JP2004522554A - 体液を滅菌的に吸引／再注入する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は望ましくない成分を含有する体液を吸引およびろ過(95)する方法、ならびにドナー被験者に処理済みの吸引液を再注入するために調製する際に体液を滅菌環境(100)で処理する方法を提供する。本発明である方法は、特に、経皮的または外科的切開によりカテーテルまたは注入針(72)を介して処理済の細胞を再注入する前に、術者またはドナーに危険を及ぼすことなく血管形成促進分子を有する吸引した細胞のトランスフェクションを促進するように設計されている。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、医学的なシステムおよび手法に関し、より詳細には生物の体腔内部表面内へ治療用薬剤を注入するためにそれらを使用する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
過去何年にもわたる心臓血管系および心胸郭手術市場の拡大は、主に、心臓切開手術によるバイパス手技の増加によるものであったが、低侵襲手技に関連する製品が出現したことにより市場が新たに成長するきっかけとなっている。医師の絶え間ない受け入れに伴い、これらの技術を用いてこれまでに肯定的な成果が見られたことから、従来の心臓切開手術市場は徐々に衰退していくと考えられる。
【０００３】
管理医療に関連する資金および費用削減方策のために、これらの進化を続ける技術および手法は患者に与える外傷の軽減を約束するだけでなく、従来の心臓切開手術に関連する莫大な費用を削減する。装置および使い捨て用品を含む、心胸郭手術の低侵襲的アプローチの市場は、今後20年間恐ろしい速度で成長することが予測される。
【０００４】
ここ数年で、拍動下での冠状動脈バイパス術およびレーザー心筋内血管再建術(TMR)などの、画期的な技術の実施を始めるセンターの数が世界中で増加している。これらの発展中の手法は、患者の外傷の著しい減少およびより低い費用、加えて心臓切開手術を受けることができない患者に実行可能な別法を提供することによって、対象としうる患者底辺サイズを拡大する可能性を提供する。
【０００５】
骨髄細胞および吸引液は、増殖因子として公知の血管形成ペプチド源と考えられている。また、また、最近の研究は、骨髄細胞は、血管芽細胞に分化する幹細胞を含むことが示されている。血管形成は、既存の毛細管または細静脈から発生することによる新たな血管の出生後の形成を示す。血管形成中、内皮細胞は静止状態の微小血管系(数千日というターンオーバー)から活性化されて、迅速な増殖（数日というターンオーバー）を起こす。
【０００６】
現在臨床段階にある1つの技術は、心臓の機能を回復させるために心臓内に自己由来の骨髄細胞を移植することを試験している。このような手法において、患者の寛骨から吸引によって得られた自己由来の骨髄細胞は、心筋細胞に分化させ心筋機能を回復させるために心室内瘢痕組織へ移植される(S. Tomitaら、Circulation 100:19 Suppl II247-56, 1999)。別の技術において、自己由来の骨髄細胞は採取され、VEGFなどの血管形成増殖因子源として虚血肢または虚血心臓組織に移植される(A. Sasameら、Jpn Heart J, Mar 40:2 165-78, 1999)。
【０００７】
このような技術を実施するために、骨髄生検、吸引、ならびに移植に使用する種々の種類の針および針集成物が提案されており、現在使用されている。それらの骨髄採取装置の多くは、骨髄の芯試料を切断するために使用することができるカニューレ、切断用先端部付きスタイレット、またはトロカールを含む。一方、骨髄液採取のために設計された装置、吸引装置は、骨髄液を吸引するための陰圧を形成するための装置に取り付けられた中空の針を備える。
【０００８】
自己由来の骨髄細胞の採取、精製、および再注入に使用される現在の手法は、3〜4時間の間患者を鎮静させておく必要がある場合があり、その間に骨髄吸引液を再注入のために調製する。また、採取される骨髄材料は通常手術室または回復室で吸引され、次いで吸引後実験室に移され、そこで吸引液から骨髄細胞を重力分離するために吸引液を遠心分離器に入れるので、現在の手法は被験者の感染という大きなリスクを伴う。多くの場合、骨髄吸引液は、重力分離用に特別に設計された遠心管に移される。次いで、分離した骨髄細胞を遠心管からシリンジに取り、患者に送達するために回復室または手術室に搬送される。従って、骨髄吸引液は滅菌されていない可能性のある条件下で処理され、滅菌されていない可能性のある調製物として患者に再度注入される。
【０００９】
一般に、処理された細胞は、再潅流が必要とされている生体部位にカテーテルによって注入される。例えば、側副毛細管形成によって虚血組織を再潅流する手段として血管形成を刺激するために、被験者の心筋内へ心臓周囲カテーテルによって骨髄細胞を送達することが知られている。しかし、従来の非滅菌骨髄吸引液を調製および注入するための方法は、移動患者にとってその後の増加した感染リスクを伴う病原菌の導入という危険がある。
【００１０】
VEGF(血管内皮増殖因子)およびbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)のような血管形成ペプチドも、冠動脈疾患を治療するための臨床試験に入っている。全身性副作用を限定するために、臨床的に関連のある送達手段の工夫および心筋などの虚血組織へのこれらのペプチドの部位特異的送達の達成に対する試みがなされている。典型的には、進行性冠動脈閉塞に罹患している被験者において側副動脈形成を生じさせるために、治療用ペプチドをコードするcDNAが心筋内に直接注入されるか、またはcDNAを保有する自己複製欠損アデノウィルス内への送達用に導入される。
【００１１】
最近、種々の文献が、心臓疾患を含む疾患の治療または予防に遺伝子導入を使用することを主張している。例えば、Mazurら、「Coronary Restenosis and Gene Therapy」、Molecular and Cellular Pharmacology, 21: 104-111, 1994、French、「Gene Transfer and Cardiovascular Disorders、Herz18:222-229, 1993、Williams、「Prospects for Gene Therapy of Ischemic Heart Disease」、American Journal of Medical Sciences 306:129-136, 1993、SchneiderおよびFrench、「The Advent of Adenovirus: Gene Therapy for Cardiovascular Disease」、Circulation 88: 1937-1942, 1993を参照されたい。別の文献、Leidenら、国際特許出願番号第PCT/US93/11133号、発明の名称「Adenovirus-Mediated Gene Transfer to Cardiac and Vascular Smooth Muscle」は、心臓の血管平滑筋細胞の機能を調節する目的のために、アデノウィルス媒介性の遺伝子導入の使用を報告している。Leidenらは、遺伝子産物をコードするDNA配列を含む組換えアデノウィルスを心臓または血管平滑筋細胞に送達し、遺伝子産物が発現されるまで細胞を維持することができることを記述している。Leidenらによると、筋細胞機能は、遺伝子の転写を変更し、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの、遺伝子転写産物の産生の変化によって調節される。Leidenらは、遺伝子産物を挿入した複製機能が欠損した5型アデノウィルス(CMVプロモーターを含有する)を完全なアデノウィルスゲノムを保有するプラスミドと共に293細胞に同時トランスフェクトすることによって遺伝子産物を含有するアデノウィルス構築物を入手する段階と、得られたアデノウィルス構築物を293細胞中で増殖させる段階と、ベクターを細胞に直接注入することによって心筋または血管平滑筋細胞にアデノウィルス構築物を送達する段階とを含む遺伝子導入方法を記載している。
【００１２】
アデノウィルスベクターを使用して心臓に遺伝子導入することを成功させるには障害がある。例えば、細胞分裂が速い細胞集団に導入遺伝子を挿入すると、導入遺伝子の発現期間が実質的に短くなる。このような細胞の例には、すべての血管の内側層を形成する内皮細胞および心臓全体に分布している線維芽細胞が挙げられる。望ましい細胞だけが導入遺伝子を収容して発現し、導入遺伝子が全身に分布されないように導入遺伝子を標的化することも非常に重要な考慮点である。これが達成されないと、導入遺伝子の全身発現および付随する問題が生じることがある。例えば、肝臓にアデノウィルス媒介的な遺伝子導入後の炎症性浸潤が証明されている(Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 91: 4407, 1994)。最後に、血管形成をインビボにおいて刺激するためのFGF-５のアデノウィルス媒介性遺伝子導入に関して、注入されたウィルス材料が、重篤で致死的であることが多い不整脈を誘発する場合もあることが知られている。
【００１３】
虚血部位に血管形成ペプチドをインビボにおいて発現するためのこのような治療用ペプチドをコードするcDNAをトランスフェクトしたこのようなアデノウィルスを用いて、上記の自己由来の骨髄細胞をトランスフェクトすることも知られている。しかし、アデノウィルスベクターの取り扱いは、それらの調製および取り扱いおよび／または患者への注入を担当する医療チームメンバーに対するリスクと一般に見なされている。このため、現在は、アデノウィルスの漏れの可能性を少なくするために、「フード下で」ベクターを調製し、骨髄細胞を形質転換することが行われているので、トランスフェクションのために骨髄を実験室に輸送する必要性があり、その後トランスフェクトした細胞は注入するために患者に戻される。
【００１４】
血管形成剤などの治療剤を、カテーテルで生体内部位に注入する低侵襲治療方法も、注入部位ならびに深度および注入される治療剤の量を制御するという困難な問題を生じている。例えば、外部から導入されるVEGFなどの血管形成因子の、被験者が耐用できる量はごく少量である。高用量では、VEGFは血圧低下を生じることが知られている。過剰用量は、少なくとも1つの臨床試験において致死的であることが証明された。従って、送達される増殖因子の量の厳密な制御が非常に重要である。また、送達部位は心筋などの体腔内部の表面に位置しているので、注入針を備えた湾曲可能な血管内カテーテルが通例使用されているが、均一な量の血管形成剤を均一に間隔をおいて送達するために心筋に侵入する位置および角度を制御することは困難である。
【００１５】
内臓壁に接近するためにカテーテルを湾曲させるとき、従来技術の先端可動型注入カテーテルには針をカテーテル内に撤退させる傾向があるため針侵入深度の制御が複雑になる場合もある。針脱落の補正として、針をカテーテルの先端から過剰に前進させることが現在行われている。治療用流体を心筋内に送達するためにカテーテルを心臓周囲空間に前進させる場合には、過剰侵入によって針を心臓壁に実際に穿刺した場合もあり、結果として治療用流体は心筋に導入されない。
【００１６】
血管形成剤以外の多数の治療用物質も体腔内部表面に導入される。例えば、再潅流手技後の再狭窄の予防または糖尿病性網膜症および種々の種類の癌の治療などの数多くの治療目的のために血管形成の逆戻りが実施される。抗再狭窄では、新たな血管の成長は遮断または抑制され、新たな組織（例えば、増殖中の腫瘍、ステントまたは人工血管の表面の新生内膜）の形成は、アンギオスタチン、エンドスタチン、またはアンタリン、組織内の細胞増殖を阻止する局所的に投与されるマイトトキシンなどの「逆血管形成(reverse angiogenesis)」剤の導入によって制限または排除される。
【００１７】
従って、自己由来の骨髄を取り扱いおよび処理する際に使用し、血管形成を誘導または低下するために、細胞、治療用ペプチドをコードする核酸等を含有する流体を体腔内部、特に血管系内および心臓の内側または外側に制御して送達するための、新規ですぐれた装置の必要性が当技術分野において存在する。
【００１８】
特に、骨髄液を吸引し、流体を滅菌環境で処理し、骨髄治療を必要としている被験者に処理した骨髄を注入するために使用することができる、ベッドサイドで使用するための閉じた滅菌系の吸引／注入装置の必要性が当技術分野において存在する。本発明はこれらの用件を満たしており、さらに利点を提供する。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
本発明は、それを必要としている被験者の組織表面内に正確に制御された治療容量の血管形成促進治療液を1回または複数回導入する方法を提供することによって、当技術分野における問題の多くを解決する。本発明である方法は、正確に制御された治療容量の液体を、実質的に滅菌された状態で反復的に送達する滅菌容器集成物を特徴とする液体注入システムを使用する。
【００２０】
一態様において、本発明である組織表面内に血管形成促進流体を導入する方法は、次を液密的配置で含む滅菌容器集成物を入手する段階を含む：
収容部材と比較して小さいサイズの開口部を有する液密収容部材であって、収容部材の内側が滅菌状態に維持されており、約3ml〜約70mlの範囲の最大内部容量を有し、中空の針カニューレを収容するための開口部を被覆する自己気密性の穿刺可能な滅菌障壁を有する液密収容部材；収容部材の内側と液密的に接続している圧力作動装置であり、収容部材の内部に含有される治療用液体に陽圧を反復的に適用し、このため液体の敗血性汚染および液体の未制御の損失を伴わずに正確に制御された容量の治療用液体を開口部を介して反復的に放出する圧力作動装置；ならびに収容部材の内側と流体的に連絡している中空の針。本発明である方法は、被験者の組織表面内に中空の針を挿入する段階と、滅菌収容部材内の治療用液体に陽圧を反復的に適用するために圧力作動装置を作動することによって、滅菌収容部材内に含有される正確に制御された容量の治療用液体を中空の針を介して被験者の組織表面内に複数回注入する段階とをさらに含む。この方法によって、正確に制御された容量の治療用血管形成促進流体が、実質的に滅菌状態で被験者の組織表面内に反復的に注入される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、それを必要としている被験者の組織表面内に、正確に制御された治療容量の血管形成促進治療液を滅菌状態で1回または複数回導入する方法を提供する。本発明である方法は、a)i)中空の針と、ii)本発明である滅菌容器と、iii)滅菌容器のプランジャーハンドルに機能的に接続された圧力作動装置とを同軸配置で含み、容器プランジャーを正確に制御された長手方向の距離だけ遠位方向に1回または複数回移動することによって、制御された容量の液体を放出するように、圧力作動装置が滅菌チャンバー内の液体に陽圧を適用する滅菌液体注入システムを入手する段階を含み、本発明である方法は、滅菌収容部材内の治療用液体に陽圧を反復的に適用するために圧力作動装置を作動することによって、滅菌収容部材に含有される正確に制御された容量の治療用流体を中空の針を介して被験者の組織表面内に複数回注入する段階であって、それによって正確に制御された容量の治療用血管形成促進流体が、実質的に滅菌された状態で被験者の組織表面内に反復的に注入される段階をさらに含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、滅菌容器の内側に流体的に連絡している中空の吸引針を介して上記の滅菌容器内に骨髄液を吸引し、滅菌容器の滅菌収容部材内に骨髄液を吸引するのに十分な部分的な真空を収容部材の内側に形成するように圧力作動装置を稼働することによって、骨髄吸引液を滅菌状態で処理する方法を提供する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、望ましくない成分を含有する生体液を吸引およびろ過し、処理した吸引液を必要とする被験者、例えば、自己ドナーに注入するために調製する際に生体液を滅菌環境で処理するための自己内蔵式装置および方法に関する。本発明は、自己内臓型の滅菌環境で骨髄液を吸引、ろ過、および処理するのに特に有用であると記載されているが、本発明の装置および方法は、他の生体液、例えば血液を吸引および処理するために使用することもできる。
【００２４】
本発明による一態様において、骨髄細胞および種々の種類の血液細胞を含有する、骨髄液などの細胞を含有する生体液を収容および／または処理するための滅菌容器およびその使用法が提供される。本発明である滅菌容器は、収容部材より小さいサイズの開口を有する液密的な収容部材と、開口部を被覆する自己密封性の穿刺可能な滅菌隔壁と、圧力作動装置を介して収容部材から液体が未制御に損失されることなく、収容部材の滅菌領域内に液体を吸引または収容部材から液体を放出するのに十分な陽圧または陰圧を滅菌領域内に確立または導入するために収容部材の内側に液密的に接続している圧力作動装置を備える。滅菌容器は、圧力作動装置が流体を吸引するために滅菌容器内に部分的な真空を確立することができる程度に気密性でなければならない。任意の種類の真空源をこの目的のために圧力作動装置に取り付けることができる。または、圧力作動装置と収容部材との間に、この目的のために十分な密封を提供するプランジャー型の圧力作動装置を撤退させることによって部分的な真空を収容部材内に確立することができる。滅菌容器から流体を放出するためには、圧力作動装置を介して滅菌容器の液体内容物に適用される空気圧を使用して流体を放出することができる。または、液体は圧縮不可能であるので、容器内に保持された液体に機械的な力を適用するように圧力作動装置を設計し、滅菌容器の開口部の滅菌障壁を介して挿入された、中空の針を介して液体を放出することができる。
【００２５】
穿刺可能で自己再密封性の滅菌障壁（例えば、エラストマー隔壁）は針によって容易に穿刺可能で、穿刺している針を除去すると、滅菌容器の収容部材内の滅菌状態を維持するために自己密封性である。圧力作動装置が滅菌収容部材内に陰圧を確立するために使用されると、容器収容部材の滅菌領域に侵入するためにエラストマー隔壁に突き刺された中空の針カニューレを介して液体を滅菌容器内に吸引することができる。同様に、滅菌収容部材内に保持される液体に陽圧を確立するために圧力作動装置が使用されると、隔壁を介して配置された針を介して液体を排出することができる。
【００２６】
滅菌容器の収容部材は任意の都合のよい材料で製造することができ、任意の都合のよい形状を有することができる。例えば、収容部材の断面形状は楕円、八角形、四角形等であってもよく、または収容部材は折りたたみ式および／または可膨張性の風船の形態をとってもよい。取り扱いを容易にするためまたは滅菌容器を直接取り扱わないために、剛性を提供する硬いキャニスターに滅菌容器自体を収容することができる。好ましくは、滅菌容器はポリカーボネートのような、通して見ることができる透明で滑らかな材料から構成される。
【００２７】
滅菌容器に関連する圧力作動装置は任意の種類の吸引または圧力供給源、モーター駆動式ポンプ等を備えてもよく、好ましくは、容量がマイクロリッター程度に少量でも、例えば、容量が1回の排出あたり約0.1ml〜約0.3mlであっても、滅菌容器内に吸引される容量または滅菌容器から排出される容量を正確に制御することができるように、圧力作動装置は調節可能な圧力を提供する。最も重要なことには、正確に制御された一定容量の流体が滅菌容器から滅菌状態で反復して排出されうるように、圧力作動装置は滅菌容器内の流体に制御された圧力を提供する。容器内にある間、液体は滅菌状態で維持され、このため滅菌容器内に吸引された液体を保存、または例えば滅菌容器内に事前に添加しておいた（例えば事前にパッケージングした）治療剤によって滅菌容器内にある間に処理でき、次いで滅菌状態で被験者に注入される。本発明である滅菌容器集成物に使用することができる圧力作動装置の例には、Alaris Medical Systems社製のASENA(登録商標) 注入システムまたはYale Apparatus社製のMULTI-PHASER(登録商標)プログラム式シリンジポンプならびに本明細書に詳細に記載されているモーター駆動式圧力作動装置が挙げられる。
【００２８】
滅菌容器の開口部に中空の針を取り付けるために、滅菌容器の開口部には、好ましくはルアーロックまたは当技術分野において既知の他の流体コネクタなどの液密的コネクタが提供される。滅菌容器から放出される流体を被験者に注入するためには、中空の針カニューレの一方の末端が滅菌容器の開口部の滅菌障壁を穿刺し、針の他方の末端が圧力作動装置によって滅菌容器から放出された流体を被験者に注入するための皮下注射針として使用されるように、両方の末端が鋭い中空の針をさらに含んでもよい。または、流体コネクタは、滅菌容器の滅菌障壁を穿刺するための針カニューレを一方の末端に提供し、滅菌容器から放出された流体を被験者に注入するための注入針を他方の末端に提供する任意の種類の流水式針集成物を含んでもよい。使用時において、本発明である滅菌容器は、本発明である滅菌吸引／再注入システムの追加の要素と共に種々のシステムおよび集成物内に配置され、それらは全て離脱可能であるように液密的に組み合う。以下に記載する各集成物は、異なる機能の性能または自己由来の流体を吸引、処理、および被験者に再注入する方法の段階が明確にされている。例えば、要素は、摩擦はめ合い、螺合、ルアーロックを形成するための組み合わせ等によって離脱可能であるように接合することができる。例えば、吸引針のハブの窪みは、好ましくは、雌型ルアー接続部材を提供し、フィルター受け器の近位末端は、吸引針72のハブ82に吸引シリンジを離脱可能であるように取り付けるための雄型ルアー接続部材を提供する。フィルター受け器の遠位部分および近位部分も同様に、摩擦はめ込み、螺合、ルアーロック等によって離脱可能であるように接合することができる。好ましくは、フィルター受け器の遠位および近位部分は、そのフィルター受け器を再利用する場合には螺合するようにネジ山が形成される。または、使い捨てであるフィルター集成物は、近位および遠位部分が接着され内部にフィルターが永続的に封入された任意の軽量プラスチックで製造される。
【００２９】
本発明である滅菌吸引／再注入システムの種々の構成要素は、図面の参照と共に本明細書において詳細に記載される。
【００３０】
本発明である滅菌容器100の一態様を図1Aおよび1Bに示す。好ましい滅菌容器は、小さい径の遠位部分70を有する円筒形部分61を有する収容部材60を同軸配置で含む。収容部材60の遠位末端に位置する開口部62も、収容部材60の円筒形部分61と比較して小さい径を有し、穿刺可能で自己密封性隔壁64で栓がされるかまたは被覆されている。圧力作動装置は断面が円形であり、収容部材60内に液密的で移動可能であるように取り付けられているピストン様プランジャー66として示される。プランジャーには、円筒形部分80、および収容部材60の小さい径の遠位末端の内側に適合するように形作られたドーム型のヘッド部分86が提供されている。プランジャーの近位末端のハンドル部分90（わずかに小さい径の円筒形部分70の延長部として示されている）は、収容部材の円筒形部分61内でプランジャーヘッド部分を移動するために使用される。この態様では、滅菌容器収容部材60の近位部分は、プランジャーの移動中にプランジャー66を同軸状に配置するためのガイドとして働く。好ましくは、滅菌容器100の遠位末端の開口部62周囲に縁108が伸展し、本発明であるフィルター集成物95、針アダプタ97、またはカテーテルに容器を離脱可能で液密的に取り付けるために内側のネジ山107と外側のネジ山94が提供されている。
【００３１】
図1Bに長手方向の断面図で示すように、収容部材60の円筒形部分61の内側壁の円周方向に固定して取り付けられている1つまたは複数のピストンリング様停止部材82に接触するとき、プランジャーの近位方向への移動がプランジャーヘッド86によって制限されるように、プランジャーヘッド86は、好ましくは、プランジャー66の円筒形部分61より大きい径を有する。ピストンリング様停止部材82は、滅菌チャンバーからの液体の漏れを防ぐ液密的な密封を形成するために、停止部材とプランジャーの円筒形部分80との間の接触点にO-リングガスケットなどの密封部材68をさらに有する。好ましくは、プランジャーヘッド86の周辺部にも、収容部材の内側壁との接触点に、ブッシング、ガスケットまたはO-リングなどの密封部材68が提供される。プランジャー66のヘッド部分86も、収容部材の内側壁とプランジャーのヘッド部分との間に液密的な密封を提供するために、1つまたは複数のガスケットまたは密封部材68が円周方向に取り付けられている。図1Bに示すように、液密的（および滅菌的）な取り付けおよび滅菌容器100の収容部材60内でのプランジャー66の移動を促進するために、プランジャーの円筒形部分80の面に接触するO-リング摩擦密封部材68に取り付けられる溝84が各停止部材82の面に提供されている。
【００３２】
滅菌隔壁64、収容部材60の内側壁、およびプランジャー66のヘッド部分86は、好ましくは、約3ml〜約70ml、例えば、12ml〜36mlの最大容量を有する膨張性滅菌チャンバー88を形成する。プランジャーと収容部材の内側壁との接触点の密封部材68は、好ましくは、プランジャーの近位方向への撤退が、膨張性および圧縮性の滅菌チャンバー88内に部分的な真空を確立するのに十分な気密である。使用時には、本発明である滅菌容器の収容部材の遠位部分からのプランジャーヘッド86の撤退が滅菌チャンバー88内に陰圧を形成し、プランジャーヘッドの停止部材84から遠位末端方向への移動が滅菌チャンバー88内に保持されている液体に陽圧を生じさせる。
【００３３】
本明細書において示すように、穿刺可能で自己密封性の滅菌障壁64は、隔壁を通してシリンジの針を挿入することによって薬剤を吸引する薬剤バイアルの開口部を密封および被覆するために使用される種類の、開口部62内に配置されるエラストマー隔壁である。滅菌障壁64の穿刺穴は針を抜くと自然に密封される。従って、本発明である滅菌容器は、滅菌障壁を通して挿入された針（例えば、中空の針カニューレ76）を介して流体を滅菌チャンバー88に収容するまたは滅菌チャンバー88から流体を放出するように適合される。本発明であるモーター駆動式圧力作動装置またはシリンジにはめ合うための外側のネジ山111も滅菌容器収容部材60の近位末端に提供される。
【００３４】
図2に示すように、滅菌容器100は、滅菌チャンバー88の内側と中空の針72との間に液密的な接続を確立するために使用される、離脱可能に取り付け可能な針アダプタ97と共に集成されうる。針アダプタ97は、一方の側に針カニューレ76を有し、他方の側に中空の針72のハブ82を接続するためのルアーロックまたは他の種類の螺合もしくは固定液密コネクタなどの流体コネクタ79を有する。注入中に針アダプタの滅菌容器への接続を安定にするために滅菌容器100の遠位末端の開口部62周囲に伸展する縁108の内側のネジ山107とネジによってはめ合う外側のネジ山110を針アダプタ97の近位部分に提供することができる。使用時には、滅菌チャンバー88内に含有される液体に機械的な陽圧を適用する、（例えば、取り付けられている圧力作動装置の活性化による）プランジャーヘッド86の遠位方向への移動によって、滅菌容器の滅菌チャンバー88から流体が（例えば、針アダプタ97および取り付けられている中空の針72を介して）放出される。
【００３５】
プランジャーのハンドル部分90は、オペレーターがハンドル部分90を握ってピストン様プランジャーを手で移動できるように、収容部材60から伸展してもよい。図2、4A、および4Bに示す本発明である滅菌吸引／再注入システムの別の態様では、滅菌容器100に、ピストン様プランジャーを移動させる圧力作動装置200が機能的に接合することができる。この集成物では、プランジャー66のハンドル部分90および圧力作動装置200のピストン210の遠位部分は、プランジャー66を圧力作動装置200のピストン210に離脱可能であるように取り付けるための固定機序を協同して形成する。例えば、図1Bに示すように、ハンドル部分90は滅菌容器の収容部材60内で窪んでおり、本発明であるモーター駆動式圧力作動装置200のピストン210の遠位末端に位置するJ型スロット212などの連結スロットに接合する1つまたは複数のピンまたは突起104がハンドル部分に提供されている。固定機序により、圧力作動装置は正確に制御された距離または一連の所定の距離（すなわちプランジャーの増加的な移動）だけ滅菌容器内でプランジャーを移動させて、滅菌容器から制御された一定容量、好ましくは、各流体の排出あたり約0.1ml〜約3.0mlの範囲の流体を排出する。圧力作動装置200は本明細書の以下にさらに詳細に記載されている。
【００３６】
図2に示すように、本発明はまた、滅菌チャンバーの内側とハブ82を有する中空の針72との間に液密的な接続を提供するために使用される針アダプタ97を含む流水式注入集成物を提供する。滅菌障壁64を通して針カニューレ76を突き刺すことによって滅菌容器の内側に液密的な接続を提供するために、針アダプタ97は、一方の側にハブ82を取り付けるための雄型ルアーロックとして示される流体コネクタ79および反対の末端に撤退した針カニューレ76が付いた雌型の流体コネクタ79を有する。
【００３７】
注入針は、（示すように）真直ぐであっても、または心臓の背面側の心外膜などの、接近が困難な位置への流体の注入を促進するために約90度まで曲がっていてもよいことが本発明の範囲内で意図される。滅菌容器に取り付けるために注入針集成物に使用される中空の針は、（示すような）典型的な皮下注射針程度に短くても、または長さが最大1メートル半であってもよい。後者の場合には、中空の針は通常柔軟であり、一般に、当技術分野において既知のように注入カテーテル内を通っているか、また2001年10月23日提出の名称「FLEXIBLE TISSUE INJECTION CATHETER WITH CONTROLED DEPTH PENETRATION」の同時係属中の米国特許出願第10/000,786号に記載されているような注入カテーテルである。
【００３８】
本発明である方法は、露出された注入部位への直接注入中における針の侵入深度の正確な制御を提供する本発明である装置およびシステムを使用する。停止部材によって許容される深さ、例えば、2mmまたは3mmより深い位置に注入針が侵入しないように、針72の周囲の1つまたは複数のくぼみに取り付けるリングなどの機械的な停止部材75が、注入針集成物に使用される注入針に提供されることも、本発明の範囲内で意図される。図3に示すように、段階的な間隔、例えば、1mm間隔で複数のこのような円周方向のくぼみ77が針72の外側に提供されてもよく、針停止部材75は中心の開口部の周囲に金属のリングが付いたポリマーディスクであり、金属のリングは針の外側のこのような円周方向のくぼみにはまるようにサイズが決められる。締め付けネジ78などのリングに取り付けられた締め付け機序を使用して、針の外側の円周方向のくぼみ77に針停止部材75の金属リングを固定して据え付けることができ、間隔をおいて位置する複数のこのようなくぼみが針の外側に提供される場合には、針の停止部材の位置、および従って、注入針の侵入深度は、停止部材を1つのくぼみから別のくぼみに移動させられる程度に締め付け機序を緩め、次いで締め付け機序を再度締め付けることによって調節することができる。または、針シャフトのくぼみが異なる径を有するように、針のシャフトは径を段階的にすることができる。この態様では、針のシャフトの径が異なるくぼみに収まるようにサイズが決められた中心の開口部を有する複数の針停止部材が提供される。
【００３９】
本発明による別の態様では、流水式フィルター集成物は例えば骨髄吸引液などの、望ましくない成分を含有する生体液をろ過するのに有用である。本発明である方法は、本発明である滅菌容器に保存および／または処理される予定の被験者から採取した流体をろ過する流水式フィルター集成物の使用法を含み、または本発明である滅菌容器から被験者に注入される流体をろ過するために有用である。図4Aおよび4Bに示すように、本発明である流水式フィルター集成物95は、遠位部分109および近位部分102を有し、遠位部分と近位部分が接合して、フィルター集成物を通過する流体から望ましくない成分をろ別するようにサイズが決められている孔を有する2つ以上の交換可能なフィルターを有する液密的な滅菌囲いを協同して形成するフィルター受け器98を含む。フィルター集成物内に取り付けられるフィルターは一般にディスク形で、フィルター集成物は1〜約10枚のフィルター、好ましくは1〜3枚のフィルターを含むようにサイズを決めることができる。生体液の吸引中にフィルター集成物が詰まらないようにするために、最遠位フィルターは、最近位フィルターより大きい平均孔サイズを有することが好ましい。例えば、本発明である針集成物が骨髄液の吸引を意図されている場合には、フィルターの孔サイズは、骨髄吸引液から骨片（マクロ凝集物）をろ過するが、骨髄細胞および血液細胞はフィルターを自由に通過させるように選択される。従って、この目的のためには、最近位フィルターは約100ミクロン〜約200ミクロンの平均孔サイズを有し、最遠位フィルターは約200ミクロン〜約400ミクロンの平均孔サイズを有することができる。また、使用中にフィルターの詰まりを防ぐためにフィルターを分離するため、一般に、フィルター間に間隔、例えば、約0.33cm〜約0.63cmの間隔が提供される。図4Aおよび4Bに示すように、フィルターの径は、フィルターの表面積を増加し、それによってフィルターの詰まりを最小にするために、針のハブ82の内径より数倍大きくてもよく、好ましくは、数倍大きく、例えば、3〜10倍大きい。フィルターは、選択的に、ステンレス鋼で製造される。適当な径および孔サイズの任意の種類のフィルターを使用することができるが、品質の高さおよび入手の容易さからMillipore(登録商標)が好ましい。
【００４０】
針のハブを接続することによって中空の吸引または注入針72をフィルター集成物95に同軸配置で取り付けるために、フィルター受け器の遠位部分の雄型流体コネクタ79を使用することができる。滅菌容器から放出される流体または滅菌容器に導入される流体をろ過するために、フィルター集成物が滅菌容器と共に集成される場合には、本発明である滅菌容器の遠位末端の滅菌隔壁を穿刺するために、フィルター受け器の近位部分102の外側に取り付けられた中空の針カニューレ76を使用する。ある態様では、使い捨てフィルターという例外も考えられるが、本発明であるフィルター集成物を再使用のために滅菌できるように、フィルター集成物全体がステンレス鋼または匹敵する強度ならびに汚れにくさおよび耐熱性の材料で構成される。この態様において、フィルター受け器の近位部分および遠位部分は本明細書に開示される任意の方法によって取り外し可能に結合される。フィルター集成物の再利用が意図されていない他の態様においては、フィルター集成物の2つの部分は例えば互いに融合、溶接などによって互いに結合される。
【００４１】
ある態様において、本発明である方法は、針ハブ82を流体コネクタ79に取り付け、フィルター集成物95の針カニューレ76で本発明である滅菌容器100の滅菌障壁64を穿刺することによって、注入針72と同軸配置でフィルター集成物95が集成される、図4Aおよび4Bに示すシステムを使用する。次いで、（例えば、停止部材から容器の遠位末端方向へのプランジャーヘッドの移動によって）注入のために滅菌容器から放出される流体が、被験者への注入の前にろ過されるように、滅菌容器100は、電気モーター駆動式圧力作動装置200に機能的に接続される。または、プランジャーヘッドを収容部材の遠位部分から撤退させる（すなわち、近位方向に）ことによって滅菌容器の滅菌チャンバー内に陰圧を形成するために圧力作動装置を使用する場合には、吸引液を、フィルター集成物のフィルターを介して容器の滅菌環境に吸引することができる。吸引液が滅菌容器内に収容され、針カニューレ76が穿刺可能な滅菌障壁64から除去されると、自己密封性の障壁が針によって作られた開口部を自然に閉じる。従って、滅菌容器に吸引された液体は、実質的に滅菌状態で維持、保存、または（例えば、滅菌容器に事前に添加しておいた薬剤で）望ましいように処理することができ、敗血症の実質的なリスクを伴わずに被験者に再注入することができる。
【００４２】
本発明の別の態様において、方法は図5に示す吸引／注入システムを使用し、これは被験者から流体を吸引する場合の使用が意図されている。この態様では、圧力作動装置はハブ103を有する従来の吸い込みまたは吸引シリンジ105であり、針72は吸引針であり、本発明であるフィルター集成物95および滅菌容器100は吸引針と同軸配置にない。代わりに、三方向分流器弁99が吸引針72のハブ82、標準的な手術用滅菌吸引シリンジ105、および本発明であるフィルター集成物に相互接続している。示す吸引シリンジ105は手動式であるが、モーター駆動式吸引ポンプが取り付けられた吸引シリンジと交換してもよい。この集成物では、骨髄液を被験者の骨から吸引針を介して吸引するのに必要な吸引を提供するために吸引シリンジが使用される。この構成では、吸引シリンジ内に含まれる吸引された流体が、シリンジプランジャーの作動によってフィルター集成物を介して滅菌容器に分流されうるように、フィルター受け器98の近位末端で中空の針カニューレ76で滅菌障壁を穿刺することによって、フィルター集成物が滅菌容器の近位末端に滅菌的に接続する。分流器弁99および吸引シリンジ105は、吸引効果を最大にするために、この集成物では同軸に配置されており、フィルター集成物95および滅菌容器100はある角度で配置されている。
【００４３】
分流器99は、弁、チェック弁、豆コック等を含む三方向弁を収容しており、数多くの弁構成が同じ正味の影響を生じる。分流器はトラップ容積または「デッド」ボリュームを最小にするように設計される。好ましくは、流体の吸引に使用される陰圧は吸引された流体を針から吸引シリンジに向かわせるが、陽圧（すなわち吸引シリンジのプランジャーの押し込みによって提供される）は、シリンジから放出される流体をろ過するために本発明である流水式フィルター集成物に通して、本発明である滅菌容器内に流入させるように、分流器内の弁機序は圧力作動的である。骨髄吸引液を吸引するためには、吸引針は、好ましくはステンレス鋼で構成され、骨に侵入および／または例えば、ドナーの寛骨または胸骨から骨髄吸引液を吸引するようにサイズが決定される。この目的のためには、16ゲージのステンレス鋼針が好ましい。
【００４４】
さらに本発明の別の態様において、方法は図4Aおよび4Bに示すさらに別の手持ち式集成物を使用し、これは注入針72、本発明であるフィルター集成物95、滅菌容器100、および圧力作動装置200を含み、これらは流体的に連絡した状態で同軸状に接続される。この集成物は、例えば、心臓表面の少なくとも一部分が露出されている心臓バイパス手技などの心臓手術中に、露出された心臓の心外膜などの露出された組織部位に直接注入するように特に適合される。手術手技の早期段階の開胸状態において本発明である吸引装置を使用して患者の胸骨から骨髄細胞を吸引し、本発明である滅菌容器に保持されている間に（例えば、吻合が実施されている間に）本明細書に記載されているように細胞を処理し、次いで本発明である滅菌容器を含むこのような手持ち式集成物を使用して、継続中の手術手技の最後の段階の間に本明細書に記載するように処理後の細胞を患者に再注入することができる。
【００４５】
従って、本発明の実施において滅菌容器自体が患者に流体を直接注入するための手持ち式注入集成物の一部内に含まれる、または一部を形成することは本発明の範囲内で意図される。または、例えば、長さ最大約1.5メーターの管系または注入カテーテルに流体を通過させることによって、滅菌容器から放出される流体を経皮的または外科的開口部を介して患者に注入することができるように、滅菌容器は卓装置に含まれてもよい。同様に、圧力作動装置を手持ち式装置に滅菌容器（および選択的にフィルター集成物）と共に配置してもよい。または、圧力作動装置（またはその一部、モーター駆動式ポンプ機序など）を滅菌容器から離れた位置に配置してもよく、圧力は、機械的な接続またはトランスデューサ、液密的または圧力管系等によって滅菌容器の流体内容物に送達される。
【００４６】
圧力作動装置200は、滅菌容器の収容部材60の遠位末端および収容部材214の外側に取り付けられ、ギア240によってピストンに機械的に接続されている精密運動制御モーター230を作動することによって撤退した位置と伸展した位置との間を移動する移動可能なピストン210（図6に示す）を収容収容接続するように形作られている円筒形の外側収容部材214を有する、図6に示すようなモーター駆動式圧力作動装置であってもよい。滅菌容器および圧力作動装置には、作動装置プランジャーの動きが滅菌容器のプランジャーに正確に伝えられるように機能的に連結するための1つまたは複数の機序が提供される。上記のように、滅菌容器のプランジャーのハンドル部分90の外側に位置する1つまたは複数のピン104が、圧力作動装置のピストン210の遠位末端のJ型スロット212に連結する。Jの垂直部分に沿ってピンを移動し、プランジャーのハンドル部分をピストンに対して四分の一回転ひねることによって、ピンは、固定機序に接合するようにJの横向きの底部に入れられ、進められる。
【００４７】
この態様では、容器プランジャーは、プランジャー収容部材内に完全に撤退している。結果として、上記のプランジャー-ピストン固定機序の接合は見えない。従って、スロット212の上部を用いてピン210を配置する助けとするために、滅菌容器の近位末端および作動装置収容部材の遠位末端に、好ましくは、本発明であるシステム要素を集成する間見ることができるはめ合い外部配置機序が提供される。例えば、図2に示すように、滅菌容器100の近位基面に容器収容部材60の円筒形の基面の対合する平坦な部分89の形状の配置構造が提供され、作動装置収容部材214の近位末端に、滅菌容器の平坦な部分89が配置される配置切り出し216などのはめ合い配置構造が提供される。配置構造がはめ合わされると、滅菌容器を圧力作動装置に対してひねり（例えば、四分の一回転）、内側のはめ合いネジ山245に容器100の外側に提供されたネジ山111を接合する。この態様では、作動装置収容部材に切り出しを有する滅菌容器の平坦な部分の配置がピストンのスロット212の先端部のプランジャーにピン104を配置するように、滅菌容器および圧力作動装置の外側に位置する配置機序の配置構造は、プランジャー-ピストン連結機序に対して間隔をおいて配向される。これら2つの装置を一体として接続するネジ山を接合するのに必要な、滅菌容器の圧力作動装置に対する四分の一回転のひねりはまた、ピンをピストンのJ型スロットの底部に押しやり、滅菌容器と圧力作動装置とを機能的に一体として固定する。
【００４８】
圧力作動装置に本発明である滅菌容器がはめ合わされるとき、滅菌容器の圧縮可能な滅菌チャンバー内に保持された制御された量の流体を排出することができるように、撤退した位置と伸展した位置との間をピストンを移動させる作動機序が圧力作動装置に提供される。図6に示すように、他の手段（例えば、リニアモーターまたは「シャクトリムシ」型の圧電ドライバー）による作動を排除するわけではないが、圧力作動装置の前進機序は作動装置の収容部材に取り付けられた精密運動制御モーター230およびギア集成物240である。精密運動制御モーターはギア集成物240の歯車を前進させ、歯車の歯は、作動装置と滅菌容器のプランジャーを連結したピストンを対応して前進させるように、作動装置のピストン210の外側に提供された溝にはまる。精密運動制御モーターには、電気取出口、電池、ソーラーパネル等などの電源に電気コネクタ251を介して接続するための電機コード250などの電力源が提供される。圧力作動装置は、作動のタイミングがオペレーターの意思の元にあるように、精密運動制御モーターを自由に作動するための電力または信号を提供するスイッチまたはボタンを作動装置の外側に提供することができる。
【００４９】
滅菌チャンバーの容量に対する精密運動制御モーター機序の較正は、滅菌チャンバーから放出される流体の量が微量で厳密に制御されるようにする。例えば、0.1ml〜約0.2ml程度の少ない量は、本発明である圧力作動装置を作動することによって、滅菌チャンバーの遠位末端の滅菌障壁を介して容易に放出される。滅菌容器100の滅菌チャンバー88の物理的な寸法（例えば、径）がわかると、滅菌容器から1回の排出あたりに排出される流体の量と、1回の排出あたりの圧力作動装置200のピストンの移動距離との相関が容易に算出されることを当業者は意図している。
【００５０】
図1Aに示すように、滅菌容器に、選択的にバーコード付きのスキャンチップなどの索引機構218が提供される。索引機構218は、モーターと機能的に連絡しているコンピュータなどの、圧力作動装置に含まれるまたは圧力作動装置が機能的に接続しているデコーダ装置によって読まれる、滅菌容器の内容物に関する情報を含み、提供する。好ましくは、索引機構218は、圧力作動装置200の遠位末端に位置づけられた、光学的スキャナ220などのスキャナによって読まれる、滅菌容器の内容物に関する光学的またはそれ以外の方法で認識可能な情報（例えば、バーコード、トランスポンダ、または不揮発性記憶装置）を含むスキャン可能な媒体またはチップを備える。好ましくは、スキャンチップ218は、配置機構として機能する、本発明である滅菌容器100の近位末端の平坦な部分89の1つに位置する。光学的スキャナ220は、選択的に窓222を有し、光学的スキャナがスキャンチップの情報を「読む」ことができるように、配置機序の接合（および2つの要素の間のはめ合いネジ山を接合するための四分の一の回転）が、（例えば、窓222を介して）スキャンチップ218が見える配置に光学的スキャナ220を置くように、圧力作動装置200の外側に対応して位置づけられる。次いで、スキャナによって「読まれた」情報は電子的に圧力作動装置のモーター230に送られ、圧力作動装置のピストンが増加ごとに移動される選択された一定の距離、一連の移動の時期等などの、圧力作動装置によって実行される注入プロトコールに関する指示を提供する。
【００５１】
図7に略図によって示す一態様において、本発明であるシステムは、モーター230およびスキャナ220と機能的に連絡しているコンピュータシステム300をさらに含むことができる。本明細書において使用する「コンピュータシステム」は、ハードウェア要素、ソフトウェア要素、および光学的スキャナ220によって「読まれる」情報を分析し、このような情報を、モータードライバー230への電気的インパルスなどのインパルスに翻訳するために使用されるデータ保存要素をいう。コンピュータシステム300は、典型的には情報を処理し、アクセスし、操作するプロセッサ305を備える。典型的には、コンピュータシステム300は、プロセッサ305、内部記憶装置310、および記憶装置315を備える。1回の投与あたりに放出される液体の量、放出される液体の投与の反復回数等を含む、スキャナ220によって「読まれる」情報はコンピュータシステム300によって受け取られ、コンピュータシステム300は、各液体の投与を達成するために圧力作動装置のピストンが前方に移動される距離、一連のこのような距離（すなわち、移動）の時期、このような投与の数等に関するモータードライバー230を作動する指示に、受け取った情報を翻訳する。
【００５２】
さらに別の態様において、本発明である方法は正確に制御された容量の治療用流体を滅菌状態で注入するための手動式注入システムを使用する。本発明である手動式注入システムは、本発明である滅菌容器を（例えば、ドロップイン要素として）組み入れるように設計される。図8および9に示すように、本発明である注入システムのこの手動式態様は本発明である滅菌容器100の一形態を滅菌液密的に連絡して含み、ここで圧力作動装置は、チャンバー内の相互運動のために滅菌容器の滅菌チャンバー内に構成および配置された、手動式プランジャーである。プランジャーハンドル部分90は、オペレーターが手動するために容器収容部材から伸展する。滅菌容器の滅菌チャンバー内の開口部および滅菌チャンバーの開口部を被覆するまたは開口部をふさぐ、本明細書に記載されている穿刺可能で自己密封性の滅菌障壁は縁108にくぼんでいる。手動式注入システムは、流体チャンバーおよび遠位流体ポート368を規定する内側面を有する細長いバレル361が付いたプランジャー作動式注入シリンジ360を含む。シリンジプランジャー362はシリンジチャンバー内の相互運動のためにシリンジの流体チャンバー内に構成および配置される。調節式プランジャー拘束部材363は、プランジャーの近位方向への移動を正確および調節可能であるように制御するために、シリンジプランジャー362に対して配置される。
【００５３】
穿刺可能な滅菌障壁を介して滅菌容器の開口部からシリンジの遠位流体ポートに、およびシリンジの流体ポートから針コネクタに液体を別個に流動させるために、一方向液体流動弁が提供される。一方向弁は手動式であってもよいが、好ましくは、滅菌容器のプランジャーの遠位方向への圧縮により、液体がプランジャー停止部材によって許容される程度だけシリンジの流体チャンバー内にのみ流動させられ、シリンジプランジャーの遠位方向への圧縮が針コネクタを介してのみシリンジの流体チャンバー内に含まれる液体を放出するような圧力作動式である。好ましくは、一方向弁は、（例えば、針コネクタ370、シリンジの遠位流体部分368、および穿刺可能な滅菌障壁を介する滅菌容器100の開口部の間の流体コネクタ（例えば、ルアーロック、接続管系等）を介して）流体接続部に位置する圧力作動式三方向弁330に組み入れられる。三方向弁と滅菌容器の開口部の流体接続点の流体コネクタは、容器の滅菌障壁を穿刺するために本明細書に記載するように中空の針カニューレを備える。この構成では、滅菌容器100のハンドル部分90の遠位方向への圧縮により、流体はシリンジの流体チャンバー内のみに、シリンジ拘束部材363によって許容される程度にだけ一方向に流動させられるが、シリンジプランジャーの遠位方向への圧縮は、シリンジの流体チャンバー内に含有される液体を、針コネクタ370を介してのみ放出する（すなわち、被験者に注入するために取り付けられている中空の針内に）。針コネクタ370は、被験者内への治療用流体の皮下または心外膜注入のための、カテーテル内に含有される皮下注入針または針コネクタなどの中空の針を取り付けるために設計されている。
【００５４】
プランジャー拘束部材363は、システムから一定容量の流体を放出するように較正された増加だけのプランジャーの近位方向への移動を制御するように、シリンジプランジャーに対して調節可能であるように配置することが可能である。例えば、図8および9に示すように、調節可能なプランジャー拘束部材は、シリンジプランジャーの近位方向への移動を制限するためにシリンジプランジャー362の近位末端に接触するように位置付けられた延長部364を有する移動可能なプレート365を備えてもよい。この構成では、プランジャー拘束部材に取り付けられている調節可能なピストンが、放出される流体の任意の望ましい増加、例えば、放出される流体の1mmの増加に実質的に対応するシリンジプランジャーの近位方向への移動の増加を可能にする。例えば、この例示では、プランジャー拘束部材の位置1は放出される流体0mlに相当し、プランジャー拘束部材の位置2は放出される流体1mlに相当し、プランジャー拘束部材の位置3は放出される流体3mlに相当する等である。好ましくは、調節可能なプランジャー拘束部材は、シリンジプランジャーの近位方向への移動を制限するためにシリンジプランジャー362の近位末端に接触するように配置されている延長部364を有する移動可能なプレート365を備える。当業者は本発明であるプランジャー拘束部材の機序を考案するために本明細書の教示を容易に活用することができ、この機序は等しくない増加分の放出流体、または等しい場合には、本明細書に記載される以外の増加分が送達されるように較正される。
【００５５】
使用時における利便性において、本発明である手持ち式注入システムは、成人の手で握れるサイズであり、金属、または選択的に透明な硬質プラスチックで製造される。図8に示すように、ホルダー350は、本発明である滅菌容器が、上記のように流体的に接続するために横滑り可能であるように配置される中空の収容空間351を提供するように設計された内側形状を有する。従って、収容空間は、滅菌容器の遠位末端が横滑り可能であるように収容されるキャニスターとして機能する。プランジャー拘束部材の移動可能な細長いプレート365は、シリンジの細長いバレルの側面に配置することができる。プランジャーハンドルの近位方向への移動は制限されるが、シリンジプランジャーの遠位方向への移動は全く妨害されないように、ホルダー360の一連の開口部366は、ホルダー350内に離脱可能であるように挿入された拘束ピン367を介して横滑り可能なプレート365を調節可能であるように配置するためにオペレーターによって使用される。この態様では、放出される流体の増加分は、複数の開口部の規則的な間隔をおいた配置、例えば、放出される流体の規則的な増加分に対応して規則的に間隔を置いて配置された一連のボアホールまたはスロットによって決定される。
【００５６】
図9は、内側成分を囲むためにホルダー350とはめ合うホルダーカバー358と、プランジャー拘束部材363の開口部内にカバーの外側から適用されるピン367とを有する囲まれた形態の本発明である手持ち式注入システムを示す。
【００５７】
本発明である注入システムの実施には、流体の非圧縮性という利点がある。オペレーターによる滅菌容器のプランジャーハンドルの押し下げにより、流体は三方向弁を介してシリンジの流体チャンバー内に流動され、プランジャー拘束部材363の配置によって許容される程度にシリンジプランジャーが近位方向に移動される。注入シリンジに典型的であるように、注入中のシリンジプランジャーの移動距離は、針コネクタ370に取り付けられた注入針を介してシリンジから放出される流体の量を制御するために、シリンジの流体チャンバーの寸法に対して較正される。
【００５８】
本発明である注入システムおよび方法は、微量で厳密に制御された流体容量の被験者への送達を容易にするように設計されている。従って、オペレーターが、シリンジハンドルの近位方向への移動が停止されるまで滅菌容器のハンドルを押しこむと、プランジャー拘束部材363によって許容されるシリンジプランジャー362の近位方向への移動の制御された距離は、シリンジの流体チャンバー内に流入されうる滅菌流体の容量を制御する。同様に、シリンジプランジャーを完全に押し込むと、シリンジチャンバー内に含まれる正確に測定された量の流体が確実に送達される。このためには、使用時には、微量の流体を送達するためにプランジャー拘束部材を位置づける前に、針コネクタ370に取り付けられた中空の針に流体を充填する。
【００５９】
本発明である注入システムはまた、一定容量の滅菌流体の、組織表面への反復注入を容易にするように設計されている。このために、滅菌容器内の滅菌チャンバーの最大容量は、注入シリンジの注入チャンバーの最大容量より少なくとも10倍大きいことが推奨される。例えば、本発明である滅菌容器から滅菌骨髄吸引液を注入するためには、各注入量は約0.2mlであってもよい。滅菌容器内に含まれる骨髄吸引液の容量が10mlである場合には、0.2mlの正確な容量の最大50回までの注入を、例えば、バイパス形成術中の心外膜に本発明である手持ち式装置を使用して高い精度で送達することができる。このためには、シリンジチャンバーの最大容量は約1mlであることが都合がよい。
【００６０】
本発明である手持ち式注入システムの別の態様は、本明細書において図10〜13に関して記載されている。この態様では、滅菌容器100は、収容部材60の近位末端から伸展するプランジャーハンドル90を有する。プランジャーの相互運動時に流体チャンバーの密封を維持するように、収容部材60から伸展するプランジャーハンドル90の部分に液密的な密封410が移動可能であるように取り付けられている。図10、11A、および11Bに示すように、密封410は、プランジャーハンドル90が挿入される蛇腹(pleated bellows)型スリーブであり、密封410は露出されたプランジャーハンドル90の反対側の末端に取り付けられる（しかし、中間地点には取り付けられない）。蛇腹型密封410は、滅菌容器100から流体を放出するためにプランジャーハンドル60が遠位方向に駆動されると圧縮されるが、密封410は、プランジャーハンドルの相互運動を制限することなく、滅菌チャンバーからの液体の漏れの連続的な障壁となる。
【００６１】
本発明である集成物の別個の要素であるホルダー415は、必要に応じて滅菌容器100に対してホルダー415を回転させるためにオペレーターが握るためのハンドル部分436と、遠位開口部425と、遠位末端430とが提供された細長い側面部分420を備える。ホルダー415は、プランジャーハンドル90の近位末端413が常にホルダー415の遠位部分430に隣接するように、滅菌容器のプランジャーを最初に収容するように設計されている。オペレーターによる滅菌容器に対するホルダー415の回転は、ホルダー415内の滅菌容器を徐々に前進させると同時に、流体を放出するためにプランジャーハンドル90を滅菌チャンバー内に押し込む。オペレーターがホルダーを滅菌容器に対して回転するとき、滅菌容器を回転させないようにするためには、プランジャーハンドルの末端413がスラスト軸受に接触するように、遠位末端430の内側に1つまたは複数のスラスト軸受435を配置することができる。
【００６２】
ホルダーの滅菌容器に対する各回転または部分的な回転によりプランジャーが滅菌容器に含まれる一定容量の流体を放出する機序は、便利なことに、ホルダーの滅菌容器に対する各回転または部分的な回転によりプランジャーが滅菌チャンバーを正確に制御された距離だけ遠位方向に前進させる機序である。このためには、図12に長手方向の断面図に示すように、ナットがボルトにネジ止めされるように滅菌容器の近位末端がホルダー内にネジ止めされるよう、ホルダー415の内側面のネジ山437は収容部材60の近位末端部分の外側のネジ山439と回転可能であるようにはめ合う。ネジ山が解放されて迅速な大量注入を可能にするためには（例えば、その後一連の制御された少量の注入が続く）、ホルダーの内側面のネジ山437および滅菌容器100の近位外側部分のはめ合いネジ山94は、各々、連続ネジ山ではなく、少なくとも2つのセットのネジ山部分の間にオープンスペースを有する間抜きネジ山であってもよい。例えば、図13に示すように、90度のネジ山部分437と、交互に存在するネジ山のない90度の部分の2セットが存在する。
【００６３】
本発明の他の態様と同様に、滅菌容器に対するホルダーの回転によって放出される制御された容量の流体のサイズは、システムの要素の相対的なサイズ決めによって決定される。ホルダーの内側の隣接するネジ山間の距離と滅菌チャンバーの寸法との関係は、完全な回転または部分的な回転あたりに容器から望ましい容量の流体を放出するように選択することができる。例えば、これらの寸法は、滅菌容器に対するホルダーの各半回転あたり0.05mlの流体および各全回転あたり0.1mlの流体、または各半回転あたり0.1mlおよび各全回転あたり0.2の流体を正確に放出するように選択することができる。
【００６４】
滅菌容器の協同的な相互作用によって形成される信号発生機序は、オペレーターがホルダーを滅菌容器に対して回転させた結果として、正確に制御された容量の流体のどれくらいが放出されたかをオペレーターに知らせるために、感知可能な信号（すなわち、視覚、聴覚、触覚、またはそれらの組み合わせなどのオペレーターの感覚の1つに直接とどくもの）を発生する。従って、オペレーターは、各注入部位に注入される流体の容量を正確に制御し、医学的手技を中断することなく、注入部位に注入される治療用流体の容量を容易に「測定する」ことができる。
【００６５】
感知可能な信号は数多くの任意の方法におけるシステムで発生させることができる。例えば、光線のフラッシュは、内蔵LEDおよび微小電池（例えば、一方はホルダーの内側に取り付けられ、他方は滅菌容器の外側に取り付けられる）を瞬時に接触させる注入システムの回転によって発生させることができる。または、感知可能な信号は、戻り止めおよび歯止めホイールを含む信号発生機序によって発生させられるような、音響および／または触覚信号であってもよい。例えば、図12に示すように、音響および／または触覚信号は、円形のプランジャーハンドル90の近位末端413の1つまたは複数の切り込み440から形成される歯止めホイールによって協同的に発生される。戻り止め450は、ホルダー415の側面に切り込まれた弓状のフラップとして示されるホルダー415の柔軟なバネ様延長部を備え、フラップの内側先端部に固定されたわずかな突起またはコブ451がプランジャーハンドル90の切り込み内に位置する。しかし、滅菌容器に対するホルダーの回転によって戻り止めを切り込みから切り込みに移動させるときに、クリック音などの音響信号（およびオペレーターの手の触感）を発生するバネとして機能するのに十分な柔軟性および弾性を有する、ホルダーに取り付けられた加圧もしくは片持ち小片または単に支持小片などの戻り止めとして機能することができる他の種類のばね様物体を当業者は考案することができる。または、切り込みが1つだけ存在する場合には、戻り止めを切り込みから移動させ、全回転の結果切り込みに戻ることによって信号が発生される。戻り止めをホルダーに取り付けるには、ホルダーの回転によって切り込みから移動されるときに戻り止めが破壊しない程度の柔軟性を提供しなければならない。
【００６６】
操作時には、オペレーターは固定されている滅菌容器に対してホルダーを回転させると同時に、各注入部位の望ましい注入容量に相当する必要な数の感知可能な信号を数える。例えば、滅菌容器に対するホルダーの回転が滅菌チャンバー内でプランジャーヘッドを遠位方向に駆動するとき、等しい容量の複数の注入部位は、等しい数の「クリック」を各注入部位に投与することによって治療することができる。
【００６７】
ホルダーは、好ましくは、精密グラインダーを使用して、隣接するネジ山間に正確な距離間隔のネジ山439をホルダーの内側面に形成することができる程度に十分剛性を有するプラスチックまたはポリマーなどの材料から成型または鋳造される。しかし、戻り止めがホルダーの側面に切り込まれた弓状のフラップから形成される場合には、材料は使用時に破壊を生じるほど硬くてはいけない。
【００６８】
本発明である感知可能な信号を有する手動式注入システムは、皮下注射針などの滅菌チャンバーの内側と液密的に連絡している中空の注入針をさらに備える。または、中空の注入針は、注入カテーテル内に含まれてもよい。
【００６９】
図14に示す本発明であるシステムの態様において、本発明である注入システムは、上記記載の手持ち式システム、および注入カテーテルの中空の針515の突出している遠位末端に、針の先端が前進した長さを示す指標を備えるオペレーター制御式の調節式針停止部材500が永久的に固定された中空針を有する、制御された深度の侵入注入カテーテル460を提供する。本発明である注入カテーテルの一部を形成する調節式針停止部材は、針の遠位端の正確に制御された１つまたは複数の増加分が、オペレーターが針を針停止部材内の一連の位置を経由して遠位方向に回転または横滑りさせることによって露出されるように設計される。針の遠位端をを前進させるためにオペレーターが針停止部材を横滑りさせた場合、針停止部材は音響および/または触覚信号をオペレーターに提供し、この信号は正確に制御された遠位端増加分のどれだけが、オペレーターによって針停止部材内から伸展させられたかを正確に示し、2001年10月23日提出の米国特許出願第10/000,786号において十分に説明されている。
【００７０】
図14および15に示す好ましい態様において、調節式針停止部材500は注入針515の遠位部分を取り囲み、実質的に円筒形の外側針ホルダー510と、針搬送体が固定して取り付けられている注入針の遠位部分515を収容するように形作られている内側を有する針搬送体520とを同軸配置で含む（断面図で示す）。好ましくは、針ホルダーの遠位末端は、針が引き込まれた位置から一連の可能な前進した位置の1つに前進させられる場合、針の遠位端が突出する実質的に平坦な遠位末端面560を有するベル形である。平坦な遠位末端面560は、注入のために組織表面に対して針を直角に配向させる助けとなる。
【００７１】
針搬送体520は、針の遠位端が針ホルダーの遠位末端から突出していない十分に引き込まれた位置と、針の遠位端が遠位端の正確に制御された増加分を露出するように徐々に前進させられる一連の徐々に前進させられる位置との間を横滑りして移動または回転するために、針ホルダー510内に取り付けられる。締め付けネジとして示されているロック機序525は、注入のために針を使用する際に針ホルダーに対する針搬送体の位置をロックするために提供される。
【００７２】
図15に長手方向の断面図で示すように、本発明である調節式針ホルダーに感知信号を提供する機序は、外側針ホルダー510の近位末端およびネジ山535（すなわち、一連の正確に間隔をおいて配置される円周方向の「刻み目」）に取り付けられた内側に突出している柔軟な戻り止め540を備えることができ、柔軟な戻り止め540上のコブ530を逐次的に収容し、このため戻り止めが１つのネジ山のくぼみ（または「刻み目」）から次のネジ山のくぼみ（または「刻み目」）へ、一連のネジ山535に沿って移動する。針の先端は2つの異なった方法で近位方向に前進させることができる。針が固定して取り付けられている針搬送体520は、針搬送体520に対して針ホルダー510を回転させることによって近位方向に前進させることができると同時に、戻り止め540はネジ山535を通る。露出される針の先端の長さの指標として、目盛り付きマークを、針搬送体の外側に、例えば、0.5ミリメーター間隔で提供することができ、それによってオペレーターは、針ホルダーの回転によって露出された針の先端の量を目視で判断することができる。
【００７３】
または、ネジ山535（一連の「刻み目」として機能する）が柔軟な戻り止め540のコブ530を逐次的に収容して、一連のネジ山535に沿って1つのネジ山の谷（「刻み目」）から次のネジ山の谷（「刻み目」）に戻り止めを移動させるようにホルダー510内で針搬送体を横滑りさせることによって、針搬送体520を近位方向に前進させることができる。上記のように針を近位方向に横滑りさせると、戻り止めがネジ山の谷からネジ山の谷に移動するごとに、指標として聴覚および／または触覚信号が発生される。従って、操作中は、聴覚および／または触覚信号を発生する機序は、クシの歯の先端に親指の爪が引っ張られるのと同様の方法で機能する。
【００７４】
好ましくは、針ホルダーの近位末端の側面の弓状の切り出しフラップ540が、戻り止め540を形成する弓状のフラップの先端に内側の突出部530を有する。この態様では、針ホルダーは、好ましくは、戻り止めが取り付けられたU字型フラップが針ホルダーの本体と連続片を形成する十分な柔軟さを有するプラスチックまたはポリマーなどの材料から成型または鋳造される。針搬送体が鋳造または成型される場合には、精密研磨装置を使用して、針搬送体の外側に正確に間隔をおいて配置される一連の刻み目535を作製することができる。
【００７５】
例えば、一連のネジ山の谷の第1のネジ山の谷の位置は、針が十分に引き込まれた位置にあることに対応することができ、ネジ山535間の距離は、針搬送体の前進によって生じる聴覚および／または触覚信号（または「カチットいう音」）の各々が針の先端の突出の望ましい増加分の1つに対応するように、正確に制御することができる。例えば、ネジ山（または「刻み目」）が正確に0.5mm間隔で配置されている場合には、3つの信号を発生するのに十分な、十分に引き込まれた位置から前方への針搬送体の移動は、針の先端が正確に1.5mm露出されたことを示す。従って、調節式針停止部材500は、本発明であるカテーテルの針先端が注入のために組織表面に侵入する深さをオペレーターが正確且つ容易に制御し、例えば、針ホルダーを横滑りまたは回転させて針の先端を露出または後退させ、所望の数の「カチッという音」を数えることによってオペレーターが手術手技中に注入部位間で針の侵入深度を容易に調節できるように設計することができる。
【００７６】
使用時には、本発明である滅菌容器は、好ましくは被験者であるドナーから生体液を収容するために使用され、生体液は処理され、被験者に実質的に滅菌状態で注入される。例えば、本発明である滅菌容器は、心外膜または心筋などの体腔内部に流体を注入するために流体が注入カテーテルに提供される、容器または流体供給源として働くことができる。本発明である滅菌容器内の滅菌チャンバーは、心筋血管再建を生じさせるために注入するため処理される骨髄吸引液を収容するようにサイズが決められると、最大64箇所の心筋部位（各0.2ml）を注入するのに十分な骨髄吸引液を採取および処理するのに十分な容量を有する。また、血液の凝固を防ぐために、骨髄吸引液1mlあたり約0.2mlの保存剤非含有ヘパリンを滅菌容器に吸引した骨髄に添加することができ、各注入部位は約0.24mlの注入液を必要とする。微生物学的および病態的評価(約1ml)、フローサイトメトリー(約1ml)、ならびに3〜4mlの追加の検討に十分な吸引液を提供するために追加の吸引液を採取してもよい。吸引液を、心筋または心外膜に注入するため細胞成分(すなわち、単核層)を分離するために（例えば、遠心分離によって）処理する予定の場合には、患者から採取される骨髄吸引液の量はほぼ2倍でなければならない。従って、この目的に使用される場合には、本発明である滅菌容器内のチャンバーの必要な容量は16箇所の注入部位では約6ml〜約12mlの範囲であり、64箇所の注入部位では約22ml〜36mlの範囲である。
【００７７】
好ましい態様において、本発明である滅菌容器のチャンバーに、生体液を処理または改変するのに有用な1つまたは複数の薬剤を事前に添加し、流体を滅菌チャンバー内に収容する。例えば、滅菌容器が、骨髄吸引液を収容および処理するために使用されることが意図されている場合には、骨髄吸引液に含有される血液の凝固を防ぐのに十分なヘパリンをチャンバーに事前に添加することができる。滅菌容器に、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)および／もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、またはVEGF、bFGFをコードするポリヌクレオチド、血小板由来内皮増殖因子(PD-ECGF)、内皮増殖因子(EGF)、組織壊死因子α(TNFα)、組織増殖因子α(TGFα)、好ましくはHIF-1などの動脈の増殖を特異的に促進する増殖因子などの血管形成を促進する増殖因子を1つまたは複数事前に添加してもよい。または、滅菌容器に、血管形成または動脈の増殖を促進する上記増殖因子のいずれかなどの治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを事前に添加してもよい。圧力作動装置による処方学的な算出を容易にするために、このような上記薬剤の容器内の存在に関する情報を、本発明である滅菌容器の外側に位置するスキャン可能な媒体またはチップに登録または内蔵することができる。
【００７８】
好ましくは、滅菌容器内に導入される生体液中の細胞、例えば、血液細胞または骨髄細胞のトランスフェクションを促進する治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示する送達システムに含まれる。このような目的に使用することができる、遺伝子治療を促進するのに好適な数多くの異なる送達システムが当技術分野において知られている。このような細胞トランスフェクションは約30分〜2時間以内に実施することができる。
【００７９】
例えば、1つまたは複数の治療タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを、滅菌チャンバーに保持される細胞に送達するためのコロイド状分散システムに事前に添加することができる。コロイド状分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質系システムが挙げられる。リポソームは、インビトロおよびインビボにおいて送達搬送体として有用な人工膜小胞である。0.2〜4.0μmのサイズ範囲の大型の単層小胞(LUV)は、大型高分子を含有する実質的な割合の緩衝水溶液を封入することができることが示されている。RNA、DNA、および無傷のビリオンは水性の内部に封入可能であり、生物学的に活性な形態の細胞に送達されうる(Fraleyら、Trends Biochem. Sci.,6: 77, 1981)。リポソームが効率的な遺伝子導入小胞であるためには、以下の特徴が存在しなければならない：(1)高い効率であるが、生物活性を損なわないで関心対象の遺伝子を封入すること；(2)非標的細胞と比較して優先的で、実質的な標的細胞への結合；(3)小胞の水性内容物を高い効率で標的細胞の細胞質に送達すること；および(4)遺伝情報の正確で効果的な発現(Manninoら、Biotechniques, 6: 682, 1988)。
【００８０】
リポソームの組成物は、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わされた、通常リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質を使用することもできる。リポソームの物理的な特徴は、pH、イオン強度、および2価陽イオンの存在に依存する。
【００８１】
リポソーム産生に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。脂質部分が炭素原子数14〜18、特に炭素原子数16〜18で、飽和のジアシルホスファチジル-グリセロールが特に好ましい。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００８２】
治療用タンパク質をコードするするポリヌクレオチドは、細胞膜を貫通してコードされる産物を「輸送する」ことができる1つの配列に「機能的に付加」または機能的に結合してもよい。このような種々のシグナル配列は既知であり、過度の実験を行う必要なく、当業者が使用することができる。
【００８３】
このような目的のために使用することが意図される遺伝子導入ベクター（「発現ベクター」とも言われる）は、その発現および／または複製のため宿主細胞に核酸を輸送するために使用される組換え核酸分子である。発現ベクターは円形または鎖状であってもよく、種々の核酸構築物を導入することができる。発現ベクターは、典型的には、適当な宿主細胞への導入の結果挿入された核酸を発現するプラスミドの形態である。
【００８４】
遺伝子治療に使用するために好適なウィルスベクターは特定の宿主系、特に哺乳動物系に使用するために開発されており、例えば、レトロウィルスベクター、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)に基づいたウィルスなどの他のレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター等が挙げられる(各々が参照として本明細書に組み入れられている、MillerおよびRosman, BioTechniques 7: 980-990, 1992、Andersonら、Nature 392: 25-30 Suppl., 1998、VermaおよびSomia, Nature 389: 239-242, 1997、Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1187(1996)を参照されたい)。好ましい遺伝子導入ベクターは、進行性冠動脈閉塞を罹患している被験者の側副動脈を形成させるためのcDNAを保有する複製機能を欠損させたアデノウィルスである(Barrら、「PCGT Catheter-Based Gene Transfer Into the Heart Using Replication-Deficient Recombinant Adenoviruses」、Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 17D, p. 195, 概要P101(1993年3月)、Barrら、「Efficient catherer-mediated gene transfer into the heart using replication-defective adenovirus」、Gene Therapy, 1巻:51-58(1994))。一般に、関心対象の遺伝子は、心臓の筋細胞（および骨格筋の筋細胞）を含む心臓（または骨格筋）にインビボにおいて導入され、コードされたタンパク質を構成的に産生させる。いくつかの異なる遺伝子導入方法が可能である。ヘルパー非依存型の複製機能を欠損させたヒトアデノウィルス5システムが好ましい。このシステムを使用すると、1回の冠動脈内注入によってインビボにおける心筋細胞の60%を超えるトランスフェクションが証明されている(GiordanoおよびHammond, Clin. Res. 42: 123A, 1994)。
【００８５】
ヒトアデノウィルス5に基づいた組換えアデノウィルスベクター(Virology 163: 614-617, 1988)はアデノウィルスゲノムの本質的な早期遺伝子(通常E1A/E1B)を欠損しており、従って、欠損している遺伝子産物をイントランス(in trans)で提供する許容細胞系統において増殖しない限り複製することができない。欠損しているアデノウィルスゲノム配列の代わりに、複製機能を欠損させたアデノウィルスを感染させた組織／細胞において関心対象の導入遺伝子をクローニングし、発現することができる。アデノウィルスに基づいた遺伝子導入は宿主ゲノムへの導入遺伝子の組込みを伴わず(宿主DNAに導入遺伝子が組み込まれるアデノウィルス媒介性のトランスフェクションは0.1%に満たない)、従って、安定ではないが、アデノウィルスベクターは高い力価で増殖することができ、複製しない細胞にもトランスフェクトすることができる。
【００８６】
レトロウィルスベクターは安定な遺伝子導入を提供し、現在ではレトロウィルスのシュードタイピングにより力価を得ることができるが(Burnsら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 8033-8037, 1993)、現在のレトロウィルスベクターは複製しない細胞に効率的に形質導入することができない。また、短期遺伝子導入が十分である場合には、宿主DNAへの導入遺伝子の組込みの危険の可能性は根拠がない。本発明では、血管形成タンパク質の限定された期間の発現が実質的な血管形成に十分であり、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている米国特許第6,174,871号に記載されているように、循環器系疾患および末梢疾患過程の一過的な遺伝子導入は治療的に十分である。
【００８７】
宿主生物、細胞、または細胞系に導入される外来核酸の量は、治療対象の患者の必要性により当業者が変更することができる。例えば、遺伝子導入を実施するためにウィルスベクターを使用する場合には、導入する核酸の量は、ウィルスベクターのプラーク形成単位(PFU)の量を変更することによって変更することができる。
【００８８】
処理後の吸引液を被験者に注入する前に、処理後の吸引液から過剰のキャリア（特に過剰のウィルス）を除去することが有利でありうることを当業者は理解している。この目的のために、容器の1つに含有される吸引液を滅菌洗浄するために、2つの滅菌容器の間に配置された流水式フィルター集成物と共に2つの滅菌容器が構成されている、本発明のさらに別の集成物である吸引／注入システムが提供される。過剰なキャリアを除去するために使用されるフィルターの孔のサイズは、滅菌洗浄液および（アデノウィルスなどの）未反応のキャリア残存物がフィルターを通過する程度に大きいが、幹細胞、骨髄細胞等などの吸引液に含有される処理後の細胞が通過しない程度に小さいように選択される。この集成物では、フィルター集成物に、フィルター集成物の近位および遠位末端に取り付けられた中空の針カニューレ76が提供されており、その各々は滅菌容器の1つの滅菌障壁を穿刺するために使用される。洗浄手法の開始時には、洗浄対象の吸引液は第1の容器に存在し、滅菌洗浄液は第2の容器に存在する。容器のプランジャーハンドルに作動装置のピストンを接続することによって、圧力作動装置を第2の容器に取り付けることができる。次いで、（例えば、流水式フィルター集成物を介して）洗浄液を第1の容器に送り出すように圧力作動装置を作動する。本発明である圧力作動装置などの任意の種類の圧力作動装置を第1の容器に取り付け、フィルター集成物を介して洗浄液およびキャリア残存物を送り出すが、処理後の細胞を第1の容器に保持するように作動装置を稼働することによって、滅菌洗浄液およびキャリア残存物を第1の滅菌容器から放出させることができる。処理および洗浄後の細胞を含有する第1の滅菌容器は、ここで、本明細書に開示されている集成物のいずれかを使用し、取り付けられている圧力作動装置によって患者に注入する用意ができる。
【００８９】
本明細書において使用する「転写調節領域」は、mRMA転写の開始を制御する核酸または遺伝子構築物の部分をいう。非哺乳類トランス活性化因子が存在しない場合、本明細書において使用が意図される調節領域は、典型的には、少なくとも1つの最小プロモーターを、リガンド／受容体ペプチド複合体に応答する調節要素と組み合わせて含む。最小プロモーターは、調節要素と組み合わせられると、リガンド／機能的二量体複合体に応答してmRNAの転写を開始するために機能する。しかし、転写は、必要な誘発物質（リガンド）が存在しないと生じない。しかし、本明細書に記載するように、本発明のある種の態様であるキメラタンパク質ヘテロダイマーは、DNA結合ドメインのリガンドが存在しない場合でもmRNA転写を活性化または抑制する。
【００９０】
本明細書において使用する「と機能的に結合する」という句は、DNAとプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列などの調節およびエフェクター配列のヌクレオチドとの機能的な関係をいう。例えば、DNAとプロモーターとの機能的な結合は、このようなDNAの転写が、そのDNAを特異的に認識、結合、転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから開始されるようなDNAとプロモーターとの間の物理的および機能的な関係をいう。
【００９１】
好ましくは、転写調節領域は、遍在的な転写因子の結合部位をさらに含む。このような結合部位は、好ましくはプロモーターと調節要素との間に位置づけられている。本明細書において使用するのに好適な遍在的な転写因子は当技術分野において既知であり、例えば、Sp1が挙げられる。
【００９２】
例示的な真核細胞発現ベクターには、pSV-2gptシステム(Mulliganら、(1979) Nature, 277: 108-114)、PBLUESKRIPT(登録商標)ベクター(Stratagene、カリフォルニア州ラ ホーヤ)、Genetics Institute(Science, (1985) 228: 810-815)によって記載されている発現クローニングベクター等などの真核細胞構築物が挙げられる。これらのプラスミドベクターは各々関心対象のタンパク質の発現を促進することができる。
【００９３】
具体的な態様において、本明細書において使用が意図される遺伝子導入ベクターは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、単純ヘルペスウィルス系ベクター、遺伝子導入のための合成ベクター等などのウィルスベクターである(Suhrら、Arch. of Neurol. 50: 1252-1268, 1998)を参照されたい)。好ましくは、本明細書において使用される遺伝子導入ベクターはレトロウィルスベクターである。本明細書において使用が意図されるレトロウィルスベクターは、2つのレトロウィルスLTRの間に存在する外来核酸を含有する発現構築物を有する遺伝子導入プラスミドである。レトロウィルスベクターは、典型的には、レトロウィルスベクターまたはレトロウィルスベクターを鋳型として使用して転写されるRNAを適当なパッケージング細胞系統のウィルスビリオンにパッケージング可能な適当なパッケージングシグナルを含有する(例えば、米国特許第4,650,764号を参照されたい)。
【００９４】
本明細書において使用するのに好適なレトロウィルスベクターは、例えば、各々全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第5,399,346号および同第5,252,479号、ならびにWIPO公報の国際公開広報第92/07573号、同第90/06997号、同第89/05345号、同第92/05266号、および同第92/14829号に記載されている。これらは、このようなレトロウィルスベクターを使用して核酸をヒト細胞に効率的に導入するための方法の説明を提供している。他のレトロウィルスベクターには、例えば、マウス乳腺腫瘍ウィルスベクター(例えば、Shacklefordら、(1988) PNAS, USA, 85: 9655-9659)、ヒト免疫不全ウィルス(例えば、Naldiniら、(1996) Science 272: 165-320)等が挙げられる。
【００９５】
複製するウィルスを本質的に含有しないレトロウィルスベクター粒子を産生するヘルパー細胞を提供する種々の手法も当技術分野において既知である。例えば、複製するウィルスを含有するウィルスベクターを作製する可能性を最小にするウィルスベクターおよびヘルパー細胞を作製する手法を開示している、米国特許第4,650,764号、Miller、Human Gene Therapy, 1: 5-14, 1990、Markowitzら、Journal of Virology, 61(4): 1120-1124, 1988、Watanabeら、Molecular and Cellular Biology, 3(12): 2241-2249, 1983、Danosら、PNAS、85: 6460-6464, 1988、およびBosselmanら、Molecular and Cellular Biology, 7(5): 1797-1806, 1987を参照されたい。
【００９６】
血管形成増殖因子などの治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを事前にパッケージングするのに好適な組換えレトロウィルスは、レトロウィルスビリオンを作製する既知の方法を使用して作製される。例えば、米国特許第4,650,764号、Miller、上記、1990、Markowitzら、上記、1988、Watanabeら、上記、1983、Danosら、PNAS、85: 6460-6464, 1988、およびBosselmanら、Molecular and Cellular Biology, 7(5): 1797-1806, 1987を参照されたい。
【００９７】
本発明は、本発明の精神または中心となる特性から逸脱することなく他の具体的な形態で具体化することができる。従って、本発明の上記の説明は本発明の例示的な態様のみを開示し、他の形態も本発明の範囲内であるとが意図される。従って、本発明は、本明細書に詳細に記載されている特定の態様に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容を示すものとしては、添付の特許請求の範囲を参照するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図1Aおよび1Bは移動式プランジャーを有する本発明である滅菌容器の図を示す図面である。図1Aは外側図を示し、図1Bは滅菌容器の内側の長手方向の断面を示す。
【図２】注入針と、注入針を滅菌容器に取り付けるための針アダプターと、モーター駆動式圧力作動装置とを備える本発明である注入システムの一態様の組み立て分解図を示す図面である。
【図３】制御された深度の侵入のための本発明である注入針の図面である。
【図４】図4Aおよび4Bは注入針と、フィルター集成物と、本発明である滅菌容器と、モーター駆動式圧力作動装置とを備える、本発明である注入システムの一態様の組み立て分解図を示す斜視図である。
【図５】吸引針が、圧力作動性三方向弁付き分流器を介して、流体を吸引するための吸引シリンジと、吸引シリンジから放出される吸引された流体を収容するためのフィルター集成物および取り付けられている滅菌容器に取り付けられている集成物とを備える本発明である吸引／注入システムの組み立て分解図である。
【図６】光学的スキャナーが外側に取り付けられている本発明であるモーター駆動式圧力作動装置の斜視図面である。相互ピストンは、滅菌容器のプランジャーに機械的に接合する。
【図７】モーター駆動式圧力作動装置と併用して使用するためのコンピュータシステムを例示する略図である。
【図８】本発明である滅菌容器から注入シリンジ内に計量され、シリンジプランジャーの押し込みによって注入シリンジから放出される液体の容量を正確に制御するためにオペレーターによって手動で取り付けられるオペレーター制御式プランジャー拘束部材を備える、本発明である手持ち式注入システムの上面図である。
【図９】図8に示す本発明である手持ち式注入システムであるが、ホルダーカバーを有するシステムの上面図である。
【図１０】滅菌容器のプランジャーが回転可能であるようにホルダー内に収容されている、本発明である手持ち式注入システムの上面図である。オペレーターによるホルダーの回転は、滅菌容器のプランジャーを遠位方向に駆動し、滅菌容器に含まれる一定容量の流体を放出する。
【図１１】図11Aおよび図11Bは滅菌容器がホルダー内に収容されている図10の手持ち式注入システムの長手方向の断面図を示す図面である。図11Aでは、プランジャーハンドルは滅菌チャンバー内にある容量の流体を収容するために伸展した位置にある。図11Bでは、プランジャーは滅菌チャンバーの容量をゼロにするように再近位位置に駆動されている。
【図１２】固定されている滅菌容器に対してオペレーターがホルダーを回転する際、音響および／または触覚信号発生する機序を示すための、ホルダー（ネジ山付き）の内側およびプランジャーハンドルの末端の断面図を提供する略図である。
【図１３】ホルダーの内側のネジ山および滅菌容器収容部材の外側のネジ山が間抜けネジ山である、図10〜12の手持ち式注入システムの略図である。
【図１４】オペレーター制御式で調節可能な針停止部材が遠位部分に取り付けられている注入カテーテルに取り付けられた図10〜13のシステムを含む、本発明である手持ち式注入集成物を示す略図である。針の遠位先端の正確に制御された増加分の1つまたは複数が、針停止部材内の一連の位置を遠位方向にオペレーターが針を前進させることによって露出される際、遠位先端の正確に制御された増加分のどれくらいがオペレーターによって針停止部材内から延ばされたかを示す指標を針停止部材がオペレーターに提供する。
【図１５】注入カテーテルの注入針の末端に固定して取り付けられているオペレーター制御式で調節可能な針停止部材の長手方向の断面図を示す略図である。

Claims (33)

1. 以下を含む、それを必要としている被験者の組織表面に正確に制御された治療容量の血管形成促進治療液を1回または複数回導入する方法であって、これにより、正確に制御された容量の治療用血管形成促進流体は、実質的に滅菌状態で被験者の組織表面内に反復的に注入される方法：
   a)i)滅菌状態の正確に制御された容量の液体を反復的に送達するための滅菌容器集成物であって、
   収容部材と比較して小さいサイズの開口部を有する液密収容部材であって、収容部材の内側が滅菌状態に維持されており、約3ml〜約70mlの範囲の最大内部容量を有する液密収容部材と、
   中空の針カニューレを収容するための開口部を被覆する自己気密性の穿刺可能な滅菌障壁と、
   収容部材の内側と液密的に接続している圧力作動装置と
   を液密的配置で含み、液体の敗血性汚染および液体の未制御の損失を伴わすに正確に制御された容量の治療用液体を開口部を介して反復的に放出するように、圧力作動装置が収容部材の内部に含有される治療用液体に陽圧を反復的に適用する滅菌容器集成物と、
   ii)収容部材の内側と流体的に連絡している中空の針と
   を液密的配置で含む、液体注入システムを入手する段階；
   b)被験者の組織表面内に中空の針を挿入する段階；ならびに
   c)滅菌収容部材内の治療用液体に陽圧を反復的に適用するために圧力作動装置を作動することによって、滅菌収容部材内に含有される正確に制御された容量の治療用液体を中空の針を介して被験者の組織表面内に複数回注入する段階。
2. 被験者に注入する前に治療用液体をろ過するための1つまたは複数のフィルターを含むフィルター集成物をシステムがさらに備え、滅菌容器から放出される治療用液体が中空の針に流入する前にフィルター集成物内の1つまたは複数のフィルターを通過するように、中空の針と滅菌収容部材の開口部との間にフィルター集成物が配置され、ここで、1つまたは複数のフィルターの孔は、被験者に治療用流体を注入する前に治療用流体から望ましくない物質をろ過するようなサイズである、請求項1記載の方法。
3. フィルターが詰まりを防止するために間隔をおいて配置され、約50ミクロン〜約300ミクロンの範囲の平均孔開口部を有する、請求項2記載の方法。
4. フィルター集成物が以下を同軸の液密的な配置で含む、請求項2記載の方法：
   液体から望ましくない成分をろ別するようなサイズの孔を有する1つまたは複数のフィルター；
   1つまたは複数のフィルターの液密的な囲いを協力して形成するように接合する遠位部分および近位部分を少なくとも有するフィルター受け器であって、フィルター受け器の遠位部分が中空の針のハブに取り付られているフィルター受け器；
   フィルター受け器の近位部分の外側に取り付けられている中空の針カニューレ；ならびに
   フィルター受け器の遠位側の外側に取り付けられている液密的な液体コネクタ；
   ここで、中空の針カニューレは滅菌容器の滅菌障壁を介して挿入される。
5. システムが手持ち式装置として構成されている、請求項1記載の方法。
6. システムが手持ち式装置として構成されている、請求項3記載の方法。
7. 中空の針が注入針カテーテル内に含有され、組織表面が被験者の心臓の心筋である、請求項1記載の方法。
8. 治療用流体が被験者から得られた骨髄吸引液を含み、組織表面が被験者の心臓の心外膜または心筋である、請求項1記載の方法。
9. 組織表面が被験者の心臓の心筋または心外膜であり、心筋内血管再建を促進するために、正確に制御された容量の治療用血管形成促進流体が間隔をおいた複数の位置に反復的に注入される、請求項1記載の方法。
10. 注入される治療用容量が、間隔をおいた位置の各々において、約0.05ml〜約5mlの範囲であるように正確に制御される、請求項8記載の方法。
11. 1回または複数回の治療用容量が心臓手術手技中に被験者の心臓に注入される、請求項8記載の方法。
12. 治療用流体が、ヘパリンおよび心臓における血管形成の刺激に好適な1つまたは複数の増殖因子をさらに含む、請求項1記載の方法。
13. 増殖因子が、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、およびHIF-1からなる群より1つまたは複数選択される、請求項11記載の方法。
14. 治療用流体が、ヘパリンおよび血管形成の刺激に好適な増殖因子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1記載の方法。
15. ポリヌクレオチドがVEGF、bFGF、およびHIF-1をコードするポリヌクレオチドからなる群より1つまたは複数選択される、請求項13記載の方法。
16. 被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
17. 以下を含む、それを必要としている被験者の組織表面内に、正確に制御された治療容量の血管形成促進治療液を1回または複数回導入する方法であって、これにより、正確に制御された容量の治療用血管形成促進流体は、実質的に滅菌された状態で被験者の組織表面内に反復的に注入される方法：
    a)i)中空の針と、
    ii)円筒状の部分と小さい径の遠位部分とを有する収容部材と、
    遠位開口部と、
    遠位開口部を被覆する穿刺可能で自己気密性の滅菌障壁と、
    収容部材の円筒状部分の内側壁に円周方向に固定して取り付けられた1つまたは複数のピストンリング様停止部材と、
    収容部材の遠位末端の内側に適合するように形作られたドーム型のヘッド部分を有し、プランジャーのストロークが遠位開口部および停止部材に対するヘッド部分の支台によって規定されるように、収容部材の円筒状部分内に液密的で、移動可能であるように取り付けられているピストン様プランジャーと、
    プランジャーを収容部材の円筒状部分内で長手方向に移動させるためにプランジャーに取り付けられているプランジャーハンドルと
    を同軸配置で含み、滅菌障壁、収容部材の円筒状部分、およびプランジャーのドーム型ヘッド部分の外側が、治療用流体を含有する膨張および圧縮可能な滅菌チャンバーを形成し、中空の針が滅菌チャンバーと滅菌障壁を介して流体的に連絡する滅菌容器と、
    iii)容器プランジャーを正確に制御された長手方向の距離だけ遠位方向に1回または複数回移動することによって制御された容量の液体を放出するように、圧力作動装置が滅菌チャンバー内の液体に陽圧を適用する、滅菌容器のプランジャーハンドルに機能的に接続された圧力作動装置と
    を液密的配置で含む滅菌された液体注入システムを入手する段階；ならびに
    b)滅菌収容部材内の治療用液体に陽圧を反復的に適用するために圧力作動装置を作動することによって、滅菌収容部材に含有される正確に制御された容量の治療用流体を中空の針を介して被験者の組織表面内に複数回注入する段階。
18. 以下を含む、骨髄吸引液を滅菌状態で処理する方法：
    a)滅菌容器と流体的に連絡している中空の吸引針を介して骨髄液を滅菌容器に吸引する段階であって、滅菌容器が、
    収容部材と比較して小さいサイズの開口部を有する液密収容部材であって、収容部材の内側が滅菌状態に維持されており、約30ml〜約70mlの範囲の最大内部容量を有する液密収容部材と、
    中空の針カニューレを収容するための開口部を被覆する自己気密性の穿刺可能な滅菌障壁と、
    収容部材の内側と液密的に接続している圧力作動装置と,
    収容部材の内側と流体的に連絡している中空の針と
    を液密的配置で含む段階；および
    b)滅菌容器の滅菌収容部材内に骨髄液を吸引するのに十分な、部分的な真空を収容部材の内側に形成するように圧力作動装置を作動する段階。
19. c)滅菌容器内に含有される間に骨髄吸引液を1つまたは複数の血管形成誘導剤で処理する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
20. 滅菌容器にヘパリンが事前に添加されている、請求項18記載の方法。
21. 滅菌容器に1つまたは複数の血管形成誘導剤が事前に添加されている、請求項18記載の方法。
22. 血管形成誘導剤が、心臓において血管形成を刺激するのに好適な1つまたは複数の増殖因子を含む、請求項19記載の方法。
23. 増殖因子が、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、およびHIF-1からなる群より1つまたは複数選択される、請求項21記載の方法。
24. 1つまたは複数の血管形成誘導剤が、血管形成を刺激するのに好適な少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、
    d)骨髄吸引液内の細胞に少なくとも1つのポリヌクレオチドをトランスフェクションする段階
    をさらに含む、請求項19記載の方法。
25. ポリヌクレオチドが、VEGF、bFGF、およびHIF-1をコードするポリヌクレオチドからなる群より1つまたは複数選択される、請求項23記載の方法。
26. ポリヌクレオチドが、骨髄吸引液中の細胞にトランスフェクションし、ポリヌクレオチドを発現させるためにベクターに含有される、請求項23記載の方法。
27. ベクターがレトロウィルスベクターである、請求項25記載の方法。
28. 以下をさらに含む、請求項25記載の方法：
    e)滅菌容器の滅菌障壁を通して挿入された中空の針を介して、滅菌容器内に滅菌洗浄液を少なくとも1回導入する段階；および
    f)容器内にトランスフェクトされた細胞を維持しながら、滅菌容器から滅菌洗浄液および過剰のベクターを除去する段階。
29. 過剰なベクターはフィルターを通過させ、トランスフェクトされた細胞を滅菌容器内に保持するようなサイズの孔を有するフィルターに滅菌容器から除去された洗浄液を通過させることによって、トランスフェクトされた細胞を滅菌容器内に保持する、請求項27記載の方法。
30. 滅菌容器の内側に流体的に連絡して配置されている中空の注入針を介して、被験者に段階c)で得られた処理済み細胞を実質的に滅菌状態で再注入する段階
    をさらに含む、請求項18記載の方法。
31. オペレーターが手で持てるように滅菌液体注入システムが構成されている、請求項1記載の方法。
32. オペレーターが圧力作動装置を手動で反復的に作動させる、請求項30記載の方法。
33. 作動装置がモーター駆動式であり、オペレーターがモーター駆動式作動装置を手動で反復的に作動させる、請求項30記載の方法。

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