JP2004526414A - 薬物代謝酵素 - Google Patents

Abstract

本発明はヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）およびＤＭＥを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＤＭＥの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、薬剤代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明はまた、これらの配列を自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患の診断・治療・予防に利用することに関する。 本発明はさらに、薬剤代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
薬剤の代謝および薬剤の体内での移動（薬物動態学）は、その効果、毒性、および他の薬剤との相互作用を決定する上で重要である。薬剤の吸収、様々な組織への分布、および薬剤代謝産物の排泄の３つのプロセスが薬物動態を支配している。様々な代謝調節によって、溶解性、受容体との結合性、および排泄速度を含む薬剤の物理化学的特性および薬理学的特性の大部分が変えられるため、これらのプロセスは、薬剤代謝に密接に関連している。薬剤を変える代謝経路はまた、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびビタミン等の様々な天然の基質を受容する。従って、これらの経路における酵素は、天然の化合物、薬剤、発癌物質、変異誘発物質および生体異物との間の生化学的および薬理学的相互作用の重要部位となる。
【０００３】
薬剤代謝における遺伝的な差異が、個人間において薬剤効果および毒性のレベルの著しい違いを引き起こすことが以前から知られている。治療指数が狭い薬剤、またはコデイン等の生理活性を必要とする薬剤の場合、このような遺伝子多型は極めて重要である。更に、一部の患者群のみに副作用を引き起こす毒性があることから有望な新規の薬剤が臨床試験で排除されることがよくある。薬剤代謝酵素が重要な部分を占める薬理ゲノミックス研究が進歩すれば、薬剤の効果および毒性の疑問に耐え得るツールが発展し、そのような情報が拡大されるであろう（Ｅｖａｎｓ， Ｗ． Ｅ．およびＲ． Ｖ． Ｒｅｌｌｉｎｇ （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６ ： ４８７−４９１を参照）。
【０００４】
薬剤代謝反応は、薬剤分子を機能させて更なる代謝のために準備するフェーズＩ、およびそれに引き続くフェーズＩＩに分類される。一般に、フェーズＩの反応生成物は部分的或いは完全に不活性であり、フェーズＩＩの反応生成物は主に排泄物である。しかしながら、フェーズＩ反応生成物は、投与された元の薬剤よりも活性が高い場合があり、この代謝活性の原理がプロドラッグとして利用される（例えば、Ｌ−ボドパ）。加えて、或る種の非毒性化合物（例えば、アフラトキシン、ベンゾ［ａ］ピレン）は、これらの経路を経て代謝されて毒性中間体になる。フェーズＩ反応は通常、薬剤代謝における律速段階である。化合物或いは他の複数の化合物への事前の暴露によって、フェーズＩ酵素の発現を誘発させることができるが、それによってこの代謝経路を介する基質の流入が増大する（Ｋｌａａｓｓｅｎ， Ｃ． Ｄ．他（１９９６） Ｃａｓａｒｅｔｔ ａｎｄ Ｄｏｕｌｌ’ｓ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ： Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １１３−１８６ 頁； Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ． Ｇ． （１９９５） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ および Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ， ４８−５９頁 ； Ｇ． Ｇ． Ｇｉｂｓｏｎ および Ｐ． Ｓｋｅｔｔ （１９９４） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ， Ｌｏｎｄｏｎを参照）。
【０００５】
薬剤代謝酵素（ＤＭＥ）は幅広い基質特異性を有する。これは、多種多様な抗体がそれらの抗原に対して高い特異性を有する免疫系とは対照的である。多様な分子を代謝するＤＭＥの能力によって、代謝レベルにおける薬剤の相互作用の可能性が生まれる。例えば、或る化合物によってＤＭＥが誘導されることにより、その酵素によって別の化合物が代謝され得る。
【０００６】
ＤＭＥは、それらが触媒する反応の種類および関係する補助因子に従って分類することができる。フェーズＩ酵素の主なクラスには、限定するものではないがチトクロームＰ４５０およびフラビン含有モノオキシゲナーゼが含まれる。フェーズ Ｉ 型触媒サイクルおよび反応に関与する他の酵素のクラスには、限定するものではないが、ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）、ミクロソームチトクロームｂ５／ＮＡＤＨチトクロームｂ５レダクターゼ系、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼレドックス対、アルド／ケト還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。フェーズＩＩ酵素の主なクラスには、限定するものではないが、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、Ｎアシルトランスフェラーゼ、およびＮアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０００７】
チトクローム Ｐ４５０ および Ｐ４５０ 触媒サイクル関連酵素
酵素チトクロームＰ４５０のスーパーファミリーのメンバーは、様々な基質の酸化的代謝を触媒する。 そのような基質には、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびビタミン等の天然の化合物や、薬剤、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物が含まれる。Ｐ４５０ヘム−チオレートタンパク質としても知られるチトクロームＰ４５０は通常、Ｐ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる多成分電子伝達鎖における末端酸化酵素として作用する。触媒される特定の反応には、ヒドロキシル化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホキシド化、Ｎ−脱アルキル化、Ｓ−脱アルキル化、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元が含まれる。これらの反応は、動物における糖質コルチコイド、コルチゾール、エストロゲン、およびアンドロゲンのステロイド産生や、昆虫における殺虫剤耐性や、植物における除草剤耐性および花の発色や、微生物による環境浄化バイオレメディエーションに関係する。薬剤、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物にチトクロームＰ４５０が作用して、物質の解毒或いはより毒性の強い生成物への変換を引き起こし得る。チトクロームＰ４５０は肝臓に豊富に存在するが、その他の組織にも存在し、その酵素はミクロソームに存在する（ＥｘＰＡＳＹ ＥＮＺＹＭＥ ＥＣ １． １４． １４． １ ； Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｅｍｅ−ｉｒｏｎ ｌｉｇａｎｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ； ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ； Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ， Ｓ．およびＰｅｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ａ． （１９９６） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０ ： ２０６−２１４．を参照）。
【０００８】
４００種類のチトクロームＰ４５０が、細菌、真菌、植物、および動物を含む様々な生物において同定されている（Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ、前出）。Ｂクラスは原核生物および真菌に見られ、Ｅクラスは細菌、植物、昆虫、脊椎動物、および哺乳動物に見られる。５つのサブクラス即ちグループが、ＥクラスチトクロームＰ４５０の大きなファミリーの中に含まれる（ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ グループ Ｉ シグネチャ）。
【０００９】
全てのチトクロームＰ４５０はヘム補助因子を用いており、構造的特性を共有する。ほとんどのチトクロームＰ４５０は、４００〜５３０のアミノ酸の長さである。酵素の二次構造は、約７０％のαヘリックスと約２２％のβシートである。タンパク質のＣ末端部におけるヘム結合部位の周りの領域は、全てのチトクロームＰ４５０に保存されている。このヘム−鉄結合領域におけるアミノ酸１０個のシグネチャ配列が同定されており、この配列には第５の配位部位にあるヘム−鉄の結合に関与する保存されたシステインが含まれている。真核生物チトクロームＰ４５０では、通常は膜貫通領域がタンパク質の初めの１５〜２０のアミノ酸において見られ、通常は約１５の疎水性残基およびそれに続く正に帯電した残基からなる（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１前出 ； Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ前出を参照）。
【００１０】
チトクロームＰ４５０酵素は、細胞増殖および発達に関係する。この酵素は、化学物質を代謝して、ＤＮＡと付加物を形成する反応性中間体にすることで起こる化学的な変異誘発および発癌において或る役割を果たす（Ｎｅｂｅｒｔ， Ｄ． Ｗ．およびＧｏｎｚａｌｅｚ， Ｆ． Ｊ． （１９８７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６ ： ９４５−９９３）。これらの付加物が、発癌を引き起こすヌクレオチドの改変およびＤＮＡの再編成を引き起こし得る。肝臓およびその他の組織におけるチトクロームＰ４５０の発現は、多環式芳香族炭化水素、ペルオキシソーム増殖因子、フェノバルビタール、および糖質コルチコイドデキサメタゾン等の生体異物によって引き起こされる（Ｄｏｇｒａ， Ｓ． Ｃ．他 （１９９８） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２５ ： １−９）。チトクロームＰ４５０タンパク質は、Ｐ４５０遺伝子ＣＹＰ１Ｂ １における突然変異が原発性先天性緑内障を引き起こすように、目の発達に関与し得る（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） ＊６０１７７１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｉ （ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）， ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １ ； ＣＹＰ１Ｂ １）。
【００１１】
チトクロームＰ４５０は炎症および感染に関係する。肝チトクロームＰ４５０活性は、様々な感染および炎症性の刺激によって著しく増減される（Ｍｏｒｇａｎ， Ｅ． Ｔ． （１９９７） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２９ ： １１２９−１１８８）。ｉｎ ｖｉｖｏで観察される効果は、炎症誘発性のサイトカインおよびインターフェロンによって模倣され得る。２つのチトクロームＰ４５０タンパク質に対する自己抗体は、自己免疫性多発性内分泌腺−カンジダ−外胚葉性ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）即ち多腺性自己免疫症候群の患者に見られた（ＯＭＩＭ ＊２４０３００ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｅｎｏｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ−ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ−ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。
【００１２】
チトクロームＰ４５０における突然変異は、副腎皮質過形成（乳児期および幼児期の副腎機能不全において最も一般的）、偽ビタミンＤ−欠損くる病、脳腱黄色腫症（進行性の神経障害、早期アテローム性動脈硬化症、および白内障によって特徴付けられる脂質貯蔵病）、抗凝血薬であるクマリンおよびワルファリンに対する遺伝性の耐性を含む代謝障害に関係する（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ， Ｋ． Ｊ．他 （１９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９６８−１９７０頁 ； Ｔａｋｅｙａｍａ， Ｋ．他 （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７ ： １８２７−１８３０ ； Ｋｉｔａｎａｋａ， Ｓ．他 （１９９８） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８ ： ６５３−６６１ ； ＯＭＩＭ ＊２１３７００ Ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ ； および ＯＭＩＭ ＆ｎｕｍ；１２２７００ Ｃｏｕｍａｒｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）。チトクロームＰ４５０タンパク質アロマターゼの極端に高度の発現が、重度の女性化乳房（女性化）の少年の繊維層板肝細胞癌に見られた（Ａｇａｒｗａｌ， Ｖ． Ｒ． （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８３ ： １７９７−１８００）。
【００１３】
チトクロームＰ４５０触媒サイクルは、ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）によるチトクロームＰ４５０の還元によって完了する。チトクロームｂ５およびＮＡＤＰＨチトクロームｂ５レダクターゼからなる別のミクロソーム電子伝達系からのチトクロームＰ４５０触媒サイクルへの電子の寄与は、小規模であると一般的に見られている。しかしながら、Ｌａｍｂ， Ｄ． Ｃ．他（１９９９ ； ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４６２ ： ２８３−２８８）による近年の研究報告から、ミクロソームチトクロームｂ５／ＮＡＤＰＨチトクロームｂ５レダクターゼ系によって効果的に還元され、支持され得るＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ５１）が確認された。従って、この別の電子供与系によって支持される多くのチトクロームＰ４５０が存在すると思われる。
【００１４】
チトクロームｂ５レダクターゼはまた、赤血球細胞における酸化型ヘモグロビン（酸素を保持することができないメトヘモグロビン）を活性型ヘモグロビン（フェロヘモグロビン）へ還元する。酸化剤、または十分に還元されていない異常なヘモグロビン（ヘモグロビンＭ）が高いレベルで存在すると、メトヘモグロビン血症が引き起こされる。メトヘモグロビン血症はまた、赤血球チトクロームｂ５レダクターゼの先天的な欠損症からも起こり得る（Ｍａｎｓｏｕｒ， Ａ．およびＬｕｒｉｅ， Ａ． Ａ． （１９９３） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４２ ： ７−１２を参照）。
【００１５】
チトクロームＰ４５０ファミリーのメンバーもまた、ビタミンＤの合成および異化に密接に関係している。ビタミンＤは、植物組織で生成されるエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）および動物組織で生成されるコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）の２つに生物学的に等価なプロホルモンとして存在する。後者のコレカルシフェロールは、７−デヒドロコレステロールが近紫外線（例えば、２９０〜３１０ ｎｍ）に曝露されると形成される。 通常は、皮膚が短時間日光に曝されると生成される（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ． Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ． Ａ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １１ ： ３１５−３１９を参照）。
【００１６】
両方のホルモン型は更に、肝臓において酵素２５−ヒドロキシラーゼによって２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）に代謝される。２５ （ＯＨ） Ｄは最も豊富に存在するビタミンＤの前駆体であって、腎臓でさらに酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ １α−ヒドロキシラーゼ（１α−ヒドロキシラーゼ）によって代謝されて、活性型である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ）になる。１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ生成の調節は主に合成経路の最終ステップで行われる。１α−ヒドロキシラーゼの活性は、酵素産物（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ）の循環レベル、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、カルシウム、リン、成長ホルモン、およびプロラクチンのレベルを含む幾つかの生理学的因子に左右される。更に、腎臓外の１α−ヒドロキシラーゼ活性が報告され、組織特異的かつ局所的なｌα， ２５ （ＯＨ） _２Ｄ生成の調節が生物学的に重要であると考えられる。ｌα，２５（ＯＨ）_２Ｄの２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）への触媒作用は、酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）を伴い腎臓でも起こる。２４−ヒドロキシラーゼはまた、基質として２５ （ＯＨ）Ｄを利用することができる（Ｓｈｉｎｋｉ， Ｔ．他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９４ ： １２９２０−１２９２５ ； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ． Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ． Ａ．、前出、を参照）。
【００１７】
ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼ、ｌα−ヒドロキシラーゼ、および２４−ヒドロキシラーゼは全て、ＮＡＤＰＨ依存性Ｉ型（ミトコンドリア）チトクロームＰ４５０酵素であって、そのファミリーの他のメンバーと高い相同性を示す。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼはまた、幅広い基質特異性を有し、胆汁酸中間体の２６−ヒドロキシル化およびコレステロールの２５−ヒドロキシル化、２６−ヒドロキシル化、および２７−ヒドロキシル化を行う（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ． Ｊ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０ ： １６７６６−１６７７４ ； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ． Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ． Ａ． 前出、を参照）。
【００１８】
ビタミンＤの活性型（ｌα，２５（ＯＨ）_２Ｄ）は、カルシウムおよびリン酸の恒常性に関与し、骨髄細胞および皮膚細胞の分化を促進する。ビタミンＤの代謝に関与する酵素（例えば、１α−ヒドロキシラーゼ）の欠損によって生じるビタミンＤ欠乏症は、低カルシウム血症、低リン酸血症、ビタミンＤ依存性 （感受性）くる病、骨密度の低下並びにヨタヨタ歩行を伴う内反膝およびＯ脚という症状を示す疾患を引き起こす。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼの欠損は、脳腱黄色腫症や、アキレス腱、脳、肺、およびその他の多くの組織におけるコレステロールおよびコレスタノールの蓄積という特徴をもつ脂質貯蔵病を引き起こす。この疾患は、思春期後の小脳性運動失調症、アテローム性動脈硬化症、および白内障を含む進行性の神経障害を示す。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼの欠損によってくる病が起きないことから、２５（ＯＨ）Ｄ合成の別の経路が存在することが推定される（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｊ． Ｅ．およびＺｅｒｗｅｋｈ， Ｊ． Ｅ． （１９８３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２ ： １１９０−１１９９ ； Ｇａｍｂｌｉｎ， Ｇ． Ｔ．他 （１９８５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７５ ： ９５４−９６０ ； およびＷ． Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ． Ａ． 前出）。
【００１９】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは電子伝達アクセサリータンパク質であって、少なくとも１つのヒトチトクロームＰ４５０種、ＣＹＰ２７遺伝子によってコードされるチトクロームＰ４５０ｃ２７を支持する（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ． Ｊ．他 （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２０ ： ２６７−７１）。ストレプトマイセス‐グリセウスチトクロームＰ４５０であるＣＹＰ１０４Ｄ１は、大腸菌において異種と共に発現され、内在性フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼ酵素によって還元されている（Ｔａｙｌｏｒ， Ｍ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６３ ： ８３８−４２）。 このことから、多くのチトクロームＰ４５０種が、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼ対によって支持されていることが推定される。フェレドキシンレダクターゼはまた、モデル薬剤代謝系に見られ、抗腫瘍性抗生物質であるアクチノマイシンＤを反応性フリーラジカル種に還元することが知られている（Ｆｌｉｔｔｅｒ， Ｗ． Ｄ．およびＭａｓｏｎ， Ｒ． Ｐ． （１９８８） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６７ ： ６３２−６３９）。
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ ＦＭＯ ）
フラビン含有モノオキシゲナーゼは、求核性の窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子のように異例な範囲の基質を酸化する。チトクロームＰ４５０と同様に、ＦＭＯはミクロソーム酵素であり、ＮＡＤＰＨおよびＯ_２を用い、その基質がチトクロームＰ４５０の基質と広範に重なる。ＦＭＯは、肝臓、腎臓、および肺などの組織に分布している。
【００２０】
組織特異的に発現される５つの異なった既知のＦＭＯのアイソフォーム（ＦＭＯ１、ＦＭＯ２、ＦＭＯ３、ＦＭ０４、およびＦＭＯ５）が哺乳動物に見られる。これらのアイソフォームは組織特異性が異なり、更に様々な化合物による阻害および反応の立体特異性等のその他の特性も異なる。ＦＭＯは、アミノ酸１３個のシグネチャ配列を有し、その成分は配列のＮ末端の３分の２にまたがり、多くのＮヒドロキシル化酵素に見られるＦＡＴＧＹモチーフおよびＦＡＤ結合領域を含む（Ｓｔｅｈｒ， Ｍ．他 （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３ ： ５６−５７ ； ＰＲＩＮＴＳ ＦＭＯＸＹＧＥＮＡＳＥ Ｆｌａｖｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【００２１】
特異的な反応には、求核性三級アミンのＮオキシドへの酸化、二級アミンのヒドロキシルアミンおよびニトロンへの酸化、一級アミンのヒドロキシルアミンおよびオキシムへの酸化、および硫黄含有化合物およびホスフィンのＳ−オキシドおよびＰ−オキシドへの酸化が含まれる。ヒドラジン、ヨウ化物、セレン化物、および硼素含有化合物も基質である。ＦＭＯは化学的にチトクロームＰ４５０に類似しているが、ＦＭＯはその熱不安定性およびチトクロームＰ４５０の非イオン界面活性剤感受性に基づいてｉｎ ｖｉｔｒｏのチトクロームＰ４５０から通常は区別することができる。 しかしながら、ＦＭＯのアイソフォームによって熱安定性および界面活性剤感受性が異なるため、これらの特性を区別に用いることは複雑である。
【００２２】
ＦＭＯは、幾つかの薬剤および生体異物の代謝に重要な役割を果たしている。ＦＭＯ（肺ＦＭＯ３）は、尿中に排出される（Ｓ）ニコチンの（Ｓ）ニコチンＮ−１’−オキシドへの代謝において主要な役割を果たす。ＦＭＯはまた、胃潰瘍の治療に広く用いられているＨ_２−アンタゴニストであるシメチジンのＳ−酸素化に関係する。ＦＭＯの肝臓発現型は、チトクロームＰ４５０と同じ調節制御下にない。例えば、ラットにおいて、フェノバルビタール治療によりチトクロームＰ４５０が生成されるが、ＦＭＯ１は抑制される。
ＦＭＯの内因性基質には、ジスルフィドに酸化されるシステアミン、シスタミンおよびトリメチルアミンＮ−オキシドに代謝されるトリメチルアミン（ＴＭＡ）が含まれる。ＴＭＡは腐った魚のような臭いがし、ＦＭＯ３アイソフォームの突然変異によって、悪臭がする遊離アミンが大量に汗、尿、および呼気から排出されるようになる。このような現象は、魚臭症候群引き起こす（ＯＭＩＭ ６０２０７９ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｕｒｉａ）。
【００２３】
リシルオキシダーゼ
リシルオキシダーゼ（リシン６−オキシダーゼＬＯ）は、コラーゲンとエラスチンの架橋結合による結合組織マトリクスの形成に関与する銅依存性アミンオキシダーゼである。ＬＯは、約５０ ｋＤａのＮグリコシル化前駆体タンパク質として分泌され、この前駆体も活性ではあるが、メタロプロテアーゼによって酵素の成熟型に切断される。ＬＯの銅原子は、酸素へ電子を伝達したりその反対に酸素から電子を取り除いたりすることに関係し、これらの細胞外マトリクスタンパク質におけるリシン残基の酸化的脱アミノ反応を促進する。銅の配位がＬＯ活性に必須であるが、食事によって銅が摂取されなくてもアポ酵素の発現はその影響を受けない。しかしながら、機能的なＬＯの不在は、食事による銅の欠損に関係する骨格組織および血管組織の疾患に関係する。ＬＯはまた、様々なセミカルバジド、ヒドラジン、および亜硝酸アミノ、並びにヘパリンによって阻害される。β−アミノプロピオノニトリルは一般にインヒビターとして用いられる。ＬＯの活性は、オゾン、カドミウム、および局所組織外傷に応答して放出されるホルモンのレベルの上昇に応答して増大する。 このようなホルモンには、トランスフォーミング成長因子−β、血小板由来成長因子、アンギオテンシンＩＩ、および線維芽成長因子等が含まれる。ＬＯ活性における異常は、メンケス症候群および後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｘ連鎖劣性遺伝性疾患））に関係する。サイトゾル型の酵素は異常な細胞増殖に関係する（Ｒｕｃｋｅｒ， Ｒ． Ｂ．他． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ６７ ： ９９６Ｓ−１００２ＳおよびＳｍｉｔｈ−Ｍｕｎｇｏ． Ｌ． Ｉ．およびＫａｇａｎ， Ｈ． Ｍ． （１９９８） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． １６ ： ３８７−３９８を参照）。
【００２４】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は遍在性の酵素であって、ジヒドロ葉酸のテトラヒド葉酸へのＮＡＤＰＨ依存性の還元を触媒するが、この反応はグリシンおよびプリンの新規な合成並びにデオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）への変換における重要な過程である。この基本的な反応は、
７，８−ジヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰＨ→５，６，７，８−テトラヒド葉酸＋ＮＡＤＰ^＋である。
【００２５】
この酵素は、トリメトプリムおよびメトトレキセートを含む多くのジヒドロ葉酸類似体によって阻害され得る。豊富なｄＴＭＰがＤＮＡの合成に必要であるため、迅速な細胞の分裂にはＤＨＦＲ活性が必要である。ＤＮＡウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）の複製はまた、高いレベルのＤＨＦＲ活性を必要とする。そのため、ＤＨＦＲを標的とする薬剤が、ＤＮＡウイルスの複製を抑制するために癌の化学療法に用いられている（同様の理由で、チミジル酸シンターゼが標的酵素である）。ＤＨＦＲを抑制する薬剤は、急激に分裂する細胞（またはＤＮＡウイルス感染細胞）に対して細胞毒であるのが好ましいが、特異性を持たず、分裂する細胞を無差別に破壊する。更に、癌細胞は、獲得性の輸送障害または１つ以上のＤＨＦＲ遺伝子の複製の結果として、メトトレキセート等の薬剤に対して耐性を有するようになり得る（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ． Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ および Ｃｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ５１１−５６１９頁）。
【００２６】
アルド／ケト還元酵素
アルド／ケト還元酵素は、単量体ＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼであり、幅広い基質特異性を有する（Ｂｏｈｒｅｎ， Ｋ． Ｍ．等 （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４ ： ９５４７−９５５１）。これらの酵素は、カルボニル含有糖および芳香族化合物を含むカルボニル含有化合物が対応するアルコールに還元されるのを触媒する。従って、様々なカルボニル含有薬剤および生体異物はこのクラスの酵素によって代謝されると思われる。
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される既知の或る反応は、グルコースがソルビトールへ還元され、更にソルビトールデヒドロゲナーゼによってフルクトースに代謝される。通常の条件下で、グルコースのソルビトールへの還元は主な経路ではない。しかしながら、高血糖状態では、ソルビトールの蓄積は糖尿病合併症の発症に関係する（ＯＭＩＭ ＊１０３８８０ Ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １， ｍｅｍｂｅｒ Ｂ１）。この酵素のファミリーのメンバーはまた、或る種の肝癌で高度に発現される（Ｃａｏ， Ｄ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ： １１４２９−１１４３５）。
【００２７】
アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、単純アルコールを対応するアルデヒドに酸化する。ＡＤＨはサイトゾル酵素であって、補助因子ＮＡＤ＋を好み亜鉛イオンを結合させる。ＡＤＨのレベルは肝臓において最も高く、腎臓、肺、および胃粘膜においては低い。
【００２８】
既知のＡＤＨアイソフォームは、４０ ｋＤａのサブユニットからなる二量体タンパク質である。これらのサブユニット（ａ、ｂ、ｇ、ｐ、ｃ）をコードする５つの既知の遺伝子座が存在し、その内の幾つかは特徴的な対立遺伝子変異体（ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｇ１、ｇ２）を有することを特徴とする。サブユニットはホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができ、サブユニットの構成によって活性な酵素の特異的特性が決定される。従って、ホロ酵素がクラスＩ（サブユニット構成、ａａ、ａｂ、ａｇ、ｂｇ、ｇｇ）、クラスＩＩ（ｐｐ）、およびクラスＩＩＩ（ｃｃ）として分類される。クラスＩ ＡＤＨイソ酵素はエタノールおよびその他の小さい脂肪族アルコールを酸化し、ピラゾールによって阻害される。クラスＩＩイソ酵素は長鎖の脂肪族アルコールおよび芳香族アルコールを好み、メタノールを酸化できない。 また、ピラゾールによって阻害されない。クラスＩＩＩイソ酵素は、更に長い長鎖脂肪族アルコール（５炭素およびそれ以上）および芳香族アルコールを好み、ピラゾールによって阻害されない。
【００２９】
短鎖アルコールデヒドロゲナーゼには、様々な基質特異性を有する幾つかの関連酵素が含まれる。このグループに含まれるものは哺乳動物酵素であるＤ−β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−依存性カルボニルレダクターゼ、コルチコステロイド１１−β−デヒドロゲナーゼ、エストラジオール−１７−β−デヒドロゲナーゼ、細菌酵素であるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、グルコース１−デヒドロゲナーゼ、３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、３−オキソアシルレダクターゼ、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトール−６−リン酸２−デヒドロゲナーゼ、７−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ｃｉｓ−１， ２−ジヒドロキシ−３，４シクロヘキサジエン−１−カルボン酸デヒドロゲナーゼ、シス−トルエンジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、シス−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ、ビフェニル−２，３−ジヒドロ−２，３−ジオールデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アシルマンノサミン１デヒドロゲナーゼ、および２−デオキシ−Ｄ−グルコン酸３−デヒドロゲナーゼがある（Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９４） Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５１ ： １２５−１３０ ； Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ８４ ： Ｃ２５−３１ ； およびＭａｒｋｓ， Ａ． Ｒ．他 （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７ ： １５４５９−１５４６３）。
【００３０】
ＵＤＰ グルクロニルトランスフェラーゼ
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼファミリー（ＵＧＴ）のメンバーは、補助因子ウリジン二リン酸−グルクロン酸（ＵＤＰ−グルクロン酸）から基質へのグルクロン酸基の転移を触媒する。この転移は、通常は求核性ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）に対して行われる。基質には、フェーズＩ反応によって機能するようになる生体異物、並びにビリルビン、ステロイドホルモン、および甲状腺ホルモン等の内因性化合物が含まれる。グルクロン酸抱合の生成物は、基質の分子量が約２５０ ｇ／ｍｏｌ未満であれば尿中に排泄されるが、グルクロン酸抱合された基質がそれより大きい場合は胆汁に排泄される。
【００３１】
ＵＧＴは肝臓、腎臓、小腸、皮膚、脳、脾臓、および鼻粘膜のミクロソームに局在する。 これらの局在化位置は、チトクロームＰ４５０酵素およびフラビン含有モノオキシゲナーゼと同じ小胞体膜の側であるため、フェーズＩ薬剤代謝の生成物への到達に理想的な位置である。ＵＧＴは、そのＵＧＴを小胞体膜に固着するＣ末端膜貫通ドメイン、並びにそのＣ末端部分における約５０のアミノ酸残基の保存されたシグネチャドメインを有する（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００３５９ ＵＤＰ−糖転移酵素シグネチャ）。
【００３２】
薬剤代謝に関係するＵＧＴは、ＵＧＴ１およびＵＧＴ２の２つの遺伝子ファミリーによってコードされる。ＵＧＴ１ファミリーのメンバーは、補助因子結合および膜挿入に関係する定常領域および可変基質結合ドメインを有する単一の遺伝子座の選択的スプライシングによって得られる。ＵＧＴ２ファミリーのメンバーは異なる遺伝子座によってコードされ、ＵＧＴ２ＡおよびＵＧＴ２Ｂの２つのファミリーに分類される。２Ａサブファミリーは嗅上皮で発現し、２Ｂサブファミリーは肝臓ミクロソームで発現する。ＵＧＴ遺伝子における突然変異は、高ビリルビン血症（ＯＭＩＭ＃１４３５００ Ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ Ｉ）、出生児からの重度の高ビリルビン血症によって特徴付けられるクリグラー−ナジャー症候群（ＯＭＩＭ＃２１８８００ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギルベール病と呼ばれる軽度の高ビリルビン血症（ＯＭＩＭ ＊１９１７４０ ＵＧＴ１）に関係する。
【００３３】
スルホトランスフェラーゼ
硫酸抱合は多くの同じ基質において起こり、Ｏ−グルクロン酸抱合により高水溶性の硫酸エステルが生成される。スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、補助因子３’‐ホスホアデノシン−５’‐ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）から基質へＳＯ_３ ⁻を転移してこの反応を触媒する。ＳＴの基質は主にフェノールおよび脂肪族アルコールであるが、抱合して対応するスルファミン酸を生成する芳香族アミンおよび脂肪族アミンも含まれる。これらの反応による生成物は主に尿中に排泄される。
【００３４】
ＳＴは、肝臓、腎臓、腸管、肺、血小板、および脳を含む様々な組織に見られる。これらの酵素は、一般にサイトゾル酵素であって、多数の型が同時に発現される場合が多い。例えば、１２種類を越えるＳＴの型がラットの肝サイトゾルに存在する。これらの生化学的に特徴付けられるＳＴは、それらの基質選択性に基づいて、アリールスルホトランスフェラーゼ、アルコールスルホトランスフェラーゼ、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ、チロシンエステルスルホトランスフェラーゼ、および胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼの５つのクラスに分類される。
ＳＴ酵素活性は、ラットの性別および年齢によって著しく異なる。発生の合図および性関連ホルモンとを組み合わせた効果が、ＳＴ発現プロファイルの差異並びにチトクロームＰ４５０等の他のＤＭＥのプロファイルの差異を生じさせると考えられている。注目すべきは、ネコにおけるＳＴの高発現が、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性のレベル低下を部分的に補償する。
【００３５】
ＳＴの幾つかの型は、ヒト肝サイトゾルから精製されクローニングされた。熱安定性および基質選択性が異なった２つのフェノールスルホトランスフェラーゼが存在する。熱安定酵素は、パラニトロフェノール、ミノキシジル、およびアセトアミノフェン等のフェノールの硫酸化を触媒し、熱不安定酵素は、ドーパミン、エピネフリン、およびｌｅｖａｄｏｐａ等のモノアミン基質を好む。その他のクローニングされたＳＴには、エストロゲンスルホトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼが含まれる。この最後に述べた酵素は、細胞生化学におけるＳＴのその他の重要な役割を示す。 即ち、細胞分化およびプロテオグリカンの成熟に重要となり得る炭化水素基質の修飾である。実際に、スルホトランスフェラーゼの先天性の異常は、成熟したケラタン硫酸プロテオグリカンの合成不良という特徴をもつ障害である斑状角膜変性症に関係する（Ｎａｋａｚａｗａ， Ｋ．他 （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９ ： １３７５１−１３７５７ ； ＯＭＩＭ ＊２１７８００ Ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ， ｃｏｒｎｅａｌ）。
【００３６】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
ガラクトシルトランスフェラーゼは、溶液に遊離している糖脂質または糖タンパク質の一部であるＮ末端アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）オリゴ糖鎖にガラクトース（Ｇａｌ）を転移するグリコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）のサブセットである（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ， Ｆ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ： ４３３−４４０ ； Ａｍａｄｏ， Ｍ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７３ ： ３５−５３）。ガラクトシルトランスフェラーゼは細胞表面で見出された可溶性細胞外タンパク質であり、ゴルジ体にも存在する。 β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩ型炭化水素鎖を形成する。既知のヒトおよびマウスβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、短いサイトゾルドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および８つの保存された領域を有する触媒ドメインを有すると考えられる（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ（前出）および Ｈｅｎｎｅｔ， Ｔ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ： ５８−６５）。マウスＵＤＰ−ガラクトースであるβ−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉの領域１がアミノ酸残基の７８−８３、領域２がアミノ酸残基の９３−１０２、領域３がアミノ酸残基１１６−１１９、領域４がアミノ酸残基１４７−１５８、領域５がアミノ酸残基の１７２−１８３、領域６がアミノ酸残基の２０３−２０６、領域７がアミノ酸残基の２３６−２４６、領域８がアミノ酸残基の２６４−２７５に位置する。 マウスＵＤＰ−ガラクトース内に見られる配列の変異体であるβ−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉの領域８が、細菌ガラクトシルトランスフェラーゼにも見られることから、この配列がガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを決定すると考えられる（Ｈｅｎｎｅｔ、前出）。近年の研究により、ｂｒａｉｎｉａｃタンパク質がβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであると報告された（Ｙｕａｎ， Ｙ．他（１９９７） Ｃｅｌｌ ８８：９−１１； およびＨｅｎｎｅｔ、前出）。
【００３７】
ＵＤＰ−ＧａｌであるＧｌｃＮＡｃ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（−１，４−ＧａｌＴ）（Ｓａｔｏ， Ｔ．他 （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６： １８５０−１８５７）が、Ｇａｌ（βｌ−４）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩＩ型炭化水素鎖の形成を触媒する。βｌ，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの場合と同様に、酵素の可溶型が、膜結合型の切断によって形成される。βｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに保存されているアミノ酸には、ジスルフィド結合によって連結された２つのシステイン残基および触媒ドメインにおける推定上のＵＤＰ−ガラクトース結合部位が含まれる（Ｙａｄａｖ， Ｓ．及びＢｒｅｗ， Ｋ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１４１６３−１４１６９； Ｙａｄａｖ， Ｓ． Ｐ．及びＢｒｅｗ， Ｋ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：６９８−７０３、及びＳｈａｐｅｒ， Ｎ． Ｌ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３１３８９−３１３９９）。 βｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質または糖脂質上に炭化水素鎖を合成するのに加えて、いくつかの特定の役割を有する。哺乳動物において、α−ラクトアルブミンを有するヘテロ二量体の一部としてβｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、乳汁分泌哺乳動物の乳汁の生成に作用する。精子の表面上のβｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、卵を特異的に認識する受容体として働く。細胞表面β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはまた、細胞接着、細胞／基底板相互作用、正常な細胞遊走、および転移性腫瘍細胞遊走に作用する（Ｓｈｕｒ， Ｂ． （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：８５４−８６３； およびＳｈａｐｅｒ， Ｊ． （１９９５） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６：９５−１０４）。
【００３８】
グルタチオン Ｓ トランスフェラーゼ
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって触媒される基本的な反応は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と求電子体の抱合である。ＧＳＴはホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質であって、主にサイトゾルに局在化するが、ある程度の活性がミクロソームにも見られる。主なイソ酵素は、共通の構造および触媒特性を有し、ヒトにおいてそれらは、主にα、μ、π、およびθの４つのクラスに分類される。２つの最も大きなクラスであるαおよびμは、それぞれのタンパク質等電点（αはｐＩが７．５−９．０まで、μはｐＩが６．６まで）によって同定される。＋それぞれのＧＳＴは、ＧＳＨに対する共通の結合部位および可変性疎水性結合部位を有する。それぞれのイソ酵素における疎水性結合部位は、特定の求電子性基質に対して特異的である。ＧＳＴ内の特定のアミノ酸残基が、これらの結合部位および触媒活性に重要であるとして同定された。残基Ｑ６７、Ｔ６８、Ｄ１０１、Ｅ１０４、およびＲ１３１は、ＧＳＨの結合に重要である（Ｌｅｅ， Ｈ−Ｃ他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９９−１０９）。残基Ｒ１３、Ｒ２０、およびＲ６９はＧＳＴの触媒活性に重要である（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｇ他（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４：５４９−５５５）。
【００３９】
殆どの場合、ＧＳＴは、潜在的な変異誘発性および発癌性の化学物質を不活性化し解毒するなど好都合に作用する。しかしながら、場合によってはそれらの作用が有害なもので、化学物質を活性化させて変異誘発性および発癌性になる。ラットおよびヒトＧＳＴの或る型は、発癌の検出を助ける信頼性の高い新生物発生前マーカーとなる。変異誘発性を調べるための良く知られたエイムス試験に用いられるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ ネズミチフス菌 ）などの細菌株におけるヒトＧＳＴの発現は、変異誘発におけるこれらの酵素の役割を決定するのに役立つ。マウスにおいて肝腫瘍を引き起こす二ハロゲン化メタン（ｄｉｈａｌｏｍｅｔｈａｎｅｓ）は、ＧＳＴによって活性化されると考えられている。この考えは、二ハロゲン化メタンが非感染細胞よりもヒトＧＳＴを発現する細菌細胞において突然変異誘発性が高いということから支持される（Ｔｈｉｅｒ， Ｒ．他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８５６７−８５８０）。二臭化エチレンおよび二塩化エチレンの変異誘発性が、ヒトαＧＳＴ，Ａ１−１を発現する細菌細胞において上昇し、アフラトキシンＢ１の変異誘発がＧＳＴの発現が促進されることで実質的に減少する（Ｓｉｍｕｌａ， Ｔ． Ｐ．他（１９９３） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １４：１３７１−１３７６）。従って、ＧＳＴ活性の制御が、変異誘発および発癌の制御において有用であろう。
【００４０】
ＧＳＴは、多剤耐性（ＭＤＲ）として知られる多くの癌の薬剤治療に対する耐性獲得に関係する。ＭＤＲは、シクロホスファミドなどの細胞毒で治療を受けた癌患者に起こり、その薬剤に対する耐性を有するようになった後、更にその他の様々な細胞毒に対しても耐性を有するようになる。ＧＳＴレベルの上昇は、これらの薬剤耐性癌に関係し、薬剤に応答してＧＳＴレベルが上昇した後、ＧＳＴによって触媒されたＧＳＨ抱合反応によりその薬剤が不活化されると考えられる。次に上昇したＧＳＴレベルにより癌細胞がその他のＧＳＴに結合する細胞毒から保護される。腫瘍におけるＡ１−１のレベルの上昇は、シクロホスファミド治療によって生じた薬剤耐性に関係する（Ｄｉｒｖｅｎ Ｈ． Ａ．他 （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：６２１５−６２２０）。従って、癌組織におけるＧＳＴ活性の調節は、癌患者のＭＤＲ治療に有用であろう。
【００４１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
γ−グルタミルトランスペプチダーゼは広範に発現する酵素であって、γ−グルタミルアミド結合を切断して細胞外のグルタチオン（ＧＳＨ）の分解を開始させる。ＧＳＨの分解は、生合成経路のために局所的なシステインプールを細胞に提供する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼはまた、細胞の酸化防止に寄与し、その発現は酸化ストレスによって引き起こされる。細胞表面局在糖タンパク質は、癌細胞において高いレベルで発現される。研究により、癌細胞の表面におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼの高レベルの活性が、プロドラッグの活性化に利用され、抗癌治療薬が局所的に高いレベルで蓄積され得る（Ｈａｎｉｇａｎ， Ｍ． Ｈ． （１９９８） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １１１−１１２：３３３−４２； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．およびＩｋｅｄａ， Ｙ． （１９９８） Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７２：２３９−７８； Ｃｈｉｋｈｉ， Ｎ．他 （１９９９） Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２２：３６７−３８０）。
【００４２】
アシルトランスフェラーゼ
Ｎ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、アミノ酸抱合体の活性化カルボキシル基への転移を触媒する。内因性化合物および生体異物は、サイトゾル、ミクロソーム、およびミトコンドリアにおけるアシル−ＣｏＡシンセターゼによって活性化される。次に、アシル−ＣｏＡ中間体は、サイトゾルまたはミトコンドリアにおけるＮ−アシルトランスフェラーゼによってアミノ酸（通常はグリシン、グルタミン、またはタウリンであるが、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、およびいくつかのジペプチドを含む）と抱合し、アミド結合を有する代謝産物を形成する。この反応は、Ｏ−グルクロン酸抱合に相補的であるが、アミノ酸抱合では、グルクロン酸抱合によって生じる場合が多い反応性および毒性の代謝産物を生成されない。
【００４３】
胆汁酸−ＣｏＡであるアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＴ）は、このクラスの良く特徴づけられた酵素の１つである。 ＢＡＴは、腸管において界面活性剤として作用する胆汁酸抱合体の生成に関与する（Ｆａｌａｎｙ， Ｃ． Ｎ．他 （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１９３７５−１９３７９； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ．他 （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３）。ＢＡＴはまた、部分肝切除の後の肝臓癌患者の予後の予測マーカーとして有用である（Ｆｕｒｕｔａｎｉ， Ｍ．他（１９９６） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２４：１４４１−１４４５）。
【００４４】
アセチルトランスフェラーゼ
アセチルトランスフェラーゼは、ヒストンのアセチル化におけるその役割について非常に良く研究されている。ヒストンのアセチル化により、真核細胞におけるクロマチン構造が弛緩し、それによって転写因子が、ゲノム（またはゲノム全体）の影響を受けた領域におけるＤＮＡの鋳型のプロモータエレメントに到達できるようになる。これとは対照的に、ヒストンが脱アセチル化すると、クロマチン構造が閉じ転写因子への到達が制限されて転写物が減少する。この最後に、ヒストンの脱アセチル化を阻害する化学薬品（例えば、酪酸ナトリウム）を細胞転写の刺激の一般的な手段として用いると、人為的結果であるが遺伝子発現が全体的に上昇する。アセチル化による遺伝子発現の調節はまた、限定するものではないが、ｐ５３、ＧＡＴＡ−１、ＭｙｏＤ、ＡＣＴＲ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、および高移動グループタンパク質（ＨＭＧ）を含むその他のタンパク質のアセチル化によっても行うことができる。ｐ５３の場合、アセチル化によりＤＮＡへの結合が増大し、ｐ５３によって調節される遺伝子の転写が刺激される。プロトタイプヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）は、サッカロミセス‐セレビジエ（酵母）に由来するＧｃｎ５である。Ｇｃｎ５は、テトラヒメナｐ５５、ヒトＧｃｎ５、およびヒトｐ３００／ＣＢＰを含むアセチラーゼのファミリーメンバーである。ヒストンのアセチル化については文献（Ｃｈｅｕｎｇ， Ｗ． Ｌ．他 （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２：３２６−３３３およびＢｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：３３６−３４１）を参照されたい。ある種のアセチルトランスフェラーゼ酵素は、限定するものではないが、アセチルコリンエステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼを含む幾つかの他の酵素の主なクラスに一般的であるα／βヒドロラーゼ折畳み（α／βｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｏｌｄ）（Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｌｚｂｕｒｇ， ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｉｒｂｍ−ｃｏｕｒｓｅ９７／Ｄｏｃｓ／ｍｓ／）を有する（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００４５】
Ｎ −アセチルトランスフェラーゼ
芳香族アミンおよびヒドラジン含有化合物は、肝臓およびその他の組織のＮ−アセチルトランスフェラーゼ酵素によってＮアセチル化される。ある種の生体異物は、同じ酵素によってある程度Ｏ−アセチル化される。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、補助因子アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）を用いて２つの過程でアセチル基を転移するサイトゾル酵素である。第１の過程では、アセチル基がアセチル−ＣｏＡから活性部位システイン残基に転移され、第２の過程でアセチル基が基質アミノ基に転移され酵素が再生される。
【００４６】
他のほとんどのＤＭＥクラスとは対照的に、既知のＮ−アセチルトランスフェラーゼの数が少ない。ヒトの場合、２つの高度に類似した酵素であるＮＡＴ１およびＮＡＴ２が存在し、マウスには第３型酵素であるＮＡＴ３が存在する。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのヒト型は、独立した調節（ＮＡＴ１は広範に発現されるが、ＮＡＴ２は肝臓および臓器のみに発現される）および重複した基質特異性を有する。両方の酵素はある程度までほとんどの基質を受容するが、ＮＡＴ１はある種の基質（パラアミノ安息香酸、パラアミノサリチル酸、スルファメトキサゾール、およびスルファニルアミド）を好み、一方ＮＡＴ２は他の基質（イソニアジド、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、およびスルファメチアジン）を好む。
【００４７】
１９５０年代に、抗結核薬であるイソニアジドを投与された患者の臨床試験から、化合物のアセチル化が速い人（ｒａｐｉｄ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）および遅い人（ｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）が報告された。これらの表現型は後に、酵素の活性または安定性に影響を与えるＮＥＴ２遺伝子における突然変異によることが示された。イソニアジドのアセチル化が遅い表現型が、中東の集団に優性（約７０％）であり、白人ではやや劣り（約５０％）、アジアの集団では２５％未満である。近年になって、ＮＥＴ１における機能的な多型が検出され、検査を受けた集団の約８％が、アセチル化が遅い表現型を有する（Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｎ． Ｊ．他 （１９９８） Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：６７−７２）。ＮＡＴ１がある種の既知の芳香族アミン発癌物質を活性化することができるため、広範に発現されるＮＡＴ１酵素における多型が癌のリスクの決定に重要であると考えられる（ＯＭＩＭ ＊１０８３４５ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）。
【００４８】
アミノトランスフェラーゼ
アミノトランスフェラーゼは、ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素のファミリーを含み、アミノ酸のトランスフォーメーションを触媒する。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）は最も研究されたＰＬＰ含有酵素である。 ＡｓｐＡＴは、ジカルボキシルＬ−アミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸、および対応する２−オキソ酸、オキサロ酢酸、および２−オキソグルタル酸の可逆的なアミノ基転移反応を触媒する。このファミリーの他のメンバーには、推定アミノトランスフェラーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）およびキヌレニンアミノトランスフェラーゼが含まれる（Ｖａｃｃａ， Ｒ． Ａ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２１９３２−２１９３７）。
【００４９】
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型は、常染色体性劣性疾患であって、肝特異的ペルオキシソーム酵素であるアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ−１の欠損が起こる。 この疾患の表現型は、グリオキシル酸代謝の欠損である。ＡＧＴが存在しない場合、グリオキシル酸はグリシンに転移されるのではなく、シュウ酸に酸化される。その結果、腎臓および尿管に不溶性カルシウムシュウ酸が蓄積し、最終的に腎不全が起こる（Ｌｕｍｂ， Ｍ． Ｊ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ ： ２０５８７−２０５９６）。
【００５０】
ヌレニンアミノトランスフェラーゼは、Ｌ−トリプトファン代謝産物Ｌ−キヌレニンの不可逆的なアミノ転移を触媒してキヌレニン酸を形成する。この酵素はまた、Ｌ−２−アミノアジピン酸から２−オキソグルタル酸およびその逆への可逆的なアミノ基転移反応を触媒して２−オキソアジピン酸およびＬ−グルタミン酸を生成し得る。キヌレイン酸は、グルタミン酸作動性神経伝達の推定上のモジュレーターであるため、キヌレインアミノトランスフェラーゼの欠損が多面発現性（ｐｌｅｏｔｒｏｐｈｉｃ）効果に関係すると思われる（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【００５１】
カテコール− Ｏ −メチルトランスフェラーゼ
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、カテコール基質における１つのヒドロキシル基（例えば、エルドーパ、ドーパミン、またはＤＢＡ）へのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ； ＳＡＭ）供与体のメチル基の転移を触媒する。３’−ヒドキシル基のメチル化は４’−ヒドキシル基のメチル化より優先され、ＣＯＭＴの膜結合アイソフォームが可溶型よりも位置特異的である。この酵素の可溶型の翻訳は、完全長ｍＲＮＡ（１．５ｋｂ）の内部の開始コドンの利用によるか、或いは内部のプロモータから転写された短いｍＲＮＡ（１．３ｋｂ）の翻訳による。提案されたＳ_Ｎ２様メチル化反応には、Ｍｇ^２＋が必要であり、Ｃａ^２＋によって抑制される。供与体および基質のＣＯＭＴへの結合が連続的に起こる。まず、ＡｄｏＭｅｔがＭｇ^２＋非依存的にＣＯＭＴに結合し、Ｍｇ^２＋の結合およびカテコール基質の結合がそれに続く。
【００５２】
組織におけるＣＯＭＴの量は活性のために通常必要とされる量より多く存在するため阻害が困難である。しかしながら、インヒビターがｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用（例えば、没食子酸、トロポロン、Ｕ−０５２１、および３’， ４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｐｈｅｔｒｏｐｏｌｏｎｅ）および臨床での使用（例えば、ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ系化合物およびｔｏｌｃａｐｏｎｅ）のために開発された。これらのインヒビターを投与すると、エルドーパの半減期が長くなり、続いてドーパミンの生成が起こる。ＣＯＭＴの阻害により、エピネフリン／ノルエピネフリン、イソプレナリン、リミテロール、ドブタミン、フェノルドパム（ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ）、アポモルフィン、およびα−メチルドパを含む他の様々なカテコール構造化合物の半減期が長くなると思われる。ノルエピネフリンの欠損は臨床的抑鬱症に繋がるため、ＣＯＭＴインヒビターの使用は抑鬱性の治療に有用であると思われる。ＣＯＭＴインヒビターは通常、副作用が最小限であり、最終的に肝臓で代謝され、体内にはわずかな代謝物が残るのみである（Ｍａｎｎｉｓｔｏ， Ｐ． Ｔ．およびＫａａｋｋｏｌａ， Ｓ． （１９９９） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５１：５９３−６２８）。
【００５３】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼはコンパクトな二量体金属酵素であって、酸化的な傷害に対する細胞防御に関係する。この酵素は１つの亜鉛原子および１つの銅原子を各サブユニットに含み、スーパーオキシドアニオンのＯ_２およびＨ_２Ｏ_２への不均化反応を触媒する。この不均化反応の速度は、拡散によって律速されるため、基質と酵素活性部位との間の好ましい静電的相互作用によって促進される。この酵素のクラスの例が、全ての真核細胞の細胞質において同定され、或る細菌種のペリプラズムでも同定された。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは強壮な酵素であって、蛋白分解および尿素およびＳＤＳによる変性に高度な耐性を有する。この酵素のコンパクトな構造に加えて、金属イオンおよび内部サブユニットのジスルフィド結合が酵素の安定性に寄与していると考えられている。酵素は７０℃もの高温でも可逆的に変性される（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ， Ａ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５６５５−５６６１）。
【００５４】
スーパーオキシドジスムターゼの過剰発現は、遺伝子組み換えアルファルファの耐凍性を高めるのに関係しており、ジフェニルエーテル除草剤であるアシフルオリフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）などの環境毒に対する耐性を与える（ＭｃＫｅｒｓｉｅ， Ｂ． Ｄ．他（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０３：１１５５−１１６３）。加えて、酵母細胞が過酸化水素への暴露の後に凍結融解損傷に対する耐性が高まる。 これは、曝露によるスーパーオキシドジスムターゼの発現の上方制御により、酵母細胞が更なる過酸化ストレスに適応するようになるためである。この研究により、酵母スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の突然変異は、冷凍保存過程を経て生物が存在するか否かを決定するのに重要であると長い間考えられていたグルタチオン代謝の調節に影響を及ぼす突然変異よりも、冷凍融解耐性に悪影響を与える（Ｊｏｎｇ−Ｉｎ Ｐａｒｋ， Ｊ−Ｉ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２２９２１−２２９２８）。
【００５５】
スーパーオキシドジスムターゼの発現はまた、結核を引き起こす生物である結核菌に関連する。スーパーオキシドジスムターゼは、結核菌によって排泄される１０の主なタンパク質の内の１つであり、酸化ストレスに応じてその発現が約５倍上方制御される。 結核菌は、非病原性ミコバクテリアＭ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓよりスーパーオキシドジスムターゼをほぼ１００倍多く発現し、極めて高い割合で発現酵素を分泌する。この結果、結核菌はＭ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓよりも最大３５０倍多い酵素を分泌し、酸化ストレスに対する実質的な耐性を与える（Ｈａｒｔｈ， Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４２８１−４２９２）。
【００５６】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現の低下、並びに抗酸化能力を有するその他の酵素の発現の低下は初期の癌に関係する。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現レベルは、正常な前立腺組織と比べ前立腺の上皮新生物および前立腺癌において低い（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， Ｄ． Ｇ． （２０００） Ｃａｎｃｅｒ ８９：１２３−１３４）。
【００５７】
ホスホジエステラーゼ
ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル化合物の２つのエステル結合の一方の加水分解を触媒する酵素のクラスを構成する。従って、ホスホジエステラーゼは様々な細胞プロセスにとって重要である。ホスホジエステラーゼには、細胞増殖および複製に必須であるＤＮＡおよびＲＮＡのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼや、ＤＮＡのトポロジー再編成中の核酸鎖の分解および再形成をするトポイソメラーゼが含まれる。Ｔｙｒ−ＤＮＡホスホジエステラーゼは、トポイソメラーゼＩ型およびＤＮＡとの間に形成されたデッドエンド共有結合中間体を加水分解することでＤＮＡの修復に作用する（Ｐｏｕｌｉｏｔ， Ｊ． Ｊ．他（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５５２−５５５； Ｙａｎｇ， Ｓ．−Ｗ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５３４−１１５３９）。
【００５８】
酸性スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成するホスホジエステラーゼである。ホスホリルコリンは、様々な細胞内シグナル伝達経路に関与するホスファチジルコリンの合成に用いられ、一方のセラミドは神経組織に高濃度で見られる膜脂質であるガングリオシドの生成のための必須前駆体である。酸性スフィンゴミエリナーゼが欠損すると、リソソームにおいてスフィンゴミエリン分子が蓄積され、それによってニーマン−ピック病が引き起こされる（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ， Ｅ． Ｈ．およびＳ． Ｒ． Ｍｉｒａｎｄａ （１９９７） Ｇｅｎｅｔ． Ｔｅｓｔ． １：１３−１９）。
【００５９】
グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼ（グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼとも呼ばれる）は、ジアセチル化リン脂質グリセロホスホジエステル（ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒｓ）を加水分解してｓｎ−グリセロール−３−リン酸およびアルコールを生成するホスホジエステラーゼである。グリセロホスホコリン、グリセロホスホエタノールアミン、グリセロホスホグリセロール、およびグリセロホスホイノシトールは、グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼのための基質の例である。大腸菌由来のグリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼは、グリセロホスホジエステル基質に対して広範な特異性を有する（Ｌａｒｓｏｎ， Ｔ． Ｊ．他（１９８３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４８：５４２８−５４３２）。
【００６０】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、サイクリックヌクレオチドｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの調節に極めて重要な酵素である。 ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、ホルモン、光、および神経伝達物質を含む様々な細胞外シグナルを伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能する。ＰＤＥはサイクリックヌクレオチドをそれらの対応する一リン酸に分解し、それによってサイクリックヌクレオチドの細胞内濃度およびシグナル伝達におけるそれらの効果を調節する。それらの役割がシグナル伝達の調節因子であることから、ＰＤＥは化学療法の標的として大規模に研究された（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１ ； Ｔｏｒｐｈｙ， Ｊ． Ｔ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：３５１−３７０）。
【００６１】
哺乳動物ＰＤＥのファミリーは、それらの基質特異性および親和性、補助因子に対する感受性、および阻害物質に対する感受性に基づいて分類される（Ｂｅａｖｏ， Ｊ． Ａ． （１９９５） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−７４８； Ｃｏｎｔｉ， Ｍ．他（１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）。これらのファミリーのいくつかは、固有の遺伝子を含み、その多くは様々な組織でスプライス変異体として発現される。ＰＤＥファミリーの中には、多数のイソ酵素およびこれらのイソ酵素の多数のスプライス変異体が存在する（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ．およびＳ．−Ｌ． Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。多数のＰＤＥファミリー、イソ酵素、およびスプライス変異体の存在は、サイクリックヌクレオチドを伴う調節経路の多様性および複雑性を示すものである（Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｍ． Ｄ．およびＧ． Ｍｉｌｌｉｇａｎ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２２：２１７−２２４）。
【００６２】
ＰＤＥ１型（ＰＤＥ１）はＣａ^２＋／カルモジュリン依存性であって、それぞれが少なくとも２つの異なったスプライス変異体を有する少なくとも３つの異なった遺伝子によってコードされると思われる（Ｋａｋｋａｒ， Ｒ． 他． （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５５：１１６４−１１８６）。ＰＤＥ１は、肺、心臓、および脳で見出された。ある種のＰＤＥ１イソ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化／脱リン酸化によって調節される。これらのＰＤＥ１イソ酵素をリン酸化すると、カルモジュリンに対するこの酵素の親和性が低下し、ＰＤＥ活性が低下し、ｃＡＭＰのレベルが安定する（Ｋａｋｋａｒ， 前出）。ＰＤＥ１は、ＰＤＥ１がサイクリックヌクレオチドおよびカルシウムのシグナル伝達の両方に関与するため、中枢神経系および心血管、免疫系の疾患に対する有用な治療標的を提供し得る（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００６３】
ＰＤＥ２は小脳、新皮質、心臓、腎臓、肺、肺動脈および骨格筋に存在するｃＧＭＰ−刺激性ＰＤＥである（Ｓａｄｈｕ， Ｋ． 他（１９９９） Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４７：８９５−９０６）。ＰＤＥ２はカテコールアミン分泌でのｃＡＭＰ の作用を媒介し、アルドステロン（Ｂｅａｖｏ， 前出）， の制御に関与し、嗅覚シグナル伝達において役割を果たしていると考えられている（Ｊｕｉｌｆｓ， Ｄ．Ｍ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３３８８−３３９５）。
【００６４】
ＰＤＥ３はｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの両方に対して高い親和性を有するため、これらのサイクリックヌクレオチドがＰＤＥ３の競合的基質として作用する。ＰＤＥ３は、心筋の収縮の刺激、血小板凝集の抑制、血管および気道平滑筋の弛緩、Ｔリンパ球および血管平滑筋培養細胞の増殖抑制、脂肪組織からのカテコールアミン誘導性遊離脂肪酸放出の調節に作用する。ホスホジエステラーゼのＰＤＥ３ファミリーは、シロスタマイド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、エノキシモン（ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ）、およびｌｉｘａｚｉｎｏｎｅなどの特定のインヒビターに対する感受性を有する。ＰＤＥ３のイソ酵素は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼまたはインスリン依存性キナーゼによって制御され得る（Ｄｅｇｅｒｍａｎ， Ｅ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６８２３−６８２６）。
【００６５】
ＰＤＥ４はｃＡＭＰに特異的であって、気道平滑筋、血管上皮、および全ての炎症細胞に局在化し、ｃＡＭＰ依存性依存性リン酸化によって活性化され得る。ｃＡＭＰのレベルの上昇によって、炎症細胞の活性が抑制され気管平滑筋が弛緩し得るため、ＰＤＥ４は、喘息治療の発見に重点をおいて新しい抗炎症剤としての可能性のある標的として広範に研究された。ＰＤＥインヒビターは、喘息、慢性塞栓性肺疾患、およびアトピー性湿疹の治療薬として現在、臨床試験が行われている。ＰＤＥ４の既知の４つ全てのイソ酵素は、マウスの行動記憶を改善することが分かっている化合物であるインヒビターロリプラムに対して感受性が高い（Ｂａｒａｄ， Ｍ．他（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５０２０−１５０２５）。ＰＤＥ４インヒビターもまた、急性肺傷害、内毒素血症、リウマチ様関接炎、多発性硬化症、および様々な神経や胃腸の疾患に対する可能性のある治療薬として研究された（Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ａ． Ｍ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：４６６−４７３）。
【００６６】
ＰＤＥ５は、基質としてｃＧＭＰに対して高い選択性を有し（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ． Ｖ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：４２００−４２０５）、２つのアロステリックｃＧＭＰ特異的結合部位を有する（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ， Ｌ． Ｍ． 他． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０６７１−３０６７９）。ｃＧＭＰのこれらのアロステリック結合部位への結合は、触媒活性の直接的な調節よりもｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼによるＰＤＥ５のリン酸化にとって重要であると思われる。ＰＤＥ５が高いレベルで、血管平滑筋、血小板、肺、および腎臓に見られる。インヒビターザプリナストはＰＤＥ５およびＰＤＥ１に対して効果がある。ＰＤＥ５に対する特異性を得るためにザプリナストを改良してシルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）を生成した（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。 このｓｉｌｄｅｎａｆｉｌは男性勃起不全の治療薬である（Ｔｅｒｒｅｔｔ， Ｎ． 他． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ６：１８１９−１８２４）。ＰＤＥ５のインヒビターは、心血管治療薬として現在研究されている（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００６７】
光受容体サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼであるＰＤＥ６は、光伝達カスケードの重要な要素である。ＰＤＥ６はＧタンパク質トランスデューシンと会合して、ｃＧＭＰを加水分解して光受容体膜におけるｃＧＭＰ作動性陽イオンチャネルを調節する。ｃＧＭＰ結合活性部位に加えて、ＰＤＥ６はまた、ＰＤＥ６の機能における調節的な役割を果たすと考えられる２つの高親和性ｃＧＭＰ結合部位を有する（Ａｒｔｅｍｙｅｖ， Ｎ． Ｏ．他（１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９３−１０４）。ＰＤＥ６の欠損は網膜の疾患に関係する。ｒｄマウスの網膜変性症（Ｙａｎ， Ｗ．他（１９９８） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３９：２５２９−２５３６）、ヒトの常染色体性劣性色素性網膜炎（Ｄａｎｃｉｇｅｒ， Ｍ．他（１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１−７）、およびアイリッシュセッター犬の杆状体／錐状体異形成１型（Ｓｕｂｅｒ， Ｍ． Ｌ．他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３９６８−３９７２）は、ＰＤＥ６Ｂ遺伝子における突然変異が原因である。
【００６８】
ＰＤＥのＰＤＥ７ファミリーは、複数のスプライス変異体を有する唯１つの既知のメンバーから成る（Ｂｌｏｏｍ， Ｔ． Ｊ．およびＪ． Ａ． Ｂｅａｖｏ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１４１８８−１４１９２）。ＰＤＥ７はｃＡＭＰ特異的であるが、その他の生理的機能については殆ど知られていない。ＰＤＥ７をコードするｍＲＮＡが骨格筋、心臓、脳、肺、腎臓、および膵臓で見られるが、ＰＤＥ７タンパク質の発現は特定の組織型に限定される（Ｈａｎ， Ｐ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６１５２−１６１５７； Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。ＰＤＥ７はＰＤＥ４ファミリーに密接に関連するが、ＰＤＥ４の特異的なインヒビターであるロリプラムによって阻害されない（Ｂｅａｖｏ， 前出）。
【００６９】
ＰＤＥ８はｃＡＭＰ特異的であり、ＰＤＥ４ファミリーに密接に関連する。ＰＤＥ８は、甲状腺、精巣、眼、肺、骨格筋、心臓、腎臓、卵巣、および脳において発現される。ＰＤＥ８のｃＡＭＰ加水分解活性は、ＰＤＥのインヒビターであるロリプラム、ビンポセチン、ミルリノン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、またはザプリナストによって抑制されないが、ＰＤＥ８はジピリダモールによって抑制される（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ． Ａ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５７０−５７７； Ｈａｙａｓｈｉ， Ｍ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−７５６； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ． Ｈ．他（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−８９９６）。
【００７０】
ＰＤＥ９はｃＡＭＰ特異的であって、ＰＤＥのＰＤＥ８ファミリーに最も類似している。ＰＤＥ９は腎臓、肺、肝臓、脳、脾臓、および小腸で発現される。 ＰＤＥ９はｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、ロリプラム、ビンポセチン、ジピリダモール、またはＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）によって抑制されないが、ＰＤＥ５インヒビターであるザプリナストに対して感受性を有する（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ． Ａ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−１５５６４ ； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ． Ｈ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−１５５５８）。
【００７１】
ＰＤＥ１０は二重基質（ｄｕａｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ＰＤＥであって、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を加水分解する。ＰＤＥ１０は、脳、甲状腺、および精巣で発現される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ． Ｈ．他（１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ， Ｋ．他（１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５； Ｌｏｕｇｈｎｅｙ， Ｋ．他（１９９９） Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７）。
【００７２】
ＰＤＥは、約２７０−３００のアミノ酸の触媒ドメイン、および補助因子の結合に必要なＮ末端調節ドメインを含み、場合によっては機能が未知の親水性Ｃ末端ドメインを含む（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ． およびＳ．−Ｌ． Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。保存された推定上の亜鉛結合モチーフであるＨＤＸＸＨＸＧＸＸＮが、全てのＰＤＥの触媒ドメインにおいて同定された。Ｎ末端調節ドメインは、ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、およびＰＤＥ６における非触媒ｃＧＭＰ結合ドメイン、ＰＤＥ１におけるカルモジュリン結合ドメイン、およびＰＤＥ３およびＰＤＥ４におけるリン酸化部位を含むドメインを有する。ＰＤＥ５では、Ｎ末端ｃＧＭＰ結合ドメインが約３８０のアミノ酸残基にまたがり、保存された配列モチーフＮ（Ｒ／Ｋ）ＸｎＦＸ_３ＤＥのタンデムリピートを含む（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ， Ｌ． Ｍ．他（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２２８６３−２２８７３）。ＮＫＸｎＤモチーフは変異誘発によって見られ、ｃＧＭＰ結合に重要である（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ． Ｖ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２２４０−２２２４４）。ＰＤＥファミリーは、触媒ドメイン内において約３０％のアミノ酸同一性を有するが、同じファミリー内のイソ酵素は通常約８５から９５％のこの領域における同一性を示す（例えばＰＤＥ４ＡとＰＤＥ４Ｂ）。更に、あるファミリー内の触媒ドメイン外の類似性は高いが（６０％を超える）、ファミリー間のこのドメイン外の配列類似性は殆ど存在しない。
【００７３】
免疫反応および炎症反応を構成する作用の多くは、細胞内のｃＡＭＰのレベルを上昇させる薬剤によって阻害される（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ， Ｍ． Ｗ．他（１９９５） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４７：１１６４−１１７１）。様々な疾患がＰＤＥ活性の上昇が原因で起こり、サイクリックヌクレオチドのレベルの低下に関係する。例えば、マウスにおける尿崩症の或る型はＰＤＥ４活性の上昇に関係し、低いＫ_ｍをもったｃＡＭＰＰＥＤ活性の上昇がアトピー患者の白血球に見られ、ＰＤＥ３が心疾患に関連する。
【００７４】
ＰＤＥの多くのインヒビターが同定され、臨床試験が行われている（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１； Ｔｏｒｐｈｙ， Ｔ． Ｊ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：３５１−３７０）。ＰＤＥ３インヒビターは、血小板凝集阻止薬、血圧降下薬、および鬱血性心不全の治療に有用な強心薬として開発された。ＰＤＥ４インヒビターであるロリプラムは、抑鬱症の治療に用いられ、ＰＤＥ４のその他のインヒビターは抗炎症薬として評価が行われている。ロリプラムはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１の複製を促すことが明らかにされているリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性ＴＮＦ−ａを阻害することが分かった。従って、ロリプラムはＨＩＶ−１の複製を阻害すると考えられる（Ａｎｇｅｌ， Ｊ． Ｂ．他（１９９５） ＡＩＤＳ ９：１１３７−１１４４）。更に、ロリプラムが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびインターフェロンγなどのサイトカインの生成を抑制する能力に基づいて脳髄膜炎の治療に有効であることが示された。ロリプラムはまた、遅発性ジスキネジアに有効であると考えられ、実験動物モデルにおける多発性硬化症の治療に効果があった（Ｓｏｍｍｅｒ， Ｎ．他（１９９５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２４４−２４８ ； Ｓａｓａｋｉ， Ｈ．他（１９９５） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８２：７１−７６）。
【００７５】
テオフィリンは、気管支喘息およびその他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的ＰＤＥインヒビターである。テオフィリンは、気道平滑筋の機能に作用し、呼吸器疾患の治療における抗炎症能力即ち免疫調節能力があると考えられる（Ｂａｎｎｅｒ， Ｋ． Ｈ．およびＣ． Ｐ． Ｐａｇｅ （１９９５） Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ８：９９６−１０００）。ペントキシフィリンは、間欠性跛行および糖尿病性末梢血管疾患の治療に用いられる別の非特異的ＰＤＥインヒビターである。ペントキシフィリンはまた、ＴＮＦ−αの生成を阻止し、ＨＩＶ−１の複製を阻害し得る（Ａｎｇｅｌ他， 前出）。
【００７６】
ＰＤＥは、様々な細胞型の細胞増殖に影響を与え（Ｃｏｎｔｉ他（１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）、様々な癌に関係すると報告された。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰの成長は、ｃＡＭＰ誘導体およびＰＤＥインヒビターの送達によって抑制された（Ｂａｎｇ， Ｙ． Ｊ．他（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５３３０−５３３４）。これらの細胞はまた、上皮からニューロン形態への表現型における永久的な変換を示した。また、ＰＤＥインヒビターがメサンギウム細胞の増殖を調節する可能性があり（Ｍａｔｏｕｓｏｖｉｃ， Ｋ．他（１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：４０１−４１０）、またリンパ球の増殖を調節する可能性もある（Ｊｏｕｌａｉｎ， Ｃ．他（１９９５） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ． １１：６３−７９）ことが示唆された。細胞内でＰＤＥを腫瘍の特定の細胞区画に送達し、細胞死を導く癌治療が報告されている（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ， Ｍ． Ｐ．およびＡ． Ａ． Ｅｐｅｎｅｔｏｓ （１９９４） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０：７８６−７９４）。
【００７７】
ホスホトリエステラーゼ
ホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ， ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅｓ）は、毒性有機リン化合物を加水分解する酵素であって、様々な組織から単離された。 この酵素は、哺乳動物には豊富に存在するが鳥や昆虫では不足していると思われ、鳥や昆虫の有機リン化合物に対する耐性の低さの説明となる（Ｖｉｌａｎｏｖａ， Ｅ．およびＳｏｇｏｒｂ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２９：２１−５７）。ホスホトリエステラーゼは、哺乳動物による殺虫剤の解毒において中心的な役割を果たす。ホスホトリエステラーゼ活性は個人によって差があり、大人より幼児の方が低い。ＰＴＥ ノックアウトマウスは、有機リン系の毒素であるダイアジノン オキソン（ｄｉａｚｏｘｏｎ）およびクロルピリホス オキソン（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ ｏｘｏｎ）に対して顕著な感受性を有する（Ｆｕｒｌｏｎｇ， Ｃ． Ｅ．，他（２０００） Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２１：９１−１００）。ＰＴＥは、有機リン含有化学廃棄物および化学兵器（例えば、パラチオン）、並びに農薬や殺虫剤の解毒能力を有する酵素として注目されている。ある研究により、ホスホトリエステラーゼがアテローム性動脈硬化症およびリポタンパク代謝に関係する疾患に関与することが示された。
【００７８】
チオエステラーゼ
脂肪酸生合成に関係する２つの可溶性チオエステラーゼが、哺乳動物組織から単離された。 その内の一方は、長鎖脂肪酸アシルチオエステルに対してのみ活性であり、他方は様々な長さの脂肪酸アシル鎖を有するチオエステルに対して活性である。これらのチオエステラーゼは、脂肪酸の新規合成における脂肪酸鎖の終結段階を触媒する。脂肪酸鎖の終結段階は、脂肪酸アシル鎖を脂肪酸シンターゼのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）のサブユニットの４’−ホスホパンテテイン補欠分子族と結合させるチオエステル結合の加水分解を伴う（Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ａ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８１−１８８； Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ｂ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８８−２００）。
【００７９】
大腸菌は、長鎖アシルチオエステルに対してのみ活性なチオエステラーゼＩ型および様々な長さの鎖に対して特異性を有するチオエステラーゼＩＩ型（ＴＥＩＩ）の２つの可溶性チオエステラーゼを含む（Ｎａｇｇｅｒｔ， Ｊ．他（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１１０４４−１１０５０）。大腸菌ＴＥＩＩは、新規の脂肪酸生合成における脂肪酸鎖終結酵素として機能する哺乳動物チオエステラーゼの２つの型のいずれとも配列類似性を有していない。哺乳動物チオエステラーゼとは異なり、大腸菌ＴＥＩＩは、特徴的なセリン活性部位ｇｌｙ−Ｘ−ｓｅｒ−Ｘ−ｇｌｙ配列モチーフを含まず、セリン変性剤であるジイソプロピルフルオロリン酸によって不活化されない。しかしながら、ヨードアセトアミドおよびジエチルピロカルボネートによるヒスチジン５８の修飾によってＰＥＩＩ活性が失われる。ＴＥＩＩの過剰な発現は大腸菌に含まれる脂肪酸を変化させない。 これは、脂肪酸生合成において脂肪酸鎖終結酵素として機能していないことを示すものである（Ｎａｇｇｅｒｔ他， 前出）。このような理由から、大腸菌ＴＥＩＩの生理学的基質がＡＣＰ−ホスホパンテテイン脂肪酸エステルではなく補酵素Ａ（ＣｏＡ）脂肪酸エステルであるとＮａｇｇｅｒｔ他（前出）は提唱した。
【００８０】
カルボキシルエステラーゼ
哺乳動物カルボキシルエステラーゼは、様々な組織および細胞型で発現される多重遺伝子ファミリーを構成する。イソ酵素は有意な配列相同性を有し、主にアミノ酸配列に基づいて分類される。 アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、およびカルボキシルエステラーゼは、エステラーゼのセリンスーパーファミリー（Ｂエステラーゼ）に分類される。 その他のカルボキシルエステラーゼには、チログロブリン、トロンビン、第ＩＸ因子、ｇｌｉｏｔａｃｔｉｎ、およびプラスミノーゲンがある。カルボキシルエステラーゼは、分子のエステル基およびアミド基の加水分解を触媒し、薬剤、環境毒、および発癌物質の解毒に関与する。カルボキシルエステラーゼの基質には短鎖および長鎖アシルグリセロール、アシルカルニチン、炭酸塩、ジピベフリン塩酸塩（ｄｉｐｉｖｅｆｒｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、コカイン、サリチル酸塩、カプサイシン、パルミトイル−ＣｏＡ、イミダプリル、ハロペリドール、ピロリジジンアルカロイド、ステロイド、ｐ−ニトロフェニル酢酸、マラチオン、ｂｕｔａｎｉｌｉｃａｉｎｅ、およびイソカルボキサジドが含まれる。 この酵素は低い基質特異性を示すことがよくある。カルボキシルエステラーゼはまた、プロドラッグを対応する遊離酸に変換するために重要である。 対応する遊離酸は、例えば、血中コレステロールを低下させるために用いられるロバスタチンなどのそのプロドラッグの活性型であり得る（Ｓａｔｏｈ， Ｔ．およびＨｏｓｏｋａｗａ， Ｍ． （１９９８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３８：２５７−２８８を参照）。
【００８１】
ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｓは、（ｉ）Ｎ末端シグナル配列を有し、（ｉｉ）細胞表面受容体に類似し、（ｉｉｉ）カルボキシルエステラーゼドメインを含み、（ｉｖ）脳で高発現され、（ｖ）カルシウム依存的にニューレキシンと結合する分子のクラスである。カルボキシルエステラーゼと相同性を有するにもかかわらず、ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎｓは活性部位セリン残基を含まず、触媒としてではなく基質結合において役割を果たすと考えられる（Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ， Ｋ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６−２６８２）。
【００８２】
スクアレンエポキシダーゼ
スクアレンエポキシダーゼ（スクアレンモノオキシゲナーゼ、ＳＥ）は、ミクロソーム膜に結合しＦＡＤ依存性のオキシドレドクターゼであって、真核細胞のステロール生合成経路における最初の酸素添加ステップを触媒する。コレステロールは、ＬＤＬ受容体仲介経路若しくは生合成経路によって獲得される細胞質膜の必須の構成成分である。後者の場合、コレステロール分子における２７全ての炭素原子がアセチル−ＣｏＡに由来する（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， 前出）。ＳＥはスクアレンをまず２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンに変換し、次にラノステロールに変換し、更にコレステロールに変換する。コレステロール生合成に関係するステップを以下に要約する（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ． Ｈ ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ５５４−５６０頁およびＳａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ．他（１９９５） ２７０：１７−２０）。アセテート（アセチル−ＣｏＡ由来）→３ヒドロキシ−３−メチル−グルタリルＣｏＡ→メバロン酸→５−ホスホメバロン酸→５−ピロホスホメバロン酸→イソペンテニルピロリン酸→ジメチルアリルピロリン酸→ゲラニルピロリン酸→ファルネシルピロリン酸→スクアレン→スクアレンエポキシド→ラノステロール→コレステロール
【００８３】
コレステロールは真核細胞の生存に必須であるが、血清コレステロールのレベルが過度に上昇すると高等生物の動脈においてアテローム斑が形成されるようになる。例えば冠状動脈などの必須の血管壁部に不溶性の脂質が蓄積されると、血流が減少して十分な血液が組織に流れないようになり組織壊死が起こる可能性がある。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロン酸への変換に必要であり、この変換がコレステロール生合成の第１のステップである。ＨＭＧ−ＣｏＡは、血漿コレステロールレベルを低下させるようにデザインされた様々な医薬化合物の標的である。しかしながら、ＭＨＧ−ＣｏＡの阻害はまた、その他の生合成経路に必要な非ステロール中間体（例えば、メバロン酸）の合成が減少する。ＳＥは、ステロール合成経路の後の方で起こる律速反応を触媒し、コレステロールはＳＥによる触媒ステップ後の経路の唯一の最終産物である。従って、ＳＥは、その他の必要な中間体を減少させない抗高脂血症薬をデザインするための理想的な標的である（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ．他（１９９６） ２７１：８０５３−８０５６）。
【００８４】
エポキシドヒドロラーゼ
エポキシドヒドロラーゼは、エポキシド含有化合物への水の付加を触媒し、それによってエポキシドがその対応する１，２−ジオールに加水分解される。これらは、細菌ハロアルカンデハロゲナーゼに関連し、酵素のα／βヒドロラーゼ折畳み（α／βｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｏｌｄ）ファミリーの他のメンバーと（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ）由来ブロモペルオキシダーゼＡ２、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ）由来のヒドロキシムコンセミアルデヒドヒドロラーゼおよび 水素細菌（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ）由来ハロアルカンデハロゲナーゼ）と配列類似性を示す。 エポキシドヒドロラーゼは遍在性であって、哺乳動物、脊椎動物、植物、真菌、細菌に見られる。この酵素のファミリーは、生物内に導入されると求電子性が高く破壊性である場合が多い生体異物エポキシド化合物の解毒にとって重要である。エポキシドヒドロラーゼ反応の例には、ｃｉｓ−９，１０−ｅｐｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−９ （Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ロイコトキシン）からその対応するジオール（ｔｈｒｅｏ−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−１２ （Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ロイコトキシンジオール））への加水分解、およびｃｉｓ−１２，１３−ｅｐｏｘｙ −ｏｃｔａｄｅｃ−９ （Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （イソロイコトキシン）からその対応するジオール（ｄｉｏｌ ｔｈｒｅｏ−１２，１３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−９ （Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （イソロイコトキシンジオール））への加水分解が含まれる。ロイコトキシンは膜の透過性やイオン輸送を変えて、炎症反応を引き起こす。加えて、エポキシド発癌物質は、薬剤および環境毒素の解毒における中間体としてチトクロームＰ４５０によって生成されることが知られている。
【００８５】
この酵素は、Ａｓｐ（求核性）、Ａｓｐ（ヒスチジンを支持する酸）、およびＨｉｓ（水活性化ヒスチジン）の３つの触媒部分を有する。エポキシドヒドロラーゼの反応メカニズムは、標的分子のエポキシド環の第１の炭素原子に対するＡｓｐ残基の１つへの求核攻撃によって開始される共有結合エステル中間体によって始まり、共有結合エステル中間体が形成される（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａｒａｎｄ， Ｍ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：４２２３−４２２９ ； Ｒｉｎｋ， Ｒ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７； Ａｒｇｉｒｉａｄｉ， Ｍ． Ａ．他（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１５２６５−１５２７０）。
【００８６】
チロシン触媒作用に関与する酵素
コハク酸とピルビン酸か、或いはフマル酸とアセト酢酸のいずれかへのアミノ酸チロシンの分解には多数の酵素が必要であり、多数の中間化合物が生成される。加えて、多くの生体異物化合物は、チロシン分解経路の一部である１つ以上の反応が用いられて代謝され得る。この経路は初め細菌で研究されたが、チロシン分解は様々な生物において起こることが知られ、多数の同様の生物学的反応が関係すると思われる。
【００８７】
チロシンのコハク酸とピルビン酸（例えば、アルトロバクター属における）への分解に関係する酵素には、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸３−ヒドロキシラーゼ、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸２，３−ジオキシゲナーゼ、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコニック（ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎｉｃ） セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランス，シス−５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼ、ホモプロトカテチュ酸（ｈｏｍｏｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ）イソメラーゼ／デカルボキシラーゼ、シス−２−オキソヘプト−３−ｅｎｅ−１，７−ジオエートヒドラターゼ、２，４−ジヒドロキシヘプト−トランス−２−ｅｎｅ−１，７−ジオエートアルドラーゼ、およびスクシニック（ｓｕｃｃｉｎｉｃ）セミアルデヒドデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００８８】
チロシンのフマル酸とアセト酢酸への分解に関係する酵素には、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチシン酸−１，２−ジオキシゲナーゼ、マレイルアセト酢酸イソメラーゼ、およびフマリルアセトアセターゼが含まれる。コハク酸／ピルビン酸経路からの中間体が受け入れられた場合は、４−ヒドロキシフェニル酢酸１−ヒドロキシラーゼが関係し得る。
【００８９】
異なった生物におけるチロシン代謝に関係する更なる酵素には、４−クロロフェニル酢酸−３，４−ジオキシゲナーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、５−オキソペント−３−ｅｎｅ−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ、２−ｏｘｏ−ｈｅｐｔ−３−ｅｎｅ−１，７−ｄｉｏａｔｅ ヒドラターゼおよび５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼが含まれる（Ｅｌｌｉｓ， Ｌ． Ｂ． Ｍ．他（１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３７３−３７６； Ｗａｃｋｅｔｔ， Ｌ． Ｐ． および Ｅｌｌｉｓ， Ｌ． Ｂ． Ｍ． （１９９６） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２５：９１−９３； および Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ． （１９９６） Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｎｅｗｓ ６２：１０２）。
【００９０】
ヒトにおいて、チロシン分解経路の酵素における後天性或いは先天性の遺伝的欠陥が、遺伝性チロシン血症Ｉ型を引き起こし得る。この疾患の１つの型である遺伝性チロシン血症Ｉ型（ＨＴ１）は、チロシンを代謝してフマル酸とアセト酢酸にする生物の経路での最後の酵素である酵素フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼの欠損によって引き起こされ得る。ＨＴ１は幼児期に始まる進行性の肝傷害によって特徴づけられ、肝癌のリスクが高い（Ｅｎｄｏ， Ｆ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２４４２６−２４４３２）。
【００９１】
複数の新規の薬剤代謝酵素、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、薬剤代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【００９２】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＤＭＥ」、個別にはそれぞれ「ＤＭＥ−１」、「ＤＭＥ−２」、「ＤＭＥ−３」、「ＤＭＥ−４」、「ＤＭＥ−５」、「ＤＭＥ−６」、「ＤＭＥ−７」、「ＤＭＥ−８」、「ＤＭＥ−９」、「ＤＭＥ−１０」、「ＤＭＥ−１１」、「ＤＭＥ−１２」、「ＤＭＥ−１３」、「ＤＭＥ−１４」、「ＤＭＥ−１５」、「ＤＭＥ−１６」、「ＤＭＥ−１７」および「ＤＭＥ−１８」と呼ぶ薬物代謝酵素である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００９３】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、を含む群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択される。
【００９４】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性のある天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を有する群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００９５】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００９６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００９７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００９８】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である天然のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００９９】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供し、有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む。一実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的ＤＭＥの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１００】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＤＭＥの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含むポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＤＭＥの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０２】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【０１０３】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【０１０４】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【０１０５】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【０１０６】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１０７】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【０１０８】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１０９】
（定義）
用語「ＤＭＥ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＤＭＥのアミノ酸配列を指す。
【０１１０】
用語「アゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＤＭＥに直接相互作用するか、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＤＭＥの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１１１】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＤＭＥをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。 また、変異ｍＲＮＡまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で１回若しくは数回生じ得る。
【０１１２】
ＤＭＥをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＤＭＥと同じポリペプチド或いはＤＭＥの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＤＭＥと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＤＭＥの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【０１１３】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【０１１４】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
【０１１５】
用語「アンタゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＤＭＥに直接相互作用するか、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＤＭＥの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１１６】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリンやその断片、例えばＦａ、Ｆ（ａｂ’）２ 及びＦｖ断片を指す。ＤＭＥポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じて担体タンパク質に抱合することも可能である。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【０１１７】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１１８】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの進化過程（例えば米国特許番号第５，２７０，１６３号に記載されたＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマーの組成は２本鎖か、または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、或いは他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基（例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ 基が２’−Ｆ または ２’−ＮＨ_２で置換されている。）を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い生存期間などの望ましい性質を改善する。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量担体等の分子に抱合させることができる。アプタマーは、例えば、架橋剤の光活性化によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる（例えば、 Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ． 及びＬ． Ｇｏｌｄ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３参照）。
【０１１９】
用語「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルス性ＲＮＡ 発現系は白血球の細胞質において高レベルで特定のＲＮＡアプタマーを発現させるのに使われている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【０１２０】
用語「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」は Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡ、または、他の左旋性ヌクレオチド誘導体あるいはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【０１２１】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドが含まれうる。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」若しくは「マイナス（−）」の語が参照ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を、「正」若しくは「プラス（＋）」がセンス鎖を指すことがある。
【０１２２】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＤＭＥ、合成のＤＭＥまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１２３】
「相補（的）」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする２つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は、相補配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」に結合する。
【０１２４】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む成分」及び「所定のアミノ酸配列を含む成分」は、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範囲の任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＤＭＥ 若しくはＤＭＥ の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）及びその他の構成エレメント（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のＤＮＡ等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１２５】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１２６】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。

【０１２７】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【０１２８】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１２９】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１３０】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１３１】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子またはタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【０１３２】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域の組換えを指す（エキソン）。エキソンはコードされたタンパク質の構造的或いは機能的ドメインを表しうるので、新たなタンパク質は安定的な下部構造の新規な再組合せにより構築される。それによって新たなタンパク質機能の進化の加速が可能となる。
【０１３３】
用語「断片」は、ＤＭＥまたはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【０１３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片の正確な長さ及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片によってコードされる。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８ の断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８ の断片及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１３６】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３７】
「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【０１３８】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１３９】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１４０】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「ｂｌａｓｔｎ」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列を対で直接比較するために用いる「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と称されるツールも利用可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ と ｂｌａｓｔｐ（後述）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。

【０１４１】
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さと比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４２】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１４３】
ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２以上のポリペプチド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１４４】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１４５】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。

【０１４６】
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４７】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１４８】
「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体により近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持しているような抗体分子を指す。
【０１４９】
「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリングするプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１５０】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約０．１％のＳＤＳの存在下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡがある。例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１５２】
「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成力によって２つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ解析等）。 或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１５３】
「挿入」及び「付加」の語は、１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドを各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１５４】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１５５】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＧＶＲＥＤのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１５６】
「マイクロアレイ」の語は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１５７】
「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、マイクロアレイ上に定義された固有の位置にあるハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、ポリペプチドその他の化合物を指す。
【０１５８】
用語「調節」は、ＤＭＥの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＤＭＥのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１５９】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１６０】
「機能的に連結した」は、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係があるように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。そして、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、同一のリーディングフレーム内にある。
【０１６１】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端のリジンは、成分に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１６２】
ＤＭＥの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＤＭＥの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１６３】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＤＭＥやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１６４】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１６５】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓら （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１６６】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５，０００ヌクレオチドまでの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（マサチューセッツ州ケンブリッジのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴゲノム研究センターから一般向けに入手可能）ではユーザーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有な、および保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１６７】
「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせなければ離隔しているような配列の２以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１６８】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターのの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは哺乳動物のワクチン接種に用いることが可能で、その際に組換え核酸が発現して哺乳動物の防御免疫応答を誘導する。
【０１６９】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の未翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１７０】
「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられる化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及び当分野で既知のその他の成分がある。
【０１７１】
ＤＮＡ配列に関する「ＲＮＡ等価物」は、窒素塩基チミンが全てウラシルに置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースから構成されていることを除いて、参照ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチド線形配列から構成されている。
【０１７２】
「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。ＤＭＥ、ＤＭＥをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１７３】
「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された遊離したＡ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合している標識されたＡの量を低減させる。
【０１７４】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメントの少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が遊離しているものを指す。
【０１７５】
「置換」は、１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドを各々別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【０１７６】
「基板」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基板は、凹み、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７７】
「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１７８】
「形質転換」は、外来性のＤＮＡが受入細胞に入り込むプロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージまたはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自己複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する、一過的に形質転換された細胞も含まれる。
【０１７９】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に示されている。
【０１８０】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常、ポリヌクレオチドがより多くまたはより少数の塩基を有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。また、多型性変異体は、１つのヌクレオチド塩基によってポリヌクレオチド配列が変化する「１塩基多型」（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１８１】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１８２】
（発明）
本発明は、新規のヒト薬剤代謝酵素（ＤＭＥ）及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患の診断、治療、及び予防に関する。
【０１８３】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１８４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｅｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。
これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１８５】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１８６】
表２および表３は共に、本発明のポリペプチドの特性を要約したものであって、これらの特性は請求するポリヌクレオチドが薬剤代謝酵素であることを立証するものである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ はＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ （ＢＬＡＳＴ）検索ツールによって確認すると、ウシのアリルアセチル−ＣｏＡ Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３００４４４５） に６４％の同一性を有する（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは７．１ｅ−８６であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。
【０１８７】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ はハムスターのカルボキシルエステラーゼ前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２６４１９８６） に５１％の相同性があることが、ＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは４．３ｅ−１２８であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はまた、カルボキシルエステラーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ がカルボキシルエステラーゼであるという、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１８８】
別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ は、線虫アセチルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１８２５７７８） に４５％の相同性があり、これはＢＬＡＳＴ 分析により確認され、その確率スコアは８．１ｅ−６７であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ は、またα／βヒドロラーゼ折たたみをも含んでおり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ がアセチルトランスフェラーゼのクラスであることと一致するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ 解析から得られたデータによって、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３がα／βヒドロラーゼおりたたみを含むことが裏付けられた。
【０１８９】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ はヒトのスルホトランスフェラーゼ１Ｃ２ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８１１７８７７） に対して６８％の相同性があり、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは９．２ｅ−１１４であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はまた、スルホトランスフェラーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がスルホトランスフェラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ の ＤＯＭＯ データベースに対するＢＬＡＳＴ 解析では、３’−ホスホアデノシン ５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ） 結合部位の存在を示している。ＰＡＰＳ はスルホトランスフェラーゼ反応の供与基である（表３参照）。
【０１９０】
別の例において、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ はヒトアンドロゲン調節性短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ９６２２１２４） に３６％の相同性があり、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは５．３ｅ−３１である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はまた、デヒドロゲナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ がデヒドロゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９１】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ はラットのＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４５８３９５） に８３％の相同性があり、これはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ 検索ツール （ＢＬＡＳＴ）によって確認される。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．５ｅ−２４８であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ はヒトＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４７５７５９ ） に８４％の相同性があるが、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは１．１ｅ−２４５．である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（図３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、 ＭＯＴＩＦＳおよびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ 解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６がＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼである、さらに確証な証拠を提供する。
【０１９２】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ はマウスのスクワレンエポキシダーゼ （スクワレンモノオキギゲナーゼ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１２１７５９３） と８７％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認される。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．５ｅ−２７３であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ はまた、ラットのスクワレンエポキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６６６０１９）に８６％の相同性を有し、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは４．６ｅ−２７２である。またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ヒトのスクワレンエポキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４２０４６７５） に８６％の相同性を有し、確率スコアは４．９ｅ−２６８である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ はまた、モノオキシゲナーゼシグネチャドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、配列識別番号７がモノオキシゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９３】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ はヒトのジヒドロ葉酸レダクターゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６１７０８０） に９２％の同一性を有するが、これはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって同定される。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．２ｅ−８７であり、これは保存されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はまた、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性部位ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８がジヒドロ葉酸レダクターゼであることをさらに確証する証拠を提供する。
【０１９４】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ はヒトヘパラン硫酸Ｄ−グルコサミニル３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ ３Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４８３５７２５） に６６％の相同性を有するが、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは４．８ｅ−１１４である。
【０１９５】
他の例においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ はマウスのフラビン含有モノオキシゲナーゼ５（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１８９９２５５） に５７％の相同性があるが、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認され、その確率スコアは１．０ｅ−１５７であった。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ はフラビン結合モノオキシゲナーゼ活性部位ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ がフラビン含有モノオキシゲナーゼドメインである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９６】
別の例におて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ はヒト１１−β水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７９４７５）（短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素ファミリのメンバー）に４８％の相同性があるが、これは Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．７ｅ−５４であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ はまた、ＢＬＡＳＴ 分析によると、 ５．３ｅ−５３の確率スコアで、ウシ１１−β水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１９１）に４５％の相同性があり、また、２．０ｅ−５１の確率スコアでマウス１１−β水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８０６９２８）に４４％の相同性を有し、５．４ｅ−５１の確率スコアでリスザル１１−β水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３８８４１４）に４５％の相同性、そして４．５ｅ−４７の確率スコアでモルモット１１−β水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６０１０７７５）に４３％の相同性がある ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はまた、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリシグネチャドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ が短鎖アルコールデヒドロゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９７】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ はウサギのフラビン含有ジメチルアラニンモノオキギゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６４９８９） に５５％の相同性があることが、ＢＬＡＳＴ 分析により確認され、その確率スコアは１．３ｅ−１５４であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ はまた、３．３ｅ−１５４の確率スコアでモルモットフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５５９０２７）に５５％の相同性があり、１．４ｅ−１５３の確率スコアでマウスフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１８９９２５５）に５６％の相同性、１．５ｅ−１５１の確率スコアでヒトフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５５９０４６）に５３％の相同性がある。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はまた、１つのフラビン含有モノオキシゲナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ がフラビン含有モノオキシゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９８】
他の例においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ はＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの特異的タイプであるウサギのＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６５８０１）に３６％の相同性があり、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認された。ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．８ｅ−７０である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ はまた、いくつかのヒトＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１４０３６５８、ｇ１４０７５９０ および ｇ１９２３２１９）に対してすべて １．２ｅ−６９の確率スコアで３３％の相同性を有し、またマウスＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ （ ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１２４６７８７）に ２．０ｅ−６９の確率スコアで３４％の相同性がある。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はまた、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３がＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼであることをさらに確証する証拠を提供する。
【０１９９】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ はヒトＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３３６０２７３ および ｇ５１６１５０）に９６％の相同性を有し、これはＢＬＡＳＴ 分析により、確率スコアがそれぞれ ３．２ｅ−１８１ と８．７ｅ−１７９で確認された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ はまた、７．４ｅ−１７１の確率スコアでサルのＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４０７９７０７）に９２％の相同性を有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はまた、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４がＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼであることをさらに確証する証拠を提供する。
【０２００】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ はまた、ＮＡＤＰＨ依存性、Ｉ型（ミトコンドリア）チトクロムＰ４５０酵素ファミリのメンバーである、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３ １α−ヒドロキシラーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２５１６２４４）に４３％の相同性を有し、これはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．７ｅ−９５であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はまた、チトクロムＰ４５０ 活性部位ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析から得られたデータによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５がチトクロムＰ４５０ファミリのメンバーであることがさらに実証される。
【０２０１】
別の例においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ は、チロシン触媒経路を通過するチロシンと生体異物化合物の異化作用に関与する酵素であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ ２−ヒドロキシヘプタ−２，４−ジエン−１，７−ジオエートイソメラーゼ（アルドラーゼ） （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０１７４６１９）に４０％の相同性があり、これはＢＬＡＳＴ 分析によって確認された。ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．７ｅ−４５である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はまた、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼファミリ活性部位ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。アセト酢酸フマリルヒドロラーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ アルドラーゼに密接な関係があり、またチロシン異化作用にも関与している。
【０２０２】
別の例においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ は、ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ９９３７２４５） と４４％の局所的相同性（すなわち、１６７の連続するアミノ酸残基について）を共有し、これはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは３．２ｅ−５８であり、これは保存されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ はまた、ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５１０９０５）に４４％の相同性（１６７の連続するアミノ酸残基について）があり、確率スコア１．７ｅ−５７でＢＬＡＳＴ 分析により確認され、またマウスグルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１３４００７６）に対しては、４１％の相同性（１８１の連続するアミノ酸残基）があり、確率スコアは４．５ｅ−５３である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性部位ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）
【０２０３】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ は短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素ファミリのメンバーである、ヒト（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７７１９８）に９６％相同性がある。ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．６ｅ−１７０である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８はまた、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性部位ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ が短鎖アルコールデヒドロゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０２０４】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、各ポリヌクレオチド配列の長さ（塩基対単位）を示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０２０５】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリを指す場合もある。例えば、７２１９０９５Ｈ１ はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＳＰＬＮＤＩＣ０１ はそれが由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリ（例えば、５５１４３９１３Ｈ１）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇ２７８７９２２）の識別番号の場合もある。さらに、列５の識別番号はＥＮＳＥＭＢＬ （Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ） データベース（すなわち、「ＥＮＳＴ」と命名された配列）から由来した配列を示す。あるいは、列５の識別番号はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ヌクレオチド配列記録データベース（すなわち、「ＮＭ」または「ＮＴ」と命名された配列）またはＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ タンパク質配列記録（すなわち、「ＮＰ」と命名された配列）から由来している。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方の集合を指す場合もある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ_１＿Ｎ_２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ_３＿Ｎ_４ は「スティッチ」配列を表しており、ＸＸＸＸＸＸはアルゴリズムが適用された配列のクラスターの識別番号であり、また、ＹＹＹＹＹ はアルゴリズムによって出された予測の番号である。Ｎ_{１，２，３．．} が存在する場合は、解析している時に手動で編集された可能性のある特定のエキソンを示す（実施例５を参照）。または列５の識別番号は、「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎ は「ストレッチ」配列の識別番号であり、ＸＸＸＸＸＸ はＩｎｃｙｔｅ プロジェクト識別番号で、ｇＡＡＡＡＡ は「エキソンストレチング」アルゴリズムが適用されたヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ 識別番号である。さらに、ｇＢＢＢＢＢ は最も近親のＧｅｎＢａｎｋ タンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ 識別番号か、またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 識別番号であり、Ｎは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。ＲｅｆＳｅｑ 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、ＲｅｆＳｅｑ 識別子（「ＮＭ 」、「ＮＰ」または「 ＮＴ」と表示された）はＧｅｎＢａｎｋ 識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使われる場合もある。
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムＤＮＡ配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。

【０２０６】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するための列５に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０２０７】
表５はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって最も頻繁に表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２０８】
本発明はまた、ＤＭＥの変異体も含む。好適なＤＭＥの変異体は、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつＤＭＥアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２０９】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＤＭＥをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：１９−３６のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価ＲＮＡ配列と同等の価値を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【０２１０】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０２１１】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＤＭＥをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のＤＭＥのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されているとみなす。
【０２１２】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＤＭＥのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＤＭＥ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。
【０２１３】
宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えずに、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０２１４】
本発明はまた、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。 更に、合成化学を用いて、ＤＭＥまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０２１５】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６ 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１等を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０２１６】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。 或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好しくは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の調製を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ 或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページ．等を参照）。
【０２１７】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＤＭＥをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、 Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８３２２を参照。）別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６等を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している。（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている。 （Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．ら （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０２１８】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０２１９】
市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２２０】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＤＭＥ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＤＭＥのクローン化及び発現に利用可能である。
【０２２１】
種々の目的でＤＭＥをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介特定部位突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。
【０２２２】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＤＭＥの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＰＫＩＮの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲ仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。このように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換えて、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２２３】
別の実施例によれば、ＤＭＥをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＤＭＥ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０頁、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成し得る。更にＤＭＥのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２２４】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３頁等を参照）。
【０２２５】
生物学的に活性なＤＭＥを発現させるために、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＤＭＥをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＤＭＥをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【０２２６】
当業者に周知の方法を用いて、ＤＭＥをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０２２７】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＤＭＥをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． ａｎｄ Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６頁、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． ら （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． ら （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． ら （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２２８】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＤＭＥをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＤＭＥが必要な場合は、ＤＭＥの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導Ｔ５バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０２２９】
ＤＭＥの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）。
【０２３０】
植物系もＤＭＥの発現に使用可能である。ＤＭＥをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターによって促進される。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換によって、または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６頁等を参照。
【０２３１】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＤＭＥをコードする配列を結合し得る。可欠Ｅ１またはＥ３領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でＤＭＥを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２３２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５を参照）。
【０２３３】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＤＭＥの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＤＭＥをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。 このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２３４】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ⁻単純細胞のために用いられるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ⁻細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． ら （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７３５７０； ＣｏｌｂｅｒｅＧａｒａｐｉｎ， Ｆ． ら （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１１４ 等を参照。）この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（例えば、 Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ． 及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１参照。）可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０２３５】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＤＭＥをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＤＭＥをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＤＭＥをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２３６】
一般に、ＤＭＥをコードする核酸配列を含み、ＤＭＥを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２３７】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＤＭＥの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＤＭＥ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． ら （１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． ら （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０２３８】
多岐にわたる標識方法及び結合方法が、当業者に知られており、また、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて用いられ得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＤＭＥをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０２３９】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＤＭＥの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２４０】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティング、折りたたみ及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０２４１】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＤＭＥタンパク質が、ＤＭＥ活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＤＭＥをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＤＭＥが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２４２】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＤＭＥの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、例えば^３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２４３】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＤＭＥへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＤＭＥの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＤＭＥが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、これらの化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＤＭＥを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、大腸菌からの細胞が含まれる。ＤＭＥを発現する細胞またはＤＭＥを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＤＭＥまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２４４】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＤＭＥと混合させるステップと、ＤＭＥとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２４５】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＤＭＥが少なくとも１つの試験化合物と混合させ、ＤＭＥの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性を試験化合物不在下でのＤＭＥの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性の変化は、ＤＭＥの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＤＭＥの活性に適した条件下でＤＭＥを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、ＤＭＥの活性を調節する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２４６】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＤＭＥまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２４７】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０２４８】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＤＭＥを乳汁内に分泌するなどＤＭＥを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２４９】
（治療）
ＤＭＥのある領域と薬剤代謝酵素のある領域との間に、例えば配列及びモチーフのからみで化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、ＤＭＥの発現は脳組織、腎組織および、乳房腫瘍、脳腫瘍、他の癌および皮膚線維芽細胞などの迅速に分裂する細胞に密接に関連する。したがって、ＤＭＥは自己免疫／炎症性疾患、細胞異常増殖、発達性疾患、内分泌性疾患、眼疾患、代謝疾患および肝臓障害を含む胃腸疾患において役割を果たしていると考えられる。ＤＭＥの発現若しくは活性亢進に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２５０】
従って、一実施例において、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。そのような疾患の例には、限定するものではないが、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、
細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、
また発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、
内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。
【０２５１】
眼疾患では、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、
代謝障害の中には、副腎機能不全、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、また、胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α_１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれる。
【０２５２】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２５３】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＤＭＥを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２５４】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２５５】
更なる実施例では、ＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれる。一実施態様では、ＤＭＥと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＤＭＥを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２５６】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２５７】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２５８】
ＤＭＥのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたＤＭＥを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＤＭＥと特異的に結合するものを同定することが可能である。ＤＭＥの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。 但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２５９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＤＭＥまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０２６０】
ＤＭＥに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。また、これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが好ましい。ＤＭＥアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２６１】
ＤＭＥに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ら． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０２６２】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために発達した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＤＭＥ特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０２６３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． ら （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９等を参照）。
【０２６４】
ＤＭＥに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、このような断片には、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）_２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）_２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性で迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． ら （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１等を参照）。
【０２６５】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、ＤＭＥとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性ＤＭＥエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２６６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＤＭＥに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＤＭＥ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。複数のＤＭＥエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、ＤＭＥに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＤＭＥエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＤＭＥ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＤＭＥが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 （Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． 及び Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２６７】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、ＤＭＥ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ らの文献等を参照）。
【０２６８】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＤＭＥをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＤＭＥをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， ｅｄ． （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照。）
【０２６９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． ら （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ 及び Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． ら （１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．等を参照）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．ら （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６． 等を参照）。
【０２７０】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連関遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、および第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５ Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラ リア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＤＭＥの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＤＭＥを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２７１】
本発明の更なる実施例では、ＤＭＥの欠損による疾患や異常症は、ＤＭＥをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＤＭＥ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． および Ｈ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）がある。
ＣＹＳＫＰ の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＤＭＥを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販のＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． 及び Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＤＭＥをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２７２】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． ら （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２７３】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． ら． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． ら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． ら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４^＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． ら （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． ら． （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． ら （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 及び Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２７４】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関して１或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＤＭＥを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． ら （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． ら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ 及び Ｘｕ， Ｈ． ら （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２７５】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＤＭＥをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＤＭＥをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＤＭＥが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関連する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． ら． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＤＭＥを導入することができる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２７６】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． ら （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７頁等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０２７７】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＤＭＥをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２７８】
任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定する。一度同定すると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【０２７９】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホスホラミダイト化学合成のようにオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＤＭＥをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２８０】
ＲＮＡ分子を修飾して細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０２８１】
本発明の更なる実施例は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特異ポリヌクレオチドの発現変異を起こすのに有効な化合物には、限定するものではないが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＤＭＥ の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＤＭＥ の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２８２】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ の無細胞系または再構成生化学系があり得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。 通常、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． ら （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． ら （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． ら （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２８３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０２８４】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２８５】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を含む組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＤＭＥ、ＤＭＥの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＤＭＥのインヒビターなどからなる。
【０２８６】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２８７】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． ら， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２８８】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２８９】
ＤＭＥまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、ＤＭＥまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． ら （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２９０】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２９１】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性分の量、たとえばＤＭＥまたはその断片、ＤＭＥの抗体、ＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ_５０（集団の５０％の治療有効量）またはＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。治療効果に対する毒性効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を処方するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２９２】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２９３】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２９４】
（診断）
別の実施例では、ＤＭＥに特異的に結合する抗体が、ＤＭＥの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＤＭＥやＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作製される。ＤＭＥの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織内のＤＭＥを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２９５】
ＤＭＥを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＤＭＥの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＤＭＥの発現の値は、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＤＭＥに対する抗体とを複合体の形成に適した条件の下で結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照および生検組織からの疾患サンプルで発現するＤＭＥの量を標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２９６】
本発明の別の実施例によれば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＤＭＥを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＤＭＥの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＤＭＥ値の調節を監視する。
【０２９７】
一実施形態では、ＤＭＥまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＤＭＥをコードする核酸配列を同定することが可能である。５’調節領域のような高度に特異的な領域から作られていても、あるいは、保存されたモチーフ等のやや特異性の低い領域から作られていても、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＤＭＥをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２９８】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＤＭＥをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の配列、或いはＤＭＥ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２９９】
ＤＭＥをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＤＭＥまたはＤＭＥ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識ヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、^３２Ｐまたは^３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０３００】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＤＭＥの発現に関連する疾患を診断することが可能である。そのような疾患の例には、限定するものではないが、自己免疫／炎症性の疾患では、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、
細胞増殖異常では日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、
また発達障害では尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、
内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。
【０３０１】
眼疾患では、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、
代謝障害の中には、副腎機能不全、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、また、
また、胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α_１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＤＭＥの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３０２】
ある実施態様では、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＤＭＥをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３０３】
ＤＭＥの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＤＭＥをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３０４】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３０５】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３０６】
ＤＭＥをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０３０７】
或る実施態様において、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法がある。ＳＳＣＰでは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０３０８】
ＤＭＥの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、 Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ． 他 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：２３５２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． 他 （１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９２３６を参照。）目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０３０９】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０３１０】
別の実施例では、ＤＭＥ、ＤＭＥの断片、ＤＭＥに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０３１１】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０３１２】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． ら． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合は、最も有用且つ正確である。理想的には、発現をゲノム全域にわたって測定すると、最高品質のシグネチャが得られる。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。規準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャを統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いた中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０３１３】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３１４】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
＋プロテオームのプロファイルは、ＤＭＥに特異的な抗体を用いてＤＭＥ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． ら． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３１５】
プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変える化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０３１６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３１７】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０３１８】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． ら （１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ら （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ らの （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．らの （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． ら （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． らの （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， ｅｄ． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。 該文献は、特別に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０３１９】
本発明の別の実施例ではまた、ＤＭＥをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、ある場合には、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。_８核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる。（例えば、 Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４； ａｎｄ Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４を参照。）一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を作製できる。（例えば、 Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照。）
【０３２０】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， ら （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ．等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＤＭＥをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０３２１】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝子地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。いったん、疾患または症候群の原因となる遺伝子が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．ら （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）健常者、保有者、感染者の三者間における転座、反転等に起因する染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０３２２】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＤＭＥと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３２３】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ， 他 （１９８４） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８４／０３５６４等を参照。）この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＤＭＥ、或いはその断片と反応してから洗浄する。次ぎに、結合されたＤＭＥが、当分野で周知の方法で検出される。 精製されたＤＭＥはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上に直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３２４】
別の実施例では、ＤＭＥと結合可能な中和抗体がＤＭＥと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＤＭＥと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３２５】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０３２６】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３２７】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第６０／２３６．９４７号、第６０／２３８．８６４号、第６０／２４２．３２３号、第６０／２４７．５８１号、第６０／２４９．５１９号、第６０／２５２．８３４及び第６０／２５０．５６７は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【０３２８】
（実施例）
１ ｃＤＮＡ ライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。 ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３２９】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０３３０】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ５．１−６．６等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズの選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に連結させた。 好適なプラスミドは例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１ プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、 ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、 ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、または ｐＩＮＣＹ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、あるいはその誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
【０３３１】
２ ｃＤＮＡ クローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 １のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、ＱＩＡＧＥＮ社のＲ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３３２】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３３３】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。 ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に与えられた試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ７．７に概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３３４】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、及びＰＦＡＭ等のようなＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースの選択に対して、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照のこと）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベース、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【０３３５】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。 列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
【０３３６】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０３３７】
４ ゲノム ＤＮＡ からのコード配列の同定及び編集
推定薬物代謝酵素は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４ 及びＢｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が薬物代謝酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいて薬物代謝酵素について問合せて分析した。潜在的な薬物代謝酵素が、薬物代謝酵素としてアノテーションが付けられたインサイトｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｂｐｒｉ及びｇｂｈｔｇと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０３３８】
５ ｃＤＮＡ 配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０３３９】
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０３４０】
６ ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０３４１】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３４２】
このようにして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ はｐ アームの末端から１６．３０ センチモルガンの間隔以内で染色体１４にマップされ、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ は５７．３０ 〜６５．００ センチモルガンの間隔以内で染色体９にマップされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５ は、２３０．７０センチモルガンからｑ末端までの間以内で染色体３にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５は、１１４．００〜１１７．７０センチモルガン以内で染色体３に、また、９２．５０〜９９．００センチモルガン以内で染色体５にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６については一つ以上のマップ位置が報告され、異なったマップ位置を持つ配列が、一つのクラスターに構築されたことを示す。極めて類似しているが、完全に同一でない配列が一つのクラスターに構築される場合にこの状態が発生する。
【０３４３】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． ら， ４章及び１６章等を参照。）
【０３４４】
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬｉｆｅＳｅｑ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【数１】

【０３４５】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０３４６】
或いは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。 ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３４７】
８ ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３４８】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３４９】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。 ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４と２−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。 プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：６０℃で１分間、ステップ ４：６８℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２０回繰り返す。ステップ ６：６８℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。別法では、プライマー対、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ５７℃， １ 分、ステップ ４： ６８℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２０回反復する。 ステップ６： ６８℃， ５ 分、ステップ７： ４℃で保存する。
【０３５０】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するためにプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３５１】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートにて３７℃で一晩培養した。
【０３５２】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ６０℃， １ 分、ステップ ４： ７２℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２９回反復する。 ステップ６： ７２℃， ５ 分、ステップ７： ４℃で保存する。上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３５３】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０３５４】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−^３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて十分に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３５５】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３５６】
１０ マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に周知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． ら （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０３５７】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３５８】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第１鎖バッファ、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール析出させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３５９】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲで１〜２ｎｇの初期量から５μｇより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０３６０】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３６１】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３６２】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３６３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中のＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成生成物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ^２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３６４】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０３６５】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３６６】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比１：１００，０００に相関させる。 異なる源（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３６７】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３６８】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３６９】
１１ 相補的ポリヌクレオチド
ＤＭＥをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＤＭＥの発現を検出、低下、または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤＭＥのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＤＭＥをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３７０】
１２ ＤＭＥ の発現
ＤＭＥの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＤＭＥが発現するために、抗生物質耐性遺伝子及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＤＭＥを発現する。真核細胞でのＤＭＥの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．等を参照）。
【０３７１】
殆どの発現系では、ＤＭＥが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＤＭＥからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＤＭＥを直接用いて以下の実施例１６、１７、及び１８のアッセイを行うことができる。
【０３７２】
１３ 機能的アッセイ
ＤＭＥの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＤＭＥをコードする配列の発現によって評価する。 ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択ベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方光散乱と９０°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０３７３】
遺伝子発現におけるＤＭＥの影響は、ＤＭＥをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。 ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。 ＤＭＥ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３７４】
１４ ＤＭＥ に特異的抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＤＭＥを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。別法では、ＤＭＥアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。 Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３７５】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５ 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＤＭＥ活性を検査するには、ペプチドまたはＤＭＥを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３７６】
１５ 特異的抗体を用いた天然 ＤＭＥ の精製
天然ＤＭＥ或いは組換えＤＭＥを、ＤＭＥに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＤＭＥ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３７７】
ＤＭＥを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＤＭＥを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下で高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＤＭＥとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＤＭＥを回収する。
【０３７８】
１６ ＤＭＥ と相互作用する分子の同定
ＣＹＡＰまたは生物学的に活性であるＣＹＡＰ断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ． ａｎｄ Ｗ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照。）マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＤＭＥと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＤＭＥ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＤＭＥ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＤＭＥの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３７９】
別法では、ＤＭＥと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３８０】
ＤＭＥはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３８１】
１７ ＤＭＥ 活性の実証
ＤＭＥのチトクロームＰ４５０活性はアニリンの４−ヒドロキシル化を用いて測定する。アニリンは酵素によって４−アミノフェノールに変換され、６３０ｎｍで最大吸光度を有する（Ｇｉｂｓｏｎ および Ｓｋｅｔｔ、前出）。このアッセイは便利な測定ではあるが、２− および３−位置でも発生する全ヒドロキシル化が過小評価される。アッセイは３７℃で行い、反応緩衝液には一定分量の酵素および適量のアニリン（約２ｍＭ）が含まれる。この反応の場合、緩衝液にＮＡＤＰＨ またはＮＡＤＰＨ産生補助因子系を入れる必要がある。この反応緩衝液の一つの処方には８５ ｍＭ トリスｐＨ ７．４、１５ ｍＭ 塩化マグネシウム、 ５０ ｍＭ ニコチン酸アミド、４０ ｍｇイソクエン酸三ナトリウムおよび ２ 単位のイソクエン酸デヒドロゲナーゼが含まれ、アッセイの直前に１０ｍＬの反応緩衝液ストックに８ｍｇのＮＡＤＰ^＋ を加える。反応は光学キュベットで行い、６３０ｎｍの吸光度を測定する。このアッセイでは、吸光度の増加率が酵素活性に比例する。標準曲線は４−アミノフェノールの既知濃度を用いて作成できる。
【０３８２】
ＤＭＥの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２４−ヒドロキシラーゼ活性は、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットにおける^３Ｈ標識された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ）の２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）への変換をモニタリングして決定する。エタノールに溶解した１μｇの１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ（或いはコントロールとしてエタノールのみ）を、ＤＭＥの欠損変異体を発現する若しくはＤＭＥを発現しないという点を除けばコントロールラットと同一のＤＭＥを発現する約６週目のオス遺伝子組換えラットに静脈内投与する。ラットを８時間後に断頭により屠殺し、腎臓を手早く取り除き、洗浄し、９倍量の氷冷バッファ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．４）、０．１９Ｍスクロース、２ｍＭ酢酸マグネシウム、および５ｍＭコハク酸ナトリウム）においてホモジナイズする。次に、各ホモジネートの所定量（例えば３ｍｌ）を、約３．５ＧＢｑ／ｍｍｏｌの特定の活性を有する０．２５ｎＭ １α，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄと、常に振盪しながら酸素存在下、３７℃で、１５分間インキュベートする。総脂質を記載 （Ｂｌｉｇｈ， Ｅ．Ｇ． 及びＷ．Ｊ． Ｄｙｅｒ （１９５９） Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７： ９１１９１７） された通りに抽出し、流速１ ｍｌ／分にてｎヘキサン／クロロホルム／メタノール （１０：２．５：１．５） 溶媒系を用いたＦＩＮＥＰＡＫ ＳＩＬ カラム（ＪＡＳＣＯ， 東京都） によってクロロホルム相を分析する。あるいは、１ｍｌ／分の流速にてアセトニトリルバッファ系（４０ 〜１００％、水中 、３０分） を用いたＪ ＳＰＨＥＲＥ ＯＤＳＡＭ カラム （ＹＭＣ Ｃｏ． Ｌｔｄ．、京都市） を使って逆相ＨＰＬＣによってクロロホルム相を分析する。この溶出物は３０秒（またはそれ以下）分画にて集め、各分画中に存在する^３Ｈ の量をシンチレーションカウンターを用いて測定する。コントロールサンプル（すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤまたは２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）を含むサンプル）のクロマトグラムと反応生成物のクロマトグラムとを比較することによって、基質（１α，２５（ＯＨ）_２［１^３Ｈ］Ｄ） および生成物（２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄ）の相対的な移動度は測定され、また、集めた容量と相関する。コントロールラットにおいて生成された２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの量を、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットの２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの量から差し引く。遺伝子組換えラットとコントロールラットとの２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの生成物の差が、そのサンプルに存在するＤＭＥの２５−ヒドラーゼ活性のレベルに比例する。基質および生成物の同定は、質量分光法によって行う（Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４１１５−１４１１９）。
【０３８３】
ＤＭＥのフラビン含有モノオキシゲナーゼ活性は代謝産物のクロマトフラフィー分析によって測定される。例えば、Ｒｉｎｇ， Ｂ．Ｊ． ら （１９９９； Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． ２７：１０９９−１１０３） は０．１ Ｍ リン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ７．４ または８．３） と １ ｍＭ ＮＡＤＰＨ 中、３７℃でフラビン含有モノオキシゲナーゼをインキュベートし、反応を有機溶媒で停止させ、 ＨＰＬＣによって生成物生成を同定する。あるいは、活性はクラーク型電極を用いて酸素の取り込みをモニタリングして測定する。例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｄ．Ｍ． と Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ．Ｌ． （１９７８； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５２：１４２−１５１） は、基質メチマゾールを含むＮＡＤＰＨ生成補助因子系（上記のものに類似の）において、酵素を３７℃でインキュベートした。酸素取込み率は酵素活性に比例する。
【０３８４】
ＤＭＥのＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性は遊離アミン基の比色定量測定を用いて測定される（Ｇｉｂｓｏｎ 及び Ｓｋｅｔｔ， 前出）。２−アミノフェノールのようなアミン含有基質は必要な補助因子（４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、 ７．５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、 ０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ ｍＭ アスコルビン酸、０．７５ ｍＭ ＵＤＰ−グルクロン酸）を含む反応緩衝液中でアリコートの酵素と３７℃にてインキュベートする。十分な時間の後、０．１ Ｍ リン酸バッファ ｐＨ ２．７中で氷冷の２０％ トリクロロ酢酸を加えて反応を停止し、氷上でインキュベートし、遠心分離して、上清を明らかにする。未反応の２−アミノフェノールはこのステップによって分解される。次に、新たに調製した十分な硝酸ナトリウムを加える。このステップによって、グルクロン酸抱合生成物のジアゾニウム塩が生成される。過剰の亜硝酸塩は十分なアンモニウムサルファメートを加えることによって取り除く、また、ジアゾニウム塩は芳香族アミン（例えば、Ｎ−ナフチルエチレンジアミン）と反応して、有色のアゾ化合物を生成する。この化合物は分光光度的に（例えば、５４０ ｎｍで）定量できる。標準曲線は既知の濃度のアニリンを用いて作成することができる。アニリンは２−アミノフェノールグルクロニドに類似の性状を有する発色団を形成する。
【０３８５】
ＤＭＥ のグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ活性は、例えば、２，４−ジニトロ−１−クロロベンゼンのようなモデル基質を用いて測定されるが、２，４−ジニトロ−１−クロロベンゼンは、グルタチオンと反応して生成物、２，４−ジニトロフェニル−グルタチオンを形成する。この生成物は３４０ ｎｍで最高の吸光度を有する。ＧＳＴは種々の基質特異性を有することに注意することが重要であり、モデル基質は目的のＧＳＴの基質優先度に基づいて選択する必要がある。アッセイは室温で行い、好適な反応バッファ（例えば、１ ｍＭ グルタチオン、 １ ｍＭ ジニトロクロロベンゼン、９０ ｍＭ リン酸カリウムバッファ、ｐＨ ６．５）中でアリコートの酵素を含める。反応は光学キュベットで行い、３４０ｎｍの吸光度を測定する。このアッセイでは、吸光度の増加率が酵素活性に比例する。
ＤＭＥ のＮ−アシルトランスフェラーゼ活性は、放射標識されたアミノ酸基質を用いて、放射標識の抱合型生成物への取り込みを測定することによって測定される。非標識アシル−ＣｏＡ 化合物と放射標識アミノ酸を含む反応緩衝液中で酵素をインキュベートし、放射標識アシル抱合体はｎ−ブタノールまたは他の適切な有機溶媒に抽出することによって未反応のアミノ酸から分離する。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ ら （１９９０； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３） は、胆汁酸ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性を測定した。すなわち、酵素をｃｈｏｌｙｌ−ＣｏＡ と^３Ｈ−グリシンまたは、 ^３Ｈ−タウリンとインキュベートし、ｎ−ブタノールに抽出することによってトリチウム化コール酸抱合体を分離し、抽出産物中の放射活性をシンチレーションで測定する。あるいは、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性は次に述べるように、還元されたＣｏＡ （ＣｏＡＳＨ） の分光光度法を用いて測定される。
【０３８６】
ＤＭＥ のＮ−アシルトランスフェラーゼ活性は［^１４Ｃ］アセチル−ＣｏＡ から基質分子への放射標識の転移を用いて測定される（Ｄｅｇｕｃｈｉ， Ｔ． （１９７５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２４：１０８３−５等を参照）。あるいは、ＤＴＮＢ （５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸； Ｅｌｌｍａｎ試薬） のＣｏＡＳＨとの反応に基づいた分光光度測定を用いることができる。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼによって触媒される、アセチル基の基質への転移反応の際に遊離チオール含有ＣｏＡＳＨ が生成される。ＣｏＡＳＨ はＤＴＮＢ 抱合体の４１２ ｎｍ における吸光度を用いて検出される（Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｊ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３０４５−３０５０）。酵素活性は放射活性の基質への取り込み率に比例するか、あるいは、分光光度測定における吸光度の増加率に比例する。
【０３８７】
別の例では、ＡＢＢＲ のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性は、組換えアフリカツメガエルヒストンＨ３２ Ｈ４２ 四量体（１００ μｇ／ｍｌ）、ＨｅＬａ 細胞（１００ μｇ／ｍｌ）から精製されたヒトヒストン Ｈ２Ａ Ｈ２Ｂ および２３ ｐｍｏｌ ［^３Ｈ］−アセチル補酵素 Ａ （１１．２ Ｃｉ／ｍｍｏｌ） の混合物を１２．５ μｌ の緩衝液（ｐＨ ８．５の２５ ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１ ｍＭ ジチオスレイトール、 ０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ナトリウム酪酸、 １５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％ グリセロール） 中、３７℃にて１時間インキュベートしたものを用いて測定する。ヒストンはＳＤＳ−１８％ポリアクリルアミドゲル中で分解し、クーマシーブリリアントブルー色素で染色して視覚化し、蛍光光度分析を行った後、オートラジオグラフィーを行う。
染色によって視覚化されたヒストンの位置に対応する放射活性バンドによって、標識がアセチル化によって特定のヒストン基質への取り込まれたことが示される。
【０３８８】
ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を３７℃で様々な時間にわたって測定する。ＳアデノシルＬ［メチル^３Ｈ］メチオニン （［^３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ； 特異的活性 ＝ ７５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ； ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） はメチル基供与基質として用いられる。有用なメチル受容基質にはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼフィブリラリングリシン−アルギニンドメイン融合タンパク質（ＧＳＴ＿−ＧＡＲ）、異種核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）または、アデノシンジアルデヒドで処理した細胞からの可溶化液中に存在する低メチル化タンパク質が含まれる。メチル化反応はＳＤＳＰＡＧＥ サンプルバッファーを加えると停止する。反応の産物はＳＤＳＰＡＧＥ によって分解され、蛍光光度分析によって視覚化される。^３Ｈ標識メチル供与基質の存在は、ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性の標示となる（Ｔａｎｇ， Ｊ． ら． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７７２３７７３０ および Ｔａｎｇ， Ｊ． ら（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５：１９８６６１９８７６）。
ＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）、１．２ｍＭ ＭｇＣＩ_{２ 、}２００μＭ ＳＡＭ （Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン） ヨウ化物（０．５μＣｉのメチル−［Ｈ^３］ＳＡＭを含む）、１ｍＭジチオスレイトール、および様々な濃度のカテコール基質（例えば、Ｌ−ドパ、ドーパミン、またはＤＢＡ）から成る最終容量が１．０ｍｌの反応液において測定する。この反応は、精製したＤＭＥまたは未精製のＤＭＥを含むサンプル２５０〜５００μｇを加えて開始し、３７℃で３０分間行った。 この反応は、氷上で素早く冷却して停止させ、直後に氷冷ｎ−ヘプタンで抽出する。次に１０分間１０００×ｇで遠心分離した後、液体シンチレーションカウンタで有機抽出物の３ ｍｌのアリコットをその中に含まれている放射活性について分析した。有機相におけるカテコール関連放射活性のレベルはＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性に比例する（Ｚｈｕ， Ｂ． Ｔ． 及びＬｉｅｈｒ， Ｊ． Ｇ． （１９９６） ２７１：１３５７−１３６３）。
【０３８９】
ＤＭＥのＤＨＦＲ活性を、３４０ｎｍ （ε_３４０ ＝ １１，８００ Ｍ^−１・ｃｍ^−１）においてＮＡＤＰＨの消滅によって１５℃で分光光度法で測定する。標準的なアッセイ混合液は、１００μＭ ＮＡＤＰＨ、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ＭＴＥＮ バッファ（５０ｍＭ ２−モルフォリノエタンスルホン酸、２５ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）エミノメタン、２５ｍＭエタノールアミン、および１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）とＤＭＥを含み、最終容量を２．０ｍｌとする。反応は５０μｍのジヒドロ葉酸（基質として）を加えることによって開始される。反応液におけるＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ^＋への酸化がジヒドロ葉酸の還元に一致し、サンプルにおけるＤＨＦＲ活性の量に比例する（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｔ．およびＩｗａｋｕｒａ， Ｍ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９０４１−１９０４７）。
【０３９０】
ＤＭＥのアルド／ケト還元酵素活性を、ＮＡＤＰＨが消費される時の３４０ｎｍにおける吸光度の低下を測定する。標準的な反応混合液は、１３５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（酵素によりｐＨ６．２〜７．２の範囲）、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３Ｍ硫酸リチウム、０．５〜２．５μｇ酵素、および好適なレベルの基質を含む。この混合液を３０℃でインキュベートし、反応を分光光度計で連続的に測定する。酵素活性は、酵素１ｍｇ 当たり消費されるＮＡＤＰＨのモル数として計算される。
【０３９１】
ＤＭＥのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、ＮＡＤ^＋がＮＡＤＨに還元される時の３４０ｎｍにおける吸光度の増大を利用して測定する。標準的な反応混合液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡである。反応液を２５℃でインキュベートし、分光光度計でモニタリングする。酵素活性は、酵素１ｍｇ当たり生成されたＮＡＤＨのモル数として計算する。
【０３９２】
ＤＭＥのカルボキシルエステラーゼ活性は、４−メチルウンベルフェリルアセテートを基質として用いて測定する。酵素反応は約１０ μｌの ＤＭＥ含有サンプルを ０．５ ｍＭ の４メチルウンベルフェリルアセテートとともに、１ｍｌの反応緩衝液（９０ ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、４０ ｍＭ ＫＣｌ、 ｐＨ ７．３） に加えると開始する。４−メチルウンベリフェロンの生成を分光光度計（ε_３５０ ＝ １２．２ ｍＭ^−１ ｃｍ^−１） で１．５分間モニターする。特異的活性は蛋白質１ｍｇにつき、一分間に生成される生成物のミクロモルとして発現され、サンプル中のＤＭＥの活性に相当する（Ｅｖｇｅｎｉａ， Ｖ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４７６９１４７７５）。
【０３９３】
別法では、ＤＭＥのコカインベンゾイルエステルヒドロラーゼ活性は、約０．１ｍｌのＤＭＥおよび３．３ ｍＭ のコカインを、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイトールを含む反応緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４， ｐＨ７．４）で３７℃でインキュベートして測定する。 全量で０．４ｍｌの反応液を１時間インキュベートし、反応は等量の５％トリクロロ酢酸で終了させる。０．１ｍｌの内部標準３，４ジメチル安息香酸（１０ μｇ／ｍｌ） を加える。沈澱タンパク質は１２，０００ × ｇ で１０分間遠心分離して分離する。上澄はきれいな試験管に移して、０．４ｍｌの塩化メチレンで２回抽出する。２つの抽出液を合わせて、窒素流下で乾燥する。この残留物を、１００ ｍｌ当たり８μ１のジエチルアミンを含む１４％アセトニトリル、２５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_{４ 、}ｐＨ４．０に再懸濁してから、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム上に注入して分離する。このカラム溶出液を２３５ｎｍでモニタリングする。ＤＭＥ 活性は内部標準に対する分析物の最高域の割合を比べて定量する。標準曲線は、トリクロロ酢酸処理のタンパク質基質において調製された安息香酸標準を用いて作成する。
【０３９４】
別法では、水溶性基質のパラニトロフェニル酪酸に対するＤＭＥカルボキシルエステラーゼ活性を当分野で周知の分光光度計法で測定する。この方法では、ＤＭＥ含有サンプルを、６ｍＭのタウロコール酸塩の存在下で０．５ Ｍ トリスＨＣｌ （ｐＨ ７．４または８．０）または酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．０） で希釈する。このアッセイは新たに調製されたパラ−ニトロフェニル酪酸溶液（ｐＨ ５．０の酢酸ナトリウム中１００ μｇ／ｍｌ ）を加えることによって開始される。次に、カルボキシエステラーゼ活性をモニターして、４０５ ｎｍ に設定した分光光度計でコントロールの自己加水分解の基質と比較する（Ｗａｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１００４１１００４６）。
【０３９５】
ＤＭＥ のスルホトランスフェラーゼ活性は［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ からフェノールのようなモデル基質への^３５Ｓ の取り込みを用いて測定する（Ｆｏｌｄｓ， Ａ． 及び Ｊ． Ｌ． Ｍｅｅｋ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２７：３６５−３７４）。アリコートの酵素は １ ｍＬ の１０ ｍＭリン酸緩衝液、 ｐＨ ６．４の５０ ｍＭ フェノールおよび、 ０．４−４．０ ｍＭ ［^３５Ｓ］ アデノシン３’−ホスフェート５’−ホスホサルフェート （ＰＡＰＳ）とともに３７℃でインキュベートする。５−２０％ の放射標識が基質に転移するのに十分な時間の後、０．２ ｍＬ の０．１ Ｍ 酢酸バリウムを加えてタンパク質とリン酸緩衝液を沈澱させる。次に、０．２ ｍＬ の ０．１ Ｍ Ｂａ（ＯＨ）_２ を加え、続いて、０．２ ｍＬの ＺｎＳＯ_４を加える。遠心分離によってタンパク質および未反応の［^３５Ｓ］ＰＡＰＳを除去し、上澄を分離させる。上澄の放射活性はシンチレーションによって測定する。この酵素活性は反応生成物の放射活性のモル数から決まる。
ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性を、ＤＭＥを含むサンプルを、２．５μｍｏｌイミダゾールＨＣ１ （ｐＨ６．８）、３．７５μｇの塩化プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２５ｎｍｏｌの完全に脱硫酸化されＮ−再硫酸化されたヘパリン（ヘキソサミンとして）、および５０ｐｍｏｌ （約 ５×１０^５ｃｐｍ）の［^３５Ｓ］ ＰＡＰＳと共に最終反応容量を５０μｌとして３７℃で２０分間インキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。 この反応は、熱湯に反応チューブを１分間浸漬して停止させる。 ０．１μｍｏｌのコンドロイチン硫酸Ａ（グルクロン酸として）を反応混合液にキャリアとして加える。^３５Ｓ標識多糖を、１．３％酢酸カリウムを含む冷却した三倍量のエタノールで沈殿させ、脱塩カラムを用いてゲルクロマトグラフフィによって取り込まれなかった［^３５Ｓ］ＰＡＰＳおよびその分解生成物から完全に分離する。一単位の酵素活性を１分間に１ｐｍｏｌの硫酸を移送するのに必要な量と定義し、沈殿した多糖の中に取り込まれた［^３５Ｓ］ＰＡＰＳの量によって測定する（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ．． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０３９６】
別法では、ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した後、ゲルから酵素を抽出して再生し測定する。分離した後、ゲルを緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０）で洗浄し、３〜５ｍｍのセグメントに切断し、０．１５Ｍ ＮａＣＩを含む同じ緩衝液、１００μｌで４℃で４８時間撹拌する。 溶出した酵素を遠心分離して収集し、上記したように、スルホトランスフェラーゼ活性についてアッセイする（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０３９７】
別法では、ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性を、［^３５Ｓ］ＰＡＰＳから固定されたペプチドへの［^３５Ｓ］硫酸の転移を測定して決定する。 この固定されたペプチドは、Ｃ末端システイン残基が付加された成熟Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドのＮ末端の１５残基である。このペプチドは３つの潜在的なチロシン硫酸化部位に渡っている。このペプチドは、システイン残基によってヨードアセトアミド活性化樹脂に結合される（１ｍｌの樹脂あたり１．５〜３．０μｍｏｌペプチドの密度）。この酵素アッセイは、４０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ （ｐＨ６．８）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ_{２ 、}５０ｍＭ ＮａＦ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭ ５’−ＡＭＰを含む最終容量１３０μｌ中にて、１０μｌのペプチド誘導体化ビーズと２〜２０μｌのＤＭＥ含有サンプルを結合させて行った。このアッセイは、０．５μＣｉの［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１．７μＭ； １Ｃｉ ＝ ３７ＧＢｑ）を加えて開始した。３７℃で３０分経過した後に、反応ビーズを６５℃で６Ｍグアニジンで洗浄し、ビーズに取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンタで測定する。ビーズ結合ペプチドに移送された［^３５Ｓ］硫酸を測定し、サンプルにおけるＤＭＥ活性を決定する。１単位の活性は１分間に１ｐｍｏｌの生成物が生成されると定義する（Ｏｕｙａｎｇ， Ｙ−Ｂ．他 （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９５：２８９６−２９０１）。
【０３９８】
別法では、ＤＭＥスルホトランスフェラーゼのアッセイを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ （ｐＨ７．０）、２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭジチオスレイトール、１４μＭ［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、およびドーパミン（２５μＭ），ρ−ニトロフェノール（５μＭ）またはその他の候補基質を含む最終容量３０μｌにおいて硫酸供与体として［^３５Ｓ］ＰＡＰＳを用いて行った。アッセイの反応は、精製されたＤＭＥ酵素試薬或いはＤＭＥ活性を含むサンプルを加えて開始させ、その反応を３７℃で１５分間続け、１００℃で３分間加熱して停止させる。 生成された沈降物を遠心分離によって除去する。次に^３５Ｓ硫酸化物を調べるために、上澄みを薄層クロマトグラフィ或いは二次元薄膜分離方法のいずれかによって分析する。^３５Ｓ硫酸化物の同定ができるように好適な標準を上澄みと平行に流し、反応性生物の移動の相対速度に基づいてＤＭＥ含有サンプルの酵素特異性を決定する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｙ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：６２４２−６２４７）。
【０３９９】
ＤＭＥのスクアレンエポキシラーゼ活性を、精製したＤＭＥ （またはＤＭＥを含む未精製の混合液）， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、０．０１ｍＭ ＦＡＤ、０．２単位のＮＡＤＰＨ−チトクロームＣ （Ｐ−４５０）レダクターゼ、０．０１ ｍＭ［^ｌ４Ｃ］スクアレン（２０μｌのＴｗｅｅｎ ８０を用いて拡散された）、および０．２Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む混合液においてアッセイする。 １ｍＭ ＮＡＤＰＨを加えて反応を開始させ、３７℃で３０分間インキュベートする。 非けん化脂質を、酢酸エチル／ベンゼン（０．５：９９．５， ｖ／ｖ）で作製したシリカゲルＴＬＣによって分析する。反応生成物を、ＤＭＥを含まない反応混合液による反応生成物と比較する。２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンの存在を、好適な脂質標準を用いて確認する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ．他（１９９５） ２７０：１７−２０）。
【０４００】
ＤＭＥ のエポキシドヒドロラーゼ活性は、エーテル抽出物のガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ） を用いて基質の消失によって測定するか、またはアセトンで急冷した反応混合物のＧＣ分析により基質の消失とジオール生成によって測定する。ＤＭＥを含むサンプルまたはエポキシドヒドロラーゼのコントロールサンプルを１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、１ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ）、および ５ ｍＭ エポキシド基質 （例えば、エチレンオキシド、スチレンオキシド、プロピレンオキシド、イソプレンモノオキシド、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピフルオロヒドリン、グルシドール 、 １，２エポキシブタン、１，２エポキシヘキサン、１，２エポキシオクタン）でインキュベートする。様々な時点でサンプルの一部を反応混合液から取り出して、内部標準を含む１ｍｌの氷冷アセトンに加えてＧＣ分析を行う（例えば、１−ノナノール）。タンパク質および塩を遠心分離（１５分、４０００×ｇ）によって除去し、抽出物を０．２ｍｍ×２５ｍ ＣＰ−Ｗａｘ５７−ＣＢカラム（ＣＨＲＯＭＰＡＣＫ， Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および水素炎イオン化検出器を用いてＧＣにより分析する。ＧＣ産物の同定は、当分野で周知の好適な標準およびコントロールを用いて行う。 １単位のＤＭＥ活性は、１分間に１μｍｏｌのジオール生成を触媒する酵素の量と定義する（Ｒｉｎｋ， Ｒ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７）。
【０４０１】
ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性は、ＤＭＥを含むサンプルを、１ｍＭ Ｌ−キヌレニンおよび１ｍＭ ２−オキソグルタル酸の存在下で、最終容量２００μｌの７０μＭ ＰＬＰを含む１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ 酢酸バッファ（ｐＨ８．０）で３７℃で１時間インキュベートしてアッセイする。キヌレニン酸の生成は、当分野で周知の好適な標準およびコントロールを用いて３３０ｎｍで分光光度検出によりＨＰＬＣで定量する。 別法では、Ｌ−３−ヒドロキシキヌレニンを基質として用い、キサンツレン酸の生成を３４０ｎｍでのＵＶ検出で生成物のＨＰＬＣ分析により測定する。キヌレニン酸およびキサンツレン酸の生成はそれぞれ、アミノトランスフェラーゼ活性を示す（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【０４０２】
別法では、ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、酵素結合補助因子であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）のＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルにおける変化をモニタリングして、一回のターンオーバーの条件下で精製したＤＭＥのサンプル或いはＤＭＥを含む未精製のサンプルの様々なアミノ酸およびオキソ酸基質に対する活性を測定して行う。この反応は、９μＭ 精製ＤＭＥ またはＤＭＥ含有サンプルおよび検査する基質（アミノ酸およびオキソ酸基質）を含む５０ｍＭ４−メチルモルフォリン（ｐＨ７．５）において２５℃で行う。アミノ酸からオキソ酸への半反応の後に、酵素結合ＰＬＰのピリドキサミン５’リン酸（ＰＭＰ）への変換により生じる３６０ｎｍにおける吸光度の低下および３３０ｎｍにおける吸光度の増加を測定する。ＤＭＥの特異性および相対的な活性を、特定の基質に対する酵素活性によって測定する（Ｖａｃｃａ， Ｒ． Ａ．他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２１９３２−２１９３７）
【０４０３】
ＤＭＥのスーパーオキシドジスムターゼ活性を、細胞ペレット、培養した上澄み、または精製したタンパク質試薬からアッセイする。サンプルすなわち溶解物を１５％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動法によって分離する。このゲルを、２．５ｍＭニトロブルーテトラゾリウムにおいて３０分間インキュベートし、その後３０ｍＭリン酸カリウム、３０ｍＭ ＴＥＭＥＤ、および３０μＭリボフラビン（ｐＨ７．８）において２０分間インキュベートする。スーパーオキシドジスムターゼ活性は、背景のブルーに対して白いバンドとして見ることができ、ライトボックスでゲルに照明を当てる。スーパーオキシドジスムターゼ活性の定量は、好適なスーパーオキシドジスムターゼのポジティブおよびネガティブコントロール（例えば、様々な量の市販されている大腸菌スーパーオキシドジスムターゼなど）を用いて活性ゲルの比重走査により行う（Ｈａｒｔｈ， Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４２８１−４２９２）。
【０４０４】
１８ ＤＭＥ インヒビターの同定
実施例１７のアッセイで説明したように、検査する化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに注入する。ＤＭＥ 活性はそれぞれのウェルについて測定し、ＤＭＥ活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および用量反応動態（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を決定することができる。ＤＭＥ活性を促進する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０４０５】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明に記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４０６】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０４０７】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４０８】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０４０９】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０４１０】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０４１１】
表７は、ＰＫＩＮの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

Claims (91)

1. 以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
   （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８（配列番号１乃至１８）を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１６からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ Ｃ ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７−１８からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９７％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ ｄ ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
   （ ｅ ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択した請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
4. 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
5. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６（配列番号１９乃至３６）を有する群から選択した請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
8. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
9. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、以下の過程を含む方法。
   （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
   （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程。
10. 前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
12. 以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
14. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程（ただし、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする）と、
    （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
15. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
    （ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
18. 前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の成分。
19. 機能的なＤＭＥ（新規の薬剤代謝酵素）の発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
20. 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
21. 請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
22. 機能的なＤＭＥの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
23. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
24. 請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
25. 機能的なＤＭＥの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２４の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
26. 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させるステップと、
    （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップを含むことを特徴とする方法。
27. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
    （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
    （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
28. 請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
    （ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
29. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
    （ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
    （ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせるステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記ステップと、
    （ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
    （ｄ）前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
30. 生物学的サンプル中のＤＭＥ の発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
    （ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項１１に記載の抗体と結合する過程と、
    （ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
31. 前記抗体が、
    （ａ）キメラ抗体
    （ｂ）単鎖抗体
    （ｃ）Ｆａｂ断片
    （ｄ）Ｆ（ａｂ’）_２ 断片
    （ｅ）ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
32. 請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む化合物。
33. 被検者のＤＭＥ の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
34. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の化合物。
35. 被検者のＤＭＥ の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
36. 請求項１１に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
    （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその免疫原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
    （ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
37. 請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
38. 請求項３７に記載のポリクローナル抗体及び好適なキャリアを含む化合物。
39. 請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を製造する方法であって、
    （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその免疫原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
    （ｃ）前記抗体産出細胞を不死化の細胞と融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
    （ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
    （ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
40. 請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
41. 請求項４０に記載のモノクローナル抗体及び好適なキャリアを含む化合物。
42. Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
43. 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
44. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、 該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
45. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程を含むことを特徴とする方法。
46. マイクロアレイの少なくとも一つの要素が請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
47. ポリヌクレオチドを含むサンプルの転写イメージを作成する方法であって、
    （ａ）サンプルのポリヌクレオチドを標識するステップと、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、請求項４６に記載のマイクロアレイの要素をサンプルの標識されたポリヌクレオチドと接触させるステップと
    （ｃ ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量するステップとを含むサンプルの転写イメージを作製する方法。
48. 固体基板上の物理的に異なった位置に付加された異なったヌクレオチド分子を含むアレイであって、前記ヌクレオチド分子の少なくとも一つが、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の近接するヌクレオチドと特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列または最初のオリゴヌクレオチドを含み、前記標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであるようなアレイ。
49. 請求項４８に記載のアレイであって、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の近接するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
50. 請求項４８に記載のアレイであって、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の近接するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
51. 請求項４８に記載のアレイであって、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が前記標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
52. マイクロアレイである請求項４８に記載のアレイ。
53. 前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズされた前記標的ポリヌクレオチドをさらに含む請求項４８に記載のアレイ。
54. 請求項４８のアレイであって、リンカーが前記ヌクレオチド分子の少なくとも一つを前記固体基板に結合するアレイ。
55. 請求項４８に記載のアレイであって、基板上の物理的に異なった各々の位置が複数のヌクレオチド分子を含み、またその複数のヌクレオチド分子が任意の一つの物理的に異なった位置で同じ配列を有し、基板上の物理的に異なった各々の位置が基板上の別の物理的に異なった位置のヌクレオチド分子の配列とは異なった配列を有するヌクレオチド分子を含むようなアレイ。
56. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
57. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
58. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
59. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
60. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
61. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド
62. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
63. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
64. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
65. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
66. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
67. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
68. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
69. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
70. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
71. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
72. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
73. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
74. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
75. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
76. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
77. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
78. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
79. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
80. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
81. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
82. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
83. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
84. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
85. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
86. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
87. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
88. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
89. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
90. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
91. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。