこと。ＰＣＲ変異誘発はまた、所望の変異を行うという用途も見出す。
【００６０】
ヌクレオチド配列のランダム変異誘発は、以下のような、当該分野で公知のいくつかの異なる技術により達成され得る：制限エンドヌクレアーゼ部位内の配列を変化させること、オリゴヌクレオチドリンカーをプラスミドへ無作為に挿入すること、Ｘ線または紫外線光の照射、インビトロでのＤＮＡ合成の間に間違ったヌクレオチドを組み込むこと、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ変異誘発、合成変異体を調製すること、または化学物質を用いて、プラスミドＤＮＡに損傷を与えること。化学変異としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、塩基に損傷を与えるかまたは塩基を除去して、それにより、正常な塩基対合を妨げる薬剤（例えば、ヒドラジンまたはギ酸）、ヌクレオチド前駆体のアナログ（例えば、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン）、またはアクリジンインターカレーティング剤（例えば、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）が挙げられる。一般的に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、化学物質を用いて処理され、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換され、そして変異プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖される。
【００６１】
ランダム酵素改変体の大きな集団は、「組換えにより強化された変異誘発（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」を用いて、インビトロで構築され得る。この方法は、例えば、野生型をコードするヌクレオチド配列の各々の、１０^６個の変異体（これは、任意の変異誘発技術を用いて作製され、次いでクローニングベクターへと挿入される）の、２つ以上のプールを用いる。
【００６２】
これらの遺伝子配列は、当業者に公知の方法を用いて１つ以上の発現ベクターに挿入され得る。発現ベクターは、所望の遺伝子に作動可能に連結された制御配列を含み得る。本発明と共に用いるための適切な発現系は、真核生物および原核生物の宿主細胞において機能する系を含む。原核生物系が好ましく、詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．と適合性のある系が特に興味深い。このような系に用いるための制御要素は、プロモーター（必要に応じて、オペレーター配列を含む）、およびリボゾーム結合部位を含む。特に有用なプロモーターとしては、本発明の遺伝子クラスターに由来する制御配列が挙げられる。しかし、他の細菌プロモーター（例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）およびマルトースのような糖代謝酵素に由来するもの）もまた、デソサミンをコードする発現カセットにおける用途を見出す。好ましいプロモーターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターとしては、ｅｒｍＥ^＊プロモーター、ｐｉｋＡプロモーター、およびｔｉｐＡプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）のような、生合成酵素に由来するプロモーター配列、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系、バクテリオファージλＰＬ、およびバクテリオファージＴ５が挙げられる。さらに、合成プロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）、これは、天然には存在しない）はまた、細菌宿主細胞において機能する。
【００６３】
宿主細胞の増殖に対する遺伝子の発現の調節を可能にする、他の調節配列もまた、好適である得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をターンオン（ｔｕｒｎ−ｏｎ）またはターンオフ（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ）するものが挙げられる。他の型の調節要素（例えば、エンハンサー配列）もまた、ベクターに存在し得る。
【００６４】
選択可能なマーカーもまた、組換え発現ベクターに含まれ得る。形質転換した細胞株を選択する際に有用である種々のマーカーは公知であり、そして一般的に、細胞が適切な選択培地において増殖される場合に、遺伝子の発現が形質転換した細胞に対して選択可能な表現型を与える遺伝子を含む。
【００６５】
目的の、種々の配列またはセグメントは、個別のカセットとして、別々の制御要素と共にか、または例えば、シグナルプロモーターの制御下で、１つ以上の組換えベクターへとクローニングされ得る。これらの配列またはセグメントは、他の配列またはセグメントの容易な欠失および挿入を可能にする、隣接する制限部位を含み得る。このような固有の制限部位の設計は、当業者に公知であり、そして上記の技術（部位特異的変異誘発およびＰＣＲ）を用いて達成され得る。
【００６６】
ランダム変異誘発により生成される配列について、ベクターの選択は、用いられる変異体配列（すなわち、ドナーまたはレシピエント）のプールに依存する。さらに、ベクターの選択は、本願の方法の引き続く工程において用いられる宿主細胞を決定する。任意の形質導入可能なクローニングベクターが、変異体のドナープールのためのクローニングベクターとして用いられ得る。しかし、ファージミド、コスミド、または類似のクローニングベクターが、変異体をコード化するヌクレオチド配列のドナープールを、宿主細胞へクローニングするために用いられることが好ましい。ファージミドおよびコスミドは、例えば、Ｍ１３ファージおよびλファージの各々においてよりも、より大きなフラグメントを、これらの中に挿入し、そして安定に増殖する能力に起因して、優れたベクターである。本方法における用途を見出すファージミドとしては、一般的に、プラスミドと線状ファージクローニングビークルとの間のハイブリッドが挙げられる。本方法における用途を見出すコスミドとしては、一般的に、ｃｏｓ部位が挿入されているλファージベースのベクターが挙げられる。レシピエントプールクローニングベクターは、任意の適切なプラスミドであり得る。変異体のプールが挿入されるクローニングベクターは、同一であり得るか、または異なる遺伝マーカーを有しかつ発現するように構築され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。異なる遺伝子マーカーを有するこのようなベクターを用いることの有用性は、首尾良い形質導入の決定を容易にするために利用される。
【００６７】
従って、例えば、用いられるクローニングベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクター（例えば、米国特許第４，４１６，９９４号、同第４，３４３，９０６号、同第４，４７７，５７１号、同第４，３６２，８１６号、および同第４，３４０，６７４号を参照のこと）、コスミド、プラスミド、人工細菌染色体（例えば、ＺｈａｎｇおよびＷｉｎｇ、１９９７；Ｓｃｈａｌｋｗｙｋら、１９９５；およびＭｏｎａｃｏおよびＬａｖｉｎ、１９９４を参照のこと）、またはファージミドであり得、そして宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐａｔｕｌｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、もしくはＳ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）のような細菌細胞、または真菌、酵母、または植物細胞（例えば、単子葉植物細胞および双子葉植物細胞）のような真核生物細胞であり得、好ましい細胞は、再生可能である。
【００６８】
さらに、特定の活性を有する組換えポリペプチドは、「遺伝子シャッフリング」を介して調製され得る。例えば、Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８；Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、米国特許第５，８３７，４５８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３０，７２７号、同第５，８１１，２３８号、同第５，６０５，７９３号を参照のこと。
【００６９】
ファージミドについて、ファージミドを含む宿主細胞の感染の際、一本鎖ファージミドＤＮＡが、他のファージベクターに類似する様式において形質導入ファージの形態で、産生され、パッケージ化され、そして細胞から放出される。従って、ファージミドにより実施される、変異体をコード化するヌクレオチド配列のクローン増幅は、適切な宿主細胞においてファージミドを増殖させることにより達成される。
【００７０】
クローン増幅の後、クローン化した変異体のドナープールを、ヘルパーファージと感染させて、ヘルパーファージゲノム、またはこの野生型をコード化するヌクレオチド配列のファージミド突然変異体対立遺伝子のいずれかを含むファージ粒子の混合物を得る。
【００７１】
宿主細胞のヘルパーファージとの感染またはトランスフェクションは、一般的に、当該分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；およびＲｕｓｓｅｌｌら、１９８６を参照のこと）により達成される。
【００７２】
ヘルパーファージは、クローニングファージと組合わせて用いて、感染性の形質導入ファージを生成し得る、任意のファージであり得る。例えば、クローニングベクターがコスミドである場合、ヘルパーファージは、必然的に、λファージである。好ましくは、クローニングベクターは、ファージミドであり、そしてヘルパーファージは、線状ファージ（好ましくは、ファージＭ１３）である。
【００７３】
所望される場合、ファージミドをヘルパーファージと感染させ、ファージ粒子の混合物を得た得た後、形質導入ファージを、大きさの違いに基づいて（Ｂａｒｎｅｓら、１９８３）か、または他の同様に有効な技術に基づいて、ヘルパーファージから分離し得る。
【００７４】
クローン化したドナー変異体の全体のスペクトルは、ここで、クローン増殖されたレシピエント細胞（これは、変異体をコード化するヌクレオチド配列のプールを形質導入または形質転換されている）へと形質導入され得る。本明細書中に開示される方法および本願方法において用いられ得るレシピエント細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、または組換え欠損ではない、他の細菌発現系であり得る。組換え欠損細胞は、組換え事象が非常に減少した細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃ⁻変異体）である（Ｃｌａｒｋら、１９６５を参照のこと）。
【００７５】
これらの形質導入体を、ここで、所望のタンパク質特性または特徴について選択し、そして必要な場合または所望される場合、増幅され得る。必要に応じて、上記のように、変異体のプールの各々がクローン化されるファージミドが、構築されて異なる遺伝マーカーを発現する場合、形質転換体は、ドナープラスミドマーカーおよびレシピエントプラスミドマーカーの両方の発現により選択され得る。
【００７６】
上記の方法により産生された組換え体は、次いで、任意の適切な方法によって、例えば、酵素活性または他の生物学的活性を、選択またはスクリーニングに供され得る。
【００７７】
増幅、感染、形質導入、および組換えの上記サイクルは、ファージミドに対してクローン化された、さらなるドナープールを用いて、任意の回数で繰り返され得る。上記のように、変異体のプールの各々がクローン化されるファージミドは、異なるマーカー遺伝子を発現するように構築され得る。各サイクルは、１０^６のファクターまで、別個の変異体の数を増加させ得る。従って、任意の別々の細胞における対立遺伝子間の組換え事象の発生の確率がｆ（実際には、組換える変異体の間の距離の関数であるパラメーター）である場合、１０^６個の対立遺伝子変異体の２つのプール由来の形質導入された培養物は、１０^１２／ｆ細胞の集団において１０^１２個までの別個の変異体を発現する。
【００７８】
本発明は、以下の非制限的実施例により、さらに記載される。
【００７９】
（実施例）
（デソサミン生合成遺伝子クラスターのｄｅｓＲ遺伝子の欠失）
いくつかのマクロライドは、付着した糖部分を１よりも多く有するので、適切な糖生合成経路に対する糖生合成遺伝子の割当ては、非常に困難であり得る。メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）（式（１）の化合物）およびネオメチマイシン（ｎｅｏｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）（式（２）の化合物）（図１）（Ｄｏｎｉｎら、１９５３；Ｄｊｅｒａｓｓｉら、１９５６）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにより産生される、２つの密接に関連したマクロライド抗生物質）は、それらの唯一の糖成分としてデソサミンを含むので、メチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスターにおける糖生合成遺伝子の構成は、あまり複雑ではないであろう。従って、この系を、デソサミン（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ−３，４，６−トリデオキシヘキソース、これはエリスロマイシン構造にもまた存在する（Ｆｌｉｎｎら、１９５４））の生合成の研究のために選択した。
【００８０】
この独特な糖の形成を研究するために、ＤＮＡライブラリーを、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（ＡＴＣＣ１５４３９）を、Ｓａｕ３Ａ Ｉを用いて、３５〜４０ｋｂのフラグメント（これをコスミドベクターｐＮＪ１へと連結した）へと部分的に消化することにより構築した（Ｔｕａｎら、１９９０）。組換えＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをトランスフェクトするために用いたバクテリオファージλへとパッケージ化した。得られたコスミドライブラリーを、ｔｙｌＡ１遺伝子およびｔｙｌＡ２遺伝子をプローブとして用いて、チロシン生合成クラスターから所望のクローンついてスクリーニングした（Ｂａｌｔｚら、１９８８；Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓら、１９９４）。これらの２つのプローブは、糖生合成遺伝子に特異的である。これらの遺伝子の産物は、初めの２つの工程を例外なく触媒した後に、これまで研究されている全ての独特な６−デオキシヘキソースへと続く。初めの反応は、α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジルイルトランスフェラーゼ（ＴｙｌＡ１）による、グルコース−１−ホスフェートからＴＤＰ−Ｄ−グルコースへの転換を伴い、引き続いて、ＴＤＰ−Ｄ−グルコースは、ＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼ（ＴｙｌＡ２）により、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースへと転換される。３つのコスミドは、ｔｙｌＡ１およびｔｙｌＡ２に相同な遺伝子を含むことを見出された。これらのコスミドのさらなる分析は、ＰＫＳ遺伝子の下流の９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定を導いた（図１）。他の糖生合成遺伝子（特に、エリスロマイシンクラスターに由来するもの（Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７））に対する配列類似性に基づいて、これらの９つのＯＲＦのうち８つは、ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成に関与すると考えられる。興味深いことに、ｅｒｙクラスターは、デソサミン経路における初めの２つの工程に応答性である、ｔｙｌＡ１遺伝子およびｔｙＡ２遺伝子のホモログ欠く。エリスロマイシン生合成機構は、ミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）およびデソサミンの形成のための、ＴＤＰ−Ｄ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースの一般的な細胞プールに依存し得る可能性がある。ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンについての生合成経路を図１に表す。
【００８１】
９つのＯＲＦのうちの８つに、デソサミン形成（ｄｅｓＲの存在）を割り当てた（これらのＯＲＦは、β−グルコシダーゼに対して強い配列相同性（３９％の同一性および４６％の類似性と同じくらい高い）を示す（Ｃａｓｔｌｅら、１９９８））が、デソサミンにおける遺伝子クラスターは難解である。メチマイシン／ネオメチマイシンの生合成に対するＤｅｓＲの機能を研究するために、ｐＫＣ１１３９由来の破壊プラスミド（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ）（ｐＢＬ１００５）（アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性マーカーを含む）（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を、構築した。このプラスミドにおいて、ｄｅｓＲ遺伝子の１．０ｋｂ ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントを欠失させ、そして平滑末端連結を介して、チオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）（１．１ｋｂ）（Ｂｉｂｂら、１９８５）により置換した。このプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１を形質転換した；このＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１は、ドナー株として働き、接合伝達を通じて、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）へとｐＢＬ１００５構築物を導入する。染色体ｄｅｓＲが破壊した遺伝子と置換されてる二重交雑変異体を、これらのチオストレプトン耐性およびアプラマイシン−感受性特性に従って選択した。サザンブロットハイブリダイゼーション分析を用いて、遺伝子置換を確認した。
【００８２】
所望の変異体を、播種培地（ｓｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中で２９℃にて４８時間、初めに増殖させ、次いで、接種して、植物培地（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）中でさらに４８時間増殖させた（Ｃａｎｅら、１９９３）。発酵ブロスを、１０，０００ｇで遠心分離して、細胞片および菌糸体を取り除いた後、上清を濃ＫＯＨを用いてｐＨ９．５に調整し、等容量のクロロホルムで抽出した（４回）。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして乾燥するまでエバポレートした。琥珀色のオイル様租生成物を、初めに、クロロホルム中の０〜４０％メタノールの勾配を用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに供し、次いで、５７ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．７）中の４５％アセトニトリルを用いて等組成で溶出される、Ｃ_１８カラムのＨＰＬＣに供した。メチマイシン（式（１）の化合物）およびネオメチマイシン（式（２）の化合物）に加えて、２つの新規の生成物を単離した。式（１３）の化合物および式（１４）の化合物の収量は、各々、発酵ブロスの５〜１０ｍｇ／Ｌの範囲である。しかし、式（１）の化合物および式（２）の化合物は、主生成物のままであった。高分解能ＦＡＢ−ＭＳは、両方の化合物が、同一の分子組成を有することを示した。この分子組成は、余分なヘキソースによってメチマイシン／ネオメチマイシンと異なる。これらの２つの新規の化合物の化学的性質は、広範なスペクトル分析により、Ｃ−２’β−グルコシル化メチマイシンおよびネオメチマイシン（それぞれ、式（１３）および式（１４）の化合物）である解明された。
【００８３】
（１３）のスペクトルデータは、以下である：
【００８４】
【化１】

（１４）のスペクトルデータは、以下である：
【００８５】
【化２】

加えられたグルコースのアノマー水素（１’’−Ｈ）のカップリング定数（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）およびデソサミンのＣ’２の低磁場シフト（１１．８ｐｐｍ）の大きさは、全て、この指定されたＣ２’−β−コンフィギュレーション（Ｓｅｏら，１９７８）と一致する。
【００８６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する式（１３）および（１４）の化合物の抗生物質活性を、滅菌した濾紙ディスクに２０μＬの各サンプル（ＭｅＯＨ中で１．６ｍＭ）を別々に適用することによって調べ、このディスクをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート（Ｍａｎｇａｈａｓ，１９９６）上で培養したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの表面に置いた。３７℃で一晩培養した後に、このコントロール（式（１）および式（２）の化合物）のプレートは、明確に視認し得る阻害域を示した。対照的に、このような除去（ｃｌｅａｒｉｎｇ）が式（１３）および（１４）の化合物のディスクの周辺で認識可能であった。明らかに、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）／ネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）中のデソサミンのＣ−２’におけるβ−グリコシル化は、これらの抗生物質を不活性にする。
【００８７】
グリコシル化によるマクロライド抗生物質の不活性化に関わる類似現象は、公知である（Ｃｅｌｍｅｒら，１９８５；Ｋｕｏら，１９８９；Ｓａｓａｋｉら，１９９６）ことに注目すべきである。例えば、エリスロマイシンがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓに与えられた場合に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓがマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ（ＭｇｔＡ）を含み、この細菌がこれらの薬物のグリコシル化によってそれ自体を防御することが可能であることが見出された（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９２；Ｊｅｎｋｉｎｓら，１９９１）。このようなマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ活性を、種々のポリケチド抗生物質を産生する総計３２放線菌株のうち１５の放線菌で検出した（Ｓａｓａｋｉら，１９９６）。興味深いことに、グリコシル化によるオレアンドマイシンの不活性化が可能なマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ（ＯｌｅＤ）（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，１９９３）、および不活性化されたオレアンドマイシンから添加されたグルコースを取り出すことが可能な細胞外β−グリコシダーゼがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓに共存すること（Ｖｉｌｃｈｅｓら，１９９２）によって、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける可能な自己耐性機構としてのグリコシル化が推測される。上述したグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子は、いくつかの場合（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓのｍｇｔＡおよびＳ．ａｎｔｉｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのｏｌｅＤ）においてクローン化されてきたが、マクロライドβ−グリコシダーゼ遺伝子の所在は、依然として曖昧である。興味深いことに、近年公開されたｅｒｙＢＩ配列は、エリスロマイシン生合成クラスター（群）の一部であるが、ｄｅｓＲに対して高度に相同性（５５％同一性）である（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７）。
【００８８】
従って、デソサミン遺伝子クラスター（遺伝子群）の中のｄｅｓＲ、マクロライドβ−グリコシダーゼ遺伝子の発見は、重要であり、そして、ｄｅｓＲ破壊後の式（１３）および（１４）の不活性化された化合物の蓄積は、グリコシル化／脱グリコシル化による類似の自己防御機構がまた、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいても適切に作用することを示す直接的な分子的証拠を提供する。しかし、有意な量のメチマイシンおよびネオメチマイシンがまた、この変異体の発酵ブロスにおいても存在するため、デソサミンのグリコシル化は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける主要な自己耐性機構ではあり得ない。実際、この遺伝子クラスターの中でＰＫＳ遺伝子の上流に見出されるｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、主要な自己耐性保護を与え得る。従って、これらの結果は、抗生物質産生生物が一般に、より多くの防御の選択肢を有するという事実と一致する（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９）。この観察によって、メチマイシン／ネオメチマイシンが、不活性なジグリコシド（式（１３）および（１４）の化合物）として部分的に産生され得、そしてこのｄｅｓＲによってコードされるマクロライド−β−グリコシダーゼが、メチマイシン／ネオメチマイシンをそれらの休眠状態から活性状態へと変換する原因となると考えられ得る。この概念を支持する場合、この翻訳されたｄｅｓＲ遺伝子は分泌タンパク質の特徴であるリーダー配列を有する（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９８６；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９８９）。従って、ＤｅｓＲは、細胞膜を介して輸送され得、そして、これらの改変された抗生物質を細胞外で加水分解して、それを活性化し得る（図２）。
【００８９】
（要約）
アミノデオキシ糖（これらは、しばしばマクロライド抗生物質の本質的な成分として見出される）の複合体アセンブリ（複合体組織化）および酵素学に触発されて、メチマイシンおよびネオメチマイシン産生株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ由来の、デソサミン生合成遺伝子クラスター全体をクローン化し、配列決定し、そしてマッピングした。９つのマップされた遺伝子のうち８つの遺伝子は、エリスロマイシンクラスターに由来する遺伝子との配列類似性に基づいて、ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成に割り当てられた。この残りの遺伝子（ｄｅｓＲとして示される）は、β−グリコシダーゼに対する強い配列相同性を示す。
【００９０】
このコードされたタンパク質（ＤｓｅＲ）の機能を調べるために、破壊変異株を構築し、この変異株において、ｄｅｓＲ遺伝子のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントを欠失させ、そして、チオストレプトン耐性（ｔｓｒ）遺伝子で置き換えた。メチマイシンおよびネオメチマイシンに加え、２つの新規の産物を変異株の発酵物から単離した。これらの２つの新規化合物は、生物学的に不活性であり、Ｃ−２’βグリコシル化された、メチマイシンおよびネオメチマイシンであることが見出された。この翻訳されたｄｅｓＲ遺伝子は、分泌タンパク質の特徴であるリーダー配列を有しているために、このＤｅｓＲタンパク質は、この改変された抗生物質から加えられたグルコースを取り除き、これらを活性することができる細胞外β−グリコシダーゼであり得る。従って、このデソサミン遺伝子クラスター中のｄｅｓＲの存在およびｄｅｓＲ破壊のときの不活性化されたグリコシル化メチマイシン／ネオメチマイシンの蓄積によって、グリコシル化を介する自己耐性機構がＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて適切に作用し得る強力な分子的証拠を提供する。
【００９１】
従って、このｄｅｓＲ遺伝子は、プローブとして使用され得、他の抗生物質生合成経路におけるホモログを同定し得る。他の抗生物質生合成経路における対応するマクロライドグリコシダーゼ遺伝子の欠失によって、グリコシル化された産物の蓄積が生じ、このグリコシル化された産物は、細胞毒性を減じたプロドラッグとして使用され得る。グリコシル化はまた、遺伝子工学的に操作された微生物によって産生される新規のマクロライド抗生物質に関連する潜在的な毒性を制御および／または最小化するためのツールとして有望である。さらには、マクロライドグリコシダーゼの有効性は、コンビナトリアル生合成アプローチ（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚら，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７；Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６；Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８）を使用する新規抗生物質の開発において有用であり、これらのマクロライドグリコシダーゼは、新規に形成される抗生物質の活性化のために使用され得、この抗生物質は意図的に操作されたグリコシルトランスフェラーゼによって失活される。
【００９２】
（実施例２）
（デソサミン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のｄｅｓＶＩ遺伝子の欠失）
多くの通常使用されている抗生物質に耐性である病原性細菌の出現によって、人間の健康に対して深刻な脅威を与え、そして、この出現は、新規の抗細菌剤に対する現在の研究の再燃の原動力となってきた（Ｂｏｘら，１９９７；Ｄａｖｉｅｓ，１９９６；Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９５）。遺伝子工学的技術を使用して、「ハイブリッド」ポリケチドを生成することに関する最初の報告（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９５）以来、二次代謝物の生合成を支配する遺伝子を操作して新規の生物学的に活性な化合物（特に、マクロライド抗生物質）を生成する可能性は、多大なる注目を受けている（Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６）。臨床的に重要な薬物であるこのクラスは、以下の２つの本質な構造成分からなる：ポリケチドアグリコンおよび付加されたデオキシ糖（Ｏｍｕｒａ，１９８４）。このアグリコンは、高度に組織化された多酵素複合体である、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚ，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７）によって触媒されるアシルチオエステルの一連の縮合によって合成される。ポリケチド生合成の理解における近年の進歩は、ＰＫＳ遺伝子の組換えを可能にし、新規の骨格のめざましいアレイの構築を可能にする（Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６；Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚ，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７；Ｅｐｐら，１９８９；Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９３；Ａｒｉｓａｗａら，１９９４；Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８）。しかし、糖成分がない場合、これらの新規の化合物は、通常、生物学的に強力である。従って、コンビナトリアル生合成アプローチによって新規のマクロライド抗生物質を生成することを計画している場合、以下の２つの当面の課題を克服しなければならない：新規の糖構造のレパートリーのアセンブリ（組織化）すること、およびそれに次いで、構造的に多様化したマクロライドアグリコンにこれらの糖を結合する能力を有すること。
【００９３】
不運なことに、これらの抗生物質において独特の糖の形成の知見は、依然として限られたままである（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８）。これについての部分的な理由は、この糖遺伝子は、一般的にＰＫＳ遺伝子の両端に分散しているという事実に由来する。マクロライド生合成遺伝子クラスター中のこのような編成は、また同じ領域に分散されている調節タンパク質またはこれらのアグリコン改変酵素をコードしている遺伝子から、糖遺伝子を識別することを難しくしている。これらのマクロライドが複数の糖成分を含む場合、この課題は、さらにずっと厄介になり得る。この「分散された」性質の糖生合遺伝子の観点において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｚｅｚｕｅｌａｅの、抗生物質メチマイシン（図１における式（１）の化合物）およびその共存代謝産物、ネオメチマイシン（図１における式（２）の化合物）によって、デオキシ糖の形成を研究するためのそれら自体が魅力的な系として提供される（Ｄｏｎｉｎら，１９５３；Ｄｊｅｒａｓｓｉら，１９５６）。第１に、これらは、Ｄ−デソサミン（式（３）の化合物）、エリスロマイシンにも存在する始源型アミノデオキシ糖を保持する。第２に、デソサミンは、式（１）および（２）のマクロラクトン（ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ）に結合した、唯一の糖であるため、このメチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスター内の糖生合成遺伝子の同定は、より高い確実性を伴って可能である。
【００９４】
このメチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスター（これは、約６０ｋｂ長である）の下流の１０ｋｂのＤＮＡのストレッチを、デソサミン生合成遺伝子クラスターの全体を保有するとして見出した（図３）。このセグメントの中にマップされる９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうち、８つはデソサミン形成に関連する可能性があるが、残りの１つ（ｄｅｓＲ）は、マクロライドβ−グリコシダーゼをコードし、このマクロライドβ−グリコシダーゼは、自己耐性機構に関与し得る。これらの同一性（図３に示されている）を、他の糖生合成遺伝子に対する配列類似性に基づいて割り当てた（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。この提案された経路は、先行文献およびアミノデオキシ糖の構築に対する機構論的洞察において十分に見出されている（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８）。
【００９５】
改変された糖を保持する新規のメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログが、デソサミン生合成遺伝子の改変によって生成され得るか否かを決定するために、このｄｅｓＶＩ遺伝子（これは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードしていると推測されている）を、標的として選択した（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。この推定ｄｅｓＶＩ産物は、エリスロマイシン産生株Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来のｅｒｙＣＶＩ産物に最も近接して関連し（７０％同一性）、そしてこの産物はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓのロドマイシン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎ）（Ｎｉｅｍｉら，１９９５）クラスター由来のｒｄｍＤの推定された産物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓのスピロマイシン（ｓｐｉｒｏｍｙｃｉｎ）クラスター由来のｓｒｍＸ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈら，１９９２）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅのチロシンクラスター由来のｔｙｌＭ１（Ｇａｎｄｅｃｈａら，１９９７）に非常に似ている。これらの酵素の全ては、Ｎ末端近くにコンセンサス配列ＬＬＤＶ（Ｉ）ＡＣＧＴＧ（配列番号２５）（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）を含み、このコンセンサス配列は、Ｓ−アデノシルメチオニン結合部位（Ｉｎｇｒｏｓｓｏら，１９８９；Ｈａｙｄｏｃｋら，１９９１）の部分である。
【００９６】
ｄｅｓＶＩの欠失は、他のデソサミン生合成遺伝子の発現に対する極性効果（ｐｏｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ）（Ｌｉｎら，１９８４）をほとんど持たず、これは、ｄｅｓＶＩの直ぐ下流に存在するＯＲＦ（ｄｅｓＲ）は、デソサミン形成には直接的には関係せず、そして、さらに下流に存在する遺伝子は、逆方向に転写されるためである。第２に、Ｎ，Ｎ−ジメチル化が、デソサミン生合成経路においてほとんど確実に最終工程であり（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８；Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）、この工程に摂動を与えることによって、式（４）の化合物の蓄積が生じ得、この式（４）の化合物は、式（６）のマクロラクトンに対する首尾良い結合について、グリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）に認識される全ての他の中間体の中で最良の可能性を示す（図２）。単一の生合成遺伝の欠失および／または破壊は、頻繁に、１を超える特定の工程での経路に影響を及ぼす。実際に、ｅｒｙＣＶＩ、ｄｅｓＶＩ（エリスロマイシンクラスターにおいて等価である）（これは、類似のＮ−メチラーゼをコードすると予測され、エリスロマイシン（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）におけるデソサミンを生成する）の破壊によって、デソサミン部分の全体を欠いている中間体の蓄積を生じる（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。
【００９７】
プラスミドｐＢＬ３００１（この中で、ｄｅｓＶＩは、チオストレプトン遺伝子（ｔｓｒ）（Ｂｉｂｂら，１９８５）によって置きかえられた）を、構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）を使用する接合伝達によって野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに導入した。チオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏ^Ｒ）およびアパマイシン（ａｐａｍｙｃｉｎ）感受性（Ａｐｍ^ｓ）の表現型を有する、２つの同一の二重交差型改変体（ＫｄｅｓＶＩ−２１およびＫｄｅｓＶＩ−２２）を得た。ｄｅｓＶＩＩ領域からのｔｓｒまたは１．１ＫｂのＨｉｎｃＩＩフラグメントを使用するサザンブロットハイブリダイゼーションによって、ｄｅｓＶＩ遺伝子が、これらの変異体の染色体上でｔｓｒによって実際に置換されたことを確認した。このＫｄｅｓＶＩ−２１変異体を、播種培地（１００ｍｌ）中ではじめに２９℃にて、４８時間増殖させ、そして、これを接種して、成長培地（３Ｌ）中でさらに４８時間増殖させ（Ｃａｎｅら，１９９３）。この発酵ブロスを、遠心分離して、細胞破片および菌糸を取り除き、そしてこの上清を、濃ＫＯＨを使用してｐＨ９．５に調整し、その後、クロロホルムで抽出した。メチマイシンまたはネオメチマイシンは見出されず；そのかわり、この１０−デオキシ−メチノリド（ｍｅｔｈｙｎｏｌｉｄｅ）（６）（３５０ｍｇ）（Ｌａｍｂａｌｏｔら，１９９２）およびＮ−アセチル化アミノ糖を含む２つの新規のマクロライド、式（７）の化合物（２０ｍｇ）および式（８）の化合物（１５ｍｇ）を単離した。これらの構造を、スペクトル分析および高分解能ＭＳによって決定した。
【００９８】
式７のスペクトルデータは以下である：
【００９９】
【化３】

。
【０１００】
式８のスペクトルデータは以下である
【０１０１】
【化４】

。
【０１０２】
改変されたデソサミンを保有する式（７）および（８）の化合物がｄｅｓＶＩ欠失変異体によって産生されるという事実は、スリリングな発見である。しかし、この結果はまた、幾分驚きである。なぜならば、この産物中の糖成分は、アミノデオキシヘキソース（４）であると予測されるからである。図４において示されるように、式（７）および（８）の化合物は、付加されたアミノデオキシ糖の合成後の非特異的なアセチル化によって、それぞれ、式（９）および（１０）の予測された化合物から誘導される可能性がある。（４）のＮ−アセチル化が最初に起こり、その後、１０−デオキシメチノリド（６）への得られた糖（１１）のカップリング（結合）が続くことがまた考えられる。それにもかかわらず、これらの新規の産物における糖部分のＮ−メチル化の欠失によって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としてのｄｅｓＶＩの割り当てを維持する説得力のある証拠を提供する。最も有意であるのは、ｄｅｓＶＩ欠失変異体による式（７）および（８）の化合物の産生によって、メチマイシン／ネオメチマイシン経路におけるグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）は、ＴＤＰ−デソサミン（５）以外の糖基質を認識しそしてプロセシングを行うができるという事実が証明される。
【０１０３】
式（７）および（８）の両方の化合物は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体によってインビボで合成された新規化合物であり、この観察されたＮ−アセチル化は、自己保護にのために必要な工程である（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９）。これらの結果の観点において、遺伝的に操作された微生物によって産生される、新規のマクロライド抗生物質に関連する潜在的な毒性を最小化し得、そして（意図的にまたは意図的ではなく）失活された新たに形成された抗生物質を、産生の間に活性化し得る。このようなアプローチは、コンビナトリアル生合成アプローチを使用する新規の抗生物質の開発のための全体的な戦略の一部分であり得る。実際に、式（７）および（８）の精製された化合物は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート（Ｍａｎｇａｈａｓ，１９９６）で増殖したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して不活性であるが、このコントロール（式（１）および式（２）の化合物）は、明確に視認し得る阻害域を示す。
【０１０４】
抗生物質の生合成に関連するいくつかのグリコシルトランスフェラーゼが、改変されたマクロラクトン（ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ）に対する緩和された特異性を有することが示されている（Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８；Ｗｅｂｅｒら，１９９１）ことが指摘されるべきである。しかし、糖基質に対する類似の緩和された特性は、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）グリコシルトランスフェラーゼについて報告され、このダウノルビシングリコシルトランスフェラーゼは、改変されたダウノサミン（ｄａｕｎｏｓａｍｉｎｅ）を認識し、そしてアグリコン、ε−ロドマイシンノン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）に対する、そのカップリングを触媒することが可能である（Ｍａｄｄｕｒｉら，１９９８）。従って、メチマイシン／ネオメチマイシングリコシルトランスフェラーゼがまたその糖基質の構造的変異体を許容し得るという事実によって、抗生物質生合成経路における少なくともいくつかのグリコシルトランスフェラーゼは、遺伝子工学による生物学的に活性なハイブリッド天然生成物を生成するのに有用であり得ること示される。
【０１０５】
（要約）
マクロライド抗生物質中に付加された糖は、これらの臨床的に重要な薬物の生物学的活性に不可欠である。従って、生物学的なコンビナトリアルアプローチを介する新規抗生物質の開発は、これらの独特の糖の生合成の詳細な知識、ならびに、この生合成遺伝子を操作し、最終的なマクロライド構造に組み込まれる新規の糖を生成する能力を必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｄｅｓＶＩ遺伝子の標的化された欠失が調製され、改変された糖を保有する新規のメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログがデソサミン生合成遺伝子の変化によって生成されるか否かを決定し得、ここで、このアナログは、配列比較によって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードすると予測される。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの欠失変異株の増殖によって、Ｎ−アセチル化アミノデオキシ糖を保有するメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログの蓄積が生じた。これらの誘導体のこれらの単離および特徴付けによって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としてのｄｅｓＶＩの同一性を確認するための最初の直接的証拠を提供しただけではなく、遺伝子欠失アプローチによって新規の糖を調製する能力を実証した。最も重要ことに、これらの結果はまた、メチマイシン／ネオメチマイシンのグリコシルトランスフェラーゼがその糖基質に対して緩和された特性を示すことを明らかにした。
【０１０６】
（実施例３）
（Ｍｅｔ／Ｐｉｋ生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび配列決定）
（材料および方法）
（細菌株および培地）Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、クローニング宿主（ホスト）として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２は、 Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅゲノムＤＮＡから誘導されるコスミドライブラリーのための宿主であった。ＬＢ培地をＥ．ｃｏｌｉ増殖において使用した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＡＴＣＣ １５４３９を、ＡＴＣＣから凍結乾燥ペレットとして得た。栄養成長および抗生物質産生のための培地を、記述されたように（Ｌａｍｂａｌｏｔら，１９９２）使用した。簡潔には、ＳＧＧＰ液体培地は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｍｙｃｅｌｉａの増殖のためである。胞子形成寒天（Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ａｇａｒ）（ＳＰＡ）をＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ胞子産生のために使用した。メチマイシン産生を、ＳＣＭ培地または植物性培地のいずれかにおいて実施し、そしてピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）産生をＳｕｚｕｋｉグルコース−ペプトン培地において実施した。
【０１０７】
（ベクター、ＤＮＡ操作、およびコスミドライブラリーの構築）
ｐＵＣ１１９は、慣例的なクローニングベクターであり、ｐＮＪｌは、ゲノムＤＮＡライブラリー構築のために使用されるコスミドベクターであった。遺伝子破壊についてのプラスミドベクターは、ｐＧＭ１６０（Ｍｕｔｈら，１９８９）またはｐＫＣｌ１３９（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）のいずれかであった。プラスミド、コスミド、およびゲノムＤＮＡ調製、制限消化，フラグメント単離、およびクローニングを、標準的な手順を使用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５）。このコスミドライブラリーを、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ λ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示書に従って作製した。
【０１０８】
（ＤＮＡ配列決定およびＤＮＡ分析）
ＰＣＲに基く二重鎖ＤＮＡ配列決定を併用する、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）入れ子欠失シリーズを用いて、ｐｉｋクラスターの配列決定をした。Ｅｒａｓｅａ−Ｂａｓｅプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従うＥｘｏＩＩＩ手順およびＤＮＡ配列決定反応を、Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。この核酸配列を、両方のＤＮＡ鎖についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサーで読んだ。ＤＮＡおよび推定タンパク質配列分析をＧｅｎｅＷｏｒｋｓおよび ＧＣＧ配列解析パッケージを使用して実施した。全ての分析を、特定のプログラムデフォルトパラメーターを使用して実施した。
【０１０９】
（遺伝子破壊）
複製プラスミド媒介ホモログ組換えアプローチを、開発してＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける遺伝子破壊を実施した。挿入不活性化のためのプラスミドを、カナマイシン耐性マーカーを標的遺伝子中にクローニングすることによって構築し、そして遺伝子欠失／置換のためのプラスミドを、このプラスミド中で標的遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子またはチオストレプトン耐性遺伝子と置換することによって構築する。破壊プラスミドを、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５）またはＲＫ２媒介抱合（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）のいずれかによってＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに導入した。従って、個々の形質転換体またはトランス結合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）由来の胞子を、非選択的なプレート上でクラスター化し、組換えを誘導した。このサイクルを３回繰り返し、組換えの機会を増大させた。二重交差産生標的化（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ）遺伝子破壊変異体を、選択し、そして抗生物質の適切な組換合わせを使用してスクリーニングし、最終的にサザンハイブリダイゼーションで確認した。
【０１１０】
（抗生物質抽出および分析）
メチマイシン、ピクロマイシン、および関連化合物を、公開された手順に従って抽出した（Ｃａｎｅら，１９９３）。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、慣例的に使用して、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンを検出した。さらなる精製を、フラッシュクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを使用して実施し、そしてこの精製された化合物を、^１Ｈ ＮＭＲ分光法、^１３Ｃ ＮＭＲ分光法およびＭＳ分光分析によって分析した。
【０１１１】
（結果）
（ｐｉｋクラスターのクローニングおよび同定）
異種ハイブリダイゼーション（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成のための遺伝子を同定した。Ｉ型ＰＫＳのＤＮＡプローブを使用するはじめのサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、ゲノム中で特徴付けられていない機能の２つの多機能ＰＫＳクラスターを明らかにした。これらの４つの抗生物質は、全て同一のデソサミン残基から構成されるので、（チロシン経路におけるｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ／ｍｙｃｏｒｏｓｅ／ｍｙｃｉｎｏｓｅの生合成のための）ｔｙｌＡＩ α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジルトランスフェラーゼＤＮＡプローブ（Ｍｅｒｓｏｎ Ｄａｖｉｅｓら，１９９４）を使用して、対応する生合成遺伝子クラスターを位置付けた。この分析によって、唯一のＰＫＳ経路がデソサミン生合成遺伝子のクラスターを含むことを立証した。９つのオーバーラップ（重複）コスミドクローンを単離し、ここで、このクローンは、チマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成のための遺伝子クラスター全体（ｐｉｋ）を包含する細菌染色体上で８０キロ塩基（ｋｂ）に及んだ（図５）その後の遺伝子破壊を通して、この他のＰＫＳクラスター（ｖｅｐ、連結したデソサミン生合成遺伝子を欠く）は、メチマイシン，ネオメチマイシン、ナルボマイシンまたはピクロマイシンの産生において役割を果たさないことを見出した。
【０１１２】
（ｐｉｋクラスターの核酸配列）
ｐｉｋクラスターの核酸配列を、完全に決定し、そしてこの配列は１８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことを示し、ここで、これらのオープンリーディングフレームは、約６０ｋｂに及ぶことを示した。多機能ＰＫＳをコードする４つの大きなＯＲＦ（ｐｉｋＡＩ、ｐｉｋＡＩＩ、ｐｉｋＡＩＩＩ、およびｐｉｋＡＩＶ）が、このクラスターについて中心にある（図５）。これらのｐｉｋ ＰＫＳを含む６つのモジュールの分析によって、これが、ナルボノライド、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの１４員環のアグリコン前駆体の産生を特定することが示された（図５）。
【０１１３】
最初の分析によって、ｐｉｋＡにコードされるＰＫＳにおける２つの重要な構造的な差異を明らかにした。第１に、ｅｒｙＡ（Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９８）およびｏｌｅＡ（Ｓｗａｎら，１９９４）、すなわち、ピクロマイシンに類似の１４員環マクロライドエリスロマイシンおよびオレアドマイシン（ｏｌｅａｄｏｍｙｃｉｎ）を産生する２つのＰＫＳクラスターと比較して、別個のＯＲＦである、ｐｉｋＡＩＩＩおよびｐｉｋＡＩＶの存在は、注目すべき、ｅｒｙＡＩＩＩおよびｏｌｅＡＩＩＩにおけるような１つの２モジュール（ｂｉｍｏｄｕｌａｒ）タンパク質とは対照的に、これらのｐｉｋＡＩＩＩおよびｐｉｋＡＩＶは、Ｐｉｋモジュール５およびＰｉｋモジュール６を（個々のモジュールとして）コードする。第２に、Ｉ型ＰＫＳクラスターの直ぐ下流にある、ＩＩ型チオエステラーゼの存在はまた、前代未聞である（図５）。これらの２つの特徴によって、ｐｉｋＡが１２員環のマクロラクトン１０−デオキシメチライドを十分に産生し得る事実が示唆される。
ＰｉｋＡＩ−ＡＩＩＩ（モジュールＬ−５）のこのドメイン構成は、１０デオキシメチライドの予測された生合成物と一致し、但し、Ｐｉｋモジュール５（ＰｉｋＡＩＩＩ）のＣ末端にＴＥ機能は不在である。ＰｉｋＡＩＩＩにおけるＴＥドメインの欠失は、（ｐｉｋＡＶによりコードされる）ＩＩ型ＴＥによって補われ得、このＩＩ型ＴＥはｐｉｋＡＩＶの直ぐ下流に存在する。２つの別個のポリケチド環系はこのｐｉｋ ＰＫＳからアセンブリされるという仮定と一致して、２つのマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンであるＢ型耐性遺伝子、ｐｉｋＲ１およびｐｉｋＲ２が、ｐｉｋ ＰＫＳの上流に見出され（図６）、これは、おそらく、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて細胞性自己保護を提供する。
【０１１４】
デソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）生合成およびグリコシル転移のための遺伝子座は、ｐｉｋＡのすぐ下流である。７つの遺伝子（ｄｅｓＩ、ｄｅｓＩＩ、ｄｅｓＩＩＩ、ｄｅｓＩＶ、ｄｅｓＶ、ｄｅｓＶＩおよびｄｅｓＶＩＩＩ）は、デオキシ糖の生合成を担っており、そして８番目の遺伝子ｄｅｓＶＩＩは、デソサミンの代替性の（１２員環および１４員環）ポリケチドアグリコンへの転移を明らかに触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。たった一セットのデソサミン遺伝子の存在は、ＤｅｓＶＩＩＩが、１０−デオキシメチノリド（ｄｅｏｘｙｍｅｔｈｙｎｏｌｉｄｅ）およびナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）の両方を基質として受け得ることを示す（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。ｄｅｓ遺伝子座において、最も大きなＯＲＦ（ｄｅｓＲ）は、細菌自己防御に関する薬物不活性化−活性化サイクルに関与するβ−グリコシダーゼをコードする。
【０１１５】
ｄｅｓ遺伝子座のすぐ下流は、ｅｒｙＦ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２）およびｅｒｙＫ（Ｓｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３）に類似するチトクロムＣ Ｐ４５０ヒドロキシラーゼＰｉｃＣをコードする遺伝子（ｐｉｋＣ）、ならびに推定調節タンパク質ＰｉｋＤをコードする遺伝子（ｐｉｋＤ）である（図５）。興味深いことに、ＰｉｋＣは、全ｐｉｋクラスターにおいて同定された唯一のＰ４５０ヒドロキシラーゼであり、この酵素が、１２員環および１４員環のマクロライド基質の両方を受け得、そして、より著しくは、ＹＣ−１７（１２員環中間体）のＣ−１０およびＣ−１２の両方に対して活性であり、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）を生成することを示唆する（図７）。ＰｉｋＤは、ラパマイシン遺伝子クラスター中のＯＲＦＨに類似の推定調節タンパク質である（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。
【０１１６】
ｐｉｋクラスターにおいて、１８の遺伝子によってコードされる一体化した機能性は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成を予想する（表１）。ｐｉｋクラスターの遺伝子座のフランキングは、おそらく一次の代謝に関する遺伝子ならびに一次および二次の代謝の両方に関連し得る遺伝子である。Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ遺伝子は、デソサミン合成においてメチル基を提供することを補助し得るｐｉｋＤの下流に位置する。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子を、ポリケチド生合成についての前駆体を提供し得るｐｉｋＲ１の上流に同定した。これらの遺伝子のいずれが抗生物質の生合成に理想的なのか、そしてそれらのいずれがｐｉｋクラスターに直接関連していないのかは、明らかではない。
【０１１７】
（表１．ｐｉｋクラスターにおけるＯＲＦの推定機能）
【０１１８】
【表１】

ＡＴ（Ａ）、アセテート伸長ユニットを取り込むアシルトランスフェラーゼ；ＡＴ（Ｐ）、プロピオネート伸長ユニットを結合するアシルトランスフェラーゼ。ＫＲ^０、不活性なＫＲ。機能の不確定な酵素に、疑問符をつける。
【０１１９】
（表２．ｐｉｋクラスターの変異分析の概要）
【０１２０】
【表２】

（ｐｉｋクラスターの変異分析）
ｐｉｋクラスターにおける遺伝子の広範な破壊を、抗生物質生成の主要な酵素の役割を指定するために実施した（表２）。第一に、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドの生合成に関連する第一の推定酵素（ＰｉｋＡＩ）を、挿入突然変異誘発により不活性化した。生じた変異体（ＡＸ９０３）は、メチマイシンまたはネオメチマイシンも、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）またはピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）のどちらも生成せず、ｐｉｋＡが１２員環および１４員環の両方のマクロラクトン形成について要求されるＰＫＳをコードすることを示す。
【０１２１】
第二に、ｄｅｓＶＩおよびｄｅｓＶの両方の欠失は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生成を破壊し、そして生じた変異体（ＬＺ３００１およひＬＺ４００１）は、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドを、その培養ブロスに蓄積する。これは、デソサミンの合成および転移に関する酵素がまた、１２員環および１４員環のマクロライドによって共有されることを示す。
【０１２２】
ＰｉｋＡＩＩＩ（ＰＩＫＡＩＩＩ（モジュール５）は、１０−デオキシメチノリドの構造において、終結点であると推測される）でポリケチド鎖終結のメカニズムを理解するために、ｐｉｋ ＴＥＩＩ遺伝子である、ｐｉｋＡＶを欠失した。欠失／置換変異体（ＡＸ９０５）は、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅと比較して、５％未満のメチマイシン、ネオメチマイシン、そして５％未満のピクロマイシンを生成する。生成物形成におけるこの抑制は、予想されるアグリコン中間体の有意な蓄積なしに生じ、ｐｉｋ ＴＥＩＩが、ＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶのそれぞれでの、１２員環および１４員環のマクロライドの終結に関連することを示唆する。極性効果は、ＡＸ９０５において観察される表現型に影響し得るが、これは、変異体ＬＺ３００１の考慮の後に除外された。ＬＺ３００１における、ｐｉｋＡＶの下流の酵素における変異は、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドを蓄積した。変異体ＡＸ９０５がこれらの中間体を蓄積し得なかったという事実は、ポリケチド鎖が、Ｐｉｋ ＴＥＩＩの非存在下でこのＰＫＳタンパク質から効果的に開放されなかったことを示唆する。それゆえ、Ｐｉｋ ＴＥＩＩは、ポリケチド鎖の開放および環化において重大な役割を果たし、そして、おそらく、Ｐｉｋポリケチド生合成において代替的な終結についてのメカニズムを提供する。
【０１２３】
最後に、ＰｉｋＣの破壊によって、ＰｉｋＣがＹＣ−１７（Ｃ−１０およびＣ−１２で）ならびにナルボマイシン（Ｃ−１２で）の両方のヒドロキシル化を修飾する唯一の酵素であることを確認した。ＰｉｋＣの緩んだ基質特異性ならびにＣ−１０およびＣ−１２でのその領域特異性は、ｐｉｋがコードする生合成系における、代謝産物多様性の別の階層を提供する。
【０１２４】
（考察）
本明細書中に記載される研究は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成が、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいてｐｉｋクラスターによってコードされることを確定した。３つの主要な酵素およびクラスターの独特な構造は、この比較的コンパクトな系が、複数のマクロライド抗生物質を生成することを可能にする。最も重要なことに、別個のタンパク質としてのｐｉｋモジュール５および６（ＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶ）の存在ならびにｐｉｋ ＴＥＩＩの活性は、細菌が、アセンブリの２つの異なるポイントでポリケチド鎖を終わらせることを可能にし、それゆえ、２つの異なる環サイズのマクロラクトンを生成する。第二に、ｐｉｋクラスターにおけるグリコシルトランスフェラーゼは（ＤｅｓＶＩＩ）、基質として１２員環および１４員環のマクロラクトンの両方を受け得る。最後に、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼであるＰｉｋＣは、注目すべき基質およびこの系に別の階層の多様性を導入する領域化学的特異性を有する。
【０１２５】
これらのＰＫＳの各々が１４員環マクロラクトンの合成を特定化するので、ｅｒｙＡおよびｏｌｅＡと類似のラインで、ｐｉｋＡが発達することを考慮することは興味深い。それゆえ、原生のｐｉｋＡＩＩＩ−ｐｉｋＡＩＶリンカー領域における変異が、２つの別個の遺伝子産物へのＰｉｋのモジュール５および６の開裂を引き起こす場合、ｐｉｋは、メチマイシンを生成する能力を獲得し得る。この概念は、ヌクレオチド配列の２つの特徴によって生じる。第一に、ｐｉｋＡＩＩＩとｐｉｋＡＩＶとの間の遺伝子間領域（１０５ｂｐ）は、３５アミノ酸のモジュラー間リンカーペプチドの残りであり得る。さらに、ｐｉｋＡＩＶの独立して調節される発現についての可能性は、比較的ＡＴリッチ（コード領域におけるＧ＋Ｃ含有量（７４％）と比較して６２％）である遺伝子の５’末端での１００ヌクレオチド領域の存在によって暗示される。従って、２モジュラー多機能タンパク質（ＰｉｋＡＩＩＩ−ＰｉｋＡＩＶ）をコードする元々のＯＲＦにおいて変異が生じるので、新規の遺伝子産物（ＰｉｋＡＩＶ）の調節された合成についてのメカニズムもまた判明し得る。
【０１２６】
ポリケチド鎖伸長中間体の代替的な終結におけるＰｉｋ ＴＥＩＩの役割は、天然生成物生合成において多様性生成の特有な局面を提供する。操作された異なる鎖長のポリケチドは、代表的に、モジュラーＰＫＳにおいて代替的位置にＴＥ触媒ドメインを移動させることによって生成される（Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。ＴＥドメインの再配置は、元々の全長ポリケチドの生成を必然的に破壊し、たった一つのマクロライドがその度ごとに生成される。固定された位置のＴＥドメインとは対照的に、独立したＰｉｋ ＴＥＩＩポリペプチドは、おそらくポリケチドアセンブリの異なる段階で終結を触媒するために、可変性を有する。それゆえ、この系が、改変された鎖長の複数の生成物を生成することを可能にする。コンビナトリアルな生物学的技術は、現在、単一の終末工程を触媒することに限定されるＴＥドメイン単独とは反対に、いくつかの新規の分子の同時生成についてＴＥＩＩを用いる新規のＰＫＳ系の構築によって分子の多様性を生成するためにこの系を利用し得る。
【０１２７】
Ｐｉｋ ＴＥＩＩに対して類似の配列が、ほとんど全ての公知のポリケチドおよび非リボソームポリペプチドの生合成系において見出されることに注目すべきである（Ｍａｒａｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。現在、ｐｉｋ ＴＥＩＩは、モジュラーＰＫＳにおいて最初に特徴付けられている。しかし、リポペプチドサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）生合成クラスターにおけるＴＥＩＩ遺伝子に関する最近の研究は、ｓｒｆ−ＴＥＩＩが、ポリペプチド鎖開放において重要な役割を果たすことを実証し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９８）、およびｓｒｆ−ＴＥＩＩが、ペプチドアセンブリにおいても同様に複数の段階で反応することを示唆し得る（Ｍａｒａｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０１２８】
１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドのポスト−ポリケチドアセンブリに関連するこの酵素は、特に、グリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）、およびＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）と通じている。両方ともが、有意な構造可変性を有する基質を受ける、著しい能力を有する。さらに、ｄｅｓ ＶＩの破壊は、ＤｅｓＶＩＩがまた、デオキシ糖構造におけるバリエーションに耐性であることを実証した。同様に、ＰｉｋＣは、インビトロでＹＣ−１７をメチマイシン／ネオメチマイシンに、そしてナルボマイシンをピクロマイシンに転換することが最近示された。
【０１２９】
ＯＲＦ１の標的化遺伝子の破壊は、ピクロマイシンおよびメチマイシン両方の生成を破壊し、これは、単一クラスターが両方の抗生物質の生合成を担うことを示す。ＴＥ２遺伝子の欠失は、メチマイシンおよびピクロマイシンの生成を実質的に減少させ、ＴＥ２が位置固定型ＴＥ１ドメインとは対照的に、アセンブリプロセスの間に異なるポイントで、ポリケチド鎖を開放する能力を有し、それゆえ、異なる鎖長のポリケチドを生成することを実証した。
【０１３０】
上記の結果は、１つのＰＫＳクラスターが、２つのマクロライド（これらは、環構造の原子数が異なる）を生成し、ＰＫＳのモジュール５およびモジュール６（スペーサー領域によって分離される）がＯＲＦに存在し、ＰｉｋＡＩＩＩがＴＥを欠き、ＩＩ型チオエステラーゼが存在し、ＴＥＩドメインが分離されておらず、そして２つの耐性遺伝子が、１２員環または１４員環のいずれかに特異的であり得ることを同定されるということが驚くべきことであるという点で予期されなかった。
【０１３１】
４つの活性マクロライドを生成する能力のあるＤＮＡの、６０ｋｂ未満にわたる１８の遺伝子を伴って、ｐｉｋクラスターは、これまでに調査されたなお最も汎用性のモジュラーＰＫＳ系の最小複合体を示す。この単純性は、強制的な発現系の基礎を提供し、新規の活性ケトシド生成物を、新しい生物学的に活性な多様な範囲の化合物の発見についてかなりの容易さで操作および生成する。
【０１３２】
（要約）
複合体ポリケチド合成は、前進的な反応メカニズムに従い、そしてＰＫＳ内の各モジュールは、一続きの３〜６個の酵素ドメインを有する。これらの酵素ドメインは、エリスロマイシン生成ＰＫＳに特に詳細に記載されるようなほぼ直線の形順序で、反応を触媒する（Ｋａｔｚ、１９９７；Ｋｈｏｓｌａ、１９９７；Ｓｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）。ポスト−ポリケチド作製のための酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ）をコードする遺伝子に加えてＰＫＳモジュールと触媒ドメインとの組み合わされたセットは、代表的に単一ポリケチド生成物の生成のために生合成系を制限する。
【０１３３】
コンビナトリアル生物学は、新規の薬物発見において使用される天然産物の分子多様性を作り出すための、複数段階の生合成経路の遺伝子操作に関する。その固有な遺伝子編成およびポリケチド代謝産物（細菌（主に、放線菌および粘液細菌）ならびに真菌によって生成される、多様な構造および生物学的活性を有する天然生産物の大きな群である）を生成する能力に起因して、ＰＫＳは、コンビナトリアル技術について最も影響を受けやすい系の１つを示す。複合体ポリケチドは、動物における長鎖の脂肪酸合成に類似のメカニズムに関する多機能なＰＫＳによって生成される（Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、１９９０）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるエリスロマイシンＰＫＳに関する先駆的研究は、モジュール編成を示した（Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０；Ｄｏｎａｄｉｏ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。このマルチドメインタンパク質系の特徴は、ラパマイシン（Ａｐａｒｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）、ＦＫ５０６（Ｍｏｔａｍｅｄｉ ｅｔ ａｌ．、１９９７）、ソラフェンＡ（ｓｏｒａｐｈｅｎ Ａ）（Ｓｃｈｕｐｐ ｅｔ ａｌ．、１９９５）、ニドダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（Ｋａｋａｖａｓ ｅｔ ａｌ．、１９９７）およびリファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）（Ａｕｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．、１９９８）のＰＫＳの分子分析を受けて、多機能な細菌ＰＫＳのモジュラー構造とそのポリケチド生成物の構造との間の同一直線的な関係を証明した。
【０１３４】
異常な代謝産物の構造的可変性を生成し得る微生物系の調査において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＡＴＣＣ １５４３９は、２つの異なるマクロライド抗生物質の群を生成するその能力において注目に値する。メチマイシンおよびネオメチマイシンは、１２員環マクロラクトンの１０−デオキシメチノリドから誘導されるが、ナルボマイシンおよびピクロマイシンは、１４員環マクロラクトン（ナルボノリド）から誘導される。これらの抗生物質の生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび特徴付けは、代謝派生物を形成することにおいてＩＩ型チオエステラーゼの重要な役割を示し、それによって、異なる鎖長のポリケチドが、ピクロマイシン多機能性ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）により生成される。ＰＫＳ遺伝子（ｐｉｋＡ）のすぐ下流は、デソサミン（ｄｅｓ）生合成およびマクロライド環ヒドロキシル化に関する遺伝子の１セットである。グリコシルトランスフェラーゼ（ｄｅｓＶＩＩＩによってコードされる）は、１２員環および１４員環のマクロラクトンの両方のグリコシル化を触媒する著しい能力を有する。さらに、ｐｉｋＣがコードするＰ４５０ヒドロキシラーゼは、マクロライド環系に領域化学的多様性を導入することによって構造可変性の別の層をさらに提供する。
【０１３５】
（実施例４）
（ｄｅｓＶ欠失変異体はＤ−キノボースを生じる）
破壊されたｄｅｓＶ遺伝子を有するＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの変異体（ＫｄｅｓＶ−４１）を、構築した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１２１５９ （１９９８））。ｄｅｓＶは３−アミノトランスフェラーゼ（３−ケト糖１７（図１１）を対応するアミノ糖４に転換することを触媒する）をコードするので、この遺伝子の欠失はＣ−３アミノ基転移を防ぎ、１７の蓄積を生じる。この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、ケト糖中間体１７を認識および処理することが可能であるならば、ＫｄｅｓＶ−４１変異体によって生成されたマクロライド生成物は、結合した３−ケト糖を有するはずであることが予測された。驚くべきことに、単離された２つの生成物は、メチマイシン／ネオメチマイシンアナログ１８および１９であり、各々４，６−ジデオキシヘキソースを有する（図１２）。この結果は、グリコシルトランスフェラーゼについてのその糖基質に対する緩やかな特異性を証明したが、これはまた、糖代謝産物のＣ−３ケト基を立体特異的に還元し得る、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける経路非依存性のレダクターゼの存在を示す。
【０１３６】
操作された糖を含むこの種類の新しいマクロライドを合成し得る変異体を生成する可能性を探索するために、デソサミンの生合成においてＣ−４脱酸素を担うデヒドラーゼをコードすることが提唱されているｄｅｓＩ遺伝子が、Ｄ−キノボース（２２；図１３）（これはまた、６−デオキシ−Ｄ−グルコースとして公知である）の最終産物への取り込みを導くという予測を改めた。理論的根拠は以下に基づく：（１）デソサミン生合成は、ｄｅｓＩ欠失に起因して、Ｃ−４脱酸素工程で「終結」し、従って３−ケト−６−デオキシヘキソース１６の蓄積を生じるはずである（図１１）。（２）Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて、３−ケトヘキソースレダクターゼの存在の平均をとることによって、この糖中間体１５がＤ−キノボース（２２）に立体特異的に還元されることが予想される。（３）糖基質に対して緩やかな特異性を有するグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）は、操作された糖Ｄ−キノボースを含む新しいマクロライド２０および２１を得るために、マクロラクトンへの２２のカップリングを触媒するはずである（図１３）。
【０１３７】
アパラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性マーカーを含むｐＫＣ１１３９から誘導した破壊プラスミド（ｐＤｅｓＩ−Ｋ）を、ｄｅｓＩをネオマイシン耐性遺伝子によって置換するように構築し、これにまた、カナマイシンに対する耐性を付与した。次いで、この構築物を、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに、ドナー株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ１７−１を用いる接合伝達によって導入した（Ｂｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。いくつかの二重交差変異体を、それらのカナマイシン耐性（Ｋａｎ^Ｒ）およびアパラマイシン感受性（Ａｐｒ^ｓ）の表現型に基づいて同定した。１つの変異体（ＫｄｅｓＩ−８０）を選択し、そして播種培地（１００ｍＬ）において２９℃にて４８時間増殖させ、次いで接種し、そして成長培地（５Ｌ）においてさらに４８時間増殖させた（Ｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９３）。発酵ブロスを遠心分離して、細胞の破片および菌糸体を除去し、そして上清を濃縮水酸化カリウム溶液を用いてｐＨ９．５に調整した。生じた溶液をクロロホルムで抽出し、そしてプールした有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまでエバポレートした。黄色油状物を、クロロホルム中の０〜１２％メタノールの勾配を用いるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーに供し、そして単離された生成物を、定組成的なＣ_ｌ８カラム溶出（水中の５０％アセトニトリルを用いる）を用いるＨＰＬＣによってさらに精製した。予想したように、メチマイシンもネオメチマイシンも検出されなかった；かわりに、１０−デオキシメチノリド２３が、主要生成物として見いだされた（約６００ｍｇ）。多量のメチノリド２４（約４０ｍｇ）およびネオメチノリド２５（約２ｍｇ）をまた、単離した（図１３）。Ｄ−キノボース（３．２ｍｇ）を含む新しいマクロライド１５を、この変異体によって生成した。この構造をスペクトル分析によって十分に確定した。１５についてのスペクトルデータ（Ｊ値はヘルツ）：
【０１３８】
【化５】

Ｄ−キノボースを含むマクロライド１５がｄｅｓＩ変異体によって実際に生成されるという事実は、重要である。第一に、予想されたようなキノボースの形成は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて経路に依存しないレダクターゼ（３−ケト糖を還元する）の存在をさらに確証する。興味深いことに、このレダクターゼは、４，６−デオキシ糖１７および６−デオキシ糖１６に対して作用し得、Ｃ−４でのヒドロキシル基の存在を無視することを示唆する。しかし、この時点ではこの還元が遊離の糖で生じるのか、または遊離の糖がアグリコンに付加された後で生じるのかは明らかではない。第二に、ｄｅｓＩ欠失の結果としてのキノボースの４−ＯＨの保持は、Ｃ−４でヒドラーゼをコードするように割り当てられたＤｅｓＩの役割を支持する強力な証拠を提供する。さらに、この結果は、この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、代替的な糖基質（これらの構造は、元々のアミノ糖基質デソサミンとはかなり異なる）を認識し得ることを再び示す。キノボースの取り込みは重要であるが、予期されていないにもかかわらず、別の注目すべき結果は、単離されたマクロライド１５アグリコンが、メチノリド２４およびネオメチノリド２５ではなく１０−デオキシメチノリド２３であったという事実である。チトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）（これは、Ｃ−１０位またはＣ−１２位のいずれかでの１０−デオキシメチノリドのヒドロキシル化を触媒する（Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８））は、付加された糖における構造的なバリエーションに感受性である可能性がある。糖部分における４−ＯＨ基の存在が、マクロライドのヒドロキシル化の減少または防止を幾分か担っていることが議論され得る。
【０１３９】
従って、この結果は、所望される構造の糖を操作するために、経路に依存する遺伝子操作と経路に依存しない酵素反応との組み合わせの実行可能性を実証する。経路に依存しない酵素がまた天然の生合成機構と合わせて使用されて、さらなる構造多様性（これは、無作為な化合物のアレイを提供し得る）を生成することが、考えられる。
【０１４０】
（実施例５）
（ハイブリッドマクロライドの操作）
マクロライドの糖構造を変化させるために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｍｅｔ／ｐｉｋ遺伝子クラスターを、親系として選択し、そしてカリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）生合成遺伝子クラスター（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓに由来）に由来する遺伝子を外来遺伝子として選択した。親クラスターは、メチマイシン、ネオメチマイシン、ピクロマイシンおよびナルボマイシンについての生合成酵素をコードし、これらは全て、抗生物質活性についての唯一の糖成分としてデソサミンを含むマクロライドである （Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。このクラスターにおける８つのオープンリーディングフレーム（ｄｅｓＩ〜ｄｅｓＶＩＩＩ）を、デソサミン生合成に関連する遺伝子として割り当てた（図１５）。抗腫瘍薬剤カリチェアミシン（２６）は、密なＤＮＡ結合（Ｋ_ａ約１０^６〜１０^８）に重要な４つの独特な糖を含み、そのうちの１つ（２９）は、４−アミノ−４，６−ジデオキシグルコース（２８）から誘導され、そして著しく制限された糖Ａと糖Ｂとの間のＮ−Ｏ結合の一部分である（図１６）（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９１；Ｄｒａｋ ｅｔ ａｌ．、１９９１；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１；Ｅｌｌｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．；Ｂｏｒｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。化合物２８は、アミノ基転移反応によって対応する４−ケト糖２７から誘導されることが予想され、そして、最近の研究は、Ｃ−４アミノトランスフェラーゼをコードするとして遺伝子（ｃａｌＨ）の割り当てを導いている（図１６）（Ａｌｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）。興味深いことに、ｃａｌＨに対して提案された基質（２７）はまた、デソサミン経路の中間体であり、ＤｅｓＩに対する基質との、トートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）（ＤｅｓＶＩＩＩ）が媒介する平衡状態で存在することが予想される（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。従って、２７が、ｄｅｓＩまたはｄｅｓＶＩＩＩの破壊／欠失Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異株において蓄積され得ることが考えられる。この変異体におけるｃａｌＨの異種性の発現は、２６から誘導した４−アミノ−４，６−ジデオキシグルコースを有する新しいメチマイシン／ピクロマイシン誘導体に指向するハイブリット経路を再構成し得る。
【０１４１】
これを試験するために、１．２ｋｂのｃａｌＨ遺伝子を、ｐＪＳＴ１１９２_{Ｋｐｎ７．０ｋｂ}（コスミド１３ａの７．０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含むサブクローン）からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９９）。増幅した遺伝子を、アプラマイシン耐性マーカーを含む、発現ベクターｐＤＨＳ６１７のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位へとクローン化した。ｐＤＨＳ６１７を、ｐＯＪ４４６（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）およびｍｅｔ／ｐｉｋ由来のプロモーター配列（Ｘｕｅら、１９９８）から誘導する。得られたプラスミド（ｐＬＺ−Ｃ２４２）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓ１７−１（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を用いて、以前に構築したＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体（ＫｄｅｓＩ）（Ｂｏｒｉｓｏｖａら、１９９９）へと接合伝達によって導入した。ここで、ｄｅｓＩを、カナマイシンに対する耐性をも与えるネオマイシン耐性遺伝子によって置き換えた。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ−ＫｄｅｓＩコロニーを含むｐＬＺ−Ｃ２４２を、アプラマイシン抗生物質（Ａｐｒ^Ｒ）に対する耐性に基づいて同定した。操作された株の１つ（ＫｄｅｓＩ／ｃａｌＨ−１）を、最初に、１００ｍＬの播種培地中で２９℃で４８時間増殖させ、次いで、定養培地（５Ｌ）に播種し、さらに４８時間増殖させる（Ｃａｎｅら、１９９３）。発酵ブロスを遠心分離して細胞組織片および菌糸を除去し、上清を濃ＫＯＨでｐＨ９．５に調節した後、クロロホルムで抽出した。粗生成物（７００ｍｇ）を、クロロホルム中の０〜２０％メタノールの勾配を用いてシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに供した。主生成物（１０−デオキシメチノリド）および副生成物の２種のマクロライド化合物の混合物を得た。この２種のマクロライドをさらに、アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ（１：１）の定組成移動相を用いて、Ｃ_１８カラム上でＨＰＬＣによって精製した。これらの化合物を、スペクトル分析によって３１（１１．０ｍｇ）および３２（１．５ｍｇ）として後に同定した。３１のスペクトルデータは以下である：
【０１４２】
【化６】

３２のスペクトルデータは以下である：
【０１４３】
【化７】

ＫｄｅｓＩ／ｃａｌＨ−１によるマクロライド３１および３２の産生が観測されたことは、大きな意味を持つ。第１に、添加されたヘキソース（３３）は、予想されたＣ−４でのアミノ基を実際に保有し、カリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）経路のＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｌ−スレオ−４−ヘキスロース４−アミノトランスフェラーゼをコードするようなｃａｌＨ遺伝子の配列を明白に支持する。第２に、新規に構築された発現ベクターによってＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおけるＣａｌＨタンパク質の首尾良い発現は、この系を使用してこの株において、他の外来遺伝子を発現する可能性を有するさらに同化したコンビナトリアル生合成ストラテジーを開発するための必須条件を強調する。さらに、この結果はまた、この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、代替の糖基質（例えば、２８）（この構造は、元々のアミノ糖基質（ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン）とかなり異なる）を認識し得ることを示す。生成物中の糖成分がアミノデオキシヘキソース２８であると予想される場合、３１および３２中の結合した糖成分の４−アミノ基は、Ｎ−アセチル化されている。アセチル化が、遊離の糖で生じるかまたはアグリコンに付加した後に生じるかという点においては、明らかではない。３１および３２の両方は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異株によってインビボで合成された新規化合物であるため、観測されたＮ−アセチル化は、自己保護のために必要な段階であり得る（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９；Ｃｕｎｄｌｉｆｅ，１９９２；ＭｃＭａｎｕｓ，１９９７）。実際に、精製した３１および３２は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上で増殖したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して不活性であり（Ｍａｎａｇａｈａｓ，１９９６）、一方、コントロール（メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ））は、明らかに識別できる阻害領域を示す。
【０１４４】
別の注目すべきことは、予測されない結果ではあるが、単離されたマクロライド３１のアグリコンがヒドロキシル化されたメチマイシンアナログおよびネオメチマイシンアナログではなく１０−デオキシメチノリドであったという事実であった。興味深いことに、３２のアグリコンはまた、ヒドロキシル化されていない１４員環ナルボノリドであった。１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリド（Ｘｕｅら、１９９８）のヒドロキシル化を触媒するチトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）は、添加した糖上の構造的バリエーションに感受性である可能性がある。実際に、アグリコンがヒドロキシル化されないことは、３１および３２が精製したＰｉｋＣと共にインビトロでインキュベートされる場合に識別可能であった。同様の観測はまた、デソサミンがキノボース（ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ）によって交換されている場合に注目される（実施例４）。糖部分中のＣ−４での置換基（ヒドロキシル基またはアミノ基のいずれか）の存在は、マクロライドのヒドロキシル化を少なくとも一部減少させるかまたは防止する原因となることが議論され得る。
【０１４５】
結論として、この結果は、非天然の二次代謝産物グリコシル化パターンが、異種遺伝子の組み合わせの合理的な選別を通じて操作され得ることを示す。天然生合成の機構と協力して、外来酵素を組み合わせるこの示された能力は、さらなる構造多様性を生成する途方もない可能性を示す。本研究を拡張することによって、多様なヌクレオチド糖グリコシル化前駆体プールの構築は、速やかに、コンビナトリアル生合成の努力を通して、現在の新規な薬物発見を実質的に高め得る。
【０１４６】
（実施例６）
（ハイブリッド糖生合成経路を操作する工程）
デソサミン経路中の６−デオキシ−４−ヘキスロース３３はまた、のＴＤＰ−Ｌ−ジヒドロストレプトース（３５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ抗生物質ストレプトマイシン（３７）中に見い出されるストレプトースの前駆体（３６）のための生合成中間体として示唆されている（図１６）（Ｏｒｔｍａｎｎら，１９７４；Ｗａｈｌら，１９７５；Ｍａｉｅｒら，１９７５；Ｗａｈｌら，１９７９）。ストレプトマイシンクラスター中の遺伝子の仮の配列（Ｐｉｓｏｗｏｔｚｋｉら，１９９１；Ｄｉｓｔｌｅｒら，１９９２）で、ＴＤＰ−Ｌ−ジヒドロストレプトースのための生合成経路が想定されている。図１６に示されるように、ｓｔｒＭ遺伝子は、３３から３４への変換をになう３，５−エピメラーゼをコードし得、一方、ｓｔｒＬ遺伝子の産物は、３４の環縮小を触媒して３５を得る推測される（Ｐｉｓｏｗｏｔｚｋｉら，１９９１；Ｄｉｓｔｌｅｒら，１９９２）。ＳｔｒＭについて提案された基質（３３）はまた、デソサミン経路における中間体であるため、３３が蓄積するＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｄｅｓＩ−変異体におけるＳｔｒＭ、ＳｔｒＬ、またはＳｔｒＭ／ＳｔｒＬの異種発現は、Ｌ−ピラノースまたはＬ−フラノースを運ぶ新規なメチマイシン／ピクロマイシン誘導体に対するハイブリッド経路を再構築し得る。
【０１４７】
これらの実験において、ｓｔｒＭ（０．８ｋｂ）およびｓｔｒＬ（１．０ｋｂ）遺伝子を、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個に増幅した。増幅したｓｔｒＭ遺伝子を、発現ベクターｐＤＨＳ７０２（Ｘｕｅら，２０００）のＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ部位（チオストレプトン耐性マーカーを含む）にクローン化した。ｓｔｒＬ遺伝子を、ベクターｐＤＨＳ６１７のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位（アプラマイシン耐性マーカーを含む）へとクローン化した。各々のプラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ１７−１へと形質転換し（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）、次いで、以前に構築した変異体Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＫｄｅｓＩへと接合伝達によって別個に導入した。得られた株（ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭおよびＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬ）を、対応する抗生物質に対する耐性に基づいて同定した。同じストラテジーを使用して、ｓｔｒＬ含有プラスミドを、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ変異体へとさらに操作して、アプラマイシンおよびチオストレプトンの両方に対して耐性を有する、組換え株ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬを産生する。このような株の１つ（ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬ−８）を選択して、１５０ｍＬの播種培地中で２９℃で４８時間増殖させ、次いで、播種して定養培地（６Ｌ）中でさらに４８時間増殖させる（Ｃａｎｅら，１９９３）。発酵ブロスを遠心分離し、上清をクロロホルムで抽出した。濃縮後、残った黄色油状物（１．５ｇ）を、溶出液としてクロロホルム中の１０％メタノールを使用してシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに供した。粗生成物を、Ｃ_１８カラム上でＨＰＬＣによって、水中の０〜５０％アセトニトリル直線勾配を２０分用いて溶出して精製し、４種の新規マクロライド誘導体、３８（３１．１ｍｇ）、３９（６．３ｍｇ）、４０（３．０ｍｇ）、および４１（３．９ｍｇ）を得た。
【０１４８】
これらの化合物のスペクトル分析から、３８〜４０は、１２員環マクロライド誘導体であり、一方、４１は、１４員環マクロライドであることがわかった。
【０１４９】
【化８】

【０１５０】
【化９】

【０１５１】
【化１０】

【０１５２】
【化１１】

興味深いことに、３８〜４１中の、アグリコンと添加した糖の間の結合の立体化学は、（Ｊ_１’２’＝０Ｈｚ）であると確立し、これは、野生型構造において見られるグリコシド結合（ｄ，Ｊ_１’２’＝６．５−７．５Ｈｚ）とは異なっている。これらの新規化合物は全て同一の６−デオキシヘキソースを有するが、ＮＭＲデータでは、付加した糖がＬ−ラムノース（４２）であるか、またはそのエナンチオマー、６−デオキシ−Ｄ−マンノース（４３）であるかを区別できない。新規に組込まれた糖を明白に同定するために、３８を、ジメトキシプロパンで処理した後、（Ｓ）−または（Ｒ）−ＭＴＡＰクロリドで誘導体化し、対応するＭｏｓｈｅｒエステル（４４および４５）を生成する。ＭＴＡＰのフェニル環の配向が２つのジアステレオマー間で異なるため、ＭＴＡＰに隣接するプロトンは、アリール基の異方性円錐に対する空間的関係に依存して異なる遮蔽を受ける（Ｏｈｔａｎｉら，１９９１；Ｆｅｒｒｅｉｒｏら，１９９１）。この十分に実証された現象に基づいて、キラル中心（Ｃ−４’）の絶対的立体化学は、（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル − （Ｒ）−ＭＴＰＡエステルとして測定された化学シフトの違いから推定され得る。図１６の底部において示されるように、１’−Ｈ、２’−Ｈ、３’−Ｈ、４’−Ｈ、アセトニド基の２つのメチルシグナルについて正の値が観測され、一方、５’−Ｈおよび５’−Ｍｅについて負の値が記録された。これらの発見は、Ｃ−４’においてＳ構造であることを示し、３８〜４１中の結合した糖がＬ−ラムノースとして割り当てられることを示す。
【０１５３】
操作されたＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬ株によって産生される代謝産物３８〜４１の糖成分としてのＬ−ラムノース（４２）の同定を用いて、３３を３４に変換する３，５−エピメラーゼとしてのＳｔｒＭの役割が、明確に確認される。ａ−連結Ｄ−キノボース（ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ）（４７，６−デオキシ−Ｄ−グルコース）を保有する、対応するメチマイシン／ピクロマイシン誘導体は、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬ株によって産生される（図１６）。これらのキノボース含有マクロライドはまた、宿主株（Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＫｄｅｓＩおよびＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株）の代謝産物として見い出された。ＳｔｒＬの基質が、３４であると予測されるため、ＳｔｒＭの非存在下で、３４を提供する３３の必要なＤ−／Ｌ−変換を触媒し、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬおよびＫｄｅｓＩ株の両方が、観察されたような同じマクロライドを産生することは驚くべきことではない。新規なマクロライド生成物が、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株のブロスにおいて見い出されないという事実は、インビボで３４が不安定であることに起因し得るか、またはグリコシルトランスフェラーゼ ＤｅｓＶＩＩが、基質としての３４を処理できないことに起因し得る。明らかに、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＫｄｅｓＩの宿主株は、ＴＤＰ−Ｄ−キノボース（４６）に３３を還元させ得るが、３４を還元するそれ自身のＬ−ヘキソースレダクターゼを欠く、Ｄ−ヘキスロースレダクターゼに依存しない経路を含む。ＳｔｒＭで触媒されるエピマー化は、可逆であると予想される。従って、Ｄ−ヘキソースレダクターゼの存在下、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株における３３と３４との間の平衡は、３３の方にシフトし、還元の後に、生成物中に観測されるようなキノボースを生じる。Ｌ−ラムノースは、ｓｔｒＬ含有株中にのみ形成されるため、ジヒドロストレプトースシンターゼとしての推定機能に加えて、ＳｔｒＬが、Ｌ−６−デオキシ−４−ヘキソース（例えば、３４）をＴＤＰ−Ｌ−ラムノース（４８）に還元し得る糖レダクターゼとしても役立つということを結論付け得る。
【０１５４】
ジヒドロストレプトース経路における環縮小工程の機構は、アピオースシンターゼによって触媒されるＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸（４９）から誘導されるＵＤＰ−Ｄ−アピオース（５０）の生合成に提案される工程と著しく類似していることに注目されるべきである（図１８）（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，１９７２；Ｇｅｂｂら，１９７５；Ｗａｔｓｏｎら，１９７５；Ｍａｔｅｒｎら，１９７７；Ｗａｈｌら，１９７８）。このシンターゼは、４−ヘキスロースレダクターゼおよび環縮小活性の両方を有する二重機能を有するように割り当てられている。というのは、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース（５１）は、アピオースシンターゼの触媒作用の副生成物であるからである（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，１９７２；Ｇｅｂｂら，１９７５；Ｗａｔｓｏｎら，１９７５；Ｍａｔｅｒｎら，１９７７；Ｗａｈｌら，１９７８）。従って、ＳｔｒＬがヘキスロースレダクターゼ活性を有するアピオースシンターゼに似ているという事実が、ジヒドロストレプトース経路における環縮小工程のための触媒のようなＳｔｒＬの類似の役割に関して強力な信用性をもたらす。マクロライド構造への３５の組込みを検出できないことは、その活性部位においてフラノースに適応するＤｅｓＶＩＩの制限を単に反映する。
【０１５５】
明細書中に記載される結果は、基質としてのＤ−糖およびＬ−糖の両方を認識するグルコシルトランスフェラーゼの珍しい例を示す（Ｗｏｈｌｅｒｔら，１９９８）。基質選択におけるグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）の確立された汎用性は、広範囲の改変された糖を保有する、新規抗生物質のためのより優れたコンビナトリアル生合成ストラテジーをさらに開発する新規マクロライドの構築における触媒としての能力のための必須要件を強調する。この研究は、再度、合理的な遺伝子の組み合わせの選別を通して二次代謝産物のグリコシル化を操作しやすいことを示す。
【０１５６】
（実施例７）
（ＤｅｓＩＩによるＴＤＰ−４−アミノ−４，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコースの合成）
炭水化物は、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を有する認識の増加に起因して、近年において生物学的分子の間で注目され始めている（Ｗｅｙｍｏｕｔｈ−Ｗｉｌｓｏｎら，１９９７）。多くの複合多糖、糖、特にデオキシ糖の成分として、多様なレパートリーの生物学的活性に寄与する。付加した糖の構造を改変することは、親の複合多糖の生物学的活性を変化または向上させるための見込みを保持するので、これらの珍しい糖がどのように生物の産生において作製されるかを探索するためのかなりの継続した努力が存在する（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００）。このような努力は、ヘキソース糖のＣ−Ｏ結合を破壊するための天然に進化した、いくつかの優雅なストラテジーの発見を導く。従って、現在、一連のα，β−脱水、その後のヒドリド還元は、ケト糖前駆体のβ−脱酸素に関する機構であり（Ｄｒａｅｇｅｒら，１９９９；Ｃｈｅｎら，１９９９）、一方、ピリドキサミン５’−ホスフェート（ＰＭＰ）に依存性の［２Ｆｅ−２Ｓ］含有酵素（Ｅ_ｌ）およびＮＡＤＨ依存性の鉄−硫黄フラボタンパク質レダクターゼ（Ｅ_３）による共同の触媒活性は、ケト糖基質のα−脱酸素のために必要とされる（Ｔｈｏｒｓｏｎら，１９９３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６；Ｃｈａｎｇら，２０００）。
【０１５７】
ヘキソースのＣ−２、Ｃ−３、およびＣ−６でのＣ−Ｏ結合開裂の機構は、十分に確立されている（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００）が、４−脱酸素化糖の作製におけるＣ−４でのＣ−Ｏ結合切断の様式についてはほとんど知られていない。Ｄ−デソサミン（図１９中の１）、３−（ジメチルアミノ）−３，４，６−トリデオキシヘキソースの生合成に関する遺伝的研究は、多くの抗生物質において見い出され、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ由来のデソサミン生合成遺伝子クラスター全体の同定を生じ（スキーム１、図１９）（Ｚｈａｏら、１９９８；Ｘｕｅら、１９９８）、メチマイシン（２）、ネオメチマイシン（３）、ピクロマイシン（４）、およびナルボマイシン（５）を産生する。このことから、このクラスター内の８つのオープンリーディングフレーム（ｄｅｓＩ−ｄｅｓＶＩＩＩ）は、Ｃ−４脱酸素工程と関連するように割り当てられるｄｅｓＩおよびｄｅｓＩＩを含むデソサミン生合成中に含まれることが示唆される（Ｚｈａｏら、１９９８；およびエリスロマイシン遺伝子クラスターにおけるＤｅｓＩ／ＤｅｓＩＩ等価体（すなわち、ＥｒｙＣＩＶ／ＥｒｙＣＶ）に関連する、Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７を参照のこと）。ｄｅｓＩの翻訳された配列が、Ｂ_６依存酵素に対して高い相同性を示し、Ｅ_１の配列に対して２４％同一性であり、翻訳されたｄｅｓＩＩ配列は、［４Ｆｅ−４Ｓ］中心について特徴的なＣＸＸＸＣＸＸＣ（配列番号５０）の保存されたモチーフを含む（Ｒｕｚｉｃｋａら，２０００）ため、Ｃ−４脱酸素は、Ｅ_ｌおよびＥ_３によって触媒されるものと類似の経路に従うように想定される（Ｚｈａｏら、１９９８；およびＧａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７を参照のこと）。スキーム１（図１９）中に示されるように、この反応は、ＤｅｓＶＩＩＩによっておそらく触媒される互変異性工程によって開始されて６（６−デオキシヘキソースのための共通の前駆体）を３−ケト−６−デオキシヘキソース（７）に変換し得る。次いで、ＤｅｓＩおよびＤｅｓＩＩは、７からの４−ＯＨの除去をもたらし、３−ケト−４，６−ジデオキシヘキソース生成物（８）を与え、この生成物（８）は、この経路における次の酵素の基質（ＤｅｓＶ）として以前に確認されている（Ｚｈａｏら、１９９８）。この提案は、４−ＯＨが、ｄｅｓＩ欠失変異体によって産生される改変されたメチマイシンおよびピクロマイシン誘導体の付加した糖（Ｄ−キノボース、９）中に保持されるという事実によって支持される（Ｂｏｒｉｓｏｖａら、１９９９）。このＣ−Ｏ結合開裂事象についてさらに学ぶために、ｄｅｓＩＩ遺伝子の標的化された破壊およびＤｅｓＩ酵素の機能的分析を行なった。
【０１５８】
ＤｅｓＩＩがＣ−４脱酸素機構の一部であるか否かを確認するために、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体を生成し、ここで、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ染色体を有する適切な挿入物を含有するプラスミドの相同組換えを介して、ｄｅｓＩＩ遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子と交換した（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）。この変異株を単離して、以前に記載されたように発酵のために使用した（Ｚｈａｏら、１９９８；Ｃｎａｅら、１９９３）。Ｅ_１で触媒される脱水が、逆方向を好む平衡可逆反応であり（Ｗｅｉｇｅｌら、１９９２）、Ｅ_３による還元は、全体的な反応を完結させるために必須であることが指摘されるべきである。それ故、Ｃ−４脱酸素は、Ｅ_１／Ｅ_３触媒活性に類似の経路に従い、ＤｅｓＩＩは、Ｅ_３等価体である場合、ｄｅｓＩＩ遺伝子の破壊は、ｄｅｓＩ変異体に対して同一な表現型を有する変異体を与えると予想される。実際に、非野生型の抗生物質を、ｄｅｓＩＩ欠失変異体の発酵ブロス（６Ｌ）中に見い出した；代わりに、２つのマクロライド含有Ｎ−アセチル化４−アミノ糖１１（２．４ｍｇ）および１２（１ｍｇ）を得た（Ｚｈａｏら、１９９８を参照のこと）。化合物１１および１２は、１０とそれぞれのアグリコンのカップリング、その後のＮ−アセチル化から誘導される（スキーム１）。しかし、１０のＮ−アセチル化はまた、アグリコンのカップリングの前に生じる可能性がある。この一連の事象にもかかわらず、１１および１２の産生は、１０が、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｄｅｓＩＩ欠失変異体中に蓄積されなければならないことを明確に示す。
【０１５９】
上述の結果は、ＤｅｓＩが４−アミノトランスフェラーゼであり、４−アミノ化は、４−脱酸素の開始段階であるというヒントを提供する。ＤｅｓＩの触媒的機能を確認するために、ｄｅｓＩ遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、Ｎ末端でＨｉｓ_６−ｔａｇを用いて、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。産生したＤｅｓＩタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって、その後ＭｏｎｏＱカラム上でＦＰＬＣによって同質性を近づけるために精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように、ＤｅｓＩのサブユニットＭ_ｒを、４５ｋＤａであると概算し、これは、４５ ７６５Ｄａ（プラスＨｉｓ_６ｔａｇ）の計算された分子量と十分に一致する。サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分析は、ＤｅｓＩに関して９５．６ｋＤａのＭ_ｒであることがわかった。それ故、ＤｅｓＩは、溶液中でホモ二量体として存在する。精製したＤｅｓＩのＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、約３００ｎｍより上で認識されない；しかし、より濃縮されたサンプルのスペクトルは、トレース量のＰＬＰの存在を示す。
【０１６０】
興味深いことに、推定基質（ＴＤＰ−３−ケト−デオキシ−Ｄ−グルコース（７））が、Ｌ−グルタメート存在下、精製したＤｅｓＩと共にインキュベートした場合、７は消費されず、新しい生成物は存在しないことを、ＨＰＬＣ分析によって認めた。これに反して、ＴＤＰ−４−アミノ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコース（６）を同一条件下でＤｅｓＩを用いてインキュベートした場合、６（保持時間＝４．５２分）の消費および新規生成物（保持時間＝３．８７分）の形成が観測された。この新規の化合物を、ＭｏｎｏＱカラム上でＦＰＬＣによって精製し、ＴＤＰ−４−アミノ−４，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコース（１０）として特性決定した。これらの結果は、ＤｅｓＩは、基質として４−ヘキソース（６）のみを認識することを確実にし、３−ヘキスロース（７）を処理しない。これらの発見は、ｄｅｓＩＩ遺伝子破壊の結果を十分に実証する。ＰＬＰ−依存性の４−アミノトランスフェラーゼのように、５６．２±３．１／分のκ_ｃａｔ値および糖基質６に関する１３０±４μＭのＫ_Ｍ値もまた、ＤｅｓＩについて決定した。
【０１６１】
ＤｅｓＩは、ＤｅｓＩＩの非存在下、６におけるアミン交換反応を触媒して、以前に提案されたＴＤＰ−Ｄ−デソサミンのための生合成経路（スキーム１、図１９）の改変のための４−アミノ糖生成物１０を生成する。明らかに、６から７への互変異性は、デソサミン経路において必要な工程ではない。さらに、Ｃ−４脱酸素の機構は、Ｅ_１／Ｅ_３によって触媒されるＣ−３脱酸素の機構に類似し得ることが暗示される（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００；Ｔｈｏｒｓｏｎら，１９９３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６；Ｃｈａｎｇら，２０００）。ＤｅｓＩ／ＤｅｓＩＩ触媒活性が、Ｃ−４での窒素官能基（例えば、１３）の組み込みによって開始されることを考慮すると、アミナール（ａｍｉｎａｌ）中間体（例えば、１４）を生成するＣ−４からＣ−３への１，２−窒素シフトは、Ｃ−４脱酸素の鍵段階であり得る。スキーム２に示されるように、１４のＣ−３からの水もしくはアンモニウム分子のいずれかの脱離は、３−ケト−４，６−ジデオキシ糖生成物（８）を生成する。１，２−アミノシフトを促進し得る酵素が存在する。２つの最もよく研究された例が、エタノールアミンアンモニアリアーゼ、およびエタノールアミンのアンモニアおよびアセトアルデヒドへの分解を触媒するアデノシルコバラミン（ａｄｅｎｏｓｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎ）（ＡｄｏＣｂｌ）依存性の酵素（Ｂａｂｉｏｒら、１９８２；ＬｏＢｒｕｔｔｏら、２００１；Ｆｒｅｙら、２０００）、ならびにアミノ基の１，２−−転移を介するＬ−リジンおよびＬ−β−リジンの相互変換を触媒するリジン２，３−アミノムターゼ（Ｂａｂｉｏｒら，１９８２；ＬｏＢｒｕｔｔｏら，２００１；Ｆｒｅｙら，２０００）である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ ＳＢ４由来の後者の酵素は、鉄−硫黄中心を含み、ＰＬＰおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性である。両方の反応は、リジン２，３−アミノムターゼにおけるＳＡＭの還元的開列またはエタノールアミンアンモニアリアーゼ中のアデノシルコブ（ＩＩＩ）アラミンのＣｏ−Ｃ結合の等方性開裂によって生成する、推定５’−デオキシアデノシルラジカルを含むと考えられる。このアデノシルラジカルは、次いで、基質から水素を引き抜き、異性化を開始する。ＤｅｓＩは、ＰＬＰ酵素であり、ＤｅｓＩＩは、最近は、配列分析によって、ラジカルＳＡＭスーパーファミリーのメンバーとして同定されており（Ｓｏｆｉａら、２００１）、ＤｅｓＩおよびＤｅｓＩＩ酵素は、共に働いてリジン２，３−アミノムターゼの働きと同様に１，２−アミノ転移を触媒して（スキーム２、図２０を参照のこと）、Ｃ−４脱酸素を達成する。（ＤｅｓＩＩは、１０から直接３−Ｈ・を引き抜くことによって単独で作用しラジカル中間体を生成することも可能であり、このラジカルは、ＯＨの脱プロトン化の後、ケチル等価体に変換される。４−アミノ基のβ脱離の後、Ｈが戻り、互変異性がまた８を与え得る）。
【０１６２】
本研究が、デソスアミンの生合成のための新規経路を示す証拠を備えることは疑いもない。これらの結果はまた、Ｃ−４脱酸素のための新規機構を推論し得る。Ｃ−３脱酸素の機構を有するこの新規機構の比較は、明らかに、天然において、生合成で珍しい糖中のケトヘキソース前駆体からα−ＯＨの除去を行うための多様性を発展させ、同化させるストラテジーを有することを示す。共に、デオキシヘキソースの生合成に関して行われる研究は、生物学的脱酸素の一般的な経路へと、新しい機構的洞察を吹き込む。これらの発見は、生物学的なＣ−Ｏ結合開裂事象の進化的な多様性に対するすぐれた証拠である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９）。
【０１６３】
【数３】

本明細書で引用される全ての特許、特許書類および明細書の完全な開示は、個々に援用されているかのように、参考として本明細書中で援用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明快にするためのみに与えられている。ここから、不必要な限定はないと理解されるべきである。本発明は、示され記載される正確な詳細に対して限定されない。というのは、当業者に明らかな改変は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、デソサミン生合成経路およびデソサミン生合成ポリペプチドの各々に付随する酵素活性の模式図である。
【図２】
図２は、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）の不活性（ジグリコシル化）形態の、活性形態のメチマイシンおよびピクロマイシンへの変換の模式図である。
【図３】
図３は、デソサミン生合成経路の模式図である。
【図４】
図４は、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのｄｅｓＶＩ変異体における式７および式８の化合物の合成経路を示す。
【図５】
図５は、メチマイシンおよびピクロマイシンならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ＡＴＣＣ １５４３９における関連化合物の構造および生合成を示す。メチマイシン：Ｒ_１＝ＯＨ、Ｒ_２＝Ｈ、ネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＯＨ；ピクロマイシン：Ｒ_３＝ＯＨ、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）：Ｒ_３＝Ｈ。ポリケチドシンターゼ成分ＰｉｋＡＩ、ＰｉｋＡＩＩ、ＰｉｋＡＩＩＩ、ＰｉｋＡＩＶおよびＰｉｋＡＶは、塗りつぶした棒線によって示される。各丸は、Ｐｉｋ ＰＫＳ系の酵素ドメインを示す。ＫＳ：β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、ＡＴ：アシルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ：アシルキャリアタンパク質、ＫＲ：β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ、ＤＨ：β−ヒドロキシル−チオエステルデヒドラーゼ、ＥＲ：エノイルレダクターゼ、ＫＳ^Ｑ：ＫＳ様ドメイン、バツ印付のＫＲ：非機能的ＫＲ、ＴＥ：チオエステラーゼドメイン、およびＴＥＩＩ：ＩＩ型チオエステラーゼ。Ｄｅｓは、デソサミン生合成および転移のための８個全ての酵素を示し、ＰｉｋＣは、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３位でのヒドロキシル化を担うチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである（Ｘｉｅら、１９９８）。
【図６】
図６は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｐｉｋクラスターの編成を示す。各矢印は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示す。ヌクレオチド配列から推定される転写の方向およびＯＲＦの相対的な大きさが示される。このクラスターは、４つの遺伝子座：ｐｉｋＡ、ｐｉｋＢ（ｄｅｓ）、ｐｉｋＣおよびｐｉｋＲから構成される。コスミドクローンは、重複する線として示される。
【図７】
図７は、ＰｉｋＣ Ｐ４５０ヒドロキシラーゼによる、ＹＣ−１７およびナルボマイシンの変換を示す。
【図８】
図８は、デソサミン遺伝子クラスターのヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図９】
図９は、例示的および好ましいアミノ酸置換を示す。
【図１０】
図１０は、デソサミン生合成経路を示す。
【図１１】
図１１は、メチマイシン／ネオメチマイシンアナログ１８および１９を生じる経路の模式図を示す。
【図１２】
図１２は、Ｄ−キノボースを有するマクロライドを示す。
【図１３】
図１３は、ｄｅｓＩ変異体によって産生される産物を示す。
【図１４】
図１４は、ＣａｌＨを発現するｄｅｓＩ変異体において産生されるマクロライドを示す。
【図１５】
図１５は、ＣａｌＨの天然の基質およびＣａｌＨの産物、ならびにカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）の構造を示す。
【図１６】
図１６は、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭを発現するｄｅｓＩ変異体において産生されるマクロライドを示す。
【図１７】
図１７は、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭの天然の基質ならびにＳｔｒＬおよびＳｔｒＭの産物を示す。
【図１８】
図１８は、アピオースシンターゼの基質および産物を示す。
【図１９】
図１９は、ｄｅｓ変異体におけるデソサミンの生合成および中間体の模式図を示す。
【図２０】
図２０は、デソサミン生合成のための代替のスキームを示す。[0001]
(Statement of Government Rights)
This invention was made with US Government grants (Grants GM48562, GM35906, GM54346 and GM58196 from the National Institutes of Health). The government may have certain rights in the invention.
[0002]
(Background of the Invention)
Nature continues to be the creator from which most drugs are derived, giving rise to the synthetic challenges posed by numerous complex secondary metabolites, and with the advent of the field of combinatorial biosynthesis, the abundance of modified non-natural skeletons A new source (Katz et al., 1993; Hutchinson et al., 1995; Carreras et al., 1997; Jacobsen et al., 1997; Cane et al., 1998; Marsden et al., 1997; McDaniel et al., 1999). However, many naturally occurring bioactive secondary metabolites (eg, polyketides) carry unusual carbohydrate ligands that function as molecular recognition elements important for biological activity (Omura, 1984; Weymouth-Wilson, 1997). Without these essential sugar linkages, the biological activity of most clinically important secondary metabolites is either completely abolished or dramatically reduced. Glucosyltransferases, which are responsible for the final glycosylation of certain secondary metabolites, exhibit a high degree of randomness to nucleotide sugar donors (Zhao et al., 1998a; Zhao et al., 1998b; Borisova et al., 1999; Weber et al., 1991; Decker) Sasaki et al., 1996; Solenberg et al., 1997; Madduri et al., 1998; Salah-Bey et al., 1998; Gaisser et al., 1998; Wohlert et al., 1998). These findings have opened the door to the possibility of manipulating the corresponding biosynthetic pathway to alter the important glycosylation patterns of the backbone of natural or unnatural secondary metabolites in a combinatorial manner. To date, the genetic manipulation of carbohydrate additives for any given metabolite has generally been limited to altering and / or knocking out a small subset of genes whose carbohydrate moieties need to be assembled and joined. (Madduri et al., 1998; Hutchinson et al., 1998; Wohlert et al., 1998).
[0003]
Therefore, what is needed is a way to significantly modify or alter the sugar additive for a particular metabolite.
[0004]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to the structural diversity of sugars for specific metabolites through the recruitment and synergism of sugar genes from various saccharide biosynthetic pathways that result in metabolites containing unnatural sugars (eg, novel glycosylated polyketides). Provide a way to make changes. This alteration can be achieved in vivo via genetic engineering. For example, the methods of the present invention provide modified recombinant bacterial host cells that have been genetically engineered to produce novel polyketides having unnatural sugar structures. To prepare the modified recombinant host cells of the invention, a saccharide biosynthesis gene from a heterologous (eg, non-native or different) saccharide biosynthesis pathway, or an in vitro modified and native (wild-type) enzyme is used. A gene encoding an enzyme having a different activity or specificity is introduced into a recombinant host cell that produces a substrate for the enzyme encoded by the gene, and a new product (ie, a product that is not produced by the corresponding recombinant host cell). ) To produce a modified recombinant host cell. Preferably, the product from the modified recombinant host cell is a sugar on the naturally occurring product from the corresponding wild-type cell (eg, an altered sugar that is not a stereoisomer of the sugar on the naturally occurring product). (Sugars on the product). Also preferably, the recombinant host cell and the modified recombinant host cell are genetically modified such that at least one gene for saccharide biosynthesis (eg, in a saccharide biosynthesis gene cluster) in the cell is, for example, Is disrupted through insertions or deletions, resulting in the accumulation of intermediates in the biosynthetic pathway that are destroyed. The disruption can be in a nucleic acid sequence present in the genome of the cell, or in a nucleic acid sequence present in an extrachromosomal element in the cell. Thus, the present invention is useful for generating libraries of polyketides and other sugar-containing molecules, which are biologically active or can be activated. For example, if the product is an acetylated sugar, deacetylase can be used to make the product biologically active. In addition, the bioavailability of such libraries can greatly reduce the time of drug discovery.
[0005]
As described below, Micromonospora echinospora spp. The 4-ketohexose aminotransferase gene (calH) from the calicheamicin pathway of C. calichensis was introduced into a mutant strain of Streptomyces venezuelae that lacks 4-dehydrase (desI) in the methimicin / picromycin pathway. Deletion of the desI gene results in the accumulation of the 4-keto-6-deoxyglucose intermediate, a substrate for CalH. As a result, heterologous expression of calH in this mutant results in two generations of two methymycin / picromycin-calicheamicin hybrids. These results clearly demonstrate the ability to manipulate the glycosylation of secondary metabolites through rational selection of gene combinations, as well as enhancing the indiscriminate nature of the corresponding glycosyltransferase (DesVII). Furthermore, the results confirm that the calH gene encodes TDP-6-deoxy-D-glycero-L-threo-4-hexulose-4-aminotransferase of the calicheamicin pathway.
[0006]
As also described herein, when various L-sugars are incorporated into metabolites, such as macrolides, a significant expansion of the structural diversity of the sugar can be achieved. Heterologous expression of genes selected from the L-dihydrostreptose pathway (eg, the strM and strL genes of Streptomyces griseus encoding 6-deoxy-4-hexulose 3,5-epimerase and dihydrostreptose synthase, respectively) . venezuelae mutants. Operated S.M. Growth of the venezuelae strain resulted in the accumulation of a series of methymycin / picromycin analogs, each carrying L-rhamnose. The formation of these new derivatives confirmed the loose substrate specificity of the desosamine glucosyltransferase DesVII and the feasibility of preparing new metabolites by reconstructing the hybrid pathway. Furthermore, these results provided evidence of a cooperative function of StrM and StrL, and established close similarities between the dihydrostreptose and apiose biosynthetic pathways.
[0007]
Accordingly, the present invention provides a modified recombinant bacterial host cell comprising at least one nucleic acid segment encoding at least one saccharide biosynthetic enzyme. Preferably, the nucleic acid segments of the invention do not encode any other non-sugar biosynthetic sequences, such as glucosyltransferase or polyketide synthase sequences. The modified recombinant host cell may contain one or more nucleic acid segments, each nucleic acid segment encoding a different enzyme, or one nucleic acid segment encoding one or more enzymes. The modified recombinant host cell also preferably contains a disrupted nucleic acid sequence, which encodes at least one saccharide biosynthetic enzyme from a pathway different from the pathway of the enzyme encoded by the nucleic acid segment. Corresponds to the nucleic acid sequence in the type host cell. For example, a non-disrupted wild-type nucleic acid sequence can encode a dehydrase, a reductase, a TDP-sugar synthase, a TDP-sugar dehydratase, an aminotransferase, an N-methyltransferase, and / or a tautomerase. The disruption results in the accumulation of a substrate for the enzyme encoded by the nucleic acid segment, thus producing a new sugar. The modified recombinant host cell also preferably transfers the new sugar to a new sugar-linked product (eg, a polyketide such as an aglycone) to produce a new product such as a macrolide. To produce native (endogenous) glucosyltransferase). Alternatively, a nucleic acid molecule encoding a glucosyltransferase with a relaxed substrate specificity can also be introduced into a recombinant host cell to provide an enzyme that binds a new sugar to another molecule in the modified recombinant host cell. Can be introduced.
[0008]
Preferred cells for use in the present invention include any cell that produces a metabolite, such as a polyketide, an anticancer agent or an antibiotic that can be modified to have or accommodate a sugar. Antibiotic-producing cells include, but are not limited to, Actinoplanes, Actinomadura, Bacillus, Cephalosporium, Micromonospora, Penicillium, Nocardia, and Streptomyces, which produce or express antibiotics. Either include genes that produce antibiotics or other biologically active compounds (eg, genes sno, str, tyl, car, srm, tet, act, gra, tcm, mit / mmc, any including elm, sal, rif, grs, srf, bac, dau, sty, dnr, sna, fren, avr, ole, urd, ery, or any combination thereof Cells). Examples of actinomycetes that naturally produce polyketides include:
[0009]
(Equation 1)

But not limited thereto. Other examples of polyketide-producing microorganisms that naturally produce polyketides include various Actinomadura, Dactylosporangium and Nocardia strains. Preferred Streptomyces spp. as,
[0010]
(Equation 2)

But not limited thereto.
[0011]
Furthermore, these same cells are a preferred source of the nucleic acid segments of the present invention. Thus, any cell that encodes a glycosynthesis gene is a source of a nucleic acid segment of the present invention. For example, sources of nucleic acid segments include streptomycin, carbomycin, tylosin, spiramycin, streptolysin, erythromycin, vancomycin, teicoplanin, chloroelemycin, methymycin, picromycin, uramycin. A compound having a sugar, including but not limited to granaticin, oleandomycin, landomycin, tetracenomycin, doxorubicin, mitramycin, epirubicin, and daunorubicin, or Other sugars such as calicheamicin or nystatin It is a cell that produces a chromatic compound. These are included within the nucleic acid segments for use in practicing the present invention.
[0012]
In one embodiment of the invention, the nucleic acid sequence encoding at least one of the enzymes in desosamine biosynthesis has been disrupted to alter desosamine biosynthesis, and the non-destructive form of the nucleic acid sequence encodes A recombinant host cell that has been enriched with a nucleic acid segment that encodes a homolog of the enzyme in question results in a modified recombinant host cell. In one embodiment, the modified recombinant host cell has no disruption in desI and is not composed of calH nucleic acid segments. A “homolog” of a reference saccharide biosynthetic enzyme is an enzyme that can recognize a substrate for the reference biosynthetic enzyme and catalyze the reaction. For example, TylB is a DesI homolog, CalH is a DesI homolog, StrL and StrM are both DesI homologs, and TylM2 is a DesVI homolog. Preferred homologs catalyze a reaction that produces a product (eg, an intermediate in sugar biosynthesis) that differs from the product of the reference enzyme. Homologs can be identified functionally using the methods as described herein. Generally, homologs have at least about 28% amino acid sequence identity to a reference enzyme.
[0013]
Other methods for identifying nucleic acid segments for use in the present invention are by hybridization or, for example, by computer-assisted sequence alignment using default settings. In one embodiment of the invention, the nucleic acid sequence of the invention is attached to a nucleic acid segment of the invention under low stringency, moderately stringent, or stringent hybridization conditions. Hybridize. Low stringency, moderately stringent, or stringent hybridization conditions are well known to those of skill in the art, and include, for example, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). See Sections 9.47-9.51 of Cold Spring Harbor, NY (1989) For example, stringent conditions include (1) using low ionic strength and high temperatures for washing (eg, 50 C., 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate (SSC); 0.1% sodium lauryl sulfate (SDS)), or (2) hybridization Use a denaturing agent such as formamide during the application (eg, at 42 ° C. with 0.1% bovine serum albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate). 50% formamide with 50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5) Exemplary low stringency conditions are 37-35% formamide, 1 M NaCl, 1% SDS (sodium dodecyl sulfate) buffer. Includes hybridization in solution and washing in 1 × -2 × SSC (20 × SSC = 3.0 M NaCl / 0.3 M trisodium citrate) at 50-55 ° C. Exemplary Medium String Genomic conditions are as follows: 37 ° C., hybrids in 40-45% formamide, 1.0 M NaCl, 1% SDS. Including high-stringency conditions at 37 ° C., 50% formamide, 1 M NaCl, 1% SDS at 37 ° C. Hybridization and washing in 0.1 × SSC at 60-65 ° C.
[0014]
Methods for preparing the modified recombinant host cells of the invention and methods for using them (eg, methods for preparing biologically active products or products that can be modified into biologically active products) ) Is also provided.
[0015]
The invention also provides an isolated and purified nucleic acid segment comprising a nucleic acid sequence comprising a sugar (desosamine) biosynthetic gene cluster, a biologically active variant or fragment thereof; Here, this nucleic acid sequence is not derived from the eryC gene cluster of Saccharopolyspora erythraea. An isolated nucleic acid segment comprising this gene cluster preferably comprises SEQ ID NO: 3 (see PCT / US99 / 14398, incorporated herein by reference) or a fragment or variant thereof. Nucleic acid sequences. This cluster comprises nine polypeptides (DesI (eg, SEQ ID NO: 8 encoded by SEQ ID NO: 7), DesII (eg, SEQ ID NO: 10 encoded by SEQ ID NO: 9), DesIII (eg, SEQ ID NO: 11). Encoded by SEQ ID NO: 12), DesIV (eg, SEQ ID NO: 14 encoded by SEQ ID NO: 13), DesV (eg, SEQ ID NO: 16 encoded by SEQ ID NO: 15), DesVI (eg, encoded by SEQ ID NO: 17) SEQ ID NO: 18), DesVII (eg, SEQ ID NO: 20 encoded by SEQ ID NO: 19), DesVIII (eg, SEQ ID NO: 22 encoded by SEQ ID NO: 21), and DesR (eg, encoded by SEQ ID NO: 23) Including SEQ ID NO: 24) Rukoto was found (see Figure 1). It is also preferred that the nucleic acid segment of the present invention encoding DesR is not derived from the eryB gene cluster of Saccharopolyspora erythraea or the oleD gene of Streptomyces antibioticus. Preferably, the nucleic acid segment comprising the desosamine biosynthetic gene cluster hybridizes to SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof under moderate to high, preferably stringent, hybridization conditions.
[0016]
The present invention also has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or fragments thereof. Variant polypeptides having at least about 80%, more preferably at least about 90%, and even more preferably at least 95% but less than 100%, contiguous amino acid sequence identity to the polypeptide are provided. Preferred variant polypeptides or subunits or fragments of the polypeptides of the present invention include SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: A variant polypeptide or subunit polypeptide having at least about 1%, more preferably at least about 10%, and even more preferably at least about 50% of the activity of a polypeptide having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 24 Is mentioned. Thus, for example, the glycosyltransferase activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 20 may be comparable to a variant of SEQ ID NO: 20 having at least one amino acid substitution, insertion or deletion relative to SEQ ID NO: 20.
[0017]
The variant nucleic acid sequence of the present invention comprises SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or Has at least about 80%, more preferably at least about 90%, and even more preferably at least about 95%, but less than 100%, contiguous nucleic acid sequence identity to a nucleic acid sequence comprising
[0018]
Expression cassette comprising a nucleic acid sequence comprising a desosamine biosynthesis gene cluster, a biologically active variant or fragment thereof operably linked to a promoter functional in a host cell, and a host comprising an expression cassette of the invention Cells are also provided. Thus, the expression cassettes of the present invention have reduced substrate specificity for individual genes within the cluster (eg, the desR gene encoding glycosidases, or polyketides and desoxy sugars (ie, the glycosyltransferase is TDP-desosamine). It is useful for expressing glycosyltransferases (desVII genes that encode glycosyltransferases that process other sugar substrates). Thus, the desVII gene can be used in a combinatorial biological approach to synthesize libraries of macrolide compounds with various polyketide and desoxy sugar substrates. In addition, expression of glycosidases in a host cell that expresses a macrolide antibiotic may be useful in methods for reducing (eg, inactivating) the toxicity of the antibiotic. For example, a host cell that produces an antibiotic is transformed with an expression cassette that encodes a glycosyltransferase. The recombinant glycosyltransferase is expressed in an amount that reversibly inactivates the antibiotic. To inactivate the antibiotic, the antibiotic is preferably an isolated antibiotic recovered from the host cell and contacted with a suitable native or recombinant glycosidase.
[0019]
Preferably, the nucleic acid segment encoding desosamine in the expression cassette of the invention is not derived from the eryC gene cluster of Saccharopolyspora erythraea. Preferred host cells are prokaryotic cells, but eukaryotic cells are also envisioned. These host cells are useful for expressing desosamine, an analog or derivative thereof, as well as individual polypeptides that can then be isolated from the host cell. Also provided is an expression cassette or host cell comprising an antisense sequence derived from at least a portion of a desosamine biosynthetic gene cluster.
[0020]
Another embodiment of the invention is a recombinant host cell (e.g., a bacterial cell), wherein the host cell has altered desosamine synthesis, preferably resulting in a reduced or absent desosamine synthesis, and / or Or, has at least a portion of the desosamine-encoding nucleic acid sequence of the host chromosome been disrupted (eg, deleted or blocked (eg, by insertion)) by a heterologous sequence to result in the synthesis of an analog or derivative of desosamine. Or a variant nucleic acid sequence of the invention. Preferably, the nucleic acid sequence to be disrupted is not derived from eryC of Saccharopolyspora erythraea. Thus, a recombinant host cell of the invention has at least one disrupted gene (ie, desI, desII, desIII, desIV, desV, desVI, desVII, desVIII or desR). One embodiment of the invention comprises a recombinant host cell in which the desVI gene, which encodes an N-methyltransferase, has been disrupted, for example, by replacement with an antibiotic resistance gene. I have. Preferably, such host cells produce an aglycone having an N-acetylated aminodesoxy sugar, 10-deoxy-methylonide, a compound of formula (7), a compound of formula (8) or a combination thereof. I do. Thus, deletion or disruption of the desVI gene may be useful in methods for preparing new sugars.
[0021]
Another preferred embodiment of the present invention is a recombinant bacterial host cell in which the desR gene, which encodes a glycosidase such as β-glycosidase, has been disrupted. Preferably, the host cell synthesizes a C-2′β-glycosylated macrolide antibiotic (eg, a compound of Formula (13), a compound of Formula (14), or a combination thereof). Accordingly, the present invention further provides a compound of formula (8), (9), (13) or (14). It will be apparent to one skilled in the art that each atom of the compounds of the present invention having an asymmetric center may exist in and be isolated in optically active and racemic forms. Some compounds may exhibit polymorphism. The present invention includes any racemic, optically active, polymorphic or stereoisomeric form of the compounds of the present invention or mixtures thereof, which have the useful properties described herein. And methods for preparing optically active forms (eg, by resolution of the racemic form by recrystallization techniques, by synthesis from optically active starting materials, by chiral synthesis, or by chromatographic separation using chiral stationary phases), and It will be appreciated that methods for determining activity are well known using the standard tests described herein or using other similar tests well known in the art.
[0022]
Also provided are methods for directing the biosynthesis of particular glycosylation-modified polyketides by genetic manipulation of the polyketide-producing microorganism. This method involves introducing a DNA sequence encoding an enzyme for saccharide biosynthesis (eg, desosamine biosynthesis) into a polyketide-producing microorganism (eg, SEQ ID NO: 3, a variant or fragment thereof), and Obtaining the microorganism that produces the glycosylated modified polyketide, or alternatively, the antisense DNA sequence of the invention can be used, and then isolating the glycosylated modified polyketide from the microorganism. It is preferred that the DNA sequence is modified so as to cause inactivation of at least one enzymatic activity upon addition of the sugar.
[0023]
Compounds (products) and modified recombinant host cells produced by the recombinant host cells of the present invention can be particularly useful as biologically active agents, eg, disease in mammals (eg, humans). Useful for adjusting medicaments for treatment of a physical condition or condition. Thus, the product may include a drug (eg, a chemotherapeutic agent, an immunosuppressive agent, an agent for treating asthma, chronic obstructive pulmonary disease as well as other diseases including respiratory inflammation, a cholesterol-lowering agent, or various organisms). (Eg, macrolide-based antibiotics that are active against multidrug-resistant pneumococci and other respiratory pathogens and bacteria, including viruses and parasite pathogens); or crop protection agents (eg, fungicides or insecticides) Agent). For example, requiring such treatment (eg, a patient having a bacterial, viral or parasitic infection, cancer, respiratory disease) or requiring immunosuppression (eg, during cell, tissue or organ transplantation). 2) Methods of using these compounds to treat mammals, birds or fish are also envisioned.
[0024]
(Detailed description of the invention)
(Definition)
As used herein, a "type I polyketide synthase" is a single polypeptide having a single set of active sites used repeatedly. This is in contrast to type II polyketide synthase, which uses active sites on a series of polypeptides.
[0025]
As used herein, a "module" is one of a series of repeating units in a multifunctional protein (eg, type I polyketide synthase or fatty acid synthase).
[0026]
As used herein, an "immature end product" is a product produced by a recombinant multifunctional protein that is different from the product produced by a non-recombinant multifunctional protein. Generally, products produced by recombinant multifunctional proteins have few acyl groups.
[0027]
As used herein, a “recombinant” nucleic acid or protein (polypeptide) molecule is a molecule in which a nucleic acid molecule encoding a protein has been modified in vitro, such that the sequence is not naturally occurring. Or a molecule that does not correspond to a naturally occurring sequence that is not located as it is located in the unmodified genome.
[0028]
A “recombinant” host cell of the present invention has been genetically engineered to alter (eg, reduce or destroy or increase) the function or activity of at least one gene of the sugar biosynthetic pathway. This operation may involve at least one gene or result in an extrachromosomal genetic element in the genome of the cell. In contrast, "wild-type" or "non-recombinant" cells are not genetically engineered. Genetic engineering in the recombinant cell preferably results in the absence of the product (compound) produced by the corresponding wild-type cell or the production of a product not produced by the corresponding wild-type cell.
[0029]
An "altered" recombinant host cell of the invention is an expression cassette, preferably comprising a promoter, which is introduced into the recombinant cell and is adapted to express at least one isolated nucleic acid segment. (Recombinant host cells). Genetic engineering in the modified recombinant host cell preferably results in the production of a product (compound) that is not produced by the corresponding recombinant host cell or by the corresponding wild-type cell.
[0030]
As used herein, DNA “derived from” a gene or gene cluster is DNA isolated and purified in vitro from genomic DNA, or prepared synthetically based on the sequence of genomic DNA. DNA.
[0031]
As used herein, the "pik" or "pik / met" gene cluster is defined as polyketide synthase (pikA), desosamine biosynthesis enzyme (also called pikB, des), cytochrome P450 (pikC), regulation. Includes sequences encoding factor (pikD) and enzyme for cell self-resistance (poiR).
[0032]
As used herein, the term "isolated and / or purified" refers to its natural cellular environment and from its association with other components of the cell (eg, nucleic acids or polypeptides). Refers to the isolation of DNA or polypeptide molecules in vitro, so that it can be sequenced, replicated and / or expressed. For example, an "isolated DNA molecule or fragment thereof encoding an enzyme for desosamine biosynthesis" encodes a biologically active polypeptide, fragment or variant thereof, and contains at least one of desosamine biosynthesis. It is complementary to the non-coding strand of the RNA encoding the enzyme, or complementary to the coding strand, or low, as defined by methods well known to those of skill in the art (eg, Sambrook et al., 1989). Under moderate or preferably stringent conditions, hybridizes to RNA or DNA containing the desosamine biosynthetic gene cluster and maintains stable binding, more than 7, preferably more than 15, and more preferably more than 20 RNA or DNA containing the above consecutive nucleotide bases.
[0033]
An "antibiotic", as used herein, is a substance produced by a microorganism that is either natural or has limited chemical modification, and is another microorganism or microorganism. Inhibits or kills the growth of eukaryotic cells.
[0034]
An “antibiotic biosynthesis gene” is a nucleic acid (eg, DNA, segment or sequence) that encodes an enzymatic activity required for an enzymatic reaction in a process that converts a primary metabolite to an antibiotic.
[0035]
The "antibiotic biosynthetic pathway" comprises the complete set of antibiotic biosynthetic genes required for the process of converting primary metabolites to antibiotics. These genes can be isolated by methods well known in the art (see, for example, US Pat. No. 4,935,340).
[0036]
Antibiotic-producing organisms include any organisms, including, but not limited to: Actinoplanes, Actinomadura, Bacillus, Cephalosporium, Micromonospora, Penicillium, Nocardia, and Strepto, all of which are also known as Streptomyces. , Which produce antibiotics or produce antibiotics when expressed).
[0037]
A gene that confers antibiotic resistance is a DNA segment that encodes an enzyme or other activity that confers resistance to an antibiotic.
[0038]
The term "polyketide" as used herein refers to a large, diverse class of natural products, including antibiotic, fungicidal, anti-cancer and anti-parasitic compounds. However, it is not limited to these. Polyketides include macrolides, anthracyclines, angucyclins, avermectins, milbemycins, tetracyclines, polyenes, polyethers, ansamycins and isochromaneones, such as isamycinine. However, the present invention is not limited to these. Polyketide antibiotics include, but are not limited to, anthracyclines and different types of macrolides (polyenes and conventional macrolides such as abamycin and erythromycin). Macrolides are described, for example, in S.A. erytheus, S.E. antibioticus, S .; venezuelae, S.M. fradiae and S.M. Produced by narbonensis.
[0039]
The term "glycosylation" refers to a molecule that contains one or more sugar residues with respect to another molecule.
[0040]
The term "sugar" or "saccharide" refers to a polyhydroxylated aldehyde or ketone. The polyhydroxylated aldehyde or ketone can be linked to a lipid, peptide and / or protein, if desired. Sugars can have additional substituents (eg, amino, sulfur, or phosphorus groups) in addition to the carbon-hydrogen-oxygen nucleus. Polymers composed of 2 to 10 sugar units are called oligosaccharides (OS) (eg, monosaccharides, disaccharides (eg, sucrose) and trisaccharides) and are composed of 10 or more sugar units. Such polymers are called polysaccharides (PS). These monosaccharide building blocks can be linked in at least 10 different ways to produce different combinations and permutations of astronomical numbers. Sugars include, for example, triose, pentose and hexose, ribose, glucose, and deoxysugars (eg, fructose, rhamnose and deoxyribose, and 6-deoxysugar, 2,6-deoxysugar, 3,6-deoxysugar, , 6-deoxysugar, 2,3,6-deoxysugar (eg, olivose, oliose, mycarose, rhodinose, mycinose) and other modified sugars (eg, Mycaminose, aminosacs, including desosamine, vancosamine, and daunosamine) Further suitable sugars are, for example, D. Voet, Bioch. Mistry, Wiley: New York, 1990; L. Stryer, Biochemistry, (Third Edition), WH Freeman and Co .: New York, 1975; J. March, Advanced Organic Chemistry, Chemistry, Chemical Management 2nd edition), McGraw Hill: New York, 1977; F. Carey and R. Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Part B: Reactions and Synthesis, (2nd edition), Plenum: New York, and 77; References). Sugar derivatives can be conveniently prepared as described in International Patent Application Publication Nos. WO 96/34005 and WO 97/03995.
[0041]
The term "glycosylation modification" when referring to a particular molecule refers to a molecule that has an altered glycosylation pattern or composition relative to the unmodified or native state of the particular molecule.
[0042]
The term "polyketide-producing microorganism" as used herein includes any microorganism that can produce a polyketide, either naturally or after being appropriately manipulated (ie, genetically engineered). Examples of actinomycetes which produce naturally polyketides, Micromonospora rosaria, Micromonospora megalomicea, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces antibioticus, Streptomyces albereticuli, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces hydroscopicus, Streptomyces tsukulubaensis, Streptomyces mycarofasciens, Streptomyces p latenesis, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces thermotolerans, Streptomyces rimosus, Streptomyces peucetius, Streptomyces coelicolor, Streptomyces glaucescens, Streptomyces roseofulvus, Streptomyces cinnamonensis, although Streptomyces Curacoi and Amycolatopsis mediterranei include, but are not limited to. Other examples of polyketide-producing microorganisms that naturally produce polyketides include various Actinomadura, Dactylsporangium and Nocardia strains.
[0043]
The term "sugar biosynthesis gene" as used herein encodes a glycosynthesis enzyme, such as, for example, Micromonospora, Streptomyces venezuleae, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces griseus, Streptomyces grease, Streptomyces griseus, Streptomyces griseus, Streptomyces griseus, Streptomyces griseus And is intended to include saccharide biosynthetic DNA from other polyketide-producing microorganisms.
[0044]
The term "sugar biosynthetic enzyme" as used herein refers to a polypeptide involved in the biosynthesis and / or conjugation of polyketide-linked sugars and their derivatives and intermediates.
[0045]
The term "polyketide-linked sugar" refers to a sugar that is known to or can bind to a polyketide.
[0046]
The term “sugar derivative” refers to a sugar that naturally associates with a polyketide, but has been altered to its unmodified or native state, including N-3-α-desdimethyl D-desosamine, including Not limited.
[0047]
The term “sugar intermediate” refers to an intermediate compound produced in the sugar biosynthetic pathway.
[0048]
As used herein, the term "derivative" refers to a particular derivative produced by a host cell of the invention or prepared in vitro using a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule of the invention. A compound (product) is meant and modified so that it can be modified to include other moieties (eg, peptide or polypeptide molecules (eg, antibodies or fragments thereof), nucleic acid molecules, sugars, lipids, fats, detectable signal molecules (eg, For example, radioisotopes (eg, gamma emitters), small chemicals, metals, salts, synthetic polymers (eg, polylactide and polyglycolide), surfactants and glycosaminoglycans, which may be covalent or non-covalent Is linked or linked to this compound).
[0049]
One skilled in the art will recognize that each atom of the compounds of the present invention having an asymmetric center may exist in and be isolated in optically active and racemic forms. Some compounds may exhibit polymorphism. The present invention includes any racemic, optically active, polymorphic or stereoisomeric form of the compounds of the present invention or mixtures thereof, which have the useful properties described herein. And methods for preparing optically active forms (eg, by resolution of the racemic form by recrystallization techniques, by synthesis from optically active starting materials, by chiral synthesis, or by chromatographic separation using chiral stationary phases), and It will be appreciated that methods for determining activity are well known using the standard tests described herein or using other similar tests well known in the art.
[0050]
The terms "sequence homology" or "sequence identity" refer to the percentage of base matches between two nucleic acid sequences or the percentage of amino acid matches between two amino acid sequences. When sequence homology is expressed as a percentage (eg, 50%), this percentage indicates the percentage of matches over the entire length of the sequence, compared to some other sequence. Gaps (in either of the two sequences) are allowed to maximize matching; gap lengths of 15 bases or less are commonly used, preferably 6 bases or less, and more preferably 2 bases or less. When oligonucleotides are used as probes, the sequence homology between the target nucleic acid and the oligonucleotide sequence is generally less than 17 target base matches (85%) of the 20 possible oligonucleotide base pair matches. Preferably 9 or fewer matches (90%) of the 10 possible base pair matches, and more preferably 19 or less (95%) of the 20 possible base pair matches.
[0051]
Two amino acid sequences are homologous if there is partial or complete identity between the sequences and / or if they have the same or similar activity. For example, 85% homology means that 85% of the amino acids are identical when the two sequences are aligned for maximum correspondence. Gaps (in either of the two sequences to be matched) are allowed in maximizing matching; gap lengths of 5 or less are preferred, and 2 or less are more preferred. Alternatively, and preferably, two protein sequences (or polypeptide sequences derived therefrom, of at least 30 amino acids in length), as the term is used herein, are used to describe a mutation data matrix and six or more amino acid sequences. Homologous if they have an alignment score of greater than 5 (in standard deviation units) using the program ALIGN with a gap penalty (Dayhoff, 1972). The two sequences, or portions thereof, are more preferably homologous, as used herein, if their amino acids are more than 29% identical.
[0052]
The following terms are used to describe the sequence relationship between two or more polynucleotides or polypeptides: "reference sequence", "comparison window", "sequence identity", "sequence identity". Percent of sex "and" substantial identity ". A "reference sequence" is a defined sequence used as a basis for sequence comparison; the reference sequence may be a subset of a longer sequence, such as a segment of a full-length cDNA or gene sequence given in the sequence listing, or may be a complete sequence. It can include cDNA or gene sequences. Generally, a reference sequence is at least 20 nucleotides in length, frequently at least 25 nucleotides in length, and often at least 50 nucleotides in length. The two polynucleotides may each include (1) a sequence that is similar between the two polynucleotides (ie, a portion of the complete polynucleotide sequence), and (2) identify a sequence that differs from the two polynucleotides from one another. As may further include, a sequence comparison between two (or more) polynucleotides typically involves comparing the sequences of the two polynucleotides over a “comparison window” to identify and compare local regions of sequence similarity It is done by doing.
[0053]
As used herein, a "comparison window" is a conceptual segment of at least 20 contiguous nucleotides, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison window represents the optimal alignment of the two sequences. As such, it refers to a segment that may contain up to 20% additions or deletions (ie, gaps) as compared to a reference sequence, which contains no additions or deletions. Optimal alignment of sequences to align the comparison windows was performed by the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981), by the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970), and by the similarity search of Pearson and Lipman (1988). Depending on the method, the computerized implementation of these algorithms (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis., GAP, BESTFIT, or FAST, ASTTF, or FAST, by ASTAFIT, AAST, or FAST). And by various methods Made the best alignment (i.e., resulting in the maximum percent homology over the comparison window) is selected. Preferably, homologs are identified using default settings and using a computerized algorithm.
[0054]
The term “sequence identity” means that two polynucleotide sequences are identical over a comparison window (ie, on a nucleotide-by-nucleotide basis). The term “percent sequence identity” means that two polynucleotide sequences are identical over a comparison window (ie, on a nucleotide-by-nucleotide basis). The term "percent sequence identity" compares two optimally aligned sequences over a comparison window, resulting in the same nucleobase (eg, A, T, C, G, U or I) in both sequences. Determine the number of positions to obtain the number of matched positions, divide the number of matched positions by the total number of positions in the comparison window (ie, the window size), and multiply the result by 100 to obtain sequence identity. Calculated by taking the percentage of sex.
[0055]
As applied to polypeptides, the terms “substantial identity” or “homology” are used to describe the optimality of two peptide sequences (eg, by the program GAP or BESTFIT using default gap weights). When aligned, they share at least about 29 percent sequence identity, preferably at least about 35 percent sequence identity, and / or have the same or similar activity, ie, recognize one or more common substrates. , Thereby producing a product.
[0056]
In accordance with the present invention, there is provided a modified recombinant host cell derived from the recombinant host cell, the genome of which has been modified and, if necessary, the sugar biosynthesis occurring in the corresponding wild-type cell has been disrupted. Is done. The modified recombinant host cell has at least one saccharide biosynthetic enzyme that is a homolog of an enzyme encoded by a wild-type cell that is absent or present in reduced amounts in the recombinant host cell as a result of the disruption. Augmented with the encoding nucleic acid segment. Thus, the modified recombinant host cell comprises at least one expression cassette, which comprises at least one isolated and purified nucleic acid segment, wherein the segment is encoded by a wild-type cell. Encodes a glycosynthetic enzyme that recognizes a substrate for the enzyme and that is not expressed or expressed in reduced amounts in recombinant cells. The enzyme encoded by the nucleic acid segment produces a substrate for another glycosynthetic enzyme or glycosyltransferase.
[0057]
The invention described herein provides a diverse range of novel, including glycosylated polyketides, through genetic redesign of saccharide biosynthetic DNA (eg, those found in Streptomyces spp. As well as other polyketide producing organisms). It can be used for the production of compounds, such as antibiotics. This gene allows for the selective production of specific compounds, including the production of new compounds. For example, modification of compounds based on combinatorial biosynthesis can selectively activate or disrupt specific genes within the sugar gene cluster and other sugar biosynthesis into biosynthetic libraries that are assayed for a wide range of biological activities. This can be achieved by expressing the gene to induce greater scientific diversity. As a further example, a biosynthetic gene may be introduced into a particular host cell, resulting in the production of a novel compound due to the activity of this biosynthetic gene on other metabolites, intermediates or components of that host cell. To bring.
[0058]
The nucleic acid sequence and segment used in the present invention include a gene encoding a saccharide biosynthetic enzyme (for example, a saccharide biosynthetic enzyme shown herein) and / or an enzyme having the same or similar activity. Genes include nucleic acid sequences and segments that hybridize under low, moderate, or stringent hybridization conditions. The nucleic acid molecules, segments or sequences of the present invention may also correspond to any of the DNA segments or sequences described herein under conditions that are complementary, complementary, or low, moderate or stringent. Can be an RNA molecule, segment or sequence that hybridizes with Thus, the present invention provides nucleic acid sequences and segments encoding homologues of particular glucosynthases, including polypeptides having at least one amino acid substitution relative to a wild-type polypeptide (FIG. 9; Alberts et al., 1989). (Eg, a homolog is at least 29% identical to a wild-type polypeptide as long as the homolog is capable of recognizing a substrate for the wild-type enzyme and catalyzing a reaction with the substrate. May be included). The homolog may be a naturally occurring enzyme or may be a recombinantly prepared enzyme.
[0059]
Thus, mutations can be made to a segment or sequence of a native (wild-type) nucleic acid of the invention to produce a segment or sequence of a variant nucleic acid, and such variants Can be used in place of the native segment or sequence, so long as it encodes an enzyme that functions in concert with the molecule of E.g. Such mutations can be made by conventional techniques (eg, by preparing a synthetic oligonucleotide containing the mutation and inserting the mutated sequence into the gene using restriction endonuclease digestion (eg, Kunkel, 1985; Geisselsoda et al., 1987)). Alternatively, the mutation can be made using a mismatched primer (generally 10-20 nucleotides in length), which is a segment of the native nucleotide at a temperature below the melting temperature of the mismatched duplex. Alternatively, hybridize to the sequence. The primer can be embodied by maintaining primer length and base composition, within relatively stringent restrictions, and by maintaining centrally located mutant bases (Zoller and Smith, 1993). . Primer extension can be performed using a DNA polymerase, the product of which is cloned and clones containing the mutated DNA (induced by segregation of the extended strand of the primer) selected. Selection can be accomplished using the mutant primer as a hybridization probe. This technique is also applicable for generating multiple point mutations. See, for example, Dalbie-McFarland et al. (1982). PCR mutagenesis also finds use in making desired mutations.
[0060]
Random mutagenesis of a nucleotide sequence can be achieved by several different techniques known in the art, such as: changing the sequence within a restriction endonuclease site, randomly inserting an oligonucleotide linker into a plasmid. Performing X-ray or UV light irradiation, incorporating the wrong nucleotides during DNA synthesis in vitro, error-prone PCR mutagenesis, preparing synthetic mutants, or Use to damage plasmid DNA. Chemical mutations include, for example, sodium bisulfite, nitrite, hydroxylamine, agents that damage or remove bases, thereby preventing normal base pairing (eg, hydrazine or formic acid), nucleotides Precursor analogs (eg, nitrosoguanidine, 5-bromouracil, 2-aminopurine), or acridine intercalating agents (eg, proflavine, acriflavine, quinacrine, etc.). Generally, plasmid DNA or DNA fragments are treated with chemicals and used to transform E. coli. coli and grown as a pool or library of mutant plasmids.
[0061]
Large populations of random enzyme variants can be constructed in vitro using "recombination-enhanced mutagenesis". This method can be used, for example, for each of the nucleotide sequences encoding the wild-type. ⁶ A pool of two or more mutants, which are created using any mutagenesis technique and then inserted into a cloning vector, is used.
[0062]
These gene sequences can be inserted into one or more expression vectors using methods known to those skilled in the art. An expression vector can include control sequences operably linked to the desired gene. Suitable expression systems for use with the present invention include systems that function in eukaryotic and prokaryotic host cells. Prokaryotic systems are preferred, and in particular, Streptomyces spp. Systems that are compatible with are of particular interest. The control elements for use in such systems include a promoter, optionally including an operator sequence, and a ribosome binding site. Particularly useful promoters include regulatory sequences derived from the gene clusters of the present invention. However, other bacterial promoters, such as those derived from sugar metabolizing enzymes such as galactose, lactose (lac) and maltose, also find use in expression cassettes encoding desosamine. A preferred promoter is the Streptomyces promoter, and the Streptomyces promoter is ermE ^* Promoter, pikA promoter, and tipA promoter, but are not limited thereto. Further examples include promoter sequences derived from biosynthetic enzymes, such as tryptophan (trp), β-lactamase (bla) promoter system, bacteriophage λPL, and bacteriophage T5. In addition, synthetic promoters, such as the tac promoter (US Pat. No. 4,551,433, which is not naturally occurring), also function in bacterial host cells.
[0063]
Other regulatory sequences that allow for regulation of the expression of the gene for growth of the host cell may also be suitable. Regulatory sequences are known to those of skill in the art, and include, for example, turn-on or turn-off of gene expression in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. off). Other types of regulatory elements (eg, enhancer sequences) can also be present in the vector.
[0064]
A selectable marker can also be included in the recombinant expression vector. A variety of markers that are useful in selecting transformed cell lines are known, and generally, when a cell is grown in a suitable selection medium, expression of the gene is relative to the transformed cell. Includes genes that confer a selectable phenotype.
[0065]
The various sequences or segments of interest can be cloned as separate cassettes, with separate control elements, or, for example, under the control of a signal promoter, into one or more recombinant vectors. These sequences or segments may contain flanking restriction sites allowing easy deletion and insertion of other sequences or segments. The design of such unique restriction sites is known to those of skill in the art and can be achieved using the techniques described above (site-directed mutagenesis and PCR).
[0066]
For sequences generated by random mutagenesis, the choice of vector will depend on the pool of mutant sequences used (ie, donor or recipient). In addition, the choice of vector will dictate the host cell used in subsequent steps of the method of the present application. Any transducible cloning vector can be used as a cloning vector for the mutant donor pool. However, it is preferred that a phagemid, cosmid, or similar cloning vector be used to clone the donor pool of nucleotide sequences encoding the variant into the host cell. Phagemids and cosmids are excellent vectors due to, for example, the ability to insert larger fragments into them and to grow stably, than in each of the M13 and λ phage. Phagemids that find use in this method generally include a hybrid between a plasmid and a linear phage cloning vehicle. Cosmids that find use in this method generally include λ phage-based vectors into which a cos site has been inserted. The recipient pool cloning vector can be any suitable plasmid. The cloning vector into which the pool of variants is inserted can be the same or can be constructed to have and express different genetic markers (see, eg, Sambrook et al., Supra). The utility of using such vectors with different genetic markers is exploited to facilitate successful transduction decisions.
[0067]
Thus, for example, the cloning vector used is E. coli. coli / Streptomyces shuttle vectors (e.g., U.S. Pat. Nos. 4,416,994, 4,343,906, 4,477,571, 4,362,816, and 4,362). 340,674), cosmids, plasmids, artificial bacterial chromosomes (see, for example, Zhang and Wing, 1997; Schalkwyk et al., 1995; and Monaco and Lavin, 1994), or phagemids, and The host cell is E. coli. coli, Penicillium patulum, and Streptomyces spp. Bacterial cells, such as (eg, S. lividans, S. venezuleae, or S. lavendulae), or eukaryotic cells, such as fungi, yeast, or plant cells (eg, monocot and dicot plants). And preferred cells are renewable.
[0068]
In addition, recombinant polypeptides having a particular activity can be prepared via "gene shuffling." For example, Crameri et al., 1998; Patten et al., 1997, U.S. Pat. Nos. 5,837,458, 5,834,252, 5,830,727, 5,811,238, and See 5,605,793.
[0069]
For phagemids, upon infection of a host cell containing the phagemid, single-stranded phagemid DNA is produced, packaged, and released from the cells in the form of transducing phage in a manner similar to other phage vectors. Thus, clonal amplification of a nucleotide sequence encoding a variant, as performed by phagemid, is accomplished by growing the phagemid in a suitable host cell.
[0070]
After clonal amplification, the donor pool of cloned mutants is infected with helper phage to generate phage particles containing either the helper phage genome or a phagemid mutant allele of the nucleotide sequence encoding this wild type. To obtain a mixture of
[0071]
Infection or transfection of a host cell with a helper phage is generally accomplished by methods well known in the art (see, eg, Sambrook et al., Supra; and Russell et al., 1986).
[0072]
The helper phage can be any phage that can be used in combination with a cloning phage to produce an infectious transducing phage. For example, if the cloning vector is a cosmid, the helper phage will necessarily be a λ phage. Preferably, the cloning vector is a phagemid and the helper phage is a filamentous phage, preferably phage M13.
[0073]
If desired, after infecting the phagemid with helper phage to obtain a mixture of phage particles, the transduced phage can be transformed based on size differences (Barnes et al., 1983) or otherwise similarly effective. Can be separated from helper phage based on various techniques.
[0074]
The entire spectrum of the cloned donor mutant is now transduced into the clonally expanded recipient cells, which have been transduced or transformed with a pool of nucleotide sequences encoding the mutant. Can be done. Recipient cells that can be used in the methods disclosed herein and in the present methods include, for example, E. coli. coli, or other bacterial expression systems that are not recombinant deficient. Recombination deficient cells are cells with a greatly reduced recombination event (eg, rec. ⁻ Mutant) (see Clark et al., 1965).
[0075]
These transductants can now be selected for desired protein properties or characteristics and amplified if needed or desired. If necessary, as described above, if the phagemid into which each of the pools of mutants is cloned is constructed and expresses a different genetic marker, the transformants will have both donor and recipient plasmid markers. Can be selected by the expression of
[0076]
Recombinants produced by the above methods can then be subjected to selection or screening by any suitable method, for example, for enzymatic activity or other biological activity.
[0077]
The above cycle of amplification, infection, transduction, and recombination can be repeated any number of times with additional pools of donors cloned against the phagemid. As described above, the phagemid into which each of the pools of mutants is cloned can be constructed to express different marker genes. Each cycle is 10 ⁶ , The number of distinct variants can be increased. Thus, if the probability of occurrence of a recombination event between alleles in any separate cell is f (a parameter that is in fact a function of the distance between the recombining mutants) ⁶ Transduced cultures from two pools of the allele variants were ¹² / F in a population of cells ¹² Express up to individual mutants.
[0078]
The present invention is further described by the following non-limiting examples.
[0079]
(Example)
(Deletion of desR gene in desosamine biosynthesis gene cluster)
Since some macrolides have more than one attached sugar moiety, assigning a saccharide biosynthesis gene to an appropriate saccharide biosynthesis pathway can be very difficult. Methymycin (compound of formula (1)) and neomethymycin (compound of formula (2)) (FIG. 1) (Donin et al., 1953; Djerassi et al., 1956) (produced by Streptomyces venezuelae, Since the two closely related macrolide antibiotics) contain desosamine as their only saccharide component, the organization of the saccharide biosynthesis genes in the methimycin / neomethymycin gene cluster will be less complex. Therefore, this system was selected for the study of the biosynthesis of desosamine (N, N-dimethylamino-3,4,6-trideoxyhexose, which is also present in the erythromycin structure (Flinn et al., 1954)). did.
[0080]
To study the formation of this unique sugar, a DNA library was developed by S.D. venezuelae (ATCC 15439) was constructed using Sau3A I by partially digesting a 35-40 kb fragment, which was ligated into the cosmid vector pNJ1 (Tuan et al., 1990). The recombinant DNA was obtained from E. coli. E. coli DH5α was packaged into bacteriophage λ used to transfect. The resulting cosmid library was screened for the desired clone from the tyrosine biosynthesis cluster using the tylA1 and tylA2 genes as probes (Baltz et al., 1988; Merson-Davies et al., 1994). These two probes are specific for the sugar biosynthesis gene. The products of these genes continue to catalyze the first two steps without exception, followed by all the unique 6-deoxyhexoses studied so far. The first reaction involved the conversion of glucose-1-phosphate to TDP-D-glucose by α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (TylA1), followed by TDP-D-glucose It is converted to TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose by -D-glucose 4,6-dehydratase (TylA2). The three cosmids were found to contain genes homologous to tylA1 and tylA2. Further analysis of these cosmids led to the identification of nine open reading frames (ORFs) downstream of the PKS gene (FIG. 1). Based on sequence similarity to other saccharide biosynthesis genes, particularly those from the erythromycin cluster (Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997), eight of these nine ORFs contained TDP-D- It is thought to be involved in the biosynthesis of desosamine. Interestingly, the ery cluster lacks the homologs of the tylA1 and tyA2 genes, which are responsive to the first two steps in the desosamine pathway. It is possible that the erythromycin biosynthesis mechanism may depend on the general cell pool of TDP-D-4-keto-6-deoxy-D-glucose for mycarose and desosamine formation. The biosynthetic pathway for TDP-D-desosamine is depicted in FIG.
[0081]
Eight of the nine ORFs were assigned desosamine formation (the presence of desR) (these ORFs had strong sequence homology to β-glucosidase (39% identity and 46% similarity). (Castle et al., 1998)), but the gene cluster in desosamine is esoteric. To study the function of DesR on the biosynthesis of methymycin / neomymycin, a disruption plasmid (pBL1005) from pKC1139 (including the apramycin resistance marker) (Bierman et al., 1992) was constructed. did. In this plasmid, the 1.0 kb NcoI / XhoI fragment of the desR gene was deleted and replaced via a blunt-end ligation with the thiostrepton resistance gene (tsr) (1.1 kb) (Bibbb et al., 1985). Using this plasmid, E. coli E. coli S17-1 was transformed; E. coli S17-1 acts as a donor strain and, through conjugative transmission, wild-type S. The pBL1005 construct is introduced into venezuelae (Bierman et al., 1992). Double cross mutants in which the chromosomal desR has been replaced with the disrupted gene were selected according to their thiostrepton resistance and apramycin-sensitive properties. Gene replacement was confirmed using Southern blot hybridization analysis.
[0082]
The desired mutant was first grown in seed medium at 29 ° C. for 48 hours, then inoculated and grown for another 48 hours in vegetable medium (Cane et al., 1993). After the fermentation broth was centrifuged at 10,000 g to remove cell debris and mycelium, the supernatant was adjusted to pH 9.5 with concentrated KOH and extracted with an equal volume of chloroform (4 times). The organic layer was dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The amber oil-like product was first subjected to flash chromatography on silica gel using a gradient of 0-40% methanol in chloroform, and then 45% acetonitrile in 57 mM ammonium acetate, pH 6.7. Eluted with equal composition by using ₁₈ The column was subjected to HPLC. In addition to methimycin (compound of formula (1)) and neomethimicin (compound of formula (2)), two new products were isolated. The yield of the compound of formula (13) and the compound of formula (14) are each in the range of 5-10 mg / L of fermentation broth. However, the compound of formula (1) and the compound of formula (2) remained the main products. High resolution FAB-MS showed that both compounds had the same molecular composition. This molecular composition differs from metimicin / neomethymycin by extra hexose. The chemical properties of these two new compounds are elucidated by extensive spectral analysis to be C-2'β-glucosylated methymycin and neomethymycin (compounds of formula (13) and (14), respectively). Was done.
[0083]
The spectral data of (13) is as follows:
[0084]
Embedded image

The spectral data of (14) is as follows:
[0085]
Embedded image

The magnitude of the added anomeric hydrogen (1 ″ -H) coupling constant of glucose (d, J = 8.0 Hz) and the downfield shift of C′2 of desosamine (11.8 ppm) are all this Consistent with the specified C2′-β-configuration (Seo et al., 1978).
[0086]
The antibiotic activity of the compounds of formulas (13) and (14) against Streptococcus pyogenes was determined by separately applying 20 μL of each sample (1.6 mM in MeOH) to a sterile filter paper disc, and the disc was subjected to Mueller- S. cerevisiae cultured on Hinton agar plates (Mangahas, 1996). Pyogenes was placed on the surface. After overnight incubation at 37 ° C., plates of this control (compounds of formula (1) and formula (2)) showed clearly visible zones of inhibition. In contrast, such clearing was recognizable around the disc of the compounds of formulas (13) and (14). Apparently, β-glycosylation at C-2 ′ of desosamine in methymycin / neomymycin renders these antibiotics inactive.
[0087]
It should be noted that similar phenomena involving the inactivation of macrolide antibiotics by glycosylation are known (Celmer et al., 1985; Kuo et al., 1989; Sasaki et al., 1996). For example, if erythromycin is given to Streptomyces lividans, it is found that Streptomyces lividans contains a macrolide glycosyltransferase (MgtA), and that the bacterium can protect itself by glycosylation of these drugs. (Cundlife, 1992; Jenkins et al., 1991). Such macrolide glycosyltransferase activity was detected in 15 actinomycetes out of a total of 32 actinomycetes producing various polyketide antibiotics (Sasaki et al., 1996). Interestingly, macrolide glycosyltransferase (OleD), which can inactivate oleandmycin by glycosylation (Hernandez et al., 1993), and the ability to remove added glucose from inactivated oleandmycin That extracellular β-glycosidase coexists in Streptomyces antibiotics (Vilches et al., 1992). Glycosylation as a possible self-resistance mechanism in antibiotics is speculated. Although the glycosyltransferase genes described above have been cloned in some cases (eg, S. lividans mgtA and S. antibioticus oleD), the location of the macrolide β-glycosidase gene remains ambiguous. Interestingly, the recently published eryBI sequence, which is part of the erythromycin biosynthesis cluster (s), is highly homologous (55% identical) to desR (Gaisser et al., 1997).
[0088]
Therefore, the discovery of the desR, macrolide β-glycosidase gene in the desosamine gene cluster (group of genes) is important, and the inactivation of the inactivated compounds of formulas (13) and (14) after desR disruption. Accumulation may be due to a similar self-defense mechanism by glycosylation / deglycosylation. It provides direct molecular evidence that it also works properly in venezuelae. However, glycosylation of desosamine was significantly reduced by S. aureus, since significant amounts of metimicin and neomethimicin were also present in the fermentation broth of this mutant. It cannot be the major self-resistance mechanism in venezuelae. In fact, the rRNA methyltransferase gene found upstream of the PKS gene in this gene cluster may confer major self-resistance protection. Thus, these results are consistent with the fact that antibiotic producing organisms generally have more protective options (Cundliffe, 1989). By this observation, methymycin / neometimycin can be partially produced as an inactive diglycoside (compounds of formulas (13) and (14)) and the macrolide-β-glycosidase encoded by the desR is It may be thought to be responsible for converting methimycin / neomimemycin from their dormant state to the active state. In support of this concept, the translated desR gene has a leader sequence that is characteristic of secreted proteins (von Heijne, 1986; von Heijne, 1989). Thus, DesR can be transported across the cell membrane and hydrolyze these modified antibiotics extracellularly to activate it (FIG. 2).
[0089]
(wrap up)
Inspired by the complex assembly (complex assembly) of aminodeoxy sugars, which are often found as an essential component of macrolide antibiotics, and enzymology, the streptomyces venezuelae, a methimicin and neomethimicin producing strain The entire desosamine biosynthesis gene cluster from the clone was cloned, sequenced and mapped. Eight of the nine mapped genes were assigned to TDP-D-desosamine biosynthesis based on sequence similarity to genes from the erythromycin cluster. This remaining gene (denoted as desR) shows strong sequence homology to β-glycosidase.
[0090]
To examine the function of the encoded protein (DseR), a disruption mutant was constructed in which the NcoI / XhoI fragment of the desR gene was deleted and the thiostrepton resistance (tsr) gene was deleted. Replaced. In addition to methymycin and neomethymycin, two new products were isolated from the mutant fermentations. These two new compounds were found to be biologically inactive, C-2'β glycosylated, methimicin and neomethimicin. Because the translated desR gene has a leader sequence that is characteristic of secreted proteins, the desR protein can remove added glucose from the modified antibiotic and activate them. It may be extracellular β-glycosidase. Thus, the presence of desR in this desosamine gene cluster and the accumulation of inactivated glycosylated methimycin / neometimycin upon disruption of desR results in a mechanism of self-resistance through glycosylation by S. aureus. Provides strong molecular evidence that can work properly in Venezuelae.
[0091]
Thus, this desR gene can be used as a probe to identify homologs in other antibiotic biosynthetic pathways. Deletion of the corresponding macrolide glycosidase gene in other antibiotic biosynthetic pathways results in the accumulation of glycosylated products, which can be used as prodrugs with reduced cytotoxicity. Glycosylation also holds promise as a tool for controlling and / or minimizing the potential toxicity associated with novel macrolide antibiotics produced by genetically engineered microorganisms. Furthermore, the efficacy of macrolide glycosidases has been demonstrated by combinatorial biosynthetic approaches (Hopwood et al., 1990; Katz et al., 1993; Hutchinson et al., 1995; Carreras et al., 1997; Kramer et al., 1996; Khosla et al., 1996; Jacobsen et al., 1997). Marsden et al., 1998) are useful in the development of new antibiotics, and these macrolide glycosidases can be used for the activation of newly formed antibiotics, which antibiotics are deliberately used. Inactivated by the engineered glycosyltransferase.
[0092]
(Example 2)
(Deletion of desVI gene in the gene of desosamine biosynthesis gene cluster)
The emergence of a pathogenic bacterium that is resistant to many commonly used antibiotics poses a serious threat to human health, and this emergence has led to a resurgence in current research on new antibacterial agents. It has been the driving force (Box et al., 1997; Davies, 1996; Service, 1995). Since the first report on producing "hybrid" polyketides using genetic engineering techniques (Hopwood et al., 1995), the genes that govern the biosynthesis of secondary metabolites have been engineered to manipulate new biologically The potential to generate active compounds, especially macrolide antibiotics, has received much attention (Kramer et al., 1996; Khosla et al., 1996). This class of clinically important drugs consists of two essential structural components: polyketide glycans and added deoxy sugars (Omura, 1984). This aglycone is an acylthioester catalyzed by polyketide synthase (PKS), a highly organized multienzyme complex (Hopwood et al., 1990; Katz, 1993; Hutchinson et al., 1995; Carreras et al., 1997). It is synthesized by a series of condensation. Recent advances in understanding polyketide biosynthesis have allowed the recombination of PKS genes and the construction of remarkable arrays of new scaffolds (Kramer et al., 1996; Khosla et al., 1996; Hopwood et al., 1990; Katz, Hutchinson et al., 1995; Carreras et al., 1997; Epp et al., 1989; Donadio et al., 1993; Arisawa et al., 1994; Jacobsen et al., 1997; Marsden et al., 1998). However, in the absence of sugar components, these new compounds are usually biologically potent. Therefore, when planning to produce new macrolide antibiotics by a combinatorial biosynthesis approach, two immediate challenges must be overcome: assembly of a novel repertoire of sugar structures. And then have the ability to bind these sugars to structurally diversified macrolide aglycones.
[0093]
Unfortunately, the finding of unique sugar formation in these antibiotics remains limited (Liu et al., 1994; Kirschning et al., 1997; Johnson et al., 1998). Part of the reason for this comes from the fact that this sugar gene is generally dispersed at both ends of the PKS gene. Such an organization in the macrolide biosynthetic gene cluster also makes it difficult to distinguish sugar genes from genes encoding regulatory proteins or these aglycone modifying enzymes that are distributed in the same region. This problem can be even more troublesome if these macrolides contain multiple sugar components. In view of this "dispersed" nature of the glycosylation gene, the antibiotic metimycin (compound of formula (1) in FIG. 1) and its co-existing metabolite, neomethimimycin (Formula (2) in FIG. ) Provide themselves as an attractive system for studying deoxysugar formation (Donin et al., 1953; Djerassi et al., 1956). First, they retain D-desosamine (a compound of formula (3)), the primary aminodeoxy sugar that is also present in erythromycin. Second, since desosamine is the only sugar linked to the macrolactones of formulas (1) and (2), the identification of a saccharide biosynthesis gene within this methymycin / neomethymycin gene cluster is: Possible with higher certainty.
[0094]
A 10 kb stretch of DNA downstream of this methymycin / neometimycin gene cluster, which is about 60 kb long, was found to carry the entire desosamine biosynthesis gene cluster (FIG. 3). Of the nine open reading frames (ORFs) mapped into this segment, eight may be involved in desosamine formation, while the other (desR) encodes macrolide β-glycosidase This macrolide β-glycosidase may be involved in the self-resistance mechanism. These identities (shown in FIG. 3) were assigned based on sequence similarity to other glycosynthetic genes (Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997). This proposed pathway is well found in the literature and mechanistic insights into the construction of aminodeoxy sugars (Liu et al., 1994; Kirschning et al., 1997; Johnson et al., 1998).
[0095]
In order to determine whether a new methymycin / neomymycin analog carrying an altered sugar could be produced by altering the desosamine biosynthesis gene, the desVI gene (which encodes N-methyltransferase) Was suspected to be the target (Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997). This putative desVI product is most closely related (70% identity) to the eryCVI product from the erythromycin-producing strain Saccharopolyspora erythraea, and this product is also the rhodomycin of Streptomyces purpurascens (rhodomycin, et al., 95). The putative product of rdmD of Streptomyces ambofaciens, srmX from the spiromycin cluster (Geistlich et al., 1992), and the tyrM1 from the tyrosine cluster of Streptomyces fradiae, which is similar to TylM1 et al. All of these enzymes contain a consensus sequence LLDV (I) ACGTG (SEQ ID NO: 25) near the N-terminus (Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997), which has an S-adenosylmethionine binding site ( Ingrosso et al., 1989; Haydock et al., 1991).
[0096]
The deletion of desVI has little polar effect on the expression of other desosamine biosynthesis genes (Lin et al., 1984), which indicates that the ORF (desR) immediately downstream of desVI forms desosamine formation. Genes that are not directly involved and are further downstream are transcribed in the opposite direction. Second, N, N-dimethylation is almost certainly the last step in the desosamine biosynthetic pathway (Liu et al., 1994; Kirschning et al., 1997; Johnson et al., 1998; Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997). By perturbing this step, accumulation of a compound of formula (4) can occur, which in turn binds glycosyltransferase (DesVII) to a successful binding to the macrolactone of formula (6). It shows the best potential among all other intermediates recognized (FIG. 2). Deletion and / or disruption of a single biosynthetic gene frequently affects pathways in more than one specific step. Indeed, the disruption of eryCVI, desVI, which is equivalent in the erythromycin cluster, which is predicted to encode a similar N-methylase and produces desosamine in erythromycin (Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997). , Resulting in the accumulation of intermediates that lack the entire desosamine moiety (Summers et al., 1997).
[0097]
Plasmid pBL3001 (where desVI was replaced by the thiostrepton gene (tsr) (Bibb et al., 1985)) was constructed and E. coli was constructed. by conjugative transfer using E. coli S17-1 (Bierman et al., 1992). venezuelae. Thiostrepton resistance (Thio ^R ) And apamycin sensitivity (Apmin) ^s )), Two identical double crossed variants (KdesVI-21 and KdesVI-22) were obtained. Southern blot hybridization using tsr from the desVII region or a HincII fragment of 1.1 Kb confirmed that the desVI gene was indeed replaced by tsr on the chromosomes of these mutants. The KdesVI-21 mutant was first grown in seeding medium (100 ml) at 29 ° C. for 48 hours and inoculated and grown in growth medium (3 L) for an additional 48 hours (Cane et al., 1993). The fermentation broth was centrifuged to remove cell debris and mycelium, and the supernatant was adjusted to pH 9.5 using concentrated KOH and then extracted with chloroform. No methimycin or neomethimicin was found; instead, this 10-deoxy-methynolide (6) (350 mg) (Lamballot et al., 1992) and two new macrolides containing N-acetylated amino sugars, the formula The compound of (7) (20 mg) and the compound of formula (8) (15 mg) were isolated. These structures were determined by spectral analysis and high resolution MS.
[0098]
The spectral data of Equation 7 is:
[0099]
Embedded image

.
[0100]
The spectral data of Equation 8 is
[0101]
Embedded image

.
[0102]
The fact that compounds of formulas (7) and (8), bearing modified desosamine, are produced by the desVI deletion mutant is a thrilling finding. But this result is also somewhat surprising. This is because the sugar component in this product is expected to be aminodeoxyhexose (4). As shown in FIG. 4, the compounds of formulas (7) and (8) have the anticipated formulas (9) and (10) due to non-specific acetylation following the synthesis of the added aminodeoxy sugar, respectively. May be derived from a given compound. It is also possible that N-acetylation of (4) occurs first, followed by coupling of the resulting sugar (11) to 10-deoxymethinolide (6). Nevertheless, the lack of N-methylation of the sugar moiety in these novel products provides compelling evidence to maintain the assignment of desVI as an N-methyltransferase gene. Most significantly, the production of the compounds of formulas (7) and (8) by the desVI deletion mutant allows the glycosyltransferase (DesVII) in the methymycin / neomethymycin pathway to bind to sugars other than TDP-desosamine (5). The fact that the substrate can be recognized and processed can be demonstrated.
[0103]
The compounds of both formulas (7) and (8) A novel compound synthesized in vivo by the Venezuelae mutant, the observed N-acetylation being a necessary step for self-protection (Cundlife, 1989). In view of these results, the potential toxicity associated with novel macrolide antibiotics produced by genetically engineered microorganisms can be minimized and (intentionally or unintentionally) inactivated The newly formed antibiotic that has been activated can be activated during production. Such an approach can be part of an overall strategy for developing new antibiotics using a combinatorial biosynthetic approach. Indeed, the purified compounds of formulas (7) and (8) are inactive against Streptococcus pyogenes grown on Mueller-Hinton agar plates (Mangahas, 1996), whereas the control (formula (1) and The compound of formula (2)) shows a clearly visible inhibition zone.
[0104]
Some glycosyltransferases involved in the biosynthesis of antibiotics have been shown to have relaxed specificity for modified macrolactones (Jacobsen et al., 1997; Marsden et al., 1998; Weber et al.). , 1991). However, similar relaxed properties for sugar substrates have been reported for daunorubicin glycosyltransferase, which recognizes a modified daunosamine and aglycone, ε-rhodomycinone. ) Can be catalyzed by its coupling (Madduri et al., 1998). Thus, at least some glycosyltransferases in the antibiotic biosynthesis pathway are genetically engineered to be biologically active due to the fact that methimycin / neomethymycin glycosyltransferase can also tolerate structural variants of its sugar substrate. It is shown that it may be useful to produce hybrid natural products.
[0105]
(wrap up)
Sugars added in macrolide antibiotics are essential for the biological activity of these clinically important drugs. Therefore, the development of novel antibiotics through a biological combinatorial approach requires detailed knowledge of the biosynthesis of these unique sugars, as well as new ones that manipulate this biosynthetic gene and incorporate it into the final macrolide structure Needs the ability to produce sugars. A targeted deletion of the desVI gene of Streptomyces venezuelae can be prepared to determine whether a novel methimicin / neomethymycin analog carrying an altered sugar is produced by a change in the desosamine biosynthesis gene. Where the analog is predicted by sequence comparison to encode N-methyltransferase. S. Growth of the deletion mutant of venezuelae resulted in the accumulation of an analog of methimycin / neomethymycin carrying N-acetylated aminodeoxy sugars. These isolations and characterization of these derivatives not only provided the first direct evidence to confirm the identity of desVI as an N-methyltransferase gene, but also provided a novel sugar by a gene deletion approach. The ability to prepare was demonstrated. Most importantly, these results also demonstrated that the glycosyltransferase of methymycin / neometimycin exhibits relaxed properties on its sugar substrate.
[0106]
(Example 3)
(Cloning and sequencing of the Met / Pik biosynthesis gene cluster)
(Materials and methods)
(Bacterial strain and culture medium) E. coli DH5α was used as a cloning host (host). E. FIG. coli LE392 is S. coli. venezuelae was a host for a cosmid library derived from genomic DNA. The LB medium was used for E. coli. used in E. coli growth. Streptomyces venezuelae ATCC 15439 was obtained from ATCC as lyophilized pellets. Medium for vegetative growth and antibiotic production was used as described (Lambalot et al., 1992). Briefly, SGGP broth is S. cerevisiae. Venezuelae mycelia. Sporulation agar (SPA) was purified from S. agar. venezuelae spores were used. Methymycin production was performed in either SCM or plant medium, and picromycin production was performed in Suzuki glucose-peptone medium.
[0107]
(Vector, DNA manipulation, and construction of cosmid library)
pUC119 was a conventional cloning vector and pNJl was a cosmid vector used for genomic DNA library construction. Plasmid vectors for gene disruption were either pGM160 (Muth et al., 1989) or pKCl139 (Bierman et al., 1992). Plasmid, cosmid, and genomic DNA preparation, restriction digestion, fragment isolation, and cloning were performed using standard procedures (Sambrook et al., 1989; Hopwood et al., 1985). This cosmid library was prepared according to the instructions of the Packagene λ-packaging system (Promega).
[0108]
(DNA sequencing and DNA analysis)
The pik cluster was sequenced using an exonuclease III (ExoIII) nested deletion series that combines PCR-based double-stranded DNA sequencing. ExoIII procedures and DNA sequencing reactions according to the Erasea-Base protocol (Stratagene) were performed using a Dye Primer Cycle Sequencing Ready Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). The nucleic acid sequence was read on an ABI PRISM 377 sequencer for both DNA strands. DNA and putative protein sequence analysis was performed using GeneWorks and the GCG sequence analysis package. All analyzes were performed using specific program default parameters.
[0109]
(Gene disruption)
A replication plasmid-mediated homologous recombination approach has been developed to Gene disruption in venezuelae was performed. A plasmid for insertional inactivation is constructed by cloning a kanamycin resistance marker into the target gene, and a plasmid for gene deletion / replacement is constructed by replacing the target gene in this plasmid with the kanamycin resistance gene or thiostreptotype. It is constructed by replacing the gene with a resistance gene. The disrupted plasmid was transformed into S. cerevisiae by either PEG-mediated protoplast transformation (Hopwood et al., 1985) or RK2-mediated conjugation (Bierman et al., 1992). venezuelae. Therefore, spores from individual transformants or transconjugants were clustered on non-selective plates to induce recombination. This cycle was repeated three times, increasing the opportunity for recombination. Double crossovers yielded targeted gene disruption mutants were selected and screened using appropriate recombination of antibiotics and finally confirmed by Southern hybridization.
[0110]
(Antibiotics extraction and analysis)
Methymycin, picromycin, and related compounds were extracted according to published procedures (Cane et al., 1993). Thin layer chromatography (TLC) was routinely used to detect methymycin, neomethymycin, nalbomycin and picromycin. Further purification was performed using flash chromatography and HPLC, and the purified compound was ¹ 1 H NMR spectroscopy, ^Thirteen Analyzed by C NMR spectroscopy and MS spectroscopy.
[0111]
(result)
(Cloning and identification of pik cluster)
Using heterologous hybridization, S. cerevisiae is used. In venezuelae, genes for the biosynthesis of methymycin, neomethymycin, nalbomycin and picromycin were identified. Initial Southern blot hybridization analysis using a type I PKS DNA probe revealed two multifunctional PKS clusters of uncharacterized function in the genome. Since these four antibiotics are all composed of the same desosamine residues, the tylAI α-D-glucose-1-phosphate thymidyltransferase DNA probe (for the biosynthesis of mycaminose / mycorose / mycinose in the tyrosine pathway) (Merson Davies et al., 1994) was used to map the corresponding biosynthetic gene cluster. This analysis demonstrated that the only PKS pathway involved a cluster of desosamine biosynthetic genes. Nine overlapping (overlapping) cosmid clones were isolated, where the clones had 80 chromosomes on the bacterial chromosome containing the entire gene cluster (pik) for biosynthesis of thymycin, neomethymycin, nalbomycin and picromycin. Through subsequent gene disruption that spanned kilobases (kb) (FIG. 5), this other PKS cluster (vep, lacking a linked desosamine biosynthetic gene) produced methymycin, neomethimicin, nalbomycin or picromycin. Did not play a role.
[0112]
(Nucleic acid sequence of pik cluster)
The nucleic acid sequence of the pik cluster was completely determined and was shown to contain 18 open reading frames (ORFs), where these open reading frames spanned approximately 60 kb. Four large ORFs encoding multifunctional PKSs (pikAI, pikAII, pikAIII, and pikAIV) are central to this cluster (FIG. 5). Analysis of the six modules containing these pik PKSs showed that they specified the production of the 14-membered aglycone precursor of nalvonolide, nalbomycin and picromycin (FIG. 5).
[0113]
Initial analysis revealed two important structural differences in PKS encoded by pikA. First, compared to eryA (Donadio et al., 1998) and oleA (Swan et al., 1994), two PKS clusters that produce the 14-membered macrolides erythromycin and oleadomycin similar to picromycin. The presence of the separate ORFs, pikAIII and pikAIV, is notable, as opposed to one bimodular protein, as in eryAIII and oleAIII, where these pikAIII and pikAIV are Pik modules 5 and Pik Code module 6 (as an individual module). Second, the presence of type II thioesterase, immediately downstream of the type I PKS cluster, is also unprecedented (FIG. 5). These two features suggest the fact that pikA can produce sufficient 12-membered macrolactone 10-deoxymethylide.
This domain organization of PikAI-AIII (module L-5) is consistent with the predicted biosynthesis of 10 deoxymethylide, except that there is no TE function at the C-terminus of Pik module 5 (PikAIII). The deletion of the TE domain in PikAIII can be compensated for by type II TE (encoded by pikAV), which is immediately downstream of pikAIV. Consistent with the assumption that two distinct polyketide ring systems are assembled from this pik PKS, two macrolide-lincosamide-streptogramin B-type resistance genes, pikR1 and pikR2, are found upstream of pik PKS. (FIG. 6), which is probably Provides cellular self-protection in Venezuelae.
[0114]
The locus for desosamine biosynthesis and glycosyl transfer is immediately downstream of pikA. Seven genes (desI, desII, desIII, desIV, desV, desVI and desVIII) are responsible for the biosynthesis of deoxysugars, and the eighth gene desVII is a replacement for desosamine (12-membered ring and 14-membered). (Ring) encodes a glycosyltransferase that clearly catalyzes the transfer to the polyketide aglycone. The presence of only one set of the desosamine gene indicates that DesVIII can receive both 10-deoxymethinolide and narvonolide as substrates (Jacobsen et al., 1997). At the des locus, the largest ORF (desR) encodes a β-glycosidase involved in the drug inactivation-activation cycle for bacterial self-protection.
[0115]
Immediately downstream of the des locus is a gene encoding the cytochrome C P450 hydroxylase PicC (pikC), similar to eryF (Andersen et al., 1992) and eryK (Stassi et al., 1993), and the putative regulatory protein PikD. This is the gene to be encoded (pikD) (FIG. 5). Interestingly, PikC is the only P450 hydroxylase identified in the entire pik cluster, which enzyme can accept both 12- and 14-membered macrolide substrates, and more significantly, YC -17 (12-membered ring intermediate) is active against both C-10 and C-12, suggesting that it produces methymycin and neomethycin (FIG. 7). PikD is a putative regulatory protein similar to ORHH in the rapamycin gene cluster (Schwecke et al., 1995).
[0116]
In the pik cluster, the integrated functionality encoded by 18 genes predicts the biosynthesis of methymycin, neomethymycin, nalbomycin and picromycin (Table 1). The flanking of the pik cluster locus is probably a gene for primary metabolism and a gene that may be involved in both primary and secondary metabolism. The S-adenosyl-methionine synthase gene is located downstream of pikD, which can help provide a methyl group in desosamine synthesis. A threonine dehydratase gene was identified upstream of pikR1 that could provide a precursor for polyketide biosynthesis. It is not clear which of these genes are ideal for antibiotic biosynthesis and which of them are not directly related to the pik cluster.
[0117]
(Table 1. Estimation function of ORF in pik cluster)
[0118]
[Table 1]

AT (A), an acyltransferase that incorporates an acetate extension unit; AT (P), an acyltransferase that binds a propionate extension unit. KR ⁰ , Inactive KR. Add question marks to enzymes whose function is uncertain.
[0119]
(Table 2. Summary of mutation analysis of pik cluster)
[0120]
[Table 2]

(Pik cluster mutation analysis)
Extensive disruption of genes in the pik cluster was performed to specify the role of key enzymes in antibiotic production (Table 2). First, the first putative enzyme (PikAI) involved in the biosynthesis of 10-deoxymethinolide and narvonolide was inactivated by insertional mutagenesis. The resulting mutant (AX903) produced neither methymycin or neomethimicin, nor narbomycin or picromycin, and pikA required for both 12- and 14-membered macrolactone formation. The PKS to be encoded.
[0121]
Second, the deletion of both desVI and desV disrupted the production of methymycin, neomethymycin, narvomycin and picromycin, and the resulting mutants (LZ3001 and LZ4001) were 10-deoxymethinolide And narvonolide accumulate in the culture broth. This indicates that the enzymes involved in the synthesis and transfer of desosamine are also shared by 12- and 14-membered macrolides.
[0122]
To understand the mechanism of polyketide chain termination at PikAIII (PIKAIII (module 5) is presumed to be the end point in the structure of 10-deoxymethinolide), the pikTEII gene, pikAV, was deleted to understand the mechanism of polyketide chain termination. did. The deletion / substitution mutant (AX905) is a wild-type Produces less than 5% of methimycin, neomethymycin, and less than 5% of picromycin as compared to venezuelae. This suppression in product formation occurs without significant accumulation of the expected aglycone intermediate, and that pik TEII is associated with termination of 12- and 14-membered macrolides at PikAIII and PikAIV, respectively. Suggests. Polar effects may affect the phenotype observed in AX905, which was ruled out after consideration of mutant LZ3001. Mutations in the enzyme downstream of pikAV in LZ3001 accumulated 10-deoxymethinolide and narvonolide. The fact that mutant AX905 was unable to accumulate these intermediates suggests that the polyketide chain was not effectively released from this PKS protein in the absence of Pik TEII. Therefore, Pik TEII plays a crucial role in the opening and cyclization of polyketide chains, and perhaps provides a mechanism for alternative termination in Pik polyketide biosynthesis.
[0123]
Finally, disruption of PikC confirmed that PikC is the only enzyme that modifies the hydroxylation of both YC-17 (at C-10 and C-12) and nalbomycin (at C-12). The relaxed substrate specificity of PikC and its region specificity at C-10 and C-12 provide another hierarchy of metabolite diversity in the biosynthetic system encoded by pik.
[0124]
(Discussion)
The studies described herein show that the biosynthesis of methymycin, neomethimicin, nalbomycin, and picromycin is based on S. aureus. venezuelae and was encoded by the pik cluster. The unique structure of the three major enzymes and clusters allows this relatively compact system to produce multiple macrolide antibiotics. Most importantly, the presence of pik modules 5 and 6 (PikAIII and PikAIV) as separate proteins and the activity of pik TEII allow bacteria to terminate polyketide chains at two different points of assembly, Therefore, two different ring sizes of macrolactone are produced. Second, glycosyltransferases in the pik cluster (DesVII) can receive both 12- and 14-membered macrolactones as substrates. Finally, PikC, a P450 hydroxylase, has a remarkable substrate and region chemical specificity that introduces another hierarchy of diversity into this system.
[0125]
Since each of these PKSs specifies the synthesis of 14-membered macrolactones, it is interesting to consider that pikA develops in a line similar to eryA and oleA. Therefore, if a mutation in the native pikAIII-pikAIV linker region results in the cleavage of Pik modules 5 and 6 into two separate gene products, pik may gain the ability to produce methymycin. This concept arises from two features of the nucleotide sequence. First, the intergenic region (105 bp) between pikAIII and pikAIV may be the remainder of a 35 amino acid intermodular linker peptide. In addition, the potential for independently regulated expression of pikAIV is 100 nucleotides at the 5 'end of a gene that is relatively AT rich (62% compared to the G + C content (74%) in the coding region). Implied by the presence of the area. Thus, as mutations occur in the original ORF encoding the bimodular multifunctional protein (PikAIII-PikAIV), the mechanism for regulated synthesis of the novel gene product (PikAIV) may also be revealed.
[0126]
The role of Pik TEII in the alternative termination of polyketide chain extension intermediates provides a unique aspect of diversity generation in natural product biosynthesis. Engineered polyketides of different chain lengths are typically generated by moving the TE catalytic domain to an alternative position in modular PKS (Cortes et al., 1995). Rearrangement of the TE domain necessarily disrupts the production of the original full-length polyketide, with only one macrolide being generated each time. In contrast to fixed-position TE domains, independent Pik TEII polypeptides have variability, probably to catalyze termination at different stages of polyketide assembly. Therefore, this system makes it possible to produce multiple products of altered chain length. Combinatorial biological techniques are currently being developed to construct new PKS systems using TEII for the simultaneous production of several new molecules, as opposed to TE domains alone, which are limited to catalyzing a single terminal step This system can be used to generate molecular diversity.
[0127]
It should be noted that sequences similar to Pik TEII are found in almost all known polyketide and non-ribosomal polypeptide biosynthetic systems (Marahiel et al., 1997). Currently, pik TEII was first characterized in modular PKS. However, recent studies on the TEII gene in the lipopeptide surfactin biosynthetic cluster have demonstrated that srf-TEII plays an important role in polypeptide chain opening (Schneider et al., 1998), and It can be suggested that srf-TEII reacts in multiple steps in peptide assembly as well (Marahiel et al., 1997).
[0128]
This enzyme, which is involved in the post-polyketide assembly of 10-deoxymethinolide and narvonolide, is particularly well known for glycosyltransferases (DesVII) and P450 hydroxylases (PikC). Both have significant ability to receive substrates with significant structural variability. In addition, disruption of des VI demonstrated that Des VII was also resistant to variations in deoxysugar structure. Similarly, PikC has recently been shown to convert YC-17 to methymycin / neometimycin and narbomycin to picromycin in vitro.
[0129]
Disruption of the ORF1 targeting gene disrupts the production of both picromycin and methymycin, indicating that a single cluster is responsible for the biosynthesis of both antibiotics. Deletion of the TE2 gene substantially reduces the production of methymycin and picromycin, and TE2 has the ability to open the polyketide chain at different points during the assembly process, as opposed to the position-fixed TE1 domain. Thus, it has been demonstrated to produce polyketides of different chain lengths.
[0130]
The above results indicate that one PKS cluster produces two macrolides, which differ in the number of atoms in the ring structure, and that modules 5 and 6 of the PKS (separated by the spacer region) are present in the ORF However, it was shown that PikAIII lacks TE, that type II thioesterase is present, that the TEI domain is not separated, and that the two resistance genes can be specific to either a 12- or 14-membered ring. It was unexpected that being identified is surprising.
[0131]
With 18 genes spanning less than 60 kb of DNA capable of producing four active macrolides, the pik cluster represents the smallest complex of the most versatile modular PKS system ever investigated. This simplicity provides the basis for a forced expression system, and new active ketoside products can be manipulated and generated with considerable ease for the discovery of a diverse range of new biologically active compounds.
[0132]
(wrap up)
Complex polyketide synthesis follows a progressive reaction mechanism, and each module within the PKS has a stretch of 3-6 enzyme domains. These enzymatic domains catalyze the reaction in an almost linear form order as described in particular detail for erythromycin-producing PKS (Katz, 1997; Khosla, 1997; Staunton et al. 1997). Combined sets of PKS modules and catalytic domains in addition to genes encoding enzymes for post-polyketide production (eg, glycosyltransferases, hydroxylases) typically produce a single polyketide product. Restrict biosynthetic systems.
[0133]
Combinatorial biology involves the engineering of a multi-step biosynthetic pathway to create the molecular diversity of natural products used in new drug discovery. Produces its unique genetic organization and polyketide metabolites, a large group of natural products with diverse structures and biological activities produced by bacteria (primarily actinomycetes and myxobacteria) and fungi Due to capabilities, PKSs represent one of the most susceptible systems for combinatorial technology. Complex polyketides are produced by a multifunctional PKS involving a mechanism similar to long-chain fatty acid synthesis in animals (Hopwood et al., 1990). Pioneering studies on erythromycin PKS in Saccharopolyspora erythraea have shown a modular organization (Cortes et al., 1990; Donadio et al., 1991). The characteristics of this multi-domain protein system include rapamycin (Aparicio et al., 1996), FK506 (Motamedi et al., 1997), sorafen A (Soraphen A) (Schupp et al., 1995), niddamycin (Kidadamycin) et al., 1997) and the molecular analysis of the PKSs of rifamycin (August et al., 1998), resulting in the alignment between the modular structure of the multifunctional bacterial PKS and the structure of its polyketide product. Proof of the relationship.
[0134]
In investigating microbial systems that can generate aberrant metabolite structural variability, Streptomyces venezuelae ATCC 15439 is notable for its ability to generate two distinct groups of macrolide antibiotics. Methymycin and neomethymycin are derived from the 12-membered macrolactone 10-deoxymethinolide, whereas narbomycin and picromycin are derived from the 14-membered macrolactone (narvonolide). Cloning and characterization of the biosynthetic gene cluster of these antibiotics indicates an important role for type II thioesterases in forming metabolic derivatives, whereby polyketides of different chain lengths are converted to picromycin multifunctional polyketides Produced by synthase (PKS). Immediately downstream of the PKS gene (pikA) is a set of genes for desosamine (des) biosynthesis and macrolide ring hydroxylation. Glycosyltransferases (encoded by desVIII) have a remarkable ability to catalyze the glycosylation of both 12- and 14-membered macrolactones. Further, p450 hydroxylase, encoded by pikC, provides another layer of structural variability by introducing domain chemical diversity into the macrolide ring system.
[0135]
(Example 4)
(The desV deletion mutant gives rise to D-quinobiose)
The S. cerevisiae with the disrupted desV gene A variant of Venezuelae (KdesV-41) was constructed (Zhao et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 12159 (1998)). Since desV encodes a 3-aminotransferase, which catalyzes the conversion of 3-keto sugar 17 (FIG. 11) to the corresponding amino sugar 4, deletion of this gene prevents C-3 transamination, 17 accumulate. If the glycosyltransferase of this pathway (DesVII) is capable of recognizing and processing ketosugar intermediate 17, the macrolide product generated by the KdesV-41 mutant will bind the bound 3-ketosugar. It was expected to have. Surprisingly, the two products isolated are the methimycin / neomethymycin analogs 18 and 19, each with 4,6-dideoxyhexose (FIG. 12). This result demonstrated the mild specificity of glycosyltransferase for its sugar substrate, but it was also able to stereospecifically reduce the C-3 keto group of sugar metabolites. 2 shows the presence of a pathway-independent reductase in Venezuelae.
[0136]
To explore the possibility of generating variants capable of synthesizing this class of new macrolides containing engineered sugars, it has been proposed to encode a dehydrase that is responsible for C-4 deoxygenation in desosamine biosynthesis. Revised the expectation that some desI genes would lead to the incorporation of D-quinobiose (22; FIG. 13) (also known as 6-deoxy-D-glucose) into the final product. The rationale is based on: (1) Desosamine biosynthesis “terminates” in the C-4 deoxygenation step due to the desI deletion, thus resulting in the accumulation of 3-keto-6-deoxyhexose 16 It should be (FIG. 11). (2) S.P. By taking the average of the presence of 3-ketohexose reductase in Venezuelae, it is expected that this sugar intermediate 15 will be stereospecifically reduced to D-quinobose (22). (3) Glycosyltransferase (DesVII), which has a loose specificity for sugar substrates, requires 22 couplings to macrolactones to obtain new macrolides 20 and 21 containing engineered sugar D-quinoboses. It should catalyze (FIG. 13).
[0137]
A disrupted plasmid (pDesI-K) derived from pKC1139 containing an apramycin resistance marker was constructed to replace desI by a neomycin resistance gene, which also conferred resistance to kanamycin. This construct was then transformed into wild-type S. aureus. Venezuelae was introduced by conjugative transfer using Escherichia coli S17-1 as a donor strain (Bierman et al., 1992). Some double crossover mutants were identified by their kanamycin resistance (Kan ^R ) And aparamycin sensitivity (Apr ^s ) Phenotype. One mutant (KdesI-80) was selected and grown for 48 hours at 29 ° C. in seeding medium (100 mL), then inoculated and grown for an additional 48 hours in growth medium (5 L) (Cane et al). , 1993). The fermentation broth was centrifuged to remove cell debris and mycelium, and the supernatant was adjusted to pH 9.5 with concentrated potassium hydroxide solution. The resulting solution was extracted with chloroform and the pooled organic extracts were dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The yellow oil was subjected to flash chromatography on silica gel using a gradient of 0-12% methanol in chloroform and the isolated product was purified by isocratic C _l8 Further purification by HPLC using column elution (using 50% acetonitrile in water). As expected, neither metimicin nor neomethimicin was detected; instead, 10-deoxymethinolide 23 was found as the major product (about 600 mg). Large amounts of methinolide 24 (about 40 mg) and neomethinolide 25 (about 2 mg) were also isolated (FIG. 13). A new macrolide 15 containing D-quinobose (3.2 mg) was produced by this mutant. This structure was fully determined by spectral analysis. Spectral data for 15 (J values are in Hertz):
[0138]
Embedded image

Significant is the fact that macrolide 15 containing D-quinoboses is actually produced by the desI mutant. First, the formation of quinoboses as expected was due to The presence of a pathway-independent reductase (reducing 3-keto sugars) in Venezuelae is further confirmed. Interestingly, this reductase can act on 4,6-deoxy sugar 17 and 6-deoxy sugar 16, suggesting that it ignores the presence of a hydroxyl group at C-4. However, at this point it is not clear whether this reduction occurs with the free sugar or after the free sugar has been added to the aglycone. Second, the retention of quinobiose 4-OH as a result of the desI deletion provides strong evidence supporting a role for DesI assigned to encode hydrolase at C-4. Furthermore, the results again indicate that the glycosyltransferase of this pathway (DesVII) can recognize alternative sugar substrates whose structures are quite different from the original amino sugar substrate desosamine. Although the incorporation of quinoboses is important, but unexpected, another notable result is that the isolated macrolide 15 aglycones have been identified as having 10-deoxymethinolide 23 rather than methinolide 24 and neomethinolide 25. That is the fact. Cytochrome P450 hydroxylase (PikC), which catalyzes the hydroxylation of 10-deoxymethinolide at either the C-10 or C-12 position (Xue et al., 1998), is added. May be sensitive to structural variations in sugars. It can be argued that the presence of the 4-OH group in the sugar moiety is responsible in part for reducing or preventing hydroxylation of the macrolide.
[0139]
Thus, this result demonstrates the feasibility of a combination of pathway-dependent genetic manipulation and a pathway-independent enzymatic reaction to manipulate a sugar of the desired structure. It is contemplated that pathway independent enzymes may also be used in conjunction with the natural biosynthetic machinery to generate additional structural diversity, which may provide an array of random compounds.
[0140]
(Example 5)
(Operation of hybrid macro ride)
In order to alter the sugar structure of the macrolide, the Streptomyces venezuelae met / pik gene cluster was selected as the parental line, and the calicheamicin biosynthetic gene cluster (from Micromonospora echinospora spp., From California). The gene was selected as a foreign gene. The parent cluster encodes the biosynthetic enzymes for methymycin, neomethymycin, picromycin and nalbomycin, all of which are macrolides containing desosamine as the only sugar component for antibiotic activity (Xue et al., 1998; Zhao et al., 1998). Eight open reading frames (desI-desVIII) in this cluster were assigned as genes involved in desosamine biosynthesis (FIG. 15). The antitumor drug calicheamicin (26) has a tight DNA binding (K _a About 10 ⁶ -10 ⁸ ) Contain four unique sugars, one of which (29) is derived from 4-amino-4,6-dideoxyglucose (28) and has significantly restricted sugars A and B (Fig. 16) (Ding et al., 1991; Drak et al., 1991; Walker et al., 1991; Ellestad et al .; Borders et al., 1995). Compound 28 is expected to be derived from the corresponding 4-keto sugar 27 by a transamination reaction, and recent studies have led to the assignment of the gene (calH) as encoding C-4 aminotransferase. (FIG. 16) (Alhert et al.). Interestingly, the proposed substrate for calH (27) is also an intermediate in the desosamine pathway and exists in a tautomerase (DesVIII) -mediated equilibrium with the substrate for DesI. Expected (Chen et al., 1999). Thus, 27 is the disruption / deletion of desI or desVIII. It is possible that they can accumulate in the Venezuelae mutant. Heterologous expression of calH in this mutant can reconstitute a hybrid pathway directed to a new methimicin / picromycin derivative with 4-amino-4,6-dideoxyglucose derived from 26.
[0141]
To test this, a 1.2 kb calH gene was inserted into pJST1192. _{Kpn 7.0kb} (A subclone containing a 7.0 kb KpnI fragment of cosmid 13a) and amplified by the polymerase chain reaction (PCR) (Thorson et al., 1999). The amplified gene was cloned into the EcoRI / XbaI site of the expression vector pDHS617 containing the apramycin resistance marker. pDHS617 is derived from pOJ446 (Bierman et al., 1992) and the promoter sequence from met / pik (Xue et al., 1998). The resulting plasmid (pLZ-C242) was constructed using S. coli previously constructed using Escherichia coli, S17-1 (Bierman et al., 1992). venezuelae mutant (KdesI) (Borisova et al., 1999) by conjugative transfer. Here, desI was replaced by a neomycin resistance gene that also confers resistance to kanamycin. S. pLZ-C242 containing the venezuelae-KdesI colonies was transferred to apramycin antibiotic (Apr ^R ). One of the engineered strains (KdesI / calH-1) is first grown in 100 mL of seeding medium at 29 ° C. for 48 hours, and then inoculated on a nutrient medium (5 L) and grown for another 48 hours. (Cane et al., 1993). The fermentation broth was centrifuged to remove cell debris and mycelia, and the supernatant was adjusted to pH 9.5 with concentrated KOH and extracted with chloroform. The crude product (700 mg) was subjected to flash chromatography on silica gel using a gradient of 0-20% methanol in chloroform. A mixture of two macrolide compounds, a main product (10-deoxymethinolide) and a by-product, was obtained. The two types of macrolides are further treated with acetonitrile / H ₂ Using an O (1: 1) isocratic mobile phase, C ₁₈ Purified by HPLC on the column. These compounds were later identified as 31 (11.0 mg) and 32 (1.5 mg) by spectral analysis. The 31 spectral data are as follows:
[0142]
Embedded image

The 32 spectral data are as follows:
[0143]
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The observation of the production of macrolides 31 and 32 by KdesI / calH-1 has great significance. First, the added hexose (33) does indeed carry the expected amino group at C-4, and the TDP-6-deoxy-D-glycero-L-threo of the calicheamicin pathway. Explicitly supports the sequence of the calH gene as encoding -4-hexulose 4-aminotransferase. Second, the newly constructed expression vector allows S. aureus. Successful expression of the CalH protein in Venezuelae highlights the prerequisites for developing a more assimilated combinatorial biosynthesis strategy with the potential to express other foreign genes in this strain using this system. In addition, the results also indicate that the glycosyltransferase of this pathway (DesVII) recognizes an alternative sugar substrate (eg, 28) whose structure is significantly different from the original amino sugar substrate (TDP-D-desosamine). To gain. If the sugar component in the product is expected to be aminodeoxyhexose 28, the 4-amino group of the linked sugar component in 31 and 32 is N-acetylated. It is not clear whether acetylation occurs on the free sugar or after addition to the aglycone. Both 31 and 32 are S.D. The observed N-acetylation may be a necessary step for self-protection because it is a novel compound synthesized in vivo by the venezuelae mutant (Cundlife, 1989; Cundlife, 1992; McManus, 1997). Indeed, purified 31 and 32 are inactive against Streptococcus pyogenes grown on Mueller-Hinton agar plates (Managahas, 1996), while the controls (methymycin and pikromycin) are The regions of inhibition that are clearly discernible are indicated.
[0144]
Another noteworthy, but unexpected result, was the fact that the isolated aglycone of macrolide 31 was 10-deoxymethinolide rather than the hydroxylated metimicin and neomethimicin analogs. Met. Interestingly, 32 aglycones were also non-hydroxylated 14-membered narvonolides. Cytochrome P450 hydroxylase (PikC), which catalyzes the hydroxylation of 10-deoxymethinolide and narvonolide (Xue et al., 1998), may be sensitive to structural variations on added sugars. In fact, the absence of aglycone hydroxylation was identifiable when 31 and 32 were incubated in vitro with purified PikC. Similar observations are also noted when desosamine is exchanged by quinovose (Example 4). It can be argued that the presence of a substituent at C-4 (either a hydroxyl group or an amino group) in the sugar moiety causes at least some reduction or prevention of hydroxylation of the macrolide.
[0145]
In conclusion, the results indicate that non-natural secondary metabolite glycosylation patterns can be manipulated through rational selection of heterologous gene combinations. This demonstrated ability to combine foreign enzymes, in concert with the mechanisms of natural biosynthesis, shows tremendous potential to generate additional structural diversity. By extending this work, the construction of a diverse pool of nucleotide sugar glycosylation precursors could rapidly substantially enhance current novel drug discovery through combinatorial biosynthesis efforts.
[0146]
(Example 6)
(Step of operating the hybrid sugar biosynthesis pathway)
6-Deoxy-4-hexulose 33 in the desosamine pathway is also a source of TDP-L-dihydrostreptose (35), a precursor to streptomycin (36) found in the Streptomyces griseus antibiotic streptomycin (37). Suggested as a synthetic intermediate (FIG. 16) (Ortmann et al., 1974; Wahl et al., 1975; Maier et al., 1975; Wahl et al., 1979). The hypothetical sequence of the genes in the streptomycin cluster (Pisowotzki et al., 1991; Distler et al., 1992) envisages a biosynthetic pathway for TDP-L-dihydrostreptoose. As shown in FIG. 16, the strM gene may encode a 3,5-epimerase responsible for the conversion of 33 to 34, while the product of the strL gene catalyzes a 34 ring contraction to 35. (Pisowotzki et al., 1991; Distler et al., 1992). The proposed substrate for StrM (33) is also an intermediate in the desosamine pathway, so that S.33 accumulates in the desosamine pathway. Heterologous expression of StrM, StrL, or StrM / StrL in venezuelae desI mutants may reconstruct a hybrid pathway for novel methymycin / picromycin derivatives carrying L-pyranose or L-furanose.
[0147]
In these experiments, the strM (0.8 kb) and strL (1.0 kb) genes were Griseus genomic DNA was separately amplified by polymerase chain reaction (PCR). The amplified strM gene was cloned into the EcoRI / NsiI site (including the thiostrepton resistance marker) of the expression vector pDHS702 (Xue et al., 2000). The strL gene was cloned into the EcoRI / XbaI site of the vector pDHS617 (containing the apramycin resistance marker). Each plasmid was transformed into Escherichia coli S17-1 (Bierman et al., 1992), and then the previously constructed mutant S. venezuelae KdesI and introduced separately by conjugative transfer. The resulting strains (KdesI / strM and KdesI / strL) were identified based on resistance to the corresponding antibiotic. Using the same strategy, the strL-containing plasmid is further engineered into a KdesI / strM mutant to produce a recombinant strain KdesI / strM / strL that is resistant to both apramycin and thiostrepton. . One such strain (KdesI / strM / strL-8) was selected and grown for 48 hours at 29 ° C. in 150 mL of seeding medium, and then seeded for an additional 48 hours in regular medium (6 L). Grow for time (Cane et al., 1993). The fermentation broth was centrifuged and the supernatant was extracted with chloroform. After concentration, the remaining yellow oil (1.5 g) was subjected to flash chromatography on silica gel using 10% methanol in chloroform as eluent. The crude product is ₁₈ Purification by HPLC on a column, eluting with a linear gradient of 0-50% acetonitrile in water for 20 minutes, the four new macrolide derivatives, 38 (31.1 mg), 39 (6.3 mg), 40 ( 3.0 mg) and 41 (3.9 mg).
[0148]
From the spectral analysis of these compounds, it was found that 38 to 40 were 12-membered macrolide derivatives, while 41 was a 14-membered macrolide.
[0149]
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[0150]
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[0151]
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[0152]
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Interestingly, in 38-41, the stereochemistry of the bond between the aglycone and the added sugar was (J _{1'2 '} = 0 Hz), which is the glycosidic bond (d, J) found in the wild-type structure. _{1'2 '} = 6.5-7.5 Hz). These new compounds all have the same 6-deoxyhexose, but the NMR data indicates that the added sugar is L-rhamnose (42) or its enantiomer, 6-deoxy-D-mannose (43). Can not distinguish. To unambiguously identify newly incorporated sugars, 38 was treated with dimethoxypropane and then derivatized with (S)-or (R) -MTAP chloride to produce the corresponding Mosher esters (44 and 45). I do. Because the orientation of the phenyl ring of the MTAP differs between the two diastereomers, the protons adjacent to the MTAP undergo different shielding depending on the spatial relationship of the aryl group to the anisotropic cone (Ohtani et al., 1991; Ferreiro). Et al., 1991). Based on this well documented phenomenon, the absolute stereochemistry of the chiral center (C-4 ') was deduced from the difference in chemical shifts measured as (S) -MTPA ester- (R) -MTPA ester. obtain. As shown at the bottom of FIG. 16, positive values were observed for the two methyl signals of 1′-H, 2′-H, 3′-H, 4′-H, acetonide groups, while 5′-H Negative values were recorded for H and 5'-Me. These findings indicate an S configuration at C-4 ', indicating that the linked sugar in 38-41 is assigned as L-rhamnose.
[0153]
Using the identification of L-rhamnose (42) as the sugar component of metabolites 38-41 produced by engineered KdesI / strM / strL strains, use of StrM as a 3,5-epimerase that converts 33 to 34 Roles are clearly identified. The corresponding methimycin / picromycin derivative carrying a-linked D-quinovose (47,6-deoxy-D-glucose) is produced by the KdesI / strL strain (Figure 16). These quinoboth-containing macrolides have also been found as metabolites of host strains (S. venezuelae KdesI and KdesI / strM strains). Since the substrate for StrL is predicted to be 34, in the absence of StrM, it catalyzes the required D- / L-conversion of 33 to provide 34, and both KdesI / strL and KdesI strains are observed. It is not surprising to produce the same macrolide as done. The fact that the novel macrolide product is not found in the broth of the KdesI / strM strain may be due to the instability of 34 in vivo, or the glycosyltransferase DesVII cannot process 34 as a substrate Can be attributed to Clearly, S.M. The Venezuelae KdesI host strain contains a D-hexose reductase-independent pathway that is capable of reducing 33 to TDP-D-quinobiose (46) but lacks its own L-hexose reductase that reduces 34. Epimerization catalyzed by StrM is expected to be reversible. Thus, in the presence of D-hexose reductase, the equilibrium between 33 and 34 in the KdesI / strM strain shifts toward 33, resulting in quinoboses after reduction as observed in the product. Since L-rhamnose is formed only in strL-containing strains, in addition to its putative function as a dihydrostreptose synthase, StrL converts L-6-deoxy-4-hexose (e.g., 34) to TDP-L- It can be concluded that it also serves as a sugar reductase that can be reduced to rhamnose (48).
[0154]
The mechanism of the ring contraction step in the dihydrostreptose pathway is significantly different from that proposed for the biosynthesis of UDP-D-apiose (50) derived from UDP-D-glucuronic acid (49) catalyzed by apiose synthase. It should be noted that the similarities (FIG. 18) (Kelleher et al., 1972; Gebb et al., 1975; Watson et al., 1975; Matern et al., 1977; Wahl et al., 1978). This synthase has been assigned to have a dual function with both 4-hexulose reductase and ring contracting activity. Because UDP-D-xylose (51) is a by-product of the catalysis of apiose synthase (Kelleher et al., 1972; Gebb et al., 1975; Watson et al., 1975; Matern et al., 1977; Wahl et al., 1978). Thus, the fact that StrL resembles an apiose synthase with hexose reductase activity provides strong credibility as to the similar role of StrL as a catalyst for the ring contraction step in the dihydrostreptose pathway. Failure to detect the incorporation of 35 into the macrolide structure simply reflects the restriction of DesVII to adapt furanose in its active site.
[0155]
The results described herein show a rare example of a glucosyltransferase that recognizes both D- and L-sugars as substrates (Wohlert et al., 1998). The established versatility of glycosyltransferases (DesVII) in substrate selection is a catalyst in the construction of novel macrolides that further develops better combinatorial biosynthesis strategies for novel antibiotics that carry a wide range of modified sugars Emphasize the essential requirements for competence. This study once again shows that glycosylation of secondary metabolites can be manipulated through selection of rational gene combinations.
[0156]
(Example 7)
(Synthesis of TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose by DesII)
Carbohydrates have recently begun to attract attention among biological molecules due to increasing recognition that plays an important role in many physiological processes (Weymouth-Wilson et al., 1997). As a component of many complex polysaccharides, sugars, especially deoxysugars, they contribute to the biological activity of a diverse repertoire. Modifying the structure of the added sugars holds promise for altering or enhancing the biological activity of the parent complex polysaccharide, so how these unusual sugars are made in the production of an organism. There is considerable ongoing effort to explore (Hallis et al., 1999; He et al., 2000). Such efforts have led to the discovery of several elegant, naturally evolved strategies for breaking the CO bond of hexose sugars. Thus, currently, a series of α, β-dehydration followed by hydride reduction is the mechanism for β-deoxygenation of ketosugar precursors (Draeger et al., 1999; Chen et al., 1999), while pyridoxamine 5′-phosphate (PMP) -dependent [2Fe-2S] -containing enzyme (E _l ) And NADH-dependent iron-sulfur flavoprotein reductase (E ₃ ) Is required for α-deoxygenation of ketosugar substrates (Thorson et al., 1993; Johnson et al., 1996; Chang et al., 2000).
[0157]
The mechanism of C—O bond cleavage at hexoses at C-2, C-3, and C-6 is well established (Hallis et al., 1999; He et al., 2000), but 4-deoxygenated sugars Little is known about the mode of C—O bond cleavage at C-4 in the production of Genetic studies on the biosynthesis of D-desosamine (1 in FIG. 19), 3- (dimethylamino) -3,4,6-trideoxyhexose have been found in many antibiotics, and desosamine production from Streptomyces venezuelae. This resulted in the identification of an entire synthetic gene cluster (Scheme 1, FIG. 19) (Zhao et al., 1998; Xue et al., 1998), methymycin (2), neomethimicin (3), picromycin (4), and nalbomycin (5). To produce This suggests that the eight open reading frames (desI-desVIII) in this cluster are involved during desosamine biosynthesis, including desI and desII assigned to be associated with the C-4 deoxygenation step. (See Zhao et al., 1998; and Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997, related to DesI / DesII equivalents in the erythromycin gene cluster (ie, EryCIV / EryCV)). The translated sequence of desI is B ₆ Show high homology to the ₁ And the translated desII sequence contains a conserved motif of CXXXCXXC (SEQ ID NO: 50) characteristic of the [4Fe-4S] center (Ruzicka et al., 2000) C-4 deoxygenation is E _l And E ₃ (See Zhao et al., 1998; and Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997). As shown in Scheme 1 (FIG. 19), the reaction was initiated by a tautomeric step, possibly catalyzed by DesVIII, to convert 6 (a common precursor for 6-deoxyhexose) to 3-keto- It can be converted to 6-deoxyhexose (7). DesI and DesII then result in the removal of 4-OH from 7, giving the 3-keto-4,6-dideoxyhexose product (8), which is the next enzyme in the pathway. (Zhao et al., 1998). This proposal is supported by the fact that 4-OH is retained in the modified sugars of the modified methymycin and picromycin derivatives (D-quinoboses, 9) produced by the desI deletion mutant (Borisova et al.). , 1999). To further learn about this CO bond cleavage event, targeted disruption of the desII gene and functional analysis of the DesI enzyme were performed.
[0158]
To determine if DesII is part of the C-4 deoxygenation mechanism, S.D. venezuelae mutants were generated in which wild-type S. The desII gene was replaced with a kanamycin resistance gene via homologous recombination of a plasmid containing the appropriate insert with the venezuelae chromosome (Bierman et al., 1992). This mutant was isolated and used for fermentation as previously described (Zhao et al., 1998; Cnae et al., 1993). E ₁ Catalyzed dehydration is an equilibrium reversible reaction favoring the reverse direction (Weigel et al., 1992); ₃ It should be pointed out that the reduction by is essential to complete the overall reaction. Therefore, C-4 deoxygenation is equivalent to E ₁ / E ₃ Following a route analogous to catalytic activity, DesII is ₃ If equivalent, disruption of the desII gene would be expected to give a mutant with the same phenotype as the desI mutant. In fact, a non-wild-type antibiotic was found in the fermentation broth (6 L) of the desII deletion mutant; instead, two macrolide-containing N-acetylated 4-amino sugars 11 (2.4 mg) and 12 (1 mg) was obtained (see Zhao et al., 1998). Compounds 11 and 12 are derived from the coupling of 10 with the respective aglycone, followed by N-acetylation (Scheme 1). However, N-acetylation of 10 can also occur prior to aglycone coupling. Despite this series of events, the production of 11 and 12 showed that 10 It clearly shows that it must accumulate in the desII deletion mutant of Venezuelae.
[0159]
The above results provide a hint that DesI is a 4-aminotransferase and that 4-amination is the onset of 4-deoxygenation. To confirm the catalytic function of DesI, the desI gene was amplified by PCR and His at the N-terminus. ₆ Using -tag, it was cloned into pET-28b (+) expression vector (Novagen). The DesI protein produced was purified to approximate homogeneity by Ni-NTA column (Qiagen) and then by FPLC on MonoQ column. DesI subunit M as determined by SDS-PAGE _r Is estimated to be 45 kDa, which is 45 765 Da (plus His ₆ (tag), which is in good agreement with the calculated molecular weight. Further analysis by size exclusion chromatography revealed a 95.6 kDa M for DesI. _r It turned out to be. Therefore, DesI exists as a homodimer in solution. The UV-vis spectrum of the purified DesI is not recognized above about 300 nm; however, the spectrum of the more concentrated sample indicates the presence of trace amounts of PLP.
[0160]
Interestingly, when the putative substrate (TDP-3-keto-deoxy-D-glucose (7)) was incubated with purified DesI in the presence of L-glutamate, 7 was not consumed and no new product was present. This was confirmed by HPLC analysis. In contrast, when TDP-4-amino-4-keto-6-deoxy-D-glucose (6) was incubated with DesI under the same conditions, the consumption of 6 (retention time = 4.52 minutes) And the formation of a new product (retention time = 3.87 minutes) was observed. This new compound was purified by FPLC on a MonoQ column and characterized as TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose (10). These results ensure that DesI recognizes only 4-hexose (6) as a substrate and does not process 3-hexulose (7). These findings fully demonstrate the consequences of the desII gene disruption. Like the PLP-dependent 4-aminotransferase, the κ of 56.2 ± 3.1 / min _cat Value and K of 130 ± 4 μM for sugar substrate 6 _M Values were also determined for DesI.
[0161]
DesI catalyzes the transamination reaction at 6 in the absence of DesII to give 4-amino for the modification of the previously proposed biosynthetic pathway for TDP-D-desosamine (Scheme 1, FIG. 19). A sugar product 10 is produced. Clearly, the 6 to 7 tautomerism is not a necessary step in the desosamine pathway. Further, the mechanism of C-4 deoxygenation is E ₁ / E ₃ (Hallis et al., 1999; He et al., 2000; Thorson et al., 1993; Johnson et al., 1996; Chang et al., 2000). Considering that DesI / DesII catalytic activity is initiated by the incorporation of a nitrogen function at C-4 (eg, 13), C-4 to C-4 produce an aminal intermediate (eg, 14). The 1,2-nitrogen shift to -3 may be a key step in C-4 deoxygenation. As shown in Scheme 2, elimination of either water or an ammonium molecule from C-3 at 14 produces the 3-keto-4,6-dideoxy sugar product (8). There are enzymes that can promote 1,2-amino shift. Two best studied examples are ethanolamine ammonia lyase, and an adenosylcobalamin (AdoCbl) -dependent enzyme that catalyzes the decomposition of ethanolamine to ammonia and acetaldehyde (Babior et al., 1982; LoBruto et al., 2001; Frey et al., 2000), and lysine 2,3-aminomutase which catalyzes the interconversion of L-lysine and L-β-lysine via 1,2-transferment of an amino group (Babior et al., 1982; LoBrutto et al. , 2001; Frey et al., 2000). The latter enzyme from Clostridium subterminale SB4 contains an iron-sulfur center and is PLP and S-adenosylmethionine (SAM) dependent. Both reactions are putative 5'-deoxyadenylates, generated by reductive cleavage of SAM in lysine 2,3-aminomutase or by isotropic cleavage of the Co-C bond of adenosylcob (III) alamine in ethanolamine ammonia lyase. It is thought to contain sil radicals. The adenosyl radical then abstracts hydrogen from the substrate and initiates isomerization. DesI is a PLP enzyme and DesII has recently been identified as a member of the radical SAM superfamily by sequence analysis (Sofia et al., 2001), and DesI and DesII enzymes work together to produce lysine 2,3- It catalyzes 1,2-aminotransfer in a manner similar to that of aminomutase (see Scheme 2, Figure 20) to achieve C-4 deoxygenation. (DesII can also act alone by extracting 3-H. Directly from 10 to produce a radical intermediate, which is converted to a ketyl equivalent after deprotonation of OH. After β-elimination of the 4-amino group, H returns and tautomerism can also give 8).
[0162]
There is no doubt that this study provides evidence for a novel pathway for desosamine biosynthesis. These results may also infer a novel mechanism for C-4 deoxygenation. A comparison of this novel mechanism with a mechanism of C-3 deoxygenation clearly demonstrates the diversity and ability to perform α-OH removal from ketohexose precursors in sugars, which are rare in biosynthesis, and assimilation. To have a strategy to Together, the work done on the biosynthesis of deoxyhexoses opens new mechanistic insights into the general pathway of biological deoxygenation. These findings are excellent evidence for the evolutionary diversity of biological CO bond cleavage events (Johnson et al., 1999).
[0163]
[Equation 3]

The complete disclosures of all patents, patent documents and specifications cited herein are hereby incorporated by reference as if individually incorporated. The foregoing detailed description and examples have been given for clarity of understanding only. From this it should be understood that there are no unnecessary limitations. The invention is not limited to the exact details shown and described. Modifications obvious to one skilled in the art are included within the scope of the invention as defined by the claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 is a schematic diagram of the desosamine biosynthetic pathway and the enzymatic activity associated with each of the desosamine biosynthetic polypeptides.
FIG. 2
FIG. 2 is a schematic representation of the conversion of the inactive (diglycosylated) form of methymycin and picromycin to the active forms of methymycin and picromycin.
FIG. 3
FIG. 3 is a schematic diagram of the desosamine biosynthesis pathway.
FIG. 4
FIG. 4 shows the synthetic route for the compounds of formulas 7 and 8 in Streptomyces desVI mutants.
FIG. 5
FIG. 5 shows the structure and biosynthesis of methymycin and picromycin and related compounds in Streptomyces venezuelae ATCC 15439. Methymycin: R ₁ = OH, R ₂ = H, neomethymycin: R ₁ = H, R ₂ = OH; picromycin: R ₃ = OH, narbomycin: R ₃ = H. The polyketide synthase components PikAI, PikAII, PikAIII, PikAIV and PikAV are indicated by solid bars. Each circle indicates the enzyme domain of the Pik PKS system. KS: β-ketoacyl-ACP synthase, AT: acyltransferase, ACP: acyl carrier protein, KR: β-ketoacyl-ACP reductase, DH: β-hydroxyl-thioester dehydrase, ER: enoyl reductase, KS ^Q : KS-like domain, cross-marked KR: non-functional KR, TE: thioesterase domain, and TEII: type II thioesterase. Des indicates all eight enzymes for desosamine biosynthesis and translocation, and PikC ₁ , R ₂ And R ₃ Is a cytochrome P450 monooxygenase responsible for hydroxylation at position (Xie et al., 1998).
FIG. 6
FIG. 2 shows the organization of the venzuelae pik cluster. Each arrow indicates an open reading frame (ORF). The direction of transcription deduced from the nucleotide sequence and the relative size of the ORF are indicated. This cluster is composed of four loci: pikA, pikB (des), pikC and pikR. Cosmid clones are shown as overlapping lines.
FIG. 7
FIG. 7 shows the conversion of YC-17 and nalbomycin by PikC P450 hydroxylase.
FIG. 8
FIG. 8 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the desosamine gene cluster.
FIG. 9
FIG. 9 shows exemplary and preferred amino acid substitutions.
FIG. 10
FIG. 10 shows the desosamine biosynthesis pathway.
FIG. 11
FIG. 11 shows a schematic of the pathway leading to the methimycin / neomimemycin analogs 18 and 19.
FIG.
FIG. 12 shows a macrolide having D-quinoboth.
FIG. 13
FIG. 13 shows the product produced by the desI mutant.
FIG. 14
FIG. 14 shows the macrolide produced in the desH mutant expressing CalH.
FIG.
FIG. 15 shows the natural substrate of CalH and the product of CalH, as well as the structure of calicheamicin.
FIG.
FIG. 16 shows macrolides produced in desI mutants expressing StrL and StrM.
FIG.
FIG. 17 shows the natural substrates of StrL and StrM and the products of StrL and StrM.
FIG.
FIG. 18 shows apiose synthase substrates and products.
FIG.
FIG. 19 shows a schematic diagram of the biosynthesis of desosamine in the des mutant and the intermediate.
FIG.
FIG. 20 shows an alternative scheme for desosamine biosynthesis.

Claims (27)

A modified recombinant bacterial host cell that produces a product comprising a sugar, wherein the sugar is not produced by a corresponding recombinant bacterial host cell or a non-recombinant bacterial host cell, wherein the modified recombinant host cell The cell and the recombinant host cell comprise a disruption in a nucleic acid sequence encoding at least one glycosynthetic enzyme, wherein the modified recombinant host cell comprises at least one nucleic acid segment, wherein the nucleic acid segment comprises: Encoding at least one saccharide biosynthetic enzyme that is a homolog of the enzyme encoded by the nucleic acid sequence, and wherein the sugar on the product produced by the modified recombinant host cell is a recombinant host cell or non-recombinant. A modified recombinant bacterial host cell that is not a stereoisomer of a sugar on the corresponding product of the host cell. 2. The modified recombinant host cell according to claim 1, wherein the product produced by the modified recombinant host cell is a glycosylated polyketide. 3. The modified recombinant host cell of claim 2, wherein the product is a macrolide, anthracycline, angcycline, abamectin, milbemycin, tetracycline, polyene, polyether, ansamycin or isochromanquinone. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said disrupted nucleic acid sequence encodes desosamine. 2. The modified recombinant host cell according to claim 1, wherein the modified recombinant host cell is Streptomyces. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein the nucleic acid segment is streptomycin, carbomycin, tylosin, spiramycin, streptolysin, erythromycin, vancomycin, teicoplanin, chloroelemycin, methimicin, picromycin, A modified recombinant host cell obtained from a cell that produces uramycin, granaticin, oleandomycin, landmycin, tetracenomycin, doxorubicin, mitramycin, epirubicin, daunorubicin, calicheamicin or nystatin. 5. The modified recombinant host cell of claim 4, wherein said nucleic acid sequence encoding DesI or DesVIII has been disrupted. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes a dehydrase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes a reductase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes a TDP-sugar synthase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes TDP-sugar dehydratase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes an aminotransferase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes N-methyltransferase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein said nucleic acid segment encodes a tautomerase. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, wherein the nucleic acid segment encodes an enzyme that is a homolog of the enzyme encoded by a nucleic acid sequence. 2. The modified recombinant host cell of claim 1, comprising at least two different nucleic acid segments. 17. The modified recombinant host cell of claim 16, wherein one of said nucleic acid segments encodes epimerase. 17. The modified recombinant host cell of claim 16, wherein one of said nucleic acid segments encodes dihydrostreptose synthase. 8. The modified recombinant host cell of claim 1 or 7, wherein said nucleic acid segment encodes CalH. 17. The modified recombinant host cell of claim 16, wherein said nucleic acid sequence encodes DesI and said nucleic acid segment encodes StrL and StrM. 2. The product produced by the modified recombinant host cell of claim 1, which is not produced by a corresponding non-recombinant host cell or recombinant host cell. 22. The product of claim 21 comprising a macrolide. 22. The product of claim 21, which is biologically active. 22. The product of claim 21, which is a polyketide. A method for preparing a product having an altered sugar component, said method having an altered sugar component compared to a product produced by a corresponding non-recombinant host cell or recombinant host cell. A method comprising culturing the modified recombinant host cell of claim 1 to produce a product. A method for identifying a product produced by a modified recombinant host cell, comprising:
a) introducing the recombinant host cell into at least one expression cassette to produce a modified recombinant host cell, wherein the recombinant host cell encodes at least one saccharide biosynthetic enzyme B. Detecting whether the modified recombinant host cell produces a different product than the product produced by the recombinant host cell,
A method comprising: A method for preparing a modified recombinant host cell, comprising introducing the recombinant host cell into at least one expression cassette to produce the modified recombinant host cell. Wherein the recombinant host cell comprises a disruption in at least a portion of a nucleic acid sequence encoding at least one glycosynthetic enzyme, wherein the expression cassette is encoded by the nucleic acid sequence. A method comprising a nucleic acid segment encoding a saccharide biosynthetic enzyme different from at least one enzyme to be performed.

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