JP2004531204A - G protein-coupled receptor - Google Patents

Abstract

The present invention provides polynucleotides that identify and encode human G protein-coupled receptor (GCREC) and GCREC. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with abnormal expression of GCREC.

Description

【００５９】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００６０】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００６１】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００６２】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００６３】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００６４】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。１つのエキソンがコードされたタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００６５】
「断片」は、ＧＣＲＥＣまたはＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの固有部分であって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のある断片の正確な長さとその断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１での領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【００６８】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００６９】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００７０】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００７１】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００７２】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）から提供されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他）、これはメリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ：５ 及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ：２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７３】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００７４】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００７５】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【００７６】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ：１１ 及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７７】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【００７８】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００７９】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定できる。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【００８０】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約０．１％のＳＤＳの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【００８２】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【００８３】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００８４】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【００８５】
「免疫原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなＧＣＲＥＣのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なＧＣＲＥＣの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【００８６】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【００８７】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【００８８】
「調節（する）」の語は、ＧＣＲＥＣの活性の変化を指す。調節することによって例えば、ＧＣＲＥＣのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【００８９】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【００９０】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【００９１】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、成分に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【００９２】
ＧＣＲＥＣの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク分解性開裂及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。 これらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、ＧＣＲＥＣの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。
【００９３】
「プローブ」は、ＧＣＲＥＣ、ＧＣＲＥＣの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【００９４】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【００９５】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ他 （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【００９６】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【００９７】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【００９８】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【００９９】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１００】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１０１】
本明細書において、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１０２】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＧＣＲＥＣをコードする核酸若しくはその断片、またはＧＣＲＥＣ自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞、染色体、細胞小器官または細胞から単離された膜からの抽出物や、細胞や、溶解しているか基板に結合しているゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡや、組織や、組織プリント等から構成され得る。
【０１０３】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１０４】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１０５】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１０６】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１０７】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１０８】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１０９】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に与えられている。
【０１１０】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの異なるスプライシングによって通常、ポリヌクレオチドがより多くまたはより少数の塩基を有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１１１】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
（発明）
本発明は、新規なヒトＧタンパク質（ＧＣＲＥＣ）と、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドと、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫／炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくものである。
【０１１２】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１１３】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示し、更に該当箇所には適当な参考文献も示す。 これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１１４】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１１５】
合わせて、表２及び表３は本発明のポリペプチドの特性を概略的に示している。 これらの特性は、特許請求の範囲に記載されたポリペプチドがＧタンパク質共役受容体であることを証明する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はマウス嗅覚受容体Ｃ６ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３９８３３７４）と５６％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは３．２ｅ−９０であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、膜７回貫通（ロドプシンファミリー）ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１が嗅覚Ｇタンパク質共役受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の解析のためのアルゴリズム及びパラメータは表５に記述する。
【０１１６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリヌクレオチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリヌクレオチド配列の長さ（塩基対単位）を示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１１７】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリを指す場合もある。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリに由来する。或いは列５の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡまたはＥＳＴを指す場合もある。或いは列５の識別番号は、ゲノムＤＮＡのＧｅｎｓｃａｎ分析により予想されるコード領域を指す場合もある。例えば、ＧＮＮ．ｇ９９６５５１８＿０００００１＿０３２ は、Ｇｅｎｓｃａｎ推定コード配列の識別番号であって、ｇ９９６５５１８ がＧｅｎｓｃａｎ分析によって得られたＧｅｎＢａｎｋの配列の識別番号である。このＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列は、配列を構築する前に編集されている場合がある。（実施例４を参照）。さらに、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列を同定し得る（即ち「ＥＮＳＴ」命名を含む配列）。或いは、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースから由来する場合もあり（即ち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓから由来する場合もある（即ち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ_１＿Ｎ_２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ_３＿Ｎ_４ はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がＸＸＸＸＸＸであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がＹＹＹＹＹ であり、（もし存在すれば）Ｎ_{１，２，３．．}が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である（ 実施例５参照 ）。または、列５の識別番号は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎ は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 識別番号である。（実施例５を参照。）あるＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、ＲｅｆＳｅｑ識別番号（「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表される）が、ＧｅｎＢａｎｋ識別（即ち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用される場合もある。
【０１１８】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。

【０１１９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために列５に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１２０】
本発明には、ＧＣＲＥＣの変異体も含まれる。好適なＧＣＲＥＣの変異体のアミノ酸配列は、ＧＣＲＥＣアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、或いは少なくとも約９５％もの一致率を有し、ＧＣＲＥＣの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するような変異体である。
【０１２１】
本発明には、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドも含まれる。特定の実施例において、本発明は、ＧＣＲＥＣをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１２２】
本発明には、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含むポリヌクレオチドの変異体を含み、この変異体はＳＥＱ ＩＤ：２の核酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。 上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、ＧＣＲＥＣの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１２３】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、ＧＣＲＥＣをコードする多数のポリヌクレオチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）を産出し得ることは理解できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のＧＣＲＥＣのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【０１２４】
ＧＣＲＥＣ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のＧＣＲＥＣのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、ＧＣＲＥＣまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなくＧＣＲＥＣ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するＲＮＡ転写物の作製がある。
【０１２５】
本発明には、ＧＣＲＥＣ、ＧＣＲＥＣ誘導体及びこれらの断片をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてＧＣＲＥＣまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１２６】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１等を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１２７】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ 或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０１２８】
ＧＣＲＥＣをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られているＰＣＲ法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、 Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８３２２を参照。）別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６。）第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している。（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１２９】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１３０】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１３１】
本発明の別の実施例では、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、適切な宿主細胞内でＧＣＲＥＣ、ＧＣＲＥＣの断片またはその機能的等価物を発現させるような組換えＤＮＡ分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重に起因して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のＤＮＡ配列を作製してＧＣＲＥＣの発現に利用し得る。
【０１３２】
種々の目的でＧＣＲＥＣがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。 ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１３３】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＳＥＣＰの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＳＥＣＰの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１３４】
別の実施例によれば、ＧＣＲＥＣをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ７．２２５−２３２を参照）。或いは、化学的方法を用いてＧＣＲＥＣそれ自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（たとえば、 Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ； Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２２０４を参照。）自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＧＣＲＥＣのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１３５】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページ等を参照）。
【０１３６】
生物学的に活性なＧＣＲＥＣを発現させるために、ＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。 好適な発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型プロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、ＧＣＲＥＣをコードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＧＣＲＥＣをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２．等を参照）。
【０１３７】
当業者によく知られている方法を用いて、ＧＣＲＥＣをコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， および１６−１７章； およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章、１３章および１６章を参照）。
【０１３８】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＧＣＲＥＣをコードする配列を保持及び発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． ａｎｄ Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． ら （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． ら （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． ら （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１３９】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。ＧＣＲＥＣをコードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。多量のＧＣＲＥＣが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、ＧＣＲＥＣの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１４０】
酵母の発現系を使用してＧＣＲＥＣを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１：１８１−１８４．を参照）。
【０１４１】
植物系を使用してＧＣＲＥＣを発現することも可能である。ＧＣＲＥＣをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターを単独で、或いは、ＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いて促進し得る。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ等を参照。
【０１４２】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、ＧＣＲＥＣをコードする配列は、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結反応され得る。非必須のＥ１またはＥ３領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でＧＣＲＥＣを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１４３】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１４４】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のＧＣＲＥＣの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、ＧＣＲＥＣをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１４５】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． ら （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７３５７０； ＣｏｌｂｅｒｅＧａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１１４ 等を参照。）この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ． および Ｒ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１を参照。）可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０１４６】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＧＣＲＥＣをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ＧＣＲＥＣをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または単一プロモーター制御下で、ＧＣＲＥＣをコードする配列とタンデムにマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１４７】
一般に、ＧＣＲＥＣをコードする核酸配列を含み且つＧＣＲＥＣを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【０１４８】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＧＣＲＥＣの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。ＧＣＲＥＣ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他 （１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１４９】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅法がある。或いは、ＧＣＲＥＣをコードする配列またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１５０】
ＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するＧＣＲＥＣの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計し得る。
【０１５１】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１５２】
本発明の別の実施例では、ＧＣＲＥＣをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列または組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもたらす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラＧＣＲＥＣタンパク質は、ＧＣＲＥＣ活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し、ＧＣＲＥＣが精製後に異種部分から切断され得るように、ＧＣＲＥＣコード配列と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解性開裂部位を含めることもできる。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１５３】
本発明の更に別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、放射能標識したＧＣＲＥＣの合成がｉｎ ｖｉｔｒｏで可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば^３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１５４】
本発明のＧＣＲＥＣまたはその断片を用いて、ＧＣＲＥＣに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＧＣＲＥＣへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１５５】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＧＣＲＥＣの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＧＣＲＥＣが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＧＣＲＥＣを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＧＣＲＥＣを発現する細胞またはＧＣＲＥＣを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＧＣＲＥＣまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１５６】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＧＣＲＥＣと結合させるステップと、ＧＣＲＥＣとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１５７】
本発明のＧＣＲＥＣまたはその断片を用いて、ＧＣＲＥＣの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＧＣＲＥＣの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも１つの試験化合物をＧＣＲＥＣと混合し、試験化合物の存在下でのＧＣＲＥＣの活性を試験化合物不在下でのＧＣＲＥＣの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＧＣＲＥＣの活性の変化は、ＧＣＲＥＣの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＧＣＲＥＣの活性に適した条件下でＧＣＲＥＣを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＧＣＲＥＣの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１５８】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＧＣＲＥＣまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１５９】
ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０１６０】
ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＧＣＲＥＣを乳汁内に分泌するなどＧＣＲＥＣを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
（治療）
化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が、ＧＣＲＥＣの領域とＧタンパク質共役受容体間に存在する。従ってＧＣＲＥＣは、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫／炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症において或る役割を果たすものと考えられる。ＧＣＲＥＣの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＧＣＲＥＣの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＧＣＲＥＣの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１６１】
従って、或る実施例において、ＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＧＣＲＥＣまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には増殖異常、神経の疾患、心血管疾患、胃腸疾患、自己免疫／炎症性の疾患、代謝障害、およびウイルス感染が含まれ、増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍や、血栓崩壊、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術、および大動脈冠動脈バイパス術移植手術の合併症や、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、代謝障害の中には、糖尿病、肥満症、および骨粗鬆症などが含まれ、感染症の中には、アデノウイルス及びアレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、トンガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染が含まれる。
【０１６２】
別の実施例では、ＧＣＲＥＣまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６３】
更に別の実施例では、実質的に精製されたＧＣＲＥＣを含む成分を好適な医薬用キャリアーと共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６４】
更に別の実施例では、ＧＣＲＥＣの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６５】
更に別の実施例では、患者にＧＣＲＥＣのアンタゴニストを投与して、ＧＣＲＥＣの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫／炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、或いはＧＣＲＥＣを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは輸送機構として間接的にＧＣＲＥＣと特異結合する抗体を用いることができる。
【０１６６】
別の実施例では、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＧＣＲＥＣの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６７】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１６８】
ＧＣＲＥＣのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたＧＣＲＥＣを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、ＧＣＲＥＣと特異結合するものを同定することが可能である。ＧＣＲＥＣの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１６９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、ＧＣＲＥＣ、またはＧＣＲＥＣの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０１７０】
ＧＣＲＥＣに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。ＧＣＲＥＣアミノ酸の短い伸長部は、別のタンパク質、例えばスカシガイのヘモシニアンの配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１７１】
ＧＣＲＥＣに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他 （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他 （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他 （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０１７２】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照。）或いは、一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られている方法を用いて、ＧＣＲＥＣ特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０１７３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他 （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他 （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９等を参照）。
【０１７４】
ＧＣＲＥＣのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）_２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）_２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１等を参照）。
【０１７５】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。 このようなイムノアッセイは通常、ＧＣＲＥＣとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与している。２つの非干渉性ＧＣＲＥＣエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるような、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合アッセイを利用してもよい（前出のＰｏｕｎｄの文献）。
【０１７６】
ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を用いて、ＧＣＲＥＣに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Ｋａで表す。 Ｋａは、平衡状態においてＧＣＲＥＣ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なＧＣＲＥＣエピトープに対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したＫａは、ＧＣＲＥＣ抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のＧＣＲＥＣエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定したＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が約１０^９〜１０^１２ Ｌ／ｍｏｌの範囲にあるような高親和性抗体試薬は、ＧＣＲＥＣ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＧＣＲＥＣが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 （Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１７７】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異抗体を含むポリクローナル抗体試薬は、ＧＣＲＥＣ抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ らの文献等を参照）。
【０１７８】
本発明の別の実施例では、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド、ＧＣＲＥＣの任意の断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＧＣＲＥＣをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、ＰＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＧＣＲＥＣをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， ｅｄ． （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照。）
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５； およびＳｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５） ９（１３）：１２８８−１２９６を参照。）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６． 等を参照）。
【０１７９】
本発明の別の実施例では、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． ら （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． ら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ． ら （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． ら． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５ Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． ら （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、並びにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＧＣＲＥＣの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からＧＣＲＥＣを発現することにより、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。
【０１８０】
本発明の更なる実施例では、ＧＣＲＥＣをコードする哺乳動物発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってＧＣＲＥＣ欠損細胞に導入することによって、ＧＣＲＥＣの欠損による疾患や異常症を治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． 及び Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． 及びＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０１８１】
限定するものではないがＧＣＲＥＣの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）及びＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）がある。ＧＣＲＥＣを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＧＣＲＥＣをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０１８２】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰＥＲＦＥＣＴ ＬＩＰＩＤ ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ ＫＩＴ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． 及び Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０１８３】
本発明の別の実施例では、ＧＣＲＥＣの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターまたは独立プロモーターの制御下でＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加レトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他 （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４^＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０１８４】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、ＧＣＲＥＣの発現に関連する１つ若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを輸送する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 及び Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． 及び Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１８５】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、ＧＣＲＥＣの発現に関連する１つ若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを輸送する。ＨＳＶが親和性を有するような中枢神経系の細胞にＧＣＲＥＣを導入する際には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターの使用は特に役立つ。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． ら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ 及び Ｘｕ， Ｈ． ら （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０１８６】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． 及び Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＧＣＲＥＣに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに導入することにより、ベクター導入細胞において多数のＧＣＲＥＣコードＲＮＡが産生され、高レベルのＧＣＲＥＣが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。αウイルスの宿主の範囲が広いことにより、様々な細胞タイプへのＧＣＲＥＣの導入が可能になる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０１８７】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．ａｎｄ Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページ等を参照。）相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０１８８】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子は、ＧＣＲＥＣをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０１８９】
任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０１９０】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＧＣＲＥＣをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０１９１】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０１９２】
本発明の追加実施例は、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＧＣＲＥＣの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＧＣＲＥＣの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０１９３】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。 通常、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０１９４】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０１９５】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０１９６】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような成分は、ＧＣＲＥＣ、ＧＣＲＥＣに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＧＣＲＥＣインヒビターから構成し得る。
【０１９７】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０１９８】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０１９９】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２００】
特殊形状の成分は、ＧＣＲＥＣまたはその断片を含む高分子を直接細胞内輸送するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。或いは、ＧＣＲＥＣまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質から短い陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２０１】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２０２】
治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にする。 そのような活性成分の例としては、ＧＣＲＥＣまたはその断片、ＧＣＲＥＣの抗体、ＧＣＲＥＣのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ_５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２０３】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２０４】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
（診断）
別の実施例では、ＧＣＲＥＣの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或いはＧＣＲＥＣやＧＣＲＥＣのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者をモニターするためのアッセイにおいて、ＧＣＲＥＣを特異的に結合する抗体が用いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＧＣＲＥＣの診断アッセイには、抗体及び標識を利用してヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてＧＣＲＥＣを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２０５】
ＧＣＲＥＣを測定するための様々なプロトコル、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ等が本技術分野において知られており、ＧＣＲＥＣ発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対象から採取した体液または細胞抽出とＧＣＲＥＣに対する抗体とを結合させることにより、ＧＣＲＥＣ発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したＧＣＲＥＣの量、対照、生検組織からの病変サンプルを標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２０６】
本発明の別の実施例によれば、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、検体におけるＧＣＲＥＣの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、ＧＣＲＥＣの不在、存在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にＧＣＲＥＣレベルの調製をモニターするために用いることができる。
【０２０７】
ある実施形態では、ＧＣＲＥＣをコードする核酸配列を同定するために、ＧＣＲＥＣまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同定するのはＧＣＲＥＣ、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在する配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。 ここで、プローブの特異性とは、プローブが高特異領域（例えば５’調節領域）からなるのか、低特異領域（例えば保存されたモチーフ）からなるのかということである。
【０２０８】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はＧＣＲＥＣをコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列、或いはＧＣＲＥＣ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２０９】
ＧＣＲＥＣをコードするＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、ＧＣＲＥＣまたはＧＣＲＥＣ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、^３２Ｐまたは^３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２１０】
ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＣＲＥＣの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には増殖異常、神経の疾患、心血管疾患、胃腸疾患、自己免疫／炎症性の疾患、代謝障害、およびウイルス感染が含まれ、増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、心血管疾患の中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍や、血栓崩壊、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術、および大動脈冠動脈バイパス術移植手術の合併症や、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、代謝障害の中には、糖尿病、肥満症、および骨粗鬆症などが含まれ、感染症の中には、アデノウイルス及びアレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、トンガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染が含まれる。ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベースの技術と、ＰＣＲ法と、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）法、ピン及びマルチフォーマットＥＬＩＳＡ様アッセイと、変異ＧＣＲＥＣの発現を検出するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２１１】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、ＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。ＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が対照サンプルと比べて著しく変化している場合は、サンプル内のＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２１２】
ＧＣＲＥＣの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あるいは標準プロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、ＧＣＲＥＣをコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２１３】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２１４】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２１５】
ＧＣＲＥＣをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利用することは、ＰＣＲの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２１６】
或る態様において、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて１塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡの増幅を行う。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２１７】
ＧＣＲＥＣ の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、 Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ． 他 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：２３５２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． 他 （１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９２３６を参照。）目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２１８】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２１９】
別の実施例では、ＧＣＲＥＣに特異的な抗体、ＧＣＲＥＣまたはその断片をマイクロアレイ上で要素として用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２２０】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２２１】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２２２】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． 及び Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２２３】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２２４】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２２５】
タンパク質の（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）プロフィールは、ＧＣＲＥＣに特異的な抗体を用いてＧＣＲＥＣ発現レベルを定量することによっても作成し得る。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２２６】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． 及び Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２２７】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２２８】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２２９】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他の （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２３０】
本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイブリダイゼーションプローブを産出するため、ＧＣＲＥＣをコードする核酸配列を用いることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（例えば、 Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４； ａｎｄ Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４を参照。）一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。（例えば、 Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照。）
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， ら （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ．等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上の、ＧＣＲＥＣをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２３１】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２３２】
本発明の別の実施例では、任意の種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のライブラリをスクリーニングするために、ＧＣＲＥＣ、ＧＣＲＥＣの触媒作用断片、免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＧＣＲＥＣとテストされる薬剤との結合複合の形成は計測できる。
【０２３３】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ， 他 （１９８４） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８４／０３５６４等を参照。）この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＧＣＲＥＣ或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したＧＣＲＥＣを検出する。 精製したＧＣＲＥＣはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２３４】
別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。 このアッセイでは、ＧＣＲＥＣを結合することができる中和抗体が、ＧＣＲＥＣを結合するための試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、１個若しくは数個の抗原決定因子をＧＣＲＥＣと共有するペプチドの存在を検出する。
【０２３５】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、ＧＣＲＥＣをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０２３６】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２３７】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第６０／２３８，３９４号に言及することをもって本明細書の一部とする。
（実施例）
１ ｃＤＮＡ ライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２３８】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２３９】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ（３００〜１０００ｂｐ）選択は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でｃＤＮＡを消化した。 好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１ プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、ｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２４０】
２ ｃＤＮＡ クローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 １のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２４１】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２４２】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２４３】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＩＭＰＳに基づくプログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースの選択に対してＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５等を参照。）問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベース、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２４４】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表５に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表５の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
【０２４５】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０２４６】
４ ゲノム ＤＮＡ からのコード配列の同定及び編集
Ｇｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを公衆のゲノム配列データベース（例えばｇｂｐｒｉ及びｇｂｈｔｇ）に対して実行することにより、推定上のＧタンパク質共役受容体を先ず同定する。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からのゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４を参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。いずれのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列がＧタンパク質共役受容体をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＧタンパク質共役受容体のためのＰＦＡＭモデムに対して問い合わせることにより分析した。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の相同体をＧタンパク質共役受容体として注釈を付けてきたことにより、潜在的Ｇタンパク質共役受容体も同定した。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または未編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２４７】
５ ｃＤＮＡ 配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライシング変異体を生み出した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２４８】
６ ＧＣＲＥＣ をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配列のクラスターに構築した（表５）。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２４９】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２５０】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． ら， ４章及び１６章等を参照）。
【０２５１】
ＢＬＡＳＴを適用した類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬｉｆｅＳｅｑ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等のｃＤＮＡデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【数１】

積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０２５２】
或いは、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、ＧＣＲＥＣをコードするｃＤＮＡの組織特異発現および疾患特異発現を反映する。 ｃＤＮＡ配列及びｃＤＮＡライブラリ／組織情報については、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）で見られる。
【０２５３】
８ ＧＣＲＥＣ をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０２５４】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２５５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。 プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ６０度で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存。 プライマー対Ｔ７、ＳＫ＋に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを用いた。 ステップ１： ９４℃で３分間 ステップ２： ９４℃で１５秒 ステップ３： ５７℃で１分間 ステップ４： ６８℃で２分間 ステップ５： ステップ２、３、４を２０回繰り返す ステップ６： ６８℃で５分間 ステップ７： ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するべくプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２５６】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２５７】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０２５８】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−^３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて十分に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０２５９】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０２６０】
１０ マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０２６１】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０２６２】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖合成バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートされた後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール析出させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０２６３】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０２６４】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で非常に良く洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０２６５】
米国特許第５，８０７，５２２号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０２６６】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０２６７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中のＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成生成物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ^２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０２６８】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０２６９】
２つの異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０２７０】
スキャンの感度は通常、既知濃度でサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により発生されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比１：１００，０００でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０２７１】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データはまず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０２７２】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０２７３】
１１ 相補的ポリヌクレオチド
ＧＣＲＥＣをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のＧＣＲＥＣの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＧＣＲＥＣをコードする配列とを用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、ＧＣＲＥＣをコードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオチドをデザインする。
【０２７４】
１２ ＧＣＲＥＣ の発現
ＧＣＲＥＣの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて行うことができる。細菌でＧＣＲＥＣを発現するために、抗生物質耐性遺伝子及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導されるとＧＣＲＥＣを発現する。真核細胞でのＧＣＲＥＣの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られている組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須のポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって、ＧＣＲＥＣをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．等を参照）。
【０２７５】
殆どの発現系では、融合タンパク質としてＧＣＲＥＣを合成するのに例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはペプチドエピトープ標識、例えばＦＬＡＧや６−Ｈｉｓを用いる。 これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製後、ＧＳＴの部分を特定の開発部位においてＧＣＲＥＣからタンパク分解的に切断することが可能である。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＧＣＲＥＣを直接用いて、適用可能な場合には実施例１６、１７及び１８のアッセイを行うことができる。
【０２７６】
１３ 機能的アッセイ
ＧＣＲＥＣ機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＧＣＲＥＣをコードする配列の発現によって評価する。 ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選択されるベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０２７７】
遺伝子発現におけるＧＣＲＥＣの影響は、ＧＣＲＥＣをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、ヒトＩｇＧまたはＣＤ６４に対する抗体（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）で覆われた磁気ビーズを用いて有効に分離することができる。 ｍＲＮＡは、本技術分野で公知の方法で細胞から精製することができる。 ＧＣＲＥＣその他の目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２７８】
１４ ＧＣＲＥＣ 特異抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製されたＧＣＲＥＣを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０２７９】
或いは、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＧＣＲＥＣアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， １１章等を参照）。
【０２８０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５ 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＧＣＲＥＣ活性を検査するには、ペプチドまたはＧＣＲＥＣを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２８１】
１５ 特異抗体を用いた天然の ＧＣＲＥＣ の精製
天然または組換えＧＣＲＥＣを、ＧＣＲＥＣ特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗ＧＣＲＥＣ抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばＣＮＢｒ活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２８２】
ＧＣＲＥＣを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＧＣＲＥＣを優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。抗体とＧＣＲＥＣの結合を破壊する条件（例えばｐＨ２〜３の緩衝液、或いは尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤）でカラムを溶出させ、ＧＣＲＥＣを回収する。
【０２８３】
１６ ＧＣＲＥＣ と相互作用する分子の同定
ＧＣＲＥＣと相互作用する分子は、Ｇタンパク質などのシグナル伝達に関与する分子以外にもアゴニスト及びアンタゴニストを含み得る。ＧＣＲＥＣまた断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ． および Ｗ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照。）ＧＣＲＥＣの断片には、例えば３つの細胞外ループのうち１つ若しくは複数のループ、細胞外Ｎ末端領域または第３細胞内ループがある。マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識したＧＣＲＥＣと共にインキュベートして洗浄し、標識したＧＣＲＥＣ複合体を有する全ての穴をアッセイする。ＧＣＲＥＣ濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのＧＣＲＥＣの数、親和性及び会合の値を計算する。
【０２８４】
或いは、ＧＣＲＥＣと相互作用する分子は、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６ に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等の２ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０２８５】
ＧＣＲＥＣはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． ら （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０２８６】
潜在的ＧＣＲＥＣアゴニストまたはアンタゴニストは、実施例１７及び１８に記載のアッセイを用いてＧＣＲＥＣ受容体活性の活性化または阻害を試験し得る。候補分子は、既知のＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニスト、ペプチドライブラリまたは組み合わせの化学ライブラリから選択し得る。
【０２８７】
ＧＣＲＥＣとＧタンパク質などの細胞内シグナル伝達分子の相互作用を検出する方法は、オーファンＧタンパク質共役膜７回貫通受容体から得た内部セグメントまたは細胞質ドメインが、既知のＧタンパク質共役膜７回貫通受容体の相似ドメインと交換され、Ｇタンパク質及びオーファン受容体ドメインに活性化された下流シグナル伝達経路を同定するために用いられるという前提に基づく（Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｂ．Ｋ． ら （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１３１０−１３１６）。相似方法においては、オルファン受容体のドメインが融合タンパク質の一部としてクローニングされ、結合アッセイで用いて特定のＧタンパク質との相互作用を実証し得る。研究によれば、Ｇタンパク質共役膜７回貫通受容体の第３細胞内ループがＧタンパク質相互作用及びシグナル伝達に重要であることが示されてきた（Ｃｏｎｋｌｉｎ， Ｂ．Ｒ． ら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：６３１−６４１）。例えば、ＧＣＲＥＣの第３細胞内ループに対応するＤＮＡ断片は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅し、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの融合ベクターにサブクローニングし得る。構成体は誘導された適切な細菌性宿主に形質転換され、融合タンパク質はグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）アフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製する。
【０２８８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイの場合、Ｇタンパク質を含む細胞抽出物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＣＨＡＰＳ、２０％グリセロール、各１０μｇのアプロチニン及びロイペプチンと、２０μｌの５０ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニルで抽出することにより準備する。溶解産物は絶えず撹拌しながら氷上で４５分間インキュベートし、２３，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離して上澄みを集める。７５０μｇの細胞抽出物をグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質ビーズを用いて４℃で２時間インキュベートする。 ＧＳＴビーズは、リン酸緩衝食塩水で５回洗浄する。結合Ｇサブユニットは、百日咳毒素またはコレラ毒素を用いた［^３２Ｐ］ＡＤＰリボシル化により検出する。ＳＤＳサンプル緩衝液（４．６％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１０％（ｖｌｖ） βメルカプトエタノール、２０％（ｗ／ｖ） グリセロール、９５．２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．０１％（ｗ／ｖ） ブロムフェノールブルー）を添加することにより反応を停止させる。［^３２Ｐ］ＡＤＰ標識されたタンパク質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、オートラジオグラフを行う。ゲル中で分離したタンパク質はニトロセルロースペーパーに移し、ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）（５％脱脂粉乳、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、２ｍＭのＣａＣｌ_２、８０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ_３ 及び０．２％ノニデットＰ−４０）を用いて室温で１時間遮断し、Ｇ_αサブタイプ選択的抗体（１：５００； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｌｉｅｍ）で１．５時間インキュベートする。３洗浄後に、ブロットはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（１：２０００， Ｃａｐｐｅｌ， Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）でインキュベートし、化学ルミネセンスベースのＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ）で可視化する。
【０２８９】
１７ ＧＣＲＥＣ 活性の実証
ＧＣＲＥＣ活性に対するアッセイは、細胞表面におけるＧＣＲＥＣの発現を測定する。 ＧＣＲＥＣをコードするｃＤＮＡは、好適な哺乳動物細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質は、記載されているようにビオチンで標識する（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ， Ｍ．Ａ． ら （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）。ＧＣＲＥＣ特異抗体を用いて免疫沈降を実行し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降と未標識免疫沈降の比は、細胞表面に発現したＧＣＲＥＣの量に比例する。
【０２９０】
或いは、ＧＣＲＥＣ活性のためのアッセイは、リガンド／受容体が仲介する細胞増殖の調節のための原型アッセイに基づく。このアッセイでは、スイスマウス３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の速度を測定する。当分野で公知の形質移入方法を用いて、ＧＣＲＥＣをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の３Ｔ３培養細胞に加える。 一過性に形質移入された細胞は次に、放射性ＤＮＡ前駆分子である［^３Ｈ］チミジンの存在下でインキュベートする。次に、培養した細胞にＧＣＲＥＣリガンドの変化する量を加える。［^３Ｈ］チミジンの酸沈殿可能ＤＮＡへの取り込みは、ラジオアイソトープカウンターを用いて適切な時間間隔で測定する。 取り込み量は、新たに合成されたＤＮＡの量に正比例する。少なくとも１００倍のＧＣＲＥＣリガンド密度範囲に対する投与−反応の１次曲線は、受容体活性を示す。ミリリットル当りの活性の１単位は、５０％の反応レベルを産出するＧＣＲＥＣの密度として画定され、１００％であれば［^３Ｈ］チミジンを酸沈殿可能ＤＮＡに最大限取り込むことを表す（ＭｃＫａｙ， Ｉ． ａｎｄ Ｉ． Ｌｅｉｇｈ， ｅｄｓ． （１９９３） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７３頁）。
【０２９１】
或いは、ＧＣＲＥＣ活性のためのアッセイは、ＧＰＣＲファミリータンパク質がＧタンパク質活性化第２メッセンジャーシグナル伝達経路（例えばｃＡＭＰ； Ｇａｕｃｌｉｎ， Ｐ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４９９０−４９９６）を調整する能力に基づく。全長ＧＣＲＥＣをコードするプラスミドを、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物細胞株に形質転換する（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）またはヒト胚腎細胞株（ＨＥＫ−２９３））。 形質転換細胞を１２ウェルトレイの培養液で４８時間増殖させ、次に培養液を捨て、付着している細胞をＰＢＳで軽く洗浄する。培地においてリガンド有りまたはリガンドなしで細胞を３０分間インキュベートし、次に培地を除去し、細胞を１Ｍの過塩素酸で処理して溶解する。溶解産物中のｃＡＭＰレベルは、当分野で既知の方法を用いて放射免疫アッセイにより測定する。 リガンドに曝された細胞から得た溶解産物中のｃＡＭＰレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するＧＣＲＥＣの量に比例する。
【０２９２】
イノシトールリン酸レベルの変化を測定するためには、１×１０^５ 細胞／穴を含む２４穴プレートで細胞を成長させ、イノシトールを含まない培地及び ［^３Ｈ］ミオイノシトールを用いて２μＣｉ／穴で４８時間インキュベートする。培地を除去し、１０ｍＭのＬｉＣｌを含む緩衝液で細胞を洗浄し、その後リガンドを添加する。反応は、過塩素酸の添加により停止する。イノシトールリン酸は、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）陰イオン交換樹脂及び液体シンチレーションにより計数された全ての標識されたイノシトールリン酸で抽出及び分離される。リガンドに曝された細胞から得た標識されたイノシトールリン酸のレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するＧＣＲＥＣの量に比例する。
【０２９３】
１８ ＧＣＲＥＣ リガンドの同定
ＧＣＲＥＣは、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）またはＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）２９３などの真核細胞株において発現する。 これらの細胞株は、ＧＰＣＲ発現過程が良好であり、発現したＧＣＲＥＣを下流エフェクターに機能的に連結させることができるような広範囲のＧタンパク質を含む。候補リガンドの存在下で発現した受容体の活性化に対し、形質転換した細胞をアッセイする。活性は、ｃＡＭＰまたはＣａ^２＋ などの細胞内第２メッセンジャーの変化により測定する。当分野で公知の標準的な方法を用いるか、活性化受容体によるタンパク質キナーゼＣの刺激に反応して発光タンパク質（例えばホタルルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）がプロモーターの転写調節下にあるようなレポーター遺伝子アッセイを用いて直接測定する（Ｍｉｌｌｉｇａｎ， Ｃ． ら （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １７：２３５−２３７）。アッセイ技術は、これら第２メッセンジャーシステムの両方に利用可能であり、アデニリルシクラーゼ活性化ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ Ａｓｓａｙ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などのマルチウェルプレートフォーマットまたはＦｌｕｏ−４ ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などの蛍光Ｃａ^２＋ 指示薬でＦＬＩＰＲ蛍光定量的プレート読出しシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を併用して高処理読出しを可能にする。生理的関連性のある第２メッセンジャー経路が知られていない場合、ＧＣＲＥＣは、ホスホリパーゼＣ及びＣａ^２＋ 可動化に関与する経路を介してＧＣＲＥＣのシグナル伝達を通すために、広範囲のＧタンパク質と結合することが実証されているようなＧタンパク質Ｇ_{α １５／１６}と同時発現し得る（Ｏｆｆｅｒｒｎａｎｎｓ， Ｓ．及びＭ．Ｉ． Ｓｉｍｏｎ （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１５１７５−１５１８０）。或いは、ＧＣＲＥＣは内因性ＧＰＣＲが不足しているような操作された酵母系に発現し、それによってＯＣＲＥＣ活性化スクリーニングに対してバックグラウンドが存在しない利点を提供し得る。これらの酵母系は、ヒトＧＰＣＲ及びＧ_αタンパク質を内因性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素に対して置換する。シグナルに対する正常な酵母反応を選択的培地の正の成長またはレポーター遺伝子発現に変換するように、下流シグナル伝達経路も変更する（Ｂｒｏａｃｈ， Ｊ．Ｒ．およびＪ． Ｔｈｏｒｎｅｒ （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４ （ｓｕｐｐ．）：１４−１６）。既知のＧＰＣＲリガンド及びその他天然の生理活性分子を含む推定上のリガンドに対して受容体をスクリーニングする。組織、生物学的流体及び細胞上澄みから抽出した生物学的抽出物もスクリーニングする。
【０２９４】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２９５】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０２９６】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０２９７】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０２９８】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０２９９】
表５は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of G protein-coupled receptors, and relates to the diagnosis, treatment and prevention of abnormal cell proliferation, neuropathy, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory diseases and metabolic disorders, and viral infections. And the use of these sequences in estimating the effects of exogenous compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of G protein-coupled receptors. The present invention further relates to the use of specific G protein-coupled receptors and identifies molecules involved in taste or smell regulation.
[0002]
(Background of the Invention)
Signaling is a general process by which cells respond to extracellular signals. Signal transduction at the plasma membrane begins with the binding of signal molecules such as hormones, neurotransmitters or growth factors to cell membrane receptors. Receptors so activated trigger an intracellular biochemical cascade that terminates in the activation of intracellular target molecules such as transcription factors. This process of signaling controls all types of cell functions, including cell proliferation, differentiation and gene transfer. G protein-coupled receptors (GPCRs), encoded by one of the largest families of genes identified, play a central role in transmitting extracellular signals at the plasma membrane. GPCRs have historically proven successful as therapeutic targets.
[0003]
GPCRs are integral membrane proteins characterized by the presence of seven hydrophobic transmembrane domains, which together form an antiparallel alpha (α) helix bundle. GPCRs range in size from 400 or less to over 1000 amino acids (Strosberg, AD (1991) Eur. J. Biochem. 196: 1-10, Coughlin, SR (1994) Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 191-197). The amino terminus of a GPCR is extracellular, variable in length, and often glycosylated. The carboxyl terminus is in the cytoplasm and is usually phosphorylated. Extracellular loops alternate with intracellular loops and are linked to transmembrane domains. Cysteine disulfide bridges connecting the second and third extracellular loops can interact with agonists and antagonists. The most conserved domains of GPCRs are the transmembrane domain and the first two cytoplasmic loops. Transmembrane domains characterize the structure and function of the receptor to some extent. In most cases, a bundle of α-helices forms a ligand binding pocket. The extracellular N-terminal segment, or one or more of the three extracellular loops, may also be involved in ligand binding. Ligand binding activates the receptor by inducing structural changes in the intracellular portion of the receptor. The large third intracellular loop of this activated receptor then interacts with a heterotrimeric guanine nucleotide binding G-protein complex that mediates further intracellular signaling. This intracellular signaling involves activation of second messengers such as cyclic AMP (cAMP), phospholipase C, and inositol triphosphate, and interaction of the activated GPCR with ion channel proteins. . (Watson, S. and S. Arkinstall (1994)The G-protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 2-6, Bolander, F. et al. F. (1994)Molecular EndocrinologyAcademic Press, San Diego CA, pp. 162-176, Baldwin, J. et al. M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6: 180190).
[0004]
GPCRs include receptors for sensory signal mediators (eg, light and olfactory stimulating molecules), adenosine, gamma aminobutyric acid (GABA), hepatocyte growth factor, melanocortin, neuropeptide Y, opioid peptides, opsin, somatostatin, tachykinin, Vasoactive intestinal polypeptide family and vasopressin, biogenic amines (eg, dopamine, epinephrine and norepinephrine, histamine, glutamic acid (metabolite effect), acetylcholine (muscarinic effect) and serotonin), chemokines, lipid mediators of inflammation (eg prostaglandin) Gins and prostanoids, platelet activating factor and leukotrienes) and peptide hormones (eg bombesin, bradykinin, calcitonin, C5a anaphylatoxin, endothelin, eggs Stimulating hormone (FSH), gonadotropin-releasing hormone (GnRH), is neurokinin and thyrotropin releasing hormone (TRH) and oxytocin). GPCRs that act as receptors whose stimuli have not yet been identified are known as orphan receptors.
[0005]
The diversity of the GPCR family is further increased by alternative splicing. Many GPCR genes contain introns and more than 30 receptors have splicing variants identified at present. The largest number of mutations is at the protein C-terminus. Variants in the N-terminal and cytoplasmic loops are also more frequent, whereas those in the extracellular loop or transmembrane domain are less frequent. Some receptors have more than one site where mutations can occur. Splicing variants appear to be functionally different based on differences observed in distribution, signaling, binding, regulation and ligand binding characteristics (Kilpatrick, GJ. Et al. (1999) Trends Pharmacol. Sd. 20). : 294-301).
[0006]
GPCRs can be divided into three major subfamilies: rhodopsin-like, secretin-like, and metabotropic glutamate receptor subfamilies. Members of the GPCR subfamily share similar functions and characteristic seven transmembrane structures, but differ in amino acid sequence. The largest family has rhodopsin-like GPCRs, which transmit a variety of extracellular signals including hormones, neurotransmitters and light. Rhodopsin is a photosensitive GPCR found in the retina of animals. In vertebrates, rhodopsin molecules are embedded in a membranous stack found in photoreceptor (rod) cells. Each rhodopsin molecule elicits a decrease in cGMP levels, which responds to one photon of light by closing plasma membrane sodium channels. In this way, the visible signal is converted into a nerve impulse. Other rhodopsin-like GPCRs are directly involved in responding to neurotransmitters. Such GPCRs include a receptor for adrenaline (adrenergic receptor), a receptor for acetylcholine (muscarinic receptor), a receptor for adenosine, a receptor for galanin, and a receptor for glutamate (N-methyl-D-asparagine). Acid / NMDA receptor) (Watson, S. and S. Arkinstall (1994)).The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA,. 7-9, 19-22, 32-35, 130-131, 214-216, pages 221-222, Habert-Ortoli, E. et al. Et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 91: 9780-9783).
[0007]
The galanin receptor mediates the activity of the neuroendocrine peptide galanin, which inhibits the secretion of insulin, acetylcholine, serotonin and noradrenaline, and stimulates the release of prolactin and growth hormone. Galanin receptors have been implicated in the feed of disease, pain, depression and Alzheimer's disease (Kask, K. et al. (1997) Life Sd. 60: 1523-1533). Other nervous system rhodopsin-like GPCRs include an increasing number of families, such as lysophosphatidic acid and receptors for other lysophosphatides that appear to have a role in development and neuropathology (Chun, J. et al. (1999) Cell Biochem). Biophys. 30: 213-242).
[0008]
Olfactory receptors, the largest subfamily of GPCRs, are also members of the rhodopsin-like GPCR family. This receptor functions by transmitting olfactory signals. A number of different olfactory receptors are needed to distinguish different odors. Each olfactory sensory neuron expresses only one type of olfactory receptor, and neurons that express a specific receptor occupy different locations in the nasal pathway. For example, the RA1c receptor isolated from a rat brain library has been shown to have limited expression in very specific regions of the brain and in specific areas of the olfactory epithelium (Raining, K. et al. (1998)). Receptors Channels 6: 141-151). However, the expression of olfactory-like receptors is not limited to olfactory tissues. For example, three rat genes encoding olfactory-like receptors with typical GPCR properties show expression patterns not only in taste and olfactory tissues but also in male reproductive tissues (Thomas, MB et al. (1996)). Gene 178: 1-5).
[0009]
Members of the secretin-like GPCR subfamily have peptide hormones such as secretin, calcitonin, glucagon, growth hormone releasing hormone, parathyroid hormone, and vasoactive intestinal peptides as ligands. For example, the secretin receptor corresponds to secretin, a peptide hormone that stimulates secretion of enzymes and ions in the pancreas and small intestine (Watson, supra, at pages 278-283). Secretin receptors are about 450 amino acids in length and are found on the plasma membrane of gastrointestinal cells. The binding of secretin to its receptor triggers the production of cAMP.
[0010]
Examples of secretin-like GPCRs that have been implicated in inflammation and the immune response include the mucin-like hormone receptor (Emrl) and the CD97 receptor protein, which include modules of EGF. These GPCRs are members of the recently characterized EGF-TM7 receptor subfamily. These seven-transmembrane hormone receptors are:in VivoAnd contains three to seven potential calcium-binding EGF-like motifs. CD97 is expressed mainly on leukocytes and is significantly upregulated on activated B and T cells (McKnight, AJ and S. Gordon (1998) J. Leukoc. Biol. 63: 271-). 280).
[0011]
The third GPCR subfamily is the metabotropic glutamate receptor family. Glutamate is the major excitatory neurotransmitter of the central nervous system. Metabotropic glutamate receptors regulate the activity of intracellular effectors and are involved in long-term potentiation (Watson, supra, p. 130). Ca²⁺The detection receptor detects changes in the extracellular concentration of calcium ions and has a large extracellular domain containing a cluster of acidic amino acids that can participate in calcium binding. The metabotropic glutamate receptor family includes pheromone receptors, GABA_BThere are also receptors and taste receptors.
[0012]
Other GPCR subfamilies include nematodes (Caenorhabditis elegansas well asCaenorhabditis briggsae )There are two groups of chemoreceptor genes that are found in E. coli and are distantly related to mammalian olfactory receptor genes. The yeast pheromone receptors STE2 and STE3, which are involved in the response to mating factors on cell membranes, are cellular slime molds that regulate the assembly of individual cells and are thought to regulate the expression of multiple developmentally regulated genes. It has a seven transmembrane signature, similar to the cAMP receptor described.
[0013]
GPCR mutations can result in decreased function or structural activation and have been implicated in a number of human diseases (Coughlin, supra). For example, retinitis pigmentosa may result from a mutation in the rhodopsin gene. In addition, somatic activating mutations in the thyroid stimulating hormone receptor have been reported to cause hyperactive thyroid adenomas, and certain GPCRs that are sensitive to constitutive activation behave like proto-oncogenes. (Parma, J. et al. (1993) Nature 365: 649-651). The following ligands: luteinizing hormone (early puberty), vasopressin V₂(X-linked renal primary diabetes mellitus), glucagon (diabetes and hypertension), calcium (hyperparathyroidism, hypocalcuria, hypercalcemia), parathyroid hormone (dwarfism), β₃GPCR receptors for adrenergic receptors (obesity, non-insulin dependent diabetes mellitus), growth hormone releasing hormone (dwarfism) and adrenocorticotropic hormone (glucocorticoid deficiency) have mutations associated with human diseases (Wilson, S. et al. (1998) Br. J. Pharmacol. 125: 1387-1392, Stadel, JM. Et al. (1997) Trends Pharmacol. Sci. 18: 430-437). GPCRs have also been implicated in depression, schizophrenia, insomnia, hypertension, anxiety, stress, renal failure and some other cardiovascular disorders (Horn, F. and G. Vrenend (1998) J. Mol. Med. 76: 464-468).
[0014]
In addition, hundreds of new drugs that directly affect GPCR activation and inhibition have been recognized in the last 20 years. The therapeutic targets of these drugs cover a wide range of diseases and disorders including cancer, osteoporosis, endometriosis as well as cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, and central nervous system disorders (Wilson, Stadel, supra). For example, the dopamine agonist L-dopa is used to treat Parkinson's disease, and dopamine antagonists are used to treat schizophrenia and early stage Huntington's disease. Adrenergic receptor agonists and antagonists have been used to treat asthma, hypertension and other cardiovascular disorders and anxiety. Muscarinic agonists are used for the treatment of glaucoma and tachycardia, serotonin 5HT1D antagonists are used for migraine, histamine H1 antagonists are used for allergic and anaphylactic reactions, hay fever, itch and motion sickness (Horn, supra).
[0015]
Recent research suggests the potential use of GPCRs in the treatment of metabolic disorders, including diabetes, obesity and osteoporosis. For example, a mutant V2 vasopressin receptor responsible for renal primary diabetes mellitus is expressed by co-expression of the C-terminal V2 receptor peptide over the region containing the mutation.in in vitroAnd can be rescued functionally. This suggests a novel strategy for disease treatment (Schoneberg, T. et al. (1996) EMBO 1.15: 1283-1291). Mutations in the melanocortin 4 receptor (MC4R) have been linked to weight control and obesity in humans. Due to mutants of the vasopressin V2 receptor, these MC4R mutants are defective in transport to the plasma membrane (Ho, G and RG MacKenzie (1999) J. Biol. Chem. 274: 35816). -35822), and thus can be treated with a similar strategy. Type 1 receptors for parathyroid hormone (PTH) are GPCRs that mediate PTH-dependent regulation of calcium homeostasis in the bloodstream. Studies of PTH / receptor interactions may allow the development of novel PTH receptor ligands for the treatment of osteoporosis (Mannstadt, M. et al. (1999) Am. J. Physiol. 277: F665-F675). .
[0016]
The chemokine receptor group of GPCRs has potential for treating inflammation and infectious diseases (for a review, see Locati, M. and PM Murphy (1999) Annu. Rev. Med. 50: 425-440). Thing). Chemokines are small polypeptides that act as intracellular signals in controlling leukocyte trafficking, hematopoiesis and angiogenesis. Targeted destruction of various chemokine receptors in mice indicates that these receptors play a role in abnormal inflammation and in autoimmune disorders such as multiple sclerosis. Infectious agents, including herpes virus and human immunodeficiency virus (HIV-1), utilize chemokine receptors to promote infection. The chemokine receptor CCR5 acts as a co-receptor for HIV-1 infection of T cells, a truncated version of which produced resistance to AIDS. This result suggests that antagonists of CCR5 may be useful in preventing AIDS.
[0017]
The involvement of certain GPCRs in taste and smell has been reported. Numerous complete or partial sequences of human and other eukaryotic sensory receptors are currently known. (Pilpel, Y. and D. Lancet (1999) Protein Sci. 8: 969-977, Mombaerts, P. (1999) Annu. Rev. Neurosci. 22: 487-509, and patents EP 867508A2, US 5,874. , 243, WO 92/17585, WO 95/18140, WO 97/17444, WO 99/67282, etc.). It has been reported that the human genome contains approximately 1000 genes that code for various repertoires of olfactory receptors (Routier, S. et al. (1998) Nat. Genet. 18: 243-250; (1998) Hum. Mol. Genet. 7: 2007-2020).
[0018]
The discovery of new G protein-coupled receptors and the polynucleotides encoding them has led to the diagnosis, treatment and diagnosis of cell proliferation disorders, neuropathies, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory and metabolic disorders and viral infections. Meet the need in the art by providing novel components that are useful in prevention and that are useful in assessing the effects of foreign compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of G protein-coupled receptors .
[0019]
(Summary of the Invention)
The present invention provides purified polypeptides that are G protein-coupled receptors, collectively referred to as "GCRECs" and individually as "GCREC-1. In certain embodiments, the present invention provides (a) SEQ ID A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide having a natural amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Or (d) an isolated polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In an aspect, there is provided an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[0020]
Also, the present invention provides (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide having a natural amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, ( c) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) a poly- genomer selected from the group consisting of an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: An isolated polynucleotide encoding a peptide is provided. In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the polypeptide has the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
[0021]
The present invention further provides G protein-coupled receptors involved in the regulation of taste or smell. The present invention further provides a polynucleotide sequence encoding the aforementioned G protein-coupled receptor.
[0022]
The invention further relates to (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising a naturally occurring amino acid sequence having at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. And a recombinant polynucleotide having a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide. In one embodiment, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide.
[0023]
Also, the present invention provides (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising a natural amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The present invention provides a method for producing the polypeptide. The method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with the recombinant polynucleotide under conditions suitable for expressing the polypeptide, and (b) recovering the polypeptide thus expressed. Wherein the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide.
[0024]
The invention further relates to (c) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising a naturally occurring amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (c ) A biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. An isolated antibody is provided that specifically binds to the polypeptide.
[0025]
The invention further includes (a) a polynucleotide having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (b) a naturally occurring polynucleotide sequence having at least 90% homology to the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide, a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (c) (a), a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (d) (b), or RNA equivalent of (e) (a)-(d) An isolated polynucleotide selected from the group consisting of: In one embodiment, the polynucleotide has at least 60 contiguous nucleotides.
[0026]
The present invention further provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (b) a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 , A polynucleotide complementary to the polynucleotide of (c) (a), a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (d) (b), or an RNA of (e) (a) to (d) Having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of equivalents. The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides containing a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; Detecting the presence / absence of the body, and optionally detecting the amount of the complex, if any, such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide or a fragment thereof. Under conditions, the probe will hybridize specifically to the target polynucleotide. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0027]
The invention also provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (b) a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (C) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a), a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (d) and (b), or an RNA of (e) (a) to (d). Having the sequence of a polynucleotide selected from the group consisting of equivalents. The detection method includes (a) a process of amplifying a target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification, and (b) detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and Optionally, detecting the amount of fragments, if any, is included.
[0028]
The invention further provides a component comprising an effective amount of the polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. An effective amount of a polypeptide comprises: (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) a polypeptide comprising the native amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Selected from the group consisting of a peptide, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Is done. In one embodiment, there is provided a composition comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Furthermore, the present invention provides a method for treating a disease or a symptom thereof associated with reduced expression of functional GCREC, which comprises administering the composition to a patient.
[0029]
The invention also relates to (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising the native amino acid sequence having at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A method of screening a compound to confirm the effectiveness of the polypeptide as an agonist. The screening method includes (a) exposing a sample containing the polypeptide to the compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In one embodiment, the present invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional GCREC, comprising administering a component to a patient in need of such treatment. I do.
[0030]
The invention further relates to (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising the native amino acid sequence having at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A method of screening a compound to confirm the effectiveness of the polypeptide as an antagonist. The screening method includes (a) exposing a sample having the polypeptide to the compound, and (b) detecting antagonist activity in the sample. In one embodiment, the invention provides a component comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In another embodiment, there is provided a method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional GCREC, comprising administering a component to a patient in need of such treatment.
[0031]
The invention further relates to (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising the native amino acid sequence having at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A method of screening for a compound that specifically binds to the polypeptide. The screening method comprises: (a) binding the polypeptide to at least one test compound under appropriate conditions; and (b) detecting the binding of the polypeptide to the test compound, whereby the compound specifically binds to the polypeptide. And identifying.
[0032]
The invention further relates to (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a polypeptide comprising the native amino acid sequence having at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (C) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. To screen for compounds that modulate the activity of the polypeptides. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under conditions permitting the activity of the polypeptide; and (b) calculating the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, wherein the change in the activity of the polypeptide in the presence of the test compound Means that the compound modulates the activity of the polypeptide.
[0033]
Further, the present invention provides a G protein-coupled receptor of the present invention, which is associated with taste or smell, a biologically active fragment thereof (receptor activity) to identify agonists or antagonists of the aforementioned receptor polypeptides. And the use of amino acid sequences having at least 90% sequence identity. These compounds are useful for modulating, blocking or mimicking specific odors.
[0034]
The present invention also provides a taste or olfactory receptor of the invention, a biologically active fragment (including receptor activity), and at least 90% of compounds of the invention, for identifying compounds that modulate, mimic, or block specific taste or olfaction. The use of polypeptides having% sequence identity with one or more other taste or olfactory receptor polypeptides.
[0035]
The invention also provides cells expressing the olfactory or taste receptor polypeptides of the invention, biologically active fragments thereof (including receptor activity), cells expressing polypeptides having at least 90% sequence identity. And the use of these cells in cell-based screens to identify molecules that modulate, mimic, or block specific olfactory or taste sensations.
[0036]
Further, the invention provides a cell that co-expresses at least one olfactory or taste G protein-coupled receptor polypeptide of the invention and a G protein, and optionally co-expresses one or more olfactory or taste G protein-coupled receptor polypeptides. Related to the use of these cells in screens to identify cells and molecules that modulate, mimic, or block specific olfactory or taste sensations.
[0037]
The present invention further provides a method of screening for a compound effective to alter the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of SEQ ID NO: 2, comprising: (a) exposing a sample containing the target polynucleotide to the compound. And (b) detecting a change in expression of the target polynucleotide.
[0038]
The invention further provides (a) treating a biological sample containing nucleic acids with a test compound; (b) (i) a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (ii) a SEQ ID NO: A polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology to a polynucleotide sequence having the following sequence: (iii) a polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of (i), (iv) (ii) A) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (v), a probe consisting of at least 20 contiguous nucleotides of a polynucleotide selected from the group consisting of RNA equivalents of (i)-(iv). Providing a method for estimating the toxicity of a test compound, including the step of hybridizing nucleic acids in a biological sample. I do. Hybridization occurs under conditions such that a particular hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in a biological sample, wherein the target polynucleotide comprises (i) SEQ ID NO: (Ii) a polynucleotide comprising a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology to the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (iii) a polynucleotide of (i) And (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), and (v) an RNA equivalent of (i) to (iv). Alternatively, the target polynucleotide may be a fragment of the polynucleotide sequence selected from the group consisting of (i) to (v), (c) a step of quantifying the amount of the hybridization complex, and (d) Comparing the amount of hybridization complex of the biological sample with the amount of hybridization complex of the untreated biological sample, wherein the difference from the amount of hybridization complex of the treated biological sample is It means the toxicity of the test compound.
[0039]
(Mode for Carrying Out the Invention)
Before describing the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention, it is to be understood that the invention is not limited to the particular devices, materials and methods described, as such may be modified. It is also understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which is limited only by the claims. Please understand at the same time.
[0040]
As used in the claims and the specification, the singular forms “a” and “the” may refer to plural unless the context clearly dictates otherwise. You have to be careful. Thus, for example, when described as "a host cell", there may be more than one such host cell, and when described as "an antibody", one or more antibodies, and It also refers to equivalents of antibodies known to those skilled in the art.
[0041]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise defined. Although any apparatus, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, the preferred devices, materials, and methods are now described. All publications mentioned in the present invention are cited for the purpose of describing and disclosing the cells, protocols, reagents and vectors that are reported in the publications and that may be of interest to the present invention. . Nothing herein is an admission that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0042]
(Definition)
The term "GCREC" refers to substantially purified GCREC amino acids obtained from all species, including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, particularly mammals including cows, sheep, pigs, mice, horses and humans. Points to an array.
[0043]
The term "agonist" refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of GCREC. Examples of agonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, and any other compounds or components that interact directly with GCREC or constitute a biological pathway involving GCREC. By acting on an element, it modulates the activity of GCREC.
[0044]
"Allelic variants" are another form of the gene encoding GCREC. Allelic variants can be made from at least one mutation in the nucleic acid sequence. It can also be made from mutant RNA or polypeptide. The structure or function of a polypeptide may or may not be mutated. A gene may have no natural allelic variants or one or several natural allelic variants. Common mutational changes that generally result in allelic variants are those that result from spontaneous deletion, addition or substitution of nucleotides. Each of these changes, alone or together with other changes, may occur once or several times within a given sequence.
[0045]
An “altered” nucleic acid sequence encoding GCREC has a nucleic acid sequence that deletes, inserts, or replaces various nucleotides, and yields a polypeptide having the same or at least one GCREC functional characteristic as GCREC. . Included in this definition are polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using specific oligonucleotide probes of the polynucleotide encoding GCREC and the normal chromosomal genes for the polynucleotide sequence encoding GCREC. Inappropriate or unexpected hybridization to an allelic variant, such as occupying a locus other than the locus. The encoded protein may also be "mutated" and may contain deletions, insertions or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and result in a functionally equivalent GCREC. Planned amino acid substitutions are based on the similarity of the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathic properties of the residues, as long as the biological or immunological activity of GCREC is retained. Can do. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids with uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, and serine and threonine. Amino acids with uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine and isoleucine and valine, glycine and alanine, and phenylalanine and tyrosine.
[0046]
The terms "amino acid" and "amino acid sequence" refer to oligopeptides, peptides, polypeptides, protein sequences, or any fragment thereof, and include natural and synthetic molecules. Where "amino acid sequence" refers to the sequence of a naturally occurring protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the described protein molecule.
[0047]
The term "amplification" relates to making a copy of a nucleic acid sequence. Amplification is typically performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art.
[0048]
The term "antagonist" refers to a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of GCREC. Antagonists may include proteins such as antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules or any other compounds or components, which may interact directly with GCRECs or may involve biological activities involving GCRECs. Modulates the activity of GCREC by acting on components of the pathway.
[0049]
The term "antibody" refers to intact immunoglobulins or fragments thereof, e.g., Fa, F (ab ') 2 and Fv fragments, which can bind to epitope determinants. Antibodies that bind to GCREC polypeptides can be prepared using intact polypeptides or fragments containing small peptides of interest as immunizing antigens. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (mouse, rat, rabbit, etc.) may be derived from a polypeptide or oligopeptide obtained by RNA translation or chemical synthesis, and may be a carrier, if desired. It can also be conjugated to a protein. Commonly used carriers that chemically bond to peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemocyanin (KLH). The binding peptide is used to immunize an animal.
[0050]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that contacts a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, a number of regions of the protein can induce the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a particular region or three-dimensional structure of the protein). Antigenic determinants can compete with the intact antigen for binding to the antibody (ie, the immunogen used to elicit the immune response).
[0051]
The term "aptamer" refers to a nucleic acid or oligonucleotide that binds to a specific molecular target. Aptamers arein in vitro(For example, SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) described in US Pat. No. 5,270,163), and such a process is carried out from a large combinatorial library by a target-specific aptamer. Select an array. Aptamer compositions can be double-stranded or single-stranded and can include deoxyribonucleotides, ribonucleotides, nucleotide derivatives, or other nucleotide-like molecules. The nucleotide component of the aptamer includes a modified sugar group (e.g., where the 2'-OH group of the ribonucleotide is 2'-F or 2'-NH₂And such sugar groups may improve desirable properties such as resistance to nucleases or longer lifespan in blood. Aptamers can be conjugated to molecules such as high molecular weight carriers to reduce the rate at which aptamers are removed from the circulation. Aptamers can be specifically cross-linked to each ligand, for example, by photoactivation or a cross-linking agent. (See Brody, EN and L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74: 5-13.)
The term "intramer"in VivoFor example, an RNA expression system based on vaccinia virus, which refers to an aptamer expressed in E. coli, has been used to express high levels of specific RNA aptamers in the cytoplasm of leukocytes (Blind, M. et al. (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 3606-3610).
[0052]
The term "spiegelmer" refers to aptamers including L-DNA, L-RNA and other levorotatory nucleotide derivatives or nucleotide-like molecules. Aptamers containing levorotatory nucleotides are resistant to degradation by natural enzymes acting on dextrorotatory nucleotides.
[0053]
As used herein, "antisense" refers to any composition capable of base-pairing with the sense (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense components include DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), oligonucleotides having a modified backbone linkage such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, 2′-methoxyethyl sugar or 2 ′ Oligonucleotides having a modified saccharide such as -methoxyethoxy sugar or oligonucleotides having a modified base such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine. Antisense molecules can be produced by any method, including chemical synthesis or transcription. Once introduced into a cell, the complementary antisense molecule will base pair with the natural nucleic acid sequence formed by the cell, forming a duplex that prevents transcription or translation. The expression "negative" or "minus" refers to the antisense strand of a reference DNA molecule, and the expression "positive" or "plus" refers to the sense strand.
[0054]
The term "biologically active" refers to a protein having structural, regulatory, or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, "immunologically active" or "immunogenic" is the ability of natural, recombinant or synthetic GCREC, or any of its oligopeptides, to induce a specific immune response in a suitable animal or cell. And the ability to bind to a particular antibody.
[0055]
The term "complementary" refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, the sequence "5'A-G-T3 '" pairs with the complementary sequence "3'TC-A5'".
[0056]
"Composition comprising a given polynucleotide sequence" or "composition comprising a given amino acid sequence" refers in a broad sense to any composition comprising a given polynucleotide or amino acid sequence. This component can include a dry formulation or an aqueous solution. A composition comprising a polynucleotide sequence encoding GCREC or a fragment of GCREC can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, the probe is dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS), and other components (eg, denhardt solution, skim milk powder, DNA of salmon sperm, etc.). Can be done.
[0057]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to separate unnecessary bases, and is extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), One or more overlapping cDNAs using a resequenced nucleic acid sequence or a computer program for fragment construction such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). And ESTs, or nucleic acid sequences constructed from genomic DNA fragments. Some sequences both extend and assemble to determine a consensus sequence.
[0058]
The term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the structure and function of the protein are not significantly changed by the substitution, and the structure of the protein, particularly its function, is preserved. The following table shows the amino acids that can be substituted for the original amino acid in the protein and those that are recognized as conservative amino acid substitutions.

[0059]
Conservative amino acid substitutions typically involve (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, such as a β-sheet or α-helical structure, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) the majority of the side chain. Hold.
[0060]
The term "deletion" refers to a change in the amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in the nucleic acid sequence that lacks one or more nucleotides.
[0061]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. For example, replacement of a hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group can be included in chemical modification of the polynucleotide sequence. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one of the biological or immunological functions of the natural molecule. The polypeptide derivative is modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function of the polypeptide of inducible origin. Polypeptide.
[0062]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of generating a measurable signal, which is covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0063]
"Differential expression" refers to an increase (up-regulation) or a decrease (down-regulation) or a deficiency in defective gene or protein expression, as determined by comparing at least two different samples. Such comparisons can be made, for example, between a post-treatment sample and an untreated sample or between a diseased sample and a normal sample.
[0064]
"Exon shuffling" refers to the recombination of different coding regions (exons). Because one exon can represent one structural or functional domain of the encoded protein, reclassification of stable substructures allows new proteins to be assembled and the evolution of new protein functions Can be promoted.
[0065]
"Fragment" refers to a unique part of GCREC or a polynucleotide encoding GCREC, which is identical to the parent sequence but shorter in length than the parent sequence. A fragment may have a length that is less than the defined length of the sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes may be at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 or It can be as long as 500 contiguous nucleotides or amino acid residues. Fragments can be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment can have a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or first 25% or 50% of the polypeptide) as set forth in the given sequence. These lengths are clearly given by way of example, and in the embodiments of the present invention may be of any length supported by the description, including the sequence listings, tables and figures.
[0066]
Fragments of SEQ ID NO: 2 include, for example, regions of the unique polynucleotide sequence that uniquely identify SEQ ID NO: 2, differing from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NO: 2 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 2 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 2 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0067]
A fragment with SEQ ID NO: 1 is encoded by a fragment with SEQ ID NO: 2. Certain fragments of SEQ ID NO: 1 contain regions of the unique amino acid sequence that specifically identify SEQ ID NO: 1. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1 are useful as immunogenic peptides in the development of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1. The exact length of a fragment of SEQ ID NO: 1 and the region at SEQ ID NO: 1 corresponding to that fragment can be determined routinely by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0068]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine), an open reading frame, and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
[0069]
The term "homology" refers to sequence similarity, or sequence identity, between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0070]
The term “percent identity” or “percent identity” for a polynucleotide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm can more significantly compare two sequences because it inserts gaps in a standardized and reproducible manner in the sequences that are compared to optimize alignment between the two sequences.
[0071]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm as incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package (a set of molecular biological analysis programs) (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is available from Higgins, D.W. G. FIG. And P.A. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Higgins, D.W. G. FIG. Et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. Default parameters for aligning the polynucleotide sequences in pairs are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. The percent identity is reported by CLUSTAL V as the "percent similarity" between the aligned polynucleotide sequences.
[0072]
Alternatively, a set of commonly used and freely available sequence comparison algorithms is provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF, et al.), Which is incorporated herein by reference. Is available from several sources, including NCBI, located in Bethesda, MD and the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The BLAST software suite includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available and is used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / b12. You can access html and use it interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are typically used with gaps and other parameters set to default settings. For example, to compare two nucleotide sequences, blastn may be performed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set as a default parameter. An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for Mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
The percent identity can be measured over the entire length of a defined sequence (eg, the sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, compared to a shorter length, eg, a fragment (eg, a fragment of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100 or 200 contiguous nucleotides) obtained from a defined, larger sequence. The coincidence rate may be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and using any sequence length fragment backed by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It can be understood that the length over which the can be measured can be explained.
[0073]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of homology may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is to be understood that this degeneracy can be used to effect changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences such that all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
[0074]
The term “percent identity” or “percent identity” as used for a polypeptide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. There are also alignment methods that take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as detailed above, generally preserve the acidity and hydrophobicity of the site of substitution, thus preserving the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0075]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as that incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see already described). The default parameters for aligning the polypeptide sequences in pairs using CLUSTAL V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. Select the PAM250 matrix as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, CLUSTAL V reports percent identity as “similarity” between aligned polypeptide sequence pairs.
[0076]
Alternatively, a set of NCBI BLAST software may be used. For example, when comparing two polypeptide sequences in pairs, one may use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. There will be. An example of setting default parameters is shown below.
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
The percent identity can be measured over the entire length of a defined sequence (eg, the sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, compared to a shorter length, eg, a fragment obtained from a defined, larger sequence (eg, a fragment of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70, or 150 contiguous nucleotides). The coincidence rate may be measured by using The lengths listed here are merely exemplary, and using fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It should be understood that the length may explain the length over which the percent match can be measured.
[0077]
"Human artificial chromosomes (HACs)" are linear small chromosomes that contain all the elements necessary for the isolation and maintenance of stable chromosomal replication, which can include DNA sequences of about 6 kb to 10 Mb in size.
[0078]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been changed to more closely resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0079]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms a base pair with a complementary single-strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization indicates that two nucleic acid sequences share a high degree of homology. Specific hybridization complexes are formed under acceptable annealing conditions and remain hybridized after the "wash" step. Wash steps are particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, non-specific binding (ie, pair binding between nucleic acid strands that are not perfectly matched) is reduced. The permissive conditions for annealing a nucleic acid sequence can be routinely determined by one skilled in the art. The permissive conditions may be constant during the hybridization experiment, but the washing conditions may be varied during the experiment to obtain the desired stringency and thus also the hybridization specificity. Conditions that permit annealing include, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS at about 68 ° C., and about 100 μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
[0080]
In general, the stringency of hybridization can be expressed, in part, in reference to the temperature at which the washing step is performed. Such a washing temperature is usually selected to be about 5 to 20 ° C. lower than the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under given ionic strength and pH conditions. The equation for calculating Tm and nucleic acid hybridization conditions are well known and are described in Sambrook et al. (1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, particularly see Volume 9, Chapter 9.
[0081]
High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a washing step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 0.1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. SSC concentrations can vary from about 0.1 to 2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking agents are used to block non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, denatured salmon sperm DNA at about 100-200 μg / ml. Under certain conditions, for example, for the hybridization of RNA and DNA, an organic solvent such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can also be used. Useful variations of washing conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, especially under high stringency conditions. Such similarities strongly suggest a similar role for nucleotides and polypeptides encoded by nucleotides.
[0082]
The term "hybridization complex" refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. Hybridization complexes can be formed in solution (C₀t or R₀t analysis). Alternatively, one nucleic acid sequence is in solution and the other nucleic acid sequence is a solid support (eg, a paper, membrane, filter, chip, pin or glass slide, or other suitable substrate, such as a cell or its nucleic acid). May be formed between two nucleic acid sequences, such as those immobilized on a substrate on which is immobilized.
[0083]
The term "insertion" or "addition" refers to a change in the amino acid or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0084]
“Immune response” can refer to a condition associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious diseases or genetic diseases. These conditions can be characterized by the expression of various factors, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules, that can act on cells and the systemic defense system.
[0085]
An "immunogenic fragment" is a polypeptide or oligopeptide fragment of GCREC that is capable of eliciting an immune response when introduced into a living organism such as a mammal. The term "immunogenic fragment" also includes any polypeptide or oligopeptide fragment of GCREC useful in any method of producing antibodies as disclosed herein or known in the art. .
[0086]
The term "microarray" refers to an arrangement of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0087]
The term "element" or "array element" refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound that has a unique, designated location on a microarray.
[0088]
The term "modulate" refers to a change in the activity of GCREC. Modulation can, for example, increase or decrease GCREC protein activity, binding properties, or other biological, functional or immunological properties.
[0089]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that may be single-stranded or double-stranded or represent a sense or antisense strand. , Peptide nucleic acid (PNA), or any DNA-like or RNA-like substance.
[0090]
"Operably linked" refers to the state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. When it is necessary to join two protein coding regions in the same reading frame, generally, operably linked DNA sequences can be very close together or contiguous.
[0091]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or an anti-gene agent that comprises an oligonucleotide at least about 5 nucleotides in length attached to the peptide backbone at amino acid residues terminating in lysine. Terminal lysine confers solubility to the components. PNAs preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcription elongation, and can be polyethyleneglycolated to extend the lifespan of PNAs in cells.
[0092]
A “post-translational modification” of GCREC may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of GCREC and can vary from cell type to cell type.
[0093]
"Probe" refers to a nucleic acid sequence that encodes GCREC, the complement of GCREC, or a fragment thereof, and is used to detect identical, allelic or related nucleic acid sequences. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioisotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. The primer can then be extended along the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs can be used for amplification (and identification) of nucleic acid sequences, for example, by the polymerase chain reaction (PCR).
[0094]
Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of a known sequence. Longer probes and primers to increase specificity, such as probes consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences; Primers may be used. Some probes and primers are considerably longer. It is understood that any length of nucleotide supported by the specification, including tables, figures and sequence listings, can be used.
[0095]
Methods for preparing and using probes and primers are described in Sambrook, J .; And others (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.C. M. Et al., (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Green Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications See Academic Press, San Diego CA, and the like. A PCR primer pair can be obtained from a known sequence using a computer program for that purpose, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
[0096]
The selection of oligonucleotides to use as primers is made using software well known in the art for such purpose. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs of up to 100 nucleotides each, oligonucleotides and up to 5,000 larger polynucleotides derived from input polynucleotide sequences up to 32 kilobases. It is also useful for analyzing data. Similar primer selection programs incorporate additional features for expansion capabilities. For example, the PrimOU primer selection program (available publicly from the Genome Center at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) is capable of selecting specific primers from megabase sequences, and thus covers the entire genome. Useful for designing primers. The Primer3 primer selection program (available from the Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research (Cambridge, Mass.)) Allows the user to enter a "non-priming library" that can specify sequences to be avoided as primer binding sites. Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays. (The source code of the latter two primer selection programs may be obtained from each source and modified to meet the specific needs of the user.) PrimerGen program (from the UK Human Genome Mapping Project-Resource Center in Cambridge, UK) Publicly available) designs primers based on multiple sequence alignments, thereby allowing the selection of primers that hybridize to either the largest or the smallest conserved region of the aligned nucleic acid sequences. I do. Thus, the program is useful for identifying unique and conserved fragments of oligonucleotides and polynucleotides. Oligonucleotides and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods can be used to identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, eg, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe to perform. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0097]
As used herein, a “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence in which two or more separate segments of a sequence are artificially combined. This artificial combination is often achieved by chemical synthesis, but more generally by the artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, for example, by genetic engineering techniques such as those described in Sambrook et al., Supra. Achieved by. The term recombinant nucleic acid also includes a mutant nucleic acid in which a part of the nucleic acid is simply added, substituted or deleted. Often, a recombinant nucleic acid includes a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can be part of a vector used, for example, to transform a cell.
[0098]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid may be part of a viral vector, for example based on vaccinia virus. Such a vaccinia virus can be inoculated into a mammal and the recombinant nucleic acid expressed and used to induce a protective immune response in the mammal.
[0099]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, and includes enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription, translation or RNA stability.
[0100]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and other components known in the art.
[0101]
As used herein, the term "RNA equivalent" for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as a reference DNA sequence, except that thymine, a nitrogenous base, is substituted with uracil, and the sugar chain backbone is Consists of ribose, not deoxyribose.
[0102]
The term "sample" is used in its broadest sense. Samples suspected of containing the nucleic acid encoding GCREC or fragments thereof, or GCREC itself, can be obtained from body fluids, extracts from cells, chromosomes, organelles or membranes isolated from cells, cells, lysates, etc. It can be composed of genomic DNA, RNA or cDNA bound to a substrate or a tissue, a tissue print, or the like.
[0103]
The terms "specific binding" and "specifically bind" refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction means that it depends on the presence or absence of a particular structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if the antibody is specific for the epitope "A", the unbound labeled "A" and the reaction solution containing the antibody may contain the polypeptide containing epitope A or the unlabeled "A" ”Reduces the amount of label A that binds to the antibody.
[0104]
The term "substantially purified" refers to an isolated or isolated nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and has at least about 60% of its naturally associated composition removed. Preferably at least about 75% removed, most preferably at least 90% removed.
[0105]
"Substitution" refers to the replacement of one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0106]
The term "substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate can have various surface morphologies, such as walls, grooves, pins, channels, holes, etc., to which polynucleotides or polypeptides bind to the substrate surface.
[0107]
"Transcription image" refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0108]
"Transformation" refers to the process by which foreign DNA is introduced into recipient cells. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art, and include any known method for inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. The method may be based. The method of transformation is selected depending on the type of host cell to be transformed. Transformation methods include, but are not limited to, viral infection, electroporation, heat shock, lipofection and microprojectile bombardment. "Transformed cells" include stably transformed cells which are capable of replicating autonomously replicating the introduced DNA as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that transiently express the introduced DNA or introduced RNA for a limited time are also included.
[0109]
As used herein, a "genetic transformant" is any organism, including, but not limited to, animals and plants, where one or several cells of the organism are involved in human involvement, for example, in the art. It has a heterologous nucleic acid introduced by well known transformation techniques. The nucleic acid is introduced into the cell either directly or indirectly, by introducing it into a precursor of the cell, by deliberate genetic manipulation, for example by microinjection or by introducing a recombinant virus. The term genetic manipulation does not refer to classical cross breeding or in vitro fertilization, but refers to the introduction of a recombinant DNA molecule. Genetic transformants contemplated according to the present invention include bacteria, cyanobacteria, fungi and plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, for example, by infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are well known and are provided in references such as Sambrook et al. (1989), supra.
[0110]
A “variant” of a particular nucleic acid sequence is defined as a nucleic acid sequence that has at least 40% homology with the particular nucleic acid sequence over the entire length of the nucleic acid sequence. At this time, blastn is executed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameter. Such a nucleic acid pair can be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may show 96%, 97%, 98%, 99% or more homology. Certain variants may be described, for example, as "allelic" variants (described above), "splice" variants, "species" variants or "polymorphic" variants. Splice variants can have significant homology to a reference molecule, but differential splicing of exons during mRNA processing usually results in polynucleotides having more or fewer bases. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack domains present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides usually have significant amino acid homology to one another. Polymorphic variants are mutations in the polynucleotide sequence of a particular gene among individuals of a given species. Polymorphic variant sequences can also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which one nucleotide of the polynucleotide sequence differs. The presence of a SNP may be indicative of, for example, a particular population, condition or propensity for a condition.
[0111]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a polypeptide sequence having at least 40% homology to the particular polypeptide sequence over one entire length of the polypeptide sequence. Here, blastp is executed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameter. Such a pair of polypeptides may be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, for a given length. , 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
(invention)
The present invention relates to novel human G proteins (GCRECs), polynucleotides encoding GCRECs, and cell proliferation abnormalities, neurological disorders, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory and metabolic disorders, and viral infections. It is based on the discovery of the use of these sequences for diagnosis, treatment and prevention.
[0112]
Table 1 is a summary of the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlates with one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was designated by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was designated by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
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Table 2 shows sequences with homology to the polypeptides of the invention, as identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the GenBank identification number (Genbank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score representing the match between each polypeptide and its GenBank homolog. Column 5 shows the annotations of the GenBank homologs, and also where appropriate references are given. These are incorporated herein by reference.
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Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues in each polypeptide. Rows 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI) of the GCG sequence analysis software package. Column 6 shows the amino acid residues that contain the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for analysis of the structure / function of the protein, and the relevant part shows a searchable database used for the analysis method.
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Taken together, Tables 2 and 3 schematically show the properties of the polypeptides of the present invention. These properties demonstrate that the claimed polypeptide is a G protein-coupled receptor. For example, SEQ ID NO: 1 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 56% identity with mouse olfactory receptor C6 (GenBank ID g3983734). (See Table 2). The BLAST probability score is 3.2e-90, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 1 also has a seven transmembrane (rhodopsin family) domain. This was determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM). (See Table 3). Data obtained from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide further evidence that SEQ ID NO: 1 is an olfactory G protein-coupled receptor. The algorithm and parameters for the analysis of SEQ ID NO: 1 are described in Table 5.
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As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequence of the present invention was constructed using a cDNA sequence or a coding (exon) sequence derived from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Columns 1 and 2 show the polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID) for each polynucleotide of the invention. Column 3 shows the length (in base pairs) of each polynucleotide sequence. Column 4 indicates fragments of the polynucleotide sequence that are useful for hybridization or amplification techniques, for example, to identify SEQ ID NO: 2 or to distinguish SEQ ID NO: 2 from related polynucleotide sequences. Column 5 shows the identification number corresponding to the cDNA sequence, the coding sequence (exon) predicted from genomic DNA and / or the sequence set having both cDNA and genomic DNA. These sequences were used to construct the full length polynucleotide sequences of the present invention. Columns 6 and 7 of Table 4 indicate the starting nucleotide (5 ') and ending nucleotide (3') positions of the cDNA and / or genomic sequence corresponding to the sequence of column 5, respectively.
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The identification numbers in column 5 of Table 4 may particularly refer to, for example, Incyte cDNA and its corresponding cDNA library. Incyte cDNAs for which no cDNA library is shown are from the pooled cDNA library. Alternatively, the identification number in row 5 may refer to a GenBank cDNA or EST that contributes to the assembly of the full length polynucleotide sequence. Alternatively, the identification numbers in column 5 may refer to coding regions predicted by Genscan analysis of genomic DNA. For example, GNN. g9965518_000001_032 is the identification number of the Genscan deduced coding sequence, and g99665518 is the identification number of the GenBank sequence obtained by Genscan analysis. This Genscan deduced coding sequence may have been edited prior to constructing the sequence. (Example 4See). In addition, the identification number in row 5 may identify a sequence derived from the ENSEMBL (The Sanger Center, Cambridge, UK) database (ie, a sequence containing the “ENST” designation). Alternatively, the identification number in column 5 may be from the NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records database (ie, a sequence containing the nomenclature "NM" or "NT"), and also from the NCBI RefSeq Protein Sequences. That is, a sequence containing the designation "NP"). Alternatively, the identification number in column 5 may refer to the group consisting of both the cDNA and the Genscan predicted exon, linked by an “exon-stitching” algorithm. For example, FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄  Indicates that the identification number of the cluster of the sequence to which the algorithm is applied is XXXXXXX, the number of the prediction generated by the algorithm is YYYYY, and N (if any)_{1,2,3. .}Are "sutured" sequences that are specific exons that may have been manually edited during analysis (see Example 5). Alternatively, the identification number in column 5 may refer to a set of exons connected by an “exon-stretching” algorithm. For example, FLXXXXXX_gAAAAAA_gBBBBBB_1_N is the identification number of the “stretch” sequence. Here, XXXXXX is the Incyte project identification number, gAAAAAA is the GenBank identification number of the human genomic sequence to which the “exon stretching” algorithm is applied, and gBBBBBB is the GenBank identification number or NCBI RefSeq identification number of the closest GenBank protein homolog. (See Example 5.) When a RefSeq sequence was used as a protein homolog for the “exon stretching” algorithm, it is represented by a RefSeq identification number (“NM”, “NP”, or “NT”). May be used instead of GenBank identification (ie, gBBBBBB).
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Alternatively, the prefix identifies a manually edited constituent sequence, a constituent sequence predicted from a genomic DNA sequence, or a constituent sequence derived from a combined sequence analysis method. The following table lists the prefixes of the constituent sequences and examples of sequence analysis methods corresponding to the prefixes (see Examples 4 and 5).

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In some cases, coverage of the Incyte cDNA was obtained that overlapped with the coverage of the sequence as shown in column 5 to confirm the final consensus polynucleotide sequence, but did not give an associated Incyte cDNA identification number.
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The present invention also includes variants of GCREC. Preferred GCREC variant amino acid sequences have at least about 80%, or at least about 90%, or even at least about 95% identity with the GCREC amino acid sequence, and have at least one functional or structural characteristic of GCREC. It is a variant that has
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The present invention also includes a polynucleotide encoding GCREC. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 2, which encodes GCREC. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 shown in the sequence listing includes an equivalent RNA sequence in which thymine, a nitrogenous base, is substituted with uracil, and the backbone of the sugar chain is not deoxyribose but ribose.
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The present invention also includes a mutant sequence of the polynucleotide sequence encoding GCREC. In particular, a variant of such a polynucleotide sequence will have at least about 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding GCREC, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, or even more. It has at least about 95% polynucleotide sequence identity. Some embodiments of the invention include variants of the polynucleotide comprising the sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the variants are at least about 70%, or at least about 85%, of the nucleic acid sequence of SEQ ID: 2, or It has at least about 95% polynucleotide sequence identity. A variant of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of GCREC.
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One of skill in the art will appreciate that the degeneracy of the genetic code results in a large number of polynucleotide sequences that encode GCREC (some polynucleotide sequences have minimal similarity to the polynucleotide sequence of a known or natural gene). It is understandable that it can produce Thus, the present invention may cover any and all possible variants of the polynucleotide sequence that can be generated by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code as applied to native GCREC polynucleotide sequences, and all such variations are believed to be expressly disclosed.
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Nucleotide sequences encoding GCREC and variants thereof are generally capable of hybridizing to the nucleotide sequence of naturally occurring GCREC under suitably selected stringent conditions, but are not limited to GCREC or derivatives thereof and substantially different codons. It would be beneficial to create a nucleotide sequence that encodes for some uses, for example, for inclusion of non-naturally occurring codons. Based on the frequency with which a particular codon is utilized by the host, it is possible to select codons to enhance the expression of peptides that occur in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding GCREC and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that it has properties that are preferred over transcripts made from the native sequence, such as having a longer half-life. Production of RNA transcripts with
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The invention also includes the production of DNA sequences encoding GCRECs, GCREC derivatives and fragments thereof, or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. Once made, the synthetic sequence may be inserted into any of the various available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to induce mutations in the sequence encoding GCREC or any fragment thereof.
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The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NO: 2 and fragments thereof (eg, Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in Definitions.
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Methods for DNA sequencing are known in the art, and any of the embodiments of the present invention can be practiced using DNA sequencing methods. Enzymes can be used in the DNA sequencing method. For example, Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), and thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia, N. Biocia, Japan) ) Can be used. Alternatively, a polymerase and a calibrated exonuclease can be used in combination, for example, as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). Preferably, an apparatus such as a MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), a PTC 200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA) and an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) are used to automate the arrangement. Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other methods well known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg, Ausubel, FM (1997)).Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7 units, Meyers, R.E. A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pages 856-853).
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The nucleic acid sequence encoding GCREC is extended using partial nucleotide sequences and various methods based on PCR well known in the art to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. be able to. For example, one of the methods that can be used, the restriction site PCR method, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (for example, Sarkar, G. (1993)). ) PCR Methods Appl. 2: 318322.) Another method is inverse PCR, which amplifies an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is obtained from a restriction enzyme fragment containing a known genomic locus and its surrounding sequences (for example, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). As a third method, there is a capture PCR method. This involves a method of PCR amplifying DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA. (See Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-119, etc.). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region by using digestion and ligation reactions of a plurality of restriction enzymes before performing PCR. Other methods that can be used to search for unknown sequences are known in the art (see, for example, Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). In addition, genomic DNA can be walked using PCR, nested primers and PromoterFinder ™ library (Clontech, Palo Alto CA). This procedure is useful for finding intron / exon junctions without having to screen the library. For all PCR-based methods, commercially available software, such as OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, may be about 22-30 nucleotides in length, Primers can be designed to anneal to the template at a GC content of about 50% or more and a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
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When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include larger cDNAs. In addition, libraries of random primers often include sequences having the 5 'region of the gene and are suitable for situations where the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA. Genomic libraries will be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
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A commercially available capillary electrophoresis system can be used to analyze the size of the sequencing or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing consists of a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera used for The output / light intensity can be converted to an electrical signal using appropriate software (such as GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR from Applied Biosystems). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
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In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding GCREC, or a fragment thereof, is cloned into a recombinant DNA molecule that expresses GCREC, a fragment of GCREC, or a functional equivalent thereof, in a suitable host cell. I can do it. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, another DNA sequence that encodes a substantially identical or functionally equivalent amino acid sequence can be generated and used for GCREC expression.
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The nucleotide sequence of the present invention can be recombined using methods commonly known in the art to change the sequence encoded by GCREC for various purposes. The objectives here include, but are not limited to, cloning, processing, and regulating the expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
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The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797; Christians, F. C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). The biological or enzymatic activity of the protein or the ability to bind to other molecules or compounds can be altered or improved. DNA shuffling is the process of creating a library of gene variants using PCR-mediated recombination of gene fragments. The library is then subjected to selection or screening to identify the gene variant with the desired properties. These suitable mutants may then be pooled and subjected to repeated DNA shuffling and selection / screening. Thus, diverse genes are created by artificial breeding and rapid molecular evolution. For example, a single gene fragment having a random point mutation can be recombined, screened, and then shuffled until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene is recombined with a homologous gene of the same gene family, obtained from either the same species or a different species, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a directed and controllable manner. be able to.
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According to another embodiment, the sequence encoding GCREC can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH. Et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7.225-232). Alternatively, GCREC itself or a fragment thereof may be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid or solid phase techniques (eg, Creighton, T. (1984)).Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60; Y. Et al. (1995) Science 269: 202204. 2.) Automated synthesis can be achieved using ABI 431A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems). Furthermore, the amino acid sequence of GCREC, or any portion thereof, may be modified by alteration during direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof, to provide a polypeptide having a native polypeptide sequence. It is possible to make peptides or variant polypeptides.
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Peptides can be substantially purified using high performance liquid chromatography for separation (see, eg, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, supra, pages 28-53, etc.).
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To express a biologically active GCREC, a nucleotide sequence encoding GCREC or a derivative thereof can be inserted into a suitable expression vector. A preferred expression vector is a vector that contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the inserted coding sequence in a suitable host. Necessary elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding GCREC. Such elements vary in length and specificity. Using a unique initiation signal, GCREC-encoding sequences may be translated more effectively. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding GCREC, its initiation codon and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be necessary. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG initiation codon should be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be of various natural and synthetic origin. Inclusion of suitable enhancers for the particular host cell line used can increase the efficiency of expression. (See Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162.).
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Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to construct an expression vector containing a sequence encoding GCREC and suitable transcription and translation control elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoGenetic recombination techniques are included (eg, Sambrook, J. et al. (1989)).Molecular Cloning. A Laboratory ManualAusubel, F., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. (See Chapters 9, 13, and 16).
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A variety of expression vector / host systems may be utilized to retain and express the sequence encoding GCREC. Such expression vector / host systems include, but are not limited to, bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viruses. Insect cell lines infected with an expression vector (eg, baculovirus) or plant cell lines transformed with a viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV or tobacco mosaic virus TMV) or a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid) And microorganisms such as animal cell lines. (Sambrook, supra, Ausubel, supra, Van Heke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509; Engelhard, EK, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6: 307-311; Science and Technology Yearbook "(The McGraw Hill Year of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196, Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659; Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355 etc.) Retroviruses, adenoviruses Nucleotide sequences can be delivered to target organs, tissues or cell populations using expression vectors derived from Herpes virus, herpes virus or vaccinia virus, or from various bacterial plasmids (Di Nicola, M. et al. (1998). 5), 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, RM et al. McGregor, DP, et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389:) Nature 317 (6040): 813-815; 239-242). The present invention is not limited by the host cell used.
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In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors are available for selection depending on the use intended for the polynucleotide sequence encoding GCREC. For example, for routine cloning, subcloning and propagation of a polynucleotide sequence encoding GCREC, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or PSPORT1 plasmid (Life Technologies) can be used. The ligation of the sequence encoding GCREC to multiple cloning sites in the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, these vectors are used in the cloned sequence.in in vitroIt may also be useful for transcription, sequencing dideoxy, rescue of single strands by helper phage, generation of nested deletions (eg, Van Heake, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 55035509). When a large amount of GCREC is required, for example, when an antibody is produced, a vector that induces GCREC expression at a high level can be used. For example, vectors containing the strong inducible SP6 or T7 bacteriophage promoter can be used.
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GCREC may be produced using a yeast expression system. Numerous vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, PGH promoter, etc.Saccharomyces cerevisiae ) Or Pichia yeast (Pichia pastoris )It can be used for Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention in cells, incorporating foreign sequences into the host genome for stable growth. (See, for example, Ausubel, 1995, supra, Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544, and Scorer. CA, et al. (1994) Bio / Technology 121: 181-184. reference).
[0141]
It is also possible to express GCREC using a plant system. Transcription of the GCREC-encoding sequence can be achieved by using a viral promoter, for example, the 35S and 19S promoters derived from CaMV alone or the omega leader sequence derived from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). Can be used in combination to facilitate. Alternatively, a plant promoter such as a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (for example, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science). 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105) These constructs are used for direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection into plants. It can be introduced into cells. (Maglow Hill Science and Technology Yearbook (The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196.
[0142]
In mammalian cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, the sequence encoding GCREC can be ligated to an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. It is possible to insert the viral genome into a non-essential E1 or E3 region to obtain an infectious virus that expresses GCREC in host cells. (See, e.g., Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 36553659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. High levels of protein expression can also be achieved using vectors based on SV40 or EBV.
[0143]
Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to transport fragments of DNA larger than those contained in and expressed from the plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb of HACs are made for treatment and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (See, e.g., Harrington. JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355.).
[0144]
For long term production of recombinant proteins in mammalian systems, stable expression of GCREC in cell lines is desirable. For example, using an expression vector containing a replication expression factor, an endogenous expression factor, or both, of a viral origin, and a selectable marker gene on the same or a different vector, a GCREC-encoding sequence is transformed into a cell. It is possible to transform the strain. After the introduction of the vector, the cells can be allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selection medium, and the presence of the selectable marker allows for the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0145]
The transformed cell line can be recovered using any number of selection systems. Such selection systems include, but are not limited to, tk⁻A herpes simplex virus thymidine kinase gene used for cells, and apr⁻There are herpes simplex virus adenine phosphoribosyltransferase genes used for cells (eg, Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823. See). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als confer resistance to chlorsulfuron, and pat confer resistance to phosphinothricin acetyltransferase (Wigler, M., et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 35673570; Columbia Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 114.) Other selectable genes, such as metabolism TrpB and hisD, which alter the requirements of the cells for, are described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. USA 85: 80478051.) Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. Using these markers, it is possible not only to identify transformants, but to quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (Rhodes, CA (1995) Methods). Mol. Biol. 55: 121131).
[0146]
Even if the presence / absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding GCREC is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing sequences encoding GCREC can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, it is also possible to arrange a marker gene in tandem with a sequence encoding GCREC under the control of a single promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0147]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence that encodes GCREC and that express GCREC can be identified using a variety of methods well known to those skilled in the art. Non-limiting methods well known to those skilled in the art include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, nucleic acid or protein detection, quantification, or both, membrane systems and solutions. There are protein bioassay or immunoassay techniques including base or chip based techniques.
[0148]
Immunological methods for detecting and measuring GCREC expression using specific polyclonal or monoclonal antibodies are known in the art. Examples of such techniques include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), and fluorescence activated cell sorting (FACS). A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on GCREC is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990).Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV, Coligan, J.M. E. FIG. Others (1997)Current Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J .; D. (1998)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ, etc.).
[0149]
A wide variety of methods for labeling and conjugation are known to those skilled in the art and may be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for producing labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences associated with polynucleotides encoding GCREC include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. There are PCR amplification methods to use. Alternatively, the sequence encoding GCREC or any fragment thereof can be cloned into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are known in the art and commercially available, with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. Such methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison WI), U.S.A. S. It can be performed using various kits commercially available from Biochemical or the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0150]
Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding GCREC can be cultured under conditions suitable for the recovery and expression of the protein from the cell culture medium. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence, the vector, or both. As will be appreciated by those skilled in the art, an expression vector comprising a polynucleotide encoding GCREC may be designed to include a signal sequence that directs secretion of GCREC across a prokaryotic or eukaryotic cell membrane.
[0151]
In addition, selection of a host cell strain may be made by its ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify the target protein, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) with unique cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va.). It is possible and can be chosen to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0152]
In another embodiment of the present invention, a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence encoding GCREC can be ligated to a heterologous sequence that results in translation of the fusion protein in any of the above host systems. For example, a chimeric GCREC protein containing a heterologous moiety that can be recognized using a commercially available antibody can facilitate screening of a peptide library for GCREC activity inhibitors. Heterologous protein moieties and heterologous peptide moieties can also facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such portions include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelating resin allow purification of homologous fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. The fusion protein can also be engineered to include a proteolytic cleavage site between the GCREC coding sequence and the heterologous protein sequence so that GCREC can be cleaved from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel (1995), Chapter 10, supra. Various commercially available kits can also be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0153]
In yet another embodiment of the present invention, the synthesis of radiolabeled GCREC using a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is described.in in vitroIs possible. These systems couple the transcription and translation of a protein coding sequence operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation, for example³⁵It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0154]
A compound that specifically binds to GCREC can be screened using the GCREC of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to GCREC. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0155]
In one embodiment, the compound so identified is closely related to a natural ligand of GCREC, eg, a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which GCREC binds, or at least some fragment of the receptor, eg, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves producing suitable cells that express GCREC as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila, or E. coli. Cells expressing GCREC or cell membrane fragments containing GCREC are contacted with a test compound to analyze binding, stimulation or inhibition of either GCREC or the compound.
[0156]
Some assays can simply experimentally bind a test compound to a polypeptide and detect that binding with a fluorescent dye, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include binding at least one test compound to GCREC in solution or immobilized on a solid support, and detecting binding of GCREC to the compound. Alternatively, detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed with cell-free reconstituted specimens, chemical libraries or natural product mixtures, where the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0157]
The GCREC of the present invention or a fragment thereof can be used to screen for a compound that modulates the activity of GCREC. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions where the activity of GCREC is permissive, in which at least one test compound is mixed with GCREC and the activity of GCREC in the presence of the test compound is determined in the absence of the test compound. GCREC activity. A change in the activity of GCREC in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of GCREC. Alternatively, the test compound comprises GCREC under conditions suitable for the activity of GCREC.in in vitroAlternatively, the assay is performed in combination with a cell-free reconstitution system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of GCREC can bind indirectly and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one and a plurality of test compounds can be screened.
[0158]
In another example, a polynucleotide encoding GCREC or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from an early mouse embryo and can be grown in a medium. These ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected, for example, from the C57BL / 6 mouse line. The blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are determined, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested with potential therapeutic or toxic agents.
[0159]
A polynucleotide encoding GCRECin in vitroIt is possible to operate on ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0160]
Polynucleotides encoding GCREC can be used to create “knock-in” humanized animals (pigs) or transgenic animals (mouse or rat) modeled on human disease. Using knock-in technology, a region of the polynucleotide encoding GCREC is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into a blastula and the blastula is implanted as described above. Study transgenic progeny or inbred lines and treat with potential medicines to obtain information on the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress GCREC, eg, secrete GCREC into milk, may be a convenient source of proteins (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55). -74).
(Treatment)
Chemical and structural similarities, such as in the context of sequences and motifs, exist between regions of GCREC and G protein-coupled receptors. Thus, GCREC is thought to play a role in abnormal cell proliferation, neuropathy, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory and metabolic disorders, and viral infections. In treating diseases associated with increased GCREC expression or activity, it is desirable to reduce GCREC expression or activity. In the treatment of a disease associated with a decrease in the expression or activity of GCREC, it is desirable to increase the expression or activity of GCREC.
[0161]
Thus, in certain embodiments, it is possible to administer GCREC or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced GCREC expression or activity. Such disorders include, but are not limited to, proliferative disorders, neurological disorders, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory disorders, metabolic disorders, and viral infections. For actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary Thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestion Includes duct, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterine cancer, etc.Some nerve diseases include epilepsy , Ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple occurrences Sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural pyometra, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral Central nervous system diseases and prion diseases including Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann syndrome, Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, and fatal familial insomnia, nervous nutritional and metabolic diseases, neurofibromatosis, Tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastomatosis, cerebral trigeminal neurovascular Syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders, cerebral palsy, nervous skeletal disorders, autonomic nervous system disorders, peripheral neuropathy, dermatomyositis and polymyositis, and hereditary, metabolic, endocrine, and Toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, psychosis including disorders of mood and anxiety, schizophrenia, seasonal disorders (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, Diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal deficiency syndrome, dystonia, schizophrenic psychiatric disorder, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration and familial frontal It includes head amnesia, and cardiovascular diseases include arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose vein, thrombophlebitis and Complications of venous thrombosis, vascular tumors, thrombolysis, balloon angioplasty, vascular replacement, and aortic coronary artery bypass graft surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina, myocardium Infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart Disease, infectious endocarditis, non-bacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart Diseases, and complications of heart transplantation, include gastrointestinal disorders, dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, digestive disorders, Inflammation, stomach cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infections, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis , Pancreatic cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss Syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel syndrome, short small bowel syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hepatic steatosis , Hemoglobinosis, Wilson disease, α-1-antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal vein occlusion and thrombus, central lobule necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein Obstruction, child It includes preeclampsia, eclampsia, gestational acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular regeneration and adenomas and carcinomas. Some autoimmune / inflammatory diseases include inflammation and sunlight. Keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, Autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocyte toxin Transient lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable colon Syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, Systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasite Insect diseases, protozoan infections, helminth infections, and trauma; metabolic disorders include diabetes, obesity, and osteoporosis; and infectious diseases include adenovirus and arenavirus, bunya Virus, calicivirus, coronavirus, filovirus, hepadnavirus, herpes virus, flavivirus, orthomyxovirus, parvovirus, Includes infection by viral pathogens classified as papovavirus, paramyxovirus, picornavirus, poxvirus, reovirus, retrovirus, rhabdovirus, tongavirus.
[0162]
In another embodiment, a vector capable of expressing GCREC or a fragment or derivative thereof is administered to a patient to treat or prevent a disease associated with reduced expression or activity of GCREC, including but not limited to the diseases described above. It is also possible.
[0163]
In yet another embodiment, a component comprising substantially purified GCREC is administered to a patient along with a suitable pharmaceutical carrier to reduce the expression or activity of GCREC, including but not limited to the diseases described above. It is also possible to treat or prevent such diseases.
[0164]
In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of GCREC is administered to a patient to treat or prevent a disease associated with reduced expression or activity of GCREC, including but not limited to the diseases described above. It is possible.
[0165]
In yet another embodiment, a patient can be administered a GCREC antagonist to treat or prevent a disease associated with increased GCREC expression or activity. Examples of such diseases include, but are not limited to, the abnormal cell proliferation described above, neurological disorders, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory disorders and metabolic disorders, and viral infections. In one embodiment, an antibody that specifically binds GCREC, either directly as an antagonist or indirectly as a targeting or transport mechanism that delivers the drug to cells or tissues that express GCREC, can be used.
[0166]
In another embodiment, a vector expressing the complement of a polynucleotide encoding GCREC is administered to a patient to treat a disease associated with increased expression or activity of GCREC, including but not limited to the diseases described above. Or it can be prevented.
[0167]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, or vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy can be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. Combination with a therapeutic agent can have a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. By using this method, a medicinal effect can be obtained with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
[0168]
GCREC antagonists may be prepared using methods generally known in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified GCREC, or libraries of therapeutic agents can be screened to identify those that specifically bind to GCREC. GCREC antibodies can also be produced using methods generally known in the art. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are generally suitable for therapeutic use.
[0169]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans, etc., may be injected with GCREC or any fragment or oligopeptide of GCREC having immunogenic properties. Can be immunized. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and other surfactants. There are agents. Among the adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0170]
Oligopeptides, peptides or fragments used to elicit antibodies against GCREC consist of at least about 5 amino acids, and generally preferably have an amino acid sequence of at least about 10 amino acids. Desirably, these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and include the entire amino acid sequence of the small native molecule. Short extensions of GCREC amino acids can be fused to sequences of another protein, such as keyhole limpet hemocyanin, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0171]
Monoclonal antibodies to GCREC may be produced by continuous cell lines in culture using any technique which produces antibody molecules. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497, Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP, et al. (1984) Mol. Cell Biol.62: 109-120 etc.).
[0172]
In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene with a human antibody gene developed for the production of "chimeric antibodies" are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 68516855; Neuberger, MS, et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314. : 452, 454.) Alternatively, applying the techniques described for producing single-chain antibodies, and producing GCREC-specific single-chain antibodies using methods known in the art. obtain. Antibodies with related specificities but differing idiotypic compositions can also be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (Bulton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 88: 10134-10137 etc.).
[0173]
Antibody production in the lymphocyte populationin VivoIt can also be done by inducing production or by screening immunoglobulin libraries or a panel of highly specific binding reagents as disclosed in the literature (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0174]
Antibody fragments which have specific binding sites for GCREC can also be produced. For example, but not by way of limitation, such fragments may include F (ab ') 2 produced by pepsin digestion of the antibody molecule.₂ Fragment and F (ab ')₂ Some Fab fragments are made by reducing the disulfide bridges of the fragment. Alternatively, it is possible to identify a monoclonal Fab fragment with desired specificity quickly and easily by preparing an Fab expression library (Huse, WD, et al. (1989) Science 246: 1275-1281). reference).
[0175]
Screening can be performed using various immunoassays to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for immunoradiometric or competitive binding assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are known in the art. Such immunoassays typically involve the measurement of complex formation between GCREC and its specific antibody. Two-site, monoclonal-based immunoassays, such as those using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering GCREC epitopes, are commonly utilized, but a competitive binding assay may be utilized (Pond, supra).
[0176]
Various methods, such as Scatchard analysis, are used in conjunction with radioimmunoassay techniques to evaluate the affinity of the antibody for GCREC. The affinity is represented by the binding constant Ka. Ka is defined as the molar concentration of the GCREC antibody complex at equilibrium divided by the molar concentrations of free antibody and free antigen. Polyclonal antibodies have heterogeneous affinities for various GCREC epitopes, and the Ka determined for the polyclonal antibody reagent represents the average affinity or avidity of the GCREC antibody. Monoclonal antibodies are monospecific for a particular GCREC epitope, and the Ka determined for a monoclonal antibody reagent represents a true measure of affinity. Ka value is about 10⁹-10¹² High affinity antibody reagents, such as in the L / mol range, are preferably used in immunoassays where the GCREC antibody conjugate must withstand severe manipulations. Ka value is 10⁶-10⁷The L / mol low affinity antibody drug is preferably used for immunopurification and similar treatments where GCREC must eventually dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; E. FIG. and Cryer, A.C. (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0177]
The titer and avidity of the polyclonal antibody reagents can be further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain subsequent applications. For example, polyclonal antibody reagents containing at least 1-2 mg / ml, preferably 5-10 mg / ml of a specific antibody are commonly used in processes requiring precipitation of GCREC antibody complexes. Information on antibody specificity, titer, avidity, and guidelines for antibody quality and use in various applications is generally available. (Refer to the above-mentioned Catty reference and the same reference by Coligan et al.).
[0178]
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding GCREC, any fragment or complement of GCREC can be used for therapeutic purposes. In one embodiment, sequences complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding GCREC and antisense molecules (DNA and RNA, PNA, modified oligonucleotides) can be designed to alter gene expression. Such techniques are well known in the art, and antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the sequence encoding GCREC, or from various locations along the coding region. (Agrawal, S., ed. (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc. , Totawa NJ. )
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing the antisense sequences into suitable target cells can be used. The antisense sequence can be transported intracellularly in the form of an expression plasmid that upon transcription creates a sequence complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (Slater, JE et al. 1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475; and Scanlon, KJ et al. (1995) 9 (13): 1288-1296.) Antisense sequences can also be, for example, retroviruses. And a viral vector such as an adeno-associated virus vector (Miller, AD (1990) Blood 76: 271; Ausubel, Uckert, W. and W. Walther (1994), supra). Pharmacol. Ther. 63 ( 3): 323-347). Other gene delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217). -225; Bodo, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736. Etc.).
[0179]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding GCREC can be used for somatic or germ cell gene therapy. Gene therapy results in (i) severe combined immunodeficiency (SCID) characterized by a gene deficiency (eg, X chromosomal strand inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)). -X1), severe combined immunodeficiency associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480; Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to deficiency of Factor VIII or Factor IX (Crystal, 35 RG (1995)). ) Science 270: 404-410, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389: 239-242), and (ii) expressing a conditional lethal gene product (eg, uncontrollable cells). (Iii) cancers caused by proliferation), (iii) parasites in cells (eg, human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996) Proc). Natl.Acad .. Sci USA 93: 11395-11399), B-type or C hepatitis virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites, etc., andPlasmodium falciparumas well asTrypanosoma cruziAnd other proteins having a protective function against protozoan parasites. When deficiency of a gene required for expression or regulation of GCREC causes disease, expression of GCREC from a suitable population of transduced cells can alleviate the onset of symptoms caused by the gene deficiency.
[0180]
In a further embodiment of the invention, a mammalian expression vector encoding GCREC is produced and these vectors are introduced into GCREC-deficient cells by mechanical means to treat diseases and disorders caused by GCREC deficiency.in VivoOrex in vitroThe mechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (ii) gene guns, (iii) transfection via liposomes, and (iv) receptors. Mediated gene transfer, and (v) the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997). ) Cell 91: 501-510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0181]
Expression vectors that can affect, but are not limited to, the expression of GCREC include PCDNA3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX, PCR2-TOPOTA vector (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG. , PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA) and PTT-OFF, PET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, and PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express GCREC, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene, etc.); (Ii) Inducible promoters (eg, a tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Inc.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). U.S.A. 89: 5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotech. 9: 451-456)), an ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), an FK506 / rapamycin inducible promoter, or a RU486 / mifepristone inducible promoter ( Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) the natural or tissue-specific promoter of an endogenous gene encoding GCREC from a normal individual. It is.
[0182]
The use of commercially available liposome transformation kits (eg, PERFECT LIPID TRANSFECTION KIT from Invitrogen) allows those skilled in the art to introduce polynucleotides into target cells in culture without too much experience. Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845. ). The introduction of DNA into primary cultures requires modification of standardized mammalian transfection protocols.
[0183]
In another embodiment of the invention, the disease or disorder caused by a genetic defect associated with the expression of GCREC comprises: (i) a polynucleotide encoding GCREC under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter; And (ii) a suitable RNA packaging signal, and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences required for efficient vector propagation. Viral vectors can be made and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and are described in published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6773-6737). Based on. The above data is incorporated herein by reference. The vector is propagated in a suitable vector-producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene with affinity for the receptor on the target cell or a pan-affinity envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650, Bender, MA, et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA. And AD Miller (1988) J. Virol. Virol. 62: 3802-3806, Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). U.S. Patent No. 5,910,434 to RIGG ("Method for observing retrovirus packaging cell lines producing high transducing effect"; a method for disseminating the virus in a retrospective system) Citation is incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, cell populations (eg, CD4⁺ Transduction of (T cells) and the return of the transduced cells to the patient are methods known to those skilled in the art of gene therapy and are described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997). J. Virol. 71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. 1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0184]
Alternatively, an adenovirus-based gene therapy delivery system is used to deliver a GCREC-encoding polynucleotide to a cell that has one or more genetic abnormalities associated with GCREC expression. The production and packaging of adenovirus-based vectors are known to those skilled in the art. Replication-defective adenovirus vectors have been shown to be variable for introducing genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets of the pancreas (Csete, ME et al. (1995) Transplantation 27). : 263-268). Adenovirus vectors that may be used are described in U.S. Patent No. 5,707,618 to Armentano ("Adenovirus vectors for gene therapy"), which is hereby incorporated by reference. And For adenovirus vectors, see Antinozzi, P. et al. A. Et al. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544 and Verma, I .; M. And N.I. See also Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242. Both documents are incorporated herein by reference.
[0185]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a GCREC-encoding polynucleotide to target cells that have one or more genetic abnormalities associated with GCREC expression. The use of herpes simplex virus (HSV) -based vectors is particularly useful in introducing GCREC into cells of the central nervous system where HSV has an affinity. The production and packaging of herpes-based vectors is known to those skilled in the art. Vectors of the replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385-385). 395). The construction of the HSV-1 viral vector is also disclosed in U.S. Patent No. 5,804,413 to DeLuca ("Herpes simplex viruses against genes transfer"), which is hereby incorporated by reference. Partly. US Patent No. 5,804,413 describes a recombinant HSV d92 comprising a genome having at least one exogenous gene introduced into a cell under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. There is a description. The patent also discloses the generation and use of recombinant HSV strains that are eliminated for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are incorporated herein by reference. Manipulation of the cloned herpesvirus sequence, production of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the genome of the herpesvirus giant, growth and propagation of the herpesvirus, and infection of cells with the herpesvirus This is a technique known to those skilled in the art.
[0186]
Alternatively, a polynucleotide encoding GCREC is delivered to target cells using an alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vector. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been extensively performed, and gene transfer vectors have been found to be based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is created, usually encoding the viral capsid protein. This subgenomic RNA is replicated to a higher level than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins relative to viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing the coding sequence for GCREC into the alphavirus genome of the capsid coding region, a large number of GCREC-encoding RNAs are produced in the vector-transfected cells and high levels of GCREC are synthesized. The ability to establish persistent infection of hamster normal kidney cells (BHK-21) harboring a mutant of Sindbis virus (SIN), while infection of the alpha virus is usually associated with cell lysis within a few days, , Suggest that the lytic replication of the α virus can be suitably modified to be applicable to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). The wide host range of alpha viruses allows the introduction of GCREC into a variety of cell types. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of cells prior to transduction. Methods for treating infectious cDNA clones of the α virus, transfecting the cDNA and RNA of the α virus, and infecting the α virus are known to those skilled in the art.
[0187]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. The transcription start site is, for example, between about -10 and about +10 counted from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because triple helix base pairing inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent advances in therapy using triple helix DNA are described in the literature (Gee, JE et al. (1994) in: Huber, BE and BI Carr, Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing). Co., Mt. Kisco, NY, pp. 163-177.) Complementary sequences or antisense molecules may also be designed to prevent translation of mRNA by preventing transcripts from binding to ribosomes. Can be.
[0188]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules, and ribozymes can also be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA and subsequent endonucleolytic cleavage. For example, hammerhead ribozyme molecules produced by genetic engineering may specifically and effectively catalyze endonucleolytic cleavage of GCREC-encoding sequences.
[0189]
Specific ribozyme cleavage sites within any RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, including GUA, GUU, GUC sequences. Once identified, assess whether the short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site has secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. Becomes possible. Assessment of the suitability of a candidate target can also be made by testing the accessibility of hybridization with a complementary oligonucleotide using a ribonuclease protection assay.
[0190]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. Optional methods include chemically synthesizing oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, the DNA sequence encoding GCRECin in vitroas well asin VivoRNA molecules can be produced by transcription. Such a DNA sequence can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that constitutively or inducibly synthesize complementary RNA can be introduced into a cell line, cell or tissue.
[0191]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible, but not limiting, modifications include the addition of flanking sequences at the 5 ′ end, 3 ′ end, or both, of the molecule, and phosphorothioate or 2 ′ rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. 'Using O-methyl. This concept is unique to the production of PNA and can be extended to all these molecules. These include adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases, with acetyl-, methyl-, thio-, and similar modifications, as well as non-conventional bases such as inosine, queosine. (Queeosine), wybutosine and the like.
[0192]
An additional embodiment of the present invention includes a method of screening for a compound effective for mutating expression of a polynucleotide encoding GCREC. Compounds that are effective to cause, but are not limited to, altered expression of a specific polynucleotide include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcription regulators, and specific polynucleotides. There are non-polymeric chemical entities that can interact with the sequence. Effective compounds can mutate polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Thus, in the treatment of diseases associated with increased GCREC expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding GCREC are therapeutically useful, and are associated with decreased GCREC expression or activity. In treating disease, compounds that specifically enhance the expression of a polynucleotide encoding GCREC may be therapeutically useful.
[0193]
At least one to a plurality of test compounds may be screened for efficacy in mutagenizing a specific polynucleotide. Test compounds are obtained by any method commonly known in the art. Such methods include mutating the expression of the polynucleotide, selecting from existing, commercially available or proprietary, natural or non-natural compound libraries, and chemically and / or structurally modifying the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective when rationally designing compounds based on properties and when selecting from libraries of combinatorially or randomly generated compounds. A sample containing a polynucleotide encoding GCREC is exposed to at least one of the test compounds thus obtained. The sample can be, for example, an intact cell, a permeabilized cell, a cell-free reconstituted system or a reconstituted biochemical system. Changes in the expression of a polynucleotide encoding GCREC are assayed by any method commonly known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding GCREC. The amount of hybridization can be quantified, thereby forming the basis for a comparison of the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. Detection of a change in expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in mutating expression of the polynucleotide. For a compound that is effective for mutant expression of a specific polynucleotide, for example, fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) Gene expression systems (Atkins, D. et al. (1999) U.S. Patent No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell lines such as HeLa cells ( Screening is performed using Clarke, ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention involve screening a combinatorial library of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against a specific polynucleotide sequence ( Bruice, TW, et al. (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW, et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0194]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitroas well asex VivoEqually suitable for the use ofex VivoFor treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient, cloned and propagated and returned to the same patient by autotransplantation. Transfection, ribosome injection or delivery by polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-). 466.).
[0195]
Any of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0196]
An additional embodiment of the present invention involves the administration of an ingredient having an active ingredient usually formulated in a pharmaceutically acceptable excipient. Excipients include, for example, sugars, starches, celluloses, gums and proteins. Various prescriptions are usually known,Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such components can consist of GCRECs, antibodies to GCRECs, mimetics, agonists, antagonists, or GCREC inhibitors.
[0197]
The components used in the present invention can be administered by any number of routes, including but not limited to oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, Intraventricular, lung, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
[0198]
Components for pulmonary administration can be prepared in liquid or dry powder form. Such components typically aerosolize shortly before inhalation by the patient. In the case of small molecules (eg, conventional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast acting formulations is known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), the recent improvement in the art of pulmonary delivery through the alveolar region of the lung results in the transport of drugs such as insulin substantially into the blood circulation. (See Patton, JS, et al., US Pat. No. 5,997,848, etc.). Pulmonary delivery is advantageous in that it is administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0199]
Ingredients suitable for use in the present invention include those that contain as much active ingredient as necessary to achieve the intended purpose. Determination of the effective dosage is within the ability of those skilled in the art.
[0200]
Specially shaped components are prepared for direct intracellular delivery of macromolecules, including GCRECs or fragments thereof. For example, a liposome formulation comprising a cell-impermeable polymer may facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, GCREC or a fragment thereof can be attached to the short cation N-terminal from the HIV Tat-1 protein. The fusion protein thus produced is known to transduce cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285: 1569-1572). .
[0201]
For any compound, an effective dosage of treatment can be initially estimated in cell culture assays, such as those for neoplastic cells, or in animal models such as mice, rabbits, dogs or pigs. . Animal models can also be used to determine suitable concentration ranges and routes of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans.
[0202]
A therapeutically effective dose refers to that amount of active ingredient that ameliorates the symptoms or condition. Examples of such active ingredients are GCREC or fragments thereof, antibodies of GCREC, agonists, antagonists or inhibitors of GCREC. Medicinal efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, for example, ED₅₀(Pharmaceutically effective amount of 50% of the population) or LD₅₀(A lethal dose of 50% of the population). The dose ratio of toxic to therapeutic effects is the therapeutic index, and the LD₅₀/ ED₅₀It can be expressed as a ratio. Components that exhibit a high therapeutic index are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for use in humans. Dosages containing such compositions will contain little or no toxicity, ED₅₀It is preferable that the concentration be in the blood concentration range containing Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.
[0203]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject include the severity of the disease, the patient's general health, the patient's age, weight and gender, the time and frequency of administration, drug combination, response sensitivity and response to treatment. Components with a longer duration of action may be administered once every 3 to 4 days, once a week, or once every two weeks depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0204]
Normal dosage amounts range from about 0.1 to 100,000 μg, depending on the route of administration, up to a total of about 1 g. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to physicians in the field. One skilled in the art will utilize formulations for nucleotides that are different from those for proteins or inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
(Diagnosis)
In another embodiment, GCRECs are specifically identified in an assay for the diagnosis of a disease characterized by the expression of GCREC or for monitoring patients being treated with GCREC or an agonist, antagonist or inhibitor of GCREC. An antibody that binds to is sometimes used. Antibodies useful for diagnostic purposes are prepared in the same manner as described above for treatment. GCREC diagnostic assays include methods that utilize antibodies and labels to detect GCREC in human body fluids or in cell and tissue extracts. The antibody can be modified or unmodified and can be labeled covalently or non-covalently with a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used, some of which are described above.
[0205]
Various protocols for measuring GCREC, such as ELISA, RIA, FACS, etc., are known in the art and provide criteria for diagnosing a corrected or abnormal level of GCREC expression. By combining a body fluid or cell extract from a normal mammalian subject, such as a human subject, with an antibody against GCREC under conditions suitable for complex formation, a normal or standard value for GCREC expression is determined. The amount of the standard complex formed can be determined by various methods, for example, by photometry. The amount of GCREC expressed in the subject, control, and lesion samples from biopsy tissue are compared to standard values. The deviation between the standard value and the subject is a parameter for diagnosing the disease.
[0206]
According to another embodiment of the present invention, polynucleotides encoding GCREC may be used for diagnostic purposes. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. Polynucleotides can be used to detect and quantify gene expression in a sample such that GCREC expression in the sample can be correlated with disease. Diagnostic assays can be used to measure the absence, presence and overexpression of GCREC, and to monitor the adjustment of GCREC levels during a therapeutic intervention.
[0207]
In certain embodiments, hybridization to a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence, including a genomic sequence, encoding a GCREC or closely related molecule can be used to identify a nucleic acid sequence encoding a GCREC. Whether a probe identifies only naturally occurring sequences, such as those encoding GCRECs, mutants or related sequences, is determined by the specificity of the probe and the stringency of hybridization or amplification. become. Here, the specificity of the probe means whether the probe consists of a high specific region (for example, a 5 'regulatory region) or a low specific region (for example, a conserved motif).
[0208]
Probes can also be used to detect related sequences, which may have at least 50% homology with any sequence encoding GCREC. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 2, or a genomic sequence containing the promoter, enhancer, and intron of the GCREC gene.
[0209]
Methods for producing specific hybridization probes for DNA encoding GCREC include cloning a polynucleotide sequence encoding GCREC or a GCREC derivative into a vector for producing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those of skill in the art and are commercially available, by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with a population of different reporters. Examples of reporter populations include:³²P or³⁵Radionuclides such as S; or enzyme labels such as alkaline phosphatase bound to the probe via an avidin / biotin binding system.
[0210]
The polynucleotide sequence encoding GCREC may be used for diagnosis of a disease associated with GCREC expression. Such disorders include, but are not limited to, proliferative disorders, neurological disorders, cardiovascular disorders, gastrointestinal disorders, autoimmune / inflammatory disorders, metabolic disorders, and viral infections. For actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary Thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestion Includes duct, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterine cancer, etc.Some nerve diseases include epilepsy , Ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple occurrences Sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural pyometra, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral Central nervous system diseases and prion diseases including Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann syndrome, Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, and fatal familial insomnia, nervous nutritional and metabolic diseases, neurofibromatosis, Tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastomatosis, cerebral trigeminal neurovascular Syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders, cerebral palsy, nervous skeletal disorders, autonomic nervous system disorders, peripheral neuropathy, dermatomyositis and polymyositis, and hereditary, metabolic, endocrine, and Toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, psychosis including disorders of mood and anxiety, schizophrenia, seasonal disorders (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, Diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal deficiency syndrome, dystonia, schizophrenic psychiatric disorder, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration and familial frontal It includes head amnesia, and cardiovascular diseases include arteriovenous fistula, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose vein, thrombophlebitis and Complications of venous thrombosis, vascular tumors, thrombolysis, balloon angioplasty, vascular replacement, and aortic coronary artery bypass graft surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina, myocardium Infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart Disease, infectious endocarditis, non-bacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus erythematosus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart Diseases, and complications of heart transplantation, include gastrointestinal disorders, dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, digestive disorders, Inflammation, stomach cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infections, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis , Pancreatic cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss Syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel syndrome, short small bowel syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hepatic steatosis , Hemoglobinosis, Wilson disease, α-1-antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal vein occlusion and thrombus, central lobule necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein Obstruction, child It includes preeclampsia, eclampsia, gestational acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular regeneration and adenomas and carcinomas. Some autoimmune / inflammatory diseases include inflammation and sunlight. Keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, Autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocyte toxin Transient lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable colon Syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, Systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasite Insect diseases, protozoan infections, helminth infections, and trauma; metabolic disorders include diabetes, obesity, and osteoporosis; and infectious diseases include adenovirus and arenavirus, bunya Virus, calicivirus, coronavirus, filovirus, hepadnavirus, herpes virus, flavivirus, orthomyxovirus, parvovirus, Includes infection by viral pathogens classified as papovavirus, paramyxovirus, picornavirus, poxvirus, reovirus, retrovirus, rhabdovirus, tongavirus. Polynucleotide sequences encoding GCREC can be obtained by Southern, Northern, dot blot or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin and multiformat ELISA-like assays, and mutant GCREC. And microarrays that utilize body fluids or tissues taken from patients to detect expression. Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0211]
In some forms, the nucleotide sequence encoding GCREC may be useful in assays that detect related disorders, particularly those mentioned above. The nucleotide sequence encoding GCREC may be labeled by standard techniques and added to a bodily fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for formation of a hybridization complex. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient sample is significantly altered relative to the control sample, the level of mutation of the nucleotide sequence encoding GCREC in the sample is indicative of the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate the effect of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or to monitor the treatment of individual patients.
[0212]
To provide a diagnostic criterion for diseases associated with GCREC expression, a normal or standard profile for expression is established. This can be achieved by combining a body fluid or cells extracted from a normal animal or human subject with a sequence encoding GCREC or a fragment thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments performed with known amounts of the substantially purified polynucleotide to values obtained from normal subjects. The standard values thus obtained can be compared to values obtained from samples obtained from patients showing signs of the disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of disease.
[0213]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to determine whether the patient's expression levels have begun to approach those observed in normal subjects. The results from serial assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0214]
With respect to cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts (under- or over-expression) in living tissue from an individual indicates the predisposition of the disease or a method of detecting the disease before actual clinical symptoms appear. Or offer. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0215]
The additional diagnostic use of oligonucleotides designed from sequences encoding GCRECs may involve the use of PCR. These oligomers can be chemically synthesized, produced enzymatically, orin in vitroCan be produced in The oligomer preferably comprises a fragment of a polynucleotide encoding GCREC, or a fragment of a polynucleotide complementary to the polynucleotide encoding GCREC, and is used under optimal conditions to identify a particular gene or condition. Oligomers can also be used under relatively mild stringent conditions for detection, quantification, or both, of closely related DNA or RNA sequences.
[0216]
In some embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding GCREC may be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause a congenital or acquired genetic disease in humans. Non-limiting methods for detecting SNPs include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, DNA is amplified using the polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers derived from the polynucleotide sequence encoding GCREC. DNA can be derived, for example, from diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in DNA cause differences in the secondary and tertiary structure of single-stranded PCR products. Differences can be detected using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This allows the detection of amplimers on high throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as arranged in a common consensus sequence. obtain. These computer-based methods filter out sequence variations due to sequencing errors using laboratory preparation and statistical models of DNA and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry, for example, using a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0217]
Methods that can be used to quantify GCREC expression also include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of regulatory nucleic acids, and interpolation of results from standard curves (see, eg, Melby, PC. (1993) J. Immunol. Methods 159: 235244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229236.) The oligomers of interest are present in various diluents and are spectrophotometrically or ratiometrically. The rate of quantification of multiple samples can be accelerated by performing assays in a high-throughput format, where quantitation is rapid due to color reactions.
[0218]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relevant expression levels of multiple genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. This information can be used to determine gene function, understand the genetic basis of disease, diagnose disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a patient's pharmacogenomic profile to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective and has few side effects for the patient can be selected.
[0219]
In another embodiment, an antibody specific for GCREC, GCREC, or a fragment thereof, can be used as an element on a microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0220]
Certain embodiments relate to the use of a polynucleotide of the invention to produce a transcribed image of a tissue or cell type. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns are analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under given conditions (Seilhamer et al., US Pat. No. 5,840,484, “Comparative Gene”). Transscript Analysis ", incorporated herein by reference to this patent). Thus, transcribed images can be generated by hybridizing the polynucleotide of the present invention or its complement to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In certain embodiments, hybridization occurs in a high-throughput format such that the polynucleotide of the invention or its complement comprises a plurality of subsets of the elements on the microarray. The resulting transcribed image can provide a profile of gene activity.
[0221]
Transcript images can be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies, or biological samples thereof. The transcribed image is therefore in the case of a tissue or biopsy samplein VivoOr in the case of cell linesin in vitroReflects gene expression at
[0222]
Transcribed images that generate the expression profile of the polynucleotides of the present invention can also be used in connection with toxicological testing of industrial or natural environmental compounds, as well as in preclinical evaluation of in vitro model systems and drugs. All compounds elicit a characteristic pattern of gene expression, often referred to as molecular fingerprints or toxic signatures, which implies a mechanism of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog). 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which are hereby incorporated by reference in their entirety. And) If the test compounds have the same signature as the signature of the compound with known toxicity, they may share toxic properties. A fingerprint or signature is most useful and accurate if it contains expression information from a large number of genes and gene families. Ideally, a genome-wide measurement of expression will provide the highest quality signature. Even if there are genes whose expression is not altered by any of the tested compounds, those genes are important because their expression levels can be used to normalize the rest of the expression data. The standardization procedure is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of a toxic signature helps to interpret the toxic mechanism, but knowledge of the gene function is not required to statistically match the signatures leading to toxicity prediction (eg, February 29, 2000). See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences, which is available at http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm. Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences during toxicological screening using toxic signatures.
[0223]
In certain embodiments, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound. Nucleic acids expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The level of transcription in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. The difference in transcription level between the two samples indicates a toxic reaction caused by the test compound in the treated sample.
[0224]
Another example involves analyzing a tissue or cell type proteome using the polypeptide sequences of the invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be individually further analyzed. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis, such as separating proteins from a sample by one-dimensional isoelectric focusing and separating according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis ( Steiner and Anderson, supra). Proteins are visualized in the gel as dispersed, uniquely located points, usually by staining the gel with a substance such as Coomassie blue or silver or a fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical densities of protein spots obtained from different samples, eg, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, are compared to identify changes in protein spot density associated with the treatment. The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 consecutive amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
[0225]
A proteomic profile of the protein can also be generated by quantifying GCREC expression levels using an antibody specific for GCREC. In one embodiment, protein expression levels are quantified by using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999) Anal. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed by various methods known in the art, for example, the proteins in the sample can be reacted with a thiol or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at the elements of each array.
[0226]
Toxic signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxic signatures at the transcript level. For some proteins in certain tissues, the correlation between transcription and protein abundance may be poor (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537), and the transcript image The proteome toxicity signature may be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect the proteome profile but alter the proteome profile. In addition, proteome profiling is more reliable and informative in such cases because the analysis of transcription in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA.
[0227]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the processed biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing the amino acid residues of the individual proteins and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0228]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins obtained from a biological sample are incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample.
[0229]
Microarrays are prepared, used, and analyzed using methods well known in the art (Brennan, TM et al. (1995) US Pat. No. 5,474,796; Schena, M.). Natl.Acad.Sci.USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No.WO95 / 35505. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155; Heller, MJ. Et al. (1997) U.S. Patent No. 5,605,662, etc.). . Various types of microarrays are known, and for details, seeDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, Editing. (1999) Oxford University Press, London. This reference is specifically incorporated by reference.
[0230]
In another embodiment of the present invention, nucleic acid sequences encoding GCREC can be used to generate effective hybridization probes when mapping native genomic sequences. Either coding or non-coding sequences can be used; in certain instances, non-coding sequences are preferred throughout the coding sequence. For example, conservation of a coding sequence within a member of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. The nucleic acid sequence can be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificially formed chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product, or a single chromosomal cDNA. Mapped to libraries (eg, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127134; and Truck, B. See, J. (1991) Trends Genet. Genetic linkage maps can be generated to correlate. (See, for example, Lander, ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357.)
fluorescencein situHybridization (FISH) can correlate with other physical and genetic map data (see Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, (1995) in Meyers, pages 965-968, etc.). Can be found in various scientific journals or on the website of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Correlation of the location of the gene encoding GCREC on a physical chromosomal map with a particular disease, or with a predisposition to a particular disease, can help determine regions of DNA associated with the disease. Therefore, the cloning operation for determining the position can be promoted.
[0231]
The genetic map can be extended using physical mapping techniques such as linkage analysis using established chromosomal markers and chromosome sample in situ hybridization. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, can reveal relevant markers even when the number or arm of a particular human chromosome is not known. This information is valuable to researchers searching for genetic diseases using positional cloning and other gene discovery techniques. Once the genes involved in the disease or syndrome are loosely located by genetic linkage to a particular gene region, such as the 11q22-23 region of ataxia telangiectasia, any sequence mapping to that region will be further investigated. (See Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580), healthy individuals, carriers, infections resulting from translocation, inversion, etc. The nucleotide sequences of the present invention may be used to discover differences in chromosomal location among the three.
[0232]
In another embodiment of the invention, GCRECs, GCREC catalytic fragments, immunogenic fragments, or oligopeptides thereof can be used to screen libraries of compounds using any of a variety of drug screening techniques. . The fragments used for drug screening will be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. The formation of a binding complex between GCREC and the agent to be tested can be measured.
[0233]
Another drug screening method is used to screen compounds having a suitable binding affinity for the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT application WO 84/03564). In the method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is reacted with GCREC or a fragment thereof and washed. The bound GCREC is then detected by methods well known in the art. Purified GCREC can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, the peptide can be captured using a non-neutralizing antibody and the peptide immobilized on a solid support.
[0234]
In another example, a competitive drug screening assay can be used. In this assay, neutralizing antibodies capable of binding GCREC specifically compete with a test compound for binding GCREC. In this method, the antibody detects the presence of a peptide that shares one or several antigenic determinants with GCREC.
[0235]
In another embodiment, future molecular biology techniques will rely on the properties of currently known nucleotide sequences, including but not limited to triplet genetic code, specific base pairing interactions, etc. If so, the new technology can be used for nucleotide sequences encoding GCREC.
[0236]
Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention in any way.
[0237]
It is incorporated herein by reference to all patent applications, patents, and publications mentioned above and below, particularly US patent application Ser. No. 60 / 238,394.
(Example)
1 cDNA Creating a library
Incyte cDNA is derived from the cDNA library described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA) and listed in column 5 of Table 4. Some tissues are homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while others are homogenized and dissolved in a mixture of phenol or a suitable denaturant. The mixture of the denaturing agent is, for example, TRIZOL (Life Technologies) which is a single-phase solution of phenol and guanidinium isothiocyanate. The resulting lysate was centrifuged in cesium chloride or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using isopropanol, sodium acetate and ethanol, or either, or another method.
[0238]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. In some cases, the RNA was treated with DNase. For most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Chatsworth CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit, such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0239]
In some cases, RNA was provided to Stratagene, and a corresponding cDNA library was sometimes produced by Stratagene. Otherwise, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) according to the recommended method or a similar method known in the art, and a cDNA library was prepared (Ausubel, supra). , 1997, 5.1-6.6 units, etc.). Reverse transcription was started with oligo d (T) or random primer. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme. For most libraries, cDNA size (300-1000 bp) selection was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech) or preparative agarose gel electrophoresis. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or enzyme. Suitable plasmids are, for example, PBLUESCRIPT plasmids (Stratagene), PSPORT1 plasmids (Life Technologies), PCDNA2.1 plasmids (Invitrogen, Carlsbad CA), PBK-CMV plasmids (Stratagene), PCR2-TOPOMIC plasmids, PCR2-TOPOMIC-InPIVag-InPovag (Stratagene), pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA), plNCY (Incyte Genomics) and the like and derivatives thereof. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli cells containing XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR from Stratagene, or DH5α, DH10B or ELECTROMAX DH10B from Life Technologies.
[0240]
2 cDNA Clone isolation
UNIZAP vector system (Stratagene) was used.in VivoBy excision or by cell lysisExample 1The plasmid obtained as described above was recovered from the host cells. Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAWELL 8PlaimPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid E. FIG. A. L. Plasmids were purified using at least one of the Prep 96 plasmid kits. After precipitation, the plasmid was resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0241]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using direct binding PCR in a high-throughput format (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling process of the host cells was performed in a single reaction mixture. Samples were processed, stored in 384-well plates, and the concentration of amplified plasmid DNA was determined fluorometrically using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a FLUOROSKANII fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Quantified.
[0242]
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in, was sequenced as shown below. The cDNA sequencing reaction can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or a PTC-200 thermal cycler (MJ Research) with a HYDRA microdispenser (Robbins ScientificLMIBlOMIBOMICRiMbO2MCR) Treated in conjunction with the system. The cDNA sequencing reaction was performed using a reagent provided by Amersham Pharmacia Biotech or an ABI sequencing kit, for example, an ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied reagent prepared from Applied reagent kit). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics) or the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using standard ABI protocols and base pairing software ( Applied Biosystems) or other sequence analysis systems well known in the art. The reading frame within the cDNA sequence was determined using standard methods (outlined in Ausubel, 1997, 7.7 Units, supra). Select some of the cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the method described in (1).
[0243]
The polynucleotide sequence derived from the Incyte cDNA sequence was validated by removing the vector, linker and poly (A) sequences and masking ambiguous base pairs. At that time, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming and adjacent dinucleotide frequency analysis were used. Then, using programs based on BLAST, FASTA and BLIMPS, to obtain annotations in the program, public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes databases; Incyte cDNA sequences or their translation were queried for selection of hidden Markov model (HMM) based protein family databases such as BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and PFAM (HMM analyzes the consensus primary structure of gene families A probabilistic approach, see Eddy, SR (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365, etc.) Queries are sent to BLAST, FASTA, BLIMPS and HMMER. It was carried out using a brute program. The Incyte cDNA sequence was constructed to yield a full-length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNA, GenBank EST, stitched sequence, stretched sequence or Genscan predicted coding sequence (Examples 4 and 5) Was used to extend the population of Incyte cDNA to full length. A population of cDNAs was screened for open reading frames using a program based on Phred, Prap and Consed, and a program based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full length polypeptide sequence. Alternatively, the polypeptides of the invention may start at any methionine residue of the full length translated polypeptide. Subsequently, full-length polypeptide sequences were queried by querying the GenBank protein database (genpept), databases such as SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, and the Hidden Markov Model (HMM) such as PFAM. analyzed. Full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Polynucleotide and polypeptide sequence alignments are made using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm, such as that incorporated into the MEGALIGN Multi-Sequence Alignment Program (DNASTAR), which also calculates the percent identity between aligned sequences.
[0244]
Table 5 outlines the tools, programs and algorithms used for the analysis and assembly of Incyte cDNA and full-length sequences, along with applicable descriptions, references and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 5 and a brief description of them in column 2. Column 3 is a preferred citation, all of which are incorporated by reference in their entirety. If applicable, column 4 shows the score, probability value and other parameters used to evaluate the strength of the match between the two sequences (the higher the score, the higher the homology between the two sequences) ).
[0245]
The programs described above for the construction and analysis of full length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NO: 2. Fragments of about 20 to about 4000 nucleotides that are useful for hybridization and amplification techniques are set forth in Table 4, column 4.
[0246]
4 Genome DNA Identification and editing of coding sequences from
Putative G protein-coupled receptors are first identified by running the Genscan gene identification program against public genomic sequence databases (eg, gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94, Burge, C. and S.). Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). The program ligates the predicted exons to form a constructed cDNA sequence that extends from methionine to the stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences analyzed at one time by Genscan was set at 30 kb. To determine which Genscan predicted cDNA sequence encodes a G protein-coupled receptor, the encoded polypeptide was analyzed by interrogating a PFAM modem for the G protein-coupled receptor. By annotating homologues of the Incyte cDNA sequence as G-protein coupled receptors, potential G-protein coupled receptors have also been identified. The Genscan predicted sequences thus selected were then compared by BLAST analysis to the public databases genpept and gbpri. If necessary, edit the Genscan predicted sequence by comparing to the top BLAST hits from genpept to correct errors in the sequence predicted by Genscan, such as extra or removed exons. BLAST analysis also provides evidence of transcription as it is used to find the public cDNA coverage of any Incyte cDNA or Genscan predicted sequence. If Incyte cDNA coverage was available, this information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence. The full-length polynucleotide sequence isExample 3Obtained by constructing the Genscan predicted coding sequence with the Incyte cDNA sequence and / or the public cDNA sequence using the construction process described in US Pat. Alternatively, the full length polynucleotide sequence is completely derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0247]
5 cDNA Construction of genome sequence data using sequence data
Stitch arrangement ( Stitched Sequence )
The partial cDNA sequence isExample 4Were extended using the exons predicted by the Genscan gene identification program described in (1).Example 3The partial cDNAs constructed as described in were mapped to genomic DNA and decomposed into clusters containing the related cDNA and Genscan exons predicted from one or more genomic sequences. Analyze each cluster using algorithms based on graph theory and dynamic programming to integrate cDNA and genomic information, and then generate, identify, edit, or extend potential splicing variants that yield full-length sequences Was. Sequences were identified in which the length of the entire interval was present in more than one sequence in the cluster, and the intervals so identified were considered equal over time. For example, if there is an interval between one cDNA and two genomic sequences, all three intervals are considered equal. This process can link unrelated but contiguous genomic sequences together by cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequences. The linkage of intervals generated along one parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) took precedence over the linkage that changed parent type (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated into public databases genpept and gbpri by BLAST analysis and compared. Incorrect exons predicted by Genscan were corrected by comparing to the top BLAST hit from genpept. If necessary, the sequence was further extended using additional cDNA sequences or by inspection of genomic DNA.
Stretch array ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, the BLAST program was used to access public databases such as GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes databases.Example 3Were queried for the partial cDNAs constructed as described in. Next, the closest GenBank protein homolog was analyzed by BLAST analysis for the Incyte cDNA sequence orExample 4As described in any of the GenScan exon predicted sequences described above. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to generate a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto a GenBank protein homolog. Insertions or deletions can occur within the chimeric protein relative to the original GenBank protein homolog. GenBank protein homologs, chimeric proteins or both were used as probes to search homologous genomic sequences from public human genome databases. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of a homologous genomic sequence. The resulting stretch sequences were examined to determine if they contained the complete gene.
[0248]
6 GCREC Chromosome Mapping of Polynucleotide Encoding
The sequence used to construct SEQ ID NO: 2 was compared to the sequences in the Incyte LIFESEQ database and the public domain database using the BLAST and Smith-Waterman algorithms. Sequences from these databases that match SEQ ID NO: 2 were assembled into contiguous and overlapping sequence clusters using construction algorithms such as Phrap (Table 5). Whether clustered sequences were previously mapped using radiation hybrid and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Institute (WIGR), and Genethon It was determined. As a result of the inclusion of the mapped sequence in a cluster, the entire sequence of that cluster, including the individual sequence numbers, was assigned to locations on the map.
[0249]
Locations on the map are represented as ranges or intervals of human chromosomes. The location on the map of centiMorgan spacing is measured relative to the end of the p-arm of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit of measure based on the frequency of recombination between chromosomal markers. On average, 1 cM is approximately equal to one megabase (Mb) of DNA in humans. The cM distance is a genetic marker mapped by Genethon such that the sequence provides a boundary for radiation hybrid markers such that the sequence is contained within each cluster. based on. Using the human genetic map and other sources available to the general public, such as the NCBI "GeneMap99" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/), the above-mentioned sections have already been identified. It can be determined whether it is located in or near a disease gene map.
[0250]
7. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information and involves the hybridization of a labeled nucleotide sequence to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. ing. (See Sambrook, supra, Chapter 7, and Ausubel. FM et al., Chapters 4 and 16, etc.).
[0251]
The same or related molecules were searched in a cDNA database such as GenBank or LifeSeq (Incyte Genomics) using a similar computer technique applying BLAST. Northern analysis is much faster than multiple membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether to classify a particular identity as exact or homologous. The search criterion is the product score, which is defined by the following equation.
(Equation 1)

The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length at which the sequences match. The product score is a standardized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent sequence identity of the nucleotides and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. The BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each base matching the high scoring segment pair (HSP) and -4 to each mismatched base pair. The two sequences may share more than one HSP (can be separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the entire shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when one end matches 100% and overlaps 70%, or the other end matches 88% and overlaps 100%. The product score 50 is obtained when either one end matches 100% and overlaps 50%, or the other end matches 79% and overlaps 100%.
[0252]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding GCREC was analyzed in relation to the tissue source from which the polynucleotide sequence was derived. For example, one full-length sequence is the Incyte cDNA sequence (Example 3) Are constructed so as to at least partially overlap with the above. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue has the following organism / tissue categories: cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryonic structure, endocrine system, exocrine glands, female genitalia, male genitalia, germ cells, blood and immune system, liver, musculoskeletal System, nervous system, pancreas, respiratory system, sensory organ, skin, stomatognathic system, non-classified / mixed or urinary tract. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / condition categories: cancer, cell lines, development, inflammation, neurology, trauma, cardiovascular, congestion, and others. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The ratio of the operation results reflects tissue-specific and disease-specific expression of the cDNA encoding GCREC. cDNA sequences and cDNA library / tissue information can be found in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0253]
8 GCREC Of polynucleotides encoding
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragment using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragment of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 'extension of the known fragment, and the other primer was synthesized to initiate 3' extension of the known fragment. The starting primer is about 22-30 nucleotides in length, has a GC content of about 50% or more, and anneals to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C., using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or another primer. Was designed from the cDNA using the appropriate program from All hairpin structures and nucleotide extensions resulting in primer-primer dimers were avoided.
[0254]
To extend the sequence, a selected human cDNA library was used. If more than one step extension was needed or desired, additional primers or nested sets of primers were designed.
[0255]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture was composed of template DNA and 200 nmol of each primer, Mg^{2 +}And (NH₄)₂SO₄And a buffer containing β-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters. Step 1: 3 minutes at 94 ° C. Step 2: 15 seconds at 94 ° C. Step 3: 1 minute at 60 ° C. Step 4: 2 minutes at 68 ° C. Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6: 68 ° C. Step 7: Store at 4 ° C. For primer pair T7, SK +, the following parameters were used instead of the above parameters. Step 1: 3 minutes at 94 ° C. Step 2: 15 seconds at 94 ° C. Step 3: 1 minute at 57 ° C. Step 4: 2 minutes at 68 ° C. Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6: 68 ° C. Step 7: Store at 4 ° C for 5 minutes
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25 (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence. The DNA is distributed to each well of a counting plate (Corning Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent, and the measurement is performed. The plate was scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure the fluorescence of the sample and quantify the DNA concentration. Aliquots of 5-10 μl of the reaction mixture were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reactions were successful in extending the sequence.
[0256]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested using CviJI cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and ligated into a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). Sonicated or sheared before. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, the fragments were excised, and the agar was digested with Agar ACE (Promega). The extended clone was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA), treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) and filled in with a restriction site over E. coli. Cells were transfected. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing an antibiotic, and each colony was cut out and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture at 37 ° C. overnight.
[0257]
The cells were lysed, and the DNA was PCR-amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 60 ° C. for 1 minute Step 4 72 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 29 times Step 6 72 ° C. for 5 minutes Step 7 Store at 4 ° C. DNA was quantified with the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples were diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), DYENAMIC energy transfer sequencing primers, and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing kit (Timer cycle kit) reaction kit) (Applied Biosystems).
Similarly, the above procedure is used to verify full-length nucleotide sequences, or to obtain 5 'regulatory sequences using oligonucleotides designed for such extension and appropriate genomic libraries.
[0258]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
Screen cDNA, mRNA, or genomic DNA using a hybridization probe from SEQ ID NO: 2. Although the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs is specifically described, the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences) and 50 pmol of each oligomer and [γ-³²P] Adenosine triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech) 250 μCi is mixed with T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is sufficiently purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of the endonucleases of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xbal or Pvu II (DuPont NEN), 10 per minute⁷An aliquot containing a count of labeled probes is used.
[0259]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blot is washed sequentially at room temperature, for example, under conditions consistent with 0.1 × sodium citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared using autoradiography or an alternative imaging means.
[0260]
10 microarray
Combining or synthesizing array elements on the surface of a microarray can be achieved using photolithography, piezoelectric printing (see inkjet printing, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques, and derivatives thereof. It is. In each of the above techniques, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, an array similar to dot blot or slot blot may be used to place and attach elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical binding procedures. Regular arrays can be made manually or using available methods and machines and can have any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470, Shalon. D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0261]
Full-length cDNA, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art, such as Laser GENE software (DNASTAR). Array elements are hybridized with polynucleotides in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization is detected at each array element using a fluorescence scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
[0262]
Prepare tissue or cell samples
Total RNA was isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) was isolated using the oligo (dT) cellulose method.⁺Purify the RNA. Each poly (A)⁺RNA samples were prepared using MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand synthesis buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP , 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). The reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGHT kit (Incyte) using poly (A).⁺Performed in 25 volume ml containing RNA. Specific control poly (A)⁺RNA is derived from non-coding yeast genomic DNAin in vitroSynthesized by transcription. After incubation for 2 hours at 37 ° C., each reaction sample (one labeled Cy3 and the other labeled Cy5) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 85 ° C. for 20 minutes. The reaction is stopped to degrade the RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After mixing, the two reaction samples are ethanol precipitated using 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then dried and finished using SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl of 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0263]
Preparation of microarray
Array elements are made using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from vector-containing bacterial cells by a cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence flanking the cDNA insert. The array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg by 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0264]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope slides (Corning) are sonicated in 0.1% SDS and acetone during and after treatment and washed very well with distilled water. Slides are etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed very well in distilled water and 0.05% aminopropylsilane (95% ethanol). Sigma). The coated slide glass is cured by heating at 110 ° C.
[0265]
Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The patent is hereby incorporated by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed mechanical device. The device now adds approximately 5 nl of array element sample per slide.
[0266]
The microarray is UV cross-linked using a STRATALLINKER UV cross-linking agent (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. After incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) for 30 minutes at 60 ° C., 0.2% SDS and Non-specific binding sites are blocked by washing with distilled water.
[0267]
Hybridization
The hybridization reaction has 9 μl of the sample mixture containing 0.2 μg each of Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis products in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted 1.8 cm on the microarray surface.² Cover with cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber having a cavity slightly larger than the microscope slide. The interior of the chamber is kept at 100% humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. The arrays were washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) at 45 ° C. for 10 minutes and in the second wash buffer (0.1 × SSC) at 45 ° C. for 10 minutes each. Wash and dry.
[0268]
detection
The reporter-labeled hybridization complex was equipped with an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of generating spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation. Detect with a microscope. The excitation laser light is focused on the array using a 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of a microscope and raster scanned through an objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example was scanned at a resolution of 20 μm.
[0269]
At two different scans, the mixed gas multiline laser excites the two fluorescent dyes sequentially. The emitted light is separated based on the wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorescent dyes. The signal is filtered using a suitable filter placed between the array and the photomultiplier. The maximum emission wavelength of the fluorescent dye used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorochromes simultaneously, but scans once for each fluorochrome using a suitable filter in the laser source, and typically scans each array twice.
[0270]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by the cDNA control species added to the sample mixture at a known concentration. A specific location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location is correlated with the hybridizing species in a 1: 100,000 weight ratio. When two samples from different sources (eg, cells to be tested and control cells) are each labeled with a different fluorescent dye and hybridized to a single array to identify differentially expressed genes Performs calibration by labeling the cDNA sample to be calibrated with two fluorescent dyes and adding equal amounts to each of the hybridization mixtures.
[0271]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) converter board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensities have been mapped using a linear 20-color conversion from a blue (low signal) to a pseudo-color range from red (high signal). The data is also analyzed quantitatively. If two different fluorochromes are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the fluorochromes (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each fluorophore.
[0272]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescent signal in each element is integrated, and a value corresponding to the average intensity of the signal is obtained. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0273]
11 Complementary polynucleotide
Sequences complementary to the GCREC-encoding sequence, or any portion thereof, are used to detect, reduce, or inhibit expression of native GCREC. Although the use of oligonucleotides containing about 15-30 base pairs is described, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. The appropriate oligonucleotides are designed using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) and the sequence encoding GCREC. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to inhibit the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, a complementary oligonucleotide is designed so that the ribosome does not bind to the transcript encoding GCREC.
[0274]
12 GCREC Expression of
Expression and purification of GCREC can be performed using a bacterial or virus-based expression system. To express GCREC in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an antibiotic resistance gene and an inducible promoter that increases the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express GCREC when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of GCREC in eukaryotic cells is based on a recombinant known as baculovirus.Autographica californicaThis is performed by infecting an insect cell line or a mammalian cell line with nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with a cDNA encoding GCREC either by homologous recombination or by bacterial-mediated gene transfer involving transfer plasmid mediation. The infectivity of the virus is maintained and a strong polyhedron promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic alteration of the baculovirus is required (Engelhard. EK, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
[0275]
Most expression systems use, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag, such as FLAG or 6-His, to synthesize GCREC as a fusion protein. By using these, affinity-based purification of the recombinant fusion protein from crude cell lysate can be performed quickly in one step. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum, which allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, portions of GST can be proteolytically cleaved from GCREC at specific development sites. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which six histidine residues are continuously extended enables purification on a metal chelating resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) supra, Chapters 10 and 16. The GCREC purified by these methods can be used directly to perform the assays of Examples 16, 17 and 18 where applicable.
[0276]
13 Functional Assay
GCREC function is assessed by expression of sequences encoding GCREC at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Vectors of choice include the pCMV SPORT plasmid (Life Technologies) and the pCR 3.1 plasmid (Invitrogen), both with the cytomegalovirus promoter. Using a liposome formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein provides a means of distinguishing transfected from non-transfected cells. In addition, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. The labeling protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or a CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells expressing GFP or CD64-GFP and evaluate their apoptotic status and other cellular properties using an automated, laser optics-based technique, flow cytometry (FCM) I do. FCM detects and quantifies the uptake of fluorescent molecules that diagnose a phenomenon that precedes or coincides with cell death. Such phenomena include changes in nuclear DNA content measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and granularity measured by forward scattered light and 90 ° side scattered light, Downregulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, changes in cell surface and intracellular protein expression as measured by reactivity with specific antibodies, and cells with fluorescent complex annexin V protein There is a change in plasma membrane composition as measured by binding to the surface. For flow cytometry, see Ormerod, M .; G. FIG. (1994)Flow Cytometry Oxford, New York, NY. There is a description.
[0277]
The effect of GCREC on gene expression can be assessed using a GCREC-encoding sequence and a highly purified cell population transfected with either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed cells and non-transformed cells can be effectively separated using magnetic beads covered with an antibody against human IgG or CD64 (DYNAL, Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods known in the art. Expression of mRNA encoding GCREC and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0278]
14 GCREC Production of specific antibodies
A standard protocol is used using GCREC substantially purified using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495) or other purification techniques. Immunize rabbits to produce antibodies.
[0279]
Alternatively, the GCREC amino acid sequence is analyzed using laser GENE software (DNASTAR) to determine a region having high immunogenicity. Then, the corresponding oligopeptide is synthesized, and the oligopeptide is used to generate an antibody by a method well known to those skilled in the art. The selection of suitable epitopes, for example those in the hydrophilic region near or adjacent to the C-terminus, is known in the art (see Ausubel, 1995, supra, Chapter 11, etc.).
[0280]
Usually, oligopeptides of about 15 residues in length are synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer using Fmoc chemistry (Applied Biosystems) and reacted with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). It binds to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in complete Freund's adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-GCREC activity of the obtained antiserum, the peptide or GCREC is bound to the substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further treated with radioactive iodine. With goat anti-rabbit IgG labeled with.
[0281]
15 Natural antibodies using specific antibodies GCREC Purification
The native or recombinant GCREC is substantially purified by immunoaffinity chromatography using a GCREC-specific antibody. An immunoaffinity column is constructed by covalently linking an anti-GCREC antibody to an activation chromatography resin, for example, CNBr-activated Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions.
[0282]
The culture solution containing GCREC is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that preferentially adsorb GCREC (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). The column is eluted with a condition that disrupts the binding between the antibody and GCREC (for example, a buffer solution having a pH of 2 to 3 or a high-concentration chaotrope such as urea or thiocyanate ions), and GCREC is collected.
[0283]
16 GCREC Of molecules that interact with
Molecules that interact with GCREC may include agonists and antagonists in addition to molecules involved in signal transduction, such as G proteins. GCREC or fragment¹²⁵Label with I Bolton Hunter reagent. (See, eg, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539.) Fragments of GCREC include, for example, one or more of three extracellular loops, There is an extracellular N-terminal region or a third intracellular loop. Candidate molecules that have been pre-arranged in the wells of the multiwell plate are incubated with the labeled GCREC, washed, and all wells with the labeled GCREC complex are assayed. The data obtained by changing the GCREC concentration is used to calculate the number, affinity and association values of GCREC with the candidate molecule.
[0284]
Alternatively, molecules that interact with GCREC are described in Fields, S .; And O. Analysis using a yeast two-hybrid system as described in Song (1989) Nature 340: 245-246, or using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the MATCHMAKER system (Clontech).
[0285]
GCREC is also used in a PATHHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a yeast two-hybrid system in a high-throughput manner to determine all interactions between genes encoded in two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0286]
Potential GCREC agonists or antagonists can be tested for activation or inhibition of GCREC receptor activity using the assays described in Examples 17 and 18. Candidate molecules can be selected from known GPCR agonists or antagonists, peptide libraries or combinatorial chemical libraries.
[0287]
A method for detecting the interaction between GCREC and an intracellular signaling molecule such as a G protein is described as follows. (Kobilka, BK et al. (1988) Science 240), which is used to identify downstream signaling pathways that have been exchanged for the receptor's analogous domain and activated to the G protein and orphan receptor domains. 1310-1316). In an analogous manner, the domain of the orphan receptor can be cloned as part of a fusion protein and used in binding assays to demonstrate interaction with a particular G protein. Studies have shown that the third intracellular loop of the G protein-coupled seven transmembrane receptor is important for G protein interaction and signal transduction (Conklin, BR et al. (1993) Cell. 73: 631-641). For example, a DNA fragment corresponding to the third intracellular loop of GCREC can be amplified by polymerase chain reaction (PCR) and subcloned into a fusion vector such as pGEX (Pharmacia Biotech). The construct is transformed into a suitable derived bacterial host and the fusion protein is purified from the cell lysate by glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech) affinity chromatography.
[0288]
in in vitroFor the binding assay, the cell extract containing the G protein was 50 mM Tris, pH 7.8, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl 2₂, 20 mM CHAPS, 20% glycerol, 10 μg each of aprotinin and leupeptin, and by extracting with 20 μl of 50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysate is incubated for 45 minutes on ice with constant stirring and the supernatant is collected by centrifugation at 23,000 g at 4 ° C. for 15 minutes. 750 μg of the cell extract is incubated with glutathione S-transferase (GST) fusion protein beads at 4 ° C. for 2 hours. GST beads are washed 5 times with phosphate buffered saline. The binding G subunit used pertussis toxin or cholera toxin [³²P] Detected by ADP ribosylation. SDS sample buffer (4.6% (w / v) SDS, 10% (vlv) β-mercaptoethanol, 20% (w / v) glycerol, 95.2 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.01% ( w / v) The reaction is stopped by adding bromophenol blue). [³²[P] ADP-labeled proteins are separated on a 10% SDS-PAGE gel and autoradiographed. The proteins separated in the gel were transferred to nitrocellulose paper and blotted (5% non-fat dry milk, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM CaCl 2).₂, 80 mM NaCl, 0.02% NaN₃ And 0.2% Nonidet P-40) for 1 hour at room temperature._αIncubate with subtype selective antibody (1: 500; Calbiochem-Novabiocliem) for 1.5 hours. After three washes, blots are incubated with horseradish peroxidase (HRP) -conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin (1: 2000, Cappel, Westchester PA) and visualized with a chemiluminescence-based ECL method (Amersham Corp).
[0289]
17 GCREC Demonstration of activity
Assays for GCREC activity measure the expression of GCREC on the cell surface. The cDNA encoding GCREC is transfected into a suitable mammalian cell line. Cell surface proteins are labeled with biotin as described (de la Fuente, MA et al. (1997) Blood 90: 2398-2405). Immunoprecipitation is performed using GCREC-specific antibodies, and the immunoprecipitated samples are analyzed using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblot techniques. The ratio of labeled to unlabeled immunoprecipitation is proportional to the amount of GCREC expressed on the cell surface.
[0290]
Alternatively, assays for GCREC activity are based on archetypal assays for ligand / receptor mediated modulation of cell proliferation. This assay measures the rate of DNA synthesis in Swiss mouse 3T3 cells. Plasmids containing polynucleotides encoding GCREC are added to quiescent 3T3 cultured cells using transfection methods known in the art. The transiently transfected cells are then radioactive DNA precursor molecules [³[H] Incubate in the presence of thymidine. Next, varying amounts of GCREC ligand are added to the cultured cells. [³H] Thymidine incorporation into acid-precipitable DNA is measured at appropriate time intervals using a radioisotope counter. The amount of incorporation is directly proportional to the amount of newly synthesized DNA. A dose-response linear curve for a GCREC ligand density range of at least 100-fold indicates receptor activity. One unit of activity per milliliter is defined as the density of GCREC that yields a 50% response level, and 100% [³H] thymidine is incorporated into the acid-precipitable DNA to the maximum extent (McKay, I. and I. Leigh, eds. (1993)Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, p. 73).
[0291]
Alternatively, assays for GCREC activity may be based on GPCR family proteins modulating G protein-activated second messenger signaling pathways (eg, cAMP; Gauclin, P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 4990-4996). Based on the ability to A plasmid encoding full length GCREC is transformed into a mammalian cell line using methods well known in the art (eg, a Chinese hamster ovary cell line (CHO) or a human embryonic kidney cell line (HEK-293)). The transformed cells are grown in culture in a 12-well tray for 48 hours, then the culture is discarded and the attached cells are washed briefly with PBS. The cells are incubated for 30 minutes with or without ligand in the medium, then the medium is removed and the cells are lysed by treatment with 1 M perchloric acid. CAMP levels in the lysate are measured by radioimmunoassay using methods known in the art. The change in cAMP levels in lysates from cells exposed to ligand compared to that without ligand is proportional to the amount of GCREC present in the transfected cells.
[0292]
To measure changes in inositol phosphate levels, 1 × 10⁵ The cells are grown in 24-well plates containing cells / well, medium without inositol and [³H] Incubate with myo-inositol at 2 μCi / well for 48 hours. The medium is removed and the cells are washed with a buffer containing 10 mM LiCl, after which the ligand is added. The reaction is stopped by the addition of perchloric acid. Inositol phosphate is extracted and separated by Dowex AG1-X8 (Bio-Rad) anion exchange resin and all labeled inositol phosphate counted by liquid scintillation. The change when comparing the level of labeled inositol phosphate from cells exposed to the ligand to that without the ligand is proportional to the amount of GCREC present in the transfected cells.
[0293]
18 GCREC Ligand identification
GCREC is expressed in eukaryotic cell lines such as CHO (Chinese Hamster Ovary) or HEK (Human Fetal Kidney) 293. These cell lines have a good GPCR expression process and contain a wide range of G proteins so that the expressed GCREC can be operably linked to downstream effectors. The transformed cells are assayed for activation of the expressed receptor in the presence of the candidate ligand. Activity is cAMP or Ca²⁺ It is measured by changes in the second intracellular messenger. A reporter gene using standard methods known in the art or in which a photoprotein (eg, firefly luciferase or green fluorescent protein) is under the transcriptional control of a promoter in response to stimulation of protein kinase C by an activating receptor It is measured directly using an assay (Milligan, C. et al. (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17: 235-237). Assay techniques are available for both of these second messenger systems, such as multi-well plate formats such as adenylyl cyclase-activated FlashPlate Assay (NEN Life Sciences Products) or fluorescent Ca such as Fluo-4 AM (Molecular Probes).²⁺ The indicator allows for high-throughput readout in conjunction with the FLIPR fluorimetric plate readout system (Molecular Devices). If the physiologically relevant second messenger pathway is not known, GCREC can detect phospholipase C and Ca²⁺ G protein G as demonstrated to bind to a wide range of G proteins to pass GCREC signaling through pathways involved in mobilization_{α 15/16}(Offernnanns, S. and MI Simon (1995) J. Biol. Chem. 270: 15175-15180). Alternatively, GCREC may be expressed in engineered yeast systems that are deficient in endogenous GPCRs, thereby providing a background-free advantage to OCREC activation screening. These yeast systems contain human GPCRs and G_αThe protein replaces the corresponding component of the endogenous yeast pheromone receptor pathway. The downstream signaling pathway is also altered to convert the normal yeast response to the signal to positive growth in selective media or reporter gene expression (Broach, JR and J. Thorner (1996) Nature 384 (supp. ): 14-16). Receptors are screened for putative ligands, including known GPCR ligands and other naturally occurring bioactive molecules. Biological extracts extracted from tissues, biological fluids and cell supernatants are also screened.
[0294]
Those skilled in the art may make various modifications to the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[0295]
(Brief description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0296]
Table 2 shows the GenBank identification numbers and annotations of the closest GenBank homolog to the polypeptide of the invention. The probability score that each polypeptide matches its GenBank homolog is also shown.
[0297]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the present invention, including predicted motifs and domains, along with methods, algorithms and searchable databases for use in analyzing polypeptides.
[0298]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to construct the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequence.
[0299]
Table 5 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references, and threshold parameters.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

Claims (63)

An isolated polypeptide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1); (b) a polypeptide having a naturally occurring amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 ( c) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (d) an immunogenic fragment of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 2. The isolated polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. 5. The isolated polynucleotide of claim 4, comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6. A genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide according to claim 6. A method for producing the polypeptide of claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Steps and
(B) recovering the polypeptide thus expressed. The method of claim 9, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a polynucleotide having a naturally occurring polynucleotide sequence that is at least 90% identical to the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (c) A polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a); a polynucleotide (e) complementary to the polynucleotide of (b); an RNA equivalent of (a) to (d); An isolated polynucleotide comprising at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12. A method for detecting a target polynucleotide having the polynucleotide sequence according to claim 12 in a sample,
(A) using a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, to form a hybridization complex between the probe and the target polynucleotide, or a fragment thereof; Hybridizing the sample under conditions in which is formed,
(B) a method for detecting the presence / absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. The method of claim 14, wherein the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides. A method for detecting a target polynucleotide having the polynucleotide sequence according to claim 12 in a sample,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) a method comprising detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof, if present. A component comprising an effective amount of the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 18. The component of claim 17, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 18. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional GCREC, comprising administering the component of claim 17 to a patient in need of such treatment. Method. A method for screening a compound for confirming the efficacy of the polypeptide according to claim 1 as an agonist,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting agonist activity in the sample. A component comprising an agonist compound identified by the method of claim 20 and a pharmaceutically acceptable excipient. 22. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional GCREC, comprising administering the component of claim 21 to a patient in need of such treatment. Method. A method for screening a compound for confirming its efficacy as an antagonist of the polypeptide according to claim 1, comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample. A component comprising an antagonist compound identified by the method of claim 23 and a pharmaceutically acceptable excipient. 25. A method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional GCREC, comprising administering the component of claim 24 to a patient in need of such treatment. . A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide according to claim 1,
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under appropriate conditions;
(B) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under conditions that permit the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound. A method according to claim 1, wherein the change in the activity of the polypeptide according to claim 1 in the presence of is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1. A method for screening a compound effective for altering the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of claim 5, comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting the mutant expression of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of said target polynucleotide in the presence of said compound in a variable amount and in the absence of said compound. A method for calculating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) hybridizing the nucleic acid of the treated biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12, wherein the hybridization comprises the hybridization of the probe and the biological sample. The reaction is carried out under conditions in which a specific hybridization complex is formed with the target polynucleotide, wherein the target polynucleotide is a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 12 or a fragment thereof, Said steps;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of the hybridization complex in the treated biological sample with the amount of the hybridization complex in an untreated biological sample. A method wherein the difference in the amount of said hybridization complex in a treated biological sample is indicative of the toxicity of said test compound. A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of GCREC in a biological sample, comprising:
(A) mixing the antibody with the polypeptide and binding the biological sample to the antibody of claim 11 under conditions suitable for forming a complex between the antibody and the polypeptide. When,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. The antibody,
The antibody according to claim 11, which is any one of (a) a chimeric antibody (b) a single-chain antibody (c) a Fab fragment (d) an F (ab ') ₂ fragment (e) a humanized antibody. A compound comprising the antibody of claim 11 and an acceptable excipient. 33. A method for diagnosing a condition or disease associated with the expression of GCREC in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of the compound of claim 32. 33. The compound of claim 32, wherein said antibody is labeled. 35. A method for diagnosing a condition or disease associated with the expression of GCREC in a subject, comprising administering to said subject an effective amount of the compound of claim 34. A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an immunogenic fragment thereof under conditions for inducing an antibody response;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody for a polypeptide, thereby identifying a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. how to. A polyclonal antibody produced by the method of claim 36. A composition comprising the polyclonal antibody of claim 37 and a suitable carrier. A method for producing a monoclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an immunogenic fragment thereof under conditions for inducing an antibody response;
(B) isolating antibody-producing cells from the animal;
(C) fusing the antibody-producing cells using immortalized cells to form monoclonal antibody-producing hybridoma cells;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the cultured monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A monoclonal antibody produced by the method of claim 39. A composition comprising the monoclonal antibody of claim 40 and a suitable carrier. The antibody according to claim 11, wherein the antibody is produced by screening a Fab expression library. The antibody according to claim 11, wherein the antibody is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. A method for detecting a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising:
(A) incubating the antibody according to claim 11 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) detecting specific binding, said specific binding indicating that a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is present in the sample. A method for purifying a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising:
(A) incubating the antibody according to claim 11 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A macroarray, wherein at least one of the microarrays is the polynucleotide according to claim 13. A method for producing a transfer image of a sample containing a polynucleotide, comprising:
a) labeling the polynucleotide of the sample;
b) contacting the elements of the microarray according to claim 46 with labeled polynucleotides of a sample under conditions suitable for hybridization complex formation;
c) quantifying the expression of the polynucleotide in the sample. An array comprising various nucleotide molecules attached to unique physical locations on a solid substrate, wherein at least one of said nucleotide molecules is specifically hybridizable to at least 30 contiguous nucleotides of a target polynucleotide. An array comprising an oligonucleotide or a polynucleotide, wherein the target polynucleotide is the polynucleotide of claim 12. 49. The array of claim 48, wherein said first oligonucleotide or polynucleotide sequence is completely complementary to at least 30 contiguous nucleotides of said target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein said first oligonucleotide or polynucleotide sequence is completely complementary to at least 60 contiguous nucleotides of said target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein said initial oligonucleotide or polynucleotide sequence is completely complementary to said target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the array is a microarray. 49. The array of claim 48, wherein said array comprises said target polynucleotide hybridized to a nucleotide molecule having the initial sequence of said oligonucleotide or polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein a linker connects at least one of said nucleotide molecules to said solid substrate. 49. The array of claim 48, wherein each unique physical location on the substrate comprises a plurality of nucleotide molecules, wherein the plurality of nucleotide molecules at any single unique physical location has the same sequence. An array, wherein each unique physical location on the substrate comprises a nucleotide molecule having a sequence that is different from a sequence of nucleotide molecules at another unique physical location on the substrate. A method of identifying compounds that modulate, mimic or block taste or smell,
a) contacting a compound with an olfactory and / or taste receptor polypeptide selected from the group consisting of:
i) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: ii) a biologically active fragment of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: iii) at least 90% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 An olfactory and / or taste receptor having a sex amino acid sequence.
b) identifying whether the compound specifically binds and / or affects the activity of said receptor polypeptide. 57. The method of claim 56, wherein said receptor polypeptide is expressed on the surface of a mammalian cell. 58. The method of claim 57, wherein the mammalian cell expresses a G protein. 59. The method of claim 58, wherein the mammalian cell expresses a plurality of G protein-coupled receptors. 60. The method of claim 59, wherein the mammalian cell expresses another taste or olfactory receptor polypeptide. 57. The method of claim 56, wherein said receptor polypeptide is fused to another polypeptide. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 13. The polynucleotide of claim 12, comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.