JP2004513612A - 実験動物の行動を分析するための新規スクリーニング器具 - Google Patents
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Abstract
本発明は、医薬化合物が行動に及ぼす複合的な作用を試験可能にするスクリーニング器具、および、このスクリーニング器具を用いた精神薬理学的モデル動物の行動試験手法に関する。
Description
【0001】
本発明は、医薬化合物が行動に及ぼす複合的な作用を試験可能にするスクリーニング器具、および、このスクリーニング器具を用いた精神薬理学的モデル動物の行動試験手法に関する。
【0002】
改良型ホールボードである本発明のスクリーニング器具は、小型の実験動物(特に、マウスやラット等の齧歯類動物、ツパイ(Tupaia belangeri)および小型霊長類動物)の行動を示差的に分析することが可能であり、薬理学的操作によって引き起こされる行動作用を評価することが可能である。
【0003】
さらに、本発明のスクリーニング器具を使用して、実験動物系統の選択的な繁殖または遺伝子操作によって引き起こされる行動変化を評価したり、実験動物の学習・記憶機能や薬物によるこれら機能への影響を評価したりすることもできる。
【0004】
行動薬理学に関する前臨床研究においては、様々な試験手法が使用されている(概説については、Lister, 1990; Menard & Treit, 1999を参照のこと)。これらの手法の大部分は、特定の1種類の治療活性、例えば、抗不安作用、鎮静作用または抗鬱作用などを予測するものであると考えられる。前臨床研究に最も広く用いられている動物である齧歯類動物では、これらの作用は、例えば、不安関連行動、リスクアセスメント、運動行動(locomotor activity)、および探索等における行動変化によって評価することができる(Belzung & Le Pape, 1994; Escorihuela et al., 1999;概説についてはRodgers, 1997を参照のこと)。
【0005】
薬物の作用を評価するには、自発的な無条件反射の試験を利用することが多い。これらの試験では、運動行動が極めて重要な役割を果たすため、運動を不安や探索の指標から確実に分離することは難しいようである(Sheldon, 1968)。化合物が行動に及ぼす作用を示差的に検討するには、異なる独立した試験を一通り行って得られる行動データと相関するモデルが実施に必要である(Treit, 1985)。従って、薬理活性を有する化合物の潜在的な行動特性の評価には、一連の特定の行動試験が必要であり、その結果、費用と時間のかかる手法となってしまう。さらに、動物の行動が状況特異的であることを考慮しなければならず、それゆえ、試験に特異的な1つの状況において薬物が抗不安作用を発揮したからと言って、該薬物が同様の作用を別の状況においても発揮するとは必ずしも言えない(概説についてはLister, 1990を参照のこと)。行動試験に基づく研究は、広範な行動様式を検討するものであり、かつ、1つの複合的なパラダイムにおける実験動物のより詳細な行動学的分析に着目したものであり、これらの欠点を解消すると考えられる(Cruz et al., 1994; Rodgers et al., 1997)。
【0006】
近年、コンビナトリアル化学やゲノムベースの研究等の分野においてかなりの進歩があり、臨床用途の可能性を有する莫大な数の新規化学物質がもたらされている。従って、製薬産業にとっては、別々の行動試験を手間と時間をかけて一通り行う必要のない単純な高速スループットスクリーニング法の必要性がますます高まっている。
【0007】
本発明は、改良型ホールボード(mHB)のパラダイムに関するものであり、単一の実験環境において無条件反射に対する複合的な行動学的観察を行うことができる。本発明のmHBは、特に、探索および活動に及ぼす薬物の作用を評価するのに使用される(File and Wardill, 1975a; Geyer, 1996)古典的なホールボードの特徴と、不安および運動活動を検討するのに使用される(概説についてはKelley, 1993を参照)オープンフィールドの特徴とを有している。本発明のmHBには、ツパイの探索欲求と認識機能を検討するために本来設計されたホールボード(Ohl et al., 1998; Ohl and Fuchs, 1999)と、運動活動を評価するために高度に標準化された試験パラダイム(概説についてはKelley, 1993を参照)であるオープンフィールドとが含まれ、該オープンフィールドは、実験動物を収容するコンパートメントに隣接している。
【0008】
さらに、本発明のmHBは、試験すべき動物間の視覚的・嗅覚的接触を可能にすることにより、試験時の社会的隔離のストレス要因を回避し、かつ、グループメンバー同士の社会的親和性を評価できるように設計されている。
【0009】
本発明のスクリーニング器具は、実験動物の行動を評価するための設備を構成するものであり、
(a)複数の前記実験動物を収容するための第1コンパートメント、
(b)前記複数の実験動物のうちの1匹の行動を試験するための第2コンパートメント、および
(c)前記第2コンパートメント内に設置されたホールボード
を含み、ここで前記第2コンパートメントはオープンフィールドであって、前記第1コンパートメントに隣接して配置されており、前記第1および第2コンパートメントは互いに少なくとも流体的に連結されている。
【0010】
以下、本発明の好適な実施形態を図面を参照しながら説明する。
図1に示す設備2には、基本的に、複数の実験動物を収容するための第1コンパートメント4が含まれる。この第1コンパートメント4は、グループコンパートメントとも称する。設備2にはさらに、第1コンパートメント4に収容される複数の実験動物のうちの1匹の行動を試験するための第2または試験コンパートメント6が含まれる。試験コンパートメント6はグループコンパートメント4に隣接して配置され、コンパートメント4および6の双方は互いに少なくとも流体的に連結されている。好ましくは、2つのコンパートメント4および6間の流体交換用に少なくとも1つの孔10を有する仕切8によって、第1および第2コンパートメント4および6を互いに区切る。本発明によれば、このような構成は、試験コンパートメント6内に入れられた試験すべき実験動物の特定の1匹が、第1またはグループコンパートメント4に収容されたその社会的グループと比較的緊密に接触し続けられるため、特に有利である。第1および第2コンパートメント4および6を区切る仕切は、好ましくは透明な材料からなり、最も好ましくは透明PVC材料からなる。
【0011】
第2または試験コンパートメント6はオープンフィールドの形態で配置し、該フィールド内へホールボード12を設置する。ホールボード12は、アレイ状に配置された複数の孔14を有する。好適な実施形態では、ホールボード12には、ホールボード12の孔14を覆う少なくとも1つの可動式の蓋(図示せず)が含まれる。この蓋は、試験動物が開閉できるように設計されている。同様に、複数のまたは全ての孔14に可動式の蓋を備えることも可能であり、場合により蓋をコイルばねで固定してもよい(Ohl F et al., (1998), J Neurosci Meth 81: 35−40)。好ましくは、ホールボード12を第2コンパートメント6の中央に設置する。即ち、第2コンパートメント6を囲むコンパートメント壁16から等距離となるように設置する。第1および第2コンパートメント4および6が互いに接触する領域では、コンパートメント壁16を仕切10の形態で配置すればよい。ホールボード12および/または第2コンパートメント6は、好ましくは不透明なPCV材料からなり、好ましくは試験すべき動物の色とコントラストをなす。
【0012】
第2コンパートメント6によって規定されるオープンフィールドは、本発明の好適な実施形態によれば、オープンフィールドを複数のより小さなフィールド20へ分割する検出可能なマーキング18を備えている。このような検出可能なマーキング18は、好ましくはオープンフィールドを方形に分割する複数のラインとして形成されるが、このようなマーキング18を用いることにより、試験される実験動物の動き、従って行動をより簡単に検出することができる。
【0013】
本発明の特に好適な一実施形態では、動物の行動を自動的に検出するための手段22によって試験される実験動物の行動を検出する。この自動検出手段22には、好ましくは、第2コンパートメント6のオープンフィールドの連続画像を供給するビデオ手段またはビデオカメラ24、信号ライン26、および、好ましくはデジタルコンピュータ28の形態をした制御手段が含まれる。本実施形態によれば、連続的に供給されるビデオカメラ24の画像は、信号ライン26を経由してデジタルコンピュータ28へ送られるが、該デジタルコンピュータには、試験される実験動物の行動を検出または評価するための適切なソフトウエアが組込まれている。デジタルコンピュータ28によって得られた評価結果は、デジタルコンピュータ28の記憶手段(図示せず)に保存してもよい。
【0014】
本発明の設備2は、好ましくは、使用する個々の実験動物の大きさに合うように設計し、典型的には、第1コンパートメント4は約長さ50cm、幅50cm、高さ50cmであり、第2コンパートメント6は約長さ100cm、幅50cm、高さ50cmであり、ホールボード12は好ましくは約長さ60cm、幅20cm、高さ2cmである。
【0015】
同様に孔の数と直径も、使用すべき個々の実験動物の大きさに合うように設計されることは明らかである。
後述する実験では、mHBが、単一の実験設定におけるマウスやラットのような齧歯類動物(並びに、ツパイや小型霊長類動物といった他の小型実験動物)の行動特性の決定にとって信頼性の高い試験であることを証明する。
【0016】
引き続く実験では、基本的な運動活動では差は見られないが、不安関連行動において差を生じると考えられるHABおよびLABを用いて、本発明のmHBの有効性を証明する。これらの実験では、ジアゼパム(標準的な抗不安薬に該当;概説についてはLister, 1990を参照)で急性処置した場合およびパロキセチン(抗鬱薬としてだけでなく非定型抗不安薬としても公知;Griebel, et al., 1999)で慢性処置した場合の行動の結果を評価する。
【0017】
薬物の精神薬理学的効力は、正常なボランティア集団では判別できないことが多いため(概説についてはHolsboer, 1995を参照)、同様のことが未選別の一般的な実験動物集団に対しても当てはまる可能性が高い(概説についてはLister, 1990を参照のこと)。従って、先天的に情動性が極端なモデル動物において、潜在的な抗不安薬が行動に及ぼす可能な作用を検討することがより適切であると考えられる(Liebsch et al., 1998b)。ウィスターラットは高架式十字迷路(elevated plus maze: EPM)に対してこの基準を満たしており、過去10年間にわたって選択的に繁殖されてきた(Liebsch et al., 1998a)。一般に、不安関連行動の多いラット(HAB)の系統は先天的に情動性が高く、ストレスの多い条件下では、不安関連行動の少ないラット(LAB)の系統よりも消極的なストレス対処対策を示す(Liebsch et al., 1998b)。薬理学的な検証を含む広範囲の研究からは、HABにおける不安亢進が強い形質であって、多くの面で精神病患者に似ていることが判明している(Keck et al., 1999; Landgraf et al., 1999; Liebsch et al., 1998b)。従ってHABは、表面的かつ予測的な妥当性を有する、先天的不安の唯一のモデル動物と言える。
【0018】
実験:
方法
動物
HABおよびLABの双方の選別と繁殖は、Liebschら(1998a)によって詳細に既述されている。簡単に言うと、ラットをMax Planck Instituteの動物施設にて標準的な実験室条件下で維持および飼育した(12:12昼:夜、6:00に照明点灯、22℃、60%湿度、水およびラット用標準固形飼料は摂取自由とした)。何年かにわたって、HABとLABを飼育管理、交配および行動試験に関して全く同様に処置した。本実験に使用する動物は、F10世代からの成体オス個体(n=82;体重:280〜350)とした。全てのラットを一群3〜5匹として標準的なラット用ケージに収容した。
【0019】
mHB試験にあたっては、1つの社会的グループに属する全ての個体(即ち、グループメンバー)をグループコンパートメントへ入れた。30分間馴化させた後、全ての個体を順に5分間ずつ実験ボックスへ入れた。全ての試験をビデオ撮影し、ラットの系統と処置を伏せた状態で、訓練を積んだ観察者によって直接モニターした。
【0020】
下記のパラメータを測定し、様々な行動カテゴリーに割り当てた:
−ボード上での時間の比率(%時間)、初めてボードに侵入するまでにかかる時間(ボード潜時)、ボードへの侵入回数(ボード侵入頻度)は、未保護領域(即ち、ボード)に対する回避行動を表し、「不安」として解釈される;
−1分間に訪れたボード上の孔の数(探索孔数)、ボード上で後肢起立した回数(ボード上起立頻度)、ボックス内で後肢起立した回数(ボックス内起立頻度)は、探索関連行動を表す;
−伸び注意(stretched attend)の回数(伸び注意頻度)は、リスクアセスメント行動を表す;
−ボックス内におけるライン横断の回数(ライン横断頻度)は、運動活動を表す;
−初回のグループ接触までにかかる時間(グループ接触潜時)は、グループメンバーに対する実験動物の社会的親和性を表す;
−初回のセルフグルーミングまでにかかる時間(グルーミング潜時)、初回の排泄までにかかる時間(排泄潜時)は、生理学的な覚醒を表す。
【0021】
実験プロトコール
全ての実験を12:00〜16:00の間に行った。行動試験の1週間前に、動物を馴化させるため試験室へ移した。ジアゼパム実験の場合には、動物に、1mg/kg体重のジアゼパム(Diazepam−Lipuro, Braun−Melsungen, Germany)またはビヒクル(Aqua ad iniectabilita, Braun−Melsungen, Germany)のいずれかを試験30分前に腹腔内注射した。
【0022】
選択的なセロトニン再取り込み阻害剤であるパロキセチン(SmithKline Beecham, Sussex, UK)は水に溶解して常用の水瓶へ充填し、飲み水を介して10週間動物に与えた(5mg/kg体重)。パロキセチン溶液の消費量を測定し、該溶液を毎朝新しいものと取り替えた。対照群には通常の飲み水を与えた。溶液の摂取量を制御するには、パロキセチン実験の動物を全て1匹ずつ収容しなければならなかったため、社会的接触の評価はできなかった。
【0023】
統計処理
HABおよびLABにおける基本試験より得られた行動データを、ラット系統をグループ間要因として一元配置分散分析(ANOVA;STATISTICA, StatSoft, Tulsa, USA)によって分析した。薬理学的実験のビヒクルグループも同様に一元配置ANOVAによって分析し、mHBにおいて起こり得る行動の系統差の再現性を制御した。次いで、薬理学的実験より得られた行動データを、遺伝子系統と処置を主要因として二元配置ANOVAで分析した。分析を行った後、しかるべき場合には事後LSD検定を行った。p<0.05を有意差ありとした。データは平均±SEMで表す。
【0024】
結果
HABおよびLABの基本行動を比較したところ、不安を表すと考えられるパラメータにおいて2つのラット系統間で有意差が認められた(ボード上における滞留時間:F(1,24)=49.7、p<0.001;ボード潜時:F(1,24)=6.7、p<0.02;ボード侵入頻度:F(1,24)=36.5、p<0.001)。さらに、HABをLABと比較すると、伸び注意の回数が多く(F(1,24)=84.0、p<0.001)、かつ、運動(F(1,24)=11.3、p<0.003)および未保護領域(即ち、ボード)の探索(ボード上起立頻度:F(1,24)=11.6、p<0.003;探索孔数:F(1,24)=14.2、p<0.001;孔潜時:F(1,24)=6.6、p<0.02)については積極性が低かったが、保護領域(即ち、ボックス)の探索と社会的親和性については差は認められなかった。同様に、いずれの薬理学的実験においても、ビヒクルで処置したHABおよびLAB間で未処置試験群と同等の行動差が認められた。
【0025】
mHBにおけるジアゼパム処置動物の行動パラメータに対する二元配置ANOVA(系統×処置)からは、HABとLABが、リスクアセスメント行動(伸び注意頻度:F(1,14)=8.25、p<0.02)および不安関連行動(ボード潜時:F(1,14)=5.89、p<0.03;ボード侵入頻度:F(1,14)=4.64、p<0.05)において有意に異なることが判明した。HABでは、ジアゼパムの急性処置によってリスクアセスメント行動が有意に減少し(p<0.01)、ビヒクル処置ラットで見られた系統差が消失した。さらに、ジアゼパムの急性処置によって、HABの「ボード潜時」(p<0.02)および両ラット系統の「ボード侵入頻度」に影響が及ぶため、不安関連行動におけるグループ差が消失した。
【0026】
mHBにおけるパロキセチン処置動物の行動パラメータに対する二元配置ANOVA(系統×処置)からは、「孔潜時」(F(1,36)=4.5、p<0.05)においてのみ2つの要因間に有意な相互作用が認められた。HABにてこのパラメータが上昇したため(p<0.01)、ビヒクル処置系統には見られなかった有意差が処置ラット系統間で生じた。他の点については、パロキセチン処置ではLABの行動に影響を与えることはなかった。
【0027】
上述の実験では、不安亢進および不安後退についてそれぞれ飼育した未処置ラットのmHB行動から、不安関連行動において明らかな差が認められたが、この所見は、無条件不安に関する別の試験によって得られた以前の結果と一致する(Henniger et al., 2000; Liebsch et al., 1998a,b)。さらに、HABをLABと比較したところ、保護領域の探索(即ち、ボックス内起立頻度)または社会的親和性においては差は認められなかった。同様の行動上の特徴が、薬理学的試験におけるビヒクル処置動物にも見られた。これらの結果からは、mHBによって齧歯類動物の行動上の特徴を示差的に検討することが可能であり、従って、精神病理学的動物モデルの表面的妥当性を評価し得ることが明らかである。
【0028】
興味深いことに、抗不安薬であるジアゼパムによる急性処置により、未処置およびビヒクル処置のHABおよびLABの双方において観察された系統差がほぼ完全に消失した。HABでは「ボード潜時」と「ボード侵入頻度」がジアゼパムによって変化したことから、極度の不安状態のラットにおける抗不安作用が明らかとなった。このような観察は、ラットにおけるジアゼパムの作用に関する以前の研究結果と合致している(Fernandez et al., 1996; Liebsch et al., 1998b)。HABでは、リスクアセスメント行動(即ち、伸び注意頻度)の減少が付随して起こる一方で運動に対しては何ら作用は認められなかったことからジアゼパムの抗不安作用が際立ったにもかからわず、不安関連行動のパラメータの1つ(ボード上での滞留時間の比率)では有意な処置作用は認めらなかったため、HABとLABの選別基準(Liebsch et al., 1998a,b)に当たる未保護領域に対する回避行動が、これらのラット系統で非常に安定であることが示唆される。
【0029】
LABでは、一見したところ、ジアゼパムによる急性処置によって抗不安作用が生み出されたように思われる。即ち、HABで観察された作用とは逆に、LABでは「ボード潜時」がかなり増加し、「ボード侵入頻度」が減少した。しかしながら、運動が減少し、かつ、リスクアセスメント行動に変化がなくなる付随的な傾向は、非不安状態の動物においてはジアゼパムの抗不安作用よりも鎮静作用を示している。以上のことを考え合わせると、これらの結果からは、不安亢進個体におけるジアゼパムの抗不安作用だけでなく、不安低下個体におけるかなりの鎮静作用に対する証拠が得られ、従って、mHBによって精神病理学的動物モデルの予測的妥当性を評価し得ることが示唆される。
【0030】
選択的なセロトニン再取り込み阻害剤であるパロキセチンによる慢性処置では、未保護領域の不安を表すパラメータに対しては何ら作用は認められなかったものの、リスクアセスメント行動における基本的な系統差がパロキセチンによる慢性処置の後で消失したことから、HABにおいては軽度の抗不安作用が明らかである。このことは、リスクアセスメント行動が慣用の不安指標よりも、パロキセチン等の非定型抗不安薬の作用の影響を受けやすいとする仮説と一致している(Griebel et al., 1997)。しかしながら、抗鬱薬(Beaufour et al., 1999)およびセロトニン再取り込み阻害剤であるフルオキセチン(Silva & Brandao, 2000)で慢性処置した後、高架式十字迷路においてラットの行動を検討した最近の研究では、古典的な不安指標およびリスクアセスメント行動のいずれにも変化は認められなかった。処置によって引き起こされるリスクアセスメント行動の変化をmHBで観察すれば、ストレスにより低下した本試験の特徴が、無条件反射の他の試験よりも微細な処置作用を見出すことができる。
【0031】
パロキセチンの慢性処置は、HABにおける「孔潜時」を顕著に増加させた。このことから、まず、パロキセチンによって、不安亢進動物における未保護領域の探索欲求がわずかに減少したことが示唆される。しかしながら、探索された孔の数はパロキセチン処置による影響を受けなかったため、未保護領域全般に対する探索欲求が変化したというよりも、探索の仕方が変わったという説明の方が妥当である。興味深いことに、LABでは処置による行動変化は観察されなかったため、パロキセチンの慢性処置は非不安状態の個体には無効であることが示唆される。
【0032】
上述の実験は、mHBが、行動プロファイルの正確かつ微細な識別を可能にする単純な試験パラダイムをもたらすことを明らかに示している。
mHBはホールボードとオープンフィールドの組合せである。mHBでは、試験すべき動物同士の社会的接触を維持し得るため、行動をマスキングしてしまう影響を憂慮してグループメンバーへの社会的接触を常に遮断していた従前の試験パラダイムとは対照的に、動物の社会的隔離が回避される。さらに、社会的接触の必要性を評価することもできる。従って、このような新規の試験パラダイムは、不安関連行動、リスクアセスメント行動、探索、運動活動および社会的親和性を含む広範囲の行動を検討することが可能である。
【0033】
上記からも明らかなように、mHB試験を用いることで、齧歯類動物の基本行動を示差的に分析し、異なる薬理学的処置によって引き起こされる行動作用をストレス低下性条件下にて評価することができる。不安、探索、および運動活動といった行動は、本行動試験で得られる行動パラメータを徹底してモニターおよび分析することにより、分離・検討することができる。従ってmHBは、別々の試験を一通り行わなければならない先行技術に比べ、有意に改善されている。行動プロファイルの微細な識別さえも単一の単純な試験によって判定し得るという所見は、予想外かつ従来の知見に反するものである。
【0034】
従ってmHBは、ハイスループットスクリーニングのための単純かつ便利なスクリーニング器具を提供するものである。
最終的にmHB試験は、社会的隔離を回避することからストレスにより低下したその特徴のため、研究者が不安関連行動の弱い変化または探索欲求の変化といった微細な行動変化を評価することが可能である。
【0035】
従ってmHBは、前臨床研究において潜在的な治療剤をハイスループットスクリーニングするのに有効な器具であり、また、特定の実験動物系統において遺伝的に引き起こされる行動作用を評価するのにも有効な器具である。mHBは単純であって費用効率もよく、さらに、実験動物の必要数を大幅に減らすことができ、併せて社会的隔離によるストレスが初めて回避された。また、従来のパラダイムとは反対に、単一の実験設定にて各々の行動パラメータを明確に識別することも可能である。例えばオープンフィールドのパラダイムでは、運動活動を探索から明確に分離することはできない。さらに、本発明のmHBを用いる試験設備および実験手法は運動試験または馴化試験に用いることもでき、また、例えばホールコンパートメントに飼料を入れて小型実験動物の視覚および嗅覚識別を評価するなどして記憶および学習を試験することもできる。
【0036】
本発明の改良型ホールボードは、Ohl et al., Biological Psychiatry, 2001(投稿中、引用により本明細書に含まれるものとする)に記載されているように、齧歯類動物の認識行為に及ぼす先天的不安の影響の検討に応用することもできる。
【0037】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明の好適な設備を体系的に示す。
本発明は、医薬化合物が行動に及ぼす複合的な作用を試験可能にするスクリーニング器具、および、このスクリーニング器具を用いた精神薬理学的モデル動物の行動試験手法に関する。
【0002】
改良型ホールボードである本発明のスクリーニング器具は、小型の実験動物(特に、マウスやラット等の齧歯類動物、ツパイ(Tupaia belangeri)および小型霊長類動物)の行動を示差的に分析することが可能であり、薬理学的操作によって引き起こされる行動作用を評価することが可能である。
【0003】
さらに、本発明のスクリーニング器具を使用して、実験動物系統の選択的な繁殖または遺伝子操作によって引き起こされる行動変化を評価したり、実験動物の学習・記憶機能や薬物によるこれら機能への影響を評価したりすることもできる。
【0004】
行動薬理学に関する前臨床研究においては、様々な試験手法が使用されている(概説については、Lister, 1990; Menard & Treit, 1999を参照のこと)。これらの手法の大部分は、特定の1種類の治療活性、例えば、抗不安作用、鎮静作用または抗鬱作用などを予測するものであると考えられる。前臨床研究に最も広く用いられている動物である齧歯類動物では、これらの作用は、例えば、不安関連行動、リスクアセスメント、運動行動(locomotor activity)、および探索等における行動変化によって評価することができる(Belzung & Le Pape, 1994; Escorihuela et al., 1999;概説についてはRodgers, 1997を参照のこと)。
【0005】
薬物の作用を評価するには、自発的な無条件反射の試験を利用することが多い。これらの試験では、運動行動が極めて重要な役割を果たすため、運動を不安や探索の指標から確実に分離することは難しいようである(Sheldon, 1968)。化合物が行動に及ぼす作用を示差的に検討するには、異なる独立した試験を一通り行って得られる行動データと相関するモデルが実施に必要である(Treit, 1985)。従って、薬理活性を有する化合物の潜在的な行動特性の評価には、一連の特定の行動試験が必要であり、その結果、費用と時間のかかる手法となってしまう。さらに、動物の行動が状況特異的であることを考慮しなければならず、それゆえ、試験に特異的な1つの状況において薬物が抗不安作用を発揮したからと言って、該薬物が同様の作用を別の状況においても発揮するとは必ずしも言えない(概説についてはLister, 1990を参照のこと)。行動試験に基づく研究は、広範な行動様式を検討するものであり、かつ、1つの複合的なパラダイムにおける実験動物のより詳細な行動学的分析に着目したものであり、これらの欠点を解消すると考えられる(Cruz et al., 1994; Rodgers et al., 1997)。
【0006】
近年、コンビナトリアル化学やゲノムベースの研究等の分野においてかなりの進歩があり、臨床用途の可能性を有する莫大な数の新規化学物質がもたらされている。従って、製薬産業にとっては、別々の行動試験を手間と時間をかけて一通り行う必要のない単純な高速スループットスクリーニング法の必要性がますます高まっている。
【0007】
本発明は、改良型ホールボード(mHB)のパラダイムに関するものであり、単一の実験環境において無条件反射に対する複合的な行動学的観察を行うことができる。本発明のmHBは、特に、探索および活動に及ぼす薬物の作用を評価するのに使用される(File and Wardill, 1975a; Geyer, 1996)古典的なホールボードの特徴と、不安および運動活動を検討するのに使用される(概説についてはKelley, 1993を参照)オープンフィールドの特徴とを有している。本発明のmHBには、ツパイの探索欲求と認識機能を検討するために本来設計されたホールボード(Ohl et al., 1998; Ohl and Fuchs, 1999)と、運動活動を評価するために高度に標準化された試験パラダイム(概説についてはKelley, 1993を参照)であるオープンフィールドとが含まれ、該オープンフィールドは、実験動物を収容するコンパートメントに隣接している。
【0008】
さらに、本発明のmHBは、試験すべき動物間の視覚的・嗅覚的接触を可能にすることにより、試験時の社会的隔離のストレス要因を回避し、かつ、グループメンバー同士の社会的親和性を評価できるように設計されている。
【0009】
本発明のスクリーニング器具は、実験動物の行動を評価するための設備を構成するものであり、
(a)複数の前記実験動物を収容するための第1コンパートメント、
(b)前記複数の実験動物のうちの1匹の行動を試験するための第2コンパートメント、および
(c)前記第2コンパートメント内に設置されたホールボード
を含み、ここで前記第2コンパートメントはオープンフィールドであって、前記第1コンパートメントに隣接して配置されており、前記第1および第2コンパートメントは互いに少なくとも流体的に連結されている。
【0010】
以下、本発明の好適な実施形態を図面を参照しながら説明する。
図1に示す設備2には、基本的に、複数の実験動物を収容するための第1コンパートメント4が含まれる。この第1コンパートメント4は、グループコンパートメントとも称する。設備2にはさらに、第1コンパートメント4に収容される複数の実験動物のうちの1匹の行動を試験するための第2または試験コンパートメント6が含まれる。試験コンパートメント6はグループコンパートメント4に隣接して配置され、コンパートメント4および6の双方は互いに少なくとも流体的に連結されている。好ましくは、2つのコンパートメント4および6間の流体交換用に少なくとも1つの孔10を有する仕切8によって、第1および第2コンパートメント4および6を互いに区切る。本発明によれば、このような構成は、試験コンパートメント6内に入れられた試験すべき実験動物の特定の1匹が、第1またはグループコンパートメント4に収容されたその社会的グループと比較的緊密に接触し続けられるため、特に有利である。第1および第2コンパートメント4および6を区切る仕切は、好ましくは透明な材料からなり、最も好ましくは透明PVC材料からなる。
【0011】
第2または試験コンパートメント6はオープンフィールドの形態で配置し、該フィールド内へホールボード12を設置する。ホールボード12は、アレイ状に配置された複数の孔14を有する。好適な実施形態では、ホールボード12には、ホールボード12の孔14を覆う少なくとも1つの可動式の蓋(図示せず)が含まれる。この蓋は、試験動物が開閉できるように設計されている。同様に、複数のまたは全ての孔14に可動式の蓋を備えることも可能であり、場合により蓋をコイルばねで固定してもよい(Ohl F et al., (1998), J Neurosci Meth 81: 35−40)。好ましくは、ホールボード12を第2コンパートメント6の中央に設置する。即ち、第2コンパートメント6を囲むコンパートメント壁16から等距離となるように設置する。第1および第2コンパートメント4および6が互いに接触する領域では、コンパートメント壁16を仕切10の形態で配置すればよい。ホールボード12および/または第2コンパートメント6は、好ましくは不透明なPCV材料からなり、好ましくは試験すべき動物の色とコントラストをなす。
【0012】
第2コンパートメント6によって規定されるオープンフィールドは、本発明の好適な実施形態によれば、オープンフィールドを複数のより小さなフィールド20へ分割する検出可能なマーキング18を備えている。このような検出可能なマーキング18は、好ましくはオープンフィールドを方形に分割する複数のラインとして形成されるが、このようなマーキング18を用いることにより、試験される実験動物の動き、従って行動をより簡単に検出することができる。
【0013】
本発明の特に好適な一実施形態では、動物の行動を自動的に検出するための手段22によって試験される実験動物の行動を検出する。この自動検出手段22には、好ましくは、第2コンパートメント6のオープンフィールドの連続画像を供給するビデオ手段またはビデオカメラ24、信号ライン26、および、好ましくはデジタルコンピュータ28の形態をした制御手段が含まれる。本実施形態によれば、連続的に供給されるビデオカメラ24の画像は、信号ライン26を経由してデジタルコンピュータ28へ送られるが、該デジタルコンピュータには、試験される実験動物の行動を検出または評価するための適切なソフトウエアが組込まれている。デジタルコンピュータ28によって得られた評価結果は、デジタルコンピュータ28の記憶手段(図示せず)に保存してもよい。
【0014】
本発明の設備2は、好ましくは、使用する個々の実験動物の大きさに合うように設計し、典型的には、第1コンパートメント4は約長さ50cm、幅50cm、高さ50cmであり、第2コンパートメント6は約長さ100cm、幅50cm、高さ50cmであり、ホールボード12は好ましくは約長さ60cm、幅20cm、高さ2cmである。
【0015】
同様に孔の数と直径も、使用すべき個々の実験動物の大きさに合うように設計されることは明らかである。
後述する実験では、mHBが、単一の実験設定におけるマウスやラットのような齧歯類動物(並びに、ツパイや小型霊長類動物といった他の小型実験動物)の行動特性の決定にとって信頼性の高い試験であることを証明する。
【0016】
引き続く実験では、基本的な運動活動では差は見られないが、不安関連行動において差を生じると考えられるHABおよびLABを用いて、本発明のmHBの有効性を証明する。これらの実験では、ジアゼパム(標準的な抗不安薬に該当;概説についてはLister, 1990を参照)で急性処置した場合およびパロキセチン(抗鬱薬としてだけでなく非定型抗不安薬としても公知;Griebel, et al., 1999)で慢性処置した場合の行動の結果を評価する。
【0017】
薬物の精神薬理学的効力は、正常なボランティア集団では判別できないことが多いため(概説についてはHolsboer, 1995を参照)、同様のことが未選別の一般的な実験動物集団に対しても当てはまる可能性が高い(概説についてはLister, 1990を参照のこと)。従って、先天的に情動性が極端なモデル動物において、潜在的な抗不安薬が行動に及ぼす可能な作用を検討することがより適切であると考えられる(Liebsch et al., 1998b)。ウィスターラットは高架式十字迷路(elevated plus maze: EPM)に対してこの基準を満たしており、過去10年間にわたって選択的に繁殖されてきた(Liebsch et al., 1998a)。一般に、不安関連行動の多いラット(HAB)の系統は先天的に情動性が高く、ストレスの多い条件下では、不安関連行動の少ないラット(LAB)の系統よりも消極的なストレス対処対策を示す(Liebsch et al., 1998b)。薬理学的な検証を含む広範囲の研究からは、HABにおける不安亢進が強い形質であって、多くの面で精神病患者に似ていることが判明している(Keck et al., 1999; Landgraf et al., 1999; Liebsch et al., 1998b)。従ってHABは、表面的かつ予測的な妥当性を有する、先天的不安の唯一のモデル動物と言える。
【0018】
実験:
方法
動物
HABおよびLABの双方の選別と繁殖は、Liebschら(1998a)によって詳細に既述されている。簡単に言うと、ラットをMax Planck Instituteの動物施設にて標準的な実験室条件下で維持および飼育した(12:12昼:夜、6:00に照明点灯、22℃、60%湿度、水およびラット用標準固形飼料は摂取自由とした)。何年かにわたって、HABとLABを飼育管理、交配および行動試験に関して全く同様に処置した。本実験に使用する動物は、F10世代からの成体オス個体(n=82;体重:280〜350)とした。全てのラットを一群3〜5匹として標準的なラット用ケージに収容した。
【0019】
mHB試験にあたっては、1つの社会的グループに属する全ての個体(即ち、グループメンバー)をグループコンパートメントへ入れた。30分間馴化させた後、全ての個体を順に5分間ずつ実験ボックスへ入れた。全ての試験をビデオ撮影し、ラットの系統と処置を伏せた状態で、訓練を積んだ観察者によって直接モニターした。
【0020】
下記のパラメータを測定し、様々な行動カテゴリーに割り当てた:
−ボード上での時間の比率(%時間)、初めてボードに侵入するまでにかかる時間(ボード潜時)、ボードへの侵入回数(ボード侵入頻度)は、未保護領域(即ち、ボード)に対する回避行動を表し、「不安」として解釈される;
−1分間に訪れたボード上の孔の数(探索孔数)、ボード上で後肢起立した回数(ボード上起立頻度)、ボックス内で後肢起立した回数(ボックス内起立頻度)は、探索関連行動を表す;
−伸び注意(stretched attend)の回数(伸び注意頻度)は、リスクアセスメント行動を表す;
−ボックス内におけるライン横断の回数(ライン横断頻度)は、運動活動を表す;
−初回のグループ接触までにかかる時間(グループ接触潜時)は、グループメンバーに対する実験動物の社会的親和性を表す;
−初回のセルフグルーミングまでにかかる時間(グルーミング潜時)、初回の排泄までにかかる時間(排泄潜時)は、生理学的な覚醒を表す。
【0021】
実験プロトコール
全ての実験を12:00〜16:00の間に行った。行動試験の1週間前に、動物を馴化させるため試験室へ移した。ジアゼパム実験の場合には、動物に、1mg/kg体重のジアゼパム(Diazepam−Lipuro, Braun−Melsungen, Germany)またはビヒクル(Aqua ad iniectabilita, Braun−Melsungen, Germany)のいずれかを試験30分前に腹腔内注射した。
【0022】
選択的なセロトニン再取り込み阻害剤であるパロキセチン(SmithKline Beecham, Sussex, UK)は水に溶解して常用の水瓶へ充填し、飲み水を介して10週間動物に与えた(5mg/kg体重)。パロキセチン溶液の消費量を測定し、該溶液を毎朝新しいものと取り替えた。対照群には通常の飲み水を与えた。溶液の摂取量を制御するには、パロキセチン実験の動物を全て1匹ずつ収容しなければならなかったため、社会的接触の評価はできなかった。
【0023】
統計処理
HABおよびLABにおける基本試験より得られた行動データを、ラット系統をグループ間要因として一元配置分散分析(ANOVA;STATISTICA, StatSoft, Tulsa, USA)によって分析した。薬理学的実験のビヒクルグループも同様に一元配置ANOVAによって分析し、mHBにおいて起こり得る行動の系統差の再現性を制御した。次いで、薬理学的実験より得られた行動データを、遺伝子系統と処置を主要因として二元配置ANOVAで分析した。分析を行った後、しかるべき場合には事後LSD検定を行った。p<0.05を有意差ありとした。データは平均±SEMで表す。
【0024】
結果
HABおよびLABの基本行動を比較したところ、不安を表すと考えられるパラメータにおいて2つのラット系統間で有意差が認められた(ボード上における滞留時間:F(1,24)=49.7、p<0.001;ボード潜時:F(1,24)=6.7、p<0.02;ボード侵入頻度:F(1,24)=36.5、p<0.001)。さらに、HABをLABと比較すると、伸び注意の回数が多く(F(1,24)=84.0、p<0.001)、かつ、運動(F(1,24)=11.3、p<0.003)および未保護領域(即ち、ボード)の探索(ボード上起立頻度:F(1,24)=11.6、p<0.003;探索孔数:F(1,24)=14.2、p<0.001;孔潜時:F(1,24)=6.6、p<0.02)については積極性が低かったが、保護領域(即ち、ボックス)の探索と社会的親和性については差は認められなかった。同様に、いずれの薬理学的実験においても、ビヒクルで処置したHABおよびLAB間で未処置試験群と同等の行動差が認められた。
【0025】
mHBにおけるジアゼパム処置動物の行動パラメータに対する二元配置ANOVA(系統×処置)からは、HABとLABが、リスクアセスメント行動(伸び注意頻度:F(1,14)=8.25、p<0.02)および不安関連行動(ボード潜時:F(1,14)=5.89、p<0.03;ボード侵入頻度:F(1,14)=4.64、p<0.05)において有意に異なることが判明した。HABでは、ジアゼパムの急性処置によってリスクアセスメント行動が有意に減少し(p<0.01)、ビヒクル処置ラットで見られた系統差が消失した。さらに、ジアゼパムの急性処置によって、HABの「ボード潜時」(p<0.02)および両ラット系統の「ボード侵入頻度」に影響が及ぶため、不安関連行動におけるグループ差が消失した。
【0026】
mHBにおけるパロキセチン処置動物の行動パラメータに対する二元配置ANOVA(系統×処置)からは、「孔潜時」(F(1,36)=4.5、p<0.05)においてのみ2つの要因間に有意な相互作用が認められた。HABにてこのパラメータが上昇したため(p<0.01)、ビヒクル処置系統には見られなかった有意差が処置ラット系統間で生じた。他の点については、パロキセチン処置ではLABの行動に影響を与えることはなかった。
【0027】
上述の実験では、不安亢進および不安後退についてそれぞれ飼育した未処置ラットのmHB行動から、不安関連行動において明らかな差が認められたが、この所見は、無条件不安に関する別の試験によって得られた以前の結果と一致する(Henniger et al., 2000; Liebsch et al., 1998a,b)。さらに、HABをLABと比較したところ、保護領域の探索(即ち、ボックス内起立頻度)または社会的親和性においては差は認められなかった。同様の行動上の特徴が、薬理学的試験におけるビヒクル処置動物にも見られた。これらの結果からは、mHBによって齧歯類動物の行動上の特徴を示差的に検討することが可能であり、従って、精神病理学的動物モデルの表面的妥当性を評価し得ることが明らかである。
【0028】
興味深いことに、抗不安薬であるジアゼパムによる急性処置により、未処置およびビヒクル処置のHABおよびLABの双方において観察された系統差がほぼ完全に消失した。HABでは「ボード潜時」と「ボード侵入頻度」がジアゼパムによって変化したことから、極度の不安状態のラットにおける抗不安作用が明らかとなった。このような観察は、ラットにおけるジアゼパムの作用に関する以前の研究結果と合致している(Fernandez et al., 1996; Liebsch et al., 1998b)。HABでは、リスクアセスメント行動(即ち、伸び注意頻度)の減少が付随して起こる一方で運動に対しては何ら作用は認められなかったことからジアゼパムの抗不安作用が際立ったにもかからわず、不安関連行動のパラメータの1つ(ボード上での滞留時間の比率)では有意な処置作用は認めらなかったため、HABとLABの選別基準(Liebsch et al., 1998a,b)に当たる未保護領域に対する回避行動が、これらのラット系統で非常に安定であることが示唆される。
【0029】
LABでは、一見したところ、ジアゼパムによる急性処置によって抗不安作用が生み出されたように思われる。即ち、HABで観察された作用とは逆に、LABでは「ボード潜時」がかなり増加し、「ボード侵入頻度」が減少した。しかしながら、運動が減少し、かつ、リスクアセスメント行動に変化がなくなる付随的な傾向は、非不安状態の動物においてはジアゼパムの抗不安作用よりも鎮静作用を示している。以上のことを考え合わせると、これらの結果からは、不安亢進個体におけるジアゼパムの抗不安作用だけでなく、不安低下個体におけるかなりの鎮静作用に対する証拠が得られ、従って、mHBによって精神病理学的動物モデルの予測的妥当性を評価し得ることが示唆される。
【0030】
選択的なセロトニン再取り込み阻害剤であるパロキセチンによる慢性処置では、未保護領域の不安を表すパラメータに対しては何ら作用は認められなかったものの、リスクアセスメント行動における基本的な系統差がパロキセチンによる慢性処置の後で消失したことから、HABにおいては軽度の抗不安作用が明らかである。このことは、リスクアセスメント行動が慣用の不安指標よりも、パロキセチン等の非定型抗不安薬の作用の影響を受けやすいとする仮説と一致している(Griebel et al., 1997)。しかしながら、抗鬱薬(Beaufour et al., 1999)およびセロトニン再取り込み阻害剤であるフルオキセチン(Silva & Brandao, 2000)で慢性処置した後、高架式十字迷路においてラットの行動を検討した最近の研究では、古典的な不安指標およびリスクアセスメント行動のいずれにも変化は認められなかった。処置によって引き起こされるリスクアセスメント行動の変化をmHBで観察すれば、ストレスにより低下した本試験の特徴が、無条件反射の他の試験よりも微細な処置作用を見出すことができる。
【0031】
パロキセチンの慢性処置は、HABにおける「孔潜時」を顕著に増加させた。このことから、まず、パロキセチンによって、不安亢進動物における未保護領域の探索欲求がわずかに減少したことが示唆される。しかしながら、探索された孔の数はパロキセチン処置による影響を受けなかったため、未保護領域全般に対する探索欲求が変化したというよりも、探索の仕方が変わったという説明の方が妥当である。興味深いことに、LABでは処置による行動変化は観察されなかったため、パロキセチンの慢性処置は非不安状態の個体には無効であることが示唆される。
【0032】
上述の実験は、mHBが、行動プロファイルの正確かつ微細な識別を可能にする単純な試験パラダイムをもたらすことを明らかに示している。
mHBはホールボードとオープンフィールドの組合せである。mHBでは、試験すべき動物同士の社会的接触を維持し得るため、行動をマスキングしてしまう影響を憂慮してグループメンバーへの社会的接触を常に遮断していた従前の試験パラダイムとは対照的に、動物の社会的隔離が回避される。さらに、社会的接触の必要性を評価することもできる。従って、このような新規の試験パラダイムは、不安関連行動、リスクアセスメント行動、探索、運動活動および社会的親和性を含む広範囲の行動を検討することが可能である。
【0033】
上記からも明らかなように、mHB試験を用いることで、齧歯類動物の基本行動を示差的に分析し、異なる薬理学的処置によって引き起こされる行動作用をストレス低下性条件下にて評価することができる。不安、探索、および運動活動といった行動は、本行動試験で得られる行動パラメータを徹底してモニターおよび分析することにより、分離・検討することができる。従ってmHBは、別々の試験を一通り行わなければならない先行技術に比べ、有意に改善されている。行動プロファイルの微細な識別さえも単一の単純な試験によって判定し得るという所見は、予想外かつ従来の知見に反するものである。
【0034】
従ってmHBは、ハイスループットスクリーニングのための単純かつ便利なスクリーニング器具を提供するものである。
最終的にmHB試験は、社会的隔離を回避することからストレスにより低下したその特徴のため、研究者が不安関連行動の弱い変化または探索欲求の変化といった微細な行動変化を評価することが可能である。
【0035】
従ってmHBは、前臨床研究において潜在的な治療剤をハイスループットスクリーニングするのに有効な器具であり、また、特定の実験動物系統において遺伝的に引き起こされる行動作用を評価するのにも有効な器具である。mHBは単純であって費用効率もよく、さらに、実験動物の必要数を大幅に減らすことができ、併せて社会的隔離によるストレスが初めて回避された。また、従来のパラダイムとは反対に、単一の実験設定にて各々の行動パラメータを明確に識別することも可能である。例えばオープンフィールドのパラダイムでは、運動活動を探索から明確に分離することはできない。さらに、本発明のmHBを用いる試験設備および実験手法は運動試験または馴化試験に用いることもでき、また、例えばホールコンパートメントに飼料を入れて小型実験動物の視覚および嗅覚識別を評価するなどして記憶および学習を試験することもできる。
【0036】
本発明の改良型ホールボードは、Ohl et al., Biological Psychiatry, 2001(投稿中、引用により本明細書に含まれるものとする)に記載されているように、齧歯類動物の認識行為に及ぼす先天的不安の影響の検討に応用することもできる。
【0037】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明の好適な設備を体系的に示す。
Claims (21)
- 実験動物の行動を評価するための設備であって、
(a)複数の前記実験動物を収容するための第1コンパートメント、
(b)前記複数の実験動物のうちの1匹の行動を試験するための第2コンパートメント、および
(c)前記第2コンパートメント内に設置されたホールボード
を含み、ここで前記第2コンパートメントはオープンフィールドであって、前記第1コンパートメントに隣接して配置されており、前記第1および第2コンパートメントは互いに少なくとも流体的に連結されている、前記設備。 - 前記ホールボードがアレイ状に配置された複数の孔を有する、請求項1記載の設備。
- 前記ホールボードが前記ホールボードの孔を覆う少なくとも1つの可動式の蓋を有する、請求項1または2記載の設備。
- 前記ホールボードの各孔にそれぞれ可動式の蓋が備えられている、請求項3記載の設備。
- 前記ホールボードが前記第2コンパートメントの実質的に中央に配置されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の設備。
- 前記第2コンパートメントの前記オープンフィールドが、前記オープンフィールドを複数のフィールドへ分割する検出可能なマーキングを備えている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の設備。
- 前記検出可能なマーキングが、前記オープンフィールドを方形に分割する複数のラインである、請求項6記載の設備。
- 前記第1および第2コンパートメントが、流体交換のための少なくとも1つの孔を有する仕切によって互いに区切られている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の設備。
- 前記仕切が透明であり、好ましくは透明PVCである、請求項8記載の設備。
- 前記ホールボードおよび前記第2コンパートメントが不透明な、好ましくは灰色の、PVCからなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の設備。
- 前記第1コンパートメントの寸法が約50×50×50cmであり、前記第2コンパートメントの寸法が約100×50×50cmであり、前記ホールボードの寸法が約60×20×2cmである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の設備。
- 前記実験動物の行動を自動的に検出するための手段をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の設備。
- 前記検出手段が、前記オープンフィールドの連続画像を供給するビデオ手段を含んでなり、前記画像はビデオ信号として前記実験動物の行動を評価するための制御手段へ送られる、請求項12記載の設備。
- 前記制御手段が、前記実験動物の行動を評価および保存するためのソフトウエアを組込んだデジタルコンピュータである、請求項13記載の設備。
- 実験動物の精神薬理学的行動パラメータをスクリーニングするための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の設備の使用。
- 不安、注意行動、好奇心、運動活動、覚醒および社会的親和性からなる群より選択される少なくとも1種類の情動に割り当てられたパラメータを測定するための、請求項15記載の設備の使用。
- 繁殖によって引き起こされる情動性の程度の変化を評価するための、請求項15記載の使用。
- 学習および記憶(認識)機能を検討するための、請求項15記載の使用。
- 薬剤が行動に及ぼす薬理学的作用を示差的に検討するための、請求項15記載の使用。
- 実験動物がマウス、ラット、ツパイ(tree shrew)または小型霊長類動物である、請求項15〜19のいずれか一項に記載の使用。
- 実験動物の行動を評価するための請求項15〜20のいずれか一項に記載の使用であって、全てのグループメンバーを好ましくは10〜60分間グループ区域(第1コンパートメント)内で馴化させた後、順に実験ボックス(第2コンパートメント)へ好ましくは5〜10分間ずつ入れ、不安に割り当てられるパラメータ(%時間、ボード潜時、ボード侵入頻度、静止時間)、探索関連行動(即ち、好奇心)を表すパラメータ(探索孔数、ボード上起立頻度、ボックス内起立頻度、孔潜時)、リスクアセスメント行動(即ち、注意行動)を表すパラメータ(伸び注意(stretched attend)頻度)、移動運動を表すパラメータ(ライン横断頻度)、社会的親和性を表すパラメータ(グループ接触潜時、グループ接触時間)および生理学的覚醒を表すパラメータ(グルーミング潜時、排泄潜時、グルーミング時間、排泄回数)を測定する、前記使用。
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