JP2004530409A - Transmembrane protein - Google Patents

Abstract

The present invention provides human transmembrane proteins (TMPs) and polynucleotides that identify and encode TMPs. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating, or preventing a disorder associated with abnormal expression of TMP.

Description

保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【００８５】
用語「欠失」は、結果的に１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【００８６】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。或るポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持している或るポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによる。
【００８７】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００８８】
「示差発現」は、少なくとも２つの異なったサンプルを比較して判定する、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００８９】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードされるタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって新しいタンパク質群を構築することが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９０】
用語「断片」は、ＴＭＰまたはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と配列が同一であるが親配列より長さが短い部分を指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、或る定義された配列内に見られるようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持つ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片の正確な長さは、また、その断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【００９２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に判定し得る。
【００９３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームと翻訳終止コドンとを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９４】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【００９５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「％一致」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するように、標準化された再現性のある方法で比較対象の配列内にギャップを挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムなどに組込まれているＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定される。「ｗｅｉｇｈｔｅｄ」残基重み付け表がデフォルトで選択される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてなされる。
【００９７】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩおよびインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも利用可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用できる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ および ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用い得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ（ｇａｐ）その他のパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００９８】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００９９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせ、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１００】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１０１】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータを用いて決定できる（参照先と共に上述）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１０２】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）のｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１０３】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さの同一性も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０４】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は直鎖状の微小染色体であり、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１０５】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１０６】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニーリング条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシーを、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容されるアニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子ＤＮＡの存在下である。
【０１０７】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度およびｐＨの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式および核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×ＳＳＣおよび約０．１％のＳＤＳの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行い得る。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、せん断した変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡとのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く標示する。
【０１０９】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列間の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはそれらの核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１０】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０１１１】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１１２】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、ＴＭＰのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」にはまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＴＭＰの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【０１１３】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１４】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１５】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、ＴＭＰの活性の変化を指す。例えば、モジュレートによって、ＴＭＰのタンパク質活性の、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【０１１６】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１１７】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列と機能的に連結している。機能的に連結したＤＮＡ配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１１８】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞内でのＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１１９】
ＴＭＰの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解性切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＴＭＰの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１２０】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列や、関連する核酸配列の検出に用いる、ＴＭＰやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１２１】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１２２】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． 他（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡなどを参照されたい。ＰＣＲプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用い得る。
【０１２３】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、また、オリゴヌクレオチドおよび最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計することにより、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチド断片およびポリヌクレオチド断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２４】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸を、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１２５】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であることができ、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２６】
「調節エレメント」は、遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２７】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１２８】
或るＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」は、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１２９】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＴＭＰ、ＴＭＰをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定される或るサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離された染色体や細胞内小器官や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１３０】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを含むポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１３１】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から採取され、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１３２】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３３】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３４】
「転写イメージ」または「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１３５】
「形質転換」とは、外来性ＤＮＡが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１３６】
本明細書で用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知の形質転換技術によって導入された異種核酸を有する生物である。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術は公知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に記載がある。
【０１３７】
或る特定の核酸配列の「変異体／変異配列」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と記述され得る。スプライス変異配列は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異配列は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１３８】
特定のポリペプチド配列の「変異配列」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１３９】
（発明）
本発明は、新規のヒト膜貫通タンパク質（ＴＭＰ）群、およびＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づき、また、これらの組成物を使用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害の診断、治療、ならびに予防の開発に基づく。
【０１４０】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）に対応する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１４１】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）と、それに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）とを示す。列３は、最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＯ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体１つ以上の注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１４２】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４３】
表２および表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが膜貫通タンパク質であることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ラットのプロスタグランジンＦ２ａ受容体調節タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０５４８８４） との８９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はまた、６つの免疫グロブリンドメイン群を有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ はシグナルペプチドと１つの膜貫通ドメインと、１つのＲＧＤモチーフとを持ち、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２がヒト膜貫通タンパク質であることを示す更に実証的な証拠を提供する。
【０１４４】
別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ヒトのコネキシン３１．１ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４３３６９０３）との５６％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．８ｅ−６８であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はまた、１つのコネキシンドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がコネキシンである、更に実証的な証拠を提供する。注意すべきは、６つの同一のコネキシン群が１つのコネクソン（ギャップ結合）を構成し、これは膜貫通チャネルであって原形質膜にあり、化学的また電気的に機能し、多くの組織内の隣接細胞間で細胞質を結合することである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は長さが１５５４アミノ酸で、１１５７アミノ酸にわたってヒトＭＥＧＦ７ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３４４９３０６） との９９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はまた、低密度リポタンパク質受容体リピート群と、低密度リポタンパク質受容体ドメイン群とを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５がタンパク質のＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーであることを裏づける証拠を更に提供する。
【０１４５】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ はＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）による同定では、マウス低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰ１Ｂ／ＬＲＰ−ＤＩＴ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８９２６２４３）との３６％の同一性を有する（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．５ｅ−４０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、低密度リポタンパク質受容体ドメイン群を有することが、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６が低密度リポタンパク質受容体関連分子であることを裏づける証拠を更に提供する。更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はヒトＴＮＦ誘導性タンパク質ＣＧ１２−１ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３９７８２４６）との５９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．２ｅ−９４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＨＭＭＥＲ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４が１つの膜貫通ドメインを持つことを示す、更に実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５−１７については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の解析のためのアルゴリズムおよびパラメータは、表７に記述した。
【０１４６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリヌクレオチド配列の長さを塩基対で示す。列４は、ポリヌクレオチド配列の断片の内、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用な断片を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列に対応する識別番号、またはゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）に、および／または、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列を用いて、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築した。表４の列６および列７はそれぞれ、それらの完全長配列に関連する列５のｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１４７】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリとを指す場合もある。例えば、６７９８８２７Ｊ１はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＣＯＬＥＮＯＲ０３は、その配列が由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ（例えば、７１７６０７５８Ｖ１）は、プールされているｃＤＮＡライブラリに由来する。または、列５の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列の構築に用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡまたはＥＳＴの識別番号の場合もある（例えば、ｇ１５０６３５５）。更に、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースに由来した配列を示す場合もある（すなわち「ＥＮＳＴ」の命名を含む配列）。あるいは、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースに由来する場合もあり（すなわち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓに由来する場合もある（すなわち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡとＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンとの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ_１＿Ｎ_２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ_３＿Ｎ_４ は「スティッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹは該アルゴリズムが生成する予測の数であり、Ｎ_{１，２，３．．．}がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列５の識別番号は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎは「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎ は特定のエキソンである（実施例５を参照）。或るＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表されるＲｅｆＳｅｑ識別子が、ＧｅｎＢａｎｋ識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用され得る。
【０１４８】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例とを列記する（実施例４と５を参照）。

【０１４９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、列５に示すような配列カバレッジと重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１５０】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリとはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリであり、これは、最も頻繁にはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群によって代表されるが、これらは、上記のポリヌクレオチド配列を構築および確認するために用いられた。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５１】
本発明はまた、ＴＭＰの変異配列（変異体）をも含む。好適なＴＭＰの変異体は、ＴＭＰアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％、さらには少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＴＭＰの機能的または構造的特徴を少なくとも１つ含む変異体である。
【０１５２】
本発明はまた、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを提供する。或る特定の実施例において、本発明は、ＴＭＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１５３】
本発明はまた、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る特定の実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択されたアミノ酸配列との少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するような、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或る配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、ＴＭＰの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５４】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。上記したスプライス変異配列は何れも、ＴＭＰの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５５】
遺伝暗号の縮重により、ＴＭＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列が産生され、中には、いかなる既知の天然遺伝子のポリヌクレオチド配列にも最小の類似性しか無いものもあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組合せは、天然ＴＭＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号を基に成されるものであり、このような変異は全て明確に開示されていると考慮されたい。
【０１５６】
ＴＭＰとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然ＴＭＰのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、ＴＭＰ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、ＴＭＰおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることもある。
【０１５７】
本発明にはまた、ＴＭＰとＴＭＰ誘導体とをコードする、ＤＮＡ配列またはそれらの断片を、完全に合成化学によって作製する過程をも含む。作製後、当分野で公知の試薬類を用いて、この合成配列を任意の多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いて、ＴＭＰまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘発し得る。
【０１５８】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４、およびそれらの断片とのハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含む（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７；Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１５９】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、ＤＮＡシークエンシング方法を用い得る。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用い得る。あるいは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）およびＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ あるいは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で公知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０１６０】
当分野で周知の、ＰＣＲ法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、ＴＭＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配列群に隣接するＤＮＡ断片群をＰＣＲ増幅する方法を含む（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９などを参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で公知である（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０などを参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー類、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ類（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのＰＣＲベースの方法で、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１６１】
完全長ｃＤＮＡ群をスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡ群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５’領域を有する配列を含むライブラリであり、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５’非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１６２】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６３】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＴＭＰ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を産生し、これらの配列をＴＭＰの発現に利用し得る。
【０１６４】
ＴＭＰをコードする配列を種々の目的で改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異配列の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１６５】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャッフリング技術を用いてシャッフリングし、ＴＭＰの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＴＭＰの生物学的特性を改変或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、ＰＣＲを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異配列のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異配列をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換え、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、或る遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６６】
別の実施例によれば、ＴＭＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５２２３； および Ｈｏｒｎ， Ｔ． 他 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＴＭＰ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４などを参照）。自動合成は、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＴＭＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変、および／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチド、または変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１などを参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページなどを参照）。
【０１６８】
生物学的に活性なＴＭＰを発現させるために、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列またはそれらの誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写と翻訳との制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントの例には、ベクターに、またＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５’および３’の非翻訳領域などが含まれる。このようなエレメント群は、特長および特異性が様々である。特定の開始シグナル類によって、ＴＭＰをコードする配列の、より効果的な翻訳を達成することも可能である。このようなシグナルの例には、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列など近傍の配列が含まれる。ＴＭＰをコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が、好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ない場合もある。しかしながら、コーディング配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルを発現ベクターが提示するようにすべきである。外来性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサー類を含めることにより、発現の効率を高めることが可能である（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２などを参照）。
【０１６９】
当業者に周知の方法を用いて、ＴＭＰをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章および８章， および１６−１７章； および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章および１６章を参照）。
【０１７０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＴＭＰをコードする配列を保持および発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１、『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５などを参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２などを参照）。 本発明は、使用する宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７１】
細菌系では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えば、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＴＭＰをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＴＭＰが必要な場合は、ＴＭＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７２】
酵母発現系を用いてＴＭＰを産生し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、およびＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０１７３】
植物系もＴＭＰの発現に使用可能である。ＴＭＰをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるような、ＣａＭＶ由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって駆動し得る。あるいは、ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページなどを参照）。
【０１７４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とを持つアデノウイルス転写／翻訳複合体に、ＴＭＰをコードする配列を結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域へ挿入することにより、宿主細胞内でＴＭＰを発現する感染ウイルスを得ることが可能である（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．およびＴ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７５】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得るものやプラスミドから発現し得るものより大きな、ＤＮＡの断片を送達し得る。治療のために、約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５を参照）。
【０１７６】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるＴＭＰの安定した発現が望ましい。例えば、ＴＭＰをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、および／または内在性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ．他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３などを参照）。また、選択の基礎として、代謝拮抗物質、抗生物質、あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４などを参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための、細胞の必要条件を改変するｔｒｐＢおよびｈｉｓＤも、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１などを参照）。
【０１７８】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＴＭＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＴＭＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子が、ＴＭＰをコードする配列とタンデムに配置されることも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現をも標示する。
【０１７９】
一般に、ＴＭＰをコードする核酸配列を含み且つＴＭＰを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションと、ＰＣＲ増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０１８０】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＴＭＰの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。ＴＭＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合する結合アッセイを用いることもできる。これらのアッセイおよびこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪなどを参照）。
【０１８１】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、または、標識したヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＴＭＰをコードする配列、またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、およびＵ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１８２】
ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのＴＭＰの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力に関して行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質ターゲッティング、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８など）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択し得る。
【０１８４】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードする、自然のあるいは修飾された、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることができ、この結果、上記した任意の宿主系の、或る融合タンパク質の翻訳を生じる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラＴＭＰタンパク質は、ＴＭＰ活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃおよび赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＴＭＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＴＭＰが、精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、放射能標識したＴＭＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の、転写と翻訳とを結合する。翻訳は、例えば^３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８６】
本発明のＴＭＰまたはその断片を用いて、ＴＭＰに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＴＭＰへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１８７】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＴＭＰの天然リガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態物質、または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、この化合物は、ＴＭＰが結合する天然受容体に、或いは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に、密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＴＭＰを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＴＭＰを発現する細胞またはＴＭＰを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、ＴＭＰまたはこの化合物のどちらかの結合、刺激、または活性の阻害を分析する。
【０１８８】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により、その結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＴＭＰと混合するステップと、ＴＭＰとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは、天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０１８９】
本発明のＴＭＰまたはその断片を用いて、ＴＭＰの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニストなどが含まれる。一実施例では、ＴＭＰが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＴＭＰの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＴＭＰの活性を、試験化合物不在下でのＴＭＰの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＴＭＰの活性の変化は、ＴＭＰの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、ＴＭＰの活性に適した条件下で、ＴＭＰを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ系すなわち無細胞系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、ＴＭＰの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングできる。
【０１９０】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＴＭＰまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号および第５，７６７，３３７号などを参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ；Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９１】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することも可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１９２】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換した細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＴＭＰを乳汁内に分泌するなど、ＴＭＰを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１９３】
（治療）
ＴＭＰの各領域と膜貫通タンパク質類との間には、例えば配列およびモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。さらに、ＴＭＰの発現は、脳、前立腺、平滑筋、心血管、下垂体、胃腸、肺、膵臓、および小腸の各組織に密接に関連している。従って、ＴＭＰは、生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝障害、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症性の疾患においてある役割を果たすと考えられる。ＴＭＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９４】
したがって、一実施例において、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＴＭＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例としては、生殖障害として、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（ｃｙｓｔｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｓ）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）が、発達障害として、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィ、癲癇、性腺発育障害、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病および神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる他、心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α_１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ＧＭ_２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が、細胞増殖障害として、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｎｓ）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症および外傷が含まれる。
【０１９５】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＴＭＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１９６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＴＭＰを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与することも可能である。
【０１９７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＴＭＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１９８】
更なる実施例では、ＴＭＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＴＭＰのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝障害、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症性の疾患が含まれる。一実施態様では、ＴＭＰと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＴＭＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１９９】
別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＴＭＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防も可能である。
【０２００】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０１】
ＴＭＰのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたＴＭＰを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、ＴＭＰと特異結合するものを同定することが可能である。ＴＭＰへの抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２０２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトその他の種々の宿主が、ＴＭＰまたは任意の断片の注入、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２０３】
ＴＭＰに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＴＭＰアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２０４】
ＴＭＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他（１９８４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０などを参照）。
【０２０５】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４などを参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＴＭＰ特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばＢｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７を参照）。
【０２０６】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、あるいは免疫グロブリンライブラリ群のスクリーニングによって、または文献に開示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネル群のスクリーニングによっても行い得る（例えばＯｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２０７】
ＴＭＰに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）_２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）_２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばＨｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【０２０８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、ＴＭＰとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性ＴＭＰエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２０９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＴＭＰに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態下でのＴＭＰ−抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なＴＭＰエピトープに対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体試薬に関して判定したＫａは、ＴＭＰ抗体群の平均親和性または結合活性を表す。或る特定ＴＭＰエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体類の、試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＴＭＰ−抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＴＭＰが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． およびＡ． Ｃｒｙｅｒ（１９９１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１０】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＴＭＰ−抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ 他の文献などを参照）。
【０２１１】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＴＭＰをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片を、ＴＭＰをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿った、さまざまな位置から設計可能である（例えばＡｇｒａｗａｌ， Ｓ．， 編集 （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照）。
【０２１２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばＳｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９８）Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ および Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．およびＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他（１９９８）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６などを参照）。
【０２１３】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｈｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）などヒトレトロウイルス、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＴＭＰの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＴＭＰを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１４】
本発明の更なる実施例では、ＴＭＰの欠損による疾患や異常症を、ＴＭＰをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＴＭＰ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、および（ｖ）ＤＮＡトランスポゾンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０２１５】
ＴＭＰの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＴＭＰを発現させるために、（ｉ）構成的に活性なプロモーター（その由来は例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチンの遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販のＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれるテトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． および Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドＰＶＧＲＸＲおよびＰＩＮＤに含まれる；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来する、ＴＭＰをコードする内在性遺伝子の天然プロモーター、若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２１７】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（ｉ）レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でＴＭＰをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナル群と、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列と、効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列とを伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢおよびＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７３３−６７３７）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＶＰＣＬは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはＶＳＶｇなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。Ｒｉｇｇに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばＣＤ４^＋Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ．（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２１８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、ＴＭＰの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製不全型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はＡｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 並びに、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０２１９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＴＭＰの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞に、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＴＭＰを導入する際に特に有用である。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えＨＳＶ ｄ９２の利用について記載する。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ２２を欠失した組換えＨＳＶ系統の、作製および使用について開示している。ＨＳＶベクター類については、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ および Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（ｌａｒｇｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２０】
別法では、或るαウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いて、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、ＳＦＶゲノムに基づく（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、ウイルスのキャプシッドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムＲＮＡが産生される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長ゲノムＲＮＡよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質群が過剰産生される。同様に、ＴＭＰをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＴＭＰをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＴＭＰが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＴＭＰを導入することできる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡおよびＲＮＡの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは、例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０との間である。同様に、三重螺旋塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重螺旋塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重螺旋の能力を阻害するので有用である。三重螺旋ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９４）ｉｎ Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．およびＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページなどを参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳をブロックすべく設計し得る。
【０２２２】
リボザイム類は、酵素性ＲＮＡ分子である。ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＴＭＰをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２３】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２２４】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＴＭＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に組み込むことが可能である。あるいは、相補的ＲＮＡを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、本来はＰＮＡ群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）を加える。
【０２２６】
本発明の更なる実施例には、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが、特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、および、特定ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することにより、ポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、ＴＭＰの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２７】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で広く知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、商用または専用の、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合と、に有効であることが知られる化合物の化学修飾がある。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを有するサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することも可能であり、それにより、１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）、またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行できる。本発明の或る特定の実施例は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド類（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングする過程に関する（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２２８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６などを参照）。
【０２２９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３０】
本発明の或る更なる実施例は、薬剤として許容できる賦形剤と共に処方される活性成分を一般に持つ、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な処方が広く知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＴＭＰ、ＴＭＰの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＴＭＰのインヒビターなどからなる。
【０２３１】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３３】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３４】
ＴＭＰまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、ＴＭＰまたはその断片を、ＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２３５】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタなどにおいて、治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２３６】
医学的に効果的な薬用量とは、症状や容態を回復させる、たとえばＴＭＰまたはその断片、ＴＭＰの抗体、ＴＭＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど活性処方成分の量を指す。薬用有効度および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばＥＤ_５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する投与量比が治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲での調剤に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く含まず、ＥＤ_５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２３７】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、薬剤の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２３８】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビター類についての処方とは異なる、ヌクレオチドについての処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２３９】
（診断）
別の実施例では、ＴＭＰに特異的に結合する抗体を、ＴＭＰの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、ＴＭＰやＴＭＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調製される。ＴＭＰの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてＴＭＰを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能で、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４０】
ＴＭＰを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，およびＦＡＣＳなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのＴＭＰの発現を診断するための基礎を提供する。正常あるいは標準的なＴＭＰの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物と、ＴＭＰに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、および、生検組織からの疾患サンプルでの、ＴＭＰの発現の量を標準値と比較する。標準値と被験者の値との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２４１】
本発明の別の実施態様によれば、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドの例には、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、ＴＭＰの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、ＴＭＰの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のＴＭＰレベルの調節を監視する。
【０２４２】
或る実施形態では、ＴＭＰまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブ類とのハイブリダイゼーションを、ＴＭＰをコードする核酸配列を同定するために用いることができる。例えば５’調節領域など高度に特異的な領域か、それとも例えば保存されたモチーフなどやや特異性の低い領域から作られているかという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとにより、プローブが、ＴＭＰをコードする天然配列のみを同定するのか、或いは対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかが決まる。
【０２４３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用でき、また、ＴＭＰをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブにはＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の配列、或いはＴＭＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４４】
ＴＭＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＴＭＰをコードまたはＴＭＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、^３２Ｐまたは^３５Ｓなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０２４５】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列は、ＴＭＰの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例としては、生殖障害として、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（ｃｙｓｔｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｓ）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）が、発達障害として、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、癲癇、性腺発育障害、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病および神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α_１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ＧＭ_２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が、細胞増殖障害として、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｎｓ）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症および外傷が含まれる。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、およびマルチフォーマットのＥＬＩＳＡ式アッセイ、および、変容したＴＭＰ発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４６】
或る特定の形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列を、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化した場合は、サンプル内のＴＭＰをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４７】
ＴＭＰの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から抽出された体液あるいは細胞と、ＴＭＰをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２４８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２４９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５０】
ＴＭＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２５１】
或る特定の態様においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）および蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーと、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）とを用いたＤＮＡの増幅を行う。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形のＰＣＲ産物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、または統計モデルとＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５２】
ＴＭＰの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９−２３６を参照）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０２５３】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最適且つ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５４】
別の実施例では、ＴＭＰ、ＴＭＰの断片、ＴＭＰに特異的な抗体を、マイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用および遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５５】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。 或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２５６】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２５７】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロフィールを作製する転写イメージはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系および薬剤の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他（１９９９）Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現の、ゲノム全域にわたる測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２５８】
或る実施態様では、核酸を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０２５９】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２６０】
プロテオームのプロフィールは、ＴＭＰに特異的な抗体を用いてＴＭＰ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６１】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はｍＲＮＡの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２６２】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質を、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質を同定するため、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較する。
【０２６３】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体が認識したタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０２６４】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５）米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他（１９９７）米国特許第５，６０５，６６２号などを参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集 （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０２６５】
本発明の別の実施態様ではまた、ＴＭＰをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１構成物、あるいは単一染色体ｃＤＮＡライブラリ群に対してマッピングされる（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４； Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．およびＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２６６】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的および遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページなどを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上の、ＴＭＰをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２６７】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を表し得る（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０などを参照）。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を発見するために、本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２６８】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰ、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。ＴＭＰと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２６９】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ他（１９８４）ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４などを参照）。この方法においては、多数の様々な小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＴＭＰ、或いはその断片と反応してから洗浄される。精製したＴＭＰはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７０】
別の実施例では、ＴＭＰと特異結合可能な中和抗体がＴＭＰとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をＴＭＰと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０２７１】
別の実施例では、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０２７２】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７３】
前述した、および以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、米国特許出願第６０／２４４，０１７号、同第６０／２５２，８５５号、同第６０／２５１，８２５号、および同第６０／２５５，０８５号も含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【０２７４】
（実施例）
１ ｃＤＮＡ ライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ群の由来は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリ群であり、表４の列５に列記した。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、また、ホモジナイズしてフェノールまたは変性剤類の好適な混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７５】
ＲＮＡの純度を高めるため、フェノールによるＲＮＡの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて、組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２７６】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位でライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＰＣＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、あるいはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７７】
２ ｃＤＮＡ クローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ ＰｌａｓｍｉｄおよびＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２７８】
別法では、高処理フォーマットで直接結合ＰＣＲ法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ．（１９９４）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）およびＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２７９】
３ シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのｃＤＮＡ配列を選択し、実施例８に開示した技術で配列を伸長させた。
【０２８０】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群より選択した１つに対して行った。すなわち、公共のデータベース群、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類およびげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＴＥＯＭＥの、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）からの配列群を持つデータベース群、および、ＰＦＡＭ等の、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群である（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ群、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。構築にはＰｈｒｅｄとＰｈｒａｐとＣｏｎｓｅｄとに基づくプログラムを用い、ＧｅｎＭａｒｋとＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとに基づくプログラムを用いて、ｃＤＮＡの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭなど隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて生成する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０２８１】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡと完全長配列との分析と構築とに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０２８２】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の構築および分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーションおよび増幅技術に有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を、表４の列４に示した。
【０２８３】
４ ゲノム ＤＮＡ からのコード配列の同定および編集
推定上の膜貫通タンパク質類の同定には、先ずＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）に対して実行した。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からのゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が膜貫通タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドを、ＰＦＡＭモデルにおいて膜貫通タンパク質について問合せて分析した。潜在的な膜貫通タンパク質はまた、既に膜貫通タンパク質として注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群に対する相同性により、同定した。これら選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列を、次にＢＬＡＳＴ分析により、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなど、Ｇｅｎｓｃａｎが予測した配列におけるエラーを補正した。ＢＬＡＳＴ分析はまた、Ｇｅｎｓｃａｎ予測配列の、いかなるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたは公共ｃＤＮＡカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列および／または公共ｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築して得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に、完全に由来する。
【０２８４】
５ ｃＤＮＡ 配列データを使ったゲノム配列データの構築
スティッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ｃＤＮＡ配列群は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いて伸長させた。実施例３に記載したように構築した部分ｃＤＮＡ群を、ゲノムＤＮＡにマッピングした。また、関連するｃＤＮＡ群と、１つ以上のゲノム配列からＧｅｎｓｃａｎ予測されたエキソン群とを含むクラスター群に分解した。ｃＤＮＡとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライシング変異配列群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、ｃＤＮＡ配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に沿って現われるようにスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と変異配列群とを生成する。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を、ＢＬＡＳＴ分析で翻訳し、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。Ｇｅｎｓｃａｎが予測した不正確なエキソン群は、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加ｃＤＮＡ配列群を用いるかゲノムＤＮＡの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０２８５】
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体を、ＢＬＡＳＴ分析により、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を、相同ゲノム配列の付加により「ストレッチ」すなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２８６】
６ ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ他のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの実装を用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよび公共のドメインデータベース群の配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続および重複した配列のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２８７】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に対して測定する（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒトＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。ｃＭ距離は、各クラスター内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ’９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図その他の資源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０２８８】
このようにして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、１１番染色体の５９．５０から６２．５０センチモルガンの区間内にマップされ、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６は、１番染色体の１７９．２から１８６．４センチモルガンの区間内にマップされた。
【０２８９】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ４章および１６章などを参照）。
【０２９０】
ＢＬＡＳＴを応用した類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのｃＤＮＡデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２９１】
【数１】

積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の、正規化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。或る高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９２】
或いは、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列を、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＴＭＰをコードするｃＤＮＡの、組織特異的発現および疾患特異的発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２９３】
８ ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計には、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて行った。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は全て回避した。
【０２９４】
選択したヒトｃＤＮＡライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡを有し、また、２００ ｎｍｏｌの各プライマーを有する。また、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを含有する。プライマー対であるＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂとに対し、以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ６０℃で１分間
ステップ４ ６８℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６ ６８℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
別法では、プライマー対であるＴ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ５７℃で１分間
ステップ４ ６８℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６ ６８℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１× ＴＥおよび０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量すべく、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μｌを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２９６】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液内の３８４ウェルプレート群に３７℃で一晩培養した。
【０２９７】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ６０℃で１分間
ステップ４ ７２℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６ ７２℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
ＤＮＡの定量化には、上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、およびＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２９８】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５’調節配列を得た。
【０２９９】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識および使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順を用いる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、ＸｂａＩまたはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３００】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０１】
１０ マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した手段を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、非多孔性の表面を持つ固体とすべきである（Ｓｃｈｅｎａ（１９９９）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばＳｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１を参照）。
【０３０２】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズする。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識その他の分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされていないヌクレオチドを生物学的サンプルから除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザ脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調整および使用について、以下に詳述する。
【０３０３】
組織または細胞サンプルの調製
全ＲＮＡを組織サンプル群から単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製するためオリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いる。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用い、２００ｎｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ群は、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルを精製するため、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム、および３００ｍｌの１００％エタノールを用いる。サンプルを次にＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて完全に乾燥させ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３０４】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメント群を作製する。各アレイエレメントは、クローン化したｃＤＮＡインサート群により、ベクター含有細菌細胞群から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３０５】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、０．１％のＳＤＳおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理中および処理後に多量の蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、多量の蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３０６】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許は引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを、高速ロボット装置（ｒｏｂｏｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３０７】
マイクロアレイをＵＶ架橋するため、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０．２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。各非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０．２％ＳＤＳおよび蒸留水で洗浄する。
【０３０８】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μｌのサンプル混合体には、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識したｃＤＮＡ合成産物群の各０．２μｇを、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ^２のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度１００に保つため、１４０μｌの５×ＳＳＣをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３０９】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ３の励起のために４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のために６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、解像度２０μｍでスキャンする。
【０３１０】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。好適なフィルター群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１１】
通常、各スキャンの感度を較正するため、ｃＤＮＡ対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比１：１００，０００で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するｃＤＮＡのサンプルを２種の蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３１２】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア２０色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３１３】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３１４】
１１ 相補的ポリヌクレオチド
ＴＭＰをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然ＴＭＰの発現が検出、低減、または阻害される。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチド群を設計するため、Ｏｌｉｇｏ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および、ＴＭＰのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な５’配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計して用いることにより、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計することにより、リボソームが、ＴＭＰをコードする転写物に結合するのを防ぐ。
【０３１５】
１２ ＴＭＰの発現
ＴＭＰの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でＴＭＰが発現するよう、ｃＤＮＡを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、ｃＤＮＡ転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターの例には、限定するものではないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターおよびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれる。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌にＴＭＰを発現させるには、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発する。真核細胞でのＴＭＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をＴＭＰをコードするｃＤＮＡと置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力な多角体プロモーターによって高レベルのｃＤＮＡ転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０３１６】
殆どの発現系では、ＴＭＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製後、ＧＳＴ要素を、操作した特定の部位においてＴＭＰからタンパク分解的に切断することが可能である。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＴＭＰを直接用いて、適用可能な場合は以下の実施例１６、および１７のアッセイを行うことができる。
【０３１７】
１３ 機能的アッセイ
ＴＭＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、ＴＭＰをコードする配列の発現によって算定する。ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選択されるベクターの例には、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＣＲ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞とを区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのｃＤＮＡ発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記述がある。
【０３１８】
遺伝子発現におけるＴＭＰの影響は、ＴＭＰをコードする配列と、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の、保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体かのどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ＴＭＰと、目的とする他の遺伝子とをコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３１９】
１４ ＴＭＰに特異的な抗体の作製
実質的に精製されたＴＭＰを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で作製し、これを用いて標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３２０】
別法では、ＴＭＰアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３２１】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ＦＭＯＣケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗ＴＭＰ活性を検査するには例えば、ペプチドまたはＴＭＰを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３２２】
１５ 特異的抗体を用いる天然ＴＭＰの精製
天然ＴＭＰあるいは組換えＴＭＰを実質的に精製するため、ＴＭＰに特異的な抗体類を用いるイムノアフィニティー（免疫親和性）クロマトグラフィを行う。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＴＭＰ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３２３】
ＴＭＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＴＭＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＴＭＰとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、ＴＭＰを回収する。
【０３２４】
１６ ＴＭＰと相互作用する分子の同定
ＴＭＰまたは生物学的に活性なＴＭＰ断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ．およびＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したＴＭＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＴＭＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＴＭＰ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＴＭＰの数量、親和性、および会合についての値を計算する。
【０３２５】
別法では、ＴＭＰと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．および Ｏ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）や、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、２−ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３２６】
ＴＭＰはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３２７】
１７ ＴＭＰ活性の実証
ＴＭＰのギャップ結合活性
ＴＭＰのギャップ結合活性を実証するには、細胞間チャネルの形成を誘発する能力を、１対のアフリカツメガエル卵母細胞にＴＭＰのｃＲＮＡを注入して調べる（Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ、前出）。ＴＭＰｃＲＮＡを実験注入する１週間前に、卵母細胞に、ＴＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入してバックグラウンドを低減する。ＴＭＰｃＲＮＡ注入卵母細胞のインキュベートを１晩行い、卵黄膜を剥ぎ、対にして、接合部電流の記録を、２細胞電圧固定で行う。測定したコンダクタンスは、ＴＭＰのギャップ結合活性に比例する。
【０３２８】
別法では、ＴＭＰ活性のアッセイのための、ＴＭＰのイオンチャネル活性の測定に、イオンコンダクタンスについての電気生理学的アッセイを用いる。哺乳動物細胞株、（例えばＣＯＳ７、ＨｅＬａ、若しくはＣＨＯなど）を、ＴＭＰをコードする真核細胞発現ベクターで形質転換させて、ＴＭＰを発現し得る。真核細胞発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。β−ガラクトシダーゼなど多数のマーカー遺伝子のいずれか１つを発現させる第二のプラスミドをこれら細胞へと同時形質転換することにより、外来ＤＮＡを取り込んで発現させた細胞群の迅速な同定が可能となる。形質転換の後、この細胞株がＴＭＰおよびβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下でこれらの細胞を４８〜７２時間、インキュベーションする。
【０３２９】
β−ガラクトシダーゼを発現する形質転換細胞は、好適な比色用基質が本技術分野で公知の条件下で培地へ添加されると、青く染色される。染色した細胞は、本技術分野で公知の電気生理技術を用いて膜コンダクタンスの違いを試験する。形質転換していない細胞、および／または、形質転換に、ベクター配列群のみ、またはβ−ガラクトシダーゼ配列群のみを用いた細胞を対照として用い、平行して試験する。ＴＭＰを発現する細胞は、対照細胞に比べてより高いアニオンコンダクタンスまたはカチオンコンダクタンスを持つこととなる。コンダクタンスに対するＴＭＰの寄与は、ＴＭＰに特異的な抗体類を用いて細胞をインキュベートすることで確認し得る。抗体は、ＴＭＰの細胞外側に結合することにより、イオンチャネル内のポアと、それに伴うコンダクタンスとをブロックする。
【０３３０】
ＴＭＰの膜貫通タンパク質活性
ＴＭＰ活性に対する或るアッセイは、細胞表面におけるＴＭＰの発現を測定する。ＴＭＰをコードするｃＤＮＡを、好適な哺乳動物細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質を、記載されているようにビオチンで標識する（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ， Ｍ． Ａ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）。ＴＭＰ特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降素と非標識免疫沈降素との比は、細胞表面に発現したＴＭＰの量に比例する。
【０３３１】
ＴＭＰ活性の或る別のアッセイは、リガンド／受容体が媒介する、細胞増殖の変調についての原型のアッセイに基づいている。このアッセイは、ＴＭＰを発現するスイスマウス３Ｔ３細胞において新規に合成されたＤＮＡの量を測定する。ＴＭＰをコードするｃＤＮＡを持つ好適な哺乳動物発現ベクターを、当分野で周知のトランスフェクション法を用いて静止状態の３Ｔ３培養細胞に加える。形質転換細胞を、［^３Ｈ］チミジンと可変量のＴＭＰリガンドとの存在下でインキュベートする。酸沈殿性ＤＮＡ内へ取り込まれた［^３Ｈ］チミジンを、トリチウムラジオアイソトープカウンターを用いて適当な時間間隔で測定する。取り込まれた量は、新規に合成されたＤＮＡの量に正比例する。少なくとも１００倍のＴＭＰリガンド濃度範囲に対する用量反応曲線がリニアであることは、受容体活性を示唆するものである。ミリリットル当りの１単位の活性の定義は、５０％の反応レベルを産出するＴＭＰの濃度であり、１００％であれば、［^３Ｈ］チミジンを酸沈殿性ＤＮＡに最大限、取り込むことを表す（ＭｃＫａｙ， Ｉ．およびＬｅｉｇｈ， Ｉ．， ｅｄｓ． （１９９３） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７３ページ）。
【０３３２】
当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載した方法およびシステムの種々の修正を行い得る。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３３３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３３４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３３５】
表３は、予測されたモチーフおよびドメインを持つ本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３３６】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡ断片やゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３３７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３３８】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３３９】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献および閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of transmembrane proteins. The present invention also relates to the diagnosis, treatment and prevention of reproductive disorders, developmental disorders, cardiovascular disorders, neurological disorders, gastrointestinal disorders, lipid metabolism, abnormal cell proliferation, and autoimmune / inflammatory diseases using these sequences. The invention further relates to the evaluation of the effect of foreign compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of transmembrane proteins.
[0002]
(Background of the Invention)
Eukaryotes differ from prokaryotes in that they have many compartments within the cell that are surrounded by membranes, such as organelles and vesicles. Many of the metabolic reactions that distinguish eukaryotic biochemistry from prokaryotic biochemistry occur within these compartments. In particular, many cellular functions require very stringent reaction conditions, and unless organelles or vesicles allow compartmentalization and sequestration of each reaction, each metabolic process in the cytoplasm can be disrupted. Examples of these organelles include mitochondria, smooth endoplasmic reticulum, rough endoplasmic reticulum, sarcoplasmic reticulum, and Golgi apparatus. Examples of vesicles include phagosomes, lysosomes, endosomes, peroxisomes, and secretory vesicles. Organelles and vesicles are surrounded by one or two layers of membrane.
[0003]
Biological membranes surround the organelles, vesicles, and the cells themselves. Biological membranes are highly selective permeable barriers composed of a lipid bilayer sheet, the components of which are phosphoglycerides, fatty acids, cholesterol, phospholipids, glycolipids, proteoglycans, and proteins. These membranes contain ion pumps, ion channels, and specific receptors, which receive external stimuli and transmit biochemical signals to the inside of the membrane. These membranes also contain second messenger proteins that interact with these pumps, channels and receptors to amplify and regulate the transmission of these signals.
[0004]
Plasma membrane proteins
Transmembrane proteins (TMPs) are characterized by an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain. TMP domains typically consist of 15 to 25 hydrophobic amino acids, which are expected to adopt one α-helical conformation. TMPs can be classified into bitopic (type I and type II) proteins (which penetrate the membrane once) and polytopic (type III and type IV) (Singer, SJ (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6: 247-96) protein, the latter having multiple transmembrane segments. TMPs acting as cell surface receptor proteins involved in signal transduction include growth factor receptors and differentiation factor receptors, as well as Drosophila pecanex and frizzled proteins, LIV-1 proteins, NF2 proteins, and GNS1 / SUR4 eukaryotes. Includes proteins that interact with the receptor, such as integral membrane proteins. TMPs also act as transporters of ions or metabolites (eg, gap junction channels (connexins) and ion channels) and as cell adhesion proteins (eg, lectins, integrins, and fibronectins). TMPs function as molecules that form vesicles and organelles (eg, caveolins) and as cell recognition molecules (eg, differentiation cluster (CD) antigens, glycoproteins, and mucins).
[0005]
The action of transporting hydrophilic molecules into and out of the membrane is facilitated by the presence of channel proteins. These form aqueous pores, which can penetrate the lipid bilayer. Many channels are composed of protein complexes formed by aggregates of multiple subunits. At least one of the subunits is an integral membrane protein, which contributes to form a pore. In some cases, the pore is configured such that only one or a few molecular species can selectively pass through. There are several different types of membrane channels, the major difference being their distribution and selectivity. Each type includes (1) aquaporins (transporting water), (2) protein conduction channels (transporting proteins through the endoplasmic reticulum membrane), and (3) gap junctions (ionic and small organic molecules between adjacent cells). (Facilitating diffusion), and (4) ion channels (modulating ion flux through various membranes).
[0006]
Gap junctions (also known as connexons) are specialized regions of the plasma membrane and are composed of transmembrane channels. Transmembrane channels function by chemically or electrically connecting the cytoplasm between adjacent cells in many tissues. Gap junctions function as electrical synapses for intercellular propagation of action potentials within each excitable tissue. In non-excitable tissues, the role of gap junctions is in tissue homeostasis and also plays a role in regulated physiological responses and regulation of metabolic cooperation, growth control, development and differentiation.
[0007]
Each connexon penetrates the lipid bilayer of the plasma membrane and is composed of six identical subunits, connexins. There are at least 14 different connexin proteins, each having a similar structure but different tissue distributions. Structurally, connexins have a short cytoplasmic N-terminal domain, connected to four transmembrane domains (M1, M2, M3, and M4). These transmembrane regions are arranged to separate two extracellular loops and one intracytoplasmic loop, followed by a C-terminal domain. The C-terminal domain is the cytoplasmic domain and has variable length (from 20 residues at Cx26 to 260 residues at Cx56). The M2-M3 loop and the N- and C-termini are facing the inside of the cytoplasm. The conserved regions are each transmembrane region and two extracellular loops. Within both extracellular loops are three conserved groups of cysteines, which are involved in disulfide bond formation. The signature pattern for both loops is one of the following: C- [DN] -T-x-Q-P-G-C-x- (2) -V-C-Y-D or C-x (3,4) -PCx (3)-[LIVM]-[DEN] -C- [FY]-[LIVM]-[SA]-[KR] -P (PDOC00341, Profilefilscan and S. Rahman And WH Evans, (1991) J. Cell Sci. 100: 567-578). The variable regions are the cytoplasmic loop and the C-terminal region and may be involved in the regulation of various connexins (Hennemann, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17225-17233; PRINTS PR00206 connexin signature; Yeager, M. et al., (1998) Curr. O. Structr. Biol. 8: 517-524).
[0008]
Gap junctions help coordinate myocardial and smooth muscle contractions, accelerate neurotransmission and help propagate extracellular signals. Opening and closing of gap junctions is possible in response to specific stimuli (eg pH, Ca⁺², And cAMP). The effective pore size of the gap junction is about 1.5 nm, which is the size that small molecules (eg, less than 1000 daltons) can diffuse freely through the pore. Examples of molecules to be transported include ions, small molecule metabolites, and second messengers (eg, Ca⁺² And cAMP).
[0009]
Connexins are involved in many diseases. The cause of infertility in female connexin 37 (Cx37) deficient mice is a lack of oocyte-granulosa cell signaling pathway. Cx43 deficient mice die shortly after birth, exhibiting heart defects that are reminiscent of some pulmonary artery stenosis in humans. Mutations in Cx32 are associated with X chromosome-linked Charcot-Marie-Tooth disease, a neuropathy of motor and sensory nerves of the peripheral nervous system. Cx26 is expressed in the placenta and transplacental transport of certain glucose analogs from the maternal circulation to the fetal circulation is reduced in Cx26 deficient mice. In humans, Cx26 has been identified as the first susceptibility gene for nonsyndromic autosomal sensorineural hearing loss. Mutations in Cx31 are linked to autosomal dominant hearing impairment (nonsense or missense mutations in the second extracellular loop) and also to the dominantly inherited skin disorder, mutated erythematous keratoderma (N-terminal). Missense mutation in the M2 domain or the M2 domain) (see AM Simon, (1999) Trends Cell Biol. 9: 169-170). Cx46 is expressed in lens fiber cells and Cx46-deficient mice develop early-onset cataracts, which resemble human nuclear cataracts (Nicholson, SM and R. Bruzzone (1997) Curr. Biol. 7: R340). -R344).
[0010]
Plasma membrane proteins (MPs) are divided into two groups, the classification criterion being the method of extracting proteins from the membrane. Extreme ionic strength or pH is used to release proteins outside the membrane, ie, superficial membrane proteins, or a protein-interacting disruptor such as urea is used. The only way to release proteins inside the membrane, ie, integral membrane proteins, is to dissolve the lipid bilayer of the membrane with a detergent.
[0011]
Many membrane proteins (MPs) have a group of amino acid sequence motifs that serve to localize these proteins to each specific intracellular site. Examples of these motifs include PDZ domains, KDEL, RGD, NGR, and GSL sequence motifs, von Willebrand factor A (vWFA) domains, and EGF-like domains. RGD, NGR, and GSL motif-containing peptides have been used as drug delivery agents to treat target cancers in tumor vasculature (Arap, W. et al. (1998) Science, 279: 377-380). Membrane proteins also include amino acid sequence motifs (eg, carbohydrate recognition domains) that interact with extracellular and intracellular molecules.
[0012]
Chemical modification of amino acid residue side chains alters the way MPs interact with other molecules (eg, membrane phospholipids). Examples of such chemical modifications include the formation of covalent bonds with glycosaminoglycans, oligosaccharides, phospholipids, acetyl and palmitoyl moieties, ADP-ribose, phosphate, and sulfate groups.
[0013]
RNAs encoding membrane proteins may have alternative splice sites, which allow proteins encoded by the same gene to have different messenger RNAs and amino acid sequences. Splice variant membrane proteins can interact with other ligands and protein isoforms.
[0014]
Transmembrane proteins of the plasma membrane also include cell surface receptors. Examples of substances recognized by cell surface receptors include hormones such as catecholamines (eg, epinephrine, norepinephrine, and histamine), and peptide hormones (eg, glucagon, insulin, gastrin, secretin, cholecystokinin, adrenocorticotropic hormone, Follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, thyroid-stimulating hormone, parathyroid hormone, and vasopressin) and growth and differentiation factors (eg, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, transforming growth factor, insulin-like growth factor, platelet-derived) Growth factors, nerve growth factors, colony stimulating factors, and erythropoietin), cytokines (eg, chemokines, interleukins, interferons, and tumor necrosis factor), and small peptide factors (eg, Bombesin, oxytocin, endothelin, angiotensin II, vasoactive intestinal peptide, and bradykinin) and neurotransmitters (eg, neuropeptide Y, neurotensin, neuromedin N, melanocortins, opioids (eg, enkephalins, endorphins, And dynorphins), galanin, somatostatin, and tachykinins), and signaling molecules (eg, angiotensin, complement, calcitonin, endothelins, and formylmethionyl peptides) that are carried into the circulation. Cell surface receptors on immune system cells recognize antigens, antibodies, and major histocompatibility complex (MHC) binding peptides. Other cell surface receptors bind to ligands, which are taken up by the cell. This receptor-mediated endocytosis includes low density lipoprotein (LDL), transferrin, glucose terminal glycoprotein, mannose terminal glycoprotein, galactose terminal glycoprotein, immunoglobulins, phosphovitellogenins, fibrin, proteinase-inhibition Function upon uptake of drug conjugates, plasminogen activator, and thrombospondin (Lodish, H. et al. (1995)Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York, NY, p. 723; and Mikhailenko, I .; Et al. (1997) J. Am. Biol. Chem. 272: 6784-6791).
[0015]
Many cell surface receptors have seven transmembrane domains and an extracellular N-terminus that binds ligand and a cytoplasmic C-terminus that interacts with G proteins (Strosberg, AD (1991). ) Eur. J. Biochem. 196: 1-10). Cysteine-rich domains are found in two families of cell surface receptors, the LDL receptor family and the tumor necrosis factor receptor / nerve growth factor receptor (TNFR / NGFR) family. A group of seven consecutive cysteine-rich repeats (about 40 amino acids) forms a binding site between LDL and calcium in the N-terminal extracellular region of the LDL receptor, and a similar repeat is the vertebrate ultra-low density lipoprotein receptor. Vertebrate low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) (also known as α₂ Macroglobulin receptor) and vertebrate low-density lipoprotein receptor-related protein 2 (also known as gp330 or megalin) (ExPASy PROSITE document PDOC 00929; and Bairoch, A. et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 217-221). The structure of the cysteine-rich repeats consists of a β-hairpin followed by a series of β-turns, with six disulfide-linked cysteines within each repeat.
[0016]
The LDL receptor is an integral membrane protein that takes up lipids by removing cholesterol from the blood. Most cells other than the liver and intestine take up cholesterol from the blood and do not synthesize themselves. LDL particles bind to the cell surface LDL receptor, and the particles are taken into cells by endocytosis (Meyers, RA (1995)).Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers, New York NY, pp. 494-501). LDL receptor deficiency causes familial hypercholesterolemia, increases plasma cholesterol levels, and ultimately results in atherosclerosis (Stryer, L (1995)Biochemistry, W.S. H Freeman, New York. 691-702).
[0017]
G protein-coupled receptor
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute a superfamily of integral membrane proteins and transmit extracellular signals. Examples of GPCRs include receptors for biogenic amines and receptors for lipid mediators of inflammation, peptide hormones, and sensory signal mediators.
[0018]
Structurally, these highly conserved receptors include seven hydrophobic transmembrane (serpentine) regions, cysteine disulfide bridges between the second and third extracellular loops, and extracellular N There is a terminal and a cytoplasmic C-terminal. The three extracellular loops alternate with the three intracellular loops, connecting the seven transmembrane regions. The most conserved portions of these proteins are the transmembrane regions and the first and second intracytoplasmic loops. The cysteine disulfide bridge connects the second and third extracellular loops. One conserved, acidic residue-Arg residue-aromatic residue triplet is in the second cytoplasmic loop and may interact with G proteins. The GPCR consensus pattern characterizes most proteins belonging to this superfamily (ExPASy PROSITE document PS00237; and Watson, S. and S. Arkinstall (1994)The G-protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, pages 2-6). Neuropathies associated with mutations in the genes encoding GPCRs and altered transcriptional activity include schizophrenia (schizophrenia), Parkinson's disease, Alzheimer's disease, drug dependence, and eating disorders. The youth development and fertility 2 (jdf-2) locus, also known as runty-jerky-sterile (rjs), is associated with deletions and point mutations in HERC2, which encodes a guanine nucleotide exchange factor protein. (Walkowicz, M. et al. (1999) Mamm. Genome 10: 870-878).
[0019]
Some GPCRs are known as FPs and have a prostaglandin F_{2 α}(PGF_{2 α}) Is a receptor. Prostaglandins are a large family of natural paracrine / autocrine mediators in physiological and inflammatory responses. PGF_{2 α}Plays a role in the responses of several tissues, such as the reproductive organs, lungs, bones, and heart, which include stimulation of uterine muscle contraction, luteal breakdown, and bronchoconstriction . Certain FP-associated molecules (FPRPs) are co-purified with FP and expression is_{2 α}Physiological roles occur only in each tissue described. FPRP is predicted to be a transmembrane protein and has glycosylated extracellular immunoglobulin loops and one short, highly charged intracellular domain. FPRP stands for PGF to FP_{2 α}Seems to be a negative regulator of binding. Therefore, FPRP is PGF_{2 α}May be involved in related diseases, examples of which may be dysmenorrhea, infertility, asthma, or cardiomyopathy (Orricky, DJ et al. (1996) Hum. Genet. 97: 655-658). ).
[0020]
Scavenger receptor
Macrophage scavenger receptors have broad ligand specificity and may be involved in binding low density lipoprotein (LDL) and foreign antigens. Scavenger receptor types I and II are trimeric membrane proteins, each subunit having a small N-terminal intracellular domain, one transmembrane domain, one large extracellular domain, and a C-terminal cysteine-rich domain. is there. The extracellular domain has one short spacer domain, one α-helical coiled-coil domain, and one triple-helical collagenous domain. These receptors have been shown to bind to a range of ligands, examples of ligands include chemically modified lipoproteins and albumin, polyribonucleotides, polysaccharides, phospholipids, asbestos and (Matsumoto, A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9133-9137; and Elomaa, O. et al. (1995) Cell 80: 603-609). It appears that scavenger receptors appear to play a major role in atherogenesis, which mediates the uptake of modified LDL in the arterial wall, and among host defenses, bacterial endotoxin. It works by binding to bacteria and protozoa.
[0021]
Tetraspan family protein
The four-transmembrane superfamily (TM4SF), also known as the tetraspan family, is a multigene family that encodes type III integral membrane proteins (Wright, MD and Tomlinson, MG (1994) Immunol. Today 15: 588-594). TM4SF consists of a membrane protein that penetrates the cell membrane four times. Examples of members of TM4SF include platelet and endothelial cell membrane proteins and melanoma-associated antigens, leukocyte surface glycoproteins, colon carcinoma antigens, tumor-associated antigens, and schistosomiasis surface proteins (Jankowski, SA (1994). ) Oncogene 9: 1205-211). Each member of TM4SF shares about 25-30% amino acid sequence identity with each other.
[0022]
Effects that have been implicated in many TM4SF members are signaling, regulation of cell adhesion, regulation of cell growth and proliferation (eg, development and carcinogenesis), and cell motility (eg, tumor cell metastasis). Expression of the TM4SF protein is associated with a variety of tumors, and the level of expression can change as cells grow and activate.
[0023]
Tumor antigen
Tumor antigens are surface molecules that are expressed differently in tumor cells than in normal cells. Tumor antigens immunologically distinguish tumor cells from normal cells and provide diagnostic and therapeutic targets for human cancer (Takagi, S. et al. (1995) Int. J. Cancer 61: 706-715; Liu). , E. et al. (1992) Oncogene 7: 1027-1032).
[0024]
Ion channel
Ion channels are found in the plasma membrane of virtually every cell in the body. For example, chloride channels mediate a variety of cellular functions, examples of which include regulation of membrane potential and absorption and secretion of ions through the epithelium. When chloride channels are in the intracellular membranes of the Golgi apparatus and endocytic vesicles, they also regulate the pH of organelles (eg, Greger, R. (1988) Annu. Rev. Physiol. 50: 111-122. reference). The electrophysiological and pharmacological properties of chloride channels, such as ion conductance, current-membrane potential relationships, and sensitivity to modulators, are associated with separate chlorides in muscle, nerve cells, fibroblasts, epithelial cells, and leukocytes. Suggests that there is an ion channel.
[0025]
Many channels have phosphorylation sites by one or more protein kinases. These protein kinases include protein kinase A, protein kinase C, casein kinase II, and tyrosine kinase, all of which regulate ion channel activity in cells. Inappropriate phosphorylation of membrane proteins has been correlated with pathological changes in cell cycle progression and cell differentiation. Changes in the cell cycle have been shown to be associated with the induction of apoptosis and the induction of cancer. Changes in cell differentiation have been shown to be associated with diseases and disorders of the reproductive system, the immune system, and skeletal muscle.
[0026]
Cerebellar granule neurons have a non-inactivating potassium current, which regulates the frequency of firing by receptor stimulation from neurotransmitters and controls resting membrane potential. An example of a potassium channel exhibiting a non-inactivating current is the ether a go-go (EAG) channel. A membrane protein named KCR1 specifically binds rat EAG at its C-terminal region and regulates cerebellar inactivated potassium current. KCR1 is predicted to contain 12 transmembrane domains and amino acid and carboxyl termini intracellularly. Structural features suggest that these transmembrane regions are similar to regions of the transporter superfamily, but since no homology is seen between KCR1 and known transporters, KCR1 is a novel class of transporters. It is suggested that it belongs to Porta. KCR1 appears to be a regulatory component of non-inactivated potassium channels (Hoshi, N. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 23080-23085).
[0027]
Proton pump
Proton ATPase is a large class of membrane proteins that use the energy of ATP hydrolysis to generate an electrochemical proton gradient across the membrane. This generated gradient is dependent on other ions (Na⁺, K⁺Or Cl⁻) Can be used for transport across membranes or for maintaining organelle pH. Proton ATPases are further divided into mitochondrial F-ATPase, plasma membrane ATPase, and vacuolar ATPase. Vacuolar ATPase establishes and maintains acidic pH in various vesicles involved in endocytic and exocytotic processes (Mellman, I. et al. (1986) Ann. Rev. Biochem. 55: 663-700).
[0028]
Twelve transmembrane domain transporters, such as PEPT 1 and PEPT 2, conjugated to protons, are involved in the gastrointestinal uptake of peptides and re-absorption in the kidneys, which drive the electrochemical proton gradient Use as force. Another type of peptide transporter, TAP transporter, is a heterodimer consisting of TAP 1 and TAP 2, and is involved in antigen processing. Peptide antigens are transported by the TAP through the endoplasmic reticulum membrane, so that the peptide antigens can be expressed at the cell surface in association with MHC molecules. Each TAP protein is composed of multiple hydrophobic transmembrane segments and one highly conserved ATP binding cassette (Boll, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 284289). Pathogenic microorganisms, such as the herpes simplex virus, may encode inhibitors of TAP-mediated peptide transport, the purpose of which is to escape immune surveillance (Marusina, K. and Manaco, JJ. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 19-26).
[0029]
ABC transporter
The ATP binding cassette (ABC) transporter, also known as the “transport ATPase”, is a superfamily of membrane proteins that mediates transport and channel functions in prokaryotes and eukaryotes (Higgins, CF (1992). Annu. Rev. Cell Biol. 8: 67-113). ABC proteins share a similar overall structure and remarkable sequence homology. All ABC proteins have a conserved domain, which is about 200 amino acid residues and has one or more nucleotide binding domains. Mutations in the ABC transporter gene cluster have been implicated in a variety of genes, including hyperbilirubinemia II / Dubin-Johnson syndrome, recessive Stargardt disease, X-linked adrenoleukodystrophy, multidrug resistance, pediatric steatosis, and cystic fibrosis. Involve in disability.
[0030]
Membrane proteins involved in intercellular communication
Intercellular communication is essential for the development and survival of multicellular organisms. Cells communicate with each other by secretion and uptake of protein signaling molecules. A means of achieving protein uptake into cells is endocytosis, in which the interaction of signaling molecules with the plasma membrane surface often occurs through binding to specific receptors, resulting in plasma membrane They form derived vesicles, which surround the molecule and carry it into the cytoplasm. A means of achieving secretion of proteins from cells is exocytosis, where intracellular molecules are packed into membrane-bound transport vesicles derived from the trans-Golgi network. These vesicles fuse with the plasma membrane and release the contents of the vesicles into the surrounding extracellular space. The consequences of endocytosis and exocytosis are the removal and addition of plasma membrane components, and the recycling of these components is complete in both the plasma membrane and the inner compartment surrounded by the membrane. Essential for maintaining gender, identity, and functionality.
[0031]
Synaptobrevins are synaptic vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) and were first discovered in rat brain. These proteins were originally restricted to nerve cells and were initially thought to function in the movement of vesicles from one cell's plasma membrane through synapses to another. Synaptobrevins now reside and function in multiple constitutive vesicle transport pathways and have been shown to be involved in receptor-mediated endocytosis and exocytosis pathways of many non-neuronal cell types . This regulated vesicle trafficking pathway can be blocked by the highly specific action of clostridial neurotoxins that cleave synaptobrevin molecules.
[0032]
In in vitro (Galli et al. (1994) J. Cell. Biol. 125: 1015-24; Link et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 18423-6). Indicates that VAMPS is widely distributed. These important membrane transport proteins also participate in nascent axonal outgrowth through exocytosis, and also appear to be involved in the release of neurotransmitters and regulatory peptides and in endocytosis. Endocytic vesicle trafficking includes intracellular events such as fusion and division of nuclear envelope, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and various inclusion bodies (eg, peroxisomes or lysosomes). Each process of endocytosis is performed by eukaryotic cells in yeast, nematodes (Caenorhabditis elegans), Drosophila, and mammals appear to be universal.
[0033]
VAMP-1B is involved in intracellular targeting and is an isoform of VAMP-1A (Isenmann, S. et al. (1998) Mol. Biol. Cell 9: 1649-1660). Four additional splice variants (VAMP-1C through F) have recently been identified. Although each mutant has a variable sequence group, its position is only at the very terminal C-terminal region, suggesting that the C-terminal region is important for vesicle targeting (Berglund, L. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 777-780).
[0034]
Lysosomes are sites for degradation of intracellular substances during autophagy, and also sites for degradation of extracellular molecules after endocytosis. Lysosomal enzymes are packed into vesicles that germinate from the trans-Golgi network. These vesicles fuse with endosomes to form mature lysosomes, where hydrolytic digestion of substances taken up by endocytosis occurs. Lysosomes can fuse with autophagosomes to form unique compartments. Within this compartment, degradation of organelles and other intracellular components occurs.
[0035]
Protein sorting by transport vesicles, such as endosomes, has important consequences for a variety of physiological processes. Examples of such processes include cell surface growth, biosynthesis of different intracellular organelles, endocytosis, and controlled secretion of hormones and neurotransmitters (Rothman, JE and Wieland, FT (1996) Science 272: 227-234). In particular, neurodegenerative disorders and other neuropathologies involve biochemical deficiencies during endosomal protein sorting or during endosome biosynthesis (Mayer RJ et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol). 389: 261-269).
[0036]
Peroxisomes are organelles that are independent of the secretory pathway. These are the sites of many oxidation reactions in the cell that produce peroxide. Peroxisomes are unique in size and number among eukaryotic cell organelles, and the enzymatic content varies depending on the organism, cell type and metabolic needs (Waterham, HR and Cregg, JM. 1997) BioEssays 19: 57-66). Genetic deficiencies in peroxisomal proteins result in peroxisome deficiency, and a number of examples of human pathologies associated with this deficiency include Zellweger syndrome, rhizomedic chondrodysplasia puncta, X chromosome linkage, There are adrenoleukodystrophy, acyl-CoA oxidase deficiency, double-headed enzyme deficiency, classic Refsum disease, DHAP alkyltransferase deficiency, and acatalaseemia (Moser, HW and Moser, AB (1996) Ann. NY Acad. Sci. 804: 427-441). See also Gartner, J. et al. Et al. (1991; Pediatr. Res. 29: 141-146) discovered a 22 kDa integral membrane protein associated with low density peroxisome-like subcellular fractionation in patients with Zellweger syndrome.
[0037]
A number of secreted proteins that modulate normal embryonic development and control of germ cell maturation interact with their respective membrane-bound receptors. Cell fate during embryonic development is determined by activin / TGF-β superfamily members, cadherins, IGF-2, and other morphogens. Also, proliferation, maturation, and redifferentiation of germ cells and reproductive tissues are regulated by, for example, IGF-2, inhibin, activin, and follistatins (Petraglia, F. (1997) Placenta 18: 3-). 8; Mather, JP et al. (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215: 209-222).
[0038]
ER membrane protein
The requirement for a normally functioning eukaryotic cell is that all newly synthesized proteins be correctly folded, modified, and delivered to specific intracellular and extracellular locations. The newly synthesized membrane proteins and secreted proteins enter the cell sorting / distribution network. This occurs during or shortly after synthesis, after which the protein is sent to specific locations inside and outside the cell. Examples of modifications that proteins undergo in the endoplasmic reticulum (ER), the first compartment of this process, include glycosylation, disulfide bond formation, and oligomerization. The modified protein is then transported through a series of membrane-bound compartments. An example of this compartment is the various lamellae of the Golgi, where further carbohydrate modification occurs. The means for effecting inter-compartmental transport are vesicle budding and fusion. Once in the secretory pathway, proteins do not need to cross membranes to reach the cell surface.
[0039]
The majority of proteins are processed in the ER and exported from the organelle, but some are retained. The signal to be retained in the ER consists of the tetrapeptide sequence KDEL in mammalian cells, which is located at the carboxyl terminus of the native ER membrane protein (Munro, S. (1986) Cell 46: 291-300). Proteins with the KDEL sequence exit the ER, but are immediately recovered from the initial Golgi lamina and return to the ER. On the other hand, proteins lacking this signal go through the secretory pathway.
[0040]
Disruption of the cellular secretory pathway has been implicated in several human diseases. In familial hypercholesterolemia, low-density lipoprotein receptors remain in the ER and do not migrate to the cell surface (Pathak, RK (1988) J. Cell Biol. 106: 1831-1841). Mutations in the transport and processing of β-amyloid precursor protein (βAPP) involve the putative vesicle transport protein presenilin and may also be involved in early-onset Alzheimer's disease (Levy-Lahad) , E. et al. (1995) Science 269: 973-977). Examples of diseases associated with altered ER-induced calcium homeostasis include cardiomyopathy, cardiac hypertrophy, myotonic dystrophy, Brody's disease, Smith-McCort dysplasia, and diabetes.
[0041]
Mitochondrial membrane protein
The mitochondrial electron transport system (ie, the respiratory chain) is a series of three enzyme complexes located in the mitochondrial membrane, which transports electrons from NADH to oxygen and couples this oxidizing action to ATP synthesis (oxidation). Phosphorylation). ATP then drives many of the cells' energy demanding reactions by providing a major source of energy.
[0042]
Most of the protein components of the mitochondrial respiratory chain are products of nuclear-encoded genes, which are imported into mitochondria, while other proteins are products of mitochondrial genes. A variety of conditions have been found in humans associated with deficient or altered expression of enzymes in the respiratory chain, examples of which include neurodegenerative diseases, myopathy (muscular diseases), and cancer.
[0043]
Lymphocyte and leukocyte membrane proteins
The response of B cells to antigens is an essential component of the normal immune system. Mature B cells recognize foreign antigens through B cell receptors (BCRs), which are specific, membrane-bound antibodies that bind foreign antigens. This antigen / receptor complex is taken up into cells and the antigen undergoes proteolytic processing. To generate an effective response to a complex antigen, all of the BCRs and BCR-associated proteins and T cell responses are required. Proteolytic fragments of the antigen form complexes with major histocompatibility complex II (MHC II) molecules on the surface of B cells. This complex can be recognized by T cells on the surface of B cells. On the other hand, macrophages and other lymphoid cells present antigens associated with MHC I molecules to T cells. T cells recognize and are activated by the MHC I-antigen complex, but this effect is due to interaction with the T cell receptor / CD3 complex. The latter complex is a T cell surface multimeric protein located at the plasma membrane. T cells activated by antigen presentation secrete various lymphokines. Lymphokines induce B cell maturation and T cell proliferation and activate macrophages that kill target cells.
[0044]
Leukocytes have a fundamental role in the inflammatory and immune responses and examples of leukocytes include monocytes / macrophages, mast cells, polymorphonuclear leukocytes, natural killer cells, neutrophils, eosinophils, basophils, And myeloid precursors. Examples of leukocyte membrane proteins include CD antigen members, N-CAM, I-CAM, human leukocyte antigen (HLA) class I and HLA class II gene products, immunoglobulins, immunoglobulin receptors, complement, complement receptor There are body, interferon, interferon receptor, interleukin receptor, and chemokine receptor.
[0045]
Examples of acute disorders associated with abnormal lymphocyte and leukocyte activity include AIDS, immunosensitivity, leukemia, leukopenia, systemic lupus, granulomatosis, and eosinophilia.
[0046]
Apoptosis-related membrane protein
A variety of ligands, receptors, enzymes, tumor suppressors, viral gene products, drugs, and inorganic ions have important positive or negative roles in regulating and performing apoptotic cell destruction. Although some specific components of the apoptotic pathway have already been identified and characterized, many interactions between the proteins involved are unclear, and key aspects of this pathway remain unknown.
[0047]
Previous studies showing the involvement of calcium levels in DNA breaks and Fas-mediated cell death suggested that calcium is required for apoptosis (Hewish, DR and LA Burgoyne (1973)). 52: 504-510; Vignaux, F. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 781-786; Oshimi, Y. and S. Miyazaki (1995) J.I. : 599-609). Another study shows that elevated intracellular calcium levels are seen when apoptosis is triggered by T-cell receptor cross-linking or glucocorticoids in thymocytes, and that blocking this increase prevents cell death. (McConkey, DJ, et al. (1989) J. Immunol. 143: 1801-1806; McConkey, DJ, et al. (1989) Arch. Biochem. Biophys. 269: 365-370). Thus, membrane proteins such as calcium channels and Fas receptors are important for the apoptotic response.
[0048]
The discovery of new transmembrane proteins and polynucleotides encoding them can provide new compositions and meet the needs of the art. These novel compositions are useful in the diagnosis, treatment and prevention of reproductive disorders, developmental disorders, cardiovascular disorders, neurological disorders, gastrointestinal disorders, lipid metabolism disorders, abnormal cell proliferation, and autoimmune / inflammatory diseases. It is also useful for calculating the effect of a group of exogenous compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of transmembrane proteins.
[0049]
(Summary of the Invention)
The present invention generally refers to "TMP", and individually refers to "TMP-1," "TMP-2," "TMP-3," "TMP-4," "TMP-5," and "TMP-6." , "TMP-7", "TMP-8", "" TMP-9 "," TMP-10 "," TMP-11 "," TMP-12 "," TMP-13 "," TMP-14 ", Provided are purified polypeptides that are transmembrane proteins called "TMP-15", "TMP-16", and "TMP-17". In certain embodiments, the present invention provides a polypeptide selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; (b) a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a natural amino acid sequence having at least 90% identity to an amino acid sequence; (c) a biological sequence of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. An isolated polypeptide selected from the group consisting of: an active fragment; and (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. . In one embodiment, the invention provides an isolated polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-17.
[0050]
The present invention also relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 17, and (b) a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 17. A polypeptide having at least 90% identity with a native amino acid sequence, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17 Or (d) an immunogenic fragment of a polynucleotide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, which encodes a polypeptide selected from the group consisting of A polynucleotide is provided. In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34.
[0051]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a certain amino acid sequence having at least 90% identity to (c) a biologically active fragment of a polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of The present invention provides a recombinant polynucleotide having a promoter sequence linked to In one embodiment, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant having the recombinant polynucleotide.
[0052]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a certain natural amino acid sequence having at least 90% identity with the sequence, and (c) a biology of a polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17. A method for producing a polypeptide selected from the group consisting of: an active fragment; and (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. . The production method comprises the steps of (a) culturing a cell under conditions suitable for expression of the polypeptide and transforming the cell with a recombinant polynucleotide; Recovering the peptide. The recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide.
[0053]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having at least 90% identity with a natural amino acid sequence; (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; (D) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; an isolated antibody that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of I will provide a.
[0054]
The invention further relates to (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. A polynucleotide having at least 90% identity with a natural polynucleotide sequence, a polynucleotide complementary to (c) (a), a polynucleotide complementary to (d) (b), and (e) C) providing an isolated polynucleotide selected from the group consisting of: RNA equivalents of (a)-(d). In one embodiment, the polynucleotide consists of at least 60 contiguous nucleotides.
[0055]
The present invention further provides one method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide was selected from the group consisting of (a) a polynucleotide having a certain polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34, and (b) the polynucleotide having a certain polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34. A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to a polynucleotide sequence, (c) a polynucleotide complementary to (a), (d) a polynucleotide complementary to (b), And (e) an RNA equivalent of (a) to (d). The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe consisting of at least 20 contiguous nucleotides consisting of a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; (b) Detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. The probe hybridizes specifically to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide or a fragment thereof. In one embodiment, the probe consists of at least 60 contiguous nucleotides.
[0056]
The present invention also provides one method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34, and (b) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to a sequence, a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (c) (a), a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (d) (b). A sequence of a polynucleotide selected from the group consisting of nucleotides and (e) RNA equivalents of (a) to (d). The detection method includes: (a) a process of amplifying a target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification; and (b) detecting presence or absence of the amplified target polynucleotide or a fragment thereof, and detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof. If present, optionally detecting its amount.
[0057]
The present invention further provides certain compositions comprising an effective amount of the polypeptide and certain pharmaceutically acceptable excipients. An effective amount of a polypeptide is (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide comprising a naturally occurring amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence; (c) a biological activity of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. In one embodiment, the composition has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. The present invention further provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional TMP, comprising administering the composition to a patient in need of such treatment. .
[0058]
The present invention also provides (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a natural amino acid sequence having at least 90% identity with (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; and (d) A) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, in order to confirm the efficacy of a polypeptide selected from the group consisting of Methods for screening compounds are provided. The screening method comprises (a) exposing a sample having the polypeptide to a certain compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an agonist compound identified in this way and an acceptable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method comprising administering the composition to a patient in need of treatment for a disease or condition associated with reduced expression of functional TMP.
[0059]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a natural amino acid sequence having at least 90% identity with (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; and (d) 2.) Screening a compound for the effectiveness as a antagonist of a polypeptide selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. Provide a way. The screening method comprises (a) exposing a sample containing the polypeptide to a certain compound, and (b) detecting antagonist activity in the sample. In another embodiment, the invention provides a composition comprising the antagonist compound identified in this way and a pharmaceutically acceptable excipient. In yet another alternative, the invention provides a method comprising administering the composition to a patient in need of treatment for a disease or condition associated with overexpression of functional TMP.
[0060]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having at least 90% identity with a natural amino acid sequence, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, or (D) a method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; provide. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under appropriate conditions; and (b) detecting the binding of the test compound to the polypeptide, thereby providing the polypeptide with Identifying a compound that specifically binds.
[0061]
The present invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A polypeptide having a certain amino acid sequence having at least 90% identity; (c) a biologically active fragment of a polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; (D) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17, a compound modulating the activity of a polypeptide selected from the group consisting of A method for screening is provided. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under conditions acceptable for the activity of the polypeptide; and (b) determining the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide in the absence of the test compound. An alteration in the activity of the polypeptide below indicates a compound that modulates the activity of the polypeptide.
[0062]
The invention further provides a method of screening a compound for the effect of altering the expression of a target polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. The method comprises: (a) exposing a sample having the target polynucleotide to a compound; and (b) detecting a modification in the expression of the target polynucleotide.
[0063]
The present invention further provides a method for determining the toxicity of a test compound. This method includes the following steps. (A) treating a biological sample having a nucleic acid group with a test compound; (B) A step of hybridizing the nucleic acid group of the treated biological sample. In this process, the following probes are used. (I) a polynucleotide having a certain polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34, and (ii) a polynucleotide having a certain polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18-34. A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having a polynucleotide sequence with 90% identity, a polynucleotide having a sequence complementary to (iii) (i), a polynucleotide having a sequence complementary to (iv) (ii) A probe consisting of at least 20 contiguous nucleotides of a polynucleotide selected from the group consisting of polynucleotides, (v) RNA equivalents of (i)-(iv). Hybridization occurs under conditions such that a particular hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in a biological sample. The target polynucleotide is (i) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34, and (ii) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to a polynucleotide sequence, (iii) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (i), a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (iv) (ii). And (v) RNA equivalents of (i) to (iv). Alternatively, the target polynucleotide has a fragment of a polynucleotide sequence selected from the group consisting of (i) to (v) above. The toxicity calculation method further includes the following process. (C) quantifying the amount of hybridization complex and (d) comparing the amount of hybridization complex in the treated biological sample to the amount of hybridization complex in the untreated biological sample. Process. Differences in the amount of hybridization complex in the treated biological sample indicate the toxicity of the test compound.
[0064]
(About the description of the present invention)
Before describing the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention, it is to be understood that the invention is not limited to the particular devices, materials and methods described, as such may be modified. It is also understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which is limited only by the claims. Please understand at the same time.
[0065]
As used in the claims and the specification, the singular forms “a” and “the” may refer to the plural unless the context clearly dictates otherwise. Note that Thus, for example, when referring to "a certain host cell", there may be a plurality of such host cells, and when "a certain antibody" is described, one or more antibodies, and Reference is also made to equivalents of antibodies known to those skilled in the art.
[0066]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise defined. Although any apparatus, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, the preferred devices, materials, and methods are now described. All publications mentioned in the present invention are cited for the purpose of describing and disclosing the cells, protocols, reagents and vectors that are reported in the publications and that may be of interest to the present invention. . Nothing herein is an admission that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0067]
(Definition)
The term "TMP" refers to substantially purified, such as natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, and obtained from all species (particularly mammals including cows, sheep, pigs, rats, horses and humans). Refers to the amino acid sequence of TMP.
[0068]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of TMP. Examples of agonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, or any protein that interacts directly with TMP or acts on a component of a biological pathway involving TMP to modulate the activity of TMP. There can be other compounds and compositions.
[0069]
“Allelic variant / mutant sequence” is another form of the gene encoding TMP. Allelic variant sequences can result from at least one mutation in a nucleic acid sequence and can result in altered mRNAs or polypeptides, and the structure of those polypeptides Or, the function may or may not change. A gene may have no, or more than one, of its natural allelic variant. The usual mutagenic changes that give rise to allelic variant sequences are generally due to natural deletions, additions or substitutions of nucleotides. These various changes, alone or with other changes, may occur more than once in an arrangement.
[0070]
The sequence included in the “altered / altered” nucleic acid sequence encoding TMP is a sequence in which various nucleotide deletions, insertions, or substitutions have occurred, and the same polypeptide as TMP or A sequence that results in a polypeptide having at least one of the functional properties. This definition includes improper or unexpected hybridization with an allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus for the TMP-encoding polynucleotide sequence, and also includes the TMP-encoding polynucleotide. Includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using certain oligonucleotide probes. The encoded protein may also be "altered / altered" and may have deletions, insertions or substitutions of amino acid residues such that a silent change results in a functionally equivalent TMP. . Intentional amino acid substitutions are similar to residues in terms of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as TMP activity is retained biologically or immunologically. It can be done based on For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids having uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, and serine and threonine. Amino acids having uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine and isoleucine and valine, glycine and alanine, and phenylalanine and tyrosine.
[0071]
The terms "amino acid" and "amino acid sequence" refer to the sequence of an oligopeptide, peptide, polypeptide, protein, or any fragment thereof, and refer to a natural or synthetic molecule. When "amino acid sequence" refers to the sequence of a native protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the protein molecule described.
[0072]
The term "amplification" relates to the act of making additional copies of a nucleic acid sequence. Amplification generally employs the polymerase chain reaction (PCR) technique known to those skilled in the art.
[0073]
The term "antagonist" refers to a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of TMP. Examples of antagonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any antibodies, such as antibodies, that interact directly with TMP or act on a component of a biological pathway involving TMP to modulate the activity of TMP. It may contain other compounds and compositions.
[0074]
The term "antibody" refers to intact immunoglobulin molecules or fragments thereof, e.g., Fab, F (ab ') 2 and Fv fragments, that can bind determinants of an epitope. Antibodies that bind to a TMP polypeptide can be prepared using an intact polypeptide or a fragment containing the small peptide of interest as the immunizing antigen. The origin of the polypeptides or oligopeptides used to immunize animals such as mice, rats, rabbits and the like may be in the case of translation of RNA or by chemical synthesis. Also, they can be conjugated to a carrier protein if desired. Examples of commonly used carriers that chemically bond to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemocyanin (KLH). The conjugated peptide is used to immunize the animal.
[0075]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that contacts a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, a number of regions of the protein can trigger the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a particular region or three-dimensional structure of the protein). Certain antigenic determinants can compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) for binding to certain antibodies.
[0076]
The term "aptamer" refers to a nucleic acid or oligonucleotide molecule that binds to a specific molecular target. Aptamers arein in vitro(Eg, SELEX, short for Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, in vitro selection method), described in US Pat. No. 5,270,163. This is the process of selecting target-specific aptamer sequences from a large set of combinatorial libraries. Aptamer configurations can be double-stranded or single-stranded and can include deoxyribonucleotides, ribonucleotides, nucleotide derivatives or other nucleotide-like molecules. Each nucleotide component of the aptamer may have a modified sugar group (eg, the 2'-OH group of a ribonucleotide is 2'-F or 2'-NH₂Which may improve desired properties, such as resistance to nucleases or longer lifespan in the blood. Conjugation of the aptamer with other molecules, such as high molecular weight carriers, can slow the clearance of this aptamer from the circulation. Aptamers can be specifically cross-linked with their cognate ligand group, for example, by photoactivation of certain cross-linkers (eg, Brody, EN and L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74: 5). -13).
[0077]
The term "intramer"in VivoRefers to the aptamer expressed in For example, certain RNA aptamers are expressed at high levels in the cytoplasm of leukocytes using certain RNA expression systems based on vaccinia virus (Blind, M. et al. (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA). 96: 3606-3610).
[0078]
The term "spiegelmer" refers to an aptamer that includes L-DNA, L-RNA or other levorotatory nucleotide derivatives or levorotatory nucleotide-like molecules. Aptamers with levorotatory nucleotides are normally resistant to degradation by natural enzymes that act on substrates with dextrorotatory nucleotides.
[0079]
The term "antisense" refers to any composition capable of forming base pairs with the sense (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Examples of antisense compositions include DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), oligonucleotides having modified backbone linkages such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, and modified sugar groups such as Oligonucleotides having 2'-methoxyethyl sugar or 2'-methoxyethoxy sugar or oligonucleotides having modified bases such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine There can be. Antisense molecules can be produced by any method, including chemical synthesis or transcription. Complementary antisense molecules, when introduced into a cell, base pair with the native nucleic acid sequence produced by the cell, forming a duplex that prevents transcription or translation. The expression "negative" or "minus" may refer to the antisense strand of a reference DNA molecule, and the expression "positive" or "plus" may refer to the sense strand of a reference DNA molecule.
[0080]
The term "biologically active" refers to a protein that has a structural, regulatory, or biochemical function of a natural molecule. Similarly, the terms "immunologically active" or "immunogenic" refer to natural or recombinant TMPs, synthetic TMPs, or any oligopeptides thereof, for which a particular immune response in a suitable animal or cell is appropriate. And the ability to bind to a particular antibody.
[0081]
The term "complementary" refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, "5'-AGT-3 '" forms a pair with its complementary sequence "3'-TCA-5'".
[0082]
“Composition comprising (having) a polynucleotide sequence of” or “composition comprising (having) an amino acid sequence of” in a broad sense refers to any composition having the polynucleotide or amino acid sequence of interest. . The composition may include a dry formulation or an aqueous solution. Compositions having a polynucleotide sequence encoding TMP or a fragment of TMP can be used as hybridization probes. These probes can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, a probe is dispersed in an aqueous solution having a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS) and other components (eg, denhardt's solution, milk powder, DNA of salmon sperm, etc.). be able to.
[0083]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to remove unnecessary bases, extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (Applied Biosystems, Foster City CA), and sequenced again. One or more overlapping cDNAs or ESTs using a computer program for fragment construction, such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). , Or a nucleic acid sequence constructed from genomic DNA fragments. Some sequences both extend and assemble to produce a consensus sequence.
[0084]
The term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution that is expected to change little the properties of the original protein. That is, the structure of the protein, especially its function, is conserved, and does not change much by its substitution. The following table shows the amino acids that can be substituted for the original amino acid in the protein and that are recognized as conservative amino acid substitutions.

Conservative amino acid substitutions typically involve (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, such as a β-sheet or α-helical structure, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) the side chain For the most part, hold.
[0085]
The term "deletion" refers to a change in the amino acid sequence that results in the deletion of one or more amino acid residues, or a change in the nucleotide sequence that lacks one or more nucleotides.
[0086]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. For example, replacement of hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group can be included in chemical modification of a polynucleotide. Certain polynucleotide derivatives encode certain polypeptides that retain at least one of the biological or immunological functions of the natural molecule. A polypeptide derivative is a polypeptide that has been modified by the following process. That is, glycosylation, polyethyleneglycation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function of the polypeptide from which it is derived.
[0087]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of generating a measurable signal and that is covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0088]
"Differential expression" refers to increased (up-regulation) or decreased (down-regulation) or defective gene or protein expression as determined by comparing at least two different samples. Such comparisons can be made, for example, between a treated sample and an untreated sample, or between a disease state sample and a healthy sample.
[0089]
"Exon shuffling" refers to the recombination of different coding regions (exons). Certain exons can represent one structural or functional domain of the encoded protein, so that new combinations of stable substructures can form new proteins and new protein functions Can promote evolution.
[0090]
The term "fragment" refers to a unique portion of TMP or a polynucleotide encoding TMP that is identical in sequence to its parent sequence but shorter in length than the parent sequence. A fragment may have a length that is less than the defined length of the sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. Certain fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes may be at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, It can be 150, 250 or 500 contiguous nucleotides or amino acid residues. Fragments can be preferentially selected from particular regions of a molecule. For example, a polypeptide fragment is a continuous stretch of a length selected from the first 250 or 500 amino acids (or the first 25% or 50%) of a polypeptide as found in a defined sequence. Can have a different amino acid. These lengths are clearly given by way of example and in embodiments of the present invention may be any length supported by the description including the sequence listings, tables and figures.
[0091]
A fragment of SEQ ID NO: 18-34 has, for example, a region of a unique polynucleotide sequence that specifically identifies SEQ ID NO: 18-34, different from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. . Certain fragments of SEQ ID NO: 18-34 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 18-34 from related polynucleotide sequences. The exact length of a fragment of SEQ ID NO: 18-34, and the region of SEQ ID NO: 18-34 corresponding to that fragment, is routinely determined by one of ordinary skill in the art based on the intended purpose for the fragment. Can decide.
[0092]
Certain fragments of SEQ ID NOs: 1-17 are encoded by certain fragments of SEQ ID NOs: 18-34. Certain fragments of SEQ ID NO: 1-17 include a region of a unique amino acid sequence that specifically identifies SEQ ID NO: 1-17. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-17 are useful as immunogenic peptides in the development of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-17. The exact length of a fragment of SEQ ID NO: 1-17 and the region of SEQ ID NO: 1-17 corresponding to this fragment are routinely determined by one skilled in the art based on the purpose of the fragment. I can do it.
[0093]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine) followed by one open reading frame and a translation stop codon. A "full-length" polynucleotide sequence encodes a "full-length" polypeptide sequence.
[0094]
The term "homology" refers to sequence similarity, interchangeability, or sequence identity between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0095]
The term "percent match" or "% match" as applied to polynucleotide sequences refers to the percentage of residues that match between two or more polynucleotide sequences, aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm can insert gaps in the compared sequences in a standardized and reproducible manner so as to optimize the alignment between the two sequences, so that the two sequences can be compared more significantly.
[0096]
The default parameter group of the CLUSTAL V algorithm incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program or the like can be used to determine the percent identity between polynucleotide sequences. This program is part of the LASERGENE software package (a set of molecular biological analysis programs) (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is available from Higgins, D.W. G. FIG. And P. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Higgins, D .; G. FIG. (1992) CABIOS 8: 189-191. Default parameters for pairwise alignment of polynucleotide sequences are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. The "weighted" residue weight table is selected by default. Reports of percent identity by CLUSTAL V are reported as "percent similarity" between the aligned polynucleotide sequences.
[0097]
Alternatively, the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) of the US National Center for Biotechnology Information (NCBI) is commonly used and provides a complete set of freely available sequence comparison algorithms (Altschul, SF. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). This algorithm is available from several sources, and is also available from NCBI, located in Bethesda, MD and the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The BLAST software suite includes a variety of sequence analysis programs, including "blastn" used to align a known polynucleotide sequence with another polynucleotide sequence in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is also available, which is used to compare two nucleotide sequences directly pairwise. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / bl2. html and can be used interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). The BLAST program generally uses gaps and other parameters set to default settings. For example, to compare two nucleotide sequences, blastn can be performed using the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set to default parameters. An example of setting default parameters is shown below.
[0098]
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for Mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
The percent identity can be measured over the entire length of a defined sequence (eg, the sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, the percent identity of shorter lengths, eg, fragments obtained from a defined, larger sequence (eg, fragments of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100, or 200 contiguous nucleotides) Can also be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and any fragment length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, may be used to determine percent identity. It should be understood that certain lengths can be described.
[0099]
Nucleic acid sequences that do not exhibit a high degree of identity may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is to be understood that this degeneracy can be used to effect changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences, all of which encode substantially the same protein.
[0100]
The term “percent identity” or “percent identity” as used for polypeptide sequences refers to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. There are also alignment methods that take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as detailed above, typically conserve the charge and hydrophobicity of the substitution site, thus preserving the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0101]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as that incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (described above with references). Default parameters for pairwise alignment of polypeptide sequences using CLUSTAL V are set to Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, the percent identity of aligned polypeptide sequence pairs is reported by CLUSTAL V as "percent similarity".
[0102]
Alternatively, the NCBI BLAST software suite may be used. For example, when comparing two polypeptide sequences on a pair-wise basis, blastp of the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) can be used with default parameters set. An example of setting default parameters is shown below.
[0103]
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
Identity can be measured over the entire length of a defined polypeptide sequence (eg, a sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, shorter lengths, eg, fragments obtained from a defined, larger polypeptide sequence (eg, a fragment of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70, or 150 contiguous residues) Can also be determined. The lengths listed here are merely exemplary, and any fragment length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, may be used to determine percent identity. It should be understood that certain lengths can be described.
[0104]
“Human artificial chromosomes (HACs)” are linear microchromosomes that can have a DNA sequence of about 6 kb to 10 Mb in size. It also has all the elements necessary for chromosome replication, segregation and maintenance.
[0105]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been modified to resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0106]
"Hybridization" is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide base pairs with a complementary single-strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization is an indication that two nucleic acid sequences share high complementarity. Specific hybridization complexes are formed under acceptable annealing conditions and remain hybridized after one or more "wash" steps. The washing step is particularly important in determining the stringency of the hybridization process; under more stringent conditions, non-specific binding (ie, binding between pairs of nucleic acid strands that do not perfectly match) is reduced. The permissive conditions for annealing a nucleic acid sequence can be routinely determined by those skilled in the art. Annealing conditions may be constant for any hybridization experiment, but washing conditions may vary from experiment to experiment to obtain the desired stringency, and thus hybridization specificity. Acceptable annealing conditions include, for example, at a temperature of 68 ° C. in the presence of about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS, and about 100 μg / ml of shear denatured salmon sperm DNA. is there.
[0107]
In general, the stringency of hybridization can be expressed, in part, in reference to the temperature at which the washing step is performed. Such washing temperatures are usually selected to be about 5-20 ° C. below the melting point (Tm) of the particular sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under the conditions of a predetermined ionic strength and pH. The formula for calculating Tm and nucleic acid hybridization conditions are well known and are described in Sambrook, J .; Others (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, particularly see Volume 9, Chapter 9.
[0108]
Hybridization under high stringency conditions between polynucleotides of the invention includes washing conditions at 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 0.1% SDS. Alternatively, it may be performed at a temperature of about 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, or 42 ° C. The SSC concentration can vary from about 0.1 to 2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking agents are used to block non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, sheared denatured salmon sperm DNA at about 100-200 μg / ml. Under certain conditions, for example, for hybridization of RNA and DNA, an organic solvent such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can also be used. Useful variations of washing conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, especially under high stringency conditions. Such similarities strongly indicate a similar role for the nucleotides and for the polypeptides they encode.
[0109]
The term "hybridization complex" refers to a complex between two nucleic acid sequences formed by the formation of hydrogen bonds between complementary bases. Hybridization complexes can be formed in solution (C₀t or R₀t analysis). Alternatively, one nucleic acid sequence is in solution and the other nucleic acid sequence is on a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin or glass slide, or other suitable substrate and the cells or their cells). (A substrate on which the nucleic acid is immobilized).
[0110]
The term "insertion" or "addition" refers to a change in an amino acid or nucleic acid sequence where one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0111]
"Immune response" can refer to a condition associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious or genetic diseases, and the like. These conditions can be characterized by the expression of various factors that can affect cells and the system of defense, such as cytokines, chemokines and other signaling molecules.
[0112]
The term "immunogenic fragment" refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of TMP that can elicit an immune response when introduced into an organism, such as a mammal. The term “immunogenic fragment” also includes any polypeptide or oligopeptide fragment of TMP useful herein for any of the methods for producing antibodies disclosed herein or known in the art.
[0113]
The term "microarray" refers to an arrangement of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0114]
The term "element" or "array element" refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound that has a unique, designated location on a microarray.
[0115]
The terms "modulate" or "modulate activity" refer to a change in the activity of TMP. For example, modulation can cause an alteration in the protein activity or binding properties of TMP, or other biological, functional or immunological properties.
[0116]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” also refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that can be single-stranded or double-stranded or represent the sense or antisense strand. Or peptide nucleic acid (PNA) or any DNA-like or RNA-like substance.
[0117]
"Operably linked" refers to the state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription or expression of the coding sequence. The operably linked DNA sequences can be very close or contiguous, and can be in the same reading frame, if necessary to join the two protein-coding regions.
[0118]
"Peptide nucleic acid (PNA)" refers to an antisense molecule or an antigenic agent having an oligonucleotide at least about 5 nucleotides in length attached to the peptide backbone at amino acid residues terminating in lysine. Terminal lysine confers solubility to the composition. PNAs preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcription elongation. Polyethylene glycolation can extend the life of PNA in cells.
[0119]
"Post-translational modifications" of a TMP may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of TMP and will vary from cell type to cell type.
[0120]
The term "probe" refers to a nucleic acid sequence encoding TMP, its complementary sequence, or a fragment thereof, which is used to detect the same or allelic nucleic acid sequence or a related nucleic acid sequence. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioisotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. The primer can then be extended along the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs can be used for amplification (and identification) of nucleic acid sequences, for example, by the polymerase chain reaction (PCR).
[0121]
Probes and primers for use in the invention usually consist of at least 15 contiguous nucleotides of known sequence. To increase specificity, longer probes and primers, such as those consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences, Primers may also be used. Some probes and primers are considerably longer. It is to be understood that any length of nucleotides supported herein, including tables, figures and sequence listings, may be used.
[0122]
For methods of preparing and using probes and primers, see Sambrook, J. et al. Others (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.C. M. Other (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Green Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis, M .; Others (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA, and the like. To obtain a PCR primer pair from a known sequence, for example, a computer program therefor, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA) can be used.
[0123]
The selection of oligonucleotides to use as primers is made using software well known in the art for such purpose. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs of up to 100 nucleotides each, and oligonucleotide and up to 5,000 larger polynucleotides, up to 32 kilobases of the input polynucleotide sequence. It is also useful for analyzing the results obtained from. Similar primer selection programs incorporate additional features for expansion capabilities. For example, the PrimOU Primer Selection Program (available publicly from the Genome Center at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) is capable of selecting specific primers from megabase sequences and thus spans the entire genome. Useful for designing primers. Using the Primer3 primer selection program (available from the Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research (Cambridge, Mass.)), A "non-priming library" that can specify the sequence to be avoided as a primer binding site can be input. Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs can be obtained from their respective sources and modified to meet user-specific needs). The PrimerGen program (available publicly from the UK Human Genome Mapping Project-Resource Center in Cambridge, UK) designs the primers based on multiple sequence alignments to maximize or conserve the aligned nucleic acid sequences. Allows selection of primers that hybridize with any of Thus, the program is useful for identifying oligonucleotide and polynucleotide fragments, whether unique or conserved. Oligonucleotide and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods can be used to identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, for example, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe to perform. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0124]
A "recombinant nucleic acid" is a sequence that is not a native sequence, but rather an artificial combination of two or more separate segments of the sequence. This artificial combination is often achieved by chemical synthesis, but more generally by artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, for example, by genetic engineering techniques as described in Sambrook, supra. I do. The term recombinant nucleic acid also includes a nucleic acid in which a part of the nucleic acid is simply modified by addition, substitution or deletion. Often, a recombinant nucleic acid includes a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can form part of a vector used, for example, to transform a cell.
[0125]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid can be part of a viral vector, for example, based on vaccinia virus. Such a vector can be inoculated into a mammal and the recombinant nucleic acid expressed and used to induce a protective immune response in the mammal.
[0126]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, including enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that control transcription, translation or RNA stability.
[0127]
A "reporter molecule" is a chemical or biochemical component used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and other components known in the art.
[0128]
An "RNA equivalent" for a DNA sequence consists of the same linear nucleotide sequence as the reference DNA sequence, but all the resulting nitrogenous bases, thymine, are replaced with uracil and the backbone of the sugar chain is deoxyribose. But not ribose.
[0129]
The term "sample" is used in its broadest sense. Some samples presumed to contain TMPs, nucleic acids encoding TMPs, or fragments thereof include body fluids, cells and chromosomes isolated from cells, extracts from organelles and membranes, There may be cells, genomic DNA, RNA, cDNA present in solution or immobilized on a substrate, tissues, tissue prints, and the like.
[0130]
The terms "specific binding" and "specifically bind" refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction depends on the presence or absence of a particular structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if an antibody is specific for epitope "A", then in a reaction involving unbound labeled "A" and the antibody, the polypeptide comprising epitope A, or The presence of unlabeled "A" reduces the amount of labeled A that binds to the antibody.
[0131]
The term "substantially purified" refers to an isolated or isolated nucleic acid or amino acid sequence taken from the natural environment, wherein at least about 60% of the naturally associated composition has been removed. Preferably at least about 75% removed, most preferably at least 90% removed.
[0132]
"Substitution" refers to the replacement of one or more amino acid residues or nucleotides with another amino acid residue or nucleotide, respectively.
[0133]
The term "substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate may have various surface morphologies such as wells, grooves, pins, channels, holes, etc., and polynucleotides and polypeptides are bound to the substrate surface.
[0134]
“Transcription image” or “expression profile” refers to the collective pattern of gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under a given condition.
[0135]
"Transformation" refers to the process by which exogenous DNA is introduced into a recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to a variety of methods known in the art, and include any known method for inserting an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. Method. The method of transformation is selected depending on the type of host cell to be transformed. Transformation methods include, but are not limited to, viral infection, electroporation, heat shock, lipofection, and microprojectile bombardment. "Transformed cells" include stably transformed cells in which the introduced DNA is replicable, either as an autonomously replicating plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that transiently express the introduced DNA or introduced RNA for a limited period of time are also included.
[0136]
As used herein, a "genetically transformant" is any organism, including, but not limited to, animals and plants, wherein one or more cells of the organism are subject to human intervention, e.g., in the art. An organism having a heterologous nucleic acid introduced by a known transformation technique. The introduction of the nucleic acid into the cell is performed by directly or indirectly introducing into the precursor of the cell. This is done by deliberate genetic manipulation, for example by microinjection or by introduction of a recombinant virus. The term genetic manipulation refers to classical cross breeding orin in vitroIt does not refer to fertilization, but refers to the introduction of a recombinant DNA molecule. Genetic transformants contemplated according to the present invention include bacteria, cyanobacteria, fungi and plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are known and described in references such as Sambrook et al. (1989), supra.
[0137]
A "variant / variant sequence" of a particular nucleic acid sequence is determined as a nucleic acid sequence having at least 40% sequence identity to the particular nucleic acid sequence over a certain length of one nucleic acid sequence. Is an array. For the determination, blastn is executed by using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as the default parameter. Such a nucleic acid pair can be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may exhibit 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity. Variant sequences can be described, for example, as "allelic" variant sequences (described above) or "splice" variant sequences, "species" variant sequences, "polymorphic" variant sequences. Although splice variant sequences may have significant identity to a reference molecule, alternative splicing of groups of exons during mRNA processing usually results in having more or fewer polynucleotides. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack the domains present in the reference molecule. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides usually have significant amino acid identity to one another. A polymorphic variant sequence is a variation within the polynucleotide sequence of a particular gene between certain individuals. Polymorphic variant sequences may also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which one nucleotide base of the polynucleotide sequence differs. The presence of a SNP may be indicative of, for example, a particular population, condition or propensity for a condition.
[0138]
A “variant sequence” of a particular polypeptide sequence is a sequence determined as a polypeptide sequence having at least 40% sequence identity to the particular polypeptide sequence over a certain length of one polypeptide sequence It is. For the determination, blastp is executed by using a “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as a default parameter. Such a polypeptide pair can be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, for one predetermined length of the polypeptide. , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
[0139]
(invention)
The present invention is based on the discovery of a novel group of human transmembrane proteins (TMPs) and polynucleotides encoding TMPs, and uses these compositions to provide abnormal cell proliferation, autoimmune / inflammatory diseases, cardiovascular Based on the development of diagnosis, treatment, and prevention of disorders, neurological disorders, and developmental disorders.
[0140]
Table 1 is a summary of the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide corresponds to one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was designated by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was designated by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO :) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
[0141]
Table 2 shows sequences homologous to the polypeptides of the invention, identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) for each polypeptide of the present invention and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Column 3 shows the GenBank identification number (GenBank ID NO :) of the closest GenBank homolog. Column 4 shows the probability score for a match between each polypeptide and one or more of its homologs. Column 5 shows appropriate citations where applicable and indicates one or more annotations of the GenBank homologs, all of which are incorporated herein by reference.
[0142]
Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues in each polypeptide. Rows 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI) of the GCG sequence analysis software package. Column 6 shows the amino acid residues that contain the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for the analysis of the structure / function of the protein, and in the corresponding part, a searchable database used for the analysis method.
[0143]
Tables 2 and 3 together summarize the properties of each of the polypeptides of the invention, which properties establish that the claimed polypeptides are transmembrane proteins. For example, SEQ ID NO: 2 has been shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 89% identity with rat prostaglandin F2a receptor modulatory protein (GenBank ID g1054884) (Table 2). reference). The BLAST probability score is 0.0, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 2 also has six immunoglobulin domain groups, which search for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM) (See Table 3). In addition, SEQ ID NO: 2 has a signal peptide, one transmembrane domain, and one RGD motif, which provides further empirical evidence that SEQ ID NO: 2 is a human transmembrane protein I do.
[0144]
As another example, SEQ ID NO: 4 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 56% identity to human connexin 31.1 (GenBank ID g4336903) (see Table 2). ). The BLAST probability score is 5.8e-68, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 4 also has one connexin domain, which searches for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM). Decided (see Table 3). Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide more empirical evidence that SEQ ID NO: 4 is a connexin. Note that six identical connexins constitute one connexon (gap junction), a transmembrane channel that resides in the plasma membrane, functions chemically and electrically, and is involved in many tissues. Binding cytoplasm between adjacent cells. SEQ ID NO: 5 is 1554 amino acids in length and has 99% identity to human MEGF7 (GenBank ID g3449306) over 1157 amino acids, as shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (see Table 2). ). The BLAST probability score is 0.0, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 5 also has a family of low-density lipoprotein receptor repeats and a group of low-density lipoprotein receptor domains, which consist of a conserved protein family domain based on a hidden Markov model (HMM). Were determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database (see Table 3). The data obtained from BLIMPS analysis provides further evidence that SEQ ID NO: 5 is a member of the LDL receptor family of proteins.
[0145]
In another example, SEQ ID NO: 6 has a 36% identity with the mouse low-density lipoprotein receptor-related protein LRP1B / LRP-DIT (GenBank ID g8926263), as identified by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). (See Table 2). The BLAST probability score is 1.5e-40, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance. SEQ ID NO: 6 also has low-density lipoprotein receptor domain clusters, which finds statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on Hidden Markov Models (HMM) (See Table 3). The data obtained from BLIMPS analysis provides further evidence that SEQ ID NO: 6 is a low-density lipoprotein receptor-related molecule. In addition, SEQ ID NO: 14 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 59% identity with human TNF-inducible protein CG12-1 (GenBank ID g397246) (see Table 2). The BLAST probability score is 1.2e-94, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. The data from the HMMER analysis provides further empirical evidence that SEQ ID NO: 14 has one transmembrane domain. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7-13, and SEQ ID NO: 15-17 were analyzed and annotated in a similar manner. The algorithm and parameters for the analysis of SEQ ID NOs: 1-17 are described in Table 7.
[0146]
As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequence of the present invention was constructed using a cDNA sequence or a coding (exon) sequence derived from genomic DNA, or by arbitrarily combining these two types of sequences. Columns 1 and 2 show the polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID) for each polynucleotide of the invention. Column 3 shows the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Column 4 shows hybridization or fragmentation of the polynucleotide sequence to identify, for example, SEQ ID NOs: 18-34 or to distinguish SEQ ID NOs: 18-34 from related polynucleotide sequences. Shows fragments useful for amplification techniques. Column 5 shows the identification number corresponding to the cDNA sequence, or the coding sequence (exon) predicted from genomic DNA, and / or the identification number corresponding to the sequence set having both cDNA and genomic DNA. These sequences were used to construct the full length polynucleotide sequences of the present invention. Columns 6 and 7 of Table 4 indicate the starting nucleotide (5 ') and ending nucleotide (3') positions of the cDNA and / or genomic sequences of column 5, respectively, relative to their full-length sequences.
[0147]
The identification numbers in column 5 of Table 4 may particularly refer to, for example, Incyte cDNA and its corresponding cDNA library. For example, 6798827J1 is the identification number of the Incyte cDNA sequence, and COLENOR03 is the identification number of the cDNA library from which the sequence is derived. Incyte cDNAs for which no cDNA library is shown (eg, 71760758V1) are derived from a pooled cDNA library. Alternatively, the identification number in column 5 may be the GenBank cDNA or EST identification number used to construct the full-length polynucleotide sequence (eg, g1506355). Further, the identification number in column 5 may indicate a sequence from the ENSEMBL (The Sanger Center, Cambridge, UK) database (ie, a sequence containing the designation "ENST"). Alternatively, the identification number in column 5 may be from the NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records database (ie, a sequence that includes the designation "NM" or "NT"), or may be from the NCBI RefSeq Protein Sequences (if it is from NCBI RefSeq Protein Sequence Records). That is, a sequence containing the designation "NP"). Alternatively, the identification number in column 5 may refer to the group consisting of both the cDNA and the Genscan predicted exon, combined by the "exon-stitching" algorithm. For example, FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄ Is the "stitched" sequence, where XXXXXX is the identification number of the cluster of sequences to which the algorithm applies, YYYYY is the number of predictions that the algorithm generates, and N_{1,2,3. . .}If present, represents a particular group of exons that were manually edited during the analysis (Example 5reference). Alternatively, the identification number in column 5 may refer to a set of exons connected by an “exon-stretching” algorithm. For example, FLXXXXXX_gAAAAAA_gBBBBBB_1_N is the identification number of the “stretch” sequence. Here, XXXXXX is the Incyte project identification number, gAAAAAA is the GenBank identification number of the human genome sequence to which the “exon stretching” algorithm is applied, gBBBBBB is the GenBank identification number of the closest GenBank protein homolog or NCBI RefSeq identification number, and N is a specific number. Is an exon (Example 5See). If a RefSeq sequence was used as a protein homolog for the “exon stretching” algorithm, the RefSeq identifier represented by “NM”, “NP”, or “NT” would be the GenBank identifier (ie, gBBBBBB). ) Can be used instead.
[0148]
Alternatively, the prefix identifies a manually edited constituent sequence, a constituent sequence predicted from a genomic DNA sequence, or a constituent sequence derived from a combined sequence analysis method. The following table lists the prefixes of the constituent sequences and examples of sequence analysis methods corresponding to the prefixes (Examples 4 and 5See).

[0149]
In some cases, to confirm the final consensus polynucleotide sequence, Incyte cDNA coverage was obtained that overlapped with the sequence coverage as shown in column 5, but did not show an associated Incyte cDNA identification number.
[0150]
Table 5 shows a representative cDNA library for full-length polynucleotide sequences constructed using Incyte cDNA sequences. Representative cDNA libraries are Incyte cDNA libraries, which are most frequently represented by the Incyte cDNA sequence family, which were used to construct and confirm the polynucleotide sequences described above. The tissues and vectors used to generate the cDNA library are shown in Table 5 and described in Table 6.
[0151]
The present invention also includes a mutant sequence (variant) of TMP. Preferred variants of TMP have at least about 80%, or at least about 90%, or even at least about 95% amino acid sequence identity to the TMP amino acid sequence and have a functional or structural characteristic of TMP. A variant containing at least one.
[0152]
The present invention also provides a polynucleotide encoding TMP. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34 encoding TMP. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 18-34 shown in the sequence listing includes an equivalent RNA sequence in which thymine of a nitrogenous base is substituted with uracil and the backbone of the sugar chain is not deoxyribose but ribose.
[0153]
The invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding TMP. In particular, such a variant of the polynucleotide sequence may have at least about 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding TMP, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, or even more. It has at least about 95% polynucleotide sequence identity. In certain embodiments of the invention, at least about 70%, or at least about 85%, or at least about 95% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. Such a variant of a polynucleotide sequence having a certain sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. A variant of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of TMP.
[0154]
In yet another example, certain polynucleotide variants of the present invention are splice variants of a polynucleotide sequence encoding TMP. Certain splice variant sequences may have portions with significant sequence identity to the polynucleotide sequence encoding TMP, but may add several blocks of sequence or may result from alternative splicing of exons during mRNA processing. The deletion usually results in having a greater or lesser number of polynucleotides. In some splice variant sequences, less than about 70%, or less than about 60%, or even less than about 50% polynucleotide sequence identity is found over the entire length of the TMP-encoding polynucleotide sequence. Some portions of the splice variant have at least about 70%, or at least about 85%, or at least about 95%, or even 100% of the polynucleotide of each portion of the polynucleotide sequence encoding TMP. Will have sequence identity. Any of the above splice variant sequences may encode a certain amino acid sequence having at least one of the functional or structural features of TMP.
[0155]
It will be appreciated by those skilled in the art that the degeneracy of the genetic code produces various polynucleotide sequences encoding TMP, some of which have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known natural gene. Will be understood. Thus, the present invention may cover all possible polynucleotide sequence variations that can be generated by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are based on the standard triplet genetic code as applied to the polynucleotide sequence of native TMP, and it is to be considered that all such variations are specifically disclosed.
[0156]
Nucleotide sequences encoding a TMP and its mutated sequences are generally capable of hybridizing to a nucleotide sequence of a native TMP under suitably selected stringency conditions, but have substantially different codons, such as including unnatural codons. It may be beneficial to create a nucleotide sequence encoding TMP or a derivative thereof that has use. Based on the frequency with which a host utilizes a particular codon, codons can be selected to enhance the expression of a peptide occurring in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding TMP and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA with favorable properties, such as a longer half-life, than transcripts made from the native sequence. Sometimes a transcript is made.
[0157]
The invention also includes the process of making DNA sequences, or fragments thereof, encoding TMP and TMP derivatives entirely by synthetic chemistry. After production, the synthetic sequence can be inserted into any of the many available expression vectors and cell lines using reagents known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to mutate the sequence encoding TMP or any fragment thereof.
[0158]
The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing to the claimed polynucleotide sequences, under various stringency conditions, particularly SEQ ID NOs: 18-34, and fragments thereof ( See, for example, Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in “Definitions”.
[0159]
Methods for DNA sequencing are known in the art, and any of the embodiments of the present invention may employ a DNA sequencing method. Enzymes can be used in DNA sequencing methods. For example, Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway, NY). Alternatively, a polymerase and a proofreading exonuclease may be used in combination, for example, as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). Preferably, an apparatus such as a MICROLAB2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), a PTC200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA) and an ABI CATARYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) are used to automate the arrangement. Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other systems known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg, Ausubel, FM (1997)).Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7 units, Meyers, R.E. A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pages 856-853).
[0160]
Utilizing various PCR-based methods and partial nucleotide sequences well known in the art, the nucleic acid sequence encoding TMP is extended to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. obtain. For example, one of the methods that can be used, restriction site PCR, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (see, for example, Sarkar, G. et al. 1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). Another method is the inverse PCR method, in which an unknown sequence is amplified from a circularized template using primers extending in various directions. The template is obtained from a restriction enzyme fragment group consisting of a sequence group of a known genomic locus and surrounding sequences (see, for example, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). A third method is the capture PCR method, which includes a method of PCR-amplifying DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic). 1: 111-119 etc.). In this method, a recombinant double-stranded sequence can be inserted within an unknown sequence region using digestion and ligation reactions of multiple restriction enzymes before performing PCR. Other methods that can be used to search for unknown sequences are also known in the art (see, eg, Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). In addition, PCR, nested primers, and PROMOTERFINDER libraries (Clontech, Palo Alto CA) can be used to walk genomic DNA. This procedure eliminates the need to screen libraries and is useful for finding intron / exon junctions. For all PCR-based methods, using commercially available software, such as OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, a GC-containing, about 22-30 nucleotides in length. The primers can be designed to anneal to the template at a rate of about 50% or more and at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
[0161]
When screening full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include larger cDNAs. Furthermore, a library of random primers is often a library containing a sequence having the 5 'region of the gene, and is suitable for a situation where an oligo d (T) library cannot produce a full-length cDNA. Genomic libraries may be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
[0162]
Commercially available capillary electrophoresis systems can be used to analyze the size of the sequencing or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing consists of a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera used for The output / light intensity can be converted to an electrical signal using appropriate software (such as GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR from Applied Biosystems). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
[0163]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding TMP, or a fragment thereof, can be cloned into a recombinant DNA molecule to express TMP, a fragment, or a functional equivalent, in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, other DNA sequences encoding substantially the same or a functionally equivalent amino acid sequence can be produced, and these sequences can be used for expression of TMP.
[0164]
To modify the sequence encoding TMP for various purposes, the nucleotide sequences of the invention can be recombined using methods generally known in the art. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, site-directed mutagenesis via oligonucleotides can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variant sequences, and the like.
[0165]
The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen, Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, CC, et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797; Christians, FC. Et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). The biological properties of the TMP can be modified or improved, such as enzymatic activity, or the ability to bind to other molecules or compounds. DNA shuffling is a process of preparing a library of gene mutation sequences using gene fragment recombination via PCR. The library then goes through a selection or screening procedure that identifies gene variants with the desired properties. Subsequently, these suitable mutated sequences can be pooled and subjected to repeated DNA shuffling and selection / screening. Thus, by "artificial" breeding and rapid molecular evolution, diverse genes are created. For example, fragments of a single gene with random point mutations can be recombined, screened, and then shuffled until the desired properties are optimized. Alternatively, a group of fragments of a gene can be recombined with fragments of a homologous gene of the same gene family, obtained from either the same or different species, thereby directing and controlling the genetic diversity of multiple naturally occurring genes. Can be maximized in a way.
[0166]
According to another embodiment, the sequence encoding TMP can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH. Et al. (1980) Nucleic). Acids Symp. Ser. 7: 215223; and Horn, T. et al. (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 225232). Alternatively, TMP itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid or solid phase techniques (Creighton, T. (1984)).Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60, Robert, J. et al. Y. (1995) Science 269: 202-204). Automated synthesis can be achieved using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems). Further, the amino acid sequence of TMP, or any portion thereof, may be modified by direct synthesis and / or by combination with sequences from other proteins or any portion thereof using chemical methods. It is possible to produce a polypeptide having the sequence of the polypeptide, or a mutant polypeptide.
[0167]
This peptide can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (see, eg, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, supra, pp. 28-53).
[0168]
In order to express a biologically active TMP, the nucleotide sequence encoding TMP or a derivative thereof can be inserted into a suitable expression vector. A suitable expression vector is a vector having a group of elements necessary for controlling transcription and translation of a coding sequence inserted into a suitable host. Examples of necessary elements include regulatory sequences in the vector and in the polynucleotide sequence encoding TMP, such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions, and the like. Such elements vary in their characteristics and specificities. With certain initiation signals, it is also possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding TMP. Examples of such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. When the sequence encoding TMP, its initiation codon, and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational control signals may be required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, the expression vector should display an exogenous translational control signal, such as an in-frame ATG initiation codon. Exogenous translation elements and initiation codons can be of various natural and synthetic origin. Inclusion of enhancers appropriate for the particular host cell line used can increase the efficiency of expression (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162). .
[0169]
Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector having a sequence encoding TMP and suitable transcription and translation control elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoThere is a gene recombination technique (for example, Sambrook, J. et al. (1989)).Molecular Cloning, A Laboratory ManualAusubel, F., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, Chapters 9, 13, and 16).
[0170]
A variety of expression vector / host systems can be utilized to retain and express sequences encoding TMP. Such expression vector / host systems include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vectors, or yeast transformed with yeast expression vectors. Or an insect cell line infected with a viral expression vector (eg, baculovirus) or transformed with a viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV or tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (eg, Ti plasmid or pBR322 plasmid). There are plant cell lines and animal cell lines that have been made (Sambrook, supra, Ausubel, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, supra). Ngelhard, EK, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987). ) EMBO J. 6: 307-311, "The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology" (1992) McGraw Hill New York, pp. 119-196. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, Harrington, JJ, et al. (1997) Nat. See, eg, 345-355). Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to transport nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, 5 (6): 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, R. M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1985) Nature 317 (6040): 813-815; 1997) Natur e 389: 239-242). The present invention is not limited by the host cell used.
[0171]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for the polynucleotide sequence encoding TMP. For example, multifunctional E. coli vectors such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or PSPORT1 plasmid (Life Technologies) can be used for routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide sequence encoding TMP. Ligation of the TMP-encoding sequence into multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, these vectors are used in the cloned sequence.in in vitroIt may also be useful for transcription, dideoxy sequencing, single-stranded rescue by helper phage, generation of nested deletions (see, eg, Van Heake, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 55035509). For example, when a large amount of TMP is required for production of an antibody or the like, a vector that induces TMP expression at a high level can be used. For example, vectors containing the strong inducible SP6 or T7 bacteriophage promoter can be used.
[0172]
TMP can be produced using a yeast expression system. Numerous vectors having constitutive or inducible promoters, such as α-factor, alcohol oxidase, PGH promoter, etc.Saccharomyces cerevisiae) Or Pichia yeast (Pichia pastoris) Can be used. In addition, such vectors direct either the secretion of the expressed protein or its retention in cells, and allow the integration of foreign sequences into the host genome for stable growth (eg, Ausubel, 1995, supra, Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544, and Scorer.CA, et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184).
[0173]
Plant systems can also be used for expression of TMP. Transcription of the sequence encoding TMP can be achieved by transcription of viral promoters, such as 35S from CaMV, alone or in combination with an omega leader sequence from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). It can be driven by the 19S promoter. Alternatively, a plant promoter, such as the small subunit of RuBisCO, or a heat shock promoter can be used (eg, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224). : 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or by pathogen-mediated transfection (McGraw Hill Science and Technology Yearbook).The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196).
[0174]
In mammalian cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding TMP can be ligated to an adenovirus transcription / translation complex having a late promoter and a tripartite leader sequence. Insertion into a non-essential E1 or E3 region of the adenovirus genome makes it possible to obtain an infectious virus that expresses TMP in host cells (eg, Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 81: 36553659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer may be used to increase expression in mammalian host cells. High levels of protein expression can also be achieved using vectors based on SV40 or EBV.
[0175]
Also, human artificial chromosomes (HACs) can be used to deliver larger fragments of DNA than can be contained in or expressed from a plasmid. For treatment, HACs of about 6 kb to 10 Mb have been produced and delivered using conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles) (eg, Harrington. JJ et al. (1997) Nat Genet). .15: 345-355).
[0176]
For long-term production of recombinant mammalian proteins, stable expression of TMP in cell lines is desirable. For example, expression vectors and a selectable marker gene on the same or another vector may be used to transform a sequence encoding TMP into a cell line. The expression vector used can have a viral origin of replication and / or endogenous expression elements. After the introduction of the vector, the cells may be allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selection agent, and the presence of the selectable marker allows for the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0177]
The transformed cell line can be recovered using any number of selection systems. Such selection systems include, but are not limited to, tk⁻A herpes simplex virus thymidine kinase gene used for cells, and apr⁻There is an adenine phosphoribosyltransferase gene of the herpes simplex virus used for cells (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232, Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823, etc.). ). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics, or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to the aminoglycoside neomycin and G-418, als confer resistance to chlorsulfuron, and pat confer resistance to phosphinothricin acetyltransferase (Wigler, M. et al. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-3570, Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Other selectable genes, such as trpB and hisD, which modify cell requirements for metabolism, have also been described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85: 80478051). Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin can be used. These markers can be used to not only identify transformants, but also quantify transient or stable protein expression resulting from a particular vector system (Rhodes, CA (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121131).
[0178]
Even if the presence or absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding TMP is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding TMP can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, a marker gene can be placed in tandem with a sequence encoding TMP under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0179]
In general, host cells that contain a TMP-encoding nucleic acid sequence and that express a TMP can be identified using a variety of methods well known to those skilled in the art. Non-limiting methods well known to those skilled in the art include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, and PCR amplification, and detection, quantification, or both of nucleic acid or protein sequences. There are also biological or immunological assays for proteins, including membrane-based, solution-based or chip-based techniques, for performing
[0180]
Immunological methods for detecting and measuring TMP expression using specific polyclonal or specific monoclonal antibodies are known in the art. Examples of such techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence activated cell sorting (FACS), and the like. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on TMP is preferred, but competing binding assays can be used. These and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990)).Serological Methods, a Laboratory ManualAPS Press. St Paul. MN, Sect. IV, Coligan, J.M. E. FIG. Others (1997)Current Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J .; D. (1998)Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ, etc.).
[0181]
A wide variety of methods for labeling and conjugation are known to those skilled in the art and may be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to a polynucleotide encoding TMP include oligo labeling, nick translation, end labeling (end labeling), or PCR amplification using labeled nucleotides is included. Alternatively, the sequence encoding TMP, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating an mRNA probe. Such vectors are known in the art and are commercially available, with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides,in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. Such methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison WI), and U.S. Pat. S. It can be performed using various kits commercially available from Biochemical and the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0182]
Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding TMP are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence used, the vector, or both. It will be appreciated by those skilled in the art that expression vectors having a polynucleotide encoding TMP can be designed to have signal sequences that direct secretion of TMP through prokaryotic or eukaryotic cell membranes.
[0183]
In addition, selection of a host cell strain may be made with regard to its ability to modulate expression of the inserted sequence or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify protein targeting, folding, and / or activity. Various host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) with specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). ) And can be selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0184]
In another embodiment of the present invention, a native or modified or recombinant nucleic acid sequence encoding TMP can be linked to a heterologous sequence so that any of the host systems described above can be used. , Resulting in the translation of certain fusion proteins. For example, a chimeric TMP protein containing a heterologous moiety that can be recognized using a commercially available antibody can facilitate screening of a peptide library for TMP activity inhibitors. Heterologous protein moieties and heterologous peptide moieties can also facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity matrices. Such portions include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelating resin allow purification of homologous fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow for immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, if the fusion protein is genetically engineered so that the fusion protein contains a proteolytic cleavage site between the sequence encoding TMP and the heterologous protein sequence, TMP may be cleaved from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel (1995), Chapter 10, supra. Various commercially available kits can also be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0185]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is used.in in vitroThus, synthesis of radiolabeled TMP is possible. These systems couple the transcription and translation of a protein coding sequence operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation, for example³⁵It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0186]
A compound that specifically binds to TMP can be screened using the TMP of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to TMP. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0187]
In one embodiment, the compound so identified is associated with a natural ligand of TMP, eg, a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic, or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which TMP binds, or to at least some fragment of the receptor, for example, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves producing suitable cells that express TMP as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila, or E. coli. Cells expressing TMP or a cell membrane fraction containing TMP are contacted with a test compound and analyzed for inhibition of binding, stimulation, or activity of either TMP or the compound.
[0188]
Some assays can simply experimentally bind a test compound to a polypeptide and detect the binding by a fluorescent dye, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include mixing at least one test compound with TMP, either in solution or immobilized on a solid support, and detecting binding of the compound to TMP. Alternatively, the detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. Further, the assay can be performed using cell-free reconstituted specimens, chemical libraries, or mixtures of natural products, where the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0189]
Using the TMP of the present invention or a fragment thereof, a compound that modulates the activity of TMP can be screened. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists, and the like. In one example, the assay is performed under conditions where the activity of the TMP is such that the TMP binds to at least one test compound, and the activity of the TMP in the presence of the test compound is determined by the TMP in the absence of the test compound. Compared to the activity of A change in the activity of TMP in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of TMP. Alternatively, the test compound has TMP under conditions suitable for the activity of TMP.in in vitroThe assay is performed in conjunction with a system, ie, a cell-free system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of TMP may modulate indirectly, without requiring direct contact with the test compound. At least one or more test compounds can be screened.
[0190]
In another example, a polynucleotide encoding TMP or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from early mouse embryos and can be grown in culture. The ES cells are transformed with a vector having the gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo; Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected from, for example, the C57BL / 6 mouse strain. These blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are identified, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested with potential therapeutic or toxic agents.
[0191]
A polynucleotide encoding TMP,in in vitroIt is also possible to operate on human blastocyst-derived ES cells. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0192]
Using a polynucleotide encoding TMP, a "knock-in" humanized animal (pig) or transgenic animal (mouse or rat) can also be produced using human disease as a model. Using knock-in technology, a region of a polynucleotide encoding TMP is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into blastocysts and the blastocysts are implanted as described above. Tested on transgenic progeny or inbreds, treated with potential medicines to obtain information on treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress TMP, eg, secrete TMP into milk, may be a convenient source of protein (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4: 55-74).
[0193]
(Treatment)
There are chemical and structural similarities between each region of TMP and the transmembrane proteins, for example, in the context of sequences and motifs. In addition, TMP expression is closely associated with brain, prostate, smooth muscle, cardiovascular, pituitary, gastrointestinal, lung, pancreatic, and small intestinal tissues. Thus, TMP is thought to play a role in reproductive disorders, developmental disorders, cardiovascular disorders, neurological disorders, gastrointestinal disorders, lipid metabolism disorders, abnormal cell proliferation, and autoimmune / inflammatory diseases. In treating diseases associated with increased TMP expression or activity, it is desirable to decrease TMP expression or activity. In the treatment of a disease associated with a decrease in the expression or activity of TMP, it is desirable to increase the expression or activity of TMP.
[0194]
Thus, in one embodiment, it is possible to administer TMP or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced TMP expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, disorders of prolactin production, reproductive disorders, infertility (eg, fallopian tube disease, poor ovulation, endometriosis, disrupted estrous cycle, disrupted menstrual cycle, Cystic ovary syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial and ovarian tumors, uterine fibroids, autoimmune disorders, ectopic pregnancy, teratogenesis, breast cancer, mammary fibrocystic disease, mastolacia, disrupted spermatogenesis, abnormalities Sperm physiology, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, prostatitis, Peyronie's disease, impotence, male breast cancer, gynecomastia, high gonadotropin hypogonadism, hypogonadotropin hypogonadism, pseudohyonymia, azoospermia, Premature ovarian insufficiency, acrosin deficiency, late puberty, retrograde ejaculation, ejaculation, hemangioblastoma, cysts and pheochromocytomas, paragod Nodules, epididymal cystadenomas, and endolymphatic sac tumors) are developmental disorders that include tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne / Becker muscular dystrophy, epilepsy, and gonadal development Disorders, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucoepithelial dysplasia, hereditary keratoderma, hereditary neuropathy (eg, Charcot (Marie-Tooth disease and neurofibromatosis), hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders (eg, Sydenham's chorea and cerebral palsy) spina bifida, anencephaly, cranial spine dystrophia, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss Others include cardiovascular disorders, including arteriovenous fistulas, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, aneurysms Arterial dissection, varicose veins, thrombophlebitis and venous thrombosis, vascular tumors, thrombolytic complications, balloon angioplasty, vascular replacement, coronary artery bypass grafting, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina pectoris, myocardium Infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annulus calcification, mitral valve prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infectious Endocarditis, nonbacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus lupus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease, Heart transplant complications, congenital lung abnormalities, pulmonary dysfunction, pulmonary congestion and edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, restrictive pulmonary disease, chronic Obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, Bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, irritable pneumonia, pulmonary eosinophils Increase, bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary bleeding syndrome, Goodpasture's syndrome, idiopathic pulmonary hematosis, collagen vascular disease complicated lung disease, alveolar proteinosis, lung Includes tumors, inflammatory and non-inflammatory pleural effusions, pneumothorax, pleural tumors, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and complications of lung transplantation. Neurological disorders include epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, brain tumor, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive Neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa (retinitis pigmentosa), hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural abscess, hard Epidural abscesses, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system diseases, and prion diseases including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease and Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome; Fatal familial insomnia, nutritional and metabolic diseases of the nervous system, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangiomatosis central nervous system development disorders, including trigeminal neurovascular syndrome, mental retardation, Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal abnormalities, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other neuromuscular diseases, Peripheral nerve disease, dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine and toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, mood disorders, anxiety disorders and schizophrenia (schizophrenia) ), Seasonal affective disorder (SAD), and restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, tardive dyskinesia, dystonia, paranoid psychosis, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, progressive Includes supranuclear palsy, basal ganglia degeneration, familial frontotemporal dementia, and also includes gastrointestinal disorders, including swallowing Harm, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, dyspepsia, dyspepsia, gastritis, gastric cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, edema of the sinus or pylorus, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis Ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreatic cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious Colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel syndrome, short small bowel syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, acquired immunodeficiency Syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, fatty liver, hemochromatosis, Wilson's disease, α₁Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal circulation obstruction and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes acute fatty liver, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular hyperplasia and adenomas, carcinomas, and lipid metabolism disorders such as fatty liver, cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, and carnitine. Palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deaminase deficiency, hypertriglyceridemia, lipid storage diseases such as Fabry disease, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic leukodystrophy, adrenoleukodystrophy, GM₂Ganglioside storage disease, celoid lipofuscinosis, β-lipoproteinemia, Tangier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous steatitis, disseminated fat necrosis, painful Steatosis, lipoid adrenal hyperplasia, minimal change nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid function Hypotension, renal disease, liver disease, lecithin: cholesterol acyltransferase deficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia, Lipid myopathy, obesity are cell proliferation disorders, actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed binding group Includes tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia and adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma Cancer, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland Cancer of the skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, etc., and also includes autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, Ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, Cholecystitis, contact dermatitis, Lone disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, pulmonary emphysema, lymphocytic factor-induced accidental lymphopenia (episodic lymphopenia with lymphocytotoxins), neonatal hemolytic disease (erythroblastosis fetalis), erythema nodosum, atrophy Gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, inflammation of the myocardium or pericardium, bone Arthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, thrombocytopenia Purpura ulcerans, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer , Hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections include infections and trauma helminths.
[0195]
In another embodiment, a vector capable of expressing TMP or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with reduced TMP expression or activity, including, but not limited to, those listed above. It can also be administered to patients.
[0196]
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified TMP for the treatment or prevention of a disease associated with reduced TMP expression or activity, including, but not limited to, the diseases described above. It can also be administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0197]
In yet another example, an agonist that modulates the activity of TMP is administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced TMP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible.
[0198]
In a further embodiment, an antagonist of TMP can be administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with increased TMP expression or activity. Examples of such diseases include, but are not limited to, the aforementioned reproductive disorders, developmental disorders, cardiovascular disorders, neurological disorders, gastrointestinal disorders, lipid metabolism disorders, abnormal cell proliferation, and autoimmune / inflammatory disorders. Is included. In one embodiment, an antibody that specifically binds to TMP can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver the agent to cells or tissues that express TMP.
[0199]
In another embodiment, a vector expressing the complement of a polynucleotide encoding TMP is administered to a patient to treat a disease associated with increased TMP expression or activity, including, but not limited to, those described above. Treatment or prevention is also possible.
[0200]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, or vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy may be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. Combination with a therapeutic agent can have a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. By this method, a small amount of each drug can achieve a medicinal effect, thereby reducing the possibility of side effects.
[0201]
Antagonists of TMP can be prepared using methods generally known in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified TMP, or a therapeutic drug library can be screened to identify those that specifically bind to TMP. Antibodies to TMP can also be produced using methods known in the art. Such antibodies can include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are generally suitable for therapeutic use.
[0202]
For the production of antibodies, goats, rabbits, rats, mice, humans and various other hosts can be immunized by injection of TMP or any fragment, or injection of its oligopeptide with immunogenic properties. . Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin (KLH), dinitrophenol, etc. Surfactants. Among the adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0203]
Oligopeptides, peptides or fragments used to elicit antibodies to TMP preferably have an amino acid sequence of at least about 5 amino acids, generally at least about 10 amino acids. Desirably, these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein. Short stretches of TMP amino acids can be fused with sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0204]
Monoclonal antibodies to TMP can be produced by continuous cell lines in culture using any technique that produces antibody molecules. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D.C.). (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP, et al. (1984). Mol. Cell Biol. 62: 109-120, etc.).
[0205]
In addition, techniques developed for the production of “chimeric antibodies”, such as splicing mouse antibody genes to human antibody genes, are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison, SL, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 68516855, Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608, Takeda, S. et al. (1985) Nature 314. : 452-454). Alternatively, TMP-specific single-chain antibodies are generated using the techniques described for the production of single-chain antibodies using methods well known in the art. Antibodies with related specificities but different idiotypic compositions can also be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (eg, Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 88: 10134-10137).
[0206]
The production of antibodies in lymphocyte populationsin VivoIt can also be done by inducing production, or by screening immunoglobulin libraries, or by screening a panel of highly specific binding reagents as disclosed in the literature (eg Orlandi, R. et al. (1989)). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0207]
Antibody fragments which contain specific binding sites for TMP can also be obtained. For example, but not by way of limitation, such fragments may include F (ab ') 2 produced by pepsin digestion of the antibody molecule.₂ Fragment and F (ab ')₂ Some Fab fragments are made by reducing the disulfide bridges of the fragment. Alternatively, by creating a Fab expression library, monoclonal Fab fragments with the desired specificity can be quickly and easily identified (eg, Huse, WD, et al. (1989) Science 246: 1275-1281). See).
[0208]
Screening can be performed using various immunoassays (immunoassays) to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for immunoradiometric or competitive binding assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are known in the art. Such immunoassays typically involve the measurement of complex formation between TMP and its specific antibody. Two-site, monoclonal-based immunoassays using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering TMP epitopes are commonly used, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).
[0209]
Various methods, such as Scatchard analysis, can be used in conjunction with radioimmunoassay techniques to assess the affinity of the antibody for TMP. The affinity is represented by the binding constant Ka, which is a value obtained by dividing the molar concentration of the TMP-antibody complex under equilibrium by the molar concentration of the free antibody and free antigen. Polyclonal antibodies are heterogeneous in their affinities for various TMP epitopes, and the Ka determined for a given polyclonal antibody reagent represents the average affinity or avidity of a group of TMP antibodies. For monoclonal antibodies monospecific for a particular TMP epitope, the Ka of the reagent represents a true measure of affinity. Ka value is 10⁹-10¹²The L / mol high affinity antibody reagent is preferably used in immunoassays where the TMP-antibody complex must withstand severe manipulations. Ka value is 10⁶-10⁷The liter / mol low-affinity antibody reagent is preferably used for immunopurification and similar treatments where TMP must eventually dissociate in an active state from the antibody (Catty, D. (1988)).Antibodies, Volume I: A Practical ApproachJ., IRL Press, Washington, DC; E. FIG. And A. Cryer (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0210]
The titer and avidity of the polyclonal antibody reagents can be further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain subsequent applications. For example, polyclonal antibody medicaments containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used in processes where a TMP-antibody complex must be precipitated. Guidance on antibody specificity, titer, avidity, and antibody quality and use in various applications is generally available (see Catty, supra, Colligan et al., Supra).
[0211]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TMP, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In some embodiments, sequences complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding TMP or antisense molecules (DNA, RNA, PNA, or modified oligonucleotides) can be designed to alter gene expression. . Such techniques are well known in the art, and antisense oligonucleotides or larger fragments can be designed from a variety of locations along the regulatory or coding regions of the TMP-encoding sequence (see, eg, Agrawal, S., Editing (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press, Totawa NJ).
[0212]
For use in therapy, any gene delivery system suitable to introduce the antisense sequence into appropriate target cells can be used. The antisense sequence can be delivered intracellularly in the form of an expression plasmid that upon transcription creates a sequence complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (eg, Slater, JE et al. (1998). J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475 and Scanlon, KJ. Et al. (1995) 9 (13): 1288-1296). Antisense sequences can also be introduced into cells using viral vectors, such as, for example, retroviruses and adeno-associated viruses (eg, Miller, AD (1990) Blood 76: 271, Ausubel, Uckert, supra). , W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347). Other gene delivery mechanisms include liposome systems, artificial virus envelopes, and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217). -225; Boado, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736. Etc.).
[0213]
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding TMP can be used for somatic or germ cell gene therapy. By performing gene therapy, (i) severe combined immunodeficiency (SCID) characterized by a gene deficiency (eg, X chromosome linkage (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)) -X1), severe combined immunodeficiency syndrome associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480, Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal, RG etc. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to deficiency of factor VIII or factor IX (Crystal, RG (1995)). ) Science 270: 404-410, Verma, IM and Somia N. (1997) Nature 389: 239-242), and (ii) expressing a conditional lethal gene product (e.g., (In the case of cancer resulting from cell proliferation), (iii) intracellular parasites such as the human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poeschla, E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. USA 93: 11395-11399), hepatitis B or C virus (HBV, HCV),Candida albicansandParacoccidioides brasiliensisParasitic fungi such asPlasmodium falciparumandCruise TrypanosomaAnd other proteins having a protective function against parasites. When a deficiency in a gene required for expression or regulation of TMP causes a disease, TMP can be expressed from a suitable population of introduced cells to alleviate the symptoms caused by the deficiency.
[0214]
In a further embodiment of the invention, diseases and disorders due to TMP deficiency are treated by creating mammalian expression vectors encoding TMP and introducing these vectors into TMP-deficient cells by mechanical means. .in VivoOrex in vitroThe mechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (ii) gene guns, (iii) transfection via liposomes, and (iv) receptors. Mediated gene transfer, and (v) the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997)). Cell 91: 501-510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0215]
Expression vectors that can affect TMP expression include, but are not limited to, PCDNA3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX, PCR2-TOPOTA vector (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV- TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTT-OFF, PET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express TMP, (i) a constitutively active promoter (derived from, for example, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin Gene, etc.), and (ii) an inducible promoter (for example, a tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456)), ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND; Invitrogen), FK506 / rapamycin inducible promoter, or RU486 / mifepristone inducible promoter (Rossi, FM). V. and H. M. Blau, supra), or (iii) the native or tissue-specific promoter of an endogenous gene encoding TMP from a normal individual.
[0216]
Using a commercially available liposome transformation kit (eg, PerFect Lipid Transfection Kit from Invitrogen), a person skilled in the art does not need to make much effort to optimize each parameter of the experiment, and can transfer the polynucleotide group to the target cell group in culture. Can be delivered. Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845). ). The introduction of DNA into primary cells requires modification of standardized mammalian transfection protocols.
[0217]
In another embodiment of the present invention, a disease or disorder caused by a genetic defect associated with TMP expression is identified by (i) encoding a TMP under the control of a retroviral long terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. Rev responsive element (RRE) with polynucleotide, (ii) suitable RNA packaging signals, (iii) additional retroviral cis-acting RNA sequences, and coding sequences required for efficient vector propagation. ) Can be prepared and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and are based on published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6733-6737). The above data is incorporated herein by reference. This vector is propagated in a suitable vector producing cell line (VPCL). VPCL expresses an envelope gene with affinity for the receptor on each target cell or a pan-affinity envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650; Bender, MA, et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). U.S. Pat. No. 5,910,434 to Rigg ("Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing strains"; "Retrospectroscopy"; Is a part of the present specification. Propagation of retroviral vectors, cell populations (eg, CD4⁺Transduction of the T cell population) and return of the transduced cell population to the patient are procedures well known to those skilled in the art of gene therapy and have been described in numerous publications (Ranga, U. et al. 1997) J. Virol. 71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U.S.A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0218]
Alternatively, certain delivery systems of adenovirus-based gene therapy are used to deliver a group of polynucleotides encoding TMP to a group of cells having one or more genetic abnormalities associated with the expression of TMP. The production and packaging of adenovirus-based vectors is well known to those skilled in the art. It has been demonstrated that replication-defective adenovirus vectors can be used in a variety of ways to import genes encoding various immunoregulatory proteins into intact pancreatic islets (Csete, ME et al. 1995) Transplantation 27: 263-268). Potentially useful adenoviral vectors are described in U.S. Patent No. 5,707,618 to Armentano ("Adenovirus vectors for gene therapy"), which is hereby incorporated herein by reference. I do. For adenovirus vectors, see Antinozzi, P. et al. A. Et al. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544 and Verma, I .; M. And N.I. See also Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242. Both documents are hereby incorporated by reference.
[0219]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a TMP-encoding polynucleotide to target cells that have one or more genetic abnormalities associated with TMP expression. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors are particularly useful for introducing TMP into central nervous cells with HSV affinity. The production and packaging of herpes-based vectors is known to those skilled in the art. Certain replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I vectors have been used to deliver certain reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385-395). The construction of the HSV-1 viral vector is also disclosed in detail in U.S. Patent No. 5,804,413 to DeLuca ("Herpes simplex strains for gene transfer"), which is hereby incorporated by reference. Book. US Patent No. 5,804,413 describes the use of recombinant HSV d92 having a genome with at least one foreign gene introduced into a cell under the control of a suitable promoter, for purposes such as human gene therapy. I do. The patent also discloses the generation and use of a recombinant HSV line lacking ICP4, ICP27, and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. Et al. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; Et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are hereby incorporated by reference. Manipulation of Cloned Herpesvirus Sequences, Production of Recombinant Virus After Transfection with Multiple Plasmids Having Various Segments of Large Herpesvirus Genomes, Herpesvirus Growth and Propagation, and Cell Groups Infection of the herpes virus into the is a technique known to those skilled in the art.
[0220]
Alternatively, certain alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vectors are used to deliver polynucleotides encoding TMP to target cells. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Fever Virus (SFV), have been extensively performed, and gene transfer vectors are based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998). ) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 464-469). During replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is produced, usually encoding the capsid proteins of the virus. This subgenomic RNA replicates at a higher level than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins compared to viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding TMP into a region encoding the capsid of the α virus genome, a large number of RNAs encoding TMP are produced in the vector-transfected cells, and TMP is synthesized at a high level. Usually, infection with the alpha virus involves cell lysis within a few days. On the other hand, the ability of a group of hamster normal kidney cells (BHK-21) with certain variants of Sindbis virus (SIN) to establish persistent infection could apply the lytic replication of alpha viruses to gene therapy. (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). Since the α virus can be introduced into various hosts, TMP can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of cells prior to transduction. Methods for treating α-virus infectious cDNA clones, transfecting α-virus cDNA and RNA, and infecting α-virus are known to those skilled in the art.
[0221]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. The transcription start site is, for example, between about −10 and about +10 counted from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helical base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because it inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent therapeutic advances using triple helical DNA are described in the literature (Gee, JE et al. (1994) in Huber, BE and BI Carr,Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco, NY, pp. 163-177). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
[0222]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules. Ribozymes can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. For example, an artificially produced hammerhead ribozyme molecule may be able to specifically and effectively catalyze endonucleolytic cleavage of a sequence encoding TMP.
[0223]
Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, such as GUA, GUU, GUC sequences. Once identified, assess whether the short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene having the cleavage site has secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. Becomes possible. Assessment of the suitability of a candidate target can also be made by testing the accessibility of hybridization with a complementary oligonucleotide using a ribonuclease protection assay.
[0224]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. As a production method, there is a method of chemically synthesizing an oligonucleotide, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, the DNA sequence encoding TMPin in vitroandin VivoRNA molecules can be produced by transcription. Such a DNA sequence can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells or tissues.
[0225]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, adding contiguous sequences at the 5'-end, 3'-end, or both, of the molecule, and adding phosphorothionate or 2 'in the backbone of the molecule rather than a phosphodiesterase bond. 'Using O-methyl. This concept is originally in the production of the PNA group, but can be extended to all these molecules. To do so, adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases, have acetyl-, methyl-, thio-, and similar modifications, and unconventional bases such as inosine , Queosine, wybutosine.
[0226]
A further embodiment of the present invention includes a method of screening for a compound that is effective in altering the expression of a polynucleotide encoding TMP. Without limitation, compounds that may be effective in causing an altered expression of a specific polynucleotide include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcription regulators, and There are non-polymeric entities that can interact with a particular polynucleotide sequence. Effective compounds can alter polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Therefore, in the treatment of diseases associated with increased TMP expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding TMP are therapeutically useful, and are associated with reduced TMP expression or activity. In treating disease, compounds that specifically promote the expression of a polynucleotide encoding TMP may be therapeutically useful.
[0227]
At least one or more test compounds may be screened for effectiveness in altering the expression of a particular polynucleotide. Test compounds are obtained by any method widely known in the art. Such methods include altering the expression of the polynucleotide, selecting from a library of existing, commercial or dedicated, natural or unnatural compounds, and modifying the chemical and / or structural properties of the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective, either when rationally designing compounds based on properties or when selecting from libraries of combinatorially or randomly generated compounds. A sample having a polynucleotide encoding TMP is exposed to at least one of the test compounds thus obtained. Samples include, for example, intact cells, permeabilized cells,in in vitroThere can be a cell-free or reconstituted biochemical system. Alterations in the expression of a polynucleotide encoding TMP are assayed by any method known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding TMP. It is also possible to quantify the amount of hybridization, which may form the basis for comparison of the expression of polynucleotides exposed or unexposed to one or more test compounds. Detection of a change in the expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in altering the expression of the polynucleotide. For compounds effective for the modified expression of certain polynucleotides, for example, fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) Gene expression system (Atkins, D. et al. (1999) US Patent No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15), or human cell lines such as HeLa cells (Clarke, ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention relate to a process of screening a combinatorial library of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against a particular polynucleotide sequence ( Bruice, TW, et al. (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW, et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0228]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitroandex VivoEqually suitable for the use ofex VivoFor treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient, cloned, propagated and returned to the patient by autotransplant. Delivery by transfection or by ribosome injection or polycationic amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-466).
[0229]
All of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment, including mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0230]
Certain further embodiments of the present invention relate to the administration of certain compositions that generally have the active ingredient formulated with a pharmaceutically acceptable excipient. Excipients include, for example, sugars, starches, celluloses, gums and proteins. Various prescriptions are widely known,Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such compositions comprise TMP, antibodies to TMP, mimetics, agonists, antagonists, or inhibitors of TMP, and the like.
[0231]
The compositions used in the present invention can be administered by any number of routes, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intrathecal, Intraventricular, lung, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
[0232]
Compositions for pulmonary administration may be prepared in liquid or dry powder form. Such compositions typically aerosolize shortly before inhalation by the patient. For small molecules (eg, traditional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast-acting formulations is known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), recent improvements in the art of pulmonary delivery through the alveolar region allow for the transport of drugs such as insulin substantially into the blood circulation. (See Patton, JS, et al., US Pat. No. 5,997,848). Pulmonary delivery is advantageous in that it is administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0233]
Compositions suitable for use in the present invention include compositions that contain as much active ingredient as necessary to achieve the intended purpose. Determination of the effective dosage is within the ability of those skilled in the art.
[0234]
Preferably, the composition is prepared in a special form to deliver the macromolecule containing TMP or a fragment thereof directly into the cell. For example, a liposome formulation containing a cell-impermeable polymer can facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, TMP or a fragment thereof can be linked to the cationic N-terminus of the HIV Tat-1 protein. The fusion proteins thus produced have been shown to transduce cells of all tissues, including the brain, of certain mouse model systems (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285). : 1569-1572).
[0235]
For any compound, an effective dosage of treatment can be estimated initially in cell culture assays, such as those for neoplastic cells, or in animal models such as mice, rabbits, dogs or pigs. . Animal models can also be used to determine suitable concentration ranges and routes of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans.
[0236]
A medically effective dose refers to that amount of an active ingredient that ameliorates a symptom or condition, eg, TMP or a fragment thereof, an antibody to TMP, an agonist or antagonist of TMP, an inhibitor, and the like. Medicinal efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, for example,₅₀(Pharmaceutically effective amount of 50% of the population) or LD₅₀(A lethal dose of 50% of the population). The dose ratio of toxic to therapeutic effects is the therapeutic index and the LD₅₀/ ED₅₀It can be expressed as a ratio. Compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for use in humans. The dosage contained in such compositions is such that there is little or no toxicity and the ED₅₀It is preferable that the concentration be in the blood concentration range containing Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.
[0237]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject can take into account the severity of the disease, the general health of the patient, the age, weight and sex of the patient, the time and frequency of administration, drug incorporation, response sensitivity and response to treatment, and the like. Compositions with a longer duration of action may be administered once every 3 to 4 days, once a week, or once every two weeks depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0238]
Normal dosage amounts range from about 0.1 to 100,000 μg, depending on the route of administration, up to a total of about 1 g. Guidance as to specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is readily available to practitioners in the field. One skilled in the art will utilize formulations for nucleotides that are different from those for proteins or their inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, site, etc.
[0239]
(Diagnosis)
In another embodiment, antibodies that specifically bind to TMP are used to diagnose disorders characterized by TMP expression, or to monitor patients being treated with TMP or agonists or antagonists or inhibitors of TMP. Can be used for the assay. Antibodies useful for diagnostic purposes are prepared in the same manner as described above for therapy. TMP diagnostic assays include methods of detecting TMP using antibodies and labels from human body fluids or from extracts of cells and tissues. The antibody can be modified or unmodified and can be labeled covalently or non-covalently with a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used, some of which are described above.
[0240]
Various protocols, such as ELISA, RIA, and FACS for measuring TMP, are well known in the art and provide a basis for diagnosing altered or abnormal levels of TMP expression. Normal or standard TMP expression values are obtained by mixing a body fluid or cell extract from a subject, such as a normal mammal, eg, a human, with an antibody to TMP under conditions suitable for complex formation. Is determined by The amount of the standard complex formed can be determined by various methods, for example, by photometry. The amount of TMP expression in subject, control, and disease samples from biopsy tissue is compared to a standard value. The deviation between the standard value and the subject's value determines the parameters for diagnosing the disease.
[0241]
According to another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding TMP may be used for diagnosis. Examples of polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. These polynucleotides can be used to detect and quantify gene expression in biopsy tissues where TMP expression can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to determine the presence or absence of TMP, as well as overexpression, and to monitor modulation of TMP levels during treatment.
[0242]
In certain embodiments, hybridization with PCR probes capable of detecting a polynucleotide sequence, such as a genomic sequence, encoding a TMP or closely related molecule can be used to identify a nucleic acid sequence encoding a TMP. . Depending on the specificity of the probe and the stringency of hybridization or amplification, for example, whether it is a highly specific region, such as a 5 'regulatory region, or is made from a region of somewhat low specificity, such as a conserved motif. Whether the probe identifies only the native sequence encoding TMP or allelic variants or related sequences.
[0243]
Probes can also be used to detect related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding TMP. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and the probe can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 18-34 or a genomic sequence containing the promoter, enhancer, and intron of the TMP gene.
[0244]
As a method for preparing a hybridization probe specific to DNA encoding TMP, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding TMP or a TMP derivative into a vector for producing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those of skill in the art, and are commercially available. By adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with a population of different reporters. Examples of reporter populations include:³²P or³⁵A radionuclide such as S, or an enzyme label such as alkaline phosphatase bound to a probe via an avidin / biotin binding system may be used.
[0245]
The polynucleotide sequence encoding TMP can be used for diagnosis of a disease associated with TMP expression. Examples of such disorders include, but are not limited to, disorders of prolactin production, reproductive disorders, infertility (eg, fallopian tube disease, poor ovulation, endometriosis, disrupted estrous cycle, disrupted menstrual cycle, Cystic ovary syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial and ovarian tumors, uterine fibroids, autoimmune disorders, ectopic pregnancy, teratogenesis, breast cancer, mammary fibrocystic disease, mastolacia, disrupted spermatogenesis, abnormalities Sperm physiology, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, prostatitis, Peyronie's disease, impotence, male breast cancer, gynecomastia, high gonadotropin hypogonadism, hypogonadotropin hypogonadism, pseudohyonymia, azoospermia, Premature ovarian insufficiency, acrosin deficiency, late puberty, retrograde ejaculation, ejaculation, hemangioblastoma, cysts and pheochromocytomas, paragod Nodules, epididymal cystadenomas, and endolymphatic sac tumors) are developmental disorders that include tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne / Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonad development disorders , WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucoepithelial dysplasia, hereditary keratoderma, hereditary neuropathy (eg, Charcot-Marie・ Tooth disease and neurofibromatosis), hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders (eg, Sydenham's chorea and cerebral palsy), spina bifida, anencephaly, cranial spine cranium, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss And cardiovascular disorders, including arteriovenous fistulas, atherosclerosis, hypertension, vasculitis, Raynaud's disease, arterial disease , Arterial dissection, varicose veins, thrombophlebitis and venous thrombosis, vascular tumors, thrombolytic complications, balloon angioplasty, vascular replacement, coronary artery bypass grafting, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina, Myocardial infarction, hypertensive heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral valve prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infection Endocarditis, non-bacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus lupus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease , Heart transplant complications, congenital lung abnormalities, pulmonary dysfunction, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, restrictive lung disease, Chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis , Bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, irritable pneumonia, pulmonary eosinophilia Swelling, bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary hemorrhage syndrome, Goodpasture's syndrome, idiopathic pulmonary hematosis, collagen vascular disease complicated lung disease, alveolar proteinosis, Includes lung tumors, inflammatory and non-inflammatory pleural effusions, pneumothorax, pleural tumors, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and complications of lung transplantation. Neurological disorders include epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, brain tumor, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive Neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa (retinitis pigmentosa), hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural abscess, hard Epidural abscesses, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system diseases, and prion diseases including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease and Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome; Fatal familial insomnia, nutritional and metabolic diseases of the nervous system, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangiomatosis central nervous system development disorders, including trigeminal neurovascular syndrome, mental retardation, Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal abnormalities, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other neuromuscular diseases, Peripheral nerve disease, dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine and toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, mood disorders, anxiety disorders and schizophrenia (schizophrenia) ), Seasonal affective disorder (SAD), and restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, tardive dyskinesia, dystonia, paranoid psychosis, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, progressive Includes supranuclear palsy, basal ganglia degeneration, familial frontotemporal dementia, and also includes gastrointestinal disorders, including swallowing Harm, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, dyspepsia, dyspepsia, gastritis, gastric cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, edema of the sinus or pylorus, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis Ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreatic cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious Colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel syndrome, short small bowel syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, acquired immunodeficiency Syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, fatty liver, hemochromatosis, Wilson's disease, α₁Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal circulation obstruction and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes acute fatty liver, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular hyperplasia and adenomas, carcinomas, and lipid metabolism disorders such as fatty liver, cholestasis, primary biliary cirrhosis, carnitine deficiency, and carnitine. Palmitoyltransferase deficiency, myoadenylate deaminase deficiency, hypertriglyceridemia, lipid storage diseases such as Fabry disease, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, metachromatic leukodystrophy, adrenoleukodystrophy, GM₂Ganglioside storage disease, celoid lipofuscinosis, β-lipoproteinemia, Tangier disease, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, lipodystrophy, lipomatosis, acute subcutaneous steatitis, disseminated fat necrosis, painful Steatosis, lipoid adrenal hyperplasia, minimal change nephrosis, lipoma, atherosclerosis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia with hypertriglyceridemia, primary hypoalphalipoproteinemia, thyroid function Hypotension, renal disease, liver disease, lecithin: cholesterol acyltransferase deficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, sitosterolemia, hypocholesterolemia, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, hyperlipidemia, hyperlipidemia, Lipid myopathy, obesity are cell proliferation disorders, actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed binding group Includes tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia and adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma Cancer, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland Cancer of the skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, etc., and also includes autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, Ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, Cholecystitis, contact dermatitis, Lone disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, pulmonary emphysema, lymphocytic factor-induced accidental lymphopenia (episodic lymphopenia with lymphocytotoxins), neonatal hemolytic disease (erythroblastosis fetalis), erythema nodosum, atrophy Gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, inflammation of the myocardium or pericardium, bone Arthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, thrombocytopenia Purpura ulcerans, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer , Hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections include infections and trauma helminths. Polynucleotide sequences encoding TMP can be obtained by Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin, and multi-format ELISA assays, and It can be used for microarrays using body fluids or tissues collected from patients to detect altered TMP expression. Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0246]
In certain forms, nucleotide sequences encoding TMP may be useful in assays that detect related disorders, particularly those described above. The nucleotide sequence encoding TMP can be labeled by standard methods and added to a bodily fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for formation of a hybridization complex. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient's sample changes significantly compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding TMP in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate the effect of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or to monitor the treatment of individual patients.
[0247]
Normal or standard profiles of expression are established to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with TMP expression. This can be achieved by mixing a body fluid or cell extracted from a normal animal or human subject with a sequence encoding TMP or a fragment thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments performed with known amounts of substantially purified polynucleotide to values obtained from normal subjects. The standard values thus obtained can be compared to values obtained from samples obtained from patients showing signs of the disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of disease.
[0248]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, the hybridization assay may be repeated periodically to determine whether the patient's expression levels have begun to approach those observed in normal subjects. The results from serial assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0249]
With respect to cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts (under- or over-expression) in living tissue from an individual indicates the predisposition of the disease or a method of detecting the disease before actual clinical symptoms appear. Can provide. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0250]
Further diagnostic uses of oligonucleotides designed from TMP-encoding sequences may include the use of PCR. These oligomers can be chemically synthesized, produced enzymatically, orin in vitroCan be produced in Oligomers, preferably including fragments of a polynucleotide encoding TMP, or fragments of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding TMP, are used to identify a particular gene or condition under optimal conditions. Used. Oligomers can also be used under relatively mild stringency conditions to detect and / or quantify closely related DNA or RNA sequences.
[0251]
In certain embodiments, single nucleotide polymorphisms (SNPs) may be detected using oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding TMP. SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause a congenital or acquired genetic disease in humans. Non-limiting methods for detecting SNPs include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, amplification of DNA is performed using an oligonucleotide primer derived from a polynucleotide sequence encoding TMP and the polymerase chain reaction (PCR). DNA can be derived, for example, from diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in the DNA cause differences in the secondary and tertiary structure of the single-stranded form of the PCR product. Differences can be detected using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This allows the detection of amplimers on high throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as arranged in a common consensus sequence. obtain. These computer-based methods filter out sequence variations due to errors in the laboratory preparation of DNA or sequencing errors using statistical models and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another aspect, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry, for example, using a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, San Diego CA).
[0252]
Methods that can be used to quantify TMP expression also include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of control nucleic acids, and interpolation of results from a standard curve (eg, Melby, PC). (1993) J. Immunol.Methods, 159: 235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229-236). To accelerate the rate of quantification of multiple samples, the oligomer or polynucleotide of interest can be placed in various diluents and assayed in a high-throughput format where quantitation is rapid by spectrophotometric or colorimetric reactions. .
[0253]
In yet another embodiment, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relative expression levels of many genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. This information can be used to determine gene function, understand the genetic basis of disease, diagnose disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a pharmacogenomic profile for the patient in order to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective and has few side effects for the patient can be selected.
[0254]
In another embodiment, TMP, fragments of TMP, antibodies specific to TMP can be used as elements on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0255]
Certain embodiments relate to the use of a polynucleotide of the invention to generate a transcribed image of a tissue or cell type. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under given conditions (Seilhamer et al., US Pat. No. 5,840,484, Comparative). See Gene Transcript Analysis, which is hereby incorporated by reference. Thus, a transcribed image can be generated by hybridizing a polynucleotide of the present invention or its complement to transcripts or reverse transcripts of a particular tissue or cell type. In some embodiments, hybridization occurs in a high-throughput format such that the polynucleotides of the invention or their complements comprise a subset of multiple elements on a microarray. The resulting transcribed image can provide a profile of gene activity.
[0256]
Transcript images may be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies or biological samples thereof. The transcribed image is therefore in the case of a tissue or biopsy samplein Vivo, In the case of cell linesin in vitroReflects gene expression at
[0257]
The transcribed image that creates the expression profile of the polynucleotide of the invention may also includein in vitroIt can be used for preclinical evaluation of model systems and drugs, or in connection with toxicity testing of industrial or natural environmental compounds. All compounds elicit a characteristic pattern of gene expression, often referred to as molecular fingerprints or toxic signatures, indicating mechanisms of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog. 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which are hereby specifically incorporated by reference. If the test compounds have the same signature as the compound with known toxicity, they may share toxic properties. A fingerprint or signature is most useful and accurate if it contains expression information from a large number of genes and gene families. Ideally, a genome-wide measurement of expression will provide the highest quality signature. Even if there are genes whose expression is not altered by any of the tested compounds, they are important because their expression levels can be used to normalize the rest of the expression data. The standardization procedure is useful for comparing expression data after treatment with various compounds. Assigning a gene function to a group of elements of a certain toxic signature is helpful in interpreting the toxic mechanism, but knowledge of the gene function is not required for statistical matching of the group of signatures, which leads to prediction of toxicity (eg, 2000 See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences on the 29th of the month, which is available at http://www.niehs.nih.gov/oc/. news / toxchip.htm). Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences during toxicological screening using toxic signatures.
[0258]
In one embodiment, the toxicity of the test compound is calculated by treating a biological sample having the nucleic acid with the test compound. Nucleic acids expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The level of transcription in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. The difference in transcript levels between the two samples is indicative of a toxic response caused by the test compound in the treated sample.
[0259]
Another embodiment involves analyzing a tissue or cell type proteome using the polypeptide sequences of the invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be individually subjected to further analysis. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis, such as separating proteins from a sample by one-dimensional isoelectric focusing and separating according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis. (Steiner and Anderson, supra). Proteins are visualized in the gel as dispersed, uniquely located points, usually by staining the gel with a substance such as Coomassie blue or silver or fluorescent stains. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. Compare the optical densities of similarly located protein spots from different samples, for example, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, to identify changes in protein spot density associated with treatment . The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 contiguous amino acid residues, to a polypeptide sequence of the present invention. In some cases, additional sequence data is obtained for definitive protein identification.
[0260]
Proteome profiles can also be generated by quantifying TMP expression levels using antibodies specific for TMP. In one embodiment, protein expression levels are quantified using these antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999). ) Anal. Biochem. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed by various methods known in the art, for example, the proteins in the sample can be reacted with a thiol or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at the elements of each array.
[0261]
Toxic signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxic signatures at the transcript level. For some proteins in some tissues, the correlation between transcript abundance and protein abundance is poor (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537). The proteome toxic signature can be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect the transcript image but alter the proteome profile. In addition, proteome profiling may be more reliable and informative in such cases, since the analysis of transcripts in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA.
[0262]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the processed biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in the amount of protein between the two samples is indicative of a toxic response to the test compound in the treated sample. To identify an individual protein, the amino acid residues of the individual protein are sequenced and these subsequences are compared to a polypeptide of the invention.
[0263]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins obtained from a biological sample are incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. Quantify the amount of protein recognized by the antibody. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in the amount of protein between the two samples is indicative of a toxic response to the test compound in the treated sample.
[0264]
Microarrays are prepared, used, and analyzed by methods known in the art (Brennan, TM et al. (1995) U.S. Patent No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No. WO 95/251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No. WO 95/35505, Heller, RA, et al. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, Heller, MJ. Et al. (1997) U.S. Patent No. 5,605,662). Various types of microarrays are known, and for details, seeDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, edited (1999) Oxford University Press, London. This document is specifically incorporated herein by reference.
[0265]
In another embodiment of the present invention, nucleic acid sequences encoding TMP can also be used to generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Either coding or non-coding sequences can be used, and in some instances, non-coding sequences are preferred over coding sequences. For example, conservation of coding sequences within members of a multigene family may result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. The sequence may be on a particular chromosome, or on a particular region of a chromosome, or on an artificial chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), It maps to bacterial P1 constructs or single chromosomal cDNA libraries (eg, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood. Rev. 7: 127-134; See Track, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Once mapped, a nucleic acid sequence of the present invention can be used to develop a genetic linkage map that correlates, for example, the inheritance of a disease state with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) (eg, Lander, 1988). ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357).
[0266]
Fluorescence in situ hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see, eg, Heinz-Ulrich, et al., (1995) in Meyers, supra, pages 965-968). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or on the website of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Correlation of the location of the gene encoding TMP on the physical chromosome map with a particular disease, or with a predisposition to a particular disease, can help determine the region of DNA associated with this disease. Locating can facilitate the cloning task.
[0267]
The genetic map can be extended using physical mapping techniques, such as linkage analysis using established chromosomal markers, and in situ hybridization of chromosomal specimens. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, can often reveal related markers, even though the exact locus on the chromosome is unknown. This information is valuable to researchers exploring disease genes using positional cloning and other gene discovery techniques. Once the gene (s) involved in the disease or syndrome is loosely positioned by genetic linkage to a particular genomic region, such as the 11q22-23 region of ataxia telangiectasia, any sequence mapping to that region can occur. (See Gatti, RA, et al. (1988) Nature 336: 577-580) for further investigation. The nucleotide sequence of the present invention may be used to discover differences in chromosomal location among the healthy, carrier, and affected individuals due to translocation, inversion, and the like.
[0268]
In another embodiment of the present invention, TMP, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof can be used to screen a library of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for drug screening can be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. Complex formation due to binding of TMP to the agent to be tested may be measured.
[0269]
Another drug screening method is used to screen compounds with suitable binding affinity for the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen et al. (1984) PCT Application No. WO84 / 03564). In this method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is washed after reacting with TMP or a fragment thereof. Purified TMP can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, the peptide can be captured using a non-neutralizing antibody and the peptide immobilized on a solid support.
[0270]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of specific binding to TMP compete with the test compound for binding to TMP. In this way, antibodies can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with TMP.
[0271]
In another embodiment, the TMP-encoding nucleotide sequence may be converted to a molecular biology technology that will be developed in the future, using the characteristics of, but not limited to, the currently known nucleotide sequence (triplet genetic code, specific base pairing). (Including interactions).
[0272]
Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention in any way.
[0273]
All of the patent applications, patents, publications mentioned above and below, U.S. Patent Application Nos. 60 / 244,017, 60 / 252,855, 60 / 251,825, and 60/244. No. 60 / 255,085 is hereby incorporated by reference.
[0274]
(Example)
1 cDNA Creating a library
The origin of the Incyte cDNA group is the cDNA library group described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA), and listed in column 5 of Table 4. Some tissues are homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while others are homogenized and dissolved in a suitable mixture of phenol or denaturants. The mixed solution of the denaturing agent is, for example, TRIZOL (Life Technologies) which is a single-phase solution of phenol and guanidine isothiocyanate. The resulting lysate was layered on a cesium chloride cushion solution and centrifuged or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using either isopropanol, sodium acetate and ethanol, or another conventional method.
[0275]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. In some cases, the RNA was treated with DNase. For most libraries, poly (A) + RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Chatsworth CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit, such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0276]
In some cases, RNA was provided to Stratagene, and a corresponding cDNA library was prepared by Stratagene. Otherwise, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) according to the recommended method or a similar method known in the art, and a cDNA library was prepared (Ausubel, supra). , 1997, 5.1-6.6 units, etc.). Reverse transcription was started with oligo d (T) or random primer. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or enzymes. For most libraries, cDNA size selection (300-1000 bp) was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech), or preparative agarose gel electrophoresis. The cDNA was ligated at the compatible restriction sites of a suitable plasmid polylinker. Suitable plasmids include, for example, PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene), PSPORT1 plasmid (Life Technologies) PCDNA2.1 plasmid (Invitrogen, Carlsbad CA), PBK-CMV plasmid (Stratagene), PCR2-TOPOTA plasmid (Invitrogen) (Invitrogen). Stratagene), pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA) or plNCY (Incyte Genomics), or derivatives thereof. Recombinant plasmids were transformed into competent Escherichia coli cells such as XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR from Stratagene, or DH5α, DH10B or ElectroMAX DH10B from Life Technologies.
[0277]
2 cDNA Clone isolation
Example 1The plasmid obtained as described above was recovered from host cells using a UNIZAP vector system (Stratagene).in VivoThis was done by excision or by cell lysis. Method of purifying plasmid, Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep purification kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAGEN Inc. QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid and QIAwell 8 Ultra Plasmid Purification System, R . E. FIG. A. L. At least one of the Prep 96 plasmid purification kits was used. After precipitation, the plasmid was resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0278]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysate using direct binding PCR in a high-throughput format (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling process of the host cells was performed in a single reaction mixture. Samples were processed, stored in 384-well plates, and the concentration of amplified plasmid DNA was determined fluorometrically using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a FLUOROSKANII fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Quantified.
[0279]
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in, was sequenced as shown below. The cDNA sequencing reaction can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or a PTC-200 thermal cycler (MJ Research) and a HYDRA microdispenser (Robins ScientificAMIBlACI200B). Treated in conjunction with a transfer system. The cDNA sequencing reaction was performed using a reagent provided by Amersham Pharmacia Biotech or an ABI sequencing kit, for example, an ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied reagent prepared from Applied reagent kit). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions, and for detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics) or ABI PRISM 373 using standard ABI protocols and base pairing software or A 377 sequencing system (Applied Biosystems) or other sequence analysis system known in the art was used. The reading frame within the cDNA sequence was identified using standard methods (outlined in Ausubel, 1997, 7.7 Units, supra). Select some cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the technique disclosed in US Pat.
[0280]
The polynucleotide sequence derived from Incyte cDNA was validated by removing the vector, linker and poly (A) sequences and masking ambiguous base pairs. An algorithm and a program based on BLAST, dynamic programming and flanking dinucleotide frequency analysis were used. Next, an inquiry about the Incyte cDNA sequences or their translation was made to one selected from the following database group. Public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM, PROTEOME, humans, rats, mice, nematodes (Caenorhabditis elegans),yeast(Saccharomyces cerevisiae), Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe)andCandida albicans(Incyte Genomics, Palo Alto CA) and a family of hidden Markov model (HMM) -based protein families, such as PFAM (HMM analyzes the consensus primary structure of gene families) (See, eg, Eddy, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365). Queries were made using programs based on BLAST, FASTA, BLIMPS, and HMMER. An Incyte cDNA sequence was constructed to generate a full-length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNAs, GenBank ESTs, stitched sequences, stretched sequences, or Genscan predicted coding sequences (Examples 4 and 5) Was used to extend the Incyte cDNA population to full length. Populations were screened for open reading frames using a program based on Phred, Phrap and Consed for construction and a program based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full length polypeptide sequence. Alternatively, the polypeptides of the invention may start at any methionine residue of the full length translated polypeptide. Subsequent queries of the full-length polypeptide sequence group were sent to the GenBank protein database group (genpept), SwissProt, PROTEOME database group, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite databases, and hidden Markov models such as PFAM. HMM) -based protein family databases. Full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Sequence alignments of polynucleotides and polypeptides are generated using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm incorporated in the MEGALIGN Multi-Sequence Alignment Program (DNASTAR). It also calculates the percent identity between aligned sequences.
[0281]
Table 7 outlines the tools, programs, and algorithms used for analysis and construction of the Incyte cDNA and full-length sequence, as well as applicable descriptions, references, and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 7 and a brief description of them is shown in column 2. Column 3 is a preferred reference, all references being incorporated by reference in their entirety. If applicable, column 4 indicates the score, probability value, or other parameter used to evaluate the strength of the match between the two sequences (higher score or lower probability value, 2 Sequence identity is high).
[0282]
The programs described above for the construction and analysis of full-length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NOs: 18-34. Fragments of about 20 to about 4000 nucleotides useful for hybridization and amplification techniques are shown in Table 4, column 4.
[0283]
4 Genome DNA And editing of coding sequences from
To identify putative transmembrane proteins, a Genscan gene identification program was first run against public genomic sequence databases (eg, gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94, Burge, C. and S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). This program ligates the predicted exons to form an assembled cDNA sequence, ranging from methionine to stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences analyzed at one time by Genscan was set at 30 kb. To determine which of these Genscan predicted cDNA sequences encode the transmembrane protein, the encoded polypeptide was queried and analyzed for the transmembrane protein in a PFAM model. Potential transmembrane proteins were also identified by homology to the Incyte cDNA sequences already annotated as transmembrane proteins. These selected Genscan predicted sequences were then compared by BLAST analysis to the public databases genpept and gbpri. If necessary, the Genscan predicted sequence was edited by comparison to the top BLAST hits from genpept to correct for errors in the Genscan predicted sequence, such as extra or removed exons. BLAST analysis has also been used to find any Incyte cDNA or public cDNA coverage of the Genscan predicted sequence, and thus provides evidence of transcription. If Incyte cDNA coverage was available, this information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence. The full-length polynucleotide sequence isExample 3Genscan predicted coding sequences were constructed from Incyte cDNA sequences and / or public cDNA sequences using the construction process described in. Alternatively, the full length polynucleotide sequence is fully derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0284]
5 cDNA Construction of genome sequence data using sequence data
Stitch array ( Stitched Sequence )
The partial cDNA sequence group isExample 4Were extended using the exon group predicted by the Genscan gene identification program described in (1).Example 3The partial cDNA group constructed as described in (1) was mapped to genomic DNA. In addition, it was decomposed into clusters including related cDNAs and exons predicted by Genscan from one or more genomic sequences. To integrate cDNA and genomic information, each cluster was analyzed using some algorithm based on graph theory and dynamic programming to generate potential splicing variant sequences. Sequences were subsequently verified, edited or extended to create full length sequences. Sequence section groups in which the total length of the sections was in two or more sequences were identified in the cluster, and the section groups identified in this manner were considered to be equal due to transitivity. For example, if a section is present in one cDNA and two genomic sequences, all three sections were considered equal. This process allows unrelated but contiguous genomic sequences to be linked and cross-linked with cDNA sequences. The sections identified in this way are "stitched" together with the stitch algorithm so that they appear along their parent sequences, to generate the longest possible sequence and the mutated sequence group. The linkage between sections that follow along one type of parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) has priority over the linkage that changes parent type (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated by BLAST analysis and compared to the public databases genpept and gbpri. The incorrect exon groups predicted by Genscan were corrected by comparison to the top BLAST hits from genpept. If necessary, the sequences were further extended using additional cDNA sequences or by examining genomic DNA.
[0285]
Stretch array ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, using the BLAST program, public databases such as GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes databases are obtained.Example 3Were queried for the partial cDNAs constructed as described in. Next, the closest GenBank protein homolog was identified by BLAST analysis with the Incyte cDNA sequence orExample 4As described in any of the GenScan exon predicted sequences described above. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to generate a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto a GenBank protein homolog. Insertions or deletions may occur within the chimeric protein relative to the original GenBank protein homolog. GenBank protein homologs, chimeric proteins or both were used as probes to search homologous genomic sequences from public human genome databases. In this way, a partial DNA sequence was "stretched" or extended by the addition of a homologous genomic sequence. The resulting stretch sequences were examined to determine if they contained the complete gene.
[0286]
6 Chromosome mapping of TMP-encoding polynucleotide
The sequences used to construct SEQ ID NOs: 18-34 were compared to those in the Incyte LIFESEQ database and public domain databases using an implementation of the BLAST et al. Smith-Waterman algorithm. Sequences from these databases consistent with SEQ ID NOs: 18-34 were combined into clusters of contiguous and overlapping sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 7). Using radiation hybrid and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Institute (WIGR), and Genethon, any clustered sequence is already It was determined whether it was mapped. If the mapped sequence was included in a cluster, the entire sequence of that cluster was assigned to a location on the map, along with the individual SEQ ID NO.
[0287]
Locations on the map are represented as ranges or intervals of human chromosomes. The location on the map of centiMorgan spacing is measured relative to the end of the p-arm of the chromosome (Centimorgan (cM) is a unit of measure based on the recombination frequency between chromosomal markers. On average, 1 cM is Approximately one megabase (Mb) of human DNA, although this value varies widely due to recombination hotspots and cold spots). The cM distance is based on Genethon-mapped genetic markers that provide boundaries for radiation hybrid markers whose sequences are contained within each cluster. Disease genes that have already been identified using the human genome map and other resources available to the general public, such as NCBI “GeneMap '99” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/), It can be determined whether or not the area is mapped in or near the above section.
[0288]
In this manner, SEQ ID NO: 22 maps within the interval from 59.50 to 62.50 centiMorgan on chromosome 11, and SEQ ID NO: 26 maps from 179.2 to 186.18 on chromosome 1. Mapped within a 4 centimorgan section.
[0289]
7. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of gene transcripts, and involves the hybridization of labeled nucleotide sequences to membranes bound by RNA from specific cell types or tissues. (See Sambrook, Chapter 7, and Ausubel (1995), Chapters 4 and 16).
[0290]
The same or related molecules were searched in cDNA databases such as GenBank and LIFESEQ (Incyte Genomics) using a similar computer technique applying BLAST. Northern analysis is much faster than some membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether to classify a particular match as exact or homologous. The search criterion is the product score, which is defined by the following equation.
[0291]
(Equation 1)

The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length at which the sequences match. The product score is a normalized value from 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent sequence identity of the nucleotides and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. A BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each matching base in a pair of high scoring segments (HSP) and assigning -4 to each mismatching base. Two sequences may share more than one HSP (separated by a gap). If there is more than one HSP, the product score is calculated using the segment pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the entire shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when one end matches 100% and overlaps 70%, or the other end matches 88% and overlaps 100%. The product score 50 is obtained when either end matches 100% and overlaps 50%, or matches 79% and overlaps 100%.
[0292]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding TMP is analyzed against the tissue of origin. For example, one full-length sequence is the Incyte cDNA sequence (Example 3) Are constructed so as to at least partially overlap with the above. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue is classified into one of the following organ / tissue categories. Cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryonic structure, endocrine system, exocrine glands, female genitalia, male genitalia, germ cells, blood and immune system, liver, musculoskeletal system, nervous system, pancreas, respiratory system, Sensory organs, skin, stomatognathic system, non-classified / mixed or urinary tract. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / pathology categories: cancer, cell lines, development, inflammation, nervous, trauma, cardiovascular, pool, and others. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The percentages obtained reflect tissue-specific and disease-specific expression of the cDNA encoding TMP. cDNA sequence and cDNA library / tissue information can be obtained from the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0293]
8. Elongation of polynucleotide encoding TMP
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragments using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragments of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 'extension of a known fragment, and another primer was synthesized to initiate 3' extension of a known fragment. The design of the starting primers was performed using OLIGO 4.06 software (such as OLIGO 4.06 software (such as about 22-30 nucleotides in length, GC content of about 50% or more, and annealing to the target sequence at a temperature of about 68 to about 72 ° C.). National Biosciences) or another suitable program. All extensions of the nucleotides that would result in hairpin structure and primer-primer dimer were avoided.
[0294]
The sequence was extended using the selected human cDNA library group. If more than one step extension was needed or desired, additional primers or nested sets of primers were designed.
[0295]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research). The reaction mixture has the template DNA and 200 nmol of each primer. In addition, Mg^{2 +}And (NH₄)₂SO₄And a reaction buffer containing 2-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer pair PCI A and PCI B with the following parameters.
Step 1 3 minutes at 94 ° C
Step 2 15 seconds at 94 ° C
Step 3 at 60 ° C for 1 minute
Step 4 2 minutes at 68 ° C
Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 5 minutes at 68 ° C
Step 7 Store at 4 ° C
Alternatively, amplification was performed on the primer pair T7 and SK + with the following parameters.
Step 1 3 minutes at 94 ° C
Step 2 15 seconds at 94 ° C
Step 3 1 minute at 57 ° C
Step 4 2 minutes at 68 ° C
Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 5 minutes at 68 ° C
Step 7 Store at 4 ° C
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25 (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence The DNA is distributed to each well of a photometer plate (Corning Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent, and the measurement is performed. Plates were scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure the fluorescence of the sample and quantify the DNA concentration. An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel to determine which reaction was successful in extending the sequence.
[0296]
The extended nucleotides were desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested with CviJI choleravirus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), sonicated or sheared, and pUC18 vector (Amersham PharmaciaBiacia). Was reconnected. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, the fragments were excised, and the agar was digested with Agar ACE (Promega). The extended clone was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA), treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) and filled in with a restriction site. E. coli cells were transfected. The transfected cell group was selected in a medium containing an antibiotic, and each colony was collected and cultured in a 384-well plate group in an LB / 2X carbenicillin culture solution at 37 ° C. overnight.
[0297]
The cells were lysed, and the DNA was PCR-amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure.
Step 1 3 minutes at 94 ° C
Step 2 15 seconds at 94 ° C
Step 3 at 60 ° C for 1 minute
Step 4 2 minutes at 72 ° C
Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 29 times
Step 6 5 minutes at 72 ° C
Step 7 Store at 4 ° C
For quantification of DNA, PICOGREEN reagent (Molecular Probes) was used as described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples were diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), DYENAMIC energy transfer sequencing primer, and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing kit. It was sequenced using a ready reaction kit (Applied Biosystems).
[0298]
Similarly, the full length polynucleotide sequence was verified using the procedure described above. Alternatively, 5 'regulatory sequences were obtained using oligonucleotides designed for such extensions and some suitable genomic libraries using the full length polynucleotides and the procedure described above.
[0299]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
Screen cDNA, mRNA, or genomic DNA using a hybridization probe from SEQ ID NO: 18-34. Although the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs is specifically described, essentially the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences), 50 pmol of each oligomer, [γ-32P] adenosine triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech) 250 μCi, and T4 polynucleotide kinase ( DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is substantially purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). 107 counts per minute in a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba I or Pvu II (DuPont NEN) endonuclease An aliquot containing the labeled probe is used.
[0300]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, blots are sequentially washed at room temperature under conditions of, for example, 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared using autoradiography or an alternative imaging means.
[0301]
10 microarray
Combining or synthesizing array elements on a microarray may be achieved using photolithography, piezoelectric printing (see inkjet printing, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques and means derived therefrom. . In each of the above techniques, the substrate should be a solid with a uniform, non-porous surface (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, a procedure similar to dot blot or slot blot may be used to place and attach elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical binding procedures. Regular arrays can be made using available methods and machines known to those of skill in the art and can have any suitable number of elements (eg, Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470). (Sharon. D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31).
[0302]
Full-length cDNAs, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art, such as LASERGENE software (DNASTAR). Array elements hybridize with the polynucleotide in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample, and hybridization at each array element is detected using a fluorescence scanner. Alternatively, laser desorption and mass spectrometry can be used to detect hybridization. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of a microarray in one embodiment is described in detail below.
[0303]
Preparation of tissue or cell samples
Using the guanidinium thiocyanate method to isolate total RNA from tissue samples, poly (A)⁺The oligo (dT) cellulose method is used to purify RNA. Each poly (A)⁺RNA samples were prepared using MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, Reverse transcription is performed using 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). The reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGHT kit (Incyte) using 200 ng of poly (A).⁺Performed in a 25 ml volume containing RNA. Specific control poly (A)⁺RNAs are derived from non-coding yeast genomic DNAin in vitroSynthesized by transcription. After incubation at 37 ° C for 2 hours, each reaction sample (one labeled Cy3 and the other labeled Cy5) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide, incubated at 85 ° C for 20 minutes, and reacted. To degrade the RNA. To purify the sample, two successive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories (CLONTECH), Palo Alto CA) are used. After mixing, 1 ml of glycogen (1 mg / ml), 60 ml of sodium acetate, and 300 ml of 100% ethanol are used for ethanol precipitation of the two reaction samples. The sample is then completely dried using SpeedVAC (Savant Instruments, Holbrook NY) and resuspended in 14 μl of 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0304]
Preparation of microarray
An array element group is prepared using the sequence of the present invention. Each array element is amplified from a vector-containing bacterial cell population by the cloned cDNA inserts. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequences flanking the cDNA insert. The array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount of more than 5 μg by 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0305]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope slides (Corning) are ultrasonically washed in 0.1% SDS and acetone, and during and after treatment with copious amounts of distilled water. Slides were etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed in copious amounts of distilled water, and 0.05% aminopropylsilane (Sigma) in 95% ethanol. ). The coated glass slide is cured in an oven at 110 ° C.
[0306]
Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. This patent is hereby incorporated by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed robotic apparatus (robotic apparatus). The apparatus now places approximately 5 nl of array element samples per slide.
[0307]
To UV-crosslink the microarray, use the STRATALLINKER UV crosslinker (Stratagene). Wash the microarray once with 0.2% SDS and three times with distilled water at room temperature. To block each non-specific binding site, the microarray was incubated in 0.2% casein in phosphate-buffered saline (PBS) (Tropix, Bedford MA) at 60 ° C. for 30 minutes and then before. Wash with 0.2% SDS and distilled water as before.
[0308]
Hybridization
9 μl of the sample mixture used for the hybridization reaction contains 0.2 μg of each of the cDNA synthesis products labeled with Cy3 or Cy5 in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted 1.8 cm on the microarray surface.²Cover with cover glass. Transfer the array to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. To keep the humidity in the chamber at 100, add 140 μl of 5 × SSC to one corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. The array was washed in a first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) at 45 ° C. for 10 minutes, and in a second wash buffer (0.1 × SSC) at 45 ° C. for 10 minutes. Wash and dry twice.
[0309]
detection
To detect reporter-labeled hybridization complexes, an Innova 70 mixed gas 10W laser (Coherent, Santa Clara CA) capable of generating spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation was provided. Use a microscope. A 20 × microscope objective (Nikon, Melville NY) is used to focus the excitation laser light on the array. The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of the microscope and raster scanned through the objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example is scanned at a resolution of 20 μm.
[0310]
In two different scans, the mixed gas multiline laser excites the two fluorescent dyes sequentially. The emitted light is separated based on the wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorescent dyes. Suitable filters are placed between the array and the photomultiplier to filter the signal. The maximum emission wavelength of the fluorescent dye used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorochromes simultaneously, but scans once for each fluorochrome using a suitable filter in the laser source, and typically scans each array twice.
[0311]
Usually, to calibrate the sensitivity of each scan, a cDNA control species is added to the sample mixture at some known concentration, and the signal intensity generated by the control species is used. A particular location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location is correlated with a 1: 100,000 weight ratio of hybridization species. When two samples from different sources (eg, representative test and control cells) are each labeled with a different fluorescent dye and hybridized to a single array to identify genes that express differently. Performs calibration by labeling a cDNA sample to be calibrated with two types of fluorescent dyes and adding equal amounts to each of the hybridization mixtures.
[0312]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) conversion board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as a signal intensity mapped image using a linear 20-color conversion from a blue (low signal) to a red (high signal) pseudo-color scale. The data is also analyzed quantitatively. If two different fluorochromes are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the fluorochromes (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each fluorophore.
[0313]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescent signal in each element is integrated, and a value corresponding to the average intensity of the signal is obtained. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0314]
11 Complementary polynucleotide
By using a group of sequences encoding TMP or a group of sequences complementary to any part thereof, the expression of native TMP is detected, reduced, or inhibited. Although the use of oligonucleotides containing about 15-30 base pairs is described, essentially the same procedure is used for fragments of smaller or larger sequences. Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of TMP are used to design the appropriate oligonucleotides. To inhibit transcription, designing and using a complementary oligonucleotide from the most unique 5 'sequence prevents the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, the ribosomes are prevented from binding to transcripts encoding TMP by designing complementary oligonucleotides.
[0315]
12 Expression of TMP
Expression and purification of TMP can be performed using a bacterial or viral based expression system. The cDNA is subcloned into a suitable vector so that the TMP is expressed in bacteria. A vector having an antibiotic resistance gene and an inducible promoter for increasing the level of cDNA transcription is used. Examples of such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Expression of TMP in antibiotic resistant bacteria is induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of TMP in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect or mammalian cell lines.Autographica californicaIt is performed by infecting a recombinant form of nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Replacement of the non-essential polyhedrin gene of baculovirus with cDNA encoding TMP involves homologous recombination or bacterial mediated gene transfer with transfer plasmid mediated. Viral infectivity is maintained and a strong polyhedron promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are often a type of night mothSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification to the baculovirus is required (Engelhard. EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945).
[0316]
In most expression systems, TMP will be a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His. Can be performed quickly and in one go. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum, which allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST element can be proteolytically cleaved from TMP at the specific site engineered. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which six histidine residues are continuously extended enables purification on a metal chelating resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) supra, Chapters 10 and 16. Using TMP purified by these methods directly, where applicable,Examples 16 and 17Can be performed.
[0317]
13 Functional Assay
TMP function is assessed by the expression of TMP-encoding sequences at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector with a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Examples of vectors selected include pCMV SPORT (Life Technologies) and pCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad CA), both with cytomegalovirus promoters. Using a liposome formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein provides a means to distinguish between transfected and non-transfected cells. In addition, expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by expression of the labeled protein. The labeling protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or a CD64-GFP fusion protein. Using an automated, laser optics-based technique, flow cytometry (FCM), transfected cells expressing GFP or CD64-GFP are identified, and their apoptotic state and other cellular properties are determined. evaluate. FCM detects and quantifies the uptake of fluorescent molecules that diagnose phenomena that precede or coincide with cell death. Such phenomena include changes in nuclear DNA content measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and granularity measured by forward scattered light and 90 ° side scattered light, Down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of deoxyuridine, alteration of cell surface and intracellular protein expression as measured by reactivity with specific antibodies, and fluorescent complex annexin V protein to cell surface Changes in plasma membrane composition as measured by the binding of For flow cytometry, see Ormerod, M .; G. FIG. (1994)Flow Cytometry, Oxford, New York, NY has a description.
[0318]
The effect of TMP on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with a sequence encoding TMP and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be efficiently separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL, Lake Success NY). mRNA can be purified from cells by methods well known to those skilled in the art. Expression of mRNA encoding TMP and another gene of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0319]
14 Preparation of TMP specific antibody
Substantially purified TMP is produced by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495) or other purification techniques. Immunize rabbits using standard protocols to produce antibodies.
[0320]
Alternatively, the TMP amino acid sequence is analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine the region of high immunogenicity, and the corresponding oligopeptide is synthesized and used to generate antibodies using methods well known to those skilled in the art. Produce. The selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).
[0321]
Usually, oligopeptides of about 15 residues in length are synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems) using FMOC chemistry and by reaction with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). Conjugated to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see, eg, Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in complete Freund's adjuvant. In order to test the anti-peptide activity and anti-TMP activity of the obtained antiserum, for example, a peptide or TMP is bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, and washed. And react with a radioactive iodine-labeled goat anti-rabbit IgG.
[0322]
15 Purification of natural TMP using specific antibodies
In order to substantially purify natural or recombinant TMP, immunoaffinity (immunoaffinity) chromatography using antibodies specific to TMP is performed. The immunoaffinity column is formed by covalently bonding an anti-TMP antibody to a resin for activation chromatography such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
[0323]
The culture solution containing TMP is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of TMP (for example, with a buffer having high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that disrupt the binding of the antibody to the TMP (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of a chaotrope such as urea or thiocyanate ions) to recover the TMP.
[0324]
16 Identification of molecules that interact with TMP
TMP or a biologically active TMP fragment¹²⁵Label with I Bolton Hunter reagent. (See, e.g., Bolton, AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539). The candidate molecules pre-arranged in each well of the multi-well plate are incubated with the labeled TMP, washed, and all wells with the labeled TMP complex are assayed. Using the data obtained at the various TMP concentrations, values for the quantity, affinity, and association of TMP bound to the candidate molecule are calculated.
[0325]
Alternatively, molecules that interact with TMP are identified in Fields, S .; And O. Analysis is performed using a commercially available kit based on a 2-hybrid system, such as the yeast two-hybrid system described in Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech). .
[0326]
TMP is also used in the PATHHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0327]
17 Demonstration of TMP activity
TMP gap junction activity
To demonstrate the gap junctional activity of TMP, the ability to induce the formation of intercellular channels is examined by injecting a pair of Xenopus oocytes with TMP cRNA (Hennemann, supra). One week before experimental injection of TMPcRNA, oocytes are injected with antisense oligonucleotides to TMP to reduce background. Incubation of the TMPcRNA-injected oocytes is performed overnight, the yolk membrane is stripped, and paired junction current recordings are performed with a two-cell voltage clamp. The measured conductance is proportional to the gap junction activity of TMP.
[0328]
Alternatively, an electrophysiological assay for ion conductance is used to measure the ion channel activity of TMP for assaying TMP activity. Mammalian cell lines, such as COS7, HeLa, or CHO, can be transformed with a eukaryotic expression vector encoding TMP to express TMP. Eukaryotic cell expression vectors are commercially available and techniques for introducing them into cells are well known to those skilled in the art. Co-transformation of these cells with a second plasmid that expresses any one of a number of marker genes, such as β-galactosidase, allows rapid identification of cells that have taken up and expressed the foreign DNA. . After transformation, the cells are incubated for 48-72 hours under conditions suitable for the cell line to express and accumulate TMP and β-galactosidase.
[0329]
Transformed cells expressing β-galactosidase are stained blue when a suitable colorimetric substrate is added to the medium under conditions known in the art. The stained cells are tested for differences in membrane conductance using electrophysiological techniques known in the art. Untransformed cells and / or cells using only the vector sequences or only the β-galactosidase sequence for transformation are tested in parallel, as controls. Cells expressing TMP will have higher anion or cation conductance than control cells. The contribution of TMP to conductance can be confirmed by incubating cells with antibodies specific for TMP. Antibodies block the pores in the ion channel and the associated conductance by binding to the extracellular side of TMP.
[0330]
Transmembrane protein activity of TMP
Certain assays for TMP activity measure TMP expression at the cell surface. The cDNA encoding TMP is transfected into a suitable mammalian cell line. Cell surface proteins are labeled with biotin as described (de la Fuente, MA et al. (1997) Blood 90: 2398-2405). Immunoprecipitation is performed using a TMP-specific antibody, and the immunoprecipitated sample is analyzed using SDS-PAGE and immunoblot techniques. The ratio between labeled and unlabeled immunoprecipitin is proportional to the amount of TMP expressed on the cell surface.
[0331]
Certain other assays for TMP activity are based on prototype assays for ligand / receptor mediated modulation of cell proliferation. This assay measures the amount of newly synthesized DNA in Swiss mouse 3T3 cells expressing TMP. A suitable mammalian expression vector having a cDNA encoding TMP is added to quiescent 3T3 cultured cells using transfection methods well known in the art. The transformed cells are³H] Incubate in the presence of thymidine and variable amounts of TMP ligand. Incorporated into acid-precipitable DNA [³[H] Thymidine is measured at appropriate time intervals using a tritium radioisotope counter. The amount incorporated is directly proportional to the amount of newly synthesized DNA. A linear dose response curve over a TMP ligand concentration range of at least 100-fold is indicative of receptor activity. The definition of one unit of activity per milliliter is the concentration of TMP that produces a 50% response level, and 100% gives [³H] thymidine is incorporated into acid-precipitable DNA to the maximum extent (McKay, I. and Leigh, I., eds. (1993)Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, p. 73).
[0332]
Those skilled in the art may make various modifications to the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with certain embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. . Various modifications of the methods of practicing the invention described herein that are apparent to those skilled in molecular biology or related fields are clearly within the scope of the following claims.
[0333]
(Brief description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0334]
Table 2 shows the GenBank identification numbers and annotations of the GenBank homologs closest to the polypeptide of the invention. The probability score that each polypeptide and its homolog (one or more) match is also shown.
[0335]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the present invention having the predicted motifs and domains, along with the methods, algorithms and searchable databases used to analyze the polypeptides.
[0336]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to construct the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequence.
[0337]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotide of the present invention.
[0338]
Table 6 is a supplementary table explaining tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0339]
Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references, and threshold parameters.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[Table 11]

[Table 12]

[Table 13]

[Table 14]

[Table 15]

[Table 16]

[Table 17]

[Table 18]

[Table 19]

[Table 20]

[Table 21]

Claims (89)

An isolated polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17 (SEQ ID NOs: 1-17); (b) at least 90 amino acid sequences selected from the group having SEQ ID NOs: 1-17 A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: (c) SEQ ID NO: 1-17; (d) SEQ ID NO: Immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having 1-17 2. The isolated polypeptide of claim 1, having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. 5. The isolated polynucleotide of claim 4, having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34. A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6. A genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide according to claim 6. A method for producing the polypeptide of claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide having a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. When,
(B) recovering the polypeptide thus expressed, wherein the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. A method comprising: The method of claim 9, wherein the polypeptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e):
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18-34 (b) at least 90% identical to a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 18-34 Polynucleotides (e) (a) to (d) complementary to the polynucleotides (d) and (b) complementary to the polynucleotides of the polynucleotides (c) and (a) having such natural polynucleotide sequences. ) RNA equivalents 13. An isolated polynucleotide having at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12. A method for detecting a target polynucleotide having the polynucleotide sequence according to claim 12 in a sample,
(A) hybridizing the sample with a probe having at least 20 contiguous nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, and combining the probe with the target polynucleotide or a fragment thereof; A process wherein a probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions in which a hybridization complex is formed,
(B) detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. The method of claim 14, wherein the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides. A method for detecting a target polynucleotide having the polynucleotide sequence according to claim 12 in a sample,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) detecting the presence or absence of the amplified target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof when the target polynucleotide or the fragment exists. Method. A composition comprising the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 18. The composition of claim 17, wherein said polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. 18. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional TMP, comprising the step of administering the composition of claim 17 to a patient in need of such treatment. how to. A method for screening a compound to confirm the effectiveness of the polypeptide of claim 1 as an agonist,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting agonist activity in the sample. A composition comprising the agonist compound identified by the method of claim 20 and also comprising a pharmaceutically acceptable excipient. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional TMP, comprising administering the composition of claim 21 to a patient in need of such treatment. how to. A method for screening a compound for confirming the effectiveness of the polypeptide of claim 1 as an antagonist,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample. A composition comprising the antagonist compound identified by the method of claim 23 and a pharmaceutically acceptable excipient. 25. A method of treating a disease or condition associated with over-expression of functional TMP, comprising administering a composition of claim 24 to a patient in need of such treatment. A method for screening a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1,
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under suitable conditions;
And (b) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under conditions that permit the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound, A method wherein the altered activity of the polypeptide of claim 1 indicates a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound effective for altering expression of a target polynucleotide having the sequence of claim 5, comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting the altered expression of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of said target polynucleotide in the presence of said compound in a variable amount and in the absence of said compound. A method for calculating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) hybridizing the treated nucleic acid of the biological sample with a probe having at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12, wherein the hybridization comprises the hybridization of the probe and the organism. Under conditions where a specific hybridization complex is formed with a target polynucleotide in a biological sample, said target polynucleotide having the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 12 or a fragment thereof. The above process, which is a polynucleotide;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of the hybridization complex in the treated biological sample with the amount of the hybridization complex in the untreated biological sample. A method wherein a difference in the amount of hybridization complex in a biological sample is indicative of the toxicity of the test compound. A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of TMP in a biological sample, comprising:
(A) mixing the biological sample with the antibody of claim 11 under conditions suitable for the antibody to bind to the polypeptide and form a complex between the antibody and the polypeptide; ,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. The antibody of claim 11, wherein
(A) a chimeric antibody (b) a single-chain antibody (c) a Fab fragment (d) an F (ab ') ₂ fragment (e) a humanized antibody. A composition comprising the antibody of claim 11 and an acceptable excipient. 33. A method for diagnosing a symptom or disease associated with the expression of TMP in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the composition of claim 32. 33. The composition of claim 32, wherein said antibody is labeled. 35. A method for diagnosing a symptom or disease associated with the expression of TMP in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of the composition of claim 34. A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody of claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-17 or an immunogenic fragment thereof under conditions for inducing an antibody response;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody with the polypeptide, thereby identifying a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17; Such a method including. A polyclonal antibody produced by the method of claim 36. A composition comprising the polyclonal antibody of claim 37 and a suitable carrier. A method for producing a monoclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-17 or an immunogenic fragment thereof under conditions that induce an antibody response;
(B) isolating antibody-producing cells from the animal;
(C) forming a hybridoma cell producing a monoclonal antibody by fusing the antibody-producing cell with the immortalized cell;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the cultured monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A monoclonal antibody produced by the method of claim 39. A composition comprising the monoclonal antibody of claim 40 and a suitable carrier. The antibody according to claim 11, which is produced by screening a Fab expression library. The antibody according to claim 11, which is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. A method for detecting a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-17 in a sample, comprising:
(A) incubating the antibody according to claim 11 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) detecting specific binding, wherein said specific binding indicates that a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-17 is present in the sample. And how. A method for purifying a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17 from a sample,
(A) incubating the antibody and one sample under conditions permitting specific binding between the antibody according to claim 11 and the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-17. A microarray, wherein at least one element of the microarray is the polynucleotide according to claim 13. A method of generating an expression profile of a sample having a polynucleotide, comprising:
(A) labeling a polynucleotide in a sample;
(B) contacting the elements of the microarray of claim 46 with labeled polynucleotides in a sample under conditions suitable for formation of a hybridization complex;
(C) quantifying the expression of the polynucleotide in the sample. An array comprising various nucleotide molecules attached to unique physical locations on a solid substrate, wherein at least one of said nucleotide molecules is specifically hybridizable to at least 30 contiguous nucleotides of a target polynucleotide. An array having an initial oligonucleotide or polynucleotide sequence, wherein said target polynucleotide is a polynucleotide of claim 12. 49. The array of claim 48, wherein the initial sequence of the oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to at least 30 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the initial sequence of the oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to at least 60 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the initial sequence of the oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to the target polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein the array is a microarray. 49. The array of claim 48, further comprising said target polynucleotide hybridized to a nucleotide molecule having an initial sequence of said oligonucleotide or polynucleotide. 49. The array of claim 48, wherein a linker connects at least one of said nucleotide molecules to said solid substrate. 49. The array of claim 48, wherein each unique physical location on the substrate comprises a plurality of nucleotide molecules, wherein the plurality of nucleotide molecules at any single unique physical location has the same sequence. An array, wherein each unique physical location on the substrate comprises a nucleotide molecule having a sequence that is different from a sequence of nucleotide molecules at another unique physical location on the substrate. 2. The polypeptide according to claim 1, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 3. The polypeptide according to claim 2, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 3, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 4, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 5, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 6, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 7, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 9. The polypeptide according to claim 8, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 9, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 10, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 11, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 13. The polypeptide according to claim 12, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 14. The polypeptide according to claim 13, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 15. The polypeptide according to claim 14, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide according to claim 15, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 17. The polypeptide according to claim 16, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 18. The polypeptide according to claim 17, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 18. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 19. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 20. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 21. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 22. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 23. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 24. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 25. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 26. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 27. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 28. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 29. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 30. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 31. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 32. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 33. 13. The polynucleotide of claim 12, having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 34.