JP2004527214A - Novel glycoproteins and methods of their use - Google Patents

Abstract

The present invention provides novel isolated ARP / BRP polynucleotides and polypeptides bound to or secreted from membranes encoded by the ARP / BRP polynucleotides. ARP and BRP protein multimers are also provided. Further provided are ARP / BRP polypeptides, or derivatives, variants, mutants, or fragments of ARP / BRP polypeptides, ARP / BRP multimeric polynucleotides, or antibodies that immunospecifically bind to the antibodies. The present invention additionally provides methods for utilizing ARP / BRP polypeptides, multimers, polynucleotides, and antibodies for the detection and treatment of a wide range of pathological conditions, such as reproductive disorders, and for other uses. I do.

Description

【００２５】
本発明は、新規糖タンパク質ベータ・サブユニットをコードしているヌクレオチド配列を含む（図１を参照のこと；配列番号１、及び３）。コードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、図２に示される（配列番号２、及び４）。ＧＣＧ Ｓｐｓｃａｎ解析は、図３に示されるようなシグナル配列を推測した（配列番号１０）。
【００２６】
ＢＲＰポリペプチドをコードする核酸を、第１４染色体からのゲノムＤＮＡ配列に含まれるＢＡＣ中に同定した（ジェンバンク登録番号ＡＬ１１８５５）。翻訳開始部位及び終止コドンを含む見かけ上の完全長のＢＲＰコーディング領域が、ＢＡＣ中で同定された。ＢＲＰコーディング領域は、２つのエクソンと１つのイントロンを含んでいる。ＢＲＰ ＤＮＡ配列は、１２９のアミノ酸のポリペプチドをコードする３８７のヌクレオチドを含んでいる（配列番号２）。
【００２７】
ＢＲＰ核酸配列は、最初から最後のシステイン残基をコードする部分の間で、ＦＳＨベータ・サブユニットに対して約５０％の同一性を示す。 ＢＲＰタンパク質の推測される成熟コーディング領域は、３０〜３５ ％の同一性をホルモンの糖タンパク質ファミリーのベータ・サブユニットに対して示す。
【００２８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ、タンパク質中の特定可能なドメインの存在は、ソフトウェア・アルゴリズム、例えばＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、及びＰｒｉｎｔｓを用いた検索により決定され、次にＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ ： ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いて交差性ドメイン合致（又は番号）によってＩｎｔｅｒｐｒｏ番号を決定する。ＤＯＭＡＩＮの結果、ＡＲＰ／ＢＲＰを、逆位特異性ＢＬＡＳＴ解析を用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴ解析ソフトウェア・サンプル・ドメインは、Ｓｍａｒｔ及びＰｆａｍ情報収集により発見した。
【００２９】
糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット・スーパーファミリーのタンパク質の他の既知のメンバーと一致するヒトＢＲＰは、表２に示されるように糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン及びシスチン・ノット・ドメインを含んでいる。
【００３０】
【表２】

【００３１】
「Ｅ値」又は「期待」値は、検索されたデータベース内に、ただ偶然にアラインされた配列がクエリー配列に対してそれらの類似性を達成しうる可能性を示す数字である。期待値（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する時、当業者が単に偶然に発見することが「期待」できるヒット数を説明する指標である。それが２つの配列の間の一致に割り当てられるスコア（Ｓ）により指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は配列間の一致のために存在するランダムなバックグラウンド・ノイズを説明する。期待値は、結果を報告するための重要性しきい値を作製する好都合な方法として使われる。ブラスティングのために使われるデフォルト値は、一般に０．０００１に設定される。期待値は、一致の重要性を報告するためのＰ値（確率）の代わりに使われもする。例えば、当業者（ｏｎｅ）がヒットに割り当てたＥ値は、特定のサイズのデータベースにおいて、当業者がただ偶然に同様のスコアにより１の一致を発見することを期待しうることを意味すると解釈されうる。ゼロのＥ値は、当業者が、ただ偶然に同様のスコアでの一致を発見することが期待できないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。
【００３２】
糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン・コンセンサス配列を持つヒトＢＲＰ、並びに糖タンパク質ホルモン・ベータ・スーパーファミリーの他のメンバーのタンパク質のアラインメントを、表３に示す。黒く輪郭を描いたアミノ酸残基は、部位の同一性を示す；灰色のアミノ酸残基は、保存的なアミノ酸置換の部位を示す。
【００３３】
【表３】

【００３４】
糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン・コンセンサス配列を持つヒトＢＲＰ、並びにシスチン・ノット・スーパーファミリーの他のメンバーのタンパク質のアラインメントを、表４に示す。
【００３５】
【表４】

【００３６】
ヒトＢＲＰの推定のシグナルペプチド及びシステインパターンは、絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ・サブユニットのｃｙｓ残基２６及び１１０に対応するシートベルト・システインの欠如を除いて、先に報告された糖タンパク質ホルモン・サブユニットのそれに類似する。（図７Ａを参照のこと）。さらに、ヒトＢＲＰタンパク質のグリコシル化パターンが、既知の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニットのそれと異なる。（図７Ｂを参照のこと）。
【００３７】
多組織発現（ＭＴＥ）解析は、脳下垂体におけるＢＲＰ発現を確認した。
【００３８】
同様に、本発明は、新規糖タンパク質アルファ・サブユニットをコードしているヌクレオチド配列を含む。（図１２を参照のこと；配列番号１７、１９、及び２１）。ＧＣＧ Ｓｐｓｃａｎ解析は、ＡＲＰのシグナル配列を推定した。（配列番号２８、２９、及び３０）。前記コードされたポリペプチドのＡＲＰアミノ酸配列を、図１３に示される（配列番号１８、２０、及び２２）。
【００３９】
ＡＲＰコード配列は、第１１染色体からのゲノムＤＮＡ配列を含むＢＡＣ中に存在する。（ジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９）。翻訳開始部位及び終止コドンを含む完全長のＡＲＰコーディング領域が、ＢＡＣ中に確認された。ＡＲＰのノーザン解析が、約８００〜９００塩基の単一ｍＲＮＡ種を確認する（図１７）。ＡＲＰコーディング領域は、３つのエクソンと２つのイントロンを既知のアルファ・サブユニット遺伝子における第２及び第３イントロンの位置に類似した位置に含んでいる（図１６を参照のこと）。ＡＲＰ ＤＮＡ塩基配列は、１２９のアミノ酸を持つことが推測されるポリペプチドをコードする３８７の塩基を持つ（配列番号１８）。
【００４０】
ＡＲＰ核酸配列は、ホルモンの糖タンパク質ファミリーのアルファ・サブユニットに対し２１％の同一性を、そしてベータ・サブユニットに対し１４％の同一性を示す。ＡＲＰタンパク質の推測される成熟コーディング領域は、ホルモンの糖タンパク質ファミリーのアルファ・サブユニットに対し２２％の同一性を、そしてベータ・サブユニットに対し１３％の同一性を示す。
【００４１】
その上、ペプチドは、各々のホルモン・ユニットに特有な二次的な構造的モチーフを共有する。
【００４２】
他のアルファ・サブユニット・タンパク質と同様に、ＡＲＰは、第２ループの（開始メチオニンから数えて）Ａｓｎ８１にＮ連結グリコシル化部位を持つ。このグリコシル化部位及び位置は、全てのアルファ・サブユニットで保存されて、完全なホルモン活性のために極めて重要であることがいくつかのホルモンに関して示された。第２ループは、性腺刺激ホルモン及びＴＳＨのアルファ・サブユニットで見られるループに長さが類似している。ＡＲＰのループ配列の終わりは、性腺刺激ホルモン及びＴＳＨのアルファ配列に一致する。アルファにおけるこれらの終末部位は、ベータ・サブユニットとの接触部位であり、そして第２及び第３ループとの交差接触部位であることが知られていている。第２のＮ連結グリコシル化部位も、ベータ・サブユニットの部位と類似した位置でＡＲＰタンパク質の第３ループに存在する。
【００４３】
ＡＲＰは、その配列の中心近くにシステイン対を持ってもいる。この配列は、アルファ・サブユニットの第５９及び６０システインに相当する。この特徴はベータ・サブユニットでは見られないが、しかし、つからないそれがＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーを含む他のシスチン・ノット・タンパク質に見られる。新しい配列中のシステイン対の存在は、第５９アミノ酸と第８７アルファ・アミノ酸のシステイン間のアルファに似たジスルフィド結合を示唆する。
【００４４】
多組織発現（ＭＴＥ）解析は、膵臓と脳下垂体のＡＲＰ発現を確認した。
【００４５】
同様に、本発明は、ＡＲＰとＢＲＰタンパク質の多量体（すなわち重合体で）を含む。本明細書中で使用されるとき、「多量体」及び「重合体」は、互換的に使われる。例えば、多量体は二量体である。本発明のＡＲＰ及びＢＲＰポリペプチド、又はそれらの断片は、例えば他に関連がある糖タンパク質ホルモン（例えば黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））のそれに対して類似した、変更した又は高められた活性を有する糖タンパク質ホルモンを製造するために他のアルファ又はベータ糖タンパク質サブユニットと一緒に多量体を形成するかもしれない。多量体は、ホモ重合体（すなわち、ＡＲＰ−ＡＲＰ、ＢＲＰ−ＢＲＰ）か、又は第２ポリペプチドを持つヘテロ重合体であるかもしれない。前記第２ポリペプチドは、例えば、ＡＲＰ又はＢＲＰと同じ種からであるかもしれない。あるいは、第２ポリペプチドは、異なる種からであるかもしれない。好ましくは、第２ポリペプチドはヒトからである。第２ペプチドは、糖タンパク質ホルモン・ベータ又はアルファ・サブユニットであるかもしれない。あるいは、第２ペプチドは、シスチン・ノット・タンパク質、例えばＮＧＦ、ＨＣＧ、ＰＤＧＦ、及びＴＧＦ−ベータ２である。例えば、ＢＲＰヘテロ重合体は、ＢＲＰタンパク質及びアルファ糖タンパク質サブユニット又はそれらの断片を含んでいる。アルファ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＡＨ１０９５７及びＣＡＣ４３２３４を含んでいる。好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰポリペプチドを持つ多量体を形成する。あるいは、ＡＲＰヘテロ重合体は、ＡＲＰポリペプチド及びベータ糖タンパク質サブユニットを含んでいる。ベータ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号Ｐ０１２２５及びＰ１８８４２を含んでいる。好ましくは、ＡＲＰポリペプチドは、ＢＲＰポリペプチドを持つ多量体を形成する。
【００４６】
これらの先に記載した糖タンパク質に対するＡＲＰ及びＢＲＰポリペプチドの類似性は、ＡＲＰ及びＢＲＰ核酸、ポリペプチド、タンパク質多量体、抗体、並びに本発明の関連化合物がさまざまな生殖及び細胞増殖障害を治療、予防、又は診断に有用であることを証明する。これらの障害は、例えば排卵障害（すなわち、濾胞発達刺激及び排卵誘発）、生殖能力に関係する障害、甲状腺機能低下、又は脳下垂体機能若しくは脳下垂体標的器官に影響する新陳代謝の障害、例えば副腎、甲状腺、生殖腺、及び肝臓を含んでいる。さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、並びにタンパク質多量体は、精子形成を刺激、甲状腺細胞の機能の増強（すなわち、甲状腺ホルモン産生及びヨウ化物捕捉の増加）、性腺機能の調節、性腺ホルモン産生の調節、生殖能力の促進又は抑制に有用でありうる。ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、並びにポリペプチドは、これらの障害を調節する新規薬剤の確認に有用でありうる。
【００４７】
ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸
本発明の１つの側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは核酸をコードする単離された核酸分子、又はそれらの生物学的に活性な部分、並びにＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸（例えばＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ）を確認するためのハイブリダイゼーション・プローブとしての使用、及びＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子の増幅若しくは突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての断片の使用に十分な核酸断片に関する。本明細書中に使用されるとき、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド・アナログを用いて製造したＤＮＡ若しくはＲＮＡのアナログ、それらの誘導体、断片、及びホモログを含むことが意図される。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖であることができるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００４８】
同様に、本発明は、セル内の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰゲノム配列の発現を修飾しうるＤＮＡ構築物を含む。そのような構築物は、ＤＮＡ調節配列及びＤＮＡターゲティング配列を含んでいる。ＤＮＡターゲティング配列は、細胞内のゲノム配列による相同的（ｈｏｍｏｇｏｕｓ）な組み換えを受けることが可能になり、それにより内因性のＡＲＰ／ＢＲＰゲノム配列に作動するようにＤＮＡ制御連結部を配置する。
【００４９】
さらに本発明に含まれるのは、細胞内の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列の発現物を増幅しうるＤＮＡ構築物である。そのような構築物は、増幅可能な遺伝子及びＤＮＡターゲティング配列を含んでいる。ＤＮＡターゲティング配列は、細胞内のゲノム配列との相同的な組み換えを受けることが可能になり、よってＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列が増幅されうるような内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列の動作可能な接続部に増幅可能な遺伝子を配置しうる。
【００５０】
「プローブ」は、好ましくは、少なくとも約１０のヌクレオチド（ｎｔ）、１００ ｎｔ、又は、例えば約６，０００ ｎｔほどの使用に依存して長さの変わる核酸配列に関する。プローブは、同一であるか、類似するか、又は相補的な核酸配列の検出に使われる。より長い長さプローブが通常天然又は組み換えの起源から得られ、高度に特異的で、オリゴマーよりハイブリダイズするのがずっと遅い。プローブは、１本−又は２本鎖であり、ＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、又はＥＬＩＳＡ様の技術に特異性を持つように設計されうる。
【００５１】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源中に存在する他の核酸分子から引き離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、それから核酸が誘導される生体のゲノムＤＮＡの中で本来核酸の側面に位置する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、さまざまな態様において、単離されたＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子は、それから核酸が誘導される細胞（例えば、精巣又は脳下垂体）のゲノムＤＮＡの中で本来核酸分子の側面に位置する、約５ ｋｂ、４ ｋｂ、３ ｋｂ、２ ｋｂ、１ ｋｂ、０．５ ｋｂ、又は０．１ ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。しかも、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組み換え技術により産生されるとき、他の細胞性物質又は培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成されるとき、化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない。
【００５２】
本発明の核酸分子、例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補体は、標準の分子生物学の技術と本明細書中に提供される配列情報を用いて単離されうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸配列の全部又はその一部をハイブリダイゼーション・プローブとして使用することにより、ＡＲＰ／ＢＲＰ分子を標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使って単離しうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９；及びＡｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９３．に記載のとおり）。
【００５３】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノム ＤＮＡを標準のＰＣＲ増幅技術による鋳型及び適当なオリゴヌクレオチド・プライマーとして使用して増幅されうる。そのように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化されて、そしてＤＮＡ配列解析によって特徴づけられる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成技術、例えば自動化されたＤＮＡ自動合成機を使うことによって準備されうる。
【００５４】
本明細書中に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連のつながれたヌクレオチド残基に関し、上記オリゴヌクレオチドには、ＰＣＲ反応に使用されるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づくか、又はそこから設計され、そして特定の細胞又は組織中の同一の、類似の、又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの増幅、確認、又は存在の解明に使われる。オリゴヌクレオチドは、約１０ ｎｔ、５０ ｎｔ、又は１００ ｎｔの長さ、好ましくは、約１５ ｎｔ〜３０ ｎｔの長さを有する核酸配列の一部を含む。１の態様において、１００ ｎｔ未満の長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに配列番号１、３、１７、１９、及び２１又はそれらの相補体の６つの隣接しているヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、そしてプローブとして使用されうる。
【００５５】
他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列にわずかな不一致又は不一致なしに水素結合し、それにより安定な２本鎖を形成する、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【００５６】
本明細書中に使用されるとき、用語「相補的である」は、核酸分子のヌクレオチド・ユニット間のワトソン−クリック型又はフーグスティーン型塩基対形成に関し、そして用語「結合」は、２のポリペプチド若しくは化合物、又は関連したポリペプチド若しくは化合物、あるいはそれらの組み合わせ物の間の物理的又は化学的な相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用などを含む。物理的な相互作用は、直接的であるか又は間接的であるかもしれない。間接的な相互作用は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通して又はそれらによるかもしれない。直接的な結合は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通して又はそれらにより発生するものではなく、むしろ他の実質的な化学的介在のない相互作用に関する。
【００５７】
１の側面において、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＷＥＫＰＩ（配列番号５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含む。
【００５８】
あるいは、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＬＨＰＦＮＶ（配列番号２４）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含み、代わりの態様において、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＬＫＫＶＫＶ（配列番号２５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含む。
【００５９】
場合により、本発明の単離された核酸分子は、アミノ酸配列ＬＨＰＦＮＶ（配列番号２４）及びＬＫＫＶＫＶ（配列番号２５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含む。
【００６０】
しかも、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸配列の一部だけ、例えばプローブ若しくはプライマーとして使われる断片、又はＡＲＰ／ＢＲＰの生物学的に活性な部分をコードする断片を含むことができる。
【００６１】
本明細書中に提供された断片は、それぞれ核酸の場合には特異的にハイブリダイゼーションに、又はアミノ酸の場合にはエピトープの特異的な認識に十分な長さの、少なくとも６の（隣接している）核酸、又は少なくとも４の（隣接している）アミノ酸の配列と定義され、かつ、完全長配列未満の多くともいくつかの部分である。断片は、選択の核酸又はアミノ酸配列のいずれかの隣接している部分から誘導される。誘導体は、本来の化合物から直接に又は修飾、若しくは部分的な置換により形成された核酸配列又はアミノ酸配列である。アナログは、本来の化合物に類似しているが、同一ではない、しかしある成分、若しくはか側鎖に関してそれと異なる構造を持つ核酸配列又はアミノ酸配列である。アナログは、合成又は異なる進化論的な起源からであるかもしれず、かつ、野生型と比較して類似の又は反対の代謝活性を持つかもしれない。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列である。
【００６２】
誘導体又はアナログが以下に記載の修飾された核酸又はアミノ酸を含むとき、誘導体及びアナログは、完全長であるか又は完全長でないかもしれない。本発明の核酸又はタンパク質の誘導体又はアナログは、制限されることなく、様々な態様において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列に渡り、又はアラインメントが本技術分野で知られているコンピュータ相同性プログラムによってなされるアラインされた配列と比較したとき、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％の同一性（８０〜９５％の好ましい同一性を持つ）で本発明の核酸又はタンパク質に実質的に相同的な部位を含む分子、あるいはストリンジェント、中程度のストリンジェント、又は低いストリンジェント条件下、当該タンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズしうる核酸をコードするものを含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９３，及び以下を参照のこと。
【００６３】
「相同的な核酸配列」又は「相同的なアミノ酸配列」、あるいはそれらの変異型は、先に議論されているようにヌクレオチド・レベル又はアミノ酸レベルでの相同性によって特徴づけられた配列に関する。相同的なヌクレオチド配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドのアイソフォームについてコードしたそれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生体の異なる組織で発現されうる。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされうる。本発明において、相同的なヌクレオチド配列は、制限されることなく、哺乳動物を含み、よってマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、雌牛、馬、及び他を生体を含みうるむヒト以外の種のＡＲＰ／ＢＫＰポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列を含む。相同的な核酸配列は、制限されることなく、天然の対立遺伝子変異体及び本明細書中で示したヌクレオチド配列の突然変異を含みもする。相同的なヌクレオチド配列は、しかしＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいない。相同的な核酸配列は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の保存的なアミノ酸置換（以下を参照のこと）、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性を持つポリペプチドをコードするそれらの核酸配列を含む。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性が以下で述べられる。
【００６４】
ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によってコードされる。本発明は、その核酸配列のＯＲＦ、及び配列番号４のポリペプチドをコードする配列番号３の核酸配列の広がりを含んでいる核酸配列を含んでいる。
【００６５】
「オープンリーディングフレーム」（「ＯＲＦ」）は、もしかするとポリペプチドに翻訳されることができたヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含んでいる核酸の広がりは、停止コドンで中断しない。完全なタンパク質に関するコード配列を提供するＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まって、３つの「停止」コドン、すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ、の１つで終わる。本願発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、又はその両方の有無にかかわらず、コード配列のいずれかの部分であるかもしれない。ＯＲＦが本物の細胞性タンパク質をコードするための良い候補物と考えられるために、最小限のサイズの要求が、例えば５０以上のアミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡの広がりにしばしば設定される。
【００６６】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織のＡＲＰ／ＢＲＰ相同体、並びに他の哺乳動物からのＡＲＰ／ＢＲＰ相同体の同定、及び／又はクローニングに使用するために設計されたプローブ及びプライマーの製造を可能にする。プローブ／プライマーは、一般に実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００の連続した配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列のセンス鎖、又は配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列のアンチ−センス鎖、あるいは配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列の天然の突然変異にストリンジェント条件下、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の一部を含む。
【００６７】
ＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に基づいたプローブは、同一又は相同タンパク質をコードしている転写産物、又はゲノム配列を見つけるために使われることができる。様々な態様において、プローブは、そこに結合された標識基をさらに含み、例えば、上記標識基は、放射性同位元素、蛍光性化合物、酵素、又は酵素補助因子であるかもしれない。そのようなプローブは、例えば、対象からの細胞サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰコード核酸のレベルを計測することによって、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡレベルの検出、又はゲノム ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が突然変異又は欠失していないかどうか決定する、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を誤って発現する細胞又は組織を確認するための診断テストキットの一部として使われることができる。
【００６８】
「ＡＲＰ／ＢＲＰの生理活性部分を持つポリペプチド」は、用量依存性の有無にかかわらず特定の生物学的アッセイで計測されるような、成熟型を含め、本発明のポリペプチドの活性に類似を示すが、しかし同一である必要はないポリペプチドに関する。「生物学的に活性なＡＲＰ／ＢＲＰのポリペプチド」をコードする核酸断片は、ＡＲＰ／ＢＲＰの生物活性（ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性は以下に記載）を持つポリペプチドをコードする配列番号１、３、１７、１９、及び２１の一部を単離し、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロにおける組み換え発現により）、そしてＡＲＰ／ＢＲＰのコードされた部分の活性を評価するすることにより準備しうる。
【００６９】
ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因し、その結果として配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるものと同じＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子をさらに組み込む。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されたアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７０】
配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に加え、アミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団中（例えば、本集団）に存在するかもしれないことは、当業者により認識される。ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子中のそのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子による個体群内の個体中に存在するかもしれない。本明細書中に使用されるとき、用語「遺伝子」及び「組み換え遺伝子」は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、好ましくは哺乳動物のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、をコードしているオープンリーディングフレームを含んでいる核酸分子に関する。そのような天然の対立遺伝子変異は、一般にＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の相違をもたらす。そのようなヌクレオチド変異、並びに天然の対立遺伝子変異の結果であり、そしてＡＲＰ／ＢＲＰの機能上の活性を変えるわけではない得られたＡＲＰ／ＢＲＰのアミノ酸多型のいずれか及びその全ては、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００７１】
しかも、他の種からのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸分子、及びそれにより配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列と異なるヌクレオチド配列を有するものは、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体及び相同物は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、標準のハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーション・プローブとしてｃＤＮＡｓ、又はそれらの一部を用いて本明細書中に開示したＡＲＰ／ＢＲＰ核酸とそれらの相同性にに基づいて単離されうる。例えば、可溶性ＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡは、膜に結合させたＡＲＰ／ＢＲＰに対するその相同性に基づいて単離しうる。同様に、膜に結合させたＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡは、可溶性ＡＲＰ／ＢＲＰに対する相同性に基づいて単離しうる。
【００７２】
したがって、他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、かつストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。他の態様において、核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、又は１２５０ヌクレオチドの長さである。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、コーディング領域にハイブリダイズする。本明細書中に使用されるとき、用語「ストリンジェント条件下のハイブリダイズ」は、互いに少なくとも６０％相同性のヌクレオチド配列が一般に互いにハイブリダイズを保持するハイブリダイゼーション及び洗浄のため条件を説明することが意図される。
【００７３】
ホモログ（すなわち、他の種由来のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸）又は他の関連配列（例えば、パラロガス）は、核酸のハイブリダイゼーション及びクローン化のために本技術分野で周知の方法を使用した、プローブとして特異的な配列の全部又はその一部を用いた、低い、中程度の、又は高いストリンジェントなハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【００７４】
本明細書中に使用されるとき、表現「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下でプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、しかし他の配列にはハイブリダイズしない条件に関する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして、異なる状況下で異なる。より長い配列が、短い配列よりも高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように設定される。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下）標的配列に相補的なプローブの約５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。一般に標的配列は過剰に存在しているので、Ｔｍで５０％のプローブが平衡状態を生じる。一般に、ストリンジェント条件は、ｐＨ ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０ Ｍナトリウム・イオン未満、一般に約０．０１〜１．０ Ｍナトリウム・イオン（又は他の塩）、そして温度は、短いプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチド（例えば、１０ ｎｔ〜５０ ｎｔ）に関して少なくとも約３０℃、及びより長いプローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドに関して少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成されもする。
【００７５】
ストリンジェント条件は、当業者により知られ、そしてＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６．に見ることができる。好ましくは、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％相同な配列が互いにハイブリダイズを保持するような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、６Ｘ ＳＳＣ、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、及び５００ ｍｇ／ｍｌの６５℃で変性されたサケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中のハイブリダイゼーション、続く５０℃での０．２Ｘ ＳＳＣ、０．０１％のＢＳＡによる１回以上の洗浄である。ストリンジェントな条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然の核酸分子に相当する。本明細書中に使用されるとき、「天然の」核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド配列を持つＲＮＡ又はＤＮＡ分子に関する（例えば、天然のタンパク質をコードする）。
【００７６】
第２の態様において、中程度のストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子、又はそれらの断片、アナログ、若しくは誘導体にハイブリダイズしうる核酸配列が提供される。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％のＳＤＳ、１００ ｍｇ／ｍｌの５５℃で変性されたサケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーション、続く３７℃での１Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＢＳＡによる１回以上の洗浄である。使用される他の中程度のストリンジェント条件は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９３， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．を参照のこと。
【００７７】
第３の態様において、低いストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子、又はそれらの断片、アナログ、若しくは誘導体にハイブリダイズしうる核酸配列が提供される。低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、３５％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００ ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％ （ｗｔ／ｖｏｌ）のデキストラン硫酸塩中の４０℃でのハイブリダイゼーション、続く５０℃での２Ｘ ＳＳＣ、２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、５ ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＳＤＳによる１回以上の洗浄である。使用される他の中程度のストリンジェント条件は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９３， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｓｈｉｌｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８： ６７８９−６７９２．を参照のこと。
【００７８】
保存的な突然変異
個体群中に存在するＡＲＰ／ＢＲＰ配列の天然の対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、変化が突然変異によって配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列内に導入されることができ、それによってＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の能力を変えないで、コードされたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことをさらに認識する。例えば、「必須でない」アミノ酸残基のアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列中に成されうる。「必須でない」アミノ酸残基は、生理活性を変えることなしにＡＲＰ／ＢＲＰの野生型配列から変わりうるが、一方「必須の」アミノ酸残基は、生理活性に必要とされる。例えば、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の間で保存されるアミノ酸残基は、変更により特に制御しにくいことが推測される。
【００７９】
さらに、図５として示されたアラインメントにより示したとおり、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質ファミリーのメンバーの間で保存されるアミノ酸残基は、変更により特に制御しにくいことが推測される。例えば、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰファミリー・メンバー及びＡＲＰ／ＢＲＰホモログ中の部分に一般に保存されている少なくとも１つのシスチン・ノット・ドメインを含みうる。そのように、これらの保存されたドメインは、突然変異に耐えられそうにない。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質メンバーの間で保存されないか又は半保存だけされているもの）は、活性に必須ではないかもしれず、故に変更を受け入れうる。
【００８０】
本発明の他の側面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸分子に関する。そのようなＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２からのアミノ酸配列と異なるが、しかし生物活性は保持する。１つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、上記核酸分子によってコードされたタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約６０％相同、より好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約７０％相同、より好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約８０％相同、より一層好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約９０％相同、そして最も好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約９５％相同である。
【００８１】
配列番号２、４、１８、２０、及び２２のタンパク質に相同的なＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする単離された核酸は、コードされたタンパク質に１以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失が導入されるような配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列への１以上のヌクレオチドの置換、付加、又は欠失の導入によって作製されうる。
【００８２】
突然変異は、部位指定突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発のような標準的な技術により配列番号１、３、１７、１９、及び２１に導入されうる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、少なくとも１の推測された必須でないアミノ酸残基で行われる。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を持つアミノ酸残基と交換されるものである。類似した側鎖があるアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性の側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐の側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、そして芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含んでいる。このように、ＡＲＰ／ＢＲＰ中の推測された必須でないアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えられる。あるいは、他の態様において、突然変異は、ＡＲＰ／ＢＲＰコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに、例えば飽和突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって導入されることができて、活性を保つ突然変異体を確認するために得られた突然変異体をＡＲＰ／ＢＲＰ生物活性についてスクリーンしうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１のの突然変異誘発に続き、コードされたタンパク質は本技術分野で知られるいずれかの組み換え技術によって発現されることができて、上記タンパク質の活性を決定しうる。
【００８３】
１の態様において、突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、（１）他のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、他の細胞表面タンパク質、又はそれらの生理活性部分とのタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質及びＡＲＰ／ＢＲＰリガンドの間の複合体形成、（３）突然変異体ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の細胞内の標的タンパク質又はそれらの生理活性部分に結合する能力；（例えば、アビジン・タンパク質）についてアッセイされうる。
【００８４】
さらに他の態様において、突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰは、糖タンパク質ホルモン・ファミリーのメンバーの活性を遂行する能力、例えば複合体形成、すなわち、（ｉ） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と糖タンパク質受容体、（ｉｉ）タンパク質のシスチン・ノット・ファミリーに非常に相同的なタンパク質；（ｉｉｉ）受容体ファミリー・メンバー・タンパク質と対を成したＬＧＲオーファンＧ−プロテインを持つＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質；そして（ｉｖ） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と糖タンパク質ホルモンの間の結合についてアッセイされうる。
【００８５】
アンチセンス
本発明の他の側面は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列、又はそれらの断片、アナログ、又は誘導体を含んでいる核酸分子にハイブリダイズしうるか、あるいはそれに相補的な単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な又はｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の側面において、ＡＲＰ／ＢＲＰコード鎖の約１０、２５、５０、１００、２５０、若しくは５００ヌクレオチド、又はその全体、あるいはそれらの一部のみに相対的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の断片、ホモログ、誘導体、及びアナログ、あるいは配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸をさらに提供する。
【００８６】
１の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の「コーディング領域」に対するアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでいるヌクレオチド配列の部位に関する（例えば、図４を参照のこと）。他の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の「非コーディング領域」に対するアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域の側面に位置する５’及び３’配列に関する（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも称される）。
【００８７】
本明細書中に開示したＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているコード鎖配列（例えば、配列番号１、３、１７、１９、及び２１）を考えると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリック、又はフーグスティーンの法則に従って設計される。アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的でありうるが、より好ましくは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡのコーディング又は非コーディング領域の部分だけに対するアンチセンスのオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲んでいる部位に相補的であるかもしれない。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチドの長さであるかもしれない。本発明のアンチセンス核酸は、本技術分野で知られている手順を用いたる化学合成又は酸素的な連結反応を使って組み立てられうる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、あるいは分子の生物学的な安定性を増やすように、又はアンチセンスとセンス核酸の間で形成された２本鎖の物理的な安定性を増すように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使って化学的に合成されうる、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドが使用されうる。
【００８８】
アンチセンス核酸の製造に使用されうる修飾されたヌクレオチドの例は、以下の：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、アンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使って生物学的に製造されうる。ターゲット核酸に（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節でさらに説明される着目の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００８９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズ、又は結合し、それにより、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することで上記タンパク質の発現を阻害するように、一般に対象に投与されるか又はｉｎ ｓｉｔｕで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定した２本鎖を形成するために慣習的なヌクレオチド相補性によるか、又は、例えばアンチセンス核酸分子の場合、それは二重らせんの主な溝における特定の相互作用を通してＤＮＡの２本鎖に結合する。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位への直接的な注入を含んでいる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選ばれた細胞を狙うために修飾されて、そして全身に投与されうる。例えば全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選ばれた細胞表面上に発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えば上記アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより修飾されうる。アンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載されるベクターを使って細胞にデリバリーされることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩ プロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００９０】
さらに他の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する、ここで通常のβ−ユニットに反して、上記の鎖は互いに平行になる（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５： ６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５： ６１３１−６１４８）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ ２１５： ３２７−３３０）を含むこともできる。
【００９１】
リボザイム及びＰＮＡ部分
制限されることのない例として、核酸の修飾は、修飾された塩基、及びその糖リン酸骨格が修飾されたか又は誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えば対象での治療のための適用においてアンチセンス結合核酸として、それらが使われうるように、修飾された核酸の化学的安定性を高めるための少なくとも一部で実行される。
【００９２】
１の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的な部位を持つ１本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを開裂しうるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒ＲＮＡ分子である。よって、リボザイム（例えば、シュモクザメ・リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１）に記載）は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ転写産物の触媒作用による開裂に使われることができ、それによってＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ＡＲＰ／ＢＲＰコードする核酸に特異性を持つリボザイムは、本明細書中に記載のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計されうる（すなわち、配列番号１、３、１７、１９、及び２１）。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、組み立てられることができ、ここでて活性部位のヌクレオチド配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードするｍＲＮＡ中の開裂すべきヌクレオチド配列に相補的である。例えば、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，９８７，０７１；、及びＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，１１６，７４２を参照のこと。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性がある触媒ＲＮＡを選ぶために使われることができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【００９３】
あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現は、標的細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するための、ＡＲＰ／ＢＲＰの制御部位（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰプロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を狙うことによって阻害されうる。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ． （１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６： ５６９−８４； Ｈｅｌｅｎｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ （１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４： ８０７−１５を参照のこと。
【００９４】
様々な態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰの核酸は、例えば安定性、ハイブリダイゼーション、又は分子の可溶性を改善するために塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾しうる。例えば、核酸のデオキシリボース・リン酸骨格は、ペプチド核酸を生じるために修飾されうる（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４： ５−２３を参照のこと）。本明細書中に使用されるとき、用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡｓ」は、核酸擬態、例えばデオキシリボース・リン酸骨格が偽ペプチド骨格により置き換えられ、そして本来の４の核酸塩基だけが保持されているＤＮＡ擬態に関する。ＰＮＡｓの中性骨格は、低いイオン強度条件下でのＤＮＡ及びＲＮＡに特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）前記； Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＰＮＡＳ ９３： １４６７０−６７５に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコールを使って実施されうる。
【００９５】
ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、治療及び診断上の用途で使われることができる。例えば、ＰＮＡｓは、例えば転写の誘発、又は翻訳の停止、又は複製の阻害により、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス、又は抗遺伝子剤として使われることができる。ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、例えば遺伝子の単独塩基対の突然変異の例えばＰＮＡ定方向ＰＣＲクランピングによる解析に；他の酵素との組み合わせで使われるとき、合成制限酵素、例えばＳＩヌクレアーゼとして（Ｈｙｒｕｐ Ｂ． （１９９６）前記）；ＤＮＡ塩基決定及びハイブリダイゼーションのためのプライマー又はプローブとして（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， ａｂｏｖｅ；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ （１９９６）、前記）使われることもできる。
【００９６】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、例えば親油基、若しくは他の補助基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することにより、又はリポソーム、若しくは本技術分野で知られているドラッグ・デリバリーの他の技術の使用でそれらの安定性又は細胞への摂取を高めるために修飾されうる。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な性質を組み合わせる、ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、製造される。そのようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性と特異性を提供しながらＤＮＡ部分での相互作用するＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合の数、及び配向性の点で選ばれた適切な長さのリンカーを使って連結されうる（Ｈｙｒｕｐ （１９９６）前記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ （１９９６）前記、及びＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４： ３３５７−６３に記載のとおり実施されうる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイト・カップリング化学を用いた固体支持体上で合成され、そして修飾されたヌクレオシドアナログ、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジン・ホスホルアミダイトがＰＮＡとＤＮＡの５’末端の間で使用されうる（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７： ５９７３−８８）。次にＰＮＡモノマーは、段階的につながれ、５’ＰＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔ及び３’ＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔを有するキメラ分子を製造する（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６）前記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔ及び３’ＰＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔを用いて合成されうる。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ （１９７５） ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５： １１１９−１１１２４を参照のこと。
【００９７】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、他の付加基、例えばペプチド（例えば、インビボにおいて宿主細胞を狙うため）、又は細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：６４８−６５２； ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）、若しくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを引き起こす開裂剤（例えば、Ｒｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）又は挿入剤（例えば、Ｚｂｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ５： ５３９−５４９を参照のこと）により修飾されうる。この目的にために、オリゴヌクレオチドを、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを引き起こす架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを引き起こす開裂剤などに結合させる。
【００９８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に関係しているヌクレオチド多型
本発明は、１以上の多型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列を含んでいる核酸配列を含んでいる。同様に、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列における多型を占有する塩基を発見する方法、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ配列多型に基づくＡＲＰ／ ＢＲＰに関連した病理の治療のための個別化された治療剤を発見する方法を含む。
【００９９】
ヌクレオチド多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）であるかもしれない。ＳＮＰは、対立遺伝子配列の間の変化に富む部位である、１のヌクレオチドによって占有された多型部位で生じる。前記部位は、通常対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００又は１０００／１未満のメンバーで変化する配列）に先行されて、そして続かれている。一塩基多型は、通常、多型部位での１のヌクレオチドの他のものへの置換により生じる。転位は、他のプリンによる１のプリンの置き換えか、又は他のピリミジンによる１のピリミジンの置き換えである。塩基転換は、ピリミジンによるプリンの置き換えであり、その逆も同様である。一塩基多型は、参照の対立遺伝子と関係してヌクレオチドの欠失、又はヌクレオチドの挿入から生じることもできる。
【０１００】
例えば、本発明による多型は、第３４２ヌクレオチドのアデノシンがシトシンによって置き換えられるＡＲＰ遺伝子の配列多型を含んでいる（図２７）。これは、ＡＲＰポリペプチド配列の１１４位でのＬｅｕのＰｈｅへのアミノ酸の変化をもたらす。ある態様において、多型配列は、第３４２ヌクレオチドが、アデノシン以外のいずれかのヌクレオチドであるＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでいる。
【０１０１】
ある態様において、多型配列は、完全長のいずれかのＡＲＰ／ＢＲＰを含んでいる。他の態様において、多型配列は、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、又は１０〜２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１０２】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質
本発明の１の側面は、単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、及びそれらの生理活性部分、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに関する。同様に、抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を惹起するための免疫原としての使用にふさわしいポリペプチド断片を提供する。１の態様において、天然のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、細胞か組織起源から標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって単離しうる。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって製造される。組み換え発現の代わりに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はかポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使って化学的に合成されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、１以上の部位でグリコシル化されうる。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質はグリコシル化されない。
【０１０３】
「単離された」又は「精製された」タンパク質、又はそれらの生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質がそれに由来する、細胞又は組織起源からの細胞性物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、あるいは化学的に合成されるとき、化学的前駆物質、又は他の化学薬品を実質的に含まない。用語「細胞性材料を実質的に含まない」は、それが単離されるか、又は組み換えにより産生される細胞の細胞の成分から分離されるタンパク質中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の前処理を含んでいる。１の態様において、用語「細胞性物資を実質的に含まない」は、約３０（乾燥重量）％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質（本明細書中で「夾雑タンパク質」とも呼ばれている）、より好ましくは約２０ ％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、よりさらに好ましくは約１０ ％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質前処理を含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分が組み換えにより産生されるとき、同様に、培地を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培地は、タンパク質調製物の量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
【０１０４】
用語「化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない」は、タンパク質の合成に関係している化学的な前駆物質又は他の化学薬品から分離されるタンパク質中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の前処理を含んでいる。１の態様において、用語「化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない」は、約３０（乾燥重量）％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、より好ましくは約２０ ％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、よりさらに好ましくは約１０ ％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、そして最も好ましくは約５％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質前処理を含んでいる。
【０１０５】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアミノ酸配列、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の完全長より少ないアミノ酸を含み、かつＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の活性を示す、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されるアミノ酸配列、に十分に相同であるか、又はそれから誘導されるアミノ酸配列を含んでいる。一般に、生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の活性を有するドメイン又はモチーフを含む。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、例えば１０、２５、５０、１００のアミノ酸、又はそれ以上の長さのポリペプチドでありうる。
【０１０６】
１つの態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、タンパク質の糖タンパク質ファミリー特有のシスチン・ノット・ドメインを少なくとも１つ含む。
【０１０７】
さらに他の態様において、ＡＲＰタンパク質の生理活性部分は、タンパク質の糖タンパク質ホルモン・ファミリーに特有な第２ループのＮ連結グリコシル化部位の少なくとも１つか、場合によりホルモンのアルファ・サブユニットを含む。
【０１０８】
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、先に規定の構造的ドメインの少なくとも１つを含んでいることは理解されている。しかも、タンパク質の他の部位が削除された他の生理活性部分は、組み換え技術によって準備されて、天然のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性の１以上について評価されうる。
【０１０９】
１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に実質的に相同であり、かつ、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のタンパク質の機能上の活性を保持し、けれども以下に詳細に記載されるように天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。それ故に、他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性を保持する。
【０１１０】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２のシスチン・ノット・ドメインに５５％相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である（例えば、アミノ酸残基３０〜１２９又はアミノ酸残基２１〜１２４について）。本発明の他の態様は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のシスチン・ノット・ドメインを有する単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、並びにそれに少なくとも６５％、好ましくは７５％、８５％、又は９５％相同なアミノ酸配を特徴とする（例えば、アミノ酸残基３１〜１２４について）。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性を保持する。
【０１１１】
ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体
同様に、ＡＲＰとＢＲＰのタンパク質多量体（すなわち、重合体）が本発明によって提供される。例えば、多量体は、二量体、三量体、又は四量体である。多量体は、ＡＲＰ、若しくはＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分、あるいはそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログ、及び第２ポリペプチドを含む。多量体のポリペプチドは、共有的に、例えば、ジスルフィド結合、又は非共有的に相互に作用する。あるいは、多量体のポリペプチドは、化学的に連結する。
【０１１２】
本発明のＡＲＰ及びＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又はそれらの断片は、例えば、他の関連する糖タンパク質ホルモン（例えば黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））のそれに対して類似の、変更された、又は高められた活性を持つ機能的な糖タンパク質ホルモンを製造するために他のアルファ又はベータ糖タンパク質サブユニットを持つ、多量体を形成するかもしれない。多量体は、ホモ重合体（すなわち、ＡＲＰ−ＡＲＰ、ＢＲＰ−ＢＲＰ）、又は第２ポリペプチド有するヘテロ重合体であるかもしれない。第２ポリペプチドは、ＡＲＰかＢＲＰの同じ種からであるかもしれない。あるいは、第２ポリペプチドは、異なる種からであるかもしれない。好ましくは、第２ポリペプチドは、例えば、ＢＲＰタンパク質及びアルファ糖タンパク質サブユニット又はそれらの断片を含んでいるＢＲＰヘテロ重合体である。あるいは、第２ポリペプチドは、シスチン・ノット・タンパク質である。アルファ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号ＡＡＨ１０９５７及びＣＡＣ４３２３４を含んでいる。好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰポリペプチドを有する多量体を形成する。より好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、配列番号１８のポリペプチド及びそれらの生理活性部分、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログを有する多量体を形成する。あるいは、ＡＲＰヘテロ重合体は、ＡＲＰポリペプチドとベータ糖タンパク質サブユニットを含んでいる。ベータ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号Ｐ０１２２５及びＰ１８８４２を含んでいる。好ましくは、ＡＲＰポリペプチドはＢＲＰポリペプチドを有する多量体を形成する。
【０１１３】
同様に、抗−ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体抗体を惹起するための免疫原としての使用に好適なポリペプチド断片を提供する。１の態様において、天然のＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、細胞又は組織起源から標準的なタンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームによって単離されうる。他の態様において、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される。組み換え発現の代わりに、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、標準的なペプチド合成技術を使って化学合成されうる。ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、１以上の部位でグリコシル化されうる。あるいは、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、グリコシル化されない。
【０１１４】
２以上の配列の間の相同性の決定
２のアミノ酸配列又は２の核酸配列のパーセント相同性を決定するために、上記配列を最適な比較のためにアラインした（例えば、第２アミノ又は核酸配列との最適なアラインメントのためにギャップを第１アミノ酸又はヌクレオチド配列配列に導入されうる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドは、その後比較される。第１配列の位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又ヌクレオチドによって占められているとき、そして分子は、そのポジションで相同である（すなわち、本明細書中に使用されるとき、アミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸「同一性」に相当する）。
【０１１５】
核酸配列の相同性は、２つの配列の間の同一性の程度として決定されうる。相同性は、本技術分野で知られるコンピュータプログラム、例えばＧＣＧプログラム・パッケージで提供されたＧＡＰソフトウェアを使って決定されうる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ １９７０ ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ４８： ４４３−４５３を参照のこと。核酸配列比較のために以下の設定：５．０のギャップ作成ペナルティー及び０．３のギャップ伸張ペナルティーでＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用したとき、先に言及したアナログ核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コーディング）部分と、好ましくはの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性の程度を示す。
【０１１６】
用語「配列の同一性」は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が特定の部位の比較に基づき残基ごとの同一性の程度に関する。用語「配列の同一性のパーセンテージ」は、比較領域上の２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一の核酸塩基（核酸の場合、例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が両配列に生じる位置の数を計測して、合致位置の数を得、合致した位置の数を比較領域内の合計位置数（すなわち、ウインドウ・サイズ）で割り、そして結果を１００を掛けて、配列の同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。用語「十分な同一性」は、本明細書中に使用されるとき、比較部位の上の参照配列と比較して少なくとも８０パーセントの配列相同性、好ましくは少なくとも８５パーセントの同一性、そしてしばしば９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常、少なくとも９９パーセントの配列同一性を持つ配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を意味する。
【０１１７】
キメラ及び融合タンパク質
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰキメラ、又は融合タンパク質をも提供する。本明細書中に使用されるとき、ＡＲＰ／ＢＲＰ「キメラ・タンパク質」又は「融合タンパク質」は、場合により非−ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドと結合したＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを含む。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーである。「ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド」は、ＡＲＰ／ＢＲＰに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関し、一方「非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド」は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質、例えばＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質及び同じ若しくは異なる生物に由来するものと異なるタンパク質に対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドに関する。ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質の中で、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の全部か又は一部に相当する。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の生理活性部分を含む。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも２の生理活性部分を含む。さらに別の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも３の生理活性部分を含む。融合タンパク質の中で、用語「利用できるように連結された」は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドと非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドが互いにフレーム単位で融合されることを示すように意図される。非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合される。
【０１１８】
例えば、１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、第２タンパク質の細胞外ドメイン利用できるように連結された、ＡＲＰ／ＢＲＰシスチン・ノット・ドメイン又は糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット・ドメインを含む。そのような融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する化合物のためのスクリーニング・アッセイにさらに利用されうる（そのような検定が以下で詳細に述べられる）。
【０１１９】
１つの態様において、融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合しているＧＳＴ−ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組み換えＡＲＰ／ＢＲＰの精製を容易にしうる。
【０１２０】
他の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質である。例えば、天然のＢＲＰシグナル配列ＭＫＬＡＦＬＬＬＧＰＭＡＬＬＬＬＡＧＹＧＣＬＧ（配列番号１０、すなわち配列番号２の第１〜２３アミノ酸について）取り除かれ、そして他のタンパク質からのシグナル配列と置き換えられうる。あるいは、天然のＡＲＰシグナル配列ＭＰＭＡＳＰＱＴＬＶＬＹＬＬＶＬＡＶＴＥＡＷＧ（配列番号２８、すなわち、配列番号１８の第１〜２５アミノ酸について）取り除かれ、そして他のタンパク質からのシグナル配列と置き換えられうる。ある宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）において、ＡＲＰ／ＢＲＰの発現及び／又は分泌は、異種のシグナル配列の使用を通して高められうる。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のシグナル配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰの分泌を促進するために、取り除かれ、ｈＣＧベータ・サブユニットのシグナル配列（ＭＥＭＦＱＧＬＬＬＬＬＬＬＳＭＧＧＴＷＡ；配列番号１１）により置き換えられる。
【０１２１】
さらに他の態様において、ホルモンの天然の第２ループ・ドメインにより交換されたＡＲＰ／ＢＲＰ第２ループ・ドメインを持つ既知の糖タンパク質ホルモンを含む。例えば、ＢＲＰタンパク質の第２ループ・ドメインを含むアミノ酸ＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶ（配列番号１２）は、代替の活性を持つｈＣＧアナログを製造するためにＣＧベータ・サブユニット中に配置されうる。得られた融合タンパク質を、図１０に示す（配列番号１３）。
【０１２２】
さらなる態様において、融合タンパク質は、既知の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット、例えばＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、又はｈＣＧからの異種のシートベルト・ドメインを含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質である。例えば、これは、アルファ・サブユニットとの相互作用を安定させるか、又は受容体結合に影響を与えるかもしれない。例えば、最後のシステインに至るまでのＢＲＰタンパク質の配列は、ＦＳＨベータの第９５〜１１１残基に融合される（図１１を参照のこと；配列番号１４）。様々な態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の第１〜７５アミノ酸内のいずれかのアミノ酸をシステインにより置き換えることによりさらに修飾される。１つの態様において、システインは、ＢＲＰの５１位のグリシンと置き換わる。代わりの態様において、システインは、ＢＲＰの５２位のロイシンと置き換わる。
【０１２３】
１つの態様において、融合タンパク質は、主にシスチン・ノット・ドメインを含むＡＲＰ／ＢＲＰ配列が免疫グロブリン・タンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合した、ＡＲＰ／ＢＲＰ免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み入れられて、そしてＡＲＰ／ＢＲＰリガンドと細胞の表面上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の間の相互作用を阻害するために対象に投与され、それによって生体内でのＡＲＰ／ＢＲＰ仲介信号変換を抑制しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰの同系統のリガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすために使用されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰリガンド／ＡＲＰ／ＢＲＰ相互作用の阻害作用は、増殖及び分化の障害の両方の治療のため、並びに細胞生存の調節（例えば、促進又は抑制）のために治療として有用かもしれない。しかも、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰリガンドを精製する、対象における抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体の製造のために免疫原としての使用され、そしてＡＲＰ／ＢＲＰとＡＲＰ／ＢＲＰリガンドの相互作用を阻害する分子を確認するためのスクリーニング・アッセイに使用されうる。
【０１２４】
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰキメラ又は融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって製造されうる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、慣例の技術により、例えば、連結のために平滑末端又はスタッガー末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切な、付着末端の埋め合わせ、好ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的な連結を利用することにより、フレーム単位で１つに連結される一緒に結紮される。他の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ自動合成機を含む慣例の技術によって合成されうる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、キメラ遺伝子配列を製造するためにその後にアニールされ、そして再増幅されうる２の連続した遺伝子断片の間の相補的な張り出しを生むアンカー・プライマーを使って、実行されうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照のこと）。しかも、多くの発現ベクターが、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードした市販されている。ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸は、融合部分がＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質にフレーム単位で連結されるようにそのような発現ベクター中にクローン化されうる。
【０１２５】
ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト及びアンタゴニスト
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト（擬態）又はＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニストとして機能するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型にも関する。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型は、突然変異誘発、例えば別個の点突然変異又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の切り詰め、によって製造されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアゴニストは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型の生理活性と実質的に同じものか、又はその一部保持しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に関与する細胞のシグナリング・カスケードの下流又は上流のメンバーに拮抗して結合することにより、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型の活性の１以上を阻害しうる。このように、特異的な生物学的な効果は、限定された機能の変異型を用いた処置により引き出されうる。１の態様において、タンパク質の天然型の生理活性の一部を有する変異型による対象の治療は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型による治療に関係する、対象におけるより少ない副作用しかない。
【０１２６】
ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト（擬態）かＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニストとして機能するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質アゴニストかアンタゴニスト活性に関してＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の突然変異型、例えば切り詰め突然変異型の組み合わせライブラリーのスクリーニングによって確認しうる。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のふ入りのライブラリーが、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により製造され、ふ入りの遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のふ入りのライブラリーは、例えば潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして発現可能であるか、もしくはより大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージ・ディスプレイのために）そこにＡＲＰ／ＢＲＰ配列のセットを含んでいるような遺伝子配列の中への合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的な連結によって製造されうる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの種々の潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のライブラリーを製造するために使われることができる方法がある。縮重した遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ自動合成機により実行されることができ、次にこの合成遺伝子は適切な発現ベクター中に連結されうる。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ配列の所望のセットをコードしている配列の全ての、１つの混合物としての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法が、本技術分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ （１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ ５３：３２３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６； Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） ＮｕｄＡｃｉｄＲｅｓ １１：４７７を参照のこと）。
【０１２７】
ポリペプチド・ライブラリー
さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質コード配列の断片のライブラリーが、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質変異型のスクリーニング及び続く選定のためのＡＲＰ／ＢＲＰ断片のふ入りの集合を製造するために使用されうる。１の態様において、コード配列断片のライブラリーは、ニック付けが１分子につき１度だけ生じる条件下でヌクレアーゼによりＡＲＰ／ＢＲＰコード配列の２本鎖ＰＣＲ断片を処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニック付けされた産物からのセンス／アンチセンス対を含む２本鎖ＤＮＡを形成させ、ＳＩヌクレアーゼで処理することにより再形成された２本鎖から１本鎖部分を除去し、そして得られた断片ライブラリーを発現ベクター中に連結することにより製造される。この方法で、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の様々なサイズのＮ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１２８】
点突然変異若しくは切り詰めにより製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選ばれた性質を持つ遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が本技術分野で知られている。そのような技術が、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の組み合わせ突然変異誘発によって製造された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適応可能である。高い処理量解析に耐えられる、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く使用される技術は、複製可能な発現ベクター中へ遺伝子ライブラリーをクローン化し、、ベクターの得られたライブラリーにより適当な細胞を形質転換し、そして所望の活性の検出がその産物が検出されるであろう上記遺伝子をコードしているベクターの分離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることを一般に含む。ライブラリーの機能性突然変異型の程度を高める新しい技術である、レクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ ａｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、でＡＲＰ／ ＢＲＰ変異型を確認するためにスクリーニング・アッセイと組み合わせて使用されうる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５； Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
【０１２９】
抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体
本発明は、いずれかのポリペプチド、例えば本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質かＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、に免疫特異的に結合する抗体及び抗体断片、例えばＦ_ａｂ又は（Ｆ_ａｂ）_２を取り込む。
【０１３０】
単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの一部若しくは断片は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を準備するための標準的な技術を用いたＡＲＰ／ＢＲＰに結合する抗体を製造するための免疫原として使用されうる。完全長のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質が使用されうるが、代わりに、本発明は、免疫原として使用するためのＡＲＰ／ＢＲＰの抗原性ペプチド断片を提供する。ＡＲＰ／ＢＲＰの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されたアミノ酸配列の少なくとも４のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対してもたらされた抗体がＡＲＰ／ＢＲＰとの特異的な免疫複合体を形成するようなＡＲＰ／ＢＲＰのエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも６、８、１０、１５、２０、又は３０のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは、用途、および当業者に周知の方法により、より短い抗原性ペプチドを上回って好ましいときがある。
【０１３１】
本発明の特定の態様において、抗原性ペプチドに含まれた少なくとも１のエピトープは、タンパク質の表面にあるＡＲＰ／ＢＲＰの部位、例えば親水性部位である。ターゲッティング抗体産生の方法として、親水性及び疎水性の部位を示すヒドロパシー・プロットが、例えばフーリエ変換のあり又はなしのいずれかのＫｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法、又はＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む本技術分野で周知の方法のいずれかによって製造される。例えば、Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ３８２４−３８２８； Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７： １０５−１４２を参照のこと、これらの全体を本明細書中に援用する。図８、及び９に示されるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、及びＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性解析は、第２ループの部位（ループ推測は、ｈＣＧベータ・サブユニット結晶構造からの相同性に基づく）が、特に親水性であり、従って、ターゲッティング抗体産生に有用な表面残基をコードすることが見込まれることを示す。
【０１３２】
特定の態様において、抗原性ペプチドは、アミノ酸配列ＣＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶＣ（配列番号１５）を含む。さらに他の特定の態様において、抗原性ペプチドは、アミノ酸配列ＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶ（配列番号１６）を含む。
【０１３３】
本明細書中に開示のように、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログは、これらのタンパク質成分を免疫特異的に結合する抗体の製造の免疫原として利用されうる。本明細書中に使用されるとき、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちＡＲＰ／ＢＲＰのような抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含んでいる分子に関する。このような抗体は、制限されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆ_ａｂ、及びＦ_{（ａｂ’）２}断片、及びＦ_ａｂ発現ライブラリーを含む。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対する抗体が開示される。本技術分野に知られている様々な手順が、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の製造のために使用される。これらのタンパク質のいくつかが以下で議論される。
【０１３４】
ポリクローナル抗体の製造のために、様々な適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物）が、天然タンパク質、又はそれらの合成変異型、若しくはそれらの誘導体の注入によって免疫される。適当な免疫原性調製物は、例えば組み換えにより発現されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又は化学的に合成されたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを含むことができる。調製物はさらにアジュバントを含むことができる。免疫応答の増強のために使われたさまざまなアジュバントは、制限されることなく、フロイント（完全、及び不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノールなど）、アジュバント、例えばカルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、又は類似した免疫刺激剤を含む。所望であれば、ＡＲＰ／ＢＲＰに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、そしてさらに、周知の技術、例えばＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーによって精製されうる。
【０１３５】
本明細書中に使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、ＡＲＰ／ＢＲＰの特定のエピトープと免疫反応しうる抗原結合部位を１種類のしか含んでいない抗体分子の集合に関する。よって、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する、特定のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対する単一結合親和性を一般に示す。特定のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はモログに対するモノクローナル抗体を準備するために、連続継代細胞系の培養による抗体分子の製造を提供するいずれかの技術が利用される。そのような技術は、制限されることなく、モノクローナル抗体を製造するためのハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；Ｂ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４： ７２を参照のこと）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ： ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， ＡｌａｎＲ， Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６を参照のこと）を含む。モノクローナル抗体は、本発明の実施に利用され、そしてハイブリドーマの使用により（Ｃｏｔｅ， ｅｔ ａｌ， １９８３．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０を参照のこと）、又はインビトロのエプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）とＢ細胞の形質転換より（Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６を参照のこと）製造されうる。先の引用のそれぞれを、それらの全体で本明細書中に援用する。
【０１３６】
本発明によると、技術は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に特異的な１本鎖抗体の製造のために適合されうる（例えば、米国特許番号第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法論が、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はホモログに対し所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ａｂ断片の迅速で、効果的な同定を可能にするＦ_ａｂ発現ライブラリーの構築のために適合させられる（例えば、Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ， １９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１を参照のこと）。非抗体は、本技術分野で周知の技術によって「ヒト化」されうる。例えば米国特許番号第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対するイディオタイプを含んでいる抗体断片は、制限されることなく：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって製造されたＦ_{（ａｂ’）２}断片；（ｉｉ） Ｆ_{（ａｂ’）２}断片のジスルフィド架橋を減らすことによって製造されたＦ_ａｂ断片；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤を用いた抗体分子の処理により製造されたＦ_ａｂ断片、及び（ｉｖ） Ｆ_ｖ断片を含む本技術分野で知られている技術によって製造されうる。
【０１３７】
その上、組み換え抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体、例えば標準的な組み換えＤＮＡ技術を使って製造されうる、両部分及び非部分を含んでいるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内にある。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術、例えば、国際出願第ＵＳ８６／０２２６９号；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開番号第８６／０１５３３号；米国特許番号第４，８１６，５６７号；米国特許番号第５，２２５，５３９号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａ／．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３； Ｌｉｕ ｅｔａｌ． （１９８７）ＰＮＡＳ８４：３４３９−３４４３； Ｌｍｅｔａｌ． （１９８７） ＪＩｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６； Ｓｍｅｔａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９−１００５； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９； Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＪＮａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８０：１５５３−１５５９）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７； Ｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｆａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３−４０６０に記載の方法の使用によって製造されうる。先の引用のそれぞれを、それらの全体で本明細書中に援用する。
【０１３８】
１つの態様において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法論は、制限されることなく、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）、及び本技術分野に知られている他の免疫学の介在する技術を含む。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の特定のドメインに対して特異的な抗体の選択は、そのようなドメインを有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の断片に結合するハイブリドーマの産生により促進される。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質内のシスチン・ノット・ドメイン、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はホモログに特異的な抗体が、本明細書中に提供されもする。
【０１３９】
抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の局在及び／又は計量に関連する本技術分野に知られている方法で使用されうる（例えば、適当な生理学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のレベルの計測への使用、診断方法への使用、タンパク質の画像化への使用など）。与えられた態様において、抗体由来の結合ドメインを含んでいる、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対する抗体は、医薬として活性な化合物［以下「治療薬（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」］として利用される。
【０１４０】
抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術、例えばアフィニティー・クロマトグラフィー又は免疫沈降によりＡＲＰ／ＢＲＰの単離に使用されうる。抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、細胞からの天然のＡＲＰ／ＢＲＰ、及び宿主細胞で発現された組み換えにより生み出されたＡＲＰ／ＢＲＰの精製を容易にしうる。しかも、抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、（例えば、細胞ライセート又は細胞上清中の） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現の量及びパターンを評価するためにＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出に使用されうる。抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、例えば与えられた投与計画の効能を決定するために臨床の試験手順の一部として組織のタンパク質レベルを観察するために診断的に使用されうる。検出は、抗体の検出可能な物質への結合（すなわち、物理的な連結）により容易にしうる。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、及び放射性物質を含んでいる。適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；好適な蛍光物質の例は、アンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生体発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含む、そして好適な放射性物質の例は、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈを含む。
【０１４１】
ＡＲＰ／ＢＲＰの組み換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の他の側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログをコードしている核酸を含んでいるベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中に使用されるとき、用語「ベクター」は、そこに連結された他の核酸を運ぶことができる核酸分子に関する。ベクターの１つの種類は、追加のＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔｓを連結しうる環状の二本鎖ＤＮＡループを言及する「プラスミド」である。ベクターの他の種類は、ウイルス・ベクターであり、追加のＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔｓをウイルス・ゲノム中に連結しうる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律的増殖が可能である（例えば、細菌の複製開始点を持つ細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主のゲノムと一緒に複製される。しかも、あるベクターは、それらが使用可能な状態で連結されている遺伝子を発現に導くことができる。そのようなベクターを、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用されうる。しかし、本発明は、同等の機能にかなう他の形態の発現ベクター、例えばウイルス・ベクター（例えば、複製を欠くレトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含むように意図される。
【０１４２】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞の核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含み、それは、組み換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に利用できるように連結されている、発現のために使用される宿主細胞に基づき選ばれた１以上の制御配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「利用できるように連結された」は、（例えば、生体外の転写／翻訳系で、又はベクターが宿主細胞に導入される時の宿主細胞で）着目のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にするやり方で制御配列に連結していることを意味するように意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニレーション・シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ； ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＯＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載されている。制御配列は、多くの種類の宿主細胞のヌクレオチド配列の本質的な発現を導くものと、ある宿主細胞だけで（例えば、組織特異的な制御配列）ヌクレオチド配列の発現を導くものを含んでいる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることは、当業者によって認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることができ、それによって本明細書中に記載された核酸によってコードされている融合タンパク質又はペプチドを含めたタンパク質又はペプチドを製造しうる（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰの突然変異型、融合タンパク質など）。
【０１４３】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞のＡＲＰ／ＢＲＰの発現のために設計されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰは、エッシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物の細胞で発現されうる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）でさらに議論される。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されうる。
【０１４４】
真核細胞におけるタンパク質の発現は、ベクターが融解又は非融合タンパク質の発現を導く構成的であるか又は誘導的なプロモーターを含むベクターを有するＥ．コリにより最も頻繁に実行される。融解ベクターは、相当数のアミノ酸をそこにコードされたタンパク質、通常組み換えタンパク質のアミノ末端に加える。そのような融解ベクターは、一般に３つの目的にかなう：（１）組み換えタンパク質の発現の増加；（２）組み換えタンパク質の可溶性の増加；そして（３）アフィニティー精製のリガンドとして働くことによる組み換えタンパク質の精製の助け。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性開裂部位が、融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にし、続いて融合タンパク質を精製するために融合部分と組み換えタンパク質の接合部に導入される。そのような酵素とそれらの同系統の認識配列は、ファクターＸａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含んでいる。典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース Ｅ結合タンパク質、プロテインＡをターゲットの組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ； Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＴＴＳ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）を含む。
【０１４５】
好適な誘導的な非融合Ｅ．コリ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ （Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、及びｐＥＴ １ｌｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） ６０−８９）を含んでいる。
【０１４６】
Ｅ．コリにおいて組み換えタンパク質発現を最大限にする１つの戦略は、組み換えタンパク質のタンパク質分解性開裂の能力が損なわれた宿主細菌によりタンパク質を発現することである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） １１９−１２８を参照のこと。他の戦略は、各々のアミノ酸についての個々のコドンがＥ．コリで優先的に利用されるような発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列に変えることである（Ｗ＆ｄａｅｔａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行されうる。
【０１４７】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＥＭＢＯＪ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｇｅｍ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ （ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）を含んでいる。
【０１４８】
あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰは、バキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞で発現されうる。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルス・ベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｔ ＣｅｌｌＢｉｏｌ ３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系（Ｌｕｃｌｄｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）を含んでいる。
【０１４９】
さらに他の態様において、本発明の核酸は、哺乳動物の発現ベクターを用いた哺乳動物の細胞で発現される。哺乳動物の発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６： １８７−１９５）を含んでいる。哺乳動物の細胞で使用されるとき、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの制御要素によって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアン・ウイルス４０由来である。原核細胞及び真核細胞のための他の好適な発現系に関しては、Ｓａｉｎｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９の第１６及び１７章を参照のこと。
【０１５０】
他の態様において、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種で優先的に核酸の発現を導きうる（例えば、組織に特有の制御要素が核酸の発現に使われる）。組織に特有の制御要素が、本技術分野で知られている。好適な組織特異的プロモーターの制限されることのない例は、アルブミン・プロモーター（肝臓に特有； Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８−２７７）、リンパに特有のプロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｂａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター （Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯＪ ８：７２９−７３３）、及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロンに特有のプロモーター（例えば、ニューロフィラメント・プロモーター； Ｂｙｍｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓に特有のプロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺に特有のプロモーター（例えば、ミルク乳漿プロモーター； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，８７３，３１６ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２６４，１６６）を含む。発達的に調節されたプロモーターが、取り込まれもする、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒａｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロテイン・プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） ＧｅｎｅｓＤｅｖ ３：５３７−５４６）。
【０１５１】
本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、ＤＮＡ分子が利用可能な状態で、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ分子の転写により）可能にするやり方で制御配列と連結される。アンチセンス方向でクローン化された核酸に利用できるように連結された制御配列は、様々な細胞種においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を導くことが選択されうる、例えば、ウイルスのプロモーター及び／又はエンハンサー、又は制御配列は、構成的な、アンチセンスＲＮＡの組織に特有の、又は細胞種に特有の発現を導くことを選択しうる。アンチセンス発現ベクターは、活性はベクターが導入された細胞種によって決定されうる高い効率の制御部位のコントロール下でアンチセンス核酸を製造する、組み換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形態であるかもしれない。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節についての論議については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６を参照のこと。
【０１５２】
本発明の他の側面は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」は、本明細書中で互換的に使われる。そのような用語が特定の対象細胞だけに関するのでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的な子孫にも関すると理解される。ある修飾が突然変異又は環境的な影響のいずれかにより次の世代に生じるかもしれないので、実際、そのような子孫は親細胞と同じでないかもしれないが、それでも本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれている。
【０１５３】
宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であるかもしれない。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、細菌の細胞、例えばＥ．コリ、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）で発現されうる。他の好適な宿主細胞は、当業者によりに知られる。
【０１５４】
ベクターＤＮＡは、慣例の形質転換又はトランスフェクション技術により原核細胞又は真核細胞に導入されうる。本明細書中に使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共同沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−仲介トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔法を含む、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための本技術分野によって認められた種々の技術に関する。宿主細胞の好適な形質転換又はトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）、及び他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１５５】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に依存して、細胞のごく一部だけが外来性のＤＮＡをそれらのゲノムに統合することが知られている。これらの要素を確認して、選ぶために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質への寛容）をコードする遺伝子が一般に着目の遺伝子と同じく宿主細胞に導入される。様々な選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートのような薬物への抵抗を授けるものを含んでいる。選択可能なマーカーをコードしている核酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているのと同じベクターにより宿主細胞に導入されうるか、又は別々のベクターで導入されうる。安定的に導入された核酸を持つトランスフェクト細胞は、薬物選択によって確認されうる（例えば、選択可能な標識遺伝子を組み込まれた細胞は生き残るが、一方他の細胞は死ぬ）。
【０１５６】
培養状態の原核又は真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の製造（すなわち、発現）に使用されうる。それ故に、本発明は、本発明の宿主細胞を用いたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の製造方法をさらに提供する。１の態様において、前記方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質が製造されるような好適な培地中で本発明の宿主細胞（ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている組み換え発現ベクターがその中に導入されている）を培養することを含む。他の態様において、前記方法は、培地又は宿主細胞からのＡＲＰ／ＢＲＰの単離をさらに含む。
【０１５７】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造することにも使用されうる。例えば、１の態様において、本発明の宿主細胞は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする配列が導入された受精卵母細胞又は胚幹細胞である。次に、そのような宿主細胞は、外因性のＡＲＰ／ＢＲＰ配列がそれらのゲノムに導入された非トランスジェニック動物、又は内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ配列が変えられた相同組み換え動物を作製するために使用されうる。そのような動物は、ＡＲＰ／ＢＲＰの機能及び／又は活性を調査するため、及びＡＲＰ／ＢＲＰ活性のモジュレーターを確認して及び／又は評価するために役立つ。本明細書中に使用されるとき、「トランスジェニック動物」は、動物細胞の１つ以上が導入遺伝子をそれに含んでいるでいる、非動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット又はマウスのようなげっ歯動物である。トランスジェニック動物の他の例は、非霊長類、羊、犬、雌牛、ヤギ、鶏、両生類などを含んでいる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから作り上げられる細胞のゲノムに統合され、成熟した動物のゲノム内に残る外因性のＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１以上の細胞種又は組織においてコードされた遺伝子産物の発現を導く。本明細書中に使用されるとき、「相同組み換え動物」は、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が内因性の遺伝子と動物の細胞、例えば、動物の発生初期の動物の幹細胞に導入された外因性のＤＮＡ分子の間の相同組み換えによって変更された、非動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０１５８】
本発明のトランスジェニック動物は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸を、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、受精卵母細胞の前核に導入し、そして卵母細胞を偽妊娠雌フォスター動物により発育させることにより作製されうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として非動物のゲノムに導入されうる。あるいは、マウスＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のようなＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のヒト以外の相同物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡ （先にさらに記載される）へのハイブリダイゼーションに基づき単離することができ、そして導入遺伝子として使用される。イントロン配列及びポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の発現の効率を高めるために導入遺伝子に含まれることもできる。組織に特有な制御配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現を特定の細胞に導くために利用できるようにＡＲＰ／ＢＲＰ 導入遺伝子と連結されうる。特定の動物、例えばマウスの胚操作及びマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の製造方法は、本技術分野の慣習となり、そして例えば、米国特許番号第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；及び同第４，８７３，１９１号；並びにＨｏｇａｎ １９８６， Ｉｎ： ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．に記載される。類似した方法が、他のトランスジェニック動物の製造のために使われる。トランスジェニック創始動物は、 そのゲノム中のＡＲＰ／ＢＲＰ導入遺伝子の存在、及び／又は動物の組織、若しくは細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの発現に基づき確認されうる。次に、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を担持する追加の動物を飼育するために使用されうる。しかも、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物に飼育されうる。
【０１５９】
相同組み換え動物の作製のために、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子をそれによって変更、例えば機能的に分裂させるために欠失、付加、又は置換が導入されたＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが、準備される。ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子は、遺伝子（例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のｃＤＮＡ）でありうるが、より好ましくはＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の非相同体である。例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のマウス相同体は、マウス・ゲノム中の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の変更に好適な相同組み換えベクターの構築に使用されうる。１の態様において、ベクターは、相同組み換えにより、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が機能的に分裂させられる（すなわち、もはや機能性タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計される。
【０１６０】
あるいは、ベクターは、相同組み換えにより、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が突然変異するか、又は他の方法により変更されるが、まだ機能性タンパク質をコードするように設計されうる（例えば、上流の制御部位が変更され、それによって内因性のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現を変えることができる）。相同組み換えベクター内で、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の変更部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の追加の核酸により５’と３’末端で挟まれており、ベクターにより担持された外因性ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子と胚幹細胞の内因性ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の間で生じる相同組み換えを可能にする。さらなるフランキングＡＲＰ／ＢＲＰ核酸は、内因性遺伝子による相同組み換えの成功のために十分な長さである。一般に、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’及び３’末端の両方）が、ベクターに含まれている。相同組み換えベクターの記載に関して、例えばＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。ベクターは、（例えば、電気穿孔法）によって胚幹細胞系に導入されて、導入されたＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が相同的に内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子と組み換えられた細胞が選ばれる（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０１６１】
次に、選択された細胞は、凝集キメラを形成するために動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入される。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ １９８７， Ｉｎ： ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． １１３−１５２を参照のこと。次に、キメラ胚は、好適な偽妊娠雌フォスター動物に移植され、そしてこの胚を妊娠させる。
【０１６２】
それらの生殖細胞に相同組み換えＤＮＡを持つ子孫は、導入遺伝子の生殖細胞系列伝達により動物の全ての細胞が相同組み換えＤＮＡを含んでいる動物を飼育するために使用されうる。相同組み換えベクター及び相同組み換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ （１９９１） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号第９０／１１３５４号；同第９１／０１１４０号；同第９２／０９６８号；及び同第９３／０４１６９号にさらに記載されている。
【０１６３】
他の態様において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選ばれたシステムを含んでいる、トランスジェニックしたヒト以外の動物が、製造されうる。そのようなシステムの１つの例が、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムの記載は、例えばＬａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ・システムの他の例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ・システムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムが導入遺伝子の発現の調節に使用されるとき、Ｃｒｅリコンビナーゼと選ばれたタンパク質の両者をコードしている導入遺伝子を含んでいる動物が必要とされる。そのような動物は、例えば、一方が選ばれたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２種類のトランスジェニック動物を交配させることによる、「二重」トランスジェニック動物の構築を通して提供されうる。
【０１６４】
本明細書中に記載の非トランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される方法により製造されることもできる。手短に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば、体細胞は、単離され、かつ、成長周期を終了して、そしてＧ_Ｏ相に入るように誘導されうる。次に、静止状態の細胞は、静止状態の細胞が単離されたのと同じ種の動物から摘出された卵母細胞に、例えば電気のパルスの使用を通して融合されうる。次に、組み換え卵母細胞は、桑実胚又は未分化胚芽細胞に発達するように培養されて、そして偽妊娠雌フォスター動物に移される。この雌フォスター動物の子孫の出産は、単離された細胞、例えば体細胞、からの動物のクローンである。
【０１６５】
医薬組成物
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、及び抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体（本明細書中で「活性化合物」とも呼ばれる）、及びそれらの誘導体、断片、アナログ、及びホモログは、投与に好適な医薬組成物に組み入れられることができる。そのような組成物は、核酸分子、タンパク質、又は抗体、及び医薬として許容される担体を一般に含む。本明細書中に使用されるとき、「医薬として許容される担体」は、薬剤投与に適合するいずれか又は全ての溶剤、分散媒体、コート剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び崩壊遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、本明細書中に援用された本分野の標準的な参考文献に記載されている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例は、制限されることなく、水、生理食塩液、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストロース溶液、及び５％の血清アルブミンを含む。リポソーム及び不揮発性油のような非水性媒体が、使用されることもできる。医薬として活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用が、本技術分野で周知である。いずれかの慣例の媒体又は薬剤が活性化合物と両立しない範囲を除いて、組成物におけるしれらの使用が意図される。補足的な活性化合物が、組成物に組み入れられることもできる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、それの意図された投与経路に適合するように配合される。投与経路の例は、腸管外、例えば静中、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、及び直腸投与を含んでいる。腸管外、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁は、以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶剤のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、又はリン酸のような緩衝物質、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調節されうる。腸管外の製剤は、アンプル、使い捨ての注射器、又はガラス若しくはプラスチックで作られた複数回投与用のバイアルに包含されうる。
【０１６７】
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、無菌の水溶液（ここでは水溶性）、又は懸濁液、並びに無菌の注射可能な溶液若しくは懸濁液の即席調製のための無菌の粉末を含んでいる。静中投与のために、好適な担体は、生理食塩液、静菌性の水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでいる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければ成らず、そして扱いやすい注射針通過性がある位に流動的であるべきである。それは製造と貯蔵の条件下で安定であり、そして細菌及びカビのような微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含む溶剤又は分散媒体であるかもしれない。適切な流動率は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合の必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用によって保持されうる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって成し遂げられることができる。多くの場合で、組成物に等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビット、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含むことによって引き起こされうる。
【０１６８】
無菌の注射可能な溶液は、先に列挙された成分の１つ、又は組み合わせを有する適当な溶液中に必要量の活性化合物（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体）を組み入れ、必要により続けてろ過滅菌することにより準備しうる。一般的に、分散剤は、活性化合物を基本的な分散媒体、及び先に列挙した必要とされる他の成分を含んでいる無菌の媒質に組み入れることによって準備される。無菌の注射可能な溶液の準備のための無菌の粉末の場合、調製方法は、前もってろ過滅菌したそれらの溶液からの有効成分、及びいずれかのさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び冷凍乾燥である。
【０１６９】
経口的組成物は、一般に不活性な希釈剤又は食用担体を含んでいる。それらはゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に押し固められる。経口的な治療投与の目的のために、活性化合物は賦形剤と組み合わされて、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用されうる。うがい薬としての使用のための流体担体を用いた経口的組成物が、準備されることもでき、ここで上記流体担体中の化合物は、経口的に用いられて、スウィシュされ（ｓｗｉｓｈｅｄ）、吐かれるか又は飲み込まれる。医薬として適合する接着剤、及び／又はアジュバント物質が、組成物の一部として含まれることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれかか、又は類似した性質の化合物を含むことができる：微細結晶性セルロース、トラガントゴム、又はゼラチンのような結合剤；デンプン又はラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤；ショ糖又はサッカリンのような甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料のような香料。
【０１７０】
吸入による投与のために、化合物は、加圧された容器又は適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体を含んでいるディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾル・スプレーの形態でデリバリーされる。
【０１７１】
全身的な投与が、経粘膜的又は経皮的な手段によるかもしてない。経粘膜的又は経皮的な投与のために、通り抜けるべき関門に対して適切な浸透剤が製剤で使われる。そのような浸透剤は、一般に本技術分野で知られていて、例えば経粘膜的投与のために、洗浄薬、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含んでいる。経粘膜的投与は、スプレー式点鼻薬又は坐剤の使用により達成されうる。経皮的投与のために、活性化合物は本技術分野で一般に知られている軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ， ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、又はクリームの中に配合される。
【０１７２】
化合物は、直腸のデリバリーのための坐剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリドのような慣例の坐剤基剤による）、又は停留浣腸の形態で調製されることもできる。
【０１７３】
１つの態様において、活性化合物は、体からの迅速な排除から化合物を保護する担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化デリバリー・システムを含む徐放製剤と一緒に調整される。生物分解性がある、生体適合性重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸酸が使用されうる。そのような製剤の調製方法は、当業者にとって明白である。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。リポソーマル懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を狙うリポソームを含む）は、医薬として許容された担体として使用されることもできる。これらは、例えば米国特許番号第４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に知られる方法に従って調製されるかもしれない。
【０１７４】
投与の容易さと投与量の統一のための投与単位形態の経口又は腸管外の組成物を処方することは特に有益である。本明細書中に使用されるとき、投与単位形態は、治療される対象に関して単一の投与量として適した物理的に別個の単位に関する；各々の単位は、所望の薬剤の担体との関連で所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の分量を含む。本発明の投与単位形態に関する詳細は、活性化合物の独特な特徴、及び成し遂げられるべき特定の治療効果、並びに個体の治療のための上述の活性化合物を配合することの本技術分野に固有な制限により影響され、そして直接的に依存している。
【０１７５】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入されて、遺伝子治療ベクターとして使用されうる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所的な投与（米国特許番号第５，３２８，４７０号を参照のこと）、又は定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）により対象にデリバリーされうる。遺伝子治療ベクターの製剤は、遺伝子治療ベクターを許容される希釈剤中に含むことができるか、又は遺伝子デリバリー媒質が組み込まれた徐放基質を含むことができる。あるいは、完璧な遺伝子デリバリー・ベクターが組み換え細胞から原型を保って製造されている場合、例えば、レトロウイルス・ベクター、製剤は１以上の、遺伝子デリバリー・システムを製造する細胞を含むことができる。
【０１７６】
医薬組成物は、投与に関する規格と一緒に容器、包み（ｐａｃｋ）、又はディスペンサーに含まれうる。
【０１７７】
本発明の使用及び方法
シスチン・ノット・ドメインを含む可溶性タンパク質、例えば糖タンパク質ホルモン及び他の増殖因子は、（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体、（ｉｉ）他のシスチン・ノット・タンパク質、（ｉｉｉ）糖タンパク質ホルモン・スーパーファミリー・メンバー、（ｉｖ）チロシンキナーゼ増殖因子受容体に結合することが知られている。これらスーパーファミリー・メンバーは、相当数の機能を調節する多機能タンパク質である。従って、シスチン・ノット・ドメインを含む本明細書中に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、多量体、及び抗体は、以下の方法の１以上で使用されうる：（ａ）スクリーニング・アッセイ、（ｂ）検出アッセイ（例えば、組織適合試験）（ｃ）予測的な医学（例えば、診断アッセイ、兆候アッセイ、臨床試験の観察、及び薬理ゲノム学）、並びに（ｄ）治療方法（例えば、治療法及び予防法）。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、他の細胞タンパク質と相互作用して、その結果、（ｉ）ＡＲＰ／ＢＲＰ関連タンパク質活性のモジュレーション；（ｉｉ）細胞増殖の調節；（ｉｉｉ）細胞分化の調節；そして（ｉｖ）生殖機能の調節のために使用されうる。
【０１７８】
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに記載のとおり、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現（例えば、遺伝子治療用途の宿主細胞中の組み換え発現ベクターにより）、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の遺伝子の損傷の検出、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節するために使用されうる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、多量体、若しくは核酸の活性若しくは発現を調節する薬物、又は化合物のスクリーン、並びにＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは多量体の不十分であるか、又は過度の産生によって特徴づけられる障害の治療、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ野生型タンパク質若しくは多量体と比較して低下したか、又は異常な活性を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質か若しくは多量体の製造に使用されうる。（例えば、脳下垂体機能又は脳下垂体の標的器官、例えば副腎、甲状腺、生殖腺、又は肝臓が影響する生殖障害、例えば癌、排卵の障害、不妊症、性機能低下、又は新陳代謝の障害）。さらに、本発明の抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出及び単離、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性の調節に使用されうる。
【０１７９】
本願発明は、先に記載したスクリーニング・アッセイによって同定された新規物質、並びに本明細書中に記載の治療のためのそれらの使用にさらに関する。
【０１８０】
スクリーニング・アッセイ
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体に結合するか、あるいは、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ発現、若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ活性に刺激又は妨害作用を持っているモジュレーター、すなわち候補物質又は試験化合物又は物質（例えば、ペプチド、ペプチド擬態、小分子、又は他の薬物）を確認する方法（本明細書中で「スクリーニング・アッセイ」とも呼ばれる）を提供する。
【０１８１】
１の態様において、本発明は、膜結合型ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはポリペプチド、又はそれらの生理活性部分に結合するか、あるいはそれらの活性を調節する候補物質又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。以下：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行面固相又は溶液相ライブラリ；デコンヴォルーションを要する合成ライブラリー方法；「ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ライブラリー方法；及びアフィニティー・クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法を含む本技術分野で知られている組み合わせライブラリー法のおびただしい数のアプローチのいずれかを使って本発明のテスト化合物を得ることができる。生物学的ライブラリ・アプローチは、ペプチド・ライブラリに限られているが、一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチド・オリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：１４５）。
【０１８２】
分子ライブラリーの合成方法の例は、本技術分野、例えば以下の： ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＪＭｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３で見ることができる。
【０１８３】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、又はビーズで（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、又はチップ上に（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌で（Ｌａｄｎｅｒ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２２３，４０９）、胞子で（Ｌａｄｎｅｒ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ２，２２３，４０９）、プラスミドで（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、又はファージにより（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：６３７８−６３８２； Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１−３１０； Ｌａｄｎｅｒ 前記）提供される。
【０１８４】
１つの態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体若しくはそれらの生理活性部分を呈する細胞を、試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に又は多量体に結合する試験化合物の能力を計測する細胞ベースのアッセイである。例えば、細胞は、哺乳動物起源又は酵母である。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は多量体に結合する試験化合物の能力の計測は、例えば試験化合物を、試験化合物のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性タンパク質への結合が複合体中の標識化合物の検出により計測できるような放射性同位元素又は酸素ラベルとの結合により達成される。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接的又は間接的に標識されることができて、そして放射性放出の直接的なカウント又はシンチレーション・カウンティングによって放射性同位元素が検出される。あるいは、試験化合物は、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼにより酵素的に標識されることができて、適切な基質の産物への転換の定量によりこの酸素ラベルを検出した。１の態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分を発現する細胞をＡＲＰ／ＢＲＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、既知の化合物と比較して時のＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはそれらの生理活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力の決定することを含む。
【０１８５】
他の態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくは多量体、又はそれらの生理活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくは多量体、又はそれらの生理活性部分の活性を調節（例えば、刺激又は、抑制）する試験化合物の能力を決定することを含む細胞ベースのアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えばＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子との結合又は相互作用を計測することにより達成される。本明細書中で使用されるとき、「標的分子」は、本来ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と結合又は相互作用する分子であり、例えばＡＲＰ／ＢＲＰと相互作用するタンパク質を呈する細胞表面上の分子、第２細胞の表面上の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側面に関係している分子、又は細胞質分子である。ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子は、非ＡＲＰ／ＢＲＰ分子又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、あるいは本発明のポリペプチドであるかもしれない。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子は、細胞膜を通って、そして細胞の中への細胞外シグナル（例えば、膜結合ＡＲＰ／ＢＲＰ分子への化合物の結合によって生じたシグナル）の伝達を容易にするシグナル経路の構成要素である。例えば、標的は、触媒活性がある第２の細胞間のタンパク質、又はＡＲＰ／ＢＲＰと下流のシグナリング分子のつながりを容易にするタンパク質であるかもしれない。
【０１８６】
ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に結合するか又はそれらと相互作用するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力の決定は、直接的な結合の計測のための先に記載の方法の１つにより達成される。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に結合するか又はそれらと相互作用するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力の決定は、標的分子の活性の計測により達成されうる。例えば、標的分子の活性は、標的（すなわち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３など）の細胞の第２メッセンジャーの誘導の検出、適切な基質標的の触媒／酵素活性の検出、（検出可能な標識、例えばルシフェラーゼ、をコードする核酸に利用できるように連結されたＡＲＰ／ＢＲＰ応答性制御要素を含む）リポーター遺伝子の誘導の検出、あるいは細胞応答、例えば細胞生存、細胞分化、又は細胞増殖の検出によって決定されうる。
【０１８７】
さらに他の態様において、本発明のアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分に結合する試験化合物の能力を確認することを含む、細胞を含まないアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質への試験化合物の結合は、先に記載のとおり直接的又は間接的に決定されうる。１の態様において、アッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分ＡＲＰ／ＢＲＰの結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、既知の化合物と比較して時のＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはそれらの生理活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力の決定することを含む。
【０１８８】
他の態様において、アッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの生理活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの生理活性部分の活性を調節（例えば、刺激又は、抑制）する試験化合物の能力を決定することを含む、細胞を含まないアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば直接的結合の計測のための先に記載の方法の１つによりＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子との結合を計測することにより達成される。代わりの態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を調節する試験化合物の能力の決定は、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的タンパク質をさらに調節するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の活性を計測することにより達成される。例えば、適当な基質における標的分子の触媒／酵素活性は、前期のとおり確認されうる。
【０１８９】
さらに他の態様において、細胞を含まないアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分ＡＲＰ／ＢＲＰの結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に優先的に結合するか、又はその活性を調節するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力を決定することを含む。
【０１９０】
本発明の細胞を含まないアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰの溶液形態又は膜結合形態の両方の使用に耐えられる。ＡＲＰ／ＢＲＰの膜結合形態を含んでいる細胞を含まないアッセイの場合に、膜結合形態のＡＲＰ／ＢＲＰが溶液状態で保持されるような溶解補助剤を利用することが望ましいかもしれない。そのような溶解補助剤の例は、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパン・スルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホンネート（ＣＨＡＰＳＯ）のような非イオンの界面活性剤を含む。
【０１９１】
本発明の前述のアッセイ方法の１以上の態様において、一方若しくは両方のタンパク質の非複合形態からの複合形態の分離を容易にするために、並びにアッセイの自動化に適応させるためにＡＲＰ／ＢＲＰ又はその標的分子を固定することが望ましい。ＡＲＰ／ＢＲＰへの試験化合物の結合、又は候補化合物の存在又は不存在下での標的分子とＡＲＰ／ＢＲＰの相互作用は、反応物を含むのに好適ないずれの容器でも達成されうる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠沈管を含んでいる。１の態様において、タンパク質の一方又は両方の基質への結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質が提供されうる。例えばＧＳＴ−ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質又はＧＳＴ−標的融合タンパク質を、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート吸着させることができ、次にそれを試験化合物、あるいは試験化合物と吸着させていない標的タンパク質若しくはＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のどちらかと結合させ、そしてこの混合物を複合体形成を招く条件下（例えば、塩及びｐＨについて生理学的な条件で）でインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを、洗浄してあらゆる非結合成分を除去し、固定化された基質がビーズの場合には、複合体が、前述のように、例えば直接的に又は間接的に決定される。あるいは、複合体は、基質から分離され、そして標準的な技術を使って、ＡＲＰ／ＢＲＰ結合又は活性のレベルが決定されうる。
【０１９２】
基質にタンパク質を固定するための他の技術は、本発明のスクリーニング・アッセイでも使用されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ又はその標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンの抱合を利用して固定化されうる。ビオチン化されたＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子は、本技術分野で周知の技術を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製することができ（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）、そしてストレプトアビジンによりコートされた９６ウェル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェル内に固定化される。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に応答性だが、標的分子とＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の結合を邪魔することのない抗体は、プレートのウェルに誘導体化されて、結合していない標的又はＡＲＰ／ＢＲＰを抗体抱合によってウェル内に捕捉しうる。そのような複合体の検出方法は、前述のＧＳＴ−固定化複合体に加えて、ＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に応答する抗体を用いた複合体の免疫検出、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に関係している酵素活性の検出を基にした酵素結合アッセイを含んでいる。
【０１９３】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物に接触されて、細胞のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を測定する方法で確認される。候補物質化合物の存在下のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現のレベルが、候補化合物の不存在下のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較される。次に、候補化合物は、この比較に基づいてＡＲＰ／ＢＲＰ発現のモジュレーターとして確認されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその不存在下よりも多い（統計的に有意に多い）とき、候補化合物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の刺激薬と確認される。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその不存在下よりも少ない（統計的に有意に少ない）とき、候補化合物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の阻害剤と確認される。細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定されうる。
【０１９４】
本発明のさらに他の側面において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰと結合、又は相互作用してＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する他のタンパク質（「ＡＲＰ／ＢＲＰ結合タンパク質」若しくは「ＡＲＰ／ＢＲＰ−ｂｐ」）を確認するために「餌タンパク質」として二重ハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）アッセイ、又は三重ハイブリッド・アッセイで使用されうる（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａｅｔａｌ． （１９９３） ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）。そのようなＡＲＰ／ＢＲＰ結合結合タンパク質は、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ経路の上流又は下流要素としてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質によるシグナルの伝播に関係していることが見込まれもする。
【０１９５】
二重ハイブリッド・システムは、分離可能なＤＮＡ結合及び活性化ドメインから成る、ほとんどの転写因子の基準の性質に基づく。要するに、このアッセイは、２種類の異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合領域をコードする遺伝子に融合させる。他の構築物において、正体不明のタンパク質（「えじき（ｐｒｅｙ）」又は「サンプル」）のＤＮＡ塩基配列のライブラリーからのＤＮＡ塩基配列を、既知の転写因子の活性化領域をコードする遺伝子に融合させる。「餌（ｂａｉｔ）」及び「えじき」タンパク質が、生体内においてＡＲＰ／ＢＲＰ依存性複合体を形成する相互作用が可能である時、転写因子のＤＮＡ結合及び活性化領域は、緊密な近似をもたらす。この近似は、転写因子に応答する転写制御部位に利用できるように連結されたリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現は、検出されることができて、そして機能的な転写因子を含む細胞コロニーが単離されて、ＡＲＰ／ＢＲＰと相互作用するタンパク質をコードするクローン化された遺伝子を得るために使用されうる。
【０１９６】
本願本発明は、前記のスクリーニング・アッセイにより同定された確認された新規薬剤、及び本明細書中に記載のような治療のためのそれらの使用にさらに関する。
【０１９７】
組織適合試験
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、わずかな生物学的なサンプルから個体を確認することに使用されることもできる。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１以上の制限酵素で消化されて、識別のための独特なバンドをもたらすためにサザンブロットで探られる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（「制限断片長多型」米国特許番号第５，２７２，０５７号に記載）のための追加のＤＮＡ標識として有用である。
【０１９８】
さらに、本発明の配列は、個体ゲノムの選ばれた部分における塩基ごとの実際のＤＮＡ塩基配列を決定する代替技術を提供することに使用されうる。このように、本明細書中に記載のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、配列の５’及び３’末端からの２つのＰＣＲプライマーを作ることに使用されうる。次に、これらのプライマーは、個体のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列決定するために使われる。
【０１９９】
このやり方で準備される個体からの対応するＤＮＡ塩基配列のパネルは、各々の個体が対立遺伝子の相違によるそのようなＤＮＡ塩基配列のユニークな組み合わせを持つ時、独特な個体の識別を提供しうる。本発明の配列は、個体と組織からそのような識別配列を得ることに使用されうる。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、特徴的にゲノムの一部を表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコーディング領域にある程度発生し、非コーディング領域により高い頻度で発生する。ヒトの個体間の対立遺伝子変異は、５００塩基当たり約１つの頻度で発生すると見積もられる。対立遺伝子変異の多くが、制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）を含む一塩基多型（ＳＮＰｓ）による。
【０２００】
本明細書中に記載の各々の配列は、ある程度まで個体からのＤＮＡを識別の目的のために比較しうる標準として使用されうる。より多数の多型が非コーディング領域で生じるので、より少ない配列しか個体を識別するのに必要ではない。配列番号２、４、１８、２０、及び２２の非コーディング配列は、各々が１００塩基の非コーディング増幅配列をもたらす多分１０〜１，０００のプライマーのパネルにより明確な個々の識別を十分に提供しうる。推測されたコード配列、例えば配列番号２、４、１８、２０、及び２２のそれが使用されたとき、十分な個体の識別のためのより適切なプライマーの数は５００〜２，０００である。
【０２０１】
予測的な医学
本発明は、診断上のアッセイ、兆候アッセイ、薬理ゲノム学、及び臨床試験の観察が兆候（推測）目的のために使用され、それによって予防に個体を処置する予測的な医学の分野に関しもする。それ故に、本発明の１の側面は、それによって個体が、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性、例えば生殖障害、不妊症、排卵の障害に関係する病気又は障害に冒されているが、あるいは障害が進行する危険性があるかを決定するための、生物学的なサンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）の状況中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ 多量体、及び／又は核酸の発現、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ及びＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性を決定するための診断アッセイに関する。本発明は、個体がＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現又は活性に関係している障害を進行させる危険があるかどうかを決定するための兆候（又は予測的）アッセイをも提供もする。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子内の突然変異は、生物学的サンプルでアッセイされうる。そのようなアッセイは、それによりＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、核酸の発現又は活性に特徴づけられたか、又は関連する障害の兆候に先立ち個体を処置するための兆候または予測的な目的のために使われることができる。
【０２０２】
本発明の他の側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現、又は個体のＡＲＰ／ＢＲＰ活性を測定し、それによってその個体について適切な治療又は病気を予防する薬剤を選ぶ方法（「薬理ゲノム学」とも呼ばれる）を提供する。薬理ゲノム学は、個体（例えば、特定の物質に応答する個体の能力を決定するために検査された個体の遺伝子型）個体の遺伝子型に基づいた個体の治療又は予防処置のための作用物質（例えば、薬物）の選定を可能にする。
【０２０３】
本発明のさらに他の側面は、臨床試験におけるＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性への作用物質（例えば、薬物若しくは化合物）の影響を観察することに関する。
【０２０４】
これら及び他の作用物質は、以下のセクションにおいてより詳細に記載される。
【０２０５】
診断上のアッセイ
生物学的なサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰの存在又は不存在を検出する模範的な方法は、試験対象から生物学的サンプルを得て、ＡＲＰ／ＢＲＰの存在が生物学的サンプルで検出されるように、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物又は作用物質と生物学的サンプルを接触させることを含む。ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための作用物質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡかゲノムＤＮＡにハイブリダイズしうる標識核酸プローブである。例えば、核酸プローブは、完全長のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸、例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸、又は少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、又は５００ヌクレオチドの、かつ、ストリンジェントな条件下、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであるようなそれらの一部でありうる。本発明の診断上のアッセイに使用するための他の好適なプローブが、本明細書中に記載されている。
【０２０６】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体を検出するための作用物質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ 多量体に結合しうる抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、又はより好ましくは、モノクローナルである。完全な抗体又はそれらの断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２）が使用されうる。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」は、連結（すなわち、物理的な連結）によるプローブ又は抗体の直接的な標識付け、並びに直接的に標識された作用物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識付けを含むように意図される。間接的な標識付けの例は、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出されるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端の標識付けを含んでいる。用語「生物学的サンプル」は、対象から単離した組織、細胞、及び生体液、並びに対象の中に存在する組織、細胞、及び流体を含むように意図される。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロにおける、並びにインビトロにおける生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡを検出するために使用されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザン・ハイブリダイゼーション及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫螢光法を含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザン・ハイブリダイゼーションを含んでいる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を対象の中へ導入することを含んでいる。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び所在が標準的な映像技術によって検出されうる放射性マーカーで標識されうる。
【０２０７】
１の態様において、生物学的サンプルは、試験対象からのタンパク質分子を含んでいる。あるいは、生物学的サンプルは、試験対象からのｍＲＮＡ分子又は試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣例の手段によって単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０２０８】
他の態様において、方法は、対照の対象から対照生物学的サンプルを得、この対照サンプルを、生物学的なサンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出するようなＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの検出が可能な化合物又は作用物質と接触させ、そして上記対照サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。
【０２０９】
本発明は、生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの存在を検出するためのキットをも含む。例えば、キットは、以下の：生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又はｍＲＮＡを検出しうる標識化合物又は作用物質；生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの量を測定するための手段；そしてサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰの量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物又は作用物質は、好適な容器により包装されうる。キットは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸を検出するためにキットを使うため規格をさらに含むことができる。
【０２１０】
兆候アッセイ
本明細書中に記載の診断上の方法は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気か、又は障害を持つか、あるいはそれらを進行させる危険がある対象を確認するためにさらに利用されうる。例えば、本明細書中に記載のアッセイ、例えば先の診断上のアッセイ又は以下のアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現又は活性に関係している障害、例えば癌、排卵の障害、不妊症、若しくは性機能低下を持つか、又はそれらを進行させる危険がある対象を確認するために利用されうる。あるいは、兆候アッセイは、病気又は障害を持つか、あるいは進行させる危険がある対象を確認するために利用されうる。このように、本発明は、対象から得られ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又は核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）の存在が検出される、試験サンプル中の異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性関係している病気又は障害を確認する方法を提供し、ここでＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又は核酸の存在を、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気又は障害を持つか、又はそれらを進行させる危険がある対象に関する診断に用いる。本明細書中に使用されるとき、「試験サンプル」は、着目のの対象から得られた生物学的サンプルに関する。例えば、試験サンプルは、生体液（例えば、血清）、細胞サンプル、又は組織であるかもしれない。
【０２１１】
さらに、本明細書中に記載の兆候のアッセイは、対象が、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気又は障害の処置のために作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、偽ペプチド、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬物候補物質）を与えられることができるかどうかを決定するために使用されうる。例えば、そのような方法は、癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下のような障害のための作用物質で対象が効果的に治療されうるかどうかを決定するために使用されうる。このように、本発明は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現に活性に関係している障害を治療ための作用物質により対象が効果的に治療されうるかどうか確認するための方法を提供することができ、ここで試験サンプルを得、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸を検出する（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸の存在は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現若しくは活性に関係している障害を治療するための作用物質が対象に与えられうるかを診断する）。
【０２１２】
本発明の方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の遺伝子の損傷を検出することにも使用されることができ、それによって、損傷遺伝子を持つ対象が異常な細胞増殖及び／又は分化によって特徴づけられる障害について危険があるかどうかを決定する。様々な態様において、前記方法は、対象からの細胞サンプルにおける、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている遺伝子の完全性に影響する少なくとも１の変更、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の誤発現によって特徴づけられる損傷遺伝子の存在又は不存在を検出することを含んでいる。例えば、そのような遺伝子の損傷は、（１）ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；（２） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加；（３） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（４）ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の染色体の転位；（５） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの変更、（６） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾、（７） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型のスプライシング・パターンの存在、（８） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の非野生型レベル、（９） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の対立遺伝子欠失、そして（１０） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の不適切な転写後修飾の少なくとも１つの存在を確かめることによって検出されうる。本明細書中に記載のとおり、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子中の損傷を検出するために使用されうる本技術分野で知られている多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣例の手段によって単離された末梢血液白血球サンプルである。しかし、例えば頬の粘膜細胞を含め、有核の細胞を含んでいるいずれの生物学的サンプルでも使用されうる。
【０２１３】
ある態様において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許番号第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、例えばアンカーＰＣＲ若しくはＲＡＣＥ ＰＣＲ、あるいはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の点突然変異の検出に特に役立つかもしれない（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者からの細胞のサンプルを収集し、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、又はその両方）を分離し、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子（存在する場合には）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと上記核酸サンプルを接触させ、そして増幅産物の存在又は不存在を検出するか、あるいは増幅産物のサイズを測定し、そして、対照サンプルと長さを比較するステップを含む。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、本明細書中に記載の突然変異を検出するために使われる技術のいずれかに関連する予備的な増幅ステップとして使用されることが望ましいと予想される。
【０２１４】
当業者が周知の技術を用いた増幅分子の検出が続く、代替の増幅方法は、以下の：自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ， ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータ・レプリカ−ゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、又は全ての他の核酸増幅方法を含む。そのような分子が非常に少ない数であれば、これらの検出スキームは核酸分子の検出に特に有用である。
【０２１５】
代替の態様において、サンプル細胞からのＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異は、制限酵素開裂パターンの変化によって確認されうる。例えば、サンプル及び対照ＤＮＡを単離し、（場合により）増幅し、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして断片長サイズをゲル電気泳動法によって決定し、そして比較する。サンプルと対照ＤＮＡの間の断片長サイズの相違は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。しかも、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許番号第５，４９３，５３１号を参照のこと）は、リボザイム開裂部位の構築又は損失による特定の突然変異の存在についてのスコアに使用されうる。
【０２１６】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰにおける遺伝子突然変異は、サンプルと対照核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、を何百又は何千ものオリゴヌクレオチド・プローブを含む高密度アレイ（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７： ２４４−２５５； Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： ７５３−７５９）にハイブリダイズさせることによって確認しうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰの遺伝子突然変異は、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．の前記に記載の発光ＤＮＡプローブを含んでいるニ次元アレイにより確認しうる。要するに、プローブの第１ハイブリダイゼーション・アレイが、一連の重複プローブの線形アレイを作ることによって配列間の塩基変化を確認するためにサンプル及び対照ＤＮＡの長い広がりを通してスキャンするために使用されうる。このステップは、点突然変異の同定を可能にする。このステップには、検出される全ての変異型又は突然変異に相補的なより小さくて、特殊なプローブ配列を使うことによって特定の突然変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーション・アレイが続く。各々の突然変異アレイは、一方が野生型遺伝子に相補的であり、そして他方が突然変異型遺伝に相補的である、平行なプローブ・セットから構成される。
【０２１７】
さらに他の態様において、本技術分野で知られている種々の配列応答のいずれかは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の直接的な配列決定に、そしてサンプルＡＲＰ／ＢＲＰの配列と対応する野生型（対照）配列を比較することによって突然変異の検出に使用されうる。配列応答の例は、Ｍａｘｉｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ （１９７７） ＰＮＡＳ ７４：５６０、又はＳａｎｇｅｒ （１９７７） ＰＮＡＳ ７４：５４６３により開発された技術に基づくものを含んでいる。同様に、質量分析での配列決定を含む診断上のアッセイ（Ｎａｅｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を遂行する時、種々の自動化された配列決定手順の全てを利用しうると意図される（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３６：１２７−１６２； ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８： １４７−１５９を参照のこと）。
【０２１８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子における突然変異の検出のための他の方法は、開裂剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖のミスマッチ塩基を検出するために使用される方法を含んでいる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。概して、「ミスマッチ開裂」の本技術分野の技術は、組織サンプルから得た潜在的な突然変異型ＲＮＡ又はＤＮＡと野生型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列を含む（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡのハイブリダイズにより形成されるヘテロ２本鎖を提供することによって始まる。ニ重鎖の２本鎖は、例えば対照とサンプル鎖の間のミスマッチ塩基対により生じるであろう、２本鎖の１本鎖部位を開裂する作用物質で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖は、ＲＮａｓｅにより、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、Ｓ１ヌクレアーゼにより酵素的にミスマッチ部位を消化するために処理されうる。他の態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖のいずれかは、ミスマッチ部位を消化するためにヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム、及びピペリジンにより処理されうる。ミスマッチ部位の消化の後に、得られた物質は、変性ポリアクリルアミドゲルを用いてサイズによって分けられ、突然変異部位が決定される。例えばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７； Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：２８６−２９５を参照のこと。１の態様において、対照ＤＮＡ又はＲＮＡは検出のために標識されうる。
【０２１９】
さらに他の態様において、ミスマッチ開裂反応は、細胞のサンプルから得られたＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡの点突然変異の検出及びマッピングにための規定のシステムとにおける２本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対を確認する１以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を利用する。例えば、Ｅ．コリのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを開裂する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）。典型的な例によると、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列に基づいたプローブ、例えば野生型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、試験細胞からのｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。２本鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素により処理され、開裂産物がもしあれば電気泳動プロトコールなどにより検出される。例えば、米国特許番号第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２２０】
他の態様において、電気泳動移動度の変化は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異の確認に使われる。例えば、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）は、突然変異型と野生型核酸の間の電気泳動移動度の相違を検出するために使われた（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ： ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） ＭｕｔａｔＲｅｓ ２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ （１９９２） Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９をも参照のこと）。サンプル及び対照ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性されて、そして再生される。１本鎖核酸の２次構造は、配列に従って変わり、電気泳動移動度において得られた変化は、１塩基の変化さえ検出を可能にする。ＤＮＡ断片は、標識されるか又は標識されたプローブで検出されうる。アッセイの感度は、２次構造が配列の変化により敏感であるＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を使うことによって高められうる。１の態様において、対象方法は、電気泳動移動度の変化に基づく２本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するためのヘテロ二重鎖解析を利用する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
【０２２１】
さらに他の態様において、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲルによる突然変異型、又は野生型断片の移動は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を使ってアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥがアッセイ方法として使われる時、ＤＮＡは、例えばＰＣＲによる約４０のｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプに付加により完全に変性しないことを確実にするために修飾される。さらなる態様において、対照とサンプルＤＮＡの移動度の違いの確認のために変性剤濃度勾配の代わりに温度勾配が使われる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ （１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３）。
【０２２２】
点突然変異の検出のための他の技術の例は、制限されることなく、選択的なオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、選択的な増幅、又は選択的なプライマー伸長を含む。例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーは、既知の突然変異が主に実施され、次に完璧な一致の場合のみにハイブリダイゼーションしうる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることにより調製される（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０）。そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に接着し、かつ、標識された標的ＤＮＡにハイブリダイズするとき、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は相当数の異なる突然変異型にハイブリダイズする。
【０２２３】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、すぐ利用できる本発明と一緒に使用されうる。特異的増幅のためのプライマーとして使われたオリゴヌクレオチドは、（増幅が差異的なハイブリダイゼーションに依存するような）分子の中心に（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２４３７−２４４８）、又は適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げるか又は減らしうるできる、１つのプライマーの極端な３’末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ （１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）に着目の突然変異を担持するかもしれない。加えて、開裂に基づく検出を生み出すために突然変異部位に新規制限部位を導入することが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。ある態様において、増幅は、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて実施されもすると予想される（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８ ８：１８９）。そのような場合、連結は、完璧な一致が３’末端の５’配列に存在した場合に限り起こり、増幅の有無を捜すことによって特定の部位での既知の突然変異の存在の検出を可能にする。
【０２２４】
本明細書中に記載の方法は、例えば本明細書中に記載のプローブ核酸又は抗体試薬の少なくとも１つを含んでいる、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に関与する疾患又は病気の症状又は家族歴を示す患者の臨床的診断に都合よく使用されうる、あらかじめ包装された診断キットの利用によって実施されうる。
【０２２５】
さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰが発現されているあらゆる細胞種又は組織、好ましくは、末梢血液白血球が、本明細書中に記載の兆候アッセイで利用されうる。しかし、例えば頬の粘膜細胞を含む、有核細胞を含むあらゆる生物学的サンプルが使用されうる。
【０２２６】
薬理ゲノム学
本明細書中に記載のスクリーン・アッセイにより同定された、ＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現）に対して刺激又は阻害効果を持つ作用物質又はモジュレーターは、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ活性に関係した障害（例えば、癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下）を治療（予防に又は治療に）するために個体に投与されうる。そのような治療に関連して、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来の化合物又は薬物へのその個体の応答の間の関係の研究）が考えられるかもしれない。治療薬の代謝の相違は、薬理学的に活性な薬剤の投与量と血中濃度の関係が変わることによって重大な毒性又は治療の失敗をもたらしうる。このように、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づいた予防又は治療処置のための効果的な作用物質（例えば薬物）の選定をもたらす。そのような薬理ゲノム学は、適切な投与量、及び治療計画の決定にさらに使用されうる。それ故に、個体のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の活性、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の発現、又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異内容は、個体の治療又は予防処置のための適切な作用物質の選択を決定しうる。
【０２２７】
薬理ゲノム学は、罹患したヒトにおける薬物の変化した性質及び異常な作用による、薬物に対する応答の臨床的に重要な遺伝的な変化に対応する。例えば、をＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９６， ２３：９８３−９８５、及びＬｉｎｄｅｒ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， １９９７，４３：２５４−２６６参照のこと。一般に、２種類の薬理ゲノム学の条件は、区別されうる。体に対する薬剤の作用の様式を変化させる１つの因子として伝達される遺伝的条件（薬物作用を変える）、又は薬物に対する体の作用の様式を変化させる１つの因子として伝達される遺伝的条件（薬物代謝を変える）。これらの薬理ゲノム学の条件は、稀な欠陥又は多型のいずれかとして生じうる。例えば、主な臨床合併症がオキシダント系薬物（抗マラリア薬、サルファ薬、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取、及びソラマメの消費後の溶血であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、遺伝性の酵素病である。
【０２２８】
説明的な態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強さ及び継続時間の両者が主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、並びにシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、ある患者が期待されている薬物効果を得ないのか、又は標準的で、安全な量の薬物を飲んだ後に過度の薬物反応と深刻な毒性を示したりする理由に関する説明を提供した。これらの多型は、集団中に、高代謝群（ＥＭ）及び低代謝群（ＰＭ）の２つの発現型を呈する。ＰＭの有病数は異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６コードする遺伝子は、高度に多型であり、そして全部が機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠損に導く、いくつかの突然変異がＰＭで確認された。それらが標準的な服用を受けた場合、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、過度の薬物反応と副作用をかなりの頻度で経験する。代謝産物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６によって形成された代謝産物モルヒネにより仲介されるコデインの無痛効果について証明されたような治療応答を示さない。他の異常は、標準的な服用に応答しないいわゆる超高代謝群である。最近、超高代謝群の分子的機序が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅が原因であると確認された。
【０２２９】
このように、個体のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の発現、又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異の内容が、それによって個体の治療又は予防処置に適切な作用物質の選択を決定しうる。さらに、薬理ゲノム学の研究は、個体の薬物反応性発現型の同定に薬物代謝酵素をコードしている多型対立遺伝子を適用するために使われうる。投薬又は薬物選択に適用されるとき、この知識は、本明細書中に記載の典型的なスクリーニング・アッセイの１つによって確認されたモジュレーターのようなＡＲＰ／ＢＲＰモジュレーターを持つ対象を処置する場合に、有害反応又は治療の失敗を避けて、その結果、治療又は予防効果を高めることができる。
【０２３０】
臨床試験中の効果の観察
ＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の発現又は活性に対する（例えば、異常な細胞増殖、及び／又は分化を調節する能力）作用物質（例えば、薬物、化合物）の影響の観察は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験でも用いられることができる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるか、又はＡＲＰ／ＢＲＰ活性を上方制御する、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイにより同定された作用物質の有効性は、低下したＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＡＲＰ／ＢＲＰ活性を示している対象の臨床試験により観察されうる。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させるか、ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を下方制御する、スクリーニング・アッセイによって同定された作用物質の有効性は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるか、又はＡＲＰ／ＢＲＰ活性を上方制御を示している対象の臨床試験で観察されうる。そのような臨床試験において、ＡＲＰ／ＢＲＰ、並びに、好ましくは、例えば癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下と関連する他の遺伝子の発現又は活性が、特定の細胞の免疫応答性の「出力」又はマーカーとして使用されうる。
【０２３１】
例えば、そして制限としてでなく、（例えば、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイで同定される）ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する作用物質（例えば、化合物、薬物、又は小分子）を用いた処理により細胞内で調節される、ＡＲＰ／ＢＲＰを含めた遺伝子を確認しうる。このように、例えば臨床試験で、細胞増殖障害に対する作用物質の効果を調査するために、細胞が単離され、そしてＲＮＡが準備され、そしてＡＲＰ／ＢＲＰ及び障害に関連した他の遺伝子の発現レベルについて分析される。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載のノーザンブロット解析、又はＲＴ−ＰＣＲ、あるいは本明細書中に記載の方法の１つによる産生されたタンパク質の測定、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ又は他の遺伝子の活性レベルの計測により定量されうる。この方法において、遺伝子発現パターンは、作用物質に対する細胞の生理学的な応答を表わしたマーカーとしての役目をする。それ故に、この応答状態は、作用物質による個体の処置の前、及びその間の様々な時点で決定される。
【０２３２】
１の態様において、本発明は、以下の（ｉ）作用物質の投与前の対象から投与前サンプルを得、；（ｉｉ） 投与前サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し、；（ｉｉｉ）対象から１点以上の投与後サンプルを得；（ｉｖ）投与以後サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルを検出し；（ｖ）投与前サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡと投与後サンプル又はサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノム ＤＮＡの発現又は活性レベルを比較し；そして（ｖｉ）対象に対する作用物質の投与量を適宜に変える、ステップを含む作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、偽ペプチド、核酸、小分子、又は本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイによって確認された他の薬物候補物質）を用いた対象の処置の有効性を観察する方法を提供する。例えば、作用物質の増加した投与は、検出されるより高いレベルまでＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を増加させるために、すなわち、作用物質の有効性を増加させるために望ましいかもしれない。あるいは、作用物質の減少した投与は、検出されるより低いレベルまでＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を減少させるために、すなわち、作用物質の有効性を減少させるために望ましいかもしれない。
【０２３３】
処置方法
本発明は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している障害、例えば細胞の増殖障害又は再生障害の危険がある（それに感受性の）か、又は障害を持つ対象を処置する予防、又は治療方法の両方を提供する。さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、及びタンパク質多量体は、精子形成を刺激するため、甲状腺細胞の機能を高めるため（すなわち、甲状腺ホルモン製造とヨウ化物捕捉の増加）、性腺機能を調節するため、性腺ホルモン製造を調節するため、生殖能力を促進するか又は抑制するために使用されうる。
【０２３４】
障害
レベル又生理活性の増加により特徴づけられる（病気又は障害で苦しんでいない対象に関係する）病気及び障害は、活性が拮抗する（すなわち、減少又は抑制）治療薬により処置される。活性が拮抗する治療薬は、治療のためであるか又は予防のための様式で投与されるかもしれない。利用されうる治療薬は、制限されることなく、（ｉ）前述のペプチド、又はそれらのアナログ、誘導体、断片、又はホモログ；（ｉｉ）前述のペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）前述のペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組み換えによって前述のペプチドの内因性機能の「ノックアウト」に利用される、「機能障害」である（すなわち、前述のペプチドに対するコード配列のコード配列内の非相同性挿入による）、アンチセンス核酸及び核酸の投与（例えばＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）；（ｖ）前述のペプチドとその結合パートナーの間の相互作用を変更するモジュレーター（すなわち、本発明でさらなる偽ペプチド若しくは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、及びアンタゴニスト）、あるいは（ｖｉ）前述のタンパク質多量体を含んでいる。
【０２３５】
レベル又生理活性の減少により特徴づけられる（病気又は障害で苦しんでいない対象に関係する）病気及び障害は、活性を増加させる（すなわち、そのアゴニストである）治療薬により処置される。活性を増加させる治療薬は、治療のためであるか又は予防のための様式で投与されるかもしれない。利用されうる治療薬は、制限されることなく、前述のペプチド、又はそれらのアナログ、誘導体、断片、又はホモログ；あるいは生理活性を増加させるアゴニストを含む。
【０２３６】
増加又は減少レベルは、（例えば、バイオプシー組織から）患者組織サンプルを得、そしてインビトロでＲＮＡ又はペプチドレベル、発現されたペプチドの構造、及び／又は活性（又は前述のペプチドのｍＲＮＡ）についてアッセイすることによる、ペプチド及び／又はＲＮＡの定量化により、容易に検出されうる。本技術分野で周知な方法は、制限されることなく、免疫学的アッセイ法（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、続くドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などにより）、及び／又はｍＲＮＡｓの発現を検出するためのハイブリダイゼーション・アッセイ法（例えば、ノーザン・アッセイ、ドット・ブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）を含む。
【０２３７】
予防方法
１の側面において、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は少なくとも１のＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する作用物質を対象に投与することによって、対象における異常なＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性に関係している病気又は症状を防ぐ方法を提供する。異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性によって引き起こされたか、又はそれに導かれた病気の危険がある対象は、例えば本明細書中に記載された診断上又は兆候のアッセイのいずれかの組み合わせにより確認されうる。予防な作用物質の投与は、病気か障害が予防されるか、あるいはその進行が遅れるような、ＡＲＰ／ＢＲＰ異常に特徴的な症状の兆候より前に存在しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰ異常の種類に依存して、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト又はＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニスト作用物質が対象の処置のために使用されうる。適切な作用物質が、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイに基づき決定されうる。本発明の予防方法は、さらに以下の小節で議論される。
【０２３８】
治療方法
本発明の他の側面は、治療目的のためのＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞に関係しているＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性の１以上の活性を調節する作用物質に細胞を接触させることを伴う。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を調節する作用物質は、本明細書中に記載の作用物質、例えば核酸又はタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然の同系統のリガンド、ペプチド、ＡＲＰ／ＢＲＰ偽ペプチド、又は他の小分子であるかもしれない。１の態様において、前記作用物質は、１以上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を促進する。そのような促進作用物質の例は、活性ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、及び細胞に導入されたＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている核酸分子を含んでいる。他の態様において、作用物質は１以上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を阻害する。そのような阻害作用物質の例は、アンチセンスＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子、及び抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を含んでいる。これらの調節方法は、インビトロ（例えば、作用物質を伴う細胞の培養により）、あるいはインビボ（例えば、作用物質を対象に投与することにより）で実施されうる。そのように、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは核酸分子の異常な発現又は活性によって特徴づけられる病気又は障害に苦しむ個体の処置方法を提供する。１の態様において、前記方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を調節（例えば、上方制御又は下方制御）する作用物質（例えば、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイによって同定された作用物質）、又は作用物質の組み合わせ物を投与することを含む。他の態様において、前記方法は、低下したか、又は異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性を償うために治療としてのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸分子を投与することを含む。
【０２３９】
ＡＲＰ／ＢＲＰ活性の促進は、ＡＲＰ／ＢＲＰが異常に下方制御されている状況、及び／又は高められたＡＲＰ／ＢＲＰ活性が有益な影響を与えることが見込まれる状況で望ましい。そのような状況の１つの例は、対象が異常な細胞増殖及び／又は分化（例えば、癌）によって特徴づけられる障害を有する場合である。そのような状況の他の例は、対象が生殖障害（例えば、排卵の障害又は不妊症）を有する場合である。
【０２４０】
治療薬の生物学的効果の確認
本発明の様々な態様において、好適なインビトロ又はインビボのアッセイは、特定の治療薬の効果、及びその投与が罹患組織の処置に必要とされるかどうかを決定するために利用される。
【０２４１】
様々な特定の実施例において、治療薬がその細胞種への所望の効果を発揮するかどうか確認するために、インビトロのアッセイが、患者の障害に関与している種類の代表的な細胞を用いて実施される。治療に使用するのための化合物は、対象で試験する前に、制限されることなく、ラット、マウス、ニワトリ、雌牛、猿、ウサギなどを含む好適な動物モデル系で試験されうる。同様に、インビボ試験のために、本技術分野で知られている動物モデル系のいずれかが対象への投与より前に使用されうる。
【０２４２】
生殖障害
前述のタンパク質及び多量体は、生殖機能に関係している。それ故に、本発明の治療薬は、生殖に関する病気か障害の治療又は予防処置に役立つかもしれない。生殖障害は、女性及び男性の療法の生殖障害を含んでいる。女性の生殖障害の例は、排卵の障害（すなわち、濾胞の発達の促進及び排卵の誘発）、月経前症候群、卵巣嚢胞、子宮内膜症、子宮平滑筋腫、不妊症、骨盤内炎症性疾患、膣痙、及び閉経含んでいる。男性の生殖障害の例は、陰茎の障害、陰嚢障害、前立腺障害、及び不妊症を含んでいる。
【０２４３】
さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、及びタンパク質多量体が、精子形成の促進、甲状腺細胞の機能を増強（すなわち、甲状腺ホルモンの産生及びヨウ化物の捕捉の増強）、性腺機能の調節、性腺ホルモン産生の調節、生殖能力の促進又は抑制に使用されうる。
【０２４４】
悪性腫瘍
前述のタンパク質及び多量体は、細胞増殖の調節に関係している。それ故に、本発明の治療薬は、細胞の過剰増殖及び／又は細胞増殖の制御喪失（例えば、癌、悪性腫瘍、及び腫瘍）に関係する病気又は障害の治療又は予防処置に役立つかもしれない。そのような過剰増殖障害の調査のために、例えば、Ｆｉｓｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ， １９８５． ＭＥＤＩＣＩＮＥ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２４５】
本発明の治療薬は、悪性腫瘍及びそれに関連する障害を治療又は予防する効能について本技術分野に知られているいずれかの方法によりアッセイされる。そのようなアッセイは、制限されることなく、患者の腫瘍由来の形質転換細胞又は細胞を利用したインビトロのアッセイ、並びに癌又は悪性腫瘍の動物モデルを用いたインビボのアッセイを含む。潜在的に効果的な治療薬は、例えば対照との比較で、培養状態の腫瘍由来細胞又は形質転換細胞の増殖を阻害するか、又は動物モデルの腫瘍の復帰を引き起こすものである。
【０２４６】
本発明の実施において、いったん悪性腫瘍又は癌が、活性を調節すること（すなわち、阻害すること、拮抗すること、又は作用させること）による処置の影響を受けやすいことが示されれば、その癌又は悪性腫瘍は、それ以降タンパク質機能の調節に役立つ治療薬の投与により治療又は予防される。
【０２４７】
前癌状態
癌又は悪性腫瘍の治療又は予防処置に有効な本発明の治療薬は、前癌状態の治療及び／又は新生物又は悪性腫瘍状態への前癌進行の予防のために投与されもする。そのような予防又は治療のための使用は、新生物又は癌への進行に先立つことが知られているか、又は疑われる、特に過形成から成る非新生物の細胞成長、化生、又は最も特に、異形成が生じた状態で望ましい。そのような異常な細胞成長の調査のために、例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ＆ Ａｎｇｅｌｌ， １９７６． ＢＡＳＩＣ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２４８】
過形成は、組織又臓器において、その構造又は機能の重大な変化なしに、細胞数の増加に関与する制御された細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、多くの場合子宮内膜癌に先行することが証明されている。化生は、ある種類の成熟又は完全に分化した細胞が他の種類の成熟細胞によって置き換えられた制御された細胞成長の形態である。化生は、上皮又は結合組織細胞で生じるかもしれない。異型性は、一般に癌の前駆体と考えられて、主に上皮で見つかる。異形成は、非新生物の細胞成長の最も無秩序な形態で、そして個々の細胞の均一性及び細胞の構造上の方向性の喪失に関与する。異形成は、慢性的な刺激又は炎症が存在する場所に特徴的に起こり、そして多くの場合、頚部、気道、口腔、及び胆嚢に見られる。
【０２４９】
あるいは、又はさらに、患者由来の細胞サンプル中の過形成、化生又は異形成症として特徴づけられた異常な細胞成長の存在、インビボ又はインビトロのいずれかで示された１以上の形質転換されたか、又は悪性の表現型の特徴の存在は、前述のタンパク質の活性を調節する能力を所有する治療薬の予防／治療のための投与の好ましさを表わしている。形質転換された表現型の特徴は、制限されることなく：（ｉ） 形態的な変化；（ｉｉ）ゆるんだ基層付着；（ｉｉｉ）細胞間接触阻害の喪失；（ｉｖ）足場依存性の損失；（ｖ）プロテアーゼ放出；（ｖｉ）糖輸送の増加；（ｖｉｉ）血清要求量の減少；（ｖｉｉｉ）胎性抗原の発現、（ｉｘ） ２５０ ｋＤａｌ細胞表面タンパク質の喪失などを含む。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ， １９８６．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２５０】
本発明の特定の態様にいて、悪性腫瘍の以下の素因の１以上を示す患者は、有効量の治療薬の投与によって処置される：（ｉ）悪性腫瘍に関係する染色体の転座（例えば、慢性骨髄性白血病に対応するフィラデルフィア染色体（ｂｃｒ／ａｂｌ）、及び濾胞性リンパ腫に対応するｔ（１４；１８）など）；（ｉｉ）家族性ポリポーシス又はガードナー症候群（結腸癌の有力な兆候）；（ｉｉｉ）単クローン性免疫グロブリン血症の未決定な重要性（複数のミエローマの有力な前駆物質）、並びに（ｉｖ）メンデルの（遺伝子の）遺伝パターンを示す癌又は前癌性の病気（例えば、結腸の家族性ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝性外骨症、多発性内分泌腺腫症、ポイツ・ジェガー症候群、フォン・レクリングハウゼン神経線維腫症、でん粉状の製造の髄様甲状腺癌、そして褐色細胞腫、網膜芽細胞腫、頚動脈小体の腫瘍、皮膚の黒色癌、眼内の黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、白皮症、Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓ再生不良性貧血及びＢｌｏｏｍ’ｓ症候群）を有する一等親以内のヒト。
【０２５１】
他の態様において、本発明の治療薬は、乳、結腸、卵巣、肺、すい臓、又は子宮癌、あるいはメラノーマ若しくは肉腫への進行を防ぐために患者に与えられる。
【０２５２】
過剰増殖及び増殖不全（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害
本発明の１の態様において、治療薬は、過剰増殖又は良性の増殖不全障害の治療又は予防薬処置のために投与される。本本発明の治療薬の過剰増殖性の病気又は障害の治療又は予防における効能は、本技術分野に知られているいずれかの方法によってアッセイされる。そのようなアッセイは、インビトロ細胞増殖アッセイ、過剰増殖性の病気又は障害の動物モデルを使ったインビトロ又はインビボのアッセイなどを含んでいる。治療薬の潜在的な効果は、例えば対照と比較して、培養において細胞増殖を促進するか、動物モデルにおいて成長、若しくは細胞増殖を引き起こすかもしれない。
【０２５３】
本発明の特定の態様は、肝硬変（瘢痕化が正常な肝臓再生プロセスに追い付いた状態）の治療又は予防；瘢痕化過程が正常な更新を邪魔する皮膚を醜くするケロイド（肥大性瘢痕）の形成の治療；乾癬（皮膚の過度の増殖と適切な細胞の運命付けの遅れにより特徴づけられる代表的な皮膚状態）；良性腫瘍；繊維嚢胞性状態、並びに組織肥大（例えば、良性前立腺肥大）に向けられる。
【０２５４】
サイトカイン及び細胞増殖／分化活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、サイトカイン、細胞増殖（誘発又は阻害）又は細胞分化（誘発又は阻害）活性を示するか、あるいはある細胞集団において他のサイトカインの産生を誘発するかもしれない。全ての既知のサイトカインを含めて、今まで発見した多数にタンパク質因子は、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示して、ゆえに上記アッセイはサイトカイン活性の好都合な確認として役立つ。本発明のタンパク質の活性は、制限されることなく、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、及びＣＭＫを含む細胞系に関する相当数のルーチンな因子依存した細胞増殖アッセイのうちのいずれかにより証明される。
【０２５５】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法：制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章及び第７章）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００， １９８６； Ｂｅｒｔａｇｎｏｉｌｉ ｅｔａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４５：１７０６−１７１２，１９９０； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌｌｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１，１９９１； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ， ｅｔ ａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３，１９９２； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １５２：１７５６−１７６１，１９９４を含むＴ細胞又は胸腺細胞増殖に関するアッセイによって、計測されうる。
【０２５６】
サイトカインの産生、及び／又は脾臓細胞、リンパ腺細胞、又は胸腺細胞の増殖に関するアッセイは、制限されることなく、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈによる：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ３．１２．１−１４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４；に、及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒによる：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．８．１−８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のものを含む。
【０２５７】
造血細胞及び白血球細胞の増殖及び分化に関するアッセイは、制限されることなく、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．３．１−６．３．１２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１； ｄｅＶｒｉｅｓ ｅｔａｌ， ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １７３：１２０５−１２１１，１９９１に； Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０−６９２， １９８８； Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２９３１−２９３８， １９８３； Ｎｏｒｄａｎによる： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．６．１−５に， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１； ＳｎａＳａ． ｅｔａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：１８５７−１８６１，１９８６； Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１−Ｂｅｎｎｅｔｔ， ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．１５．１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１に； Ｃｉａｒｌｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．１３．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１に記載のものを含む。
【０２５８】
（増殖及びサイトカイン産生の計測により、特にＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用、並びに直接的なＴ細胞効果に影響するタンパク質を同定する）抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイは、制限されることなく、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第６章、第７章）； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ７７：６０９１−６０９５， １９８０； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎ １１：４０５−４１１， １９８１； Ｊａｋａｉｅｔａｌ，ＪＩｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８に記載のものを含む。
【０２５９】
免疫刺激又は抑制活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、制限されることなく、それに対するアッセイが本明細書中に記載されているところの活性を含む免疫刺激又は免疫抑制活性を示すかもしれない。タンパク質は、（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を含む）様々な免疫の欠損及び障害の処置、例えば、Ｔ及び／又はＢリンパ球の成長及び増殖の（上方又は下方）調節、並びにＮＫ細胞と他の細胞集団の細胞溶解活性の達成に役立つかもしれない。これらの免疫欠損は、遺伝子に関するか、又は生体（例えば、ＨＩＶ）、並びに細菌又はカビの感染症により引き起こされるか、又は自己免疫疾患から起こるかもしれない。より特に、生体、細菌、真菌又は他の感染症により引き起こされる感染症は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種、及びカンジダ症のような様々な真菌感染の感染症を含めて、本発明のタンパク質を使って治療できる。もちろん、この件に関して、免疫システムの増強が一般に望ましい、すなわち、癌の治療とき、本発明のタンパク質が有用でもある。
【０２６０】
本発明のタンパク質を用いて処置されうる自己免疫疾患は、例えば結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチを含んでいる、自己免疫性肺炎、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存型糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主病、及び自己免疫性炎症性眼病を含む。本発明のそのようなタンパク質は、アレルギー反応及び症状、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）、又は他の呼吸の問題の処置に有用であるかもしれない。（免疫の抑制が望まれる） （例えば、臓器移植を含む）他の条件も本発明のタンパク質を用いて治療できるかもしれない。
【０２６１】
相当数の方法により免疫応答に本発明のタンパク質を用いることが可能でもある。下方制御は、すでに進行中又は免疫応答の誘導を防ぐかもしれない免疫応答を抑制又は遮断する形式の中にあるかもしれない。活性化されたＴ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制するか、又はＴ細胞の特異的な寛容を誘発するか、あるいはその両方により抑制されうる。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般に抑制的な作用物質にＴ細胞の継続的な暴露を必要とする、活性な非抗原特異的プロセスである。Ｔ細胞の非反応性又は無能力の誘発を伴う寛容は、一般に抗原特異的であり、そして寛容化剤（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）への暴露を終えた後に持続する点で免疫抑制と見分けられる。
【０２６２】
実施面から、寛容は、寛容化剤の不存在下、特定の抗原に対する再暴露におけるＴ細胞応答の欠損によって証明されうる。
【０２６３】
例えば、活性的にされたＴ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げる、１以上の抗原機能の下方制御又は予防（制限されることなく、Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７）を含む）は、組織、皮膚、及び臓器移植の状況、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に有用である。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は、組織移植の組織破壊の減少をもたらしうる。一般に、組織移植組織で、移植組織の拒絶は、Ｔ細胞によるそれが異物であるとの認識を通して始まり、移植組織を破壊する免疫反応が続く。移植に先立ち、Ｂ７リンパ球抗原の免疫の細胞上のその天然のリガンド（例えば、Ｂ７−２活性があるペプチドの可溶性、単量体型、単独で、あるいは他のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を持つか、又は抗体をブロックするペプチドの単量体型との結合状態で）との相互作用を阻害するか又は遮断する分子の投与は、同時刺激シグナルの伝達なしに免疫細胞上の天然のリガンド（ｓ）への分子の結合を導きうる。この問題のＢリンパ球抗原機能をブロッキングは、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカイン合成を妨げ、それにより免疫抑制剤として働く。しかも、同時刺激の不足は、Ｔ細胞の活性化に十分でもあり、それによって対象の寛容を誘発する。Ｂリンパ球の抗原を遮断する試薬による長期の寛容の誘導は、これらの遮断試薬の繰り返し投与の必要を回避するかもしれない。対象における十分な免疫抑制又は寛容を達成するために、Ｂリンパ球抗原の機能を遮断する必要もあるかもしれない。
【０２６４】
臓器移植の拒絶反応又はＧＶＨＤの予防における特定のブロッキング試薬の効能は、ヒトでの効能を予測させる動物モデルを用いて評価されうる。使用しうる適切なシステムの例は、ラットにおける異質遺伝型の心臓移植片、及びマウスにおける異種の膵臓の島細胞移植片を含み、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２ （１９９２）、及びＴｕｒｋａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１１１０２−１１１０５ （１９９２）に記載のとおりその両方がインビボにおけるＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制性の効果の検査に使用されている。さらに、ＧＶＨＤのマウス・モデル（Ｐａｕｌ ｅｄ．， ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｐｐ． ８４６−８４７を参照のこと）が、インビボにおいて、その病気の進行におけるＢリンパ球抗原機能遮断の効果を確認するために使用されうる。
【０２６５】
抗原機能を妨げることは、自己免疫疾患の処置のために治療として有用でありもする。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応せいであり、そしてサイトカインの製造を促進するＴ細胞、並びに病気の病理学に関係している自己抗体の不適切な活性化の結果である。自己応答性Ｔ細胞の活性化を防ぐことは、病徴を減らすか又は除くかもしれない。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を崩壊させることによってＴ細胞の同時刺激を妨げる試薬の投与は、Ｔ細胞活性化を抑えて、そして自己抗体又は病気プロセスに関係しているＴ細胞由来のサイトカインの産生を防ぐために使用されうる。その上、ブロッキング試薬は、長期の病気の軽減をもたらしうる自己応答性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘発するかもしれない。自己免疫疾患を防ぐか又は軽くするブロッキング試薬の効能は、相当数のよく特徴づけられた自己免疫疾患の動物モデルを用いて決定されうる。例は、マウスの実験的な自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢハイブリッドマウスの全身的な狼瘡エリテマトーデス、マウスの自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウス及びＢＢラットの糖尿病、マウスの実験的な重症筋無力症を含んでいる（Ｐａｕｌ ｅｄ．， ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｐｐ． ８４０−８５６を参照のこと）。
【０２６６】
免疫応答を上方調節する手段としての抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節は、治療に有用かもしれない。免疫応答の上方調節は、免疫応答を高めるか、又は最初の免疫応答を引き出す形で存在している。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を促進することを通して免疫応答を高めることは、ウイルス感染の場合に有用かもしれない。さらに、インフルエンザ、風邪、及び脳炎のような全身的な重大な病気は、意図的にＢリンパ球抗原の促進型の投与によって軽減されるかもしれない。
【０２６７】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を取り除く、本発明のペプチドの発現、又は本発明の可溶性ペプチドの促進型と一緒にウイルス抗原のパルス状のＡＰＣｓによりインビトロにおいてＴ細胞を同時刺激する、並びに患者にインビトロにおいて活性化されたＴ細胞を再導入することよって感染患者で高められうる。抗生体免疫応答を高める他の方法は、患者から感染細胞を単離し、上記細胞がそれらの表面にタンパク質の全部若しくはその一部を発現するように本明細書中に記載の本発明のタンパク質をコードしている核酸によりそれらをトランスフェクトし、そしてこのトランスフェクト細胞を患者の中に再導入することである。ここで、感染細胞は、Ｔ細胞に同時刺激シグナルをデリバリーし、そしてそれによりＴ細胞を活性化する。
【０２６８】
他の適用において、抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節又は増強は、腫瘍免疫の誘導に有用かもしれない。本発明の少なくとも１のペプチドをコードする核酸によりトランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、悪性腫瘍）は、対象における腫瘍特異的寛容の克服のために対象に投与されうる。所望であれば、腫瘍細胞はペプチドの組み合わせを発現するようにトランスフェクトされうる。例えば、患者から得られた腫瘍細胞は、単独でＢ７−２様の活性があるペプチドの、又はＢ７−１様の活性及び／又はＢ７−３様の活性があるペプチドと一緒での発現に導く発現ベクターによりｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされうる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、トランスフェクト細胞の表面上のペプチドの発現をもたらすために患者に戻される。あるいは、遺伝子治療技術は、インビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的に使用しうる。
【０２６９】
腫瘍細胞表面におけるＢリンパ球抗原の活性を持つ本発明のペプチドの存在は、トランスフェクト腫瘍細胞に対するＴ細胞介在免疫応答を誘発するためにＴ細胞への同時刺激シグナルの必要性を提供する。さらに、 ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くか、又はＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の十分な量の再発現できない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質及びβ_２ミクログロブリンタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩの１本鎖タンパク質、及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質の全部又は一部（例えば、細胞ドメインの切断部分）をコードする核酸によりトランスフェクトされうる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を持つペプチドと結合状態の適切なクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣの発現は、トランスフェクト腫瘍細胞に対するＴ細胞介在免疫応答を誘発する。場合により、ＭＨＣクラスＩＩに関連するタンパク質、例えば不変鎖の発現を妨げるアンチセンス構築物をコードしている遺伝子が、腫瘍関連抗原の提示、及び腫瘍特異的免疫の誘発を促進するためにＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドをコードするＤＮＡと一緒に同時トランスフェクトされることもできる。このように、対象のＴ細胞介在免疫応答の誘導は、対象の腫瘍特有的寛容を克服するのに十分であるかもしれない。
【０２７０】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測られうる：胸腺細胞又は脾細胞細胞毒性のための好適なアッセイは、制限されることなく、以下の：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第７章）； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４， １９８２； Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２，１９８５； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４，１９８２； Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２， １９８５； Ｔａｋ＆ｉｅｔａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ’１３７：３４９４−３５００， １９８６； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１９９２−１９９８； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１，１９９１； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：３０７９−３０９２， １９９４に記載のものを含む。
【０２７１】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答及びアイソタイプ・スイッチング（中でも、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節する、及びＴｈ１／Ｔｈ２特性に影響するタンパク質を同定する）ためのアッセイは、制限されることなく：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：３０２８−３０３３， １９９０；及びＭｏｎｄ ａｎｄ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎ： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎｅｆ ａｌ， （ｅｄｓ．） Ｖｏｌ １ ｐｐ． ３．８．１−３．８．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のものを含む。
【０２７２】
リンパ球混合培養法（ＭＬＲ）アッセイ（中でも、大部分のＴｈ１とＣＴＬ応答を産むタンパク質を同定する）は、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第７章）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３， １９９２に記載のものを含む。
【０２７３】
樹状細胞依存性アッセイ（中でも、未熟なＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されたタンパク質を同定する）は、制限されることなく：Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４：５３６−５４４， １９９５； Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：５４９−５５９，１９９１； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５０７１−５０７９，１９９５； Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：２５５−２６０， １９９５； Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４０６２−４０６９，１９９３； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５， １９９４； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２６４，１９８９； Ｂｈａｒｄｗａｊ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ９４：７９１−８０７， １９９４；及びＩｎａｂａ ｅｔａｌ．， ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １７２：６３１−６４０，１９９０に記載のものを含む。
【０２７４】
リンパ球の生存／アポトーシスについてのアッセイ（中でも、超抗原の誘導の後のアポトーシスを防ぐタンパク質、及びリンパ球の恒常性を調節するタンパク質を同定する）は、制限されることなく：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８， １９９２； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：６５９−６７０，１９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：１９４５−１９５１，１９９３； Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ６６：２３３−２４３， １９９１； Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：４０３７−４０４５， １９９０； Ｚａｍａｉ ｅｔａｌ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８９１−８９７，１９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃｕｅｔａｌ．ＪｎｔｅｒｎａｔＪＯｎｃｏｌ １：６３９−６４８，１９９２に記載のものを含む。
【０２７５】
Ｔ細胞の関係づけ及び発達の初期ステップに影響を与えるタンパク質に関するアッセイは、制限されることなく：Ａｎｔｉｃａ ｅｔａｌ， Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７， １９９４； Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５： １１１−１２２，１９９４； Ｇａｌｙｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７％， １９９５； Ｔｏｔｅ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１，１９９１に記載のものを含む。
【０２７６】
組織成長活性
本発明のＡＲＰ／ＢＫＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体は、骨、軟骨、腱、靭帯、及び／又は神経組織成長、又は再生のため、並びに創傷治癒及び組織の修復と置き換えのため、そして火傷、切開、及び潰瘍の処置に使用される組成物にも有用性を持っているかもしれない。
【０２７７】
骨が普通に形成されないとき、周囲の軟骨及び／又は骨の成長を誘発する本発明のタンパク質は、骨破損及び軟骨損傷か、又はヒト及び他の動物における変節の治療への適用を持っている。本発明のタンパク質を利用したそのような製剤は、閉じている、並びに開いている骨折の減少、及び人工関節の改善された固定にも予防的に使用される。骨形成剤によって誘発された新たな骨形成は、 先天的か、外傷が誘発したか、又は癌切除が誘発した頭蓋及び顔面の欠損の修復に寄与し、化粧用の形成外科にも有用である。
【０２７８】
本願発明のタンパク質は、歯周疾患の処置、及び他の歯の修復過程でも使用されうる。そのような作用物質は、骨形成細胞を引き付けるか、骨形成細胞の成長を促進するか、又は骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘発するための環境を提供するかもしれない。本発明のタンパク質は、例えば骨及び／又は軟骨修復の刺激を通して、あるいは炎症過程によって仲介された炎症又は組織破壊（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）の過程をブロックすることによって骨粗鬆症又は変形性関節症の処置に有用でもある。
【０２７９】
本発明のタンパク質に起因するかもしれない組織再生活性の他のカテゴリーは、腱／靭帯形成である。そのような組織が正常に形成されない所の周囲に腱／靭帯様の組織の又は他の組織の形成を誘発する、本発明のタンパク質は、ヒト及び他の動物における腱又は靭帯の裂傷、形成異常、及び他の腱又は靭帯の欠損の治療における適用がある。タンパク質を誘発している腱／靭帯様の組織に利用されるそのような製剤は、腱又は靭帯組織への損害を防ぐために予防的に使用され、並びに腱又は靭帯の骨又は他の組織への固定に使用され、そして腱又は靭帯組織の欠陥の修復に使用される。本発明の組成物によって誘発された腱／靭帯様の組織の新たな形成は、先天的、外傷に誘発された、又は他の起源の他の腱又は靭帯の欠損の修復に寄与して、かつ、腱か靭帯の接着又は修復のための美容整形手術に有用である。本発明の組成物は、腱又は靭帯形成細胞を引き付けるか、腱又は靭帯形成細胞の成長を促進するか、腱又は靭帯形成細胞の前駆細胞の分化を誘発するか、又は又はインビボで効果組織に戻すために、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて腱／靭帯細胞、若しくは前駆細胞の成長を誘発するための環境を提供するかもしれない。本発明の組成物は、腱炎、ｃＡＲＰ／ＢＲＰａｌ管症候群及び他の腱又は靭帯の欠損の処置にも有用かもしれない。前記組成物は、本技術分野で周知の適切な基質及び／又は担体としての封鎖剤をも含んでいるかもしれない。
【０２８０】
本発明のタンパク質は、神経系の細胞の増殖、並びに神経及び脳組織の再生に、すなわち、神経系の細胞か神経組織に変性、死滅、又は外傷を含む中枢及び末梢神経系の病気、及びニューロパシー、並びに力学的及び外傷的な障害の処置のために有用でありもする。より特に、タンパク質は、末梢神経傷害、末梢性ニューロパシー、及び局所的なニューロパシーのような末梢神経系の病気、並びにアルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイ−ドレーガー症候群のような中枢神経系の病気の処置に使用されうる。本発明に従って処置されるさらなる症状は、脊髄障害、頭外傷、及び脳血管障害、例えば脳卒中のような力学的及び外傷的な障害を含んでいる。化学療法又は他の医学療法から起こっている末端的なニューロパシーも、本発明のタンパク質を用いて治療できるかもしれない。
【０２８１】
本発明のタンパク質は、制限されることなく、床擦れ、血管機能不全に関係する潰瘍、手術及び外傷性の創傷などを含む非回復創傷のより良い又はより速い閉鎖に有用でもある。
【０２８２】
同様に、本発明のタンパク質は、他の組織、例えば臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋（平滑、骨格、心）、及び脈管（脈管の内皮細胞を含む）の発生又は再生のための、あるいはそのような組織を含め細胞の成長を促進するための活性を示しもすると思われる。所望の効果の一部は、正常な組織の再生を可能にする繊維性瘢痕化の阻害又は調節による。本発明のタンパク質は、血管形成活性をも示すかもしれない。
【０２８３】
本発明のタンパク質は、腸の保護又は再生、並びに肺又は肝臓の線維化、様々な組織の再灌流障害、並びに全身的なサイトカイン損傷から起こった症状の処置にも有用かもしれない。
【０２８４】
本発明のタンパク質は、前駆組織又は細胞から前記の組織への分化の促進又は抑制に；あるいは前記の組織の成長の抑制にも有用かもしれない。
【０２８５】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測られうる：
組織発生活性に関するアッセイは、制限されることなく：国際特許公開番号第９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号第９５／０５８４６号（神経、神経系）；国際特許公開番号第９１／０７４９１号（皮革、内皮）に記載のものを含む。
【０２８６】
創傷治癒活性に関するアッセイは、制限されることなく：Ｗｈｉｔｅｒ， ＥＰＩＤＥＲＭＡＬ ＷＯＵＮＤ ＨＥＡＬＩＮＧ， ｐｐ． ７１−１１２ （Ｍａｉｂａｃｈ ａｎｄ Ｒｏｖｅｅ， ｅｄｓ．）， Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ， ａｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｅｎｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７１：３８２−８４ （１９７８）に記載のものを含む。
【０２８７】
アクチビン／インヒビン活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体は、アクチビン−又はインヒビン−関連活性をも示すかもしれない。インヒビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を抑制するそれらの能力によって特徴づけられ、一方アクチビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を促進するそれらの能力によって特徴づけられる。このように、単独で又はインヒビン・ファミリーのメンバーとのヘテロ多量体で、本発明のタンパク質は、雌の哺乳動物の生殖能力及び雄の哺乳動物の精子形成を減少させるインヒビンの能力に基づいた避妊薬として有用かもしれない。十分な量の他のインヒビンの投与は、これらの哺乳動物の不妊症を誘発しうる。あるいは、ホモダイマー又はインヒビン−ｂグループの他のタンパク質サブユニットとのヘテロダイマーの本発明のタンパク質は、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を促進するアクチビン分子の能力に基づく、生殖能力増強療法として有用かもしれない。例えば、米国特許番号第４，７９８，８８５号を参照のこと。本発明のタンパク質は、雌牛、羊、及び豚のような家畜の一生涯の生殖実績を増やすために、性的に未熟な哺乳動物の生殖能力の発現の向上のためにも有用かもしれない。
【０２８８】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測される：
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイは、制限されることなく：Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９１：５６２−５７２， １９７２； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９−７８２， １９８６； Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７６−７７９， １９８６； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９−６６３， １９８５； Ｆｏｒａｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：３０９１−３０９５，１９８６に記載のものを含む。
【０２８９】
化学走化性／化学運動性活性
本発明のタンパク質又は多量体は、例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、及び／又は内皮細胞を含む哺乳動物の細胞に対して化学走化性又は化学運動性活性（例えば、ケモカインとしての作用）を持っているかもしれない。化学走化性及び化学運動性タンパク質は、所望の細胞集団を所望の作用点に動員されるか、又は引き付けるために使用されうる。化学走化性又は化学運動性タンパク質は、組織への創傷及び他の外傷の処置、並びに局所的感染の処置に特別な利益を提供する。例えば、腫瘍又は感染部位へのリンパ球、単球、又は好中球の動員は、腫瘍又は感染物質に対する改善された免疫応答をもたらすかもしれない。
【０２９０】
特定の細胞集団の指向性の配向性又は動きを直接的に又は間接的に刺激しうるとき、タンパク質又はペプチドは、このような細胞集団について化学走化性活性を持つ。好ましくは、前記タンパク質又はペプチドは、直接的に細胞の指向性の動きを刺激する能力がある。特定のタンパク質が細胞集団について化学走化性活性を持つかどうかは、このタンパク質又はペプチドを細胞化学走性に関する既知のアッセイのいずれかに用いることで容易に確認されうる。
【０２９１】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測される：
化学走化性活性（化学走性を誘発又は妨げるタンパク質を同定する）に関するアッセイは、膜を横切る細胞の移行を誘発するタンパク質の能力、並びに他の細胞集団にある細胞集団の接着を誘発するタンパク質の能力を計測するアッセイから成る。移動及び接着に関する好適なアッセイは、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （第６章、第１２章， ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＯＦ ＡＬＰＨＡ ＡＮＤ ＢＥＴＡ ＣＨＥＭＯＫＩＮＥＳ ６．１２．１−６．１２．２８）； Ｔａｕｂ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５：１３７０−１３７６， １９９５； Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ． ＡＰＭＳ １０３：１４０−１４６，１９９５； Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５： １７４４−１７４８； Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２： ５８６０−５８６７， １９９４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３： １７６２−１７６８， １９９４に記載のものを含む。
【０２９２】
受容体／リガンド活性
本発明のタンパク質又は多量体は、受容体、受容体リガンド、又は受容体／リガンド相互作用の阻害剤、若しくはアゴニストとしての活性をも発揮するかもしれない。そのような受容体及びリガンドの例は、制限されることなく、サイトカイン受容体とそれらのリガンド、受容体キナーゼとそれらのリガンド、受容体ホスファターゼとそれらのリガンド、細胞間相互作用に関与する受容体とそれらのリガンド（制限されることなく、細胞接着分子（セレクチン、インテグリンとそれらのリガンド）、及び抗原提示に関与する受容体／リガンド対、抗原認識及び発達に関する細胞性及び体液性免疫受容体を含んでいる）を含んでいる。受容体及びリガンドは、関連した受容体／リガンド相互作用の阻害剤の可能性があるペプチド又は小分子のスクリーニングにも有用である。本発明のタンパク質（制限されることなく、受容体及びリガンドの断片を含む）は、受容体／リガンド相互作用の阻害剤としてそれら自体が有用であるかもしれない。
【０２９３】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測されうる：
受容体−リガンド活性に関する好適なアッセイは、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第７．２８章， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ７．２８．１−７．２８．２２）， Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８４：６８６４−６８６８，１９８７； Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８：１１４５−１１５６，１９８８； Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１４９−１６０ １９８９； Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９−６８，１９９４； Ｓｔｉｔｔｅｔａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０：６６１ −６７０，１９９５に記載のものを含んでいる。
【０２９４】
抗炎症活性
本発明のタンパク質又は多量体は、抗炎症活性をも示すかもしれない。抗炎症活性は、炎症応答に関係している細胞への刺激を提供することによって、細胞間相互作用（例えば、細胞接着）を抑制するか又は促進することによって、細胞の溢血を抑制するか又は促進して、炎症プロセスに関係している細胞の化学走化性を抑制するか又は促進することによって、あるいは炎症応答をより直接的に抑制するか又は促進する他の因子の産生を刺激するか又は抑制することによって成し遂げられうる。そのような活性を示すタンパク質は、制限されることなく、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、又は全身的な炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血−再潅流傷害、致死性内毒素、関節炎、補体により仲介された超急性拒絶反応、腎炎、サイトカイン、若しくはケモカインによって誘発された肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、又はサイトカイン、例えばＴＮＦ、若しくはＩＬ−１の過剰産生によるものを含む炎症症状（慢性又は急性症状を含む）の処置に使用されうる。本発明のタンパク質は、抗原性の物質又は材料に対するアナフィラキシー及び過敏症の処置にも有用であるかもしれない。
【０２９５】
腫瘍抑制活性
腫瘍の免疫学的処置又は予防のための先に記載の活性に加え、本発明のタンパク質又は多量体は、他の抗腫瘍活性を示すかもしれない。タンパク質は、腫瘍成長を直接的に又は間接的に（例えば、ＡＤＣＣを経由して）抑制するかもしれない。タンパク質は、腫瘍組織又は腫瘍前駆組織に作用することにより、腫瘍成長を補助するのに必要な組織（例えば、血管形成に抑制により）の形成を抑制することにより、腫瘍成長を抑制する他の因子、作用物質、又は細胞種の製造を引き起こすことにより、あるいは腫瘍成長を促進する因子、作用物質、又は細胞種を抑制、除去又は阻害することにより示されるかもしれない。
【０２９６】
実施例
本実施例で頻繁に使用される特定の用語及び手順の簡単な説明を以下に提供する。
【０２９７】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【０２９８】
「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素により全部の、又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成された相補的ＤＮＡである。
【０２９９】
ＤＮＡの「消化」を、通常、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）から購入した制限エンドヌクレアーゼを用いて行った。緩衝液及び反応条件は、製造業者によって指定されたものと同様である。
【０３００】
ＰＣＲ ＤＮＡ断片及び制限エンドヌクレアーゼ消化から得られたＤＮＡ断片の「ゲル精製」を、適切な分子量標準と一緒にアガロースゲル中、電気泳動による反応混合物のサイズ分別により行った。電気泳動の後に、ＤＮＡを、臭化エチジウムにより可視化し、所望のサイズの断片をゲルから摘出し、次にＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｏｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いてアガロースから分離した。
【０３０１】
精製ＤＮＡ断片の消化され、そして精製されたベクターＤＮＡ内への「連結」又は「挿入」を製造業者によって供給された緩衝液とＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）製のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。同様に、連結を、ベクター及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）製のキットに提供された試薬を用いて、トポイソメラーゼＩにより行った。
【０３０２】
「クローン化」は、連結反応からのＤＮＡにより好適なＥ．コリ宿主株の形質転換に関し、この形質転換株を増殖させ、そしてＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ製のキットを用いて細菌からプラスミドＤＮＡを精製する。
【０３０３】
プラスミドＤＮＡ鋳型、ＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（例えば、Ｔ７、Ｔ３、Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ、及び遺伝子特異的プライマー）、及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）からの試薬を用いた、サイクル配列決定反応により「ＤＮＡ塩基配列決定」を行った。反応条件及びサイクリング条件は、キット中に提供された規格に従って行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を、キャピラリー電気泳動及び未加工のＤＮＡ塩基配列の定量のために使用した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （バージョン４．０．５、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びＧＣＧ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）ソフトウェアを、断片アセンブリー及びＤＮＡ塩基配列アラインメントのために使用した。
【０３０４】
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」蛍光発生５’ヌクレアーゼ・アッセイを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて行った。反応を、２５ μｌの全反応容量中、３００又は９００ ｎｍｏｌｅの正及び逆プライマー、２５０ ｎｍｏｌｅのプローブ、及び様々な量の、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを伴う１Ｘユニバーサル・ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）中で行った。普遍的なサイクリング指標を、ＰＣＲに用いた（５０℃ １０分；９５℃ １０分、続いて９５℃ １５秒、６０℃ １分の４０サイクル）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのためのプライマー及びプローブをＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５（登録商標） Ｏｒｉｇｏ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて設計した。
【０３０５】
「未加工の培養上清の濃縮」は、タンパク質の重大な損失なしに、それによりタンパク質含量に関してサンプルを濃縮する、特定のサンプルの調整培地の容量を減少させるいずれかの方法に関する。この作業のために使われた方法は、名目上の分子量１０，０００ Ｄａ排除のポリエーテルスルホンの低タンパク質吸着性膜を横切るタンジェンシャル・フローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であった（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ Ｐ／Ｎ ０５０１０Ｃ７０）。駆動力を、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓぺリスター・ポンプ・ドライブ及びＰｈａｒＭｅｄサイズ１５ 薄壁チューブで垂直かどうか測られたモデル７５１８−１０ ｅａｓｙ−ｌｏａｄポンプ・ヘッドにより提供した。循環速度を、９００〜１１００ ｍｌ／分とし、そして可変流出制限の使用を通して背圧を〜１．５ ａｔｍに維持した。培養上清容量は、免疫アフィニティー精製のための開始材料を製造するために２５〜５０倍縮小した。
【０３０６】
「ＳＤＳページ」は、適用された電界の駆動力に応じた、硫酸ドデシル界面活性剤により処理したタンパク質サンプルが重合体ゲル基質中の移動度に基づき分別される技術群に関する。
【０３０７】
「ウェスタンブロッティング」は、膜下層に移された電気泳動により分けられたタンパク質を続いて特定の抗体の結合によって検出する全ての技術に関する。この作業で、電気泳動物が移ったポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、個々の図面に規定のとおり、種々の検出抗体との結合に使用した。
【０３０８】
「免疫アフィニティー・クロマトグラフィー」は、固定化抗体に対する１以上のサンプル成分の結合親和性に基づいてサンプルが分別される方法である。原則として、競合するリガンド、又は急激なｐＨ変化による固定化抗体の可逆的な変性を結合したサンプルの回収に使用しうる。この作業のために、捕捉されたタンパク質を、７．５から３．５へのｐＨ変化によって固定化抗体から抽出した。抽出されたタンパク質を含む画分をｐＨ紙で観察し、適当な量の１ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ９．２の添加によって直ちに中和した。結合タンパク質の溶出の直後に、固定化タンパク質の不可逆的な変性を最小限にするために、クロマトグラフィー樹脂をｐＨ ７．５に戻って平衡化した。
【０３０９】
実施例１：組織から抽出したＲＮＡ中のヒトＢＲＰ転写産物の検出
精巣、脳下垂体、肝臓、甲状腺、腎臓、膵臓、及びＫ−５６２ （慢性の骨髄性白血病）から精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入した。このＲＮＡを、２０μｌ反応量につき０．５〜１ μｇのＲＮＡ及び５０ ｎｇのランダムヘキサマーを含む、製造業者の推奨に従ったＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（ｃａｔ＃１１９０４−０１８）製のＲＴ−ＰＣＲのためにＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標） Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いた相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）の合成に使用した。逆転写酵素を抜いた以外は同じ、対照反応を、ＲＮＡ調製の残余のゲノム ＤＮＡからのＰＣＲプライミングを観察するために実行した。逆転写酵素のあり、又はなしでなされた反応を、それぞれ「＋ＲＴ」又は「−ＲＴ」指定した。
【０３１０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用したＢＲＰ正及び逆プライマーは、それぞれ５’−ＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号７６）及び５’−ＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号４６）であった。ＡＲＰ／ＢＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号４７）であった。蛍光性プローブはＢＲＰの２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写物を検出することが意図される。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを、２５μｌの全反応量中で、２５ ｎｇ又は５０ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製された鋳型ｃＤＮＡを用いて行った。
【０３１１】
ＢＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ実験の結果を表５に示す。
【０３１２】
【表５】

【０３１３】
この結果は、スプライシングされたヒトＢＲＰ ｍＲＮＡ転写産物が脳下垂体及び精巣のポリ（Ａ）＋ＲＮＡで再現性を持って検出されうることを示す。ＢＲＰ転写産物は、試験した他のＲＮＡサンプルで検出されなかったが、細胞の小さな亜集団、又はこれらの組織及び他の組織の特定の発達段階、又は生理学的な状態の間のＢＲＰ発現を除外することはできない。
【０３１４】
サンプル１〜３について、β−アクチンＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を、ｃＤＮＡ合成の効率を評価するために使われた。２５μｌの反応物につき５０ ｎｇの入力ＲＮＡを用いて、各々のサンプルを三重で分析した。前記アッセイを製造業者の規格に従って行った。ｃＤＮＡ合成の効率的を証明する、平均Ｃ_Ｔは、全３点のｃＤＮＡサンプル関しては１６であった。
【０３１５】
サンプル５〜９を、Ｏｒｉｇｅｎｅパネルを用いて得られた結果と比較のためにＡＲＰレベルを調べられた。ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを、反応につき２５ ｎｇの入力ＲＮＡを用いた。結果は、発現について以下の相対比を示した：膵臓（Ｃ_Ｔ≒２０）＞脳下垂体（Ｃ_Ｔ≒２２）＞精巣（Ｃ_Ｔ≒２５）＞腎臓（Ｃ_Ｔ≒２９）＞肝臓（Ｃ_Ｔ≒３１）＞胎盤（Ｃ_Ｔ≒３３）。これらの結果は、実施例４で報告されたものと一致していた。
【０３１６】
実施例２：ヒトＢＲＰに対応するｃＤＮＡクローンの単離
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＬ１１８５５５（図４）からのＤＮＡ塩基配列、及びＰＲＩＭＥソフトウェア・プログラム （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、約５ ｋｂのイントロンによって分けられた２つの推測上のエクソンに含まれている、ＡＲＰ／ＢＲＰの予測されたコーディング領域の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計するために使用した。正、及び逆プライマー（ＡＲＰ／ＢＲＰＣＤＳプライマーと呼ばれる）の配列は、それぞれ、５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号７７）、及び５’−ＧＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号４８）であった。
【０３１７】
ヒトＢＲＰタンパク質コーディング領域をクローン化するためのＰＣＲ反応を以下の成分を含む５０μｌの量で行った：４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、２００ ｎＭの正プライマー、２００ ｎＭの逆プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、０．５単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び２μｌの脳下垂体ｃＤＮＡ（前項に記載の１００ ｎｇ ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡと同等物）。サイクリング条件は、９９．９℃ ２分、続いて９４℃ ３０秒間、６７℃ １５秒間、そして７５℃ ３０秒間の４０サイクルであった。これらの条件は、アガロースゲルにおいて、約４００塩基対（ｂｐ）の弱々しいバンドの検出をもたらした。この断片をゲル精製し、そしてＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。約４００ｂｐのＥｃｏＲＩ挿入断片を持つプラスミドを確認し、ｈＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔと呼んだ（図１９）。ＤＮＡ塩基配列決定法の結果は、４００ ｂｐのＰＣＲ断片の正体がＢＲＰであることを立証した。断片のＤＮＡ塩基配列は、配列番号２と一致するアミノ酸翻訳を持つ配列番号１のそれに一致した。
【０３１８】
実施例３：哺乳動物細胞におけるヒトＢＲＰ融合タンパク質の発現のためのプラスミドの構築。
【０３１９】
ＡＰ−ＢＲＰ
以下のプライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号４９）、及び５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号５０）を用いてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のＣ末端部位への（シグナル配列のない）予測的された成熟ヒトＢＲＰについてのコーディング領域の融合を行った。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりであった：１００ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び１００ ｎｇのｈＢＲＰ／ＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔプラスミドＤＮＡ。サイクリング条件は、９９℃ ２分、続いて９４℃ ３０秒間、７０℃ ３０秒間の２５サイクルであった。得られたＰＣＲ断片をゲル精製し、そしてＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。期待の制限エンドヌクレアーゼ・バンディング・パターンを持つＢＲＰ−ＮＴＡＰ（図２０）と呼ばれるプラスミドを確認し、そして配列決定した。ＢＲＰ−ＮＴＡＰプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩ及びＡｐａＩにより消化し、そしてＢＲＰコーディング領域を含んでいる挿入断片をゲル精製し、そしてＸｈｏＩ及びＡｐａＩ消化したＡｐｔａｇ−５ベクターＤＮＡ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ（登録商標） Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）に挿入した。これが、Ｎ末端の分泌アルカリホスファターゼ及びＢＲＰａｔのＣ末端から成る融合タンパク質の発現のために作り出したプラスミドをもたらした（ＡＰ−ＢＲＰｉｎ Ａｐｔａｇ−５、図２１）。
【０３２０】
ＢＲＰ−ＧＦＰ
ヒトＢＲＰのＣ末端への緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）の融合を以下のＰＣＲプライマー、５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号５１）、及び５’−ＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号５２）を用いて行った。ＰＣＲ反応条件は以下の通りだった：５０ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び５０ ｎｇのｈＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔプラスミドＤＮＡ。４９℃〜６９℃の範囲でアニーリング温度の１２点のグラジエントを試験するために１２の同一な５０μｌの反応液を準備した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、４９〜６９．１℃ １５秒、及び７５℃ ３０秒の２５サイクルであった。６３〜６８℃のアニーリング温度を用いた反応からのＰＣＲ産物を、貯めて、ゲル精製した。末端へのｄＡ残基に付加にに加え、精製された断片を、Ｍｇ不含１Ｘ ＰＣＲバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、２ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各２００ μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰを含む１００μｌの反応容量中、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）により処理した。７２℃ １５分間のインキュベーションの後、この断片をＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて精製した。ｄＡテールを持ったＢＲＰＰＣＲ断片を、製造業者によって指定されたプロトコールを用いてＣＴ−ＧＦＰ Ｆｕｓｉｏｎ ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ発現式キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に提供されたベクター内に挿入した。Ｎ末端がヒトＢＲＰ、そしてＣ末端がＣｙｃｌｅ３ ＧＦＰから成る融合タンパク質の発現のための発現ベクターを得た（ＢＲＰ−ＧＦＰｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１、図２２）。融合構築物の構造を、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した（図２３）。
【０３２１】
ＦＬＡＧ−ＢＲＰ
Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するＢＲＰの発現のためのベクターを作り出すために、ＢＲＰ−ＮＴＡＰプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、約４００ｂｐのヒトＢＲＰ挿入断片をゲル精製した。精製ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に挿入した。１００ ｂｐのＰｓｔＩ断片を取り除くために、得られたプラスミド構築物（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＢＲＰ−ＲＩ−ＢＡＭ）をＰｓｔＩにより消化し、４．９キロベースペア（ｋｂ）のベクター断片をゲル精製した。ＢＲＰ−ＮＴＡＰをＳｐｅＩとＳｔｕＩで消化し、４．３ ｋｂのベクターＤＮＡ断片をゲル精製し、次に以下の配列、５’−ＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号５３）、及び５’−ＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡ−３’（配列番号５４）を持つ相補的なオリゴヌクレオチドに連結した。クローン化の後に、正の配列を持つプラスミド構築物を同定し、そしてＰｓｔＩにより消化した。１００ ｂｐのＰｓｔＩ断片をゲル精製し、そしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＢＲＰ−ＲＩ−ＢＡＭ（前記）からの４．９ ｋｂのＰｓｔＩベクター断片に挿入した。正の配向性のＰｓｔＩ挿入断片を持つ構築物を同定し、配列決定して、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合断片が、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１のマウスのプレプロトリプシン・シグナル配列をフレーム単位でコードすることを確認した。この発現ベクター・プラスミドをＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（図２４）と呼んだ。ＦＬＡＧ−ＢＲＰ挿入断片を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５５）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’（配列番号５６）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りだった：５０ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び５０ ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１プラスミドＤＮＡ。６５℃〜７５℃の範囲でアニーリング温度の１２点のグラジエントを試験するために１２の同一な５０μｌの反応液を準備した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６５〜７５℃ １５秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。６５〜７１℃のアニーリング温度を用いた反応からのＰＣＲ産物を、貯めて、ゲル精製した。この断片を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化したｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に連結して、霊長類細胞発現ベクター・プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４を得た（図２５）。ＤＮＡ塩基配列解析を、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードする正しい配列を確認するために使用した。
【０３２２】
ＨＩＳ−ＡＲＰ
ＡＲＰのＮ末端の、（１）マウス・プレプロトリプシン・シグナルペプチド、（２） ６ヒスチジン−１グリシン・タグ（６Ｈｉｓｇ）、及び（３）エンテロキナーゼ開裂部位（ＥＫ）から成る融合タンパク質を得るために２段階のＰＣＲ増幅を行った。最初の段階で、１１．７３ ｎｇのＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡをプライマー、５’−ＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１０３）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１０４）に対して鋳型として使用した。ＰＣＲを、１単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、４２０ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を含む９つの同一の５３ μｌの反応容量中で行った。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６８℃ ３０秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。ＰＣＲに続いて、１μｌの最初の段階の反応物を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０５）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１０６）を用いた第２段階の反応のための新しい試験管に移した。
【０３２３】
反応容量は１２０μｌであり、最初の段階と同じものである、全ての他の反応条件を備えた。反応ミックスの各１２μｌのアリコートを、６５℃〜７６℃の範囲でアニーリング温度の９点のグラジエントを試験するために使用した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６５〜７６℃ ３０秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。全ての条件が、期待されているサイズの断片を製造し、これをゲル精製し、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて濃縮し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化されたｐＣＥＰ４ｉｎｔに挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドを同定し、６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔと呼んだ（Ｈｉｓ−ＡＲＰと省略される）。融合タンパク質の構造をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。図４１Ｂに示される融合タンパク質のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸翻訳を有するプラスミドの図を図４１Ａに示す。
【０３２４】
実施例４：ヒトの組織から抽出されたＲＮＡ中のヒトＡＲＰ転写産物の検出
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用したヒトＡＲＰの正、及び逆プライマーは、それぞれ、５’−ＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号５７）、及び５’−ＴＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５８）であった。ＡＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５９）であった。蛍光性プローブは、ＡＲＰの最初の２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物を検出することが意図される。
【０３２５】
ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのためのｃＤＮＡ鋳型を提供するためにＨｕｍａｎ Ｒａｐｉｄ−Ｓｃａｎ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を使用した。前記パネルは、１０００Ｘ、１００Ｘ、１０Ｘ、及び１Ｘから連続的に希釈された、２４の組織からのｃＤＮＡを含んでいた。最も低い濃度の、１Ｘは、約１ ｐｇのｃＤＮＡであった。１０００Ｘ及び１００Ｘ希釈物を、ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用した。１ＸのｃＤＮＡ濃度を含んだ二重のパネルからのウェルをヒトβ−アクチンｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄアッセイ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に使用した。
【０３２６】
前記パネルは脳下垂体からのｃＤＮＡを含んでいないため、実施例１からの脳下垂体ｃＤＮＡを使用した。β−アクチンｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）、及び脳下垂体ｃＤＮＡの希釈物を、Ｏｒｉｇｅｎｅパネルによる１０００Ｘ、１００Ｘ、１０Ｘ、及び１Ｘ ｃＤＮＡ希釈物と同等なおおよその量を決定するために使用した。結果は、５ ｐｇの脳下垂体ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから準備したｃＤＮＡが、約３１のＣ_Ｔｓを示す１ＸのｃＤＮＡ濃度に相当することを示した。従って、５ ｎｇ及び０．５ ｎｇの脳下垂体のポリ（ａ）＋ＲＮＡからのｃＤＮＡを、それぞれＯｒｉｇｅｎｅパネル１０００Ｘ及び１００Ｘ ｃＤＮＡｓに相当すると見なした。
【０３２７】
結果を表６に示す。
【０３２８】
【表６】

【０３２９】
この結果は、検査された組織サンプル、膵臓、脳下垂体、及び精巣組織が最も高いレベルのＡＲＰを含んでいることを示す。残りの組織は、より低いか又は検出不能なレベルのＡＲＰ ｍＲＮＡを有していた。
【０３３０】
実施例５：ラット組織中のＡＲＰ ｍＲＮＡの検出
ラットＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入するか、又は液体窒素中で急速冷凍し、そして−８０℃で保存した臓器から調製した。重量が最大で４０ ｍｇまでの組織を、ＲＬＴバッファー（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）キット Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）中で４５秒間、携帯型乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）によって押しつぶし、続いて２１ゲージの針を１０回通過させて均質化した。ＲＬＴバッファー、又はＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）のいずれかの中で、より大きな組織を均質にするために、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎを使用した。使用した均質化バッファーのメーカーにより供給されたプロトコールに従ってＲＮＡを精製した。実施例１に記載のとおりｃＤＮＡを調製した。
【０３３１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用したラットＡＲＰの正、及び逆プライマーは、それぞれ、５’−ＡＧＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号６０）、及び５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴ−３’（配列番号６１）であった。ラットＡＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号６２）であった。蛍光性プローブが、ＡＲＰの最初の２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物を検出することが意図される。
【０３３２】
ＡＲＰ ｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲによりラットの脳下垂体、卵巣、精巣、眼、及びラット下垂体腺腫細胞株ＲＣ−４Ｂ／Ｃにおいて検出可能だった（データ未掲載）。（膣スミアによって決定される）発情前期、発情期、及び発情間期の７６日成熟雌動物から取ったラット脳下垂体組織から抽出した全ＲＮＡにおけるアッセイの結果は、ラットＡＲＰ ｍＲＮＡが発情周期中、調節されているため、生殖における役割を担っているかもしれないことを示唆した。ＡＲＰｍＲＮＡが発情期中減少を平らにするということで、ＡＲＰ ｍＲＮＡレベルを低下させる前記調節は、ＦＳＨβ ｍＲＮＡのそれの反対のものであるように思われるのに対し、ＦＳＨβ ｍＲＮＡレベルは、上昇する（表７）。
【０３３３】
【表７】

【０３３４】
実施例６：ヒトＡＲＰに対応するｃＤＮＡクローンの単離
以下の正、及び逆ＰＣＲプライマー：それぞれ、５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号６３）、及び５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６４）（終止コドンなし）によるＰＣＲのための鋳型としてＩＭＡＧＥ ２３３８９５０クローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）から精製したＤＮＡを使用した。ＰＣＲを、４単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１ μＭの各正及び負プライマー、２ ｍＭのＭｇＳＯ_４、各２５０μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び１μｌのＩＭＡＧＥ ２３３８９５０プラスミドＤＮＡを含む１００ μｌの反応容量中で行った。サイクリング条件は、９４℃ １分、５６℃ ３５秒、及び７２℃ １分の３０サイクルであった。ＰＣＲから得られた約４００ｂｐの断片を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化し、次にＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩベクターＤＮＡ（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）中に連結した。挿入断片であるＡＲＰの同一性を確認するために、得られたプラスミド、ｐＢＳＳＫＩＩｈＡＲＰ．４（２６Ａ）をＤＮＡ塩基配列解析にかけた。ヒトＡＲＰタンパク質コード領域の配列（図２６Ｂ）が、配列番号１７と一致した。興味深いことに、配列番号２３に示したＤＮＡ塩基配列は、クローン化されたＡＲＰ ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４及び配列番号１７の両者と比べた場合、一のヌクレオチド相違を持っている。この相違（Ａ→Ｃ）は、図２９で説明されて、第１１４残基でのＡＲＰアミノ酸配列のＬｅｕのＰｈｅへの変化をもたらす。ＥＳＴデータベースの検索は、ＡＲＰ−Ｐｈｅ型が支配的であり、そのためＡＲＰ−Ｌｅｕ型は集団内ではあまり一般的ではない可能性のある多型の変異型であることを明らかにした。ＡＲＰ−Ｐｈｅタンパク質をコードしたｃＤＮＡクローンを得るために、多型と一致しているＡ残基をＡＲＰ−Ｐｈｅ型がコードされるようにｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４のＣに変更した。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩのＴ３プロモーター配列に対応するプライマー、及び、５’−ＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号６５）による、ＰＣＲのための鋳型としてｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４を用いることにより行われた。反応条件及びサイクリング・パラメーターは、完全なＡＲＰコーディング領域をクローン化するために先に記載されたものと同様であった。得られたＰＣＲ断片を、ゲル精製し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。ＤＮＡ塩基配列解析は、ｐＣＲｂｌｕｎｔ Ｐｈｅと呼ばれるプラスミドの突然変異の存在を立証した。ｐＣＲｂｌｕｎｔ Ｐｈｅからの精製ＤＮＡをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩにより消化した。Ｐｈｅ突然変異を含むＡＲＰ断片を、ゲル精製し、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩにより消化されたｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４に挿入し、そしてＡＲＰ−Ｌｅｕ断片から精製した。ｐＢＳＳＫｎ ｈＡＲＰ−Ｐｈｅ （図２８Ａ）と呼ばれる、期待されているサイズの挿入断片を持つプラスミドを、同定し、ＤＮＡ塩基配列解析によって正しくＡＲＰ−Ｐｈｅ変異型（図２８Ｂ）をコードしたオープンリーディングフレームを持っていることを示した。
【０３３５】
実施例７：哺乳動物細胞におけるヒトＡＲＰ融合タンパク質の発現のためのプラスミドの構築。
【０３３６】
ＧＦＰ−ＡＲＰ
ｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ．４からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）にサブクローニングした。正しい制限エンドヌクレアーゼ・バンド・パターンを持つクローンを同定した。１つをさらなる研究のために選び、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ又はＡＲＰ−ＧＦＰ（図２９）と呼んだ。対応するアミノ酸翻訳と一緒に融合タンパク質ＯＲＦのＤＮＡ塩基配列を図３０に示す。
【０３３７】
ＡＰ−ＡＲＰ
サブクローニングを容易にするために、オリゴヌクレオチド・アダプター・カセット（５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣ−３’（配列番号６６）、及び５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号６７））を、ｐＡＰｔａｇ５のポリリンカーのＸｂａＩとＡｐａｌ部位の間へのＥｃｏＲＩ部位を挿入するために使用し、そしてベクターｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）を作製した。シグナルペプチドのないＡＲＰコーディング断片を得るために、ＰＣＲ増幅を、以下のプライマー、５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６８）、及び５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６９）、並びに鋳型としてｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ．４を用いて行った。３４０ ｂｐのＰＣＲ産物を、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化し、精製し、そしてＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化されたｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）に挿入した。これが、Ｎ−末端をアルカリホスファターゼによりタグしたＡＲＰ−Ｌｅｕ変異型の発現に好適な、ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）と呼ばれるベクターを製造した。ＡＰタグされたＡＲＰ−Ｐｈｅの発現のためのベクターを構築するために、以下の断片を単離し、連結反応により結合してプラスミドｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）−ＡＲＰ−Ｐｈｅ （図３１Ａ）を得た：ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）からの６．６ ｋｂ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）−ＡＲＰ−Ｌｅｕからの２４０ ｂｐのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片、及びｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ−Ｐｈｅからの８３ ｂｐのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片。ＡＰ−ＡＲＰ接合部部位のＤＮＡ塩基配列を決定し、期待されているオープンリーディングフレームをコードすることが示された。
【０３３８】
ＦＬＡＧ−ＡＲＰ
ＦＬＡＧタグの上流にマウス・プレプロトリプシン・シグナルペプチドを持つ、ＡＲＰのＮ末端のＦＬＡＧから成る融合タンパク質を得るために、２段階のＰＣＲ増幅を行った。最初の段階で、ｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ−Ｐｈｅ （１μｌのプラスミドＤＮＡ）を、以下のプライマー、５’−ＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号７０）、及び５’−ＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号７１）に対する鋳型として使用した。ＰＣＲを、１単位のＶｅｎｔ_Ｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、４ ｍＭのＭｇＳＯ_４、１００ ｎＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を含む５０ μｌの反応容量中で行った。９６℃ ３０秒、７０℃ ３０秒の１６サイクルを増幅のために用いた。ＰＣＲに続いて、１０μｌの最初の段階の反応物を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号７２）、及び５’−ＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ７３）を用いた第２段階の反応のために新しい試験管に移した。全ての他の反応及びサイクリングが最初の段階と同じで、反応容量が１００μｌであった。ＰＣＲの第２段階から製造されたＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化されたｐＣＥＰ４に挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドを同定し、そしてＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ （図３２）と呼んだ。
【０３３９】
ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ｉｎｔ
ＡＲＰ遺伝子のイントロン−エクソン構造は、その親類、糖タンパク質アルファ・サブユニットのそれと類似している。糖タンパク質アルファ・サブユニットは哺乳動物細胞中での効率的な発現のためにイントロン又はゲノム断片を必要とするので（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ５，６７４，７１１）、ＡＲＰもこの必要性がある可能性がある。これを試験するために、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ発現構築物を、ｍＲＮＡの５’非翻訳部位中のイントロンを用いて設計した。ｐＣＩｎｅｏ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）からのキメラ・イントロンを、５’ＫｐｎＩ部位 （５’−ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ−３’（配列番号７４））、及び３’ＰｖｕＩＩ部位（５’−ＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号７５））を加えるように設計されたプライマーによりＰＣＲ増幅した。反応混合物は、１０ ｎｇのｐＣＩｎｅｏ ＤＮＡ、１Ｘ Ｐｆｕバッファー（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３．２ ｍＭのＭｇＳＯ_４、並びに０．５ μｌのＰｆｕターボ・ポリメラーゼ（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を２５ μｌの総量中に含む。サイクリング条件は、９５℃ １分、続いて９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、及び７２℃ １分の２０サイクルであった。サイクリング後に、反応物を１０分間７２℃でインキュベートし、次に４℃に冷却した。イントロンを含んでいる約２００ ｂｐのＰＣＲ断片をＰｖｕＩＩとＫｐｎＩにより消化し、ゲル精製して、ＰｖｕＩＩとＫｐｎＩにより消化されたｐＣＥＰ４に挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドｐＣＥＰ４ｉｎｔが同定した。イントロンの構造を、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４をＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化した。４００ ｂｐの挿入断片をゲル精製し、そしてＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化されたｐＣＥＰ４ｉｎｔ中にクローン化されてプラスミドＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔを設計した（図３３）。
【０３４０】
実施例８：ＡＲＰ及びＢＲＰによる哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション
別段の記載のない限り、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ １０８５２）をＡＲＰ及びＢＲＰ融合タンパク質の製造のために使用した。細胞培養を、成長、及びインキュベーション手順の間、３７℃、５％ ＣＯ_２、９５％の湿気で維持した。Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２４： ５９６−６０１， １９９６）により記載されたリン酸カルシウム沈殿手順を、成長培地が１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％のＬ−グルタミンを補ったダルベッコ変性イーグル培地Ｆ−１２ （ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）であったことを除いて、一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの約１時間前に、成長培地を除き、トランスフェクション培地（２ ％のＦＢＳ、及び１％のＬ−グルタミンを補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と交換して、そしてリン酸カルシウム沈澱したＤＮＡを添加した。一般に、１枚の１００ ｍｍの皿につき１２．５μｇ〜２５μｇのＤＮＡを１種類のプラスミド・トランスフェクションのために使用した。同時トランスフェクションのために、１２．５μｇの各プラスミドＤＮＡの混合物を使用した。４〜６時間後に、トランスフェクション培地を成長培地に交換した。約２４時間後に、成長培地を補足してＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （収集培地）に交換した。４８〜７２時間後に、収集培地を除き、残屑を取り除くために遠心分離し、解析又は濃縮のために保存し、そして新鮮な収集培地を細胞培養に添加した。さらに４８〜７２時間後、収集培地を除き、遠心分離し、保存し、そして細胞を廃棄した。培地の濃縮を製造業者によって指定されたプロコールにより、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０ （Ａｍｉｃｏｎ）を用いて行った。
【０３４１】
実施例９： ＡＲＰ及びＢＲＰによる哺乳動物細胞の安定したトランスフェクション
収集培地を使用しなかった以外、先の一過性トランスフェクションについての記載のとおりｐＣＥＰ４誘導プラスミドによる安定したトランスフェクションを行った。トランスフェクションの約２日後に、成長培地を選択媒体（１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン、及び２５０ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２）と交換した。細胞が集密化し、そして凍結、及び製造規模の拡大のために分ける準備ができるまで選択培地を２〜３日ごとに交換した。
【０３４２】
実施例１０：培地中の分泌されたＧＦＰ融合タンパク質の検出
完全な、それらの天然シグナルペプチド配列を持つ、ＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰの両方を、培地中に分泌させ、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｔｒｉｐプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５１８８）を用いた融合タンパク質の捕捉、又は抗ＧＦＰウエスタンブロットによって検出できた。
【０３４３】
ウエスタンブロットによりＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質を分析するために、ＢＲＰ−ＧＦＰの一過性トランスフェクションからの１マイクロリットル、２マイクロリットル、及び５マイクロリットルの濃縮培地を分析した。ＣＯＳ−７細胞（複製不全ＳＶ４０により形質転換されたアフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ細胞系１６５１）をこの実験のために使用した。１０％ ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ ｖ／ｖの２００ ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１％ ｖ／ｖの１００ ｍＭ ピラベートを補った５００マイクロリットルのダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１ウェルにつき１００，０００の細胞密度で細胞を２４ウェルプレート上に蒔き、そして無菌条件下、３７℃、５％ ＣＯ_２、９５％湿気で培養した。翌日、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）と結合させる１マイクログラムのＢＲＰ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡを各々のウェルに添加することによって、細胞をリポフェクションによってトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、細胞を無血清培地（１％ ｖ／ｖのＬ−グルタミン及び１％ ｖ／ｖのピルベートを補ったＤＭＥＭ）に交換し、更に培養３日後に、培地を、収集し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心性濃縮器（ＹＭ−１０）を用いて濃縮し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰを用いた類似のＣＯＳトランスフェクションからのＡＲＰ−ＧＦＰのサンプル（２マイクロリットル）、並びにＤＮＡを含まないトランスフェクション条件に晒されたＣＯＳ−７細胞からのサンプル（１マイクロリットル）をも分析した。５マイクロリットルのＢＲＰ−ＧＦＰサンプル（６．８５マイクログラムの総タンパク質）中に存在したときに、各々が大体同じ量の総タンパク質（タンパク質含量のＢＣＡ分析に基づく）を含むように、ＡＲＰ−ＧＦＰ及び対照サンプル量をが選んだ。
【０３４４】
１０％ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｅｃａｓｔゲル及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの試薬を用いて電気泳動が実施した。サンプルを、純水（及び還元サンプルのために、１マイクロリットルの還元剤（０．５Ｍのジチオスレイトール））と合わせ、及び２．５マイクロリットルの４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） ＬＤＳサンプル・バッファー（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ００７） そして１０マイクロリットルの最終容量となった。７０℃で５分間のこれらの希釈サンプルを加熱した後に、サンプルを１５ウェルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルに添加した。ＧＦＰ標準のサンプル（４ナノグラム、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をウエスタンブロットの正の対照として含んだ。Ｂｉｏ−Ｒａｄからの広範囲着色マーカー（カタログ＃ ７２８０７Ａ）をＢｉｏ−Ｒａｄからのビオチン化マーカーに加えて使用した。電気泳動を一定の電圧（１２５Ｖ）でＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ００５）を用いて実施し、そしてサンプル・バッファーからのＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅがゲルの底に届いた時に止めた。タンパク質をゲルからＮｕＰＡＧＥ転写バッファー及びＨｏｅｆｆｅｒ ＴＥ２２ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ装置（定電流−４００ｍＡを使用）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ０００２）に移した。転写の後（ゲルからＰＶＤＦへの着色マーカーの移動によって確認した）に、膜上の非特異的結合部位を、４℃で一晩、１ｘカゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＳＰ５０２０）と一緒に水中でインキュベートすることによりふさいだ。ブロッキングの後に、膜を、ＴＢＳＴ（１ＯＯ ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５ ＋ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で緩やかに振とうしながら、各々の５分間ずつインキュベートすることにより３回洗浄した。次に、この膜を、ＴＢＳＴ中で１／２０００に希釈した１次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄビオチン化ヤギ抗ＧＦＰ ６００１０６１５）の溶液中、室温で３０分インキュベートし、その後この膜を前記のとおりＴＢＳＴ中で３回洗浄した。結合した抗体の検出を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＫ５００１）からの試薬を用いて行った。
【０３４５】
図３４で明らかなように、ＢＲＰ−ＧＦＰ及びＡＲＰ−ＧＦＰの両者が、トランスフェクト細胞からの培地中で容易に検出された。非還元条件下、ＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰの両者が、還元サンプルで減少しているか又は不在の多量体形態を示す。
【０３４６】
実施例１１：分泌されたＦＬＡＧ融合タンパク質の検出、及びイントロンありとなしのＦＬＡＧ−ＡＲＰ発現の比較
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔにより一過性トランスフェクトした。培養上清を収集し、濃縮した。１０μｌ、５μｌ、及び２μｌの各々のＡＲＰトランスフェクションからの濃縮上清、並びに５μｌのＢＲＰトランスフェクションからの濃縮した培養上清を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ＮｕＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をタンパク質サイズ分離のために使用した。サイズによって分別されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。転写に続いて、膜を５％の粉末ドライミルク中４℃で一晩ブロッキングした。残りの手順を室温で行った。膜をＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により５回洗浄し、次に５％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ中、１：５００に希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ３１６５）を含む溶液中で１時間処理した。ＰＢＳＴにより４回洗浄した後に、膜をＰＢＳＴ＋５％の粉末ドライミルク中、１：３０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｌａｄｓ ＃１７０−６５１６）を含む溶液中で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ（１０Ｘ濃縮液＃１７０−６４３５１からの１Ｘ Ｔｒｉｓ緩衝食塩液、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）により５回洗浄し、続いてＴｒｉｓ緩衝食塩液ｐＨ ９．５ （ＴＢＳ）によって１回洗浄した。ＨＲＰを、製造業者によって供給されたプロトコールを用いてＢＭ化学発光基質（ＰＯＤ） （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １５００６９４）により検出した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）をＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質からのシグナルの定量に使用した。ＦＬＡＧ−ＢＲＰ及びＦＬＡＧ−ＡＲＰを、それぞれＭｒ ２１．５ ｋＤａ、及びＭｒ ２４．２ ｋＤａのバンドとしてはっきりと検出可能であった（図３５）。ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｐＣＥＰ４ｉｎｔトランスフェクションのシグナルは、１０μｌ、５μｌ、及び２μｌの添加量についてのＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｐＣＥＰ４トランスフェクションのシグナルよりもそれぞれ１．９Ｘ、２．８Ｘ、１６Ｘ高かった。これらの結果は、イントロンの存在がＡＲＰタンパク質の発現を高めることを示し、そしてこの結果、発現構築物内にイントロン又はゲノミック・クローンを含むことがこのタンパク質の製造の最良の方法である。
【０３４７】
実施例１２：ＡＲＰ−ＢＲＰヘテロ複合体形成の証明
方法 １ ： ＡＰ 検出による ＧＦＰ の捕捉
Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｔｒｉｐプレート（ｐｉｅｒｃｅ １５１８８）を３回、２００μｌのＰＢＳＴにより洗浄した。ＡＰ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、及びＡＰ対照（ｐＡＰｔａｇ５による単独プラスミド・トランスフェクション）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清を、ＰＢＳで１：２、１：６、及び１：１０希釈した。希釈していない、及び希釈した培養上清の二重の１００μｌアリコーとを、ウェルに入れ、室温で２０分間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳＴによる４回の洗浄の後に、５０μｌの蒸留水を培養上清により処理したウェルに加えた。検量線のために、５０μｌの、連続的に希釈したＡＰタンパク質（３９０ ｎｇ／ｍｌから６．１ ｎｇ／ｍｌまでの２倍希釈）を不用なものが取り除かれたウェルに添加した。さらなる対照のために、５０μｌの、培養上清の（蒸留されたＨ_２Ｏ中） １：１０の希釈物を、総ＡＰを計測するためにこの時点で空のウェルに添加した。１ウェルにつき５０μｌのＡＰアッセイ試薬Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ（登録商標） Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）を、試験サンプルとＡＰ標準に添加した添加した。プレートの側面を軽く叩き試薬を混ぜ、次に１０分間３７℃でインキュベートした。各々のウェルへの１００μｌの０．５ Ｎ ＮａＯＨの追加によって反応を止めた。４０５ ｎｍの吸光度をプレートリーダーにより測定した。代表的なアッセイの結果を表８に示す。
【０３４８】
【表８】

【０３４９】
方法 ２ ． ＦＬＡＧ 検出による ＧＦＰ の捕捉
ＦＬＡＧ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（単独プラスミド）、ＡＲＰ−ＧＦＰ（単独プラスミド）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清、並びにＤＮＡ不含対照を、方法１に記載した手順によるＧＦＰ捕捉に使用した。捕捉ステップ及びＰＢＳＴ洗浄の後に、１００μｌの、（ＰＢＳＴ中）１：５００に希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ３１６５）を、各々のウェルに添加し、室温で１時間、又は４℃で一晩インキュベートした。２００ μｌのＰＢＳＴによりウェルを４回洗浄し、次に１００ μｌの、ヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）−ＡＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｌａｄｓ Ｓ２３２４２５）の（ＰＢＳＴによる）１：２０００希釈物を各々に添加した。２００ μｌのＰＢＳＴによる５回の洗浄の後に、５０ μｌの蒸留水を各々のウェルに添加し、そして捕捉されたタンパク質を計測するためＡＰアッセイ試薬Ａを方法１に記載のとおり使用した。結果を表９に示す。
【０３５０】
【表９】

【０３５１】
方法３．抗ＦＬＡＧ−モノクローナル抗体による免疫沈降及びＡＰの検出
ＡＰ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ （同時トランスフェクション）、及びＡＰ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（同時トランスフェクション）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清（最初と２回目の４８〜７２時間の収集の両方）を、免疫沈降実験のために使用した。各々の免疫沈降反応のために、５０ μｌのＭＰＧビーズ（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）を、磁性セパレータを用いて１ミリリットルのＰＢＳＴにより３回洗浄した。最後の洗浄の後に、ビーズを１ ｍｌのＰＢＳＴ中に再懸濁した。これに５μｌの、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｆ３１６５）の４ μｇ／μｌ溶液を添加した。この混合物を回転装置を用いて室温で２０分間インキュベートした。１ ｍｌのＰＢＳＴによる５回の洗浄の後に、ビーズを０．５ ｍｌ又は０．１ ｍｌの試験培養上清サンプル中に再懸濁し、そして各々に１ ｍｌの全容量までＰＢＳＴを添加した。回転装置を用いて、ＦＬＡＧタグしたタンパク質を４℃で一晩捕捉した。ＰＢＳＴによりビーズを５回洗浄し、そして５０ μｌの蒸留水中に再懸濁した。５０μｌのＡＰアッセイ試薬Ａと一緒にインキュベートし、そしてＮａＯＨによる反応停止を方法１に記載のとおり行った。この反応を止めた後に、各々のウェルから別々の試験管に１００ μｌのアリコートを回収し、４００μｌの蒸留水で希釈した。４０５ ｎｍの吸光度を分光光度計により計測した。結果を表１０に示す。
【０３５２】
【表１０】

【０３５３】
まとめて考えると、結果は、ＢＲＰ及びＡＲＰ融合タンパク質がヘテロ複合体を形成するために相互作用することを示す。従って、前記タンパク質の天然型が特定の生理活性を持つヘテロ複合体を形成するとも考えられる。
【０３５４】
実施例１３：ＦＬＡＧ−ＢＲＰの小規模製造
発現プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４により安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、成長培地を用いて４つのＴ−１７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ， Ｃａｔ＃３５３１１２）内に広げた。大体集密になったとき、この細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ ２５３００−０５４）処理し、溜めて、６３２０ ｃｍ^２のｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ Ｃａｔ＃ｌ ６４３２７）の播種に使用した。それらが集密に達するまで成長培地を必要とされるときに細胞に供給し、達したとき、成長培地を産生培地（１ ｍｇ／ｌ インシュリン、１２．２４ ｍｇ／ｌのクエン酸酸化鉄、及び０．００６８ ｍｇ／１のセレンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と交換した。産生培地を２〜３日ごとに取り除き、新鮮な産生培地（１５００〜２２５０ ｍｌ）と交換して、数ロットを産生した。各々のロットを、採取後直ちにＧｅｌｍａｎ ０．４５μｍ ｍｉｎｉ−ｃａｐｓｕｌｅフィルター（Ｇｅｌｍａｎ， Ｃａｔ＃ １２１２３）を通してろ過し、次にＮａｌｇｅｎｅ ＰＥＴＧ瓶（Ｃａｔ＃ ２０１９−０５００、及び２０１９−１０００）に入れて、−８０℃で保存した。
【０３５５】
実施例１４：ヒトＢＲＰホモ複合体の認識
２の小規模産生ロットからの未加工培養上清の濃縮の後に、抗ＦＬＡＧ−アガロース・アフィニティー・ゲル（Ｓｉｇｍａ， ＃Ａ−１２０５）を用いて、ＦＬＡＧ−ＢＲＰを約７５％の同一性まで免疫アフィニティー精製した。この精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＳｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ （Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８７ Ｎｏｖ ｌ；１６６（２）：３６８−７９）のＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝系を用いた抗ＦＬＡＧ特異的ウエスタンブロットにより分析した。図３６は、見かけ上の分子量に関して並べた銀染色したゲル、及び抗ＦＬＡＧウエスタンブロットの像を示す。７０℃で１０分間、沸騰で２分間、及び２％のβ−メルカプトエタノールの存在下、沸騰で２分間の処置前の条件を選択した、なぜならこれらの条件下、ＦＳＨがそれぞれヘテロダイマー、解離したヘテロダイマー、還元された解離したヘテロダイマーとして存在するので選んだ（銀染色されたゲルによるＦＳＨ比較を参照のこと）。
【０３５６】
銀染色による両ロットのＭｒ ３６ ｋＤａの還元感受性バンドの検出は、精製ＦＬＡＧ−ＢＲＰタンパク質の少なくとも１部が共有結合ホモダイマーとして存在することを示唆している。この３６ ｋＤａのバンドは、一過性発現系又は免疫アフィニティー精製法の人為的な影響ではなさそうである。
【０３５７】
実施例１４：ＡＲＰ／ＢＲＰのｉｎ ｓｉｔｕ組織化学
動物及び組織の準備
成熟した生後６０日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。動物は食物と水を自由摂取させた。組織切片を公表された手順に従って準備した（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３２７ ｐ１９−３１）
ラット組織へのＡＰ−Ｂ５ＡＲＰ又はＡＰ−Ｂ５結合のｉｎ ｓｉｔｕ解析
切片を２回、１ＯｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２バッファーにより室温で５分間洗浄し、次にブロッキング・バッファー（１Ｏ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５％のＢＳＡ）中、室温で１時間プレインキュベートした。次に、切片を以下の処置の１つと一緒にインキュベートした：
１．ｐＡＰｔａｇ５ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（ＡＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
２．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
３．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）、及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４（ＡＰ−ＢＲＰ／ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
４．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５、及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４により同時トランスフェクトした２９３細胞からの調整培地、さらにＨｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（ＡＰ−ＢＲＰ／ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ）により同時トランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
５．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）、さらに部分的に精製したＦＬＡＧ−ＢＲＰ （ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地。
【０３５８】
ＡＰタンパク質とのインキュベーションを、ブロッキング・バッファー中で、室温で一晩実施した。インキュベーションの後に、次に切片をそして冷ブロッキング・バッファーにより６回洗浄し、アセトン（６０％）及びホルムアルデヒド（３％）を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ ７．５）中で、３０秒間固定した。次に、固定した切片を、ＨＳバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５）中、洗浄し、内因性のアルカリホスファターゼ活性を不活化するために６５℃で３０分間加熱した。ＨＳバッファーを完全に除去した後に、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ ＡＰアッセイ試薬Ｓを用いてＡＰ活性について、この切片を染色し、細胞表面に結合したＡＰ活性を検出した。
【０３５９】
他の態様
本発明は、その詳細な説明に関連して説明されている一方で、この先の説明が説明を意図し、本発明の範囲を制限しないことは理解され、上記本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によって定義される。他の側面、利点、及び修飾は、前記請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による新規ベータ関連タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１、及び３）の描写である。
【図２】
本発明による新規ベータ関連タンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２、及び４）の描写である。
【図３】
本発明によるベータ関連タンパク質の推測されたシグナル配列の描写である（配列番号１０）。
【図４−１】
ゲノム・コード配列及び産物を含むジェンバンク登録番号：ＡＬ１１８５５５の部分の描写である。エクソンは太字である。
【図４−２】
図４−１の続きである。
【図４−３】
図４−１の続きである。
【図５】
ヒトＢＲＰポリペプチド配列（ベータ５とも呼ばれる；配列番号２）とＬＨβ（配列番号６）；ＦＳＨβ（配列番号７）；ＣＧβ（配列番号８）；ＴＳＨβ（配列番号９）のアラインメントである。
【図６】
他の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニットと比較した、ＢＲＰ配列の同一性（対角線の上方の％値）、及び類似性（対角線の下方の％値）を説明する。ＢＬＡＳＴを用いて分析し、そして（コア成熟配列の全域で生じる同一性及び類似性を示す（すなわち、ｃｙｓ９［ｈＣＧ番号付け］からｃｙｓ１００まで）。
【図７Ａ】
ＢＲＰ構造の描写モデルである。パネルＡは、シートベルト・ドメインの欠如を説明する。
【図７Ｂ】
ＢＲＰ構造の描写モデルである。パネルＢは、ｈＣＧ及びＦＳＨと比較したＢＲＰ上のグリコシル化の位置を説明する。
【図８】
ヒトのＢＲＰのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを説明する。
【図９】
ヒトのＢＲＰのＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性プロットを説明する。
【図１０】
本発明によるＢＲＰ−ｈＣＧ融合タンパク質を説明する。太字のアミノ酸は、ｈＣＧから誘導されたアミノ酸配列を示す。下線部のアミノ酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰから誘導されたアミノ酸配列を示す。
【図１１】
本発明によるＢＲＰ−ｈＦＳＨ融合タンパク質を説明する。太字のアミノ酸は、ｈＦＳＨから誘導されたアミノ酸配列を示す。下線部のアミノ酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰから誘導されたアミノ酸配列を示す。
【図１２−１】
本発明による新規アルファ関連タンパク質のヌクレオチド配列の描写である（配列番号１７、１９、及び２１）。
【図１２−２】
図１２−１の続きである。
【図１２−３】
図１２−１の続きである。
【図１２−４】
図１２−１の続きである。
【図１３】
本発明による新規アルファ関連タンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１８、２０、及び２２）の描写である。「＾」は成熟タンパク質の推測された開始部位を示す。
【図４】
第１１染色体の広げられたゲノム断片の描写である（ホモ・サピエンス染色体１１ｑ１３ＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ｂ７９ｇ１７、ジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９）；配列番号２３。
【図１５】
ヒトのＡＲＰポリペプチド配列（配列番号１８）とＦＳＨα（配列番号２６）、及びＦＳＨβ（配列番号２７）のアラインメントである。赤い文字は、ｈＦＳＨα又はｈＦＳＨβで見つかったｈＡＲＰ中の同一残基を示す。黄色は、システインを意味する。
【図１６】
ゲノム・コード配列及び翻訳産物を含むジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９ （ＡＲＰ）の部分の描写である。エクソンは、図字及び下線部であり、そしてポリアデニル化シグナルは下線部である。
【図１７】
ＡＲＰ ｍＲＮＡのノーザンブロット解析の描写である。
【図１８】
Ａｒｐ遺伝子発現の多組織発現（ＭＴＥ）ブロット解析の描写である。
【図１９】
（Ａ） ＢＲＰのオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｈＢＲＰ ｉｎ ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ」の図面である。ＤＮＡ配列及びオープンリーディングフレームのアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２０】
（Ａ）分泌シグナルペプチドを持たないＢＲＰオープンリーディングフレーム含むプラスミド構築物「ＢＲＰ−ＮＴＡＰ」の図面である。ＤＮＡ塩基配列及びオープンリーディングフレームのアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２１】
（Ａ） ＡＰ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５」の図面である。ＡＰ及び（太字の）ＢＲＰの一部のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２２】
ＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＢＲＰ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１」の図面である。
【図２３】
プラスミド「ＢＲＰ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１」にコードされたＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳の描写である。
【図２４】
（Ａ） ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＢＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図２５】
プラスミド構築物「ＦＬＡＧ− ＢＲＰ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。
【図２６】
ＡＲＰオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＢＳ−ＳＫＩＩｈＡＲＰ．４」の図面である。オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２７】
ＡＲＰ−Ｌｅｕタンパク質のＤＮＡ配列と対応する翻訳の描写である。単一ヌクレオチド部位の相違はＡＲＰ−Ｐｈｅ形式が同一であることでもたらされる。
【図２８】
（Ａ） ＡＲＰ−Ｐｈｅタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＢＳ−ＳＫＩＩ ｈＡＲＰ−Ｐｈｅ」の図面である。ＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２９】
ＡＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ」の図面である。
【図３０】
プラスミド「ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ」にコードされたＡＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳の描写である。
【図３１】
（Ａ） ＡＰ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ） ＡＲＰ−Ｐｈｅ」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。 矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図３２】
（Ａ）ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図３３】
プラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＡＲＰ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。
【図３４】
分泌されたＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロット解析の描写である。
【図３５】
分泌されたＦＬＡＧ−ＢＲＰ及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ融合タンパク質のウエスタンブロット解析の描写である。
【図３６】
精製されたＢＲＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析の描写である。
【図３７】
ＡＰ−ＢＲＰが精巣細胞に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰにより置き換えられうることを示すラット精巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰと３９０ ｎＭのＦＬＡＧ−ＢＲＰ。
【図３８】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が卵巣細胞（黄体）に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット卵巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図３９】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が卵巣細胞（濾胞）に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット卵巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図４０】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が精巣細胞に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット精巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図４１】
（Ａ） ６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ−ｐＣＥＰ４ｉｎｔ」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。[0001]
Field of the invention
The present invention relates to polynucleotides and polypeptides encoded by such polynucleotides, as well as the polynucleotides and vectors, host cells, antibodies, and recombinant methods for producing the polypeptides.
[0002]
Background of the invention
Glycoprotein hormones, especially those first discovered to be synthesized and secreted by the anterior pituitary gland, may play important roles in various physiological functions. These functions can include, for example, metabolism, thermoregulation, growth, and reproduction. Pituitary glycoprotein, luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), and thyroid stimulating hormone (TSH) are similar in structure to chorionic gonadotropin (hCG), a placental gonadotropin. These hormones belong to the cystine knot family of proteins and form multimers of the alpha and beta subunits. Among species, the alpha chains for each of the known hormones are identical. In contrast, beta chains differ in sequence and confer specificity on particular hormones.
[0003]
Summary of the present invention
The present invention is based, in part, on the discovery of novel polynucleotide sequences encoding novel beta and alpha subunits of glycoproteins. The encoded proteins were named beta-related protein (BRP) or alpha-related protein (ARP), respectively. Collectively, these polynucleotides and polypeptides are referred to as ARP / BRP.
[0004]
In one aspect, the invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding a beta-related polypeptide (BRP), or a fragment, homolog, analog, or derivative thereof (SEQ ID NOS: 1 and 3, as shown in FIG. 1). I will provide a. The nucleic acid can include, for example, a nucleic acid sequence encoding a polypeptide that is at least 75% identical to the polypeptide of FIG. 2 (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4). The nucleic acid can be, for example, a genomic DNA fragment or a cDNA molecule.
[0005]
The present invention also provides multimers of proteins, for example, multimers of a first polypeptide and a second polypeptide. The first polypeptide may be an ARP or BRP polypeptide.
[0006]
The second polypeptide may be an alpha glycoprotein subunit or a beta glycoprotein subunit, ie, ARP or BRP. Alternatively, the second polypeptide can be a cystine-knot protein.
[0007]
Also included in the invention are vectors containing the nucleic acid molecules described herein, or cells containing the vectors or nucleic acids described herein.
[0008]
The present invention is also directed to a host cell transformed with a vector containing the ARP / BRP nucleic acid molecule.
[0009]
The present invention provides for the administration of any of the nucleic acid molecules disclosed herein or a polypeptide or protein encoded by administering to a mammal a sufficient amount of the following polypeptides to elicit an immune response: Methods for eliciting a mammalian immune response to a multimer are provided.
[0010]
In a further aspect, the invention provides antibodies that specifically bind to ARP, BRP, or hetero- or homo-multimers thereof, or those multimers with alpha or beta subunits from other gonadotropins. I do. The antibodies can be, for example, monoclonal or polyclonal antibodies, and fragments, homologs, analogs, and derivatives thereof. The present invention also includes a pharmaceutical composition comprising an ARP / BRP antibody and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The invention is also directed to an isolated antibody that binds to an epitope on a polypeptide encoded by any of the foregoing nucleic acid molecules.
[0011]
In one aspect, the invention includes a pharmaceutical composition comprising an ARP / BRP nucleic acid and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. In a further aspect, the invention relates to substantially purified ARP / BRP polypeptides, such as ARP / BRP polypeptides encoded by ARP / BRP nucleic acids, and any of their fragments, homologs, analogs, and derivatives. Including. In another aspect, the invention includes a pharmaceutical composition comprising an ARP / BRP multimer and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The present invention also includes a pharmaceutical composition comprising an ARP / BRP polypeptide and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
[0012]
Further, the invention is directed to a kit comprising an antibody that binds to a polypeptide encoded by any of the nucleic acid molecules described above, and a negative control antibody.
[0013]
The present invention further provides a method for producing an ARP / BRP polypeptide. The method comprises providing a cell containing an ARP / BRP nucleic acid, such as a vector containing an ARP / BRP nucleic acid, and culturing the cell under conditions sufficient to express the ARP / BRP polypeptide encoded by the nucleic acid. Including that. Next, the expressed ARP / BRP polypeptide is recovered from the cells.
[0014]
The cell may be, for example, a prokaryotic or eukaryotic cell. Preferably, it is a higher eukaryotic cell, such as a mammal.
[0015]
The present invention provides for the modification of wild-type cells from endogenous sequences after insertion of non-naturally occurring regulatory elements and / or insertion of an amplifiable gene operably linked to the endogenous gene sequence. Further provided are cells expressing ARP / BRP or multimers of these polypeptides at the indicated levels.
[0016]
The invention relates to binding to an ARP / BRP polypeptide or multimer by contacting an ARP / BRP polypeptide or multimer with a compound and determining whether the compound binds to the ARP / BRP or multimeric polypeptide. And a method for identifying a compound.
[0017]
The present invention provides for contacting an ARP / BRP polypeptide or multimer with a compound, wherein the compound binds to the ARP / BRP polypeptide or multimer, binds the ARP / BRP polypeptide or multimer, Determining whether to modify binding to the encoding nucleic acid is also directed to compounds that modulate the activity of the ARP / BRP polypeptide or multimer.
[0018]
In another aspect, the invention provides a method for determining the presence or predisposition to a reproductive disorder, eg, ovulation disorder or infertility, in a subject. The method includes providing a protein sample from a subject and measuring the amount of ARP / BRP polypeptide or multimer in the subject sample. Next, the amount of ARP / BRP in the subject sample is compared to the amount of ARP / BRP polypeptide or multimer in the control protein sample. A change in the amount of ARP / BRP polypeptide or multimer in the subject protein sample relative to the amount of ARP / BRP polypeptide or multimer in the control protein sample indicates that the subject has a reproductive disorder. Preferably, the control sample is from an equivalent individual, ie, an individual of similar general age, gender or other general condition except suspected of having a reproductive disorder. Alternatively, the control sample is from a subject when the subject is not suspected of having a reproductive disorder. In certain embodiments, ARP / BRP polypeptides or multimers are discovered using ARP / BRP antibodies.
[0019]
In another aspect, the invention provides a method for determining the presence of, or predisposition to, a reproductive disorder, eg, ovulation disorder or infertility, in a subject. The method includes providing a nucleic acid sample from a subject, eg, RNA or DNA, or both, and measuring the amount of ARP / BRP nucleic acid in the subject nucleic acid. Next, the amount of the ARP / BRP nucleic acid sample in the subject nucleic acid is compared to the amount of ARP / BRP nucleic acid in the control sample. A change in the amount of ARP / BRP nucleic acid in the control sample relative to the amount of ARP / BRP in the sample indicates that the subject has a reproductive disorder.
[0020]
In another aspect, the invention provides a method of treating a pathological condition, eg, a reproductive disorder in a subject. The method includes administering an ARP / BRP polypeptide, multimer, or antibody to the subject in an amount sufficient to alleviate the pathological condition.
[0021]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not limiting.
[0022]
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and claims.
[0023]
Detailed description of the invention
The present invention is based, in part, on the discovery of novel nucleic acid sequences that encode polypeptides related to the glycoprotein beta and alpha subunits. The polypeptides and nucleic acids of the invention related to the beta subunit are referred to herein as beta-related proteins (BRPs), whereas the polypeptides and nucleic acids of the invention related to the alpha subunit are described in the present invention. It is referred to herein as alpha-related protein (ARP). As used herein, "ARP / BRP" means that reference is made to both beta-related and alpha-related nucleic acids and polypeptides of the invention. Table 1 below depicts the sequence descriptors used herein.
[0024]
[Table 1]

[0025]
The present invention includes a nucleotide sequence that encodes a novel glycoprotein beta subunit (see FIG. 1; SEQ ID NOs: 1 and 3). The amino acid sequence of the encoded polypeptide is shown in FIG. 2 (SEQ ID NOs: 2 and 4). GCG Spscan analysis predicted a signal sequence as shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 10).
[0026]
A nucleic acid encoding a BRP polypeptide was identified in the BAC contained in the genomic DNA sequence from chromosome 14 (Genbank accession number AL11855). An apparent full-length BRP coding region, including the translation start site and stop codon, was identified in BAC. The BRP coding region contains two exons and one intron. The BRP DNA sequence contains 387 nucleotides encoding a 129 amino acid polypeptide (SEQ ID NO: 2).
[0027]
The BRP nucleic acid sequence shows about 50% identity to the FSH beta subunit between the first and last cysteine residue encoding portions. The predicted mature coding region of the BRP protein shows 30-35% identity to the beta subunit of the glycoprotein family of hormones.
[0028]
ARP / BRP, the presence of an identifiable domain in a protein, is determined by a search using software algorithms such as PROSITE, DOMAIN, Blocks, Pfam, ProDomain, and Prints, then the Interpro website (http : www. ebi. ac. uk / interpro) Is used to determine the Interpro number by cross domain match (or number). As a result of DOMAIN, ARP / BRP was collected from Conserved Domain Database (CDD) using inversion specific BLAST analysis. This BLAST analysis software sample domainSmartas well asPfamDiscovered by collecting information.
[0029]
Human BRP, which is consistent with other known members of the glycoprotein hormone beta subunit superfamily of proteins, contains a glycoprotein hormone beta chain domain and a cystine knot domain as shown in Table 2. .
[0030]
[Table 2]

[0031]
An "E value" or "expected" value is a number that indicates the likelihood that sequences that are accidentally aligned in the searched database can achieve their similarity to the query sequence. The expected value (E) is an index that describes the number of hits that a person skilled in the art can simply “expected” to discover by chance when searching a database of a specific size. It decreases exponentially with the score (S) assigned to the match between the two sequences. Essentially, the E value accounts for the random background noise that exists due to matches between sequences. Expectations are used as a convenient way to create importance thresholds for reporting results. The default value used for blasting is generally set to 0.0001. Expectations are also used instead of P-values (probabilities) to report the importance of a match. For example, an E value assigned to a hit by one (one) is interpreted to mean that in a database of a particular size, one can expect a person of ordinary skill to find only one match with a similar score by chance. sell. An E-value of zero means that one of ordinary skill in the art cannot be expected to just find a match with a similar score. For example,http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo /checking ...
[0032]
Table 3 shows the protein alignment of human BRP with glycoprotein hormone beta chain domain consensus sequence, as well as other members of the glycoprotein hormone beta superfamily. Amino acid residues outlined in black indicate site identity; gray amino acid residues indicate sites of conservative amino acid substitution.
[0033]
[Table 3]

[0034]
Table 4 shows the protein alignment of human BRP with glycoprotein hormone beta chain domain consensus sequence, as well as other members of the cystine-knot superfamily.
[0035]
[Table 4]

[0036]
The putative signal peptide and cysteine pattern of human BRP is similar to the previously reported glycoprotein hormone except for the absence of seat belt cysteine corresponding to cys residues 26 and 110 of the beta subunit of chorionic gonadotropin.・ Similar to that of the subunit. (See FIG. 7A). Furthermore, the glycosylation pattern of the human BRP protein differs from that of the known glycoprotein hormone beta subunit. (See FIG. 7B).
[0037]
Multi-tissue expression (MTE) analysis confirmed BRP expression in the pituitary gland.
[0038]
Similarly, the invention includes nucleotide sequences that encode novel glycoprotein alpha subunits. (See FIG. 12; SEQ ID NOs: 17, 19 and 21). GCG Spscan analysis deduced the signal sequence of ARP. (SEQ ID NOs: 28, 29, and 30). The ARP amino acid sequence of the encoded polypeptide is shown in FIG. 13 (SEQ ID NOs: 18, 20, and 22).
[0039]
The ARP coding sequence is present in the BAC containing the genomic DNA sequence from chromosome 11. (Genbank registration number AC000159). The full length ARP coding region, including the translation start site and stop codon, was identified in BAC. Northern analysis of ARP confirms a single mRNA species of about 800-900 bases (FIG. 17). The ARP coding region contains three exons and two introns at positions similar to the positions of the second and third introns in the known alpha subunit gene (see FIG. 16). The ARP DNA base sequence has 387 bases encoding a polypeptide predicted to have 129 amino acids (SEQ ID NO: 18).
[0040]
The ARP nucleic acid sequence shows 21% identity to the alpha subunit and 14% identity to the beta subunit of the glycoprotein family of hormones. The predicted mature coding region of the ARP protein exhibits 22% identity to the alpha subunit and 13% identity to the beta subunit of the glycoprotein family of hormones.
[0041]
Moreover, the peptides share secondary structural motifs that are unique to each hormone unit.
[0042]
Like other alpha subunit proteins, ARP has an N-linked glycosylation site at Asn81 (counting from the starting methionine) in the second loop. This glycosylation site and position is conserved in all alpha subunits and has been shown to be crucial for full hormonal activity for some hormones. The second loop is similar in length to the loop found in gonadotropins and the alpha subunit of TSH. The end of the ARP loop sequence corresponds to the gonadotropin and TSH alpha sequences. These terminal sites in alpha are known to be sites of contact with the beta subunit, and of cross-contact with the second and third loops. A second N-linked glycosylation site is also present in the third loop of the ARP protein at a location similar to that of the beta subunit.
[0043]
ARP also has a cysteine pair near the center of its sequence. This sequence corresponds to the 59th and 60th cysteines of the alpha subunit. This feature is not found in the beta subunit, but it is not found in other cystine-knot proteins, including members of the PDGF / VEGF family. The presence of the cysteine pair in the new sequence suggests an alpha-like disulfide bond between the cysteines at amino acids 59 and 87.
[0044]
Multi-tissue expression (MTE) analysis confirmed ARP expression in the pancreas and pituitary.
[0045]
Similarly, the invention includes multimers (ie, in polymers) of ARP and BRP proteins. As used herein, "multimer" and "polymer" are used interchangeably. For example, a multimer is a dimer. The ARP and BRP polypeptides of the present invention, or fragments thereof, may be used, for example, with other related glycoprotein hormones such as luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and placental May form multimers with other alpha or beta glycoprotein subunits to produce glycoprotein hormones with similar, altered or enhanced activity to that of gonadotropin (hCG)) Absent. The multimer may be a homopolymer (ie, ARP-ARP, BRP-BRP) or a heteropolymer having a second polypeptide. The second polypeptide may be, for example, from the same species as ARP or BRP. Alternatively, the second polypeptide may be from a different species. Preferably, the second polypeptide is from a human. The second peptide may be a glycoprotein hormone beta or alpha subunit. Alternatively, the second peptide is a cystine knot protein, such as NGF, HCG, PDGF, and TGF-beta2. For example, a BRP heteropolymer comprises a BRP protein and an alpha glycoprotein subunit or a fragment thereof. Examples of alpha glycoprotein subunits include GenBank accession numbers AAH10957 and CAC43234. Preferably, the BRP polypeptide forms a multimer with the ARP polypeptide. Alternatively, the ARP heteropolymer comprises an ARP polypeptide and a beta glycoprotein subunit. Examples of beta glycoprotein subunits include Genbank accession numbers P01225 and P18842. Preferably, the ARP polypeptide forms a multimer with the BRP polypeptide.
[0046]
The similarity of ARP and BRP polypeptides to these previously described glycoproteins indicates that ARP and BRP nucleic acids, polypeptides, protein multimers, antibodies, and related compounds of the invention treat various reproductive and cell proliferative disorders, Prove that it is useful for prevention or diagnosis. These disorders include, for example, disorders of ovulation (ie, stimulation of follicular development and ovulation induction), disorders related to fertility, hypothyroidism, or disorders of metabolism affecting pituitary function or pituitary target organs, such as the adrenal gland , Thyroid, gonads, and liver. In addition, BRP and ARP nucleic acids, polypeptides, and protein multimers stimulate spermatogenesis, enhance thyroid cell function (ie, increase thyroid hormone production and iodide capture), regulate gonad function, regulate gonad hormone production. It may be useful for regulation, promotion or suppression of fertility. BRP and ARP nucleic acids and polypeptides may be useful in identifying new agents that modulate these disorders.
[0047]
ARP / BRP nucleic acid
One aspect of the invention is an isolated nucleic acid molecule encoding an ARP / BRP protein or nucleic acid, or a biologically active portion thereof, and a nucleic acid encoding ARP / BRP (eg, ARP / BRP mRNA) Nucleic acid fragments that are sufficient for use as hybridization probes to identify DNA fragments and for use as PCR primers for amplification or mutation of ARP / BRP nucleic acid molecules. As used herein, the term “nucleic acid molecule” refers to DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA), RNA molecules (eg, mRNA), DNA or RNA analogs produced using nucleotide analogs, and the like. It is intended to include derivatives, fragments, and homologs of The nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.
[0048]
Similarly, the invention includes DNA constructs that can modify the expression of endogenous ARP / BRP genomic sequences in the cell. Such a construct contains a DNA regulatory sequence and a DNA targeting sequence. The DNA targeting sequence is capable of undergoing homologous recombination with the genomic sequence in the cell, thereby positioning the DNA control junction to operate on the endogenous ARP / BRP genomic sequence.
[0049]
Also included in the invention are DNA constructs capable of amplifying the expression of an endogenous ARP / BRP genomic sequence in a cell. Such a construct contains an amplifiable gene and a DNA targeting sequence. The DNA targeting sequence is capable of undergoing homologous recombination with the genomic sequence in the cell, and thus is an operable junction of the endogenous ARP / BRP genomic sequence such that the ARP / BRP genomic sequence can be amplified. The amplifiable gene can be arranged in the gene.
[0050]
A "probe" preferably relates to a nucleic acid sequence that varies in length depending on the use of at least about 10 nucleotides (nt), 100 nt, or, for example, about 6,000 nt. Probes are used to detect identical, similar or complementary nucleic acid sequences. Longer length probes are usually obtained from natural or recombinant sources, are highly specific, and hybridize much slower than oligomers. Probes are single- or double-stranded and can be designed to have specificity for PCR, membrane-based hybridization techniques, or ELISA-like techniques.
[0051]
An "isolated" nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid. Preferably, an “isolated” nucleic acid is a sequence that is naturally located on the side of the nucleic acid (ie, the sequences located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid) in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived. Not included. For example, in various embodiments, an isolated ARP / BRP nucleic acid molecule can be isolated from the genomic DNA of the cell (eg, testis or pituitary gland) from which the nucleic acid is derived, by approximately flanking the nucleic acid molecule. It can include a nucleotide sequence of less than 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb. Moreover, an "isolated" nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, is substantially free of other cellular materials or media when produced by recombinant technology, or chemically synthesized when chemically synthesized. Substantially no precursors or other chemicals.
[0052]
Nucleic acid molecules of the invention, for example, nucleic acid molecules having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or the complement of any of these nucleotide sequences, can be prepared using standard molecular biology techniques and techniques described herein. It can be isolated using the sequence information provided herein. By using all or part of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 as hybridization probes, ARP / BRP molecules can be isolated using standard hybridization and cloning techniques. (E.g., Sambrook et al., (Eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993. As).
[0053]
The nucleic acids of the invention can be amplified using cDNA, mRNA or genomic DNA as a template and appropriate oligonucleotide primers by standard PCR amplification techniques. The nucleic acid so amplified is cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis. In addition, oligonucleotides corresponding to ARP / BRP nucleotide sequences can be prepared by standard synthetic techniques, eg, using an automated DNA synthesizer.
[0054]
As used herein, the term "oligonucleotide" refers to a series of connected nucleotide residues, wherein the oligonucleotide has a sufficient number of nucleotide bases to be used in a PCR reaction. Short oligonucleotide sequences are based on or designed from genomic or cDNA sequences, and elucidate the amplification, confirmation, or presence of identical, similar, or complementary DNA or RNA in a particular cell or tissue. Used for Oligonucleotides comprise a portion of a nucleic acid sequence having a length of about 10 nt, 50 nt, or 100 nt, preferably about 15 nt to 30 nt. In one embodiment, the oligonucleotide comprising a nucleic acid molecule less than 100 nt in length further comprises six adjacent nucleotides of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or their complement. Oligonucleotides can be chemically synthesized and used as probes.
[0055]
In other embodiments, the isolated nucleic acid molecules of the invention include nucleic acid molecules that are the complement of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21. In another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleic acid molecule as set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or a complement of a portion of this nucleotide sequence. Including. SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, which hydrogen bond to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 with little or no mismatch, thereby forming a stable duplex. , And 21 are sufficiently complementary to the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21.
[0056]
As used herein, the term "complementary" relates to Watson-Crick or Hoogsteen base pairing between nucleotide units of a nucleic acid molecule, and the term "binding" refers to two A physical or chemical interaction between polypeptides or compounds, or related polypeptides or compounds, or combinations thereof. Binding includes ionic, non-ionic, van der Waals, hydrophobic interactions, and the like. Physical interactions may be direct or indirect. Indirect interactions may be through or by the effects of other polypeptides or compounds. Direct binding does not occur through or by the effects of other polypeptides or compounds, but rather involves interactions without other substantial chemical intervention.
[0057]
In one aspect, an isolated nucleic acid molecule of the invention comprises a BRP nucleic acid that includes adjacent nucleotides, eg, encoding the amino acid sequence WEKPI (SEQ ID NO: 5).
[0058]
Alternatively, an isolated nucleic acid molecule of the invention comprises a BRP nucleic acid comprising adjacent nucleotides, eg, encoding the amino acid sequence LHPFNV (SEQ ID NO: 24), and in an alternative embodiment, an isolated nucleic acid of the invention The molecule includes, for example, a BRP nucleic acid that includes adjacent nucleotides that encode the amino acid sequence LKKVKV (SEQ ID NO: 25).
[0059]
Optionally, an isolated nucleic acid molecule of the invention comprises adjacent nucleotides encoding the amino acid sequences LHPFNV (SEQ ID NO: 24) and LKKVKV (SEQ ID NO: 25).
[0060]
In addition, the nucleic acid molecules of the present invention may comprise only a portion of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19 and 21, such as fragments used as probes or primers, or biologically active portions of ARP / BRP. May be included.
[0061]
The fragments provided herein have at least six (adjacent) fragments, each of sufficient length for specific hybridization in the case of nucleic acids or specific recognition of the epitope in the case of amino acids. Is defined as a nucleic acid, or a sequence of at least four (adjacent) amino acids, and at most some portions that are less than the full-length sequence. Fragments are derived from adjacent portions of either the nucleic acid or amino acid sequence of choice. Derivatives are nucleic acid or amino acid sequences formed directly from the original compound or by modification or partial substitution. An analog is a nucleic acid or amino acid sequence that is similar, but not identical, to the original compound, but has a different structure with respect to one component or side chain. Analogs may be of synthetic or different evolutionary origin, and may have similar or opposite metabolic activity compared to wild type. A homolog is a nucleic acid or amino acid sequence of a particular gene from a different species.
[0062]
When the derivatives or analogs contain the modified nucleic acids or amino acids described below, the derivatives and analogs may or may not be full length. Derivatives or analogs of the nucleic acids or proteins of the invention can be, without limitation, in various embodiments, spanning the same size nucleic acid or amino acid sequence, or alignments made by computer homology programs known in the art. A nucleic acid or protein of the invention having at least about 30%, 50%, 70%, 80%, or 95% identity (having a preferred identity of 80-95%) when compared to the aligned sequence. Molecules containing substantially homologous sites, or those that encode nucleic acids capable of hybridizing to the complement of the sequence encoding the protein under stringent, moderately stringent, or low stringency conditions. See, for example, Ausubel, et al. See, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993, and below.
[0063]
“Homologous nucleic acid sequence” or “homologous amino acid sequence” or variants thereof, relates to a sequence characterized by homology at the nucleotide or amino acid level as discussed above. Homologous nucleotide sequences encode those sequences that have been encoded for isoforms of ARP / BRP polypeptides. Isoforms can be expressed in different tissues of the same organism, for example, as a result of alternative splicing of RNA. Alternatively, the isoforms can be encoded by different genes. In the present invention, homologous nucleotide sequences include, but are not limited to, non-human species, including mammals, and thus may include mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, and others. Contains the nucleotide sequence encoding for the ARP / BKP polypeptide. Homologous nucleic acid sequences also include, without limitation, naturally occurring allelic variants and mutations of the nucleotide sequences set forth herein. Homologous nucleotide sequences, however, do not include the nucleotide sequence encoding the ARP / BRP protein. Homologous nucleic acid sequences include conservative amino acid substitutions of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 (see below), and those nucleic acid sequences that encode polypeptides having ARP / BRP activity. Including. The biological activity of ARP / BRP protein is described below.
[0064]
ARP / BRP polypeptides are encoded by the open reading frame ("ORF") of an ARP / BRP nucleic acid. The invention includes a nucleic acid sequence comprising the ORF of the nucleic acid sequence and a stretch of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 4.
[0065]
An "open reading frame" ("ORF") corresponds to a nucleotide sequence that could possibly be translated into a polypeptide. The spread of the nucleic acid containing the ORF is not interrupted by a stop codon. The ORF, which provides the coding sequence for the complete protein, begins with an ATG "start" codon and ends with one of three "stop" codons: TAA, TAG or TGA. For purposes of the present invention, an ORF may be any part of a coding sequence, with or without a start codon, a stop codon, or both. Since the ORF is considered a good candidate for encoding a real cellular protein, minimal size requirements are often set on the extent of the DNA encoding the protein, for example, 50 or more amino acids.
[0066]
The nucleotide sequence determined from the cloning of the ARP / BRP gene can be used to identify and / or clone ARP / BRP homologs from other cell types, such as other tissues, and from other mammals. Enables the production of probes and primers designed for use. Probes / primers generally comprise substantially purified oligonucleotides. The oligonucleotide generally comprises a sense strand of at least about 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, or 400 contiguous nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, Or hybridizing under stringent conditions to the anti-sense strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 17, 19, and 21, or to the natural mutation of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 17, 19, and 21. Includes a portion of the soybean nucleotide sequence.
[0067]
Probes based on ARP / BRP nucleotide sequences can be used to find transcripts encoding the same or homologous proteins, or genomic sequences. In various embodiments, the probe further comprises a label group attached thereto, for example, the label group may be a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzyme cofactor. Such probes can be used, for example, to measure the level of ARP / BRP-encoding nucleic acid in a cell sample from a subject, eg, to detect ARP / BRP mRNA levels, or to mutate or delete the genomic ARP / BRP gene. Can be used as part of a diagnostic test kit to identify cells or tissues that mis-express the ARP / BRP protein.
[0068]
A "polypeptide having a bioactive portion of ARP / BRP" is analogous to the activity of the polypeptide of the invention, including the mature form, as measured by a particular biological assay, with or without dose dependence. , But need not be the same. The nucleic acid fragment encoding the “biologically active ARP / BRP polypeptide” is SEQ ID NO: 1 encoding a polypeptide having the biological activity of ARP / BRP (the physiological activity of the ARP / BRP protein is described below). , 3, 17, 19, and 21 are isolated, the encoded portion of the ARP / BRP protein is expressed (eg, by recombinant expression in vitro), and the activity of the encoded portion of ARP / BRP is determined. It can be prepared by evaluating.
[0069]
ARP / BRP variant
The present invention relates to a SEQ ID NO: 1, which results from the degeneracy of the genetic code and consequently encodes the same ARP / BRP protein as that encoded by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19 and 21. Further incorporate nucleic acid molecules that differ from the nucleotide sequences set forth in 1, 3, 17, 19, and 21. In other embodiments, the isolated nucleic acid molecules of the invention have a nucleotide sequence that encodes a protein having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22.
[0070]
In addition to the ARP / BRP nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, DNA sequence polymorphisms that lead to amino acid sequence changes may be present in the population (eg, the population). Will be recognized by those skilled in the art. Such genetic polymorphisms in the ARP / BRP gene may be present in individuals within the population due to natural alleles. As used herein, the terms "gene" and "recombinant gene" refer to a nucleic acid molecule comprising an open reading frame encoding an ARP / BRP protein, preferably a mammalian ARP / BRP protein. About. Such natural allelic variations generally result in 1-5% variance in the nucleotide sequence of the ARP / BRP gene. Any and all of the resulting ARP / BRP amino acid polymorphisms that are the result of such nucleotide variations, as well as natural allelic variations, and that do not alter the functional activity of ARP / BRP, are described in the present invention. It is intended to be within the scope of the invention.
[0071]
Moreover, nucleic acid molecules encoding ARP / BRP proteins from other species, and thereby having nucleotide sequences that differ from the sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, are within the scope of the invention. It is intended to be Natural allelic variants and homologues of the ARP / BRP cDNAs of the present invention can be obtained by using the cDNAs, or portions thereof, as hybridization probes by standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions. The ARP / BRP nucleic acids disclosed herein can be isolated based on their homology. For example, a soluble ARP / BRP cDNA can be isolated based on its homology to ARP / BRP bound to a membrane. Similarly, ARP / BRP cDNA bound to a membrane can be isolated based on homology to soluble ARP / BRP.
[0072]
Thus, in another aspect, an isolated nucleic acid molecule of the present invention is at least 6 nucleotides in length and comprises, under stringent conditions, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21. Hybridizes with a nucleic acid molecule. In other embodiments, the nucleic acid is at least 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, or 1250 nucleotides in length. In other embodiments, the isolated nucleic acid molecules of the invention hybridize to a coding region. As used herein, the term "hybridizes under stringent conditions" refers to conditions for hybridization and washing in which nucleotide sequences at least 60% homologous to each other generally remain hybridized to each other. Is intended.
[0073]
Homologs (ie, nucleic acids encoding ARP / BRP proteins from other species) or other related sequences (eg, paralogous) can be obtained by methods well known in the art for nucleic acid hybridization and cloning. It can be obtained by low, moderate or high stringency hybridization using all or part of the specific sequences used as probes.
[0074]
As used herein, the phrase "stringent hybridization conditions" refers to a condition under which a probe, primer, or oligonucleotide hybridizes to its target sequence, but to other sequences. Not about conditions. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different under different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures than shorter sequences. Generally, stringent conditions are set to be about 5 ° C. below the thermal melting point (Tm) for a particular sequence at a given ionic strength and pH. Tm is the temperature (under defined ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) at which about 50% of the probes complementary to the target sequence hybridize to the target sequence at equilibrium. Typically, 50% of the probes at Tm will equilibrate because the target sequence is present in excess. Generally, stringent conditions are pH 7.0-8.3, salt concentrations less than about 1.0 M sodium ion, typically about 0.01-1.0 M sodium ion (or other salt), And the temperature is at least about 30 ° C. for short probes, primers, or oligonucleotides (eg, 10 nt to 50 nt), and at least about 60 ° C. for longer probes, primers, and oligonucleotides. Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
[0075]
Stringent conditions are known by those skilled in the art, and can be found in Ausubel et al. , (Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.W. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Can be seen in Preferably, conditions are such that sequences that are at least 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homologous to each other remain hybridized to each other. Non-limiting examples of stringent hybridization conditions include 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% % BSA, and hybridization in high salt buffer containing 500 mg / ml of salmon sperm DNA denatured at 65 ° C., followed by one or more rounds at 50 ° C. with 0.2 × SSC, 0.01% BSA. Cleaning. An isolated nucleic acid molecule of the invention that hybridizes under stringent conditions to the sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule. As used herein, a “natural” nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule having a naturally occurring nucleotide sequence (eg, encoding a naturally occurring protein).
[0076]
In a second embodiment, it may hybridize under moderate stringency conditions to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 17, 19, and 21, or a fragment, analog, or derivative thereof. A nucleic acid sequence is provided. Non-limiting examples of moderately stringent hybridization conditions include hybridization in 6X SSC, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100 mg / ml at 55 ° C. denatured salmon sperm DNA, Subsequent one or more washes at 37 ° C. with 1 × SSC, 0.1% BSA. Other moderately stringent conditions used are well known to those skilled in the art. For example, Ausubel et al. (Eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990, GEN TRANSACTION AND PRESS REPORT, ACCESS REPORT, ACCESS REPORT, ACCESS REPORT, PRESS REVIEW checking ...
[0077]
In a third aspect, a nucleic acid sequence capable of hybridizing under low stringency conditions to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or a fragment, analog, or derivative thereof. Is provided. Non-limiting examples of low stringency hybridization conditions include 35% formamide, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA, hybridization at 40 ° C. in 10% (wt / vol) dextran sulfate, followed by 2 × SSC at 50 ° C., 25 mM One or more washes with Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, and 0.1% SDS. Other moderately stringent conditions used are well known to those skilled in the art. For example, Ausubel et al. (. Eds), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; Shilo and Weinberg, 1981, Proc NatlAcad Sci USA 78 : 6789-6792. checking ...
[0078]
Conservative mutation
In addition to naturally occurring allelic variants of the ARP / BRP sequence present in a population, those skilled in the art will appreciate that alterations are introduced by mutation into the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21. It will further be appreciated that this can lead to changes in the amino acid sequence of the encoded ARP / BRP protein without thereby altering the functional capacity of the ARP / BRP protein. For example, nucleotide substitutions resulting in amino acid substitutions of "non-essential" amino acid residues can be made in the sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21. “Non-essential” amino acid residues can vary from the wild-type sequence of ARP / BRP without altering the bioactivity, while “essential” amino acid residues are required for bioactivity. For example, it is presumed that amino acid residues conserved between the ARP / BRP proteins of the present invention are particularly difficult to control due to the change.
[0079]
Furthermore, as shown by the alignment shown in FIG. 5, it is assumed that the amino acid residues conserved among the members of the ARP / BRP protein family of the present invention are particularly difficult to control due to the change. For example, an ARP / BRP protein of the invention can include at least one cystine knot domain that is generally conserved in ARP / BRP family members and portions in ARP / BRP homologs. As such, these conserved domains are unlikely to survive the mutation. However, other amino acid residues (eg, those that are not conserved or only partially conserved between ARP / BRP protein members) may not be essential for activity and are therefore amenable to changes.
[0080]
Another aspect of the invention pertains to nucleic acid molecules encoding ARP / BRP proteins that include changes in amino acid residues that are not essential for activity. Such ARP / BRP proteins differ from the amino acid sequence from SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, but retain biological activity. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a protein that includes an amino acid sequence that is at least about 45% homologous to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22. Preferably, the protein encoded by the nucleic acid molecule is at least about 60% homologous to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, and more preferably at least about 60% homologous to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22. 70% homology, more preferably at least about 80% homology to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, even more preferably at least about 90% homology to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22; Most preferably, it is at least about 95% homologous to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22.
[0081]
An isolated nucleic acid encoding an ARP / BRP protein homologous to the proteins of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22 is characterized by one or more amino acid substitutions, additions, or deletions in the encoded protein. It can be made by introducing one or more nucleotide substitutions, additions, or deletions into the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1, 3, 17, 19, and 21 as introduced.
[0082]
Mutations can be introduced into SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 by standard techniques, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made at at least one putative non-essential amino acid residue. A "conservative amino acid substitution" is one in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged electrode side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, Threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), side chains of beta branches (eg, threonine, valine, isoleucine), and aromatics Contains amino acids with side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, deduced non-essential amino acid residues in ARP / BRP are replaced with other amino acid residues from the same side chain family. Alternatively, in other embodiments, the mutation can be introduced randomly, for example, by saturation mutagenesis, along all or part of the ARP / BRP coding sequence, such as by saturation mutagenesis, to preserve activity. The resulting mutants can be screened for ARP / BRP biological activity to identify the body. Following mutagenesis of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, the encoded protein can be expressed by any recombinant technique known in the art to reduce the activity of the protein. Can be determined.
[0083]
In one embodiment, the mutant ARP / BRP protein has the ability to form a protein: protein interaction with (1) another ARP / BRP protein, another cell surface protein, or a bioactive portion thereof, (2) Complex formation between the mutant ARP / BRP protein and the ARP / BRP ligand, (3) the ability of the mutant ARP / BRP protein to bind to intracellular target proteins or bioactive portions thereof; Protein).
[0084]
In yet other embodiments, the mutated ARP / BRP has the ability to perform the activity of a member of the glycoprotein hormone family, eg, complex formation, ie, (i) ARP / BRP protein and glycoprotein receptor, (ii) A protein very homologous to the cystine-knot family of proteins; (iii) an ARP / BRP protein with an LGR orphan G-protein paired with a receptor family member protein; and (iv) an ARP / BRP It can be assayed for binding between the protein and the glycoprotein hormone.
[0085]
Antisense
Another aspect of the present invention is that it is capable of hybridizing to or complementary to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or a fragment, analog, or derivative thereof. It relates to an isolated antisense nucleic acid molecule. An “antisense” nucleic acid comprises a nucleotide sequence that is complementary to a “sense” nucleic acid that encodes a protein, eg, complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or to an mRNA sequence. In certain aspects, provided are antisense nucleic acid molecules comprising relative sequences at about 10, 25, 50, 100, 250, or 500 nucleotides of the ARP / BRP coding strand, or all or only a portion thereof. You. Fragments, homologs, derivatives, and analogs of the ARP / BRP proteins of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, or complementary to the ARP / BRP nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 An antisense nucleic acid is further provided.
[0086]
In one embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to the "coding region" of the coding strand of the nucleotide sequence encoding ARP / BRP. The term "coding region" relates to a site in a nucleotide sequence that includes codons translated into amino acid residues (see, eg, FIG. 4). In another embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a "non-coding region" of the coding strand of a nucleotide sequence encoding ARP / BRP. The term "uncoding region" relates to 5 'and 3' sequences flanking the coding region which are not translated into amino acids (i.e., also referred to as 5 'and 3' untranslated regions).
[0087]
Given the coding strand sequences encoding ARP / BRP disclosed herein (eg, SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21), the antisense nucleic acids of the present invention are characterized by Watson and Crick, Alternatively, it is designed according to Hoogsteen's law. The antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of ARP / BRP mRNA, but is more preferably an antisense oligonucleotide to only a portion of the coding or non-coding region of ARP / BRP mRNA. For example, an antisense oligonucleotide may be complementary to a site surrounding the translation start site of ARP / BRP mRNA. Antisense oligonucleotides may be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 nucleotides in length. The antisense nucleic acids of the present invention can be assembled using chemical synthesis or oxygenic ligation using procedures known in the art. For example, antisense nucleic acids (e.g., antisense oligonucleotides) can be naturally occurring nucleotides or double stranded nucleic acids formed between the antisense and sense nucleic acids to increase the biological stability of the molecule. For example, phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides can be used, which can be chemically synthesized using variously modified nucleotides designed to increase physical stability.
[0088]
Examples of modified nucleotides that can be used in the production of antisense nucleic acids include the following: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, -(Carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosyl eosin, inosine, N6-isopentenyl adenine, 1-methylguanine , 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5 -Methoxya Nomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosyl eosin, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wibutoxosine ), Pseudouracil, queosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (V), including 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w, and 2,6-diaminopurine. Alternatively, antisense nucleic acids can be produced biologically using expression vectors subcloned in the antisense orientation. To the target nucleic acid (ie, the RNA transcribed from the inserted nucleic acid is in an antisense orientation with respect to the target nucleic acid of interest, further described in the following subsection).
[0089]
The antisense nucleic acid molecules of the invention hybridize or bind to cellular mRNA and / or genomic DNA encoding an ARP / BRP protein, thereby inhibiting, for example, transcription and / or translation of said protein. It is generally administered to a subject or produced in situ to inhibit expression. Hybridization can be by conventional nucleotide complementarity to form a stable duplex, or, for example, in the case of an antisense nucleic acid molecule, through specific interactions in the major groove of the double helix. Binds to the main strand. Examples of routes of administration of the antisense nucleic acid molecules of the invention include direct injection into a tissue site. Alternatively, antisense nucleic acid molecules can be modified to target selected cells and administered systemically. For example, for systemic administration, the antisense molecules can be used to specifically bind the receptor or antigen expressed on the selected cell surface, e.g., the antisense nucleic acid molecule to a cell surface receptor or antigen. Can be modified by linking to a peptide or antibody that binds to. Antisense nucleic acid molecules can also be delivered to cells using the vectors described herein. To achieve sufficient intracellular concentrations of the antisense molecule, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is placed under the control of a strong pol II or pol III promoter are preferred.
[0090]
In yet another aspect, the antisense nucleic acid molecules of the invention are α-anomeric nucleic acid molecules. The a-anomeric nucleic acid molecule forms a specific double-stranded hybrid with the complementary RNA, where the strands are parallel to each other, contrary to the normal β-unit (Gaultier et al. (1987)). Nucleic Acids Res 15: 6625-6641). Antisense nucleic acid molecules include 2'-o-methyl ribonucleotides (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al. (1987) FEES Lett 215: 327-330).
[0091]
Ribozyme and PNA part
By way of non-limiting example, modifications of nucleic acids include modified bases and nucleic acids whose sugar phosphate backbone has been modified or derivatized. These modifications are performed, at least in part, to increase the chemical stability of the modified nucleic acids, such that they can be used as antisense-binding nucleic acids in therapeutic applications in a subject.
[0092]
In one embodiment, the antisense nucleic acids of the invention are ribozymes. Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave single-stranded nucleic acids, eg, mRNA, that have complementary sites. Thus, ribozymes (eg, described in Hazelhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591) can be used to catalyze the cleavage of ARP / BRP mRNA transcripts, thereby producing ARP / BRP mRNA transcripts. Inhibits BRP mRNA translation. Ribozymes having specificity for ARP / BRP-encoding nucleic acids can be designed based on the nucleotide sequence of the ARP / BRP cDNA described herein (ie, SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21). . For example, a derivative of Tetrahymena L-19 IVS RNA can be assembled, wherein the nucleotide sequence of the active site is complementary to the nucleotide sequence to be cleaved in the ARP / BRP encoding mRNA. See, for example, Cech et al. U. S. Pat. No. 4,987,071; and Cech et al. U. S. Pat. No. See 5,116,742. Alternatively, ARP / BRP mRNA can be used to select a catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules. See, for example, Bartel et al. , (1993) Science 261: 1411-1418.
[0093]
Alternatively, ARP / BRP gene expression is complementary to ARP / BRP regulatory sites (eg, ARP / BRP promoter and / or enhancer) to form a triple helix that prevents transcription of the ARP / BRP gene in target cells. Can be inhibited by aiming at a unique nucleotide sequence. Generally, Helene. (1991) Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; and Maher (1992) Bioassays 14: 807-15.
[0094]
In various embodiments, the ARP / BRP nucleic acids can be modified at the base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone, for example, to improve stability, hybridization, or solubility of the molecule. For example, the deoxyribose-phosphate backbone of nucleic acids can be modified to yield peptide nucleic acids (see Hyrup et al. (1996) Bioorg Med Chem 4: 5-23). As used herein, the term "peptide nucleic acids" or "PNAs" refers to nucleic acid mimics, for example, where the deoxyribose-phosphate backbone is replaced by a pseudopeptide backbone and only the original four nucleobases are retained. DNA mimicry. The neutral backbone of PNAs has been shown to allow DNA and RNA specific hybridization under low ionic strength conditions. The synthesis of PNA oligomers is described in Hyrup et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) PNAS 93: 14670-675, using standard solid phase peptide synthesis protocols.
[0095]
ARP / BRP PNAs can be used in therapeutic and diagnostic applications. For example, PNAs can be used as antisense or antigenetic agents for sequence-specific regulation of gene expression, for example, by inducing transcription or stopping translation or inhibiting replication. ARP / BRP PNAs can be used, for example, for analysis of single base pair mutations in genes, eg, by PNA directed PCR clamping; when used in combination with other enzymes, as synthetic restriction enzymes, eg, SI nucleases (Hyrup B (Hyrup et al. (1996), above; Perry-O'Keefe (1996), supra) can also be used as primers or probes for DNA base determination and hybridization.
[0096]
In other embodiments, ARP / BRP PNAs are known, for example, by attaching a lipophilic group or other auxiliary group to PNA, forming a PNA-DNA chimera, or liposomes, or in the art. The use of other techniques for drug delivery may be modified to increase their stability or uptake into cells. For example, PNA-DNA chimeras of ARP / BRP are produced that combine the advantageous properties of PNA and DNA. Such chimeras allow for DNA recognition enzymes, such as RNase H and DNA polymerase, to interact with the DNA portion while the PNA portion provides high binding affinity and specificity. PNA-DNA chimeras can be linked using linkers of appropriate length chosen in terms of base stacking, number of nucleobase linkages, and orientation (Hyrup (1996) supra). The synthesis of PNA-DNA chimeras is described in Hyrup (1996) supra, and in Finn et al. (1996) Nucl Acids Res 24: 3357-63. For example, DNA strands are synthesized on a solid support using standard phosphoramidite coupling chemistry and modified nucleoside analogs, such as 5 '-(4-methoxytrityl) amino-5'-deoxy. -Thymidine phosphoramidite can be used between the PNA and the 5 'end of the DNA (Mag et al. (1989) Nucl Acid Res 17: 5973-88). The PNA monomers are then connected stepwise to produce a chimeric molecule having a 5 'PNA SEQent and a 3' DNA SEQment (Finn et al. (1996) supra). Alternatively, chimeric molecules can be synthesized using a 5 'DNA SEQent and a 3'PNA SEQent. See Petersen et al (1975) Bioorg Med Chem Lett 5: 1119-11124.
[0097]
In other embodiments, the oligonucleotide may contain other additional groups, such as peptides (eg, to target host cells in vivo), or cell membranes (eg, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.). SA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci.84: 648-652; PCT Publication No. W088 / 09810, or the blood-brain barrier (e.g. , PCT Publication No. W089 / 10134). In addition, the oligonucleotide may be a cleavage agent (see, eg, Rrol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) or an intercalating agent (eg, Zbn, 1988, Pharm. Res. 5: 539) that causes hybridization. -549). To this end, the oligonucleotide is conjugated to another molecule, such as a peptide, a cross-linking agent that causes hybridization, a transport agent, a cleavage agent that causes hybridization, and the like.
[0098]
Nucleotide polymorphisms related to ARP / BRP genes
The invention includes nucleic acid sequences that include one or more polymorphic ARP / BRP sequences. Similarly, a method for finding bases occupying a polymorphism in an ARP / BRP sequence, and a method for finding a personalized therapeutic agent for the treatment of ARP / BRP-related pathologies based on ARP / BRP sequence polymorphisms including.
[0099]
The nucleotide polymorphism may be a single nucleotide polymorphism (SNP). SNPs occur at polymorphic sites occupied by one nucleotide, a site rich in variation between allelic sequences. The sites are usually preceded and followed by highly conserved sequences of the allele (eg, sequences that vary in less than 1/100 or 1000/1 members of the population). Single nucleotide polymorphisms usually result from the replacement of one nucleotide for another at the polymorphic site. Rearrangement is the replacement of one purine by another purine, or the replacement of one pyrimidine by another pyrimidine. A transversion is the replacement of a purine by a pyrimidine and vice versa. Single nucleotide polymorphisms can also result from nucleotide deletions or insertions relative to a reference allele.
[0100]
For example, a polymorphism according to the present invention includes a sequence polymorphism in the ARP gene in which the adenosine at nucleotide 342 is replaced by cytosine (FIG. 27). This results in an amino acid change to Leu's Phe at position 114 of the ARP polypeptide sequence. In some embodiments, the polymorphic sequence comprises the nucleotide sequence of the ARP gene wherein nucleotide 342 is any nucleotide other than adenosine.
[0101]
In some embodiments, the polymorphic sequence comprises any full-length ARP / BRP. In other embodiments, the polymorphic sequence comprises a polynucleotide that is 10-100 nucleotides, 10-75 nucleotides, 10-50 nucleotides, or 10-25 nucleotides in length.
[0102]
ARP / BRP protein
One aspect of the present invention relates to isolated ARP / BRP proteins and their biologically active portions, or derivatives, fragments, analogs, or homologs thereof. Also provided are polypeptide fragments suitable for use as immunogens to raise anti-ARP / BRP antibodies. In one embodiment, the native ARP / BRP protein can be isolated from a cell or tissue source by a suitable purification scheme using standard protein purification techniques. In another embodiment, the ARP / BRP protein is produced by recombinant DNA technology. As an alternative to recombinant expression, ARP / BRP proteins or polypeptides can be synthesized chemically using standard peptide synthesis techniques. ARP / BRP proteins can be glycosylated at one or more sites. Alternatively, the ARP / BRP protein is not glycosylated.
[0103]
An “isolated” or “purified” protein, or biologically active portion thereof, is substantially free of cellular material or other contaminating proteins from cell or tissue sources from which the ARP / BRP protein is derived. When chemically synthesized or substantially free of chemical precursors or other chemicals. The term "substantially free of cellular material" includes pretreatment of the ARP / BRP protein in the protein from which it is isolated or separated from the cellular components of the recombinantly produced cell. . In one embodiment, the term "substantially free of cellular material" refers to less than about 30 (dry weight) non-ARP / BRP protein (also referred to herein as "contaminating protein"), More preferably, less than about 20% non-ARP / BRP protein, even more preferably, less than about 10% non-ARP / BRP protein, and most preferably, less than about 5% non-ARP / BRP protein. Includes processing. When the ARP / BRP proteins or bioactive portions thereof are produced recombinantly, it is likewise preferably substantially free of medium, ie, the medium is less than about 20% of the amount of the protein preparation, more preferably Corresponds to less than about 10%, most preferably less than about 5%.
[0104]
The term "substantially free of chemical precursors or other chemicals" refers to ARP / BRP proteins in proteins separated from chemical precursors or other chemicals involved in protein synthesis. Pre-processing. In one embodiment, the term "substantially free of chemical precursors or other chemicals" refers to less than about 30% (dry weight) of chemical precursors or non-ARP / BRP chemicals, more preferably Is less than about 20% of a chemical precursor or non-ARP / BRP chemical, even more preferably less than about 10% of a chemical precursor or non-ARP / BRP chemical, and most preferably less than about 5%. Includes ARP / BRP protein pretreatment with chemical precursors or non-ARP / BRP chemicals.
[0105]
The biologically active portion of the ARP / BRP protein comprises the amino acid sequence of the ARP / BRP protein, eg, less than the full length amino acids of the ARP / BRP protein, and exhibits at least one activity of the ARP / BRP protein; 4, 18, 20, and 22 are sufficiently homologous to or include amino acid sequences derived therefrom. Generally, a bioactive moiety comprises a domain or motif having at least one activity of an ARP / BRP protein. The bioactive portion of the ARP / BRP protein can be, for example, a polypeptide that is 10, 25, 50, 100 amino acids, or longer.
[0106]
In one embodiment, the bioactive portion of the ARP / BRP protein comprises at least one cystine knot domain that is unique to the glycoprotein family of proteins.
[0107]
In yet other embodiments, the bioactive portion of the ARP protein comprises at least one of the second loop N-linked glycosylation sites that are unique to the glycoprotein hormone family of proteins, and optionally the alpha subunit of the hormone.
[0108]
It is understood that the bioactive portion of the ARP / BRP protein of the present invention contains at least one of the above defined structural domains. Moreover, other bioactive portions in which other portions of the protein have been deleted can be prepared by recombinant techniques and evaluated for one or more of the functional activities of the native ARP / BRP protein.
[0109]
In one embodiment, the ARP / BRP protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22. In other embodiments, the ARP / BRP proteins are substantially homologous to SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, and are functionally equivalent to the proteins of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22. But differ in amino acid sequence by natural allelic variation or mutagenesis, as described in detail below. Therefore, in another embodiment, the ARP / BRP protein is a protein comprising an amino acid sequence that is at least about 45% homologous to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22; It retains the functional activity of 4, 18, 20, and 22 ARP / BRP proteins.
[0110]
In other embodiments, the ARP / BRP protein is a protein having an amino acid sequence 55% homologous to the cystine knot domain of SEQ ID NO: 2 (eg, for amino acid residues 30-129 or 21-124). . Another embodiment of the present invention relates to an isolated ARP / BRP protein having the cystine knot domains of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, and at least 65%, preferably 75%, 85% Or 95% homologous amino acid sequences (e.g., for amino acid residues 31-124). In one embodiment, the ARP / BRP protein retains the functional activity of the ARP / BRP proteins of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22.
[0111]
ARP / BRP multimer
Similarly, protein multimers (ie, polymers) of ARP and BRP are provided by the present invention. For example, the multimer is a dimer, trimer, or tetramer. The multimer comprises an ARP or BRP protein or a biologically active portion thereof, or a derivative, fragment, analog or homolog thereof, and a second polypeptide. Multimeric polypeptides interact covalently, eg, with disulfide bonds, or non-covalently. Alternatively, the multimeric polypeptides are chemically linked.
[0112]
The ARP and ARP / BRP polypeptides or fragments thereof of the present invention can be used, for example, in combination with other related glycoprotein hormones such as luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and placenta. A large amount of other alpha or beta glycoprotein subunits to produce a functional glycoprotein hormone with similar, altered, or enhanced activity to that of gonadotropin (hCG) May form a body. The multimer may be a homopolymer (ie, ARP-ARP, BRP-BRP), or a heteropolymer having a second polypeptide. The second polypeptide may be from the same species of ARP or BRP. Alternatively, the second polypeptide may be from a different species. Preferably, the second polypeptide is a BRP heteropolymer comprising, for example, BRP protein and alpha glycoprotein subunits or fragments thereof. Alternatively, the second polypeptide is a cystine knot protein. Examples of alpha glycoprotein subunits include Genbank accession numbers AAH10957 and CAC43234. Preferably, the BRP polypeptide forms a multimer with the ARP polypeptide. More preferably, the BRP polypeptide forms a multimer having the polypeptide of SEQ ID NO: 18 and biologically active portions thereof, or derivatives, fragments, analogs, or homologs thereof. Alternatively, the ARP heteropolymer comprises an ARP polypeptide and a beta glycoprotein subunit. Examples of beta glycoprotein subunits include Genbank accession numbers P01225 and P18842. Preferably, the ARP polypeptide forms a multimer with the BRP polypeptide.
[0113]
Also provided are polypeptide fragments suitable for use as immunogens for raising anti-ARP or BRP multimeric antibodies. In one embodiment, the native ARP or BRP multimer can be isolated from a cell or tissue source by a suitable purification scheme using standard protein purification techniques. In other embodiments, ARP or BRP multimers are produced by recombinant DNA technology. As an alternative to recombinant expression, ARP or BRP multimers can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques. ARP or BRP multimers can be glycosylated at one or more sites. Alternatively, ARP or BRP multimers are not glycosylated.
[0114]
Determining homology between two or more sequences
To determine the percent homology of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences were aligned for optimal comparison (e.g., leaving a gap for optimal alignment with a secondary amino or nucleic acid sequence). One amino acid or nucleotide sequence). The amino acid residue or nucleotide at the corresponding amino acid position or nucleotide position is then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, and the molecules are homologous at that position (ie, as used herein, "Homology" of an amino acid or nucleic acid corresponds to amino acid or nucleic acid "identity."
[0115]
Nucleic acid sequence homology can be determined as the degree of identity between two sequences. Homology may be determined using computer programs known in the art, for example, GAP software provided in a GCG program package. See Needleman and Wunsch 1970 JMol Biol 48: 443-453. When using GCG GAP software with a gap creation penalty of 5.0 and a gap extension penalty of 0.3 for nucleic acid sequence comparison, the coding region of the analog nucleic acid sequence referred to above is SEQ ID NO: 1, 3, 17, 19, and 21 with at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% of the CDS (coding) portion of the DNA sequence shown. Indicates the degree of identity.
[0116]
The term “sequence identity” relates to the degree of identity between two polynucleotide or polypeptide sequences, based on a comparison of specific sites, residue by residue. The term "percentage of sequence identity" refers to comparing two optimally aligned sequences on a comparison region and identifying identical nucleobases (for nucleic acids, for example, A, T, C, G, U, or I ) Counts the number of positions that occur in both sequences to get the number of matched positions, divides the number of matched positions by the total number of positions in the comparison area (ie, window size), and multiplies the result by 100 Calculated by obtaining the percentage of sequence identity. The term "sufficient identity", as used herein, means at least 80 percent sequence homology, preferably at least 85 percent identity, and often 90 percent, compared to a reference sequence above a comparison site. It refers to a characteristic of a polynucleotide sequence comprising sequences that have 〜95 percent sequence identity, more usually at least 99 percent sequence identity.
[0117]
Chimeric and fusion proteins
The present invention also provides ARP / BRP chimeras, or fusion proteins. As used herein, an ARP / BRP “chimeric protein” or “fusion protein” includes an ARP / BRP polypeptide optionally linked to a non-ARP / BRP polypeptide. Alternatively, the ARP / BRP fusion protein is a multimer, eg, a homodimer, or a heterodimer. “ARP / BRP polypeptide” refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to ARP / BRP, while “non-ARP / BRP polypeptide” refers to a protein that is not substantially homologous to the ARP / BRP protein, eg, ARP / BRP. The present invention relates to a BRP protein and a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein different from that derived from the same or different organism. Among the ARP / BRP fusion proteins, the ARP / BRP polypeptide corresponds to all or a part of the ARP / BRP protein. In one embodiment, the ARP / BRP fusion protein comprises at least one bioactive portion of the ARP / BRP protein. In other aspects, the ARP / BRP fusion protein comprises at least two bioactive portions of the ARP / BRP protein. In yet another aspect, the ARP / BRP fusion protein comprises at least three bioactive portions of the ARP / BRP protein. Among the fusion proteins, the term "operably linked" is intended to indicate that the ARP / BRP polypeptide and the non-ARP / BRP polypeptide are fused frame by frame to each other. The non-ARP / BRP polypeptide is fused to the N-terminus or C-terminus of the ARP / BRP polypeptide.
[0118]
For example, in one embodiment, the ARP / BRP fusion protein comprises an ARP / BRP cystine knot domain or a glycoprotein hormone beta subunit domain operatively linked to an extracellular domain of a second protein. . Such fusion proteins can be further utilized in screening assays for compounds that modulate ARP / BRP activity (such assays are described in detail below).
[0119]
In one embodiment, the fusion protein is a GST-ARP / BRP fusion protein in which the ARP / BRP sequence is fused to the C-terminus of a GST (ie, glutathione S-transferase) sequence. Such a fusion protein may facilitate purification of the recombinant ARP / BRP.
[0120]
In another embodiment, the fusion protein is an ARP / BRP protein containing a heterologous signal sequence at its N-terminus. For example, the native BRP signal sequence MKLAFLLLGPMALLLLAGYGCLG (for amino acids 1 to 23 of SEQ ID NO: 2, ie, SEQ ID NO: 2) can be removed and replaced with a signal sequence from another protein. Alternatively, the native ARP signal sequence MPMASPQTLVLYLLVLAVTEAWG (for SEQ ID NO: 28, ie, amino acids 1-25 of SEQ ID NO: 18) can be removed and replaced with a signal sequence from another protein. In certain host cells (eg, mammalian host cells), expression and / or secretion of ARP / BRP can be enhanced through use of a heterologous signal sequence. In certain embodiments, the signal sequence of the ARP / BRP protein is removed and replaced by the signal sequence of the hCG beta subunit (MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA; SEQ ID NO: 11) to promote ARP / BRP secretion.
[0121]
In yet another aspect, the invention includes a known glycoprotein hormone having an ARP / BRP second loop domain replaced by the hormone's native second loop domain. For example, the amino acid ETWEKPILEPPYIEAHRHRV (SEQ ID NO: 12), which contains the second loop domain of the BRP protein, can be placed in the CG beta subunit to produce an hCG analog with alternative activity. The obtained fusion protein is shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 13).
[0122]
In a further aspect, the fusion protein is an ARP / BRP protein containing a heterologous seatbelt domain from a known glycoprotein hormone beta subunit, eg, FSH, TSH, LH, or hCG. For example, this may stabilize interaction with the alpha subunit or affect receptor binding. For example, the sequence of the BRP protein up to the last cysteine is fused to residues 95-111 of FSH beta (see FIG. 11; SEQ ID NO: 14). In various embodiments, the ARP / BRP protein is further modified by replacing any amino acid within amino acids 1-75 of the ARP / BRP protein with cysteine. In one embodiment, cysteine replaces glycine at position 51 of BRP. In an alternative embodiment, cysteine replaces leucine at position 52 of BRP.
[0123]
In one embodiment, the fusion protein is an ARP / BRP immunoglobulin fusion protein in which an ARP / BRP sequence comprising primarily a cystine knot domain is fused to a sequence from a member of the immunoglobulin protein family. An ARP / BRP-immunoglobulin fusion protein of the invention is incorporated into a pharmaceutical composition and administered to a subject to inhibit the interaction between ARP / BRP ligand and ARP / BRP protein on the surface of cells. Thus, ARP / BRP-mediated signal conversion in a living body can be suppressed. ARP / BRP-immunoglobulin fusion proteins can be used to affect the bioavailability of ARP / BRP cognate ligands. Inhibitory effects of the ARP / BRP ligand / ARP / BRP interaction may be useful as treatments for the treatment of both proliferation and differentiation disorders, and for modulating (eg, promoting or suppressing) cell survival. Moreover, the ARP / BRP-immunoglobulin fusion protein of the present invention is used as an immunogen for the production of anti-ARP / BRP antibodies in a subject, purifying ARP / BRP ligand, and ARP / BRP and ARP / It can be used in screening assays to identify molecules that inhibit BRP ligand interaction.
[0124]
ARP / BRP chimeric or fusion proteins of the present invention can be produced by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA encoding different polypeptide sequences can be prepared by conventional techniques, for example, blunt or staggered ends for ligation, restriction enzyme digestion to provide suitable ends, appropriate cohesive end compensation, undesired ligation. Are ligated together frame by frame by utilizing alkaline phosphatase treatment to avoid and enzymatic ligation. In other embodiments, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques, including automatic DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of a gene fragment is performed using anchor primers that produce a complementary overhang between two consecutive gene fragments that can subsequently be annealed to produce a chimeric gene sequence and re-amplified. (See, for example, Ausubel et al. (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Moreover, many expression vectors are commercially available that already encode a fusion moiety (eg, a GST polypeptide). The nucleic acid encoding ARP / BRP can be cloned into such an expression vector such that the fusion moiety is linked in frame to the ARP / BRP protein.
[0125]
ARP / BRP agonists and antagonists
The present invention also relates to mutant forms of the ARP / BRP protein that function as ARP / BRP agonists (mimics) or ARP / BRP antagonists. Variants of the ARP / BRP protein can be produced by mutagenesis, such as by separate point mutations or truncation of the ARP / BRP protein. An agonist of the ARP / BRP protein may have substantially the same or a portion of the native biological activity of the ARP / BRP protein. An antagonist of the ARP / BRP protein may, for example, antagonize and bind to a downstream or upstream member of a signaling cascade of cells involved in the ARP / BRP protein, thereby effecting one or more of the activities of the native form of the ARP / BRP protein. Can inhibit. Thus, a specific biological effect can be elicited by treatment with a variant of limited function. In one embodiment, treatment of a subject with a variant having a portion of the native biological activity of the protein has fewer side effects in the subject related to treatment with the native form of the ARP / BRP protein.
[0126]
Mutants of the ARP / BRP protein that function as ARP / BRP agonists (mimics) or ARP / BRP antagonists can be obtained by combining a mutant form of the ARP / BRP protein with respect to ARP / BRP protein agonist or antagonist activity, such as a truncated mutant form. It can be confirmed by rally screening. In one embodiment, a populated library of ARP / BRP variants is produced by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level and is encoded by a populated gene library. A full library of ARP / BRP variants can be used, for example, in which a degenerate set of potential ARP / BRP sequences can be expressed as individual polypeptides or as a larger set of fusion proteins (eg, phage Can be produced by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides into a gene sequence such that it contains a set of ARP / BRP sequences (for display). There are methods that can be used to produce libraries of various potential ARP / BRP variants from degenerate oligonucleotide sequences. Chemical synthesis of the degenerate gene sequence can be performed by an automatic DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector. The use of a degenerate set of genes allows for the provision of all of the sequences encoding the desired set of potential ARP / BRP sequences as one mixture. Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are known in the art (eg, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) AnnuRevBiochem 53: 323; Itakura et al. (1984) Science). Ike et al. (1983) NudAcid Res 11: 477).
[0127]
Polypeptide library
In addition, a library of fragments of the ARP / BRP protein coding sequence can be used to produce a dense set of ARP / BRP fragments for screening and subsequent selection of ARP / BRP protein variants. In one embodiment, the library of coding sequence fragments is treated with a nuclease under conditions where nicking occurs only once per molecule to treat the double-stranded PCR fragment of the ARP / BRP coding sequence to denature the double-stranded DNA. The DNA is reconstituted to form double-stranded DNA containing sense / antisense pairs from different nicked products and treated with SI nuclease to remove the single-stranded portion from the reformed double-strand And ligating the resulting fragment library into an expression vector. In this way, expression libraries encoding N-terminal and internal fragments of various sizes of ARP / BRP protein can be obtained.
[0128]
Several techniques are known in the art for screening gene products of combinatorial libraries produced by point mutation or truncation, and for screening cDNA libraries for gene products having selected properties. ing. Such techniques are applicable for rapid screening of gene libraries produced by combined ARP / BRP protein mutagenesis. The most widely used technique for screening large gene libraries that can withstand high-throughput analysis is to clone the gene library into a replicable expression vector and to make the resulting library of vectors more suitable. Transforming a cell and detecting the desired activity generally involves expressing the combinatorial gene under conditions that facilitate the isolation of a vector encoding the gene whose product will be detected. A new technique for increasing the degree of functional mutations in the library, Recruitable Ensemble Mutagenesis (REM), is combined with screening assays to identify ARP / BRP variants in (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6: 327-331).
[0129]
Anti-ARP / BRP antibody
The present invention provides antibodies and antibody fragments, such as F, that immunospecifically bind to any polypeptide, such as an ARP / BRP protein or ARP / BRP multimer of the invention._abOr (F_ab)₂Take in.
[0130]
The isolated ARP / BRP proteins, or portions or fragments thereof, are used as immunogens for producing antibodies that bind to ARP / BRP using standard techniques for preparing polyclonal and monoclonal antibodies. Can be done. While the full length ARP / BRP protein can be used, the present invention alternatively provides an antigenic peptide fragment of ARP / BRP for use as an immunogen. The antigenic peptide of ARP / BRP comprises at least 4 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 18, 20, and 22, and the antibody raised against the peptide is Includes ARP / BRP epitopes that form a specific immune complex with BRP. Preferably, the antigenic peptide comprises at least 6, 8, 10, 15, 20, or 30 amino acid residues. Longer antigenic peptides may be preferred over shorter antigenic peptides, depending on the application and methods well known to those skilled in the art.
[0131]
In certain embodiments of the invention, the at least one epitope included in the antigenic peptide is an ARP / BRP site on the surface of the protein, for example, a hydrophilic site. For methods of producing targeting antibodies, hydropathy plots showing hydrophilic and hydrophobic sites can be obtained by methods known in the art, including, for example, the Kyte Doolittle method with or without Fourier transform, or the Hopp Woods method. Manufactured by either. See, for example, Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Am. Mol. Biol. 157: 105-142, which are incorporated herein in their entirety. The Kyte-Doolittle and Hopp-Woods hydrophobicity analysis of the ARP / BRP protein sequence shown in FIGS. 8 and 9 was based on the site of the second loop (loop prediction is based on homology from the hCG beta subunit crystal structure). ) Are particularly hydrophilic and thus are expected to encode surface residues useful for the production of targeting antibodies.
[0132]
In certain embodiments, the antigenic peptide comprises the amino acid sequence CETWEKPILEPPYIEAHRHRVC (SEQ ID NO: 15). In yet another particular aspect, the antigenic peptide comprises the amino acid sequence ETWEKPILEPPYIEAHHRV (SEQ ID NO: 16).
[0133]
As disclosed herein, the ARP / BRP protein sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, or derivatives, fragments, analogs, or homologs thereof, make these protein components immunospecific. Can be used as an immunogen for the production of antibodies that bind to. As used herein, the term “antibody” specifically binds (immunoreacts with) immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, ie, antigens such as ARP / BRP. A) relating to molecules comprising an antigen binding site. Such antibodies include, without limitation, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, F_ab, And F_{(Ab ') 2}Fragments, and F_abIncludes expression library. In certain embodiments, antibodies to ARP / BRP proteins are disclosed. Various procedures known in the art include the production of polyclonal or monoclonal antibodies against the ARP / BRP protein sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, or derivatives, fragments, analogs, or homologs thereof. Used for Some of these proteins are discussed below.
[0134]
For the production of polyclonal antibodies, various suitable host animals (eg, rabbits, goats, mice, or other mammals) are immunized by injection of a native protein, or a synthetic variant thereof, or a derivative thereof. You. Suitable immunogenic preparations can include, for example, recombinantly expressed ARP / BRP proteins, or chemically synthesized ARP / BRP polypeptides. The preparation can further include an adjuvant. The various adjuvants used to enhance the immune response include, without limitation, Freund (complete and incomplete), inorganic gels (eg, aluminum hydroxide), surfactants (eg, lysolecithin, Pluronic® Polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, dinitrophenol, etc.), adjuvants such as Bacillus Calmette-Guerin (Bacille Calmette-Guerin) And Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvum) Or similar immunostimulants. If desired, antibody molecules to ARP / BRP can be isolated from mammals (eg, from blood) and further purified by well-known techniques, eg, Protein A chromatography to obtain an IgG fraction.
[0135]
As used herein, the term "monoclonal antibody" or "monoclonal antibody composition" refers to an antibody molecule that contains only one antigen binding site capable of immunoreacting with a particular epitope of ARP / BRP. Regarding the set. Thus, a monoclonal antibody composition generally exhibits a single binding affinity for a particular ARP / BRP protein with which it immunoreacts. To prepare monoclonal antibodies to a particular ARP / BRP protein, or derivative, fragment, analog, or molog thereof, any technique that provides for the production of antibody molecules by continuous cell line culture is used. . Such techniques include, without limitation, hybridoma technology for producing monoclonal antibodies (see Kohler & Milstein, 1975 Nature 256: 495-497); trioma technology; B cell hybridoma technology (Kozbor, et al.). al., 1983 Immunol Today 4:72, and EBV hybridoma technology (Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R, p.77, 96. That). Monoclonal antibodies have been utilized in the practice of the present invention and have been described by use of hybridomas (see Cote, et al., 1983. Proc NatlAcad Sci USA 80: 2026-2030), or by the Epstein-Barr virus (Epsteinin) in vitro. Barr Virus) and B cell transformation (see Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Each of the above citations is incorporated herein in their entirety.
[0136]
According to the present invention, the technology can be adapted for the production of single-chain antibodies specific for ARP / BRP proteins (see, eg, US Pat. No. 4,946,778). Further, the method may comprise a monoclonal antibody having the desired specificity for the ARP / BRP protein, or a derivative, fragment, analog, or homolog thereof._abF that allows rapid and effective identification of fragments_abAdapted for the construction of expression libraries (see, for example, Huse, et al, 1989 Science 246: 1275-1281). Non-antibodies can be "humanized" by techniques well known in the art. See, for example, U.S. Patent No. 5,225,539. Antibody fragments containing the idiotype to the ARP / BRP protein include, but are not limited to: (i) F produced by pepsin digestion of the antibody molecule._{(Ab ') 2}Fragment; (ii) F_{(Ab ') 2}F produced by reducing disulfide bridges in fragments_abFragment; (iii) F produced by treatment of the antibody molecule with papain and a reducing agent._abFragments, and (iv) F_vIt can be produced by techniques known in the art, including fragments.
[0137]
Moreover, recombinant anti-ARP / BRP antibodies, for example, chimeric and humanized monoclonal antibodies, including both parts and non-parts, that can be produced using standard recombinant DNA techniques are within the scope of the invention. Such chimeric and humanized monoclonal antibodies can be obtained using recombinant DNA techniques known in the art, for example, International Application No. US86 / 02269; European Patent Application No. 184,187; European Patent Application No. 171, 496. European Patent Application No. 173,494; PCT Publication No. 86/01533; US Patent No. 4,816,567; US Patent No. 5,225,539; European Patent Application No. 125,023; Better et a /. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Lmetal. (1987) J Immunol. 139: 3521-3526; Smetal. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al (1985) Nature 314: 446-449; Shaw et al. (1988) JNatl Cancer Inst 80: 1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan efal. (1988) Science 239: 1534; and Beidler et al. (1988) J Immunol 141: 4053-4060. Each of the above citations is incorporated herein in their entirety.
[0138]
In one embodiment, screening methodology for antibodies with the desired specificity includes, but is not limited to, immunoenzymatic assays (ELISA), and other immunology-mediated techniques known in the art. In certain embodiments, selection of an antibody specific for a particular domain of the ARP / BRP protein is facilitated by production of hybridomas that bind to a fragment of the ARP / BRP protein having such a domain. Antibodies specific for a cystine knot domain within the ARP / BRP protein, or a derivative, fragment, analog, or homolog thereof, are also provided herein.
[0139]
Anti-ARP / BRP antibodies can be used in methods known in the art relating to localization and / or quantification of ARP / BRP protein (eg, levels of ARP / BRP protein in a suitable physiological sample). Use for measurement, use for diagnostic methods, use for protein imaging, etc.). In a given embodiment, an antibody against an ARP / BRP protein, or a derivative, fragment, analog, or homolog thereof, comprising a binding domain derived from the antibody is a pharmaceutically active compound [hereinafter "Therapeutics". ].
[0140]
Anti-ARP / BRP antibodies (e.g., monoclonal antibodies) can be used for ARP / BRP isolation by standard techniques, e.g., affinity chromatography or immunoprecipitation. Anti-ARP / BRP antibodies may facilitate the purification of native ARP / BRP from cells and recombinantly produced ARP / BRP expressed in host cells. Moreover, anti-ARP / BRP antibodies can be used to detect ARP / BRP protein to assess the amount and pattern of expression of ARP / BRP protein (eg, in cell lysates or cell supernatants). Anti-ARP / BRP antibodies can be used diagnostically, for example, to monitor tissue protein levels as part of a clinical testing procedure to determine the efficacy of a given dosing regimen. Detection may be facilitated by binding of the antibody to the detectable substance (ie, physical linkage). Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; suitable fluorescent materials Examples include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol; examples of bioluminescent materials include Examples of suitable radioactive materials, including luciferase, luciferin, and aequorin, and¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S, or³H.
[0141]
ARP / BRP recombinant expression vector and host cell
Another aspect of the present invention relates to a vector, preferably an expression vector, comprising a nucleic acid encoding an ARP / BRP protein, an ARP / BRP multimer, or a derivative, fragment, analog or homolog thereof. As used herein, the term "vector" relates to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid linked thereto. One type of vector is a "plasmid," which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA SEQments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, wherein additional DNA SEQments can be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous propagation in a host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors can direct the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as "expression vectors". Generally, expression vectors useful for recombinant DNA technology are often in the form of a plasmid. As used herein, "plasmid" and "vector" may be used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the invention is intended to include other forms of expression vectors that serve equivalent functions, such as viral vectors (eg, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses that lack replication).
[0142]
A recombinant expression vector of the invention comprises a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of a nucleic acid in a host cell, wherein the recombinant expression vector is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed. Means one or more regulatory sequences selected based on the host cell used for In a recombinant expression vector, "operably linked" means that the nucleotide sequence of interest is a nucleotide (e.g., in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell). It is intended to mean linked to control sequences in a manner that allows expression of the sequence. The term "control sequences" is intended to include promoters, enhancers, and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). Such control sequences are described, for example, in Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOOY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatory sequences include those that direct essential expression of the nucleotide sequence in many types of host cells, and those that direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells (eg, tissue-specific control sequences). It will be appreciated by those skilled in the art that the design of the expression vector may depend on such factors as the choice of the host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, and the like. An expression vector of the invention can be introduced into a host cell, thereby producing a protein or peptide, including a fusion protein or peptide encoded by a nucleic acid described herein (e.g., ARP / BRP protein, ARP / BRP mutant, fusion protein, etc.).
[0143]
The recombinant expression vectors of the present invention can be designed for expression of ARP / BRP in prokaryotic or eukaryotic cells. For example, ARP / BRP stands for Escherichia coli (E. FIG. coli), Insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells, or mammalian cells. Suitable host cells are described in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternatively, the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro using, for example, a T7 promoter control sequence and T7 polymerase.
[0144]
Expression of proteins in eukaryotic cells has been described by E. coli having a vector containing a constitutive or inducible promoter, where the vector directs the expression of a molten or non-fusion protein. Most frequently performed by stiffness. Melting vectors add a significant number of amino acids to the amino terminus of the protein encoded therein, usually the recombinant protein. Such melting vectors generally serve three purposes: (1) increase the expression of the recombinant protein; (2) increase the solubility of the recombinant protein; and (3) purify the recombinant protein by acting as a ligand for affinity purification. Help. Often, in fusion expression vectors, a proteolytic cleavage site is introduced at the junction of the fusion moiety and the recombinant protein to allow separation of the recombinant protein from the fusion moiety, and subsequently to purify the fusion protein. Such enzymes and their cognate recognition sequences include Factor Xa, thrombin, and enterokinase. Typical fusion expression vectors are pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67: 31-40) in which glutathione S-transferase (GST), maltose E-binding protein, and protein A are fused to the target recombinant protein, respectively. ), PMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), And pRTTS (Pharmacia, Piscataway, NJ).
[0145]
Suitable inducible non-fusion E. coli. Examples of E. coli expression vectors are pTrc (Ammann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 1ld (Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY A.P. (1990) 60-89).
[0146]
E. FIG. One strategy to maximize recombinant protein expression in E. coli is to express the protein by a host bacterium that has impaired its ability to proteolytically cleave the recombinant protein. Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Another strategy is to use individual codons for each amino acid in E. coli. In other words, the nucleic acid sequence of the nucleic acid inserted into the expression vector is preferentially used in E. coli (W & daetal., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Such alterations of the nucleic acid sequences of the present invention can be performed by standard DNA synthesis techniques.
[0147]
In another embodiment, the ARP / BRP expression vector is a yeast expression vector. Yeast S. Examples of vectors for expression in S. cerevisae are pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBOJ 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 9333. ), PJRY88 (Schultz et al., (1987) Gem 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), And picZ (InVitrogen Corp., San Diego, Calif.).
[0148]
Alternatively, ARP / BRP can be expressed in insect cells using a baculovirus expression vector. Baculovirus vectors available for protein expression in cultured insect cells (eg, SF9 cells) include the pAc system (Smith et al. (1983) Mot Cell Biol 3: 2156-2165) and the pVL system (Luclow and Summers). (1989) Virology 170: 31-39).
[0149]
In yet another embodiment, the nucleic acids of the invention are expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195). When used in mammalian cells, the expression vector's control functions are often provided by viral control elements. For example, commonly used promoters are from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus, and simian virus 40. For other suitable expression systems for prokaryotic and eukaryotic cells, see, Sainbrook et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.W. Y. , 1989, Chapters 16 and 17.
[0150]
In other embodiments, the recombinant mammalian expression vector can direct nucleic acid expression preferentially in a particular cell type (eg, tissue-specific regulatory elements are used for nucleic acid expression). Tissue-specific control elements are known in the art. Non-limiting examples of suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev 1: 268-277), the lymph-specific promoter (Calame and Baton ( 1988) Adv Immunol 43: 235-275), especially the T cell receptor (Winoto and Baltimore (1989) EMBOJ 8: 729-733), and the promoter of the immunoglobulin (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), a promoter specific to neurons (eg, the neurofilament promoter; Byme) nd Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5577), a pancreas specific promoter (Edlund et al (1985) Science 230: 912-916), and a mammary gland specific promoter (eg, milk whey promoter; USS). Pat.No.4,873,316 and European Application Publication No.264,166). Developmentally regulated promoters are also incorporated, for example, the murine hox promoter (Kessel and Grass (1990) Science 249: 374-379) and the α-fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3: 537). -546).
[0151]
The present invention further provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule of the present invention cloned into the expression vector in an antisense orientation. That is, with the DNA molecule available, it is linked to regulatory sequences in a manner that allows (by transcription of the DNA molecule) the expression of an RNA molecule that is antisense to ARP / BRP mRNA. The control sequences operably linked to the nucleic acid cloned in the antisense orientation can be selected to direct continuous expression of the antisense RNA molecule in various cell types, eg, a viral promoter and / or Or, enhancers, or regulatory sequences, may be chosen to direct constitutive, tissue-specific or cell type-specific expression of the antisense RNA. The antisense expression vector may be in the form of a recombinant plasmid, phagemid, or attenuated virus that produces the antisense nucleic acid under the control of high efficiency control sites whose activity can be determined by the cell type into which the vector has been introduced. Absent. For a discussion of the regulation of gene expression using antisense genes, see Weintraub et al. , "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis," Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986.
[0152]
Another aspect of the present invention relates to a host cell into which the recombinant expression vector of the present invention has been introduced. The terms "host cell" and "recombinant host cell" are used interchangeably herein. It is understood that such terms relate not only to the particular cell of interest, but also to the progeny or potential progeny of such a cell. In fact, such progeny may not be the same as the parent cell, because certain modifications may occur in the next generation, either due to mutations or environmental effects, but are still used herein. Included within the scope of the term.
[0153]
Host cells may be prokaryotic or eukaryotic. For example, ARP / BRP proteins can be found in bacterial cells, such as E. coli. Coli, insect cells, yeast, or mammalian cells (eg, Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells). Other suitable host cells will be known to those skilled in the art.
[0154]
Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. As used herein, the terms "transformation" and "transfection" refer to exogenous nucleic acids, including calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection, or electroporation. It relates to various techniques recognized by the art for introducing (eg, DNA) into host cells. Suitable methods for transformation or transfection of host cells are described in Sambrook, et al. ), And other laboratory manuals.
[0155]
For stable transfection of mammalian cells, only a small portion of the cells are known to integrate exogenous DNA into their genome, depending on the expression vector and transfection technology used. . To identify and select for these elements, a gene encoding a selectable marker (eg, tolerance to antibiotics) is generally introduced into the host cell, as is the gene of interest. Various selectable markers include those that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin, and methotrexate. The nucleic acid encoding the selectable marker can be introduced into the host cell by the same vector encoding ARP / BRP, or can be introduced on a separate vector. Transfected cells with stably introduced nucleic acids can be identified by drug selection (eg, cells that have incorporated the selectable marker gene will survive while other cells die).
[0156]
A host cell of the invention, such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used for the production (ie, expression) of ARP / BRP proteins. Therefore, the present invention further provides a method for producing an ARP / BRP protein using the host cell of the present invention. In one embodiment, the method comprises using a host cell of the invention (in which a recombinant expression vector encoding ARP / BRP has been introduced) in a suitable medium in which ARP / BRP protein is produced. Culturing. In another embodiment, the method further comprises isolating ARP / BRP from the medium or the host cell.
[0157]
Transgenic animals
The host cells of the invention can also be used to produce non-human transgenic animals. For example, in one embodiment, the host cell of the present invention is a fertilized oocyte or embryonic stem cell into which a sequence encoding ARP / BRP has been introduced. Such host cells can then be used to produce non-transgenic animals in which exogenous ARP / BRP sequences have been introduced into their genome, or homologous recombinant animals in which the endogenous ARP / BRP sequences have been altered. Can be used. Such animals are useful for investigating ARP / BRP function and / or activity, and for identifying and / or evaluating modulators of ARP / BRP activity. As used herein, a "transgenic animal" is a non-animal, preferably a mammal, more preferably a rat or mouse, wherein one or more of the animal cells contains a transgene therein. It is a rodent. Other examples of transgenic animals include non-primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, amphibians, and the like. A transgene is exogenous DNA that is integrated into the genome of the cell from which the transgenic animal is made and remains in the genome of the mature animal, thereby being encoded in one or more cell types or tissues of the transgenic animal. The expression of the gene product. As used herein, "homologous recombinant animal" refers to an exogenous ARP / BRP gene in which an endogenous ARP / BRP gene has been introduced into an animal cell, eg, an exogenous animal stem cell, which has been introduced into an animal stem cell. A non-animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, altered by homologous recombination between the DNA molecules of the present invention.
[0158]
The transgenic animals of the invention introduce a nucleic acid encoding ARP / BRP into the pronucleus of a fertilized oocyte, for example, by microinjection, retroviral infection, and allow the oocyte to develop by a pseudopregnant female Foster animal. Can be produced by The ARP / BRP cDNA sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 can be introduced as a transgene into the genome of a non-animal. Alternatively, non-human homologs of the ARP / BRP gene, such as the mouse ARP / BRP gene, can be isolated based on hybridization to the ARP / BRP cDNA (described further above) and the transgene Used as Intron sequences and polyadenylation signals can also be included in the transgene to increase the efficiency of expression of the transgene. Tissue-specific control sequences can be linked to the ARP / BRP transgene so that they can be used to direct expression of the ARP / BRP protein to particular cells. Methods for the production of transgenic animals by embryonic manipulation and microinjection of certain animals, such as mice, become routine in the art and are described, for example, in US Pat. Nos. 4,736,866; 4,870,009. No. 4,873,191; and Hogan 1986, In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ; Y. It is described in. Similar methods are used for the production of other transgenic animals. A transgenic founder can be identified based on the presence of an ARP / BRP transgene in its genome and / or expression of ARP / BRP mRNA in animal tissues or cells. The transgenic founder can then be used to breed additional animals carrying the transgene. Moreover, a transgenic animal carrying a transgene encoding ARP / BRP can be bred to another transgenic animal carrying another transgene.
[0159]
For the production of a homologous transgenic animal, a vector comprising at least a part of the ARP / BRP gene in which the ARP / BRP gene has been altered, eg, deleted, added or substituted to functionally divide, Be prepared. The ARP / BRP gene can be a gene (eg, the cDNA of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21), but is more preferably a non-homolog of the ARP / BRP gene. For example, mouse homologs of the ARP / BRP genes of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21 can be used to construct homologous recombination vectors suitable for altering the endogenous ARP / BRP gene in the mouse genome. . In one embodiment, the vector is designed such that the endogenous ARP / BRP gene is functionally disrupted (ie, no longer encodes a functional protein; also referred to as a “knockout” vector) by homologous recombination.
[0160]
Alternatively, the vector may be designed such that the endogenous ARP / BRP gene is mutated or otherwise altered by homologous recombination, but still encodes a functional protein (eg, upstream regulatory The site may be altered, thereby altering the expression of the endogenous ARP / BRP protein). Within the homologous recombination vector, the altered portion of the ARP / BRP gene is flanked at the 5 'and 3' ends by additional nucleic acids of the ARP / BRP gene, and the exogenous ARP / BRP gene carried by the vector and embryonic stem cells Homologous recombination that occurs between the endogenous ARP / BRP genes of E. coli. Additional flanking ARP / BRP nucleic acids are of sufficient length for successful homologous recombination with the endogenous gene. Generally, several kilobases of flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) are included in the vector. For a description of homologous recombination vectors, see, for example, Thomas et al. (1987) Cell 51: 503. As the vector, a cell is selected by introducing the gene into the embryonic stem cell line (for example, by electroporation) and homologously transfecting the introduced ARP / BRP gene with the endogenous ARP / BRP gene (for example, Li et al. (1992) Cell 69: 915).
[0161]
Next, the selected cells are injected into blastocysts of an animal (eg, a mouse) to form an aggregation chimera. See, e.g., Bradley 1987, In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. See 113-152. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female Foster animal and the embryo is allowed to become pregnant.
[0162]
Progeny that carry homologous recombinant DNA in their germ cells can be used to breed animals in which all cells of the animal contain the homologous recombinant DNA by germline transmission of the transgene. Methods for constructing homologous recombination vectors and animals are described in Bradley (1991) Curr Opin Biotechnol 2: 823-829; PCT International Publication Nos. 90/11354; 91/01140; 92/0968; No. 93/04169 is further described.
[0163]
In other embodiments, transgenic non-human animals can be produced that contain selected systems that allow for regulated expression of the transgene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. A description of the cre / loxP recombinase system can be found, for example, in Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6322-2236. Another example of a recombinase system is Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) (O 'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355). When the cre / loxP recombinase system is used to regulate the expression of a transgene, an animal containing the transgene encoding both the Cre recombinase and the selected protein is required. Such animals can be "double" transgenic, for example, by mating two transgenic animals, one containing a transgene encoding a selected protein and the other containing a transgene encoding a recombinase. It can be provided through the construction of a transgenic animal.
[0164]
Clones of the non-transgenic animals described herein are described in Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813. Briefly, cells from a transgenic animal, eg, somatic cells, are isolated and complete the growth cycle and_OIt can be guided into a phase. The quiescent cell can then be fused to an oocyte isolated from an animal of the same species from which the quiescent cell was isolated, for example, through the use of an electrical pulse. The recombinant oocytes are then cultured to develop into morula or undifferentiated germ cells and transferred to pseudopregnant female Foster animals. The birth of the offspring of this female Foster animal is an animal clone from an isolated cell, eg, a somatic cell.
[0165]
Pharmaceutical composition
ARP / BRP nucleic acid molecules, ARP / BRP proteins, ARP / BRP multimers, and anti-ARP / BRP antibodies (also referred to herein as "active compounds") of the invention, and derivatives, fragments, analogs, And homologs can be incorporated into pharmaceutical compositions suitable for administration. Such compositions generally include the nucleic acid molecule, protein, or antibody, and a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" refers to any or all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and disintegration delaying agents that are compatible with drug administration. And the like. Suitable carriers are described in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference in the art, incorporated herein by reference. Preferred examples of such carriers or diluents include, without limitation, water, saline, finger's solutions, dextrose solution, and 5% serum albumin. Non-aqueous vehicles such as liposomes and fixed oils can also be used. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well-known in the art. Except insofar as any conventional media or agent is incompatible with the active compound, the use of them in the compositions is contemplated. Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.
[0166]
A pharmaceutical composition of the invention is formulated to be compatible with its intended route of administration. Examples of routes of administration include parenteral, eg, intravenous, intradermal, subcutaneous, oral (eg, inhalation), transdermal (topical), transmucosal, and rectal administration. Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal, or subcutaneous application can include the following components: distilled water for injection, saline, fixed oils, polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol. Or a sterile diluent such as, or another synthetic solvent; an antimicrobial agent, such as benzyl alcohol or methyl paraben; an antioxidant, such as ascorbic acid or sodium bisulfite; a chelating agent, such as ethylenediaminetetraacetic acid; acetic acid, citric acid Or a buffer substance such as phosphate and an agent for tonicity adjustment such as sodium chloride or dextrose. pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. The parenteral preparation can be enclosed in ampules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.
[0167]
Pharmaceutical compositions suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or suspensions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or suspensions. I have. For intravenous administration, suitable carriers include saline, bacteriostatic water, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, NJ), or phosphate buffered saline (PBS). In. In all cases, the composition must be sterile and should be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and mold. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersants, and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbite, sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0168]
Sterile injectable solutions incorporate the required amount of active compound (eg, ARP / BRP protein or anti-ARP / BRP antibody) in a suitable solution having one or a combination of the above-listed components; If necessary, it can be prepared by successively sterilizing by filtration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preparation method will consist of vacuum drying and freeze-drying to obtain a powder of the active ingredient from those solutions which has been previously filter sterilized, and any further desired ingredients It is.
[0169]
Oral compositions generally include an inert diluent or an edible carrier. They can be enclosed in gelatin capsules or compressed into tablets. For the purpose of oral therapeutic administration, the active compound can be incorporated with excipients and used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions using a fluid carrier for use as a gargle can also be prepared, wherein the compound in the fluid carrier is used orally, swished and swallowed. Get swallowed or swallowed. Pharmaceutically compatible adhesives, and / or adjuvant materials can be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, troches and the like can contain any of the following ingredients, or compounds of a similar nature: binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; such as starch or lactose. Excipients, disintegrants such as alginic acid, Primogel, or corn starch; lubricants such as magnesium stearate or Sterates; lubricants such as colloidal silicon dioxide; sweeteners such as sucrose or saccharin; or peppermint. Fragrances, such as methyl salicylate, or orange fragrance.
[0170]
For administration by inhalation, the compounds are delivered in the form of an aerosol spray from pressurized container or dispenser which contains a suitable propellant, for example a gas such as carbon dioxide, or a nebulizer.
[0171]
Systemic administration may be by transmucosal or transdermal means. For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be passed are used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art, and include, for example, for transmucosal administration, detergents, bile salts, and fusidic acid derivatives. Transmucosal administration can be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. For transdermal administration, the active compounds are formulated into ointments, salves, gels, or creams as generally known in the art.
[0172]
The compounds can also be prepared in the form of suppositories for rectal delivery (eg, with conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas.
[0173]
In one embodiment, the active compounds are prepared with carriers that will protect the compound against rapid elimination from the body, such as a controlled release formulation, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydride, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid can be used. Methods for preparing such formulations will be apparent to those skilled in the art. Materials are available from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. It can also be obtained commercially from. Liposomal suspensions (including liposomes targeting infected cells with monoclonal antibodies to viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These may be prepared according to methods known to those skilled in the art, for example, as described in US Pat. No. 4,522,811.
[0174]
It is especially advantageous to formulate oral or parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, dosage unit form refers to physically discrete units suitable as a single dosage for the subject to be treated; each unit is associated with a carrier of the desired agent. It includes a predetermined quantity of the active compound calculated to produce the desired therapeutic effect. Details regarding the dosage unit forms of the present invention are due to the unique characteristics of the active compounds and the particular therapeutic effect to be achieved, as well as the inherent limitations in the art of formulating the above-described active compounds for treatment of an individual. Affected and directly dependent.
[0175]
The nucleic acid molecule of the present invention can be inserted into a vector and used as a gene therapy vector. Gene therapy vectors can be used, for example, for intravenous injection, topical administration (see U.S. Patent No. 5,328,470), or stereotactic injection (e.g., Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057). ) Can be delivered to the subject. Formulations of the gene therapy vector can include the gene therapy vector in an acceptable diluent, or can include a slow release substrate incorporating the gene delivery vehicle. Alternatively, if a perfect gene delivery vector is produced intact from recombinant cells, for example, a retroviral vector, the formulation can include one or more cells that make up the gene delivery system.
[0176]
The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.
[0177]
Uses and methods of the invention
Soluble proteins containing cystine knot domains, such as glycoprotein hormones and other growth factors, include (i) G protein-coupled receptors, (ii) other cystine knot proteins, (iii) glycoprotein hormone superfamily -Member, (iv) is known to bind to tyrosine kinase growth factor receptor. These superfamily members are multifunctional proteins that regulate a significant number of functions. Accordingly, the nucleic acid molecules, proteins, protein homologs, multimers, and antibodies described herein that contain a cystine knot domain can be used in one or more of the following methods: (a) screening assays, ( b) detection assays (e.g., histocompatibility testing); (c) predictive medicine (e.g., diagnostic assays, sign assays, observation of clinical trials, and pharmacogenomics); and (d) therapeutic methods (e.g., therapeutics and Prophylaxis). The ARP / BRP protein interacts with other cellular proteins, resulting in (i) modulation of ARP / BRP-related protein activity; (ii) regulation of cell proliferation; (iii) regulation of cell differentiation; and (iv) ) Can be used for regulation of reproductive function.
[0178]
The isolated nucleic acid molecules of the invention can be used to express ARP / BRP proteins (eg, by recombinant expression vectors in host cells for gene therapy use), ARP / BRP mRNA (eg, Or the detection of genetic damage to the ARP / BRP gene, as well as to modulate ARP / BRP activity. In addition, ARP / BRP proteins are screens of drugs or compounds that modulate the activity or expression of ARP / BRP polypeptides, multimers, or nucleic acids, and inadequate or excessive amounts of ARP / BRP proteins or multimers. Or the production of an ARP / BRP protein or multimer having reduced or abnormal activity compared to the ARP / BRP wild-type protein or multimer. (Eg, pituitary function or target organs of the pituitary gland, such as reproductive disorders affecting the adrenal gland, thyroid, gonads, or liver, such as cancer, disorders of ovulation, infertility, hypogonadism, or disorders of metabolism). Further, the anti-ARP / BRP antibodies of the present invention can be used for the detection and isolation of ARP / BRP proteins, and for modulating ARP / BRP activity.
[0179]
The present invention further relates to novel substances identified by the screening assays described above, as well as their use for the treatments described herein.
[0180]
Screening assay
The present invention relates to modulators which bind to ARP / BRP proteins or ARP / BRP multimers or which have, for example, a stimulating or interfering effect on ARP / BRP expression or ARP / BRP activity, ie candidate substances or test compounds Or, a method of identifying a substance (eg, a peptide, peptidomimetic, small molecule, or other drug) is provided (also referred to herein as a “screening assay”).
[0181]
In one embodiment, the present invention provides an assay for screening candidate substances or test compounds that bind to a membrane-bound ARP / BRP protein or polypeptide, or a bioactive portion thereof, or modulate their activity. I will provide a. The following: biological libraries; spatially addressable parallel-plane solid or solution phase libraries; synthetic library methods requiring deconvolution; "one-bead one-compound" library methods; and affinity chromatography. Test compounds of the invention can be obtained using any of the numerous approaches of combinatorial library methods known in the art, including synthetic library methods using selection. Biological library approaches are limited to peptide libraries, while the other four approaches are applicable to small molecule libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des 12: 145).
[0182]
Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art, for example, in: DeWitt et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U.S.A. S. A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U.S.A. S. A. 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33: 2061; and Gallop et al. (1994) JMed Chem 37: 1233.
[0183]
The library of compounds can be in solution (eg, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), or in beads (Lam (1991) Nature 354: 82-84), or on a chip (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacteria (Ladner US Pat. No. 5,223,409), spores (Ladner US Pat. No. 2,223,409) and plasmids (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) or by phage (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404). . 406; Cwirla et al (1990) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 87: 6378-6382; Felici (1991) JMol Biol 222: 301-310; Ladner above) is provided.
[0184]
In one embodiment, the assay involves contacting a cell that exhibits a membrane-bound ARP / BRP protein, or an ARP / BRP multimer or a bioactive portion thereof, on the cell surface with a test compound and then reacts with the ARP / BRP protein or A cell-based assay that measures the ability of a test compound to bind to a multimer. For example, the cells are of mammalian origin or yeast. The ability of the test compound to bind to the ARP / BRP protein or multimer can be measured, for example, by detecting the test compound by binding of the test compound to the ARP / BRP protein or their bioactive protein by detecting a labeled compound in the complex. Achieved by coupling with a radioisotope or oxygen label that can be measured. For example, test compounds can be labeled directly or indirectly with 125I, 35S, 14C, or 3H, and the radioisotope is detected by direct counting of radioactive emissions or scintillation counting. Alternatively, test compounds can be enzymatically labeled, for example, with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, or luciferase, and the oxygen label detected by quantification of conversion of the appropriate substrate to product. In one embodiment, the assay comprises contacting a cell expressing a membrane-bound ARP / BRP protein, or a bioactive portion thereof, on the cell surface with a known compound that binds to ARP / BRP to form an assay mixture. Contacting the assay mixture with a test compound and determining the ability of the test compound to interact with the ARP / BRP protein, wherein determining the ability of the test compound to interact with the ARP / BRP protein is known. Determining the ability of a test compound to bind preferentially to ARP / BRP or a bioactive moiety thereof as compared to a compound of formula (I).
[0185]
In other embodiments, the assay comprises contacting a cell that expresses a membrane-bound ARP / BRP protein, or multimer, or a bioactive portion thereof, on a cell surface with a test compound and treating the ARP / BRP protein, A cell-based assay that involves determining the ability of a test compound to modulate (eg, stimulate or inhibit) the activity of the body, or a bioactive portion thereof. Determining the ability of a test compound to modulate the activity of an ARP / BRP protein, or a biologically active portion thereof, is achieved, for example, by measuring the binding or interaction of the ARP / BRP protein with an ARP / BRP target molecule. As used herein, a "target molecule" is a molecule that naturally binds or interacts with an ARP / BRP protein, for example, a molecule on the cell surface that exhibits a protein that interacts with ARP / BRP, a second molecule. A molecule on the surface of a cell, a molecule in the extracellular environment, a molecule associated with the inner surface of a cell membrane, or a cytoplasmic molecule. The ARP / BRP target molecule may be a non-ARP / BRP molecule or an ARP / BRP protein, or a polypeptide of the invention. In one embodiment, the ARP / BRP target molecule facilitates transduction of an extracellular signal through the cell membrane and into the cell (eg, a signal generated by binding of the compound to a membrane-bound ARP / BRP molecule). Is a component of the signaling pathway. For example, the target may be a protein between a second cell that is catalytically active, or a protein that facilitates the connection of ARP / BRP to downstream signaling molecules.
[0186]
Determining the ability of ARP / BRP proteins to bind to or interact with ARP / BRP target molecules is achieved by one of the methods described above for direct binding measurement. In one embodiment, determining the ability of ARP / BRP proteins to bind to or interact with an ARP / BRP target molecule can be achieved by measuring the activity of the target molecule. For example, the activity of the target molecule is determined by the target (ie, intracellular Ca²⁺, Diacylglycerol, IP₃Detection of the induction of a second messenger in the cell, detection of catalytic / enzymatic activity of a suitable substrate target, ARP / BRP response linked to a nucleic acid encoding a detectable label, such as luciferase. (Including sex control elements), or by detecting a cellular response, such as cell survival, cell differentiation, or cell proliferation.
[0187]
In yet other embodiments, the assays of the invention contact an ARP / BRP protein or a bioactive portion thereof with a test compound and confirm the ability of the test compound to bind to the ARP / BRP protein or a bioactive portion thereof. This is a cell-free assay. Binding of the test compound to the ARP / BRP protein can be determined directly or indirectly as described above. In one embodiment, the assay is contacted with a known compound to which the ARP / BRP protein, or a bioactive portion thereof, ARP / BRP binds, to form an assay mixture, the assay mixture is contacted with a test compound, and the ARP / BRP Determining the ability of the test compound to interact with the BRP protein, wherein determining the ability of the test compound to interact with the ARP / BRP protein comprises comparing the ARP / BRP or their Determining the ability of the test compound to bind preferentially to the bioactive moiety of the test compound.
[0188]
In other embodiments, the assay contacts a cell expressing the ARP / BRP protein, or a bioactive portion thereof, with a test compound and modulates the activity of the ARP / BRP protein, or a bioactive portion thereof (eg, stimulates). Or a cell-free assay that involves determining the ability of a test compound to inhibit). Determining the ability of a test compound to modulate ARP / BRP protein can be accomplished, for example, by measuring the binding of the ARP / BRP protein to an ARP / BRP target molecule by one of the methods described above for measuring direct binding. Is achieved by In an alternative embodiment, determining the ability of a test compound to modulate an ARP / BRP protein is achieved by measuring the activity of the ARP / BRP protein that further modulates an ARP / BRP target protein. For example, the catalytic / enzymatic activity of the target molecule on a suitable substrate can be confirmed as before.
[0189]
In yet other embodiments, the cell-free assay comprises contacting the ARP / BRP protein or a known compound to which the bioactive moiety ARP / BRP binds to form an assay mixture, and contacting the assay mixture with a test compound. And determining the ability of the test compound to interact with the ARP / BRP protein, wherein determining the ability of the test compound to interact with the ARP / BRP protein preferentially favors the ARP / BRP target molecule. Determining the ability of the ARP / BRP protein to bind or modulate its activity.
[0190]
The cell-free assays of the present invention withstand the use of both solution or membrane bound forms of ARP / BRP. In the case of cell-free assays that include the membrane-bound form of ARP / BRP, it may be desirable to utilize a solubilizing agent such that the membrane-bound form of ARP / BRP is retained in solution. Examples of such solubilizers include n-octylglucoside, n-dodecylglucoside, n-dodecylmaltoside, octanoyl-N-methylgucamide, decanoyl-N-methylgucamide, Triton ™ X-100, Triton ™. X-114, Thesit ™, isotridecipoly (ethylene glycol ether) n, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-amino-1-propane sulfonate, 3- (3-cholamidopropyl) dimethylamniol -Includes a non-ionic surfactant such as 1-propanesulfonate (CHAPS) or 3- (3-cholamidopropyl) dimethylamniol-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO).
[0191]
In one or more embodiments of the foregoing assay method of the invention, the ARP / BRP or its ARP or BRP to facilitate the separation of the complex form from the uncomplex form of one or both proteins, as well as to accommodate automated assays. It is desirable to immobilize the target molecule. Binding of a test compound to ARP / BRP, or interaction of ARP / BRP with a target molecule in the presence or absence of a candidate compound, can be accomplished in any vessel suitable for containing the reactants. Examples of such vessels include microtiter plates, test tubes, and micro centrifuge tubes. In one embodiment, a fusion protein can be provided that adds a domain that allows the protein to bind to one or both substrates. For example, a GST-ARP / BRP fusion protein or a GST-target fusion protein can be adsorbed on a glutathione sepharose bead (Sigma Chemical, St. Louis, MO) or a glutathione-derivatized microtiter plate, which can then be adsorbed to a test compound. Alternatively, the test compound is allowed to bind to either the unadsorbed target protein or the ARP / BRP protein, and the mixture is incubated under conditions that result in complex formation (eg, physiological conditions for salt and pH). Following the incubation, the beads or wells of the microtiter plate are washed to remove any unbound components, and if the immobilized substrate is a bead, the conjugate may be, for example, directly, as described above. Or it is determined indirectly. Alternatively, the complex can be separated from the substrate and the level of ARP / BRP binding or activity determined using standard techniques.
[0192]
Other techniques for immobilizing proteins on substrates can also be used in the screening assays of the invention. For example, ARP / BRP or its target molecule can be immobilized using conjugation of biotin and streptavidin. Biotinylated ARP / BRP or target molecules can be prepared from biotin-NHS (N-hydroxy-succinimide) using techniques well known in the art (eg, a biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill), and immobilized in wells of a 96-well plate (Pierce Chemicals) coated with streptavidin. Alternatively, antibodies that are responsive to ARP / BRP or the target molecule but do not interfere with the binding of the target molecule to the ARP / BRP protein can be derivatized into the wells of the plate to bind unbound target or ARP / BRP. It can be captured in a well by antibody conjugation. Methods for detecting such a complex include, in addition to the GST-immobilized complex described above, immunodetection of the complex using an antibody that responds to ARP / BRP or the target molecule, and methods related to ARP / BRP or the target molecule. Enzyme binding assays based on the detection of the enzymatic activity being performed.
[0193]
In another embodiment, a modulator of ARP / BRP expression is identified by a method of contacting a cell with a candidate compound and measuring the expression of ARP / BRP mRNA or protein in the cell. The level of expression of ARP / BRP mRNA or protein in the presence of the candidate compound is compared to the level of expression of ARP / BRP mRNA or protein in the absence of the candidate compound. The candidate compound can then be identified as a modulator of ARP / BRP expression based on this comparison. For example, when the expression of ARP / BRP mRNA or protein is greater in the presence of the candidate compound than in its absence (statistically significantly higher), the candidate compound is stimulated with ARP / BRP mRNA or protein expression. It is confirmed. Alternatively, when the expression of ARP / BRP mRNA or protein is less in the presence of the candidate compound than in its absence (statistically significantly less), the candidate compound is identified as an inhibitor of ARP / BRP mRNA or protein expression. It is confirmed. The level of ARP / BRP mRNA or protein expression in the cell can be determined by the methods described herein for detecting ARP / BRP mRNA or protein.
[0194]
In yet another aspect of the invention, the ARP / BRP protein binds to or interacts with ARP / BRP to modulate ARP / BRP activity (“ARP / BRP binding protein” or “ARP / BRP- bp ") can be used as a" bait protein "in a two-hybrid assay or in a triple hybrid assay (eg, US Pat. No. 5,283,317; Zervos) (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) JBiol Chem 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. 993) Oncogene 8: 1693-1696; and see Brent WO94 / 10300). Such ARP / BRP binding binding proteins may be involved in signal propagation by the ARP / BRP protein, for example, as an upstream or downstream element of the ARP / BRP pathway.
[0195]
The dual hybrid system is based on the canonical nature of most transcription factors, consisting of separable DNA binding and activation domains. In short, this assay utilizes two different DNA constructs. In one construct, the gene encoding ARP / BRP is fused to a gene encoding the DNA binding region of a known transcription factor (eg, GAL-4). In other constructs, a DNA sequence from a library of DNA sequences of an unknown protein ("prey" or "sample") is fused to a gene encoding the activation region of a known transcription factor. . When the "bait" and "Ejiki" proteins are capable of interacting in vivo to form an ARP / BRP-dependent complex, the DNA binding and activation domains of transcription factors provide a close approximation. . This approximation allows for transcription of a reporter gene (eg, LacZ) that is operatively linked to a transcription control site responsive to the transcription factor. Expression of the reporter gene can be detected, and cell colonies containing a functional transcription factor can be isolated to obtain a cloned gene encoding a protein that interacts with ARP / BRP. Can be used.
[0196]
The present invention further relates to the identified novel agents identified by the above-described screening assays, and their use for treatment as described herein.
[0197]
Histocompatibility testing
The ARP / BRP sequences of the present invention can also be used to identify individuals from small biological samples. In this technique, an individual's genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes and probed on a Southern blot to yield unique bands for discrimination. The sequences of the present invention are useful as additional DNA labels for RFLP (described in "Restriction Fragment Length Polymorphism" US Pat. No. 5,272,057).
[0198]
Furthermore, the sequences of the present invention can be used to provide an alternative technique for determining the actual DNA sequence for each base in a selected portion of an individual's genome. Thus, the ARP / BRP sequences described herein can be used to make two PCR primers from the 5 'and 3' ends of the sequence. These primers are then used to amplify the DNA of the individual and subsequently sequence it.
[0199]
A panel of corresponding DNA sequences from individuals prepared in this manner may provide unique individual identification when each individual has a unique combination of such DNA sequences due to allelic differences. . The sequences of the present invention can be used to obtain such discriminating sequences from individuals and tissues. The ARP / BRP sequences of the present invention characteristically represent a portion of the genome. Allelic variation occurs to some extent in the coding regions of these sequences and more frequently in non-coding regions. Allelic variation between human individuals is estimated to occur at a frequency of about one per 500 bases. Many allelic variations are due to single nucleotide polymorphisms (SNPs), including restriction fragment length polymorphisms (RFLPs).
[0200]
Each of the sequences described herein can be used as a standard to which DNA from an individual to some extent can be compared for identification purposes. As more polymorphisms occur in non-coding regions, less sequence is required to identify an individual. The non-coding sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22 provide sufficient distinct individual discrimination with a panel of possibly 10-1,000 primers, each resulting in a non-coding amplified sequence of 100 bases. sell. When the deduced coding sequence, eg, that of SEQ ID NOs: 2, 4, 18, 20, and 22, is used, a more suitable number of primers for sufficient individual identification is 500-2,000.
[0201]
Predictive medicine
The present invention also relates to the field of predictive medicine, where diagnostic assays, indication assays, pharmacogenomics, and observations of clinical trials are used for indication (predictive) purposes, thereby treating an individual prophylactically. . Therefore, one aspect of the invention is that the individual is affected by a disease or disorder whereby the individual is associated with abnormal ARP / BRP expression or activity, such as reproductive disorders, infertility, ovulation disorders. Of ARP / BRP proteins, ARP / BRP multimers, and / or nucleic acids in the context of a biological sample (eg, blood, serum, cells, tissues) to determine if there is a risk of progression , And diagnostic assays for determining the activity of ARP / BRP and ARP / BRP multimers. The invention also provides an indication (or predictive) assay for determining whether an individual is at risk of developing a disorder related to the expression or activity of ARP / BRP proteins, multimers, nucleic acids. . For example, mutations in the ARP / BRP gene can be assayed in a biological sample. Such an assay is characterized by the expression or activity of an ARP / BRP protein, nucleic acid, or is used for an indication or predictive purpose to treat an individual prior to an indication of a related disorder. Can be.
[0202]
Another aspect of the invention is a method of measuring ARP / BRP protein, multimer, nucleic acid expression, or ARP / BRP activity of an individual, and thereby selecting an appropriate therapeutic or disease-preventive agent for the individual ("" Pharmacogenomics). Pharmacogenomics is a method of treating an individual (e.g., the genotype of an individual that has been tested to determine an individual's ability to respond to a particular substance) based on the genotype of the individual for therapeutic or prophylactic treatment of the individual. For example, a drug).
[0203]
Yet another aspect of the invention relates to observing the effect of an agent (eg, a drug or compound) on ARP / BRP expression or activity in clinical trials.
[0204]
These and other agents are described in more detail in the following sections.
[0205]
Diagnostic assays
An exemplary method of detecting the presence or absence of ARP / BRP in a biological sample is to obtain a biological sample from a test subject and to detect the presence of ARP / BRP in the biological sample. Contacting a biological sample with a compound or agent capable of detecting ARP / BRP protein, ARP / BRP multimer or nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA) encoding ARP / BRP protein. The agent for detecting ARP / BRP mRNA or genomic DNA is a labeled nucleic acid probe capable of hybridizing to ARP / BRP mRNA or genomic DNA. For example, the nucleic acid probe can be a full-length ARP / BRP nucleic acid, such as the nucleic acids of SEQ ID NOs: 1, 3, 17, 19, and 21, or at least 15, 30, 50, 100, 250, or 500 nucleotides and a string. Under gentle conditions, it can be ARP / BRP mRNA or a portion thereof that is an oligonucleotide of sufficient length to specifically hybridize to genomic DNA. Other suitable probes for use in the diagnostic assays of the invention are described herein.
[0206]
The agent for detecting ARP / BRP protein or ARP / BRP multimer is an antibody capable of binding to ARP / BRP protein or ARP / BRP multimer, preferably an antibody having a detectable label. Antibodies are polyclonal, or more preferably, monoclonal. Intact antibodies or fragments thereof (e.g., Fab or F (ab ')₂) Can be used. With respect to a probe or antibody, the term "labeled" refers to direct labeling of the probe or antibody by ligation (i.e., physical linkage), as well as to probe or antibody by reactivity with a directly labeled agent. Is intended to include indirect labeling of Examples of indirect labeling include detection of the primary antibody using a fluorescently labeled secondary antibody, and labeling the ends of the DNA probe with biotin as detected with fluorescently labeled streptavidin. . The term "biological sample" is intended to include tissues, cells, and biological fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells, and fluids that are present in a subject. That is, the detection method of the present invention can be used for detecting ARP / BRP mRNA, protein, and genomic DNA in vitro and in biological samples in vitro. For example, in vitro techniques for detection of ARP / BRP mRNA include Northern hybridizations and in situ hybridizations. In vitro techniques for detection of ARP / BRP protein include enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), Western blots, immunoprecipitations, and immunofluorescence. In vitro techniques for detection of ARP / BRP genomic DNA include Southern hybridizations. In addition, in vivo techniques for the detection of ARP / BRP protein include introducing a labeled anti-ARP / BRP antibody into a subject. For example, the antibody can be labeled with a radioactive marker whose presence and location in a subject can be detected by standard imaging techniques.
[0207]
In one embodiment, the biological sample contains protein molecules from the test subject. Alternatively, the biological sample can include mRNA molecules from the test subject or genomic DNA molecules from the test subject. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means.
[0208]
In other embodiments, the method comprises obtaining a control biological sample from a control subject, wherein the control sample comprises detecting ARP / BRP protein, multimer, mRNA, or genomic DNA in the biological sample. Contacting a compound or agent capable of detecting ARP / BRP protein, multimer, mRNA, or genomic DNA, and determining the presence of ARP / BRP protein, mRNA, or genomic DNA in the control sample, Including comparing to the presence of ARP / BRP protein, multimer, mRNA, or genomic DNA.
[0209]
The invention also includes a kit for detecting the presence of ARP / BRP in a biological sample. For example, the kit comprises the following: a labeled compound or agent capable of detecting ARP / BRP protein, multimer, or mRNA in a biological sample; for measuring the amount of ARP / BRP in a biological sample Means; and means for comparing the amount of ARP / BRP in the sample with a standard. The compound or agent can be packaged in a suitable container. The kit can further include specifications for using the kit to detect ARP / BRP proteins or nucleic acids.
[0210]
Sign assay
The diagnostic methods described herein may further be used to identify subjects with a disease or disorder associated with aberrant ARP / BRP expression or activity, or at risk of developing them. Can be used. For example, the assays described herein, such as the diagnostic assays described above, or the following assays, may involve disorders related to the expression or activity of ARP / BRP proteins, multimers, nucleic acids, such as cancer, disorders of ovulation. Can be used to identify subjects who have, are at risk of developing, infertility, or hypogonadism. Alternatively, a symptom assay may be used to identify a subject with a disease or disorder or at risk of developing. Thus, the present invention is directed to a method for detecting abnormal ARP / BRP expression or ARP / BRP expression in a test sample, wherein the ARP / BRP protein, multimer, or nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA) presence is detected from a subject. Provided is a method of identifying a disease or disorder associated with activity, wherein the presence of an ARP / BRP protein, multimer, or nucleic acid is identified as having a disease or disorder associated with abnormal ARP / BRP expression or activity. Or for diagnosis of subjects at risk of developing them. As used herein, "test sample" refers to a biological sample obtained from a subject of interest. For example, a test sample may be a biological fluid (eg, serum), a cell sample, or a tissue.
[0211]
In addition, the symptom assays described herein provide that the subject can treat an agent (eg, agonist, antagonist, pseudopeptide, pseudopeptide, etc.) for the treatment of a disease or disorder associated with abnormal ARP / BRP expression or activity. (A protein, peptide, nucleic acid, small molecule, or other drug candidate). For example, such methods can be used to determine whether a subject can be effectively treated with an agent for a disorder such as cancer, ovulation disorders, infertility, or hypogonadism. Thus, the present invention can provide a method for determining whether a subject can be effectively treated with an agent for treating a disorder associated with aberrant ARP / BRP expression, Here, a test sample is obtained and an ARP / BRP protein or nucleic acid is detected (eg, the presence of the ARP / BRP protein or nucleic acid acts to treat a disorder associated with abnormal ARP / BRP expression or activity). Diagnose whether a substance can be given to a subject).
[0212]
The methods of the present invention can also be used to detect genetic damage to the ARP / BRP gene, whereby the subject carrying the damaged gene is treated for a disorder characterized by abnormal cell proliferation and / or differentiation. Determine if there is danger. In various embodiments, the method comprises, in a cell sample from the subject, at least one alteration that affects the integrity of the gene encoding the ARP / BRP protein, or damage characterized by misexpression of the ARP / BRP gene. And detecting the presence or absence of the gene. For example, such genetic damage can be caused by (1) deletion of one or more nucleotides from the ARP / BRP gene; (2) addition of one or more nucleotides to the ARP / BRP gene; (3) ARP / BRP gene (4) chromosomal translocation of ARP / BRP gene; (5) alteration of messenger RNA transcription level of ARP / BRP gene, (6) methylation pattern of ARP / BRP gene, for example, genomic DNA (7) presence of non-wild-type splicing pattern of messenger RNA transcription of ARP / BRP gene, (8) non-wild-type level of ARP / BRP protein, (9) allele of ARP / BRP gene Deletion and (10) the presence of at least one of inappropriate post-transcriptional modifications of the ARP / BRP protein. It can be detected by verifying. As described herein, there are a number of assay techniques known in the art that can be used to detect damage in ARP / BRP genes. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means. However, any biological sample containing nucleated cells can be used, including, for example, buccal mucosal cells.
[0213]
In some embodiments, the detection of damage is accomplished by polymerase chain reaction (PCR) (see, eg, US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202), such as anchor PCR or RACE PCR, Alternatively, the use of probes / primers in the ligation chain reaction (LCR) (see, eg, Landegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) PNAS 91: 360-364). The latter may be particularly useful for detecting point mutations in the ARP / BRP gene (see Abravaya et al. (1995) Nucl Acids Res 23: 675-682). This method involves collecting a sample of cells from a patient, separating nucleic acids (eg, genomic, mRNA, or both) from the cells of the sample, and hybridizing and amplifying the ARP / BRP gene (if present). The nucleic acid sample is contacted with one or more primers that specifically hybridize to the ARP / BRP gene under conditions such that the amplification occurs, and the presence or absence of the amplification product is detected, or the size of the amplification product is measured. And comparing the length with a control sample. It is expected that PCR and / or LCR will be desirably used as a preliminary amplification step in connection with any of the techniques used to detect mutations described herein.
[0214]
Alternative amplification methods followed by detection of the amplified molecule using techniques well known to those skilled in the art include the following: autonomous sequence replication (Guatelli et al., 1990, Proc NatlAcad Sci USA 87: 1874-1878), transcription amplification. Includes the system (Kwoh, et al, 1989, Proc NatlAcad Sci USA 86: 1173-1177), Q-beta replicase (Lizardi et al, 1988, BioTechnology 6: 1197), or all other nucleic acid amplification methods. . Given the very small number of such molecules, these detection schemes are particularly useful for detecting nucleic acid molecules.
[0215]
In an alternative embodiment, mutation of the ARP / BRP gene from a sample cell may be confirmed by an altered restriction enzyme cleavage pattern. For example, sample and control DNA is isolated, (optionally) amplified, digested with one or more restriction endonucleases, and fragment length sizes are determined by gel electrophoresis and compared. Differences in fragment length size between the sample and control DNA indicate a mutation in the sample DNA. Moreover, the use of sequence-specific ribozymes (see, eg, US Pat. No. 5,493,531) can be used to score for the presence of a particular mutation due to the construction or loss of a ribozyme cleavage site.
[0216]
In other embodiments, genetic mutations in the ARP / BRP are characterized by high density arrays (Cronin et al. (1996) Mutation 7) containing hundreds or thousands of oligonucleotide probes comprising a sample and a control nucleic acid, eg, DNA or RNA. : 244-255; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). For example, ARP / BRP gene mutations are described in Cronin et al. Can be confirmed by a two-dimensional array containing the luminescent DNA probe described above. In short, a first hybridization array of probes can be used to scan through long stretches of sample and control DNA to identify base changes between sequences by creating a linear array of overlapping probes. This step allows the identification of point mutations. This step involves a second hybridization array that is complementary to all variants or mutations to be detected, and that allows the characterization of a particular mutation by using a smaller, specialized probe sequence. Continue. Each mutation array is comprised of a parallel set of probes, one complementary to the wild-type gene and the other complementary to the mutant inheritance.
[0217]
In yet other embodiments, any of the various sequence responses known in the art can be used for direct sequencing of the ARP / BRP gene, and for wild-type (control) corresponding to the sequence of the sample ARP / BRP. By comparing sequences, it can be used to detect mutations. Examples of sequence responses include those based on techniques developed by Maxim and Gilbert (1977) PNAS 74: 560, or Sanger (1977) PNAS 74: 5463. Similarly, it is contemplated that all of the various automated sequencing procedures may be utilized when performing a diagnostic assay involving sequencing by mass spectrometry (Naeve et al., (1995) Biotechniques 19: 448). (See, e.g., PCT International Publ. No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36: 127-162; and Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: pp. 138-59). .
[0218]
Other methods for the detection of mutations in the ARP / BRP gene include those in which protection from cleavage agents is used to detect mismatched bases in RNA / RNA or RNA / DNA heteroduplexes. (Myers et al. (1985) Science 230: 1242). In general, the technique of "mismatch cleavage" is formed by the hybridization of (labeled) RNA or DNA containing wild-type ARP / BRP sequences with a potential mutant RNA or DNA obtained from a tissue sample. Begin by providing a heteroduplex that is The duplex of the duplex is treated with an agent that cleaves a single-stranded portion of the duplex, such as would be caused by mismatched base pairs between the control and sample strands. For example, RNA / DNA duplexes can be treated with RNase and DNA / DNA hybrids with S1 nuclease to digest enzymatically the mismatch site. In other embodiments, either the DNA / DNA or RNA / DNA duplex can be treated with hydroxylamine or osmium tetroxide, and piperidine to digest the site of the mismatch. After digestion of the mismatch sites, the resulting material is separated by size using a denaturing polyacrylamide gel to determine the mutation site. See, e.g., Cotton et al (1988) Proc NatlAcad Sci USA 85: 4397; Saleba et al (1992) Methods Enzymol 217: 286-295. In one embodiment, control DNA or RNA can be labeled for detection.
[0219]
In yet another embodiment, the mismatch cleavage reaction identifies mismatched base pairs of double-stranded DNA in a defined system for the detection and mapping of point mutations in ARP / BRP cDNA obtained from a sample of cells. The above proteins (so-called "DNA mismatch repair" enzymes) are used. For example, E. The E. coli mutY enzyme cleaves the A of the G / A mismatch, and thymidine DNA glycosylase from HeLa cells cleaves the T of the G / T mismatch (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). According to a typical example, a probe based on an ARP / BRP sequence, such as a wild-type ARP / BRP sequence, will hybridize with cDNA or other DNA products from a test cell. The double strand is treated with a DNA mismatch repair enzyme, and cleavage products, if any, are detected by an electrophoresis protocol or the like. See, for example, U.S. Patent No. 5,459,039.
[0220]
In another embodiment, changes in electrophoretic mobility are used to confirm mutations in the ARP / BRP gene. For example, single-stranded DNA conformational polymorphisms (SSCP) have been used to detect differences in electrophoretic mobility between mutant and wild-type nucleic acids (Orita et al. (1989) Proc NatlAcad). Sci USA: 86: 2766; Cotton (1993) Mutat Res 285: 125-144; Hayashi (1992) See also Gene Anal Tech Appl 9: 73-79). Single-stranded DNA fragments of the sample and control ARP / BRP nucleic acids are denatured and regenerated. The secondary structure of single-stranded nucleic acids varies according to sequence, and the resulting change in electrophoretic mobility allows detection of even a single base change. DNA fragments can be labeled or detected with a labeled probe. The sensitivity of the assay can be increased by using RNA (rather than DNA) whose secondary structure is more sensitive to sequence changes. In one embodiment, the subject method utilizes heteroduplex analysis to separate double-stranded heteroduplex molecules based on changes in electrophoretic mobility (Keen et al. (1991) Trends Genet 7). : 5).
[0221]
In still other embodiments, migration of mutant or wild-type fragments on polyacrylamide gels containing denaturant gradients is assayed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (Myers et al ( 1985) Nature 313: 495). When DGGE is used as an assay method, the DNA is modified to ensure that it is not completely denatured by addition to a GC clamp of about 40 bp high melting point GC-rich DNA, for example by PCR. In a further embodiment, a temperature gradient is used instead of a denaturant concentration gradient to confirm the difference in mobility between control and sample DNA (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265: 12753).
[0222]
Examples of other techniques for the detection of point mutations include, without limitation, selective oligonucleotide hybridization, selective amplification, or selective primer extension. For example, oligonucleotide primers are prepared by predominantly performing known mutations and then hybridizing to the target DNA under conditions that allow hybridization only for perfect matches (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163; Saiki et al. (1989) Proc NatlAcad. Sci USA 86: 6230). When the oligonucleotide adheres to the hybridizing membrane and hybridizes to the labeled target DNA, such allele-specific oligonucleotide hybridizes to the PCR amplified target DNA or a number of different mutant forms. Soy.
[0223]
Alternatively, allele-specific amplification techniques that rely on selective PCR amplification can be used with the readily available invention. Oligonucleotides used as primers for specific amplification were placed at the center of the molecule (as amplification is dependent on differential hybridization) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 2434-2448). Or, under appropriate conditions, may carry the mutation of interest at the extreme 3 'end of one primer (Prossner (1993) Tibtech 11: 238), which mismatch can prevent or reduce polymerase extension. In addition, it is desirable to introduce a new restriction site at the mutation site to generate cleavage-based detection (Gasparini et al (1992) Mol Cell Probes 6: 1). In certain embodiments, it is expected that amplification will also be performed using Taq ligase for amplification (Barany (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 189). In such cases, ligation only occurs if a perfect match was present in the 5 'sequence at the 3' end, allowing the detection of the presence of a known mutation at a particular site by looking for the presence or absence of amplification. I do.
[0224]
The methods described herein provide a symptom or family history of a disease or condition involving, for example, an ARP / BRP gene, including, for example, at least one of the probe nucleic acids or antibody reagents described herein. It can be performed by utilizing a pre-packaged diagnostic kit, which can be conveniently used for clinical diagnosis of a patient.
[0225]
In addition, any cell type or tissue in which ARP / BRP is expressed, preferably peripheral blood leukocytes, may be utilized in the sign assays described herein. However, any biological sample containing nucleated cells, including, for example, buccal mucosal cells, can be used.
[0226]
Pharmacogenomics
Agents or modulators having a stimulatory or inhibitory effect on the activity of ARP / BRP or ARP / BRP multimers (eg, ARP / BRP gene expression) identified by the screen assays described herein include: It can be administered to an individual to treat (either prophylactically or therapeutically) a disorder associated with abnormal ARP / BRP activity (eg, cancer, impaired ovulation, infertility, or hypogonadism). In connection with such treatment, pharmacogenomics of an individual (ie, a study of the relationship between an individual's genotype and the individual's response to a foreign compound or drug) may be considered. Differences in the metabolism of the therapeutic agent can lead to significant toxicity or treatment failure by altering the relationship between pharmacologically active agent dose and blood concentration. Thus, the pharmacogenomics of an individual results in the selection of effective agents (eg, drugs) for prophylactic or therapeutic treatment based on considerations of the individual's genotype. Such pharmacogenomics can be further used to determine appropriate dosages and treatment regimens. Therefore, the activity of the ARP / BRP protein, the expression of the ARP / BRP nucleic acid, or the mutation content of the ARP / BRP gene in the individual may determine the selection of an appropriate agent for therapeutic or prophylactic treatment of the individual.
[0227]
Pharmacogenomics responds to clinically significant genetic changes in response to drugs due to the altered nature and abnormal effects of drugs in affected humans. See, for example, Eichelbaum, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1996, 23: 983-985, and Linder, Clin Chem, 1997, 43: 254-266. In general, two types of pharmacogenomic conditions can be distinguished. Genetic conditions transmitted as one factor that alters the mode of action of the drug on the body (altering drug action) or genetic conditions transmitted as one factor that alters the mode of action of the body on the drug (drug Alter metabolism). These pharmacogenomic conditions can arise as either rare defects or polymorphisms. For example, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency, the main clinical complications of which are oxidant drugs (antimalarial drugs, sulfa drugs, analgesics, nitrofurans), and hemolysis after consumption of broad bean, Hereditary enzyme disease.
[0228]
As an illustrative aspect, the activity of a drug metabolizing enzyme is a major determinant of both the strength and duration of drug action. The discovery of genetic polymorphisms of drug metabolizing enzymes (eg, N-acetyltransferase 2 (NAT2), and the cytochrome P450 enzymes CYP2D6 and CYP2C19) indicates that some patients do not have the expected drug effect or And explanations for why they may show excessive drug response and severe toxicity after taking safe amounts of the drug. These polymorphisms exhibit two phenotypes in the population: extensive metabolizers (EM) and poor metabolizers (PM). The prevalence of PM varies between different populations. For example, the gene encoding CYP2D6 is highly polymorphic, and several mutations have been identified in PM, all leading to loss of functional CYP2D6. Poor metabolizers of CYP2D6 and CYP2C19 frequently experience excessive drug response and side effects when they receive standard doses. When the metabolite is the active therapeutic moiety, PM does not show a therapeutic response as demonstrated for the analgesic effects of codeine mediated by the metabolite morphine formed by CYP2D6. Other abnormalities are so-called hypermetabolizers who do not respond to standard doses. Recently, the molecular mechanism of the ultra-high metabolizer has been identified to be due to CYP2D6 gene amplification.
[0229]
Thus, the ARP / BRP protein, the activity of the ARP / BRP multimer, the expression of the ARP / BRP nucleic acid, or the nature of the ARP / BRP gene mutation in the individual, thereby effecting the appropriate treatment or treatment of the individual. The choice of material may be determined. In addition, pharmacogenomic studies can be used to apply polymorphic alleles encoding drug metabolizing enzymes to the identification of drug-responsive phenotypes in individuals. When applied to dosing or drug selection, this knowledge may be useful when treating a subject with an ARP / BRP modulator, such as a modulator identified by one of the typical screening assays described herein. , Avoid adverse reactions or treatment failures, thereby increasing the therapeutic or prophylactic effect.
[0230]
Observing effects during clinical trials
Observing the effect of an agent (eg, drug, compound) on the expression or activity of ARP / BRP or ARP / BRP multimers (eg, the ability to modulate abnormal cell proliferation and / or differentiation) is a fundamental drug. It can be used in clinical trials as well as screening. For example, agents identified by the screening assays described herein that increase ARP / BRP gene expression, protein levels, or up-regulate ARP / BRP activity, have reduced ARP / BRP gene expression, protein levels, or can be observed by clinical trials in subjects showing down-regulated ARP / BRP activity. Alternatively, the efficacy of an agent identified by a screening assay that reduces ARP / BRP gene expression, protein levels, or down regulates ARP / BRP activity, increases ARP / BRP gene expression, protein levels , Or in clinical trials in subjects exhibiting up-regulation of ARP / BRP activity. In such clinical trials, the expression or activity of ARP / BRP, and preferably, other genes associated with, for example, cancer, impaired ovulation, infertility, or hypogonadism, may increase the immunoreactivity of particular cells. Can be used as "output" or marker.
[0231]
For example, and without limitation, treatment with an agent (eg, a compound, drug, or small molecule) that modulates ARP / BRP activity (eg, identified in a screening assay described herein). Can be used to identify genes, including ARP / BRP, that are regulated in cells. Thus, cells are isolated, RNA is prepared, and expression levels of ARP / BRP and other genes associated with the disorder are investigated, eg, in clinical trials, to investigate the effect of the agent on the cell proliferation disorder. Is analyzed. The level of gene expression (ie, gene expression pattern) can be determined by Northern blot analysis as described herein, or by RT-PCR, or measurement of protein produced by one of the methods described herein, or It can be quantified by measuring the activity level of ARP / BRP or other genes. In this way, the gene expression pattern serves as a marker indicative of the physiological response of the cell to the agent. This response state is therefore determined before and at various points during treatment of the individual with the agent.
[0232]
In one embodiment, the present invention provides (i) obtaining a pre-dose sample from a subject prior to administration of the agent; (ii) the level of expression of ARP / BRP protein, mRNA, or genomic DNA in the pre-dose sample (Iii) obtaining one or more post-administration samples from the subject; (iv) detecting the level of ARP / BRP protein, mRNA or genomic DNA expression or activity of the sample after administration; (v) administering Comparing the expression or activity level of the ARP / BRP protein, mRNA or genomic DNA of the pre-sample with the ARP / BRP protein, mRNA or genomic DNA of the post-administration sample or sample; and (vi) the dose of the agent to the subject Agents that include steps (eg, agonists, antagonists, proteins, Plastid, peptidomimetics, nucleic acids, a method of observing the effectiveness of treatment of a subject with other drug candidate substance) which was confirmed by screening assays described small molecules, or elsewhere herein. For example, increased administration of an agent may be desirable to increase ARP / BRP expression or activity to higher levels detected, ie, to increase the effectiveness of the agent. Alternatively, reduced administration of the agent may be desirable to reduce ARP / BRP expression or activity to lower levels detected, ie, to reduce the effectiveness of the agent.
[0233]
Treatment method
The present invention relates to the prevention or treatment of a subject associated with aberrant ARP / BRP expression or activity, such as a subject at risk for (or susceptible to) or having a disorder of impaired cell proliferation or regeneration. Provides both ways. In addition, BRP and ARP nucleic acids, polypeptides, and protein multimers stimulate spermatogenesis, enhance thyroid cell function (ie, increase thyroid hormone production and iodide capture), and regulate gonad function. Can be used to regulate gonadal hormone production, to promote or suppress fertility.
[0234]
Obstacle
Diseases and disorders characterized by increased levels or bioactivity (associated with a subject not afflicted with the disease or disorder) are treated with a therapeutic agent whose activity is antagonized (ie, decreased or suppressed). Therapeutics that antagonize activity may be administered in a therapeutic or prophylactic manner. Therapeutic agents that can be utilized include, without limitation, (i) the aforementioned peptides, or analogs, derivatives, fragments, or homologs thereof; (ii) antibodies to the aforementioned peptides; (iii) encoding the aforementioned peptides. Nucleic acid; (iv) "dysfunctional" (i.e., due to non-homologous insertions in the coding sequence of the coding sequence for said peptide) utilized by "knockout" of said peptide's intrinsic function by homologous recombination. Administration of antisense nucleic acids and nucleic acids (see, for example, Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292); (v) modulators that alter the interaction between the aforementioned peptides and their binding partners (ie, the invention) Inhibition involving further pseudopeptides or antibodies specific to the peptides of the invention Include agonists and antagonists), or (vi) above protein multimers.
[0235]
Diseases and disorders characterized by decreased levels or bioactivity (associated with a subject not afflicted with a disease or disorder) are treated with therapeutic agents that increase activity (ie, are agonists thereof). Therapeutic agents that increase activity may be administered in a therapeutic or prophylactic manner. Therapeutic agents that can be used include, without limitation, the aforementioned peptides, or analogs, derivatives, fragments, or homologs thereof; or agonists that increase bioactivity.
[0236]
Increasing or decreasing levels are obtained from patient tissue samples (eg, from biopsy tissue) and assayed in vitro for RNA or peptide levels, expressed peptide structure, and / or activity (or mRNA for the aforementioned peptides). Can be easily detected by quantification of the peptide and / or RNA. Methods well known in the art include, without limitation, immunological assays (eg, by Western blot analysis, immunoprecipitation, followed by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, immunocytochemistry, etc.) And / or hybridization assays to detect expression of mRNAs (eg, Northern assays, dot blots, in situ hybridizations, etc.).
[0237]
Preventive measures
In one aspect, the invention relates to abnormal ARP / BRP expression or activity in a subject by administering to the subject an agent that modulates ARP / BRP expression or at least one ARP / BRP activity. A method is provided for preventing a disease or condition. A subject at risk for a disease caused by or guided by aberrant ARP / BRP expression or activity can be identified, for example, by any combination of the diagnostic or indication assays described herein. . Administration of a prophylactic agent can be prior to any signs of symptoms characteristic of ARP / BRP abnormalities, such as preventing or slowing the progression of the disease or disorder. Depending on the type of ARP / BRP abnormality, for example, an ARP / BRP agonist or ARP / BRP antagonist agent may be used for treating the subject. Suitable agents can be determined based on the screening assays described herein. The preventive methods of the present invention are further discussed in the following subsections.
[0238]
Method of treatment
Another aspect of the invention relates to a method of modulating ARP / BRP expression or activity for therapeutic purposes. The modulation methods of the invention involve contacting a cell with an agent that modulates one or more of the ARP / BRP protein activities associated with the cell. An agent that modulates ARP / BRP protein activity can be an agent described herein, such as a nucleic acid or protein, a natural cognate ligand of the ARP / BRP protein, a peptide, an ARP / BRP pseudopeptide, or other agent. May be a small molecule. In one embodiment, the agent promotes one or more ARP / BRP protein activities. Examples of such facilitating agents include active ARP / BRP proteins and nucleic acid molecules encoding ARP / BRP introduced into cells. In other embodiments, the agent inhibits one or more ARP / BRP protein activities. Examples of such inhibitory agents include antisense ARP / BRP nucleic acid molecules, and anti-ARP / BRP antibodies. These methods of modulation can be performed in vitro (eg, by culturing cells with the agent) or in vivo (eg, by administering the agent to a subject). As such, the present invention provides a method of treating an individual suffering from a disease or disorder characterized by abnormal expression or activity of an ARP / BRP protein or nucleic acid molecule. In one embodiment, the method comprises an agent that modulates (eg, up-regulates or down-regulates) ARP / BRP expression or activity (eg, an agent identified by a screening assay described herein). Or administering a combination of agents. In another embodiment, the method comprises administering an ARP / BRP protein or nucleic acid molecule as a treatment to compensate for reduced or abnormal ARP / BRP expression or activity.
[0239]
Enhanced ARP / BRP activity is desirable in situations where ARP / BRP is abnormally down-regulated and / or where enhanced ARP / BRP activity is expected to have a beneficial effect. One example of such a situation is when the subject has a disorder characterized by abnormal cell proliferation and / or differentiation (eg, cancer). Another example of such a situation is where the subject has a reproductive disorder (eg, a disorder of ovulation or infertility).
[0240]
Confirmation of biological effect of therapeutic agent
In various aspects of the invention, suitable in vitro or in vivo assays are utilized to determine the effect of a particular therapeutic agent and whether its administration is required for treatment of the affected tissue.
[0241]
In various specific embodiments, an in vitro assay uses representative cells of a type implicated in a patient's disorder to determine whether a therapeutic agent exerts a desired effect on that cell type. Is implemented. Compounds for use in therapy may be tested in suitable animal model systems, including without limitation, rats, mice, chickens, cows, monkeys, rabbits, etc., before testing in a subject. Similarly, for in vivo testing, any of the animal model systems known in the art may be used prior to administration to a subject.
[0242]
Reproductive disorders
The aforementioned proteins and multimers have been implicated in reproductive function. Therefore, the therapeutic agents of the present invention may be useful for treating or preventing reproductive diseases or disorders. Reproductive disorders include reproductive disorders in female and male therapies. Examples of female reproductive disorders include disorders of ovulation (ie, promotion of follicular development and induction of ovulation), premenstrual syndrome, ovarian cysts, endometriosis, uterine leiomyoma, infertility, pelvic inflammatory disease, Includes vaginal spasms, and menopause. Examples of male reproductive disorders include penile disorders, scrotal disorders, prostate disorders, and infertility.
[0243]
In addition, BRP and ARP nucleic acids, polypeptides, and protein multimers promote spermatogenesis, enhance thyroid cell function (ie, increase thyroid hormone production and iodide capture), modulate gonad function, It can be used to regulate production, promote or suppress fertility.
[0244]
Malignant tumor
The aforementioned proteins and multimers have been implicated in regulating cell growth. Therefore, the therapeutics of the invention may be useful for treating or preventing a disease or disorder associated with cell hyperproliferation and / or loss of control of cell proliferation (eg, cancer, malignancies, and tumors). For the investigation of such hyperproliferative disorders, see, for example, Fishman, et al, 1985. MEDICINE, 2nd ed. , J. et al. B. Lippincott Co. See, Philadelphia, PA.
[0245]
Therapeutic agents of the invention are assayed for their efficacy in treating or preventing malignancies and disorders related thereto by any method known in the art. Such assays include, but are not limited to, in vitro assays utilizing transformed cells or cells derived from a patient's tumor, as well as in vivo assays using animal models of cancer or malignancy. Potentially effective therapeutic agents are those that inhibit the growth of tumor-derived cells or transformed cells in culture, or cause reversion of the tumor in an animal model, for example, as compared to a control.
[0246]
In the practice of the present invention, once a malignancy or cancer has been shown to be susceptible to treatment by modulating (ie, inhibiting, antagonizing, or acting) activity, the cancer Alternatively, malignancy is subsequently treated or prevented by administration of a therapeutic agent that helps regulate protein function.
[0247]
Precancerous condition
Therapeutic agents of the invention effective for the treatment or prevention of cancer or malignancy are also administered for the treatment of precancerous conditions and / or prevention of precancerous progression to neoplastic or malignant conditions. Such prophylactic or therapeutic uses are known or suspected to precede progression to neoplasms or cancer, particularly non-neoplastic cell growth, metaplasia, or most particularly consisting of hyperplasia. It is desirable in a state where dysplasia occurs. For investigations of such abnormal cell growth, see, for example, Robbins & Angell, 1976. BASIC PATHHOLOGY, 2nd ed. , W.S. B. Saunders Co. See, Philadelphia, PA.
[0248]
Hyperplasia is a form of controlled cell growth that involves an increase in cell number in a tissue or organ without significant changes in its structure or function. For example, endometrial hyperplasia has often been shown to precede endometrial cancer. Metaplasia is a form of controlled cell growth in which one type of mature or fully differentiated cell is replaced by another type of mature cell. Metaplasia may occur in epithelial or connective tissue cells. Atypia is commonly found as a precursor of cancer and is found primarily in the epithelium. Dysplasia is the most disorderly form of non-neoplastic cell growth and involves loss of individual cell homogeneity and structural orientation of the cell. Dysplasia characteristically occurs where chronic irritation or inflammation is present, and is often found in the neck, airways, oral cavity, and gallbladder.
[0249]
Alternatively, or additionally, the presence of abnormal cell growth characterized as hyperplasia, metaplasia or dysplasia in a cell sample from the patient, one or more transformed cells shown either in vivo or in vitro , Or the presence of a malignant phenotypic feature indicates the preference of prophylactic / therapeutic administration of therapeutic agents possessing the ability to modulate the activity of the aforementioned proteins. The characteristics of the transformed phenotype are without limitation: (i) morphological changes; (ii) loose substratum attachment; (iii) loss of cell-cell contact inhibition; (iv) anchorage-dependent loss. (Vi) increased sugar transport; (vii) reduced serum demand; (viii) expression of fetal antigen, (ix) loss of 250 kDal cell surface protein, and the like. See, for example, Richards, et al, 1986. MOLECULAR PATHHOLOGY, W.M. B. Saunders Co. See, Philadelphia, PA.
[0250]
In certain embodiments of the invention, patients who exhibit one or more of the following predispositions to malignancy are treated by administration of an effective amount of a therapeutic agent: (i) chromosomal translocations associated with the malignancy (eg, Philadelphia chromosome corresponding to chronic myeloid leukemia (bcr / abl), And t (14; 18) corresponding to follicular lymphoma); (ii) familial polyposis or Gardner's syndrome (a likely sign of colon cancer); (iii) undetermined monoclonal immunoglobulinemia. Importance (potential precursors of multiple myeloma), and (iv) cancer or precancerous diseases (eg familial polyposis of the colon, Gardner syndrome, hereditary exostosis) exhibiting a Mendelian (genetic) inheritance pattern Multiple endocrine neoplasia, Peutz-Jeghers syndrome, von Recklinghausen neurofibromatosis, medullary thyroid carcinoma in the form of starch, and pheochromocytoma, retinoblastoma, carotid body tumor, skin Melanoma, melanoma in the eye, xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia, Chediak-Higashi syndrome, albinism, Fanconi's aplastic poor And Bloom's syndrome) human within first degree with.
[0251]
In another embodiment, a therapeutic agent of the invention is given to a patient to prevent progression to breast, colon, ovarian, lung, pancreatic, or uterine cancer, or melanoma or sarcoma.
[0252]
Hyperproliferative and dysproliferative disorders
In one aspect of the invention, the therapeutic agent is administered for the treatment or prophylactic treatment of a hyperproliferative or benign proliferative dysfunction disorder. The efficacy of a therapeutic of the invention in treating or preventing a hyperproliferative disease or disorder is assayed by any method known in the art. Such assays include in vitro cell proliferation assays, in vitro or in vivo assays using animal models of hyperproliferative diseases or disorders, and the like. Potential effects of the therapeutic agent may promote cell growth in culture, or cause growth or cell proliferation in animal models, for example, as compared to controls.
[0253]
Certain embodiments of the invention are directed to the treatment or prevention of cirrhosis (a condition in which scarring has caught up with the normal liver regeneration process); the formation of keloids (hypertrophic scars) that makes the skin ugly, where the scarring process interferes with normal renewal. For psoriasis (a typical skin condition characterized by excessive skin growth and delayed proper cell fate); benign tumors; fibrocystic conditions, and towards tissue hypertrophy (eg, benign prostatic hyperplasia) Can be
[0254]
Cytokines and cell proliferation / differentiation activity
The ARP / BRP proteins of the invention may exhibit cytokine, cell proliferation (induction or inhibition) or cell differentiation (induction or inhibition) activity, or may induce the production of other cytokines in certain cell populations. Many protein factors discovered so far, including all known cytokines, show activity in one or more factor-dependent cell proliferation assays, thus serving as a convenient confirmation of cytokine activity. The activity of the protein of the present invention is not limited to 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9 / 11, BaF3, MC9 / G, M + (preB M +), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, Demonstrated by any of a number of routine factor-dependent cell proliferation assays for cell lines including HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e, and CMK.
[0255]
The activity of the proteins of the invention may be determined, among other means, by the following method: without limitation: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Ed by Colligan et al. , Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3 and 7); Takai et al. , JImmunol 137: 3494-3500, 1986; Bertagnoli et al, JImmunol 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et al, Cellmmunol 133: 327-341, 1991; et al, J Immunol 152: 1756-1761, 1994, and can be measured by assays for T cell or thymocyte proliferation.
[0256]
Assays for cytokine production and / or proliferation of spleen cells, lymphocytes, or thymocytes are without limitation, by Kruisbek and Shevach: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al. , Eds. Vol 1, pp. 3.12.1-14, John Wiley and Sons, Toronto 1994; and by Schreiber: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.8.1-8, John Wiley and Sons, Toronto 1994.
[0257]
Assays for proliferation and differentiation of hematopoietic and leukocyte cells are without limitation, Bottomly et al. , By: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al, eds. Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto 1991; deVries et al, JExp Med 173: 1205-1121, 1991; Moreau et al, Nature 336: 690-692, eger, 1988; , Proc Natl AcadSci U.S.A. S. A. 80: 2931-2938, 1983; by Nordan: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al, eds. Vol 1 pp. 6.6.1-5, John Wiley and Sons, Toronto 1991; SnaSa. et al, Proc Natl AcadSci U.S.A. S. A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of Interleukin 11-Bennett, et al. , By: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al, eds. Vol 1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto 1991; Cirletta, et al. , By: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al, eds. Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto 1991.
[0258]
Assays for T cell clonal responses to antigens (by measuring proliferation and cytokine production, specifically identifying proteins that affect APC-T cell interactions, and direct T cell effects) are without limitation, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al. , Eds. , Green Publishing Associates and Wiley-Literscience (Chapter 3, Chapter 6, Chapter 7); Weinberger et al, Proc NatlAcadSci USA 77: 6091-6095, 1980; Jaketal et al., J Immunol 137: 3494-3500, 1986; Takai et al. , J Immunol 140: 508-512, 1988.
[0259]
Immunostimulatory or inhibitory activity
The ARP / BRP proteins of the present invention may exhibit, without limitation, immunostimulatory or immunosuppressive activities, including assays for which assays are described herein. The protein is useful for treating various immune deficits and disorders (including severe combined immunodeficiency disease (SCID)), for example, regulating (up or down) T and / or B lymphocyte growth and proliferation, and NK cells. It may help achieve the cytolytic activity of other cell populations. These immunodeficiencies may be genetically related or caused by infections of the organism (eg, HIV), as well as by bacteria or fungi, or may result from autoimmune diseases. More particularly, infections caused by living organisms, bacteria, fungi or other infections include infections of various fungal infections such as HIV, hepatitis virus, herpes virus, mycobacteria, Leishmania species, malaria species, and candidiasis. Diseases can be treated using the protein of the present invention. Of course, in this regard, enhancement of the immune system is generally desirable, that is, the proteins of the invention are also useful when treating cancer.
[0260]
Autoimmune diseases that can be treated with the proteins of the invention include, for example, connective tissue diseases, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, autoimmune pneumonia, Guillain-Barre syndrome, autoimmunity Including thyroiditis, insulin-dependent diabetes, myasthenia gravis, graft-versus-host disease, and autoimmune inflammatory eye disease. Such proteins of the invention may be useful in treating allergic reactions and conditions, such as asthma (particularly allergic asthma), or other respiratory problems. (Suppression of immunity is desired.) Other conditions (including, for example, organ transplantation) may also be treatable with the proteins of the invention.
[0261]
It is also possible to use the proteins of the invention in immune responses by a number of methods. Down-regulation may be in a form that suppresses or blocks the immune response that is already in progress or that may prevent the induction of an immune response. Activated T cell function can be suppressed by suppressing the T cell response, or by inducing specific tolerance of the T cell, or both. Immunosuppression of T cell responses is an active, non-antigen-specific process that generally requires continuous exposure of T cells to suppressive agents. Tolerance with induction of non-reactivity or incompetence of T cells is generally distinguished from immunosuppression in that it is antigen-specific and persists after ending exposure to a tolerizing agent.
[0262]
In practice, tolerance can be evidenced by a lack of T cell response upon re-exposure to a particular antigen in the absence of a tolerizing agent.
[0263]
For example, down-regulation or prevention of one or more antigen functions (including, without limitation, B lymphocyte antigen function (eg, B7)) that prevents high levels of lymphokine synthesis by activated T cells, Useful in the context of tissue, skin, and organ transplantation, and in graft versus host disease (GVHD). For example, blocking T cell function can result in reduced tissue destruction of a tissue transplant. Generally, in tissue transplants, rejection of the transplant begins through the recognition by the T cells that it is a foreign substance, followed by an immune response that destroys the transplant. Prior to transplantation, its natural ligand on cells immunized with B7 lymphocyte antigen (eg, the soluble, monomeric form of a peptide with B7-2 activity, alone or with another B lymphocyte antigen (eg, B7- 1, the administration of a molecule which has the activity of B7-3) or inhibits or blocks its interaction with (in the state of binding to the monomeric form of the peptide which blocks the antibody) no transmission of costimulatory signals Can lead to the binding of the molecule to the natural ligand (s) on immune cells. Blocking the B lymphocyte antigen function of this problem prevents cytokine synthesis by immune cells such as T cells, thereby acting as an immunosuppressant. Moreover, the lack of costimulation is also sufficient for T cell activation, thereby inducing tolerance in the subject. Induction of long-term tolerance by reagents that block B lymphocyte antigens may obviate the need for repeated administration of these blocking reagents. To achieve sufficient immunosuppression or tolerance in a subject, it may also be necessary to block B lymphocyte antigen function.
[0264]
The efficacy of a particular blocking reagent in preventing organ transplant rejection or GVHD can be evaluated using animal models that predict efficacy in humans. Examples of suitable systems that can be used include allogeneic heart transplants in rats and xenogeneic pancreatic islet cell transplants in mice, see Lenschow et al. , Science 257: 789-792 (1992), and Turka et al, Proc Nati Acad Sci USA, 89: 11102-11105 (1992), both of which test the immunosuppressive effects of CTLA4Ig fusion proteins in vivo. Used in In addition, a mouse model of GVHD (see Paul ed., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847) has been shown in vivo to block B lymphocyte antigen function during disease progression. Can be used to confirm the effect.
[0265]
Interfering with antigen function may also be useful therapeutically for the treatment of autoimmune diseases. Many autoimmune diseases are responsive to self-tissue and are the result of inappropriate activation of T cells that promote cytokine production, as well as autoantibodies that are involved in the pathology of the disease. Preventing activation of self-responsive T cells may reduce or eliminate symptoms. Administration of reagents that interfere with T cell co-stimulation by disrupting the receptor: B lymphocyte antigen receptor: ligand interaction suppresses T cell activation and is derived from autoantibodies or T cells involved in disease processes Can be used to prevent the production of cytokines. Moreover, blocking reagents may induce antigen-specific tolerance of auto-reactive T cells, which may result in long-term disease relief. The efficacy of a blocking reagent to prevent or mitigate an autoimmune disease can be determined using a number of well-characterized animal models of autoimmune disease. Examples include experimental autoimmune encephalitis in mice, systemic lupus lupus erythematosus in MRL / lpr / lpr or NZB hybrid mice, autoimmune collagen arthritis in mice, diabetes in NOD and BB rats, experimental in mice. Includes myasthenia gravis (see Paul ed., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856).
[0266]
Up-regulation of antigen function (preferably B-lymphocyte antigen function) as a means of up-regulating the immune response may be therapeutically useful. Up-regulation of the immune response exists in a way that enhances the immune response or elicits an initial immune response. For example, enhancing the immune response through promoting B lymphocyte antigen function may be useful in the case of a viral infection. In addition, systemic serious illnesses such as influenza, colds, and encephalitis may be intentionally alleviated by the enhanced administration of B lymphocyte antigens.
[0267]
Alternatively, an anti-viral immune response removes T cells from a patient, co-stimulates T cells in vitro with pulsed APCs of viral antigens together with expression of a peptide of the invention, or an enhanced form of a soluble peptide of the invention. As well as by reintroducing activated T cells into the patient in vitro. Another method of raising an antibiotic immune response is to isolate infected cells from a patient and to express a protein of the invention described herein such that the cells express all or a portion of the protein on their surface. Transfecting them with the encoding nucleic acids and reintroducing the transfected cells into the patient. Here, the infected cells deliver a costimulatory signal to the T cells, and thereby activate the T cells.
[0268]
In other applications, up-regulation or enhancement of antigen function, preferably B lymphocyte antigen function, may be useful for inducing tumor immunity. Tumor cells (eg, sarcomas, melanomas, lymphomas, leukemias, neuroblastomas, malignancies) transfected with a nucleic acid encoding at least one peptide of the invention can be used to overcome tumor-specific tolerance in a subject. It can be administered to a subject. If desired, the tumor cells can be transfected to express the peptide combination. For example, tumor cells obtained from a patient can lead to the expression of a peptide with B7-2-like activity alone or together with a peptide with B7-1-like activity and / or B7-3-like activity. Depending on the expression vectorex VivoCan be transfected. The transfected tumor cells are returned to the patient to effect expression of the peptide on the surface of the transfected cells. Alternatively, gene therapy techniques may be used to target tumor cells for transfection in vivo.
[0269]
The presence of a peptide of the invention having the activity of a B lymphocyte antigen on the surface of tumor cells provides the need for costimulatory signals to T cells to elicit a T cell mediated immune response against transfected tumor cells. In addition, tumor cells that lack MHC class I or MHC class II molecules or are unable to re-express a sufficient amount of MHC class I or MHC class II molecules have MHC class I α chain protein and β₂It can be transfected with a nucleic acid encoding a microglobulin protein or an MHC class II single chain protein, and all or a portion of an MHC class II β chain protein (eg, a truncated portion of a cell domain). Expression of appropriate class I or class II MHC in association with a peptide having the activity of a B lymphocyte antigen (eg, B7-1, B7-2, B7-3) is indicative of a T cell-mediated immune response against transfected tumor cells Trigger. Optionally, a gene encoding a protein associated with MHC class II, such as an antisense construct that prevents expression of the invariant chain, may be used to enhance the presentation of tumor-associated antigens and B lymphocytes to promote tumor-specific immunity. It can also be co-transfected with DNA encoding a peptide having the activity of an antigen. Thus, induction of a T cell-mediated immune response in a subject may be sufficient to overcome the tumor-specific tolerance of the subject.
[0270]
The activity of the proteins of the invention can be measured, among other means, by the following method: Suitable assays for thymocyte or splenocyte cytotoxicity include, without limitation, the following: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY . Coligan et al. , Eds. Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, Chapter 7); Herrmann et al. , Proc Natl Acad Sci USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al. , J Immunol 128: 1968-1974, 1982; Handa et al. Takai et al, J Immunol 137: 3494-3500, 1986; Takai et al, J Immunol 140: 508-512, 1988; Herrmann et al., ProcNac, Canada 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J Immunol 128: 1968-1974, 1982; Handa et al. , J Immunol 135: 1564-1572, 1985; , J Immunol '137: 3494-3500, 1986; Bowman et al, J Virology 61: 1992-1998; Takai et al. J. Immunol 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al, Cell Immunol 133: 327-341, 1991; Brown et al, J Immunol 153: 3079-3092, 1994.
[0271]
Assays for T cell-dependent immunoglobulin responses and isotype switching (among others, modulating T cell-dependent antibody responses and identifying proteins that affect Th1 / Th2 properties) are without limitation: Malizezewski, J Immunol 144: 3028-3033, 1990; and Mond and Brunswick In: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coliganefal, (eds.) Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto 1994.
[0272]
The lymphocyte mixed culture (MLR) assay, which identifies, among other things, proteins that produce most Th1 and CTL responses, is without limitation: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Coligan et al, eds. Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, Chapter 7); Takai et al. , J Immunol 137: 3494-3500, 1986; Takai et al, J Immunol 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al, J Immunol 149: 3778-3783, 1992.
[0273]
Dendritic cell-dependent assays, among others identifying proteins expressed by dendritic cells that activate immature T cells, are without limitation: Guery et al. , J Immunol 134: 536-544, 1995; Inaba et al. , J Exp Med 173: 549-559, 1991; Mactonia et al, J Immunol 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al, J Exp Med 182: 255-260, 1995; Nair et al, 406: Huang et al, Science 264: 961-965, 1994; Macatonia et al, J Exp Med 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et. al. , J Clin Investig 94: 791-807, 1994; and Inaba et al. , JExp Med 172: 631-640, 1990.
[0274]
Assays for lymphocyte survival / apoptosis, among others identifying proteins that prevent apoptosis following induction of superantigens and proteins that regulate lymphocyte homeostasis, are not limited: Darzynkiewicz et al, Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al, Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al, Cancer Res 53: 1945-1951, 1993; J. Immunol 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczycueta. . JnnatJOncol 1: 639-648, 1992.
[0275]
Assays for proteins affecting T cell association and the early steps of development are not limited: Antica et al, Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al, Cell Immunol 155: 111-122, 1994. Gally et al .; , Blood 85: 2770-277%, 1995; Tote et al. , Proc Nat AcadSci USA 88: 7548-7551, 1991.
[0276]
Tissue growth activity
The ARP / BKP proteins or multimers of the invention can be used for bone, cartilage, tendon, ligament, and / or nerve tissue growth or regeneration, and for wound healing and tissue repair and replacement, and for burns, Compositions used for incision and treatment of ulcers may also have utility.
[0277]
Proteins of the invention that induce the growth of surrounding cartilage and / or bone when bone is not formed normally have applications in the treatment of bone and cartilage damage, or metastasis in humans and other animals. . Such formulations utilizing the proteins of the invention are also used prophylactically for reducing closed and open fractures and for improved fixation of artificial joints. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the repair of congenital, trauma-induced or cancer resection-induced cranial and facial defects, and is also useful in cosmetic plastic surgery .
[0278]
The proteins of the present invention can also be used in the treatment of periodontal disease, and in other tooth restoration processes. Such agents may provide an environment for attracting osteogenic cells, promoting osteogenic cell growth, or inducing the differentiation of osteogenic progenitor cells. The proteins of the invention may be used, for example, by stimulating bone and / or cartilage repair or by blocking the process of inflammation or tissue destruction (collagenase activity, osteoclast activity, etc.) mediated by inflammatory processes. It is also useful in the treatment of the disease.
[0279]
Another category of tissue regeneration activity that may be attributable to the proteins of the present invention is tendon / ligament formation. The proteins of the present invention, which induce the formation of tendon / ligament-like or other tissue around where such tissue is not normally formed, may be used in humans and other animals to rupture tendons or ligaments, dysplasia. , And other tendon or ligament defects. Such formulations, which are utilized in protein-inducing tendon / ligament-like tissue, are used prophylactically to prevent damage to tendon or ligament tissue, as well as tendon or ligament bone or other tissue. Used for fixation and for repairing defects in tendon or ligament tissue. The new formation of tendon / ligament-like tissue induced by the composition of the present invention contributes to the repair of congenital, trauma-induced or other tendon or ligament defects of other origin, and Useful for cosmetic surgery for the bonding or repair of tendons or ligaments. The compositions of the present invention may attract tendon or ligament forming cells, promote the growth of tendon or ligament forming cells, induce the differentiation of tendon or ligament forming cell progenitor cells, or effect tissue in vivo. To returnex VivoMay provide an environment for inducing the growth of tendon / ligament cells, or progenitor cells. The compositions of the present invention may also be useful in treating tendinitis, cARP / BRPal canal syndrome and other tendon or ligament defects. The composition may also include a suitable substrate and / or sequestering agent as a carrier, as is well known in the art.
[0280]
The proteins of the present invention are useful for the proliferation of cells of the nervous system and regeneration of nerve and brain tissue, i.e. diseases of the central and peripheral nervous system, including degeneration, death or trauma to cells or nerve tissue of the nervous system, and neuropathy As well as for the treatment of mechanical and traumatic disorders. More particularly, proteins are found in diseases of the peripheral nervous system such as peripheral nerve injury, peripheral neuropathy, and local neuropathy, as well as Alzheimer's, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Shy-Drager syndrome For treating central nervous system disorders such as Additional conditions to be treated according to the present invention include spinal cord disorders, head trauma, and mechanical and traumatic disorders such as cerebrovascular disorders such as stroke. Terminal neuropathy arising from chemotherapy or other medical therapy may also be treatable with the proteins of the present invention.
[0281]
The proteins of the present invention are also useful for better or faster closure of non-healing wounds, including but not limited to rubbing, ulcers associated with vascular dysfunction, surgery and traumatic wounds, and the like.
[0282]
Similarly, the proteins of the present invention may be used in other tissues, such as organs (including, for example, pancreas, liver, intestine, kidney, skin, endothelium), muscle (smooth, skeletal, heart), and vascular (endovascular endothelium). (Including cells), or to promote the growth of cells, including such tissues. Part of the desired effect is due to the inhibition or modulation of fibrous scarring, which allows normal tissue regeneration. The proteins of the present invention may also exhibit angiogenic activity.
[0283]
The proteins of the present invention may also be useful in protecting or regenerating intestines, as well as in treating lung or liver fibrosis, reperfusion injury of various tissues, and conditions resulting from systemic cytokine damage.
[0284]
The proteins of the present invention may also be useful for promoting or inhibiting the differentiation of precursor tissues or cells into said tissue; or for inhibiting the growth of said tissue.
[0285]
The activity of a protein of the invention can be measured, among other means, by the following methods:
Assays for histogenetic activity are without limitation: International Patent Publication No. 95/16035 (bone, cartilage, tendon); International Patent Publication No. 95/05846 (nerve, nervous system); International Patent Publication No. No. 91/07491 (leather, endothelium).
[0286]
Assays for wound healing activity are without limitation: Whiter, EPIDERMAL WOUND HEALING, pp. 71-112 (Maibach and Rovee, eds.), Year Book Medical Publishers, Inc. , Chicago, as modified by Eagstein and Menz, J. Mol. Invest. Dermatol 71: 382-84 (1978).
[0287]
Activin / inhibin activity
The ARP / BRP proteins or multimers of the invention may also exhibit activin- or inhibin-related activity. Inhibins are characterized by their ability to suppress the release of follicle stimulating hormone (FSH), whereas activins are characterized by their ability to promote the release of follicle stimulating hormone (FSH). Thus, alone or in heteromultimers with members of the inhibin family, the proteins of the present invention provide contraception based on the ability of inhibin to reduce fertility in female mammals and spermatogenesis in male mammals. May be useful as a medicine. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in these mammals. Alternatively, proteins of the invention, either homodimers or heterodimers with other protein subunits of the inhibin-b group, are useful as fertility enhancing therapies based on the ability of activin molecules to promote FSH release from cells of the anterior pituitary gland. Maybe. See, for example, U.S. Patent No. 4,798,885. The proteins of the present invention may also be useful for increasing the lifetime reproductive performance of livestock such as cows, sheep, and pigs, and for enhancing the expression of fertility in sexually immature mammals.
[0288]
The activity of the protein of the invention is measured, among other means, by the following method:
Assays for activin / inhibin activity are without limitation: Vale et al. Ling et al., Endocrinology 91: 562-572, 1972; , Nature 321: 779-782, 1986; Vale et al, Nature 321: 776-779, 1986; Mason et al. , Nature 318: 659-663, 1985; Forage et al, Proc NatlAcad Sci USA 83: 3091-3095, 1986.
[0289]
Chemotaxis / chemokinetic activity
The proteins or multimers of the present invention may be chemically modified against mammalian cells, including, for example, monocytes, fibroblasts, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, epithelial cells, and / or endothelial cells. It may have chemotactic or chemokinetic activity (eg, acting as a chemokine). Chemotactic and chemotactic proteins can be used to recruit or attract a desired cell population to a desired point of action. Chemotactic or chemotactic proteins offer particular benefits for the treatment of wounds and other trauma to tissues, as well as for the treatment of local infections. For example, recruitment of lymphocytes, monocytes, or neutrophils to the site of a tumor or infection may result in an improved immune response to the tumor or infectious agent.
[0290]
A protein or peptide has chemotactic activity for such a cell population when it can directly or indirectly stimulate the directional orientation or movement of a particular cell population. Preferably, the protein or peptide is capable of directly stimulating directional movement of the cell. Whether a particular protein has chemotactic activity for a cell population can be readily ascertained by using the protein or peptide in any of the known assays for cell chemotaxis.
[0291]
The activity of the protein of the invention is measured, among other means, by the following method:
Assays for chemotactic activity (identifying proteins that induce or prevent chemotaxis) are based on the ability of the protein to induce the translocation of cells across the membrane, as well as the protein that induces the adhesion of a cell population to another cell population. Consists of an assay that measures the ability of Suitable assays for migration and adhesion are without limitation: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan et al. , Eds. (Chapter 6, Chapter 12, MEASUREMENT OF ALPHA AND BETA CHEMOKINES 6.12.1-6.12.28); Taub et al. J Clin Invest 95: 1370-1376, 1995; Lind et al. APMS 103: 140-146, 1995; Muller et al, Eur J Immunol 25: 1744-1748; Gruber et al. J Immunol 152: 5860-5867, 1994; Johnston et al, J Immunol 153: 1762-1768, 1994.
[0292]
Receptor / ligand activity
The proteins or multimers of the present invention may also exert activity as inhibitors, or agonists of receptors, receptor ligands, or receptor / ligand interactions. Examples of such receptors and ligands include, without limitation, cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, receptors involved in cell-cell interactions And their ligands (without limitation, cell adhesion molecules (selectins, integrins and their ligands), and receptor / ligand pairs involved in antigen presentation, and cellular and humoral immune receptors for antigen recognition and development. Contains). Receptors and ligands are also useful for screening peptides or small molecules that may be inhibitors of related receptor / ligand interactions. The proteins of the present invention, including but not limited to receptor and ligand fragments, may themselves be useful as inhibitors of receptor / ligand interaction.
[0293]
The activity of the protein of the invention can be measured by the following methods, among other means:
Suitable assays for receptor-ligand activity are without limitation: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Ed by Coligan, et al. , Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions, 7.28.71-28.28-Aci.Acon. Bierer et al, J.A. Exp. Med. 168: 1145-1156, 1988; Rosenstein et al. Exp. Med. 169: 149-160 1989; Stoltenborg et al. J. Immunol Methods 175: 59-68, 1994; Stittetal. , Cell 80: 661-670, 1995.
[0294]
Anti-inflammatory activity
The proteins or multimers of the present invention may also exhibit anti-inflammatory activity. Anti-inflammatory activity inhibits or promotes cell extravasation by providing stimulation to cells involved in the inflammatory response, thereby inhibiting or promoting cell-cell interactions (eg, cell adhesion) or By promoting or inhibiting the chemotaxis of cells involved in the inflammatory process, or by stimulating the production of other factors that more directly inhibit or promote the inflammatory response Or it can be accomplished by suppressing. Proteins exhibiting such activity include, without limitation, infection-related inflammation (eg, septic shock, sepsis, or systemic inflammatory response syndrome (SIRS)), ischemia-reperfusion injury, lethal Endotoxin, arthritis, complement-mediated hyperacute rejection, nephritis, lung injury induced by cytokines or chemokines, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or overproduction of cytokines such as TNF or IL-1 Can be used to treat inflammatory conditions, including those due to chronic or acute conditions. The proteins of the present invention may also be useful for treating anaphylaxis and hypersensitivity to antigenic substances or materials.
[0295]
Tumor suppressive activity
In addition to the activities described above for immunological treatment or prevention of tumors, the proteins or multimers of the present invention may exhibit other anti-tumor activities. The protein may directly or indirectly (eg, via ADCC) suppress tumor growth. The protein acts on tumor tissue or tumor progenitor tissue, thereby inhibiting the formation of tissue necessary to support tumor growth (eg, by inhibiting angiogenesis), and thereby other factors that inhibit tumor growth. , By causing the production of an agent or cell type, or by inhibiting, removing or inhibiting a factor, agent or cell type that promotes tumor growth.
[0296]
Example
A brief description of certain terms and procedures that are frequently used in this example are provided below.
[0297]
"PCR" is the polymerase chain reaction.
[0298]
"CDNA" is complementary DNA synthesized from whole or poly (A) + RNA by reverse transcriptase.
[0299]
"Digestion" of the DNA was usually performed using restriction endonucleases purchased from New England Biolabs (Beverly MA). Buffers and reaction conditions are similar to those specified by the manufacturer.
[0300]
"Gel purification" of PCR DNA fragments and DNA fragments obtained from restriction endonuclease digestion was performed by electrophoretic size fractionation of the reaction mixture in agarose gels with appropriate molecular weight standards. After electrophoresis, the DNA is visualized with ethidium bromide, the desired size fragment is excised from the gel, and then agarose using the Wizard PCR Preos DNA purification system (Promega Corporation, Madison, WI). Separated from
[0301]
The "ligation" or "insertion" of the purified DNA fragment into the digested and purified vector DNA was performed using a buffer supplied by the manufacturer and T4 DNA ligase from New England Biolabs (Beverly MA). . Similarly, ligation was performed with topoisomerase I using the vectors and reagents provided in a kit from Invitrogen (Carlsbad, CA).
[0302]
“Cloning” refers to a more suitable E. coli For transformation of E. coli host strains, the transformants can be grown and transformed by Qiagen Inc. The plasmid DNA is purified from the bacteria using a kit from Santa Clara, CA.
[0303]
Plasmid DNA templates, DNA oligonucleotide primers (eg, T7, T3, M13F, M13R, and gene-specific primers), and ABI PRISM® BigDye® Terminator Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, System) "DNA sequencing" was performed by a cycle sequencing reaction using reagents from CA). Reaction and cycling conditions were performed according to the specifications provided in the kit. ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Was used for capillary electrophoresis and quantification of raw DNA sequences. Sequencher (version 4.0.5, Gene Codes Corporation) and GCG (Wisconsin Package version 10.1, Genetics Computer Group, Madison, WI) software were used for fragment assembly and DNA sequence alignment.
[0304]
The "TaqMan®" fluorescing 5 'nuclease assay was performed using the ABI PRISM® 7700 sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reactions were performed in a 25 μl total reaction volume with 1 × Universal Mix (Applied) with 300 or 900 nmoles of forward and reverse primers, 250 nmoles of probe, and various amounts of cDNA prepared from poly (A) + RNA. Biosystems, Foster City, CA). A universal cycling index was used for PCR (10 minutes at 50 ° C .; 10 minutes at 95 ° C., followed by 40 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute). Primers and probes for the TaqMan® assay were designed using Primer Express Version 1.5® Origo Design software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
[0305]
“Enrichment of the raw culture supernatant” relates to any method of reducing the volume of conditioned media for a particular sample, without constraining the protein significantly, thereby enriching the sample for protein content. The method used for this work was tangential flow filtration across a low protein-adsorbing membrane of polyethersulfone with a nominal molecular weight of 10,000 Da (Pall Filtron Ultrasette P). / N05010C70). Driving power was provided by a Masterflex L / S @ Lister pump drive and a Model 7518-10 easy-load pump head measured vertically with a PharMed size 15 thin-walled tube. The circulation rate was 900-1100 ml / min and the back pressure was maintained at １．５1.5 atm through the use of a variable outflow restriction. Culture supernatant volume was reduced 25-50 fold to produce starting material for immunoaffinity purification.
[0306]
The "SDS page" relates to a family of techniques in which protein samples treated with dodecyl sulfate surfactant are sorted based on their mobility in the polymer gel matrix, depending on the driving force of the applied electric field.
[0307]
"Western blotting" refers to all techniques for detecting electrophoretically separated proteins transferred to the submembrane layer, followed by binding of specific antibodies. In this work, the polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane to which the electrophoresis was transferred was used for binding to various detection antibodies as specified in the individual figures.
[0308]
“Immunity affinity chromatography” is a method in which a sample is fractionated based on the binding affinity of one or more sample components for an immobilized antibody. In principle, reversible denaturation of the immobilized antibody by competing ligands or sudden pH changes can be used to recover bound samples. For this work, the captured proteins were extracted from the immobilized antibody by a pH change from 7.5 to 3.5. The fractions containing the extracted proteins were observed on pH paper and immediately neutralized by the addition of an appropriate amount of 1 M Tris pH 9.2. Immediately after elution of the bound protein, the chromatography resin was equilibrated back to pH 7.5 to minimize irreversible denaturation of the immobilized protein.
[0309]
Example 1: Detection of human BRP transcript in RNA extracted from tissue
Poly (A) + RNA purified from testis, pituitary, liver, thyroid, kidney, pancreas, and K-562 (chronic myeloid leukemia) was purchased from Clontech (Palo Alto, CA). The RNA was purified from Life Technologies, Inc. according to the manufacturer's recommendations, containing 0.5-1 μg RNA and 50 ng random hexamer per 20 μl reaction volume. (Cat # 11904-018) was used for the synthesis of complementary DNA (cDNA) using SUPERSCRIPT ™ First-Stand Synthesis System for RT-PCR. The same control reaction, except that reverse transcriptase was omitted, was performed to observe PCR priming from the residual genomic DNA of the RNA preparation. Reactions performed with or without reverse transcriptase were designated "+ RT" or "-RT", respectively.
[0310]
The BRP forward and reverse primers used in the TaqMan® assay were 5'-GGGCCTTCGGATCACCAC-3 '(SEQ ID NO: 76) and 5'-TCGATGATGGGCTTCAATATAGG-3' (SEQ ID NO: 46), respectively. The probe for ARP / BRP was 5'-6FAM-CCTGGGAGAAAACCCATTCTGGAACCC-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 47). Since the fluorescent probe spans the predicted junction of the two coding exons of BRP, this assay is intended to detect specifically spliced mRNA transcripts. TaqMan PCR was performed using template cDNA prepared from 25 ng or 50 ng of poly (A) + RNA in a total reaction volume of 25 μl.
[0311]
Table 5 shows the results of the real-time quantitative PCR experiments using the BRP TaqMan® assay.
[0312]
[Table 5]

[0313]
This result indicates that spliced human BRP mRNA transcripts can be reproducibly detected in pituitary and testis poly (A) + RNA. BRP transcripts were not detected in other RNA samples tested, but ruled out BRP expression during small subpopulations of cells, or specific developmental stages of these and other tissues, or physiological conditions I can't.
[0314]
For samples 1-3, the β-actin Pre-Developed TaqMan® assay (Applied Biosystems, Foster City, CA) was used to evaluate the efficiency of cDNA synthesis. Each sample was analyzed in triplicate using 50 ng of input RNA per 25 μl reaction. The assay was performed according to the manufacturer's specifications. Average C, demonstrating the efficiency of cDNA synthesis_TWas 16 for all three cDNA samples.
[0315]
Samples 5-9 were tested for ARP levels for comparison with the results obtained using the Origen panel. The ARP TaqMan® assay used 25 ng of input RNA per reaction. The results showed the following relative ratios for expression: pancreas (C_T$ 20)> Pituitary gland (C_T# 22)> Testis (C_T$ 25)> Kidney (C_T# 29)> Liver (C_T# 31)> Placenta (C_T# 33). These results were consistent with those reported in Example 4.
[0316]
Example 2: Isolation of cDNA clone corresponding to human BRP
The DNA sequence from Genbank accession number AL118555 (FIG. 4) and the PRIME software program (Wisconsin Package version 10.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis.) Were separated by an intron of about 5 kb2. Used to design PCR primers for amplification of the predicted coding region of ARP / BRP, contained in two putative exons. The sequences of the forward and reverse primers (referred to as ARP / BRPCDS primers) were 5'-CAGCATGAAGCTGGCATTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 77) and 5'-GCCTCAGATGGTCTCACACTCC-3' (SEQ ID NO: 48), respectively.
[0317]
The PCR reaction for cloning the human BRP protein coding region was performed in a volume of 50 μl containing the following components: 4 mM MgSO₄, 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, 200 μM each of dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA), 0.5 units of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA) and 2 μl of pituitary cDNA (equivalent to cDNA prepared from 100 ng polyA + RNA as described in the previous section). Cycling conditions were 99.9 ° C for 2 minutes, followed by 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 67 ° C for 15 seconds, and 75 ° C for 30 seconds. These conditions resulted in the detection of a weak band of about 400 base pairs (bp) on the agarose gel. This fragment was gel purified and cloned using the Zero Blunt® TOPO® PCR cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). A plasmid having an EcoRI insert of about 400 bp was identified and called hBRPin pCR4Blunt (FIG. 19). DNA sequencing results confirmed that the identity of the 400 bp PCR fragment was BRP. The DNA base sequence of the fragment corresponded to that of SEQ ID NO: 1 having an amino acid translation matching SEQ ID NO: 2.
[0318]
Example 3: Construction of plasmid for expression of human BRP fusion protein in mammalian cells.
[0319]
AP-BRP
Prediction (without signal sequence) to the C-terminal site of alkaline phosphatase (AP) using the following primers 5'-CTCGAGGCCTCCAGTGGAACCTCGCGCAC-3 '(SEQ ID NO: 49) and 5'-GGGCCCGGATCCTCCAGATGGTCTCACACTCC-3' (SEQ ID NO: 50) A fusion of the coding region for the targeted mature human BRP was performed. The PCR reaction conditions were as follows: 4 mM MgSO in a 100 μl reaction volume₄, 200 nM of each primer, 200 μM of dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA), 1 unit of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA) and 100 ng of hBRP / BRPin pCR4Blunt plasmid DNA. Cycling conditions were 99 ° C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C for 30 seconds and 70 ° C for 30 seconds. The resulting PCR fragment was gel purified and cloned using the Zero Blunt® TOPO® PCR cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). A plasmid called BRP-NTAP (FIG. 20) with the expected restriction endonuclease banding pattern was identified and sequenced. BRP-NTAP plasmid DNA was digested with XhoI and ApaI, and the insert containing the BRP coding region was gel purified and XhoI and ApaI digested Aptag-5 vector DNA (GenHunter® Corporation, Nashville, TN). ). This resulted in a plasmid created for expression of a fusion protein consisting of secreted alkaline phosphatase at the N-terminus and the C-terminus of BRPat (AP-BRPin Aptag-5, FIG. 21).
[0320]
BRP-GFP
Fusion of green fluorescent protein (GFP) to the C-terminus of human BRP was performed using the following PCR primers, 5′-GCTAGCATGAAGCTGGCATTCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 51), and 5′-TATCGATGGTTCCACACTCCGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 52). I went. The PCR reaction conditions were as follows: 4 mM MgSO in a 50 μl reaction volume₄, 200 nM of each primer, 200 μM of dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA), 1 unit of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA) and 50 ng of hBRPin pCR4Blunt plasmid DNA. Twelve identical 50 μl reactions were prepared to test 12 annealing temperature gradients in the range of 49 ° C. to 69 ° C. Cycling conditions were 99 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 49-69.1 ° C for 15 seconds, and 75 ° C for 30 seconds. PCR products from reactions using an annealing temperature of 63-68 ° C were pooled and gel purified. In addition to the addition of dA residues to the ends, the purified fragment was combined with Mg-free 1X PCR buffer (Life Technologies, Rockville, MD), 2 mM MgCl₂And 2.5 units of Taq DNA polymerase (Life Technologies, Rockville, MD) in a 100 μl reaction volume containing 200 μM each of dCTP, dATP, dTTP and dGTP. After incubation at 72 ° C. for 15 minutes, the fragment was purified using the Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega Corporation, Madison, Wis.). The BRPPCR fragment with the dA tail was inserted into the vector provided in the CT-GFP Fusion TOPO® TA expression kit (Invitrogen Carlsbad, CA) using the protocol specified by the manufacturer. An expression vector was obtained for the expression of a fusion protein consisting of human BRP at the N-terminus and Cycle3 GFP at the C-terminus (BRP-GFPin pcDNA3.1, FIG. 22). The structure of the fusion construct was confirmed by DNA sequencing (FIG. 23).
[0321]
FLAG-BRP
To create a vector for expression of BRP with an N-terminal FLAG tag, the BRP-NTAP plasmid was digested with EcoRI and BamHI, and the approximately 400 bp human BRP insert was gel purified. The purified DNA fragment was inserted into pFLAG-CMV-1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) digested with EcoRI and BamHI. To remove the 100 bp PstI fragment, the resulting plasmid construct (pFLAG-CMV-BRP-RI-BAM) was digested with PstI and the 4.9 kilobase pair (kb) vector fragment was gel purified. The BRP-NTAP was digested with SpeI and StuI, 4.3 vector DNA fragment kb was gel purified, then the following sequence, 5'-CTAGTCTCGAGGCTGCAGTTGCTGACTACAAAGACGATGACGACAAGG-3 '(SEQ ID NO: 53), and 5'-CCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGCAACTGCAGCCTCGAGA-3 '(SEQ ID NO: 54) was ligated to a complementary oligonucleotide. After cloning, a plasmid construct with a positive sequence was identified and digested with PstI. The 100 bp PstI fragment was gel purified and inserted into the 4.9 kb PstI vector fragment from pFLAG-CMV-BRP-RI-BAM (described above). Constructs with the positively oriented PstI insert were identified and sequenced to confirm that the FLAG-BRP fusion fragment encodes the pFLAG-CMV-1 mouse preprotrypsin signal sequence in frame units. . This expression vector plasmid was called FLAG-BRPin pFLAG-CMV-1 (FIG. 24). The FLAG-BRP insert was PCR amplified using the following primers, 5'-TTTGCTAGCACCATGTCTGCACTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 55), and 5'-TTTGGATCTCCAGATGGTCTCACACTC-3' (SEQ ID NO: 56). The PCR reaction conditions were as follows: 4 mM MgSO in a 50 μl reaction volume₄, 200 nM of each primer, 200 μM of dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA), 1 unit of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA) and 50 ng of FLAG-BRPin pFLAG-CMV-1 plasmid DNA. Twelve identical 50 μl reactions were prepared to test 12 annealing temperature gradients in the range of 65 ° C. to 75 ° C. Cycling conditions were 99 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65-75 ° C for 15 seconds, and 75 ° C for 30 seconds. PCR products from reactions using an annealing temperature of 65-71 ° C were pooled and gel purified. This fragment was digested with NheI and BamHI, and then ligated to pCEP4 plasmid DNA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Digested with NheI and BamHI to obtain a primate cell expression vector plasmid FLAG-BRPin pCEP4 (FIG. 9). 25). DNA sequence analysis was used to confirm the correct sequence encoding the FLAG-BRP fusion protein.
[0322]
HIS-ARP
To obtain a fusion protein consisting of (1) mouse preprotrypsin signal peptide, (2) 6 histidine-1 glycine tag (6 Hisg), and (3) enterokinase cleavage site (EK) at the N-terminus of ARP A two-step PCR amplification was performed. In the first step, 11.73 ng of FLAG-ARP-Phein pCEP4 plasmid DNA was primed with 5'-CTCTTGTTGGAGGCTGCAGTTGCTCATCATCACCCATCACCATGGTGGACGATGACGATAAGCAGGAGGCAG-3 '(SEQ ID NO: CTGCGA for the sequence SEQ ID NO: CTGCGA). And used as a template. PCR is performed using one unit of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA), 4 mM MgSO₄, 420 nM of each primer, 200 μM of each dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, and 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA) in nine identical 53 μl reaction volumes. Cycling conditions were 99 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds, and 75 ° C. for 30 seconds. Following PCR, 1 μl of the first-stage reaction was prepared using the following primers: Was transferred to a new tube for the reaction.
[0323]
The reaction volume was 120 μl, with all other reaction conditions being the same as in the first step. Each 12 μl aliquot of the reaction mix was used to test a 9 point gradient of annealing temperature in the range of 65 ° C. to 76 ° C. Cycling conditions were 99 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65-76 ° C for 30 seconds, and 75 ° C for 30 seconds. All conditions produced fragments of the expected size, which were gel purified, digested with Nhel and BamHI, concentrated using the Wizard® PCR Prep DNA purification system (Promega), and then It was inserted into pCEP4int digested with NheI and BamHI. A plasmid with the correct size insert was identified and called 6Hisg-ARP-Phe in pCEP4int (abbreviated His-ARP). The structure of the fusion protein was confirmed by DNA sequencing. FIG. 41A shows a diagram of a plasmid having the DNA base sequence and amino acid translation of the fusion protein shown in FIG. 41B.
[0324]
Example 4: Detection of human ARP transcript in RNA extracted from human tissue
The human ARP forward and reverse primers used in the TaqMan® assay were 5′-AGGAGGCAGTCATCCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 57) and 5′-TGCCTTGGCGGTCACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 58), respectively. . The probe for ARP was 5'-6FAM-TGCCACTTGGCACCCTTCAATGTG-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 59). Because the fluorescent probe spans the predicted junction of the first two coding exons of ARP, this assay is intended to detect specifically spliced mRNA transcripts.
[0325]
Human Rapid-Scan ™ Expression Panel (OriGene Technologies, Inc., Rockville, Md.) Was used to provide a cDNA template for the ARP TaqMan® assay. The panel contained cDNA from 24 tissues, serially diluted from 1000 ×, 100 ×, 10 ×, and 1 ×. The lowest concentration of 1X was approximately 1 pg of cDNA. 1000X and 100X dilutions were used for the ARP TaqMan® assay. Wells from duplicate panels containing 1 × cDNA concentration were used for the human β-actin pre-developed assay reagent kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
[0326]
The pituitary cDNA from Example 1 was used because the panel did not contain pituitary cDNA. β-actin pre-developed TaqMan® and dilutions of pituitary cDNA were used to determine approximate equivalents of 1000X, 100X, 10X, and 1X cDNA dilutions by the Origen panel. The results show that cDNA prepared from 5 pg of pituitary poly (A) + RNA has approximately 31 C_Ts corresponding to a cDNA concentration of 1X. Therefore, cDNA from 5 ng and 0.5 ng of pituitary poly (a) + RNA was considered to correspond to the Origen panel 1000X and 100X cDNAs, respectively.
[0327]
Table 6 shows the results.
[0328]
[Table 6]

[0329]
This result indicates that the tissue samples examined, pancreas, pituitary gland, and testis tissue contain the highest levels of ARP. The remaining tissues had lower or undetectable levels of ARP mRNA.
[0330]
Example 5: Detection of ARP mRNA in rat tissue
Rat RNA was purchased from Clontech (Palo Alto, CA) or snap frozen in liquid nitrogen and prepared from organs stored at -80 ° C. Tissue weighing up to 40 mg is crushed with a hand-held pestle (Kontes, Vineland, NJ) in RLT buffer (Rneasy® kit Qiagen Inc., Valencia, CA) for 45 seconds, followed by 21 gauge. The needle was homogenized by passing 10 times. Brinkman Polytron was used to homogenize larger tissues in either RLT buffer or Trizol® (Life Technologies, Rockville, MD). RNA was purified according to the protocol supplied by the manufacturer of the homogenization buffer used. CDNA was prepared as described in Example 1.
[0331]
Rat ARP forward and reverse primers used in the TaqMan® assay were 5′-AGGCAGCCGTCCCAATC-3 ′ (SEQ ID NO: 60) and 5′-GATCACTTCGCACTGTCACGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 61), respectively. . The probe for rat ARP was 5'-6FAM-CAGGCTGCCACTTGCACCCTT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 62). This assay is intended to detect specifically spliced mRNA transcripts since the fluorescent probe spans the predicted junction of the first two coding exons of ARP.
[0332]
ARP cDNA was detectable by TaqMan® PCR in rat pituitary, ovary, testis, eye and rat pituitary adenoma cell lines RC-4B / C (data not shown). Assay results on total RNA extracted from rat pituitary tissue taken from 76-day adult females in proestrus, estrus, and interestrus (as determined by vaginal smear) show that rat ARP mRNA was Suggested that it might play a role in reproduction because it is regulated. Because ARP mRNA levels out during estrus, the regulation of lowering ARP mRNA levels appears to be the opposite of that of FSHβ mRNA, whereas FSHβ mRNA levels are elevated (Table 7).
[0333]
[Table 7]

[0334]
Example 6: Isolation of cDNA clone corresponding to human ARP
The following forward and reverse PCR primers: IMAGE as template for PCR with 5'-TTTTAGAGCTTAGTGATGCCTATGGCGTCCC-3 '(SEQ ID NO: 63), and 5'-TTTTGAATTCGTAGCGAGAGAGGCG-3' (SEQ ID NO: 64) (no stop codon), respectively. DNA purified from the 2338950 clone (Research Genetics, Huntsville, AL) was used. PCR with 4 units of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA), 1 μM of each positive and negative primer, 2 mM MgSO₄, 250 μM each of dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, and 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA), and 1 μl of IMAGE 2338950 plasmid DNA. Cycling conditions were 94 ° C for 1 minute, 56 ° C for 35 seconds, and 30 cycles of 72 ° C for 1 minute. The approximately 400 bp fragment obtained from the PCR was gel purified, digested with HindIII and EcoRI, and then ligated into HindIII and EcoRI digested pBluescript SKII vector DNA (Sratagene, La Jolla, Calif.). To confirm the identity of the insert, ARP, the resulting plasmid, pBSSKIIhARP. 4 (26A) was subjected to DNA base sequence analysis. The sequence of the human ARP protein coding region (FIG. 26B) was consistent with SEQ ID NO: 17. Interestingly, the DNA base sequence shown in SEQ ID NO: 23 is a cloned ARP insert in pBSSKII hARP. 4 and has a single nucleotide difference when compared to SEQ ID NO: 17. This difference (A → C) is illustrated in FIG. 29 and results in a change of the ARP amino acid sequence at residue 114 to Leu to Phe. A search of the EST database revealed that the ARP-Phe type was dominant, so that the ARP-Leu type is a polymorphic variant that may not be very common in the population. In order to obtain a cDNA clone encoding the ARP-Phe protein, the A residue corresponding to the polymorphism was replaced with pBSSKII hARP. Changed to C of 4. This was performed using primers corresponding to the T3 promoter sequence of pBluescript SKII, and pBSSKII hARP.5 as a template for PCR with 5'-TTTTGAGATCTTTCACGGCCAGGG-3 '(SEQ ID NO: 65). 4 was performed. Reaction conditions and cycling parameters were similar to those described above for cloning the complete ARP coding region. The resulting PCR fragment was gel purified and cloned using the Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). DNA sequence analysis demonstrated the presence of a plasmid mutation called pCRblunt Phe. Purified DNA from pCRblunt Phe was digested with BglII and NotI. The ARP fragment containing the Phe mutation was gel-purified and digested with BglII and NotI in pBSSKII hARP. 4 and purified from the ARP-Leu fragment. A plasmid having an insert of the expected size, called pBSSKn hARP-Phe (FIG. 28A), was identified and had an open reading frame encoding ARP-Phe mutant (FIG. 28B) correctly by DNA sequence analysis. Showed that.
[0335]
Example 7: Construction of a plasmid for expression of a human ARP fusion protein in mammalian cells.
[0336]
GFP-ARP
pBSSKII ARP. The HindIII-EcoRI insert from 4 was subcloned into pEGFP-N2 (Clontech Palo Alto, CA) digested with HindIII and EcoRI. Clones with the correct restriction endonuclease band pattern were identified. One was chosen for further study and called pEGFP-N2-ARP or ARP-GFP (FIG. 29). The DNA sequence of the fusion protein ORF together with the corresponding amino acid translation is shown in FIG.
[0337]
AP-ARP
To facilitate subcloning, the oligonucleotide adapter cassettes (5′-CTAGAGGAATTCGGGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 66) and 5′-CGAATTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 67)) were linked to the XAPaI of pAPtag5 polylinker. Used to insert an EcoRI site between the and Apal sites, and created the vector pAPtag5 (RI). To obtain the ARP coding fragment without the signal peptide, PCR amplification was performed using the following primers, 5′-TTTTCTTAGAACAGGAGGCAGTCATCCCAGGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 68), and 5′-TTTTGAATTCCTAGTAGCGGAGAGGGGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 69) pBSSKII ARP. 4 was performed. The 340 bp PCR product was digested with Xbal and EcoRI, purified, and inserted into XAPal and EcoRI digested pAPtag5 (RI). This produced a vector called pAPtag5 (RI) suitable for expression of the ARP-Leu mutant whose N-terminus was tagged with alkaline phosphatase. To construct a vector for expression of AP-tagged ARP-Phe, the following fragments were isolated and ligated by ligation to yield plasmid pAPtag5 (RI) -ARP-Phe (FIG. 31A): pAPtag5 6.6 kb XbaI-EcoRI fragment from (RI), 240 bp XbaI-PstI fragment from pAPtag5 (RI) -ARP-Leu, and 83 bp PstI-EcoRI fragment from pBSSKII ARP-Phe. The DNA sequence at the AP-ARP junction was determined and shown to encode the expected open reading frame.
[0338]
FLAG-ARP
A two-step PCR amplification was performed to obtain a fusion protein consisting of the N-terminal FLAG of ARP with the mouse preprotrypsin signal peptide upstream of the FLAG tag. In the first step, pBSSKII ARP-Phe (1 μl of plasmid DNA) was replaced with the following primers: used. PCR is performed using one unit of Vent_RPolymerase (New England Biolabs Beverly MA), 4 mM MgSO₄, 100 nM of each primer, 200 μM of each dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, and 1 × Thermopol buffer (New England Biolabs Beverly MA) in a 50 μl reaction volume. Sixteen cycles of 96 ° C. for 30 seconds and 70 ° C. for 30 seconds were used for amplification. Following PCR, 10 μl of the first-step reaction was performed using the following primers: 5′-TTTGCTAGCCACCATGTCTGCACTCTCTGATCCTAGCTCTTGTTGGAGCTGCAGGTGCTGACTACAAAGACGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 72); Was transferred to a new test tube. All other reactions and cycling were the same as in the first step, with a reaction volume of 100 μl. The PCR fragment produced from the second stage of the PCR was digested with NheI and BamHI and then inserted into NheI and BamHI digested pCEP4. A plasmid with the correct size insert was identified and called FLAG-ARP-Phe in pCEP4 (FIG. 32).
[0339]
FLAG-ARP-int
The intron-exon structure of the ARP gene is similar to that of its relative, glycoprotein alpha subunit. Since the glycoprotein alpha subunit requires introns or genomic fragments for efficient expression in mammalian cells (USSN 5,674,711), ARP is also required for this. There could be. To test this, a FLAG-ARP expression construct was designed with introns in the 5 'untranslated site of the mRNA. The chimeric intron from pCIneo (Promega Corporation, Madison, Wis.) was constructed with a 5 'KpnI site (5'-GGTACCAAGGGTAGCCTTGCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 74)) and a 3 'PvuII site (5'-CAGCTGGGTAATTGATAGGAGGATGGATGGATGGAGGA). PCR amplification with primers designed to add No. 75)). The reaction mixture contained 10 ng of pCIneo DNA, 1X Pfu buffer (Sratagene, La Jolla, Calif.), 1 μM of each primer, 200 μM of each dCTP, dATP, dTTP, and dGTP, 3.2 mM MgSO.₄And 0.5 μl of Pfu Turbo polymerase (Sratagene, La Jolla, Calif.) In a total volume of 25 μl. Cycling conditions were 95 ° C for 1 minute, followed by 20 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. After cycling, the reaction was incubated for 10 minutes at 72 ° C, then cooled to 4 ° C. The approximately 200 bp PCR fragment containing the intron was digested with PvuII and KpnI, gel purified, and inserted into pCEP4 digested with PvuII and KpnI. Plasmid pCEP4int with the correct size insert was identified. The structure of the intron was confirmed by DNA sequencing. FLAG-ARP-Phe in pCEP4 was digested with NheI and BamHI. The 400 bp insert was gel purified and cloned into pCEP4int digested with NheI and BamHI to design the plasmid FLAG-ARP-Phein pCEP4int (FIG. 33).
[0340]
Example 8: Transient transfection of mammalian cells with ARP and BRP
Unless otherwise stated, the HEK293EBNA cell line (ATCC, CRL 10852) was used for the production of ARP and BRP fusion proteins. Cell cultures were grown at 37 ° C., 5% CO 2 during growth and incubation procedures.₂, 95% humidity. Jordan et al. (Nucleic Acids Research. 24: 596-601, 1996) using the calcium phosphate precipitation procedure described in Dulbecco's Modified Eagle Medium F supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% L-glutamine in growth medium. -12 (DMEM / F-12) except for transient transfection. About 1 hour prior to transfection, the growth medium was removed, replaced with transfection medium (DMEM / F-12 supplemented with 2% FBS and 1% L-glutamine), and the calcium phosphate precipitated DNA was removed. Was added. Generally, 12.5 μg to 25 μg of DNA per 100 mm dish was used for one plasmid transfection. For co-transfection, a mixture of 12.5 μg of each plasmid DNA was used. After 4-6 hours, the transfection medium was replaced with growth medium. After about 24 hours, the growth medium was supplemented and replaced with DMEM / F-12 (collection medium). After 48-72 hours, the collection medium was removed, centrifuged to remove debris, saved for analysis or concentration, and fresh collection medium was added to the cell culture. After an additional 48-72 hours, the harvest media was removed, centrifuged, stored, and the cells discarded. Concentration of the media was performed using Centriprep YM-10 (Amicon) according to the protocol specified by the manufacturer.
[0341]
Example 9: Stable transfection of mammalian cells with ARP and BRP
Stable transfection with the pCEP4 derived plasmid was performed as described for transient transfection, except that no harvesting medium was used. About two days after transfection, the growth medium was replaced with selection medium (DMEM-F12 supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine, and 250 μg / ml hygromycin). The selection medium was changed every 2-3 days until cells were confluent and ready for freezing and splitting for production scale up.
[0342]
Example 10: Detection of secreted GFP fusion protein in medium
Both ARP-GFP and BRP-GFP, complete with their native signal peptide sequence, are secreted into the medium and capture of the fusion protein using Reacti-Bind Anti-GFP strip plates (Pierce 15188), or It could be detected by anti-GFP western blot.
[0343]
To analyze the BRP-GFP fusion protein by Western blot, 1 microliter, 2 microliters, and 5 microliters of concentrated media from transient transfection of BRP-GFP were analyzed. COS-7 cells (African green monkey kidney cells transformed with replication defective SV40, ATCC cell line 1651) were used for this experiment. 100 per well in 500 microliters Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% v / v FBS, 1% v / v 200 mM L-glutamine, and 1% v / v 100 mM pyrabate. Cells are seeded at a cell density of 2,000 on 24-well plates and are sterile at 37 ° C., 5% CO 2.₂And 95% humidity. The following day, cells were transfected by lipofection by adding 1 microgram of BRP-GFP plasmid DNA coupled to Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Inc.) to each well according to the manufacturer's instructions. The day after transfection, the cells were replaced with serum-free medium (DMEM supplemented with 1% v / v L-glutamine and 1% v / v pyruvate), and after 3 days of culture, the medium was collected and Amicon was collected. It was concentrated using a Centriprep centrifugal concentrator (YM-10) and subjected to SDS-PAGE. A sample of ARP-GFP from a similar COS transfection with plasmid pEGFP-N2-ARP (2 microliters), as well as a sample from COS-7 cells exposed to DNA-free transfection conditions (1 microliter) ) Was also analyzed. When present in 5 microliters of BRP-GFP sample (6.85 micrograms of total protein), the ARP-GFP so that each contains approximately the same amount of total protein (based on BCA analysis of protein content). And control sample volume were chosen.
[0344]
Electrophoresis was performed using a 10% NuPAGE® Bis-Tris precast gel and reagents from Invitrogen. The sample is combined with pure water (and 1 microliter of reducing agent (0.5M dithiothreitol) for the reduced sample) and 2.5 microliters of 4x NuPAGE® LDS sample buffer ( Novex NP007) and a final volume of 10 microliters. After heating these diluted samples at 70 ° C. for 5 minutes, the samples were loaded on a 15-well Invitrogen 10% Bis-Tris NuPAGE gel. A sample of the GFP standard (4 nanograms, Clontech) was included as a positive control in the Western blot. An extensively colored marker from Bio-Rad (catalog # 72807A) was used in addition to the biotinylated marker from Bio-Rad. Electrophoresis was performed with MOPS running buffer (Novex NP005) at a constant voltage (125 V) and stopped when Serva Blue from sample buffer reached the bottom of the gel. The proteins were transferred from the gel to a PVDF membrane (Novex LC0002) using NuPAGE transfer buffer and Hoeffer TE22 Transformer (using a constant current of -400 mA). After transcription (confirmed by transfer of the colored marker from the gel to PVDF), incubate the non-specific binding sites on the membrane in water with 1 × casein (Vector Labs SP5020) at 4 ° C. overnight. Blocked by. After blocking, the membranes were incubated three times for 5 minutes each in TBST (1OO mM Tris / 0.9% NaCl, pH 7.5 + 0.1% Tween 20) with gentle shaking. Washed. The membrane was then incubated at room temperature for 30 minutes in a solution of the primary antibody (Rockland biotinylated goat anti-GFP 60010615) diluted 1/2000 in TBST, after which the membrane was incubated in TBST as described above. Washed twice. Bound antibody detection was performed using reagents from the Vectastain ABC-AP kit (Vector Laboratories AK5001).
[0345]
As can be seen in FIG. 34, both BRP-GFP and ARP-GFP were easily detected in the medium from the transfected cells. Under non-reducing conditions, both ARP-GFP and BRP-GFP show reduced or absent multimeric form in reduced samples.
[0346]
Example 11: Detection of secreted FLAG fusion protein and comparison of FLAG-ARP expression with and without intron
HEK293EBNA cells were transiently transfected with plasmids FLAG-BRPin pCEP4, FLAG-ARP-Phein pCEP4 and FLAG-ARP-Phein pCEP4int. Culture supernatants were collected and concentrated. Using SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen) using 10 μl, 5 μl, and 2 μl of the concentrated supernatant from each ARP transfection, and 5 μl of the concentrated culture supernatant from BRP transfection for protein size separation did. The proteins separated by size were electrically transferred to a PVDF membrane. Following transfer, the membrane was blocked in 5% powdered dry milk at 4 ° C. overnight. The remaining steps were performed at room temperature. The membrane was washed five times with PBST (phosphate-buffered saline, 0.05% Tween 20) and then diluted 1: 500 in anti-FLAG M2 antibody (Sigma-Aldrich) in PBS containing 5% bovine serum albumin. # F3165) for 1 hour. After washing four times with PBST, the membrane was washed in a solution containing goat anti-mouse IgG (H + L) -HRP conjugate (Bio-Lads # 170-6516) diluted 1: 3000 in PBST + 5% powdered dry milk. Incubated for 1 hour. The membrane was washed 5 times with TBST (1X Tris buffered saline from 10X concentrate # 170-64351, 0.05% Tween 20), followed by one wash with Tris buffered saline pH 9.5 (TBS). . HRP was detected by BM chemiluminescent substrate (POD) (Roche Molecular Biochemicals 1500694) using the protocol supplied by the manufacturer. Typhoon 8600 Variable Mode Imager (Molecular Dynamics, Inc. Sunnyvale, CA) was used for quantification of the signal from the FLAG-ARP-Phe fusion protein. FLAG-BRP and FLAG-ARP were clearly detectable as Mr 21.5 kDa and Mr 24.2 kDa bands, respectively (FIG. 35). The FLAG-ARP-Phe pCEP4int transfection signal was 1.9X, 2.8X, 16X higher than the FLAG-ARP-Phe pCEP4 transfection signal for 10 μl, 5 μl, and 2 μl loadings, respectively. These results indicate that the presence of the intron enhances the expression of the ARP protein, and thus the inclusion of an intron or genomic clone in the expression construct is the best way to produce this protein.
[0347]
Example 12: Demonstration of ARP-BRP heterocomplex formation
Method 1 : AP By detection GFP Capture
Reacti-Bind Anti-GFP strip plates (pierce 15188) were washed three times with 200 μl of PBST. Culture supernatant from HEK293EBNA transient transfection with plasmids encoding AP-ARP + BRP-GFP (co-transfection), AP-BRP + ARP-GFP (co-transfection), and AP control (single plasmid transfection with pAPtag5) Was diluted 1: 2, 1: 6, and 1:10 with PBS. Duplicate 100 μl aliquots of undiluted and diluted culture supernatant were placed in wells and incubated at room temperature for 20 minutes. After four washes with 200 μl of PBST, 50 μl of distilled water was added to the wells treated with the culture supernatant. For the calibration curve, 50 μl of serially diluted AP protein (2-fold dilution from 390 ng / ml to 6.1 ng / ml) was added to the decanted wells. For further control, 50 μl of culture supernatant (distilled H₂A 1:10 dilution (in O) was added to the empty wells at this point to measure total AP. 50 μl of AP assay reagent A (GenHunter® Corporation, Nashville, TN) was added per well to the test samples and AP standards. The side of the plate was tapped gently to mix the reagent and then incubated for 10 minutes at 37 ° C. The reaction was stopped by adding 100 μl of 0.5 N NaOH to each well. The absorbance at 405 nm was measured with a plate reader. Representative assay results are shown in Table 8.
[0348]
[Table 8]

[0349]
Method 2 . FLAG By detection GFP Capture
HEK293EBNA transient transfection with plasmids encoding FLAG-BRP + ARP-GFP (co-transfection), FLAG-ARP + BRP-GFP (co-transfection), FLAG-BRP (single plasmid), ARP-GFP (single plasmid) Culture supernatants, as well as DNA-free controls, were used for GFP capture by the procedure described in Method 1. After the capture step and PBST wash, 100 μl of anti-FLAG M2 monoclonal antibody (Sigma-Aldrich # F3165) diluted 1: 500 (in PBST) was added to each well and left at room temperature for 1 hour or 4 ° C. For overnight. The wells were washed four times with 200 μl of PBST and then 100 μl of a 1: 2000 dilution (by PBST) of goat anti-mouse IgG (H + L) -AP conjugate (Bio-Lads S232425) was added to each. . After 5 washes with 200 μl of PBST, 50 μl of distilled water was added to each well and AP assay reagent A was used as described in Method 1 to measure the captured protein. Table 9 shows the results.
[0350]
[Table 9]

[0351]
Method 3. Immunoprecipitation with anti-FLAG-monoclonal antibody and detection of AP
Codes AP-ARP + BRP-GFP (co-transfection), AP-BRP + ARP-GFP (co-transfection), AP-BRP + FLAG-ARP-Phe (co-transfection), and AP-ARP-Phe + FLAG-BRP (co-transfection) Culture supernatants from HEK293EBNA transient transfections with both plasmids (both first and second 48-72 hour harvests) were used for immunoprecipitation experiments. For each immunoprecipitation reaction, 50 μl of MPG beads (CPG Inc.) were washed three times with 1 ml of PBST using a magnetic separator. After the last wash, the beads were resuspended in 1 ml PBST. To this was added 5 μl of a 4 μg / μl solution of anti-FLAG M2 monoclonal antibody (Sigma-Aldrich, F3165). The mixture was incubated for 20 minutes at room temperature using a rotator. After 5 washes with 1 ml PBST, the beads were resuspended in 0.5 ml or 0.1 ml test culture supernatant samples and PBST was added to each to a total volume of 1 ml. The FLAG-tagged protein was captured overnight at 4 ° C. using a rotator. The beads were washed 5 times with PBST and resuspended in 50 μl of distilled water. Incubate with 50 μl of AP Assay Reagent A and stop the reaction with NaOH as described in Method 1. After stopping the reaction, 100 μl aliquots were collected from each well into separate tubes and diluted with 400 μl distilled water. The absorbance at 405 nm was measured with a spectrophotometer. Table 10 shows the results.
[0352]
[Table 10]

[0353]
Taken together, the results indicate that the BRP and ARP fusion proteins interact to form a heterocomplex. Therefore, it is considered that the natural form of the protein forms a hetero complex having a specific physiological activity.
[0354]
Example 13: Small scale production of FLAG-BRP
HEK293EBNA cells stably transfected with the expression plasmid FLAG-BRPin pCEP4 were spread in four T-175 flasks (Falcon, Cat # 353112) using growth medium. When approximately confluent, the cells were treated with trypsin (Gibco Cat # 25300-054), pooled and 6320 cm3.²Cell factory (Nunc Cat # l 64327). The growth medium is supplied to the cells when needed until they reach confluence, and when they are reached, the growth medium is added to the production medium (1 mg / l insulin, 12.24 mg / l iron citrate oxide, and DMEM / F-12) containing 0.0068 mg / 1 selenium. The production medium was removed every 2-3 days and replaced with fresh production medium (1500-2250 ml) to produce several lots. Immediately after collection, each lot was filtered through a Gelman 0.45 μm mini-capsule filter (Gelman, Cat # 12123), then placed in Nalgene PETG bottles (Cat # 2019-0500, and 2019-1000) and -80. Stored at ° C.
[0355]
Example 14: Recognition of human BRP homocomplex
After concentration of the raw culture supernatant from two small-scale production lots, FLAG-BRP was immunized to approximately 75% identity using anti-FLAG-agarose affinity gel (Sigma, # A-1205). Affinity purified. The purified protein was analyzed by SDS-PAGE and anti-FLAG-specific Western blot using a Tris-Tricine buffer system of Sagger and von Jagow (Anal Biochem. 1987 Novl; 166 (2): 368-79). FIG. 36 shows images of silver stained gels ordered for apparent molecular weight and anti-FLAG western blot. Pre-treatment conditions of 10 minutes at 70 ° C., 2 minutes at boiling, and 2 minutes at boiling in the presence of 2% β-mercaptoethanol were chosen because under these conditions, FSH was heterodimer and dissociated, respectively. Heterodimers were chosen because they exist as reduced dissociated heterodimers (see FSH comparison with silver stained gels).
[0356]
Detection of the reduction sensitive band of Mr 36 kDa in both lots by silver staining suggests that at least a portion of the purified FLAG-BRP protein is present as a covalent homodimer. This 36 kDa band is unlikely to be an artifact of a transient expression system or an immunoaffinity purification procedure.
[0357]
Example 14: ARP / BRP in situ histochemistry
Animal and tissue preparation
Mature 60-day-old Sprague-Dawley rats were used. Animals had free access to food and water. Tissue sections were prepared according to published procedures (Flanagan et al., Methods in Enzymology, Vol. 327 p19-31).
In situ analysis of AP-B5ARP or AP-B5 binding to rat tissue
Sections were cut twice, 10 mM Tris, pH 7.6, 5 mM MgCl₂Wash with buffer for 5 minutes at room temperature, then block buffer (10 mM Tris, pH 7.6, 5 mM MgCl 2)₂, 2.5% BSA) at room temperature for 1 hour. The sections were then incubated with one of the following treatments:
1. Conditioned media from 293 cells transfected with pAPtag5 (GenHunter) (AP)
2. Conditioned media from 293 cells transfected with AP-BRP in pAPtag5 (AP-BRP)
3. Conditioned media from 293 cells transfected with AP-BRP in pAPtag5 (AP-BRP) and FLAG-ARP-Phe in pCEP4 (AP-BRP / FLAG-ARP-Phe)
4. Conditioned media from 293 cells co-transfected with AP-BRP in pAPtag5 and FLAG-ARP-Phe in pCEP4, as well as His-ARP-Phe + FLAG-BRP (AP-BRP / FLAG-ARP-Phe + FLAG-BRP / His- Conditioned media from 293 cells co-transfected with ARP-Phe)
5. Conditioned media from 293 cells transfected with AP-BRP in pAPtag5 (AP-BRP), and also partially purified FLAG-BRP (AP-BRP + FLAG-BRP).
[0358]
Incubation with the AP protein was performed in blocking buffer overnight at room temperature. After incubation, the sections were then washed six times with cold blocking buffer and fixed in 20 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing acetone (60%) and formaldehyde (3%) for 30 seconds. The fixed sections were then washed in HS buffer (20 mM HEPES containing 150 mM NaCl, pH 7.5) and heated at 65 ° C. for 30 minutes to inactivate endogenous alkaline phosphatase activity. After complete removal of the HS buffer, the sections were stained for AP activity using GenHunter AP assay reagent S to detect AP activity bound to the cell surface.
[0359]
Other aspects
While the present invention has been described in connection with its detailed description, it is understood that the foregoing description is intended to be illustrative and does not limit the scope of the invention, which is set forth in the appended claims. Defined by the scope of the term. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 4 is a depiction of the nucleotide sequence of the novel beta-related protein according to the invention (SEQ ID NOs: 1 and 3).
FIG. 2
FIG. 2 is a depiction of the translated amino acid sequence of a novel beta-related protein according to the invention (SEQ ID NOs: 2 and 4).
FIG. 3
FIG. 4 is a depiction of the deduced signal sequence of a beta-related protein according to the present invention (SEQ ID NO: 10).
FIG. 4-1
FIG. 6 is a depiction of the portion of Genbank Accession No .: AL118555 containing the genomic coding sequence and product. Exxons are bold.
FIG. 4-2
It is a continuation of FIG.
FIG. 4-3
It is a continuation of FIG.
FIG. 5
Alignment of the human BRP polypeptide sequence (also called beta 5; SEQ ID NO: 2) with LHβ (SEQ ID NO: 6); FSHβ (SEQ ID NO: 7); CGβ (SEQ ID NO: 8); TSHβ (SEQ ID NO: 9).
FIG. 6
2 illustrates the identity (% above the diagonal) and similarity (% below the diagonal) of the BRP sequence compared to other glycoprotein hormone beta subunits. Analyzed using BLAST and shows the identity and similarities that occur across the core mature sequence (ie, from cys9 [hCG numbering] to cys100).
FIG. 7A
It is a depiction model of a BRP structure. Panel A illustrates the lack of a seatbelt domain.
FIG. 7B
It is a depiction model of a BRP structure. Panel B illustrates the location of glycosylation on BRP compared to hCG and FSH.
FIG. 8
2 illustrates a Kyte-Doolittle hydrophobicity plot of human BRP.
FIG. 9
2 illustrates a Hopp-Woods hydrophobicity plot of human BRP.
FIG. 10
The BRP-hCG fusion protein according to the present invention will be described. Bold amino acids indicate amino acid sequences derived from hCG. The underlined amino acids indicate the amino acid sequence derived from ARP / BRP.
FIG. 11
The BRP-hFSH fusion protein according to the present invention will be described. Bold amino acids indicate amino acid sequences derived from hFSH. The underlined amino acids indicate the amino acid sequence derived from ARP / BRP.
FIG. 12-1
FIG. 2 is a depiction of the nucleotide sequence of a novel alpha-related protein according to the present invention (SEQ ID NOs: 17, 19, and 21).
FIG. 12-2
It is a continuation of FIG.
FIG. 12-3
It is a continuation of FIG.
FIG. 12-4
It is a continuation of FIG.
FIG. 13
FIG. 3 is a depiction of the translated amino acid sequence of a novel alpha-related protein according to the present invention (SEQ ID NOs: 18, 20, and 22). "＾" indicates the predicted start site of the mature protein.
FIG. 4
SEQ ID NO: 23 is a depiction of an expanded genomic fragment of chromosome 11 (Homo sapiens chromosome 11q13 BAC Clone b79g17, GenBank accession number AC000159).
FIG.
Figure 2 is an alignment of the human ARP polypeptide sequence (SEQ ID NO: 18) with FSHα (SEQ ID NO: 26) and FSHβ (SEQ ID NO: 27). Red letters indicate identical residues in hARP found in hFSHα or hFSHβ. Yellow means cysteine.
FIG.
FIG. 6 is a depiction of the portion of Genbank Accession No. AC000159 (ARP) containing the genomic coding sequence and translation product. Exons are underlined and underlined, and polyadenylation signals are underlined.
FIG.
Figure 5 is a depiction of Northern blot analysis of ARP mRNA.
FIG.
Figure 3 is a depiction of a multi-tissue expression (MTE) blot analysis of Arp gene expression.
FIG.
(A) Drawing of a plasmid construct "hBRP in pCR4Blunt" containing the BRP open reading frame. The amino acid translation of the DNA sequence and open reading frame is also shown in (B).
FIG.
(A) Drawing of a plasmid construct “BRP-NTAP” containing a BRP open reading frame without a secretory signal peptide. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are also shown in (B).
FIG. 21
(A) Drawing of a plasmid construct “AP-BRP in pAPtag5” containing an open reading frame encoding an AP-BRP fusion protein. The DNA sequences and amino acid translations of some of the AP and BRP (in bold) are also shown in (B).
FIG. 22
FIG. 2 is a drawing of a plasmid construct “BRP-GFP in pcDNA3.1” containing an open reading frame encoding a BRP-GFP fusion protein.
FIG. 23
2 is a depiction of the DNA sequence and amino acid translation of the BRP-GFP fusion protein encoded by the plasmid “BRP-GFP in pcDNA3.1”.
FIG. 24
(A) Drawing of a plasmid construct “FLAG-BRP in pFLAGCMV-1” containing an open reading frame encoding a FLAG-BRP fusion protein. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are shown in (B). Arrows indicate components of the fusion protein. The amino acid sequence of BRP is in bold.
FIG. 25
It is a drawing of a plasmid construct "FLAG-BRP in pCEP4".
FIG. 26
FIG. 2 is a drawing of a plasmid construct “pBS-SKIIhARP.4” containing an ARP open reading frame. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are also shown in (B).
FIG. 27
2 is a depiction of the ARP-Leu protein DNA sequence and corresponding translation. Single nucleotide site differences result from the same ARP-Phe format.
FIG. 28
(A) Drawing of a plasmid construct “pBS-SKII hARP-Phe” containing an open reading frame encoding ARP-Phe protein. The DNA sequence and amino acid translation are also shown in (B).
FIG. 29
FIG. 2 is a drawing of a plasmid construct “pEGFP-N2-ARP” containing an open reading frame encoding an ARP-GFP fusion protein.
FIG. 30
FIG. 2 is a depiction of the DNA sequence and amino acid translation of the ARP-GFP fusion protein encoded by the plasmid “pEGFP-N2-ARP”.
FIG. 31
(A) Drawing of the plasmid construct “pAPtag5 (RI) ARP-Phe” containing the open reading frame encoding the AP-ARP-Phe fusion protein. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are shown in (B). Arrows indicate components of the fusion protein. The amino acid sequence of ARP is in bold.
FIG. 32
(A) Drawing of a plasmid construct “FLAG-ARP-Phe in pCEP4” containing an open reading frame encoding a FLAG-ARP-Phe fusion protein. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are shown in (B). Arrows indicate components of the fusion protein. The amino acid sequence of ARP is in bold.
FIG. 33
It is a drawing of a plasmid construct "FLAG-ARP in pCEP4".
FIG. 34
Figure 5 is a depiction of a Western blot analysis of secreted ARP-GFP and BRP-GFP fusion proteins.
FIG. 35
Figure 4 is a depiction of a Western blot analysis of secreted FLAG-BRP and FLAG-ARP fusion proteins.
FIG. 36
FIG. 4 is a depiction of SDS-PAGE and Western blot analysis of purified BRP protein.
FIG. 37
Figure 4 is a photomicrograph of rat testis showing that AP-BRP binds to testis cells and can be replaced by FLAG-BRP. Panel a) AP alone, b) AP-BRP, c) AP-BRP and 390 nM FLAG-BRP.
FIG. 38
Microscope of rat ovary showing that AP-tagged protein from AP-BRP + FLAG-ARP-Phe co-transfection binds to ovarian cells (luteal body) and is replaced by FLAG-BRP / His-ARP-Phe It is a photograph. Panel a) AP alone, b) AP-BRP + FLAG-ARP-Phe, c) Culture supernatant from co-transfection of AP-BRP + FLAG-ARP-Phe and FLAG-BRP / His-ARP-Phe.
FIG. 39
Microscope of rat ovary showing that AP-tagged protein from AP-BRP + FLAG-ARP-Phe co-transfection binds to ovarian cells (follicles) and is replaced by FLAG-BRP / His-ARP-Phe It is a photograph. Panel a) AP alone, b) AP-BRP + FLAG-ARP-Phe, c) Culture supernatant from co-transfection of AP-BRP + FLAG-ARP-Phe and FLAG-BRP / His-ARP-Phe.
FIG. 40
FIG. 4 is a photomicrograph of rat testis showing that AP-tagged protein from AP-BRP + FLAG-ARP-Phe co-transfection binds to testis cells and is replaced by FLAG-BRP / His-ARP-Phe. . Panel a) AP alone, b) AP-BRP + FLAG-ARP-Phe, c) Culture supernatant from co-transfection of AP-BRP + FLAG-ARP-Phe and FLAG-BRP / His-ARP-Phe.
FIG. 41
(A) Drawing of a plasmid construct “6Hisg-ARP-Phe-pCEP4int” containing an open reading frame encoding a 6Hisg-ARP-Phe fusion protein. The DNA sequence and amino acid translation of the open reading frame are shown in (B). Arrows indicate components of the fusion protein. The amino acid sequence of ARP is in bold.

Claims (40)

An isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence at least 75% identical to SEQ ID NO: 2 or 4, or the complement of the above nucleic acid molecule. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the nucleic acid molecule hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid sequence that is complementary to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or The complement of a nucleic acid molecule. 2. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the nucleic acid molecule encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence comprising one or more conservative substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. An isolated nucleic acid molecule. 2. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the nucleic acid molecule encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or the complement of the nucleic acid molecule. 2. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or the complement of the nucleic acid molecule. 2. The nucleic acid molecule according to claim 1, wherein said nucleic acid molecule has a nucleotide sequence of cDNA. The nucleic acid molecule of claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises adjacent nucleotides that encode the amino acid sequence WEKPI (SEQ ID NO: 5). below:
(A) encodes a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and (b) includes adjacent nucleotides encoding the amino acid sequence WEKPI (SEQ ID NO: 5);
Or an complement of the nucleic acid molecule. A nucleic acid molecule having a length of less than 100 nucleotides and comprising at least six adjacent nucleotides of SEQ ID NO: 1 or a complement thereof. A nucleic acid vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 1. A host cell comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 1. below:
a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4;
b) a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, wherein said fragment comprises at least six adjacent amino acids of SEQ ID NO: 2;
c) a derivative of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4;
d) an analog of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4;
e) a homolog of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4; and f) a naturally occurring allelic variant of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, wherein said polypeptide is a stringent Encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under conditions to the nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 1 or 3.
An isolated polypeptide at least 80% identical to a polypeptide selected from the group consisting of: The polypeptide or a fragment thereof,
a) binds to the glycoprotein hormone receptor;
b) binds to an LGR orphan G-protein coupled receptor;
13. The polypeptide of claim 12, which binds c) to a glycoprotein hormone; or d) to cystine knot protein. 13. The polypeptide of claim 12, wherein said polypeptide or fragment thereof is glycosylated at one or more sites. 13. The polypeptide of claim 12, wherein said polypeptide or a fragment thereof is not glycosylated. 13. The polypeptide of claim 12, wherein said polypeptide or a fragment thereof comprises a cystine knot domain. A protein multimer comprising a first polypeptide corresponding to the polypeptide according to claim 12 and a second polypeptide. A protein multimer comprising an ARP polypeptide and a second polypeptide. 19. The protein multimer according to claim 17 or 18, wherein the second polypeptide is the same as the first polypeptide. 18. The protein multimer of claim 17, wherein said second polypeptide is an alpha glycoprotein subunit. 19. The protein multimer of claim 18, wherein said second polypeptide is a beta glycoprotein subunit. 19. The protein multimer according to claim 17 or 18, wherein the second polypeptide is a cystine knot protein. 18. The protein multimer of claim 17, wherein said second polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 19. The protein multimer according to claim 17, wherein the protein multimer is a dimer. An antibody that selectively binds to the polypeptide of claim 12, and fragments, homologs, analogs, and derivatives of the antibody. An antibody that selectively binds to the protein multimer according to claim 17 or 18, and fragments, homologs, analogs, and derivatives thereof. A method for producing a BRP polypeptide, comprising the step of culturing the host cell according to claim 11, under conditions under which a nucleic acid molecule is expressed. 13. A method for detecting the presence of a polypeptide according to claim 12 in a sample, comprising contacting said sample with a compound that selectively binds to the polypeptide according to claim 12. Determining the presence of a compound bound to the polypeptide of the above. 2. A method for detecting the presence of a nucleic acid molecule according to claim 1 in a sample, wherein the sample is contacted with a nucleic acid probe or primer that selectively binds to the nucleic acid molecule, and the nucleic acid according to claim 1. Such a method, comprising determining whether said nucleic acid probe or primer bound to a molecule is present in said sample. 13. A method for regulating the activity of a polypeptide according to claim 12, wherein a cell sample containing the polypeptide according to claim 12 is added to the polypeptide in an amount sufficient to regulate the activity of the polypeptide. Such a method, comprising contacting with the compound to be bound. A method of treating or preventing a reproductive disorder in a subject, the method comprising the following in an amount sufficient to treat or prevent the reproductive disorder in the subject:
a) ARP / BRP nucleic acids;
b) ARP / BRP polypeptide; and c) ARP / BRP antibody;
The method comprising administering to a subject in need thereof a therapeutic agent selected from the group consisting of: 19. A method for treating or preventing a reproductive disorder in a subject, wherein the therapeutic agent is administered in an amount sufficient to treat or prevent the reproductive disorder in the subject, the therapeutic agent comprising the protein multimer according to claim 17 or 18. The above method comprising administering to a subject in need thereof. Therapeutically or prophylactically effective amounts of the following:
a) ARP / BRP nucleic acids;
b) ARP / BRP polypeptide; and c) ARP / BRP antibody;
A pharmaceutical composition comprising a therapeutic agent selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of a therapeutic agent selected from the group consisting of the protein multimers of claim 17 or 18, and a pharmaceutically acceptable carrier. A kit comprising one or more containers comprising a therapeutic or prophylactically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 33 or 34. A method for screening for modulators of reproductive disorder activity or potential or predisposition, comprising:
a) administering a test compound to a test animal expressing the ARP / BRP polypeptide by genetic modification at a high risk for the pathology associated with the polypeptide of claim 1;
b) measuring the activity of the polypeptide in the test animal after administering the compound of step (a), and c) determining the activity of the protein in the test animal in a control animal not receiving the polypeptide. Comparing to the activity of the polypeptide, wherein a change in the activity of the polypeptide in the test animal relative to the control animal indicates that the test compound is a modulator of a potential or predisposition to reproductive disorders. Including the above method. The test animal is a transgenic test animal expressing the test protein transgene or expressing the transgene under the control of a promoter at an elevated level relative to wild-type, and the promoter is 36. The method of claim 35, wherein the transgene is not a native gene promoter. A method for determining the presence or predisposition of a reproductive disorder in a subject, comprising:
a) measuring the amount of ARP / BRP polypeptide or ARP / BRP multimer in the sample from the subject; and b) determining the amount of the polypeptide in step (a) in the control sample. Comparing to the amount of peptide,
Wherein the change in the level of the polypeptide or multimer in step (a) is indicative of a disease state when compared to a control sample. A method for determining the presence or predisposition of a reproductive disorder in a subject, comprising:
a) measuring the amount of ARP / BRP nucleic acid in a sample from a mammalian subject; and b) comparing the amount of said nucleic acid in step (a) with the amount of said nucleic acid present in a control sample.
Wherein the change in the level of the nucleic acid in step (a) is indicative of a disease state when compared to a control sample. A method for expressing an ARP / BRP polypeptide as a product of an endogenous gene in a cell, comprising:
(A) transfecting cells with a DNA construct comprising a transcriptional regulatory element operably linked to the endogenous gene, thereby producing a genetically modified cell, and / or (b) Transfecting the cells with a DNA construct comprising an amplifiable gene and a DNA targeting sequence into which an operably linked amplifiable gene can be inserted, thereby producing a transgenic cell; Culturing the genetically modified cells and, if desired, selecting cells containing multiple copies of the endogenous gene,
Wherein the polypeptide is expressed at an altered level relative to wild-type cells.

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