JP2004521102A

JP2004521102A - 抗真菌化合物の活性代謝物

Info

Publication number: JP2004521102A
Application number: JP2002555759A
Authority: JP
Inventors: ドロピンスキー，ジエイムズ・エフ; ヒツクス，パトリシア・スコツト
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-04
Publication date: 2004-07-15
Also published as: CA2433652A1; EP1351701A2; WO2002055022A3; WO2002055022A2

Abstract

本発明は、真菌感染を治療するための方法であって、有効量の式Ｉの化合物またはその医薬適合性の塩をそうした治療が必要な哺乳動物患者に投与することを含む方法に関する。本発明の他の態様には、式Ｉの化合物と第二抗真菌剤の組み合わせを用いる真菌感染の治療法および前記組み合わせの医薬組成物が挙げられる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌活性を有する下記式Ｉ：
【０００２】
【化１】
の代謝化合物の同定に関する。この代謝産物は、ヒトの血漿において生産されるＣＡＮＣＩＤＡＳ（商標）（酢酸カスポフンジン（ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎａｃｅｔａｔｅ））の主たる代謝物であることがわかった。酢酸カスポフンジンは、カンジダ感染、アスペルギウス感染、ニューモシスティス−カリニ感染および他の真菌感染の非経口治療用に開発された半合成抗真菌剤である。その活性は、β−（１，３）−グルカン（標的生物の細胞壁内在性成分）の合成の阻害によって媒介される。カスポフンジンは、米国特許第５，３７８，８０４号に開示されている分子量１０９４の大環状ペプチドである。この化合物は、アミナール部分を含む様々な潜在的に反応性の官能基を有する。この代謝物は、オルニチン残基中のアミナールを加水分解し、開環し、再環化して、二つの異性体５員環状ヘミアミナール生成物を生成することによって、生産される。これらの二つの異性体は、高速液体クロマトグラフィーによって容易に分解されないため、一つの生産物として一緒に分離し、まとめて「代謝物」と呼ばれる。
【０００３】
【化２】
【背景技術】
【０００４】
ニューモカンジンＢ_０の関連開環類似体が、非常に劣ったβ−（１，３）−グルカン合成活性を有すると判明することは、先行の研究において見極められていたことだった。しかし、式Ｉのこのヘキサペプチド代謝物は、カンジダ分離菌に対して驚くべき活性を有することが判明した。
【０００５】
ニューモカンジンＢ_０の開環類似体は、ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって開示されている。Ｊ．Ｍ．Ｂａｌｋｏｖｅｃら、「新規エキノカンジンリポペプチドの水溶性プロドラッグの合成、安定性および生物学的評価。全身性カンジダ症およびニューモシスティスカリニ肺炎（ＰＣＰ）の治療用に可能性のある臨床薬の発見（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＷａｔｅｒＳｏｌｕｂｌｅＰｒｏｄｒｕｇｓｏｆＮｅｗＥｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎＬｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａＰｏｔｅｎｔｉａｌＣｌｉｎｉｃａｌＡｇｅｎｔｆｏｒｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＳｙｓｔｅｍｉｃＣａｎｄｉｄｉａｓｉｓａｎｄＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉＰｎｅｕｍｏｎｉａ（ＰＣＰ））」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９２，３５，１９４−８を参照のこと。化合物２（式Ｉの化合物の合成における中間体）の合成は、Ｆ．Ａ．Ｂｏｕｆｆａｒｄら、「新規カチオン性ニューモカンジンＢ_０誘導体の合成および抗真菌活性（ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＡｃｔｉｖｉｒｙｏｆＮｏｖｅｌＣａｔｉｏｎｉｃＰｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎＢ_０Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，２２２−５によって最初に説明された。式Ｉの化合物の調製は、ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって開示されている手順に従うことにより分離することができるニューモカンジンＢ_０を用いて開始する。Ｒ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、「ＺａｌｅｒｉｏｎａｒｂｏｒｉｃｏｌａＩからのニューモカンジン。発見および分離（ＰｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎｓｆｒｏｍＺａｌｅｒｉｏｎａｒｂｏｒｉｃｏｌａＩ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９９２）４５：１８５３−１８６６、およびＰ．Ｓ．Ｍａｓｕｒｅｋａｒら、「ＺａｌｅｒｉｏｎａｒｂｏｒｉｃｏｌａＩＩからのニューモカンジン。突然変異および培地操作による生産物スペクトルの修飾（ＰｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎｓｆｒｏｍＺａｌｅｒｉｏｎａｒｂｏｒｉｃｏｌａＩＩ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｏｎｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓｐｅｃｔｒｕｍｂｙｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｍｅｄｉｕｍｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９９２）４５：１８６７−１８７４、および米国特許第５，１９４，３７７号および同第５，２０２，３０９号を参照のこと。米国特許第５，８５４，２１２号および同第５，９３９，３８４号は、ニューモカンジンＢ_０の調製方法も開示している。実施例１を参照のこと。
【０００６】
最近の開示物は、カスポフンジンの代謝／分解副生産物の形成を論議している。ＸＵ，Ｘ．，ＤＥＬＵＮＡ，Ｆ．，ＹＵＡＮＧ，Ａ．，ＣＹＬＣ，Ｄ．，ＤＡＶＩＳ，Ｍ．，ＳＡＨＬＹ，ＹおよびＬＩＮ，Ｊ．Ｈ．を参照のこと。ラットでは、遅い肝摂取および排出は、Ｌ−７４３，８７２（強力な抗真菌剤）の動態に重要な役割を果たす。ＡｍｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｔｉｓｔｓ１０ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ（ＡＡＰＳ），Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１０／２６／１９９６−１０／３１／１９９６；ＫＡＵＦＭＡＮ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＮＥＲＵＲＫＡＲ，Ｍ．「大環状抗真菌剤Ｌ−７４３，８７２の分解：反応生成物および動態、ならびに安定化戦略（ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｇｅｎｔＬ−７４３，８７２：Ｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｚａｉｔｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」での発表の故。ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ３１ｓｔＭｉｄｄｌｅＡｔｌａｎｉｔｃＲｅｇｉｏｎａｌＭｅｅｔｉｎｇ，Ｐｌｅａｓａｎｔｖｉｌｌｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，０５／２７／１９９７−０５／３０／１９９７；ＫＡＵＦＭＡＮ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＮＥＲＵＲＫＡＲ，Ｍ．「大環状抗真菌剤Ｌ−７４３，８７２の分解：反応生成物および動態、ならびに安定化戦略（ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｇｅｎｔＬ−７４３，８７２：Ｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｚａｉｔｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」での発表の故。ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ３１ｓｔＭｉｄｄｌｅＡｔｌａｎｉｔｃＲｅｇｉｏｎａｌＭｅｅｔｉｎｇ，Ｐｌｅａｓａｎｔｖｉｌｌｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，０５／２７／１９９７−０５／３０／１９９７；ＢＡＬＡＮＩ，Ｓ．Ｋ．，ＸＵ，Ｘ．，ＡＲＩＳＯＮ，Ｂ．Ｈ．，ＳＩＬＶＡ，Ｍ．Ｖ．，ＧＲＩＥＳ，Ａ．，ＤＥＬＵＮＡ，Ｆ．Ａ．，ＣＵＩ，Ｄ．，ＫＡＲＩ，Ｐ．Ｈ．，ＬＹ，Ｔ．，ＨＯＰ，Ｃ．Ｅ．Ｃ．Ａ．，ＳＩＮＧＨ，Ｒ．，ＷＡＬＬＡＣＥ，Ｍ．Ａ．，ＤＥＡＮ，Ｄ．Ｃ．，ＬＩＮ，Ｊ．Ｈ．，ＰＥＡＲＳＯＮ，Ｐ．Ｇ．ａｎｄＢＡＩＬＬＩＥ，Ｔ．Ａ．「ヒトの血漿および尿中の酢酸カスポフンジン、強力な抗真菌剤、の代謝物質（Ｍｅｔａｂｉｌｉｔｅｓｏｆｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎａｃｅｔａｔｅ，ａｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｇｅｎｔ，ｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａａｎｄｕｒｉｎｅ）」での発表の故。薬物代謝および動態（ＤｒｕｇＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＤｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ならびにＭＣＱＵＡＤＥ，Ｍ．Ｓ．，ＦＯＲＳＹＴＨ，Ｒ．Ｊ．，ＺＩＭＭＥＲＭＡＮ，Ｊ．ａｎｄＲＯＢＥＲＴＳ，Ｊ．Ｃ．「通常用いられる静脈内適用溶液および軟質ポリ塩化ビニル容器中での再構成Ｃａｎｉｃｉｄａｓ（商標）（酢酸カスポフンジン）の安定性（ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄＣａｎｃｉｄａｓ^ＴＭ（ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎａｃｅｔａｔｅ）ｉｎｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｉ．ｖ．ｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｆｌｅｘｉｂｌｅｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）」に準拠する故。ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅａｌｔｈ−ＳｙｓｔｅｍＰｈａｒｍａｃｙに準拠する故。
【発明の開示】
【０００７】
真菌感染を治療するための方法であって、有効量の下記式Ｉ：
【０００８】
【化３】
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な哺乳動物の患者に投与することを含む方法。本発明のさらなる態様には、１）真菌感染を制御するための方法であって、有効量の式Ｉの化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な免疫構成患者に投与することを含む方法；２）ニューモシスティス肺炎を制御する方法であって、有効量の式Ｉの化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な免疫構成患者に投与することを含む方法；３）式Ｉの化合物またはその医薬適合性の塩、ならびにアゾールまたはポリエン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤、キチン合成阻害剤、延長因子阻害剤、マンナン形成抗真菌剤、殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物、および複合糖質抗真菌剤から成る群より選択される第二抗真菌剤を含む医薬組成物；および４）真菌感染を治療するための方法であって、有効量の、式Ｉの化合物またはその医薬適合性の塩と、アゾールまたはポリエン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤、キチン合成阻害剤、延長因子阻害剤、マンナン形成抗真菌剤、殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物、および複合糖質抗真菌剤から成る群より選択される第二抗真菌剤から成る群より選択される第二抗真菌剤との組み合わせを、そうした治療が必要な哺乳動物患者に投与することを含む方法が挙げられる。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
真菌感染を治療するための方法であって、有効量の下記式Ｉ：
【００１０】
【化４】
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な哺乳動物の患者に投与することを含む方法。
【００１１】
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、上に記載の方法。
【００１２】
医薬組成物が、非経口投与または経口投与される、上に記載の方法。
【００１３】
医薬組成物が、非経口投与される、上に記載の方法。
【００１４】
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、上に記載の方法。
【００１５】
真菌感染を制御するための方法であって、有効量の下記式Ｉ
【００１６】
【化５】
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な哺乳動物の患者に投与することを含む方法。
【００１７】
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、上に記載の方法。
【００１８】
医薬組成物が、非経口投与される、上に記載の方法。
【００１９】
医薬組成物が、静脈内注射によって投与される、上に記載の方法。
【００２０】
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、上に記載の方法。
【００２１】
ニューモシスティス肺炎を制御する方法であって、有効量の下記式Ｉ：
【００２２】
【化６】
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な免疫構成患者に投与することを含む方法。
【００２３】
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、上に記載の方法。
【００２４】
医薬組成物が、非経口投与される、上に記載の方法。
【００２５】
医薬組成物が、静脈内注射によって投与される、上に記載の方法。
【００２６】
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、上に記載の方法。
【００２７】
本発明は、記式Ｉの化合物と第二抗真菌剤の組み合わせを含む医薬組成物、ならびに式Ｉの抗真菌化合物および第二抗真菌剤の投与を含む抗真菌併用療法にも関する。
【００２８】
この併用療法は、これら二つの薬剤の逐次、同時または並行投与を含むものとする。より詳細には、本発明は、アゾールまたはポリエン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤、キチン合成阻害剤、延長因子阻害剤、マンナン形成抗真菌剤、殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物、および複合糖質抗真菌剤などの第二抗真菌剤の使用を含む抗真菌併用療法に関する。
【００２９】
こうした第二抗真菌剤の代表例は、フルコナゾール、ボリコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾールなどのアゾール；アンフォテリシンＢ、ナイスタチンまたはそのリポソームおよびリピド形態（ＡＢＥＬＣＥＴ、ＡＭＢＩＳＯＭＥおよびＡＭＰＨＯＣＩＬなど）；フルシトシンなどのプリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤；またはニッコマイシン（特に、ニッコマイシンＺ）などのポリオキシンまたは他のキチン合成阻害剤；ソルダリンおよびその類似体などの延長因子阻害剤；プラダマイシンなどのマンナン形成抗真菌剤；ＸＭＰ．９７もしくはＸＭＰ．１２７などの殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物；またはＣＡＮ−２９６などの複合糖質抗真菌剤である。
【００３０】
特に、本併用療法は、クリプトコックス属、カンジダ属、アスペルギウス属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、パラコクシジオイデス属、ブラストミセス属、フザリウム属、スポロトリクス属、トリコスポロン属、クモノスカビ属、シュードアレシェリア属、皮膚糸状菌、ペシロミセス属、アルテルナリア属、フルブラリア属、エキソフィアラ属、ワンギエラ属、ペニシリウム属、サッカロミセス属、黒色真菌およびニューモシスティス−カリニなどの日和見病原体に対して有用であることが判明した。
【００３１】
ＣＡＮＣＩＤＡＳ（商標）（酢酸カスポフンジン）は、米国特許第５，３７８，８０４号に開示されており、その調製法は、前記特許および米国特許第５，５５２，５２１号に記載されている。
【００３２】
アゾール、ポリエンまたは他の抗真菌剤は、経口投与または非経口投与することができる。式Ｉの化合物は、好ましくは、非経口投与されるが、その経路に限定されず、経口、筋肉内もしくは皮下などの他の経路によっても投与されうる。
【００３３】
併用療法は、すべての薬剤の部分阻害濃度を利用して、結果的に作用を強化する。これらの作用は、カンジダ−ネオフォーマンス、カンジダ−ルビカンス、アスペルギウス−フミガーツスの臨床および環境菌株を用いて、インビトロおよびインビボで実証することができる。
【００３４】
式Ｉの化合物は、動物性の基を加水分解し、その後、開環して、オルニチン基のＮ２上へ再び環化することによって、カスポフンジンから生成する。
【００３５】
式Ｉの化合物は、図式１に概要を示す手順に従って、ニューモカンジンＢ_０（化合物Ｉ）から調製することができる。簡単にいえば、ニューモカンジンＢ_０の３−ヒドロキシグルタミン残基を還元して、化合物２を得ることができる。ボラン−硫化ジメチル複合体が、好ましい還元剤である。化合物２をトリエチルアミンなどの塩基で処理して開環させ、その後の再び環化して、式Ｉの化合物を得ることができる。式Ｉの化合物は、新たに生成されるヘミアミナール基での二つの異性体の混合物として生成される。これらの異性体は、標準的なクロマトグラフ技術によって容易に分離することができないため、混合物として用いることとなる。
【００３６】
【化７】
【００３７】
本発明は、酸付加塩も包含する。分離の標準的な過程での式Ｉの化合物は、酸付加塩として得られる。従って、この塩を水に溶解し、望ましいアニオンを有するアニオン交換カラムに通すことができる。その望ましい塩を含有する溶離液を濃縮して、その塩を固体生成物として回収することができる。
【００３８】
式Ｉの化合物をプロトコルＭ２７−Ａに従って酵母菌感受性について試験した。このプロトコルは、それらの酵母分離菌を抗真菌剤に対する感受性についてすべて臨床検査する標準的プロトコルである。Ｊ．Ｎ．Ｇａｌｇｉａｎｉら、「液体希釈抗真菌感受性試験についての参照法：承認基準Ｍ２７−Ａ（参照Ｆ−７）（ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＢｒｏｔｈＤｉｌｕｔｉｏｎＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇ：ＡｐｐｒｏｖｅｄＳｔａｎｄａｒｄＭ２７−Ａ（ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＦ−７））」、米国臨床研究所規格委員会（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ）１９９７；１７（９）：１−２９を参照のこと。この方法の記載は次のとおりである：接種材料は、分光光電光度計（光学密度、５５０ｎｍ）で標準化し、希釈して、Ｌ−グルタミンを含有し、炭酸水素ナトリウムを含有せず、０．１６５ＭのＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸）で緩衝されたＲＰＭＩ１６４０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中での最終濃度０．５×１０^３〜２．５×１０^３にした。
【００３９】
式Ｉの化合物とともに適切な対照標準物質を、滅菌脱イオン水中の濃縮保存溶液として調製し、ＰＲＭＩ１６４０培地中で希釈し、１２８μｇ／ｍＬから二段階希釈法で０．０６μｇ／ｍＬに低下する濃度範囲で試験した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、３５℃で２４または４８時間インキュベーションした後、目に見える増殖を完全に阻害した化合物の最小濃度と定義した。
【００４０】
標準試料をＭ３８−Ｐ［米国臨床研究所規格委員会。分生子形成性糸状菌の液体希釈真菌感受性試験についての参照法（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｂｒｏｔｈｄｉｌｕｔｉｏｎａｎｔｉｆｕｎｇａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｃｏｎｉｄｉｕｍ−ｆｏｒｍｉｎｇｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ）。推奨基準Ｍ３８−Ｐ。Ｗａｙｎｅ，ＰＡ：米国臨床研究所規格委員会；１９９８］にすること、接種材料最終濃度を分生子１〜５×１０^４／ｍＬにしたこと、およびＭＩＣを増殖対照と比較した時、増殖を顕著に低下させる（対照の約５０％）化合物の最低濃度と定義すること以外は、上に記載したものと同じ方法をアスペルギウスに用いた。結果を表Ａに示す：
【００４１】
【表１】
【００４２】
式Ｉの化合物は、真菌に対するインビボでの有効性も示し、これは、次のインビボアッセイを利用して実証することができる。
【００４３】
カンジダ−アルビカンスＭＹ１０５５のオーバーナイトＳＤＡ培養物からの増殖物を滅菌サリンに浮遊させ、その細胞濃度を血球計数器での計数によって測定し、細胞浮遊液を細胞３．７５×１０^５／ｍＬにした。その後、最終接種材料が細胞７．５×１０^４／ｍＬになるように、この浮遊液の０．２ミリリットルをマウスの尾静脈に静脈内投与した。
【００４４】
その後、上記の方法であらかじめカンジダ−アルビカンスに感染させた１８〜２０グラムの雌ＤＢＡ／２マウスに、式Ｉの化合物の水溶液を１日の間、１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）、様々な濃度で腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与することによって、アッセイを行った。対照として、脱イオン水をカンジダ−アルビカンス感染マウスにＩ．Ｐ．投与した。２４時間後、二酸化炭素ガスによってマウスを犠牲にし、対の腎臓を無菌状態で取り出し、滅菌サリン５ミリリットルを収容した無菌ポリエチレンバッグに入れた。腎臓をバッグ内でホモジナイズし、滅菌サリン中で系列希釈して、アリコートをＳＤＡプレートの表面に塗布した。そのプレートを３５℃で４８時間インキュベートし、酵母菌コロニーを数えて、腎臓１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を決定した。結果を表Ｂに示す。式Ｉの化合物は、０．３１、１．２５、５および１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で感染させた動物の腎臓における汚染組織数を減少させた。
【００４５】
【表２】
【００４６】
式Ｉの化合物は、免疫無防備状態の患者におけるニューモシスティス−カリニ感染の阻害または緩和にも有用である。治療目的または抗感染目的のための本発明の化合物の効能は、免疫抑制ラットでの研究で実証することができる。
【００４７】
代表的な研究では、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重約２５０グラム）を飲み水の中のデキサメタゾン（２．０ｍｇ／Ｌ）で免疫抑制し、７週間低蛋白食を続けて、潜伏感染からのニューモシスティス肺炎の発症を誘発する。薬物治療の前に、２匹のラットを犠牲にして、ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰＣＰ）の存在を確認する。５匹のラット（体重約１５０グラム）に１日２回、４日間、ビヒクル（蒸留水）０．２５ｍＬ中の式Ｉの化合物を皮下（ｓｃ）注射する。ビヒクル対照も行う。すべての動物は、治療期間中、飲み水の中のデキサメタゾンおよび低蛋白食を摂取し続ける。治療完了時、すべての動物を犠牲にし、肺を取り出して、処理し、染色されたスライドの顕微鏡分析によって疾病の広がりを測定した。
【００４８】
その傑出した特性は、この化合物が通常の医薬調剤技術に従って医薬適合性の担体を伴う新規医薬組成物に調合される時、最も有効に利用される。
【００４９】
この新規組成物は、少なくとも治療抗真菌または抗ニューモシスティス量の活性化合物を含有する。一般に、この組成物は、少なくとも１重量％の式Ｉの化合物を含有する。使用前の希釈液に適する濃縮組成物は、９０重量％以上の組成物を含有しうる。こうした組成物には、経口、局所、非経口（腹腔内、皮下、筋肉内および静脈内を含む）、鼻内および坐薬投与または吸入に適する組成物が挙げられる。こうした組成物は、式Ｉの化合物を望ましい培地に適する成分と均質混合することによって事前包装することができる。
【００５０】
経口投与用に調合された組成物は、液体組成物または固体組成物であることができる。液体製剤については、水、グリコール、油、アルコールおよびこれらに類するものなどの液体担体を用いて治療薬を調合することができ、また、カプセルおよび錠剤などの固体製剤については、ステアリン酸カルシウムなどの潤滑剤とともに結合剤、崩壊剤およびこれらに類するものを一般には含有する、デンプン、糖、カオリン、エチルセルロース、炭酸カルシウムおよびナトリウム、リン酸カルシウム、カオリン、タルク、ラクトースなどの固体担体を用いて治療薬を調合することができる。錠剤およびカプセルは、投与が容易なため、最も有利な経口剤形の代表である。投与の容易さおよび投薬量の均一性のためには、組成物を単位剤形（下文にて定義）で調合すると、特に有利である。単位剤形での組成物は、本発明の一つの態様を構成する。
【００５１】
組成物は、注射用に調合することができ、水中０．８５％の塩化ナトリウムまたは５％のデキストロースなどの油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態を取ることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有することができる。緩衝剤ならびに添加剤（生理食塩水またはグルコースなど）を添加して、溶液を等張性にすることができる。点滴静脈内投与のために、化合物をアルコール／プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールに溶解することもできる。これらの組成物は、望ましくは保存薬を添加した、アンプル内または複数回分用容器内の単位剤形で提供することもできる。あるいは、有効成分は、投与前に適するビヒクルと再構成するように、粉末形態であることができる。
【００５２】
本明細書および特許請求の範囲で用いられている用語「単位剤形」は、各単位が医薬用担体と共同して望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の有効成分を含有する物理的に別個の単位を指す。こうした単位剤形の例は、錠剤、カプセル、ピル、粉末パケット、カシェ剤、アンプル内または複数回分用容器内の定量単位である。本発明の単位投薬量は、一般に、本化合物のうちの一つを１００〜２００ミリグラム含む。
【００５３】
本化合物が抗真菌用途用である時、あらゆる投与方法を用いることができる。真菌感染の治療には、通常、経口投与または静脈内投与が用いられる。
【００５４】
本化合物をニューモシスティス感染の制御に用いるべき時には、肺および気管支を直接治療することが望ましい。このためには吸入法が好ましい。吸入による投与については、本発明の化合物は、加圧パックまたはネブライザーから、エーロゾルスプレー押し出しの形態で、適便に送達される。吸入のために好ましい送達系は、定量吸入（ＭＤＩ）用エーロゾルあり、これは、過フッ化炭化水素または炭化水素などの適する噴射剤中の式Ｉの化合物の懸濁液または溶液として調合することができる。
【００５５】
本発明の化合物は、錠剤、カプセル、局所用組成物、吸入用粉剤、坐薬およびこれらに類するものとして用いることができるが、水および水性媒体への本発明の化合物の溶解度によって注射用調合物で用いることができるようになり、また、エーロゾルスプレーに適する液体組成物でも用いることができるようになる。
【００５６】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、制限するものとは解釈しないでいただきたい。
【実施例１】
【００５７】
【表３】
【００５８】
パートＡ．ニューモカンジンＢ_０（化合物Ｉとも呼ぶ）は、１９９３年４月１３日発行の米国特許第５，２０２，３０９号に開示されており、好気条件下で真菌Ｇｌａｒｅａｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ（Ｚａｌｅｒｉｏｎａｒｂｏｒｉｃｏｌａとして以前に特定されたもの）を培養することによって生産する。ニューモカンジンＢ_０の生産方法は、１９９３年３月１６日発行の米国特許第５，１９４，３７７号に開示されている。ニューモカンジンＢ_０は、ブダペスト条約のもと、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２のＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたＧｌａｒｅａｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ番号２０８６８を培養することによって生産する。ニューモカンジンＢ_０は、米国特許第５，９３９，３８４号に記載の手順に従って調製することもできる。あるいは、ニューモカンジンＢ_０は、下記の手順に従って分離することができる。
【００５９】
パートＢ．ニューモカンジンＢ_０の別合成
培養
真菌Ｇｌａｒｅａｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ７４０３０）を用いて、化合物Ｉおよび構造関連類似体を生産する。この改良生産菌種は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの突然変異誘発の逐次的段階によって、野生型生物、ＡＴＣＣ２０８６８（淡水のサンプルから分離したもの）から最終的に誘導した。その培養物を５％（容積／容積）グリセロール中の菌糸浮遊液のアリコートとして維持して、−７０℃で保管した。
【００６０】
フラスコ振盪スケールの発酵制御方法
１ｍＬの解凍培養株とともに５０ｍＬのＬＹＣＰ−５培地を収容した２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコを無菌状態でインキュベートした。この第一段階の種培養物を２２０ｒｐｍで攪拌しながら２５℃で３〜５日間インキュベートした。５０ｍＬのＬＹＣＰ−５培地を収容した第二の２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに第一段階の種の１ｍＬ量を移した。第二段階の種培養物を３日間、上記のようにインキュベートした。
【００６１】
【表４】
【００６２】
試験した各不確定要素（すなわち、治療グループ）について、２５ｍＬのＦＧＹ培地（表２）またはその変種（下記のもの）を各々収容した幾つかの２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコを第二段階の種５％（容積／容積）接種した。フラスコを２２０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で１４日間インキュベートした。必要な場合には、各治療グループからフラスコを一つ取り出し、酸または塩基を添加してｐＨを５．０〜５．５に戻し、その後、それと同じ量の滅菌滴定液をそのグループの残りのフラスコに添加することによって、治療グループごとにｐＨを調整した。必要な場合には、一定量の滅菌フルクトース溶液を発酵中に添加して、残留濃度を特定の範囲内で維持した。
【００６３】
【表５】
【００６４】
生産されたニューモカンジンの分析は、全ブイヨンの有機溶媒での抽出、その後の標準的逆相および順相手順を用いたクロマトグラフ分析によって行った。ニューモカンジンＢ_０の力価は、任意の「単位」として表す。構造類似体のレベルは、比率（生産されたニューモカンジンＢ_０の量の％）として表す。
【００６５】
アミノ酸の補充
発酵６日目またはほぼ６日目（すなわち、中間期）に、Ｌ−プロリン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トレオニン、セリン、アルギニン、オルニチンまたはグルタミンの無菌液をその発酵に添加して、適切な最終濃度を得た。ニューモカンジンの抽出および分析は、発酵の１４日後に行った。
【００６６】
基礎培地中のプロリン濃度を上昇させると（０〜１５ｇ／Ｌ）、結果的として化合物ＸおよびＸＩのレベルが用量に依存して低下したが、化合物ＶＩのレベルは、プロリン濃度の関数として上昇した（表３）。６日目またはほぼ６日目にこれらの治療グループ各々に１５ｇ／Ｌのプロリンを添加すると、結果として、各治療グループについて匹敵する力価をもたらしたが、培地中のプロリンの初期レベルの影響を相殺することはできなかった。
【００６７】
【表６】
【００６８】
ヒドロキシプロリンの中間期の添加は、発酵にも影響を及ぼす（表４）。ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを５ｇ／Ｌ添加すると、結果として、力価が５０％向上し、化合物Ｘ、ＶＩおよびＸＩのレベルが劇的に低下した。逆に、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを５ｇ／Ｌ添加すると、結果として、化合物Ｘのレベルが二倍になり、他の類似体またはニューモカンジンＢ_０の力価に対する影響が最小になった。
【００６９】
【表７】
【００７０】
Δ^１−プロリン−５−カルボキシレート（Ｐ５Ｃ）に代謝されうるグルタミン、アルギニンおよびオルニチンなどのアミノ酸も、ニューモカンジンＢ_０における３−ヒドロキシプロリンによって「占有された」位置に組み込まれる特異的アミノ酸によって定義される類似体に対して影響を有するように見受けられる（表５）。
【００７１】
【表８】
【００７２】
トレオニンまたはセリン５ｇ／Ｌを培地に補充すると、結果として、それぞれ、化合物ＩＶのレベルが完全に無くなるかまたは大きく上昇した（表６）。両方の場合において、化合物Ｉの力価は、３０％低下した。追加研究によって、１ｇ／Ｌのトレオニンは、化合物ＩＶを許容レベルで維持するには充分であるが、化合物Ｉの力価に対する影響は有さないことが判明した。
【００７３】
【表９】
【００７４】
微量元素の影響
幾つかの微量元素を化合物Ｉの力価および生産された構造類似体のスペクトルに対する影響について試験した。第一鉄塩と等しい濃度で添加した時、亜鉛塩、コバルト塩およびニッケル塩は、最も顕著な影響を有した（表７）。亜鉛は、化合物Ｉの力価を５０％低下させ、化合物ＶＩのレベルを二倍にした。コバルトは、化合物Ｉの力価を２５％低下させたが、化合物ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＶのレベルを上昇させた。ニッケルの添加は、化合物Ｉの力価に対して影響を有さなかったが、化合物Ｖのレベルを上昇させた。
【００７５】
【表１０】
【００７６】
オスモル濃度
この発酵では、残留フルクトース濃度を高濃度（＞７５ｇ／Ｌ）または低濃度（＜３０ｇ／Ｌ）で維持することによって、オスモル濃度を制御することができる。対照法における初期フルクトース濃度は１２５ｇ／Ｌであり、１４サイクルの間に５０ｇ／Ｌを２回添加することによって高濃度を維持する。あるいは、初期フルクトース濃度を４０ｇ／Ｌに低下させ、発酵の過程で２５ｇ／Ｌを数回添加して、低い残留糖レベルを維持することができる。「低」フルクトース法を行うと、化合物Ｉの力価が上昇するとともに、化合物Ｘのレベルが上昇する（表８）。化合物Ｘのレベル上昇は、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムなどの無機塩の添加によって相殺することができる。無機塩の添加は、低下したフルクトース濃度で行うことの影響を低下させる。これらの結果は、オスモル濃度がニューモカンジン合成において一定の役割を果たすことを示唆している。
【００７７】
【表１１】
【００７８】
要約すると、ニューモカンジンＢ_０のアミノ酸のヒドロキシル化パターンは、亜鉛、コバルトおよびニッケルの影響を受けやすい。加えて、生産培地へのアミノ酸の添加は、発酵によって生産されたニューモカンジンに直接的な影響を及ぼす。生産培地にプロリン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを補充することによって、ニューモカンジンＢ_０にｔｒａｎｓ−３またはｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン残基が組み込まれる。発酵にトレオニンを添加することによって、セリン類似体、化合物ＩＶのレベルが制御される。
【００７９】
従って、発酵に対するアミノ酸および微量元素の影響は、ニューモカンジンＢ_０（化合物Ｉ）の生体合成に影響を及ぼす因子に対する洞察をもたらすものであり、構造類似体のレベルを低下させ、ニューモカンジンＢ_０の力価を上昇させる改善された発酵法のために提供したものである。
【実施例２】
【００８０】
式Ｉの化合物の調製
パートＡ．ニューモカンジンＢ_０（１５．９ｇ、純型領域％８９％、水分３．４重量％、０．０１２８ｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（０．６４Ｌ）に添加し、その浮遊液を３Åモレキュラーシーブの床を通して還流させることによって水分１０ｍｏｌ％未満に乾燥させた。追加の乾燥ＴＨＦを添加して、混合物を元の容積に再構成し、氷／水／メタノール浴でその浮遊液を４℃未満に冷却した。ニートＢＨ_３ＳＭｅ_２（１０．９１ｇ、０．１４４ｇ）を１０分間かけて添加し、その反応混合物を、出発原料の生産物に対する比率が反応の終了を示す１：１になるまで（３．５時間）、ＨＰＬＣによってモニターした。４時間で、その混合物を−１２℃に冷却し、２ＮのＨＣｌ（０．０３６Ｌ）でゆっくりと反応を停止させた。この溶液を水で１．１４Ｌに希釈した。化合物ＩＩのアッセイ収量は、６．６０ｇ（４７％）であった。その反応停止溶液を水で４Ｌに希釈し、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐＲＰ−Ｃ１８吸着剤（１５８ｇ）の中圧カラムに充填した。充填後、カラムを１．２Ｌの水で洗浄し、そのアミンを１：４（容積／容積）のアセトニトリル／水１．９Ｌ、次いで１：３（容積／容積）のアセトニトリル／水０．３８Ｌで溶離した。そのリッチカット（＞８０領域％）を混合し、水で希釈して１：７．３（容積／容積）アセトニトリル／水（合計１．７Ｌ）にした。この混合物を上記のものと同じカラムに充填し、そのカラムを０．５７Ｌの水で洗浄した。所望の化合物を０．５７Ｌのメタノールで抽出した。そのリッチカット画分（＞８５領域％）を混合し、ロータリーエバポレータおよび静的高真空によって濃縮して、４３％の分離収率のために５．９２ｇの化合物２の塩酸塩を含有する６．８１ｇ（純型８７重量％、水分６．８重量％）を得た。部分^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ７．１２（ｄ，２Ｈ）、６．７５（ｄ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，１Ｈ）、４．９７（ｄ，１Ｈ）、１．１９（ｄ，３Ｈ）、０．８９（ｔ，３Ｈ）、０．８６（ｄ，６Ｈ）。質量スペクトル（ＦＡＢ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｌｉ）^＋：１０５８。
【００８１】
パートＢ．図式Ｉに示した化合物２（０．２２０ｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を１：１（容積／容積）アセトニトリル／水（８ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（０．０６０ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を添加し、その濁った混合物を室温で一晩攪拌した。午前中に追加のトリエチルアミン０．０６０ｍＬを添加し、混合物をさらに２時間攪拌した。ＨＰＬＣ分析（４５：５５（容積／容積）のアセトニトリル／水／０．１％のＴＦＡ、ＺｏｒｂａｘＣ１８、１．５ｍＬ／分）は、出発原料（ＲＲＴ４．８３分）より所望の生産物（ＲＲＴ５．６８分）のほうが優勢であることを示した。この反応混合物を０．５ｍＬの氷酢酸で酸性化し、真空下で濃縮した。分取ＨＰＬＣ（４２：５８（容積／容積）のアセトニトリル／水／０．１％のＴＦＡ、ＷａｔｅｒｓＤＥＬＴＡＰＡＫＣ−１８１９Ｘ３００ｍｍ、１２ｍＬ／分）による精製によって、式Ｉの化合物をヘミアミナール中心での二つの異性体の混合物として得た（ＨＰＬＣ分析による純度９８％）。部分^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ７．２０および７．１８（ｄ，２Ｈ）、６．７４（ｄ，２Ｈ）、５．３２および５．２７（ｄ，１Ｈ）。質量スペクトル（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋：１０５１．７。

Claims

真菌感染を治療するための方法であって、有効量の下記式Ｉ：
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な哺乳動物の患者に投与することを含む方法。
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与または経口投与される、請求項２に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与される、請求項３に記載の方法。
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、請求項４に記載の方法。
真菌感染を制御するための方法であって、有効量の下記式Ｉ
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な哺乳動物の患者に投与することを含む方法。
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与または経口投与される、請求項７に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与される、請求項８に記載の方法。
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、請求項９に記載の方法。
ニューモシスティス肺炎を制御する方法であって、有効量の下記式Ｉ：
の化合物またはその医薬適合性の塩を、そうした治療が必要な免疫構成患者に投与することを含む方法。
式Ｉの化合物が、医薬適合性の担体を伴う前記化合物の医薬組成物として投与される、請求項１１に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与または経口投与される、請求項１に記載の方法。
医薬組成物が、非経口投与される、請求項１に記載の方法。
医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、請求項１に記載の方法。
下記式Ｉ：
の化合物またはその医薬適合性の塩、ならびにアゾールまたはポリエン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤、キチン阻害剤、延長因子阻害剤、マンナン形成抗真菌剤、殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物、および複合糖質抗真菌剤から成る群より選択される第二抗真菌剤を含む、医薬組成物。
第二抗真菌剤が、アゾール：フルコナゾール、ボリコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ラブコナゾール、またはポサコナゾールである、請求項１６に記載の医薬組成物。
第二抗真菌剤が、ポリエン：アンフォテリシンＢ、ナイスタチンまたはそのリポソーム、ＡＢＥＬＣＥＴ、ＡＭＢＩＳＯＭＥもしくはＡＭＰＨＯＣＩＬである、請求項１６に記載の医薬組成物。
真菌感染を治療するための方法であって、有効量の、下記式Ｉ：
の化合物もしくはその医薬適合性の塩と、アゾールまたはポリエン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド阻害剤、キチン合成阻害剤、延長因子阻害剤、マンナン形成抗真菌剤、殺菌性／透過性誘発（ＢＰＩ）蛋白質産物、および複合糖質抗真菌剤から成る群より選択される第二抗真菌剤との組み合わせを、そうした治療が必要な哺乳動物患者に投与することを含む方法。
前記組み合わせの投与が、逐次、同時または並行投与である、請求項１９に記載の治療方法。
第二抗真菌剤が、アゾール：フルコナゾール、ボリコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ラブコナゾール、またはポサコナゾールである、請求項２０に記載の治療方法。
第二抗真菌剤が、ポリエン：アンフォテリシンＢ、ナイスタチンまたはそのリポソーム、ＡＢＥＬＣＥＴ、ＡＭＢＩＳＯＭＥまたはＡＭＰＨＯＣＩＬである、請求項２０に記載の治療方法。