JP2004519431A

JP2004519431A - Oncolytic virus

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Publication number: JP2004519431A
Application number: JP2002545626A
Authority: JP
Inventors: アールガーネットブラウン，; ジーンルタムヨムビサ，; ジョンキャメロンベル，; デイビッドフランシスストッジュル，
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・オタワ
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2004-07-02
Also published as: CA2430495A1; WO2002043647A3; WO2002050304A3; AU2002243257A1; AU2002220416A1; WO2002043647A2; EP1339736A2; WO2002050304A2

Abstract

腫瘍細胞の生存率を減少させ、哺乳動物中の新生物に感染させ、特定の天然に存在しないウイルスを使用する方法が、開示される。ウイルス再集合体（例えば、レオウイルス再集合体）およびＰＫＲ感受性ウイルスを同定するための技術もまた開示される。腫瘍細胞の生存率を減少させる方法であって、該方法は、該腫瘍細胞に、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含する。哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する。Methods for reducing the viability of tumor cells, infecting neoplasms in mammals, and using certain non-naturally occurring viruses are disclosed. Techniques for identifying virus reassortants (eg, reovirus reassortants) and PKR-susceptible viruses are also disclosed. A method of reducing the viability of a tumor cell, the method comprising administering to the tumor cell a non-naturally occurring virus. A method of infecting a neoplasm in a mammal with a virus, comprising administering to the mammal a non-naturally occurring virus.

Description

【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍細胞の生存率を減少させる方法、哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法、または哺乳動物中の新生物を処置する方法を提供し、この方法は、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含し、ここで、このウイルスは、以下：ａ）そのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルス；またはｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；またはｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、このレオウイルス以外のウイルスが、以下：ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そしてｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルス、またはネガティブセンス（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスである。本発明はさらに、腫瘍細胞の生存率の減少、哺乳動物中の新生物の感染、または哺乳動物中の新生物の処置のための医薬の製造における、このような天然に存在しないウイルスの使用を提供する。
【０００２】
本発明は、ＰＫＲ感受性ウイルスを同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）試験されるウイルスサンプルを、第一部分および第二部分に分割する工程；ｂ）ＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖を可能にする条件下で、ＰＫＲ＋／＋細胞をこの第一部分と接触させ、そしてＰＫＲ−／−細胞をこの第二部分と接触させる工程；ｃ）ＰＫＲ＋／＋細胞およびＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖速度を決定する工程；ならびにｄ）工程ｃ）の増殖速度を比較する工程であって、ここで、ＰＫＲ＋／＋細胞における増殖速度よりも高いＰＫＲ−／−細胞における増殖速度が、ウイルスをＰＫＲ感受性として同定する工程、を包含する。本発明に従って同定されたこのようなＰＫＲ感受性ウイルスは、腫瘍細胞の生存率の減少、哺乳動物中の新生物の感染、または哺乳動物中の新生物の処置のために有用である。
【０００３】
（発明の詳細な説明）
本出願を通じて、アミノ酸は、一般に、標準的な１文字の略号を使用して特定されるが、名前または標準的な３文字の略号によってもまた特定され得る。
【０００４】
Ｔ３Ｄ、Ｔ１Ｌ、Ｔ３ＡおよびＴ２Ｊは、それぞれ、レオウイルス株Ｔ３Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１Ｌａｎｇ、Ｔ３ＡｂｎｅｙおよびＴ２Ｊｏｎｅｓの標準的な略号である。上に列挙した株の名前およびそのそれぞれの略号は、交換可能に使用される。
【０００５】
本明細書中で使用される場合、「表現型」とは、ウイルスの発現されたタンパク質の配列をいう。レオウイルスの場合、発現されたタンパク質は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４遺伝子の遺伝子産物である。従って、これら遺伝子の産物のアミノ酸配列が２つの異なるレオウイルス株において同じである場合、これらの株は、同じ表現型を有すると言われる。
【０００６】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子型」とは、ウイルスのコード領域のヌクレオチド配列をいう。従って、例えば、２つのレオウイルスのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４遺伝子のヌクレオチド配列が２つの異なるレオウイルス株において同じである場合、これらの株は、同じ遺伝子型を有すると言われる。
【０００７】
用語「ＰＦＵ」は、プラーク形成単位を意味し、そして生きたウイルス粒子の定量的測定である。
【０００８】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の例としては、そのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスを利用する方法および使用が挙げられる。より特定の実施形態において、このレオウイルスｍｕ−２タンパク質は、例えば、このｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子の核酸配列を有する遺伝子によって発現される場合、レオウイルス株Ｔ３Ｄｅａｒｉｎｇのｍｕ−２タンパク質のアミノ酸配列を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、ｅｂ８６、ｅｂ１２９、ｅｂ８８、ｅｂ１３およびｅｂ１４５からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、およびその配列がレオウイルス株Ｔ１ＬａｎｇのＬ３遺伝子と同じであるＬ３遺伝子を有し、例えば、このウイルスは、ｅｂ２８、ｅｂ３１、ｅｂ９７、ｅｂ１２３およびｇ１６からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有し得る。なおより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、ｅｂ９６、ｅｂ１４６およびｅｂ１０８から選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。さらにより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子、Ｓ２遺伝子およびＳ４遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、レオウイルス株ｅｂ９６と同じ遺伝子型を有する。
【０００９】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の他の例としては、レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫であるウイルスを利用する方法および使用が挙げられる。例えば、再集合体は、レオウイルス株Ｔ３Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１Ｌａｎｇ、Ｔ３ＡｂｎｅｙおよびＴ２Ｊｏｎｅｓのうち２種、３種または４種から作製され得る。より特定の実施形態において、この再集合体は、親株Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇおよびＴ１Ｌａｎｇから生成される。このような株の例としては、ｅｂ１１８、ｅｂ７３．１、ｈ１７、ｈ１５、ｅｂ３９およびｈ６０、ならびに表１および２に示される他の株が挙げられる。
【００１０】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の他の例としては、レオウイルス以外のウイルスを利用する方法および使用が挙げられ、このレオウイルス以外のウイルスは、ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そしてｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科からなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである。適切なＤＮＡウイルスの例としては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルスまたは風疹ウイルスが挙げられる。適切なポジティブセンスＲＮＡウイルスの例としては、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルスまたはコロナウイルスが挙げられる。Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択される適切なネガティブセンスＲＮＡウイルスの例としては、インフルエンザウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスが挙げられる。
【００１１】
上記のような本発明のＰＫＲ感受性ウイルスを同定する方法に従って、任意のＰＫＲ＋／＋細胞およびＰＫＲ−／−細胞が使用され得、そしてウイルスの増殖速度は、ウイルス粒子の数を直接的に測定するか、またはウイルスタンパク質の量を測定する技術を含む、ウイルス増殖をモニタリングする任意の標準的な技術によって決定される。特定の実施形態において、このＰＫＲ細胞は、マウス胚線維芽細胞である。別の特定の実施形態において、ウイルスの増殖速度は、プラーク力価アッセイ、抗体アッセイおよびウエスタンブロットからなる群より選択される技術によって決定される。これら技術の各々は、以下に例示される。好ましくは、ＰＫＲ−／−細胞におけるウイルスの増殖速度は、ＰＫＲ＋／＋細胞における増殖速度よりも少なくとも１０倍速い。
【００１２】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の全てにおいて、このウイルスは、複製能のあるウイルスおよび／またはクローン性ウイルスであり得る。ウイルスは、鼻腔内、気管内、静脈内、腹腔内または腫瘍内が挙げられるがこれらに限定されない任意の従来の経路によって投与され得る。上記の腫瘍細胞の生存率を減少させる方法または使用に従って、このウイルスは、インビボまたはエキソビボのいずれかで、腫瘍細胞に投与され得る。ウイルスが哺乳動物に投与される場合、この哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌまたはウサギ）のいずれかであり得る。最適な量は、患者によっていくらか異なると予測されるが、熟練の臨床医によって容易に決定され得、３×１０^７〜３×１０^９ＰＦＵ／ｋｇの投薬量が代表的である。
【００１３】
本発明に従って利用されるウイルスは、任意の従来の手段（２以上の親ウイルス株間での再集合体化または標準的な組換え遺伝子技術の使用を含む）によって生成され得る。一旦生成されると、このようなウイルスは、子孫を生成するために細胞中で培養することによって、再産生され得る。ウイルスの再集合体の構築は、周知であり、例えば、Ｂｒｏｗｎら、「ＴｈｅＬ２ＧｅｎｅｏｆＲｅｏｖｉｒｕｓＳｅｒｏｔｙｐｅ３ＣｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅＣａｐａｃｉｔｙｔｏＩｎｔｅｒｆｅｒｅ，ＡｃｃｕｍｕｌａｔｅＤｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈＰｅｒｓｉｓｔｅｎｔＩｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｄｏｕｂｌｅ−ＳｔｒａｎｄｅｄＲＮＡＶｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏｍｐａｎｓら、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８３）に記載される。例えば、再集合体は、レオウイルス株Ｔ３Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１Ｌａｎｇ、Ｔ３ＡｂｎｅｙおよびＴ２Ｊｏｎｅｓのうちの２種、３種または４種から作製され得る。Ｔ３ＤｅａｒｉｎｇとＴ１Ｌａｎｇとの再集合体は、実施例２に記載される。好ましくは、このウイルスは、複製能のあるウイルスおよび／またはクローン性ウイルスである。
【００１４】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より良く理解される。これらの実施例は、本明細書中に記載される発明を例示するが、限定することを意図しない。
【００１５】
（実験）
（実験１：ＰＫＲノックアウト線維芽細胞および野生型繊維芽細胞におけるレオウイルス株Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの増殖）
（ウイルス増殖）
レオウイルス感染に対するＰＫＲの影響を、ＰＫＲノックアウト（ＰＫＲ−／−）マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して試験した。レオウイルスＴ１ＬおよびＴ３Ｄの両方は、プラークアッセイによって測定されるように、ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦと比較して、ＰＫＲ−／−ＭＥＦにおいて、数倍高い力価まで増殖した（図１）。このことは、以下に記載される蛍光抗体染色によって検出される抗原陽性細胞のより高い割合に関連した。このことと一致して、ＰＫＲ−／−ＭＥＦの感染は、以下に記載されるウエスタンブロットによってアッセイされるような、数倍高いウイルスタンパク質の量を生じた。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの両方は、ＰＫＲ遺伝子を欠く細胞においてより高い力価まで増殖したが、Ｔ１Ｌウイルスは、ＰＫＲ−／−細胞においてもＰＫＲ＋／＋細胞においても、Ｔ３Ｄよりも高い力価まで増殖した（図１）。
【００１６】
（間接的免疫染色）
細胞を、直径３５ｍｍのディッシュ中のカバーガラス上で増殖させ、そして１０の感染効率（ｍｏｉ）でレオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄに感染させた。４８時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中でリンスし、そして予め冷却したアセトン中で５分間固定した。ＰＢＳ中でのリンス（３×５分間）後、型特異的ウサギ抗ウイルス抗血清の適切な希釈物１００μｌを適用し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、カバーガラスをＰＢＳ中でリンスし（３×５分間）、そして二次抗体としてＣｙ３結合体化ロバ抗ウサギ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の適切な希釈物を用いて処理した。室温でもう３０分間インキュベートした後、このカバーガラスをＰＢＳ中でリンスし（３×５分間）、そしてスライドグラスをＧｅｌ／Ｍｏｕｎｔ（ＢｉｏｍｅｄａＣｏｒｐ）に載せた。全ての抗体希釈を、ＰＢＳ／３％ＢＳＡで行った。
【００１７】
サンプルを、エピ蛍光および４０×１．４０ＮＡＰｌａｎＡｐｏ対物レンズを備えるＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて試験した。画像を、ＩｍａｇｅＯｎｅＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアおよびＨａｍａｍａｔｓｕ冷却電荷結合デジタルカメラ（モデルＣ５９８５）を使用して収集した。デジタル画像の構成を、ＣｏｒｅｌＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して行った。
【００１８】
（イムノブロッティング）
ＭＥＦの単層培養物に、ｍｏｉ＝１０のＴ１ＬウイルスまたはＴ３Ｄウイルスを上記のように感染させた。種々の時点で、培養培地を取り出して、細胞をＰＢＳでリンスし、その後１ｍｌのサンプル緩衝液（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび５％２−メルカプトエタノール）（Ｌａｅｍｍｌｉ）中に可溶化した。２５μｌ容量のアリコートを、ＳＤＳＰＡＧＥに供し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に、２５Ｖにて４℃で一晩トランスブロットした。乾燥したメンブレンを、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）のスキムミルク粉末を用いて、室温で１時間ブロッキングした。その後、これに、新たなブロッキング溶液中の型特異的ウサギ抗レオウイルス免疫血清を一次抗体として添加し、そして４℃で２時間インキュベートした。次いで、このメンブレンを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてＴＢＳ（１００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９％ＮａＣｌ）中で１回洗浄して、リン酸塩を除去し、そしてアルカリホスファターゼ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、Ｏｎｔ）製）と結合体化した１μｇ／ｍｌのプロテインＡを含有する、ＴＢＳ中の５％ミルク中でインキュベートした。最後に、メンブレンを、ＴＢＳ中で４回洗浄し、その後、アルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２および１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））中で、発色基質（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（３３μｇ／ｍｌ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＩＣＰ）（３．３μｌ／ｍｌ））と反応させた。この反応を、２０ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳで停止させた。
【００１９】
（実験２：レオウイルスＴ１Ｌ株とＴ３Ｄ株との間の再集合体）
（レオウイルス血清型１Ｌａｎｇ株と血清型３Ｄｅａｒｉｎｇ株との間の遺伝的再集合体の生成）
マウスＬ９２９細胞に、各々５の感染効率でレオウイルス血清型１Ｌａｎｇ株（Ｔ１Ｌ）および血清型３Ｄｅａｒｉｎｇ株（Ｔ３Ｄ）を共感染させた。感染２４時間後に、３サイクルの凍結および解凍によってウイルスを収集し、その後、Ｌ９２９単層における２サイクルのプラーク単離によって子孫ウイルスを単離した。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの対応するゲノムセグメントの各々は、電気泳動の移動度により識別可能であるので、セグメント化した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ゲノムのポリアクリルアミドゲル電気泳動により各セグメントの移動度を親株と比較し、各ウイルスの遺伝子組成を決定した。Ｌａｅｍｍｌｉにより記載されたように調製したゲルは、１０％のポリアクリルアミドおよび０．２７％のメチレンビス−アクリルアミドを含んだ。二本鎖ＲＮＡを、３日間感染させたＬ９２９細胞から獲得し、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液に溶解し、そして以前（ＺｏｕＳ．およびＥ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ（１９９２）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｇｎａｌｓｆｏｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｏｖｉｒｕｓＭ１ｇｅｎｏｍｅｓｅｇｍｅｎｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８６：３７７−８８）に記載されたようにエチジウムブロマイドで染色したゲルにおいて検出した。この再集合体のパネルの使用は、Ｅ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｌ．Ｎｉｂｅｒｔ、およびＢ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（１９８３）ＴｈｅＬ２ｇｅｎｅｏｆｒｅｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅ３ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅｃａｐａｃｉｔｙｔｏｉｎｔｅｒｆｅｒｅ，ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｄｏｕｂｌｅ−ＳｔｒａｎｄｅｄＲＮＡＶｉｒｕｓｅｓ、Ｒ．Ｗ．ＣｏｍｐａｎｓおよびＤ．Ｈ．Ｌ．Ｂｉｓｈｏｐ編、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．によって、最初に記載された。
【００２０】
（レオウイルスの増殖）
Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、および上記の再集合手順由来のウイルスストックを、細胞変性効果が完全になるまで５％ウシ胎仔血清ならびにペニシリン（１００ユニット／ｍｌまで）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌまで）を補充したＥａｒｌ最小必須培地（ＭＥＭ）にて増殖させたＬ９２９細胞中で調製した。細胞および培養上清を、プラークアッセイにより滴定する前に、３サイクルの凍結および解凍に供した。
【００２１】
（マウス胚線維芽細胞における収率）
野生型ＰＫＲ＋／＋細胞を、Ｂａｌｂ−Ｃマウスから獲得し、ＰＫＲ−／−細胞を、ＰＫＲノックアウトマウスから獲得した。細胞培養物を、細断処理（ｍｉｎｃｉｎｇ）およびトリプシン処理により分解した１５〜１７日の胚を用いて生成した。細胞単層を、３７℃、５％ＣＯ_２環境で、１０％ＦＢＳおよびＰ／Ｓを補充したＭＥＭ中の３５ｍｍプラスチック皿にて増殖させた。１５分間隔で攪拌しながら０．５時間ストックウイルスを吸着させることにより、１０の感染効率（ｍｏｉ）で滴定したＴ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、または再集合レオウイルスを細胞に感染させた。吸着しなかったウイルスを、２ｍｌの温めたＰＢＳで３回洗浄することにより除去し、その後、５％のウシ胎仔血清ならびにペニシリン（１００ユニット／ｍｌまで）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌまで）を補充した３ｍｌのＭＥＭを添加した。Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄの収率を、４日間にわたる時点でアッセイし、これを図１に示す。再集合レオウイルスを感染させたＭＥＦ細胞からのウイルスの収率の比較を、二連の培養物のプラークアッセイにより３日間インキュベーションした後に実施した。これらの結果を、以下の表１（ＰＫＲ−／−）および表２（ＰＫＲ＋／＋）に示す。
【００２２】
（Ｌ９２９細胞におけるレオウイルスのプラークアッセイ）
Ｌ９２９細胞の単層培養物を培地からデカントし、ＰＢＳ中で、０．１ｍｌ容量の連続希釈したウイルスに感染させた（二連）。ウイルスを０．５時間吸着させ、その後、１％寒天、５％ＦＢＳ、およびＰ／Ｓを補充した３ｍｌのＭＥＭを適用した。培養物を３７℃にてインキュベートし、同一培地の２ｍｌアリコートの補助的な上乗せを、感染３日後および６日後に添加した。感染８日後、この単層を、プラークを観察するために、ニュートラルレッドを補充した（０．０１％重量／容量）２ｍｌの同一の上乗せ溶液で２４時間染色した。
【００２３】
（議論）
各細胞型におけるＴ１Ｌの増強した増殖能の遺伝的な基礎を、Ｔ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体を用いて決定した。野生型ＭＥＦ（ＰＫＲ＋／＋）における収率の差は、主にＭ１遺伝子と関連しなかったが、ＰＫＲ−／−ＭＥＦにおける収率の差は、Ｌ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子と関連し、Ｍ１遺伝子と関連しなかった。ＰＫＲ−／−ＭＥＦ細胞における複製に対するＰＫＲ＋／＋細胞における複製に関する遺伝的基礎の比較は、レオウイルス感染を阻害するＰＫＲ遺伝子の能力が、Ｍ１遺伝子の特性に依存することを示す。さらに、複製の程度（つまり、ＰＫＲ−／−細胞の搾取（ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ））は、Ｌ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子の性質に依存する。従って、ＰＫＲ−／−細胞においてＰＫＲ＋／＋細胞よりも最も大きな複製能の差を有する再集合ウイルスは、Ｔ３ＤＭ１遺伝子を有し、ＰＫＲ−／−細胞（多くの腫瘍細胞の特徴）における最も大きな複製能を有するウイルスは、Ｔ１ＬのＬ１、Ｌ３、Ｍ３、およびＳ２遺伝子を有する。このようなウイルスは、ＰＫＲ＋／＋細胞の複製において制限されるが、ＰＫＲ−／−細胞においてＴ１ＬまたはＴ３Ｄのいずれよりも大きな程度で複製し、再集合体ｅｂ９６およびｅｂ１０８の特性を具体化する。実験結果の統計的分析を、表１、２、および３に示す
Ｔ１Ｌｍｕ２タンパク質およびＴ３Ｄｍｕ２タンパク質のアミノ酸配列を表４に示す。各タンパク質は７３６アミノ酸長であり、１０アミノ酸位で異なる。ＰＫＲ−／−ＭＥＦ細胞に対するＰＫＲ＋／＋細胞における複製能として見られるＰＫＲに対する感受性の観察される差は、これらのタンパク質間のアミノ酸配列の差に起因し、従って、これらの位置でこれらのアミノ酸変化または他の置換を有するレオウイルスのＭ１タンパク質を、本明細書中に記載する。ｍｕ２タンパク質は、Ｍ１遺伝子によりコードされる。Ｔ１ＬＭ１遺伝子およびＴ３ＤＭ１遺伝子のヌクレオチド配列を、表５に示す。各ゲノムセグメントは２３０４ヌクレオチド長であり、５１ヌクレオチド位で異なる。
（表１：ＰＫＲ−／−）
【００２４】
【表１】

（表２：ＰＫＲ＋／＋（野生型））
【００２５】
【表２】

表１および表２において、ゲノムセグメントの親起源を、Ｌ（Ｔ１Ｌ）またはＤ（Ｔ３Ｄ）により示す。統計的な有意性を、ｔ−試験およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（ＭＷ）試験を用いて決定した。
（表３：ＰＫＲに対する感受性は、Ｍ１遺伝子と関連しない）
【００２６】
【表３】

（表４：Ｔ１Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ４２５７０．１）ｍｕ２タンパク質とＴ３Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ４７２５６．１）ｍｕ２タンパク質とのアラインメント。これらのアミノ酸配列を、ｃＤＮＡから推定した。各タンパク質は７３６ヌクレオチド長であり、１０アミノ酸位で異なる。）
【００２７】
【表４】

（表５：ｍｕ−２タンパク質をコードするＴ１Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５９９４５．１）およびＴ３Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２７２６１．１）Ｍ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列のアラインメント。完全なコード配列を示す。レオウイルスは、二本鎖ＲＮＡウイルスなので、レオウイルスゲノムは「ｔ」の代わりに「ｕ」を含む。以下に示す各ゲノムセグメントは２３０４ヌクレオチド長であり、５１ヌクレオチド位で異なる。）
【００２８】
【表５】

（実験３：ＰＫＲ−／−マウス対ＰＫＲ＋／＋マウスにおける致死感染の評価）
成体Ｂａｌｂ−ＣＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスに、種々の用量の感染性レオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄを、腹腔内（ＩＰ）経路または鼻腔内（ＩＮ）経路を通じて感染させた。ＩＰ注入は、０．１ｍｌのストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの投与を含んだ。ＩＮ感染は、ハロタン（酸素中３％で投与した）で麻酔したマウスの鼻パッドに対する、０．０５ｍｌのストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの適用を含んだ。成体マウスの生存率を、３０日間にわたりモニターした。成体ＰＫＲ＋／＋マウスおよびＰＫＲ−／−マウスは、５ｅ６感染性Ｔ３Ｄウイルスの感染に抵抗性であったのに対し、Ｔ１Ｌウイルスは、この用量でＰＫＲ−／−マウスを殺傷したが、ＰＫＲ＋／＋マウスは殺傷しなかった。このことは、ＰＫＲ−／−マウスの組織へのＴ１Ｌの感染能が増強されたことを実証する（表５）。
【００２９】
２日齢の離乳前のＢａｌｂ−ＣＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスに、種々の用量の感染性レオウイルスＴ１ＬまたはＴ３Ｄを、ＩＮ経路を通じて感染させた。ＩＮ感染は、ハロタン（酸素中３％で投与した）で麻酔したマウスの鼻パッドに対する、０．０１ｍｌ容量のストックウイルスまたはＰＢＳで希釈したウイルスの適用を含んだ。離乳前のマウスの生存率を、１８日間にわたりモニターした。離乳前のＰＫＲ＋／＋マウスまたはＰＫＲ−／−マウスは両方とも、類似用量のＴ１Ｌに対して感受性であったのに対し、Ｔ３Ｄウイルスは、ＰＫＲ＋／＋マウスよりもずっと効果的に（野生型の離乳前のマウスを殺傷するのに必要とされる用量よりも１００倍以上少ない用量で）ＰＫＲ−／−マウスを殺傷した。このことは、離乳前のマウスのＰＫＲ−／−組織に対するＴ３Ｄの感染能が増強されたことを実証し、このことは、両方のウイルスは異なる年齢（成体対離乳前）のＰＫＲ＋／＋マウスの複製においてより制限されたが、ＰＫＲ＋／＋マウス対ＰＫＲ−／−マウスにおける示差的な複製に関するＴ１Ｌ株とＴ３Ｄ株との特性の差を示す（表５）。
【００３０】
（表５）
【００３１】
【表６】

（実験４：レオウイルスＴ３Ｄは、Ｔ１Ｌよりも強力なＰＫＲＭＥＦのインデューサーである）
ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦの感染により、リン酸化形態のＰＫＲがより多く発現する（図２）。ＰＫＲ＋／＋ＭＥＦに、１０のｍｏｉで感染させ、そしてイムノブロット分析のために、ＰＫＲの最初の１００アミノ酸と反応するウサギ抗ＰＫＲ血清を用いて、４８時間インキュベートした。タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＩＭＭＯＢＩＬＯＮメンブレン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｎｃ．）に移した後、カゼインの存在下で１／１００希釈した一次抗体と共にインキュベートした。繰り返し洗浄した後、このブロットを、アルカリホスファターゼ（１／３０，０００希釈）（ＳｉｇｍａＩｎｃ）に結合したヤギ抗ウサギ抗体と共に、１時間インキュベートし、その後、繰り返し洗浄し、図２に示すリン光検出のためにＡｔｔｏｐｈｏｓ基質と反応させた。ＰＫＲの活性化は、わずかに遅い移動度の電気泳動形態を生じる（ＰＫＲ−Ｐとして示す）。Ｔ３Ｄによる感染は、Ｔ１Ｌによる感染よりも多く、この形態を生じる。このことは、ＰＫＲ発現が、Ｔ３Ｄ感染細胞において増強されることを実証し、このことが、ＰＫＲ遺伝子に対するこの遺伝子のより大きな感受性に起因し得ることを示す。
【００３２】
（実験５：レオウイルスＴ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体の改善された腫瘍溶解の原理の解明：Ｔ３ＤのＭ１遺伝子ならびにＴ１ＬおよびＴ３Ｄからの残りの遺伝子を有するレオウイルス再集合体は、優れた腫瘍溶解特性を有することの実証）
３つの再集合体を、それらの親ウイルスに関する腫瘍溶解特性の試験のために選択した。再集合体、ＥＢ９６、ＥＢ１０８、およびＥＢ１４６の各々は、Ｔ３ＤのＭ１遺伝子を有し、それらの感染応答において損傷を受けた細胞において優先的に複製することが期待された。これらの再集合体はまた、最適な複製能を提供することが予測されるＴ１ＬのＬ１、Ｌ３、およびＳ２遺伝子を有した。
【００３３】
腫瘍溶解試験を、Ｂａｌｂ−Ｃ起源のＣＴ２６結腸腫瘍細胞株由来の肺腫瘍を有するマウスへの、１０^７ｐｆｕの各ウイルスの鼻腔内感染により実施した。実験０日目に、３×１０^５のＣＴ２６を、成体雌ＢＬＡＢ−Ｃマウス（４〜６週齢）の尾静脈に注入した。７日目に、３匹のマウスからなる群を麻酔し、０．０５０容量の培養培地中で１０^７ｐｆｕのウイルスで感染させた。マウスを、さらに６日間飼育した後、９０％ＣＯ_２／１０％Ｏ_２で安楽死させた。肺を取り出し、重量を測定し、ホルマリン中で固定し、そして写真を撮影した。１つのセットの肺を、パラフィンで包埋し、薄切した後に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により組織学的に試験した。
【００３４】
処理後の肺の全体的な外観は、未処理のコントロール肺が、継続的な腫瘍小節に起因する石目模様の表面外観を有する重度の腫瘍を有した（図３）。これらの動物は癌の最終段階にあった。なぜならば、１匹の動物はこの時点で死亡し、他の動物は呼吸窮迫症であったからである。これらの肺は、未感染のｂａｌｂ−ｃ肺よりも３倍重度であり、このことは、増加した腫瘍質量が肺組織の質量の２倍と該算されることを示す（図４）。組織学的に、これらの肺は、腫瘍小節の連続層で覆われており、内部腫瘍塊は、細胞のエオシン好性の成長として観察された（図４および５）。Ｔ１Ｌウイルスによる感染は、全体的な検査で観察可能な表面腫瘍の成長の部分的な休止（ｆｒｅｅｉｎｇ）を引き起こし、これはまた、未処理コントロールに対する、内部および表面の小節の減少ならびに肺重量の２０％の減少と関連した（図３、４、および５）。Ｔ３Ｄ処理は、Ｔ１Ｌ処理ほど効果的ではなく、肺は、大きさがわずかな減少（８％）によってのみ未処理コントロールから識別可能であるが、腫瘍の全体的外観および顕微的外観は類似した（図３、４、および５）。
【００３５】
非常に対照的に、ＥＢ９６再集合ウイルスは、処置によって肺の全体の腫瘍塊を浄化した（図３）。この肺は、腫瘍塊を含まないほぼ正常な重量を有した（図４）。組織学的検査により検出されたように、少数の残留性の腫瘍細胞がこの時点で残留していた（図５）。この肺は、正常の大きさおよび外観（いくつかの環状のパターンおよび肺表面のへこみ（以前の腫瘍小節の位置を示すと思われる）を除く）であった。ＦＢ１４６ウイルスは、Ｔ３Ｄ親ウイルスよりも腫瘍溶解においてより効果的でなかった（図３、４、および５）。再集合体ＥＢ１０８は、腫瘍溶解に部分的に効果的であり、Ｔ１Ｌ親株よりもわずかに良好であるが類似する結果をもたらした。再集合体の遺伝子型の比較において、３つの再集合体が、７つのゲノムセグメントを共通して有し、従って、それらのＬ２、Ｓ３、およびＳ４ゲノムセグメントにおいて異なることが観察され得、このことは、遺伝子の後者の群が、腫瘍溶解の重要なモジュレーターを含むことを示す。ＥＢ９６再集合体は、Ｓ４遺伝子の性質に起因してＥＢ１０８単独よりも効果的である。なぜならば、これらのウイルスは、この遺伝子の親起源においてのみ異なるからである。このことは、Ｔ１ＬＳ４遺伝子が、Ｔ３ＤＳ４遺伝子よりも増強された腫瘍溶解特性を与えることを示す。Ｓ４遺伝子は、ＰＫＲの活性化をブロックするｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードするので、Ｔ１ＬＳ４遺伝子は、この能力において異なり、従って、Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄゲノムセグメントの他の組み合わせと強調して、腫瘍溶解能力を制御し得る。結論として、親Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄウイルスと比較しての、腫瘍溶解におけるＥＢ９６再集合体の効果の劇的な増大は、特定の遺伝子型を有するレオウイルスの再集合体が、活性な免疫応答を有する宿主の転移性腫瘍における、増強された、効果的な腫瘍溶解能力を有するという原理の証明を実証する（表６）。
【００３６】
（表６：レオウイルス再集合体が、ｃｔ２６肺腫瘍を溶解する能力のランク付け。未処置のコントロール腫瘍保有肺に対する、ｃｔ２６腫瘍保有肺の相対的重量を示す。ゲノムセグメントの親の起源を、Ｔ１ＬについてはＬで、そしてＴ３ＤについてはＤで示す。）
【００３７】
【表７】

（実験６：Ｔ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体が、インビトロで腫瘍を溶解する能力）
ＮＣＩ腫瘍パネル（ＳＦ５３９、ｃｎｓ；ＳＫＭＥＬ２８、黒色腫；ＨＴ２９；ＮＣＩＨ２３、ｎｓｃ−肺；ＳＷ６２０、結腸；ＤＵ１４５、前立腺）から得た腫瘍細胞株のパネルに、１０の感染効率で、Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄまたはその再集合体、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を感染させ、細胞病理学的効果について、５日間にわたって観察した。腫瘍細胞を溶解する能力を、−〜＋＋＋の段階で視覚的にスコアした。−は、モック感染細胞との差異が存在しないことを示し、そして＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ、３３％の細胞破壊、６６％の細胞破壊および完全な溶解を示す。異なる腫瘍細胞型は、異なるレオウイルス親株または再集合体による溶解に対する感受性が異なったが、再集合体ウイルスは、全て、インビトロの腫瘍細胞溶解においてＴ３Ｄ親ウイルス同様に有効か、またはＴ３Ｄ親ウイルスよりも有効であった（表７）。
【００３８】
（表７：異なる腫瘍細胞株における、レオウイルスＴ１ＬおよびＴ３Ｄならびに再集合体の細胞病理学）
【００３９】
【表８】

【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＰＫＲ−／− 対ＰＫＲ＋／＋のマウス胚線維芽細胞における、レオウイルス株Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄのウイルス収率。
【図２】ＲｅｏＴ１ＬおよびＴ３Ｄを感染させたＭＥＦにおけるＰＫＲのイムノブロット。
【図３】レオウイルス株での処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を、未処理のコントロール肺と比較する。２匹のマウス由来の肺を、各処理について示す。
【図４】ＢＡＬＢ−Ｃマウス肺の重量を、ＣＴ２６腫瘍およびレオウイルス処理の存在と比較する。
【図５】レオウイルス株処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺葉を示す、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織学的切片。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６、ＥＢ１０８およびＥＢ１４６を、未処理のコントロール肺と比較する。DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0001]
(Summary of the Invention)
The present invention provides a method of reducing tumor cell viability, infecting a neoplasm in a mammal with a virus, or treating a neoplasm in a mammal, wherein the method is not naturally occurring. Administering the virus, wherein the virus comprises the following: a) the mu-2 protein is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458; , At positions 652 and 726, respectively, a reovirus having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S; or b) of a virus species selected from the family Reoviridae. A reassortant of two or more parent strains or progeny thereof; or c) a virus other than a reovirus, wherein the virus other than the reovirus is: i) position 93, position 150, 300 At positions 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S A viral mu-2 protein, and ii) a DNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae, a positive-sense RNA virus, or a negative-sense RNA-sense virus. . The invention further relates to the use of such non-naturally occurring viruses in the manufacture of a medicament for reducing the viability of tumor cells, infecting a neoplasm in a mammal, or treating a neoplasm in a mammal. provide.
[0002]
The present invention provides a method for identifying a PKR-susceptible virus, the method comprising the following steps: a) dividing the virus sample to be tested into a first part and a second part; b) PKR − / − cells Contacting the PKR + / + cells with the first portion and the PKR − / − cells with the second portion under conditions that allow for the growth of the virus in c); c) PKR + / + cells and PKR − / -Determining the growth rate of the virus in the cells; and d) comparing the growth rate in step c), wherein the growth rate in the PKR-/-cells is higher than the growth rate in the PKR + / + cells. Identifying the virus as PKR susceptible. Such PKR-sensitive viruses identified according to the present invention are useful for reducing tumor cell viability, infecting neoplasms in mammals, or treating neoplasms in mammals.
[0003]
(Detailed description of the invention)
Throughout this application, amino acids are generally identified using standard one-letter abbreviations, but may also be identified by name or standard three-letter abbreviations.
[0004]
T3D, T1L, T3A and T2J are the standard abbreviations for the reovirus strains T3 Dearing, T1 Lang, T3 Abney and T2 Jones, respectively. The names of the strains listed above and their respective abbreviations are used interchangeably.
[0005]
As used herein, "phenotype" refers to the sequence of the expressed protein of the virus. In the case of reovirus, the expressed protein is the gene product of the L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3 and S4 genes. Thus, if the amino acid sequences of the products of these genes are the same in two different reovirus strains, the strains are said to have the same phenotype.
[0006]
As used herein, "genotype" refers to the nucleotide sequence of the coding region of a virus. Thus, for example, if the nucleotide sequences of the L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3 and S4 genes of two reoviruses are the same in two different reovirus strains, then these strains are: It is said to have the same genotype.
[0007]
The term "PFU" refers to plaque forming units and is a quantitative measure of live virus particles.
[0008]
Examples of anti-neoplastic and anti-tumor methods, and the use of the invention described above, include that the mu-2 protein is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458. At positions 652 and 726, methods and uses utilizing reoviruses having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S, respectively, are included. In a more specific embodiment, the reovirus mu-2 protein is expressed, for example, when the mu-2 protein is expressed by a gene having the nucleic acid sequence of the M1 gene of the reovirus strain T3 Deering. Has the amino acid sequence of the mu-2 protein. In a more specific embodiment, the reovirus has the same genotype as a reovirus strain selected from the group consisting of eb86, eb129, eb88, eb13, and eb145. In a more specific embodiment, the reovirus has an M1 gene whose sequence is the same as the M1 gene of reovirus strain T3 Deering, and an L3 gene whose sequence is the same as the L3 gene of reovirus strain T1 Lang. For example, the virus may have the same genotype as a reovirus strain selected from the group consisting of eb28, eb31, eb97, eb123 and g16. In an even more particular embodiment, the reovirus has a M1 gene whose sequence is the same as the M1 gene of reovirus strain T3 Dearing, as well as an L3 gene whose sequence is the same as the corresponding gene of reovirus strain T1 Lang. , L1 and S2 genes, for example, the reovirus has the same genotype as a reovirus strain selected from eb96, eb146 and eb108. In an even more particular embodiment, the reovirus has a M1 gene whose sequence is the same as the M1 gene of reovirus strain T3 Deering, as well as an L3 gene whose sequence is the same as the corresponding gene of reovirus strain T1 Lang. , L1 gene, S2 gene and S4 gene, for example, this reovirus has the same genotype as reovirus strain eb96.
[0009]
Anti-neoplastic and anti-tumor methods, and other examples of the use of the invention described above, utilize viruses that are reassortants or progeny of two or more parent strains of a viral species selected from the reoviridae family. Methods and uses. For example, reassortants can be made from two, three or four of the reovirus strains T3 Dearing, T1 Lang, T3 Abney and T2 Jones. In a more specific embodiment, the reassortant is generated from parent strains T3 Deering and T1 Lang. Examples of such strains include eb118, eb73.1, h17, h15, eb39 and h60, and other strains shown in Tables 1 and 2.
[0010]
Other examples of anti-neoplastic and anti-tumor methods, as well as the uses of the present invention described above, include methods and uses utilizing viruses other than reoviruses, wherein the non-reovirus is i) position 93 At positions 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, A reovirus mu-2 protein having I and S, and ii) a DNA virus, a positive sense RNA virus, or a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae. Examples of suitable DNA viruses include herpes virus, adenovirus, parvovirus, papovavirus, iridovirus, hepadnavirus, poxvirus, mumps virus, human parainfluenza virus, measles virus or rubella virus. Can be Examples of suitable positive sense RNA viruses include togavirus, flavivirus, picornavirus or coronavirus. Examples of suitable negative sense RNA viruses selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae include influenza virus or vesicular stomatitis virus.
[0011]
According to the method of identifying a PKR-sensitive virus of the present invention as described above, any PKR + / + and PKR − / − cells can be used, and the growth rate of the virus directly measures the number of virus particles. Or as determined by any standard technique for monitoring virus growth, including techniques for measuring viral protein levels. In certain embodiments, the PKR cells are mouse embryonic fibroblasts. In another specific embodiment, the growth rate of the virus is determined by a technique selected from the group consisting of a plaque titer assay, an antibody assay and a Western blot. Each of these techniques is exemplified below. Preferably, the growth rate of the virus in PKR − / − cells is at least 10 times faster than in PKR + / + cells.
[0012]
In anti-neoplastic and anti-tumor methods, and all of the uses of the invention described above, the virus can be a replication competent virus and / or a clonal virus. The virus can be administered by any conventional route, including, but not limited to, intranasally, intratracheally, intravenously, intraperitoneally or intratumorally. In accordance with the methods or uses for reducing the viability of tumor cells described above, the virus can be administered to tumor cells either in vivo or ex vivo. When the virus is administered to a mammal, the mammal can be either a human or a non-human mammal, such as a mouse, sheep, cow, pig, dog or rabbit. The optimal amount is expected to vary somewhat from patient to patient, but can easily be determined by a skilled clinician and ⁷ ~ 3 × 10 ⁹ A dosage of PFU / kg is typical.
[0013]
The viruses utilized in accordance with the present invention can be produced by any conventional means, including reassortment between two or more parental virus strains or using standard recombinant genetic techniques. Once produced, such viruses can be reproduced by culturing in cells to produce progeny. The construction of reassortants of viruses is well known and is described, for example, in Brown et al., "The L2 Gene of Reovirus Sereotype 3 Controls the Capability to Interfere", Accurate Deletion of the Diseases and the Essence of the Essence. , Elsevier (1983). For example, reassortants can be made from two, three or four of the reovirus strains T3 Dearing, T1 Lang, T3 Abney and T2 Jones. A reassembly of T3 Dearing and T1 Lang is described in Example 2. Preferably, the virus is a replication competent virus and / or a clonal virus.
[0014]
The invention will be better understood by reference to the following examples. These examples illustrate, but are not intended to limit, the invention described herein.
[0015]
(Experiment)
(Experiment 1: Proliferation of reovirus strains T1L and T3D in PKR knockout fibroblasts and wild-type fibroblasts)
(Virus multiplication)
The effect of PKR on reovirus infection was tested using PKR knockout (PKR-/-) mouse embryonic fibroblasts (MEF). Both reoviruses T1L and T3D grew to several fold higher titers in PKR − / − MEF as compared to PKR + / + MEF as measured by plaque assay (FIG. 1). This was associated with a higher percentage of antigen positive cells detected by the fluorescent antibody staining described below. Consistent with this, infection with PKR-/-MEF resulted in several times higher amounts of viral protein as assayed by Western blot as described below. While both T1L and T3D grew to higher titers in cells lacking the PKR gene, T1L virus grew to higher titers than T3D in both PKR − / − and PKR + / + cells ( (Fig. 1).
[0016]
(Indirect immunostaining)
Cells were grown on coverslips in 35 mm diameter dishes and infected with reovirus T1L or T3D at a multiplicity of infection (moi) of 10. After a 48-hour incubation, cells were rinsed in PBS and fixed in pre-chilled acetone for 5 minutes. After rinsing in PBS (3 × 5 minutes), 100 μl of the appropriate dilution of type-specific rabbit antiviral antiserum was applied and incubated for 30 minutes at room temperature. The coverslips were then rinsed in PBS (3 × 5 minutes) and treated with an appropriate dilution of Cy3-conjugated donkey anti-rabbit antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) as a secondary antibody. After another 30 minutes incubation at room temperature, the coverslips were rinsed in PBS (3 × 5 minutes) and the slides were mounted on Gel / Mount (Biomeda Corp). All antibody dilutions were performed in PBS / 3% BSA.
[0017]
The samples were examined using a Zeiss microscope equipped with epifluorescence and a 40 × 1.40NA PlanApo objective. Images were collected using Image One Metamorph software and a Hamamatsu cooled charge-coupled digital camera (model C5985). Digital image construction was performed using Corel Presentations software.
[0018]
(Immunoblotting)
Monolayer cultures of MEF were infected with moi = 10 T1L or T3D virus as described above. At various time points, the culture medium is removed, the cells are rinsed with PBS, then 1 ml of sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 0.05% bromo. Phenol blue and 5% 2-mercaptoethanol) (Laemmli). Aliquots of 25 μl volume were subjected to SDS PAGE and transblotted onto Immobilon P membrane (Millipore) at 25 V at 4 ° C. overnight. The dried membrane was blocked with 5% (w / v) skim milk powder in PBS for 1 hour at room temperature. This was followed by the addition of type-specific rabbit anti-reovirus immune serum in fresh blocking solution as primary antibody and incubation at 4 ° C. for 2 hours. The membrane is then washed three times in PBS and once in TBS (100 mM Tris HCl (pH 7.4), 0.9% NaCl) to remove phosphate and remove alkaline phosphatase. Incubated in 5% milk in TBS containing 1 μg / ml Protein A conjugated with (Sigma Chemicals (Oakville, Ont)). Finally, the membrane is washed four times in TBS, then alkaline phosphatase buffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ Chromogenic substrate (nitroblue tetrazolium (NBT) (33 μg / ml) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BICP) (3.3 μl / ml) in 100 mM Tris-HCl (pH 9.5)). ml)). The reaction was stopped with PBS containing 20 mM EDTA.
[0019]
(Experiment 2: Reassembly between reovirus T1L and T3D strains)
(Generation of genetic reassortants between reovirus serotype 1Lang strain and serotype 3Dearing strain)
Mouse L929 cells were co-infected with reovirus serotype 1Lang strain (T1L) and serotype 3Dearing strain (T3D) at an infection efficiency of 5 each. Twenty-four hours after infection, virus was harvested by three cycles of freezing and thawing, and then progeny virus was isolated by two cycles of plaque isolation in L929 monolayer. Since each of the corresponding genomic segments of T1L and T3D can be identified by electrophoretic mobility, the mobility of each segment is compared with that of the parent strain by polyacrylamide gel electrophoresis of the segmented double-stranded RNA (dsRNA) genome. By comparison, the gene composition of each virus was determined. Gels prepared as described by Laemmli contained 10% polyacrylamide and 0.27% methylene bis-acrylamide. Double-stranded RNA was obtained from L929 cells infected for 3 days, dissolved in a buffer containing sodium dodecyl sulfate, and previously described (Zou S. and EG Brown (1992) Identification of Sequence elements containing signals). for replication and encapsidation of the reovirus M1 genome segment, Virology 186: 377-88) was detected in the gel stained with ethidium bromide. The use of this reassembly panel is described in E.I. G. FIG. Brown, M .; L. Nibert, and B.A. N. Fields (1983) The L2 gene of reovirous serotype 3 controls the capacity to interfere, accumulate dele tions and establishment introductory infactance infactance infection W. Compans and D.M. H. L. Ed. Bishop, Elsevier Science Publishing Co. First described by
[0020]
(Propagation of reovirus)
T1L, T3D, and virus stocks from the reassembly procedure described above were combined with Earl supplemented with 5% fetal calf serum and penicillin (up to 100 units / ml) and streptomycin (up to 100 ug / ml) until the cytopathic effect was complete. Prepared in L929 cells grown in minimal essential medium (MEM). Cells and culture supernatant were subjected to three cycles of freezing and thawing before titration by plaque assay.
[0021]
(Yield in mouse embryo fibroblasts)
Wild-type PKR + / + cells were obtained from Balb-C mice and PKR − / − cells were obtained from PKR knockout mice. Cell cultures were generated using 15-17 day embryos degraded by mincing and trypsinization. Cell monolayers are grown at 37 ° C., 5% CO 2 ₂ Grow in a 35 mm plastic dish in MEM supplemented with 10% FBS and P / S in the environment. Cells were infected with T1L, T3D, or reassorted reovirus titered at a multiplicity of infection (moi) of 10 by adsorbing the stock virus for 0.5 hour with stirring at 15 minute intervals. Unadsorbed virus was removed by washing three times with 2 ml of warm PBS, followed by supplementation with 5% fetal calf serum and penicillin (up to 100 units / ml) and streptomycin (up to 100 ug / ml). 3 ml of MEM was added. The yields of T1L and T3D were assayed over a period of 4 days and are shown in FIG. Comparison of virus yield from MEF cells infected with reassorted reovirus was performed after 3 days of incubation by duplicate culture plaque assay. The results are shown in Table 1 (PKR − / −) and Table 2 (PKR + / +) below.
[0022]
(Reovirus plaque assay in L929 cells)
Monolayer cultures of L929 cells were decanted from the medium and infected with a 0.1 ml volume of serially diluted virus in PBS (duplicate). The virus was allowed to adsorb for 0.5 hour, after which 3 ml of MEM supplemented with 1% agar, 5% FBS and P / S was applied. Cultures were incubated at 37 ° C. and supplemental overlays of 2 ml aliquots of the same medium were added 3 and 6 days post infection. Eight days after infection, the monolayer was stained with 2 ml of the same overlay solution supplemented with neutral red (0.01% w / v) for plaques for 24 hours.
[0023]
(Discussion)
The genetic basis of the enhanced proliferative potential of T1L in each cell type was determined using T1L × T3D reassortants. Yield differences in wild-type MEF (PKR + / +) were not primarily associated with the M1 gene, while yield differences in PKR − / − MEF were associated with the L1, L3, M3, and S2 genes. , M1 gene. Comparison of the genetic basis for replication in PKR + / + cells versus replication in PKR − / − MEF cells indicates that the ability of the PKR gene to inhibit reovirus infection depends on the properties of the M1 gene. Furthermore, the degree of replication (ie, the exploitation of PKR − / − cells) depends on the nature of the L1, L3, M3, and S2 genes. Thus, the reassortant virus with the greatest replication potential difference in PKR − / − cells than PKR + / + cells has the T3D M1 gene and is the largest in PKR − / − cells (a characteristic of many tumor cells). The replication competent virus has the T1, L2, L3, M3, and S2 genes. Such viruses are restricted in the replication of PKR + / + cells but replicate to a greater extent in PKR − / − cells than either T1L or T3D, embodying the properties of reassortants eb96 and eb108. Statistical analysis of the experimental results is shown in Tables 1, 2 and 3.
Table 4 shows the amino acid sequences of the T1L mu2 protein and the T3D mu2 protein. Each protein is 736 amino acids long and differs by about 10 amino acids. The observed difference in sensitivity to PKR, seen as the ability to replicate in PKR + / + cells versus PKR − / − MEF cells, is due to differences in amino acid sequence between these proteins and, therefore, these amino acid changes at these positions. Or, the M1 protein of a reovirus with other substitutions is described herein. The mu2 protein is encoded by the M1 gene. The nucleotide sequences of the T1L M1 and T3D M1 genes are shown in Table 5. Each genome segment is 2304 nucleotides long and differs at the 51 nucleotide position.
(Table 1: PKR-/-)
[0024]
[Table 1]

(Table 2: PKR + / + (wild type))
[0025]
[Table 2]

In Tables 1 and 2, the parental origin of the genomic segment is indicated by L (T1L) or D (T3D). Statistical significance was determined using the t-test and the Mann-Whitney (MW) test.
(Table 3: Sensitivity to PKR is not associated with the M1 gene)
[0026]
[Table 3]

Table 4: Alignment of the T1L (GenBank Accession No. CAA42570.1) mu2 protein with the T3D (GenBank Accession No. AAA47256.1) mu2 protein The amino acid sequence of these was deduced from cDNA, each protein being 736 nucleotides long. , Differs at the 10 amino acid position.)
[0027]
[Table 4]

(Table 5: Alignment of the nucleotide sequence of the T1L (GenBank Accession No. X599455.1) and T3D (GenBank Accession No. M27261.1) M1 cDNAs encoding the mu-2 protein. The complete coding sequence is shown. (Because it is a single-stranded RNA virus, the reovirus genome contains "u" instead of "t." Each genomic segment shown below is 2304 nucleotides long and differs at the 51st nucleotide.)
[0028]
[Table 5]

(Experiment 3: Evaluation of lethal infection in PKR − / − mice versus PKR + / + mice)
Adult Balb-C PKR + / + or PKR − / − mice were infected with various doses of infectious reovirus T1L or T3D via the intraperitoneal (IP) or intranasal (IN) routes. IP injections included administration of 0.1 ml of stock virus or virus diluted in PBS. IN infection involved application of 0.05 ml of stock virus or virus diluted in PBS to nasal pads of mice anesthetized with halothane (administered at 3% in oxygen). Adult mouse viability was monitored over a 30 day period. Adult PKR + / + and PKR − / − mice were resistant to infection with 5e6 infectious T3D virus, whereas T1L virus killed PKR − / − mice at this dose, but PKR + / + The mice were not killed. This demonstrates that the ability of T1L to infect PKR − / − mouse tissues was enhanced (Table 5).
[0029]
Two-day-old pre-weaned Balb-C PKR + / + or PKR-/-mice were infected with various doses of infectious reovirus T1L or T3D via the IN route. IN infection involved application of a 0.01 ml volume of stock virus or virus diluted in PBS to the nasal pad of mice anesthetized with halothane (administered at 3% in oxygen). Preweaning mouse survival was monitored over 18 days. Both pre-weaning PKR + / + or PKR − / − mice were susceptible to similar doses of T1L, whereas the T3D virus was much more effective than the PKR + / + mice (wild-type PKR − / − mice were killed (at doses more than 100-fold less than those required to kill pre-weaning mice). This demonstrated that the ability of T3D to infect TKR-/-tissues of pre-weaning mice was enhanced, indicating that both viruses were different in PKR + / + mice of different ages (adult vs. pre-weaning). Shows the difference in properties between T1L and T3D strains for differential replication in PKR + / + versus PKR − / − mice, although more restricted in replication (Table 5).
[0030]
(Table 5)
[0031]
[Table 6]

(Experiment 4: Reovirus T3D is a more potent inducer of PKR MEF than T1L)
Infection of PKR + / + MEF results in more phosphorylated PKR expression (FIG. 2). PKR + / + MEFs were infected at 10 moi and incubated for 48 hours with rabbit anti-PKR serum reacting with the first 100 amino acids of PKR for immunoblot analysis. Proteins were separated on a 10% polyacrylamide gel, transferred to an IMMOBILON membrane (Millipore Inc.) and then incubated with the primary antibody diluted 1/100 in the presence of casein. After repeated washing, the blot was incubated with a goat anti-rabbit antibody conjugated to alkaline phosphatase (diluted 1 / 30,000) (Sigma Inc) for 1 hour, followed by repeated washing and phosphorescence detection as shown in FIG. Was reacted with an Attophos substrate. Activation of PKR results in a slightly slower mobility electrophoretic form (denoted as PKR-P). Infection with T3D is more common than infection with T1L, resulting in this form. This demonstrates that PKR expression is enhanced in T3D infected cells, indicating that this may be due to the greater sensitivity of this gene to the PKR gene.
[0032]
(Experiment 5: Elucidation of the principle of improved oncolysis of reovirus T1L × T3D reassembly: Reovirus reassembly with the M1 gene of T3D and the remaining genes from T1L and T3D has excellent oncolytic properties Demonstration of having
Three reassortants were selected for testing the oncolytic properties of their parental virus. Each of the reassortants, EB96, EB108, and EB146, had the T3D M1 gene and were expected to replicate preferentially in damaged cells in their infection response. These reassortants also had the T1, L L1, L3, and S2 genes predicted to provide optimal replication competence.
[0033]
Oncolytic studies were performed on mice bearing lung tumors from the CT26 colon tumor cell line of Balb-C origin, with 10 ⁷ Performed by intranasal infection of each virus of pfu. On day 0 of the experiment, 3 × 10 ⁵ Was injected into the tail vein of adult female BLAB-C mice (4-6 weeks old). On day 7, a group of 3 mice was anesthetized and 10% in 0.050 volume of culture medium. ⁷ Infected with pfu virus. After the mice were reared for an additional 6 days, 90% CO 2 ₂ / 10% O ₂ Euthanized. Lungs were removed, weighed, fixed in formalin, and photographed. One set of lungs was histologically examined by hematoxylin and eosin staining after being embedded in paraffin and sectioned.
[0034]
The overall appearance of the lung after treatment was such that the untreated control lung had a severe tumor with a stone-like surface appearance due to continuous tumor nodules (FIG. 3). These animals were in the final stages of cancer. One animal died at this point and the other had respiratory distress. These lungs are three times more severe than uninfected balb-c lungs, indicating that the increased tumor mass is calculated to be twice that of lung tissue (FIG. 4). Histologically, these lungs were covered with a continuous layer of tumor nodules, and the internal tumor mass was observed as eosin-friendly growth of cells (FIGS. 4 and 5). Infection with the T1L virus causes a partial freeing of surface tumor growth observable by gross examination, which also reduces internal and surface nodules and lung weight by 20% relative to untreated controls. % Reduction (FIGS. 3, 4, and 5). T3D treatment was not as effective as T1L treatment, and lungs were distinguishable from untreated controls only by a small reduction in size (8%), but the overall and microscopic appearance of tumors was similar ( Figures 3, 4, and 5).
[0035]
In sharp contrast, EB96 reassortant virus cleared the entire tumor mass of the lung upon treatment (FIG. 3). The lung had an almost normal weight without tumor mass (FIG. 4). A small number of persistent tumor cells remained at this point, as detected by histological examination (FIG. 5). The lung was of normal size and appearance (except for some annular patterns and dents in the lung surface, which would indicate the location of previous tumor nodules). The FB146 virus was less effective at oncolysis than the T3D parent virus (FIGS. 3, 4, and 5). Reassembly EB108 was partially effective in oncolysis, with slightly better but similar results than the T1L parental strain. In comparing the genotypes of the reassortants, it can be observed that the three reassortants have in common seven genomic segments and therefore differ in their L2, S3 and S4 genomic segments, Indicates that the latter group of genes contains important modulators of oncolysis. EB96 reassortants are more effective than EB108 alone due to the nature of the S4 gene. Because these viruses differ only in the parental origin of this gene. This indicates that the T1LS4 gene confers enhanced oncolytic properties over the T3DS4 gene. Since the S4 gene encodes a dsRNA binding protein that blocks activation of PKR, the T1L S4 gene differs in this capacity, thus highlighting other combinations of T1L and T3D genomic segments to control oncolytic capacity I can do it. In conclusion, the dramatic increase in the effects of EB96 reassortants on oncolysis compared to parental T1L and T3D viruses indicates that reassortants of reoviruses with particular genotypes have an active immune response It demonstrates the proof of principle that it has enhanced and effective oncolytic capacity in metastatic tumors of the host (Table 6).
[0036]
(Table 6: Ranking of the ability of reovirus reassortants to lyse ct26 lung tumors. Shows the relative weight of ct26 tumor-bearing lungs relative to untreated control tumor-bearing lungs. (L for T1L and D for T3D.)
[0037]
[Table 7]

(Experiment 6: Ability of T1L × T3D reassortants to lyse tumors in vitro)
A panel of tumor cell lines obtained from the NCI tumor panel (SF539, cns; SKMEL28, melanoma; HT29; NCI H23, nsc-lung; SW620, colon; DU145, prostate) with TlL, T3D or The reassortants, EB96, EB108 and EB146, were infected and observed for cytopathological effects over 5 days. The ability to lyse tumor cells was visually scored on a scale of-to +++. -Indicates that there is no difference from mock infected cells, and +, ++ and +++ indicate 33% cell destruction, 66% cell destruction and complete lysis, respectively. The different tumor cell types differed in susceptibility to lysis by different reovirus parent strains or reassortants, but the reassortant viruses were all as effective in in vitro tumor cell lysis as the T3D parent virus, or more effective than Was also effective (Table 7).
[0038]
Table 7: Cytopathology of reoviruses T1L and T3D and reassortants in different tumor cell lines.
[0039]
[Table 8]

[Brief description of the drawings]
[0040]
FIG. 1: Virus yield of reovirus strains T1L and T3D in mouse embryonic fibroblasts with PKR − / − vs. PKR + / +.
FIG. 2. Immunoblot of PKR in MEFs infected with Reo T1L and T3D.
FIG. 3. Lungs of ct26 tumor-bearing mice after treatment with a reovirus strain. T1L, T3D, EB96, EB108 and EB146 are compared to untreated control lungs. Lungs from two mice are shown for each treatment.
FIG. 4 compares BALB-C mouse lung weight with the presence of CT26 tumor and reovirus treatment.
FIG. 5 Histological sections stained with hematoxylin and eosin showing lung lobes of mice with ct26 tumors after reovirus strain treatment. T1L, T3D, EB96, EB108 and EB146 are compared to untreated control lungs.

Claims

A method of reducing the viability of a tumor cell, the method comprising administering to the tumor cell a non-naturally occurring virus, wherein the virus comprises:
a) a reovirus, wherein the mu-2 protein of the reovirus is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652, and 726, respectively. A reovirus having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S; or b) a reassortant of two or more parental strains of a virus species selected from the family Reoviridae. Or its progeny; or c) at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F A virus other than a reovirus capable of expressing a reovirus mu-2 protein having L, M, I, Q, I and S, wherein the virus other than the reovirus is Or. homyxoviridae, Rhabdoviridae and DNA virus selected from the group consisting of the Paramyxoviridae, a positive sense RNA virus or a negative-sense RNA viruses, other than reovirus virus,
Is the way.

A method of infecting a neoplasm in a mammal with a virus, the method comprising administering to the mammal a non-naturally occurring virus, wherein the virus comprises:
a) a reovirus, wherein the mu-2 protein of the reovirus is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652, and 726, respectively. A reovirus having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S; or b) a reassortant of two or more parental strains of a virus species selected from the family Reoviridae. Or its progeny; or c) a virus other than a reovirus, wherein the virus other than the reovirus is
i) at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, A reovirus mu-2 protein having I, Q, I and S, and ii) a DNA virus, a positive sense RNA virus, or a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae. ,
Viruses other than reovirus,
Is the way.

A method of treating a neoplasm in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a non-naturally occurring virus, wherein the virus comprises:
a) a reovirus, wherein the mu-2 protein of the reovirus is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652, and 726, respectively. A reovirus having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S; or b) a reassortant of two or more parental strains of a virus species selected from the family Reoviridae. Or its progeny; or c) a virus other than a reovirus, wherein the virus other than the reovirus is
i) at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, A reovirus mu-2 protein having I, Q, I and S, and ii) a DNA virus, a positive sense RNA virus, or a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae. ,
Viruses other than reovirus,
Is the way.

Use of a non-naturally occurring virus in the manufacture of a medicament for reducing tumor cell viability, infecting a neoplasm in a mammal, or treating a neoplasm in a mammal, wherein the non-naturally occurring virus is used. Wherein the virus is:
a) a reovirus, wherein the mu-2 protein of the reovirus is at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652, and 726, respectively. A reovirus having amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S; or b) a reassortant of two or more parental strains of a virus species selected from the family Reoviridae. Or its progeny; or c) a virus other than a reovirus, wherein the virus other than the reovirus is
i) at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, A reovirus mu-2 protein having I, Q, I and S, and ii) a DNA virus, a positive sense RNA virus, or a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae. ,
Viruses other than reovirus,
Use.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, or the use according to claim 4, wherein the virus is a reovirus and the mu-2 protein of the reovirus is at positions 93, 150. At positions 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, I, Q, I and S Having,
Way or use.

6. The method or use according to claim 5, wherein the mu-2 protein has the amino acid sequence of mu-2 protein of reovirus strain T3 Deering.

The method or use according to claim 6, wherein the mu-2 protein is expressed by a gene having the nucleic acid sequence of the M1 gene of the reovirus strain T3 Deering.

The method of claim 7, wherein the reovirus has the same genotype as a reovirus strain selected from the group consisting of eb86, eb129, eb88, eb13, and eb145.

The method or use according to claim 7, wherein the reovirus has an L3 gene, and the sequence of the L3 gene is the same as the L3 gene of reovirus strain T1 Lang.

10. The method or use according to claim 9, wherein said reovirus has the same genotype as a reovirus strain selected from the group consisting of eb28, eb31, eb97, eb123 and g16.

The method according to claim 9, wherein the reovirus has an L1 gene and an S2 gene, and the sequences of the L1 gene and the S2 gene are the same as the corresponding genes of the reovirus strain T1 Lang.

12. The method of claim 11, wherein said reovirus has the same genotype as a reovirus strain selected from eb146 and eb108.

12. The method of claim 11, wherein the reovirus has an S4 gene, and the sequence of the S4 gene is the same as the corresponding gene of reovirus strain T1 Lang.

13. The method of claim 12, wherein the reovirus has the same genotype as reovirus strain eb96.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, or the use according to claim 4, wherein the virus is a reassortant of two or more parent strains of a virus species selected from the family Reoviridae or a progeny thereof. Is, the way or the use.

16. The method or use according to claim 15, wherein the viral species is a reovirus and the parent strain is selected from the group consisting of T3 Dearing, T1 Lang, T3 Abney and T2 Jones.

17. The method or use according to claim 16, wherein the parent strains are T3 Deearing and T1 Lang.

18. The method or use according to claim 17, wherein the virus is selected from the group consisting of virus strains eb118, eb73.1, h17, h15, eb39 and h60.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, or the use according to claim 4, wherein the virus is a virus other than a reovirus, wherein the virus other than a reovirus is:
i) at positions 93, 150, 300, 302, 347, 372, 434, 458, 652 and 726, respectively, amino acid residues A, R, M, F, L, M, A reovirus mu-2 protein having I, Q, I and S, and ii) a DNA virus, a positive sense RNA virus, or a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae. ,
Viruses other than reovirus,
Is,
Way or use.

20. The method or use according to claim 19, wherein the virus is a herpes virus, adenovirus, parvovirus, papovavirus, iridovirus, hepadnavirus, poxvirus, mumps virus, human parainfluenza virus. Or a DNA virus selected from the group consisting of a measles virus and a rubella virus.

20. The method or use according to claim 19, wherein the virus is a positive sense RNA virus selected from Togavirus, Flavivirus, Picornavirus or Coronavirus.

20. The method or use according to claim 19, wherein the virus is a negative sense RNA virus selected from the group consisting of Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae and Paramyxoviridae.

20. The method or use according to claim 19, wherein the virus is an influenza virus or a vesicular stomatitis virus.

24. The method or use according to any one of claims 1 to 23, wherein the virus is a replication competent virus.

25. The method or use according to claim 24, wherein the virus is a clonal virus.

26. The method of any one of claims 1 to 25, wherein the virus is administered by a route selected from the group consisting of intranasal, intratracheal, intravenous, intraperitoneal, or intratumoral.

27. The method or use according to any one of the preceding claims, wherein the virus is administered to a human or non-human mammal.

Wherein the virus is administered at a dose of ^{^{3 × 10 7 ~3 × 10 9}} PFU / kg, method or use of claim 26 or 27.