JP2004512819A - Stable Zymomonas mobilis xylose and arabinose fermentation strains - Google Patents

Abstract

Briefly, the present invention relates to a transposon for stable insertion of a foreign gene into a bacterial genome, comprising at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, araBAD and tal / tkt, and At least one promoter for expressing the structural gene in bacteria, a pair of inverted insertion sequences, the operon contained inside the insertion sequence, and a transposon containing a transposase gene provided outside the insertion sequence. Including. A plasmid shuttle vector for transforming a foreign gene into a bacterial genome, comprising at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, araBAD, and tal / tkt; Also provided is a plasmid shuttle vector containing at least one promoter for expression and at least two DNA fragments homologous to the gene of the bacterial genome to be transformed. In accordance with the present invention, transposons and shuttle vectors are useful in constructing a wide variety of Zymomonas mobilis strains, which are stable with respect to expression in non-selective media, and thus provide for the production of cellulose-derived pentose sugars using conventional fermentation techniques. Useful for conversion to fuels and drugs.

Description

【００２９】
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、ベーリンガー　マンハイム　ハイブリダイゼーション　キットに記載された既定のプロトコルにしたがって実施した。
【００３０】
実施例１
以下の実施例は、キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含有するＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃの構築、ならびに、その構築物のＺ．モビリス２０６およびＡＴＣＣ３９６７６への接合転移（ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を示す。キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含有するＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃは、プラスミドｐＧＰ７０４に含有されるＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃの唯一のＮｏｔＩ部位にＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢオペロンを挿入することにより構築された。図１を参照のこと。Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢオペロンは、米国特許第５，７１２，１３３号明細書および同第５，７２６，０５３号明細書のプラスミドｐＺＢ４またはｐＺＢ５から得られた。得られたプラスミドは、Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＴｃｘｙｌＡ／ｘｙｌＢ（Ｘ４）およびＭｉｎｉ−Ｔｎ５ＴｃｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ５）と命名され、エレクトロポレーションによって供与株大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒを形質転換し、そしてＺ．モビリスＡＴＣＣ３９６７６および２０６Ｃ株のいずれかと交配した。Ｚ．モビリス２０６Ｃは、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４３，７６０号明細書に開示されている。９つのチモモナスＴｃ^ｒトランス接合体は、Ｔｃおよびナリジキシン酸を含有する培地上での選択によって、Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＴｃｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ４）およびＭｉｎｉ−Ｔｎ５ＴｃｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ５）を含有するＳＭ１０λｐｉｒ供与株双方から得られた。図２（ｂ）を参照のこと。
【００３１】
ついで、９つのＺ．モビリスＴｃ^ｒトランス接合体由来のゲノムプラスミドＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）で、サザンブロット分析を行った。トランス接合体由来のゲノムプラスミドＤＮＡは、ハイブリッドトランスポゾンおよびキシロースオペロンに切り分けるＳｐｈＩで消化され、ついでそのブロットは、Ｔｃプローブ、ＸｙｌＢプローブまたはトランスポザーゼＴｎｐプローブのいずれかにハイブリダイズされた。（１）キシロースオペロンＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢはＴｃ^ｒ遺伝子とともにチモモナスゲノムに挿入されたこと；（２）各接合体に１つの挿入のみが生じたこと；（３）挿入はゲノム内の異なる位置であったこと；（４）Ｔｃ^ｒ遺伝子およびＸｙｌＢはプラスミド画分に存在しないこと；および（５）ｔｎｐトランスポザーゼ遺伝子はトランス接合体に存在しないことが、オートラジオグラフから明らかにされた。
【００３２】
チモモナスＴｃ^ｒＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）の発現を確認するために、チモモナスＴｃ^ｒＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体の酵素分析を行った。この分析により、すべてのトランス接合体に関するキシロースイソメラーゼの酵素レベルは、それらのプラスミド対応物（ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）の約半分の酵素レベルであることが明らかになった。同様に、プラスミド運搬株のキシルロキナーゼ活性の約半分が、組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）において観察された。ＸＩおよびＸＫ活性の双方は、チモモナスゲノム上の遺伝子の単コピーから発現され、プラスミド運搬株にみられる１細胞当たり１０コピーのものと比較して、予想されるよりもはるかに高いものであった。
【００３３】
実施例２（Ｃ２５）
本実施例は、組換え体Ｚ．モビリスの遺伝子安定性を高めるために、抗生物質選択の非存在下で、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードするキシロース同化遺伝子ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ、ならびにトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードするペントースリン酸経路遺伝子ｔａｌＢおよびｔｋｔＡは、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５を用いてＺ．モビリスゲノムに導入された。Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢおよびＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡを含有する２つのオペロンは、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５に組み入れられ、得られたプラスミドはＺ．モビリスに接合された。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５カセットの外側に設けられたトランスポザーゼの助力で、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡの単コピーは、サザンハイブリダイゼーションによって示されるように、Ｚ．モビリスゲノムに挿入された。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素分析により、それらすべての遺伝子が調和して発現されたこと、および組込みを行った株はプラスミド運搬株の酵素活性の約３０〜７０％を生産したことが示された。それらの酵素レベルは、微生物が増殖し、そしてキシロースを醗酵してエタノールにするために充分であった。
【００３４】
クローニング過程を容易にするために、オペロンＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡ含有ＢｇｌＩＩ断片を、図３に示す新たに構築した補助プラスミドｐＵＳＣｆｉＭＣＳのＢａｍＨＩ部位に挿入した。補助プラスミドｐＵＳＣｆｉＭＣＳは、ｐＵＣ１９由来のマルチクローニングサイトを含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣＳｆｉに挿入することにより構築された。ついで、ｐＵＣｔａｌｔｋｔを、図に示すように、ｐＵＣｐｆｉＭＣＳおよびｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉから構築した。
【００３５】
ここで図２を引用すると、ついでＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡをｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉからＳｆｉＩ断片として切りだし、ｍｉｎｉ−ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢにクローン化するために用いた。図に示すように、Ｔｃ^ｒ遺伝子は、Ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢカセットのＳｆｉＩ部位に側面を接する。Ｍｉｎｉ−ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢをＳｆｉＩで部分的におよび完全に消化し、図２（ｃ）に示すように、Ｐｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡＳｆｉ断片にライゲーションした。その部分的な消化によりＴｃ^ｒ遺伝子含有プラスミドを産出し、ｍｉｎｉ−ｔｎ５−Ｔｃｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢと命名し（（図２））、一方、完全な消化により、Ｔｃ^ｒ遺伝子を含有しない本明細書における発明のプラスミドを産出し、ｍｉｎｉＴｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢと命名した。図２（ｄ）参照のこと。
【００３６】
双方のプラスミドで供与株大腸菌Ｓ１７−１を形質転換し、そしてＺ．モビリス２０６Ｃと交配させた。得られたトランス接合体は、グルコース、Ｔｃおよびナリジキシン酸を含有する交配培地で、ｍｉｎｉＴｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃに関して選択した。ｍｉｎｉ−ｔｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢに関しては、トランス接合体は、キシロースおよびナリジキシン酸を含有する交配培地で直接、選択された。ｍｉｎｉ−ｔｎ５ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃに関し、多数のＴｃ^ｒトランス接合体（グルコース増殖）が得られた。いくつかのキシロース増殖トランス接合体が、ｍｉｎｉ−ｔｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢに関して得られた。
【００３７】
予備的なバッチ培養物を、３０℃でｐＨ調整をせずに２％キシロース含有ＲＭ８０ｍｌのボトル中で、醗酵ダイナミクスに関して静置的に試験した。コロニーは、ＲＭ＋２％キシロースプレートから得られ、定常増殖期（光学密度_６００＝０．１、５００ｎｍ）に達するまで、ＲＭ２％キシロース培地において一晩２０℃で培養され、そして播種材料として使用した。キシロースおよびエタノールは、ＨＰ１０４７Ａ屈折率検出器およびバイオラッドＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラムを備えるヒューレット−パッカード１０９０Ｌ　ＨＰＬＣを用い、６５℃、０．６ｍｌ／ｍｉｎの０．０１Ｎ硫酸移動相流速で作動させることにより、分析された。エタノール収率は、醗酵された糖の重量または培地中の利用可能な糖全体のいずれかを用いて計算された。最大の理論的収量は、０．５１ｇエタノール／ｇキシロースに基づいた。
【００３８】
ｍｉｎｉ−ｔｎ５ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢカセットの転位が生じたかどうかを検討するために、Ｚ．モビリストランス接合体由来のゲノムプラスミドＤＮＡ試料のサザンブロット分析を行った。ｍｉｎｉ−ｔｎ５ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢの４つのトランス接合体から製造したゲノムプラスミドＤＮＡは、カセット内で２回切断するＳｐｈＩにより消化されることにより、Ｔａｌプローブ相同性を有する１つの断片を生じた。ブロットは、ついで、ＴａｌプローブまたはＴｎｐプローブのいずれかにハイブリダイズされた。図４のオートラジオグラフは、Ｔａｌプローブでハイブリダイズした場合に、Ｚ．モビリスＤＮＡに隣接する、４ｋｂ（Ｐｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡのサイズ）より大きなただ１つのバンドが、すべてのゲノムＤＮＡ標本から検出されたことを示す。また、試料のうち３つ（番号２２、２３および２４、おそらく姉妹株）はプラスミド画分においてバンドを示し、本来備わっているプラスミドに組込みが生じたことを示唆した。試料番号２１に関しては、明らかに、組込みはＺ．モビリスゲノムに生じており、単コピーのみが挿入されていた。それらトランス接合体由来のゲノムプラスミドＤＮＡ試料の、Ｔｎｐプローブを用いるハイブリダイゼーション（図５）により、試料ＤＮＡとＴｎｐプローブとのあいだには相同性がないことが明らかになった。その結果により、キシロース同化遺伝子およびペントースリン酸経路遺伝子がＴｃ^ｒ遺伝子とともにＺ．モビリスゲノムに転位されたこと、ならびに、ただ１つの挿入が各トランス接合体に生じ、かつその挿入はゲノム上の異なる位置にあることが示唆された。
【００３９】
Ｚ．モビリストランス接合体に関して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性は、以前に記載されたように（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５）測定した。前に説明したように、ゲノム上のＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ単コピーの発現は、プラスミド運搬株に関して生じるＸＩおよびＸＫ酵素の約半分の発現であった。しかしながら、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）が、チモモナスｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃおよびｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体において発現したかどうかを確認するために酵素分析を行うと、図６に示されるように、すべてのトランス接合体（番号４、５、１７、１８、２１、２３および２４）に関するＴＡＬの酵素レベルは、プラスミド対応物の約５０〜７０％酵素レベルであった。プラスミド運搬株のＴＫＴ活性の約３０〜７０％が、組込み体において観察された。プラスミド組込み体はＴＡＬおよびＴＫＴ活性がわずかに上昇したが、チモモナスゲノム内の遺伝子の単コピーから発現したＴＡＬおよびＴＫＴ双方の活性は、プラスミド運搬株でみられる１細胞あたり１０コピーの活性と比較して、予想される以上にかなり高いものであった。
【００４０】
ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢチモモナス組込み体（番号２１、２２、５および１１）の４つすべては、キシロースで増殖することができた。ついで、３０℃で２％キシロース基質を用いることにより、それらの組込み体に関する予備的な醗酵研究を行なった。それらの組込み体に関する醗酵プロフィールは、図７に示される。図において、Ｚ．モビリス組込み体番号２１の増殖および糖利用率は、プラスミド運搬株３９６７６／ｐＺＢ４よりも遅いものであった。しかしながら、Ｚ．モビリス組込み体の大半（番号２２、５および１１）は、プラスミド運搬株と同様であった。すべての組込み体は、９２％の最大理論産生率で、キシロースからエタノールを産生した。
【００４１】
ゲノムに組込まれたそれらの株および３つのプラスミド運搬株の安定性は、非選択培地において測定された。すべての株をＲＭＧ培地で培養し、そして順次、毎日約１０世代毎に移し換えた。キシロースを醗酵してエタノールにする能力を測定するために、細胞は、４０世代ごとに、１％グルコースおよび５％キシロースを含有するＲＭ培地のフラスコに播種するために用いられた。エタノール生産率およびキシロース利用率は、安定性に関するマイルストーンとして用いられた。ゲノムに組込まれた２つの株は、９０（Ｃ２５およびＤ９５）世代よりも長いあいだ安定を示し、一方プラスミド運搬株（２０６／ｐＺＢ４、２０６／ｐＺＢ４ＬおよびＢＣ１ｐＺＢ４Ｌ）は、約４０世代のあいだ安定であった。図８を参照のこと。
【００４２】
Ｃ２５およびＤ９５株の醗酵能は、ｐＨ調整された条件のもとで、様々な濃度の全グルコースおよびキシロース（１％グルコースおよび５％キシロース；３％グルコースおよび３％キシロース；ならびに４．５％グルコースおよび４．５％キシロース）を含有するＲＭ培地において分析された。図に示したように、Ｃ２５株は、ｐＨ５およびｐＨ５．５の双方で、４．５％グルコースおよび４．５％キシロースを含有するＲＭにおいて、Ｄ９５よりも優れたキシロース利用率およびエタノール生産率を示した。その結果、続く実施例において、３つのアラビノース同化遺伝子（ａｒａＢＡＤ）をＣ２５ゲノムに組み込んだ。
【００４３】
実施例３（ＡＸ）
以下の実施例は、ｍｉｎｉ−トランスポゾンＴｎ１０を用いることによる、ｌｄｈを介する相同組み換えおよび転位によるアラビノース同化酵素のＣ２５ゲノムへの導入を説明する。下記プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、エレクトロポレーションによってＺ．モビリスまたは大腸菌を形質転換するために使用された。形質転換体は、グルコースおよびテトラサイクリンで補完した交配プレートで選択された。Ｔｃ^ｒコロニーは、キシロースまたはアラビノースで補完したＲＭ（ＲＭＳおよびＲＭＡ）における増殖によって、Ａｒａ^＋Ｘｙｌ^＋であることをさらに確認された。同じく下記プラスミドＴｎ１０Ｇは、フィルター交配技術（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７）を用いる接合により、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ供与株からＺ．モビリスＣ２５に移された。得られたトランス接合体は、アラビノース含有交配プレートにおいて選択された。
【００４４】
Ａ．　ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａの構築および相同組換えを用いるＣ２５における組込み
相同領域として１ｋｂのｌｄｈ断片を用いることによってチモモナスゲノムにａｒａＢＡＤを組み込むという以前の試みは、成功しなかった。組換え頻度を上げるために、より広い相同領域が用いられた。ｌｄｈおよびフランキング領域を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片は、ＰｆｕＰＣＲおよび鋳型として米国特許第５，７２６，０５３号明細書のＺ．モビリスＡＴＣＣ３９６７６由来のＤＮＡを用いて増幅された。プライマーは、Ｙａｍａｎｏ Ｉ．，（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１７５， ３９２６−３９３３に公表された、Ｚ．モビリスＣＰ４のＤＮＡ配列に基づき設計された。公表された配列により、ＰＣＲから２．５ｋｂの断片が予想されたが、そうではなく３．４ｋｂの断片が得られた。３．４ｋｂの断片をＢａｍＨＩで消化したのち、２つの断片（２．５および０．９ｋｂ）が得られた。双方の断片は、ｌｄｈのみにアニーリングするように設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより試験された。２．５ｋｂの断片は正しいサイズのＰＣＲ産物を産出したのに対して、０．９ｋｂの断片は産出せず、前者がｌｄｈ配列を含有することを示した。したがって、２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ｌｄｈＬと命名）はクローン化され、そしてＣ２５への遺伝子組込みのための相同領域として使用された。
【００４５】
ｌｄｈＬ断片ならびにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したｌｄｈ、ａｒａおよびｔｎｐプローブを、Ｐｆｕ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製、ラ　ジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ）またはＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）製、バレンシア、ＣＡ）のいずれかを用いるＰＣＲにより増幅した。ＤＩＧ−ＵＴＰは、ベーリンガー　マンハイム、インディアナポリス、ＩＮより購入した。ＡＩプローブは、Ｔｎ１０のトランスポザーゼ遺伝子であるＩＳ１０_Ｒを調べるために使用された。ｌｄｈＬ、ｌｄｈ、ａｒａおよびｔｎｐに対するＰＣＲ産物はそれぞれ、２．５、１、１．４および０．８ｋｂである。以下のプライマー配列が用いられた。

【００４６】
クローニングの目的で、ｌｄｈ遺伝子の中央に位置するＮｃｏＩ部位にオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣ−３’を挿入することにより、ＮｏｔＩ部位をｌｄｈＬに導入した。その新たなＮｏｔＩ部位は、ｌｄｈＬの各末端から約１．４および１．１ｋｂであった。ＮｏｔＩ部位を含有するｌｄｈＬのＢａｍＨＩ断片（２．５ｋｂ）を、ＢｃｌＩ部位でｐＺＢ１８６２にライゲーションした。最終的に、４．４ｋｂのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤは、ｐＺＢ２０６（米国特許第５，７１２，１３３号明細書および同第５，７２６，０５３号明細書）から単離され、組込みプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａを形成するために、ｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位にクローン化された。図１０を参照のこと。
【００４７】
３つのアラビノース同化遺伝子を含有するＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンは、相同組換えにより、Ｃ２５ゲノムのｌｄｈ部位に組み込まれた。Ｃ２５のゲノムにａｒａＢＡＤ遺伝子を組み込むために、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは大腸菌ＤＨ５αにおいて構築された。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａはエレクトロポレーションによりＣ２５に転移された。Ｔｃ耐性形質転換体は、アラビノースにおける増殖に関して選択および試験された。形質転換体の増殖のあいだ、Ｐｇａｐ−ａｒａ−ＢＡＤは、相同組換えによるｌｄｈＬのｌｄｈＬ’−ａｒａＢＡＤ−ｌｄｈＬ′カセット（プラスミド由来）との置換によって、Ｃ２５のゲノムに組み込まれることができた。
【００４８】
組換え体を質的に高めて単離するために、形質転換体にプラスミドキュアリングを実施した。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、Ｚ．モビリスにおいて複製するであろう。しかしながら、Ｚ．モビリスは、最適以下の増殖条件（たとえば３７℃）で外来プラスミドを失う傾向がある。その特性を用いて、いくつかの転移体（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）に関し、Ｔｃ非存在下で３７℃でＣ２５形質転換体をサブカルチャーすることによって、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａのキュアリングを成し遂げた。各転移体由来の培養物は、プラスミドの脱落について定期的に監視された。第３の転移体までに１００％の細胞がＴｃ^ｓになり、プラスミドの脱落が示された。潜在的なＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込み体の増殖を質的に高めるために、第３、第４、第５および第６の転移体由来の培養物を３０℃でアラビノース含有ＲＭ（ＲＭＡ）に播種した。質的に高められた細胞は、ＲＭＧプレートに移されて、ＲＭＡ、ＲＭＸおよびＲＭＧＴｃプレート上にレプリカをとられた。以下に記載するように、Ｘｙｌ^＋Ａｒａ^＋Ｔｃ^ｓの表現型を有するいくつかの組込み体（ＡＸ）をさらに分析した。それらの組込み体は、唯一の炭素源として、キシロースまたはアラビノースのいずれかを使用することができた。
【００４９】
Ｂ．　Ｔｎ１０Ｇの構築およびＣ２５への接合
Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５は、Ｐｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔおよびＰｇａｐ−ｘｙｌＡＢオペロンを有するＣ２５を構築するために使用された。トランスポザーゼ遺伝子はＣ２５に存在しなかったが、ｍｉｎｉ−Ｔｎ１０は、同じトランスポゾン間で生じ得る不一致を避けるため、続くＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みのために使用された。プラスミドＴｎ１０Ｇ（図１１）は、Ｔｎ１０ベースの送達プラスミドｐＬＯＦＫｍに基づき構築された。Ｋｍ^ｒ遺伝子は、ｐＺＢ２０６から単離された、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤのＮｏｔＩ断片に置換された。Ｔｎ１０Ｇは、大腸菌Ｃ１１８中で構築されて維持された。ついで、プラスミドは、Ｚ．モビリスとの接合のために、交配供与株大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒに転移された。Ｔｎ１０Ｇは、Ｚ．モビリスにおいては自殺プラスミドであるため、ａｒａＢＡＤ組込みによるトランス接合体のみが、アラビノースで補完した交配プレート上で増殖することができる。そのプレートにおいて、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ供与株はナリジキシン酸の存在により阻害された。トランス接合体は、交配／ａｒａプレート上で７日で出現した。コロニーは、その表現型を確認するために、ＲＭＡおよびＲＭＸ上にレプリカをとられた。選択されたコロニーの８６％がＸｙｌ^＋Ａｒａ^＋であった。選択プレートから得た２０コロニーを、異なるプレートに交差転移した（キシロースプレートからアラビノースプレートに、またはその逆）。それらのコロニーの６０％が、Ｘｙｌ^＋Ａｒａ^＋のままであった。２０コロニーは、予備的なサザンハイブリダイゼーションにおいて分析された（データは示さない）。ｔｎｐプローブを用いることにより、約５０％の株が、ゲノム中にトランスポザーゼ遺伝子を含有した。８つの組換え体は、ついで、サザンハイブリダイゼーションによって詳細に分析された。
【００５０】
Ｃ２５のｌｄｈへのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みは、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａ組込み体ＤＮＡに関して、ＤＩＧ標識化ａｒａおよびｌｄｈプローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーションによって確認された。図１２（ａ）および（ｂ）を参照のこと。ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａ上にはただ１つのＰｓｔＩ部位が存在し、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤに位置する。したがって、ａｒａプローブを用いることにより、ＰｓｔＩ消化したプラスミド由来の１つのハイブリダイゼーションバンド（１２．９ｋｂ）が予想された。ゲノムに組み込まれたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤに関しては、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤにおけるＰｓｔＩ部位およびＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの外側に位置するゲノム上の付属のＰｓｔＩ部位により生じる２つのバンドが予想された。図１３（ａ）から、結果は明らかに、全ＤＮＡ標本由来の２つのバンドがａｒａプローブにハイブリダイズすることを示し、そしてＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みを証明した。組込み体のプラスミドＤＮＡ由来のハイブリダイゼーションバンドの欠如は、組込みが、本来備わっているプラスミド上ではなくゲノム上で生じたことを意味した。ｌｄｈがＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込みによって破壊されたことを示すために、同じＤＮＡを転移させ、ｌｄｈプローブにハイブリダイズした。予想したとおり、図１２（ｂ）に示すように、組込み体に関するハイブリダイゼーションのパターンは、Ｃ２５を除いて、両ブロットにおいて正確に同一であった。完全なｌｄｈを有し、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込みのために使用された宿主株Ｃ２５由来の全ＤＮＡは、ただ１つのバンドを示した。その結果により、ａｒａＢＡＤがＣ２５のｌｄｈに組み込まれたことが確認された。
【００５１】
図１３（ａ）および（ｂ）は、Ｔｎ１０転位により生じた８つのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤトランスポゾン組換え体に関して、ＤＩＧ標識化Ｔｎｐおよびａｒａプローブそれぞれを用いたサザンハイブリダイゼーション結果を示す。ＤＮＡはＰｓｔＩ制限酵素で消化した。ＰｓｔＩはＴｎ１０Ｇを２つの断片（７．７および５．９ｋｂ）に切断し、５．９ｋｂの断片のみがトランスポザーゼ遺伝子（ＩＳ１０_Ｒ）を保持する。双方の断片は、ａｒａプローブにハイブリダイズした。そのブロットによると、Ｇ８、Ｇ１１、Ｇ１５およびＧＨ１７のみが、ａｒａ陽性かつｔｎｐ陰性であった。様々なバンドのパターンは、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤがゲノム中の異なる位置に組み込まれたことを示す。トランスポザーゼ遺伝子が組込み体のゲノムに維持されることは予想されなかったが、８つのうち４つの株（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１４およびＧ１９）は、トランスポザーゼ遺伝子を含有した。さらに、Ｇ１４およびＧ１９は、プラスミド上にトランスポザーゼを含有した。ａｒａプローブに関しては、組込み体由来の２つのバンドが予想された。しかしながら、ただ１つのバンドが観察された。この不明確さを解決するために、組換え体に対し、ａｒａプライマーを用いてＰＣＲを実施し、８つすべての組換え体がゲノム中にＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤを含有することを確認した（データは示さない）。
【００５２】
重要でない改変をしたＺｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９５およびＤｅａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６にしたがい、Ｚ．モビリス組換え体およびコントロール株の無細胞抽出液を用いることにより、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシルロキナーゼ（ＸＫ）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ＡＩ）、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ＲＫ）、Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（Ｌ−Ｒｅｐｉ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）およびトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）を分析した。無細胞抽出液は、後期対数期（３０℃、ＯＤ_６００約１．２）に培養物を回収し、音波処理緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）で１回洗い、ついで音波処理することによって調製した。細胞屑を遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４５分間、４℃）により除去した。Ｌ−ＡＩ分析において、定期試料の容量は、半分（５０μｌ）、７０％Ｈ_２ＳＯ_４（１．５ｍｌ）および０．１２％カルバゾール（５０μｌ）に減少した。すべてのチューブは、７０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加前後、吸光度を読むまで、２５℃の水槽で維持した。試料は、反応のあいだ、０、５、１０および２０分時に調べられた。
【００５３】
相同組換えおよびトランスポゾン組込みで得られた組換え体は、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース上で増殖することができたが、組込まれた遺伝子の発現レベルは、酵素活性を測定することによって決定した。単離体Ｃ２５／ＡＸ１、Ｃ２５／ＡＸ１０１およびＣ２５／Ｇ８は、下記の安定性研究で決定されるように最も安定な組込み体であったので、酵素分析のために選択された。酵素分析の結果を図１４および図１５に要約する。すべての分析に関し（キシルロキナーゼとともに、およびキシルロキナーゼを除いて）、コントロール（Ｃ２５および／または２０６Ｃ）と比較して、組込み体は顕著な活性を示した。現時点では、組込み体に関するＸＫの低い活性は、実験上の過失、分析の性質または双方が原因であると思われる。たいていの分析において（Ｌ−リブロキナーゼおよびキシロースイソメラーゼを除く）、組込み体は、プラスミド運搬株（２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１）よりも低い活性を示した。これは、遺伝子のコピー数に関連すると思われる。
【００５４】
安定性研究のために、培養物は、ＲＭＧを含有する試験管に播種され、３０℃で一晩インキュベーションされ、そして毎日、ＲＭＧ管に移された。播種材料は、１０世代毎に移されるよう管理された。ｐＨ調整せずに３０℃で糖に対する醗酵能を試験するために、細胞は、４０世代毎に、糖の混合液を含有するフラスコに播種するために使用された。バッチ醗酵研究は、操作容量として５００ｍｌを用い、Ｂｉｏ−ＳｔａｔＱケモスタット（Ｂ，ブラウン社（Ｂ， Ｂｒａｕｎ）、アレンタウン、ＰＡの登録商標）において３０℃でｐＨ調整して実施した。ｐＨは、２Ｎ　ＫＯＨにより自動的に調整された。開始の糖濃度およびｐＨは、培養条件により、各バッチで様々であった。使用された糖すべてが試薬級であった。醗酵の間中、試料は定期的に採取され、糖、エタノールおよび副産物に関して、以前に記載されたように（Ｚｈａｎｇ １９９５）ＨＰＬＣで分析された。細胞増殖を監視するために、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度が測定された。エタノール収率は、利用可能な全糖の量に基づいた。
【００５５】
相同組換えおよび転位の双方により開発された、ゲノム組み込みを行ったキシロースおよびアラビノース醗酵Ｚ．モビリス株のいくつかは、非選択培地（ＲＭＧ）における安定性に関して検討された。それらの株をＲＭＧ培地で培養し、そして毎日、約１０世代ののち、順次移した。キシロースおよびアラビノースを醗酵してエタノールにする能力を試験するため、細胞は、４０世代毎に、１％グルコースおよび２％キシロースおよび２％アラビノースを含有するフラスコに播種するために使用された。エタノール生産率、ならびにキシロースおよびアラビノース利用率は、安定特性として使用した。２つの単離体は１６０世代のあいだ安定であった。図１６および図１７を参照のこと。３つの組込み株および１つのプラスミド運搬株は、ｐＨ５．５および３０℃で、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースの混合物を含有する培地において、醗酵能に関してさらに試験された。図１８に示すように、３つの株すべては、グルコース、キシロースおよびアラビノースを７２時間で利用したが、プラスミド運搬株では６ｇ／Ｌのアラビノースが残留した。しかしながら、組込み株はキシリトールをプラスミド運搬株（１ｇ／Ｌ）よりも多く（４ｇ／Ｌ）産生した。２つの相同組換え体ＡＸ１株およびＡＸ１０１株は、乳酸脱水素酵素遺伝子が遺伝子組込みにより不活性化されたので、乳酸を産生しなかった。組込み株の生産率（理論上約８３％）は、プラスミド運搬株と極めて類似した。さらには、組込み株は、より高い細胞密度まで増殖した。おそらく原因は、７つの遺伝子を単コピーのみ有することと関連する、より少ない代謝負担である。
【００５６】
例示の実施態様に関して本発明を説明したが、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識および理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
本明細書に組み込まれ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の少なくとも１つの実施の態様を示しており、詳細な説明とともに本発明の原則を説明する。
【図１】
図１は、本発明のキシロース同化オペロンを含有するｐＧＰ７０４におけるＭｉｎｉ−Ｔｎ５のプラスミドマップである。
【図２】
図２は、本発明のｍｉｎｉ−Ｔｎ５の一連の構築を説明する一連のプラスミドマップである。
【図３】
図３は、ｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉのプラスミドマップを生じる一連の構築の説明図である。
【図４】
図４は、Ｔａｌプローブを用いるｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ　Ｚ．モビリストランス接合体のサザン分析の結果である。Ｃは、コントロールプラスミドｍｉｎｉ−Ｔｎ５ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢである。λＨは、ＤＮＡサイズマーカーである。
【図５】
図５は、Ｔｎｐプローブを用いるｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ　Ｚ．モビリストランス接合体のサザン分析の結果である。Ｃは、コントロールプラスミドｍｉｎｉ−Ｔｎ５ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢである。λＨは、ＤＮＡサイズマーカーである。
【図６】
図６は、本発明の安定なキシロース醗酵Ｚ．モビリス株の数種の単離体に関する酵素活性のグラフである。
【図７】
図７は、図６の４つの単離体（番号２１、２２および５）に関する醗酵プロフィールならびにプラスミド運搬株３９６７３／ｐＺＢ４およびＢＣ１／ｐＺＢ４Ｌに関するそれらの性能のグラフを示す。
【図８】
図８は、本発明の安定なキシロース醗酵Ｚ．モビリス株Ｃ２５およびＤ９５の安定性を示すグラフ表示である。グラフは、エタノール生産率およびキシロース利用率パラメーターを指標として用いることにより、プラスミドを運搬し、かつゲノムに組み込んだキシロース醗酵株の安定性を示す。本発明のＣ２５株およびＤ９５株は、９０世代より長いあいだ安定であった。醗酵培地は、１％グルコースおよび５％キシロースを含有するＲＭからなり、温度は３０℃で一定であった。
【図９】
図９は、本発明にしたがい、ｐＨ５．０およびｐＨ５．５、３０℃で、４．５％グルコースおよび４．５％キシロース含有ＲＭ培地において、ゲノム組込みを行なったキシロース醗酵株Ｃ２５およびＤ９５のバッチ醗酵（ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に関するパーセントのキシロース利用率を比較した場合の、光学密度（ＯＤ_６００）でのバイオマス濃度、時間関数としてのキシロース利用率、時間関数としてのエタノール生産量および生産率を示す。
【図１０】
図１０は、組み込みプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａのマップである。ａｒａＢＡＤはｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位に挿入され、ｌｄｈを分離する。構築は、Ｚ．モビリスの複製プラスミドｐＺＢ１８６２をベースとする。
【図１１】
図１１は、Ｔｎ１０Ｇのプラスミドマップである。ＩＳ１０_Ｒはトランスポザーゼ遺伝子である。ＩＲは、トランスポゾンの逆方向反復配列である。ａｒａＢＡＤは、ＮｏｔＩ部位で２つの逆方向反復配列のあいだに挿入された。
【図１２】
図１２は、ＤＩＧ−ａｒａおよびＤＩＧ−ｌｄｈプローブを用いた、相同組換えで得られたゲノム組込みを行なったキシロース／アラビノース醗酵Ｚ．モビリス株のサザン分析を示す。ＡＸ１、１３、２３、１０１、１０４および１０７はａｒａＢＡＤ組込み体である。Ｃ２５は宿主コントロールである。ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、ＤＨ５αから単離されたプラスミドコントロールである。λ／Ｈは、２３、９．４、６．６、４．３、２．３および２．０ｋｂの分子量マーカーである。
【図１３】
図１３は、ＤＩＧ−ｔｎｐおよびＤＩＧ−ａｒａプローブを用いた、トランスポゾン組み込みで得られたゲノム組込みを行ったキシロース／アラビノース醗酵チモモナス株のサザン分析を示す。Ｇ５、６、１１、１５、１７、１４および１９はａｒａＢＡＤ組込み体である。Ｃ２５は宿主コントロールである。Ｔｎ１０Ｇは、プラスミドコントロールである。λＨは、２３、９．４、６．６、４．３、２．３および２．０ｋｂの分子量マーカーである。図１３（ａ）はｔｎｐのＰｓｔＩ消化であり、図１３（ｂ）はプローブがＰｓｔＩ消化である。
【図１４】
図１４は、ゲノム組み込み体株のトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの酵素活性の棒グラフを示す。２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１はプラスミドコントロールである。２０６Ｃは宿主コントロールである。Ｃ２５は、キシロース醗酵組込み体である。Ｇ８は、Ｔｎ１０転位で得られたキシロース／アラビノース醗酵組込み体である。ＡＸ１およびＡＸ１０１は、相同組換えで得られたキシロース／アラビノース醗酵組換え体である。
【図１５】
図１５は、ゲノム組込みを行なった株のＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼの酵素活性の棒グラフ結果を示す。２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１はプラスミドコントロールである。２０６Ｃは宿主コントロールである。Ｃ２５は、キシロース醗酵組込み体である。Ｇ８は、Ｔｎ１０転位で得られたキシロース／アラビノース醗酵組込み体である。ＡＸ１およびＡＸ１０１は、相同組換えで得られたキシロース／アラビノース醗酵組込み体である。
【図１６】
図１６は、Ｔ＝３０℃でｐＨ調整なしのＲＭＧＸＡ（１：２：２％）における、ゲノム組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のエタノール生産率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図１７】
図１７は、３０℃でｐＨ調整した、１％グルコース、２％キシロースおよび２％アラビノースを含有するＲＭにおける、ゲノム組込みを行ったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のキシロースおよびアラビノースの利用率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図１８】
図１８は、ｐＨ５．５および３０℃で、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースを含有するＲＭにおける、ゲノム組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株の醗酵能の折れ線グラフ表示である。[0001]
The United States Government has rights in this invention under Contract No. DE-AC36-99GO10337 between the United States Department of Energy and the Midwest Research Institute.
[0002]
[Field of the Invention]
The present invention relates to the bioconversion of cellulosic substrates into fuels and drugs, and in particular, to recombinant Zymomonas mobilis strains that ferment xylose and arabinose or both to ethanol.
[0003]
[Background of the present invention]
Fermentation techniques are useful for converting regenerated biomass cellulose substrates into fuels and drugs, such as ethanol. A typical substrate consists of 35-45% cellulose, 30-40% hemicellulose and 15% lignin. The hydrolyzed fraction contains glucose polymer and the hemicellulose fraction contains mainly xylose. Arabinose is also an important fermentation substrate found in biomass materials such as switchgrass grass and corn fiber. Thus, achieving high specific product formation and conversion efficiencies in the fermentation of pentose sugars is essential for the commercial production of fuels and drugs from regenerated substrates.
[0004]
Z. Mobilis is widely described for its ability to rapidly and efficiently convert glucose substrates to ethanol in low pH, anaerobic cultures and in media containing inhibitory compounds that normally bind to lignocellulose-hydrolysate. It has been reported. However, Z. A distinct disadvantage in the use of mobilis is that it does not ferment pentose sugars. In order to overcome this disadvantage, the prior art discloses a recombinant Z. fermentation for fermenting glucose, and xylose or arabinose, or a mixture of both, by using exogenous genes that catalyze the metabolism of xylose and arabinose. Mobilis strain is concentrated. These strains, and cloning vectors, are based on the use of multiple-copy plasmids with an antibiotic resistance marker.
[0005]
U.S. Pat. No. 5,514,583 discloses a transformed Z. mori having an exogenous gene. Mobilis xylose fermentation strains (CP4 / pZB4 and pZB5) and at least one that encodes xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase and transketolase and is recognized by Zymomonas to regulate the expression of at least one of said genes Disclosed are plasmid vectors (pZB4 and pZB5) that further include promoters (Pgap and Peno). The microorganism can grow on xylose as the sole carbon source and ferment xylose to ethanol with a maximum theoretical yield of about 88%. The patent claims the incorporated strain.
[0006]
U.S. Pat. Nos. 5,712,133 and 5,726,053 describe, inter alia, L-arabinose isomerase, L-ribulokinase and L-ribulokinase, which provide the ability to ferment arabinose to ethanol. Z. containing an exogenous gene encoding L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase, transaldolase and transketolase. A mobilis arabinose fermentation transformant (39676 / pZB206) is disclosed. Also disclosed are plasmid vectors (pZB206) and methods of using the transformants for fermentation of substrates containing glucose and arabinose. That patent claims the integration of the exogenous gene into the host genome.
[0007]
U.S. Patent No. 5,843,760 discloses xylose isomerase, xylulokinase, L-arabinose isomerase, L-librokinase, L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase, transaldolase and transketolase. Z. containing an exogenous gene that encodes, further comprising at least one promoter that regulates the expression of at least one of said genes and is recognized by Zymomonas. A mobilis xylose and arabinose fermentation transformant (206C / pZB301) is disclosed. The microorganism can grow using arabinose and / or xylose alone or in combination as a carbon source, and the arabinose and xylose can be fermented to ethanol. Methods of using the transformants with plasmid vectors (pZB301, pZB401, pZB402 and pZB403) are also disclosed. The patent claims the integration of those exogenous genes into the host genome.
[0008]
Hybrid plasmids are grown in mono-culture under controlled conditions in Z. Although easily maintained in M. mobilis, hybrid plasmids often become unstable when the host organism is grown in the absence of selection pressure for plasmid maintenance, ie, in the presence of antibiotics. For example, the exogenous gene of the previously cited strain is capable of stable expression for about 40 generations. In a mixed culture such as a cellulose simultaneous saccharification and fermentation process, it is preferable to use Z. Instability can be exacerbated if mobilis must compete with other organisms. Furthermore, antibiotic resistance markers are generally considered unsuitable for industrial use such as mass production of ethanol. Therefore, the cloned gene is It should preferably be inserted into the mobilis genome, be maintained at a low natural copy number, and therefore be not over-expressed and be at least theoretically as stable as genomic DNA.
[0009]
In Escherichia coli, a classical method of providing genomic insertion of foreign genes involves the use of specialized lambda phage cloning vectors which can be stably present in the lysogenic state. Alternatively, the gene can be inserted via homologous recombination when surrounded by the chromosomal sequence of E. coli or by transposition if the gene can be cloned into the permissive site of a transposon. The dislocation is Z. Mobilis (Pappas, KM, et al., (1997) Transposon mutagenesis and strain construction in Zymomonas mobilis, Journal of Applied Microbiology, Vol. 82, pp. 379-388. ), Which are limited to mini-Mμ or Tn5 multiple transpositions that result in a phenotype of random auxotrophy or antibiotic resistance in genetic analysis, and reportedly inserts in the case of Tn5 derivatives Is stable only for 5 to 15 generations. Pappas, K .; M. , Et seq. P. 383, FIG. One. Furthermore, Z. No site-specific insertion via homologous recombination in M. mobilis has been described, and no bacteriophage has been isolated from Zymomonas.
[0010]
Transposons Tn5 and Tn10 are known and are widely used for mutagenesis and insertion of cloned DNA into various Gram-negative bacteria. Herrero, M.S. et al. (1990) Transposon vectors containing a non-antibiotic resistance selectable marker for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in Gram-negative bacteria. Bacteriol. 172: 6557-6567 describe two sets of plasmids, (i) the transposition properties of Tn10 and Tn5, (ii) resistance to certain compounds and (iii) suicide delivery properties of the R6K-based plasmid pGP704. Techniques for cloning by combination and stable insertion of foreign genes into gram-negative eubacteria chromosomes have been disclosed. The resulting construct contains one NotI or SfiI site within either the Tn10 or Tn5 inverted repeat. These sites are used for cloning DNA fragments with the help of two further specialized cloning plasmids pUC18Not and pUC18Sfi. The newly derived construct is maintained only in donor host strains that produce the R6K-specific π protein, an essential replication protein for R6K and R6K-derived plasmids. The donor plasmid containing the hybrid transposon can be transferred to specialized λ pri lysogenized E. coli strains such as E. coli Sm10 (λpir) by RP4, which is integrated into the chromosome and provides broad host range conjugative transfer functions. Transformed. Delivery of the donor plasmid to the selected host bacterium is achieved by crossing with the target strain. Translocation of the hybrid transposon from the delivered suicide plasmid to the target replicon is achieved by a cognate transposase encoded by the plasmid at a site outside the transposon. Since transposase function is not maintained in target cells, such cells are not affected by further transposition processes. Thus, multiple insertions in the same strain are only limited by the availability of different selectable markers.
[0011]
Herrero, M.S. et al. 1990, Insertion Mutagenesis Promoter Probing and Mini-Tn5 transposon derivatives for genomic insertion of cloned DNA in Gram-negative eubacteria, Journal of Bacteriol. Vol 172, no. 11, p. 6568-6572 further disclose constructs consisting of collected Tn5-derived minitransposons, such as Tn5Tc, which allow the introduction of foreign DNA fragments into the chromosomes of various Gram-negative bacteria. The mini-transposon consists of a gene exhibiting kanamycin and tetracycline resistance as a selectable marker, and one NotI cloning site flanked on both sides by a 19 base pair terminal repeat of Tn5. The transposon is IS50 _R The transposase is located on an R6K-based suicide delivery plasmid that provides the tnp gene in cis outside of the mobility element, and its conjugative transfer to the recipient strain is mediated by the donor RP4 mobility property. Thus, insertions caused by those factors are generally more stable because there are no transposase-mediated second transpositions, deletions and inversions. D. E. FIG. Berg, Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington, DC, Berg et al. (1989) Transposable elements and bacterial genetic engineering, p. p. See also 879-926. Thus, very stable insertion is achieved, for example, also by factors derived from Tn10. Way, J.M. C. et al. , (1984) New Tn10 derivatives for transposon mutagenesis and construction of lacZ operon fusions by transposition, Gene 32: 369-379.
[0012]
The structure of mini-Tn5Tc (Herrero, et seq., p. 6569) can be used for insertional mutagenesis or for DNA fragments flanking the NotI site (first, the DNA fragments can be (Isolated by cloning) are disclosed as transposon vectors for cloning. Mini-Tn5Tc factor is constructed in vitro using conventional recombinant DNA technology. Maniatis, T .; , Et al. , (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.W. Y. . Determinants of tetracycline (Tc) resistance are obtained as EcoRI fragments from plasmids carrying them as interposons (Fellay, R., et al. (1987) interposon mutations in soil and water bacteria). Induction: DNA fragments designed for in vitro insertional mutagenesis of Gram-negative bacteria, Gene 52: 147-154). The fragment is then cloned into the unique EcoRI site of pUC18Sfi, excised as a SfiI fragment, and the mobile unit is present in all cases as the XbaI-EcoRI (partial) part of the delivery plasmid. Into the pUT between the 19 base pair ends of Tn5. The obtained factor is mini-Tn5Tc.
[0013]
Tn10-based transposon vector delivery systems are described in Herrero, M .; , Et seq. 172: 6557-6567. The phage λ, which is a derivative λRP167, carries a 5.1 kb EcoRI insert containing the mini-Tn10Km factor, and transposase gene IS10 _R Is located outside the inverted repeat of the mobility element and downstream of the pTac promoter. To obtain a transposon delivery plasmid that controls transposition in a host-independent manner, the EcoRI insert was lacI from plasmid pMJR1560. ^q Ligation to pBOR8, a pGP704 derivative containing The plasmid cannot replicate in the host strain due to the lack of the R6K-specific π protein product of the pir gene. pGP704 contains the conjugal transfer origin of the RP4 plasmid (oriT sequence) and therefore can be transferred to Gram-negative bacteria when provided in trans by its mobile (Mob) property. The MluI fragment, which is inside the inverted repeat sequence and contains the prototype specific π protein product of the mini-Tn10 prototype kanamycin resistance gene, is a SfiI-Ptt cassette appropriately modified by the addition of a NotI site and a MluI adapter. And is replaced by a fragment that produces pLODPtt. The construct has unique SfiI, NotI and XbaI cloning sites between the mini-Tn10 inverted repeats. PLOFPtt Ptt resistance marker (Ptt ^r ) Are exchanged for kanamycin resistance to produce plasmid pLOFKm.
[0014]
In view of the foregoing, the production of a stable recombinant Z. capable of fermenting xylose and arabinose or both to ethanol by the production of stable genomic inserts encoding enzymes required for xylose and arabinose catabolism. Mobilis strains need to be constructed. The strain should not be antibiotic resistant and should be stable in non-selective media for more than 40 generations. Also, it is desirable that the strain exhibit a high specific product formation rate, approaching the maximum theoretical product yield.
[0015]
[Disclosure of the present invention]
An object of the present invention is a transposable element and a plasmid vector useful for stable integration of a foreign structural gene, comprising an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, tal / tkt and araBAD; It is an object of the present invention to provide a transposable element encoding at least one control gene for introducing a structural gene into the mobilis genome and a plasmid vector.
[0016]
A further object of the present invention is to provide an extremely diverse Z. cerevisiae capable of stably expressing structural genes in a non-selective medium. Mobilis strains.
[0017]
Still another object of the present invention is to provide a highly variable expression of stable genes but characterized by a high rate of specific product formation and conversion efficiency when used as a biocatalyst in a cellulose hydrolysis reaction mixture. Z. Mobilis strains.
[0018]
In order to alleviate the problems associated with the related art, and in accordance with the purpose of the present invention, and as embodied and broadly described herein, the present invention is essentially a transposon for the stable insertion of foreign genes into a bacterial genome. Wherein at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, araBAD and tal / tkt, and at least one promoter for expressing said structural gene in bacteria, a pair of inverted A transposon containing an insertion sequence, the operon contained inside the insertion sequence, and a transposase gene provided outside the insertion sequence; a plasmid shuttle vector for transforming a foreign gene into a bacterial genome, comprising xylAxylB, araBAD And tal at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of tkt, at least one promoter for expressing the structural gene in bacteria, and having homology to a gene of the bacterial genome to be transformed It includes a plasmid shuttle vector containing at least two DNA fragments.
[0019]
Transposons and shuttle vectors are useful in constructing a wide variety of Zymomonas mobilis strains according to the present invention, and since they are stable in expression in non-selective media, cellulose-derived pentoses by using conventional fermentation techniques. Useful in converting sugars to fuels and drugs.
[0020]
Additional advantages of the invention will be set forth in part in the description which follows, and in part will be obvious from the description, or may be learned by practice of the invention. The advantages of the invention may be realized and attained by the methods particularly pointed out in the appended claims.
[0021]
[Detailed description of the invention]
Unless defined otherwise, all technical or scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described. All United States patents are incorporated by reference as if fully set forth herein.
[0022]
Reference will now be made in detail to the presently preferred embodiments of the invention, examples of which are illustrated in the accompanying drawings. With respect to the examples below, "plasmid-bearing strains" means or refers to those strains and vectors described in the United States patents set forth in the description of the related art. "Z. mobilis genome, or genomic", as a whole, refers to a defined Z. mobilis genome. Genes that specify all the expression characteristics and potentially expressible characteristics for mobilis. C25 means Zymomonas mobilis patent deposit designation PTA-1799, AX means Zymomonas mobilis patent deposit designation PTA-1797, G8 means Zymomonas mobilis patent deposit designation PTA-1796, mini-Tn5-tal / tkt- xylAxylB means E. coli DH5α (pZb1862-IdhL-ara) Patent Deposit Designation PTA-1798, and C25 means Zymomonas mobilis Patent Deposit Designation PTA-1799. All of the foregoing have been deposited with the American Type Culture Collection, University Boulevard 10801, Manassas, Virginia 20111209, and are subject to the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure May 1, 2000. Received and commissioned on the day.
[0023]
[Example]
Strains, plasmids and media
E. coli bacterial strains CC118λ (pir), CC118λ (pir) (mini-tn5Tc), SM10λ (pir) and pUT / Tc containing plasmids pUC19, pLOF / Km, pUC18sfi, minitransposons Tn5, Tn10 and pUC18Not are the Federal Republic of Germany. , Day-38124 Braunschweig, Mascherodelbek GEB-Geselshaft Fir Biotechnique Forsching Mitt Beschlenktel Haftsung, GBF-Gesellschaft Fur Biotechnolge schörgörgörgebörg der gebörgörge der gebge der Gaschörg. K. Obtained from Dr. K. Timmis. E. coli DH5α was used as a host for plasmid construction. Escherichia coli SM10λpir was used as a donor strain during the mating experiment. Z. Mobilis ATCC 39676 strain and its derivative 206C strain (US Pat. No. 5,843,760) were used as recipient strains according to the present invention. A Tn10-based plasmid was constructed and maintained in E. coli CC118.
[0024]
The E. coli strain was cultured in LB medium at 37 ° C. Z. Mobilis strains were RM (10 g / L yeast extract, 2 g / L KH) supplemented with 20 g / L glucose, D-xylose or L-arabinose unless otherwise specified. ₂ PO ₄ ) Were maintained anaerobically. All strains containing the plasmid were tetracycline (Tc) ((10 μg / ml in the liquid of Z. mobilis and E. coli; 20 μg / ml in agar for Z. mobilis; and 15 μg / ml in agar for E. coli, or Ampicillin (Ap) 100 μg / ml).
[0025]
Z. For regeneration and selection of mobilis transformants or transzygotes, mating plates ((10 g / L yeast extract, 5 g / L tryptone, 2.5 g / L (NH 4)) supplemented with tetracycline or nalidixic acid (20 μg / ml) ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.2 g / L K ₂ HPO ₄ And 50 g / L sugar)). All agar plates were made with 15 g / L agar.
[0026]
Recombinant DNA technology
Published protocol Sambrook et al. , (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.M. Y. Alternatively, plasmid DNA isolation, restriction endonuclease digestion, ligation and transformation, agarose electrophoresis, and other recombinant DNA techniques are performed, specified, and known in the art according to the product instructions for each reagent. . Z. Mobilis genomic DNA was extracted using 3 milliliters of overnight cultured cells resuspended in 250 ml of 50 mM Tris-50 mM EDTA buffer. Cells were treated with lysozyme for 30 minutes at 37 ° C., then 100 ml of a 5% SDS solution and ribonuclease (final concentration 20 ng / ml) were added and the mixture was incubated for a further 30 minutes. Phenol / chloroform extraction was performed twice to remove proteins. Genomic DNA was recovered by the ethanol precipitation method.
[0027]
Conjugation and transformation
Plasmids were ligated from donor strain E. coli SM10λpir or S17-1 to Z. Mobilis strain. By electroporation (Zhang et al., 1995), Z. et al. E. coli or E. coli cells were transformed.
[0028]
Southern blot analysis
DNA was transferred onto a nylon membrane using a Stratagene Posi Blot pressure blotter. DNA probes Tc, xylB, Tnp and Tal were digoxigenin-UTP labeled by polymerase chain reaction (PCR). The following primers were used for DNA labeling.

[0029]
Prehybridization and hybridization were performed according to the prescribed protocol described in the Boehringer Mannheim Hybridization Kit.
[0030]
Example 1
The following examples describe the construction of Mini-Tn5Tc containing a gene encoding xylose anabolic enzyme, and the Z. cerevisiae of the construct. 2 shows the conjugal transfer to Mobilis 206 and ATCC 39676. Mini-Tn5Tc containing the gene encoding xylose assimilation enzyme was constructed by inserting the Pgap-xylAxylB operon into the unique NotI site of Mini-Tn5Tc contained in plasmid pGP704. See FIG. The Pgap-xylAxylB operon was obtained from plasmids pZB4 or pZB5 of US Pat. Nos. 5,712,133 and 5,726,053. The resulting plasmids, named Mini-Tn5TcxylA / xylB (X4) and Mini-Tn5TcxylAxylB (X5), were transformed by electroporation into the donor strain E. coli SM10λpir and M. mobilis ATCC 39676 and 206C were crossed. Z. Mobilis 206C is disclosed in U.S. Patent No. 5,843,760, which is incorporated herein by reference. 9 Timomonas Tc ^r Transconjugates were obtained from both SM10λpir donor strains containing Mini-Tn5TcxylAxylB (X4) and Mini-Tn5TcxylAxylB (X5) by selection on media containing Tc and nalidixic acid. See FIG. 2 (b).
[0031]
Then, nine Z. Mobilis Tc ^r Southern blot analysis was performed on genomic and plasmid DNA from transzygotes. Genomic plasmid DNA from transzygotes was digested with SphI, which cuts into a hybrid transposon and a xylose operon, and the blot was hybridized to either a Tc probe, a XylB probe or a transposase Tnp probe. (1) The xylose operon Pgap-xylAxylB is Tc ^r (2) that only one insertion occurred in each zygote; (3) the insertion was at a different position in the genome; (4) Tc ^r Autoradiography revealed that the gene and XylB were absent from the plasmid fraction; and (5) the tnp transposase gene was absent from the transzygote.
[0032]
Zymomonas Tc ^r To confirm the expression of xylose isomerase (XI) and xylulokinase (XK) in the Pgap-xylAxylB transzygote, Zymomonas Tc ^r Enzyme analysis of the Pgap-xylAxylB transconjugate was performed. This analysis revealed that the enzyme levels of xylose isomerase for all transzygotes were about half that of their plasmid counterparts. Similarly, about half of the xylulokinase activity of the plasmid-carrying strain was observed in the integrant. Both XI and XK activities were expressed from a single copy of the gene on the Zymomonas genome and were much higher than expected compared to 10 copies per cell found in the plasmid-carrying strain.
[0033]
Example 2 (C25)
This example demonstrates that recombinant Z. To increase the gene stability of M. mobilis, in the absence of antibiotic selection, the xylose assimilation genes xylA and xylB encoding xylose isomerase and xylulokinase, and the pentose phosphate pathway gene talB encoding transaldolase and transketolase. And tktA were determined using mini-Tn5. Mobilis genome. The two operons containing Pgap-xylA / xylB and Peno-talB / tktA were incorporated into mini-Tn5 and the resulting plasmid was transformed into Z. Mobilis joined. With the help of a transposase located outside of the mini-Tn5 cassette, single copies of Pgap-xylAxylB and Peno-talB / tktA were transformed into Z. coli as indicated by Southern hybridization. Mobilis genome. Enzymatic analysis of xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase and transaldolase showed that all of the genes were expressed in harmony, and that the strain that performed the integration showed about 30-70% of the enzymatic activity of the plasmid-carrying strain. It was shown that it produced. Their enzyme levels were sufficient for the microorganism to grow and ferment xylose to ethanol.
[0034]
To facilitate the cloning process, a BglII fragment containing the operon Peno-talB / tktA was inserted into the BamHI site of the newly constructed auxiliary plasmid pUSCfiMCS shown in FIG. The auxiliary plasmid pUSCfiMCS was constructed by inserting the EcoRI-HindIII fragment containing the multiple cloning site from pUC19 into pUCSfi. Next, pUCtaltkt was constructed from pUCpfiMCS and pUCtaltktSfi as shown in the figure.
[0035]
Referring now to FIG. 2, Peno-talB / tktA was then excised from pUCtaltktSfi as a SfiI fragment and used to clone into mini-tn5-Tc-xylAxylB. As shown in the figure, Tc ^r The gene flanks the SfiI site of the Tn5-Tc-xylAxylB cassette. Mini-tn5-Tc-xylAxylB was partially and completely digested with SfiI and ligated to the Peno-talB / tktASfi fragment as shown in FIG. 2 (c). Due to its partial digestion, Tc ^r A gene-containing plasmid was generated and named mini-tn5-Tctal / tkt-xylAxylB (FIG. 2), while complete digestion resulted in Tc ^r A plasmid of the invention herein containing no gene was generated and named miniTn5-tal / tkt-xylAxylB. See FIG. 2 (d).
[0036]
The donor strain E. coli S17-1 was transformed with both plasmids and Mobilis 206C. The resulting transzygotes were selected for miniTn5-tal / tkt-xylAxylB-Tc in a mating medium containing glucose, Tc and nalidixic acid. For mini-tn5-tal / tkt-xylAxylB, transzygotes were selected directly on a mating medium containing xylose and nalidixic acid. For mini-tn5tal / tkt-xylAxylB-Tc, many Tc ^r A trans conjugate (glucose growth) was obtained. Several xylose growth transzygotes were obtained for mini-tn5-tal / tkt-xylAxylB.
[0037]
Preliminary batch cultures were tested statically for fermentation dynamics at 30 ° C. without pH adjustment in 80 ml RM bottles containing 2% xylose. Colonies were obtained from RM + 2% xylose plates, stationary growth phase (optical density ₆₀₀ = 0.1, 500 nm) was reached overnight at 20 ° C. in RM 2% xylose medium and used as seeding material. Xylose and ethanol were run on a Hewlett-Packard 1090L HPLC equipped with an HP1047A refractive index detector and a Bio-Rad HPX-87H organic acid analysis column at 65 ° C. with a 0.01 N sulfuric acid mobile phase flow rate of 0.6 ml / min. Was analyzed. Ethanol yield was calculated using either the weight of fermented sugar or the total available sugar in the medium. The maximum theoretical yield was based on 0.51 g ethanol / g xylose.
[0038]
In order to examine whether translocation of the mini-tn5tal / tkt-xylAxylB cassette has occurred, Z. Southern blot analysis of genomic plasmid DNA samples from Mobilistrance conjugates was performed. Genomic plasmid DNA prepared from the four trans-zygotes of mini-tn5tal / tkt-xylAxylB was digested with SphI, which cuts twice in the cassette, resulting in one fragment with Tal probe homology. Blots were then hybridized to either Tal or Tnp probes. The autoradiograph of FIG. 4 shows that when hybridized with the Tal probe, Z. Only one band, larger than 4 kb (Peno-talB / tktA size), adjacent to mobilis DNA, was detected from all genomic DNA specimens. Also, three of the samples (numbers 22, 23 and 24, possibly sister strains) showed bands in the plasmid fraction, suggesting that integration had occurred in the native plasmid. For sample no. It occurred in the mobilis genome, and only a single copy was inserted. Hybridization of the transzygous genomic plasmid DNA samples with the Tnp probe (FIG. 5) revealed no homology between the sample DNA and the Tnp probe. The results show that the xylose assimilation gene and the pentose phosphate pathway gene ^r Z. together with the gene. It was suggested that the transposition into the mobilis genome and that only one insertion occurred in each transzygote and that the insertion was at a different location on the genome.
[0039]
Z. For mobilistran conjugates, xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase and transketolase activities were measured as previously described (Zhang et al., 1995). As described previously, expression of a single copy of Pgap-xylAxylB on the genome was about half the expression of the XI and XK enzymes that occurred with the plasmid-carrying strain. However, enzymatic analysis was performed to determine whether transaldolase (TAL) and transketolase (TKT) were expressed in the zymomonas tal / tkt-xylAxylB-Tc and tal / tkt-xylAxylB transconjugates. As shown in Figure 6, the enzymatic level of TAL for all transzygotes (numbers 4, 5, 17, 18, 21, 23 and 24) was approximately 50-70% of the plasmid counterpart. Approximately 30-70% of the TKT activity of the plasmid-carrying strain was observed in the integrant. Although the plasmid integrant had a slight increase in TAL and TKT activity, the activity of both TAL and TKT expressed from a single copy of the gene in the Zymomonas genome was higher than the 10 copies / cell activity seen in the plasmid-carrying strain. Was much higher than expected.
[0040]
All four of the tal / tkt-xylAxylB Zymomonas integrants (numbers 21, 22, 5, and 11) were able to grow on xylose. Preliminary fermentation studies on these integrants were then performed by using 2% xylose substrate at 30 ° C. The fermentation profiles for these integrants are shown in FIG. In FIG. The growth and sugar utilization of mobilis integrant number 21 was slower than plasmid carrying strain 39676 / pZB4. However, Z. Most of the mobilis integrants (numbers 22, 5 and 11) were similar to the plasmid-carrying strain. All integrants produced ethanol from xylose with a maximum theoretical production rate of 92%.
[0041]
The stability of those strains and the three plasmid-carrying strains integrated into the genome were measured in non-selective media. All strains were cultured in RMG medium and sequentially transferred about every 10 generations daily. To determine the ability to ferment xylose to ethanol, cells were used to seed every 40 generations into flasks of RM medium containing 1% glucose and 5% xylose. Ethanol production and xylose utilization were used as stability milestones. The two strains integrated into the genome showed stability for more than 90 (C25 and D95) generations, while the plasmid-carrying strains (206 / pZB4, 206 / pZB4L and BC1pZB4L) were stable for about 40 generations. Was. See FIG.
[0042]
The fermentation capacity of the C25 and D95 strains, under pH adjusted conditions, varied the concentration of total glucose and xylose (1% glucose and 5% xylose; 3% glucose and 3% xylose; and 4.5% glucose). And 4.5% xylose). As shown in the figure, the C25 strain has better xylose utilization and ethanol production than D95 at RM containing 4.5% glucose and 4.5% xylose at both pH 5 and pH 5.5. Indicated. As a result, in the following examples, three arabinose assimilation genes (araBAD) were integrated into the C25 genome.
[0043]
Example 3 (AX)
The following example illustrates the introduction of arabinose assimilation enzyme into the C25 genome by ldh-mediated homologous recombination and transposition by using the mini-transposon Tn10. The following plasmid, pZB1862-ldhL-ara, was obtained by electroporation in Z. Mobilis or E. coli. Transformants were selected on mating plates supplemented with glucose and tetracycline. Tc ^r Colonies were grown on Ara by growth on RMs supplemented with xylose or arabinose (RMS and RMA). ⁺ Xyl ⁺ It was further confirmed that Similarly, the following plasmid Tn10G was obtained from E. coli SM10λpir donor strain by conjugation using a filter hybridization technique (Conway et al., 1987). Transferred to Mobilis C25. The resulting transzygotes were selected on arabinose-containing mating plates.
[0044]
A. Construction of pZB1862-ldhL-ara and integration at C25 using homologous recombination
Previous attempts to integrate araBAD into the Zymonas genome by using a 1 kb ldh fragment as a homology region were unsuccessful. To increase recombination frequency, wider homologous regions were used. A 2.5 kb DNA fragment containing the ldh and flanking regions was prepared using Pfu PCR and the template described in US Pat. No. 5,726,053, Z. et al. Amplified using DNA from Mobilis ATCC 39676. Primers were obtained from Yamano I.S. , (1993) Journal of Bacteriology, Vol. 175, 3926-3933; It was designed based on the DNA sequence of Mobilis CP4. The published sequence predicted a 2.5 kb fragment from the PCR, but instead yielded a 3.4 kb fragment. After digestion of the 3.4 kb fragment with BamHI, two fragments (2.5 and 0.9 kb) were obtained. Both fragments were tested by PCR using primers designed to anneal only to ldh. The 2.5 kb fragment produced a PCR product of the correct size, whereas the 0.9 kb fragment did not, indicating that the former contained the ldh sequence. Thus, a 2.5 kb BamHI fragment (designated ldhL) was cloned and used as a homologous region for gene integration into C25.
[0045]
The ldhL fragment and digoxigenin (DIG) labeled ldh, ara and tnp probes were purchased from Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) or Taq DNA polymerase (Qiagen, Valencia). , CA). DIG-UTP was purchased from Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. The AI probe is IS10, a transposase gene for Tn10. _R Used to find out. The PCR products for ldhL, ldh, ara and tnp are 2.5, 1, 1.4 and 0.8 kb, respectively. The following primer sequences were used.

[0046]
For the purpose of cloning, a NotI site was introduced into ldhL by inserting the oligonucleotide 5'-CATGCCGCGCCGCC-3 'into the NcoI site located in the center of the ldh gene. The new NotI sites were approximately 1.4 and 1.1 kb from each end of ldhL. A BamHI fragment of ldhL (2.5 kb) containing a NotI site was ligated to pZB1862 at the BclI site. Finally, the 4.4 kb Pgap-araBAD was isolated from pZB206 (U.S. Pat. Nos. 5,712,133 and 5,726,053) and integrated plasmid pZB1862-ldhL-ara. Was cloned into the NotI site of ldhL. See FIG.
[0047]
The Pgap-araBAD operon containing three arabinose assimilation genes was integrated into the Cdh genome at the ldh site by homologous recombination. To integrate the araBAD gene into the C25 genome, pZB1862-ldhL-ara was constructed in E. coli DH5α. Plasmid pZB1862-ldhL-ara was transferred to C25 by electroporation. Tc resistant transformants were selected and tested for growth on arabinose. During the growth of the transformants, Pgap-ara-BAD could be integrated into the C25 genome by replacement of ldhL with the ldhL'-araBAD-ldhL 'cassette (from plasmid) by homologous recombination.
[0048]
Transformants were subjected to plasmid curing to qualitatively enhance and isolate the recombinants. Plasmid pZB1862-ldhL-ara was derived from Z. Will replicate in Mobilis. However, Z. Mobilis tends to lose foreign plasmids under suboptimal growth conditions (eg, 37 ° C.). Using that property, curing of pZB1862-ldhL-ara was achieved for some transferers by subculture of C25 transformants at 37 ° C in the absence of Tc. Cultures from each transfer were regularly monitored for plasmid shedding. By the third metastasis, 100% of cells have Tc ^s , Indicating that the plasmid was dropped. To qualitatively enhance the growth of potential Pgap-araBAD integrants, cultures from the third, fourth, fifth and sixth metastases were seeded at 30 ° C. on arabinose-containing RM (RMA). Qualitatively enriched cells were transferred to RMG plates and replicated on RMA, RMX and RMGTc plates. As described below, Xyl ⁺ Ara ⁺ Tc ^s Some integrants (AX) having the following phenotypes were further analyzed. These integrants could use either xylose or arabinose as the sole carbon source.
[0049]
B. Construction of Tn10G and conjugation to C25
Mini-Tn5 was used to construct C25 with Peno-tal / tkt and Pgap-xylAB operons. The transposase gene was not present at C25, but mini-Tn10 was used for subsequent Pgap-araBAD integration to avoid possible mismatches between the same transposons. Plasmid Tn10G (FIG. 11) was constructed based on the Tn10-based delivery plasmid pLOFKm. Km ^r The gene was replaced with the NotI fragment of Pgap-araBAD, isolated from pZB206. Tn10G was constructed and maintained in E. coli C118. Subsequently, the plasmid is Transfer to Escherichia coli SM10λpir for conjugation with Mobilis. Tn10G is described in Z. In mobilis, because of the suicide plasmid, only trans-zygotes with araBAD integration can grow on mating plates supplemented with arabinose. In the plate, the E. coli SM10λpir donor strain was inhibited by the presence of nalidixic acid. Transzygotes appeared on mating / ara plates at 7 days. Colonies were replicated on RMA and RMX to confirm their phenotype. 86% of the selected colonies are Xyl ⁺ Ara ⁺ Met. Twenty colonies from the selection plate were cross-transferred to different plates (from xylose plate to arabinose plate or vice versa). 60% of those colonies are Xyl ⁺ Ara ⁺ It was still. Twenty colonies were analyzed in a preliminary Southern hybridization (data not shown). By using the tnp probe, about 50% of the strains contained the transposase gene in the genome. The eight recombinants were then analyzed in detail by Southern hybridization.
[0050]
Incorporation of Pgap-araBAD into ldh of C25 was confirmed by Southern hybridization by using DIG-labeled ara and ldh probes for pZB1862-ldhL-ara integrant DNA. See FIGS. 12 (a) and (b). There is only one PstI site on pZB1862-ldhL-ara, located at Pgap-araBAD. Thus, using the ara probe, one hybridization band (12.9 kb) from the PstI digested plasmid was expected. With respect to Pgap-araBAD integrated into the genome, two bands were expected due to the PstI site in Pgap-araBAD and the associated PstI site on the genome located outside of Pgap-araBAD. From FIG. 13 (a), the results clearly showed that two bands from the total DNA sample hybridized to the ara probe, and demonstrated incorporation of Pgap-araBAD. The lack of a hybridization band from the plasmid DNA of the integrant indicated that the integration had occurred on the genome rather than on the native plasmid. The same DNA was transferred and hybridized to the ldh probe to show that ldh was destroyed by Pgap-araBAD integration. As expected, as shown in FIG. 12 (b), the hybridization pattern for the integrant was exactly the same in both blots except for C25. Total DNA from host strain C25, which had the complete ldh and was used for Pgap-araBAD integration, showed only one band. The results confirmed that araBAD was incorporated into ldh of C25.
[0051]
FIGS. 13 (a) and (b) show the results of Southern hybridization using DIG-labeled Tnp and ara probe, respectively, for eight Pgap-araBAD transposon recombinants generated by Tn10 transposition. DNA was digested with PstI restriction enzyme. PstI cuts Tn10G into two fragments (7.7 and 5.9 kb), with only the 5.9 kb fragment being the transposase gene (IS10 _R ) Hold. Both fragments hybridized to the ara probe. According to the blot, only G8, G11, G15 and GH17 were ara positive and tnp negative. The patterns of the various bands indicate that Pgap-araBAD was integrated at different locations in the genome. Although the transposase gene was not expected to be maintained in the genome of the integrant, four of the eight strains (G5, G6, G14 and G19) contained the transposase gene. In addition, G14 and G19 contained transposase on the plasmid. For the ara probe, two bands from the integrant were expected. However, only one band was observed. To resolve this ambiguity, PCR was performed on recombinants using ara primers, confirming that all eight recombinants contained Pgap-araBAD in the genome (data Not shown).
[0052]
Zhang, et al. , 1995 and Deanda et al. , 1996; By using cell-free extracts of the mobilis recombinant and the control strain, xylose isomerase (XI), xylulokinase (XK), L-arabinose isomerase (L-AI), L-librokinase (L-RK), L-Ribulose-5-P-4-epimerase (L-Repi), transketolase (TKT) and transaldolase (TAL) were analyzed. Cell-free extracts are in late log phase (30 ° C., OD ₆₀₀ The culture is harvested to about 1.2) and sonicated buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2). ₂ ), And then sonicated. Cell debris was removed by centrifugation (14000 rpm, 45 minutes, 4 ° C.). In the L-AI analysis, the volume of the periodic sample was half (50 μl), 70% H ₂ SO ₄ (1.5 ml) and 0.12% carbazole (50 μl). All tubes are 70% H ₂ SO ₄ Before and after addition, the mixture was kept in a water bath at 25 ° C. until the absorbance was read. Samples were examined at 0, 5, 10 and 20 minutes during the reaction.
[0053]
Recombinants obtained by homologous recombination and transposon integration were able to grow on D-xylose and L-arabinose, but the level of expression of the integrated gene was determined by measuring enzyme activity. . Isolates C25 / AX1, C25 / AX101 and C25 / G8 were selected for enzyme analysis because they were the most stable integrants as determined in the stability studies described below. The results of the enzyme analysis are summarized in FIGS. For all assays (with and without xylulokinase), the integrant showed significant activity compared to the control (C25 and / or 206C). At this time, the low activity of XK on the integrants may be due to experimental negligence, the nature of the assay, or both. In most assays (except L-librokinase and xylose isomerase), the integrant showed lower activity than the plasmid-carrying strain (206C / pZB301). This appears to be related to the copy number of the gene.
[0054]
For stability studies, cultures were inoculated into tubes containing RMG, incubated overnight at 30 ° C., and transferred daily to RMG tubes. Seeding material was managed to be transferred every 10 generations. To test the fermentability for sugars at 30 ° C. without pH adjustment, cells were used to seed a flask containing a mixture of sugars every 40 generations. Batch fermentation studies were performed on a Bio-StatQ chemostat (B, Braun, Allentown, PA) at 500C using a working volume of 500 ml with pH adjustment at 30 ° C. pH was automatically adjusted with 2N KOH. The starting sugar concentration and pH varied in each batch depending on the culture conditions. All sugars used were reagent grade. Throughout the fermentation, samples were taken periodically and analyzed by HPLC for sugar, ethanol and by-products as described previously (Zhang 1995). The optical density at 600 nm (OD600) was measured to monitor cell growth. Ethanol yield was based on the amount of total sugar available.
[0055]
A xylose and arabinose fermentation with genomic integration, developed by both homologous recombination and transposition. Some mobilis strains were tested for stability in non-selective media (RMG). The strains were cultured in RMG medium and transferred sequentially after about 10 generations daily. To test the ability to ferment xylose and arabinose to ethanol, cells were used to seed every 40 generations into flasks containing 1% glucose and 2% xylose and 2% arabinose. Ethanol production rates, and xylose and arabinose utilization were used as stability characteristics. The two isolates were stable for 160 generations. See FIG. 16 and FIG. The three integrated strains and one plasmid-carrying strain were further tested for fermentability at pH 5.5 and 30 ° C. in a medium containing a mixture of 4% glucose, 4% xylose and 2% arabinose. As shown in FIG. 18, all three strains utilized glucose, xylose and arabinose in 72 hours, while the plasmid-carrying strain retained 6 g / L arabinose. However, the integrated strain produced more xylitol (4 g / L) than the plasmid-carrying strain (1 g / L). The two homologous recombinant strains AX1 and AX101 did not produce lactic acid because the lactate dehydrogenase gene was inactivated by gene integration. The yield of the integrated strain (approximately 83% in theory) was very similar to the plasmid-carrying strain. In addition, the integrated strain grew to higher cell densities. Perhaps the cause is a lower metabolic burden associated with having only a single copy of the seven genes.
[0056]
Although the invention has been described with reference to illustrative embodiments, it will be appreciated and understood that modifications can be made without departing from the true spirit and scope of the invention.
[Brief description of the drawings]
The accompanying drawings, which are incorporated in and constitute a part of this specification, illustrate at least one embodiment of the invention and, together with the description, explain the principles of the invention.
FIG.
FIG. 1 is a plasmid map of Mini-Tn5 in pGP704 containing the xylose assimilation operon of the present invention.
FIG. 2
FIG. 2 is a series of plasmid maps illustrating a series of constructions of mini-Tn5 of the present invention.
FIG. 3
FIG. 3 is an illustration of a series of constructions that yield a plasmid map of pUCtaltktSfi.
FIG. 4
FIG. 4 shows tal / tkt-xylAxylBZ. It is a result of Southern analysis of a mobilistrans zygote. C is the control plasmid mini-Tn5tal / tkt-xylAxylB. λH is a DNA size marker.
FIG. 5
FIG. 5 shows tal / tkt-xylAxylB Z. using Tnp probe. It is a result of Southern analysis of a mobilistrans zygote. C is the control plasmid mini-Tn5tal / tkt-xylAxylB. λH is a DNA size marker.
FIG. 6
FIG. 6 shows the stable xylose fermentation of the present invention. FIG. 3 is a graph of enzyme activity for several isolates of S. mobilis strains.
FIG. 7
FIG. 7 shows a graph of the fermentation profiles for the four isolates of FIG. 6 (numbers 21, 22 and 5) and their performance for the plasmid carriers 39673 / pZB4 and BC1 / pZB4L.
FIG. 8
FIG. 8 shows the stable xylose fermentation of the present invention. 2 is a graphical representation showing the stability of Mobilis strains C25 and D95. The graph shows the stability of the xylose fermentation strain that carried the plasmid and integrated into the genome using the ethanol production rate and xylose utilization parameters as indicators. The C25 and D95 strains of the present invention were stable for more than 90 generations. The fermentation medium consisted of RM containing 1% glucose and 5% xylose and the temperature was constant at 30 ° C.
FIG. 9
FIG. 9 shows a batch of xylose fermentation strains C25 and D95 that had undergone genomic integration in an RM medium containing 4.5% glucose and 4.5% xylose at 30 ° C. at pH 5.0 and pH 5.5 at 30 ° C. The optical density (OD) when comparing the percentage xylose utilization for batch fermentation ₆₀₀ 3) shows the biomass concentration, xylose utilization as a function of time, and ethanol production and production as a function of time.
FIG. 10
FIG. 10 is a map of the integration plasmid pZB1862-ldhL-ara. araBAD is inserted into the NotI site of ldhL and separates ldh. The construction is described in Z. Mobilis replication plasmid pZB1862.
FIG. 11
FIG. 11 is a plasmid map of Tn10G. IS10 _R Is the transposase gene. IR is the inverted repeat of a transposon. araBAD was inserted between the two inverted repeats at the NotI site.
FIG.
FIG. 12 shows the xylose / arabinose fermentation Z. harbored by genomic integration obtained by homologous recombination using the DIG-ara and DIG-ldh probes. 3 shows a Southern analysis of a Mobilis strain. AX1, 13, 23, 101, 104 and 107 are araBAD integrants. C25 is a host control. pZB1862-ldhL-ara is a plasmid control isolated from DH5α. λ / H is a 23, 9.4, 6.6, 4.3, 2.3 and 2.0 kb molecular weight marker.
FIG. 13
FIG. 13 shows Southern analysis of xylose / arabinose fermented Zymomonas strains with genomic integration obtained by transposon integration using DIG-tnp and DIG-ara probes. G5, 6, 11, 15, 17, 14 and 19 are araBAD integrants. C25 is a host control. Tn10G is a plasmid control. λH is a 23, 9.4, 6.6, 4.3, 2.3 and 2.0 kb molecular weight marker. FIG. 13 (a) shows the digestion of tnp with PstI, and FIG. 13 (b) shows the probe with PstI digestion.
FIG. 14
FIG. 14 shows a bar graph of the enzymatic activities of transketolase, transaldolase, xylose isomerase and xylulokinase of the genomic integration strain. 206C / pZB301 is a plasmid control. 206C is a host control. C25 is a xylose fermentation integrant. G8 is a xylose / arabinose fermentation integrant obtained by Tn10 rearrangement. AX1 and AX101 are xylose / arabinose fermentation recombinants obtained by homologous recombination.
FIG.
FIG. 15 shows the bar graph results of the enzymatic activities of L-arabinose isomerase, L-librokinase and L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase in the strains into which the genome was integrated. 206C / pZB301 is a plasmid control. 206C is a host control. C25 is a xylose fermentation integrant. G8 is a xylose / arabinose fermentation integrant obtained by Tn10 rearrangement. AX1 and AX101 are xylose / arabinose fermentation integrants obtained by homologous recombination.
FIG.
FIG. 16 shows the bar graph results of the ethanol production rates of xylose and arabinose fermented Zymomonas strains with genomic integration in RMGXA (1: 2: 2%) at T = 30 ° C. without pH adjustment. The strains were inoculated from various generations of culture in non-selective medium.
FIG.
FIG. 17 shows the bar graph results of xylose and arabinose utilization of genomic integrated xylose and arabinose fermented Timomonas strains in RM containing 1% glucose, 2% xylose and 2% arabinose, pH adjusted at 30 ° C. Show. The strains were inoculated from various generations of culture in non-selective medium.
FIG.
FIG. 18 is a line graph representation of the fermentation capacity of genomically integrated xylose and arabinose fermented Zymomonas strains at RM containing 4% glucose, 4% xylose and 2% arabinose at pH 5.5 and 30 ° C.

Claims (22)

A transposon for stable insertion of a foreign gene into a bacterial genome, comprising at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, araBAD and tal / tkt; A transposon containing at least one promoter for expression, a pair of inverted inserts, the operon contained inside the insert, and a transposase gene located outside the insert. A plasmid vector containing the transposon according to claim 1. A bacterium transformed with the plasmid of claim 2. The bacterium is of the Z. The bacterium according to claim 3, which is mobilis. The bacterium according to claim 3, wherein the transposon is a derivative of Tn5 or Tn10. The bacterium according to claim 4, wherein the operon contains the xylAxylB and tal / tkt structural genes. The bacterium according to claim 4, wherein the operon contains the araBAD and tal / tkt structural genes. The bacterium according to claim 4, wherein the promoter is selected from the group consisting of Peno and Pgap. A plasmid vector for transforming a foreign gene into a bacterial genome, comprising at least one operon having a structural gene encoding an enzyme selected from the group consisting of xylAxylB, araBAD and tal / tkt, expressing the structural gene in bacteria A plasmid vector containing at least one promoter for carrying out the process and at least two DNA fragments having homology to the DNA sequence of the bacterial genome to be transformed. A bacterium transformed with the vector according to claim 9. A second operon having a structural gene encoding an enzyme consisting essentially of araBAD, at least one promoter for expressing the structural gene in bacteria, and at least one having homology to the DNA sequence of the bacterial genome to be transformed. 7. The bacterium according to claim 6, further transformed with a plasmid vector containing two DNA fragments. A second operon having a structural gene encoding an enzyme consisting essentially of xylAxylB, at least one promoter for expressing the structural gene in bacteria, and at least having homology to the DNA sequence of the bacterial genome to be transformed. 8. The bacterium according to claim 7, further transformed with a plasmid vector containing two DNA fragments. The DNA fragment having homology is described in ATCC 39676Z. Mobilis strain obtained as a template. The vector according to claim 9, which is ldhL containing a 2.5 Kb region of Mobilis DNA. The bacterium is of the Z. The bacterium according to claim 10, which is mobilis. 7. The bacterium according to claim 6, wherein the expression of the product of the structural gene is stable for at least 45 generations. The bacterium according to claim 11, wherein the expression of the product of the structural gene is stable for at least 45 generations. The vector pZB1862-ldhL-ara having the ATCC accession number PTA-1798. A transposable element mini-Tn5-tal / tkt-xylAxylB having ATCC accession number PTA-1795. Bacterial strain G8 having ATCC accession number PTA-1796. Bacterial strain C25 having ATCC accession number PTA-1799. Bacterial strain AX having ATCC accession number PTA-1797. A reaction mixture comprising a fermentation medium comprising xylose or arabinose and the bacterium according to claim 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 19, 20 or 21.

Images