JP2004533806A - 単離ヒトg−タンパク共役受容体、ヒトgpcrタンパクをコード化する核酸分子、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、本発明にかかるGPCRペプチドであるヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されるペプチドのアミノ酸配列を提供する。特に本発明は、単離ペプチドと核酸分子、GPCRペプチドのオルソログとパラログを特定する方法、及びGPCRペプチドの変調剤を特定する方法を提供する。
Description
【0001】
関連出願
本出願は、2000年10月25日付け出願のU.S.Serial No.09/695,045(Atty. Docket CL000900)、及び2001年5月31日付け出願のU.S.Serial No.09/867,570(Atty. Docket CL000900−CIP)の優先権を主張するものである。
【0002】
技術分野
本発明は、ヒトMas関連GPCR受容体サブファミリーに関連するG−タンパク共役受容体(GPCR)、組換えDNA分子、及びタンパク生成に関する。特に本発明は、新規のGPCRペプチドとタンパク、及び該ペプチド及びタンパク分子をコード化する核酸分子を提供し、これらはヒト治療学、及び診察用組成物と診察方法の発展のために有用である。
【0003】
背景技術
G − タンパク共役受容体
G−タンパク共役受容体(GPCR)は、細胞内での信号伝達を担うタンパクの主要なクラスを構成している。GPCRは3つの構造のドメインを持っている。それはアミノ末端細胞外ドメイン;7つの貫膜セグメント・3つの細胞外ループ・3つの細胞内ループを含む貫膜ドメイン;及びカルボキシ末端細胞内ドメインである。GPCRの細胞外部分にリガンドが結合する際に、細胞内で信号が伝達され、その結果、細胞の生物学的又は生理的な性質が変化する。GPCRは、G−タンパク及び効果器(細胞内酵素、G−タンパクにより変調されるチャンネル)と共に、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力へと結びつけるモジュラー信号系の要素である。
【0004】
GPCR遺伝子及び遺伝子生成物は、疾患を引き起こす原因薬剤となり得る(Spiegel et al., J. Clin. Invest. 92:1119−1125 (1993); McKusick et al., J. Med. Genet. 30:1−26 (1993))。ロドプシン遺伝子及びV2バソプレッシン受容体遺伝子に特有の欠陥は、種々の色素性網膜炎(Nathans et al., Annu. Rev. Genet. 26:403−424(1992))、及び腎性尿崩症(Holtzman et al., Hum. Mol. Genet. 2:1201−1204 (1993)) を引き起こすことが示されている。これらの受容体は、中枢神経系及び末梢の生理的プロセスにおいて非常に重要である。進化解析により、これらのタンパクの祖先は元来、複合体設計、神経系とともに発達してきたことが示唆される。
【0005】
GPCRタンパクスーパーファミリーは、ファミリーI:ロドプシン及びβ2−プリン作動性受容体に代表され、現在200以上の特有のメンバーが示されている受容体ファミリー(Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem. 60:653−688 (1991)); ファミリーII:副甲状腺ホルモン/カルシトニン/セクレチン受容体ファミリー(Juppner et al., Science 254:1024−1026 (1991); Lin et al., Science 254:1022−1024 (1991)); ファミリーIII:代謝性のグルタミン酸塩受容体ファミリー(Nakanishi, Science 258 597:603 (1992)); ファミリーIV:走化性及びD. discoideumの発達に重要なcAMP受容体ファミリー(Klein et al., Science 241:1467−1472 (1988)); ファミリーV:STE2等の菌類交接フェロモン受容体ファミリー(Kurjan, Annu. Rev. Biochem. 61:1097−1129 (1992))、の5つのファミリーに分類することができる。
【0006】
7つの推定疎水性セグメントを示し、GPCRとは無関係と思われる少数の他のタンパクも存在する;これらはG−タンパクとの共役を示さなかった。ショウジョウバエは、光受容体に特有のタンパクであるbride−of−sevenless(boss)を発現し、この7つの貫膜セグメントを持つタンパクは広範囲にわたって研究されているが、GPCRであるという証拠は示されていない(Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5047−5051 (1993))。ショウジョウバエ中のちぢれた遺伝子(fz)もまた、7つの貫膜セグメントを持つタンパクであると考えられる。bossと同様に、fzもG−タンパクとの共役を示さなかった(Vinson et al., Nature 338:263−264 (1989))。
【0007】
G−タンパクは、グアニンヌクレオチドと結合するα、β、及びγサブユニットから成るヘテロ三量体タンパクファミリーを表す。これらのタンパクは、通常、例えば7つの貫膜セグメントを含む受容体等の細胞表面の受容体に結合している。リガンドのGPCRへの結合に続いて、立体配座の変化がG−タンパクに伝達され、これによりαサブユニットにおいてGDP分子がGTP分子と交換され、β、γサブユニットから分離される。αサブユニットのGTP結合様式は、典型的には、効果器変調部として機能し、cAMP(例えば、アデニルシクラーゼの活性化により)、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸塩等の二次メッセンジャーの生成を導く。20種類以上の異なるαサブユニットがヒトにおいて知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットの小さいプールと関連している。哺乳類のG−タンパクの例としては、Gi、Go、Gq、Gs、及びGtが含まれる。G−タンパクは、Lodish et al., Molecular Cell Biology、(Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995)に広範囲にわたって記載されており、その内容は参考文献としてここに折り込まれている。GPCR、G−タンパク、G−タンパク結合効果器、及び二次メッセンジャーシステムについては、The G−Protein Linked Receptor Fact Book, Watson et al., eds., Academic Press (1994)に記述されている。
【0008】
アミン作動性GPCR
GPCRの1つのファミリーであるファミリーIIには、アセチルコリン、カテコールアミン、及びインドールアミンリガンド(以下、生体アミンとする)の受容体が含まれる。生体アミン受容体(アミン作動性GPCR)はGPCRの大きなグループであり、これらは進化における祖先を共有しており、脊椎動物(新口動物)と無脊椎動物(旧口動物)の両方に存在する。このGPCRファミリーには、5−HT類、ドーパミン類、アセチルコリン類、アドレナリン類、メラトニン類のGPCRが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0009】
ドーパミン受容体
脳の機能、及び疾患に関するドーパミン作動性システムへの理解は、数十年前、薬物治療後の3つの異なる観察がなされたことにより発展を遂げた。これらは、パーキンソン病を改善するためのドーパミン置換療法において、ドーパミン受容体をブロックする抗うつ病薬及び抗精神病薬に由来するレセルピンによってドーパミンや他のカテコールアミンが減少することが観察されたというものである。典型的な抗精神病薬のドーパミン受容体結合親和性が、それらの臨床効果に相互に関連するという発見から、精神分裂症におけるドーパミン過活性の仮説が導かれた(Snyder, S.H., Am J Psychiatry 133, 197−202 (1976); Seeman, P. and Lee, T., Science 188, 1217−9 (1975))。今日、ドーパミン受容体は、精神分裂症、パーキンソン病、トゥレット症候群、遅行性ジスキネジア、ハンティングトン疾患の薬理療法における重要な対象である。ドーパミン作動性システムには、黒質線条体、中間皮質、及び隆起漏斗の経路が含まれる。黒質線条体系経路は線条体内モーターシステムの一部であり、その退化はパーキンソン病を引き起こす:中間皮質系経路は、増強及び感情表現において重要な役割を果たし、抗精神病性薬の作用において要求される部位である:隆起漏斗系経路は脳下垂体からのプロラクチン分泌を調節する。
【0010】
ドーパミン受容体は、Gタンパク共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共に7つの螺旋形膜スパニング構造を有し、ヘテロ3量体グアニンヌクレオチド結合調節タンパク(Gタンパク)の結合を通じて信号を変換する大きなタンパクグループである。ドーパミン受容体は、それらの異なるリガンド結合様式、信号伝達特性、配列相同性、ゲノム組織に基づいて、D1類(D1及びD5)、D2類(D2、D3及びD4)といったサブファミリーに分類される(Civelli, O., Bunzow, J.R. and Grandy, D.K., Annu Rev Pharmacol Toxicol 33, 281−307 (1993))。D1類受容体であるD1及びD5は、Gs類タンパクとの結合を通じてcAMP合成を活性化し、また、それらの遺伝子はタンパクコード領域中にイントロンを含まない。他方、D2類受容体であるD2、D3及びD4は、Gi類タンパクとの相互作用を通じてcAMP合成を阻害し、また、タンパクコード領域中にイントロンを含む類似のゲノム組織を共有している。
【0011】
セロトニン受容体
セロトニン(5−Hydroxytryptamine)は、最初に血清から単離され、そこでは血管収縮を促進することが示された(Rapport, M.M., Green, A.A. and Page, I.H., J Biol Chem 176, 1243−1251 (1948)。LSDやプシロシビン等の幻覚剤が、平滑筋製造における5−HTの作用を阻害することが観察され、5−HTと精神的疾患との関係に対する関心が高められた(Gaddum, J.H. and Hameed, K.A., Br J Pharmacol 9, 240−248 (1954))。この観察は、精神医学的障害において脳での5−HT活性が変化され得るという仮説を導くものである(Wooley, D.W. and Shaw, E., Proc Natl Acad Sci U S A 40, 228−231 (1954); Gaddum, J.H. and Picarelli, Z.P., Br J Pharmacol 12, 323−328 (1957))。この仮説は、三環性抗憂鬱剤及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤が多くのうつ症状治療へと導入され、これらの製剤のノルアドレナリン及び5−HTの代謝への影響が観察されたことにより強化された。今日、セロトニン作用系に作用している薬剤は、一般に不安症状・社会恐怖症とされている鬱病、精神分裂症、強迫症状、パニック症候群、また偏頭痛、ガン化学療法により誘発する嘔吐、及び胃運動性障害等の精神病の薬物療法において、効果的であることが証明されている。
【0012】
セロトニン受容体は、神経伝達物質受容体における非常に大きく多様なファミリーである。現在までに哺乳類において、13のGタンパク共役5−HT受容体タンパクと、1つのリガンドゲートイオンチャンネル受容体(5−HT3)が記述されている。この受容体の多様性は、神経伝達物質及びホルモンとしてのセロトニンの古代起源と同様に、哺乳類における5−HTの多くの異なる役割を反映するものと考えられる。5−HT受容体は、それらの異なるリガンド−親和性プロフィール、分子構造、及び細胞内伝達機構によって、7つのサブファミリー又はグループに分類される(Hoyer, D. et al., Pharmacol. Rev. 46, 157−203 (1994))。
【0013】
アドレナリン作動性GPCR
アドレナリン作動性受容体は、Gタンパク共役受容体「スーパーファミリー」において、最も大きく、最も広く特徴づけられたファミリーのうちの1つを含む。このスーパーファミリーには、アドレナリン作動性受容体だけでなく、ムスカリン系、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性受容体も含まれる。グルカゴン、ソマトスタチン、バソプレッシン受容体、同様に視覚(ロドプシン)、味覚、及び嗅覚のための感覚受容体といった多くのタンパク受容体もまた、このファミリーに属する。シグナリング分子の多様性にもかかわらず、G−タンパク共役受容体の全てのプロセスは、7つの推定αへリックス構造膜に特徴付けられる初期の構造体と全く同様である(Probst et al., 1992)。最も基本的な理解としては、アドレナリン作動性受容体は、カテコールアミン、エピネフリン、及びノルエピネフリンの作用する生理的部位である。
【0014】
アドレナリン作動性受容体は、Ahlquistによって最初にα又はβとして分類され、彼は2つの受容体サブタイプにおいて、生理的反応を引き起こす一連のアゴニストの効力が、両者で明らかに異なることを証明した(Ahlquist(1948))。機能的には、αアドレナリン作動性受容体は、血管収縮、瞳孔拡張、及び子宮の抑制を制御することが示され、一方でβアドレナリン作動性受容体は、血管弛緩、心筋刺激、及び気管支拡張に関係している(Regan et al., 1990)。結局のところ、薬理学者達は、これらの反応はいくつかの異なるアドレナリン作動性受容体サブタイプの活性化により生じるものであると認識した。心臓中のβアドレナリン作動性受容体はβサブ1として定義され、肺及び脈管系中のそれらはβサブ2と呼ばれている(Lands et al., 1967)。
【0015】
一方で、αアドレナリン作動性受容体は、最初にシナプス前後(それぞれαサブ1、αサブ2)としての解剖学的位置に基づいて分類された(Langer et al., 1974)。しかしながら、この分類案は、αサブ2受容体が血小板のような明らかな非シナプス位置に存在していることによって混乱させられた。(Berthelsen and Pettinger, 1977)。放射性リガンド結合技術の開発に伴い、αアドレナリン作動性受容体は、プラゾシン又はヨヒンビンアンタゴニストとの親和性に基づいて薬理学的に識別された(Stark, 1981)。
【0016】
しかしながら、アドレナリン作動性受容体サブタイプの決定的な証拠としては、アドレナリン作動性受容体サブタイプの精製、及び分子クローニングが待たれた。1986年に、ハムスターのβサブ21アドレナリン作動性受容体(Dickson et al., 1986)、及び七面鳥のβサブ1アドレナリン作動性受容体(Yarden et al., 1986)の遺伝子がクローン化され、配列決定された。そして、水治療解析により、これらのタンパクが、光受容体であるロドプシンに類似した7つの疎水性ドメインを含んでいることが明らかとなった。これ以降、アドレナリン作動性受容体ファミリーは、3つのβ受容体サブタイプ(Emorine et al., 1989)、3つのαサブ1受容体サブタイプ(Schwinn et al., 1990)、及び3つの異なるβサブ2受容体(Lomasney et al., 1990)を含むように拡大された。
【0017】
動物組織由来のα受容体サブタイプのクローニング、配列解析及び発現から、α1受容体は、α1d(以前、α1a又はα1a/1dとして知られていた)、α1b、及びα1a(以前、α1cとして知られていた)サブタイプへと分類されるに至った。それぞれのα1受容体は、薬理学的特異性、及び組織特異性を示す。「α1a」という名称は、1995年の受容体及びイオンチャンネル命名補遺(Watson and Girdlestone, 1995)において概説されているように、以前「α1c」と命名されていたサブタイプについて、近年、IUPHARN命名委員会により公認された名称である(Watson and Girdlestone, 1995)。
【0018】
本発明においては、α1aという名称はこのようなサブタイプのことをいう。また、同時に、以前α1aと称されていた受容体は、α1dと命名された。本発明においては新しい命名法が用いられている。これらのα1受容体サブタイプを発現している安定な細胞系がここに記述されている;しかしながら、American Type Culture Collection (ATCC)では、これらの細胞系は古い命名法の下に記載されている。α1アドレナリン作動性受容体サブタイプの分類については、Martin C. Michel, et al., Naunyn−Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. (1995) 352:1−10を参照。
【0019】
αアドレナリン作動性受容体サブタイプにおける相違は、病態生理学的な症状に関連している。良性の前立腺肥大又はBPHとして知られている良性前立腺過形成は、典型的には50歳以上の男性に発症し、年齢が増すに連れ病状は深刻なものとなる。症状の兆候としては、これに限られるものではないが、排尿の困難性増加や性的機能不全がある。これらの徴候は、前立腺の肥大又は過形成によって引き起こされる。前立腺が肥大すると、男性の尿道における自由な流れを阻害する。これに付随して、肥大した前立腺のノルアドレナリン作動性神経刺激伝達が増大することにより、膀胱口及び尿道におけるアドレナリン作用が増大し、さらには尿道を通じての尿の流れが制限されるに至る。
【0020】
αサブ2受容体は、β及びαサブ1受容体の両者よりも早く開散されると考えられる。αサブ2受容体は、その染色体位置に基づいて、αサブ2C2、αサブ2C4、αサブ2C10と呼ばれる3つの異なる分子のサブタイプに分解される。これらのサブタイプはそれぞれ、薬理学的に定義されるαサブ2B、αサブ2C、αサブ2Aサブタイプに対応していると考えられる(Bylund et al., 1992)。
【0021】
全てのアドレナリン作動性受容体がエピネフリンにより認識されるとはいえ、それらは薬理学的に異なるものであり、個別の遺伝子によってコード化されているものである。これらの受容体は、一般的にG−タンパクを通じ結合される、異なる二次メッセンジャー経路に結合される。アドレナリン作動性受容体において、βサブ1及びβサブ2受容体はアデニレートシクラーゼを活性化し、αサブ2受容体はアデニレートシクラーゼを阻害し、αサブ1受容体はホスホリパーゼC経路を活性化し、ポリホスホイノシチド分解を促進する(Chung, F. Z. et al., J. Biol. Chem., 263:4052 (1988))。αサブ1及びαサブ2アドレナリン作動性受容体は、それらの薬剤としての細胞活性において相違する。
【0022】
このタンパクファミリーのメンバーの有用性を開示している米国の特許としては、6,063,785号(良性前立腺過形成の治療に有用なフタルイミドアリールピペラジン)、6,060,492号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、6,057,350号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、6,046,192号(フェニルエタノールアミノテトラリンカルボキサミド誘導体)、6,046,183号(良性前立腺過形成の共同治療方法)、6,043,253号(β3アゴニストとしてのアリールスルホンアミド置換融合ピペリジン)、6,043,224号(神経病的障害及び神経変性疾患の治療のための組成物及び方法)、6,037,354号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、6,034,106号(糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ3 アゴニストとしてのオキサジアゾールベンゼンスルホンアミド)、6,011,048号(糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ3アゴニストとしてのチアゾールベンゼンスルホンアミド)、6,008,361号及び5,994,506号(アドレナリン作動性受容体)、5,994,294号(ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用)、5,990,128号(良性前立腺過形成の治療のためのαサブ1Cの特定化合物)、5,977,154号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、5,977,115号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、5,939,443号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、5,932,538号(ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用)、5,922,722号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト26)、5,908,830号及び5,861,309号(ヒトα1アドレナリン作動性受容体をコード化するDNA)が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0023】
プリン作動性GPCR
プリン受容体P2Y1
P2プリン受容体は、ATPゲートチャンネルであるP2X受容体、G−タンパク共役受容体のファミリーであるP2Y受容体、及びマスト細胞中で非選択的に細孔を媒介するP2Z受容体に大きく分類されてきた。それぞれのP2受容体において、多くのサブクラスが特定されている。P2Y受容体は、ATP及びその類似体に対する選択的な応答性によって特徴づけられる。これらのうちのいくつかは、UTPに対しても応答する。P2プリン受容体命名法の推奨に基づき、P2Yプリン受容体はクローニングの順序により番号付けられる。P2Y1、P2Y2、及びP2Y3は、様々な種からクローン化された。P2Y1は、ADPとATPに対して応答する。
【0024】
ヒトの骨及び2つの骨芽細胞系におけるP2Y受容体サブタイプの発現についてRT−PCRにより分析したところ、全ての公知のヒトP2Y受容体サブタイプ、すなわちP2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、及びP2Y7が発現していることが示された(Maier et al. 1997)。対照的に、脳由来の細胞系における分析では、脳組織においてはP2Y受容体サブタイプの選択的な発現が起こっていることが示唆された。
【0025】
Leonらは、P2Y1受容体の生理学的な役割を調べるためにP2Y1−ヌルマウスを生成した(J. Clin. Invest. 104: 1731−1737(1999))。これらのマウスは、発達、寿命、再生、血小板の形状等に影響する異常を生じることなく成長することができ、これらの血小板の計測数は野生型マウスと同等だった。しかしながら、P2Y1不足マウスから取り出した血小板は、通常のADP濃度では凝集することができず、他のアゴニストへの凝集も減少したが、高濃度のADPでは形状変化なしに凝集する。
【0026】
さらに、アデニリルシクラーゼのADP由来の阻害が未だ生じており、P2Y1とは別のADP受容体の存在が示された。P2Y1−ヌルマウスは、自発的な出血傾向は持たないが、ADP又はコラーゲンとアドレナリンの静脈注射により引き起こされる血栓塞栓症に対する抵抗力があった。したがって、P2Y1受容体は、血栓症状において重要な役割を果たし、抗血栓性薬剤を代表する。Somersらは、短腕の染色体3上の末端マーカーから、173〜174cMの位置のフランキングマーカーD3S1279とD3S128の間の、P2RY1遺伝子をマップした(Genomics 44: 127−130 (1997)。
【0027】
プリン受容体P2Y2
嚢胞性線維症(CF)に欠けている塩化物イオン分泌経路は、細胞外ヌクレオチドにより活性化される塩化物イオンの代替となる輸送経路によってバイパスされる。従って、この効果を媒介するP2受容体は、CF患者の塩化物イオン分泌を改善するための治療対象である。Parrらは、タンパクをコード化するヒト気道上皮細胞からクローンされたcDNAの配列及び機能発現を、P2Yヌクレオチド受容体の特性とともに報告した(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3275−3279 (1994))。ヒトP2RY2遺伝子は、染色体11上のq13.5〜q14.1にマップされた。
【0028】
プリン受容体P2Y4
P2RY4受容体は、UTP及びUDPにより特異的に活性化され、ATP及びADPでは活性化しないと考えられる。このウリジンヌクレオチド受容体の活性化により、イノシトールリン酸形成向上、及びカルシウム移動を生じる。UNR遺伝子は染色体Xq13上に位置する。
【0029】
プリン受容体P2Y6
Somersらは、P2RY6遺伝子を、多型マーカーD11S1314及びD11S916との間の11q13.5にマップし、P2RY2は4cM以下のP2RY6内に位置する(Genomics 44: 127−130 (1997)。これは、この遺伝子ファミリーの染色体群化について最初に記述したものである。
【0030】
アデニン、ウリジンヌクレオチドは、細胞内エネルギー代謝、リン酸化、及び核酸合成における既定の役割に加えて、重要な細胞外信号分子でもある。P2Y代謝性受容体は、種々の生理的プロセスを調節している細胞外ヌクレオチドの影響を媒介するGPCRである。少なくとも10のP2Y受容体サブファミリーが確認されている。これらの受容体サブファミリーは、配列、及びヌクレオチドアゴニストの選択性及び有効性において大きく異なっている。
【0031】
脳においては、P2Y1受容体が強く発現されることが証明されているが、P2Y2、P2Y4、及びP2Y6受容体も存在している。神経細胞、神経膠細胞、脳脈管又は脳室上衣細胞における、これらのサブタイプの局在化は、in situ mRNAハイブリダイゼーション、及びこれらの培養細胞の研究において発見された。P2Y1受容体は神経細胞に顕著に存在する。あるP2Y受容体サブタイプの、N型Ca2 +チャンネル又は特定のK+チャンネルへの共役が実証された。
【0032】
また、いくつかのP2Y受容体が、細胞内経路を刺激して、平滑筋細胞の生育促進効果を媒介することが示された。この細胞内経路はGqタンパク、タンパクキナーゼC、及びチロシンリン酸化に関連し、即時の初期遺伝子発現、細胞数、DNA及びタンパク合成を引き起こしている。さらにP2Y調節が、動脈硬化症の発症に応答し、分裂促進の役割を果たすことが証明された。
【0033】
さらにP2Y受容体が、嚢胞性線維症において重要な役割を果たすことが示された。気道表面の液体の体積及び組成は、気道上皮を透過するイオンの能動輸送により調整されている。これは、基底外受容体に作用する自律神経のアゴニスト、及び発光性受容体に作用するアゴニストの両者によって次々に調節される。特に、気道表面の液体中に存在する細胞外ヌクレオチドは、発光性P2Y受容体において、Cl−分泌、及びNa+吸収を制御するよう作用する。ヌクレオチドは気道上皮細胞から調節されて放出されるので、気道上イオン輸送の調節は、気道上皮の発光性表面に局在したオートクリン調節系の一部をなしていることが好ましい。この生理学的な役割に加えて、P2Y受容体アゴニストは、上皮のイオン輸送障害であるCFの治療において有益である可能性がある。CFを有するヒトの気道では、不完全なCl−分泌及び異常に高率なNa+吸収が生じている。P2Y受容体アゴニストは、これらのイオン輸送経路の両方を調節し、CFにおけるイオン輸送欠陥に対する薬理学的なバイパスとなる可能性を持つ。
【0034】
GPCR、特にヒトMas関連GPCR受容体サブファミリーのメンバーは、薬剤作用と開発のための主要な対象である。従ってそれは、未知のGPCRを識別し特徴付ける調剤開発の分野において貴重である。本発明は、未確認のヒトGPCRを提供することにより、技術レベルを向上する。
【0035】
発明の概要
本発明は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーやその対立変異体、その他の哺乳動物のオルソログに関連するヒトキナーゼペプチド及びタンパクのアミノ酸配列の特定に一部基づく。これら独特なペプチド配列及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒト治療対象の開発のモデルとして使用でき、治癒力のあるタンパクの同定に役立ち、ヒト治療薬剤の開発のための対象として役立つ。
【0036】
本発明のタンパクは、これらのタンパクを発現する細胞において、ヒトMas関連GPCRサブファミリーにより媒介された経路をシグナリングすることに関与するGPCRである。図1における実験データは、ヒトの赤白血病細胞と精巣での発現を示している。ここで、「信号経路」とは、リガンドのGPCRタンパクへの結合における細胞の機能/活性の変調(例えば、刺激又は抑制)を表す。そのような機能の例としては、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸 (PIP2)、イノシトール1,4,5−三リン酸 (IP3)、及びアデニル酸シクラーゼ等の信号形質導入経路に関与する細胞内分子の動員 ; 原形質膜の分極 ; 分子の産生又は分泌 ; 細胞成分の構造変化 ; DNAの合成等の細胞増殖 ; 細胞移動 ; 細胞分化 ; 及び細胞生存等を含む。
【0037】
受容体タンパクにより媒介された反応は、発現する細胞のタイプに依存する。本発明のGPCRサブファミリーの他のメンバーを発現する細胞のタイプについては、当技術においていくらかの情報がある (背景において引用された引例、及び図2に提供された近似の相同タンパクについての情報を参照。図1における実験データは、ヒトの赤白血病細胞と精巣での発現を示している)。例えばある細胞においては、受容体タンパクへのリガンドの結合は、化合物の解放、チャンネルのゲーティング、細胞付着、遊走、分化等の活性を刺激し、ホスファチジルイノシトール又は他の細胞のサイクリックAMP代謝と代謝回転を通じて、異なる結果を引き起こす。本発明の特定のGPCRにより調整された細胞の活性/応答にかかわらず、受容タンパクは、GPCRであり、GPCRを表現する細胞又は組織における生物学的工程に関与する細胞において、ホスファチジルイノシトール又はサイクリックAMP代謝と代謝回転等の様々な細胞内信号形質導入経路を通じて、1つ以上の二次信号を生成するために、G−タンパクと相互作用することが、当技術の研究者には明確にわかるであろう。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0038】
ここで、「ホスファチジルイノシトール代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸(PIP2)の代謝回転と代謝に関係する分子を意味する。PIP2は、原形質膜のサイトゾルリーフレットに発見されたリン脂質である。いくつかの細胞において、受容体へのリガンドの結合は、PIP2を加水分解し、1,2−ジアシルグリセロール(DAG)及びイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)を生成する原形質膜酵素ホスホリパーゼCを活性化する。一度成形されたIP3は、例えばIP3結合サイトを含むカルシウムチャンネルタンパク等のIP3受容体を結合できるところで、小胞体表面に放出されるかもしれない。IP3結合は、チャンネルの開放を引き起こし、カルシウムイオンの細胞質への解放を可能にする。IP3は特有なキナーゼによってリン酸化され、細胞外媒体から細胞質へのカルシウム導入を起こしうる分子であるイノシトール1,3,4,5−四リン酸(IP4)を形成する。IP3 及びIP4は後に、非常に急速に加水分解され、それぞれ不活性なイノシトール1,4−二リン酸(IP2)及びイノシトール1,3,4−三リン酸になる。これらの不活性な生成物は、PIP2を合成するために、細胞によりリサイクルされる。PIP2の加水分解により生成された他の二次メッセンジャー、すなわち1,2−ジアシルグリセロール(DAG) は、細胞膜にとどまり、ここで酵素タンパクキナーゼCを活性化させるのに役立つ。細胞の細胞質において、タンパクキナーゼCは通常可溶性であることがわかるが、細胞内のカルシウム濃縮度の上昇によって、この酵素は原形質膜に動き、ここでDAGにより活性化されることができる。種々の細胞でのタンパクキナーゼCの活性化は、グリコーゲンシンターゼのリン酸化、又はNF―kB等の様々な転写因子のリン酸化等の様々な細胞の反応を生じる。ここで、「ホスファチジルイノシトール活性」という語は、PIP2又はその代謝産物の1つの活性を表す。
【0039】
受容体が関与しうる別の信号経路は、cAMP代謝回転経路である。ここで、「サイクリックAMP代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、サイクリックAMP(cAMP)の代謝回転と代謝に関連する分子をも含む。サイクリックAMPは、一定のG−タンパク共役受容体のリガンド誘導の刺激に反応して生み出された二次メッセンジャーである。cAMP信号経路において、GPCRへのリガンドの結合は、酵素アデニルシクラーゼの活性化を引き起こし、これはcAMPの合成を触媒する。新しく合成されたcAMPは、cAMP依存タンパクキナーゼを次々に活性化する。この活性化したキナーゼは、電圧ゲートカリウムチャンネルタンパク又は関連したタンパクをリン酸化し、活動電位間においてカリウムチャンネルを開かなくする。カリウムチャンネルが開かないと、カリウムの外への流れが減少し、これは通常神経膜を再分極し、延長された膜分極を導く。
【0040】
GPCRを調整する薬剤を対象とすることによって、受容体により媒介された信号活性及び生物学的工程は、具体的な細胞及び組織において、活性化又は阻害される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。このような活性化作用及び阻害作用は、治療分野(哺乳動物療法)又は毒物分野(抗細胞療法、例えば制ガン剤)において生物学的活性を調整するための基礎として役立つ。
【0041】
発明の詳細な説明
一般説明
本発明はヒトゲノム配列決定に基づく。ヒトゲノムの配列解析及び構築において、配列情報を分析することにより、当該分野においてGPCRタンパク又はGPCRタンパクの一部であると特定されるタンパク/ペプチド/ドメインに、構造及び/又は配列の相同性を有するペプチドをコード化し、ヒトMas関連GPCRサブファミリーに関連するヒトゲノムの未知のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を利用することにより、付加的なゲノム配列が組み立てられ、転写及び/又はcDNA配列は単離され特徴付けられた。この分析に基づき、本発明は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーと関連するヒトGPCRペプチド及びタンパクのアミノ酸配列、転写配列型の核酸配列、これらのGPCRペプチド及びタンパクをコード化するcDNA配列及び/又はゲノム配列、核酸変異(対立変異体情報)、発現の組織分布、及び本発明のGPCRと構造又は配列の相同性を有する近似の公知タンパク/ペプチド/ドメインに関する情報を提供する。
【0042】
本発明において提供されるペプチドは、未知なだけでなく、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるかどうかに基づいて選択される。特に、本発明のぺプチドは、ヒトMas関連GPCRサブファミリーの公知のGPCRタンパクとの相同性及び/又は構造上の相関、及び観察される発現パターンに基づき選択される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この技術は、このタンパクファミリーのメンバー、及び本遺伝子と同様な発現型を持つタンパクのメンバーの、商業的な重要性を明確に確立した。本発明のペプチドのより具体的な機能及びその用途は、本明細書、特に発明の背景、及び図の注釈に説明されており、及び/又は公知のヒトMas関連GPCRファミリー又はGPCRタンパクのサブファミリーの技術において知られている。
【0043】
具体的な実施例
ペプチド分子
本発明は、タンパクのGPCRファミリーメンバーであり、ヒトMas関連GPCRサブファミリーであると特定され、タンパク分子をコード化する核酸配列を提供する。(タンパク配列は図2、転写/cDNA配列は図1、ゲノム配列は図3に提供される)。ここに示した明らかな変異体と同様に、図2に提供されたペプチド配列、例えば対立遺伝子変異は、本発明のGPCRペプチド、GPCRペプチド、あるいは本発明のペプチド/タンパクとしてここに参照される。
【0044】
本発明は、当技術の製造と用途におけるこれらペプチドのすべての明らかな変異だけでなく、図2に示されるGPCRペプチドのアミノ酸配列(図1の転写/cDNA配列、あるいは図3のゲノム配列の核酸分子よってコード化される)から成っているか、実質的に成っているか、又はそれを含む単離ペプチド及びタンパク分子を提供する。これらの変異は以下に詳細に説明される。
【0045】
ここでペプチドは、細胞物質、又は化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは均一に、又はある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な特徴は、調製物中に相当量の他成分が存在していたとしても、調製物がペプチドの所望の機能を発揮できるということである(単離核酸分子の特徴については以下に記述される)。
【0046】
ここで、「細胞物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約30%(乾燥重量)以下の他のタンパク(即ち汚染タンパク)、20%以下の他のタンパク、10%以下の他のタンパク、又は5%以下の他のタンパクを有するペプチド組成物を含む。ペプチドが組替えにより生産される場合、タンパク調製物の容量に対して培地が約20%以下の場合、培地を実質的に含まないとすることができる。
【0047】
「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、合成時において関与する化学前駆体又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物を含む。ある例においては、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、約30%(乾燥重量)以下の化学前駆体又は他の化学物質、20%以下の化学前駆体又は他の化学物質、10%以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は5%以下の化学前駆体又は他の化学物質を有するGPCRペプチド調製物を含む。
【0048】
単離GPCRペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製でき、それを発現するよう変異した細胞(組換体)から精製でき、或いは公知のタンパク合成手法を用いて合成できる。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。例えば、GPCRペプチドをコード化する核酸分子は、発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、タンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準的なタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【0049】
したがって、本発明は、図2で与えられたアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)からなるタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。このようなタンパクのアミノ酸配列は図2に提供される。このアミノ酸配列がタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、タンパクはそのアミノ酸配列からなる。
【0050】
本発明はさらに、図2で与えられたアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)から実質的になるタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が、例えば最終タンパク中に約1〜100の付加的な残基、典型的には約1〜20の付加的残基のように少ない付加的アミノ酸残基のみが存在する場合、タンパクは実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【0051】
本発明はさらに、図2に与えられるアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を含むタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、タンパクはこのアミノ酸配列を含む。このように、タンパクは該ペプチドのみからなることができ、又は通常そのタンパクに関連する又は非相同アミノ酸残基/ペプチド配列であるアミノ酸残基(隣接コード化配列)のような、付加的アミノ酸分子を有することもできる。このようなタンパクは、わずかな付加的アミノ酸残基を有することができ、又は数百或いはそれ以上の付加的アミノ酸を有することもできる。本発明のGPCRペプチドを含む好ましいタンパクは、成熟タンパクに自然に生じる。これらの各種タンパクを調製/単離する方法を、以下に簡潔に説明する。
【0052】
本発明のGPCRペプチドは、キメラ又は融合タンパクを形成するために非相同配列と接合することができる。このようなキメラ又は融合タンパクは、GPCRペプチドと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する非相同タンパクに作用的に結合されたGPCRペプチドを含む。「作用的に結合された」とは、GPCRペプチドと非相同タンパクとがフレーム内に融合することを示す。非相同タンパクは、GPCRペプチドのN末端又はC末端に融合されることができる。
【0053】
ここで、融合タンパクはGPCRペプチドの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドGAL融合体、ポリ−His融合体、MYC付加体、HI付加体、及びIg融合体等の酵素融合タンパクを含むがこれらに限定されない。このような融合タンパク、特にポリ−His融合体は、本発明の組替えGPCRペプチドの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞(例えば哺乳類の宿主細胞)では、タンパクの発現及び/又は分泌が非相同信号配列を用いることで増加する。
【0054】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組替えDNA技術により生産することができる。例えば、異なるタンパク配列をコードするDNAフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に配置される。他の例では、融合遺伝子は自動DNA合成を含む従来技術により合成され得る。あるいは、二つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、その後アニールし、キメラ遺伝子配列を再増幅することにより、遺伝子フラグメントのPCR増幅を行うことができる(Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology,1992を参照)。さらに、既に融合部分をコード化した多くの発現ベクターが、商業的に入手可能である(例えばGSTタンパク)。GPCRペプチドコード化核酸は、発現ベクター等へクローニングすることができるので、融合部分はGPCRペプチドにフレーム内で結合される。
【0055】
上述のように、本発明は、ペプチドの天然由来の成熟型、ペプチドの対立遺伝子/配列変異体、天然由来でない組換えによるペプチドの変異体、及びペプチドのオルソログとパラログ等の本発明のタンパクのアミノ酸配列の明らかな変異体も提供し、使用可能にする。このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク生化学の分野における公知の技術を用い、容易に生成することができる。しかしながら、変異体は、本発明以前に公開されたいずれのアミノ酸配列をも含まない。
【0056】
このような変異体は、分子技術とここに開示された配列情報を用いて、容易に特定/製造できる。さらに、このような変異体は、本発明のGPCRペプチドに相同である配列及び/又は構造に基づき、他のペプチドと容易に区別できる。相同性/同一性の程度は、第一にペプチドが機能的変異体であるか非機能的変異体であるか、パラロググループに存在する分化量、及びオルトログ間の進化的相違に基づき判断される。
【0057】
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性%を決定するために、配列は最適な比較をするように並べられる(例えば、最適配列のため、ギャップは第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方あるいは両方に導入され、非相同配列は比較のため無視し得る)。好ましい例においては、参照配列の長さの30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%以上が比較のため並べられる。対応するアミノ酸配置あるいはヌクレオチド配置に対応したアミノ酸残基あるいはヌクレオチドが比較される。第一配列の配置が、第二配列の対応した配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、分子はその位置で同一である(ここで、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である)。2つの配列間の同一性%は、配列において共有される同一位置の数に相関があり、ギャップ数と各ギャップの長さを考慮し、ギャップは2つの配列の最適配置に導入される必要がある。
【0058】
2つの配列間の配列比較と、同一性%と類似性の定量は、数学的アルゴリズムを使って遂行できる。(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).好ましい例において、2つのアミノ酸配列の同一性%は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに装着されたNeedleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444−453 (1970))アルゴリズム(http://www.gcg.comより入手可)を用い、Blossom 62 matrix又はPAM250 matrix、及び16,14,12,10,8,6,4のギャップ重量、及び1,2,3,4,5又は6の長さ重量の両者を用いて決定される。さらに別の好ましい例において、2つのヌクレオチド配列の同一性%は、GCGソフトウェアパッケージ(Devereux,J.,et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984)(http://gcg.comより入手可))を用い、NWSgapdna.CMPマトリックス及び40,50,60,70又は80のギャップ重量、及び1,2,3,4,5,又は6の長さ重量を用いて決定される。異なる例において、2つのアミノ酸あるいはヌクレオチド配列の同一性%は、ALIGNプログラム(version 2.0)に装着されたE.Myers and W.Miller(CABIOS,4:11−17(1989))アルゴリズムを用い、PAM120重量残基テーブル、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを用いて決定される。
【0059】
本発明の核酸及びタンパクの配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を特定するために配列データペースに対する調査を行う「クエリー配列」として用いることができる。このような調査は、Altschul,et al(J.Mol.Biol.215:403−10(1990))のNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)を用いて行われる。BLASTヌクレオチド調査は、NBLASTプログラムにより行われ、スコア=100、ワードレングス=12で、本発明の核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク調査は、XBLASTプログラムを用い、スコア=50、ワードレングス=3で、本発明のタンパクに相同であるアミノ酸配列性を得ることができる。比較目的のためのギャップ配列を得るため、Altschul et al.(Nucleic Acid Res.25(17):3389−3402(1997))に記載されているGapped BLASTを用いることができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを用いる場合、対応プログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)の規定パラメータを用いることができる。
【0060】
成熟処理型(mature processed forms)と同様、本発明のペプチドの一つを含むタンパクの全長処理前型(full−length pre−processed forms)は、ここで提供される本発明のGPCRペプチドと同じ遺伝子位置によってコード化されるだけでなく、本発明のGPCRペプチドの一つと完全配列同一性を有するものとして、容易に特定できる。図3のデータに示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされた。
【0061】
本発明のGPCRペプチドの対立変異体は、ここで提供されるGPCRペプチドと同じ遺伝子位置でコード化されたものと同様、少なくともGPCRペプチドの部位で配列相同性/同一性の高い程度(重大な)を有するヒトタンパクとして容易に確認される。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマップされたゲノム配列のように、図3で提供される遺伝子情報に基づき容易に決定される。図3のデータに示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされた。
【0062】
ここで、2つのタンパク(あるいはタンパクの領域)は、アミノ酸配列が典型的には少なくとも約70〜80%、80〜90%、及びより典型的には少なくとも約90〜95%あるいはそれ以上の相同性を有するとき、強い相同性を有するとする。強い相同性を有するアミノ酸配列は、本発明によれば、より詳細には以下に示されるストリンジェント条件下で、核酸分子をコード化するGPCRペプチドに対してハイブリダイズされる核酸配列によりコード化される。
【0063】
GPCRペプチドのパラログは、少なくともGPCRペプチドの領域に対し、強い配列相同性/同一性の程度を有し、ヒト遺伝子によりコード化される、また同様の活性又は機能を有することが容易に確認できる。アミノ酸配列が典型的には少なくとも約60%以上、より典型的には約70%以上、与えられた領域あるいはドメインに相同性を有する場合、2つのタンパクは典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された核酸分子をコード化するGPCRペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【0064】
GPCRペプチドのオルトログは、少なくともGPCRペプチドの領域に対し、強い配列相同性/同一性の程度を有し、他の生物の遺伝子にコード化されることが容易に確認できる。好ましいオルトログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒト治療対象及び薬剤として開発される。このようなオルトログは、詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された、核酸分子をコード化するGPCRペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化され、タンパクを産生する2つの生物の相関性の程度に依存する。
【0065】
本発明のGPCRペプチドの天然由来でない変異体は、組換え技術を用いて容易に調製することができる。このような変異体は、GPCRペプチドのアミノ酸配列の削除、付加、置換を含むがこれに限られない。例えば、置換の1種として、維持アミノ酸置換が挙げられる。これらの置換は、近似した性質を有する他のアミノ酸によりGPCRペプチドのアミノ酸を置換するものである。維持置換は、脂肪族アミノ酸Ala,Val,Leu及びIle間の一方から他方への置換;ヒドロキシル残基Ser及びThrの交換;酸性残基Asp及びGluの交換、アミド残基Asn及びGln間の置換;塩基性残基Lys及びArgの交換;及び芳香族残基Phe及びTyr間の置換に典型的に認められる。いずれのアミノ酸置換が表現型的に能動的でないかに関する指針は、Bowie et al., Science 247:1306−1310(1990)に記載されている。
【0066】
変異体GPCRペプチドは完全に機能することもあり、あるいは例えばリガンド結合能、Gタンパク結合能、信号調整能等の1つ以上の活性において機能を失うこともある。完全に機能する変異体は、典型的には維持変異あるいは非致命的残基又は非致命的領域の変異を含む。図2はタンパク分析の結果を提供し、致命的ドメイン/領域の特定に用いることができる。機能的変異体は、変化のない、あるいは変化が機能上重要ではない近似アミノ酸の置換を含む。あるいは、このような置換はある程度、プラス又はマイナスに作用する。
【0067】
非機能的変異体は、典型的には、1つ以上の非維持的アミノ酸置換、欠失、挿入、転化、移動、又は致命的残基あるいは致命的領域における置換、挿入、転化又は欠失を含む。
【0068】
機能に必須なアミノ酸は、特定部位の変異誘発あるいはアラニンスキャニング変異誘発(Cunningham et al., Science 244:1081−1085(1989))等の当該分野で公知の方法によって特定され、特に図2に示す結果が用いられる。後者の手法は分子のすべての残基において1つのアラニン変異を導入するものである。得られた変異分子は、リガンド/効果基分子結合等の生物学的活性あるいはin vitroの延命活性等の活性について試験される。リガンド受容体結合に重要な位置は、また、結晶化、核磁気共鳴又は光学親和性標識(Smith et al., J.Mol.Biol.224:899−904(1992)); de Vos et al. Science 255:306−312(1992)) 等の構造分析により決定できる。
【0069】
本発明はさらに、GPCRペプチドのフラグメントを提供し、このフラグメントを含む及びこのフラグメントからなるタンパク及びペプチドに加えて、特に図2に特定される残基を含むフラグメントが含まれる。しかしながら、本発明が関連するフラグメントは、本発明以前に公知のフラグメントを含まない。
【0070】
ここで、フラグメントは、GPCRペプチドの少なくとも8,10,12,14,16あるいはそれ以上の隣接アミノ酸残基を含む。このようなフラグメントは、GPCRペプチドの生物学的活性の一つ以上を有する能力に基づき選択され、あるいは、例えばリガンドや効果基に結合する能力又は抗原として働く能力などにより選択される。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、ペプチドは、例えば8あるいはそれ以上のアミノ酸長を有する。このようなフラグメントは、典型的には活性部位、Gタンパク結合部位、貫膜ドメイン、あるいはリガンド結合ドメイン等の、GPCRペプチドのドメインあるいはモチーフを有する。さらに、可能なフラグメントは、フラグメントを含むドメインあるいはモチーフ、可溶性ペプチドフラグメント、及び抗原構造を有するフラグメントを含むが、これに限定されない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者に容易に利用可能な、よく知られたコンピュータプログラム(例えばPROSITE analysis)により容易に特定可能である。このような分析の一つの結果は図2に示されている。
【0071】
ポリペプチドは、20天然由来アミノ酸と通常呼ばれる20個のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、加工や翻訳後修飾等の天然の過程、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。GPCRペプチドに天然に起こる典型的な修飾は、基本テキスト、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている (図2において、これらの機能のいくつかが特定される)。
【0072】
知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパクへの転移RNA媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【0073】
従って、本発明のGPCRペプチドは、置換アミノ酸残基が、遺伝コードによってコード化されたものではない誘導体又は類似体、置換基が含まれる誘導体又は類似体、成熟GPCRペプチドが、GPCRペプチドの半減期を増加させる化合物(例えばポリエチレングリコール)等の別の化合物により融合されている誘導体又は類似体、あるいは付加的なアミノ酸が、リーダー又は分泌性の配列、成熟GPCRペプチド又はプロタンパクの精製のための配列等の成熟GPCRペプチドに融合した誘導体又は類似体も含む。
【0074】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に非常に詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びADPリボシル化はほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Proteins−Structure AND Molecular Properties, 2ndEd., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York(1993)が挙げられる。この主題についての多くの詳細な評論が入手でき、例えば Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnston, Ed., Academic Press, New York 1−12(1983);Seifter et al.(Meth. Enzymol. 182:626−646(1990)) AND Rattan et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48−62(1992))が挙げられる。
【0075】
タンパク / ペプチドの使用
本発明のタンパクは、抗体を引き起こす又は別の免疫反応を誘発するため;生物的液体のタンパク(又はその結合相手又は受容体)のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬(ラベル試薬を含む)として;対応したタンパクが優先的に発現される組織(形成的に、組織の分化又は発達の特別な段階において、あるいは病気の状態において)のマーカーとして;図及び背景に提供された機能的な情報と関連した実質的及び特異的なアッセイにおいて使われうる。タンパクが、別のタンパクに結合する又は潜在的に結合する所(例えば、受容体リガンド相互作用等において)では、タンパクを、結合相手を特定するために使用し、結合相互作用の阻害剤を特定するシステムを発達させることができる。これらの一部又は全ての用途を調査することにより、商業製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。
【0076】
上記の使用を達成するための方法は、当業者によく知られている。このような方法を示す文献には、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, や ”Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987 等がある。
【0077】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパクの種類/作用と同様にタンパク源に基づく。例えば、ヒトから単離されたGPCR及びそれらのヒト/哺乳動物オルソログは、特にGPCRを発現する細胞又は組織における生物学的又は病理学的反応を調整するための哺乳動物の治療剤、例えばヒトの薬剤に使用する特定試薬の対象として役立つ。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。すべての薬剤の約70%が、GPCR活性を調整する。無脊椎動物と哺乳動物オルソログの組合せは、無脊椎動物に特異的な薬剤を発見する選択的なスクリーニング方法において使用できる。背景や図における構造及び機能的な情報により、特に図1の発現情報との組み合わせにおいて、本発明の分子の明確で現実的な用途が提供される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。このような用途は、当技術及び規定の実験において知られたここに提供された情報を使ってすぐに決定できる。
【0078】
本発明のタンパク(本発明より先に明らかにされた変異とフラグメントを含む)は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーのメンバーと関連するGPCRと関連した生物学的アッセイに有益である。このようなアッセイは、公知のGPCR機能又は活性、あるいは、特にこの受容体を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属しているGPCRサブファミリーに特異的であるGPCR関連症状の診断と治療に有用な特性のいずれかに関係する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0079】
本発明のタンパクは、細胞系、又は無細胞系の薬剤スクリーニングアッセイにおいても有益である。細胞系は、天然型、すなわち受容体タンパクを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。他の実施例では、細胞ベースアッセイは受容タンパクを発現する組換えの宿主細胞を含む。
【0080】
ポリペプチドは、自然状態でタンパクの受容体活性を変調する化合物、又は受容体に関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型を特定するために用いることができる。本発明のGPCRと、適切な変異体及びフラグメントは、受容体への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするためのハイスループットスクリーンにおいて使用することができる。
【0081】
これらの化合物は、これらの受容体活性に対する化合物の影響を判定するために、機能性受容体に対してさらにスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性/効果を判定する試験することができる。化合物は、受容体を望ましい程度までに活性化(アゴニスト)又は不活性化(アンタゴニスト)すると特定される。
【0082】
さらに、本発明のタンパクは、受容体タンパクと、通常受容体タンパクと相互作用する分子(例えば、Gタンパク、あるいはcAMP又はホスファチジルイノシトール代謝回転及び/又はアデニル酸シクラーゼ、又はホスホリパーゼC活性化に関連する他の相互作用分子)との相互作用を促進又は抑制する能力により、化合物をスクリーンするために使用できる。このようなアッセイは一般的には、受容体タンパク又はフラグメントが対象分子と相互作用する条件下で、受容体タンパクと候補化合物とを結合する工程を含み、タンパクと対象との複合物の構成を検出する、あるいはGタンパクリン酸化、cAMP又はホスファチジルイノシトール代謝回転、アデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼC活性化等の信号伝達関連の効果等の受容体タンパクと対象と相互作用の生化学的結果を検出する。
【0083】
候補化合物には、例えば、1)最後部がIgの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリー(例えばLam et al., Nature 354:82−84(1991); Houghten et al., Nature 354:84−86(1991))や、D型及び/又はL型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド;2)ホスホペプチド(例えばランダムあるいは部分的変質したホスホペプチドライブラリー(例えばSongyang et al., Cell 72:767−778(1993) 参照)のメンバー); 3)抗体(例えば、Fab,F(ab‘)2、Fab発現ライブラリーフラグメント、抗体のエピトープ結合フラグメントだけでなく、ポリクロナール、モノクロナール、ヒューマナイズド、抗イディオティピック、キメラ、及び単一鎖抗体);及び4)小有機及び無機分子(例えば組み合わせ及び天然産物ライブラリーから得られる分子)等が例示的に含まれる。
【0084】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼすキナーゼを含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。従って、発明にはリガンドに競合するフラグメントは、例えばより高い親和性を持ち、又はリガンドを結合するが解放しないフラグメントが含まれる。
【0085】
本発明はさらに、受容体活性を変調(促進又は阻害)する化合物を同定するための、他の末端アッセイを含む。このアッセイは、一般的に受容体活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、増殖等の細胞工程、及び受容体タンパク依存信号カスケードに応答して上向き又は下向き調整される遺伝子発現の変化がアッセイされる。1実施例においては、このような遺伝子の規定領域は、発光酵素等の容易に発見できるマーカーに操作可能に接続できる。
【0086】
受容体により調整された生物学又は生化学の機能のうちのいずれもが、末端アッセイとして使われうる。これらは、ここに記載され、ここに文献が参照され、これら末端アッセイの対象に関する文献に参照され、及び当業者が知る他の機能あるいは図、特に図2に提供される情報により容易に特定される機能による生化学的、あるいは生化学/生物学的挙動のすべてを含む。特に、キナーゼを発現する細胞又は組織の生物学的機能が試験できる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0087】
結合及び/又は活性化化合物は、キメラキナーゼタンパクを用いスクリーニングすることができ、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、貫膜ドメイン全体又は一部(例えば7種の貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ)、及びカルボキシ末端細胞内ドメイン又はその一部は、非相同ドメイン又はサブレジオンに置換されうる。例えば、Gタンパク結合領域は、異なるGタンパクと相互作用し、天然受容体により認識されるものとして用いることができる。従って、信号転換要素の異なる組は活性化のエンドポイントアッセイに有用である。あるいは、全体の貫膜部分又はサブ領域(貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ等の)は、アミノの末端細胞外ドメイン及び/又はGタンパク結合領域が誘導される宿主細胞とは異なる宿主細胞に特有な全体の貫膜部分又はサブ領域と交換できる。これは、受容体が誘導される特定宿主細胞以外で行われるアッセイを可能とする。あるいは、アミノの末端細胞外ドメイン(及び/又は他のリガンド結合領域)は、異なるリガンドに結合するドメイン(及び/又は、他の結合領域)に交換可能であり、これにより、非相同アミノ末端細胞外ドメイン(又は領域)と相互作用するが、信号形質導入を起こすテスト化合物にアッセイを提供する。最後に、活性化は、天然の信号形質導入経路の一部である転写規定配列と操作可能に結び付けられた容易に発見できるコード化領域を含むレポーター遺伝子により検出できる。
【0088】
本発明のタンパクは、受容体と相互作用する化合物を発見するために設計された方法である競合結合アッセイに有用でもある。従って、ポリペプチドに結合又は相互作用することができる条件下で、化合物は受容体ポリペプチドに接触する(Hodgson, Bio/technology, 1992, Sept 10(9);973−80)。可溶性受容体ポリペプチドも混合物に加えられる。被検化合物が可溶性受容体ポリペプチドと相互作用する場合には、受容体対象から形成される複合物の量、あるいは活性が減少する。この種のアッセイは、特に受容体の特定領域に相互作用する化合物を探索する場合に有用である。そして、本発明の対象受容体領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象の領域に対応するペプチド配列を含むよう設計される。
【0089】
無細胞薬剤のスクリーニングアッセイを行うため、受容体タンパク又はフラグメント、あるいはその対象分子を免疫化することが好ましい場合があり、アッセイの自動化を可能とするだけでなく、タンパクの1つあるいは両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化する。
基質上のタンパクを免疫化する技術は、薬剤スクリーニングアッセイに用いられる。ある例において、融合タンパクは、タンパクが基質に結合することを可能にするドメインを付加するものである。例えば、グルタチオン−S−トラスフェラーゼ融合タンパクは、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis,MO)、又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞ライセート(lysates)(例えば35S−labeled)、対象化合物、又は複合物形成条件(例えば、塩及びpHの生理学的条件)下で培養された混合物と結合する。培養に続いて、ビーズは、結合していない標識を除くため洗浄され、基質は免疫化され、放射性ラベルが直接測定され、あるいは複合物を解離した後上澄みを測定する。あるいは、複合体は基質から解離され、SDS−PAGEにより分離され、ビーズ断片中に見出される受容体結合タンパクのレベルを、標準的な電気泳動技術によりゲルから定量する。例えば、ポリペプチドあるいはその対象分子のいずれかは、周知の方法により、ビオチン及びストレプトアビジンの共役を用いて免疫化する。あるいは、タンパクと反応するが該タンパクが対象分子と結合することを妨げない抗体をプレートのウェルに誘導し、抗体結合によりタンパクをウェルに取り付ける。受容体結合タンパク及び候補化合物の組成物は、受容体タンパク存在ウェル中で培養され、ウェルに取り付けられた複合物の量を定量することができる。このような複合体の検出方法としては、GST固定複合体による前述の方法に加えて、受容体タンパク対象分子に反応性のある抗体、又は、キナーゼタンパクに反応性があり対象分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及び対象分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【0090】
本発明のGPCRの一つを調整する薬剤は、上記アッセイの1つ以上を単独あるいは組み合わせて用いることで特定することができる。一般的には最初に細胞系又は無細胞系を用い、その後動物又は他のモデル系で活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は当技術において周知であり、この記載において容易に用いることができる。
【0091】
このような薬剤スクリーニングアッセイよって特定される受容体タンパク活性の変調剤は、受容体を発現する細胞又は組織を扱うことにより、受容体経路の異常制御の患者を治療するのに用いることができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。これらの治療方法は、医薬組成物中のGPCR活性の変調剤を治療に必要な量、患者に投与する工程を含み、変調剤はここに記載されたように特定されたものである。
【0092】
本発明の他の形態において、GPCRタンパクは、ツーハイブリッドアッセイあるいはスリーハイブリッドアッセイにおいて「バイトタンパク」として用いることができ(例えばU.S.Patent No.5,283,317;Zervos et al.(1993)Cell 72:223−232;Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.268:12046−12054;Bartel et al.(1993) Biotechniques 14:920−924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693−1696; 及びBrent WO94/10300参照)、GPCRと結合あるいは相互作用しGPCR活性に関与する他のタンパクを特定する。このようなGPCR結合タンパクは、GPCRタンパク、又はGPCR媒介信号経路の下流因子等のGPCR対象による信号伝達に関与している。このようなGPCR結合タンパクは、GPCR阻害剤であることがある。
【0093】
ツーハイブリッド系は、分離可能なDNA−結合及び活性化ドメインからなる多くの転写因子の変調性に依存する。簡潔に言えば、このアッセイは2つの異なるDNA構造を利用する。1つの構造においては、GPCRタンパクをコードする遺伝子は、公知の転写因子(例えばGAL−4)のDNA結合ドメインをコード化する遺伝子に融合されている。他方の構造においては、DNA配列ライブラリーから得られ、未知のタンパク(「prey」又は「sample」)をコード化しているDNA配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。 「bait」及び「prey」タンパクは相互作用が可能であり、in vivoでGPCR依存複合体を形成し、転写因子のDNA−結合及び活性化ドメインは近接する。この近接は、転写因子に応答する転写制御サイトへ動作可能に結合するリポーター遺伝子(例えばLacZ)の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能性転写因子を含む細胞コロニーが単離され、GPCRタンパクと相互作用するタンパクをコード化するクローン化遺伝子を得るのに用いることができる。
【0094】
本発明はさらに前記スクリーニングアッセイにより特定される新規薬剤に関する。従って、ここで記述された特定薬剤を適当な動物モデルで使用することも本発明の範囲内である。例えば、ここで記述された特定薬剤(例えば、GPCR調整薬剤、アンチセンスGPCR核酸分子、GPCR特異的抗体、あるいはGPCR結合対象)は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤で処理した場合の有効性、毒性、あるいは副作用を判定するために用いることができる。あるいは、ここで記述された特定薬剤は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤の挙動機構を判定するために用いることができる。さらに本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【0095】
本発明のGPCRタンパクは、また、ペプチドにより調整される疾患又は疾患の傾向を診断する対象を提供するのに有効である。従って本発明は、細胞、組織、又は生体中でのタンパク(あるいはコード化したmRNA)の存在又は程度を検出する方法を提供する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この方法は、生物サンプルと、受容体タンパクとの相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのようなマルチディテクション形態で提供される。
【0096】
サンプル中のタンパクを検出するある薬剤は、タンパクと選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルは、患者から単離した組織、細胞、及び生物的液体、同様に患者中の組織、細胞及び生物的液体を含む。
【0097】
本発明にかかるペプチドは、また、変異ペプチドを有する患者の活性タンパクの活性度、疾患、疾患の傾向、特に本発明のタンパクが属するタンパクグループの他のものにおいて知られている活性及び状態を診断する対象を提供する。そして、生物サンプルからペプチドを単離することができ、変異ペプチドを生じる遺伝子変異の存在をアッセイすることができる。これはアミノ酸置換、欠失、挿入、再配置(異常組織挙動の結果)、及び適当でない転写後変異を含む。分析方法は、変更された電気泳動、変更されたトリプティックペプチド消化、細胞系あるいは無細胞における変更された受容体活性のアッセイ、リガンドあるいは抗体結合パターンの変化、変化した当電点、直接アミノ酸配列、及びその他のタンパク中の変異を検出するのに有用な公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、シングル検出形態、あるいは抗体チップアレイのようなマルチ検出形態に適用できる。
【0098】
ペプチドのIn vitro検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISAs)ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ペプチドは、ラベルされた抗ペプチド抗体あるいは他種の検出薬剤を対象中に導入し、対象中でin vitroで検出することができる。例えば、抗体は放射性のマーカーによりラベルすることができ、その対象中における存在及び分布は標準的なイメージ化技術により検出することができる。対象中に発現されたペプチドの対立変異体の検出方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントの検出方法は、特に有用である。
【0099】
ペプチドはまた、薬理学的分析に有用である。薬理学では、変更された薬剤位置による薬剤への反応、及び影響されたヒトの異常挙動において、臨床的に重要な遺伝変異態を扱う。例えばEichelbaum,M.(Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10−11):983−985(1996))、及びLider, M.W.(Clin.Cem.43(2):254−266(1997))を参照。これらの変異体から生じる臨床結果は、個人の代謝の変動により、ある個人に対しては治療用薬剤の重篤な毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗となる。そして、個人の遺伝子型は、体への治療薬剤の作用、あるいは薬剤の体内代謝を決定する。さらに、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤挙動の強度と存続期間の両方に影響を与える。そして、個人の薬理学は、個人の遺伝子型に応じて、予防あるいは治療処置に効果的な薬剤及び効果的な薬剤の投与量の選択を可能とする。ある薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見は、なぜある患者に対しては期待された薬剤効果が得られず、または過大な薬剤効果を示し、あるいは標準的な薬剤投与量において重大な毒性を示すのかを明らかにするものである。多型は、強い代謝表現型と弱い代謝表現型とで表現される。従って、遺伝子多型は、ある集団に見られる受容体機能の1つ以上が他の集団のものとは異なり、受容体タンパクの対立タンパク変異体を導き出すものと思われる。よってペプチドは、治療方法に影響を与える遺伝子配置を確かめる対象となる。よってリガンドベース治療において、多型は、リガンド結合で多少能動的であるアミノ末端細胞外ドメイン及び/又は他のリガンド結合領域に起こり受容体を活性化する。従って、リガンド投与量は、多型を含む集団に対する治療効果を最大とするように調整されることが必要である。遺伝子型の代わりに特定の多型ペプチドを特定することもできる。
【0100】
ペプチドはまた、タンパクの発現の欠如、不適切あるいは不必要な発現により特徴づけられる異常を治療するためにも有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。従って治療方法は、GPCRタンパクあるいはフラグメントの使用も含むものである。
【0101】
抗体
本発明はまた、その変異やフラグメントだけでなく、本発明のペプチド及び該ペプチドのフラグメントを含むタンパクの一つに、選択的に結合する抗体を提供する。ここで抗体は、対象ペプチドと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない場合、選択的に対象ペプチドと結合する。抗体は、それが対象ペプチドと実質的に同種ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、そのタンパクが抗体の対象ペプチドのフラグメント又はドメインと同一性を共有する限り、選択的にペプチドと結合するとみなされる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【0102】
ここで抗体は、当技術において認識されるものと一致する用語で定義される:それらは、抗原の攻撃に応答して哺乳類生物により生産された、マルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、Fab又はF(ab’)2、及びFvフラグメント等の抗体のフラグメントだけでなく、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体も含むがこれに限定されない。
【0103】
与えられた対象ペプチドに対する抗体を生成及び/又は特定する多くの方法が知られている。このような方法の幾つかは、Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,(1989)に記述されている。
【0104】
一般的に、抗体を生成するには、単離されたペプチドを免疫原として用い、これを哺乳動物、例えばラット、ウサギあるいはマウスに投与する。全長タンパク、抗原ペプチドフラグメント又は融合タンパクを使用することができる。特に重要なフラグメントは、図2に特定されるような機能性ドメインをカバーするものであり、また相同配列又はグループの中での分化配列のドメインであり、これらはタンパク配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示される。
【0105】
抗体は、好ましくはGPCRタンパクの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能/活性、及び/又は受容体/結合相手相互作用を伴う領域を含む。配列整列により維持された特有の配列フラグメントを特定できるので、図2により特に重要な領域を特定することができる。
【0106】
抗原性フラグメントは通常、少なくとも8個の隣接アミノ酸残基を含む。しかしながら、該抗原性ペプチドは、少なくとも10、12、14、16又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域のようなタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメントのような、物理的性質により選択され得る、又は特有の配列に基づき選択され得る(図2を参照)。
【0107】
本発明の抗体の検出は、抗体を検知可能な物質へ共役(即ち、物理的な結合)させることにより行うことができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる;適当な補綴基複合物の例としては、ストレプタビジン/ビオチン、及びアビジン/ビオチンが含まれる;適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる;発光物質の例としては、ルミノールが含まれる;バイオ発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、125I、131I、35S、又は3Hが含まれる。
【0108】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術により、本発明のタンパクの一つを単離するために使用することができる。抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組替え的に生産されたタンパクからの、天然タンパクの精製を容易にすることができる。さらにこの抗体は、通常の発達の進行に渡って、生物の様々な組織間におけるタンパクの発現のパターンを決定するため、細胞又は組織中における該タンパクの存在を検知するのに有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。さらにこの抗体は、発現の豊富さ及びパターンを評価するために、in situ、in vitro、又は細胞溶解液あるいは上澄み中におけるタンパクを検知するために使用することができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行間における、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパクの循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を特定するために使用することができる。
【0109】
さらに抗体は、タンパク機能に関連した疾患の活性段階、又は該疾患素因を持つ個人等の、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現/加工された型により引き起こされる場合、抗体は通常のタンパクに対して調製することができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。もし変調がタンパクの特異的な変異により特徴付けられる場合には、この変異タンパクに特異的な抗体を、特異的な変異タンパクの存在のアッセイに使用することができる。
【0110】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用することができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニターするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療効率をモニターするために使用することができる。
【0111】
さらに、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を特定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常タンパクのための免疫的マーカーとしての診断にも有用である。
【0112】
この抗体は、組織分類のためにも有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。従って、特異的なタンパクが特異的な組織の発現と関係している場合、このタンパクに特異的な抗体は、組織タイプを特定するために使用できる。
【0113】
抗体は、タンパク機能の阻害、例えば、リガンド等の結合相手へのGPCRタンパクの結合の阻害にも有用である。これらの使用は、タンパクの機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば結合を阻害し、これによりペプチドの活性を変調(作動又は拮抗)するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞あるいは細胞膜と関連する完全なタンパクに対して調製することができる。構造の情報としては、本発明のタンパクと関連する図2を参照。
【0114】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包む。このキットは、ラベル化又はラベル可能な抗体の等の抗体、及び生物サンプル中のタンパクを検知するための化合物又は試薬;サンプル中のタンパクの量を決定する手段;サンプル中のタンパクの量を基準と比較する手段;及び使用のための手引きを含むことができる。このようなキットは、単一のタンパク又はエピトープを検出するために供給される、あるいは抗体検出アレイ等において多数のエピトープのうちの1つを検出するために設定される。核酸アレイについてのアレイが以下に詳細に記述されるが、同様な方法が抗体アレイにも開発されている。
【0115】
核酸分子
本発明はさらに、本発明にかかるGPCRペプチド又はタンパクをコード化する単離核酸分子を提供する(cDNA、転移、及びゲノム配列)。該核酸分子は、本発明のGPCRペプチドの1つ、その対立変異体、又はそのオルソログあるいはパラログをコード化するヌクレオチド配列からなるか、本質的に該ヌクレオチド配列からなるか、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【0116】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムDNA中で核酸のフランキング配列(すなわち、5’、及び3’末端に位置する配列)は含まない。しかしながら、例えば、約5KB、4KB、3KB、2KB又は1KB以上又はこれ以下の、フランキングヌクレオチド配列があり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が離れた重要でないフランキング配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【0117】
さらに、転写/cDNA分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【0118】
例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は単離されていると考えられる。単離DNA分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えDNA分子、又は溶液中の精製(部分的に又は実質的に)されたDNA分子が挙げられる。単離RNA分子は、in vivo、又はin vitroでの本発明の単離DNA分子のRNA転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【0119】
従って、本発明は、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)よりなる核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【0120】
本発明はさらに、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)より実質的になる核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。このようなヌクレオチド配列が、ごくわずかの付加核酸残基とともに、最終的な核酸分子中に存在するとき、核酸分子はヌクレオチド実質的に配列から成る。
【0121】
本発明はさらに、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)を含む核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である核酸配列である時、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子は少しの付加的ヌクレオチドを有する、あるいは数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして製造され/単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【0122】
図1,3には、コード化及び非コード化配列の両方が提供されている。本発明のヒトゲノム配列(図3)、及びcDNA/転写配列(図1)により、図中の核酸分子は、ゲノムイントロニック配列、5´及び3´非コード化配列、遺伝子規定領域、及び非コード化相互ゲノム配列を含むことがある。一般的には、このような配列特徴は図1か3のどちらかに表示されており、当技術分野で知られている計算機を使って容易に特定できる。以下に述べられるように、いくつかの非コード化領域、特にプロモーターのような遺伝子特定要素は、例えば、非相同遺伝子発現の変調、化合物を変調する遺伝子活性を特定する対象として様々な目的に有用であり、ここに与えられるゲノム配列のフラグメントとして特に要求される。
【0123】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸(例えば成熟形態が1つ以上のペプチド鎖を有する場合)をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、アッセイ又は製造の際のタンパク操作の効率化、あるいは他の事由に役割を果たす。一般にin situの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【0124】
上記のように、単離核酸分子は、GPCRペプチドのみをコード化する配列、主又は副配列(例えばpre−pro 又はpro−タンパク配列)等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化5´及び3´配列のような転写はされるが翻訳はされず、転写、mRNA処理(スプライシング及びポリアデニル化信号を含む)、リボゾーム結合及びmRNAの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【0125】
単離核酸分子は、mRNAのようなRNA形態、あるいはcDNA及びクローニング又は化学合成技術又はこれらの組み合わせで得られたゲノムDNAを含むDNA形態でありえる。核酸、特にDNAは二重鎖又は一重鎖でありえる。一重鎖核酸はコード鎖(センス鎖)又は非コード鎖(アンチセンス鎖)でありえる。
【0126】
本発明はさらに、先に述べた本発明のGPCRタンパクの明らかな変異をコード化する核酸分子だけでなく、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、対立変異体(同じ位置)、パラログ(異なる位置)、オルソログ(異なる生物)等の天然に由来する、又はDNA組換え法あるいは化学合成により構成される。このような天然に由来しない変異は、核酸分子、細胞、又は生物に適用されるものを含む変異誘発技術により作られる。よって、上記のように、変異はヌクレオチドの置換、欠失、転化、及び挿入を含む。変異はコード化領域、非コード化領域の一方あるいは両方に起こりうる。変異は維持又は非維持アミノ酸置換を作る。
【0127】
本発明はさらに図1及び3に示される核酸分子の非コード化フラグメントを提供する。好ましい非コード化フラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が挙げられるが、これに限定されない。このようなフラグメントは非相同遺伝子発現を調整し、遺伝子変調薬剤を特定するスクリーンを発現するのに有用である。
【0128】
フラグメントは、12又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも30,40,50,100,250,又は500のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動領域をコード化し、又はDNAプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。ラベルされたプローブは、コード領域に対応する核酸を単離するcDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、又はmRNAをスクリーニングするために用いることができる。さらにプライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするPCR反応を用いることができる。
【0129】
プローブ/プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約12,20,25,40,50又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるストリンジェント条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【0130】
オルソログ、ホモログ、及び対立変異体は、当技術においてよく知られている方法により特定できる。ペプチドの項で記載したように、これらの変異体はペプチドをコードする核酸配列を含み、図面に示された核酸配列あるいはこの配列のフラグメントに対し、典型的には60〜70%、70〜80%,80〜90%、及びより典型的には90〜95%あるいはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図に記載されたヌクレオチド配列あるいはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるものとして、容易に特定することができる。対立変異体は遺伝子をコード化する遺伝子座により容易に決定することができる。
【0131】
図3に示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。
【0132】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも60〜70%の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約60%、少なくとも約70%、又は少なくとも約80%以上の相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、約45℃において6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でハイブリダイズし、続いて50〜65℃において、0.2XSSC、0.1%SDSで一回以上洗浄するという条件である。低いストリンジェントハイブリダイズ条件へ加減する例は、当技術においてよく知られている。
【0133】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、マッピング試薬、発現調整試薬及び生物学的アッセイに有用である。核酸分子は、図2に表現されたペプチドをコード化する全長cDNAとゲノムクローンを単離するため、及び図2に示すペプチドと同じ又は関連したペプチドを生成する変異体(対立遺伝子、オルソログ等)に関連するcDNAとゲノムクローンを単離するための、mRNA、転写/cDNA、及びゲノムDNAへのハイブリダイズプローブとして有益である。
【0134】
プローブは、図に示した核酸分子の全長にわたって、いずれかの配列にも対応することができる。従って、それは5´非コード化領域、コード化領域、及び3´非コード化領域から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【0135】
核酸分子は、PCRによる核酸分子のいずれかの与えられた領域のプライマーとして有用であり、また、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子の合成に有用である。このような分子は遺伝子分類やマッピング実験に有用であり、特にプローブ領域が、ここに表された対立変異体の1つ又はそれ以上を含む時に有用である。
【0136】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び/又は遺伝子生成物の発現状態をin situで変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について1以上の特に変異を引き起こすコード化領域に相同的に組換えることができる。
【0137】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部位を示すのにも有用である。
また、核酸分子は、in situハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体位置を決定するためのプローブとして有用である。図3に示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。
【0138】
核酸分子はまた、以下に詳しく説明するように、本発明の核酸分子の遺伝子特定領域を含むベクターを作るのに有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のmRNAに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
【0139】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【0140】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはDNA又はRNAで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で、発現及び/又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、GPCRタンパクの発現が増加又は減少することを含む異常の診断に等価である。
【0141】
mRNAの検出のin vitro技術は、ノーザンハイブリダイズ及びin situハイブリダイズを含む。DNA検出のin vitro技術は、サザンハイブリダイズ及びin situハイブリダイズを含む。
【0142】
プローブは、GPCRタンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の受容体コード化核酸、例えばmRNA又はゲノムDNAのレベルを測定すること、又は受容体遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0143】
核酸発現アッセイは、特に受容体を発現する細胞又は組織でのGPCR核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【0144】
従って、本発明により、GPCR遺伝子の核酸発現に関連した異常、それを表現する細胞及び組織において、GPCRにより媒介される特別な生物学的および病理学的工程を処置するために使用できる化合物の特定のための方法が提供される。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この方法は、典型的にはGPCR核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくないGPCR核酸の発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞系及び無細胞系で行うことができる。細胞系のアッセイは、GPCR核酸を自然に発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【0145】
GPCR核酸発現のためのアッセイは、mRNAレベル、又は信号経路に関係する副次的な化合物等の核酸レベルの直接的なアッセイを含むことができる。さらに、GPCRタンパク信号経路に反応して、上昇又は下降調節される遺伝子の発現も、アッセイされる。この例において、これらの遺伝子の規定領域は、発光酵素などのレポーター遺伝子と関連付けられうる。
【0146】
よって、GPCR遺伝子発現の変調剤は、細胞を候補化合物に接触させ、決定されたmRNAを発現させるという方法で特定される。候補化合物存在下でのGPCRmRNA発現のレベルは、候補化合物非存在下でのGPCRmRNA発現のレベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づいて核酸発現の変調剤として特定でき、例えば異常な核酸によって特徴付けられる異常の処置に使用できる。候補化合物存在下でのmRNA発現が、候補化合物非存在下でのmRNA発現と比較して顕著に大きい場合、候補化合物は核酸発現の誘発剤として特定される。候補化合物存在下でのmRNA発現が、候補化合物非存在下でのmRNA発現と比較して顕著に少ない場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【0147】
本発明はさらに、核酸を対象として、タンパクを発現する細胞又は組織において、GPCR核酸発現を変調する、特にタンパクを発現する細胞又は組織内で活性を変調する遺伝子変調剤として薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。変調は、上向き調整(例えば活性化又は作動化)又は下向き調整(抑制又は拮抗)の両方の調節、又は核酸発現を含む。
【0148】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパクを発現する細胞又は組織中でGPCR核酸発現を阻害する限り、GPCR核酸発現の変調剤は、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて特定される小分子又は薬剤であり得る。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。
【0149】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、GPCR遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。よって、遺伝子発現パターンは化合物による治療の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは、影響された細胞の化合物への生理的反応を暗示するマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは、化合物の投与量の増加、あるいは患者が耐性を示さない別の化合物の投与を認める。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【0150】
核酸分子はまた、GPCR核酸の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状を導き出す質的変化に有用である。核酸分子はGPCR遺伝子及びmRNAのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子は、GPCR遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。変異は、遺伝子中の1以上のヌクレオチドの欠如、付加、置換;転置又は転移のような染色体再配置;異常メチル化パターンのようなゲノムDNAの変化;増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。疾患がGPCRタンパクの過剰発現、過小発現又は変異発現による場合、機能障害に関連するGPCR遺伝子の変異体の検出により、疾患の活性又は疾患への感受性の診断ツールが提供される。
【0151】
GPCR遺伝子に変異を有する個人は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。図3のデータにより示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。GenomicDNAは直接分析されるか、または分析に先がけて、PCRを使って拡大できる。RNA又はcDNAも同様に使われうる。変異の検出は、ある用途では、アンカーPCR又はRACE PCRのようなポリメラーゼ鎖反応(PCR)(U.S.Patent No.4,683,195及び4,683,202参照)、又は異なるものではリゲーション鎖反応(LCR)(Landegran et al., Science 241:1077−1080(1988);及びNakazawa et al., PNAS 91:360−364(1994)参照)におけるプローブ/プライマーの使用を含み、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である(Abravaya et al., Nucleic Acids Res.23:675−682(1995)参照)。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程;細胞サンプルから核酸(例えばゲノム,mRNA又は両者)を単離する工程;核酸サンプルを遺伝子(もし存在すれば)のハイブリダイズ及び増幅が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした1以上のプライマーと接触させる工程;増幅生成物の存在又は不存在を検出する、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程;を含む。欠失及び挿入は増幅生成物を正常遺伝子型と比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅DNAを正常RNA又はアンチセンスDNAとハイブリダイズすることで特定することができる。
【0152】
あるいは、GPCR遺伝子の変異は、例えばゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
さらに、配列特定リボザイム(U.S. Patent No. 5,498,531)は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在を評点することに用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ、又は融点の違いによって、不一致の配列から区別することができる。
【0153】
特定領域の配列変化は、RNase及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異GPCR遺伝子と野性型遺伝子との間の配列相違は、直接DNA配列化により決定できる。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり(Naeve,C.W.,(1995)Biotechniques 19:448)、マススペクトルによる配列化を含む(PCT International Publication No.WO94/16101;Cohen et al., Adv.Chromatogr.36:127−162(1996);及びGriffin et al., Appl.Biochem. Biotechnol. 38;147−159(1993)参照)。
【0154】
遺伝子の変異を検出する他の方法には、RNA/RNA又はRNA/DNA二重鎖の不適合塩基を検出するため開裂試薬から保護する方法(Myers et al., Science 230;1242(1985));Cotton et al.,PNAS85:4397(1988);Saleeba et al.,Meth.Enzymol.217:286−295(1992))、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較する方法(Orita et al.,PNAS 86;2766(1989);Cotton et al., Mutat.Res.285:125−144(1993);及びHayashi et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.9:73−79(1992))、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型フラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法 (Myers et al., Nature 313:495(1985))が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【0155】
核酸分子は、治療方法に影響を及ぼすにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型の個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関(薬理ゲノム相関)についての研究に用いることができる。したがって、治療のために適切な化合物及び投与量を選択するために、ここに記載されている核酸分子を、個人のGPCR遺伝子の変異の評価に用いることができる。
【0156】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個人に対するテーラー治療に用いることのできる診断対象を提供する。従って、これらの多型を有する組換細胞及び動物の製造は、治療化合物及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【0157】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるGPCR遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。DNAアンチセンス核酸分子は、転写に関連する遺伝子の領域に相補的に設計され、転写及びその後のGPCRタンパクの製造を阻止する。アンチセンスRNA又はDNA核酸分子は、mRNAにハイブリダイズされ、mRNAのGPCRタンパクへの翻訳を阻止する。
【0158】
あるいは、アンチセンス分子の一種は、GPCR核酸の発現を減少させ、mRNAを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくないGPCR核酸発現により特徴づけられる異常を治療することができる。この技術は、mRNAの1以上の部分に、mRNAが翻訳される能力を減じるヌクレオチド配列を相補的に含むリボザイムによる開裂に関する。可能な部分はコード領域、特にリガンド結合領域のようなGPCRタンパクの触媒活性及び他の機能的活性に関連したコード領域である。
【0159】
核酸分子はさらに、GPCR遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。組み換え細胞は、ex vivoで調製され患者に戻される細胞を含み、個人の体内に導入されて、そこで細胞は個人の治療のために望ましいGPCRタンパクを生成する。
【0160】
本発明はまた、生物的サンプル中のGPCR核酸の存在を検知するキットを含む。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。例えば、キットは、ラベル化された又はラベル化可能な核酸、あるいは生物学的サンプル中でGPCR核酸を検出することのできる試薬;サンプル中のGPCR核酸量を決定する手段;及び標準サンプルのGPCR核酸量と比較する手段;を含むことができる。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにGPCRタンパクmRNA又はDNAを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【0161】
核酸アレイ
さらに本発明により、図1及び3(SEQ ID NO:1及び3)で与えられる配列情報に基づく核酸分子のアレイ又はマイクロアレイ等の核酸検出キットが提供される。
【0162】
ここで用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを表す。1つの例において、マイクロアレイはU.S.Patent 5,837,832,Chee et al., PCT 出願 WO95/11995(Chee et al.),Lockhart,D.J.et al.(1996;Nat.Biotech.14:1675−1680)及びShena,M.et al.(1996;Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614−10619)に記載された方法にしたがって調製且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の例では、このようなアレイはBrown et al., U.S.Patent No.5,807,522に記載される方法により製造される。
【0163】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは多くの特異な単鎖核酸配列を含み、通常、固形担体に固定された合成アンチセンスオリゴヌクレオチド又はcDNAのフラグメントのいずれかを含む。オリゴヌクレオチドは好ましくは約6〜60のヌクレオチド長で、より好ましくは15〜30のヌクレオチド長、もっとも好ましくは約20〜25のヌクレオチド長である。ある種のマイクロアレイあるいは検出キットでは、好ましくはわずか7〜20のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。マイクロアレイあるいは検出キットは、既知の5’あるいは3’配列を包含するオリゴヌクレオチド、全長配列を包含する配列化オリゴヌクレオチド、あるいは配列の長さに沿った特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含む。マイクロアレイあるいは検出キットに用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子あるいは対象遺伝子グループに特異的なオリゴヌクレオチドである。
【0164】
マイクロアレイあるいは検出キット用に公知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するため、対象となる遺伝子(あるいは本発明により特定されるORF)は、典型的にはヌクレオチド配列の5’あるいは3’末端から開始する、コンピュータアルゴリズムを用いて検査される。典型的なアルゴリズムは、遺伝子に特異的な長さであり、ハイブリダイズに適した範囲にGC含有量を有し、ハイブリダイズを妨害する二次構造を有さないとされたオリゴマーを特定する。ある条件下で、マイクロアレイあるいは検出キット上のオリゴヌクレオチド対を用いることが好適である。「対」は同一で、好ましくは配列の中央部に位置する一つのヌクレオチドを除く。対の第二オリゴヌクレオチド(一方とは整合しない)はコントロールとなる。オリゴヌクレオチド対の数は2から百万である。オリゴマーは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロンあるいは多種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、あるいは他の適当な固体担体である。
【0165】
他の例では、オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはPCT出願 WO95/251116(Baldeschweiler等)に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列は、ドット(又はスロット)がcDNAフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、UV、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な装置(スロットブロット又はドットブロット装置)、材料(適当な固体担体のいずれか)及び機械(ロボット化設備)により製造され、8,24,96,384,1536,6144又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は市販の設備の効率的な用途に適している2〜100万のオリゴヌクレオチドを含む。
【0166】
マイクロアレイあるいは検出キットを用いたサンプル分析を行うため、生物サンプルから得られたRNAあるいはDNAをハイブリダイズプローブに調製する。mRNAは単離され、cDNAは製造され、アンチセンスRNA(aRNA)を製造する型として使用される。aRNAは蛍光ヌクレオチドの存在下に増幅され、ラベルされたプローブはマイクロアレイあるいは検出キットとともに培養され、プローブの配列はマイクロアレイあるいは検出キットのオリゴヌクレオチドに相補的にハイブリダイズされる。完全な相補性、又は様々な程度の少ない相補性を持つようにハイブリダイズが起こるよう、培養条件が調整される。非ハイブリダイズプローブが除かれた後、蛍光レベル及びパターンを決定するためスキャナーが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイあるいは検出キット上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的存在度を決定する検査を行う。生物的サンプルはいずれの体液(血液、尿、唾液、たん、胃液等)、培養細胞、生体組織、あるいは他の組織調製物からも得ることができる。検出システムは、すべての区別される配列についてハイブリダイゼーションの欠如、存在、及び量を測定するのに用いられる。このデータは、配列、発現型、変異、変異体又はサンプル間の多型の大規模な相互関係研究のために使用することができる。
【0167】
本発明は、このようなアレイを用い、本発明のGPCRタンパク/ペプチドの発現を特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを1以上の核酸分子と共に培養し、被検サンプル中の成分への核酸分子の結合をアッセイすることを含む。このアッセイは、典型的には多くの遺伝子を含む配列を含み、少なくとも1つは本発明の遺伝子及び/又は本発明のGPCR遺伝子の対立遺伝子である。
【0168】
核酸分子の培養条件は被検サンプルとともに変化する。培養条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、一般的に適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ形態を、ここに記述されたヒトゲノムの新規なフラグメントを用いるのに適するよう調製することができる。このようなアッセイの例は、Chard,T,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1986);Bullock,G.R.et al., Techniques in Immnocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol.1(1982),Vol.2(1983), Vol.3 (1985);Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassay: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1985) に記載されている。
【0169】
本発明の披検サンプルは、細胞、タンパク、又は細胞から得られる細胞膜抽出物を含む。上記の方法により使われた披検サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、及びアッセイされるサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変化する。核酸、又は細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と矛盾のないサンプルを得るために、容易に適応できる。
【0170】
本発明の他の例では、キットは本発明のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むように規定される。
【0171】
特に本発明は、(a)核酸プローブの一つ、例えばここに記述されるヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる核酸分子を含む第一の容器;及び(b)洗浄剤又は結合核酸の存在を検出することのできる試薬の一つ以上を含む一以上の容器を含む、小さく仕切られ、コンパートメント化されたキットを提供する。
【0172】
詳細には、コンパートメント化されたキットは、隔離された容器に試薬が入る各キットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ化材料を含む。このような容器は、一つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液(リン酸緩衝液、Tris緩衝液等)を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。当業者は、本発明の遺伝子をコード化する本発明の未特定GPCR遺伝子を、ここに開示された配列情報を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式、特に発現アレイに折り込んで用いることができる。
【0173】
ベクター / 宿主細胞
本発明はまた、ここに記載の核酸分子を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、核酸分子を輸送する媒体、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、一本鎖又は二本鎖のファージ、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAウイルスベクター、あるいは人工染色体を含み、例えば、BAC、PAC、YAC、MACなどが挙げられる。
【0174】
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【0175】
本発明は、維持のためのベクター(クローニングベクター)あるいは核酸分子発現のためのベクター(発現ベクター)を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、あるいはその両者において機能することができる(シャトルベクター)。
【0176】
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第2の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクター自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び/又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【0177】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、mRNA転写を指示するプロモーターを含む。これは、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのlac、TRP、及びTACプロモーター、SV40からの初期及び後期プロモーター、CMV即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含むが、これらに限定されない。
【0178】
発現ベクターは、転写を促進するコントロール領域の他に、レプレッサー結合領域やエンハンサー等の転写調節領域をも含むことができる。例としては、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスLTRエンハンサーを含む。
【0179】
発現ベクターは、転写を開始及びコントロールするための領域を含む他、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合領域を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化信号だけでなく開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: Alaboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, NY (1989) に記載されている。
【0180】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来;バクテリオファージ由来;酵母エピソーム由来;酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来;バクロウイルス、SV40等のパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来;のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核宿主及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: Alaboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, NY (1989) に記載されている。
【0181】
調節配列は1つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく(すなわち、組織特異的)、あるいは、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような一つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核宿主及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【0182】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するDNA配列は、一つ以上の制限酵素によりDNA配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに結合することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び結合反応の手順は、当業者に良く知られている。
【0183】
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖あるいは発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌、及びネズミチフス菌を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、COSやCHO細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【0184】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパクの発現を増大し、組換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部位の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部位から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Xa因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、対象組換えタンパクに対してグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク、あるいはタンパクAとそれぞれ融合するpGEX (Smith et al., Gene 67:31−40 (1988))、 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)、及びpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。
【0185】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、pTrc (Amann et al., Gene 69:301−315 (1988)) 及び pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60−89 (1990))を含む。
【0186】
組換えタンパクの発現は、組換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する宿主細胞の能力が減じられている遺伝的背景を提供することにより、宿主細菌において最大化することができる(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119−128)。あるいは、関係のある核酸分子の配列は、大腸菌等の特定の宿主細胞に優先的コドンの使用を提供するように変更することができる(Wada et al., Nucleic Acids Res. 20:2111−2118 (1992))。
【0187】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばS. cerevisiae での発現のためのベクターの例としては、pYepSec1 (Baldari, et al., EMBO J. 6:229−234 (1987))、 pMFa (Kurjan et al., Cell 30:933−943(1982))、 pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113−123 (1987))、 及び pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。
【0188】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞(例えば、Sf 9 細胞)中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、pAc系(Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156−2165 (1983)) 及び pVL系 (Lucklow et al., Virology 170:31−39 (1989)) を含む。
【0189】
本発明のある例において、ここに記載の核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを用い、哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840(1987)) 及び pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187−195 (1987))を含む。
【0190】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用であり、当業者が利用可能な周知のベクターの単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖あるいは発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に認められる。
【0191】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向きにベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスRNAの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域及び非コード領域の両方を含むここに記載の核酸分子配列の全てあるいは一部に対して生産することができる。このアンチセンスRNAの発現は、センスRNAの発現に関する上記各パラメータに従う(調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現)。
【0192】
本発明は、ここに記載のベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核細胞、酵母等の下等真核細胞、昆虫細胞等の他の真核細胞、及び哺乳類細胞等の高等真核細胞を含む。
【0193】
組換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びSambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【0194】
宿主細胞は、一つ以上のベクターを含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、あるいは発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子等に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。一つ以上のベクターを細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、あるいは核酸分子ベクターに結合することができる。
【0195】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルスあるいはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製コンピテント(replication−competent)あるいは複製欠損(replication−defective)であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において、複製は起こる。
【0196】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構成物を含む細胞亜集団の選択ができる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、あるいは別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン抵抗性遺伝子を含む。しかしながら、表現型形質を選択する何れのマーカーも効果的である。
【0197】
成熟タンパクは、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、ここに記載のDNA構成物に由来するRNAを用いて、これらタンパクを生産するために無細胞転写及び翻訳系を使用することも可能である。
【0198】
ペプチド分泌が望まれるところでは、GPCR等のタンパクを含むマルチ貫膜ドメインが達成しづらく、適切な分泌信号がベクターに組み入れられる。信号配列は、ペプチドに対して内因性であるか、あるいはこれらのペプチドに対して非相同であることができる。
【0199】
ペプチドを媒体中に分泌しないところでは、それはGPCRの場合に典型的であるが、タンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【0200】
ここに記載のペプチドの組換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によって様々なグリコシル化パターンを有することができ、あるいは細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれない。さらに、宿主媒介工程の結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【0201】
ベクターと宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、細胞は、GPCRタンパクの生産、あるいは、さらに精製して所望量のGPCRタンパクやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【0202】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットだけでなく、前記のようなGPCRタンパクあるいはGPCRタンパクフラグメントに関連する細胞系アッセイにも有用である。従って、天然GPCRタンパクを発現する組換え宿主細胞は、GPCRタンパク機能を刺激あるいは抑制する物質アッセイに有用である。
【0203】
宿主細胞はまた、その機能に影響があるGPCRタンパク変異体の特定にも有用である。その変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その変異を含む宿主細胞は、天然GPCRタンパクに対しては示さないかもしれない効果であり、GPCRタンパク変異体に対しては望ましい効果(例えば、誘発機能や抑制機能)を有する化合物の分析に有用である。
【0204】
一般的に、設計された宿主細胞は、さらにヒト以外の形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくは哺乳類、例えば、ラットやマウス等の齧歯類であり、その動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の一つ以上の細胞型あるいは組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性DNAである。これらの動物は、GPCRタンパクの機能の研究、並びにGPCRタンパク活性の変調剤の特定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例としては、ヒト以外の霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【0205】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えば微量注入法、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。GPCRタンパクヌクレオチド配列は何れも、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【0206】
発現ベクターにおいて有用な調節配列あるいは他の配列は何れも、形質転換配列の一部を形成することができる。これは、もし既に含まれていない場合に、イントロン配列及びポリアデニル化信号を含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対してGPCRタンパクの発現を指示する。
【0207】
胚操作及び微量注入法による形質転換動物の生成方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、U.S.Patent No.4,736,866及びU.S.Patent No.4,870,009(共にLeder et al.)、U.S.Patent No.4,873,191(Wagner et al.)、並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物は、そのゲノム中の導入遺伝子及び/又はその動物の組織あるいは細胞中の形質転換mRNAの発現の存在に基づき特定することができる。形質転換の基礎動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組換え宿主細胞を用いて完全な動物あるいはその動物の組織を生産する動物も含む。
【0208】
別の例において、ヒト以外の形質転換動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージP1のcre/oxPリコンビナーゼシステムである。cre/oxPリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Lakso et al. PNAS 89:6232−6236 (1992)を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はS. cerevisiae のFLPリコンビナーゼシステムである(O’Gorman et al. Science 251:1351−1355 (1991))。cre/oxPリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Creリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、”複”形質転換動物の構築を通じて、例えば、2つの形質転換動物、すなわち、一つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む2つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【0209】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Wilmut, I. et al. Nature 385:810−813 (1997) 並びにPCT国際公開公報 WO 97/07668及びWO 97/07669に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルから脱してG0期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
【0210】
休止細胞は、その後、例えば電気パルスを使用して、その休止細胞を単離した動物と同種の動物由来の無核卵母細胞に対して、融合することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚又は尾胞に発達し、疑似妊娠雌養育動物に転移する。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンであろう。
【0211】
ここに記載のペプチドを発現する組換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをin vivo状況下で行うのに有用である。従って、in vivoに存在し、リガンド結合、GPCRタンパク活性化、及び信号形質導入に影響する様々な生理的因子は、in vitroの無細胞分析あるいは細胞系分析からは明らかでないかもしれない。従って、ヒト以外の形質転換動物の提供は、in vivoにおけるGPCRタンパク機能、例えば、リガンド相互作用、GPCRタンパク機能とリガンド相互作用に対する特異的変異GPCRタンパクの影響、並びにキメラGPCRタンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル変異、すなわち、実質的にあるいは完全に一つ以上のGPCRタンパク機能を除去する変異の影響を評価することもできる。
【0212】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい例に関連して記載しているが、クレームされた本発明はこのような特定の例に不当に限定されないことが理解されるべきである。特に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な前記本発明の実施態様の様々な修飾は、以下のクレームの範囲内であることを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明のGPCRをコード化するcDNA分子のヌクレオチド配列を提供する(SEQ ID NO:1)。さらに、ATG開始、終止、及び組織分布等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。
【図2】
図2は、本発明にかかるGPCRの予測アミノ酸配列を提供する(SEQ ID NO:2)。さらに、タンパクファミリー、機能、及び修飾部位等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。
【図3】
図3は、本発明にかかるGPCRタンパクをコード化する遺伝子をスパンするゲノム配列を提供する(SEQ ID NO:3)。さらに、イントロン/エキソン構造、プロモーター位置等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。また図3は、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされたことも示す。
関連出願
本出願は、2000年10月25日付け出願のU.S.Serial No.09/695,045(Atty. Docket CL000900)、及び2001年5月31日付け出願のU.S.Serial No.09/867,570(Atty. Docket CL000900−CIP)の優先権を主張するものである。
【0002】
技術分野
本発明は、ヒトMas関連GPCR受容体サブファミリーに関連するG−タンパク共役受容体(GPCR)、組換えDNA分子、及びタンパク生成に関する。特に本発明は、新規のGPCRペプチドとタンパク、及び該ペプチド及びタンパク分子をコード化する核酸分子を提供し、これらはヒト治療学、及び診察用組成物と診察方法の発展のために有用である。
【0003】
背景技術
G − タンパク共役受容体
G−タンパク共役受容体(GPCR)は、細胞内での信号伝達を担うタンパクの主要なクラスを構成している。GPCRは3つの構造のドメインを持っている。それはアミノ末端細胞外ドメイン;7つの貫膜セグメント・3つの細胞外ループ・3つの細胞内ループを含む貫膜ドメイン;及びカルボキシ末端細胞内ドメインである。GPCRの細胞外部分にリガンドが結合する際に、細胞内で信号が伝達され、その結果、細胞の生物学的又は生理的な性質が変化する。GPCRは、G−タンパク及び効果器(細胞内酵素、G−タンパクにより変調されるチャンネル)と共に、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力へと結びつけるモジュラー信号系の要素である。
【0004】
GPCR遺伝子及び遺伝子生成物は、疾患を引き起こす原因薬剤となり得る(Spiegel et al., J. Clin. Invest. 92:1119−1125 (1993); McKusick et al., J. Med. Genet. 30:1−26 (1993))。ロドプシン遺伝子及びV2バソプレッシン受容体遺伝子に特有の欠陥は、種々の色素性網膜炎(Nathans et al., Annu. Rev. Genet. 26:403−424(1992))、及び腎性尿崩症(Holtzman et al., Hum. Mol. Genet. 2:1201−1204 (1993)) を引き起こすことが示されている。これらの受容体は、中枢神経系及び末梢の生理的プロセスにおいて非常に重要である。進化解析により、これらのタンパクの祖先は元来、複合体設計、神経系とともに発達してきたことが示唆される。
【0005】
GPCRタンパクスーパーファミリーは、ファミリーI:ロドプシン及びβ2−プリン作動性受容体に代表され、現在200以上の特有のメンバーが示されている受容体ファミリー(Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem. 60:653−688 (1991)); ファミリーII:副甲状腺ホルモン/カルシトニン/セクレチン受容体ファミリー(Juppner et al., Science 254:1024−1026 (1991); Lin et al., Science 254:1022−1024 (1991)); ファミリーIII:代謝性のグルタミン酸塩受容体ファミリー(Nakanishi, Science 258 597:603 (1992)); ファミリーIV:走化性及びD. discoideumの発達に重要なcAMP受容体ファミリー(Klein et al., Science 241:1467−1472 (1988)); ファミリーV:STE2等の菌類交接フェロモン受容体ファミリー(Kurjan, Annu. Rev. Biochem. 61:1097−1129 (1992))、の5つのファミリーに分類することができる。
【0006】
7つの推定疎水性セグメントを示し、GPCRとは無関係と思われる少数の他のタンパクも存在する;これらはG−タンパクとの共役を示さなかった。ショウジョウバエは、光受容体に特有のタンパクであるbride−of−sevenless(boss)を発現し、この7つの貫膜セグメントを持つタンパクは広範囲にわたって研究されているが、GPCRであるという証拠は示されていない(Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5047−5051 (1993))。ショウジョウバエ中のちぢれた遺伝子(fz)もまた、7つの貫膜セグメントを持つタンパクであると考えられる。bossと同様に、fzもG−タンパクとの共役を示さなかった(Vinson et al., Nature 338:263−264 (1989))。
【0007】
G−タンパクは、グアニンヌクレオチドと結合するα、β、及びγサブユニットから成るヘテロ三量体タンパクファミリーを表す。これらのタンパクは、通常、例えば7つの貫膜セグメントを含む受容体等の細胞表面の受容体に結合している。リガンドのGPCRへの結合に続いて、立体配座の変化がG−タンパクに伝達され、これによりαサブユニットにおいてGDP分子がGTP分子と交換され、β、γサブユニットから分離される。αサブユニットのGTP結合様式は、典型的には、効果器変調部として機能し、cAMP(例えば、アデニルシクラーゼの活性化により)、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸塩等の二次メッセンジャーの生成を導く。20種類以上の異なるαサブユニットがヒトにおいて知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットの小さいプールと関連している。哺乳類のG−タンパクの例としては、Gi、Go、Gq、Gs、及びGtが含まれる。G−タンパクは、Lodish et al., Molecular Cell Biology、(Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995)に広範囲にわたって記載されており、その内容は参考文献としてここに折り込まれている。GPCR、G−タンパク、G−タンパク結合効果器、及び二次メッセンジャーシステムについては、The G−Protein Linked Receptor Fact Book, Watson et al., eds., Academic Press (1994)に記述されている。
【0008】
アミン作動性GPCR
GPCRの1つのファミリーであるファミリーIIには、アセチルコリン、カテコールアミン、及びインドールアミンリガンド(以下、生体アミンとする)の受容体が含まれる。生体アミン受容体(アミン作動性GPCR)はGPCRの大きなグループであり、これらは進化における祖先を共有しており、脊椎動物(新口動物)と無脊椎動物(旧口動物)の両方に存在する。このGPCRファミリーには、5−HT類、ドーパミン類、アセチルコリン類、アドレナリン類、メラトニン類のGPCRが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0009】
ドーパミン受容体
脳の機能、及び疾患に関するドーパミン作動性システムへの理解は、数十年前、薬物治療後の3つの異なる観察がなされたことにより発展を遂げた。これらは、パーキンソン病を改善するためのドーパミン置換療法において、ドーパミン受容体をブロックする抗うつ病薬及び抗精神病薬に由来するレセルピンによってドーパミンや他のカテコールアミンが減少することが観察されたというものである。典型的な抗精神病薬のドーパミン受容体結合親和性が、それらの臨床効果に相互に関連するという発見から、精神分裂症におけるドーパミン過活性の仮説が導かれた(Snyder, S.H., Am J Psychiatry 133, 197−202 (1976); Seeman, P. and Lee, T., Science 188, 1217−9 (1975))。今日、ドーパミン受容体は、精神分裂症、パーキンソン病、トゥレット症候群、遅行性ジスキネジア、ハンティングトン疾患の薬理療法における重要な対象である。ドーパミン作動性システムには、黒質線条体、中間皮質、及び隆起漏斗の経路が含まれる。黒質線条体系経路は線条体内モーターシステムの一部であり、その退化はパーキンソン病を引き起こす:中間皮質系経路は、増強及び感情表現において重要な役割を果たし、抗精神病性薬の作用において要求される部位である:隆起漏斗系経路は脳下垂体からのプロラクチン分泌を調節する。
【0010】
ドーパミン受容体は、Gタンパク共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共に7つの螺旋形膜スパニング構造を有し、ヘテロ3量体グアニンヌクレオチド結合調節タンパク(Gタンパク)の結合を通じて信号を変換する大きなタンパクグループである。ドーパミン受容体は、それらの異なるリガンド結合様式、信号伝達特性、配列相同性、ゲノム組織に基づいて、D1類(D1及びD5)、D2類(D2、D3及びD4)といったサブファミリーに分類される(Civelli, O., Bunzow, J.R. and Grandy, D.K., Annu Rev Pharmacol Toxicol 33, 281−307 (1993))。D1類受容体であるD1及びD5は、Gs類タンパクとの結合を通じてcAMP合成を活性化し、また、それらの遺伝子はタンパクコード領域中にイントロンを含まない。他方、D2類受容体であるD2、D3及びD4は、Gi類タンパクとの相互作用を通じてcAMP合成を阻害し、また、タンパクコード領域中にイントロンを含む類似のゲノム組織を共有している。
【0011】
セロトニン受容体
セロトニン(5−Hydroxytryptamine)は、最初に血清から単離され、そこでは血管収縮を促進することが示された(Rapport, M.M., Green, A.A. and Page, I.H., J Biol Chem 176, 1243−1251 (1948)。LSDやプシロシビン等の幻覚剤が、平滑筋製造における5−HTの作用を阻害することが観察され、5−HTと精神的疾患との関係に対する関心が高められた(Gaddum, J.H. and Hameed, K.A., Br J Pharmacol 9, 240−248 (1954))。この観察は、精神医学的障害において脳での5−HT活性が変化され得るという仮説を導くものである(Wooley, D.W. and Shaw, E., Proc Natl Acad Sci U S A 40, 228−231 (1954); Gaddum, J.H. and Picarelli, Z.P., Br J Pharmacol 12, 323−328 (1957))。この仮説は、三環性抗憂鬱剤及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤が多くのうつ症状治療へと導入され、これらの製剤のノルアドレナリン及び5−HTの代謝への影響が観察されたことにより強化された。今日、セロトニン作用系に作用している薬剤は、一般に不安症状・社会恐怖症とされている鬱病、精神分裂症、強迫症状、パニック症候群、また偏頭痛、ガン化学療法により誘発する嘔吐、及び胃運動性障害等の精神病の薬物療法において、効果的であることが証明されている。
【0012】
セロトニン受容体は、神経伝達物質受容体における非常に大きく多様なファミリーである。現在までに哺乳類において、13のGタンパク共役5−HT受容体タンパクと、1つのリガンドゲートイオンチャンネル受容体(5−HT3)が記述されている。この受容体の多様性は、神経伝達物質及びホルモンとしてのセロトニンの古代起源と同様に、哺乳類における5−HTの多くの異なる役割を反映するものと考えられる。5−HT受容体は、それらの異なるリガンド−親和性プロフィール、分子構造、及び細胞内伝達機構によって、7つのサブファミリー又はグループに分類される(Hoyer, D. et al., Pharmacol. Rev. 46, 157−203 (1994))。
【0013】
アドレナリン作動性GPCR
アドレナリン作動性受容体は、Gタンパク共役受容体「スーパーファミリー」において、最も大きく、最も広く特徴づけられたファミリーのうちの1つを含む。このスーパーファミリーには、アドレナリン作動性受容体だけでなく、ムスカリン系、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性受容体も含まれる。グルカゴン、ソマトスタチン、バソプレッシン受容体、同様に視覚(ロドプシン)、味覚、及び嗅覚のための感覚受容体といった多くのタンパク受容体もまた、このファミリーに属する。シグナリング分子の多様性にもかかわらず、G−タンパク共役受容体の全てのプロセスは、7つの推定αへリックス構造膜に特徴付けられる初期の構造体と全く同様である(Probst et al., 1992)。最も基本的な理解としては、アドレナリン作動性受容体は、カテコールアミン、エピネフリン、及びノルエピネフリンの作用する生理的部位である。
【0014】
アドレナリン作動性受容体は、Ahlquistによって最初にα又はβとして分類され、彼は2つの受容体サブタイプにおいて、生理的反応を引き起こす一連のアゴニストの効力が、両者で明らかに異なることを証明した(Ahlquist(1948))。機能的には、αアドレナリン作動性受容体は、血管収縮、瞳孔拡張、及び子宮の抑制を制御することが示され、一方でβアドレナリン作動性受容体は、血管弛緩、心筋刺激、及び気管支拡張に関係している(Regan et al., 1990)。結局のところ、薬理学者達は、これらの反応はいくつかの異なるアドレナリン作動性受容体サブタイプの活性化により生じるものであると認識した。心臓中のβアドレナリン作動性受容体はβサブ1として定義され、肺及び脈管系中のそれらはβサブ2と呼ばれている(Lands et al., 1967)。
【0015】
一方で、αアドレナリン作動性受容体は、最初にシナプス前後(それぞれαサブ1、αサブ2)としての解剖学的位置に基づいて分類された(Langer et al., 1974)。しかしながら、この分類案は、αサブ2受容体が血小板のような明らかな非シナプス位置に存在していることによって混乱させられた。(Berthelsen and Pettinger, 1977)。放射性リガンド結合技術の開発に伴い、αアドレナリン作動性受容体は、プラゾシン又はヨヒンビンアンタゴニストとの親和性に基づいて薬理学的に識別された(Stark, 1981)。
【0016】
しかしながら、アドレナリン作動性受容体サブタイプの決定的な証拠としては、アドレナリン作動性受容体サブタイプの精製、及び分子クローニングが待たれた。1986年に、ハムスターのβサブ21アドレナリン作動性受容体(Dickson et al., 1986)、及び七面鳥のβサブ1アドレナリン作動性受容体(Yarden et al., 1986)の遺伝子がクローン化され、配列決定された。そして、水治療解析により、これらのタンパクが、光受容体であるロドプシンに類似した7つの疎水性ドメインを含んでいることが明らかとなった。これ以降、アドレナリン作動性受容体ファミリーは、3つのβ受容体サブタイプ(Emorine et al., 1989)、3つのαサブ1受容体サブタイプ(Schwinn et al., 1990)、及び3つの異なるβサブ2受容体(Lomasney et al., 1990)を含むように拡大された。
【0017】
動物組織由来のα受容体サブタイプのクローニング、配列解析及び発現から、α1受容体は、α1d(以前、α1a又はα1a/1dとして知られていた)、α1b、及びα1a(以前、α1cとして知られていた)サブタイプへと分類されるに至った。それぞれのα1受容体は、薬理学的特異性、及び組織特異性を示す。「α1a」という名称は、1995年の受容体及びイオンチャンネル命名補遺(Watson and Girdlestone, 1995)において概説されているように、以前「α1c」と命名されていたサブタイプについて、近年、IUPHARN命名委員会により公認された名称である(Watson and Girdlestone, 1995)。
【0018】
本発明においては、α1aという名称はこのようなサブタイプのことをいう。また、同時に、以前α1aと称されていた受容体は、α1dと命名された。本発明においては新しい命名法が用いられている。これらのα1受容体サブタイプを発現している安定な細胞系がここに記述されている;しかしながら、American Type Culture Collection (ATCC)では、これらの細胞系は古い命名法の下に記載されている。α1アドレナリン作動性受容体サブタイプの分類については、Martin C. Michel, et al., Naunyn−Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. (1995) 352:1−10を参照。
【0019】
αアドレナリン作動性受容体サブタイプにおける相違は、病態生理学的な症状に関連している。良性の前立腺肥大又はBPHとして知られている良性前立腺過形成は、典型的には50歳以上の男性に発症し、年齢が増すに連れ病状は深刻なものとなる。症状の兆候としては、これに限られるものではないが、排尿の困難性増加や性的機能不全がある。これらの徴候は、前立腺の肥大又は過形成によって引き起こされる。前立腺が肥大すると、男性の尿道における自由な流れを阻害する。これに付随して、肥大した前立腺のノルアドレナリン作動性神経刺激伝達が増大することにより、膀胱口及び尿道におけるアドレナリン作用が増大し、さらには尿道を通じての尿の流れが制限されるに至る。
【0020】
αサブ2受容体は、β及びαサブ1受容体の両者よりも早く開散されると考えられる。αサブ2受容体は、その染色体位置に基づいて、αサブ2C2、αサブ2C4、αサブ2C10と呼ばれる3つの異なる分子のサブタイプに分解される。これらのサブタイプはそれぞれ、薬理学的に定義されるαサブ2B、αサブ2C、αサブ2Aサブタイプに対応していると考えられる(Bylund et al., 1992)。
【0021】
全てのアドレナリン作動性受容体がエピネフリンにより認識されるとはいえ、それらは薬理学的に異なるものであり、個別の遺伝子によってコード化されているものである。これらの受容体は、一般的にG−タンパクを通じ結合される、異なる二次メッセンジャー経路に結合される。アドレナリン作動性受容体において、βサブ1及びβサブ2受容体はアデニレートシクラーゼを活性化し、αサブ2受容体はアデニレートシクラーゼを阻害し、αサブ1受容体はホスホリパーゼC経路を活性化し、ポリホスホイノシチド分解を促進する(Chung, F. Z. et al., J. Biol. Chem., 263:4052 (1988))。αサブ1及びαサブ2アドレナリン作動性受容体は、それらの薬剤としての細胞活性において相違する。
【0022】
このタンパクファミリーのメンバーの有用性を開示している米国の特許としては、6,063,785号(良性前立腺過形成の治療に有用なフタルイミドアリールピペラジン)、6,060,492号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、6,057,350号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、6,046,192号(フェニルエタノールアミノテトラリンカルボキサミド誘導体)、6,046,183号(良性前立腺過形成の共同治療方法)、6,043,253号(β3アゴニストとしてのアリールスルホンアミド置換融合ピペリジン)、6,043,224号(神経病的障害及び神経変性疾患の治療のための組成物及び方法)、6,037,354号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、6,034,106号(糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ3 アゴニストとしてのオキサジアゾールベンゼンスルホンアミド)、6,011,048号(糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ3アゴニストとしてのチアゾールベンゼンスルホンアミド)、6,008,361号及び5,994,506号(アドレナリン作動性受容体)、5,994,294号(ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用)、5,990,128号(良性前立腺過形成の治療のためのαサブ1Cの特定化合物)、5,977,154号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、5,977,115号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト)、5,939,443号(選択的β3アドレナリン作動性アゴニスト)、5,932,538号(ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用)、5,922,722号(α1aアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト26)、5,908,830号及び5,861,309号(ヒトα1アドレナリン作動性受容体をコード化するDNA)が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0023】
プリン作動性GPCR
プリン受容体P2Y1
P2プリン受容体は、ATPゲートチャンネルであるP2X受容体、G−タンパク共役受容体のファミリーであるP2Y受容体、及びマスト細胞中で非選択的に細孔を媒介するP2Z受容体に大きく分類されてきた。それぞれのP2受容体において、多くのサブクラスが特定されている。P2Y受容体は、ATP及びその類似体に対する選択的な応答性によって特徴づけられる。これらのうちのいくつかは、UTPに対しても応答する。P2プリン受容体命名法の推奨に基づき、P2Yプリン受容体はクローニングの順序により番号付けられる。P2Y1、P2Y2、及びP2Y3は、様々な種からクローン化された。P2Y1は、ADPとATPに対して応答する。
【0024】
ヒトの骨及び2つの骨芽細胞系におけるP2Y受容体サブタイプの発現についてRT−PCRにより分析したところ、全ての公知のヒトP2Y受容体サブタイプ、すなわちP2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、及びP2Y7が発現していることが示された(Maier et al. 1997)。対照的に、脳由来の細胞系における分析では、脳組織においてはP2Y受容体サブタイプの選択的な発現が起こっていることが示唆された。
【0025】
Leonらは、P2Y1受容体の生理学的な役割を調べるためにP2Y1−ヌルマウスを生成した(J. Clin. Invest. 104: 1731−1737(1999))。これらのマウスは、発達、寿命、再生、血小板の形状等に影響する異常を生じることなく成長することができ、これらの血小板の計測数は野生型マウスと同等だった。しかしながら、P2Y1不足マウスから取り出した血小板は、通常のADP濃度では凝集することができず、他のアゴニストへの凝集も減少したが、高濃度のADPでは形状変化なしに凝集する。
【0026】
さらに、アデニリルシクラーゼのADP由来の阻害が未だ生じており、P2Y1とは別のADP受容体の存在が示された。P2Y1−ヌルマウスは、自発的な出血傾向は持たないが、ADP又はコラーゲンとアドレナリンの静脈注射により引き起こされる血栓塞栓症に対する抵抗力があった。したがって、P2Y1受容体は、血栓症状において重要な役割を果たし、抗血栓性薬剤を代表する。Somersらは、短腕の染色体3上の末端マーカーから、173〜174cMの位置のフランキングマーカーD3S1279とD3S128の間の、P2RY1遺伝子をマップした(Genomics 44: 127−130 (1997)。
【0027】
プリン受容体P2Y2
嚢胞性線維症(CF)に欠けている塩化物イオン分泌経路は、細胞外ヌクレオチドにより活性化される塩化物イオンの代替となる輸送経路によってバイパスされる。従って、この効果を媒介するP2受容体は、CF患者の塩化物イオン分泌を改善するための治療対象である。Parrらは、タンパクをコード化するヒト気道上皮細胞からクローンされたcDNAの配列及び機能発現を、P2Yヌクレオチド受容体の特性とともに報告した(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3275−3279 (1994))。ヒトP2RY2遺伝子は、染色体11上のq13.5〜q14.1にマップされた。
【0028】
プリン受容体P2Y4
P2RY4受容体は、UTP及びUDPにより特異的に活性化され、ATP及びADPでは活性化しないと考えられる。このウリジンヌクレオチド受容体の活性化により、イノシトールリン酸形成向上、及びカルシウム移動を生じる。UNR遺伝子は染色体Xq13上に位置する。
【0029】
プリン受容体P2Y6
Somersらは、P2RY6遺伝子を、多型マーカーD11S1314及びD11S916との間の11q13.5にマップし、P2RY2は4cM以下のP2RY6内に位置する(Genomics 44: 127−130 (1997)。これは、この遺伝子ファミリーの染色体群化について最初に記述したものである。
【0030】
アデニン、ウリジンヌクレオチドは、細胞内エネルギー代謝、リン酸化、及び核酸合成における既定の役割に加えて、重要な細胞外信号分子でもある。P2Y代謝性受容体は、種々の生理的プロセスを調節している細胞外ヌクレオチドの影響を媒介するGPCRである。少なくとも10のP2Y受容体サブファミリーが確認されている。これらの受容体サブファミリーは、配列、及びヌクレオチドアゴニストの選択性及び有効性において大きく異なっている。
【0031】
脳においては、P2Y1受容体が強く発現されることが証明されているが、P2Y2、P2Y4、及びP2Y6受容体も存在している。神経細胞、神経膠細胞、脳脈管又は脳室上衣細胞における、これらのサブタイプの局在化は、in situ mRNAハイブリダイゼーション、及びこれらの培養細胞の研究において発見された。P2Y1受容体は神経細胞に顕著に存在する。あるP2Y受容体サブタイプの、N型Ca2 +チャンネル又は特定のK+チャンネルへの共役が実証された。
【0032】
また、いくつかのP2Y受容体が、細胞内経路を刺激して、平滑筋細胞の生育促進効果を媒介することが示された。この細胞内経路はGqタンパク、タンパクキナーゼC、及びチロシンリン酸化に関連し、即時の初期遺伝子発現、細胞数、DNA及びタンパク合成を引き起こしている。さらにP2Y調節が、動脈硬化症の発症に応答し、分裂促進の役割を果たすことが証明された。
【0033】
さらにP2Y受容体が、嚢胞性線維症において重要な役割を果たすことが示された。気道表面の液体の体積及び組成は、気道上皮を透過するイオンの能動輸送により調整されている。これは、基底外受容体に作用する自律神経のアゴニスト、及び発光性受容体に作用するアゴニストの両者によって次々に調節される。特に、気道表面の液体中に存在する細胞外ヌクレオチドは、発光性P2Y受容体において、Cl−分泌、及びNa+吸収を制御するよう作用する。ヌクレオチドは気道上皮細胞から調節されて放出されるので、気道上イオン輸送の調節は、気道上皮の発光性表面に局在したオートクリン調節系の一部をなしていることが好ましい。この生理学的な役割に加えて、P2Y受容体アゴニストは、上皮のイオン輸送障害であるCFの治療において有益である可能性がある。CFを有するヒトの気道では、不完全なCl−分泌及び異常に高率なNa+吸収が生じている。P2Y受容体アゴニストは、これらのイオン輸送経路の両方を調節し、CFにおけるイオン輸送欠陥に対する薬理学的なバイパスとなる可能性を持つ。
【0034】
GPCR、特にヒトMas関連GPCR受容体サブファミリーのメンバーは、薬剤作用と開発のための主要な対象である。従ってそれは、未知のGPCRを識別し特徴付ける調剤開発の分野において貴重である。本発明は、未確認のヒトGPCRを提供することにより、技術レベルを向上する。
【0035】
発明の概要
本発明は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーやその対立変異体、その他の哺乳動物のオルソログに関連するヒトキナーゼペプチド及びタンパクのアミノ酸配列の特定に一部基づく。これら独特なペプチド配列及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒト治療対象の開発のモデルとして使用でき、治癒力のあるタンパクの同定に役立ち、ヒト治療薬剤の開発のための対象として役立つ。
【0036】
本発明のタンパクは、これらのタンパクを発現する細胞において、ヒトMas関連GPCRサブファミリーにより媒介された経路をシグナリングすることに関与するGPCRである。図1における実験データは、ヒトの赤白血病細胞と精巣での発現を示している。ここで、「信号経路」とは、リガンドのGPCRタンパクへの結合における細胞の機能/活性の変調(例えば、刺激又は抑制)を表す。そのような機能の例としては、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸 (PIP2)、イノシトール1,4,5−三リン酸 (IP3)、及びアデニル酸シクラーゼ等の信号形質導入経路に関与する細胞内分子の動員 ; 原形質膜の分極 ; 分子の産生又は分泌 ; 細胞成分の構造変化 ; DNAの合成等の細胞増殖 ; 細胞移動 ; 細胞分化 ; 及び細胞生存等を含む。
【0037】
受容体タンパクにより媒介された反応は、発現する細胞のタイプに依存する。本発明のGPCRサブファミリーの他のメンバーを発現する細胞のタイプについては、当技術においていくらかの情報がある (背景において引用された引例、及び図2に提供された近似の相同タンパクについての情報を参照。図1における実験データは、ヒトの赤白血病細胞と精巣での発現を示している)。例えばある細胞においては、受容体タンパクへのリガンドの結合は、化合物の解放、チャンネルのゲーティング、細胞付着、遊走、分化等の活性を刺激し、ホスファチジルイノシトール又は他の細胞のサイクリックAMP代謝と代謝回転を通じて、異なる結果を引き起こす。本発明の特定のGPCRにより調整された細胞の活性/応答にかかわらず、受容タンパクは、GPCRであり、GPCRを表現する細胞又は組織における生物学的工程に関与する細胞において、ホスファチジルイノシトール又はサイクリックAMP代謝と代謝回転等の様々な細胞内信号形質導入経路を通じて、1つ以上の二次信号を生成するために、G−タンパクと相互作用することが、当技術の研究者には明確にわかるであろう。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0038】
ここで、「ホスファチジルイノシトール代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸(PIP2)の代謝回転と代謝に関係する分子を意味する。PIP2は、原形質膜のサイトゾルリーフレットに発見されたリン脂質である。いくつかの細胞において、受容体へのリガンドの結合は、PIP2を加水分解し、1,2−ジアシルグリセロール(DAG)及びイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)を生成する原形質膜酵素ホスホリパーゼCを活性化する。一度成形されたIP3は、例えばIP3結合サイトを含むカルシウムチャンネルタンパク等のIP3受容体を結合できるところで、小胞体表面に放出されるかもしれない。IP3結合は、チャンネルの開放を引き起こし、カルシウムイオンの細胞質への解放を可能にする。IP3は特有なキナーゼによってリン酸化され、細胞外媒体から細胞質へのカルシウム導入を起こしうる分子であるイノシトール1,3,4,5−四リン酸(IP4)を形成する。IP3 及びIP4は後に、非常に急速に加水分解され、それぞれ不活性なイノシトール1,4−二リン酸(IP2)及びイノシトール1,3,4−三リン酸になる。これらの不活性な生成物は、PIP2を合成するために、細胞によりリサイクルされる。PIP2の加水分解により生成された他の二次メッセンジャー、すなわち1,2−ジアシルグリセロール(DAG) は、細胞膜にとどまり、ここで酵素タンパクキナーゼCを活性化させるのに役立つ。細胞の細胞質において、タンパクキナーゼCは通常可溶性であることがわかるが、細胞内のカルシウム濃縮度の上昇によって、この酵素は原形質膜に動き、ここでDAGにより活性化されることができる。種々の細胞でのタンパクキナーゼCの活性化は、グリコーゲンシンターゼのリン酸化、又はNF―kB等の様々な転写因子のリン酸化等の様々な細胞の反応を生じる。ここで、「ホスファチジルイノシトール活性」という語は、PIP2又はその代謝産物の1つの活性を表す。
【0039】
受容体が関与しうる別の信号経路は、cAMP代謝回転経路である。ここで、「サイクリックAMP代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、サイクリックAMP(cAMP)の代謝回転と代謝に関連する分子をも含む。サイクリックAMPは、一定のG−タンパク共役受容体のリガンド誘導の刺激に反応して生み出された二次メッセンジャーである。cAMP信号経路において、GPCRへのリガンドの結合は、酵素アデニルシクラーゼの活性化を引き起こし、これはcAMPの合成を触媒する。新しく合成されたcAMPは、cAMP依存タンパクキナーゼを次々に活性化する。この活性化したキナーゼは、電圧ゲートカリウムチャンネルタンパク又は関連したタンパクをリン酸化し、活動電位間においてカリウムチャンネルを開かなくする。カリウムチャンネルが開かないと、カリウムの外への流れが減少し、これは通常神経膜を再分極し、延長された膜分極を導く。
【0040】
GPCRを調整する薬剤を対象とすることによって、受容体により媒介された信号活性及び生物学的工程は、具体的な細胞及び組織において、活性化又は阻害される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。このような活性化作用及び阻害作用は、治療分野(哺乳動物療法)又は毒物分野(抗細胞療法、例えば制ガン剤)において生物学的活性を調整するための基礎として役立つ。
【0041】
発明の詳細な説明
一般説明
本発明はヒトゲノム配列決定に基づく。ヒトゲノムの配列解析及び構築において、配列情報を分析することにより、当該分野においてGPCRタンパク又はGPCRタンパクの一部であると特定されるタンパク/ペプチド/ドメインに、構造及び/又は配列の相同性を有するペプチドをコード化し、ヒトMas関連GPCRサブファミリーに関連するヒトゲノムの未知のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を利用することにより、付加的なゲノム配列が組み立てられ、転写及び/又はcDNA配列は単離され特徴付けられた。この分析に基づき、本発明は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーと関連するヒトGPCRペプチド及びタンパクのアミノ酸配列、転写配列型の核酸配列、これらのGPCRペプチド及びタンパクをコード化するcDNA配列及び/又はゲノム配列、核酸変異(対立変異体情報)、発現の組織分布、及び本発明のGPCRと構造又は配列の相同性を有する近似の公知タンパク/ペプチド/ドメインに関する情報を提供する。
【0042】
本発明において提供されるペプチドは、未知なだけでなく、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるかどうかに基づいて選択される。特に、本発明のぺプチドは、ヒトMas関連GPCRサブファミリーの公知のGPCRタンパクとの相同性及び/又は構造上の相関、及び観察される発現パターンに基づき選択される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この技術は、このタンパクファミリーのメンバー、及び本遺伝子と同様な発現型を持つタンパクのメンバーの、商業的な重要性を明確に確立した。本発明のペプチドのより具体的な機能及びその用途は、本明細書、特に発明の背景、及び図の注釈に説明されており、及び/又は公知のヒトMas関連GPCRファミリー又はGPCRタンパクのサブファミリーの技術において知られている。
【0043】
具体的な実施例
ペプチド分子
本発明は、タンパクのGPCRファミリーメンバーであり、ヒトMas関連GPCRサブファミリーであると特定され、タンパク分子をコード化する核酸配列を提供する。(タンパク配列は図2、転写/cDNA配列は図1、ゲノム配列は図3に提供される)。ここに示した明らかな変異体と同様に、図2に提供されたペプチド配列、例えば対立遺伝子変異は、本発明のGPCRペプチド、GPCRペプチド、あるいは本発明のペプチド/タンパクとしてここに参照される。
【0044】
本発明は、当技術の製造と用途におけるこれらペプチドのすべての明らかな変異だけでなく、図2に示されるGPCRペプチドのアミノ酸配列(図1の転写/cDNA配列、あるいは図3のゲノム配列の核酸分子よってコード化される)から成っているか、実質的に成っているか、又はそれを含む単離ペプチド及びタンパク分子を提供する。これらの変異は以下に詳細に説明される。
【0045】
ここでペプチドは、細胞物質、又は化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは均一に、又はある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な特徴は、調製物中に相当量の他成分が存在していたとしても、調製物がペプチドの所望の機能を発揮できるということである(単離核酸分子の特徴については以下に記述される)。
【0046】
ここで、「細胞物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約30%(乾燥重量)以下の他のタンパク(即ち汚染タンパク)、20%以下の他のタンパク、10%以下の他のタンパク、又は5%以下の他のタンパクを有するペプチド組成物を含む。ペプチドが組替えにより生産される場合、タンパク調製物の容量に対して培地が約20%以下の場合、培地を実質的に含まないとすることができる。
【0047】
「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、合成時において関与する化学前駆体又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物を含む。ある例においては、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、約30%(乾燥重量)以下の化学前駆体又は他の化学物質、20%以下の化学前駆体又は他の化学物質、10%以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は5%以下の化学前駆体又は他の化学物質を有するGPCRペプチド調製物を含む。
【0048】
単離GPCRペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製でき、それを発現するよう変異した細胞(組換体)から精製でき、或いは公知のタンパク合成手法を用いて合成できる。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。例えば、GPCRペプチドをコード化する核酸分子は、発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、タンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準的なタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【0049】
したがって、本発明は、図2で与えられたアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)からなるタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。このようなタンパクのアミノ酸配列は図2に提供される。このアミノ酸配列がタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、タンパクはそのアミノ酸配列からなる。
【0050】
本発明はさらに、図2で与えられたアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)から実質的になるタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が、例えば最終タンパク中に約1〜100の付加的な残基、典型的には約1〜20の付加的残基のように少ない付加的アミノ酸残基のみが存在する場合、タンパクは実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【0051】
本発明はさらに、図2に与えられるアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を含むタンパクを提供する。例えば、図1に示された転写/cDNA核酸配列(SEQ ID NO:1)、及び図3に示されたゲノム配列(SEQ ID NO:3)によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、タンパクはこのアミノ酸配列を含む。このように、タンパクは該ペプチドのみからなることができ、又は通常そのタンパクに関連する又は非相同アミノ酸残基/ペプチド配列であるアミノ酸残基(隣接コード化配列)のような、付加的アミノ酸分子を有することもできる。このようなタンパクは、わずかな付加的アミノ酸残基を有することができ、又は数百或いはそれ以上の付加的アミノ酸を有することもできる。本発明のGPCRペプチドを含む好ましいタンパクは、成熟タンパクに自然に生じる。これらの各種タンパクを調製/単離する方法を、以下に簡潔に説明する。
【0052】
本発明のGPCRペプチドは、キメラ又は融合タンパクを形成するために非相同配列と接合することができる。このようなキメラ又は融合タンパクは、GPCRペプチドと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する非相同タンパクに作用的に結合されたGPCRペプチドを含む。「作用的に結合された」とは、GPCRペプチドと非相同タンパクとがフレーム内に融合することを示す。非相同タンパクは、GPCRペプチドのN末端又はC末端に融合されることができる。
【0053】
ここで、融合タンパクはGPCRペプチドの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドGAL融合体、ポリ−His融合体、MYC付加体、HI付加体、及びIg融合体等の酵素融合タンパクを含むがこれらに限定されない。このような融合タンパク、特にポリ−His融合体は、本発明の組替えGPCRペプチドの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞(例えば哺乳類の宿主細胞)では、タンパクの発現及び/又は分泌が非相同信号配列を用いることで増加する。
【0054】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組替えDNA技術により生産することができる。例えば、異なるタンパク配列をコードするDNAフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に配置される。他の例では、融合遺伝子は自動DNA合成を含む従来技術により合成され得る。あるいは、二つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、その後アニールし、キメラ遺伝子配列を再増幅することにより、遺伝子フラグメントのPCR増幅を行うことができる(Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology,1992を参照)。さらに、既に融合部分をコード化した多くの発現ベクターが、商業的に入手可能である(例えばGSTタンパク)。GPCRペプチドコード化核酸は、発現ベクター等へクローニングすることができるので、融合部分はGPCRペプチドにフレーム内で結合される。
【0055】
上述のように、本発明は、ペプチドの天然由来の成熟型、ペプチドの対立遺伝子/配列変異体、天然由来でない組換えによるペプチドの変異体、及びペプチドのオルソログとパラログ等の本発明のタンパクのアミノ酸配列の明らかな変異体も提供し、使用可能にする。このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク生化学の分野における公知の技術を用い、容易に生成することができる。しかしながら、変異体は、本発明以前に公開されたいずれのアミノ酸配列をも含まない。
【0056】
このような変異体は、分子技術とここに開示された配列情報を用いて、容易に特定/製造できる。さらに、このような変異体は、本発明のGPCRペプチドに相同である配列及び/又は構造に基づき、他のペプチドと容易に区別できる。相同性/同一性の程度は、第一にペプチドが機能的変異体であるか非機能的変異体であるか、パラロググループに存在する分化量、及びオルトログ間の進化的相違に基づき判断される。
【0057】
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性%を決定するために、配列は最適な比較をするように並べられる(例えば、最適配列のため、ギャップは第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方あるいは両方に導入され、非相同配列は比較のため無視し得る)。好ましい例においては、参照配列の長さの30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%以上が比較のため並べられる。対応するアミノ酸配置あるいはヌクレオチド配置に対応したアミノ酸残基あるいはヌクレオチドが比較される。第一配列の配置が、第二配列の対応した配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、分子はその位置で同一である(ここで、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である)。2つの配列間の同一性%は、配列において共有される同一位置の数に相関があり、ギャップ数と各ギャップの長さを考慮し、ギャップは2つの配列の最適配置に導入される必要がある。
【0058】
2つの配列間の配列比較と、同一性%と類似性の定量は、数学的アルゴリズムを使って遂行できる。(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).好ましい例において、2つのアミノ酸配列の同一性%は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに装着されたNeedleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444−453 (1970))アルゴリズム(http://www.gcg.comより入手可)を用い、Blossom 62 matrix又はPAM250 matrix、及び16,14,12,10,8,6,4のギャップ重量、及び1,2,3,4,5又は6の長さ重量の両者を用いて決定される。さらに別の好ましい例において、2つのヌクレオチド配列の同一性%は、GCGソフトウェアパッケージ(Devereux,J.,et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984)(http://gcg.comより入手可))を用い、NWSgapdna.CMPマトリックス及び40,50,60,70又は80のギャップ重量、及び1,2,3,4,5,又は6の長さ重量を用いて決定される。異なる例において、2つのアミノ酸あるいはヌクレオチド配列の同一性%は、ALIGNプログラム(version 2.0)に装着されたE.Myers and W.Miller(CABIOS,4:11−17(1989))アルゴリズムを用い、PAM120重量残基テーブル、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを用いて決定される。
【0059】
本発明の核酸及びタンパクの配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を特定するために配列データペースに対する調査を行う「クエリー配列」として用いることができる。このような調査は、Altschul,et al(J.Mol.Biol.215:403−10(1990))のNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)を用いて行われる。BLASTヌクレオチド調査は、NBLASTプログラムにより行われ、スコア=100、ワードレングス=12で、本発明の核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク調査は、XBLASTプログラムを用い、スコア=50、ワードレングス=3で、本発明のタンパクに相同であるアミノ酸配列性を得ることができる。比較目的のためのギャップ配列を得るため、Altschul et al.(Nucleic Acid Res.25(17):3389−3402(1997))に記載されているGapped BLASTを用いることができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを用いる場合、対応プログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)の規定パラメータを用いることができる。
【0060】
成熟処理型(mature processed forms)と同様、本発明のペプチドの一つを含むタンパクの全長処理前型(full−length pre−processed forms)は、ここで提供される本発明のGPCRペプチドと同じ遺伝子位置によってコード化されるだけでなく、本発明のGPCRペプチドの一つと完全配列同一性を有するものとして、容易に特定できる。図3のデータに示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされた。
【0061】
本発明のGPCRペプチドの対立変異体は、ここで提供されるGPCRペプチドと同じ遺伝子位置でコード化されたものと同様、少なくともGPCRペプチドの部位で配列相同性/同一性の高い程度(重大な)を有するヒトタンパクとして容易に確認される。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマップされたゲノム配列のように、図3で提供される遺伝子情報に基づき容易に決定される。図3のデータに示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされた。
【0062】
ここで、2つのタンパク(あるいはタンパクの領域)は、アミノ酸配列が典型的には少なくとも約70〜80%、80〜90%、及びより典型的には少なくとも約90〜95%あるいはそれ以上の相同性を有するとき、強い相同性を有するとする。強い相同性を有するアミノ酸配列は、本発明によれば、より詳細には以下に示されるストリンジェント条件下で、核酸分子をコード化するGPCRペプチドに対してハイブリダイズされる核酸配列によりコード化される。
【0063】
GPCRペプチドのパラログは、少なくともGPCRペプチドの領域に対し、強い配列相同性/同一性の程度を有し、ヒト遺伝子によりコード化される、また同様の活性又は機能を有することが容易に確認できる。アミノ酸配列が典型的には少なくとも約60%以上、より典型的には約70%以上、与えられた領域あるいはドメインに相同性を有する場合、2つのタンパクは典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された核酸分子をコード化するGPCRペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【0064】
GPCRペプチドのオルトログは、少なくともGPCRペプチドの領域に対し、強い配列相同性/同一性の程度を有し、他の生物の遺伝子にコード化されることが容易に確認できる。好ましいオルトログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒト治療対象及び薬剤として開発される。このようなオルトログは、詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された、核酸分子をコード化するGPCRペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化され、タンパクを産生する2つの生物の相関性の程度に依存する。
【0065】
本発明のGPCRペプチドの天然由来でない変異体は、組換え技術を用いて容易に調製することができる。このような変異体は、GPCRペプチドのアミノ酸配列の削除、付加、置換を含むがこれに限られない。例えば、置換の1種として、維持アミノ酸置換が挙げられる。これらの置換は、近似した性質を有する他のアミノ酸によりGPCRペプチドのアミノ酸を置換するものである。維持置換は、脂肪族アミノ酸Ala,Val,Leu及びIle間の一方から他方への置換;ヒドロキシル残基Ser及びThrの交換;酸性残基Asp及びGluの交換、アミド残基Asn及びGln間の置換;塩基性残基Lys及びArgの交換;及び芳香族残基Phe及びTyr間の置換に典型的に認められる。いずれのアミノ酸置換が表現型的に能動的でないかに関する指針は、Bowie et al., Science 247:1306−1310(1990)に記載されている。
【0066】
変異体GPCRペプチドは完全に機能することもあり、あるいは例えばリガンド結合能、Gタンパク結合能、信号調整能等の1つ以上の活性において機能を失うこともある。完全に機能する変異体は、典型的には維持変異あるいは非致命的残基又は非致命的領域の変異を含む。図2はタンパク分析の結果を提供し、致命的ドメイン/領域の特定に用いることができる。機能的変異体は、変化のない、あるいは変化が機能上重要ではない近似アミノ酸の置換を含む。あるいは、このような置換はある程度、プラス又はマイナスに作用する。
【0067】
非機能的変異体は、典型的には、1つ以上の非維持的アミノ酸置換、欠失、挿入、転化、移動、又は致命的残基あるいは致命的領域における置換、挿入、転化又は欠失を含む。
【0068】
機能に必須なアミノ酸は、特定部位の変異誘発あるいはアラニンスキャニング変異誘発(Cunningham et al., Science 244:1081−1085(1989))等の当該分野で公知の方法によって特定され、特に図2に示す結果が用いられる。後者の手法は分子のすべての残基において1つのアラニン変異を導入するものである。得られた変異分子は、リガンド/効果基分子結合等の生物学的活性あるいはin vitroの延命活性等の活性について試験される。リガンド受容体結合に重要な位置は、また、結晶化、核磁気共鳴又は光学親和性標識(Smith et al., J.Mol.Biol.224:899−904(1992)); de Vos et al. Science 255:306−312(1992)) 等の構造分析により決定できる。
【0069】
本発明はさらに、GPCRペプチドのフラグメントを提供し、このフラグメントを含む及びこのフラグメントからなるタンパク及びペプチドに加えて、特に図2に特定される残基を含むフラグメントが含まれる。しかしながら、本発明が関連するフラグメントは、本発明以前に公知のフラグメントを含まない。
【0070】
ここで、フラグメントは、GPCRペプチドの少なくとも8,10,12,14,16あるいはそれ以上の隣接アミノ酸残基を含む。このようなフラグメントは、GPCRペプチドの生物学的活性の一つ以上を有する能力に基づき選択され、あるいは、例えばリガンドや効果基に結合する能力又は抗原として働く能力などにより選択される。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、ペプチドは、例えば8あるいはそれ以上のアミノ酸長を有する。このようなフラグメントは、典型的には活性部位、Gタンパク結合部位、貫膜ドメイン、あるいはリガンド結合ドメイン等の、GPCRペプチドのドメインあるいはモチーフを有する。さらに、可能なフラグメントは、フラグメントを含むドメインあるいはモチーフ、可溶性ペプチドフラグメント、及び抗原構造を有するフラグメントを含むが、これに限定されない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者に容易に利用可能な、よく知られたコンピュータプログラム(例えばPROSITE analysis)により容易に特定可能である。このような分析の一つの結果は図2に示されている。
【0071】
ポリペプチドは、20天然由来アミノ酸と通常呼ばれる20個のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、加工や翻訳後修飾等の天然の過程、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。GPCRペプチドに天然に起こる典型的な修飾は、基本テキスト、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている (図2において、これらの機能のいくつかが特定される)。
【0072】
知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパクへの転移RNA媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【0073】
従って、本発明のGPCRペプチドは、置換アミノ酸残基が、遺伝コードによってコード化されたものではない誘導体又は類似体、置換基が含まれる誘導体又は類似体、成熟GPCRペプチドが、GPCRペプチドの半減期を増加させる化合物(例えばポリエチレングリコール)等の別の化合物により融合されている誘導体又は類似体、あるいは付加的なアミノ酸が、リーダー又は分泌性の配列、成熟GPCRペプチド又はプロタンパクの精製のための配列等の成熟GPCRペプチドに融合した誘導体又は類似体も含む。
【0074】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に非常に詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びADPリボシル化はほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Proteins−Structure AND Molecular Properties, 2ndEd., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York(1993)が挙げられる。この主題についての多くの詳細な評論が入手でき、例えば Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnston, Ed., Academic Press, New York 1−12(1983);Seifter et al.(Meth. Enzymol. 182:626−646(1990)) AND Rattan et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48−62(1992))が挙げられる。
【0075】
タンパク / ペプチドの使用
本発明のタンパクは、抗体を引き起こす又は別の免疫反応を誘発するため;生物的液体のタンパク(又はその結合相手又は受容体)のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬(ラベル試薬を含む)として;対応したタンパクが優先的に発現される組織(形成的に、組織の分化又は発達の特別な段階において、あるいは病気の状態において)のマーカーとして;図及び背景に提供された機能的な情報と関連した実質的及び特異的なアッセイにおいて使われうる。タンパクが、別のタンパクに結合する又は潜在的に結合する所(例えば、受容体リガンド相互作用等において)では、タンパクを、結合相手を特定するために使用し、結合相互作用の阻害剤を特定するシステムを発達させることができる。これらの一部又は全ての用途を調査することにより、商業製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。
【0076】
上記の使用を達成するための方法は、当業者によく知られている。このような方法を示す文献には、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, や ”Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987 等がある。
【0077】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパクの種類/作用と同様にタンパク源に基づく。例えば、ヒトから単離されたGPCR及びそれらのヒト/哺乳動物オルソログは、特にGPCRを発現する細胞又は組織における生物学的又は病理学的反応を調整するための哺乳動物の治療剤、例えばヒトの薬剤に使用する特定試薬の対象として役立つ。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。すべての薬剤の約70%が、GPCR活性を調整する。無脊椎動物と哺乳動物オルソログの組合せは、無脊椎動物に特異的な薬剤を発見する選択的なスクリーニング方法において使用できる。背景や図における構造及び機能的な情報により、特に図1の発現情報との組み合わせにおいて、本発明の分子の明確で現実的な用途が提供される。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。このような用途は、当技術及び規定の実験において知られたここに提供された情報を使ってすぐに決定できる。
【0078】
本発明のタンパク(本発明より先に明らかにされた変異とフラグメントを含む)は、ヒトMas関連GPCRサブファミリーのメンバーと関連するGPCRと関連した生物学的アッセイに有益である。このようなアッセイは、公知のGPCR機能又は活性、あるいは、特にこの受容体を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属しているGPCRサブファミリーに特異的であるGPCR関連症状の診断と治療に有用な特性のいずれかに関係する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0079】
本発明のタンパクは、細胞系、又は無細胞系の薬剤スクリーニングアッセイにおいても有益である。細胞系は、天然型、すなわち受容体タンパクを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。他の実施例では、細胞ベースアッセイは受容タンパクを発現する組換えの宿主細胞を含む。
【0080】
ポリペプチドは、自然状態でタンパクの受容体活性を変調する化合物、又は受容体に関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型を特定するために用いることができる。本発明のGPCRと、適切な変異体及びフラグメントは、受容体への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするためのハイスループットスクリーンにおいて使用することができる。
【0081】
これらの化合物は、これらの受容体活性に対する化合物の影響を判定するために、機能性受容体に対してさらにスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性/効果を判定する試験することができる。化合物は、受容体を望ましい程度までに活性化(アゴニスト)又は不活性化(アンタゴニスト)すると特定される。
【0082】
さらに、本発明のタンパクは、受容体タンパクと、通常受容体タンパクと相互作用する分子(例えば、Gタンパク、あるいはcAMP又はホスファチジルイノシトール代謝回転及び/又はアデニル酸シクラーゼ、又はホスホリパーゼC活性化に関連する他の相互作用分子)との相互作用を促進又は抑制する能力により、化合物をスクリーンするために使用できる。このようなアッセイは一般的には、受容体タンパク又はフラグメントが対象分子と相互作用する条件下で、受容体タンパクと候補化合物とを結合する工程を含み、タンパクと対象との複合物の構成を検出する、あるいはGタンパクリン酸化、cAMP又はホスファチジルイノシトール代謝回転、アデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼC活性化等の信号伝達関連の効果等の受容体タンパクと対象と相互作用の生化学的結果を検出する。
【0083】
候補化合物には、例えば、1)最後部がIgの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリー(例えばLam et al., Nature 354:82−84(1991); Houghten et al., Nature 354:84−86(1991))や、D型及び/又はL型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド;2)ホスホペプチド(例えばランダムあるいは部分的変質したホスホペプチドライブラリー(例えばSongyang et al., Cell 72:767−778(1993) 参照)のメンバー); 3)抗体(例えば、Fab,F(ab‘)2、Fab発現ライブラリーフラグメント、抗体のエピトープ結合フラグメントだけでなく、ポリクロナール、モノクロナール、ヒューマナイズド、抗イディオティピック、キメラ、及び単一鎖抗体);及び4)小有機及び無機分子(例えば組み合わせ及び天然産物ライブラリーから得られる分子)等が例示的に含まれる。
【0084】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼすキナーゼを含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。従って、発明にはリガンドに競合するフラグメントは、例えばより高い親和性を持ち、又はリガンドを結合するが解放しないフラグメントが含まれる。
【0085】
本発明はさらに、受容体活性を変調(促進又は阻害)する化合物を同定するための、他の末端アッセイを含む。このアッセイは、一般的に受容体活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、増殖等の細胞工程、及び受容体タンパク依存信号カスケードに応答して上向き又は下向き調整される遺伝子発現の変化がアッセイされる。1実施例においては、このような遺伝子の規定領域は、発光酵素等の容易に発見できるマーカーに操作可能に接続できる。
【0086】
受容体により調整された生物学又は生化学の機能のうちのいずれもが、末端アッセイとして使われうる。これらは、ここに記載され、ここに文献が参照され、これら末端アッセイの対象に関する文献に参照され、及び当業者が知る他の機能あるいは図、特に図2に提供される情報により容易に特定される機能による生化学的、あるいは生化学/生物学的挙動のすべてを含む。特に、キナーゼを発現する細胞又は組織の生物学的機能が試験できる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0087】
結合及び/又は活性化化合物は、キメラキナーゼタンパクを用いスクリーニングすることができ、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、貫膜ドメイン全体又は一部(例えば7種の貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ)、及びカルボキシ末端細胞内ドメイン又はその一部は、非相同ドメイン又はサブレジオンに置換されうる。例えば、Gタンパク結合領域は、異なるGタンパクと相互作用し、天然受容体により認識されるものとして用いることができる。従って、信号転換要素の異なる組は活性化のエンドポイントアッセイに有用である。あるいは、全体の貫膜部分又はサブ領域(貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ等の)は、アミノの末端細胞外ドメイン及び/又はGタンパク結合領域が誘導される宿主細胞とは異なる宿主細胞に特有な全体の貫膜部分又はサブ領域と交換できる。これは、受容体が誘導される特定宿主細胞以外で行われるアッセイを可能とする。あるいは、アミノの末端細胞外ドメイン(及び/又は他のリガンド結合領域)は、異なるリガンドに結合するドメイン(及び/又は、他の結合領域)に交換可能であり、これにより、非相同アミノ末端細胞外ドメイン(又は領域)と相互作用するが、信号形質導入を起こすテスト化合物にアッセイを提供する。最後に、活性化は、天然の信号形質導入経路の一部である転写規定配列と操作可能に結び付けられた容易に発見できるコード化領域を含むレポーター遺伝子により検出できる。
【0088】
本発明のタンパクは、受容体と相互作用する化合物を発見するために設計された方法である競合結合アッセイに有用でもある。従って、ポリペプチドに結合又は相互作用することができる条件下で、化合物は受容体ポリペプチドに接触する(Hodgson, Bio/technology, 1992, Sept 10(9);973−80)。可溶性受容体ポリペプチドも混合物に加えられる。被検化合物が可溶性受容体ポリペプチドと相互作用する場合には、受容体対象から形成される複合物の量、あるいは活性が減少する。この種のアッセイは、特に受容体の特定領域に相互作用する化合物を探索する場合に有用である。そして、本発明の対象受容体領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象の領域に対応するペプチド配列を含むよう設計される。
【0089】
無細胞薬剤のスクリーニングアッセイを行うため、受容体タンパク又はフラグメント、あるいはその対象分子を免疫化することが好ましい場合があり、アッセイの自動化を可能とするだけでなく、タンパクの1つあるいは両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化する。
基質上のタンパクを免疫化する技術は、薬剤スクリーニングアッセイに用いられる。ある例において、融合タンパクは、タンパクが基質に結合することを可能にするドメインを付加するものである。例えば、グルタチオン−S−トラスフェラーゼ融合タンパクは、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis,MO)、又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞ライセート(lysates)(例えば35S−labeled)、対象化合物、又は複合物形成条件(例えば、塩及びpHの生理学的条件)下で培養された混合物と結合する。培養に続いて、ビーズは、結合していない標識を除くため洗浄され、基質は免疫化され、放射性ラベルが直接測定され、あるいは複合物を解離した後上澄みを測定する。あるいは、複合体は基質から解離され、SDS−PAGEにより分離され、ビーズ断片中に見出される受容体結合タンパクのレベルを、標準的な電気泳動技術によりゲルから定量する。例えば、ポリペプチドあるいはその対象分子のいずれかは、周知の方法により、ビオチン及びストレプトアビジンの共役を用いて免疫化する。あるいは、タンパクと反応するが該タンパクが対象分子と結合することを妨げない抗体をプレートのウェルに誘導し、抗体結合によりタンパクをウェルに取り付ける。受容体結合タンパク及び候補化合物の組成物は、受容体タンパク存在ウェル中で培養され、ウェルに取り付けられた複合物の量を定量することができる。このような複合体の検出方法としては、GST固定複合体による前述の方法に加えて、受容体タンパク対象分子に反応性のある抗体、又は、キナーゼタンパクに反応性があり対象分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及び対象分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【0090】
本発明のGPCRの一つを調整する薬剤は、上記アッセイの1つ以上を単独あるいは組み合わせて用いることで特定することができる。一般的には最初に細胞系又は無細胞系を用い、その後動物又は他のモデル系で活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は当技術において周知であり、この記載において容易に用いることができる。
【0091】
このような薬剤スクリーニングアッセイよって特定される受容体タンパク活性の変調剤は、受容体を発現する細胞又は組織を扱うことにより、受容体経路の異常制御の患者を治療するのに用いることができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。これらの治療方法は、医薬組成物中のGPCR活性の変調剤を治療に必要な量、患者に投与する工程を含み、変調剤はここに記載されたように特定されたものである。
【0092】
本発明の他の形態において、GPCRタンパクは、ツーハイブリッドアッセイあるいはスリーハイブリッドアッセイにおいて「バイトタンパク」として用いることができ(例えばU.S.Patent No.5,283,317;Zervos et al.(1993)Cell 72:223−232;Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.268:12046−12054;Bartel et al.(1993) Biotechniques 14:920−924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693−1696; 及びBrent WO94/10300参照)、GPCRと結合あるいは相互作用しGPCR活性に関与する他のタンパクを特定する。このようなGPCR結合タンパクは、GPCRタンパク、又はGPCR媒介信号経路の下流因子等のGPCR対象による信号伝達に関与している。このようなGPCR結合タンパクは、GPCR阻害剤であることがある。
【0093】
ツーハイブリッド系は、分離可能なDNA−結合及び活性化ドメインからなる多くの転写因子の変調性に依存する。簡潔に言えば、このアッセイは2つの異なるDNA構造を利用する。1つの構造においては、GPCRタンパクをコードする遺伝子は、公知の転写因子(例えばGAL−4)のDNA結合ドメインをコード化する遺伝子に融合されている。他方の構造においては、DNA配列ライブラリーから得られ、未知のタンパク(「prey」又は「sample」)をコード化しているDNA配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。 「bait」及び「prey」タンパクは相互作用が可能であり、in vivoでGPCR依存複合体を形成し、転写因子のDNA−結合及び活性化ドメインは近接する。この近接は、転写因子に応答する転写制御サイトへ動作可能に結合するリポーター遺伝子(例えばLacZ)の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能性転写因子を含む細胞コロニーが単離され、GPCRタンパクと相互作用するタンパクをコード化するクローン化遺伝子を得るのに用いることができる。
【0094】
本発明はさらに前記スクリーニングアッセイにより特定される新規薬剤に関する。従って、ここで記述された特定薬剤を適当な動物モデルで使用することも本発明の範囲内である。例えば、ここで記述された特定薬剤(例えば、GPCR調整薬剤、アンチセンスGPCR核酸分子、GPCR特異的抗体、あるいはGPCR結合対象)は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤で処理した場合の有効性、毒性、あるいは副作用を判定するために用いることができる。あるいは、ここで記述された特定薬剤は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤の挙動機構を判定するために用いることができる。さらに本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【0095】
本発明のGPCRタンパクは、また、ペプチドにより調整される疾患又は疾患の傾向を診断する対象を提供するのに有効である。従って本発明は、細胞、組織、又は生体中でのタンパク(あるいはコード化したmRNA)の存在又は程度を検出する方法を提供する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この方法は、生物サンプルと、受容体タンパクとの相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのようなマルチディテクション形態で提供される。
【0096】
サンプル中のタンパクを検出するある薬剤は、タンパクと選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルは、患者から単離した組織、細胞、及び生物的液体、同様に患者中の組織、細胞及び生物的液体を含む。
【0097】
本発明にかかるペプチドは、また、変異ペプチドを有する患者の活性タンパクの活性度、疾患、疾患の傾向、特に本発明のタンパクが属するタンパクグループの他のものにおいて知られている活性及び状態を診断する対象を提供する。そして、生物サンプルからペプチドを単離することができ、変異ペプチドを生じる遺伝子変異の存在をアッセイすることができる。これはアミノ酸置換、欠失、挿入、再配置(異常組織挙動の結果)、及び適当でない転写後変異を含む。分析方法は、変更された電気泳動、変更されたトリプティックペプチド消化、細胞系あるいは無細胞における変更された受容体活性のアッセイ、リガンドあるいは抗体結合パターンの変化、変化した当電点、直接アミノ酸配列、及びその他のタンパク中の変異を検出するのに有用な公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、シングル検出形態、あるいは抗体チップアレイのようなマルチ検出形態に適用できる。
【0098】
ペプチドのIn vitro検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISAs)ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ペプチドは、ラベルされた抗ペプチド抗体あるいは他種の検出薬剤を対象中に導入し、対象中でin vitroで検出することができる。例えば、抗体は放射性のマーカーによりラベルすることができ、その対象中における存在及び分布は標準的なイメージ化技術により検出することができる。対象中に発現されたペプチドの対立変異体の検出方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントの検出方法は、特に有用である。
【0099】
ペプチドはまた、薬理学的分析に有用である。薬理学では、変更された薬剤位置による薬剤への反応、及び影響されたヒトの異常挙動において、臨床的に重要な遺伝変異態を扱う。例えばEichelbaum,M.(Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10−11):983−985(1996))、及びLider, M.W.(Clin.Cem.43(2):254−266(1997))を参照。これらの変異体から生じる臨床結果は、個人の代謝の変動により、ある個人に対しては治療用薬剤の重篤な毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗となる。そして、個人の遺伝子型は、体への治療薬剤の作用、あるいは薬剤の体内代謝を決定する。さらに、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤挙動の強度と存続期間の両方に影響を与える。そして、個人の薬理学は、個人の遺伝子型に応じて、予防あるいは治療処置に効果的な薬剤及び効果的な薬剤の投与量の選択を可能とする。ある薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見は、なぜある患者に対しては期待された薬剤効果が得られず、または過大な薬剤効果を示し、あるいは標準的な薬剤投与量において重大な毒性を示すのかを明らかにするものである。多型は、強い代謝表現型と弱い代謝表現型とで表現される。従って、遺伝子多型は、ある集団に見られる受容体機能の1つ以上が他の集団のものとは異なり、受容体タンパクの対立タンパク変異体を導き出すものと思われる。よってペプチドは、治療方法に影響を与える遺伝子配置を確かめる対象となる。よってリガンドベース治療において、多型は、リガンド結合で多少能動的であるアミノ末端細胞外ドメイン及び/又は他のリガンド結合領域に起こり受容体を活性化する。従って、リガンド投与量は、多型を含む集団に対する治療効果を最大とするように調整されることが必要である。遺伝子型の代わりに特定の多型ペプチドを特定することもできる。
【0100】
ペプチドはまた、タンパクの発現の欠如、不適切あるいは不必要な発現により特徴づけられる異常を治療するためにも有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。従って治療方法は、GPCRタンパクあるいはフラグメントの使用も含むものである。
【0101】
抗体
本発明はまた、その変異やフラグメントだけでなく、本発明のペプチド及び該ペプチドのフラグメントを含むタンパクの一つに、選択的に結合する抗体を提供する。ここで抗体は、対象ペプチドと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない場合、選択的に対象ペプチドと結合する。抗体は、それが対象ペプチドと実質的に同種ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、そのタンパクが抗体の対象ペプチドのフラグメント又はドメインと同一性を共有する限り、選択的にペプチドと結合するとみなされる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【0102】
ここで抗体は、当技術において認識されるものと一致する用語で定義される:それらは、抗原の攻撃に応答して哺乳類生物により生産された、マルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、Fab又はF(ab’)2、及びFvフラグメント等の抗体のフラグメントだけでなく、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体も含むがこれに限定されない。
【0103】
与えられた対象ペプチドに対する抗体を生成及び/又は特定する多くの方法が知られている。このような方法の幾つかは、Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,(1989)に記述されている。
【0104】
一般的に、抗体を生成するには、単離されたペプチドを免疫原として用い、これを哺乳動物、例えばラット、ウサギあるいはマウスに投与する。全長タンパク、抗原ペプチドフラグメント又は融合タンパクを使用することができる。特に重要なフラグメントは、図2に特定されるような機能性ドメインをカバーするものであり、また相同配列又はグループの中での分化配列のドメインであり、これらはタンパク配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示される。
【0105】
抗体は、好ましくはGPCRタンパクの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能/活性、及び/又は受容体/結合相手相互作用を伴う領域を含む。配列整列により維持された特有の配列フラグメントを特定できるので、図2により特に重要な領域を特定することができる。
【0106】
抗原性フラグメントは通常、少なくとも8個の隣接アミノ酸残基を含む。しかしながら、該抗原性ペプチドは、少なくとも10、12、14、16又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域のようなタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメントのような、物理的性質により選択され得る、又は特有の配列に基づき選択され得る(図2を参照)。
【0107】
本発明の抗体の検出は、抗体を検知可能な物質へ共役(即ち、物理的な結合)させることにより行うことができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる;適当な補綴基複合物の例としては、ストレプタビジン/ビオチン、及びアビジン/ビオチンが含まれる;適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる;発光物質の例としては、ルミノールが含まれる;バイオ発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、125I、131I、35S、又は3Hが含まれる。
【0108】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術により、本発明のタンパクの一つを単離するために使用することができる。抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組替え的に生産されたタンパクからの、天然タンパクの精製を容易にすることができる。さらにこの抗体は、通常の発達の進行に渡って、生物の様々な組織間におけるタンパクの発現のパターンを決定するため、細胞又は組織中における該タンパクの存在を検知するのに有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。さらにこの抗体は、発現の豊富さ及びパターンを評価するために、in situ、in vitro、又は細胞溶解液あるいは上澄み中におけるタンパクを検知するために使用することができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行間における、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパクの循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を特定するために使用することができる。
【0109】
さらに抗体は、タンパク機能に関連した疾患の活性段階、又は該疾患素因を持つ個人等の、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現/加工された型により引き起こされる場合、抗体は通常のタンパクに対して調製することができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。もし変調がタンパクの特異的な変異により特徴付けられる場合には、この変異タンパクに特異的な抗体を、特異的な変異タンパクの存在のアッセイに使用することができる。
【0110】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用することができる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニターするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療効率をモニターするために使用することができる。
【0111】
さらに、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を特定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常タンパクのための免疫的マーカーとしての診断にも有用である。
【0112】
この抗体は、組織分類のためにも有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。従って、特異的なタンパクが特異的な組織の発現と関係している場合、このタンパクに特異的な抗体は、組織タイプを特定するために使用できる。
【0113】
抗体は、タンパク機能の阻害、例えば、リガンド等の結合相手へのGPCRタンパクの結合の阻害にも有用である。これらの使用は、タンパクの機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば結合を阻害し、これによりペプチドの活性を変調(作動又は拮抗)するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞あるいは細胞膜と関連する完全なタンパクに対して調製することができる。構造の情報としては、本発明のタンパクと関連する図2を参照。
【0114】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包む。このキットは、ラベル化又はラベル可能な抗体の等の抗体、及び生物サンプル中のタンパクを検知するための化合物又は試薬;サンプル中のタンパクの量を決定する手段;サンプル中のタンパクの量を基準と比較する手段;及び使用のための手引きを含むことができる。このようなキットは、単一のタンパク又はエピトープを検出するために供給される、あるいは抗体検出アレイ等において多数のエピトープのうちの1つを検出するために設定される。核酸アレイについてのアレイが以下に詳細に記述されるが、同様な方法が抗体アレイにも開発されている。
【0115】
核酸分子
本発明はさらに、本発明にかかるGPCRペプチド又はタンパクをコード化する単離核酸分子を提供する(cDNA、転移、及びゲノム配列)。該核酸分子は、本発明のGPCRペプチドの1つ、その対立変異体、又はそのオルソログあるいはパラログをコード化するヌクレオチド配列からなるか、本質的に該ヌクレオチド配列からなるか、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【0116】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムDNA中で核酸のフランキング配列(すなわち、5’、及び3’末端に位置する配列)は含まない。しかしながら、例えば、約5KB、4KB、3KB、2KB又は1KB以上又はこれ以下の、フランキングヌクレオチド配列があり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が離れた重要でないフランキング配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【0117】
さらに、転写/cDNA分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【0118】
例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は単離されていると考えられる。単離DNA分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えDNA分子、又は溶液中の精製(部分的に又は実質的に)されたDNA分子が挙げられる。単離RNA分子は、in vivo、又はin vitroでの本発明の単離DNA分子のRNA転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【0119】
従って、本発明は、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)よりなる核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【0120】
本発明はさらに、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)より実質的になる核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。このようなヌクレオチド配列が、ごくわずかの付加核酸残基とともに、最終的な核酸分子中に存在するとき、核酸分子はヌクレオチド実質的に配列から成る。
【0121】
本発明はさらに、図1又は3に示されるヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1の転写配列、及びSEQ ID NO:3のゲノム配列)を含む核酸分子、又は図2SEQ ID NO:2のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である核酸配列である時、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子は少しの付加的ヌクレオチドを有する、あるいは数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして製造され/単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【0122】
図1,3には、コード化及び非コード化配列の両方が提供されている。本発明のヒトゲノム配列(図3)、及びcDNA/転写配列(図1)により、図中の核酸分子は、ゲノムイントロニック配列、5´及び3´非コード化配列、遺伝子規定領域、及び非コード化相互ゲノム配列を含むことがある。一般的には、このような配列特徴は図1か3のどちらかに表示されており、当技術分野で知られている計算機を使って容易に特定できる。以下に述べられるように、いくつかの非コード化領域、特にプロモーターのような遺伝子特定要素は、例えば、非相同遺伝子発現の変調、化合物を変調する遺伝子活性を特定する対象として様々な目的に有用であり、ここに与えられるゲノム配列のフラグメントとして特に要求される。
【0123】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸(例えば成熟形態が1つ以上のペプチド鎖を有する場合)をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、アッセイ又は製造の際のタンパク操作の効率化、あるいは他の事由に役割を果たす。一般にin situの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【0124】
上記のように、単離核酸分子は、GPCRペプチドのみをコード化する配列、主又は副配列(例えばpre−pro 又はpro−タンパク配列)等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化5´及び3´配列のような転写はされるが翻訳はされず、転写、mRNA処理(スプライシング及びポリアデニル化信号を含む)、リボゾーム結合及びmRNAの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【0125】
単離核酸分子は、mRNAのようなRNA形態、あるいはcDNA及びクローニング又は化学合成技術又はこれらの組み合わせで得られたゲノムDNAを含むDNA形態でありえる。核酸、特にDNAは二重鎖又は一重鎖でありえる。一重鎖核酸はコード鎖(センス鎖)又は非コード鎖(アンチセンス鎖)でありえる。
【0126】
本発明はさらに、先に述べた本発明のGPCRタンパクの明らかな変異をコード化する核酸分子だけでなく、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、対立変異体(同じ位置)、パラログ(異なる位置)、オルソログ(異なる生物)等の天然に由来する、又はDNA組換え法あるいは化学合成により構成される。このような天然に由来しない変異は、核酸分子、細胞、又は生物に適用されるものを含む変異誘発技術により作られる。よって、上記のように、変異はヌクレオチドの置換、欠失、転化、及び挿入を含む。変異はコード化領域、非コード化領域の一方あるいは両方に起こりうる。変異は維持又は非維持アミノ酸置換を作る。
【0127】
本発明はさらに図1及び3に示される核酸分子の非コード化フラグメントを提供する。好ましい非コード化フラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が挙げられるが、これに限定されない。このようなフラグメントは非相同遺伝子発現を調整し、遺伝子変調薬剤を特定するスクリーンを発現するのに有用である。
【0128】
フラグメントは、12又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも30,40,50,100,250,又は500のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動領域をコード化し、又はDNAプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。ラベルされたプローブは、コード領域に対応する核酸を単離するcDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、又はmRNAをスクリーニングするために用いることができる。さらにプライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするPCR反応を用いることができる。
【0129】
プローブ/プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約12,20,25,40,50又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるストリンジェント条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【0130】
オルソログ、ホモログ、及び対立変異体は、当技術においてよく知られている方法により特定できる。ペプチドの項で記載したように、これらの変異体はペプチドをコードする核酸配列を含み、図面に示された核酸配列あるいはこの配列のフラグメントに対し、典型的には60〜70%、70〜80%,80〜90%、及びより典型的には90〜95%あるいはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図に記載されたヌクレオチド配列あるいはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるものとして、容易に特定することができる。対立変異体は遺伝子をコード化する遺伝子座により容易に決定することができる。
【0131】
図3に示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。
【0132】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも60〜70%の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約60%、少なくとも約70%、又は少なくとも約80%以上の相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、約45℃において6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でハイブリダイズし、続いて50〜65℃において、0.2XSSC、0.1%SDSで一回以上洗浄するという条件である。低いストリンジェントハイブリダイズ条件へ加減する例は、当技術においてよく知られている。
【0133】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、マッピング試薬、発現調整試薬及び生物学的アッセイに有用である。核酸分子は、図2に表現されたペプチドをコード化する全長cDNAとゲノムクローンを単離するため、及び図2に示すペプチドと同じ又は関連したペプチドを生成する変異体(対立遺伝子、オルソログ等)に関連するcDNAとゲノムクローンを単離するための、mRNA、転写/cDNA、及びゲノムDNAへのハイブリダイズプローブとして有益である。
【0134】
プローブは、図に示した核酸分子の全長にわたって、いずれかの配列にも対応することができる。従って、それは5´非コード化領域、コード化領域、及び3´非コード化領域から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【0135】
核酸分子は、PCRによる核酸分子のいずれかの与えられた領域のプライマーとして有用であり、また、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子の合成に有用である。このような分子は遺伝子分類やマッピング実験に有用であり、特にプローブ領域が、ここに表された対立変異体の1つ又はそれ以上を含む時に有用である。
【0136】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び/又は遺伝子生成物の発現状態をin situで変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について1以上の特に変異を引き起こすコード化領域に相同的に組換えることができる。
【0137】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部位を示すのにも有用である。
また、核酸分子は、in situハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体位置を決定するためのプローブとして有用である。図3に示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。
【0138】
核酸分子はまた、以下に詳しく説明するように、本発明の核酸分子の遺伝子特定領域を含むベクターを作るのに有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のmRNAに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
【0139】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【0140】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはDNA又はRNAで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で、発現及び/又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、GPCRタンパクの発現が増加又は減少することを含む異常の診断に等価である。
【0141】
mRNAの検出のin vitro技術は、ノーザンハイブリダイズ及びin situハイブリダイズを含む。DNA検出のin vitro技術は、サザンハイブリダイズ及びin situハイブリダイズを含む。
【0142】
プローブは、GPCRタンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の受容体コード化核酸、例えばmRNA又はゲノムDNAのレベルを測定すること、又は受容体遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。
【0143】
核酸発現アッセイは、特に受容体を発現する細胞又は組織でのGPCR核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【0144】
従って、本発明により、GPCR遺伝子の核酸発現に関連した異常、それを表現する細胞及び組織において、GPCRにより媒介される特別な生物学的および病理学的工程を処置するために使用できる化合物の特定のための方法が提供される。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。この方法は、典型的にはGPCR核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくないGPCR核酸の発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞系及び無細胞系で行うことができる。細胞系のアッセイは、GPCR核酸を自然に発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【0145】
GPCR核酸発現のためのアッセイは、mRNAレベル、又は信号経路に関係する副次的な化合物等の核酸レベルの直接的なアッセイを含むことができる。さらに、GPCRタンパク信号経路に反応して、上昇又は下降調節される遺伝子の発現も、アッセイされる。この例において、これらの遺伝子の規定領域は、発光酵素などのレポーター遺伝子と関連付けられうる。
【0146】
よって、GPCR遺伝子発現の変調剤は、細胞を候補化合物に接触させ、決定されたmRNAを発現させるという方法で特定される。候補化合物存在下でのGPCRmRNA発現のレベルは、候補化合物非存在下でのGPCRmRNA発現のレベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づいて核酸発現の変調剤として特定でき、例えば異常な核酸によって特徴付けられる異常の処置に使用できる。候補化合物存在下でのmRNA発現が、候補化合物非存在下でのmRNA発現と比較して顕著に大きい場合、候補化合物は核酸発現の誘発剤として特定される。候補化合物存在下でのmRNA発現が、候補化合物非存在下でのmRNA発現と比較して顕著に少ない場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【0147】
本発明はさらに、核酸を対象として、タンパクを発現する細胞又は組織において、GPCR核酸発現を変調する、特にタンパクを発現する細胞又は組織内で活性を変調する遺伝子変調剤として薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。変調は、上向き調整(例えば活性化又は作動化)又は下向き調整(抑制又は拮抗)の両方の調節、又は核酸発現を含む。
【0148】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパクを発現する細胞又は組織中でGPCR核酸発現を阻害する限り、GPCR核酸発現の変調剤は、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて特定される小分子又は薬剤であり得る。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。
【0149】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、GPCR遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。よって、遺伝子発現パターンは化合物による治療の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは、影響された細胞の化合物への生理的反応を暗示するマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは、化合物の投与量の増加、あるいは患者が耐性を示さない別の化合物の投与を認める。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【0150】
核酸分子はまた、GPCR核酸の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状を導き出す質的変化に有用である。核酸分子はGPCR遺伝子及びmRNAのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子は、GPCR遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。変異は、遺伝子中の1以上のヌクレオチドの欠如、付加、置換;転置又は転移のような染色体再配置;異常メチル化パターンのようなゲノムDNAの変化;増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。疾患がGPCRタンパクの過剰発現、過小発現又は変異発現による場合、機能障害に関連するGPCR遺伝子の変異体の検出により、疾患の活性又は疾患への感受性の診断ツールが提供される。
【0151】
GPCR遺伝子に変異を有する個人は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。図3のデータにより示されるように、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子はヒト染色体3にマップされた。GenomicDNAは直接分析されるか、または分析に先がけて、PCRを使って拡大できる。RNA又はcDNAも同様に使われうる。変異の検出は、ある用途では、アンカーPCR又はRACE PCRのようなポリメラーゼ鎖反応(PCR)(U.S.Patent No.4,683,195及び4,683,202参照)、又は異なるものではリゲーション鎖反応(LCR)(Landegran et al., Science 241:1077−1080(1988);及びNakazawa et al., PNAS 91:360−364(1994)参照)におけるプローブ/プライマーの使用を含み、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である(Abravaya et al., Nucleic Acids Res.23:675−682(1995)参照)。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程;細胞サンプルから核酸(例えばゲノム,mRNA又は両者)を単離する工程;核酸サンプルを遺伝子(もし存在すれば)のハイブリダイズ及び増幅が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした1以上のプライマーと接触させる工程;増幅生成物の存在又は不存在を検出する、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程;を含む。欠失及び挿入は増幅生成物を正常遺伝子型と比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅DNAを正常RNA又はアンチセンスDNAとハイブリダイズすることで特定することができる。
【0152】
あるいは、GPCR遺伝子の変異は、例えばゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
さらに、配列特定リボザイム(U.S. Patent No. 5,498,531)は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在を評点することに用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ、又は融点の違いによって、不一致の配列から区別することができる。
【0153】
特定領域の配列変化は、RNase及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異GPCR遺伝子と野性型遺伝子との間の配列相違は、直接DNA配列化により決定できる。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり(Naeve,C.W.,(1995)Biotechniques 19:448)、マススペクトルによる配列化を含む(PCT International Publication No.WO94/16101;Cohen et al., Adv.Chromatogr.36:127−162(1996);及びGriffin et al., Appl.Biochem. Biotechnol. 38;147−159(1993)参照)。
【0154】
遺伝子の変異を検出する他の方法には、RNA/RNA又はRNA/DNA二重鎖の不適合塩基を検出するため開裂試薬から保護する方法(Myers et al., Science 230;1242(1985));Cotton et al.,PNAS85:4397(1988);Saleeba et al.,Meth.Enzymol.217:286−295(1992))、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較する方法(Orita et al.,PNAS 86;2766(1989);Cotton et al., Mutat.Res.285:125−144(1993);及びHayashi et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.9:73−79(1992))、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型フラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法 (Myers et al., Nature 313:495(1985))が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【0155】
核酸分子は、治療方法に影響を及ぼすにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型の個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関(薬理ゲノム相関)についての研究に用いることができる。したがって、治療のために適切な化合物及び投与量を選択するために、ここに記載されている核酸分子を、個人のGPCR遺伝子の変異の評価に用いることができる。
【0156】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個人に対するテーラー治療に用いることのできる診断対象を提供する。従って、これらの多型を有する組換細胞及び動物の製造は、治療化合物及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【0157】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるGPCR遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。DNAアンチセンス核酸分子は、転写に関連する遺伝子の領域に相補的に設計され、転写及びその後のGPCRタンパクの製造を阻止する。アンチセンスRNA又はDNA核酸分子は、mRNAにハイブリダイズされ、mRNAのGPCRタンパクへの翻訳を阻止する。
【0158】
あるいは、アンチセンス分子の一種は、GPCR核酸の発現を減少させ、mRNAを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくないGPCR核酸発現により特徴づけられる異常を治療することができる。この技術は、mRNAの1以上の部分に、mRNAが翻訳される能力を減じるヌクレオチド配列を相補的に含むリボザイムによる開裂に関する。可能な部分はコード領域、特にリガンド結合領域のようなGPCRタンパクの触媒活性及び他の機能的活性に関連したコード領域である。
【0159】
核酸分子はさらに、GPCR遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。組み換え細胞は、ex vivoで調製され患者に戻される細胞を含み、個人の体内に導入されて、そこで細胞は個人の治療のために望ましいGPCRタンパクを生成する。
【0160】
本発明はまた、生物的サンプル中のGPCR核酸の存在を検知するキットを含む。図1の実験データにより、本発明のGPCRタンパクが、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットにより、ヒトの赤白血病細胞においての発現が示される。さらに、PCRベースの組織スクリーニングパネルにより、精巣での発現が示される。例えば、キットは、ラベル化された又はラベル化可能な核酸、あるいは生物学的サンプル中でGPCR核酸を検出することのできる試薬;サンプル中のGPCR核酸量を決定する手段;及び標準サンプルのGPCR核酸量と比較する手段;を含むことができる。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにGPCRタンパクmRNA又はDNAを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【0161】
核酸アレイ
さらに本発明により、図1及び3(SEQ ID NO:1及び3)で与えられる配列情報に基づく核酸分子のアレイ又はマイクロアレイ等の核酸検出キットが提供される。
【0162】
ここで用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを表す。1つの例において、マイクロアレイはU.S.Patent 5,837,832,Chee et al., PCT 出願 WO95/11995(Chee et al.),Lockhart,D.J.et al.(1996;Nat.Biotech.14:1675−1680)及びShena,M.et al.(1996;Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614−10619)に記載された方法にしたがって調製且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の例では、このようなアレイはBrown et al., U.S.Patent No.5,807,522に記載される方法により製造される。
【0163】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは多くの特異な単鎖核酸配列を含み、通常、固形担体に固定された合成アンチセンスオリゴヌクレオチド又はcDNAのフラグメントのいずれかを含む。オリゴヌクレオチドは好ましくは約6〜60のヌクレオチド長で、より好ましくは15〜30のヌクレオチド長、もっとも好ましくは約20〜25のヌクレオチド長である。ある種のマイクロアレイあるいは検出キットでは、好ましくはわずか7〜20のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。マイクロアレイあるいは検出キットは、既知の5’あるいは3’配列を包含するオリゴヌクレオチド、全長配列を包含する配列化オリゴヌクレオチド、あるいは配列の長さに沿った特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含む。マイクロアレイあるいは検出キットに用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子あるいは対象遺伝子グループに特異的なオリゴヌクレオチドである。
【0164】
マイクロアレイあるいは検出キット用に公知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するため、対象となる遺伝子(あるいは本発明により特定されるORF)は、典型的にはヌクレオチド配列の5’あるいは3’末端から開始する、コンピュータアルゴリズムを用いて検査される。典型的なアルゴリズムは、遺伝子に特異的な長さであり、ハイブリダイズに適した範囲にGC含有量を有し、ハイブリダイズを妨害する二次構造を有さないとされたオリゴマーを特定する。ある条件下で、マイクロアレイあるいは検出キット上のオリゴヌクレオチド対を用いることが好適である。「対」は同一で、好ましくは配列の中央部に位置する一つのヌクレオチドを除く。対の第二オリゴヌクレオチド(一方とは整合しない)はコントロールとなる。オリゴヌクレオチド対の数は2から百万である。オリゴマーは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロンあるいは多種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、あるいは他の適当な固体担体である。
【0165】
他の例では、オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはPCT出願 WO95/251116(Baldeschweiler等)に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列は、ドット(又はスロット)がcDNAフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、UV、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な装置(スロットブロット又はドットブロット装置)、材料(適当な固体担体のいずれか)及び機械(ロボット化設備)により製造され、8,24,96,384,1536,6144又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は市販の設備の効率的な用途に適している2〜100万のオリゴヌクレオチドを含む。
【0166】
マイクロアレイあるいは検出キットを用いたサンプル分析を行うため、生物サンプルから得られたRNAあるいはDNAをハイブリダイズプローブに調製する。mRNAは単離され、cDNAは製造され、アンチセンスRNA(aRNA)を製造する型として使用される。aRNAは蛍光ヌクレオチドの存在下に増幅され、ラベルされたプローブはマイクロアレイあるいは検出キットとともに培養され、プローブの配列はマイクロアレイあるいは検出キットのオリゴヌクレオチドに相補的にハイブリダイズされる。完全な相補性、又は様々な程度の少ない相補性を持つようにハイブリダイズが起こるよう、培養条件が調整される。非ハイブリダイズプローブが除かれた後、蛍光レベル及びパターンを決定するためスキャナーが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイあるいは検出キット上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的存在度を決定する検査を行う。生物的サンプルはいずれの体液(血液、尿、唾液、たん、胃液等)、培養細胞、生体組織、あるいは他の組織調製物からも得ることができる。検出システムは、すべての区別される配列についてハイブリダイゼーションの欠如、存在、及び量を測定するのに用いられる。このデータは、配列、発現型、変異、変異体又はサンプル間の多型の大規模な相互関係研究のために使用することができる。
【0167】
本発明は、このようなアレイを用い、本発明のGPCRタンパク/ペプチドの発現を特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを1以上の核酸分子と共に培養し、被検サンプル中の成分への核酸分子の結合をアッセイすることを含む。このアッセイは、典型的には多くの遺伝子を含む配列を含み、少なくとも1つは本発明の遺伝子及び/又は本発明のGPCR遺伝子の対立遺伝子である。
【0168】
核酸分子の培養条件は被検サンプルとともに変化する。培養条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、一般的に適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ形態を、ここに記述されたヒトゲノムの新規なフラグメントを用いるのに適するよう調製することができる。このようなアッセイの例は、Chard,T,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1986);Bullock,G.R.et al., Techniques in Immnocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol.1(1982),Vol.2(1983), Vol.3 (1985);Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassay: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1985) に記載されている。
【0169】
本発明の披検サンプルは、細胞、タンパク、又は細胞から得られる細胞膜抽出物を含む。上記の方法により使われた披検サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、及びアッセイされるサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変化する。核酸、又は細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と矛盾のないサンプルを得るために、容易に適応できる。
【0170】
本発明の他の例では、キットは本発明のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むように規定される。
【0171】
特に本発明は、(a)核酸プローブの一つ、例えばここに記述されるヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる核酸分子を含む第一の容器;及び(b)洗浄剤又は結合核酸の存在を検出することのできる試薬の一つ以上を含む一以上の容器を含む、小さく仕切られ、コンパートメント化されたキットを提供する。
【0172】
詳細には、コンパートメント化されたキットは、隔離された容器に試薬が入る各キットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ化材料を含む。このような容器は、一つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液(リン酸緩衝液、Tris緩衝液等)を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。当業者は、本発明の遺伝子をコード化する本発明の未特定GPCR遺伝子を、ここに開示された配列情報を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式、特に発現アレイに折り込んで用いることができる。
【0173】
ベクター / 宿主細胞
本発明はまた、ここに記載の核酸分子を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、核酸分子を輸送する媒体、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、一本鎖又は二本鎖のファージ、一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAウイルスベクター、あるいは人工染色体を含み、例えば、BAC、PAC、YAC、MACなどが挙げられる。
【0174】
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【0175】
本発明は、維持のためのベクター(クローニングベクター)あるいは核酸分子発現のためのベクター(発現ベクター)を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、あるいはその両者において機能することができる(シャトルベクター)。
【0176】
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第2の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクター自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び/又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【0177】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、mRNA転写を指示するプロモーターを含む。これは、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのlac、TRP、及びTACプロモーター、SV40からの初期及び後期プロモーター、CMV即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含むが、これらに限定されない。
【0178】
発現ベクターは、転写を促進するコントロール領域の他に、レプレッサー結合領域やエンハンサー等の転写調節領域をも含むことができる。例としては、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスLTRエンハンサーを含む。
【0179】
発現ベクターは、転写を開始及びコントロールするための領域を含む他、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合領域を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化信号だけでなく開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: Alaboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, NY (1989) に記載されている。
【0180】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来;バクテリオファージ由来;酵母エピソーム由来;酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来;バクロウイルス、SV40等のパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来;のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核宿主及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: Alaboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, NY (1989) に記載されている。
【0181】
調節配列は1つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく(すなわち、組織特異的)、あるいは、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような一つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核宿主及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【0182】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するDNA配列は、一つ以上の制限酵素によりDNA配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに結合することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び結合反応の手順は、当業者に良く知られている。
【0183】
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖あるいは発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌、及びネズミチフス菌を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、COSやCHO細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【0184】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパクの発現を増大し、組換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部位の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部位から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Xa因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、対象組換えタンパクに対してグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク、あるいはタンパクAとそれぞれ融合するpGEX (Smith et al., Gene 67:31−40 (1988))、 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)、及びpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。
【0185】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、pTrc (Amann et al., Gene 69:301−315 (1988)) 及び pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60−89 (1990))を含む。
【0186】
組換えタンパクの発現は、組換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する宿主細胞の能力が減じられている遺伝的背景を提供することにより、宿主細菌において最大化することができる(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119−128)。あるいは、関係のある核酸分子の配列は、大腸菌等の特定の宿主細胞に優先的コドンの使用を提供するように変更することができる(Wada et al., Nucleic Acids Res. 20:2111−2118 (1992))。
【0187】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばS. cerevisiae での発現のためのベクターの例としては、pYepSec1 (Baldari, et al., EMBO J. 6:229−234 (1987))、 pMFa (Kurjan et al., Cell 30:933−943(1982))、 pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113−123 (1987))、 及び pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。
【0188】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞(例えば、Sf 9 細胞)中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、pAc系(Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156−2165 (1983)) 及び pVL系 (Lucklow et al., Virology 170:31−39 (1989)) を含む。
【0189】
本発明のある例において、ここに記載の核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを用い、哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840(1987)) 及び pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187−195 (1987))を含む。
【0190】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用であり、当業者が利用可能な周知のベクターの単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖あるいは発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に認められる。
【0191】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向きにベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスRNAの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域及び非コード領域の両方を含むここに記載の核酸分子配列の全てあるいは一部に対して生産することができる。このアンチセンスRNAの発現は、センスRNAの発現に関する上記各パラメータに従う(調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現)。
【0192】
本発明は、ここに記載のベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核細胞、酵母等の下等真核細胞、昆虫細胞等の他の真核細胞、及び哺乳類細胞等の高等真核細胞を含む。
【0193】
組換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びSambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【0194】
宿主細胞は、一つ以上のベクターを含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、あるいは発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子等に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。一つ以上のベクターを細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、あるいは核酸分子ベクターに結合することができる。
【0195】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルスあるいはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製コンピテント(replication−competent)あるいは複製欠損(replication−defective)であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において、複製は起こる。
【0196】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構成物を含む細胞亜集団の選択ができる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、あるいは別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン抵抗性遺伝子を含む。しかしながら、表現型形質を選択する何れのマーカーも効果的である。
【0197】
成熟タンパクは、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、ここに記載のDNA構成物に由来するRNAを用いて、これらタンパクを生産するために無細胞転写及び翻訳系を使用することも可能である。
【0198】
ペプチド分泌が望まれるところでは、GPCR等のタンパクを含むマルチ貫膜ドメインが達成しづらく、適切な分泌信号がベクターに組み入れられる。信号配列は、ペプチドに対して内因性であるか、あるいはこれらのペプチドに対して非相同であることができる。
【0199】
ペプチドを媒体中に分泌しないところでは、それはGPCRの場合に典型的であるが、タンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【0200】
ここに記載のペプチドの組換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によって様々なグリコシル化パターンを有することができ、あるいは細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれない。さらに、宿主媒介工程の結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【0201】
ベクターと宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、細胞は、GPCRタンパクの生産、あるいは、さらに精製して所望量のGPCRタンパクやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【0202】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットだけでなく、前記のようなGPCRタンパクあるいはGPCRタンパクフラグメントに関連する細胞系アッセイにも有用である。従って、天然GPCRタンパクを発現する組換え宿主細胞は、GPCRタンパク機能を刺激あるいは抑制する物質アッセイに有用である。
【0203】
宿主細胞はまた、その機能に影響があるGPCRタンパク変異体の特定にも有用である。その変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その変異を含む宿主細胞は、天然GPCRタンパクに対しては示さないかもしれない効果であり、GPCRタンパク変異体に対しては望ましい効果(例えば、誘発機能や抑制機能)を有する化合物の分析に有用である。
【0204】
一般的に、設計された宿主細胞は、さらにヒト以外の形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくは哺乳類、例えば、ラットやマウス等の齧歯類であり、その動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の一つ以上の細胞型あるいは組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性DNAである。これらの動物は、GPCRタンパクの機能の研究、並びにGPCRタンパク活性の変調剤の特定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例としては、ヒト以外の霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【0205】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えば微量注入法、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。GPCRタンパクヌクレオチド配列は何れも、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【0206】
発現ベクターにおいて有用な調節配列あるいは他の配列は何れも、形質転換配列の一部を形成することができる。これは、もし既に含まれていない場合に、イントロン配列及びポリアデニル化信号を含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対してGPCRタンパクの発現を指示する。
【0207】
胚操作及び微量注入法による形質転換動物の生成方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、U.S.Patent No.4,736,866及びU.S.Patent No.4,870,009(共にLeder et al.)、U.S.Patent No.4,873,191(Wagner et al.)、並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物は、そのゲノム中の導入遺伝子及び/又はその動物の組織あるいは細胞中の形質転換mRNAの発現の存在に基づき特定することができる。形質転換の基礎動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組換え宿主細胞を用いて完全な動物あるいはその動物の組織を生産する動物も含む。
【0208】
別の例において、ヒト以外の形質転換動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージP1のcre/oxPリコンビナーゼシステムである。cre/oxPリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Lakso et al. PNAS 89:6232−6236 (1992)を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はS. cerevisiae のFLPリコンビナーゼシステムである(O’Gorman et al. Science 251:1351−1355 (1991))。cre/oxPリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Creリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、”複”形質転換動物の構築を通じて、例えば、2つの形質転換動物、すなわち、一つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む2つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【0209】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Wilmut, I. et al. Nature 385:810−813 (1997) 並びにPCT国際公開公報 WO 97/07668及びWO 97/07669に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルから脱してG0期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
【0210】
休止細胞は、その後、例えば電気パルスを使用して、その休止細胞を単離した動物と同種の動物由来の無核卵母細胞に対して、融合することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚又は尾胞に発達し、疑似妊娠雌養育動物に転移する。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンであろう。
【0211】
ここに記載のペプチドを発現する組換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをin vivo状況下で行うのに有用である。従って、in vivoに存在し、リガンド結合、GPCRタンパク活性化、及び信号形質導入に影響する様々な生理的因子は、in vitroの無細胞分析あるいは細胞系分析からは明らかでないかもしれない。従って、ヒト以外の形質転換動物の提供は、in vivoにおけるGPCRタンパク機能、例えば、リガンド相互作用、GPCRタンパク機能とリガンド相互作用に対する特異的変異GPCRタンパクの影響、並びにキメラGPCRタンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル変異、すなわち、実質的にあるいは完全に一つ以上のGPCRタンパク機能を除去する変異の影響を評価することもできる。
【0212】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい例に関連して記載しているが、クレームされた本発明はこのような特定の例に不当に限定されないことが理解されるべきである。特に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な前記本発明の実施態様の様々な修飾は、以下のクレームの範囲内であることを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明のGPCRをコード化するcDNA分子のヌクレオチド配列を提供する(SEQ ID NO:1)。さらに、ATG開始、終止、及び組織分布等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。図1の実験データにより、ヒトの赤白血病細胞と精巣に発現されることが示される。
【図2】
図2は、本発明にかかるGPCRの予測アミノ酸配列を提供する(SEQ ID NO:2)。さらに、タンパクファミリー、機能、及び修飾部位等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。
【図3】
図3は、本発明にかかるGPCRタンパクをコード化する遺伝子をスパンするゲノム配列を提供する(SEQ ID NO:3)。さらに、イントロン/エキソン構造、プロモーター位置等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。また図3は、本発明の新規Mas関連GPCRをコード化する遺伝子がヒト染色体3にマップされたことも示す。
Claims (23)
- 下記(a)〜(d)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
(a)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列。
(b)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
(c) SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
(d) SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも10個の隣接アミノ酸を含むもの。 - 下記(a)〜(d)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
(a)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列。
(b)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
(c) SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
(d) SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも10個の隣接アミノ酸を含むもの。 - 請求項2のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
- 下記(a)〜(e)からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
(a)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
(b)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
(c)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
(d)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも10個の隣接アミノ酸を含むもの。
(e)(a)〜(d)のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。 - 下記(a)〜(e)からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
(a)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
(b)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
(c)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
(d)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも10個の隣接アミノ酸を含むもの。
(e)(a)〜(d)のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。 - 請求項5の核酸分子を含む遺伝子チップ。
- 請求項5の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組換動物。
- 請求項5の核酸分子を含む核酸ベクター。
- 請求項8のベクターを含む宿主細胞。
- (a)〜(d)のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項1のペプチドのいずれかを製造する方法。
- (a)〜(d)のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項2のペプチドのいずれかを製造する方法。
- 請求項2のペプチドのいずれかの存在をサンプル中に検出する方法であり、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出できる検出試薬にサンプルを接触させ、該ペプチドの存在を検出することを含む方法。
- 請求項5の核酸分子の存在をサンプル中に検出する方法であり、ストリンジェント条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させ、オリゴヌクレオチドがサンプル中の核酸分子に結合するかどうかを判断することを含む方法。
- 請求項2のペプチドの変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判断することを含む方法。
- 該ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に試薬が投与される請求項14の方法。
- 請求項2のペプチドのいずれかに結合する試薬を特定する方法であり、ペプチドを該試薬に接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が成形されているかどうかを判断することを含む方法。
- 請求項16の方法により特定される試薬、及びその薬剤的に許容できる媒体を含む薬剤組成物。
- ヒトプロテアーゼにより媒介される疾患又は状態の治療方法であり、請求項16の方法により特定される試薬を薬剤的に効果的な量、患者に投与することを含む方法。
- 請求項2のペプチド発現の変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを発現する細胞を試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調するかどうかを判断することを含む方法。
- SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%が相同であるアミノ酸配列を有する本発明の単離ヒトプロテアーゼペプチド。
- SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%が相同である請求項20のペプチド。
- ヒトプロテアーゼペプチドをコード化する単離核酸分子であり、SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子と少なくとも80%が相同である核酸分子。
- SEQ ID NO:1(転写)又は3(ゲノム)に示される核酸分子と少なくとも90%が相同である請求項22の核酸分子。
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