JP2004517839A - Ｅｂｖ感染およびｅｂｖ関連障害の処置および予防 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の予防用ワクチンとして用いるのに適した物質およびそれらを投与する方法を提供する。該ワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１）に対するものであり、最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖから得られる抗原を含む。好ましい抗原には、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４が含まれる。最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は減少しているまたは消失している。もう一つの態様において、該ワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはその免疫原性フラグメントを含有する。本発明は、更に、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置する方法を提供する。
Description
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本出願は、２０００年１２月１１日出願の予備出願第６０／２５４，６７３号に基づくが、この内容は、信頼され且つ本明細書中にそのまま援用され、これにより、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益優先権は、請求の範囲に記載される。
【０００２】
政府基金
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられるＡＩ１４９１０としての政府援助で行われた。米国政府が、本発明の当然の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染およびＥＢＶ関連障害の処置および予防の方法に関する。
【０００４】
背景
ＥＢＶは、大部分の集団に感染して、疾患および新形成に関連している偏在性ヒトヘルペスウイルスである。１７２ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスであるＥＢＶは、リンパ球および上皮細胞に感染しうる。Ｂリンパ球のＥＢＶ感染は、それらの活性化および増殖を引き起こす。９０％を超える成人は、潜在的にＥＢＶに感染している。大部分の個体において、一次ＥＢＶ感染は幼児期に起こるが、臨床的発現を生じない。一次感染が青年期まで遅れた場合、ＥＢＶに感染したＢ細胞の自己限定性増殖である伝染性単核球症（ＩＭ）が起こりうる。
【０００５】
一次感染に続いて、ＥＢＶに感染した細胞は、宿主中で生存し続ける。低レベルの感染性ウイルスは、大半の無症候性血清陽性個体の唾液中に流れ出る。ＥＢＶに感染したＢ細胞は、適切に機能している免疫系によって ｉｎ ｖｉｖｏ での制御されない増殖が抑えられている。しかしながら、免疫抑制されている個体の場合、ＥＢＶに感染した細胞は、リンパ増殖性障害を引き起こして、疾患または腫瘍形成をもたらすことがありうる。
【０００６】
ＥＢＶ感染は、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）のような悪性疾患、地方病性バーキットリンパ腫（ＢＬ）およびホジキン病（ＨＤ）を含めた多数の病理学的状態に関連していることが知られている（Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ３ｄ ｅｄ． １９９６， ｐｐ．２３９７−２４４６， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ． に概説される）。更に、最近になって、５０％の乳癌は、ＥＢＶ陽性であることが分かり（Ｇｏｎｎｅｔ Ｍ．， Ｇｕｉｎｅｂｒｅｔｔｉｅｒｅ Ｊ−Ｍ．， Ｋｒｅｍｍｅｒ Ｅ．， Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ Ｖ．， Ｂｅｎｈａｍｏｕ Ｅ．， Ｃｏｎｔｅｓｓｏ Ｇ．， Ｊｏａｂ Ｉ． Ｄｅｔｅｃｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒｓ． Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９１：１３７６−８１，１９９９）、そして狼瘡（Ｈａｒｌｅｙ Ｊ．Ｂ．， Ｊａｍｅｓ Ｊ．Ａ． Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ｔｅｅｎａｇｅｒｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． １９９９ Ａｕｇ； ４２（８）：１７８２−３）、慢性関節リウマチ（Ｔａｋｅｄａ Ｔ．， Ｍｉｚｕｇａｋｉ Ｙ．， Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｌ．， Ｉｍａｉ Ｓ．， Ｋｏｉｋｅ Ｔ．， Ｔａｋａｄａ Ｋ． Ｌｙｔｉｃ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２０００ Ｊｕｎ； ４３（６）：１２１８−２５）およびシェーグレン症候群（Ｓａｉｔｏ Ｉ．Ｂ．， Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ Ｔ．， Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｔ．， Ｆｏｘ Ｒ．Ｉ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−９８，１９８９）のような自己免疫疾患も、ＥＢＶに関連している。更に、免疫抑制薬で処置されている臓器被移植者のような免疫抑制された個体は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞リンパ腫を発症することがありうる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体も、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞リンパ腫を発症することがありうるが、これは、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（ＡＲＬ）と称される。ＥＢＶに感染した上皮病変として舌の上に現れる口内毛様白板（ＯＨＬ）も、ＡＩＤＳ患者で認められている。
【０００７】
高ＥＢＶ力価並びに高レベルのＴ細胞（例えば、Ｖβ１３Ｔ細胞）は、慢性関節リウマチまたはシェーグレン症候群のようなＥＢＶ関連自己免疫疾患に苦しむ個体で報告されている（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−２１９８（１９８９）； Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−２１９８（１９８９）； Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：６８１−６８５（１９９２）； Ｙｏｎａｈａ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３５：１３６２−１３６７（１９９２）； および Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３３：４２０−４２４（１９９４））。
【０００８】
病原性微生物は、その微生物の病原性を増大させると考えられる強力な抗原非依存性Ｔ細胞応答を引き起こす、スーパー抗原（ＳＡｇ）と称されるある種のタンパク質を生産することが知られている。ＳＡｇを有することが知られている微生物には、細菌およびウイルスの二つの群がある。大多数の細菌ＳＡｇは、構造的におよび機能的に十分に特性決定されているが、これまでのところ、僅か３種類のウイルスファミリー、すなわち、レトロウイルス、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスだけが、ＳＡｇ活性に関係している。Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｔ．， Ｈｓｕ，Ｐ．Ｎ． ＆ Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． Ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６０，４７３−４８２（１９９６）。
【０００９】
本発明者は、以前に、ＥＢＶに感染したＢ細胞がＳＡｇを発現するということを報告し、ＳＡｇに媒介されるＴ細胞活性化は、急性ＥＢＶ感染に関連した疾患である伝染性単核球症（ＩＭ）の際に認められるリンパ球増加症の原因となると考えている。（Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）； Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｃ．， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｐ ＆ Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｆ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２５，１２６９−１２７４（１９８０）； Ｈｅｎｌｅ，Ｇ．， Ｈｅｎｌｅ，Ｗ． ＆ Ｄｉｅｈｌ，Ｖ． Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ−ｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｎｏｃｌｅｏｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ５９，９４−１０１（１９６８））。初めの方に述べられたように、ＳＡｇに作動されるＴ細胞活性化は、休止記憶Ｂ細胞画分における寿命期間のウイルス存続に向けたＥＢＶ感染の進行を容易にするおよび／またはウイルス再活性化にある役割を果たす。Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｅ．Ｍ．， Ｙａｎｇ，Ｂ．， Ｌａｍ，Ｋ．Ｍ．， Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｈ． ＆ Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｌａｔｅｎｃｙ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｅｌｌ ８０，５９３−６０１（１９９５）； Ｈａｓｕｉｋｅ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩＤＤＭＫ１，２−２２−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ， ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＡ ｒｅｐｅａｔ ａｔ ｉｔｓ ｌｏｃｕｓ． Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４４．３４３−３４７（１９９９）。
【００１０】
ＳＡｇは、強力なＴ細胞応答を宿主から引き出す微生物病原体由来タンパク質である。それらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と連結することおよび特定のＴ細胞受容体（β鎖可変（ＴＣＲＢＶ））遺伝子を発現するＴ細胞に結合することによってこれを行う。これは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖によって形成される溝に結合する特異的抗原からそれらを区別し、それによって、小集団のＴ細胞だけを活性化する。
【００１１】
ＳＡｇによって引き出されるＴ細胞刺激は、正常なＴ細胞応答で考えられるように、病原体を制限しないと考えられる。逆説的には、その応答は有益であると考えられ、病原体がそのライフサイクルを終えるのに役立つ。本発明者は、以前に、偏在性ヘルペスウイルスであるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連したＴ細胞受容体β鎖可変（ＴＣＲＢＶ１３）遺伝子特異的ＳＡｇ活性を発見した。Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）。本発明者は、ここで、このＳＡｇが、ＥＢＶによってトランス活性化される、内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８のｅｎｖ遺伝子によってコードされていることを発見した。これは、宿主にコードされるＳＡｇを借りる感染性物質についての最初の報告である。ＥＢＶは、このＴ細胞刺激活性を利用して、Ｂ細胞中での持続性感染の樹立を容易にしていると考えられる。ＳＡｇに媒介されるＴ細胞活性化の調節解除は、ラージＴ細胞浸潤によってその多くが特性決定される、伝染性単核球症、ＥＢＶ関連悪性疾患およびＥＢＶ関連自己免疫障害の病原性にきわめて重要である。
【００１２】
いろいろなアプローチを用いて、ＥＢＶ感染に関連した病理学を減少させようと試みられている。例えば、ピロリン酸類似体、チミジンキナーゼ類似体、リボヌクレオシドレダクターゼ阻害剤、およびアシクロビルのようなヌクレオシド類似体は、ＥＢＶ感染に関連した疾患を制御するのに用いられている。これら物質で、潜伏性ＥＢＶに対して有効であるものはないし、ＥＢＶ複製および関連の病理学を阻止するのに理想的であるものはない。更に、これら物質の使用は、正常な細胞過程の阻害を引き起こすことがあり、順次、望ましくない副作用を引き起こす。種々のＥＢＶ遺伝子に特異的であるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドも設計されているが、これらは、ＥＢＶの溶菌および潜伏サイクルに関連している。米国特許第５，２４２，９０６号および同第５，８３７，８５４号；Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８４：５８２−５８７（１９９４）；ＷＯ９３／１１２６７号。
【００１３】
したがって、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の有効な予防および処置が、依然として大いに必要とされている。
【００１４】
発明の要旨
本発明者は、ＥＢＶ感染が、Ｔ細胞スーパー抗原（ＳＡｇ）活性を発現し、順次、ＥＢＶ病原性に広範な関連性を有する多クローン性Ｔ細胞活性化へと急速に進行する内因性レトロウイルスの誘導をもたらすということを発見した。例えば、広範囲に及ぶＴ細胞浸潤は、ホジキンリンパ腫および鼻咽頭癌のようなＥＢＶ関連腫瘍に特有であり；活性化Ｔヘルパー細胞は、移植関連リンパ腫の発症にある役割を果たしている。更に、広範囲に及ぶリンパ増加症は、急性ＩＭの特徴である。したがって、理論によって拘束されたくはないが、本発明者は、ＥＢＶに誘発されるＳＡｇ活性が、これら過程に関連した多くの疾患にある役割を果たしていると考え、そしてこのような活性の防止または阻害は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するおよび／または予防する場合に有用であろうと考えている。
【００１５】
本発明の一つの態様は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の予防および処置のためのワクチン接種方法を提供する。このような方法には、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するおよび／または予防するための、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１）またはその免疫原性フラグメント、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはそのフラグメントおよび薬学的に許容しうるキャリヤーを含んで成るワクチンが含まれる。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、ＥＢＶ感染またはＥＢＶ関連障害の危険がある個体のＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を予防する方法であって、このような個体に、配列番号：１、配列番号：２（ｃｐｋｅｉｐｋｇｓｋｎｔｅｖｌ）、配列番号：３および配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを含むワクチンを投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様において、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖまたはその免疫原性フラグメントは、減少したまたは消失したＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性を有する。本明細書中で用いられる「減少した」という用語は、ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性が、正常の場合と比較して少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも７５％、なお一層好ましくは、９５％減少していることを意味する。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、以下の実施例に更に十分に記載されるように測定することができる。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、アミノ酸の置換、付加および欠失を含めた標準的な技法を用いて、減少させることができる、好ましくは、消失させることができる。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、ＶＢ１３＋Ｔ細胞に対して調べることができる。
【００１８】
本発明のなおもう一つの態様は、ＩＭおよびＥＢＶ誘発リンパ腫のようなＥＢＶ関連障害を有する個体を処置する方法を提供するが、これには、このような個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの処置有効量を投与することが含まれる。これら抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントが含まれる。抗体は、単鎖抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってよい。例えば、青年の場合、ＩＭの回復期間は長引き、しばしば、数ヶ月間続く。しかしながら、この疾患の早期確認後の、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖＳＡｇの活性化を阻止すると考えられる抗体を含む医薬組成物の投与は、疾患の持続期間および重症度を減少させると考えられる。ＩＭの早期確認は、この疾患の一般的な症状（例えば、腫れた腺、咽頭痛等）を示している個体に、例えば、モノスポットまたはＥＢＶ特異的血清試験を行うことによって達成される。
【００１９】
本発明のなおもう一つの態様は、ＥＢＶによる感染に感受性の個体のＥＢＶによる感染への受動免疫療法を提供する。この方法は、この個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ抗体組成物を投与することを含む。
【００２０】
もう一つの態様において、本発明者は、免疫無防備状態（免疫抑制された）個体の腫瘍形成性形質転換を処置するおよび／または予防する方法を提供する。この方法には、早期腫瘍形成性形質転換に関連する臨床症状を示す免疫無防備状態個体を識別し、そしてこのような個体に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを含むワクチン、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの治療的有効量を投与することが含まれる。この抗体またはそのフラグメントは、免疫抑制療法の開始前に投与してよい。好ましくは、抗体投与は、免疫抑制療法の間中継続する。腫瘍形成性形質転換は、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、リンパ増殖性障害、ＥＢＶ陽性乳癌、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌を含めたリンパ腫を引き起こすことがありうる。
【００２１】
免疫無防備状態（免疫抑制された）個体は、Ｔ細胞機能の全体的減少を特徴とする。このような個体でのＥＢＶの再活性化は、腫瘍形成に関連している。したがって、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖＳＡｇ活性を妨げるまたはそれに干渉することにより、ＥＢＶに誘発される腫瘍形成を消失させることができるしまたは実質的に減少させることができる。
【００２２】
免疫抑制は、様々な方法で生じることができる。例えば、多数の病原体は、概して、免疫応答を抑制する。ＨＩＶ感染は、病原体に誘発される免疫抑制の極端な場合を示している。ＡＩＤＳの最終的な死因は、通常、日和見病原体（環境中に存在するが、正常な免疫応答によって制御されているので、通常は、疾患を引き起こさない病原体）への感染である。したがって、病原体に誘発される免疫抑制に苦しむ個体の場合、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの投与は、病原体に誘発される免疫抑制の持続期間必要とされると考えられる。
【００２３】
医学的に誘発される免疫抑制（医原性免疫抑制）は、例えば、臓器移植および骨髄移植に関連して必要とされる。シクロスポリンＡは、有効であるし、比較的無毒性でもあるので、臨床移植に広く用いられている。類似の活性を有する関連のない化合物は、ＦＫ５０６である。これら化合物は、Ｔ細胞受容体によって開始されるシグナリング経路の後期を遮断することにより、ＩＬ−２の合成を妨げる。
【００２４】
臓器移植を受ける個体は、実質臓器移植後のある期間（例えば、１〜数ヶ月間）急性免疫抑制（すなわち、免疫不適格に）される。基底レベルの免疫抑制は、概して、その個体の寿命の間維持されるが、この急性免疫抑制期間後、免疫適格度が確立される。このような個体での腫瘍形成性形質転換を予防するために、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与を、本発明において提供する。好ましくは、投与期間は、急性免疫抑制の期間である。
【００２５】
骨髄被移植者も、移植後の免疫抑制期間を必要とする。この免疫抑制期間は、移植された細胞の再生を可能にするのに必要とされる。この免疫抑制期間中、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与は、ＥＢＶ誘発リンパ腫を妨げると考えられる。
【００２６】
なおもう一つの態様において、ＥＢＶ関連自己免疫障害を処置する方法も提供する。この方法は、自己免疫障害に急性罹患したＥＢＶ陽性個体を識別し、そしてこのような個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの有効量を投与することを含む。
【００２７】
最後に、包装材料およびその包装材料中に含有された薬剤を含む製品であって、この包装材料が、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するための、有効量で十分な期間投与することができる薬剤を指示するラベルを含み、この薬剤が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む製品を提供する。
【００２８】
定義
本明細書中で用いられる「ＥＢＶ関連障害（単数または複数種類）」という用語は、ＥＢＶによって直接的にまたは間接的に引き起こされる、特に、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、鼻咽頭癌、バーキットリンパ腫、ホジキン病、乳癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、口内毛様白板、狼瘡、慢性関節リウマチおよびシェーグレン症候群が含まれるがこれに制限されるわけではないいずれかの疾患または障害を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いられる「核酸」という用語は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含めたＤＮＡかまたはＲＮＡを意味する。本明細書中で用いられる「ゲノム」は、単離された核酸分子のコーディング領域および非コーディング領域双方を意味する。「核酸配列」は、５’〜３’末端まで読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。それには、自己複製性プラスミド、ウイルス核酸を含めたＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。
【００３０】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」という用語は、核酸によってコードされる完全長さ遺伝子産物かまたはその一部分を意味する。したがって、「ポリペプチド」には、完全長さタンパクのみならず、５０アミノ酸残基長さ未満のペプチドを含めた部分長さフラグメントも含まれる。
【００３１】
「コードする核酸分子」という句は、特定のポリペプチドの発現を支配する核酸分子を意味する。これら核酸配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、相補的ＤＮＡ鎖、およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列も含まれる。この核酸分子には、完全長さ核酸配列も、更には、非完全長さ配列も含まれる。更に、この配列には、特定の宿主細胞中にコドン選択性を与えるように導入されうる１種類または複数の天然配列の縮重コドンが含まれるということは理解される。
【００３２】
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が明確に有効であるようにさせるような形であり、しかもその組成物が投与される対象にとって毒性である追加の成分を含有していない製剤を意味する。このような医薬組成物は、当該技術分野において知られている方法によって製造し且つ剤形で製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９７５ を参照されたい。
【００３３】
「薬学的に許容しうる」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる活性成分の有効量を与えるように、対象哺乳動物に適度に投与することができるものである。典型的なビヒクルには、生理食塩水、デキストロース溶液、リンガー液等が含まれるが、非水性ビヒクルを用いてもよい。
【００３４】
薬理学的意味において、本発明の文脈中の、抗ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ抗体のような抗体の「有効量」は、ＥＢＶに関連した状態の制御に有効な量を意味する。この場合、「制御」という用語は、このような障害の予防および処置両方を含むのに用いられる。したがって、抗体は、予防的に（すなわち、感染または障害の発生前に）または治療的に（すなわち、感染または障害の発生後に）投与することができる。
【００３５】
特に断らない限り、本明細書中で用いられる専門用語および科学用語は全て、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたのに類似したまたは均等な方法および材料を、本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料は下に記載される。本明細書中に述べられる公報、特許出願、特許および参考文献は全て、援用される。更に、材料、方法および実施例は、単に例示するものであり、制限するためのものではない。抵触する場合、定義を含めた本明細書が優先する。
【００３６】
発明の記述
本発明者は、ヒトのＥＢＶ関連障害に可能性のある原因物質を、Ｔ細胞の大きな画分を刺激することができるスーパー抗原（ＳＡｇ）活性を有するヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのＥＢＶに媒介されるトランス活性化として識別した。内因性ＳＡｇのこのトランス活性化は、誘導条件下において、伝染性単核球症（ＩＭ）、ＥＢＶ誘発リンパ腫、狼瘡、慢性関節リウマチおよびシェーグレン症候群のようなＥＢＶ関連自己免疫疾患などの多数の障害を引き起こすことがあり得る寿命期間のウイルス存続に向けたＥＢＶ感染の進行を容易にすることがありうる。
【００３７】
ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害のためのワクチンおよび予防法
本発明は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の予防用ワクチンとして用いるのに適した物質、およびそれらを投与する方法を提供する。これらワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１）に対するものであり、最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖから得られる抗原を含む。好ましい抗原には、配列番号：２（ｃｐｋｅｉｐｋｇｓｋｎｔｅｖｌ）、配列番号：３および配列番号：４（図４を参照されたい）が含まれる。最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、減少しているまたは消失している。もう一つの態様において、ワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはその免疫原性フラグメントを含有する。
【００３８】
本発明は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害に対して対象にワクチン接種する方法であって、その対象に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１（図４を参照されたい））またはその免疫原性フラグメント、またはその抗原をコードする核酸の有効量および適当な許容しうるキャリヤーを投与し、それによって対象にワクチン接種することを含む方法を提供する。１回またはそれを超えるブースター投与を行ってよい。
【００３９】
このワクチンは、抗原として上に記載されている合成ペプチドまたは組換えによって製造されるポリペプチドを用いて製造することができる。典型的には、ワクチンには、約０．１〜１ｍｇの抗原が含まれるであろう。典型的には、このワクチンは、１用量に約０．５ミリリットルが含まれるように製剤化される。ワクチンは、当該技術分野において知られているいずれの経路によって投与されてもよい。好ましくは、その経路は非経口である。より好ましくは、それは皮下または筋肉内である。
【００４０】
抗原の有効性を増幅させるために、特に、ワクチンの技術分野に関連する多数の戦略がある。例えば、ペプチドの環化または環状化は、ペプチドの抗原性および免疫原性力価を増加させることがありうる。米国特許第５，００１，０４９号を参照されたい。より慣用的には、抗原を適当なキャリヤー、通常は、タンパク質分子にコンジュゲートさせることができる。この手順には、いくつかの面がある。それは、ペプチドのような抗原の多重コピーを、単一のより大きいキャリヤー分子にコンジュゲートさせることができる。更に、このキャリヤーは、抗原の輸送、結合、吸収または転移を容易にする性状を有していてよい。
【００４１】
皮下注射のような非経口投与について、適当なキャリヤーの例は、得られたコンジュゲートに最小限の遺伝的制限しか与えないという理由で、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミンおよびヤツメウナギまたはキーホールリンペットヘモシアニンである。これら普遍的キャリヤーを含めたコンジュゲートは、きわめて異なった遺伝子セットを有する個体においてＴ細胞クローン活性化因子として機能することができる。
【００４２】
ペプチドとキャリヤーとの間のコンジュゲーションは、当該技術分野において知られている方法の一つを用いて行うことができる。具体的には、このコンジュゲートは、例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ， ”Ａ ｒｅｃｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：２−１２（１９９０） によって詳述されるように、二機能クロスリンカーを結合剤として用いることができる。
【００４３】
これらワクチンは、経口および非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射を含めたいずれか慣用的なワクチン投与方法によって投与することができる。筋肉内投与が好適である。この処置は、１回用量のワクチンまたは一定期間にわたる複数回用量から成りうる。その用量を、ヒト患者に生後８ヶ月以内に与えるのが好適であり得る。
【００４４】
当業者は、有効な免疫防御を引き出すためには、哺乳動物を適当なエピトープに暴露することが必要なだけであるということを容易に理解するであろう。これらエピトープは、典型的には、タンパク質全体の小さい部分であるアミノ酸セグメントである。組換え遺伝学を用いると、天然のタンパク質の一次構造を変化させて、天然に存在するエピトープと同一のまたは実質的に同様の（免疫学的に均等な）エピトープを包含する誘導体を生じることは常套的である。このような誘導体には、ペプチドフラグメント、アミノ酸置換、アミノ酸欠失およびアミノ酸付加が含まれうる。
【００４５】
投与
処置される対象は、哺乳動物、またはより具体的には、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、サルまたは齧歯類動物であってよい。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００４６】
組成物は、投薬製剤に適合する方法でおよび治療的有効量で投与される。投与される必要な活性成分の正確な量は、医療の実務家の判断に依り、各々の対象に特異である。
【００４７】
初回投与およびブースターショットに適当な計画も、変化しうるが、初回投与によってタイプ分けした後、次の注射または他の投与により、１時間またはそれを超える間隔で反復投与する。
【００４８】
本明細書中で用いられる「投与」は、対象に投与する方法を意味する。このような方法は、当業者に周知であり、局所、非経口、経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下またはエアゾルによる投与が含まれるが、これに制限されるわけではない。試剤の投与は、患者体内の治療薬が、ＥＢＶ関連障害の対象を処置するのに有効であるように、連続的にまたは間欠的に行われてよい。
【００４９】
本発明の医薬製剤または組成物は、固体、半固体、または例えば、懸濁剤またはエアゾル剤等のような液体の剤形であってよい。好ましくは、これら組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形で投与される。これら組成物には、望まれる製剤に依って、動物またはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するのに一般的に用いられるビヒクルとして定義されている、薬学的に許容しうる無毒性キャリヤーまたは希釈剤も含まれてよい。希釈剤は、その組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液である。更に、医薬組成物または製剤には、他のキャリヤー、アジュバント；または無毒性の非治療的な非免疫原性安定化剤等も含まれてよい。このような希釈剤またはキャリヤーの有効量は、成分の溶解性または生物学的活性等の点で、薬学的に許容しうる組成物を得るのに有効である量である。
【００５０】
免疫療法
包装材料およびその包装材料中に含有された薬剤を含む製品であって、この包装材料が、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するための、有効量で十分な期間投与することができる薬剤を指示するラベルを含み、この薬剤が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む製品を提供する。
【００５１】
この抗体は、免疫抑制剤、増強剤および副作用軽減薬が含まれるがこれに制限されるわけではない、２種類またはそれを超える抗体、他の治療薬、組成物または類似のものを含有する混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）中でかまたは単独で、患者に投与することができる。これら試剤は全て、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （２０００）， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂａｒｎｈａｒｔ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ に開示されたような、一般的許容有効用量範囲で投与される。
【００５２】
抗体は、注射可能標品に製剤化されてよい。非経口製剤が知られており、本発明で用いるのに、好ましくは、ｉ．ｍ．またはｉ．ｖ．投与に適している。治療的有効量の抗体を含有する製剤は、滅菌液状溶液か、液状懸濁液かまたは凍結乾燥型であり、安定化剤または賦形剤を含有していてよい。凍結乾燥組成物は、適当な希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、０．３％グリシン等で、適宜、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（宿主体重）〜１０ｍｇ／ｋｇのレベルで再構成される。典型的には、抗体を含有する医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ（処置される個体）の範囲内の治療的有効量で投与されるであろう。抗体を含有する医薬組成物の好ましい治療的有効量は、連続的患者用量上昇計画で、各１時間にわたって与えられる毎日の静脈内注入により数日間〜２週間にわたって投与される約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ（処置される個体の体重）の範囲内であろう。
【００５３】
抗体は、ｉ．ｍ．、皮下または腹腔内注射によって全身に投与されてよい。その用量は、十分に医師の技術の範囲内である、用いられる抗体の性状、例えば、その活性および生物学的半減期、製剤中の抗体濃度、投薬部位および速度、関与した患者の臨床的寛容、患者を悩ます疾患等に依存するであろう。
【００５４】
本発明の抗体は、溶液中で投与してよい。その溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５の範囲内であるべきである。抗体またはその誘導体は、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸等のような適当な薬学的に許容しうる緩衝剤を有する溶液中であるべきである。緩衝剤濃度は、１〜１００ｍＭの範囲内であるべきである。抗体の溶液は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩を５０〜１５０ｍＭの濃度で含有してもよい。アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミン塩のような有効量の安定化剤は、含まれてもよいし、抗体またはイムノトキシンを含有する溶液に、またはその溶液が調製される組成物に加えられてよい。
【００５５】
抗体の全身投与は、概して筋肉内注射によって毎日行われてよいが、血管内注入が許容しうる。投与は、鼻腔内または他の非非経口（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路であってもよい。抗体は、血液を含めたある一定の組織中に入れられるミクロスフェア、リポソームまたは他の微粒子デリバリーシステムによって投与されてもよい。
【００５６】
これら抗体は、分子全体にかまたはそのペプチドに対して上昇しうる。このようなペプチドは、動物系に、ＫＬＨのようなキャリヤータンパク質と一緒に、または十分に長い、おそらく２５アミノ酸残基である場合、キャリヤーを伴うことなく提示されてよい。
【００５７】
上の技法によって生じる多クローン性抗体を、直接的に用いてよいし、または適当な抗体生産性細胞を動物から単離し且つ用いて、既知の手段（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：７９５．（１９７５））によってハイブリドーマを形成してよい。適当なハイブリドーマの選択も、当業者に明らかであろう。
【００５８】
本発明によって用いるための抗体は、適宜、単クローン性または多クローン性であってよいということは理解されるであろう。これらの抗体均等物は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの、抗体のＦａｂ’フラグメント；イディオトープ；またはアロトープ（ａｌｌｏｔｏｐｅ）移植の結果（動物抗体の認識領域が、患者の免疫応答を免れるようにヒト抗体の適当な領域中に移植されている場合）を含んでいてよい。単鎖抗体を用いてもよい。他の適当な修飾および／または試剤は、当業者に明らかであろう。
【００５９】
キメラ抗体およびヒト化抗体も、本発明の範囲内である。キメラ抗体およびヒト化抗体は、ヒト対象において、対応する非キメラ抗体よりも免疫原性が少ないであろうと考えられる。キメラ抗体、例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含むものを作るためのいろいろなアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１，６８５１（１９８５）； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２（１９８５）， Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， 欧州特許公開ＥＰ１７１４９６号；欧州特許公開０１７３４９４号，英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。更に、キメラ抗体は、可変領域部分、特に、抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト起源であり且つ超可変領域だけが非ヒト起源であるように、更に「ヒト化」することができる。このような変更された免疫グロブリン分子は、当該技術分野において知られているいくつかの技法のいずれかによって製造することができ（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０，７３０８−７３１２（１９８３）； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４，７２７９（１９８３）； Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２，３−１６（１９８２））、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００号の内容にしたがって製造される。ヒト化抗体は、例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ２ Ｈｏｌｌｙ Ｒｏａｄ， Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ によって商業的に製造することができる。本発明によって用いるための抗体は、本明細書中にそのまま援用される米国特許第６，１１１，１６６号に記載の方法を用いて製造することもできる。
【００６０】
ＥＢＶに対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントを生じるもう一つの方法は、本発明のタンパク質またはそのペプチドフラグメントについて、免疫グロブリン遺伝子をコードするファージ発現ライブラリーまたはそれらの一部分をスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂフラグメント、Ｖ Ｈ領域およびＶ領域誘導体は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６：（１９８９）； Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１（１９８９）； および ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４（１９９０） を参照されたい。
【００６１】
本発明は、発明を代表するためのものである次の実施例によって更に特徴づけられるであろう。
【００６２】
実施例
実験技術
本発明者は、ＳＡｇ活性を有する（最近、ＣＤ４８の最初のイントロン中の染色体ｌｑ２１．２−ｑ２２に存在することが確認された）ヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８（８）を、ＥＢＶがトランス活性化するということを発見した。ＥＢＶ誘導エンハンサーは、以前に、ＣＤ４８出発部位から１．５８ｋｂ上流の領域に位置づけられていた。更に、ＩＤＤＭＫ１，２２２レトロウイルスは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８の対立遺伝子変異体（対立遺伝子１またはＫ１８．１と称される）であり、そのｅｎｖ遺伝子がＳＡｇ活性をコードするということが分かった。これら知見は、いずれのＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶによって誘導されうるＴＣＲＢＶ１３ＳＡｇ活性を有していたか調べるのに役立つ。Ｔｏｎｊｅｓ，Ｒ．Ｒ．， Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ． ＆ Ｋｕｒｔｈ，Ｒ． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｋ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３，９１８７−９１９５（１９９９）； Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ．， Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．， Ｂｈａｎ，Ａ．Ｋ． ＆ Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ． Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ （Ｂ−ＬＡＳＴ １） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ． Ｃｅｌｌ ３０，４１５−４２５（１９８２）； Ｋｌａｍａｎ，Ｌ．Ｄ． ＆ Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４８ ｇｅｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｓｉｔｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９，８７１−８８１（１９９５）； Ｃｏｎｒａｄ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｅｌｌ ９０，３０３−３１３（１９９７）； Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｎｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ （ＨＥＲＶ−Ｋ） ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｕｎｉｑｕｅ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９，８６１−８６８（１９９９）。
【００６３】
ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子１および２であるＫ１８．１およびＫ１８．２は、いくつかの位置で異なり、Ｋ１８．１Ｅｎｖは、停止コドンをａ．ａ．１５３に有するのに対して、Ｋ１８．２Ｅｎｖは、完全長さの５５３アミノ酸タンパク質である。Ｋ１８．１対立遺伝子は、以前に特性決定されているので、本発明者は、Ｋ１８．２の完全長さｅｎｖがＴ細胞を刺激しうるかどうか調べた。したがって、本発明者は、以前に報告された染色体１挿入配列をＰＣＲプライマーとして用いて、ＨＥＲＶ−Ｋ１８．２プロウイルス全体をクローン化した。配列決定後、このｅｎｖ遺伝子を、第二シストロン中のマーカーＥＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）を含むビシストロン性発現ベクターｐＣＤＬＩ中にサブクローン化した。マウスゲノムは、いずれのＨＥＲＶ関連プロウイルスも持たないので、ネズミＡ２０Ｂリンパ腫細胞をトランスフェクション実験用に選択した。Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．， Ｎｅｃｋｅｒ，Ａ．， Ｌｅｇｅｔ，Ｃ．， Ｍａｌｉｓｓｅｎ，Ｂ． ＆ Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｆ． Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｖｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６４，９８７−９９４（１９９６）。異なったレベルのＥＹＦＰを発現する安定なクローンを、フローサイトメトリーによって選択し、ＴＣＲＢＶ１３ Ｔ細胞活性化について調べた。
【００６４】
本発明者は、以前に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用するＥＢＶ感染Ｂ細胞系でのネズミＴ細胞ハイブリドーマ（ＴＨｙ）の刺激に基づくＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について検定するシステムを記載している。これらＴＨｙは、ネズミα鎖およびＣＤ３タンパク質を含むヒト（ｈ）ＴＣＲＢＶ遺伝子産物を含んで成るキメラＴＣＲを有する（注記１）。図１ａで理解されうるように、Ｋ１８．２ｅｎｖトランスフェクタント（Ａ２０／Ｋ１８．２）は全て、ｈＴＣＲＢＶ１３ ＴＨｙを刺激したが、ｈＴＣＲＢＶ８ ＴＨｙを刺激しなかったのに対して、双方のＴＨｙは、ＣＤ３架橋によって等しく活性化された。この応答の大きさは、ＥＢＶのＢ９５−８株によって形質転換されたＫ１８．２ドナーからのＢ細胞から作られるリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）によって引き出される応答に類似していたが、トランスフェクションされていないＡ２０細胞は、応答を生じなかった。Ｋ１８．２ｅｎｖをヒトＥＢＶ−Ｂ細胞リンパ腫ＢＪＡＢ中にトランスフェクションすることにより、類似の結果が得られた（データは示されていない）。これらデータは、Ｋ１８．２ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇに類似したＴＣＲＢＶ１３によって認識されるということを示している。
【００６５】
Ｋ１８．２ｅｎｖトランスフェクタントが、他のＴ細胞サブセットを刺激したかどうか調べるために、本発明者は、異なったｈＴＣＲＢＶ遺伝子を発現するネズミＴＨｙのパネルを用いた。更に、本発明者は、Ａ２０細胞中にトランスフェクションされる切断されたＫ１８．１ｅｎｖへの応答を調べた。図１ｂ〜ｈに示される結果（注記２）は、未感染のＢＬ４１細胞に対する、Ｂ９５−８ ＬＣＬとＢ９５−８に感染したバーキットリンパ腫（ＢＬ）ＢＬ４１とで得られた応答間の比較を示している。ＥＢＶ＋ＢＬおよびＬＣＬ、およびＡ２０で発現された双方のＫ１８ｅｎｖ対立遺伝子は、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１およびｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２のＴＨｙを刺激したが、ｈＴＣＲＢＶ２、３、８または１７のＴＨｙを刺激しなかったのに対して、ｐＣＤＬＩベクター単独でトランスフェクションされたＡ２０は、いずれのハイブリドーマも刺激しなかった。５：１のＡＰＣ：レスポンダー比では、Ｋ１８Ｅｎｖ対立遺伝子およびＢ９５−８に感染したＢＬ４１およびＬＣＬは、ｈＴＣＲＢＶ９ ＴＨｙも刺激し、追加の特異性が示唆された。更に、高ＡＰＣ比率での未感染ＢＬ４１は、おそらくは、これら細胞中での低レベルの内因性Ｋ１８ｅｎｖ発現のために、きわめて感受性のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙを弱く刺激した（図２ａ〜ｃを参照されたい）。ホルボールエステルＰＭＡでの全ＡＰＣ系の前処理は、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について以前に示されたように、ＴＨｙの刺激に必要であったということが述べられるはずである。これらデータは、双方のＫ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇと同じＴＣＲＢＶ特異性を有するということを示している。
【００６６】
ＳＡｇ活性が、Ｋ１８Ｅｎｖによるかどうか調べるために、本発明者は、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ の親水性指数によって選択される、Ｋ１８ｅｎｖペプチド１１６−１３０に対して上昇したウサギ抗血清を用いた。この抗血清は、ＴＣＲＢＶ１３Ｓ１およびＴＣＲＢＶ１３Ｓ２のＴＨｙによるＫ１８．１およびＫ１８．２ｅｎｖ対立遺伝子の免疫認識を用量依存方式で特異的に阻止したが（図１ｉおよびｊ）、前免疫血清は作用しなかった（注記３）。次に、本発明者は、この抗血清を用いて、ＥＢＶ感染細胞によるＴＣＲＢＶ１３活性化が、Ｋ１８ｅｎｖによって媒介されたことを証明した。図１ｋおよびｌに示されるように、このｅｎｖ抗血清は、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬおよびＥＢＶ感染ＢＬ４１によるこれらＴＨｙの刺激を遮断した。
【００６７】
もう一方において、Ｅｎｖ抗血清は、抗ＣＤ３応答に作用しなかったし、非特異的阻止は、前免疫血清では認められなかった。更に、マーモセット細胞系Ｂ９５−８は、ＥＢＶの潜伏および溶菌遺伝子両方を発現し且つ高力価のウイルスを生じるが、ＨＥＲＶ−Ｋ１８プロウイルスを含有しないものであり、これは、ＴＣＲＢＶ１３ ＴＨｙを刺激しなかった。これらデータは、ＴＣＲＢＶ１３特異的ＥＢＶ ＳＡｇ活性が、内因性ＨＥＲＶ−Ｋ１８プロウイルスのｅｎｖ遺伝子産物によるという証拠を与える。
【００６８】
ＥＢＶが、ＣＤ４８の場合のように、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ発現をアップレギュレーションしうるかどうか調べるために、本発明者は、Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子を全て検出するが、他のＨＥＲＶ−Ｋｅｎｖ転写物を検出しないように設計されたＲＮアーゼ保護検定（注記４）を用いた。図２ａ〜ｃで理解されうるように、これらｅｎｖ転写物は、Ｂ９５−８ ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ中で容易に検出され、そしてＥＢＶ−ＢＬ４１細胞が、Ｂ９５−８ウイルスの感染によってＥＢＶ＋に変換された場合、更に高くアップレギュレーションされる。ＰＭＡでのＡＰＣの処理は、Ｋ１８ｅｎｖ転写に作用しなかった。したがって、ＳＡｇ活性のＰＭＡ増大は、Ｋ１８ｅｎｖ転写レベルで作用しない。ＰＭＡは、おそらくは、ＭＨＣクラスＩＩ分子または補助分子のアップレギュレーションによって、ＳＡｇ提示の効率を増加させるように作用していると考えられる。これらデータは、ＥＢＶが、Ｋ１８ｅｎｖ発現を転写的に活性化することを示している。
【００６９】
一次Ｔ細胞へのＫ１８ｅｎｖの刺激活性を確かめるために、本発明者は、Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０細胞によって誘導される末梢血Ｔ細胞の増殖を測定した。増殖は、共培養から４８時間後に評価した（注記５）。図３ａで理解されうるように、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖは、Ｔ細胞を激しく且つ急速に刺激したが、前処理されたＡ２０／ｐＣＤＬＩは、最小限の活性しか与えなかった。この応答は、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について以前に示されたように、自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬで、またはマイトジェンＰＨＡで引き出される応答に匹敵した。Ｋ１８ｅｎｖのＥＢＶ誘導が、この多クローン性増殖を作動していたことを実証するために、本発明者は、再度、Ｋ１８ｅｎｖペプチドに対して上昇したウサギ抗血清を用いて抗体阻止実験（注記６）を行った（図３ｂ）。この抗血清は、末梢血Ｔ細胞がＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖに対して用量依存式に応答することを阻止したが、前免疫血清は阻害的ではなかった。ｅｎｖ抗血清は、更に、Ｂ９５−８ＥＢＶでのＢ細胞の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 形質転換から得られる自己由来ＬＣＬに対するＥＢＶ血清陰性ドナーのＴ細胞増殖応答を完全に阻止したが、マイトジェンＰＨＡへの応答は、影響されなかった。更に、これらデータは、この引き出されたＴ細胞増殖が、強力なリコール応答によった可能性を除外する。更に、このＥＢＶ−ドナーによる応答は、これらＴＨｙについて得られた結果に類似して、ＥＢＶ＋マーモセット細胞系Ｂ９５−８には認められなかった（図１ｋおよびｌ）。マーモセットは、ＥＢＶに容易に感染するが、持続感染を樹立しないということは興味深い。したがって、ＥＢＶ感染時にＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖによって引き出されるＳＡｇ活性は、宿主中のＥＢＶの長期間潜伏に必要である可能性がある。
【００７０】
本発明者は、Ｂ細胞のＥＢＶ感染が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子のトランス活性化をもたらし、これが、ＥＢＶ関連ＳＡｇとして以前に識別されたＴＣＲＢＶ１３特異的ＳＡｇ活性を発現するということを示している。Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）。これは、内因性ＳＡｇを誘導する微生物病原体をそれ自体の使用のために初めて実証するものである。持続性ヘルペスウイルスに利益を与える可能性がある内因性レトロウイルスを進化論的に存続させてきた生物学的活性の相互作用を研究することは、興味深いであろう。このＳＡｇ活性の検出には、ネズミトランスフェクタントがＫ１８ｅｎｖ遺伝子産物をｈＴＣＲＢＶ特異的ＴＨｙに提示する、高度に規定されたシステムが必要であった。これらＴＨｙのキメラヒト／マウスＴＣＲは、ＴＣＲＢＶ１３．１、１３．２および９の遺伝子産物に選択性を示した。一次細胞において、ＥＢＶ関連Ｔ細胞応答は、最初はＴＣＲＢＶ１３に限られるが、速やかに多クローン性になった。実際に、本発明者は、ここで、Ｋ１８ｅｎｖが、マウスＡＰＣによって与えられたにせよＥＢＶ感染Ｂ細胞によって与えられたにせよ、末梢血Ｔ細胞中で多クローン性応答を引き起こしたことを示している。類似の作用は、細菌ＳＡｇについての毒素滴定実験で認められており、Ｋ１８．１ＥｎｖのＴＣＲＢＶ７特異性の最初の知見についての議論を説明すると考えられている。
【００７１】
したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ ＥＢＶ感染は、強力なＴ細胞刺激活性を有する内因性プロウイルスの発現をもたらし、ＥＢＶ病原性を理解するための広範な関連性を有する。広範囲のＴ細胞浸潤は、ＥＢＶ関連腫瘍、ホジキンリンパ腫および鼻咽頭癌の特徴であり、移植関連リンパ腫の発症における活性化Ｔヘルパー細胞の役割について十分に証明される。更に、広範囲に及ぶリンパ球増加症は、急性伝染性単核球症の特徴である。ＥＢＶに誘発されるＳＡｇ活性は、これら過程のいずれにおいてもある役割を果たしうると考えられる
次の注記および参考文献は、本明細書中に引用され、本明細書中に援用される。
【００７２】
注記
（注記１）全ての細胞系を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸Ｎａ、β−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。ＥＢＶ細胞系、およびＨＥＲＶ−Ｋ１８．２ｅｎｖを発現する安定なＡ２０トランスフェクタントを、ＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）で３７℃において一晩、次に、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，０．１ｍｇ／ｍｌ）で１時間処理し、ＰＢＳで充分に洗浄した。細胞を計数し、そして９６ウェル丸底プレートの四重ウェル中に、２ｘ１０４個／ウェルの各細胞タイプを用いて、ＴＨｙと一緒に再懸濁させた。３７℃で４８時間後、それらプレートを−８０℃で凍結させて細胞を溶解させ、そして融解した上澄みを、ｍＩＬ−２の存在についてＥＬＩＳＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって調べ、ｒＩＬ−２についての標準曲線（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と比較した。正対照として、ＴＨｙを、プレート結合抗ＣＤ３（１４５ ２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で刺激した。
【００７３】
（注記２）Ｋ１８．１またはＫ１８．２ｅｎｖ、またはｐＣＤＬＩでトランスフェクションされたＡ２０、およびＥＢＶ細胞系を、上のようにＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理し、そして２ｘ１０４個／ウェルのＴＨｙを用いて、５：１または１：１のＡＰＣ：レスポンダー比でＴＨｙと一緒に再懸濁させた。各ＴＨｙについてのＩＬ−２生産は、プレート結合抗ＣＤ３への応答に基づく最大％として表した。
【００７４】
（注記３）抗血清阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）研究は、１：１００または１：２００に希釈されたウサギ抗Ｅｎｖペプチド１１６−１３０抗血清、または１：１００の前免疫血清と一緒に、ＡＰＣを３７℃において３０分間プレインキュベートすることによって行った。ＡＰＣ：レスポンダー比は、２ｘ１０４個／ウェルのＴＨｙについて２：１であった。プレートを２４時間目に凍結させ、融解した上澄みを、上のようにｍＩＬ−２について調べた。
【００７５】
（注記４）２ｘ１０８個のＢＬ４１、ＢＬ４１／Ｂ９５−８（Ｇ．Ｌｅｎｏｉｒ からのａ）またはＢ９５−８ＬＣＬ（１０６個の末梢血Ｂ細胞を、培地中で１：１に希釈された１ｍｌの５ｄＢ９５−８ウイルス上澄みで、３７℃において１．５時間形質転換することによって作成後、１０％ＦＣＳ／完全ＲＰＭＩ培地中で数週間増殖させた）を、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で０、２、８または１６時間処理後、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で調製した。ＲＮアーゼ保護検定は、前に記載のように行ったが、１００μｇ／列の全ＲＮＡについて行った。対照として、トランスフェクションされていないＡ２０細胞からの１００μｇのＲＮＡと、ＨＥＲＶ−Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０（ＩＤＤＭ４６５）からの２０μｇのＲＮＡとをゲル上に載せた。（このトランスフェクタントが、ＬＣＬと比較して大きくｅｎｖ遺伝子を過発現したことは、注目されるべきである）。デンシトメトリー値は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ プログラムを用いて、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ １０００でオートラジオグラフを走査することによって得た。Ｋ１８ｅｎｖ：ｈＴＢＰ（ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質）比を決定した。
【００７６】
（注記５）末梢血単核細胞は、健康な成人有志より入手し、１０％ＦＣＳ／完全ＲＰＭＩ培地中において３７℃で一晩プレートして（ｐｌａｔｅ）、単球を付着させた後、Ｔ細胞源として用いた。ＨＥＲＶ−Ｋ１８．１ｅｎｖまたはｐＣＤＬＩ単独でトランスフェクションされたＡ２０、または自己由来Ｂ細胞から形質転換されたＢ９５−８ＬＣＬを、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で一晩、次に、マイトマイシンＣ（０．１ｍｇ／ｍｌ）で１時間処理し、ＰＢＳで充分に洗浄した。ＡＰＣおよびＴ細胞を、９６ウェル丸底プレート中の四重ウェル中において１０５個／ウェルのＴ細胞を用いて、いろいろな比率で再懸濁させた。３７℃で４８時間後、細胞に（３Ｈ）チミジン（１μＣｉ／ウェル）を１２時間適用後、細胞を採取し、（３Ｈ）取込みについて計数した。
【００７７】
（注記６）抗血清阻止研究は、全く同じに行ったが、しかしながら、Ｔ細胞添加前に、ＡＰＣを、１：１００または１：２００に希釈したＥｎｖ抗血清、または１：１００の前免疫血清と一緒に３０分間プレインキュベートした。
【００７８】
本発明へのいろいろな修正および変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができるということは、当業者に理解されるであろう。したがって、本発明の修正および変更が、請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内になるという条件ならば、本発明はそれらを包含するものである。
【００７９】
本出願中にある参考文献は、本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
本明細書の一部分に包含される且つそれを構成する添付の図面は、本発明の態様を詳しく説明し、そして明細書と一緒に、本発明の目的、利点および原理を説明するのに役立つ。
【図１】
図１ａ〜ｃは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇのように、ｈＴＣＲＢＶ１３およびｈＴＣＲＢＶ９を選択的に活性化することを示している。図１ａは、トランスフェクションされていないＡ２０細胞、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８．２ｅｎｖで安定してトランスフェクションされたＡ２０の５種類の個々のクローンの、ＰＭＡで前処理後、等数のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１またはｈＴＣＰＢＶ８ＴＨｙと一緒に再懸濁されたものに応答したＩＬ−２生産を示す。このＩＬ−２応答を、Ｋ１８．２ｅｎｖドナーからのＰＭＡ処理されたＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬと、および抗ＣＤ３クロスリンケージによって得られる最大ＩＬ−２生産と比較した。図１ｂ〜ｈは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子１または２でトランスフェクションされたＡ２０、またはベクターのみ（それぞれ、Ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ、Ａ２０／Ｋ１８．２ｅｎｖ、Ａ２０／ｐＣＤＬＩ）に応答したＩＬ−２生産を示しているが、Ｂ９５−８で形質転換されたＬＣＬ、ＢＬ４１およびＢＬ４１／Ｂ９５−８に感染した細胞は、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理し、そして５：１（黒棒）または１：１（白棒）のＡＰＣ：レスポンダー比の示されたｈＴＣＲＢＶ ＴＨｙと一緒に再懸濁させた。結果は、抗ＣＤ３クロスリンケージによる各ＴＨｙの刺激に基づく最大ＩＬ−２生産百分率として表されている。この検定についての最大ＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ）：ＴＣＲＢＶ２＝３８９．１±１０８．２；ＴＣＲＢＶ３＝２５５．７±１６．３；ＴＣＲＢＶ８＝４９７．２±１１．７；ＴＣＲＢＶ９＝３４．１±１４．７；ＴＣＲＢＶ１３Ｓ１＝１４１．２±１３．５；ＴＣＲＢＶ１３Ｓ２＝１９．８±９．９；およびＴＣＲＢＶ１７Ｓ１＝５８．０５±３６．９。
図１ｉ〜ｍは、抗ＨＥＲＶ Ｋ１８ｅｎｖ抗血清およびＭＨＣクラスＩＩ抗体が、Ｋ１８ｅｎｖトランスフェクタントおよびＥＢＶ関連ＳＡｇによるＴＨｙの活性化を阻止するということを示す。図１ｉおよび１ｊは、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ、Ａ２０／Ｋ１８．２ｅｎｖの、１：１００または１：２００に希釈されたＥｎｖ抗血清と一緒に、または前免疫血清（１：１００）と一緒に３０分間インキュベート後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２を２：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えたものに応答したＩＬ−２生産を示す。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。この応答を、Ａ２０／ｐＣＤＬＩ（負の対照）と比較した。図１ｋおよび１ｌは、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＢ９５−８マーモセット細胞、Ｂ９５−８ ＬＣＬ、ＢＬ４１またはＢＬ４１／Ｂ９５−８の、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２ ＴＨｙと一緒にインキュベートされたものに応答したＩＬ−２生産を示す。Ｂ９５−８ ＬＣＬおよびＢＬ４１／Ｂ９５−８は、更に、１：１００または１：２００に希釈されたＥｎｖ抗血清で、または前免疫血清（１：１００）で３０分間前処理後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２を２：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えた。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。これら応答を、抗ＣＤ３クロスリンケージによって引き出される応答と比較した。毒性対照として、Ｅｎｖ抗血清を抗ＣＤ３ウェルにも加えた。図１ｍは、ＰＭＡで前処理されたＡ２０、Ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖまたはＢ９５−８ ＬＣＬの、ＨＬＡ．ＤＲ、Ｈ−２Ｄｄ、Ｉ−ＡｄまたはＩ−Ｅｋ／ｄに特異的な抗体とプレインキュベート後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１に１：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えたものに応答したＩＬ−２生産を示す。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。
【図２】
図２ａ〜ｃは、Ｂ９５−８ ＥＢＶが、Ｂ細胞中でのＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ発現を転写的に活性化するということを示している。図２ａは、Ｂ９５−８で形質転換されたＬＣＬ、ＢＬ４１およびＢＬ４１／Ｂ９５−８に感染した細胞を、ＰＭＡで０、２、８または１６時間処理し、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子に特異的なリボプローブおよびｈＴＢＰ（負荷対照 （ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ））と一緒にインキュベート後、ＲＮアーゼで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上で実験した細胞からの全ＲＮＡを示す。ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖの保護されたフラグメントは、３００ｂで、ｈＴＢＰについてはダブレットとして１６１ｂで検出された。２００ｂダブレットは、ｈＴＢＰの部分消化を示している。対照として、Ａ２０と、ＨＥＲＶ Ｋ１８．１でトランスフェクションされたＡ２０とからのＲＮＡを包含した。ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ構築物は、リボプローブによって保護されている追加の３０ｂの Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクター配列を有し、これは正対照と３００ｂＫ１８ｅｎｖバンドとの間のサイズ差を説明する。Ｋ１８ｅｎｖ：ｈＴＢＰダブレットのデンシトメトリー値比率を、下の各列に示す。図２ｂは、３種類の異なったドナー（１〜３）からの精製Ｂ細胞と、同じ３種類のドナーからのＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬとに由来するＲＮＡを用いて行われた相対量的ＲＴ−ＰＣＲを示している。プライマーは、ｅｎｖ遺伝子３’ＬＴＲを越える１６１ｂｐＨＥＲＶ Ｋ１８リードスルー転写物、および３’ＬＴＲから１２２ｂｐ下流まで位置する隣接した染色体１配列を検出するように設計した。２５回のＰＣＲサイクルは、直鎖状範囲内の産物を生じるように決定した。これらリードスルー転写物はきわめてまれであったので、ＰＣＲは、［３２Ｐ］α−ｄＣＴＰの存在下で行った。内因性標準として、１８ｓ ｒＲＮＡ４８９ｂｐ産物に特異的なプライマーを各反応で用い、そして負対照として、Ｈ２ＯのみおよびＲＴ不含の反応を同時に行った。ＰＣＲ産物を６％変性アクリルアミドゲル上で分離し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ によって定量した。ＨＥＲＶ Ｋ１８：１８ｓ ｒＲＮＡの比率を、下の各列に印し、Ｂ９５−８形質転換後のＨＥＲＶ Ｋ１８転写物のフォールド誘導を、各個体について（Ｂ９５−８：Ｂ）示す。図２ｃは、ＬＰＳで処理されて、同じ血液ドナー由来のＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬと比較される３種類の個体からの精製一次Ｂ細胞に応答したＩＬ−２生産を示す。ＬＰＳ Ｂ細胞もＢ９５−８ ＬＣＬも、ＰＭＡで前処理し、洗浄し、そして２ｘ１０４ＴＨｙ／四重ウェルを用いたいろいろなＡＰＣ／レスポンダー比のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙと一緒にインキュベートした。ＩＬ−２生産は、４８時間後に測定した。
【図３】
図３ａおよび３ｂは、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性が、Ｋ１８ｅｎｖによって引き起こされるということを示している。図３ａは、Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０が、ＥＢＶ関連ＳＡｇに類似した速度論および大きさで末梢血Ｔ細胞を活性化したということを示している。ＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖまたはＡ２０／ｐＣＤＬＩ、および自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬを、４８時間Ｔ細胞増殖検定でＡＰＣとして用いたが、［３Ｈ］チミジンの取込みによって測定したところ、１：１（黒棒）、１：３（灰色棒）および１：１０（白棒）のＡＰＣ：レスポンダー比は、Ｔ細胞増殖が、抗原投与量に依存することを示している。この応答をマイトジェンＰＨＡと比較し、ＡＰＣは、比較のために示されているにすぎない。図３ｂは、Ｋ１８ｅｎｖ抗ペプチド（ａ．ａ．１１６〜１３０）抗血清が、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理されたＡ２０／Ｋ１８．１の、１：１００および１：２００希釈でプレインキュベートされたものへの４８時間Ｔ細胞増殖を阻止したのに対して、前免疫血清は阻止しなかったことを示している。更に、ＥＢＶ血清陰性ドナーからの自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬへのＴ細胞増殖は、ｅｎｖ抗血清によって阻止されたが、前免疫血清では阻止されなかったのに対して、ｅｎｖ抗血清は、ＰＨＡによるＴ細胞増殖に作用しなかった。Ｂ９５−８マーモセット細胞系は、高力価ＥＢＶを生じるが、これは、ＥＢＶ血清陰性ドナーＴ細胞に刺激性ではなかった。
【図４】
図４は、配列番号：１、配列番号：３および配列番号：４のＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖアミノ酸配列を示す。
関連出願へのクロス・リファレンス
本出願は、２０００年１２月１１日出願の予備出願第６０／２５４，６７３号に基づくが、この内容は、信頼され且つ本明細書中にそのまま援用され、これにより、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益優先権は、請求の範囲に記載される。
【０００２】
政府基金
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられるＡＩ１４９１０としての政府援助で行われた。米国政府が、本発明の当然の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染およびＥＢＶ関連障害の処置および予防の方法に関する。
【０００４】
背景
ＥＢＶは、大部分の集団に感染して、疾患および新形成に関連している偏在性ヒトヘルペスウイルスである。１７２ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスであるＥＢＶは、リンパ球および上皮細胞に感染しうる。Ｂリンパ球のＥＢＶ感染は、それらの活性化および増殖を引き起こす。９０％を超える成人は、潜在的にＥＢＶに感染している。大部分の個体において、一次ＥＢＶ感染は幼児期に起こるが、臨床的発現を生じない。一次感染が青年期まで遅れた場合、ＥＢＶに感染したＢ細胞の自己限定性増殖である伝染性単核球症（ＩＭ）が起こりうる。
【０００５】
一次感染に続いて、ＥＢＶに感染した細胞は、宿主中で生存し続ける。低レベルの感染性ウイルスは、大半の無症候性血清陽性個体の唾液中に流れ出る。ＥＢＶに感染したＢ細胞は、適切に機能している免疫系によって ｉｎ ｖｉｖｏ での制御されない増殖が抑えられている。しかしながら、免疫抑制されている個体の場合、ＥＢＶに感染した細胞は、リンパ増殖性障害を引き起こして、疾患または腫瘍形成をもたらすことがありうる。
【０００６】
ＥＢＶ感染は、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）のような悪性疾患、地方病性バーキットリンパ腫（ＢＬ）およびホジキン病（ＨＤ）を含めた多数の病理学的状態に関連していることが知られている（Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ３ｄ ｅｄ． １９９６， ｐｐ．２３９７−２４４６， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ． に概説される）。更に、最近になって、５０％の乳癌は、ＥＢＶ陽性であることが分かり（Ｇｏｎｎｅｔ Ｍ．， Ｇｕｉｎｅｂｒｅｔｔｉｅｒｅ Ｊ−Ｍ．， Ｋｒｅｍｍｅｒ Ｅ．， Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ Ｖ．， Ｂｅｎｈａｍｏｕ Ｅ．， Ｃｏｎｔｅｓｓｏ Ｇ．， Ｊｏａｂ Ｉ． Ｄｅｔｅｃｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒｓ． Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９１：１３７６−８１，１９９９）、そして狼瘡（Ｈａｒｌｅｙ Ｊ．Ｂ．， Ｊａｍｅｓ Ｊ．Ａ． Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ｔｅｅｎａｇｅｒｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． １９９９ Ａｕｇ； ４２（８）：１７８２−３）、慢性関節リウマチ（Ｔａｋｅｄａ Ｔ．， Ｍｉｚｕｇａｋｉ Ｙ．， Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｌ．， Ｉｍａｉ Ｓ．， Ｋｏｉｋｅ Ｔ．， Ｔａｋａｄａ Ｋ． Ｌｙｔｉｃ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２０００ Ｊｕｎ； ４３（６）：１２１８−２５）およびシェーグレン症候群（Ｓａｉｔｏ Ｉ．Ｂ．， Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ Ｔ．， Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｔ．， Ｆｏｘ Ｒ．Ｉ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−９８，１９８９）のような自己免疫疾患も、ＥＢＶに関連している。更に、免疫抑制薬で処置されている臓器被移植者のような免疫抑制された個体は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞リンパ腫を発症することがありうる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体も、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞リンパ腫を発症することがありうるが、これは、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（ＡＲＬ）と称される。ＥＢＶに感染した上皮病変として舌の上に現れる口内毛様白板（ＯＨＬ）も、ＡＩＤＳ患者で認められている。
【０００７】
高ＥＢＶ力価並びに高レベルのＴ細胞（例えば、Ｖβ１３Ｔ細胞）は、慢性関節リウマチまたはシェーグレン症候群のようなＥＢＶ関連自己免疫疾患に苦しむ個体で報告されている（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−２１９８（１９８９）； Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６９：２１９１−２１９８（１９８９）； Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：６８１−６８５（１９９２）； Ｙｏｎａｈａ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３５：１３６２−１３６７（１９９２）； および Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３３：４２０−４２４（１９９４））。
【０００８】
病原性微生物は、その微生物の病原性を増大させると考えられる強力な抗原非依存性Ｔ細胞応答を引き起こす、スーパー抗原（ＳＡｇ）と称されるある種のタンパク質を生産することが知られている。ＳＡｇを有することが知られている微生物には、細菌およびウイルスの二つの群がある。大多数の細菌ＳＡｇは、構造的におよび機能的に十分に特性決定されているが、これまでのところ、僅か３種類のウイルスファミリー、すなわち、レトロウイルス、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスだけが、ＳＡｇ活性に関係している。Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｔ．， Ｈｓｕ，Ｐ．Ｎ． ＆ Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． Ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６０，４７３−４８２（１９９６）。
【０００９】
本発明者は、以前に、ＥＢＶに感染したＢ細胞がＳＡｇを発現するということを報告し、ＳＡｇに媒介されるＴ細胞活性化は、急性ＥＢＶ感染に関連した疾患である伝染性単核球症（ＩＭ）の際に認められるリンパ球増加症の原因となると考えている。（Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）； Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｃ．， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｐ ＆ Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｆ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２５，１２６９−１２７４（１９８０）； Ｈｅｎｌｅ，Ｇ．， Ｈｅｎｌｅ，Ｗ． ＆ Ｄｉｅｈｌ，Ｖ． Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ−ｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｎｏｃｌｅｏｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ５９，９４−１０１（１９６８））。初めの方に述べられたように、ＳＡｇに作動されるＴ細胞活性化は、休止記憶Ｂ細胞画分における寿命期間のウイルス存続に向けたＥＢＶ感染の進行を容易にするおよび／またはウイルス再活性化にある役割を果たす。Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｅ．Ｍ．， Ｙａｎｇ，Ｂ．， Ｌａｍ，Ｋ．Ｍ．， Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｈ． ＆ Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｌａｔｅｎｃｙ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｅｌｌ ８０，５９３−６０１（１９９５）； Ｈａｓｕｉｋｅ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩＤＤＭＫ１，２−２２−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ， ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＡ ｒｅｐｅａｔ ａｔ ｉｔｓ ｌｏｃｕｓ． Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４４．３４３−３４７（１９９９）。
【００１０】
ＳＡｇは、強力なＴ細胞応答を宿主から引き出す微生物病原体由来タンパク質である。それらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と連結することおよび特定のＴ細胞受容体（β鎖可変（ＴＣＲＢＶ））遺伝子を発現するＴ細胞に結合することによってこれを行う。これは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖によって形成される溝に結合する特異的抗原からそれらを区別し、それによって、小集団のＴ細胞だけを活性化する。
【００１１】
ＳＡｇによって引き出されるＴ細胞刺激は、正常なＴ細胞応答で考えられるように、病原体を制限しないと考えられる。逆説的には、その応答は有益であると考えられ、病原体がそのライフサイクルを終えるのに役立つ。本発明者は、以前に、偏在性ヘルペスウイルスであるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連したＴ細胞受容体β鎖可変（ＴＣＲＢＶ１３）遺伝子特異的ＳＡｇ活性を発見した。Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）。本発明者は、ここで、このＳＡｇが、ＥＢＶによってトランス活性化される、内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８のｅｎｖ遺伝子によってコードされていることを発見した。これは、宿主にコードされるＳＡｇを借りる感染性物質についての最初の報告である。ＥＢＶは、このＴ細胞刺激活性を利用して、Ｂ細胞中での持続性感染の樹立を容易にしていると考えられる。ＳＡｇに媒介されるＴ細胞活性化の調節解除は、ラージＴ細胞浸潤によってその多くが特性決定される、伝染性単核球症、ＥＢＶ関連悪性疾患およびＥＢＶ関連自己免疫障害の病原性にきわめて重要である。
【００１２】
いろいろなアプローチを用いて、ＥＢＶ感染に関連した病理学を減少させようと試みられている。例えば、ピロリン酸類似体、チミジンキナーゼ類似体、リボヌクレオシドレダクターゼ阻害剤、およびアシクロビルのようなヌクレオシド類似体は、ＥＢＶ感染に関連した疾患を制御するのに用いられている。これら物質で、潜伏性ＥＢＶに対して有効であるものはないし、ＥＢＶ複製および関連の病理学を阻止するのに理想的であるものはない。更に、これら物質の使用は、正常な細胞過程の阻害を引き起こすことがあり、順次、望ましくない副作用を引き起こす。種々のＥＢＶ遺伝子に特異的であるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドも設計されているが、これらは、ＥＢＶの溶菌および潜伏サイクルに関連している。米国特許第５，２４２，９０６号および同第５，８３７，８５４号；Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８４：５８２−５８７（１９９４）；ＷＯ９３／１１２６７号。
【００１３】
したがって、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の有効な予防および処置が、依然として大いに必要とされている。
【００１４】
発明の要旨
本発明者は、ＥＢＶ感染が、Ｔ細胞スーパー抗原（ＳＡｇ）活性を発現し、順次、ＥＢＶ病原性に広範な関連性を有する多クローン性Ｔ細胞活性化へと急速に進行する内因性レトロウイルスの誘導をもたらすということを発見した。例えば、広範囲に及ぶＴ細胞浸潤は、ホジキンリンパ腫および鼻咽頭癌のようなＥＢＶ関連腫瘍に特有であり；活性化Ｔヘルパー細胞は、移植関連リンパ腫の発症にある役割を果たしている。更に、広範囲に及ぶリンパ増加症は、急性ＩＭの特徴である。したがって、理論によって拘束されたくはないが、本発明者は、ＥＢＶに誘発されるＳＡｇ活性が、これら過程に関連した多くの疾患にある役割を果たしていると考え、そしてこのような活性の防止または阻害は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するおよび／または予防する場合に有用であろうと考えている。
【００１５】
本発明の一つの態様は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の予防および処置のためのワクチン接種方法を提供する。このような方法には、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するおよび／または予防するための、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１）またはその免疫原性フラグメント、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはそのフラグメントおよび薬学的に許容しうるキャリヤーを含んで成るワクチンが含まれる。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、ＥＢＶ感染またはＥＢＶ関連障害の危険がある個体のＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を予防する方法であって、このような個体に、配列番号：１、配列番号：２（ｃｐｋｅｉｐｋｇｓｋｎｔｅｖｌ）、配列番号：３および配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを含むワクチンを投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様において、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖまたはその免疫原性フラグメントは、減少したまたは消失したＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性を有する。本明細書中で用いられる「減少した」という用語は、ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性が、正常の場合と比較して少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも７５％、なお一層好ましくは、９５％減少していることを意味する。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、以下の実施例に更に十分に記載されるように測定することができる。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、アミノ酸の置換、付加および欠失を含めた標準的な技法を用いて、減少させることができる、好ましくは、消失させることができる。ＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、ＶＢ１３＋Ｔ細胞に対して調べることができる。
【００１８】
本発明のなおもう一つの態様は、ＩＭおよびＥＢＶ誘発リンパ腫のようなＥＢＶ関連障害を有する個体を処置する方法を提供するが、これには、このような個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの処置有効量を投与することが含まれる。これら抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントが含まれる。抗体は、単鎖抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってよい。例えば、青年の場合、ＩＭの回復期間は長引き、しばしば、数ヶ月間続く。しかしながら、この疾患の早期確認後の、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖＳＡｇの活性化を阻止すると考えられる抗体を含む医薬組成物の投与は、疾患の持続期間および重症度を減少させると考えられる。ＩＭの早期確認は、この疾患の一般的な症状（例えば、腫れた腺、咽頭痛等）を示している個体に、例えば、モノスポットまたはＥＢＶ特異的血清試験を行うことによって達成される。
【００１９】
本発明のなおもう一つの態様は、ＥＢＶによる感染に感受性の個体のＥＢＶによる感染への受動免疫療法を提供する。この方法は、この個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ抗体組成物を投与することを含む。
【００２０】
もう一つの態様において、本発明者は、免疫無防備状態（免疫抑制された）個体の腫瘍形成性形質転換を処置するおよび／または予防する方法を提供する。この方法には、早期腫瘍形成性形質転換に関連する臨床症状を示す免疫無防備状態個体を識別し、そしてこのような個体に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを含むワクチン、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの治療的有効量を投与することが含まれる。この抗体またはそのフラグメントは、免疫抑制療法の開始前に投与してよい。好ましくは、抗体投与は、免疫抑制療法の間中継続する。腫瘍形成性形質転換は、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、リンパ増殖性障害、ＥＢＶ陽性乳癌、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌を含めたリンパ腫を引き起こすことがありうる。
【００２１】
免疫無防備状態（免疫抑制された）個体は、Ｔ細胞機能の全体的減少を特徴とする。このような個体でのＥＢＶの再活性化は、腫瘍形成に関連している。したがって、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖＳＡｇ活性を妨げるまたはそれに干渉することにより、ＥＢＶに誘発される腫瘍形成を消失させることができるしまたは実質的に減少させることができる。
【００２２】
免疫抑制は、様々な方法で生じることができる。例えば、多数の病原体は、概して、免疫応答を抑制する。ＨＩＶ感染は、病原体に誘発される免疫抑制の極端な場合を示している。ＡＩＤＳの最終的な死因は、通常、日和見病原体（環境中に存在するが、正常な免疫応答によって制御されているので、通常は、疾患を引き起こさない病原体）への感染である。したがって、病原体に誘発される免疫抑制に苦しむ個体の場合、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの投与は、病原体に誘発される免疫抑制の持続期間必要とされると考えられる。
【００２３】
医学的に誘発される免疫抑制（医原性免疫抑制）は、例えば、臓器移植および骨髄移植に関連して必要とされる。シクロスポリンＡは、有効であるし、比較的無毒性でもあるので、臨床移植に広く用いられている。類似の活性を有する関連のない化合物は、ＦＫ５０６である。これら化合物は、Ｔ細胞受容体によって開始されるシグナリング経路の後期を遮断することにより、ＩＬ−２の合成を妨げる。
【００２４】
臓器移植を受ける個体は、実質臓器移植後のある期間（例えば、１〜数ヶ月間）急性免疫抑制（すなわち、免疫不適格に）される。基底レベルの免疫抑制は、概して、その個体の寿命の間維持されるが、この急性免疫抑制期間後、免疫適格度が確立される。このような個体での腫瘍形成性形質転換を予防するために、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与を、本発明において提供する。好ましくは、投与期間は、急性免疫抑制の期間である。
【００２５】
骨髄被移植者も、移植後の免疫抑制期間を必要とする。この免疫抑制期間は、移植された細胞の再生を可能にするのに必要とされる。この免疫抑制期間中、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与は、ＥＢＶ誘発リンパ腫を妨げると考えられる。
【００２６】
なおもう一つの態様において、ＥＢＶ関連自己免疫障害を処置する方法も提供する。この方法は、自己免疫障害に急性罹患したＥＢＶ陽性個体を識別し、そしてこのような個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの有効量を投与することを含む。
【００２７】
最後に、包装材料およびその包装材料中に含有された薬剤を含む製品であって、この包装材料が、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するための、有効量で十分な期間投与することができる薬剤を指示するラベルを含み、この薬剤が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む製品を提供する。
【００２８】
定義
本明細書中で用いられる「ＥＢＶ関連障害（単数または複数種類）」という用語は、ＥＢＶによって直接的にまたは間接的に引き起こされる、特に、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、鼻咽頭癌、バーキットリンパ腫、ホジキン病、乳癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、口内毛様白板、狼瘡、慢性関節リウマチおよびシェーグレン症候群が含まれるがこれに制限されるわけではないいずれかの疾患または障害を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いられる「核酸」という用語は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含めたＤＮＡかまたはＲＮＡを意味する。本明細書中で用いられる「ゲノム」は、単離された核酸分子のコーディング領域および非コーディング領域双方を意味する。「核酸配列」は、５’〜３’末端まで読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。それには、自己複製性プラスミド、ウイルス核酸を含めたＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。
【００３０】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」という用語は、核酸によってコードされる完全長さ遺伝子産物かまたはその一部分を意味する。したがって、「ポリペプチド」には、完全長さタンパクのみならず、５０アミノ酸残基長さ未満のペプチドを含めた部分長さフラグメントも含まれる。
【００３１】
「コードする核酸分子」という句は、特定のポリペプチドの発現を支配する核酸分子を意味する。これら核酸配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、相補的ＤＮＡ鎖、およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列も含まれる。この核酸分子には、完全長さ核酸配列も、更には、非完全長さ配列も含まれる。更に、この配列には、特定の宿主細胞中にコドン選択性を与えるように導入されうる１種類または複数の天然配列の縮重コドンが含まれるということは理解される。
【００３２】
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が明確に有効であるようにさせるような形であり、しかもその組成物が投与される対象にとって毒性である追加の成分を含有していない製剤を意味する。このような医薬組成物は、当該技術分野において知られている方法によって製造し且つ剤形で製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９７５ を参照されたい。
【００３３】
「薬学的に許容しうる」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる活性成分の有効量を与えるように、対象哺乳動物に適度に投与することができるものである。典型的なビヒクルには、生理食塩水、デキストロース溶液、リンガー液等が含まれるが、非水性ビヒクルを用いてもよい。
【００３４】
薬理学的意味において、本発明の文脈中の、抗ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ抗体のような抗体の「有効量」は、ＥＢＶに関連した状態の制御に有効な量を意味する。この場合、「制御」という用語は、このような障害の予防および処置両方を含むのに用いられる。したがって、抗体は、予防的に（すなわち、感染または障害の発生前に）または治療的に（すなわち、感染または障害の発生後に）投与することができる。
【００３５】
特に断らない限り、本明細書中で用いられる専門用語および科学用語は全て、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたのに類似したまたは均等な方法および材料を、本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料は下に記載される。本明細書中に述べられる公報、特許出願、特許および参考文献は全て、援用される。更に、材料、方法および実施例は、単に例示するものであり、制限するためのものではない。抵触する場合、定義を含めた本明細書が優先する。
【００３６】
発明の記述
本発明者は、ヒトのＥＢＶ関連障害に可能性のある原因物質を、Ｔ細胞の大きな画分を刺激することができるスーパー抗原（ＳＡｇ）活性を有するヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのＥＢＶに媒介されるトランス活性化として識別した。内因性ＳＡｇのこのトランス活性化は、誘導条件下において、伝染性単核球症（ＩＭ）、ＥＢＶ誘発リンパ腫、狼瘡、慢性関節リウマチおよびシェーグレン症候群のようなＥＢＶ関連自己免疫疾患などの多数の障害を引き起こすことがあり得る寿命期間のウイルス存続に向けたＥＢＶ感染の進行を容易にすることがありうる。
【００３７】
ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害のためのワクチンおよび予防法
本発明は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害の予防用ワクチンとして用いるのに適した物質、およびそれらを投与する方法を提供する。これらワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１）に対するものであり、最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖから得られる抗原を含む。好ましい抗原には、配列番号：２（ｃｐｋｅｉｐｋｇｓｋｎｔｅｖｌ）、配列番号：３および配列番号：４（図４を参照されたい）が含まれる。最も好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのＳＡｇ Ｔ細胞刺激活性は、減少しているまたは消失している。もう一つの態様において、ワクチンは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはその免疫原性フラグメントを含有する。
【００３８】
本発明は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害に対して対象にワクチン接種する方法であって、その対象に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ（配列番号：１（図４を参照されたい））またはその免疫原性フラグメント、またはその抗原をコードする核酸の有効量および適当な許容しうるキャリヤーを投与し、それによって対象にワクチン接種することを含む方法を提供する。１回またはそれを超えるブースター投与を行ってよい。
【００３９】
このワクチンは、抗原として上に記載されている合成ペプチドまたは組換えによって製造されるポリペプチドを用いて製造することができる。典型的には、ワクチンには、約０．１〜１ｍｇの抗原が含まれるであろう。典型的には、このワクチンは、１用量に約０．５ミリリットルが含まれるように製剤化される。ワクチンは、当該技術分野において知られているいずれの経路によって投与されてもよい。好ましくは、その経路は非経口である。より好ましくは、それは皮下または筋肉内である。
【００４０】
抗原の有効性を増幅させるために、特に、ワクチンの技術分野に関連する多数の戦略がある。例えば、ペプチドの環化または環状化は、ペプチドの抗原性および免疫原性力価を増加させることがありうる。米国特許第５，００１，０４９号を参照されたい。より慣用的には、抗原を適当なキャリヤー、通常は、タンパク質分子にコンジュゲートさせることができる。この手順には、いくつかの面がある。それは、ペプチドのような抗原の多重コピーを、単一のより大きいキャリヤー分子にコンジュゲートさせることができる。更に、このキャリヤーは、抗原の輸送、結合、吸収または転移を容易にする性状を有していてよい。
【００４１】
皮下注射のような非経口投与について、適当なキャリヤーの例は、得られたコンジュゲートに最小限の遺伝的制限しか与えないという理由で、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミンおよびヤツメウナギまたはキーホールリンペットヘモシアニンである。これら普遍的キャリヤーを含めたコンジュゲートは、きわめて異なった遺伝子セットを有する個体においてＴ細胞クローン活性化因子として機能することができる。
【００４２】
ペプチドとキャリヤーとの間のコンジュゲーションは、当該技術分野において知られている方法の一つを用いて行うことができる。具体的には、このコンジュゲートは、例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ， ”Ａ ｒｅｃｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：２−１２（１９９０） によって詳述されるように、二機能クロスリンカーを結合剤として用いることができる。
【００４３】
これらワクチンは、経口および非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射を含めたいずれか慣用的なワクチン投与方法によって投与することができる。筋肉内投与が好適である。この処置は、１回用量のワクチンまたは一定期間にわたる複数回用量から成りうる。その用量を、ヒト患者に生後８ヶ月以内に与えるのが好適であり得る。
【００４４】
当業者は、有効な免疫防御を引き出すためには、哺乳動物を適当なエピトープに暴露することが必要なだけであるということを容易に理解するであろう。これらエピトープは、典型的には、タンパク質全体の小さい部分であるアミノ酸セグメントである。組換え遺伝学を用いると、天然のタンパク質の一次構造を変化させて、天然に存在するエピトープと同一のまたは実質的に同様の（免疫学的に均等な）エピトープを包含する誘導体を生じることは常套的である。このような誘導体には、ペプチドフラグメント、アミノ酸置換、アミノ酸欠失およびアミノ酸付加が含まれうる。
【００４５】
投与
処置される対象は、哺乳動物、またはより具体的には、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、サルまたは齧歯類動物であってよい。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００４６】
組成物は、投薬製剤に適合する方法でおよび治療的有効量で投与される。投与される必要な活性成分の正確な量は、医療の実務家の判断に依り、各々の対象に特異である。
【００４７】
初回投与およびブースターショットに適当な計画も、変化しうるが、初回投与によってタイプ分けした後、次の注射または他の投与により、１時間またはそれを超える間隔で反復投与する。
【００４８】
本明細書中で用いられる「投与」は、対象に投与する方法を意味する。このような方法は、当業者に周知であり、局所、非経口、経口、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下またはエアゾルによる投与が含まれるが、これに制限されるわけではない。試剤の投与は、患者体内の治療薬が、ＥＢＶ関連障害の対象を処置するのに有効であるように、連続的にまたは間欠的に行われてよい。
【００４９】
本発明の医薬製剤または組成物は、固体、半固体、または例えば、懸濁剤またはエアゾル剤等のような液体の剤形であってよい。好ましくは、これら組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形で投与される。これら組成物には、望まれる製剤に依って、動物またはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するのに一般的に用いられるビヒクルとして定義されている、薬学的に許容しうる無毒性キャリヤーまたは希釈剤も含まれてよい。希釈剤は、その組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液である。更に、医薬組成物または製剤には、他のキャリヤー、アジュバント；または無毒性の非治療的な非免疫原性安定化剤等も含まれてよい。このような希釈剤またはキャリヤーの有効量は、成分の溶解性または生物学的活性等の点で、薬学的に許容しうる組成物を得るのに有効である量である。
【００５０】
免疫療法
包装材料およびその包装材料中に含有された薬剤を含む製品であって、この包装材料が、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するための、有効量で十分な期間投与することができる薬剤を指示するラベルを含み、この薬剤が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む製品を提供する。
【００５１】
この抗体は、免疫抑制剤、増強剤および副作用軽減薬が含まれるがこれに制限されるわけではない、２種類またはそれを超える抗体、他の治療薬、組成物または類似のものを含有する混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）中でかまたは単独で、患者に投与することができる。これら試剤は全て、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （２０００）， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂａｒｎｈａｒｔ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ に開示されたような、一般的許容有効用量範囲で投与される。
【００５２】
抗体は、注射可能標品に製剤化されてよい。非経口製剤が知られており、本発明で用いるのに、好ましくは、ｉ．ｍ．またはｉ．ｖ．投与に適している。治療的有効量の抗体を含有する製剤は、滅菌液状溶液か、液状懸濁液かまたは凍結乾燥型であり、安定化剤または賦形剤を含有していてよい。凍結乾燥組成物は、適当な希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、０．３％グリシン等で、適宜、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（宿主体重）〜１０ｍｇ／ｋｇのレベルで再構成される。典型的には、抗体を含有する医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ（処置される個体）の範囲内の治療的有効量で投与されるであろう。抗体を含有する医薬組成物の好ましい治療的有効量は、連続的患者用量上昇計画で、各１時間にわたって与えられる毎日の静脈内注入により数日間〜２週間にわたって投与される約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ（処置される個体の体重）の範囲内であろう。
【００５３】
抗体は、ｉ．ｍ．、皮下または腹腔内注射によって全身に投与されてよい。その用量は、十分に医師の技術の範囲内である、用いられる抗体の性状、例えば、その活性および生物学的半減期、製剤中の抗体濃度、投薬部位および速度、関与した患者の臨床的寛容、患者を悩ます疾患等に依存するであろう。
【００５４】
本発明の抗体は、溶液中で投与してよい。その溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５の範囲内であるべきである。抗体またはその誘導体は、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸等のような適当な薬学的に許容しうる緩衝剤を有する溶液中であるべきである。緩衝剤濃度は、１〜１００ｍＭの範囲内であるべきである。抗体の溶液は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩を５０〜１５０ｍＭの濃度で含有してもよい。アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミン塩のような有効量の安定化剤は、含まれてもよいし、抗体またはイムノトキシンを含有する溶液に、またはその溶液が調製される組成物に加えられてよい。
【００５５】
抗体の全身投与は、概して筋肉内注射によって毎日行われてよいが、血管内注入が許容しうる。投与は、鼻腔内または他の非非経口（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路であってもよい。抗体は、血液を含めたある一定の組織中に入れられるミクロスフェア、リポソームまたは他の微粒子デリバリーシステムによって投与されてもよい。
【００５６】
これら抗体は、分子全体にかまたはそのペプチドに対して上昇しうる。このようなペプチドは、動物系に、ＫＬＨのようなキャリヤータンパク質と一緒に、または十分に長い、おそらく２５アミノ酸残基である場合、キャリヤーを伴うことなく提示されてよい。
【００５７】
上の技法によって生じる多クローン性抗体を、直接的に用いてよいし、または適当な抗体生産性細胞を動物から単離し且つ用いて、既知の手段（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：７９５．（１９７５））によってハイブリドーマを形成してよい。適当なハイブリドーマの選択も、当業者に明らかであろう。
【００５８】
本発明によって用いるための抗体は、適宜、単クローン性または多クローン性であってよいということは理解されるであろう。これらの抗体均等物は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの、抗体のＦａｂ’フラグメント；イディオトープ；またはアロトープ（ａｌｌｏｔｏｐｅ）移植の結果（動物抗体の認識領域が、患者の免疫応答を免れるようにヒト抗体の適当な領域中に移植されている場合）を含んでいてよい。単鎖抗体を用いてもよい。他の適当な修飾および／または試剤は、当業者に明らかであろう。
【００５９】
キメラ抗体およびヒト化抗体も、本発明の範囲内である。キメラ抗体およびヒト化抗体は、ヒト対象において、対応する非キメラ抗体よりも免疫原性が少ないであろうと考えられる。キメラ抗体、例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含むものを作るためのいろいろなアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１，６８５１（１９８５）； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２（１９８５）， Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， 欧州特許公開ＥＰ１７１４９６号；欧州特許公開０１７３４９４号，英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。更に、キメラ抗体は、可変領域部分、特に、抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト起源であり且つ超可変領域だけが非ヒト起源であるように、更に「ヒト化」することができる。このような変更された免疫グロブリン分子は、当該技術分野において知られているいくつかの技法のいずれかによって製造することができ（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０，７３０８−７３１２（１９８３）； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４，７２７９（１９８３）； Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２，３−１６（１９８２））、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００号の内容にしたがって製造される。ヒト化抗体は、例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ２ Ｈｏｌｌｙ Ｒｏａｄ， Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ によって商業的に製造することができる。本発明によって用いるための抗体は、本明細書中にそのまま援用される米国特許第６，１１１，１６６号に記載の方法を用いて製造することもできる。
【００６０】
ＥＢＶに対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントを生じるもう一つの方法は、本発明のタンパク質またはそのペプチドフラグメントについて、免疫グロブリン遺伝子をコードするファージ発現ライブラリーまたはそれらの一部分をスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂフラグメント、Ｖ Ｈ領域およびＶ領域誘導体は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６：（１９８９）； Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１（１９８９）； および ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４（１９９０） を参照されたい。
【００６１】
本発明は、発明を代表するためのものである次の実施例によって更に特徴づけられるであろう。
【００６２】
実施例
実験技術
本発明者は、ＳＡｇ活性を有する（最近、ＣＤ４８の最初のイントロン中の染色体ｌｑ２１．２−ｑ２２に存在することが確認された）ヒト内因性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ１８（８）を、ＥＢＶがトランス活性化するということを発見した。ＥＢＶ誘導エンハンサーは、以前に、ＣＤ４８出発部位から１．５８ｋｂ上流の領域に位置づけられていた。更に、ＩＤＤＭＫ１，２２２レトロウイルスは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８の対立遺伝子変異体（対立遺伝子１またはＫ１８．１と称される）であり、そのｅｎｖ遺伝子がＳＡｇ活性をコードするということが分かった。これら知見は、いずれのＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶによって誘導されうるＴＣＲＢＶ１３ＳＡｇ活性を有していたか調べるのに役立つ。Ｔｏｎｊｅｓ，Ｒ．Ｒ．， Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ． ＆ Ｋｕｒｔｈ，Ｒ． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｋ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３，９１８７−９１９５（１９９９）； Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ．， Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．， Ｂｈａｎ，Ａ．Ｋ． ＆ Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ． Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ （Ｂ−ＬＡＳＴ １） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ． Ｃｅｌｌ ３０，４１５−４２５（１９８２）； Ｋｌａｍａｎ，Ｌ．Ｄ． ＆ Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４８ ｇｅｎｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｓｉｔｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９，８７１−８８１（１９９５）； Ｃｏｎｒａｄ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｅｌｌ ９０，３０３−３１３（１９９７）； Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｎｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ （ＨＥＲＶ−Ｋ） ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｕｎｉｑｕｅ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９，８６１−８６８（１９９９）。
【００６３】
ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子１および２であるＫ１８．１およびＫ１８．２は、いくつかの位置で異なり、Ｋ１８．１Ｅｎｖは、停止コドンをａ．ａ．１５３に有するのに対して、Ｋ１８．２Ｅｎｖは、完全長さの５５３アミノ酸タンパク質である。Ｋ１８．１対立遺伝子は、以前に特性決定されているので、本発明者は、Ｋ１８．２の完全長さｅｎｖがＴ細胞を刺激しうるかどうか調べた。したがって、本発明者は、以前に報告された染色体１挿入配列をＰＣＲプライマーとして用いて、ＨＥＲＶ−Ｋ１８．２プロウイルス全体をクローン化した。配列決定後、このｅｎｖ遺伝子を、第二シストロン中のマーカーＥＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）を含むビシストロン性発現ベクターｐＣＤＬＩ中にサブクローン化した。マウスゲノムは、いずれのＨＥＲＶ関連プロウイルスも持たないので、ネズミＡ２０Ｂリンパ腫細胞をトランスフェクション実験用に選択した。Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．， Ｎｅｃｋｅｒ，Ａ．， Ｌｅｇｅｔ，Ｃ．， Ｍａｌｉｓｓｅｎ，Ｂ． ＆ Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｆ． Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｖｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６４，９８７−９９４（１９９６）。異なったレベルのＥＹＦＰを発現する安定なクローンを、フローサイトメトリーによって選択し、ＴＣＲＢＶ１３ Ｔ細胞活性化について調べた。
【００６４】
本発明者は、以前に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用するＥＢＶ感染Ｂ細胞系でのネズミＴ細胞ハイブリドーマ（ＴＨｙ）の刺激に基づくＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について検定するシステムを記載している。これらＴＨｙは、ネズミα鎖およびＣＤ３タンパク質を含むヒト（ｈ）ＴＣＲＢＶ遺伝子産物を含んで成るキメラＴＣＲを有する（注記１）。図１ａで理解されうるように、Ｋ１８．２ｅｎｖトランスフェクタント（Ａ２０／Ｋ１８．２）は全て、ｈＴＣＲＢＶ１３ ＴＨｙを刺激したが、ｈＴＣＲＢＶ８ ＴＨｙを刺激しなかったのに対して、双方のＴＨｙは、ＣＤ３架橋によって等しく活性化された。この応答の大きさは、ＥＢＶのＢ９５−８株によって形質転換されたＫ１８．２ドナーからのＢ細胞から作られるリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）によって引き出される応答に類似していたが、トランスフェクションされていないＡ２０細胞は、応答を生じなかった。Ｋ１８．２ｅｎｖをヒトＥＢＶ−Ｂ細胞リンパ腫ＢＪＡＢ中にトランスフェクションすることにより、類似の結果が得られた（データは示されていない）。これらデータは、Ｋ１８．２ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇに類似したＴＣＲＢＶ１３によって認識されるということを示している。
【００６５】
Ｋ１８．２ｅｎｖトランスフェクタントが、他のＴ細胞サブセットを刺激したかどうか調べるために、本発明者は、異なったｈＴＣＲＢＶ遺伝子を発現するネズミＴＨｙのパネルを用いた。更に、本発明者は、Ａ２０細胞中にトランスフェクションされる切断されたＫ１８．１ｅｎｖへの応答を調べた。図１ｂ〜ｈに示される結果（注記２）は、未感染のＢＬ４１細胞に対する、Ｂ９５−８ ＬＣＬとＢ９５−８に感染したバーキットリンパ腫（ＢＬ）ＢＬ４１とで得られた応答間の比較を示している。ＥＢＶ＋ＢＬおよびＬＣＬ、およびＡ２０で発現された双方のＫ１８ｅｎｖ対立遺伝子は、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１およびｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２のＴＨｙを刺激したが、ｈＴＣＲＢＶ２、３、８または１７のＴＨｙを刺激しなかったのに対して、ｐＣＤＬＩベクター単独でトランスフェクションされたＡ２０は、いずれのハイブリドーマも刺激しなかった。５：１のＡＰＣ：レスポンダー比では、Ｋ１８Ｅｎｖ対立遺伝子およびＢ９５−８に感染したＢＬ４１およびＬＣＬは、ｈＴＣＲＢＶ９ ＴＨｙも刺激し、追加の特異性が示唆された。更に、高ＡＰＣ比率での未感染ＢＬ４１は、おそらくは、これら細胞中での低レベルの内因性Ｋ１８ｅｎｖ発現のために、きわめて感受性のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙを弱く刺激した（図２ａ〜ｃを参照されたい）。ホルボールエステルＰＭＡでの全ＡＰＣ系の前処理は、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について以前に示されたように、ＴＨｙの刺激に必要であったということが述べられるはずである。これらデータは、双方のＫ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇと同じＴＣＲＢＶ特異性を有するということを示している。
【００６６】
ＳＡｇ活性が、Ｋ１８Ｅｎｖによるかどうか調べるために、本発明者は、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ の親水性指数によって選択される、Ｋ１８ｅｎｖペプチド１１６−１３０に対して上昇したウサギ抗血清を用いた。この抗血清は、ＴＣＲＢＶ１３Ｓ１およびＴＣＲＢＶ１３Ｓ２のＴＨｙによるＫ１８．１およびＫ１８．２ｅｎｖ対立遺伝子の免疫認識を用量依存方式で特異的に阻止したが（図１ｉおよびｊ）、前免疫血清は作用しなかった（注記３）。次に、本発明者は、この抗血清を用いて、ＥＢＶ感染細胞によるＴＣＲＢＶ１３活性化が、Ｋ１８ｅｎｖによって媒介されたことを証明した。図１ｋおよびｌに示されるように、このｅｎｖ抗血清は、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬおよびＥＢＶ感染ＢＬ４１によるこれらＴＨｙの刺激を遮断した。
【００６７】
もう一方において、Ｅｎｖ抗血清は、抗ＣＤ３応答に作用しなかったし、非特異的阻止は、前免疫血清では認められなかった。更に、マーモセット細胞系Ｂ９５−８は、ＥＢＶの潜伏および溶菌遺伝子両方を発現し且つ高力価のウイルスを生じるが、ＨＥＲＶ−Ｋ１８プロウイルスを含有しないものであり、これは、ＴＣＲＢＶ１３ ＴＨｙを刺激しなかった。これらデータは、ＴＣＲＢＶ１３特異的ＥＢＶ ＳＡｇ活性が、内因性ＨＥＲＶ−Ｋ１８プロウイルスのｅｎｖ遺伝子産物によるという証拠を与える。
【００６８】
ＥＢＶが、ＣＤ４８の場合のように、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ発現をアップレギュレーションしうるかどうか調べるために、本発明者は、Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子を全て検出するが、他のＨＥＲＶ−Ｋｅｎｖ転写物を検出しないように設計されたＲＮアーゼ保護検定（注記４）を用いた。図２ａ〜ｃで理解されうるように、これらｅｎｖ転写物は、Ｂ９５−８ ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ中で容易に検出され、そしてＥＢＶ−ＢＬ４１細胞が、Ｂ９５−８ウイルスの感染によってＥＢＶ＋に変換された場合、更に高くアップレギュレーションされる。ＰＭＡでのＡＰＣの処理は、Ｋ１８ｅｎｖ転写に作用しなかった。したがって、ＳＡｇ活性のＰＭＡ増大は、Ｋ１８ｅｎｖ転写レベルで作用しない。ＰＭＡは、おそらくは、ＭＨＣクラスＩＩ分子または補助分子のアップレギュレーションによって、ＳＡｇ提示の効率を増加させるように作用していると考えられる。これらデータは、ＥＢＶが、Ｋ１８ｅｎｖ発現を転写的に活性化することを示している。
【００６９】
一次Ｔ細胞へのＫ１８ｅｎｖの刺激活性を確かめるために、本発明者は、Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０細胞によって誘導される末梢血Ｔ細胞の増殖を測定した。増殖は、共培養から４８時間後に評価した（注記５）。図３ａで理解されうるように、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖは、Ｔ細胞を激しく且つ急速に刺激したが、前処理されたＡ２０／ｐＣＤＬＩは、最小限の活性しか与えなかった。この応答は、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性について以前に示されたように、自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬで、またはマイトジェンＰＨＡで引き出される応答に匹敵した。Ｋ１８ｅｎｖのＥＢＶ誘導が、この多クローン性増殖を作動していたことを実証するために、本発明者は、再度、Ｋ１８ｅｎｖペプチドに対して上昇したウサギ抗血清を用いて抗体阻止実験（注記６）を行った（図３ｂ）。この抗血清は、末梢血Ｔ細胞がＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖに対して用量依存式に応答することを阻止したが、前免疫血清は阻害的ではなかった。ｅｎｖ抗血清は、更に、Ｂ９５−８ＥＢＶでのＢ細胞の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 形質転換から得られる自己由来ＬＣＬに対するＥＢＶ血清陰性ドナーのＴ細胞増殖応答を完全に阻止したが、マイトジェンＰＨＡへの応答は、影響されなかった。更に、これらデータは、この引き出されたＴ細胞増殖が、強力なリコール応答によった可能性を除外する。更に、このＥＢＶ−ドナーによる応答は、これらＴＨｙについて得られた結果に類似して、ＥＢＶ＋マーモセット細胞系Ｂ９５−８には認められなかった（図１ｋおよびｌ）。マーモセットは、ＥＢＶに容易に感染するが、持続感染を樹立しないということは興味深い。したがって、ＥＢＶ感染時にＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖによって引き出されるＳＡｇ活性は、宿主中のＥＢＶの長期間潜伏に必要である可能性がある。
【００７０】
本発明者は、Ｂ細胞のＥＢＶ感染が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子のトランス活性化をもたらし、これが、ＥＢＶ関連ＳＡｇとして以前に識別されたＴＣＲＢＶ１３特異的ＳＡｇ活性を発現するということを示している。Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４，９７１−９８０（１９９６）。これは、内因性ＳＡｇを誘導する微生物病原体をそれ自体の使用のために初めて実証するものである。持続性ヘルペスウイルスに利益を与える可能性がある内因性レトロウイルスを進化論的に存続させてきた生物学的活性の相互作用を研究することは、興味深いであろう。このＳＡｇ活性の検出には、ネズミトランスフェクタントがＫ１８ｅｎｖ遺伝子産物をｈＴＣＲＢＶ特異的ＴＨｙに提示する、高度に規定されたシステムが必要であった。これらＴＨｙのキメラヒト／マウスＴＣＲは、ＴＣＲＢＶ１３．１、１３．２および９の遺伝子産物に選択性を示した。一次細胞において、ＥＢＶ関連Ｔ細胞応答は、最初はＴＣＲＢＶ１３に限られるが、速やかに多クローン性になった。実際に、本発明者は、ここで、Ｋ１８ｅｎｖが、マウスＡＰＣによって与えられたにせよＥＢＶ感染Ｂ細胞によって与えられたにせよ、末梢血Ｔ細胞中で多クローン性応答を引き起こしたことを示している。類似の作用は、細菌ＳＡｇについての毒素滴定実験で認められており、Ｋ１８．１ＥｎｖのＴＣＲＢＶ７特異性の最初の知見についての議論を説明すると考えられている。
【００７１】
したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ ＥＢＶ感染は、強力なＴ細胞刺激活性を有する内因性プロウイルスの発現をもたらし、ＥＢＶ病原性を理解するための広範な関連性を有する。広範囲のＴ細胞浸潤は、ＥＢＶ関連腫瘍、ホジキンリンパ腫および鼻咽頭癌の特徴であり、移植関連リンパ腫の発症における活性化Ｔヘルパー細胞の役割について十分に証明される。更に、広範囲に及ぶリンパ球増加症は、急性伝染性単核球症の特徴である。ＥＢＶに誘発されるＳＡｇ活性は、これら過程のいずれにおいてもある役割を果たしうると考えられる
次の注記および参考文献は、本明細書中に引用され、本明細書中に援用される。
【００７２】
注記
（注記１）全ての細胞系を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸Ｎａ、β−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。ＥＢＶ細胞系、およびＨＥＲＶ−Ｋ１８．２ｅｎｖを発現する安定なＡ２０トランスフェクタントを、ＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）で３７℃において一晩、次に、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，０．１ｍｇ／ｍｌ）で１時間処理し、ＰＢＳで充分に洗浄した。細胞を計数し、そして９６ウェル丸底プレートの四重ウェル中に、２ｘ１０４個／ウェルの各細胞タイプを用いて、ＴＨｙと一緒に再懸濁させた。３７℃で４８時間後、それらプレートを−８０℃で凍結させて細胞を溶解させ、そして融解した上澄みを、ｍＩＬ−２の存在についてＥＬＩＳＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって調べ、ｒＩＬ−２についての標準曲線（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と比較した。正対照として、ＴＨｙを、プレート結合抗ＣＤ３（１４５ ２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で刺激した。
【００７３】
（注記２）Ｋ１８．１またはＫ１８．２ｅｎｖ、またはｐＣＤＬＩでトランスフェクションされたＡ２０、およびＥＢＶ細胞系を、上のようにＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理し、そして２ｘ１０４個／ウェルのＴＨｙを用いて、５：１または１：１のＡＰＣ：レスポンダー比でＴＨｙと一緒に再懸濁させた。各ＴＨｙについてのＩＬ−２生産は、プレート結合抗ＣＤ３への応答に基づく最大％として表した。
【００７４】
（注記３）抗血清阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）研究は、１：１００または１：２００に希釈されたウサギ抗Ｅｎｖペプチド１１６−１３０抗血清、または１：１００の前免疫血清と一緒に、ＡＰＣを３７℃において３０分間プレインキュベートすることによって行った。ＡＰＣ：レスポンダー比は、２ｘ１０４個／ウェルのＴＨｙについて２：１であった。プレートを２４時間目に凍結させ、融解した上澄みを、上のようにｍＩＬ−２について調べた。
【００７５】
（注記４）２ｘ１０８個のＢＬ４１、ＢＬ４１／Ｂ９５−８（Ｇ．Ｌｅｎｏｉｒ からのａ）またはＢ９５−８ＬＣＬ（１０６個の末梢血Ｂ細胞を、培地中で１：１に希釈された１ｍｌの５ｄＢ９５−８ウイルス上澄みで、３７℃において１．５時間形質転換することによって作成後、１０％ＦＣＳ／完全ＲＰＭＩ培地中で数週間増殖させた）を、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で０、２、８または１６時間処理後、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で調製した。ＲＮアーゼ保護検定は、前に記載のように行ったが、１００μｇ／列の全ＲＮＡについて行った。対照として、トランスフェクションされていないＡ２０細胞からの１００μｇのＲＮＡと、ＨＥＲＶ−Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０（ＩＤＤＭ４６５）からの２０μｇのＲＮＡとをゲル上に載せた。（このトランスフェクタントが、ＬＣＬと比較して大きくｅｎｖ遺伝子を過発現したことは、注目されるべきである）。デンシトメトリー値は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ プログラムを用いて、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ １０００でオートラジオグラフを走査することによって得た。Ｋ１８ｅｎｖ：ｈＴＢＰ（ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質）比を決定した。
【００７６】
（注記５）末梢血単核細胞は、健康な成人有志より入手し、１０％ＦＣＳ／完全ＲＰＭＩ培地中において３７℃で一晩プレートして（ｐｌａｔｅ）、単球を付着させた後、Ｔ細胞源として用いた。ＨＥＲＶ−Ｋ１８．１ｅｎｖまたはｐＣＤＬＩ単独でトランスフェクションされたＡ２０、または自己由来Ｂ細胞から形質転換されたＢ９５−８ＬＣＬを、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で一晩、次に、マイトマイシンＣ（０．１ｍｇ／ｍｌ）で１時間処理し、ＰＢＳで充分に洗浄した。ＡＰＣおよびＴ細胞を、９６ウェル丸底プレート中の四重ウェル中において１０５個／ウェルのＴ細胞を用いて、いろいろな比率で再懸濁させた。３７℃で４８時間後、細胞に（３Ｈ）チミジン（１μＣｉ／ウェル）を１２時間適用後、細胞を採取し、（３Ｈ）取込みについて計数した。
【００７７】
（注記６）抗血清阻止研究は、全く同じに行ったが、しかしながら、Ｔ細胞添加前に、ＡＰＣを、１：１００または１：２００に希釈したＥｎｖ抗血清、または１：１００の前免疫血清と一緒に３０分間プレインキュベートした。
【００７８】
本発明へのいろいろな修正および変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができるということは、当業者に理解されるであろう。したがって、本発明の修正および変更が、請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内になるという条件ならば、本発明はそれらを包含するものである。
【００７９】
本出願中にある参考文献は、本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
本明細書の一部分に包含される且つそれを構成する添付の図面は、本発明の態様を詳しく説明し、そして明細書と一緒に、本発明の目的、利点および原理を説明するのに役立つ。
【図１】
図１ａ〜ｃは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子が、ＥＢＶ関連ＳＡｇのように、ｈＴＣＲＢＶ１３およびｈＴＣＲＢＶ９を選択的に活性化することを示している。図１ａは、トランスフェクションされていないＡ２０細胞、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８．２ｅｎｖで安定してトランスフェクションされたＡ２０の５種類の個々のクローンの、ＰＭＡで前処理後、等数のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１またはｈＴＣＰＢＶ８ＴＨｙと一緒に再懸濁されたものに応答したＩＬ−２生産を示す。このＩＬ−２応答を、Ｋ１８．２ｅｎｖドナーからのＰＭＡ処理されたＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬと、および抗ＣＤ３クロスリンケージによって得られる最大ＩＬ−２生産と比較した。図１ｂ〜ｈは、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子１または２でトランスフェクションされたＡ２０、またはベクターのみ（それぞれ、Ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ、Ａ２０／Ｋ１８．２ｅｎｖ、Ａ２０／ｐＣＤＬＩ）に応答したＩＬ−２生産を示しているが、Ｂ９５−８で形質転換されたＬＣＬ、ＢＬ４１およびＢＬ４１／Ｂ９５−８に感染した細胞は、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理し、そして５：１（黒棒）または１：１（白棒）のＡＰＣ：レスポンダー比の示されたｈＴＣＲＢＶ ＴＨｙと一緒に再懸濁させた。結果は、抗ＣＤ３クロスリンケージによる各ＴＨｙの刺激に基づく最大ＩＬ−２生産百分率として表されている。この検定についての最大ＩＬ−２生産（ｐｇ／ｍｌ）：ＴＣＲＢＶ２＝３８９．１±１０８．２；ＴＣＲＢＶ３＝２５５．７±１６．３；ＴＣＲＢＶ８＝４９７．２±１１．７；ＴＣＲＢＶ９＝３４．１±１４．７；ＴＣＲＢＶ１３Ｓ１＝１４１．２±１３．５；ＴＣＲＢＶ１３Ｓ２＝１９．８±９．９；およびＴＣＲＢＶ１７Ｓ１＝５８．０５±３６．９。
図１ｉ〜ｍは、抗ＨＥＲＶ Ｋ１８ｅｎｖ抗血清およびＭＨＣクラスＩＩ抗体が、Ｋ１８ｅｎｖトランスフェクタントおよびＥＢＶ関連ＳＡｇによるＴＨｙの活性化を阻止するということを示す。図１ｉおよび１ｊは、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ、Ａ２０／Ｋ１８．２ｅｎｖの、１：１００または１：２００に希釈されたＥｎｖ抗血清と一緒に、または前免疫血清（１：１００）と一緒に３０分間インキュベート後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２を２：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えたものに応答したＩＬ−２生産を示す。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。この応答を、Ａ２０／ｐＣＤＬＩ（負の対照）と比較した。図１ｋおよび１ｌは、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで前処理されたＢ９５−８マーモセット細胞、Ｂ９５−８ ＬＣＬ、ＢＬ４１またはＢＬ４１／Ｂ９５−８の、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２ ＴＨｙと一緒にインキュベートされたものに応答したＩＬ−２生産を示す。Ｂ９５−８ ＬＣＬおよびＢＬ４１／Ｂ９５−８は、更に、１：１００または１：２００に希釈されたＥｎｖ抗血清で、または前免疫血清（１：１００）で３０分間前処理後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙまたはｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ２を２：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えた。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。これら応答を、抗ＣＤ３クロスリンケージによって引き出される応答と比較した。毒性対照として、Ｅｎｖ抗血清を抗ＣＤ３ウェルにも加えた。図１ｍは、ＰＭＡで前処理されたＡ２０、Ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖまたはＢ９５−８ ＬＣＬの、ＨＬＡ．ＤＲ、Ｈ−２Ｄｄ、Ｉ−ＡｄまたはＩ−Ｅｋ／ｄに特異的な抗体とプレインキュベート後、ｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１に１：１のＡＰＣ／レスポンダー比で加えたものに応答したＩＬ−２生産を示す。ＩＬ−２生産は、２４時間後に測定した。
【図２】
図２ａ〜ｃは、Ｂ９５−８ ＥＢＶが、Ｂ細胞中でのＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ発現を転写的に活性化するということを示している。図２ａは、Ｂ９５−８で形質転換されたＬＣＬ、ＢＬ４１およびＢＬ４１／Ｂ９５−８に感染した細胞を、ＰＭＡで０、２、８または１６時間処理し、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ対立遺伝子に特異的なリボプローブおよびｈＴＢＰ（負荷対照 （ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ））と一緒にインキュベート後、ＲＮアーゼで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上で実験した細胞からの全ＲＮＡを示す。ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖの保護されたフラグメントは、３００ｂで、ｈＴＢＰについてはダブレットとして１６１ｂで検出された。２００ｂダブレットは、ｈＴＢＰの部分消化を示している。対照として、Ａ２０と、ＨＥＲＶ Ｋ１８．１でトランスフェクションされたＡ２０とからのＲＮＡを包含した。ａ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖ構築物は、リボプローブによって保護されている追加の３０ｂの Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクター配列を有し、これは正対照と３００ｂＫ１８ｅｎｖバンドとの間のサイズ差を説明する。Ｋ１８ｅｎｖ：ｈＴＢＰダブレットのデンシトメトリー値比率を、下の各列に示す。図２ｂは、３種類の異なったドナー（１〜３）からの精製Ｂ細胞と、同じ３種類のドナーからのＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬとに由来するＲＮＡを用いて行われた相対量的ＲＴ−ＰＣＲを示している。プライマーは、ｅｎｖ遺伝子３’ＬＴＲを越える１６１ｂｐＨＥＲＶ Ｋ１８リードスルー転写物、および３’ＬＴＲから１２２ｂｐ下流まで位置する隣接した染色体１配列を検出するように設計した。２５回のＰＣＲサイクルは、直鎖状範囲内の産物を生じるように決定した。これらリードスルー転写物はきわめてまれであったので、ＰＣＲは、［３２Ｐ］α−ｄＣＴＰの存在下で行った。内因性標準として、１８ｓ ｒＲＮＡ４８９ｂｐ産物に特異的なプライマーを各反応で用い、そして負対照として、Ｈ２ＯのみおよびＲＴ不含の反応を同時に行った。ＰＣＲ産物を６％変性アクリルアミドゲル上で分離し、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ によって定量した。ＨＥＲＶ Ｋ１８：１８ｓ ｒＲＮＡの比率を、下の各列に印し、Ｂ９５−８形質転換後のＨＥＲＶ Ｋ１８転写物のフォールド誘導を、各個体について（Ｂ９５−８：Ｂ）示す。図２ｃは、ＬＰＳで処理されて、同じ血液ドナー由来のＢ９５−８で形質転換されたＢ ＬＣＬと比較される３種類の個体からの精製一次Ｂ細胞に応答したＩＬ−２生産を示す。ＬＰＳ Ｂ細胞もＢ９５−８ ＬＣＬも、ＰＭＡで前処理し、洗浄し、そして２ｘ１０４ＴＨｙ／四重ウェルを用いたいろいろなＡＰＣ／レスポンダー比のｈＴＣＲＢＶ１３Ｓ１ ＴＨｙと一緒にインキュベートした。ＩＬ−２生産は、４８時間後に測定した。
【図３】
図３ａおよび３ｂは、ＥＢＶ関連ＳＡｇ活性が、Ｋ１８ｅｎｖによって引き起こされるということを示している。図３ａは、Ｋ１８．１ｅｎｖでトランスフェクションされたＡ２０が、ＥＢＶ関連ＳＡｇに類似した速度論および大きさで末梢血Ｔ細胞を活性化したということを示している。ＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理されたＡ２０／Ｋ１８．１ｅｎｖまたはＡ２０／ｐＣＤＬＩ、および自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬを、４８時間Ｔ細胞増殖検定でＡＰＣとして用いたが、［３Ｈ］チミジンの取込みによって測定したところ、１：１（黒棒）、１：３（灰色棒）および１：１０（白棒）のＡＰＣ：レスポンダー比は、Ｔ細胞増殖が、抗原投与量に依存することを示している。この応答をマイトジェンＰＨＡと比較し、ＡＰＣは、比較のために示されているにすぎない。図３ｂは、Ｋ１８ｅｎｖ抗ペプチド（ａ．ａ．１１６〜１３０）抗血清が、ＰＭＡ／マイトマイシンＣで処理されたＡ２０／Ｋ１８．１の、１：１００および１：２００希釈でプレインキュベートされたものへの４８時間Ｔ細胞増殖を阻止したのに対して、前免疫血清は阻止しなかったことを示している。更に、ＥＢＶ血清陰性ドナーからの自己由来のＢ９５−８で形質転換されたＬＣＬへのＴ細胞増殖は、ｅｎｖ抗血清によって阻止されたが、前免疫血清では阻止されなかったのに対して、ｅｎｖ抗血清は、ＰＨＡによるＴ細胞増殖に作用しなかった。Ｂ９５−８マーモセット細胞系は、高力価ＥＢＶを生じるが、これは、ＥＢＶ血清陰性ドナーＴ細胞に刺激性ではなかった。
【図４】
図４は、配列番号：１、配列番号：３および配列番号：４のＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖアミノ酸配列を示す。
Claims (17)
- ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するおよび／または予防するためのワクチンであって、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ配列番号：１またはその免疫原性フラグメント、またはＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖをコードする核酸またはそのフラグメントおよび薬学的に許容しうるキャリヤーを含むワクチン。
- 免疫原性フラグメントが、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４から成る群より選択される請求項１に記載のワクチン。
- 免疫原性フラグメントが配列番号：２である請求項１に記載のワクチン。
- 配列番号：２のアミノ酸配列を有する単離されたペプチド。
- 免疫原性フラグメントが、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖタンパク質全体またはそのペプチドを含み、ここにおいて、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖのスーパー抗原Ｔ細胞刺激活性が減少している請求項１に記載のワクチン。
- ＥＢＶ感染の危険がある個体のＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を予防する方法であって、該個体に、請求項１、２または３に記載のワクチンを投与することを含む方法。
- ＥＢＶ関連障害を有する個体を処置する方法であって、該個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの処置有効量を投与することを含む方法。
- ＥＢＶ関連障害が、伝染性単核球症またはＥＢＶに誘発されるリンパ腫である請求項７に記載の方法。
- ＥＢＶによる感染に感受性の個体に、ＥＢＶによる感染への受動免疫を与える方法であって、該個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖ抗体組成物を投与することを含む方法。
- 免疫抑制された個体のＥＢＶ関連障害を予防する方法であって、該個体に、請求項１、２および３に記載のワクチンを投与することを含む方法。
- 免疫抑制療法の開始前に、ワクチンを投与する請求項１０に記載の方法。
- 前記個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの処置有効量を投与することを含む請求項７に記載の方法。
- 前記個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの処置有効量を投与することを含む請求項７に記載の方法。
- ＥＢＶ関連自己免疫障害を処置する方法であって、
（ａ）ＥＢＶ陽性の免疫無防備状態個体を識別し；そして
（ｂ）該免疫無防備状態個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの有効量を投与することを含む方法。 - 免疫無防備状態個体の腫瘍形成性形質転換を処置する方法であって、
（ａ）早期腫瘍形成性形質転換に関連する臨床症状を示す免疫無防備状態個体を識別し；そして
（ｂ）該免疫無防備状態個体に、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントの有効量を投与することを含む方法。 - 腫瘍形成性形質転換が、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、リンパ増殖性障害、ＥＢＶ陽性リンパ腫、ＥＢＶ陽性乳癌、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌を引き起こす請求項１５に記載の方法。
- 包装材料および該包装材料中に含有された薬剤を含む製品であって、該包装材料が、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連障害を処置するための、有効量で十分な期間投与することができる該薬剤を指示するラベルを含み、該薬剤が、ＨＥＲＶ−Ｋ１８ｅｎｖに対する抗体またはそのフラグメントを、薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に含む製品。
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