JP2004515215A - Gタンパク質結合受容体 - Google Patents
Gタンパク質結合受容体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004515215A JP2004515215A JP2001587153A JP2001587153A JP2004515215A JP 2004515215 A JP2004515215 A JP 2004515215A JP 2001587153 A JP2001587153 A JP 2001587153A JP 2001587153 A JP2001587153 A JP 2001587153A JP 2004515215 A JP2004515215 A JP 2004515215A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- seq
- polypeptide
- sequence
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 title abstract description 61
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 title abstract description 60
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 329
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 329
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 329
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 218
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 138
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 67
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 240
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 221
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 215
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 181
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 137
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 121
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 110
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 99
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 81
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 73
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 69
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 68
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 68
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 56
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 54
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 39
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 30
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 30
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 45
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 23
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 9
- 101000887490 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(z) subunit alpha Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000052301 human GNAZ Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 188
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 107
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 96
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 95
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 63
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 51
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 47
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 44
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 43
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 40
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 37
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 25
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 25
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 25
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 24
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 22
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 16
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 15
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 12
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 10
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 10
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 10
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 10
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 10
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 10
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 9
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 9
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 7
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 7
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 7
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 7
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 7
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 7
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 7
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 7
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 6
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 6
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 5
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 5
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 5
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 5
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 5
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 4
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 4
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 4
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 4
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 4
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 102000016193 Metabotropic glutamate receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010010914 Metabotropic glutamate receptors Proteins 0.000 description 4
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 201000001352 cholecystitis Diseases 0.000 description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 4
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 4
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 4
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 208000012672 seasonal affective disease Diseases 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 3
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 3
- 102000001796 Melanocortin 4 receptors Human genes 0.000 description 3
- 102000016978 Orphan receptors Human genes 0.000 description 3
- 108070000031 Orphan receptors Proteins 0.000 description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 3
- 108010002724 Pheromone Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 3
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 3
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 3
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108010021436 Type 4 Melanocortin Receptor Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 102000004136 Vasopressin Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000643 Vasopressin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 102100038344 Vomeronasal type-1 receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 3
- 239000002427 pheromone receptor Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 3
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- 208000031091 Amnestic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 2
- 206010003226 Arteriovenous fistula Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 102100036465 Autoimmune regulator Human genes 0.000 description 2
- 208000012219 Autonomic Nervous System disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 2
- 206010004552 Bicuspid aortic valve Diseases 0.000 description 2
- 208000015163 Biliary Tract disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000004020 Brain Abscess Diseases 0.000 description 2
- 208000007257 Budd-Chiari syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 2
- 206010008635 Cholestasis Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 2
- 102000012437 Copper-Transporting ATPases Human genes 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 208000019736 Cranial nerve disease Diseases 0.000 description 2
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 2
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 2
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 206010062608 Endocarditis noninfective Diseases 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 206010058838 Enterocolitis infectious Diseases 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 206010015226 Erythema nodosum Diseases 0.000 description 2
- 206010049466 Erythroblastosis Diseases 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000007217 Esophageal Stenosis Diseases 0.000 description 2
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- 206010061846 Extradural abscess Diseases 0.000 description 2
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- 101800002068 Galanin Proteins 0.000 description 2
- 102000011392 Galanin receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050001605 Galanin receptor Proteins 0.000 description 2
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 2
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 2
- 206010058991 Hepatic vein occlusion Diseases 0.000 description 2
- 206010019713 Hepatic vein thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 description 2
- 101000928549 Homo sapiens Autoimmune regulator Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 206010021518 Impaired gastric emptying Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-proline amide Natural products NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062062 Large intestinal obstruction Diseases 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 208000024369 Libman-Sacks endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 206010058225 Lupus endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 206010026712 Mallory-Weiss syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 2
- 206010027260 Meningitis viral Diseases 0.000 description 2
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 2
- 206010068836 Metabolic myopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 2
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 2
- 206010028643 Myopathy endocrine Diseases 0.000 description 2
- 206010028648 Myopathy toxic Diseases 0.000 description 2
- 208000023137 Myotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009905 Neurofibromatoses Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010030194 Oesophageal stenosis Diseases 0.000 description 2
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 102100036050 Phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A Human genes 0.000 description 2
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 2
- 208000024571 Pick disease Diseases 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 2
- 206010036774 Proctitis Diseases 0.000 description 2
- 206010036783 Proctitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 208000012287 Prolapse Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 206010037075 Protozoal infections Diseases 0.000 description 2
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 2
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 2
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 2
- 206010037651 Pyometra Diseases 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 206010037779 Radiculopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 2
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 2
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 2
- 201000007981 Reye syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 102100028927 Secretin receptor Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- 208000029033 Spinal Cord disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 2
- 208000010112 Spinocerebellar Degenerations Diseases 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000000627 Thyrotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 102400000336 Thyrotropin-releasing hormone Human genes 0.000 description 2
- 101800004623 Thyrotropin-releasing hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 208000000323 Tourette Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 208000026911 Tuberous sclerosis complex Diseases 0.000 description 2
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 2
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 102000055135 Vasoactive Intestinal Peptide Human genes 0.000 description 2
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 2
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 2
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 2
- 206010058990 Venous occlusion Diseases 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 201000011032 Werner Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000027207 Whipple disease Diseases 0.000 description 2
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000017733 acquired polycythemia vera Diseases 0.000 description 2
- 208000009621 actinic keratosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000006986 amnesia Effects 0.000 description 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 2
- 206010002906 aortic stenosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 2
- 208000018300 basal ganglia disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021654 bicuspid aortic valve disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027119 bilirubin metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000005761 carcinoid heart disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 206010007776 catatonia Diseases 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000021617 central nervous system development Effects 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 2
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000007870 cholestasis Effects 0.000 description 2
- 231100000359 cholestasis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003200 chromosome mapping Methods 0.000 description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 2
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 2
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- VZFRNCSOCOPNDB-UHFFFAOYSA-N domoic acid Natural products OC(=O)C(C)C=CC=C(C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VZFRNCSOCOPNDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 2
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 2
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 201000000165 epidural abscess Diseases 0.000 description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 2
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 208000001288 gastroparesis Diseases 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 2
- 208000018578 heart valve disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 2
- 208000007386 hepatic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 206010019680 hepatic infarction Diseases 0.000 description 2
- 201000011200 hepatorenal syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000003636 hereditary ataxia Diseases 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000036796 hyperbilirubinemia Diseases 0.000 description 2
- 208000008384 ileus Diseases 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000027139 infectious colitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 208000001024 intrahepatic cholestasis Diseases 0.000 description 2
- 230000007872 intrahepatic cholestasis Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000007261 marantic endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 208000018389 neoplasm of cerebral hemisphere Diseases 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 201000004931 neurofibromatosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 2
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 208000016135 nonbacterial thrombotic endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 2
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 2
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 2
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 201000002765 pyometritis Diseases 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 206010061928 radiculitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 2
- 208000004124 rheumatic heart disease Diseases 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700027603 secretin receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 229940034199 thyrotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000009999 tuberous sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 2
- 201000011531 vascular cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 2
- 201000009371 venous hemangioma Diseases 0.000 description 2
- 201000010044 viral meningitis Diseases 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNSMPSPTFDIWRQ-GSVOUGTGSA-N (2r)-4-amino-2-(methylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(N)=O LNSMPSPTFDIWRQ-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- PFCLMNDDPTZJHQ-XLPZGREQSA-N 2-amino-7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PFCLMNDDPTZJHQ-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- ZPZDIFSPRVHGIF-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropylsilicon Chemical compound NCCC[Si] ZPZDIFSPRVHGIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 241000157882 Acrasida Species 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003594 Ataxia telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGBVRMYSNSKIEF-UHFFFAOYSA-N Benzylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CC1=CC=CC=C1 OGBVRMYSNSKIEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102400000140 C5a anaphylatoxin Human genes 0.000 description 1
- 101800001654 C5a anaphylatoxin Proteins 0.000 description 1
- 108700011778 CCR5 Proteins 0.000 description 1
- 101100152433 Caenorhabditis elegans tat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 239000005496 Chlorsulfuron Substances 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 108700020473 Cyclic AMP Receptor Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 1
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229940125633 GPCR agonist Drugs 0.000 description 1
- 102400001370 Galanin Human genes 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 206010072079 Glucocorticoid deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101001042049 Human herpesvirus 1 (strain 17) Transcriptional regulator ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 101000999690 Human herpesvirus 2 (strain HG52) E3 ubiquitin ligase ICP22 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010008364 Melanocortins Proteins 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 101100018717 Mus musculus Il1rl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100042676 Mus musculus Skap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000000592 Nasal Polyps Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029216 Nervousness Diseases 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010093625 Opioid Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001490 Opioid Peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 1
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000881705 Porcine endogenous retrovirus Species 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101710097451 Putative G-protein coupled receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100039117 Putative vomeronasal receptor-like protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 101150006985 STE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100204213 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) STE3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 102000003141 Tachykinin Human genes 0.000 description 1
- 101000783611 Takifugu rubripes 5-hydroxytryptamine receptor 1D Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical compound OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 1
- QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-difluoro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(F)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 239000000674 adrenergic antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011256 aggressive treatment Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 108091008690 chemoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003210 dopamine receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000003136 dopamine receptor stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000001752 female genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 108091005708 gustatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000938 histamine H1 antagonist Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000027928 long-term synaptic potentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 101710130522 mRNA export factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000000260 male genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000002865 melanocortin Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960003248 mifepristone Drugs 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N molport-023-220-247 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CNC=N1 SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000003152 motion sickness Diseases 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000472 muscarinic agonist Substances 0.000 description 1
- 230000003551 muscarinic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 208000016366 nasal cavity polyp Diseases 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 1
- 210000001706 olfactory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001517 olfactory receptor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000003399 opiate peptide Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N phenylarsine oxide Chemical compound O=[As]C1=CC=CC=C1 BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 208000006155 precocious puberty Diseases 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229940127293 prostanoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003814 prostanoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009991 second messenger activation Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000697 sensory organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000001548 stomatognathic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 108060008037 tachykinin Proteins 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001779 taste bud Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000008280 toxic mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N wybutosine Natural products C1=NC=2C(=O)N3C(CCC(NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1C1OC(CO)C(O)C1O QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N wybutosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N3C(CC[C@H](NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/06—Antimigraine agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
- A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Obesity (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Psychology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
Abstract
本発明はヒトGタンパク質結合受容体 (GCREC) およびGCRECを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、GCRECの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防におけるこれらの配列の利用と、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外因性化合物の効果の算定におけるこれらの配列の利用に関する。
【0002】
(発明の背景)
シグナル伝達は、それによって細胞が細胞外シグナルに応答するような一般的プロセスである。原形質膜でのシグナル伝達は、ホルモン、神経伝達物質または成長因子などのシグナル分子が細胞膜受容体と結合することから開始する。受容体が活性化され、転写因子などの細胞内標的分子の活性化で終了する細胞内の生化学的カスケードを誘発する。シグナル伝達のこのプロセスは、細胞増殖、分化及び遺伝子転移を含む全てのタイプの細胞機能を制御する。同定された遺伝子の最大ファミリーの1つによりコードされたGタンパク質結合受容体(GPCR)は、原形質膜での細胞外シグナルの伝達において中心的役割を果たす。GPCRが治療の標的として成功であることは歴史的に証明されている。
【0003】
GPCRは、7つの疎水性膜貫通ドメインの存在により特徴付けられた膜内在性タンパク質であり、それらのドメインがまとまって逆平行アルファ(α)螺旋の束を形成するようになる。GPCRのサイズは、400以下から1000以上のアミノ酸に及ぶ(Strosberg, A.D. (1991) Eur. J. Biochem. 196:1−10、Coughlin, S.R. (1994) Curr. Opin. Cell Biol.6:191−197)。GPCRのアミノ末端は、細胞外にあり、長さが可変で、多くの場合グリコシル化される。カルボキシル末端は、細胞質内にあり、通常はリン酸化される。細胞外ループは、細胞内ループと交互に現れ、膜貫通ドメインを結合する。第2及び第3細胞外ループを結合するシステインジスルフィド架橋は、アゴニスト及びアンタゴニストと相互に作用し得る。GPCRの最も保存されたドメインは、膜貫通ドメイン及び最初の2つの細胞質ループである。膜貫通ドメインは、受容体の構造的及び機能的特徴をある程度明らかにする。大抵の場合、αへリックスの束がリガンド結合ポケットを形成する。細胞外N末端セグメント即ち1個若しくは数個の第3細胞外ループは、リガンド結合にも関与し得る。リガンド結合は、受容体の細胞内部分で構造変化を誘導することにより受容体を活性化する。次に、この活性化された受容体の大きな第3の細胞内ループが、更なる細胞内のシグナル伝達作用を仲介するヘテロ三量体であるグアニンヌクレオチド結合Gタンパク質複合体と相互作用する。この細胞内のシグナル伝達作用には、サイクリックAMP(cAMP)、ホスホリパーゼC、およびイノシトール三リン酸などのセカンドメッセンジャーの活性化、並びに活性化されたGPCRとイオンチャネルタンパク質との相互作用が含まれる(Watson, S. および S. Arkinstall (1994) The G−protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 2−6ページ; Bolander, F.F. (1994) Molecular Endocrinology, Academic Press, San Diego CA, 162−176ページ; Baldwin, J.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:180190等参照)。
【0004】
GPCRには、感覚性シグナルメディエータ(例えば光及び嗅覚刺激性分子)の受容体、アデノシン、γアミノ酪酸(GABA)、肝細胞成長因子、メラノコルチン、ニューロペプチドY、オピオイドペプチド、オプシン、ソマトスタチン、タキキニン、血管作用性腸管ポリペプチドファミリー及びバソプレシン、生体アミン(例えばドーパミン、エピネフリン及びノルエピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸(代謝調節作用)、アセチルコリン(ムスカリン様作用)及びセロトニン)、ケモカイン、炎症の脂質メディエータ(例えばプロスタグランジン及びプロスタノイド、血小板活性化因子及びロイコトリエン)及びペプチドホルモン(例えばボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン、C5aアナフィラトキシン、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ニューロキニン及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)及びオキシトシン)がある。同定された刺激に対する受容体として作用するGPCRは、オーファン受容体として知られている。
【0005】
GPCRファミリーの多様性は、別のスプライシングによって更に増加する。多くのGPCR遺伝子にはイントロンが含まれ、スプライシング変異体が同定されるそのような受容体は現在では30を超えている。変異の数が最も大きいのは、タンパク質C末端においてである。細胞外ループまたは膜貫通ドメインは頻度が低いのに対して、N末端及び細胞質内ループ変異体もまた高頻度である。変異が発生し得るような部位を2ヶ所以上有する受容体もある。スプライシング変異体は、分布、シグナル伝達、結合、制御及びリガンド結合の特徴に観察される差異に基づき、機能的に異なる(Kilpatrick, G.J. ら (1999) Trends Pharmacol. Sd. 20:294−301)。
【0006】
GPCRは、3つの主要なサブファミリー即ちロドプシン様、セクレチン様及び代謝調節型グルタミン酸受容体サブファミリーに分けることができる。GPCRサブファミリーのメンバーは、同様の機能及び特徴的な膜7回貫通構造を共有しているが、アミノ酸配列は互いに異なる。最大のファミリーはロドプシン様GPCRを有し、ロドプシン様GPCRはホルモン、神経伝達物質及び光を含む多様な細胞外シグナルを伝送する。ロドプシンは、動物の網膜に見られる感光性GPCRである。脊椎動物では、ロドプシン分子は光受容体(杆体)細胞に見られる膜性スタックに包埋されている。各ロドプシン分子は、原形質膜ナトリウムチャネルの閉鎖に導くcGMPレベルの低下を誘発することにより光の光子に反応する。この方法で、可視シグナルが神経インパルスに変換される。その他のロドプシン様GPCRは、神経伝達物質への反応に直接関与する。このようなGPCRには、アドレナリンに対する受容体(アドレナリン受容体)、アセチルコリンに対する受容体(ムスカリン様受容体)、アデノシンに対する受容体、ガラニンに対する受容体及びグルタミン酸に対する受容体(N−メチル−D−アスパラギン酸/NMDA受容体)がある(Watson, S. および S. Arkinstall (1994) The G−Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 7−9, 19−22, 32−35, 130−131, 214−216, 221−222の各ページ、Habert−Ortoli, E. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9780−9783に概説されている)。
【0007】
ガラニン受容体は、インスリン、アセチルコリン、セロトニン及びノルアドレナリンの分泌を害する神経内分泌ペプチドガラニンの活性を仲介し、プロラクチン及び成長ホルモンの放出を刺激する。ガラニン受容体は、摂食に関する疾患、痛み、うつ病及びアルツハイマー病に関与している(Kask, K. ら (1997) Life Sd. 60:1523−1533)。その他の神経系ロドプシン様GPCRは、発達及び神経病理学において役割を有するように考えられる、リゾホスファチジン酸その他のリゾホスファチドに対する受容体など、増大する数のファミリーを含む(Chun, J.ら (1999) Cell Biochem. Biophys. 30:213−242)。 GPCRの最大のサブファミリーである嗅覚受容体もまた、ロドプシン様GPCRファミリーのメンバーである。この受容体は、臭気物質シグナルの伝達により機能する。異なる臭気を区別するためには、複数の異なる嗅覚受容体が必要である。各嗅覚感覚ニューロンは1種類の嗅覚受容体しか発現せず、特有の受容体を発現するニューロンが、鼻の経路中の異なる位置を占める。例えば、ラット脳ライブラリから単離したRA1c受容体は、脳の非常に特有な領域及び画定された嗅覚上皮の特有の区域だけに発現が限定されていることを示していた(Raining, K. ら (1998) Receptors Channels 6:141−151)。しかしながら、嗅覚様受容体の発現は嗅覚組織に限定されない。例えば、典型的なGPCR特性を有する嗅覚様受容体をコードする3つのラット遺伝子は、味覚及び嗅覚組織のみならず男性生殖組織においても発現パターンを示す(Thomas, M.B. ら (1996) Gene 178:1−5)。
【0008】
セクレチン様GPCRサブファミリーのメンバーは、セクレチン、カルシトニン、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、及び血管作用性小腸ペプチドなどのペプチドホルモンをリガンドとして有する。例えば、セクレチン受容体は、膵臓及び小腸で酵素及びイオンの分泌を刺激するペプチドホルモンであるセクレチンに対応する(前出のWatson, 278−283ページ)。セクレチン受容体は、長さが約450アミノ酸であり、胃腸細胞の原形質膜に見られる。セクレチンがその受容体に結合することにより、cAMPの産出が誘発される。
【0009】
炎症及び免疫反応に結びつけられるセクレチン様GPCRの例には、EGFのモジュールを含んだムチン様ホルモン受容体(Emrl)及びCD97受容体タンパク質がある。これらのGPCRは、最近特徴付けられたEGF−TM7受容体サブファミリーのメンバーである。これら膜7回貫通ホルモン受容体は、in vivoでヘテロ二量体として存在し、3から7の潜在的カルシウム結合EGF様モチーフを含む。CD97は、主に白血球で発現し、活性化されたB及びT細胞上で顕著に上方制御される(McKnight, A.J. および S. Gordon (1998) J. Leukoc. Biol. 63:271−280)。
【0010】
第3GPCRサブファミリーは、代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリーである。グルタミン酸は、中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。代謝調節型グルタミン酸受容体は、細胞内エフェクターの活性を調節し、長期の増強作用に関与する(前出のWatson, p.130)。Ca2+検出受容体は、カルシウムイオンの細胞外濃度の変化を検出するものであり、カルシウム結合に関与し得る酸性アミノ酸のクラスターを含む大きな細胞外ドメインを有する。代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリーには、フェロモン受容体、GABAB受容体及び味覚受容体もある。
【0011】
その他のGPCRのサブファミリーには、線虫及びCaenorhabditis briggsaeに見られる化学受容体遺伝子の2つの群があり、これらは哺乳動物の嗅覚受容体遺伝子に直接関係している。細胞膜上の接合因子への反応に関与している酵母フェロモン受容体STE2及びSTE3は、細胞性粘菌で、個々の細胞の集合を調整し、複数の発達的制御遺伝子の発現を制御すると考えられているcAMP受容体と同様に、膜7回貫通シグネチャを有する。
【0012】
GPCR突然変異は、機能または恒常的活性化の減少を招き得るものであり、多数のヒト疾患に関係してきた(前出のCoughlin)。例えば、色素性網膜炎はロドプシン遺伝子の突然変異から発生し得る。更に、甲状腺刺激ホルモン受容体の体細胞活性化突然変異は、機能亢進甲状腺アデノーマの原因となることが報告されており、恒常的活性化に感受性が高い或るGPCRが癌原遺伝子のように振舞い得ることを示唆している(Parma, J. ら (1993) Nature 365:649−651)。以下のリガンド即ち黄体形成ホルモン(思春期早発症)、バソプレシンV2(X連鎖の腎原発性糖尿病)、グルカゴン(糖尿病及び高血圧)、カルシウム(副甲状腺機能亢進症、低カルシウム尿症(hypocalcuria)、高カルシウム血症)、副甲状腺ホルモン(短肢小人症)、f33−アドレナリン受容体(肥満症、非インスリン依存型糖尿病)、成長ホルモン放出ホルモン(小人症)及び副腎皮質刺激ホルモン(糖質コルチコイド欠乏症)に対するGPCR受容体には、ヒトの疾患に関連する突然変異も含まれる(Wilson, S. ら (1998) Br. J. Pharmocol. 125:1387−.1392、Stadel, J.M. ら (1997) Trends Pharmacol. Sci. 18:430−437)。GPCRは、抑うつ症、分裂病、不眠症、高血圧、不安、ストレス、腎不全その他幾つかの心血管障害にも関与している(Horn, F. および G. Vriend (1998) J. Mol. Med. 76:464−468)。
【0013】
更に、GPCRの活性化及び阻害に直接作用する数百の新薬が過去20年のうちに認知されてきた。これらの薬の治療標的は、癌、骨粗鬆症、子宮内膜症のみならず心血管障害、胃腸障害、中枢神経系疾患を含めた幅広い疾病及び疾患に及ぶ(前出のWilson、同Stadel)。例えば、ドーパミンアゴニストのLドーパはパーキンソン病の治療に用いられ、ドーパミンアンタゴニストは精神分裂病及び初期段階のハンチントン病の治療に用いられる。アドレナリン受容体のアゴニスト及びアンタゴニストは、喘息、高血圧その他の心血管障害及び不安の治療に用いられてきた。 ムスカリン様アゴニストは、緑内障及び頻脈の治療に用いられ、セロトニン5HT1Dアンタゴニストは片頭痛に対して用いられ、ヒスタミンH1アンタゴニストはアレルギー性及びアナフィラキシー性反応、枯草熱、痒み及び動揺病に対して用いられる(前出のHorn)。
【0014】
最近の調査では、糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症を含む代謝障害の治療においてGPCRを将来的に使用する可能性を示唆している。例えば、腎原発性糖尿病の原因となる突然変異体V2バソプレシン受容体は、突然変異を含む領域に及ぶC末端V2受容体ペプチドの同時発現によりin vitroで機能的に救出され得る。これは疾病治療の新規なストラテジーを示唆する(Schoneberg, T. ら (1996) EMBO 1. 15:1283−1291)。メラノコルチン4受容体(MC4R)における突然変異は、ヒトの体重調節及び肥満症に結びつけられる。バソプレシンV2受容体の突然変異体により、これらMC4Rの突然変異体は原形質膜への輸送に欠陥があるので(Ho, G. および R.G. MacKenzie (1999) J. Biol. Chem. 274:35816−35822)、従って同様のストラテジーで処理し得る。副甲状腺ホルモン(PTH)のための1型受容体は、血流中のカルシウムホメオスタシスのPTH依存型制御を仲介するGPCRである。PTH/受容体の相互作用の研究は、骨粗鬆症の治療のための新規なPTH受容体リガンドの開発を可能にし得る(Mannstadt, M. ら (1999) Am. J. Physiol. 277:F665−F675)。
【0015】
GPCRのケモカイン受容体グループは、炎症及び感染症の治療に役立つ可能性を有する(Locati, M. および P.M. Murphy (1999) Annu. Rev. Med. 50:425−440の概説を参照)。ケモカインは、白血球輸送、造血及び血管形成の制御において細胞内シグナルとして作用する小ポリペプチドである。マウスにおける種々のケモカイン受容体の標的破壊によって、これらの受容体が異常炎症において及び多発性硬化症などの自己免疫異常において役割を果たしていることを示す。ヘルペスウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス(HIV−1)を含む感染体が、感染を促進させるために、ケモカイン受容体を利用している。ケモカイン受容体CCR5は、HIV−1によるT細胞の感染に対する補助受容体として作用するものであり、その受容体で一部が切断されたものはAIDSに対する抵抗力を生じさせた。この結果は、CCR5のアンタゴニストがAIDSの予防に有用たり得ることを示唆する。
【0016】
新たなGタンパク質結合受容体及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防において有用であり、また、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【0017】
(発明の概要)
本発明は、総称して「GCREC」、個別にはそれぞれ「GCREC−1」、「GCREC−2」、「GCREC−3」、「GCREC−4」、「GCREC−5」、「GCREC−6」、「GCREC−7」、「GCREC−8」、「GCREC−9」、「GCREC−10」、「GCREC−11」、「GCREC−12」、「GCREC−13」、「GCREC−14」、「GCREC−15」、「GCREC−16」、「GCREC−17」、「GCREC−18」、「GCREC−19」、「GCREC−20」、「GCREC−21」、「GCREC−22」および「GCREC−23」と呼ぶGタンパク質結合受容体である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択した実質上単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1−23のアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。
【0018】
また、本発明は(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1−23を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:24−46を有する群から選択される。
【0019】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列からなる天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【0020】
また、本発明は(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、(a)組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、(b)そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有する。
【0021】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。
【0022】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、(b)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(e)(a)〜(d)のRNA等価物とで構成される群から選択した実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60の連続したヌクレオチドを有する。
【0023】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(b)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(b)ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む。
【0024】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで標的ポリヌクレオチドは、(a)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、(b)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物とを含む群から選択したポリヌクレオチド配列を有する。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(b)標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【0025】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。 有効量のポリペプチドは、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列から成るポリペプチド、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列から成る天然のポリペプチド、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片を含む。一実施例では、SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、このような治療を必要としている患者にこの組成物を投与することを含む、機能的GCRECの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0026】
本発明はまた、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択されたアゴニストとしてのポリペプチドの有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。一実施態様では、本発明は機能性GCRECの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。
【0027】
本発明は更に、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片から成る群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。別の実施態様では、機能性GCRECの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。
【0028】
本発明は更に、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、(b)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる天然のポリペプチドと、(c)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、(d)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【0029】
その方法は、(a)ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と混合させる過程と、(b)ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、(c)試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【0030】
本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 標的ポリヌクレオチドは、SEQ NO ID:24−46を有する群から選択した配列を含む。 スクリーニング方法は、(a)標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、(b)標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含む。
【0031】
本発明は更に、(a)核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、(b)(i)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、(c)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(d)処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【0032】
(発明を実施するための形態)
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【0033】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その(この)」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【0034】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【0035】
(定義)
用語「GCREC」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種(特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物)から得られる実質的に精製されたGCRECのアミノ酸配列を指す。
【0036】
「アゴニスト」の語は、GCRECの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはGCRECと直接相互作用することによって、或いはGCRECが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、GCRECの活性を調節する。
【0037】
「対立遺伝子変異体」は、GCRECをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも1の突然変異から作製し得る。 また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。 ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、1個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【0038】
GCRECをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失、挿入または置換する核酸配列を有し、GCRECと同一またはGCRECの機能的特徴を少なくとも1つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、GCRECをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能或いは検出困難な多型現象と、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なGCRECとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。計画的アミノ酸置換は、GCRECの生物学的または免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【0039】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【0040】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行う。
【0041】
「アンタゴニスト」の語は、GCRECの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子またはその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはGCRECと直接相互作用することによって、或いはGCRECが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、GCRECの活性を調節する。
【0042】
「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab’)2 及びFv断片を指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる。GCRECポリペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免疫抗原として感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することができる。動物(マウス、ラット、ウサギ等)を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好みに応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【0043】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域(即ちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基(タンパク質の特定の領域または3次元構造)に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原(即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原)と競合し得る。
【0044】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成することが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸(PNA)や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2’−メトキシエチル糖または2’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5−メチルシトシン、2−デオキシウラシルまたは7−デアザ−2’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」若しくは「マイナス(−)」の語が参照DNA分子のアンチセンス鎖を、「正」若しくは「プラス(+)」がセンス鎖を指すことがある。
【0045】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えまたは合成のGCREC、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指す。
【0046】
「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5’−AGT−3’」は、相補配列「3’−TCA−5’」に結合する。
【0047】
「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列からなる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。GCREC若しくはGCRECの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム;SDS)及びその他の構成エレメント(例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等)を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【0048】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL−PCRキット(Applied Biosystems, Foster City, CA.)を用いて5’及び/または3’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて1つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及びアセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
保存アミノ酸置換では通常、(a)置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、(b)置換部位における分子の電荷または疎水性、及び/または(c)側鎖の大部分を保持する。
【0049】
「欠失」は、結果的に1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【0050】
「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも1つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylation)、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも1つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【0051】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【0052】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子またはタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【0053】
「断片」は、GCRECまたはGCRECをコードするポリヌクレオチドの固有部分であって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画定された配列の全長から1ヌクレオチド/アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、5〜1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の250または500アミノ酸(またはポリペプチドの最初の25%または50%)から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【0054】
SEQ NO ID:24−46の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。
この領域は、SEQ NO ID:24−46を特異的に同定するものであり、例えば同一ゲノム中のSEQ NO ID:24−46以外の配列とは異なるものである。SEQ NO ID:24−46の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列からSEQ NO ID:24−46を区別する類似の方法において有用である。SEQ NO ID:24−46の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ NO ID:24−46の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【0055】
SEQ NO ID:1−23の断片は、SEQ NO ID:24−46の断片によってコードされる。 SEQ NO ID:1−23の断片には、SEQ NO ID:1−23を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ NO ID:1−23の断片は、SEQ NO ID:1−23を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 SEQ NO ID:1−23の断片及び断片に対応するSEQ NO ID:1−23の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【0056】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも1つの翻訳開始コドン(例えばメチオニン)、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【0057】
「相同性」の語は、配列類似性即ち2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【0058】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、2つの配列をより有意に比較できる。
【0059】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151−153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189−191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【0060】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410)。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその1つである。その他にも、2つのヌクレオチド配列を対で直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn と blastp(後述)の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年4月21日) を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0061】
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: −2
Open Gap5 及びExtension Gap: 2 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
一致率は、完全に画定された(例えば特定のSEQ NO ID:で画定された)配列長さと比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配列から得られた断片(例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0062】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【0063】
ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2以上のポリペプチド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を(従って機能も)保存する。
【0064】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる(既に説明したのでそれを参照されたい)。CLUSTAL Vを用いて、ポリぺプチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【0065】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、2つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr−21−2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0066】
Matrix:BLOSUM62
Open Gap11 及びExtension Gap: 2 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
一致率は、完全に画定された(例えば特定のSEQ NO ID:で画定された)ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片(例えば少なくとも15、20、30、40、50、70または150の連続した残基の断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0067】
「ヒト人工染色体(HAC)」は、約6kb(キロベース)〜10MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【0068】
「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体により近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持しているような抗体分子を指す。
【0069】
「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリングするプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合(即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合)が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%(w/v)のSDS、並びに約100μg/mlのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【0070】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点(Tm)より約5〜20℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の50%がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【0071】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約0.2x SSC及び約0.1%のSDSの存在の下、約68℃で1時間の洗浄過程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSC濃度は、約0.1%のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【0072】
「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成力によって2つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析等)。 或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若しくはその核酸が固定される基質)に固定されているような2つの核酸配列間に形成され得る。
【0073】
「挿入」及び「付加」の語は、1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【0074】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【0075】
「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなGCRECのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なGCRECの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【0076】
「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【0077】
「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、特異の画定されたマイクロアレイの環境において配置されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまた他の化学化合物を指す。
【0078】
「調節(する)」の語は、GCRECの活性の変化を指す。調節することによって例えば、GCRECのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【0079】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【0080】
「機能的に結合した」は、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係があるように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。同一のリーディングフレーム内で2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。
【0081】
「ペプチド核酸」(PNA)は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端のリジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【0082】
GCRECの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク分解性開裂及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。 これらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、GCRECの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。
【0083】
「プローブ」は、GCREC、GCRECの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸配列の増幅(及び同定)に用い得る。
【0084】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100または150の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。 表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【0085】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley−Intersciences, New York NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【0086】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大5,000までの大きめのポリヌクレオチドであって32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム(マサチューセッツ州ケンブリッジのWhitehead Institute/MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能)ではユーザーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。)PrimerGenプログラム(英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【0087】
「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせなければ離隔しているような配列の2以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【0088】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであって例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応答を誘導する。
【0089】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5’及び3’の未翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【0090】
「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられる化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【0091】
DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースから構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列から構成されている。
【0092】
「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。GCRECをコードする核酸若しくはその断片、またはGCREC自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プリント等から構成され得る。
【0093】
「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基即ちエピトープ)であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離したA及びその抗体を含む反応において、エピトープA(つまり遊離し、標識されていないA)を含むポリヌクレオチドの存在が、抗体に結合している標識されたAの量を低減させる。
【0094】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメントの少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約75%、最も好ましいのは少なくとも約90%が遊離しているものを指す。
【0095】
「置換」は、1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドを各々別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【0096】
「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【0097】
「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【0098】
「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させるプロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【0099】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の1個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前述のSambrook ら (1989) 等の参考文献に記載されている。
【0100】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列1本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40%の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体(前述)、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。また、多形性変異体は、1つのヌクレオチド塩基によってポリヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」(SNP)を含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【0101】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の1本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40%の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【0102】
(発明)
本発明は、新規なヒトGタンパク質(GCREC)と、GCRECをコードするポリヌクレオチドと、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくものである。
【0103】
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、1つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号(ポリペプチドSEQ ID NO)とIncyteポリペプチド配列番号(IncyteポリペプチドID)によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号(ポリヌクレオチドSEQ ID NO)とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(IncyteポリヌクレオチドID)によって表示した。
【0104】
表2は、GenBankタンパク質(genpept)データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号(Polypeptide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号(Genbank ID NO :)を示す。列4は、各ポリペプチドとそのGenBank相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列5は、GwnBank相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【0105】
表3は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号(SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列4および列5はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列6は、シグネチャ(signature)配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列7は、タンパク質の構造/機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【0106】
合わせて、表2及び表3は本発明のポリペプチドの特性を概略的に示している。 これらの特性は、特許請求の範囲に記載されたポリペプチドがGタンパク質結合受容体であることを証明する。例えば、SEQ ID NO:2はラット味蕾受容体タンパク質(GenBank ID g1256389) と59%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。(表2参照)BLAST確率スコアは5.7e−95であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2はまた、膜7回貫通(ロドプシンファミリー)ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。スコアは146.3 であり、確率値は2.2e−45 である。(表3参照)更にSEQ ID NO:2 は、BLOCKS (BL00237) とPRINTS (PR00237) デ−タベ−スのBLIMPS 分析またProsite デ−タベ−スのProfileScan分析により決定されるGタンパク質結合受容体シグネチャ、そしてPRINTS デ−タベ−スのBLIMPS 分析によって決定される嗅覚受容体シグネチャ(PR00245) を含む。BLAST、BLIMPS、ProfileScan及びHMMによる分析に基づくと、SEQ ID NO:2 は嗅覚Gタンパク質結合受容体である。別の例において、SEQ ID NO:15 はマウス臭覚受容体MOR18(GenBank ID g6178008) に85%の同一性を有する(表2参照)。BLAST確率スコアは4.6e−138である。SEQ ID NO:15はまた、膜7回貫通受容体ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:15がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。別の例では、SEQ ID NO:16は、BLAST 分析で決定されたように確率スコア2.7e−85でマウス嗅覚受容体(GenBank ID g3983392)に72% の同一性を有する。SEQ ID NO:17は、確率スコア1.2e−109でゴリラ嗅覚受容体(GenBank ID g7211257)に97% の同一性を有する。またSEQ ID NO:18は、確率スコア4.1e−82でイヌ嗅覚受容体(GenBank ID g1314663)に51% の同一性を有する(表2参照)。SEQ ID NO:17 と SEQ ID NO:18 は、これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定されたGタンパク質結合受容体ドメインとシグネチャ配列も含む (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:16−18がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。別の例においてSEQ ID NO:19 は、BLASTにより決定されるマウス臭覚受容体S19 (GenBank ID g6532001) に56%の同一性を有する(表2参照)。BLAST 確率スコアは1.4e−88である。SEQ ID NO:19はまた、膜7回貫通(ロドプシンファミリー)ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:19がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。SEQ ID NO:1 、SEQ ID NO:3−14およびSEQ ID NO:20−23は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:1−23の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表7で記述されている。
【0107】
表4に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、或いはこれら2種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリペプチド配列識別番号(Polynucleotide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(Incyte Polynucleotide ID)を示す。列3は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列4は、例えば、SEQ ID NO:24−46を同定するため、或いはSEQ ID NO:24−46と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列5はcDNA配列、ゲノムDNAから予想されたコード配列(エキソン)及び/またはcDNA及びゲノムDNAを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブルするのに用いた。表4の列6および列7はそれぞれ完全長配列に対して、列5の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド(5’)位置および終了ヌクレオチド(3’)位置を示す。
【0108】
表4の列5の識別番号は、特に例えばIncyte cDNAとそれに対応するcDNAライブラリに照会し得る。例えば、7669623H1はIncytecDNA配列の識別番号であり、NOSEDIC02 はそれが由来するcDNAライブラリの識別番号である。cDNAライブラリが示されていないインサイトcDNAは、プールされているcDNAライブラリに由来する。または、列5の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたGenBankのcDNAすなわちEST(例えば., g2525800)の識別番号の場合もある。或いは列5の識別番号は、ゲノムDNAのGenscan分析により予想されるコード領域に照会し得る。例えば、GNN.g7329615_000006_002 は、Genscan推定コード配列の識別番号であって、g7329615 がGenscan分析によって得られたGenBankの配列の識別番号である。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集する場合がある(例4を参照)。または列5の識別番号は、「エキソンスティッチング(exon−stitching)」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合に照会し得る。または、列5の識別番号は、「エキソンスティッチング」アルゴリズムによってcDNAおよびGenscan推定エキソンの両方からなる群の場合もある(実施例5を参照)。場合によっては、列5に示されている配列の範囲と重複するIncyte cDNAの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するIncyte cDNAの識別番号は示されていない。
【0109】
表5は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブルされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列をアセンブル及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表5に示し、表6で説明している。
【0110】
表8は、本発明のポリヌクレオチドの組織特異発現を示す。列1は、ポリヌクレオチドの発現のためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で試験された組織群を示す。残りの列は、特定のポリヌクレオチドが各組織群で発現したかどうかを示す。PCR産物が検出された場合、”+” の記号で表示されるポジティブな発現により示した。またPCR産物が検出できなかった場合”−”の記号で表示され、発現がなかったことを示した。
【0111】
本発明には、GCRECの変異体も含まれる。好適なGCRECの変異体のアミノ酸配列は、GCRECアミノ酸配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%、或いは少なくとも約95%もの一致率を有し、GCRECの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも1つ有するような変異体である。
【0112】
本発明には、GCRECをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、GCRECをコードするSEQ NO ID:24−46からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列が本発明に含まれている。SEQ NO ID:24−46のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価値を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【0113】
本発明には、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70%、或いは少なくとも約85%、または少なくとも約95%もの一致率を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:24−46からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも70%のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85%のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:24−46からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、GCRECの機能的或いは構造的特徴の少なくとも1つを有するアミノ酸配列をコードする。
【0114】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、GCRECをコードする多数のポリヌクレオチド配列(既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある)を産出し得ることは理解できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のGCRECのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【0115】
GCREC及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のGCRECのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、GCRECまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなくGCREC及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA転写物の作製がある。
【0116】
本発明には、GCREC、GCREC誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。 更に、合成化学を用いてGCRECまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【0117】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:24−46及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399−407; Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507−511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【0118】
DNAシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Applied Biosystems)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200サーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー(Applied Biosystems)等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 (Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856−853ページ等を参照)。
【0119】
GCRECをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の1つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318−322等を参照)。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る(Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res 16:8186等を参照)。第3の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。(Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:111−119等を参照)。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている。 (Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055−3060等を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder(商標)ライブラリ(Clontech, Palo Alto CA)を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50%以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【0120】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の5’領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、5’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【0121】
市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力/光の強度は、適切なソフトウェア(Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等)を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【0122】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、適切な宿主細胞内でGCREC、GCRECの断片またはその機能的等価物を発現させるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA配列を作製してGCRECの発現に利用し得る。
【0123】
種々の目的でGCRECがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。 ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介定方向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。
【0124】
本発明のヌクレオチドは、MolecularBreedingTM(Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.−C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:793−797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259−264、Crameri, A. ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315−319に記載)等のDNAシャッフリング技術の対象となり、GCRECの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択/スクリーニングを行ってもよい。このように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換えて、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【0125】
別の実施例によれば、GCRECをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.ら(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215−223; 及びHorn, T.他(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser7.225−232を参照)。或いは、化学的方法を用いてGCRECそれ自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55−60ページ、Roberge, J.Y. ら (1995) Science 269:202−204等を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて達成し得る。更にGCRECのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び/または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【0126】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である(Chiez, R.M.および F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392−421等を参照)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる(前出のCreighton, 28−53ページ等を参照)。
【0127】
生物学的に活性なGCRECを発現させるために、GCRECをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。 好適な発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びGCRECをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型プロモーター、5’及び3’の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、GCRECをコードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。GCRECをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(Scharf, D. ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125−162.等を参照)。
【0128】
当業者によく知られている方法を用いて、GCRECをコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び16−17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章及び16章を参照)。
【0129】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、GCRECをコードする配列を保持及び発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター/宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある(前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307−311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655−3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345−355等を参照)レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる(Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350−356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340−6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813−815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219−226、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239−242等を参照)本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【0130】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT1プラスミド(Life Technologies)などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。GCRECをコードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、lacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509.等を参照)。多量のGCRECが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、GCRECの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【0131】
酵母の発現系を使用してGCRECを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことができ、安定した増殖を生じる(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. ら (1987) Methods Enzymol.153:516−544、及びScorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 12:181−184.を参照)。
【0132】
植物系を使用してGCRECを発現することも可能である。GCRECをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV(Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307−311)由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい(例えば、Coruzzi, G. ら. (1984) EMBO J. 3 : 1671−1680 ; Broglie, R. ら (1984) Science 224 : 838−843 ; および Winter, J. ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85−105を参照)。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である(『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ等を参照。)。
【0133】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、GCRECをコードする配列は、後発プロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体に連結反応され得る。可欠E1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でGCRECを発現する感染ウイルスを得ることが可能である(Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655−3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【0134】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約6kb〜10MbのHACsを作製し、従来の輸送方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で送達する(Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345−355を参照)。
【0135】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のGCRECの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、GCRECをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【0136】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれtk−またはapr−細胞において使用される(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223−232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817−823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(例えば、Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567−3570; Colbere−Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1−14を参照)。この他の選択可能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(Hartman, S.C.および R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047−8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121−131等を参照)。
【0137】
マーカー遺伝子発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、GCRECをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、GCRECをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または単一プロモーター制御下で、GCRECをコードする配列とタンデムにマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【0138】
一般に、GCRECをコードする核酸配列を含み且つGCRECを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。 限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【0139】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてGCRECの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。GCREC上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイ(two−site, monoclonal−based immunoassay)が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である(Hampton. R. ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照)。
【0140】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、これらは様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いることができる。GCRECをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR法がある。或いは、GCRECをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega(Madison WI)、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【0141】
GCRECをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、GCRECをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するGCRECの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計し得る。
【0142】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び/または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等)は、American Type Culture Collection(ATCC, Bethesda, VA)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【0143】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列または組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもたらす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラGCRECタンパク質は、GCREC活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を容易にする。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、c−myc、赤血球凝集素(HA)がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6−Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c−myc及び赤血球凝集素(HA)は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し、GCRECが精製後に異種部分から切断され得るように、GCRECコード配列と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解性開裂部位を含めることもできる。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【0144】
本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いて、放射能標識したGCRECの合成がin vitroで可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば、 35S−メチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【0145】
本発明のGCRECまたはその断片を用いて、GCRECに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも1つまたは複数の試験化合物を用いて、GCRECへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば受容体)または小分子が挙げられる。
【0146】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのGCRECの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照)。同様に、化合物は、GCRECが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてGCRECを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエあるいは大腸菌からの細胞が含まれる。GCRECを発現する細胞またはGCRECを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、GCRECまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【0147】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたGCRECと結合させるステップと、GCRECとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【0148】
本発明のGCRECまたはその断片を用いて、GCRECの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、GCRECが少なくとも1つの試験化合物と結合する、GCRECの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのGCRECの活性が試験化合物不在下でのGCRECの活性と比較する。試験化合物の存在下でのGCRECの活性の変化は、GCRECの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をGCRECの活性に適した条件下でGCRECを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、GCRECの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも1つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【0149】
別の実施例では、胚性幹細胞(ES細胞)における相同組換えを用いて動物モデル系内で、GCRECまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照)。例えばマウス129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288−1292)等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre−loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999−2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323−4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【0150】
GCRECをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも8つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する(Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145−1 147)。
【0151】
GCRECをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換え動物(マウスまたはラット)を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、GCRECをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばGCRECを乳汁内に分泌するなどGCRECを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る(Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55−74)。
【0152】
(治療)
化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が、GCRECの領域と細胞骨格関連タンパク質間に存在する。さらにGCREC の発現は鼻ポリープ組織に密接に関連している。従ってGCRECは、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症において或る役割を果たすものと考えられる。GCRECの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、GCRECの発現または活性を低下させることが望ましい。また、GCRECの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、GCRECの発現または活性を増大させることが望ましい。
【0153】
従って、或る実施例において、GCRECの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にGCRECまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害が含まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また代謝障害も含まれ、その中には糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症が含まれ、またアデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトンガウイルス(tongavirus)として分類されるウイルス性病原体による感染症も含まれる。
【0154】
別の実施例では、GCRECまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0155】
更に別の実施例では、実質的に精製されたGCRECを含む成分を好適な医薬用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0156】
更に別の実施例では、GCRECの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0157】
更に別の実施例では、患者にGCRECのアンタゴニストを投与して、GCRECの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、或いはGCRECを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは輸送機構として間接的にGCRECと特異結合する抗体を用いることができる。
【0158】
別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0159】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【0160】
GCRECのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたGCRECを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、GCRECと特異結合するものを同定することが可能である。GCRECの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体(即ち二量体の形成を阻害する抗体)は通常、治療用に好適である。
【0161】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、GCREC、またはGCRECの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【0162】
GCRECに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約5のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。また、これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。GCRECアミノ酸の短い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【0163】
GCRECに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEBV−ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495−497、Kozbor, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31−42、Cote, R.J. ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026−2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120等を参照)。
【0164】
更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることが可能である(Morrison, S.L.ら. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851−6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Nature 312:604−608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452−454等を参照)。或いは、一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られている方法を用いて、GCREC特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる(Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134−10137等を参照)。
【0165】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833−3837、Winter, G. ら (1991) Nature 349:293−299等を参照)。
【0166】
GCRECのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab’)2 断片と、F(ab’)2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D. ら (1989) Science 246:1275−1281等を参照)。
【0167】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。 このようなイムノアッセイは通常、GCRECとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与している。2つの非干渉性GCRECエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるような、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合アッセイを利用してもよい(前出のPoundの文献)。
【0168】
ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を用いて、GCRECに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。 Kaは、平衡状態においてGCREC抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なGCRECエピトープに対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは、GCREC抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のGCRECエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約109〜1012 liter/molの範囲にあるような高親和性抗体試薬は、GCREC抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜107liter/molの低親和性抗体試薬は、GCRECが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製(immunopurification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【0169】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2mg/ml、好ましくは5〜10mg/mlの特異抗体を含むポリクローナル抗体試薬は、GCREC抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である(前出のCattyの文献、同Coligan らの文献等を参照)。
【0170】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチド、GCRECの任意の断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施態様では、GCRECをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子(DNA及びRNA、PNA、修飾ヌクレオチド)を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、GCRECをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照.)。
【0171】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である(Slater, J.E. ら (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469−475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)9(13):1288−1296.等を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. および W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323−347等を参照)。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる(Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217−225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308−1315、Morris, M.C. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730−2736. 等を参照)。
【0172】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、(i)遺伝子欠損症(例えばX染色体鎖遺伝(Cavazzana−Calvo, M. ら (2000) Science 288:669−672)により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)−X1の場合)、先天性アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損(Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475−480、Bordignon, C. ら (1995) Science 270:470−475)、嚢胞性繊維症(Zabner, J. ら (1993) Cell 75:207−216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643−666、Crystal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667−703)、サラセミア(thalassamia)、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病(Crystal, R.G. (1995) Science 270:404−410、Verma, I.M. および Somia. N. (1997) Nature 389:239−242)を治療し、(ii)条件的致死性遺伝子産物を発現させ(例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合)、(iii)細胞内の寄生虫(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature 335:395−396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395−11399)、B型若しくはC型肝炎ウイルス(HBV、HCV)、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。GCRECの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からGCRECを発現することにより、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。
【0173】
本発明の更なる実施例では、GCRECをコードする哺乳動物発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってGCREC欠損細胞に導入することによって、GCRECの欠損による疾患や異常症を治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポソンの使用(Morgan, R.A. および W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191−217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501−510; Boulay, J−L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445−450)がある。
【0174】
限定するものではないがGCRECの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV−SCRIPT、PCMV−TAG、PEGSH/PERV(Stratagene, La Jolla CA)及びPTET−OFF、PTET−ON、PTRE2、PTRE2−LUC、PTK−HYG(Clontech, Palo Alto CA)がある。GCRECを発現させるために、(i)恒常的に活性なプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ(TK)、若しくはβ−アクチン遺伝子等)、(ii)誘導性プロモーター(例えば、市販されているT−REXプラスミド(Invitrogen)に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター(Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547−5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766−1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451−456))、エクジソン誘導性プロモーター(市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている:Invitrogen)、FK506/ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486/ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V. および H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来するGCRECをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【0175】
市販のリポソーム形質転換キット(例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit)を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. および A.J. Eb (1973) Virology 52:456−467)若しくは電気穿孔法(Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841−845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【0176】
本発明の別の実施例では、GCRECの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーターまたは独立プロモーターの制御下でGCRECをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加レトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター(例えばPFB及びPFBNEO)はStratagene社から市販されており、刊行データ(Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733−6737)に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系(VPCL)において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する(Armentano, D. ら (1987) J. Virol. 61:1647−1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639−1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802−3806、Dull, T. ら (1998) J. Virol. 72:8463−8471、Zufferey, R. ら (1998) J. Virol. 72:9873−9880)。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号(「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」)において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団(例えばCD4+ T細胞)の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている(Ranga, U. ら. (1997) J. Virol. 71:7020−7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259−2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707−4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201−1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283−2290)。
【0177】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、GCRECの発現に関連する1つ若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にGCRECをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された(Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:263−268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号(”Adenovirus vectors for gene therapy”)に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511−544 及び Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239−242も参照されたい。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【0178】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、GCRECの発現に関連する1つ若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にGCRECをコードするポリヌクレオチドを輸送する。HSVが向性を有するような中枢神経系の細胞にGCRECを導入する際には、単純ヘルペスウイルス(HSV)系のベクターの使用は特に役立つ。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス(HSV)I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた(Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169:385−395)。HSV−1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(”Herpes simplex virus swains for gene transfer”)に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも1つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519−532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152−161も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【0179】
別法では、αウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用いてGCRECをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest Virus, SFV)の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった(Garoff, H. および K.−J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464−469)。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性(例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ)を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、GCRECに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに導入することにより、ベクター導入細胞において多数のGCRECコードRNAが産生され、高レベルのGCRECが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス(SIN)の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞(BHK−21)の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している(Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74−83)。αウイルスの宿主の範囲が広いことにより、様々な細胞タイプへのGCRECの導入が可能になる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【0180】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−10と約+10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163−177ページ等を参照)。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【0181】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、GCRECをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。
【0182】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定すると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような2次構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【0183】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、GCRECをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【0184】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の5’末端、3’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2’ O−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン(queosine)、ワイブトシン(wybutosine)等を加えることができる。
【0185】
本発明の追加実施例は、GCRECをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、GCRECの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、GCRECの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【0186】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び/または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。GCRECをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも1つの試験化合物に曝され、このように得られる。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。 通常、GCRECをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって1つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系(Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHeLa細胞等のヒト細胞系(Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8−13)を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド)の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している(Bruice, T.W. ら (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米国特許第6,022,691号)。
【0187】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる。 (Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 15:462−466.等を参照。
【0188】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【0189】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA)の最新版に記載されている。このような成分は、GCREC、GCRECに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはGCRECインヒビターから構成し得る。
【0190】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【0191】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば伝統的な低分子量有機薬)の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高分子(例えばより大きなペプチド及びタンパク質)の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした(Patton, J.S. ら, 米国特許第5,997,848号等を参照)。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【0192】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【0193】
特殊形状の成分は、GCRECまたはその断片を含む高分子を直接細胞内送達するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。或いは、GCRECまたはその断片をHIV Tat−1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている(Schwarze, S.R. ら (1999) Science 285:1569−1572)。
【0194】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【0195】
治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にする。 そのような活性成分の例としては、GCRECまたはその断片、GCRECの抗体、GCRECのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50(集団の50%の医薬的有効量)またはLD50(集団の50%の致死量)を測定するなどして決定することができる。毒性効果の薬用効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【0196】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって3〜4日毎に1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。
【0197】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100,000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【0198】
(診断)
別の実施例では、GCRECの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或いはGCRECやGCRECのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者をモニターするためのアッセイにおいて、GCRECを特異的に結合する抗体が用いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。GCRECの診断アッセイには、抗体及び標識を利用してヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてGCRECを検出する方法が含まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。 多様なレポーター分子が本技術分野で知られており、それらを用いることができる。 幾つかのレポーター分子については上記した。
【0199】
GCRECを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術分野において知られており、GCREC発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対象から採取した体液または細胞抽出とGCRECに対する抗体とを結合させることにより、GCREC発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したGCRECの量、対照、検体からの病変サンプルを標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【0200】
別の実施例によれば、GCRECをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、検体におけるGCRECの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、GCRECの不在、存在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にGCRECレベルの調製をモニターするために用いることができる。
【0201】
ある実施形態では、GCRECをコードする核酸配列を同定するために、GCRECまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同定するのはGCREC、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在する配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。 ここで、プローブの特異性とは、プローブが高特異領域(例えば5’調節領域)からなるのか、低特異領域(例えば保存されたモチーフ)からなるのかということである。
【0202】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はGCRECをコードする任意の配列と少なくとも50%の相同性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:24−46の配列、或いはGCREC遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【0203】
GCRECをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、GCRECまたはGCREC誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【0204】
GCRECをコードするポリヌクレオチド配列は、GCRECの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害が含まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また代謝障害も含まれ、その中には糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症が含まれ、またアデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトンガウイルス(tongavirus)として分類されるウイルス性病原体による感染症も含まれる。GCRECをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベースの技術と、PCR法と、ディップスティック(dipstick)法、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイと、変異GCRECの発現を検出するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【0205】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、GCRECをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。GCRECをコードするヌクレオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が対照サンプルと比べて著しく変化している場合は、サンプル内のGCRECをコードするヌクレオチド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【0206】
GCRECの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あるいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、GCRECをコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【0207】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【0208】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物(過少発現または過剰発現)の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【0209】
GCRECをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはGCRECをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはGCRECをコードするポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【0210】
或る態様において、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単一ヌクレオチド多形性(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP(single−stranded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP(fSSCP)法がある。SSCPでは、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を用いたDNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の2次及び3次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー(amplimer)の検出が可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP, isSNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較することにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【0211】
GCREC の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)及び標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、Melby, P.C.ら(1993) J. Immunol. Methods, 159:235−244;Duplaa, C.ら(1993) Anal. Biochem.212: 229−236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【0212】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行/後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【0213】
別の実施例では、GCRECに特異的な抗体、GCRECまたはその断片をマイクロアレイ上で要素として用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【0214】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る(Seilliamer らの米国特許第5,840,484号 ”Comparative Gene Transcript Analysis” を参照。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【0215】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【0216】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性サインと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する(Nuwaysir, E.F. ら. (1999) Mol. Carcinog. 24:153−159、Steiner, S. および N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112−113:467−471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。自己の発現が任意の試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインの要素への遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの阻止に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない(例えば2000年2月29日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00−02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である)。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【0217】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な1つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【0218】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、1次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、2次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような2次元ゲル電気泳動により分離が達成される(前出のSteiner および Anderson)。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも5個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【0219】
タンパク質の(proteomic)プロフィールは、GCRECに特異的な抗体を用いてGCREC発現レベルを定量することによっても作成し得る。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する(Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103−111、Mendoze, L.G. ら. (1999) Biotechniques 27:778−788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【0220】
プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性サインと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので(Anderson, N.L. および J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533−537)、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【0221】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【0222】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【0223】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する(Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614−10619、Baldeschweiler らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150−2155、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【0224】
本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイブリダイゼーションプローブを産出するため、GCRECをコードする核酸配列を用いることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345−355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127−134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149−154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る(Lander, E.S. および D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353−7357を参照)。
【0225】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る(前出のHeinz−Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965−968ページ.等を参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上のGCRECをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性或いは特定の疾患に対する素因は、その疾患に関係するDNAの領域を画定するのに役立ち得るものであり、従って更に位置クローニングする試みとなり得る。
【0226】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q22−23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる(Gatti, R.A.ら (1988) Nature 336:577−580等を参照)。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【0227】
本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のライブラリをスクリーニングするために、GCREC、GCRECの触媒作用断片、免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。GCRECとテストされる薬剤との結合複合の形成は計測できる。
【0228】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen,らの(1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、GCREC或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したGCRECを検出する。精製したGCRECはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【0229】
別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。このアッセイでは、GCRECを結合することができる中和抗体が、GCRECを結合するための試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、1個若しくは数個の抗原決定因子をGCRECと共有するペプチドの存在を検出する。
【0230】
別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性(限定するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む)に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術においても、GCRECをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。
【0231】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【0232】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/208,834号、第60/206,222号、第60/207,476号、第60/208,861号及び第60/209,868号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【0233】
(実施例)
1 cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリに由来するものであり、表4の列5に列記した。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL(Life Technologies)等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【0234】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN, Chatsworth CA)またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【0235】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム(Life Technologies)を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した(前出のAusubel, 1997, unit 5.1−6.6等を参照)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ(300〜1000bp)選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)), PCDNA2.1プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK−CMVプラスミド(Stratagene)または pINCY (Incyte Genomics, Palo Alto CA), or derivatives thereof.またはその誘導体等である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1−Blue、XL1−BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
【0236】
2 . cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム(Stratagene)を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも1つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、4℃で保管した。
【0237】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光分析的に定量した。
【0238】
3 シークエンシング及び分析
実施例2に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー(Applied Biosystems)またはPTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research)をHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)またはMICROLAB 2200(Hamilton)液体転移システムと併用して処理した。 cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)に与えられた試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法(前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例8に記載した方法で配列を伸長させた。
【0239】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づくプログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAM等のHidden Markov Model(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース(HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス1次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361−365等を参照)問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列(実施例4及び5を参照)を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース(genpept)、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム(DNASTAR)に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【0240】
Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列1に、それらの簡単な説明を列2に示す。 列3は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列4は2つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す(スコアが高ければ高いほど2配列間の相同性が高くなる)。
【0241】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:24−46のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約20〜約4000ヌクレオチドの断片を表4の列4に示した。
【0242】
4 ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
Genscan遺伝子同定プログラムを公衆のゲノム配列データベース(例えばgbpri及びgbhtg)に対して実行することにより、推定上のGタンパク質結合受容体を先ず同定する。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである(Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78−94 及びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346−354参照)。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。いずれのGenscan予測cDNA配列がGタンパク質結合受容体をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをGタンパク質結合受容体のためのPFAMモデムに対して問い合わせることにより分析した。Incyte cDNA配列の相同体をGタンパク質結合受容体として注釈を付けてきたことにより、潜在的Gタンパク質結合受容体も同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgbpri及びgbhtgと比較した。必要であれば、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例3に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び/または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【0243】
5 ゲノム配列データの cDNA 配列データへの構築
ステッチ配列( Stiched Sequence )
部分cDNA配列は、実施例4に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例3に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び1つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の2以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、1つのcDNA及び2つのゲノム配列に間隔が存在する場合、3つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列(parent sequence)に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。1種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖(cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列)は、親の種類を変える連鎖(cDNA−ゲノム配列)に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【0244】
ストレッチ配列( Stretched Sequence )
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例3に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例4に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対(HSP)を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【0245】
6 ポリヌクレオチドをコードするGCRECの染色体マッピング
SEQ ID NO:24−46を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith−Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:24−46と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配列のクラスターに構築した(表7)。スタンフォード・ヒトゲノムセンター(SHGC)、ホワイトヘッド・ゲノム研究所(WIGR)、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々のSEQ NO ID:を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【0246】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。(センチモルガン(cM)は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、1cMは、ヒト中のDNAの1メガベース(Mb)にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。)cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap99」(http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap)などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【0247】
7 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している(前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章(1995) 等を参照。)。
【0248】
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq(Incyte Genomics)等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【0249】
【数1】
積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、0〜100の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対(HSP)に一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−4を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る(ギャップにより隔離され得る)。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100%一致する場合のみ得られる。積スコア70は、一端が100%一致し、70%重畳しているか、他端が88%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100%一致し、50%重畳しているか、他端が79%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【0250】
或いは、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列(実施例3を参照)と少なくとも一部は重畳するように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能/混合、または尿管などの1つの生物/組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患/病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の1つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、GCRECをコードするcDNAの組織特異発現または疾患特異発現を反映する。 cDNA配列及びcDNAライブラリ/組織情報については、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)で見られる。
【0251】
8 ポリヌクレオチドをコードする GCREC の伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の5’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が50%以上となり、約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【0252】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。2段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【0253】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)を用いて96穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2 +と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1 94℃で3分間、 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 60℃で1分間、ステップ4 68℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す、ステップ6 68℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1 94℃で3分間、ステップ2 94℃で15秒、 ステップ3 57℃で1分間、 ステップ4 68℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す、 ステップ6 68℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。
【0254】
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンした。反応混合物のアリコート5〜10μlを1%アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【0255】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)を用いて消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE(Promega)で消化した。伸長させたクローンをT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いてpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で処理して制限部位の張出部(overhang)を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。
【0256】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1 94℃で3分間、 ステップ2 94℃で15秒、 ステップ3 60℃で1分間、 ステップ4 72℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す、 ステップ6 72℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20%ジメチルスルホキシド(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0257】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5’調節配列を得る。
【0258】
9 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ NO ID:24−46から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して、cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ−32P] アデノシン三リン酸(Amersham Pharmacia Biotech), )及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN、Boston MA)とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G−25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II(DuPont NEN)のいずれか1つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【0259】
各消化物から得たDNAは、0.7%アガロースゲル上で分画してナイロン膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【0260】
10 マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷(インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照)、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである(Schena (1999) 前出)。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. ら (1995) Science 270:467−470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639−645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27−31.を参照)。
【0261】
完全長cDNA、発現配列タグ(EST)、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【0262】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、1×第1鎖緩衝液、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP−Cy3(BDS)またはdCTP−Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用いて200 ng ポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃ で2時間インキュベートした後、各反応サンプル(1つはCy3、もう1つはCy5標識)は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、2つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム(CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA)を用いて精製する。 結合後、2つの反応サンプルは、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)を用いて析出させたエタノール、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100%エタノールである。サンプルは次に、SpeedVAC(Savant Instruments Inc., Holbrook NY)を用いて乾燥して仕上げ、14μlの5×SSC/0.2%SDS中で再懸濁する。
【0263】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRで1〜2ngの初期量から5μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL−400(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製される。
【0264】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス(Corning)は、処理中及び処理後に0.1%のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、95%エタノール中で0.05%アミノプロピルシラン(Sigma)を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃の天火で硬化させる。
【0265】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA1μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント(open capillary printing element)に充填する。装置はここで、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【0266】
マイクロアレイには、STRATALINKER UV架橋剤(Stratagene)を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2%SDSで1度洗浄し、蒸留水で3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)中の0.2%カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように0.2%SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【0267】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、5×SSC,0.2%SDSハイブリダイゼーション緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各0.2μg含む9μlのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、65℃まで5分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。 アレイは、第1洗浄緩衝液中(1×SSC,0.1%SDS)において45℃で10分間洗浄し、第2洗浄緩衝液中(0.1×SSC)において45℃で10分間各々3度洗浄して乾燥させる。
【0268】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには488nm、Cy5の励起のためには632nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出する。20×顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX−Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。
【0269】
2つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは2つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、2つの蛍光色素に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素1つにつき1度スキャンし、各アレイを通常2度スキャンする。
【0270】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比1:100,000に相関させる。 異なる源泉(例えば試験される細胞及び対照細胞など)からの2つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、2つの蛍光色素で較正するcDNAのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【0271】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(A/D)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク(発光スペクトルの重なりに起因する)を補正する。
【0272】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。
【0273】
11 相補的ポリヌクレオチド
GCRECをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のGCRECの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア(National Biosciences)とGCRECをコードする配列とを用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、GCRECをコードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオチドをデザインする。
【0274】
12 GCREC の発現
GCRECの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて行うことができる。細菌でGCRECを発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導されるとGCRECを発現する。真核細胞でのGCRECの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって、GCRECをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(Engelhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945.等を参照)。
【0275】
殆どの発現系では、融合タンパク質としてGCRECを合成するのに例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや6−Hisを用いる。 これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に1ステップで行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする(Amersham Pharmacia Biotech)。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてGCRECからタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いて免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6−Hisは、金属キレート樹脂(QIAGEN)上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel(1995)10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したGCRECを直接用いて、適用可能な場合には実施例16、17及び18のアッセイを行うことができる。
【0276】
13 機能的アッセイ
GCREC機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのGCRECをコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド(Life Technologies)及びpCR 3.1プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA) が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、CD64またはCD64−GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー(FCM)を用いて、GFPまたはCD64−GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【0277】
遺伝子発現におけるGCRECの影響は、GCRECをコードする配列とCD64またはCD64−GFPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64−GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG(IgG)の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、ヒトIgGまたはCD64に対する抗体(DYNAL, Lake Success. NY)で覆われた磁気ビーズを用いて有効に分離することができる。 mRNAは、本技術分野で公知の方法で細胞から精製することができる。 GCRECその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【0278】
14 GCREC 特異抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488−495等を参照)または他の精製技術を用いて実質上精製されたGCRECを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
或いは、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いてGCRECアミノ酸配列を解析し、免疫抗原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばC末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である(前出のAusubel, 1995, 11章等を参照)。
【0279】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて合成し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を用いた反応によってKLH(Sigma−Aldrich, St. Louis MO)に結合させて、免疫抗原性を高める(前出のAusubel, 1995 等を参照)。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗GCREC活性を検査するには、ペプチドまたはGCRECを基質に結合し、1%BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【0280】
15 特異抗体を用いた天然の GCREC の精製
天然または組換えGCRECを、GCREC特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗GCREC抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース(Amersham Pharmacia Biotech)と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【0281】
GCRECを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、GCRECを優先的に吸着する条件下(例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液)でカラムを洗浄する。抗体とGCRECの結合を破壊する条件(例えばpH2〜3の緩衝液、或いは尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤)でカラムを溶出させ、GCRECを回収する。
【0282】
16 GCREC と相互作用する分子の同定
GCRECと相互作用する分子は、Gタンパク質などのシグナル伝達に関与する分子以外にもアゴニスト及びアンタゴニストを含み得る。GCRECまた断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529−539を参照)。GCRECの断片には、例えば3つの細胞外ループのうち1つ若しくは複数のループ、細胞外N末端領域または第3細胞内ループがある。マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識したGCRECと共にインキュベートして洗浄し、標識したGCREC複合体を有する全ての穴をアッセイする。GCREC濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのGCRECの数、親和性及び結合の値を計算する。
【0283】
或いは、GCRECと相互作用する分子は、Fields, S. 及び O. Song (1989) Nature 340:245−246 に記載されているような酵母2ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはMATCHMAKERシステム(Clontech)等の2ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
GCRECはまた、高処理方法で酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)に用いて、遺伝子の2大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる(Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号)。
【0284】
潜在的GCRECアゴニストまたはアンタゴニストは、実施例17及び18に記載のアッセイを用いてGCREC受容体活性の活性化または阻害を試験し得る。候補分子は、既知のGPCRアゴニストまたはアンタゴニスト、ペプチドライブラリまたは組み合わせの化学ライブラリから選択し得る。
【0285】
GCRECとGタンパク質などの細胞内シグナル伝達分子の相互作用を検出する方法は、オーファンGタンパク質結合膜7回貫通受容体から得た内部セグメントまたは細胞質ドメインが、既知のGタンパク質結合膜7回貫通受容体の相似ドメインと交換され、Gタンパク質及びオーファン受容体ドメインに活性化された下流シグナル伝達経路を同定するために用いられるという前提に基づく(Kobilka, B.K. ら (1988) Science 240:1310−1316)。同様に、オーファン受容体のドメインが融合タンパク質の一部としてクローニングされ、結合アッセイで用いて特定のGタンパク質との相互作用を実証し得る。研究によれば、Gタンパク質結合膜7回貫通受容体の第3細胞内ループがGタンパク質相互作用及びシグナル伝達に重要であることが示されてきた(Conklin, B.R. ら (1993) Cell 73:631−641)。例えば、GCRECの第3細胞内ループに対応するDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により増幅し、pGEX(Pharmacia Biotech)などの融合ベクターにサブクローニングし得る。構成体は誘導された適切な細菌性宿主に形質転換され、融合タンパク質はグルタチオンセファロース4B(Pharmacia Biotech)アフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製する。
【0286】
in vitro結合アッセイの場合、Gタンパク質を含む細胞抽出物は、50mM Tris、pH7.8、1mM EGTA、5mMのMgCl2、20mMのCHAPS、20%グリセロール、各10μgのアプロチニン及びロイペプチンと、20μlの50mMフッ化フェニルメチルスルフォニルで抽出することにより準備する。溶解産物は絶えず撹拌しながら氷上で45分間インキュベートし、23,000g、4℃で15分間遠心分離して上澄みを集める。750μgの細胞抽出物をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質ビーズを用いて4℃で2時間インキュベートする。 GSTビーズは、リン酸緩衝食塩水で5回洗浄する。結合Gサブユニットは、百日咳毒素またはコレラ毒素を用いた[32P]ADPリボシル化により検出する。SDSサンプル緩衝液(4.6%(w/v) SDS、10%(vlv) βメルカプトエタノール、20%(w/v) グリセロール、95.2mM Tris−HCl、pH6.8、0.01%(w/v) ブロムフェノールブルー)を添加することにより反応を停止させる。[32P]ADP標識されたタンパク質は、10%SDS−PAGEゲルで分離し、オートラジオグラフを行う。ゲル中で分離したタンパク質はニトロセルロースペーパーに移し、ブロット(blotto)(5%脱脂粉乳、50mMのTris−HCl (pH 8.0)、2mMのCaCl2、80mMのNaCl、0.02%のNaN3 及び0.2%ノニデットP−40)を用いて室温で1時間遮断し、Gαサブタイプ選択的抗体(1:500; Calbiochem−Novabiocliem)で1.5時間インキュベートする。3洗浄後に、ブロットはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)共役ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(1:2000, Cappel, Westchester PA)でインキュベートし、化学ルミネセンスベースのECL法(Amersham Corp)で可視化する。
【0287】
17 GCREC 活性の実証
GCREC活性に対するアッセイは、細胞表面におけるGCRECの発現を測定する。 GCRECをコードするcDNAは、好適な哺乳動物細胞系に形質移入する。細胞表面タンパク質は、記載されているようにビオチンで標識する(de la Fuente, M.A. ら (1997) Blood 90:2398−2405)。GCREC特異抗体を用いて免疫沈降を実行し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降と未標識免疫沈降の比は、細胞表面に発現したGCRECの量に比例する。
【0288】
或いは、GCREC活性のためのアッセイは、リガンド/受容体が仲介する細胞増殖の調節のための原型アッセイに基づく。このアッセイでは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の速度を測定する。当分野で公知の形質移入方法を用いて、GCRECをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3培養細胞に加える。 一過性に形質移入された細胞は次に、放射性DNA前駆分子である[3H]チミジンの存在下でインキュベートする。次に、培養した細胞にGCRECリガンドの変化する量を加える。[3H]チミジンの酸沈殿可能DNAへの取り込みは、ラジオアイソトープカウンターを用いて適切な時間間隔で測定する。 取り込み量は、新たに合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも100倍のGCRECリガンド密度範囲に対する投与−反応の1次曲線は、受容体活性を示す。ミリリットル当りの活性の1単位は、50%の反応レベルを産出するGCRECの密度として画定され、100%であれば[3H]チミジンを酸沈殿可能DNAに最大限取り込むことを表す(McKay, I. および I. Leigh, eds. (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, p.73)。
【0289】
或いは、GCREC活性のためのアッセイは、GPCRファミリータンパク質がGタンパク質活性化第2メッセンジャーシグナル伝達経路(例えばcAMP; Gauclin, P. ら (1998) J. Biol. Chem. 273:4990−4996)を調整する能力に基づく。GCRECをコードするプラスミドを、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物細胞系に形質転換する(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞系(CHO)またはヒト胚腎細胞株(HEK−293))。 形質転換細胞を12ウェルトレイの培養液で48時間増殖させ、次に培養液を捨て、付着している細胞をPBSで軽く洗浄する。培地においてリガンド有りまたはリガンドなしで細胞を30分間インキュベートし、次に培地を除去し、細胞を1Mの過塩素酸で処理して溶解する。溶解産物中のcAMPレベルは、当分野で既知の方法を用いて放射免疫アッセイにより測定する。 リガンドに曝された細胞から得た溶解産物中のcAMPレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するGCRECの量に比例する。
【0290】
イノシトールリン酸レベルの変化を測定するためには、1×105 細胞/穴を含む24穴プレートで細胞を成長させ、イノシトールを含まない培地及び [3H]ミオイノシトールを用いて2μCi/穴で48時間インキュベートする。培地を除去し、10mMのLiClを含む緩衝液で細胞を洗浄し、その後リガンドを添加する。反応は、過塩素酸の添加により停止する。イノシトールリン酸は、Dowex AG1−X8(Bio−Rad)陰イオン交換樹脂及び液体シンチレーションにより計数された全ての標識されたイノシトールリン酸で抽出及び分離される。リガンドに曝された細胞から得た標識されたイノシトールリン酸のレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するGCRECの量に比例する。
【0291】
18 GCREC リガンドの同定
GCRECは、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)またはHEK(ヒト胎児腎臓)293などの真核細胞系において発現する。 これらの細胞系は、GPCR発現過程が良好であり、発現したGCRECを下流エフェクターに機能的に結合させることができるような広範囲のGタンパク質を含む。候補リガンドの存在下で発現した受容体の活性化に対し、形質転換した細胞をアッセイする。活性は、cAMPまたはCa2+ などの細胞内第2メッセンジャーの変化により測定する。当分野で公知の標準的な方法を用いるか、活性化受容体によるタンパク質キナーゼCの刺激に反応して発光タンパク質(例えばホタルルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質)がプロモーターの転写調節下にあるようなレポーター遺伝子アッセイを用いて直接測定する(Milligan, C. ら (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235−237)。アッセイ技術は、これら第2メッセンジャーシステムの両方に利用可能であり、アデニリルシクラーゼ活性化FlashPlate Assay(NEN Life Sciences Products)などのマルチウェルプレートフォーマットまたはFluo−4 AM(Molecular Probes)などの蛍光Ca2+ 指示薬でFLIPR蛍光定量的プレート読出しシステム(Molecular Devices)を併用して高処理読出しを可能にする。生理的関連性のある第2メッセンジャー経路が知られていない場合、GCRECは、ホスホリパーゼC及びCa2+ 可動化に関与する経路を介してGCRECのシグナル伝達を通すために、広範囲のGタンパク質と結合することが実証されているようなGタンパク質Gα 15/16と同時発現し得る(Offerrnanns, S. および M.I. Simon (1995) J. Biol. Chem. 270:15175−15180)。或いは、GCRECは内在性GPCRが不足しているような操作された酵母系に発現し、それによってOCREC活性化スクリーニングに対してバックグラウンドが存在しない利点を提供し得る。これらの酵母系は、ヒトGPCR及びGαタンパク質を内在性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素に対して置換する。シグナルに対する正常な酵母反応を選択的培地の正の成長またはレポーター遺伝子発現に変換するように、下流シグナル伝達経路も変更する(Broach, J.R. および J. Thorner (1996) Nature 384 (supp.):14−16)。既知のGPCRリガンド及びその他天然の生理活性分子を含む推定上のリガンドに対して受容体をスクリーニングする。組織、生物学的流体及び細胞上澄みから抽出した生物学的抽出物もスクリーニングする。
【0292】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【0293】
(表の簡単な説明)
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【0294】
表2は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【0295】
表3は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【0296】
表4は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA及びゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【0297】
表5は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【0298】
表6は、表5に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【0299】
表7は、GCRECの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【0300】
表8は、本発明のポリヌクレオチドの組織特異発現を示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
(技術分野)
本発明は、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防におけるこれらの配列の利用と、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外因性化合物の効果の算定におけるこれらの配列の利用に関する。
【0002】
(発明の背景)
シグナル伝達は、それによって細胞が細胞外シグナルに応答するような一般的プロセスである。原形質膜でのシグナル伝達は、ホルモン、神経伝達物質または成長因子などのシグナル分子が細胞膜受容体と結合することから開始する。受容体が活性化され、転写因子などの細胞内標的分子の活性化で終了する細胞内の生化学的カスケードを誘発する。シグナル伝達のこのプロセスは、細胞増殖、分化及び遺伝子転移を含む全てのタイプの細胞機能を制御する。同定された遺伝子の最大ファミリーの1つによりコードされたGタンパク質結合受容体(GPCR)は、原形質膜での細胞外シグナルの伝達において中心的役割を果たす。GPCRが治療の標的として成功であることは歴史的に証明されている。
【0003】
GPCRは、7つの疎水性膜貫通ドメインの存在により特徴付けられた膜内在性タンパク質であり、それらのドメインがまとまって逆平行アルファ(α)螺旋の束を形成するようになる。GPCRのサイズは、400以下から1000以上のアミノ酸に及ぶ(Strosberg, A.D. (1991) Eur. J. Biochem. 196:1−10、Coughlin, S.R. (1994) Curr. Opin. Cell Biol.6:191−197)。GPCRのアミノ末端は、細胞外にあり、長さが可変で、多くの場合グリコシル化される。カルボキシル末端は、細胞質内にあり、通常はリン酸化される。細胞外ループは、細胞内ループと交互に現れ、膜貫通ドメインを結合する。第2及び第3細胞外ループを結合するシステインジスルフィド架橋は、アゴニスト及びアンタゴニストと相互に作用し得る。GPCRの最も保存されたドメインは、膜貫通ドメイン及び最初の2つの細胞質ループである。膜貫通ドメインは、受容体の構造的及び機能的特徴をある程度明らかにする。大抵の場合、αへリックスの束がリガンド結合ポケットを形成する。細胞外N末端セグメント即ち1個若しくは数個の第3細胞外ループは、リガンド結合にも関与し得る。リガンド結合は、受容体の細胞内部分で構造変化を誘導することにより受容体を活性化する。次に、この活性化された受容体の大きな第3の細胞内ループが、更なる細胞内のシグナル伝達作用を仲介するヘテロ三量体であるグアニンヌクレオチド結合Gタンパク質複合体と相互作用する。この細胞内のシグナル伝達作用には、サイクリックAMP(cAMP)、ホスホリパーゼC、およびイノシトール三リン酸などのセカンドメッセンジャーの活性化、並びに活性化されたGPCRとイオンチャネルタンパク質との相互作用が含まれる(Watson, S. および S. Arkinstall (1994) The G−protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 2−6ページ; Bolander, F.F. (1994) Molecular Endocrinology, Academic Press, San Diego CA, 162−176ページ; Baldwin, J.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:180190等参照)。
【0004】
GPCRには、感覚性シグナルメディエータ(例えば光及び嗅覚刺激性分子)の受容体、アデノシン、γアミノ酪酸(GABA)、肝細胞成長因子、メラノコルチン、ニューロペプチドY、オピオイドペプチド、オプシン、ソマトスタチン、タキキニン、血管作用性腸管ポリペプチドファミリー及びバソプレシン、生体アミン(例えばドーパミン、エピネフリン及びノルエピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸(代謝調節作用)、アセチルコリン(ムスカリン様作用)及びセロトニン)、ケモカイン、炎症の脂質メディエータ(例えばプロスタグランジン及びプロスタノイド、血小板活性化因子及びロイコトリエン)及びペプチドホルモン(例えばボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン、C5aアナフィラトキシン、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ニューロキニン及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)及びオキシトシン)がある。同定された刺激に対する受容体として作用するGPCRは、オーファン受容体として知られている。
【0005】
GPCRファミリーの多様性は、別のスプライシングによって更に増加する。多くのGPCR遺伝子にはイントロンが含まれ、スプライシング変異体が同定されるそのような受容体は現在では30を超えている。変異の数が最も大きいのは、タンパク質C末端においてである。細胞外ループまたは膜貫通ドメインは頻度が低いのに対して、N末端及び細胞質内ループ変異体もまた高頻度である。変異が発生し得るような部位を2ヶ所以上有する受容体もある。スプライシング変異体は、分布、シグナル伝達、結合、制御及びリガンド結合の特徴に観察される差異に基づき、機能的に異なる(Kilpatrick, G.J. ら (1999) Trends Pharmacol. Sd. 20:294−301)。
【0006】
GPCRは、3つの主要なサブファミリー即ちロドプシン様、セクレチン様及び代謝調節型グルタミン酸受容体サブファミリーに分けることができる。GPCRサブファミリーのメンバーは、同様の機能及び特徴的な膜7回貫通構造を共有しているが、アミノ酸配列は互いに異なる。最大のファミリーはロドプシン様GPCRを有し、ロドプシン様GPCRはホルモン、神経伝達物質及び光を含む多様な細胞外シグナルを伝送する。ロドプシンは、動物の網膜に見られる感光性GPCRである。脊椎動物では、ロドプシン分子は光受容体(杆体)細胞に見られる膜性スタックに包埋されている。各ロドプシン分子は、原形質膜ナトリウムチャネルの閉鎖に導くcGMPレベルの低下を誘発することにより光の光子に反応する。この方法で、可視シグナルが神経インパルスに変換される。その他のロドプシン様GPCRは、神経伝達物質への反応に直接関与する。このようなGPCRには、アドレナリンに対する受容体(アドレナリン受容体)、アセチルコリンに対する受容体(ムスカリン様受容体)、アデノシンに対する受容体、ガラニンに対する受容体及びグルタミン酸に対する受容体(N−メチル−D−アスパラギン酸/NMDA受容体)がある(Watson, S. および S. Arkinstall (1994) The G−Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 7−9, 19−22, 32−35, 130−131, 214−216, 221−222の各ページ、Habert−Ortoli, E. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9780−9783に概説されている)。
【0007】
ガラニン受容体は、インスリン、アセチルコリン、セロトニン及びノルアドレナリンの分泌を害する神経内分泌ペプチドガラニンの活性を仲介し、プロラクチン及び成長ホルモンの放出を刺激する。ガラニン受容体は、摂食に関する疾患、痛み、うつ病及びアルツハイマー病に関与している(Kask, K. ら (1997) Life Sd. 60:1523−1533)。その他の神経系ロドプシン様GPCRは、発達及び神経病理学において役割を有するように考えられる、リゾホスファチジン酸その他のリゾホスファチドに対する受容体など、増大する数のファミリーを含む(Chun, J.ら (1999) Cell Biochem. Biophys. 30:213−242)。 GPCRの最大のサブファミリーである嗅覚受容体もまた、ロドプシン様GPCRファミリーのメンバーである。この受容体は、臭気物質シグナルの伝達により機能する。異なる臭気を区別するためには、複数の異なる嗅覚受容体が必要である。各嗅覚感覚ニューロンは1種類の嗅覚受容体しか発現せず、特有の受容体を発現するニューロンが、鼻の経路中の異なる位置を占める。例えば、ラット脳ライブラリから単離したRA1c受容体は、脳の非常に特有な領域及び画定された嗅覚上皮の特有の区域だけに発現が限定されていることを示していた(Raining, K. ら (1998) Receptors Channels 6:141−151)。しかしながら、嗅覚様受容体の発現は嗅覚組織に限定されない。例えば、典型的なGPCR特性を有する嗅覚様受容体をコードする3つのラット遺伝子は、味覚及び嗅覚組織のみならず男性生殖組織においても発現パターンを示す(Thomas, M.B. ら (1996) Gene 178:1−5)。
【0008】
セクレチン様GPCRサブファミリーのメンバーは、セクレチン、カルシトニン、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、及び血管作用性小腸ペプチドなどのペプチドホルモンをリガンドとして有する。例えば、セクレチン受容体は、膵臓及び小腸で酵素及びイオンの分泌を刺激するペプチドホルモンであるセクレチンに対応する(前出のWatson, 278−283ページ)。セクレチン受容体は、長さが約450アミノ酸であり、胃腸細胞の原形質膜に見られる。セクレチンがその受容体に結合することにより、cAMPの産出が誘発される。
【0009】
炎症及び免疫反応に結びつけられるセクレチン様GPCRの例には、EGFのモジュールを含んだムチン様ホルモン受容体(Emrl)及びCD97受容体タンパク質がある。これらのGPCRは、最近特徴付けられたEGF−TM7受容体サブファミリーのメンバーである。これら膜7回貫通ホルモン受容体は、in vivoでヘテロ二量体として存在し、3から7の潜在的カルシウム結合EGF様モチーフを含む。CD97は、主に白血球で発現し、活性化されたB及びT細胞上で顕著に上方制御される(McKnight, A.J. および S. Gordon (1998) J. Leukoc. Biol. 63:271−280)。
【0010】
第3GPCRサブファミリーは、代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリーである。グルタミン酸は、中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質である。代謝調節型グルタミン酸受容体は、細胞内エフェクターの活性を調節し、長期の増強作用に関与する(前出のWatson, p.130)。Ca2+検出受容体は、カルシウムイオンの細胞外濃度の変化を検出するものであり、カルシウム結合に関与し得る酸性アミノ酸のクラスターを含む大きな細胞外ドメインを有する。代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリーには、フェロモン受容体、GABAB受容体及び味覚受容体もある。
【0011】
その他のGPCRのサブファミリーには、線虫及びCaenorhabditis briggsaeに見られる化学受容体遺伝子の2つの群があり、これらは哺乳動物の嗅覚受容体遺伝子に直接関係している。細胞膜上の接合因子への反応に関与している酵母フェロモン受容体STE2及びSTE3は、細胞性粘菌で、個々の細胞の集合を調整し、複数の発達的制御遺伝子の発現を制御すると考えられているcAMP受容体と同様に、膜7回貫通シグネチャを有する。
【0012】
GPCR突然変異は、機能または恒常的活性化の減少を招き得るものであり、多数のヒト疾患に関係してきた(前出のCoughlin)。例えば、色素性網膜炎はロドプシン遺伝子の突然変異から発生し得る。更に、甲状腺刺激ホルモン受容体の体細胞活性化突然変異は、機能亢進甲状腺アデノーマの原因となることが報告されており、恒常的活性化に感受性が高い或るGPCRが癌原遺伝子のように振舞い得ることを示唆している(Parma, J. ら (1993) Nature 365:649−651)。以下のリガンド即ち黄体形成ホルモン(思春期早発症)、バソプレシンV2(X連鎖の腎原発性糖尿病)、グルカゴン(糖尿病及び高血圧)、カルシウム(副甲状腺機能亢進症、低カルシウム尿症(hypocalcuria)、高カルシウム血症)、副甲状腺ホルモン(短肢小人症)、f33−アドレナリン受容体(肥満症、非インスリン依存型糖尿病)、成長ホルモン放出ホルモン(小人症)及び副腎皮質刺激ホルモン(糖質コルチコイド欠乏症)に対するGPCR受容体には、ヒトの疾患に関連する突然変異も含まれる(Wilson, S. ら (1998) Br. J. Pharmocol. 125:1387−.1392、Stadel, J.M. ら (1997) Trends Pharmacol. Sci. 18:430−437)。GPCRは、抑うつ症、分裂病、不眠症、高血圧、不安、ストレス、腎不全その他幾つかの心血管障害にも関与している(Horn, F. および G. Vriend (1998) J. Mol. Med. 76:464−468)。
【0013】
更に、GPCRの活性化及び阻害に直接作用する数百の新薬が過去20年のうちに認知されてきた。これらの薬の治療標的は、癌、骨粗鬆症、子宮内膜症のみならず心血管障害、胃腸障害、中枢神経系疾患を含めた幅広い疾病及び疾患に及ぶ(前出のWilson、同Stadel)。例えば、ドーパミンアゴニストのLドーパはパーキンソン病の治療に用いられ、ドーパミンアンタゴニストは精神分裂病及び初期段階のハンチントン病の治療に用いられる。アドレナリン受容体のアゴニスト及びアンタゴニストは、喘息、高血圧その他の心血管障害及び不安の治療に用いられてきた。 ムスカリン様アゴニストは、緑内障及び頻脈の治療に用いられ、セロトニン5HT1Dアンタゴニストは片頭痛に対して用いられ、ヒスタミンH1アンタゴニストはアレルギー性及びアナフィラキシー性反応、枯草熱、痒み及び動揺病に対して用いられる(前出のHorn)。
【0014】
最近の調査では、糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症を含む代謝障害の治療においてGPCRを将来的に使用する可能性を示唆している。例えば、腎原発性糖尿病の原因となる突然変異体V2バソプレシン受容体は、突然変異を含む領域に及ぶC末端V2受容体ペプチドの同時発現によりin vitroで機能的に救出され得る。これは疾病治療の新規なストラテジーを示唆する(Schoneberg, T. ら (1996) EMBO 1. 15:1283−1291)。メラノコルチン4受容体(MC4R)における突然変異は、ヒトの体重調節及び肥満症に結びつけられる。バソプレシンV2受容体の突然変異体により、これらMC4Rの突然変異体は原形質膜への輸送に欠陥があるので(Ho, G. および R.G. MacKenzie (1999) J. Biol. Chem. 274:35816−35822)、従って同様のストラテジーで処理し得る。副甲状腺ホルモン(PTH)のための1型受容体は、血流中のカルシウムホメオスタシスのPTH依存型制御を仲介するGPCRである。PTH/受容体の相互作用の研究は、骨粗鬆症の治療のための新規なPTH受容体リガンドの開発を可能にし得る(Mannstadt, M. ら (1999) Am. J. Physiol. 277:F665−F675)。
【0015】
GPCRのケモカイン受容体グループは、炎症及び感染症の治療に役立つ可能性を有する(Locati, M. および P.M. Murphy (1999) Annu. Rev. Med. 50:425−440の概説を参照)。ケモカインは、白血球輸送、造血及び血管形成の制御において細胞内シグナルとして作用する小ポリペプチドである。マウスにおける種々のケモカイン受容体の標的破壊によって、これらの受容体が異常炎症において及び多発性硬化症などの自己免疫異常において役割を果たしていることを示す。ヘルペスウイルス及びヒト免疫不全症ウイルス(HIV−1)を含む感染体が、感染を促進させるために、ケモカイン受容体を利用している。ケモカイン受容体CCR5は、HIV−1によるT細胞の感染に対する補助受容体として作用するものであり、その受容体で一部が切断されたものはAIDSに対する抵抗力を生じさせた。この結果は、CCR5のアンタゴニストがAIDSの予防に有用たり得ることを示唆する。
【0016】
新たなGタンパク質結合受容体及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防において有用であり、また、Gタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【0017】
(発明の概要)
本発明は、総称して「GCREC」、個別にはそれぞれ「GCREC−1」、「GCREC−2」、「GCREC−3」、「GCREC−4」、「GCREC−5」、「GCREC−6」、「GCREC−7」、「GCREC−8」、「GCREC−9」、「GCREC−10」、「GCREC−11」、「GCREC−12」、「GCREC−13」、「GCREC−14」、「GCREC−15」、「GCREC−16」、「GCREC−17」、「GCREC−18」、「GCREC−19」、「GCREC−20」、「GCREC−21」、「GCREC−22」および「GCREC−23」と呼ぶGタンパク質結合受容体である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択した実質上単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1−23のアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。
【0018】
また、本発明は(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1−23を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:24−46を有する群から選択される。
【0019】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列からなる天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【0020】
また、本発明は(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、(a)組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、(b)そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有する。
【0021】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。
【0022】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、(b)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(e)(a)〜(d)のRNA等価物とで構成される群から選択した実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60の連続したヌクレオチドを有する。
【0023】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(b)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(b)ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む。
【0024】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで標的ポリヌクレオチドは、(a)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、(b)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物とを含む群から選択したポリヌクレオチド配列を有する。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(b)標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【0025】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。 有効量のポリペプチドは、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列から成るポリペプチド、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列から成る天然のポリペプチド、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片を含む。一実施例では、SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、このような治療を必要としている患者にこの組成物を投与することを含む、機能的GCRECの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0026】
本発明はまた、(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択されたアゴニストとしてのポリペプチドの有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。一実施態様では、本発明は機能性GCRECの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。
【0027】
本発明は更に、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片から成る群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。別の実施態様では、機能性GCRECの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。
【0028】
本発明は更に、(a)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ NO ID:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、(b)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる天然のポリペプチドと、(c)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、(d)SEQ ID NO:1−23からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【0029】
その方法は、(a)ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と混合させる過程と、(b)ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、(c)試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【0030】
本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 標的ポリヌクレオチドは、SEQ NO ID:24−46を有する群から選択した配列を含む。 スクリーニング方法は、(a)標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、(b)標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含む。
【0031】
本発明は更に、(a)核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、(b)(i)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ NO ID:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、(c)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(d)処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【0032】
(発明を実施するための形態)
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【0033】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その(この)」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【0034】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【0035】
(定義)
用語「GCREC」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種(特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物)から得られる実質的に精製されたGCRECのアミノ酸配列を指す。
【0036】
「アゴニスト」の語は、GCRECの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはGCRECと直接相互作用することによって、或いはGCRECが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、GCRECの活性を調節する。
【0037】
「対立遺伝子変異体」は、GCRECをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも1の突然変異から作製し得る。 また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。 ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、1個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【0038】
GCRECをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失、挿入または置換する核酸配列を有し、GCRECと同一またはGCRECの機能的特徴を少なくとも1つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、GCRECをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能或いは検出困難な多型現象と、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なGCRECとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。計画的アミノ酸置換は、GCRECの生物学的または免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【0039】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【0040】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行う。
【0041】
「アンタゴニスト」の語は、GCRECの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子またはその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはGCRECと直接相互作用することによって、或いはGCRECが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、GCRECの活性を調節する。
【0042】
「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab’)2 及びFv断片を指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる。GCRECポリペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免疫抗原として感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することができる。動物(マウス、ラット、ウサギ等)を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好みに応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【0043】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域(即ちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基(タンパク質の特定の領域または3次元構造)に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原(即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原)と競合し得る。
【0044】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖と塩基対を形成することが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸(PNA)や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2’−メトキシエチル糖または2’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5−メチルシトシン、2−デオキシウラシルまたは7−デアザ−2’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」若しくは「マイナス(−)」の語が参照DNA分子のアンチセンス鎖を、「正」若しくは「プラス(+)」がセンス鎖を指すことがある。
【0045】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えまたは合成のGCREC、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指す。
【0046】
「相補(的)」または「相補性」の語は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの、塩基対形成による自然結合を指す。例えば、配列「5’−AGT−3’」は、相補配列「3’−TCA−5’」に結合する。
【0047】
「所定のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所定のアミノ酸配列からなる成分」は、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。GCREC若しくはGCRECの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム;SDS)及びその他の構成エレメント(例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等)を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【0048】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL−PCRキット(Applied Biosystems, Foster City, CA.)を用いて5’及び/または3’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて1つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及びアセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
保存アミノ酸置換では通常、(a)置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、(b)置換部位における分子の電荷または疎水性、及び/または(c)側鎖の大部分を保持する。
【0049】
「欠失」は、結果的に1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【0050】
「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも1つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylation)、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも1つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【0051】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【0052】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子またはタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【0053】
「断片」は、GCRECまたはGCRECをコードするポリヌクレオチドの固有部分であって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画定された配列の全長から1ヌクレオチド/アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、5〜1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の250または500アミノ酸(またはポリペプチドの最初の25%または50%)から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【0054】
SEQ NO ID:24−46の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。
この領域は、SEQ NO ID:24−46を特異的に同定するものであり、例えば同一ゲノム中のSEQ NO ID:24−46以外の配列とは異なるものである。SEQ NO ID:24−46の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列からSEQ NO ID:24−46を区別する類似の方法において有用である。SEQ NO ID:24−46の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ NO ID:24−46の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【0055】
SEQ NO ID:1−23の断片は、SEQ NO ID:24−46の断片によってコードされる。 SEQ NO ID:1−23の断片には、SEQ NO ID:1−23を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ NO ID:1−23の断片は、SEQ NO ID:1−23を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 SEQ NO ID:1−23の断片及び断片に対応するSEQ NO ID:1−23の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【0056】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも1つの翻訳開始コドン(例えばメチオニン)、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【0057】
「相同性」の語は、配列類似性即ち2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【0058】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、2つの配列をより有意に比較できる。
【0059】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151−153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189−191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【0060】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410)。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその1つである。その他にも、2つのヌクレオチド配列を対で直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn と blastp(後述)の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年4月21日) を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0061】
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: −2
Open Gap5 及びExtension Gap: 2 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
一致率は、完全に画定された(例えば特定のSEQ NO ID:で画定された)配列長さと比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配列から得られた断片(例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0062】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【0063】
ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2以上のポリペプチド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を(従って機能も)保存する。
【0064】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる(既に説明したのでそれを参照されたい)。CLUSTAL Vを用いて、ポリぺプチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【0065】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、2つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr−21−2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0066】
Matrix:BLOSUM62
Open Gap11 及びExtension Gap: 2 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
一致率は、完全に画定された(例えば特定のSEQ NO ID:で画定された)ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片(例えば少なくとも15、20、30、40、50、70または150の連続した残基の断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0067】
「ヒト人工染色体(HAC)」は、約6kb(キロベース)〜10MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【0068】
「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体により近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持しているような抗体分子を指す。
【0069】
「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリングするプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合(即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合)が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%(w/v)のSDS、並びに約100μg/mlのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【0070】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点(Tm)より約5〜20℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の50%がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【0071】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約0.2x SSC及び約0.1%のSDSの存在の下、約68℃で1時間の洗浄過程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSC濃度は、約0.1%のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【0072】
「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成力によって2つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析等)。 或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若しくはその核酸が固定される基質)に固定されているような2つの核酸配列間に形成され得る。
【0073】
「挿入」及び「付加」の語は、1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【0074】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【0075】
「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなGCRECのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なGCRECの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【0076】
「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【0077】
「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、特異の画定されたマイクロアレイの環境において配置されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまた他の化学化合物を指す。
【0078】
「調節(する)」の語は、GCRECの活性の変化を指す。調節することによって例えば、GCRECのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【0079】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【0080】
「機能的に結合した」は、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係があるように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。同一のリーディングフレーム内で2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。
【0081】
「ペプチド核酸」(PNA)は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端のリジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【0082】
GCRECの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク分解性開裂及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。 これらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、GCRECの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。
【0083】
「プローブ」は、GCREC、GCRECの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸配列の増幅(及び同定)に用い得る。
【0084】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100または150の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。 表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【0085】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley−Intersciences, New York NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【0086】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大5,000までの大きめのポリヌクレオチドであって32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム(マサチューセッツ州ケンブリッジのWhitehead Institute/MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能)ではユーザーが「ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライマー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。)PrimerGenプログラム(英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【0087】
「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせなければ離隔しているような配列の2以上のセグメントを人為的に組み合わせて産出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【0088】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであって例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応答を誘導する。
【0089】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の未翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5’及び3’の未翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【0090】
「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられる化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【0091】
DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースから構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列から構成されている。
【0092】
「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。GCRECをコードする核酸若しくはその断片、またはGCREC自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プリント等から構成され得る。
【0093】
「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基即ちエピトープ)であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離したA及びその抗体を含む反応において、エピトープA(つまり遊離し、標識されていないA)を含むポリヌクレオチドの存在が、抗体に結合している標識されたAの量を低減させる。
【0094】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメントの少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約75%、最も好ましいのは少なくとも約90%が遊離しているものを指す。
【0095】
「置換」は、1個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドを各々別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置換することを意味する。
【0096】
「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【0097】
「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【0098】
「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させるプロセスを表す。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【0099】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の1個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前述のSambrook ら (1989) 等の参考文献に記載されている。
【0100】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列1本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40%の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体(前述)、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多形性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。また、多形性変異体は、1つのヌクレオチド塩基によってポリヌクレオチド配列が変化する「単一ヌクレオチド多形性」(SNP)を含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【0101】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の1本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40%の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【0102】
(発明)
本発明は、新規なヒトGタンパク質(GCREC)と、GCRECをコードするポリヌクレオチドと、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症の診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくものである。
【0103】
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、1つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号(ポリペプチドSEQ ID NO)とIncyteポリペプチド配列番号(IncyteポリペプチドID)によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号(ポリヌクレオチドSEQ ID NO)とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(IncyteポリヌクレオチドID)によって表示した。
【0104】
表2は、GenBankタンパク質(genpept)データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号(Polypeptide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号(Genbank ID NO :)を示す。列4は、各ポリペプチドとそのGenBank相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列5は、GwnBank相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【0105】
表3は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号(SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列4および列5はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列6は、シグネチャ(signature)配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列7は、タンパク質の構造/機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【0106】
合わせて、表2及び表3は本発明のポリペプチドの特性を概略的に示している。 これらの特性は、特許請求の範囲に記載されたポリペプチドがGタンパク質結合受容体であることを証明する。例えば、SEQ ID NO:2はラット味蕾受容体タンパク質(GenBank ID g1256389) と59%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。(表2参照)BLAST確率スコアは5.7e−95であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2はまた、膜7回貫通(ロドプシンファミリー)ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。スコアは146.3 であり、確率値は2.2e−45 である。(表3参照)更にSEQ ID NO:2 は、BLOCKS (BL00237) とPRINTS (PR00237) デ−タベ−スのBLIMPS 分析またProsite デ−タベ−スのProfileScan分析により決定されるGタンパク質結合受容体シグネチャ、そしてPRINTS デ−タベ−スのBLIMPS 分析によって決定される嗅覚受容体シグネチャ(PR00245) を含む。BLAST、BLIMPS、ProfileScan及びHMMによる分析に基づくと、SEQ ID NO:2 は嗅覚Gタンパク質結合受容体である。別の例において、SEQ ID NO:15 はマウス臭覚受容体MOR18(GenBank ID g6178008) に85%の同一性を有する(表2参照)。BLAST確率スコアは4.6e−138である。SEQ ID NO:15はまた、膜7回貫通受容体ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:15がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。別の例では、SEQ ID NO:16は、BLAST 分析で決定されたように確率スコア2.7e−85でマウス嗅覚受容体(GenBank ID g3983392)に72% の同一性を有する。SEQ ID NO:17は、確率スコア1.2e−109でゴリラ嗅覚受容体(GenBank ID g7211257)に97% の同一性を有する。またSEQ ID NO:18は、確率スコア4.1e−82でイヌ嗅覚受容体(GenBank ID g1314663)に51% の同一性を有する(表2参照)。SEQ ID NO:17 と SEQ ID NO:18 は、これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定されたGタンパク質結合受容体ドメインとシグネチャ配列も含む (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:16−18がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。別の例においてSEQ ID NO:19 は、BLASTにより決定されるマウス臭覚受容体S19 (GenBank ID g6532001) に56%の同一性を有する(表2参照)。BLAST 確率スコアは1.4e−88である。SEQ ID NO:19はまた、膜7回貫通(ロドプシンファミリー)ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:19がGタンパク質結合受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。SEQ ID NO:1 、SEQ ID NO:3−14およびSEQ ID NO:20−23は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:1−23の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表7で記述されている。
【0107】
表4に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、或いはこれら2種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリペプチド配列識別番号(Polynucleotide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(Incyte Polynucleotide ID)を示す。列3は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列4は、例えば、SEQ ID NO:24−46を同定するため、或いはSEQ ID NO:24−46と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列5はcDNA配列、ゲノムDNAから予想されたコード配列(エキソン)及び/またはcDNA及びゲノムDNAを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブルするのに用いた。表4の列6および列7はそれぞれ完全長配列に対して、列5の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド(5’)位置および終了ヌクレオチド(3’)位置を示す。
【0108】
表4の列5の識別番号は、特に例えばIncyte cDNAとそれに対応するcDNAライブラリに照会し得る。例えば、7669623H1はIncytecDNA配列の識別番号であり、NOSEDIC02 はそれが由来するcDNAライブラリの識別番号である。cDNAライブラリが示されていないインサイトcDNAは、プールされているcDNAライブラリに由来する。または、列5の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたGenBankのcDNAすなわちEST(例えば., g2525800)の識別番号の場合もある。或いは列5の識別番号は、ゲノムDNAのGenscan分析により予想されるコード領域に照会し得る。例えば、GNN.g7329615_000006_002 は、Genscan推定コード配列の識別番号であって、g7329615 がGenscan分析によって得られたGenBankの配列の識別番号である。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集する場合がある(例4を参照)。または列5の識別番号は、「エキソンスティッチング(exon−stitching)」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合に照会し得る。または、列5の識別番号は、「エキソンスティッチング」アルゴリズムによってcDNAおよびGenscan推定エキソンの両方からなる群の場合もある(実施例5を参照)。場合によっては、列5に示されている配列の範囲と重複するIncyte cDNAの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するIncyte cDNAの識別番号は示されていない。
【0109】
表5は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブルされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列をアセンブル及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表5に示し、表6で説明している。
【0110】
表8は、本発明のポリヌクレオチドの組織特異発現を示す。列1は、ポリヌクレオチドの発現のためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で試験された組織群を示す。残りの列は、特定のポリヌクレオチドが各組織群で発現したかどうかを示す。PCR産物が検出された場合、”+” の記号で表示されるポジティブな発現により示した。またPCR産物が検出できなかった場合”−”の記号で表示され、発現がなかったことを示した。
【0111】
本発明には、GCRECの変異体も含まれる。好適なGCRECの変異体のアミノ酸配列は、GCRECアミノ酸配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%、或いは少なくとも約95%もの一致率を有し、GCRECの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも1つ有するような変異体である。
【0112】
本発明には、GCRECをコードするポリヌクレオチドも含まれる。或る例では、GCRECをコードするSEQ NO ID:24−46からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列が本発明に含まれている。SEQ NO ID:24−46のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列と同等の価値を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【0113】
本発明には、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70%、或いは少なくとも約85%、または少なくとも約95%もの一致率を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:24−46からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも70%のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85%のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:24−46からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、GCRECの機能的或いは構造的特徴の少なくとも1つを有するアミノ酸配列をコードする。
【0114】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、GCRECをコードする多数のポリヌクレオチド配列(既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある)を産出し得ることは理解できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のGCRECのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【0115】
GCREC及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のGCRECのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、GCRECまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなくGCREC及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA転写物の作製がある。
【0116】
本発明には、GCREC、GCREC誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。 更に、合成化学を用いてGCRECまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【0117】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:24−46及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399−407; Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507−511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【0118】
DNAシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、本発明の何れの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Applied Biosystems)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200サーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー(Applied Biosystems)等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 (Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856−853ページ等を参照)。
【0119】
GCRECをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の1つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318−322等を参照)。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る(Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res 16:8186等を参照)。第3の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。(Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:111−119等を参照)。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている。 (Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055−3060等を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder(商標)ライブラリ(Clontech, Palo Alto CA)を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50%以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【0120】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の5’領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、5’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【0121】
市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力/光の強度は、適切なソフトウェア(Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等)を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【0122】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、適切な宿主細胞内でGCREC、GCRECの断片またはその機能的等価物を発現させるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因して、実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA配列を作製してGCRECの発現に利用し得る。
【0123】
種々の目的でGCRECがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。 ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介定方向突然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。
【0124】
本発明のヌクレオチドは、MolecularBreedingTM(Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.−C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:793−797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259−264、Crameri, A. ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315−319に記載)等のDNAシャッフリング技術の対象となり、GCRECの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCR仲介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択/スクリーニングを行ってもよい。このように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換えて、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【0125】
別の実施例によれば、GCRECをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.ら(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215−223; 及びHorn, T.他(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser7.225−232を参照)。或いは、化学的方法を用いてGCRECそれ自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55−60ページ、Roberge, J.Y. ら (1995) Science 269:202−204等を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて達成し得る。更にGCRECのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び/または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【0126】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である(Chiez, R.M.および F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392−421等を参照)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる(前出のCreighton, 28−53ページ等を参照)。
【0127】
生物学的に活性なGCRECを発現させるために、GCRECをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。 好適な発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びGCRECをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型プロモーター、5’及び3’の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、GCRECをコードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。GCRECをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(Scharf, D. ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125−162.等を参照)。
【0128】
当業者によく知られている方法を用いて、GCRECをコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び16−17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章及び16章を参照)。
【0129】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、GCRECをコードする配列を保持及び発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター/宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある(前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307−311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655−3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345−355等を参照)レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる(Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350−356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340−6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813−815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219−226、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239−242等を参照)本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【0130】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT1プラスミド(Life Technologies)などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。GCRECをコードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、lacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509.等を参照)。多量のGCRECが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、GCRECの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【0131】
酵母の発現系を使用してGCRECを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことができ、安定した増殖を生じる(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. ら (1987) Methods Enzymol.153:516−544、及びScorer. C. A. ら (1994) Bio/Technology 12:181−184.を参照)。
【0132】
植物系を使用してGCRECを発現することも可能である。GCRECをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV(Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307−311)由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい(例えば、Coruzzi, G. ら. (1984) EMBO J. 3 : 1671−1680 ; Broglie, R. ら (1984) Science 224 : 838−843 ; および Winter, J. ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85−105を参照)。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である(『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ等を参照。)。
【0133】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、GCRECをコードする配列は、後発プロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体に連結反応され得る。可欠E1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でGCRECを発現する感染ウイルスを得ることが可能である(Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655−3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【0134】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約6kb〜10MbのHACsを作製し、従来の輸送方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で送達する(Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345−355を参照)。
【0135】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のGCRECの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、GCRECをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【0136】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれtk−またはapr−細胞において使用される(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223−232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817−823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(例えば、Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567−3570; Colbere−Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1−14を参照)。この他の選択可能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(Hartman, S.C.および R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047−8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121−131等を参照)。
【0137】
マーカー遺伝子発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、GCRECをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、GCRECをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または単一プロモーター制御下で、GCRECをコードする配列とタンデムにマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【0138】
一般に、GCRECをコードする核酸配列を含み且つGCRECを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。 限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。
【0139】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてGCRECの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。GCREC上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイ(two−site, monoclonal−based immunoassay)が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である(Hampton. R. ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照)。
【0140】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、これらは様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いることができる。GCRECをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR法がある。或いは、GCRECをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega(Madison WI)、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【0141】
GCRECをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、GCRECをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するGCRECの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計し得る。
【0142】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び/または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等)は、American Type Culture Collection(ATCC, Bethesda, VA)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【0143】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列または組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもたらす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラGCRECタンパク質は、GCREC活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を容易にする。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、c−myc、赤血球凝集素(HA)がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6−Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c−myc及び赤血球凝集素(HA)は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し、GCRECが精製後に異種部分から切断され得るように、GCRECコード配列と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解性開裂部位を含めることもできる。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【0144】
本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いて、放射能標識したGCRECの合成がin vitroで可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば、 35S−メチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【0145】
本発明のGCRECまたはその断片を用いて、GCRECに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも1つまたは複数の試験化合物を用いて、GCRECへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば受容体)または小分子が挙げられる。
【0146】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのGCRECの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照)。同様に、化合物は、GCRECが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてGCRECを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエあるいは大腸菌からの細胞が含まれる。GCRECを発現する細胞またはGCRECを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、GCRECまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【0147】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたGCRECと結合させるステップと、GCRECとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【0148】
本発明のGCRECまたはその断片を用いて、GCRECの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、GCRECが少なくとも1つの試験化合物と結合する、GCRECの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのGCRECの活性が試験化合物不在下でのGCRECの活性と比較する。試験化合物の存在下でのGCRECの活性の変化は、GCRECの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をGCRECの活性に適した条件下でGCRECを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、GCRECの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも1つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【0149】
別の実施例では、胚性幹細胞(ES細胞)における相同組換えを用いて動物モデル系内で、GCRECまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照)。例えばマウス129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288−1292)等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre−loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999−2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323−4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【0150】
GCRECをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも8つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する(Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145−1 147)。
【0151】
GCRECをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換え動物(マウスまたはラット)を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、GCRECをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばGCRECを乳汁内に分泌するなどGCRECを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る(Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55−74)。
【0152】
(治療)
化学的及び構造的類似性、例えば配列及びモチーフとの関連における類似性が、GCRECの領域と細胞骨格関連タンパク質間に存在する。さらにGCREC の発現は鼻ポリープ組織に密接に関連している。従ってGCRECは、細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症において或る役割を果たすものと考えられる。GCRECの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、GCRECの発現または活性を低下させることが望ましい。また、GCRECの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、GCRECの発現または活性を増大させることが望ましい。
【0153】
従って、或る実施例において、GCRECの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にGCRECまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害が含まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また代謝障害も含まれ、その中には糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症が含まれ、またアデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトンガウイルス(tongavirus)として分類されるウイルス性病原体による感染症も含まれる。
【0154】
別の実施例では、GCRECまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0155】
更に別の実施例では、実質的に精製されたGCRECを含む成分を好適な医薬用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0156】
更に別の実施例では、GCRECの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0157】
更に別の実施例では、患者にGCRECのアンタゴニストを投与して、GCRECの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、神経障害、心血管障害、胃腸障害、自己免疫/炎症疾患及び代謝障害並びにウイルス性感染症がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、或いはGCRECを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは輸送機構として間接的にGCRECと特異結合する抗体を用いることができる。
【0158】
別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むGCRECの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【0159】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【0160】
GCRECのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたGCRECを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、GCRECと特異結合するものを同定することが可能である。GCRECの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体(即ち二量体の形成を阻害する抗体)は通常、治療用に好適である。
【0161】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、GCREC、またはGCRECの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【0162】
GCRECに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約5のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。また、これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。GCRECアミノ酸の短い伸長部は、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【0163】
GCRECに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEBV−ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495−497、Kozbor, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31−42、Cote, R.J. ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026−2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120等を参照)。
【0164】
更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることが可能である(Morrison, S.L.ら. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851−6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Nature 312:604−608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452−454等を参照)。或いは、一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、本技術分野で知られている方法を用いて、GCREC特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる(Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134−10137等を参照)。
【0165】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833−3837、Winter, G. ら (1991) Nature 349:293−299等を参照)。
【0166】
GCRECのための特異結合部位を有する抗体を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab’)2 断片と、F(ab’)2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D. ら (1989) Science 246:1275−1281等を参照)。
【0167】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。 このようなイムノアッセイは通常、GCRECとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与している。2つの非干渉性GCRECエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるような、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合アッセイを利用してもよい(前出のPoundの文献)。
【0168】
ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を用いて、GCRECに対する抗体の親和性を評価する。親和性は結合定数Kaで表す。 Kaは、平衡状態においてGCREC抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なGCRECエピトープに対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは、GCREC抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のGCRECエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約109〜1012 liter/molの範囲にあるような高親和性抗体試薬は、GCREC抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜107liter/molの低親和性抗体試薬は、GCRECが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製(immunopurification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【0169】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2mg/ml、好ましくは5〜10mg/mlの特異抗体を含むポリクローナル抗体試薬は、GCREC抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である(前出のCattyの文献、同Coligan らの文献等を参照)。
【0170】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチド、GCRECの任意の断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施態様では、GCRECをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子(DNA及びRNA、PNA、修飾ヌクレオチド)を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、GCRECをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照.)。
【0171】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である(Slater, J.E. ら (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469−475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)9(13):1288−1296.等を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. および W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323−347等を参照)。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる(Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217−225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308−1315、Morris, M.C. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730−2736. 等を参照)。
【0172】
本発明の別の実施例では、GCRECをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、(i)遺伝子欠損症(例えばX染色体鎖遺伝(Cavazzana−Calvo, M. ら (2000) Science 288:669−672)により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)−X1の場合)、先天性アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損(Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475−480、Bordignon, C. ら (1995) Science 270:470−475)、嚢胞性繊維症(Zabner, J. ら (1993) Cell 75:207−216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643−666、Crystal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667−703)、サラセミア(thalassamia)、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病(Crystal, R.G. (1995) Science 270:404−410、Verma, I.M. および Somia. N. (1997) Nature 389:239−242)を治療し、(ii)条件的致死性遺伝子産物を発現させ(例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合)、(iii)細胞内の寄生虫(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature 335:395−396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395−11399)、B型若しくはC型肝炎ウイルス(HBV、HCV)、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。GCRECの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からGCRECを発現することにより、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。
【0173】
本発明の更なる実施例では、GCRECをコードする哺乳動物発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってGCREC欠損細胞に導入することによって、GCRECの欠損による疾患や異常症を治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポソンの使用(Morgan, R.A. および W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191−217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501−510; Boulay, J−L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445−450)がある。
【0174】
限定するものではないがGCRECの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV−SCRIPT、PCMV−TAG、PEGSH/PERV(Stratagene, La Jolla CA)及びPTET−OFF、PTET−ON、PTRE2、PTRE2−LUC、PTK−HYG(Clontech, Palo Alto CA)がある。GCRECを発現させるために、(i)恒常的に活性なプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ(TK)、若しくはβ−アクチン遺伝子等)、(ii)誘導性プロモーター(例えば、市販されているT−REXプラスミド(Invitrogen)に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター(Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547−5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766−1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451−456))、エクジソン誘導性プロモーター(市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている:Invitrogen)、FK506/ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486/ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V. および H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来するGCRECをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【0175】
市販のリポソーム形質転換キット(例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit)を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. および A.J. Eb (1973) Virology 52:456−467)若しくは電気穿孔法(Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841−845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【0176】
本発明の別の実施例では、GCRECの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーターまたは独立プロモーターの制御下でGCRECをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加レトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター(例えばPFB及びPFBNEO)はStratagene社から市販されており、刊行データ(Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733−6737)に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系(VPCL)において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する(Armentano, D. ら (1987) J. Virol. 61:1647−1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639−1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802−3806、Dull, T. ら (1998) J. Virol. 72:8463−8471、Zufferey, R. ら (1998) J. Virol. 72:9873−9880)。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号(「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」)において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団(例えばCD4+ T細胞)の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている(Ranga, U. ら. (1997) J. Virol. 71:7020−7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259−2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707−4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201−1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283−2290)。
【0177】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、GCRECの発現に関連する1つ若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にGCRECをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された(Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:263−268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号(”Adenovirus vectors for gene therapy”)に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511−544 及び Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239−242も参照されたい。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【0178】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、GCRECの発現に関連する1つ若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にGCRECをコードするポリヌクレオチドを輸送する。HSVが向性を有するような中枢神経系の細胞にGCRECを導入する際には、単純ヘルペスウイルス(HSV)系のベクターの使用は特に役立つ。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス(HSV)I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた(Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169:385−395)。HSV−1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(”Herpes simplex virus swains for gene transfer”)に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも1つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519−532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152−161も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【0179】
別法では、αウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用いてGCRECをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest Virus, SFV)の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった(Garoff, H. および K.−J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464−469)。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性(例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ)を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、GCRECに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに導入することにより、ベクター導入細胞において多数のGCRECコードRNAが産生され、高レベルのGCRECが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス(SIN)の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞(BHK−21)の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している(Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74−83)。αウイルスの宿主の範囲が広いことにより、様々な細胞タイプへのGCRECの導入が可能になる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【0180】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−10と約+10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163−177ページ等を参照)。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【0181】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、GCRECをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。
【0182】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定すると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような2次構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【0183】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、GCRECをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【0184】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の5’末端、3’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2’ O−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン(queosine)、ワイブトシン(wybutosine)等を加えることができる。
【0185】
本発明の追加実施例は、GCRECをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、GCRECの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、GCRECの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【0186】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び/または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。GCRECをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも1つの試験化合物に曝され、このように得られる。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。GCRECをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。 通常、GCRECをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって1つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系(Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHeLa細胞等のヒト細胞系(Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8−13)を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド)の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している(Bruice, T.W. ら (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米国特許第6,022,691号)。
【0187】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる。 (Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 15:462−466.等を参照。
【0188】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【0189】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA)の最新版に記載されている。このような成分は、GCREC、GCRECに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはGCRECインヒビターから構成し得る。
【0190】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【0191】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば伝統的な低分子量有機薬)の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高分子(例えばより大きなペプチド及びタンパク質)の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした(Patton, J.S. ら, 米国特許第5,997,848号等を参照)。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【0192】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【0193】
特殊形状の成分は、GCRECまたはその断片を含む高分子を直接細胞内送達するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。或いは、GCRECまたはその断片をHIV Tat−1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている(Schwarze, S.R. ら (1999) Science 285:1569−1572)。
【0194】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【0195】
治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にする。 そのような活性成分の例としては、GCRECまたはその断片、GCRECの抗体、GCRECのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50(集団の50%の医薬的有効量)またはLD50(集団の50%の致死量)を測定するなどして決定することができる。毒性効果の薬用効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【0196】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって3〜4日毎に1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。
【0197】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100,000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【0198】
(診断)
別の実施例では、GCRECの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或いはGCRECやGCRECのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者をモニターするためのアッセイにおいて、GCRECを特異的に結合する抗体が用いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。GCRECの診断アッセイには、抗体及び標識を利用してヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてGCRECを検出する方法が含まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。 多様なレポーター分子が本技術分野で知られており、それらを用いることができる。 幾つかのレポーター分子については上記した。
【0199】
GCRECを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術分野において知られており、GCREC発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対象から採取した体液または細胞抽出とGCRECに対する抗体とを結合させることにより、GCREC発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。対象内で発現したGCRECの量、対照、検体からの病変サンプルを標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【0200】
別の実施例によれば、GCRECをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは、検体におけるGCRECの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、GCRECの不在、存在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にGCRECレベルの調製をモニターするために用いることができる。
【0201】
ある実施形態では、GCRECをコードする核酸配列を同定するために、GCRECまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが同定するのはGCREC、突然変異体または関連配列をコードするような、天然に存在する配列のみであるか否かは、プローブの特異性及びハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーによって決定されることになる。 ここで、プローブの特異性とは、プローブが高特異領域(例えば5’調節領域)からなるのか、低特異領域(例えば保存されたモチーフ)からなるのかということである。
【0202】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はGCRECをコードする任意の配列と少なくとも50%の相同性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:24−46の配列、或いはGCREC遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【0203】
GCRECをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、GCRECまたはGCREC誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【0204】
GCRECをコードするポリヌクレオチド配列は、GCRECの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害が含まれ、その中には癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また代謝障害も含まれ、その中には糖尿病、肥満症及び骨粗鬆症が含まれ、またアデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトンガウイルス(tongavirus)として分類されるウイルス性病原体による感染症も含まれる。GCRECをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベースの技術と、PCR法と、ディップスティック(dipstick)法、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイと、変異GCRECの発現を検出するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【0205】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、GCRECをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。GCRECをコードするヌクレオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が対照サンプルと比べて著しく変化している場合は、サンプル内のGCRECをコードするヌクレオチド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【0206】
GCRECの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あるいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、GCRECをコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【0207】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【0208】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物(過少発現または過剰発現)の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【0209】
GCRECをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはGCRECをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはGCRECをコードするポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【0210】
或る態様において、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単一ヌクレオチド多形性(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP(single−stranded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP(fSSCP)法がある。SSCPでは、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を用いたDNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の2次及び3次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー(amplimer)の検出が可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP, isSNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較することにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【0211】
GCREC の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)及び標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、Melby, P.C.ら(1993) J. Immunol. Methods, 159:235−244;Duplaa, C.ら(1993) Anal. Biochem.212: 229−236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【0212】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行/後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【0213】
別の実施例では、GCRECに特異的な抗体、GCRECまたはその断片をマイクロアレイ上で要素として用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【0214】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る(Seilliamer らの米国特許第5,840,484号 ”Comparative Gene Transcript Analysis” を参照。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【0215】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【0216】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性サインと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する(Nuwaysir, E.F. ら. (1999) Mol. Carcinog. 24:153−159、Steiner, S. および N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112−113:467−471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。自己の発現が任意の試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインの要素への遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの阻止に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない(例えば2000年2月29日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00−02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である)。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【0217】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な1つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【0218】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、1次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、2次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような2次元ゲル電気泳動により分離が達成される(前出のSteiner および Anderson)。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも5個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【0219】
タンパク質の(proteomic)プロフィールは、GCRECに特異的な抗体を用いてGCREC発現レベルを定量することによっても作成し得る。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する(Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103−111、Mendoze, L.G. ら. (1999) Biotechniques 27:778−788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【0220】
プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性サインと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので(Anderson, N.L. および J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533−537)、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【0221】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【0222】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【0223】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する(Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614−10619、Baldeschweiler らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150−2155、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【0224】
本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイブリダイゼーションプローブを産出するため、GCRECをコードする核酸配列を用いることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345−355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127−134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149−154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る(Lander, E.S. および D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353−7357を参照)。
【0225】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る(前出のHeinz−Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965−968ページ.等を参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上のGCRECをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性或いは特定の疾患に対する素因は、その疾患に関係するDNAの領域を画定するのに役立ち得るものであり、従って更に位置クローニングする試みとなり得る。
【0226】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q22−23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる(Gatti, R.A.ら (1988) Nature 336:577−580等を参照)。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【0227】
本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のライブラリをスクリーニングするために、GCREC、GCRECの触媒作用断片、免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。GCRECとテストされる薬剤との結合複合の形成は計測できる。
【0228】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen,らの(1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、GCREC或いはその断片と反応させ、洗浄する。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したGCRECを検出する。精製したGCRECはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【0229】
別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。このアッセイでは、GCRECを結合することができる中和抗体が、GCRECを結合するための試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、1個若しくは数個の抗原決定因子をGCRECと共有するペプチドの存在を検出する。
【0230】
別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性(限定するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む)に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術においても、GCRECをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。
【0231】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【0232】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/208,834号、第60/206,222号、第60/207,476号、第60/208,861号及び第60/209,868号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【0233】
(実施例)
1 cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリに由来するものであり、表4の列5に列記した。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL(Life Technologies)等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【0234】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN, Chatsworth CA)またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【0235】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム(Life Technologies)を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した(前出のAusubel, 1997, unit 5.1−6.6等を参照)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ(300〜1000bp)選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)), PCDNA2.1プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK−CMVプラスミド(Stratagene)または pINCY (Incyte Genomics, Palo Alto CA), or derivatives thereof.またはその誘導体等である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1−Blue、XL1−BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
【0236】
2 . cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム(Stratagene)を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも1つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、4℃で保管した。
【0237】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光分析的に定量した。
【0238】
3 シークエンシング及び分析
実施例2に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー(Applied Biosystems)またはPTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research)をHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)またはMICROLAB 2200(Hamilton)液体転移システムと併用して処理した。 cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)に与えられた試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法(前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例8に記載した方法で配列を伸長させた。
【0239】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づくプログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAM等のHidden Markov Model(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース(HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス1次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361−365等を参照)問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列(実施例4及び5を参照)を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース(genpept)、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム(DNASTAR)に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【0240】
Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列1に、それらの簡単な説明を列2に示す。 列3は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列4は2つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す(スコアが高ければ高いほど2配列間の相同性が高くなる)。
【0241】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:24−46のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約20〜約4000ヌクレオチドの断片を表4の列4に示した。
【0242】
4 ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
Genscan遺伝子同定プログラムを公衆のゲノム配列データベース(例えばgbpri及びgbhtg)に対して実行することにより、推定上のGタンパク質結合受容体を先ず同定する。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである(Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78−94 及びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346−354参照)。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。いずれのGenscan予測cDNA配列がGタンパク質結合受容体をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをGタンパク質結合受容体のためのPFAMモデムに対して問い合わせることにより分析した。Incyte cDNA配列の相同体をGタンパク質結合受容体として注釈を付けてきたことにより、潜在的Gタンパク質結合受容体も同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgbpri及びgbhtgと比較した。必要であれば、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例3に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び/または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【0243】
5 ゲノム配列データの cDNA 配列データへの構築
ステッチ配列( Stiched Sequence )
部分cDNA配列は、実施例4に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例3に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び1つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の2以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、1つのcDNA及び2つのゲノム配列に間隔が存在する場合、3つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列(parent sequence)に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。1種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖(cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列)は、親の種類を変える連鎖(cDNA−ゲノム配列)に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【0244】
ストレッチ配列( Stretched Sequence )
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例3に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例4に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対(HSP)を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【0245】
6 ポリヌクレオチドをコードするGCRECの染色体マッピング
SEQ ID NO:24−46を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith−Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:24−46と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配列のクラスターに構築した(表7)。スタンフォード・ヒトゲノムセンター(SHGC)、ホワイトヘッド・ゲノム研究所(WIGR)、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々のSEQ NO ID:を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【0246】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。(センチモルガン(cM)は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、1cMは、ヒト中のDNAの1メガベース(Mb)にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。)cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap99」(http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap)などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【0247】
7 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している(前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章(1995) 等を参照。)。
【0248】
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq(Incyte Genomics)等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【0249】
【数1】
積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、0〜100の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対(HSP)に一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−4を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る(ギャップにより隔離され得る)。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100%一致する場合のみ得られる。積スコア70は、一端が100%一致し、70%重畳しているか、他端が88%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100%一致し、50%重畳しているか、他端が79%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【0250】
或いは、GCRECをコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列(実施例3を参照)と少なくとも一部は重畳するように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能/混合、または尿管などの1つの生物/組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患/病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の1つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、GCRECをコードするcDNAの組織特異発現または疾患特異発現を反映する。 cDNA配列及びcDNAライブラリ/組織情報については、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)で見られる。
【0251】
8 ポリヌクレオチドをコードする GCREC の伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の5’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が50%以上となり、約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【0252】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。2段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【0253】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)を用いて96穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2 +と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1 94℃で3分間、 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 60℃で1分間、ステップ4 68℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す、ステップ6 68℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1 94℃で3分間、ステップ2 94℃で15秒、 ステップ3 57℃で1分間、 ステップ4 68℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す、 ステップ6 68℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。
【0254】
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンした。反応混合物のアリコート5〜10μlを1%アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【0255】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)を用いて消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE(Promega)で消化した。伸長させたクローンをT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いてpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で処理して制限部位の張出部(overhang)を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。
【0256】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1 94℃で3分間、 ステップ2 94℃で15秒、 ステップ3 60℃で1分間、 ステップ4 72℃で2分間、 ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す、 ステップ6 72℃で5分間、 ステップ7 4℃で保管。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20%ジメチルスルホキシド(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0257】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5’調節配列を得る。
【0258】
9 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ NO ID:24−46から得たハイブリダイゼーションプローブを利用して、cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ−32P] アデノシン三リン酸(Amersham Pharmacia Biotech), )及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN、Boston MA)とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G−25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II(DuPont NEN)のいずれか1つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【0259】
各消化物から得たDNAは、0.7%アガロースゲル上で分画してナイロン膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【0260】
10 マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷(インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照)、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである(Schena (1999) 前出)。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. ら (1995) Science 270:467−470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639−645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27−31.を参照)。
【0261】
完全長cDNA、発現配列タグ(EST)、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【0262】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、1×第1鎖緩衝液、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP−Cy3(BDS)またはdCTP−Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用いて200 ng ポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃ で2時間インキュベートした後、各反応サンプル(1つはCy3、もう1つはCy5標識)は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、2つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム(CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA)を用いて精製する。 結合後、2つの反応サンプルは、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)を用いて析出させたエタノール、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100%エタノールである。サンプルは次に、SpeedVAC(Savant Instruments Inc., Holbrook NY)を用いて乾燥して仕上げ、14μlの5×SSC/0.2%SDS中で再懸濁する。
【0263】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRで1〜2ngの初期量から5μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL−400(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製される。
【0264】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス(Corning)は、処理中及び処理後に0.1%のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、95%エタノール中で0.05%アミノプロピルシラン(Sigma)を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃の天火で硬化させる。
【0265】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA1μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント(open capillary printing element)に充填する。装置はここで、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【0266】
マイクロアレイには、STRATALINKER UV架橋剤(Stratagene)を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2%SDSで1度洗浄し、蒸留水で3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)中の0.2%カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように0.2%SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【0267】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、5×SSC,0.2%SDSハイブリダイゼーション緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各0.2μg含む9μlのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、65℃まで5分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。 アレイは、第1洗浄緩衝液中(1×SSC,0.1%SDS)において45℃で10分間洗浄し、第2洗浄緩衝液中(0.1×SSC)において45℃で10分間各々3度洗浄して乾燥させる。
【0268】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには488nm、Cy5の励起のためには632nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出する。20×顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX−Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。
【0269】
2つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは2つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、2つの蛍光色素に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素1つにつき1度スキャンし、各アレイを通常2度スキャンする。
【0270】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比1:100,000に相関させる。 異なる源泉(例えば試験される細胞及び対照細胞など)からの2つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、2つの蛍光色素で較正するcDNAのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【0271】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(A/D)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク(発光スペクトルの重なりに起因する)を補正する。
【0272】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。
【0273】
11 相補的ポリヌクレオチド
GCRECをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のGCRECの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア(National Biosciences)とGCRECをコードする配列とを用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、GCRECをコードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオチドをデザインする。
【0274】
12 GCREC の発現
GCRECの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて行うことができる。細菌でGCRECを発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導されるとGCRECを発現する。真核細胞でのGCRECの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え、或いは転移プラスミドの仲介に関与する細菌仲介遺伝子転移のどちらかによって、GCRECをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(Engelhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945.等を参照)。
【0275】
殆どの発現系では、融合タンパク質としてGCRECを合成するのに例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや6−Hisを用いる。 これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に1ステップで行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする(Amersham Pharmacia Biotech)。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてGCRECからタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いて免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6−Hisは、金属キレート樹脂(QIAGEN)上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel(1995)10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したGCRECを直接用いて、適用可能な場合には実施例16、17及び18のアッセイを行うことができる。
【0276】
13 機能的アッセイ
GCREC機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのGCRECをコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド(Life Technologies)及びpCR 3.1プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA) が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、CD64またはCD64−GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー(FCM)を用いて、GFPまたはCD64−GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【0277】
遺伝子発現におけるGCRECの影響は、GCRECをコードする配列とCD64またはCD64−GFPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64−GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG(IgG)の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、ヒトIgGまたはCD64に対する抗体(DYNAL, Lake Success. NY)で覆われた磁気ビーズを用いて有効に分離することができる。 mRNAは、本技術分野で公知の方法で細胞から精製することができる。 GCRECその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【0278】
14 GCREC 特異抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488−495等を参照)または他の精製技術を用いて実質上精製されたGCRECを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
或いは、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いてGCRECアミノ酸配列を解析し、免疫抗原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばC末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である(前出のAusubel, 1995, 11章等を参照)。
【0279】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて合成し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を用いた反応によってKLH(Sigma−Aldrich, St. Louis MO)に結合させて、免疫抗原性を高める(前出のAusubel, 1995 等を参照)。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗GCREC活性を検査するには、ペプチドまたはGCRECを基質に結合し、1%BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【0280】
15 特異抗体を用いた天然の GCREC の精製
天然または組換えGCRECを、GCREC特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗GCREC抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース(Amersham Pharmacia Biotech)と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【0281】
GCRECを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、GCRECを優先的に吸着する条件下(例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液)でカラムを洗浄する。抗体とGCRECの結合を破壊する条件(例えばpH2〜3の緩衝液、或いは尿素またはチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤)でカラムを溶出させ、GCRECを回収する。
【0282】
16 GCREC と相互作用する分子の同定
GCRECと相互作用する分子は、Gタンパク質などのシグナル伝達に関与する分子以外にもアゴニスト及びアンタゴニストを含み得る。GCRECまた断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529−539を参照)。GCRECの断片には、例えば3つの細胞外ループのうち1つ若しくは複数のループ、細胞外N末端領域または第3細胞内ループがある。マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識したGCRECと共にインキュベートして洗浄し、標識したGCREC複合体を有する全ての穴をアッセイする。GCREC濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのGCRECの数、親和性及び結合の値を計算する。
【0283】
或いは、GCRECと相互作用する分子は、Fields, S. 及び O. Song (1989) Nature 340:245−246 に記載されているような酵母2ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはMATCHMAKERシステム(Clontech)等の2ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
GCRECはまた、高処理方法で酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)に用いて、遺伝子の2大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる(Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号)。
【0284】
潜在的GCRECアゴニストまたはアンタゴニストは、実施例17及び18に記載のアッセイを用いてGCREC受容体活性の活性化または阻害を試験し得る。候補分子は、既知のGPCRアゴニストまたはアンタゴニスト、ペプチドライブラリまたは組み合わせの化学ライブラリから選択し得る。
【0285】
GCRECとGタンパク質などの細胞内シグナル伝達分子の相互作用を検出する方法は、オーファンGタンパク質結合膜7回貫通受容体から得た内部セグメントまたは細胞質ドメインが、既知のGタンパク質結合膜7回貫通受容体の相似ドメインと交換され、Gタンパク質及びオーファン受容体ドメインに活性化された下流シグナル伝達経路を同定するために用いられるという前提に基づく(Kobilka, B.K. ら (1988) Science 240:1310−1316)。同様に、オーファン受容体のドメインが融合タンパク質の一部としてクローニングされ、結合アッセイで用いて特定のGタンパク質との相互作用を実証し得る。研究によれば、Gタンパク質結合膜7回貫通受容体の第3細胞内ループがGタンパク質相互作用及びシグナル伝達に重要であることが示されてきた(Conklin, B.R. ら (1993) Cell 73:631−641)。例えば、GCRECの第3細胞内ループに対応するDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により増幅し、pGEX(Pharmacia Biotech)などの融合ベクターにサブクローニングし得る。構成体は誘導された適切な細菌性宿主に形質転換され、融合タンパク質はグルタチオンセファロース4B(Pharmacia Biotech)アフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製する。
【0286】
in vitro結合アッセイの場合、Gタンパク質を含む細胞抽出物は、50mM Tris、pH7.8、1mM EGTA、5mMのMgCl2、20mMのCHAPS、20%グリセロール、各10μgのアプロチニン及びロイペプチンと、20μlの50mMフッ化フェニルメチルスルフォニルで抽出することにより準備する。溶解産物は絶えず撹拌しながら氷上で45分間インキュベートし、23,000g、4℃で15分間遠心分離して上澄みを集める。750μgの細胞抽出物をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質ビーズを用いて4℃で2時間インキュベートする。 GSTビーズは、リン酸緩衝食塩水で5回洗浄する。結合Gサブユニットは、百日咳毒素またはコレラ毒素を用いた[32P]ADPリボシル化により検出する。SDSサンプル緩衝液(4.6%(w/v) SDS、10%(vlv) βメルカプトエタノール、20%(w/v) グリセロール、95.2mM Tris−HCl、pH6.8、0.01%(w/v) ブロムフェノールブルー)を添加することにより反応を停止させる。[32P]ADP標識されたタンパク質は、10%SDS−PAGEゲルで分離し、オートラジオグラフを行う。ゲル中で分離したタンパク質はニトロセルロースペーパーに移し、ブロット(blotto)(5%脱脂粉乳、50mMのTris−HCl (pH 8.0)、2mMのCaCl2、80mMのNaCl、0.02%のNaN3 及び0.2%ノニデットP−40)を用いて室温で1時間遮断し、Gαサブタイプ選択的抗体(1:500; Calbiochem−Novabiocliem)で1.5時間インキュベートする。3洗浄後に、ブロットはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)共役ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(1:2000, Cappel, Westchester PA)でインキュベートし、化学ルミネセンスベースのECL法(Amersham Corp)で可視化する。
【0287】
17 GCREC 活性の実証
GCREC活性に対するアッセイは、細胞表面におけるGCRECの発現を測定する。 GCRECをコードするcDNAは、好適な哺乳動物細胞系に形質移入する。細胞表面タンパク質は、記載されているようにビオチンで標識する(de la Fuente, M.A. ら (1997) Blood 90:2398−2405)。GCREC特異抗体を用いて免疫沈降を実行し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降と未標識免疫沈降の比は、細胞表面に発現したGCRECの量に比例する。
【0288】
或いは、GCREC活性のためのアッセイは、リガンド/受容体が仲介する細胞増殖の調節のための原型アッセイに基づく。このアッセイでは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の速度を測定する。当分野で公知の形質移入方法を用いて、GCRECをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3培養細胞に加える。 一過性に形質移入された細胞は次に、放射性DNA前駆分子である[3H]チミジンの存在下でインキュベートする。次に、培養した細胞にGCRECリガンドの変化する量を加える。[3H]チミジンの酸沈殿可能DNAへの取り込みは、ラジオアイソトープカウンターを用いて適切な時間間隔で測定する。 取り込み量は、新たに合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも100倍のGCRECリガンド密度範囲に対する投与−反応の1次曲線は、受容体活性を示す。ミリリットル当りの活性の1単位は、50%の反応レベルを産出するGCRECの密度として画定され、100%であれば[3H]チミジンを酸沈殿可能DNAに最大限取り込むことを表す(McKay, I. および I. Leigh, eds. (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, p.73)。
【0289】
或いは、GCREC活性のためのアッセイは、GPCRファミリータンパク質がGタンパク質活性化第2メッセンジャーシグナル伝達経路(例えばcAMP; Gauclin, P. ら (1998) J. Biol. Chem. 273:4990−4996)を調整する能力に基づく。GCRECをコードするプラスミドを、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物細胞系に形質転換する(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞系(CHO)またはヒト胚腎細胞株(HEK−293))。 形質転換細胞を12ウェルトレイの培養液で48時間増殖させ、次に培養液を捨て、付着している細胞をPBSで軽く洗浄する。培地においてリガンド有りまたはリガンドなしで細胞を30分間インキュベートし、次に培地を除去し、細胞を1Mの過塩素酸で処理して溶解する。溶解産物中のcAMPレベルは、当分野で既知の方法を用いて放射免疫アッセイにより測定する。 リガンドに曝された細胞から得た溶解産物中のcAMPレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するGCRECの量に比例する。
【0290】
イノシトールリン酸レベルの変化を測定するためには、1×105 細胞/穴を含む24穴プレートで細胞を成長させ、イノシトールを含まない培地及び [3H]ミオイノシトールを用いて2μCi/穴で48時間インキュベートする。培地を除去し、10mMのLiClを含む緩衝液で細胞を洗浄し、その後リガンドを添加する。反応は、過塩素酸の添加により停止する。イノシトールリン酸は、Dowex AG1−X8(Bio−Rad)陰イオン交換樹脂及び液体シンチレーションにより計数された全ての標識されたイノシトールリン酸で抽出及び分離される。リガンドに曝された細胞から得た標識されたイノシトールリン酸のレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するGCRECの量に比例する。
【0291】
18 GCREC リガンドの同定
GCRECは、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)またはHEK(ヒト胎児腎臓)293などの真核細胞系において発現する。 これらの細胞系は、GPCR発現過程が良好であり、発現したGCRECを下流エフェクターに機能的に結合させることができるような広範囲のGタンパク質を含む。候補リガンドの存在下で発現した受容体の活性化に対し、形質転換した細胞をアッセイする。活性は、cAMPまたはCa2+ などの細胞内第2メッセンジャーの変化により測定する。当分野で公知の標準的な方法を用いるか、活性化受容体によるタンパク質キナーゼCの刺激に反応して発光タンパク質(例えばホタルルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質)がプロモーターの転写調節下にあるようなレポーター遺伝子アッセイを用いて直接測定する(Milligan, C. ら (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235−237)。アッセイ技術は、これら第2メッセンジャーシステムの両方に利用可能であり、アデニリルシクラーゼ活性化FlashPlate Assay(NEN Life Sciences Products)などのマルチウェルプレートフォーマットまたはFluo−4 AM(Molecular Probes)などの蛍光Ca2+ 指示薬でFLIPR蛍光定量的プレート読出しシステム(Molecular Devices)を併用して高処理読出しを可能にする。生理的関連性のある第2メッセンジャー経路が知られていない場合、GCRECは、ホスホリパーゼC及びCa2+ 可動化に関与する経路を介してGCRECのシグナル伝達を通すために、広範囲のGタンパク質と結合することが実証されているようなGタンパク質Gα 15/16と同時発現し得る(Offerrnanns, S. および M.I. Simon (1995) J. Biol. Chem. 270:15175−15180)。或いは、GCRECは内在性GPCRが不足しているような操作された酵母系に発現し、それによってOCREC活性化スクリーニングに対してバックグラウンドが存在しない利点を提供し得る。これらの酵母系は、ヒトGPCR及びGαタンパク質を内在性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素に対して置換する。シグナルに対する正常な酵母反応を選択的培地の正の成長またはレポーター遺伝子発現に変換するように、下流シグナル伝達経路も変更する(Broach, J.R. および J. Thorner (1996) Nature 384 (supp.):14−16)。既知のGPCRリガンド及びその他天然の生理活性分子を含む推定上のリガンドに対して受容体をスクリーニングする。組織、生物学的流体及び細胞上澄みから抽出した生物学的抽出物もスクリーニングする。
【0292】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【0293】
(表の簡単な説明)
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【0294】
表2は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【0295】
表3は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【0296】
表4は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA及びゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【0297】
表5は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【0298】
表6は、表5に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【0299】
表7は、GCRECの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【0300】
表8は、本発明のポリヌクレオチドの組織特異発現を示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
Claims (90)
- 以下の(a)−(d)を有する群から選択した実質上単離されたポリペプチド。
(a)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるようなアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド
(c)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
(d)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片 - SEQ ID NO:1−23を有する群から選択した請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:24−46を有する群から選択した請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
- 請求項6に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
- 請求項1に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
(a)前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
(b)このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。 - 請求項1に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
- 以下の(a)−(d)を有する群から選択した実質上単離されたポリヌクレオチド。
(a)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(b)SEQ ID NO:24−46を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるような天然のポリヌクレオチド
(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(e)(a)〜(d)のRNA等価物 - 請求項11に記載のポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
(b)前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。 - 前記プローブが少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
(b)前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。 - 有効量の請求項1のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを有することを特徴とする成分。
- 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項16に記載の成分。
- 機能性GCRECの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項16に記載の成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。 - 請求項19に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。
- 機能性GCRECの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項20に記載の成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。 - 請求項22に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。
- 機能性GCRECの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項23に記載の成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)適切な条件下で請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、
(b)請求項1に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、
(b)請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
(c)試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。 - 請求項5に記載の配列を有する標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
(c)可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
(a)核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
(b)処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項11のポリヌクレオチドの少なくとも20の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせるステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項11のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記ステップと、
(c)ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
(d)前記処理した生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理していない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理した生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。 - 生物学的サンプル中のGCRECの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
(a)前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項10に記載の抗体と結合する過程と、
(b)前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。 - 前記抗体が、
(a)キメラ抗体
(b)単鎖抗体
(c)Fab断片
(d)F(ab’)2 断片
(e)ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする請求項10に記載の抗体。 - 請求項10に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む化合物。
- 被検者のGCRECの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項31に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
- 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項31に記載の化合物。
- 被検者のGCRECの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項33に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項10に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体を単離する過程と、
(c)前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 請求項35に記載の方法で産出した抗体。
- 請求項36に記載の抗体及び適切なキャリアを含む化合物。
- 請求項10に記載の抗体の特異性を有する抗体を用いてモノクローナル抗体を製造する方法であって、
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
(c)不死化細胞を用いて前記抗体産出細胞を融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
(d)前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
(e)SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 請求項38に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
- 請求項39に記載の抗体及び適切なキャリアを含む化合物。
- Fab発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項10に記載の抗体。
- 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項10に記載の抗体。
- SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する方法であって、
(a)前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項10に記載の抗体をインキュベートする過程と、
(b)特異結合を検出する過程とを含み、 該特異結合が、SEQ ID NO:1−23 を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。 - SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
(a)前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項10に記載の抗体をインキュベートする過程と、
(b)前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1−23を有する群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。 - SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ NO ID:24のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:25のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:26のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:27のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:28のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:31のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:32のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:33のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:34のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:35のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:36のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:37のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:38のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:39のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:40のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:43のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:44のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:45のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ NO ID:46のポリヌクレオチド配列を有する請求項11に記載のポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20622200P | 2000-05-22 | 2000-05-22 | |
US20747600P | 2000-05-25 | 2000-05-25 | |
US20883400P | 2000-06-02 | 2000-06-02 | |
US20886100P | 2000-06-02 | 2000-06-02 | |
US20986800P | 2000-06-07 | 2000-06-07 | |
PCT/US2001/016833 WO2001090359A2 (en) | 2000-05-22 | 2001-05-22 | G-protein coupled receptors |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004515215A true JP2004515215A (ja) | 2004-05-27 |
JP2004515215A5 JP2004515215A5 (ja) | 2008-04-17 |
Family
ID=27539537
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001587153A Pending JP2004515215A (ja) | 2000-05-22 | 2001-05-22 | Gタンパク質結合受容体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1301595A2 (ja) |
JP (1) | JP2004515215A (ja) |
AU (1) | AU2001261814A1 (ja) |
CA (1) | CA2408140A1 (ja) |
WO (1) | WO2001090359A2 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1280899A2 (en) * | 2000-04-28 | 2003-02-05 | Warner-Lambert Company | Gene and sequence variation associated with sensing carbohydrate compounds and other sweeteners |
AU2001273167A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-14 | Curagen Corporation | G-protein coupled receptors and nucleic acids encoding same |
WO2002006345A2 (en) * | 2000-07-18 | 2002-01-24 | Curagen Corporation | G-protein coupled receptor proteins (gpcr) and nucleic acids encoding same |
EP1322758A2 (en) * | 2000-09-25 | 2003-07-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human g protein-coupled receptor |
AU2002227445A1 (en) * | 2000-12-18 | 2002-07-01 | Curagen Corporation | Proteins and nucleic acids encoding same |
US7803982B2 (en) | 2001-04-20 | 2010-09-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | T1R3 transgenic animals, cells and related methods |
EP1572871A4 (en) * | 2001-04-20 | 2007-11-14 | Sinai School Medicine | T1R3, A NEW TASTE RECEPTOR |
AU2002309196A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-01-08 | Decode Genetics Ehf. | Nucleic acids encoding olfactory receptors |
US8796441B2 (en) | 2005-04-13 | 2014-08-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Human sweet and umami taste receptor variants |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001066563A2 (en) * | 2000-03-07 | 2001-09-13 | Senomyx, Inc. | T1r taste receptors and genes encoding same |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100602857B1 (ko) * | 1998-07-28 | 2006-07-20 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 감각 정보 전달과 관련된 g-단백질 커플링된 수용체를암호화하는 핵산 |
EP2143796A3 (en) * | 2000-02-29 | 2010-03-17 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 1983, 52881, 2398, 45449, 50289, and 52872, G protein-coupled receptors and uses therefor |
EP1280899A2 (en) * | 2000-04-28 | 2003-02-05 | Warner-Lambert Company | Gene and sequence variation associated with sensing carbohydrate compounds and other sweeteners |
US20040086877A1 (en) * | 2000-06-16 | 2004-05-06 | Lal Preeti G. | Multi-mode directi memory access controller and method |
US20050106571A1 (en) * | 2003-10-02 | 2005-05-19 | The Regents Of The University Of California | Mammalian T1R3 sweet taste receptors |
-
2001
- 2001-05-22 AU AU2001261814A patent/AU2001261814A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-22 JP JP2001587153A patent/JP2004515215A/ja active Pending
- 2001-05-22 CA CA002408140A patent/CA2408140A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-22 WO PCT/US2001/016833 patent/WO2001090359A2/en active Application Filing
- 2001-05-22 EP EP01935748A patent/EP1301595A2/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001066563A2 (en) * | 2000-03-07 | 2001-09-13 | Senomyx, Inc. | T1r taste receptors and genes encoding same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001090359A3 (en) | 2003-01-30 |
EP1301595A2 (en) | 2003-04-16 |
AU2001261814A1 (en) | 2001-12-03 |
WO2001090359A2 (en) | 2001-11-29 |
CA2408140A1 (en) | 2001-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2004523203A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
US20080241158A1 (en) | Human taste-specific receptor TIR3 | |
JP2004500808A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
JP2004517604A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
JP2004516817A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2003527107A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
US20060035331A1 (en) | G-protein coupled receptors | |
JP2004516812A (ja) | 受容体 | |
JP2004500870A (ja) | 分泌タンパク質 | |
JP2004518402A (ja) | 分泌タンパク質 | |
JP2004515215A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
JP2003528633A (ja) | Gタンパク質結合受容体 | |
JP2004530409A (ja) | 膜貫通タンパク質 | |
JP2004528007A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2005503111A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2004532630A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2004531204A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2005501503A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2005500037A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2004520012A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
JP2005503775A (ja) | Gタンパク質共役受容体 | |
WO2004018631A2 (en) | G-protein coupled receptors | |
JP2004510415A (ja) | インテグリン | |
EP1303609A2 (en) | G-protein coupled receptors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080228 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101102 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110329 |