JP2004512818A - Drug metabolizing enzymes - Google Patents

Abstract

The present invention provides human drug metabolizing enzymes (DMEs) and polynucleotides that identify and encode DME. The invention also provides expression vectors and host cells, antibodies, agonists, antagonists. Further, the present invention provides a method for diagnosing, treating, and preventing a disease associated with abnormal expression of DME.

Description

一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、ａ）置換された領域のポリペプチドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、ｂ）置換された部位の分子の電荷または疎水性、及び／または、ｃ）側鎖の大半が維持される。
【０１２７】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１２８】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドのことである。
【０１２９】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１３０】
用語「断片」は、ＤＭＥまたはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【０１３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【０１３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【０１３３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３４】
「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えることができる。
【０１３５】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比較を行うことができる。
【０１３６】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１３７】
別法では、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）が提供する、広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム一式が、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含む幾つかのソース及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメータと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【０１３８】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１３９】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【０１４０】
ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）が保存される。
【０１４１】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ バージョン３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（上記）に組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いる対方式のポリぺプチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１４２】
別法では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【０１４３】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペプチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１４４】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１４５】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１４６】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ちストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のストリンジェンシーにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１４７】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低く選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他による， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版の１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ； 特に２巻の９章に記載されている。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣの濃度は、約０．１％のＳＤＳが存在の下、約０．１〜２ｘ ＳＳＣの範囲である。通常は、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの切断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【０１４９】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【０１５０】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１５１】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴をもつ。
【０１５２】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１５３】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１５４】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１５５】
用語「調節」は、ＤＭＥの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＤＭＥのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１５６】
用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物質である。
【０１５７】
「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、機能的に結合したＤＮＡ配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【０１５８】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組成物が溶解性となる。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る。
【０１５９】
ＤＭＥの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＤＭＥの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１６０】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＤＭＥやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレオチドにアニーリングした後、あるＤＮＡポリメラーゼ酵素によって、標的のＤＮＡ一本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、ＰＣＲ法における核酸配列の増幅（及び同定）に用いることができる。
【０１６１】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【０１６２】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他による、１９８９年、名称「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版の１−３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）、またはＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他による、１９８７年、名称「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、並びに Ｉｎｎｉｓ他による、１９９０年、名称「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ．）を参照されたい。ＰＣＲ用のプライマーの組は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用いて、ある既知の配列から引き出すことができる。
【０１６３】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのＰＣＲ用のプライマーの対の選択、及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌクレオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ ＴＸより入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｏｐｅ）におけるプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ１より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。また、Ｐｒｉｍｅｒ３は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することもできる）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例えば、ＰＣＲ法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレメント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【０１６４】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化学合成によって作られる場合も多いが、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ に記載されたような遺伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【０１６５】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニアウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【０１６６】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはＲＮＡの安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１６７】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分が含まれる。
【０１６８】
本明細書において、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１６９】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＤＭＥ、ＤＭＥをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１７０】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１７１】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１７２】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１７３】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板には、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこにポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７４】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１７５】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こり、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージまたはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１７６】
本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的な交雑育種やｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精ではなく、組換えＤＮＡ分子を導入することである。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物が含まれる。本発明の単離されたＤＮＡは、当分野で周知の、例えば、感染、形質移入、形質転換、トランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などの方法によって、宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをそのような生物に導入する技術は周知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）に記載されている。
【０１７７】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。
【０１７８】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｐによって、あるポリペプチド配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【０１７９】
（発明）
本発明は、新規のヒト薬剤代謝酵素（ＤＭＥ）及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患の診断、治療、及び予防に関する。
【０１８０】
表１は、本発明のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の識別番号を示す。各ポリヌクレオチドおよびそれに対応するポリペプチドは、１つのインサイトプロジェクト識別番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＩＤ）に相関する。各ポリペプチド配列は、記載されているようにポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）の両方によって示されている。各ポリヌクレオチド配列は、記載されているようにポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ＩＤ）の両方によって示されている。
【０１８１】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｅｐｔ）データベースにおいてＢＬＡＳＴ解析により同定された本発明のポリペプチドに相同性を有する配列を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｗｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１８２】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、潜在的なリン酸化部位および潜在的なグリコシル化部位を示す。列６は、シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１８３】
表２および表３は共に、本発明のポリペプチドの特性を一覧にしたものであって、これらの特性は請求するポリペプチドが薬剤代謝酵素であることを立証するものである。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、ヒト推定Ｎ−アセチルトランスフェラーゼＣａｍｅｌｌｏ２ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６６５１４３８）と３２％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２を参照）。ＢＬＡＳＴの確率スコアは６．５０Ｅ−２３であり、探しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はまた、ＳＰＳｃａｎプログラムによって決定されたシグナルペプチドサイン配列、及び保存されたタンパク質ファミリードメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのＰＦＡＭデータベースにおける統計的に有意なマッチを検索して決定されたアセチルトランスフェラーゼを有する。アセチルトランスフェラーゼに対するＨＭＭの確率は、３．２ｅ−１２である（図３参照）。ＢＬＡＳＴ及びＨＭＭ解析を基にすると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ９のタンパク質はＮ−アセチルトランスフェラーゼである（表７を参照）。これらサイン配列のすべては、統計学的に高度に有意であり（しきい値については表７を参照）、例えば、アルド−ケト レダクターゼファミリーサイン配列に対するＨＭＭの確率値は、５．６ｅ−１７０である。ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭ、ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩ、及びＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ解析を基に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０のタンパク質がアルド／ケト レダクターゼであり、これに限定する物ではないが、グルコース及びカルボニル含有薬剤分子及びゼノバイオティックスを有するカルボニル含有糖及び芳香族化合物を減少させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １− ８は、同様の規則で解析され、アノテーションを付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： １−１０のアルゴリズム及びパラメーターは表７に記載されている。
【０１８４】
表４に示されているように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列、またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから推定されるコード配列（エキソン）、および／またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方からなる群に対応する識別番号を示す。これらの配列を用いて本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を組み立てた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１８５】
表４の列５に示されている識別番号は、具体的には、例えばインサイトｃＤＮＡおよびそれらに対応するｃＤＮＡライブラリの識別番号を示す。例えば、３７０００６５Ｆ６はインサイトｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＳＩＮＩＮＯＴ０５はそれが由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないインサイトｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリ（例えば、７１４４７９１０Ｖ１）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇ５６６３４５９）の識別番号の場合もある。または、列５の識別番号は、Ｇｅｎｓｃａｎ分析によって推定されるゲノムＤＮＡのコード領域の場合もある。例えば、ＧＮＮ．ｇ７０２５７４４＿００００５５＿００２は、Ｇｅｎｓｃａｎ推定コード配列の識別番号であって、ｇ７０２５７４４がＧｅｎｓｃａｎ分析によって得られたＧｅｎＢａｎｋの配列の識別番号である。このＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集する場合がある（実施例４を参照）。または、列５の識別番号は、”ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ”アルゴリズムによってｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ推定エキソンの両方からなる群の場合もある。例えば、ＦＬ１５２８２４＿００００１はステッチ配列（”ｓｔｉｃｈｅｄ”ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であって、この１５２８２４はアルゴリズムに用いた配列のクラスター識別番号を表し、００００１はアルゴリズムによって推定された数を表す（実施例５を参照）。または、列５の識別番号は、”ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ”アルゴリズムによってｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ推定エキソンの両方からなる群の場合もある（実施例５を参照）。場合によっては、列５に示されている配列の範囲と重複するインサイトｃＤＮＡの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するインサイトｃＤＮＡの識別番号は示されていない。
【０１８６】
表５は、インサイトｃＤＮＡ配列を用いて組み立てられたこれらの完全長ポリヌクレオチド配列が由来する代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。代表的なｃＤＮＡライブラリとは、上記ポリヌクレオチド配列の組み立ておよび決定に用いられたインサイトｃＤＮＡ配列を最も多く含むインサイトｃＤＮＡライブラリのことである。表５に示されているｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターが表６に示されている。
【０１８７】
本発明はまた、ＤＭＥの変異体も含む。好適なＤＭＥの変異体は、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつＤＭＥアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１８８】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＤＭＥをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１８９】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１９０】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＤＭＥをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、天然のＤＭＥのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１９１】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＤＭＥのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＤＭＥ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞または原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１９２】
本発明はまた、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＤＭＥまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１９３】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１９４】
当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【０１９５】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＤＭＥをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． 他 （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【０１９６】
完全長のｃＤＮＡをスクリーニングする場合は、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１９７】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１９８】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＤＭＥ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＤＭＥのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１９９】
種々の目的でＤＭＥをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能である。
【０２００】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＤＭＥの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＤＭＥの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャフリングは、ＰＣＲ法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有する遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ましい変異体をプールし、ＤＮＡシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもできる。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【０２０１】
別の実施例によれば、ＤＭＥをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＤＭＥ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ５５−６０； Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＤＭＥのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２０２】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、ｐｐ２８−５３を参照）。
【０２０３】
生物学的に活性なＤＭＥを発現させるために、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＤＭＥをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＤＭＥをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【０２０４】
当業者に周知の方法を用いて、ＤＭＥをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０２０５】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＤＭＥをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１； Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． １９１−１９６、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２０６】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＤＭＥをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＤＭＥが必要な場合は、ＤＭＥの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０２０７】
ＤＭＥの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）。
【０２０８】
植物系もＤＭＥの発現に使用可能である。ＤＭＥをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０２０９】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＤＭＥをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＤＭＥを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【０２１０】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０２１１】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＤＭＥの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＤＭＥをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２１２】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ⁻またはａｐｒ⁻細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．他（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１を参照）。
【０２１３】
マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＤＭＥをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＤＭＥをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＤＭＥをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２１４】
一般に、ＤＭＥをコードする核酸配列を含み、ＤＭＥを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１５】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＤＭＥの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＤＭＥ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他．（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【０２１６】
種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＤＭＥをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【０２１７】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＤＭＥの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２１８】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０２１９】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＤＭＥタンパク質が、ＤＭＥ活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＤＭＥをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＤＭＥが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０２２０】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＤＭＥの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、^３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０２２１】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＤＭＥへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２２２】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＤＭＥの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＤＭＥが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＤＭＥを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。ＤＭＥを発現する細胞またはＤＭＥを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＤＭＥまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２２３】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＤＭＥと結合させるステップと、ＤＭＥとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２２４】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＤＭＥが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＤＭＥの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性が試験化合物不在下でのＤＭＥの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性の変化は、ＤＭＥの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＤＭＥの活性に適した条件下でＤＭＥを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＤＭＥの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２２５】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＤＭＥまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２２６】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０２２７】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、潜在的な医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＤＭＥを乳汁内に分泌するなどＤＭＥを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２２８】
（治療）
ＤＭＥのある領域と薬剤代謝酵素のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＤＭＥの発現は、肝臓腫瘍細胞株、肝臓腫瘍組織、膵臓組織、脳下垂体腫瘍、脳腫瘍、小腸細胞、胎児の脳組織、及び不等皮質脳組織に密接に関連する。従って、ＤＭＥは、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患においてある役割を果たすと考えられる。ＤＭＥの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２２９】
従って、一実施例において、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常の異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれ、自己免疫／炎症の疾患の中には、炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、内分泌障害の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれ、眼の疾患の中には、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、代謝障害の中には、副腎機能不全、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれる。
【０２３０】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２３１】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＤＭＥを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２３２】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２３３】
更なる実施例では、ＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれる。一実施態様では、ＤＭＥと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＤＭＥを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２３４】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２３５】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０２３６】
ＤＭＥのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＤＭＥを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＤＭＥと特異的に結合するものを同定が可能である。ＤＭＥの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０２３７】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＤＭＥまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０２３８】
ＤＭＥに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＤＭＥアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２３９】
ＤＭＥに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ら． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０２４０】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１−４８５１−４８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＤＭＥ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０２４１】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、得ることもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２４２】
ＤＭＥに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）_２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． ら． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０２４３】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合アッセイ、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＤＭＥとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ＤＭＥエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２４４】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＤＭＥに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＤＭＥ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＤＭＥエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、ＤＭＥに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＤＭＥエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、ＤＭＥ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＤＭＥが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２４５】
ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＤＭＥ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。（例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出， 及びＣｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０２４６】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＤＭＥをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＤＭＥをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０２４７】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することができる（例えば、Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５； ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．を参照 ）。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１； Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出； Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ、及び当分野で周知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ， Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５； ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６．を参照）。
【０２４８】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、（ｉ）遺伝子欠損症（例えば、Ｘ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． 他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１）、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０； Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）に関連する重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． 他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． 他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６； Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． 他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損による血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５　Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０； Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療したり、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物（例えば、細胞増殖の制御不能による癌の場合）を発現させたり、及び（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６； Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）や、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体）に対する防御機能を有するタンパク質を発現させて行うことができる。ＤＭＥの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＤＭＥを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２４９】
本発明の更なる実施例では、ＤＭＥの欠損による疾患や異常症は、ＤＭＥをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＤＭＥ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的な導入技術には、（ｉ）個々の細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、（ｉｉ）金粒子の打ち込み、（ｉｉｉ）リポソーム仲介性トランスフェクション、（ｉｖ）受容体仲介性遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソン（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７； Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． ａｎｄ Ｈ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）の使用が含まれる。
【０２５０】
ＤＭＥの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＤＭＥを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＤＭＥをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２５１】
市販のリポソーム形質転換キット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売しているＰＥＲＦＥＣＴ ＬＩＰＩＤ及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ ＫＩＴ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法 （Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代細胞にＤＮＡを導入するためには、これらの標準的な哺乳動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。
【０２５２】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えば、ＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能であり、公表データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。このベクターは、ＶＳＶｇ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０； Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６； Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６； Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１； Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治療の分野では周知であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９； Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７； Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６； Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６： Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２５３】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他． （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４； ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２５４】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＤＭＥを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製は、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも１つの内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。また上記特許には、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ株の作製及び使用方法が開示されている。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ ａｎｄ Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペスウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で周知の技術である。
【０２５５】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的な研究が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）がＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． ａｎｄ Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡが完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルで複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が過剰に産生される。同様に、ＤＭＥをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＤＭＥをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＤＭＥが合成される。通常はαウイルス感染は２〜３日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に変更することが可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＤＭＥを導入することができる。ある集団における細胞のサブセットの特定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合がある。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの操作、αウイルスｃＤＮＡ及びＲＮＡのトランスフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で周知である。
【０２５６】
例えば開始部位から約−１０から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を阻害することが可能である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重鎖ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． ら． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０２５７】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＤＭＥをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０２５８】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０２５９】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＤＭＥをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０２６０】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏメチルを用いる修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０２６１】
本発明の更なる実施例は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポリペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化させ得る。従って、ＤＭＥの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６２】
特定のポリヌクレオチドの発現の変化の有効性を調べるために、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は、有効な化合物の化学修飾を含む当分野で周知の任意の方法で得ることができる。このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販されている或いは専売の天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づいて化合物を合理的にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効である。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊離系または再構成生化学系が含まれ得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの収量を定量し、その値が１或いは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発現の変化に試験化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリのスクリーニングを含む（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２６３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６：を参照）。
【０２６４】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０２６５】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような組成物は、ＤＭＥ、ＤＭＥの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＤＭＥのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物またはホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０２６６】
本発明に用いられる組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０２６７】
肺投与用の組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば、従来の低分子量有機薬剤）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当分野で周知である。高分子（例えばより大きなペプチドやタンパク質）の場合には、肺の肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬剤を実際に血中に輸送することが可能となった（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要でなくなる。
【０２６８】
本発明に用いる好適な組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、十分に自身の能力で効果的な服用量を決めることができる。
【０２６９】
ＤＭＥまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、ＤＭＥまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入されることが確認されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２７０】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０２７１】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＤＭＥまたはその断片、ＤＭＥの抗体、ＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ_５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある用量）またはＬＤ_５０（服用に対して集団の５０％に致命的である用量）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０と示すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０２７２】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用期間が長い組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０２７３】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇまでの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０２７４】
（診断）
別の実施例では、ＤＭＥに特異的に結合する抗体が、ＤＭＥの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＤＭＥやＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＤＭＥの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＤＭＥを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０２７５】
ＤＭＥを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＤＭＥの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＤＭＥの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＤＭＥに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）などの種々の方法で定量され得る。被験者のＤＭＥの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【０２７６】
本発明の別の実施例によれば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＤＭＥを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＤＭＥの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＤＭＥ値の調節を監視する。
【０２７７】
一実施形態では、ＤＭＥまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＤＭＥをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＤＭＥをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２７８】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＤＭＥをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０の配列、或いはＤＭＥ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２７９】
ＤＭＥをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＤＭＥ及びＤＭＥ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば^３２Ｐ或いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０２８０】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＤＭＥの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常の異常、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれ、自己免疫／炎症の疾患の中には、炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、内分泌障害の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれ、眼の疾患の中には、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、代謝障害の中には、副腎機能不全、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＤＭＥの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０２８１】
ある実施態様では、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＤＭＥをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０２８２】
ＤＭＥの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＤＭＥをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【０２８３】
疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０２８４】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【０２８５】
ＤＭＥをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェントな条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０２８６】
或る実施態様において、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、ヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿入及び欠失である。限定するものではないが、ＳＮＰの検出方法には、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法が含まれる。ＳＳＣＰでは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。このＤＮＡは、例えば病変或いは正常な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識することによって、ＤＮＡシークエンシング装置などのハイスループット機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出をすることが可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ：ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するＤＮＡ断片の配列を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシークエンシングエラーや研究室でのＤＮＡの調整に起因する配列のばらつきを排除する。別法では、例えばハイスループットのＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２８７】
ＤＭＥの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．ら（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．ら（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度は、ハイスループット型のアッセイを用いることで速くなるであろう。このアッセイでは、目的のオリゴマーやポリヌクレオチドが様々な希釈液中に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速である。
【０２８８】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを、上記したように多数の遺伝子の相対的な発現レベルを同時にモニタリングする転写イメージング技術に用いることができる。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行／後退をモニタリングし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うことができる。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありながら副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２８９】
別の実施例では、ＤＭＥ、ＤＭＥの断片、ＤＭＥに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようにタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニタリング及び測定することが可能である。
【０２９０】
特定の実施例は、或る組織または細胞型の転写イメージを生成する本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞型により遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ”を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞型の転写物または逆転写物の全てに本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列をハイブリダイズすることにより、転写イメージが生成され得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列がマイクロアレイ上に複数のエレメントのサブセットを構成するハイスループット型でハイブリダイゼーションさせる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルとなり得る。
【０２９１】
転写イメージは、組織、細胞株、生検サンプル、またはその他の生体サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。従って、転写イメージは、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子発現を反映する。
【０２９２】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロファイルを示す転写イメージはまた、合成化合物または天然化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用され得る。全ての化合物は、作用及び毒性の機構を示唆する、頻繁に分子フィンガープリント若しくは毒性シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを引き起こす（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、また言及することを以って本明細書の一部とする）。試験化合物が、毒性を有する既知の化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性が高い。フィンガープリンまたはシグネチャが、より多くの遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいれば、より有用かつ正確になる。理想としては、発現のゲノム全域にわたって測定し、最高品質のシグネチャを提供することである。任意の試験化合物によっても発現が変化しない遺伝子も同様に重要である。それは、これらの遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを標準化することができるためである。標準化処理は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる毒性スクリーニングにおいて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要でありまた望ましいことである。
【０２９３】
一実施例では、試験化合物の毒性は、核酸を含有する生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１若しくは複数のプローブでハイブリダイズさせ、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量することができる。処理した生体サンプル中の転写レベルを、非処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差が、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示唆する。
【０２９４】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞型のプロテオームを分析することに関連する。「プロテオーム」という用語は、或る特定の組織または細胞型におけるタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームを構成する各タンパク質は、個々に更なる分析をすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロファイルは、所定の条件下で所定の時間に発現したタンパク質の数及びそれらの相対的な存在量を定量することにより分析する。従って、ある細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞型のポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、このような分離は２次元ゲル電気泳動によって行う。この２次元ゲル電気泳動法では、まず、１次元の等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に、２次元のドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に従って分離する（前出のＳｔｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。これらのタンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの染色剤を用いてゲルを染色して、分散した個別の位置にあるスポットとしてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理済みまたは未処理のいずれかの生体サンプルから得られる等位置にあるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を調べる。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的に切断した後、質量分析する標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基であるその部分的な配列を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２９５】
プロテオームのプロファイルは、ＤＭＥに特異的な抗体を用いてＤＭＥ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上のエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝露して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． ら． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２９６】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織における或るタンパク質では、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関性が低いことがあるため（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． ａｎｄ Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、プロテオーム毒性シグネチャは、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを変化させる化合物の分析において有用たり得る。更に、体液中での転写の分析は、ｍＲＮＡが急速に分解するため困難である。しがたがって、このような場合にはプロテオームのプロファイル作成はより信頼でき、情報価値がある。
【０２９７】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質を分離して、各タンパク質の量が定量できるようにする。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプル中のタンパク質の量の差は、処理されたサンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。個々のタンパク質は、それらのアミノ酸残基をシークエンシングし、これらの部分配列を本発明のポリペプチドと比較することで同定する。
【０２９８】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理することにより評価する。生体サンプルから得たタンパク質を、本発明のポリペプチドに特異的な抗体と共にインキュベートする。その抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差が、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。
【０２９９】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他 （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， ｅｄ． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。また、この文献を引用することを以って本明細書の一部とする。
【０３００】
本発明の別の実施例ではまた、ＤＭＥをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存されていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４、Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０３０１】
ｉｎ ｓｉｔ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝子地図データと相関し得る（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他による（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８を参照）。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のワールドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体地図上のＤＭＥをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０３０２】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることにより、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や症候群に関与する１つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他による（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０３０３】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＤＭＥと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３０４】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，他による（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、ＤＭＥ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＤＭＥが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＤＭＥはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０３０５】
別の実施例では、ＤＭＥと結合可能な中和抗体がＤＭＥと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＤＭＥと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３０６】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＤＭＥをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０３０７】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０３０８】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第６０／１９７，５９０号、同第６０／１９８，４０３号、同第６０／２００，１８５号、同第６０／２０２，２３４号、および同第６０／２０３，５０９号に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０３０９】
（実施例）
１　 ｃＤＮＡ ライブラリの作製
インサイトｃＤＮＡはＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に含まれているｃＤＮＡライブラリに由来し、表４の列５に示されている。ある組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液においてホモジナイズして溶解する一方、別の組織を、フェノールにおいて、或いはグアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの変性剤の好適な混合液においてホモジナイズして溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離によって、或いはクロロホルムで抽出した。ＲＮＡは、イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムとエタノールのどちらか、或いは別の一般的な方法でこの溶解物から沈殿させた。
【０３１０】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０３１１】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当分野で周知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出，ユニット５．１−６．６を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはアガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮＣＹプラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、またはそれらの誘導体などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５αまたはＤＨ１０Ｂ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し形質転換した。
【０３１２】
２　 ｃＤＮＡ クローンの単離
上記実施例１に記載したように得たプラスミドは、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用したｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、またはＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、またはＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いた。沈殿させた後、０．１ ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３１３】
別法では、ハイスループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリングステップは、１つの反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０３１４】
３　シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したインサイトｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は標準的な方法で行うか、またはＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）或いはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ） 液体移送装置と共にＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） サーマルサイクラー或いはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などのハイスループット装置を用いて行った。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の試薬、またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれる試薬を用いて行った。ｃＤＮＡシークエンシングの反応物の電気泳動的による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または当分野で周知のその他の配列解析システムを用いて行った。ｃＤＮＡ配列内の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長した。
【０３１５】
インサイトｃＤＮＡに由来する本ポリヌクレオチド配列の確認は、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング、およびジヌクレオチドの分布による解析（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー、およびポリＡ配列を取り除き、更にあいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、インサイトｃＤＮＡ配列およびそれらの翻訳を、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベース、およびＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にしたタンパク質ファミリーのデータベースから選択した配列に対して問合せた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス主構造を分析する確率的手法である。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６ ： ３６１−３６５を参照）。このような問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＲに基づいたプログラムを用いて行った。インサイトｃＤＮＡ配列を組み立てて、完全長ポリヌクレオチド配列を作製した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡｓ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチ配列（ｓｔｉｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ストレッチ配列（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、またはＧｅｎｓｃａｎ−推定コード配列（実施例４および５を参照）を用いて、インサイトｃＤＮＡ群を完全長の配列に伸長した。配列の組み立ては、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、およびＣｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて行い、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ、およびＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いて、オープンリーディングフレームを決定するべくｃＤＡＮ群をスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長ポリペプチド配列を得た。別法では、本発明のポリヌクレオチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基から始まり得る。次に、完全長ポリペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問合せて分析した。こられの完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯ ソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアラインメントを、アライメントした配列間のパーセント同一性も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって指定されたデフォルトパラメータを用いて作成した。
【０３１６】
表７は、インサイトｃＤＮＡおよび完全長配列の組み立て、および組み立てた配列の分析に利用したツール、プログラム、およびアルゴリズム、並びにそれらの説明、引用文献、閾値パラメータを簡単に示す。表７の列１は用いたツール、プログラム、およびアルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列４の記載されている部分は２つの配列の一致の程度を評価するために用いたスコア、確率値、およびその他のパラメータを示す（スコアが高くなれば高くなるほど即ち確率値が低ければ低いほど、配列間の相同性が高くなる）。
【０３１７】
完全長のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０３１８】
４　ゲノム ＤＮＡ からコード配列の同定および編集
推定薬剤代謝酵素は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物に由来するゲノムＤＮＡ配列を分析するための汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８ ： ７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８ ： ３４６−３５４を参照）。このプログラムは推定エキソンを連結して、メチオニンから停止コドンまで伸長した組み立てｃＤＮＡ配列を構築する。Ｇｅｎｓｃａｎにより得られる配列は、ＦＡＳＴＡデータベースのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列になる。Ｇｅｎｓｃａｎによって一回で解析できる配列の最大長さは３０ｋｂに設定されている。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が薬剤代謝酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいて薬剤代謝酵素について問合せて分析した（７ｔｍ＿１、７ｔｍ＿２、７ｔｍ＿３、および７ｔｍ＿４）。潜在的な薬剤代謝酵素が、薬剤代謝酵素としてアノテーションが付けられたインサイトｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。次に、これらの選択されたＧｅｎｓｃａｎ推定配列を、ＢＬＡＳＴ解析を用いてｇｅｎｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースの配列と比較した。必要に応じて、Ｇｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して、Ｇｅｎｓｃａｎ推定配列における余分なエキソンや省いてしまったエキソンなどのエラーを修正し、編集した。ＢＬＡＳＴ解析を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含むインサイトｃＤＮＡまたは公共のｃＤＮＡを見つけ出すことにより、転写の証拠が得られる。インサイトｃＤＮＡがＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含む場合、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定配列を修正或いは確認できる。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に説明した組み立て方法でＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列とインサイトｃＤＮＡおよび／または公共のｃＤＮＡ配列を組み立てて作製した。別法では、完全長ポリヌクレオチド配列は、その全てが編集した或いは未編集のＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列から作製した。
【０３１９】
５　ゲノム配列データと ｃＤＮＡ 配列データとの組み立て
ステッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分的なｃＤＮＡ配列を、実施例４に記載したＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムによって推定されたエキソンで伸長した。実施例３に記載されたように組み立てられた部分的なｃＤＮＡをゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡおよび１或いは複数のゲノム配列に由来する関連する推定Ｇｅｎｓｃａｎエキソンを含む複数のクラスターに入れた。各クラスターを、グラフ理論および動的計画法に基づいたアルゴリズムを用いて、ｃＤＮＡおよびゲノム情報を統合して分析し、後に確認される潜在的なスプライスバリアントを生成し、編集或いは伸長して完全長の配列を作製した。或るクラスターの２つ以上の配列に或る区間の全長が存在する配列区間を同定し、推移（ｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）により同定した区間を同等と考える。例えば、或る区間がｃＤＮＡおよび２つのゲノム配列のそれぞれに存在する場合、これら３つ全ての区間を同等と考える。この方法によって、関連しないが連続するゲノム配列をｃＤＮＡ配列によって繋ぎ１つにする。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。或るタイプ（ｃＤＮＡとｃＤＮＡ、またはゲノム配列とゲノム配列）の親配列に沿って連結される区間と区間との繋ぎ合わせは、親配列のタイプが異なる（ｃＤＮＡとゲノム配列）連結より好ましい。得られたステッチ配列を翻訳し、ＢＬＡＳＴ解析でｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースにおける配列と比較した。Ｇｅｎｓｃａｎによって推定された不適当なエキソンを、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して修正する。このような配列を更なるｃＮＤＡ配列で伸長し、必要に応じてゲノムＤＮＡで検査した。
【０３２０】
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分的なＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴ解析に基づいたアルゴリズムで完全長に伸長した。まず、実施例３に記載したように組み立てた部分的なｃＤＮＡを、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。次に、ＧｅｎＢａｎｋの相同性の最も高いタンパク質を、実施例４に記載したインサイトｃＤＮＡ或いはＧｅｎＳｃａｎエキソン推定配列の何れかと比較した。得られた複数の高スコアのセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を作製し、ＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質上に翻訳した配列をマッピングした。元のＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質に対して、キメラタンパク質に挿入や欠失が起こり得る。公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を探し出すために、ＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質およびキメラタンパク質の両方をプローブとして用いた。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。完全な遺伝子を含んでいるか得られたストレッチ配列を検査した。
【０３２１】
６　 ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０を組み立てるために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、インサイトＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｎｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＳＨＧＣ）、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＧＲ）及びＧｅｎｅｔｈｏｎなどの公共の情報源から入手できる放射線ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）及び遺伝子マッピングのデータを用いて、クラスター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスターにマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列（特定のＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含む）をそのマッピング位置に割り当てた。
【０３２２】
遺伝子地図の位置は、範囲、区間、またはヒト染色体によって表される。センチモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染色体の短腕（ｐ）の末端から測定した（センチモルガン（ｃＭ）は、同一染色体上の遺伝子間の乗換え率に基づいた距離を表す単位である。平均すると、１ｃＭはヒトの染色体の１メガベースに概ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分があるため、大きく変化し得る）。距離ｃＭは、配列がそれぞれのクラスターに含まれている放射線ハイブリッドマーカーの境界を検出できるＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝子マーカーに基づいている。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの公衆が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３２３】
７　ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０３２４】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなｃＤＮＡデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
【０３２５】
【数１】

として定義される積スコアである。積スコアは、０〜１００の標準化された値であり、以下のように求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除す。高スコアのセグメントの対（ＨＳＰ）において一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより離隔される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、ＢＬＡＳＴアラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合にのみ得られる。積スコア７０は、１００％の同一性で重畳が７０％であるか、或いは８８％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。積スコア５０は、１００％の同一性で重畳が５０％であるか、或いは７９％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。
【０３２６】
或いは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば、ある完全長の配列は、少なくとも部分的にインサイトｃＤＮＡ配列をオーバーラップさせて組み立てられる（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。同様に、各ヒト組織は、癌、細胞系、発生、炎症、神経、外傷、心血管、プール（ｐｏｏｌｅｄ）などの１つの疾患／症状のカテゴリーに分類され、各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。得られるパーセンテージは、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３２７】
８　 ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【０３２８】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【０３２９】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０３３０】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【０３３１】
伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３３２】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３３３】
同様に上述の手順で、完全長のポリヌクレオチド配列を検査したり、或いは完全長のポリヌクレオチド配列を利用して、この伸長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適なゲノムライブラリを用いて５′調節配列を得た。
【０３３４】
９　個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−２０から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐^３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０３３５】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して比較する。
【０３３６】
１０　マイクロアレイ
マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾプリント（インクジェットプリンター、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９）．前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線、または化学的或いは機械的な結合手段で基板の表面にエレメントを配置して結合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正な数のエレメントを含めることができる（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． ａｎｄ Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０３３７】
完全長ｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片やオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片やオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で周知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしなかったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけるハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３３８】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第１鎖緩衝液、０．０３単位／μｌのＲＮアーゼインヒビター、５００μＭ ｄＡＴＰ、５００μＭ ｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＴＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。この逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて、２００ ｎｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを含む２５ ｍｌ容量で行う。特異的なコントロールポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により非コーディング酵母ゲノムＤＮＡから合成する。３７０℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（一方はＣｙ３標識、他方はＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ 水酸化ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを変性する。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプルを、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌ ５×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３３９】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡ挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３４０】
精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定する。顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水での洗浄と、０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライドガラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中の０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０３４１】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを分注する。
【０３４２】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１回洗浄し、蒸留水で３回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）における０．２％カゼイン中で６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートし、その後上述したように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することによってブロックする。
【０３４３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから１．８ｃｍ^２ のカバーガラスで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移す。チャンバーの角に１４０μｌの５×ＳＳＣを加えて、チャンバー内を湿度１００％に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間それぞれ３回洗浄し、その後乾燥させる。
【０３４４】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３を励起するための４８８ｎｍ、及びＣｙ３を励起するための６３２ｎｍのスペクトル線を生成し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御Ｘ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンする。
【０３４５】
２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体１つにつき１回スキャンし、各アレイを通常２回スキャンする。
【０３４６】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比１：１００，０００に相関するようにする。異なる試料（例えば検査細胞及びコントロール細胞を代表する）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズさせる場合には、較正は２つの蛍光体を有する較正するｃＤＮＡのサンプルを標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。
【０３４７】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（ＡＩＤ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示される。データはまた、定量的に分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正される。
【０３４８】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３４９】
１１　相補的ポリヌクレオチド
ＤＭＥをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＤＭＥの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤＭＥのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＤＭＥをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３５０】
１２　 ＤＭＥ の発現
ＤＭＥの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＤＭＥが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＤＭＥを発現する。真核細胞でのＤＭＥの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０３５１】
殆どの発現系では、ＤＭＥが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＤＭＥからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＤＭＥを直接用いて以下の実施例１６、１７、及び１８のアッセイを行うことができる。
【０３５２】
１３　機能のアッセイ
ＤＭＥの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＤＭＥをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０３５３】
遺伝子発現におけるＤＭＥの影響は、ＤＭＥをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。ＤＭＥ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３５４】
１４　 ＤＭＥ に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＤＭＥを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３５５】
別法では、ＤＭＥアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３５６】
通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＤＭＥ活性を検査するには、ペプチドまたはＤＭＥを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３５７】
１５　特異的抗体を用いる天然 ＤＭＥ の精製
天然ＤＭＥ或いは組換えＤＭＥを、ＤＭＥに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＤＭＥ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する。
【０３５８】
ＤＭＥを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＤＭＥを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＤＭＥとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＤＭＥを回収する。
【０３５９】
１６　 ＤＭＥ と相互作用する分子の同定
ＤＭＥまたは生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＤＭＥと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＤＭＥ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＤＭＥ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＤＭＥの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３６０】
別法では、ＤＭＥと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３６１】
ＤＭＥはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３６２】
１７　 ＤＭＥ 活性の実証
ＤＭＥのチトクロームＰ４５０活性を、アニリンの４−ヒドロキシル化を利用して測定する。アニリンは酵素によって４−アミノフェノールに変換され、６３０ｎｍにおいて光吸収率が最大である（ＧｉｂｓｏｎｏおよびＳｋｅｔｔ、前出）。このアッセイは便利な方法であるが、ヒドロキシル化が２位および３位でも起こるため全体のヒドロキシル化が過少評価される。アッセイは３７℃で行い、反応バッファには酵素のアリコットおよび好適な量のアニリン（最大２ｍＭ）が含まれている。バッファは、反応のためにＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰＨ生成補助因子系を含まなければならない。この反応バッファのある調整では、８５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２， ５０ｍＭニコチンアミド、４０ｍｇ ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ、および２単位のイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含め、アッセイの前に８ｍｇ ＮＡＤＰ^＋を１０ｍＬの反応バッファストックに加える。反応は蛍光キュベットで行い、６３０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度の上昇の割合が、アッセイにおける酵素活性に比例する。既知の濃度の４−アミノフェノールを用いて標準的な曲線を作成することができる。
【０３６３】
ＤＭＥの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２４−ヒドロキシラーゼ活性を、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットにおける^３Ｈ標識された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ）の２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）への変換をモニタリングして決定する。エタノール（或いはコントロールとしてエタノールのみ）に溶解した１μｇの１α，２５（ＯＨ）_２Ｄを、ＤＭＥの破壊変異体を発現する若しくはＤＭＥを発現していないという点を除けばコントロールラットと同一のＤＭＥを発現する約６週目のオス遺伝子組換えラットに静脈内投与する。ラットを８時間後に断頭により屠殺し、腎臓を手早く取り除き、洗浄し、９倍量の氷冷バッファ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．４）、０．１９Ｍスクロース、２ｍＭ酢酸マグネシウム、および５ｍＭコハク酸ナトリウム）においてホモジナイズする。次に、各ホモジネートの所定量（例えば３ｍｌ）を、約３．５ＧＢｑ／ｍｍｏｌの特定の活性を有する０．２５ｎＭ １α，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄにおいて、常に振盪しながら酸素存在下、３７℃で、１５分間インキュベートする（Ｂｌｉｇｈ， Ｅ． Ｇ．およびＤｙｅｒ， Ｗ． Ｊ． （１９５９） Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：９１１−９１７）。次にクロロホルム相を、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でｎ−ヘキサン／クロロホルム／メタノール （１０：２．５：１．５） の溶液を含むＦＩＮＥＰＡＫ ＳＩＬカラム （ＪＡＳＣＯ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ） を用いてＨＰＬＣで分析する。別法では、クロロホルム相は、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でアセトニトリルバッファ系（４０〜１００％， 水中で３０分間）でＪ ＳＰＨＥＲＥ ＯＤＳ−ＡＭカラム （ＹＭＣ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ） を用いて逆相ＨＰＬＣで分析する。溶出液を３０秒（或いは３０秒未満）毎に集め、その容量における^３Ｈの存在量をシンチレーションカウンタで測定する。コントロールサンプル（すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤまたは２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）を含むサンプル）のクロマトグラムと反応生成物のクロマトグラムとを比較し、基質（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）および生成物（２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄ）の相対的な移動度を決定し、その値が収集した容量における存在量と相関性を有する。コントロールラットにおいて生成された２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの量を、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットの２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの量から差し引く。遺伝子組換えラットとコントロールラットとの２４，２５（ＯＨ）_２［１−^３Ｈ］Ｄの生成物の差が、そのサンプルに存在するＤＭＥの２５−ヒドラーゼ活性のレベルに比例する。基質および生成物の同定は、質量分光法によって行う（Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４１１５−１４１１９）。
【０３６４】
ＤＭＥのフラビン含有モノオキシゲナーゼ活性を代謝産物のクロマトグラフ分析によって測定する。例えば、Ｒｉｎｇ， Ｂ． Ｊ．他（１９９９ ； Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． ２７：１０９９−１１０３） は、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４または８．３）および１ｍＭ ＮＡＤＰＨにおいてＦＭＯを３７℃でインキュベートし、有機溶剤で反応を停止させ、ＨＰＬＣにより生成物の形成を決定する。別法では、活性はクラーク型電極を用いて炭素の取り込み量をモニタリングして測定する。例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｄ． Ｍ．およびＰｏｕｌｓｅｎ， Ｌ． Ｌ． （１９７８ ； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５２：１４２−１５１） は、基質メチマゾールを含むＮＡＤＰＨ生成補助因子系（上記したものに類似）において３７℃でこの酵素をインキュベートした。酸素の取り込み割合が酵素活性に比例する。
【０３６５】
ＤＭＥのＵＤＰグルコニルトランスフェラーゼ活性を、遊離アミノ基の比色測定を用いて測定する（ＧｉｂｓｏｎおよびＳｋｅｔｔ、前出）。２−アミノフェノールなどのアミン含有基質は、必要な補助因子を含む反応バッファ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０， ７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２， ０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １ｍＭアスコルビン酸， ０．７５ ｍＭ ＵＤＰ−グルクロン酸）において酵素のアリコットと共に３７℃でインキュベートする。十分な時間が経過した後に、０． １Ｍリン酸バッファｐＨ２．７に氷冷した２０％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させ、氷上でインキュベートし、遠心分離器にかけて上澄みを除去する。反応しなかった全ての２−アミノフェノールをこのステップで破壊する。次に、新しく準備した亜硝酸ナトリウムを加え、グルクロン酸抱合体であるジアゾニウム塩が形成されるようにする。過剰な亜硝酸は、十分なスルファミン酸アンモニウムを加えて除去し、ジアゾニウム塩を芳香族アミン（例えば、Ｎ−ナフチルエチレンジアミン）と反応させて、分光光度計でアッセイ可能な（例えば５４０ｎｍにおいて）着色アゾ化合物を生成する。２−アミノフェノールグルクロニドと特性が類似した発色団を形成するアニリンの既知の濃度を用いて標準的な曲線を作成することができる。
【０３６６】
ＤＭＥのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性を、３４０ｎｍにおける最大吸光率を有するモデル基質を用いて測定する。このモデル基質は、グルタチオンと反応して２，４−ジニトロフェニルグルタチオンを生成する２，４−ジニトロ−１−クロロベンゼンなどである。ＧＳＴが様々な基質特異性を有することは重要であり、モデル基質は目的のＧＳＴの基質選択制に基づいて選択しなければならない。アッセイは室温で行われ、酵素のアリコットを好適な反応バッファ（例えば１ｍＭ グルタチオン， １ｍＭ ジニトロクロロベンゼン， ９０ｍＭリン酸カリウムバッファ、ｐＨ６．５）に含める。反応は蛍光キュベットで行い、３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度の上昇の割合がアッセイにおける酵素活性に比例する。
【０３６７】
ＤＭＥのＮ−アシルトランスフェラーゼ活性を、放射標識したアミノ酸基質を用い、抱合体の中に取り込まれた放射標識を測定して決定する。酵素を、無標識のアシル−ＣｏＡ化合物および放射線標識したアミノ酸を含む反応バッファにおいてインキュベートし、放射線標識アシル抱合体をｎ−ブタノールまたはその他の好適な有機溶剤の中に抽出して反応しなかったアミノ酸から分離する。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ．他（１９９０； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３）が、この酵素をコリルＣｏＡ（ｃｈｏｌｙｌ−ＣｏＡ）および^３Ｈグリシンまたは^３Ｈタウリンと共にインキュベートしてトリチウム化コール酸抱合体をｎ−ブタノールの中に抽出し、抽出した生成物の中の放射活性をシンチレーションカウンタで測定して、胆汁酸ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性を決定した。別法では、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性を、分光光度計で後述する還元型ＣｏＡ （ＣｏＡＳＨ）を測定して決定する。
【０３６８】
ＤＭＥのＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を、［^ｌ４Ｃ］アセチルＣｏＡから基質分子への放射標識の転移を利用して測定する（例えば、Ｄｅｇｕｃｈｉ， Ｔ． （１９７５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２４：１０８３−５を参照）。別法では、ＣｏＡＳＨとＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）； エルマン試薬）の反応に基づいた分光光度アッセイが用いられ得る。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの触媒によるアセチル基の基質への転移の間に、遊離チオール含有ＣｏＡＳＨが生成される。ＣｏＡＳＨは、４１２ｎｍにおけるＤＴＮＢ複合体の吸光度を用いて決定される（Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｊ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３０４５−３０５０）。酵素活性は基質の中に取り込まれた放射活性の割合、または分光光度アッセイにおける吸収率の上昇の割合に比例する。
【０３６９】
ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性が、様々な時間間隔で、３７℃で測定される。Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−^３Ｈ］メチオニン（［^３Ｈ］ ＡｄｏＭｅｔ ； 比活性 ｐ＝ ７５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ ； ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、メチルドナー基質として用いられている。有用なメチル受容基質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ核小体蛋白質（ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ）ｇｌｙｃｉｎｅ−アルギニンドメイン融合タンパク質（ＧＳＴ−ＧＡＲ）、非均質核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、またはアデノシンジアルデヒド処置細胞よりライセート中に存在する低メチル化タンパク質を含む。メチル化反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファを添加することで停止される。反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解され、フルオログラフィーで示される。^３Ｈ−ラベルされたメチルドナー基質は、ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を示している（Ｔａｎｇ， Ｊ．ら、 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ ： ７７２３−７７３０ 及び Ｔａｎｇ， Ｊ． ら （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ ： １９８６６−１９８７６）。
【０３７０】
ＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）、１．２ｍＭ ＭｇＣＩ_{２ 、}２００μＭ ＳＡＭ （Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン） ヨウ化物（０．５μＣｉのメチル−［Ｈ^３］ＳＡＭを含む）、１ｍＭジチオスレイトール、および様々な濃度のカテコール基質（例えば、レボドパ、ドーパミン、またはＤＢＡ）から成る最終容量が１．０ｍｌの反応液において測定する。この反応は、精製したＤＭＥまたは未精製のＤＭＥを含むサンプル２５０〜５００μｇを加えて開始し、３７℃で３０分間行った。この反応は、氷上で素早く冷却して停止させ、直後に氷冷ｎ−ヘプタンで抽出する。次に１０分間１０００×ｇで遠心分離した後、液体シンチレーションカウンタで有機抽出物の３ ｍｌのアリコットをその中に含まれている放射活性について分析した。有機相におけるカテコール関連放射活性のレベルがＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性に比例する（Ｚｈｕ， Ｂ． Ｔ． Ｌｉｅｈｒ， Ｊ． Ｇ． （１９９６） ２７１：１３５７−１３６３）。
【０３７１】
ＤＭＥのＤＨＦＲ活性を、３４０ｎｍ （ε_３４０ ＝ １１，８００ Ｍ^−１・ｃｍ^−１）においてＮＡＤＰＨの消滅の後に１５℃で分光光度法で測定する。標準的なアッセイ混合液は、１００μＭ ＮＡＤＰＨ、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ＭＴＥＮ バッファ（５０ｍＭ ２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、２５ ｍＭ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ、２５ｍＭエタノールアミン、および１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を含み最終容量を２．０ｍｌとする。反応は５０μｍのジヒドロ葉酸（基質として）を追加して開始させる。反応液におけるＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ^＋への酸化がジヒドロ葉酸の還元に一致し、サンプルにおけるＤＨＦＲ活性の量に比例する（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｔ．およびＩｗａｋｕｒａ， Ｍ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９０４１−１９０４７）。
【０３７２】
ＤＭＥのアルド／ケト還元酵素活性を、ＮＡＤＰＨが消費される時の３４０ｎｍにおける吸光率の低下を測定する。標準的な反応混合液は、１３５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（酵素によりｐＨ６．２〜７．２の範囲）、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３Ｍ硫酸リチウム、０．５〜２．５μｇ酵素、および好適なレベルの基質を含む。この混合液を３０℃でインキュベートし、反応を分光光度計で連続的に測定する。酵素活性は、酵素１μｇ当たり消費されるＮＡＤＰＨのモル数として計算される。
【０３７３】
ＤＭＥのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、ＮＡＤ^＋がＮＡＤＨに還元される時の３４０ｎｍにおける吸光率の増大を利用して測定する。標準的な反応混合液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡである。反応液を２５℃でインキュベートし、分光光度計でモニタリングする。酵素活性は、酵素１μｇ当たり生成されたＮＡＤＨのモル数として計算する。
【０３７４】
ＤＭＥのカルボキシルエステラーゼ活性を、基質として４−酢酸メチルウンベルフェリル（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて測定する。酵素反応は、約１０μｌのＤＭＥ含有サンプルを、０．５ｍＭ ４−酢酸メチルウンベルフェリルを含む１ｍｌの反応バッファ（９０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４， ４０ｍＭ ＫＣ１， ｐＨ７．３）に加えて開始させる。４−メチルウンベルフェロンの生成を分光光度計（ε_３５０ ＝ １２．２ｍＭ^−１・ｃｍ^−１）で１分３０秒モニタリングする。酵素活性は、１分間に１ｍｇのタンパク質で生成され生成物のμモルとして表すことができ、サンプルにおけるＤＭＥ活性に非例する（Ｅｖｇｅｎｉａ， Ｖ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４７６９−１４７７５）。
【０３７５】
別法では、ＤＭＥのコカインベンゾイルエステルヒドロラーゼ（ｃｏｃａｉｎｅ ｂｅｎｚｏｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性を、約０．１ｍｌの酵素および３．３ ｍＭ コカインを、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む反応バッファ（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４， ｐＨ７．４）で３７℃でインキュベートして測定する。全量で０．４ｍｌの反応液を１時間インキュベートし、等量の５％トリクロロ酢酸で終了させる。０．１ｍｌの内部標準３，４−ジメチル安息香酸（１０μｇ／ｍｌ）を加える。沈降したタンパク質を１０分間１２，０００×ｇで遠心分離して分離する。上澄みを新しいチューブに移して、０．４ｍｌの塩化メチレンで２回抽出する。２つの抽出物を混ぜ、窒素を流して乾燥させる。この残滓を、１００ ｍｌ当たり８μ１のジエチルアミンを含む１４％アセトニトリル、２５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_{４ 、}ｐＨ４．０に再懸濁してから、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム上に注入して分離する。このカラム溶出液を２３５ｎｍでモニタリングする。ＤＭＥ活性は、内部標準に対する分析物のピーク面積の割合を比較して定量する。標準曲線は、トリクロロ酢酸処理タンパク質基質内に準備した安息香酸標準で作成する（Ｅｖｇｅｎｉａ， Ｖ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４７６９−１４７７５）。
【０３７６】
別法では、水溶性基質であるパラニトロフェニル酪酸に対するＤＭＥカルボキシルエステラーゼ活性を、当分野で周知の分光光度法によって測定する。この方法では、ＤＭＥ含有サンプルを、６ ｍＭタウロコール酸塩の存在下で０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４または８．０）または酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で希釈する。このアッセイは、新たに準備したパラニトロフェニル酪酸溶液（酢酸ナトリウムに１００μｇ／ｍｌ， ｐＨ５．０）を加えて開始する。次にカルボキシルエステラーゼ活性をモニタリングし、４０５ｎｍにセットした分光光度計で基質のコントロール自己加水分解と比較する（Ｗａｎ， Ｌ．他（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１００４１−１００４６）。
【０３７７】
ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性を、［^３５Ｓ］ＰＡＰＳからフェノールなどのモデル基質内への^３５Ｓの取り込みを用いて測定する（Ｆｏｌｄｓ， Ａ．およびＭｅｅｋ， Ｊ． Ｌ． （１９７３） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２７：３６５−３７４）。酵素のアリコットを１ｍＬの１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ６．４、５０μＭフェノール、および０．４〜４．０μＭ［^３５Ｓ］ＰＡＰＳで３７℃でインキュベートする。放射標識の５〜２０％が基質に転移するのに十分な時間が経過した後、０．２ｍＬの０．１Ｍ酢酸バリウムを加えタンパク質およびリン酸バッファを沈降させる。次に０．２ｍＬの０．１Ｍ Ｂａ（ＯＨ）_２を加え、その後に０．２ｍＬのＺｎＳＯ_４を加える。円心分離して上澄みをはっきりさせ、タンパク質および未反応の［^３５Ｓ］ＰＡＰＳを除去する。上澄みの放射活性をシンチレーションカウンタで測定する。酵素活性は、反応生成物における放射活性のモル数から決定する。
【０３７８】
ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性を、ＤＭＥを含むサンプルを、２．５μｍｏｌイミダゾールＨＣ１ （ｐＨ６．８）、３．７５μｇの塩化プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２５ｎｍｏｌの完全に脱硫酸化されＮ−再硫酸化されたヘパリン（ヘキソサミンとして）、および５０ｐｍｏｌ （約 ５×１０^５ｃｐｍ）の［^３５Ｓ］ アデノシン３’−リン酸５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）と共に最終反応容量５０μｌで３７℃で２０分間インキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。この反応は、熱湯に反応チューブを１分間浸漬して停止させる。０．１μｍｏｌのコンドロイチン硫酸Ａ（グルクロン酸として）を、キャリアとして反応混合液に加える。^３５Ｓ標識ポリ多糖を、１．３％酢酸カリウムを含む冷却した三倍量のエタノールで沈殿させ、脱塩カラムを用いてゲルクロマトグラフフィによって取り込まれなかった［^３５Ｓ］ＰＡＰＳおよびその分解生成物から完全に分離する。一単位の酵素活性を１分間に１ｐｍｏｌの硫酸を移送するのに必要な量と定義し、沈殿した多糖の中に取り込まれた［^３５Ｓ］ＰＡＰＳの量によって測定する（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ．． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０３７９】
別法では、ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した後、ゲルから酵素を抽出して再生し測定する。分離した後、ゲルをバッファ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０）で洗浄し、３〜５ｍｍのセグメントに切断し、０．１５Ｍ ＮａＣＩを含む同じバッファを１００μｌで４℃で４８時間撹拌する。溶出した酵素を遠心分離して収集し、上記したように、スルホトランスフェラーゼ活性についてアッセイする（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０３８０】
別法では、ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性を、［^３５Ｓ］ＰＡＰＳから固定されたペプチドへの［^３５Ｓ］硫酸の転移を測定して決定する。この固定されたペプチドは、Ｃ末端システイン残基が付加された成熟Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドのＮ末端の１５残基である。このペプチドは３つの潜在的なチロシン硫酸化部位に渡っている。このペプチドは、システイン残基によってヨードアセトアミド活性化樹脂に結合される（１ｍｌの樹脂あたり１．５〜３．０μｍｏｌペプチドの密度）。この酵素アッセイは、１４０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ （ｐＨ６．８）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ_{２ 、}５０ｍＭ ＮａＦ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭ ５’−ＡＭＰを含む最終容量１３０μｌにおいて１０μｌのペプチド誘導体ビーズと２〜２０μｌのＤＭＥ含有サンプルを結合させて行った。このアッセイは、０．５μＣｉの［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１．７μＭ； １Ｃｉ ＝ ３７ＧＢｑ）を加えて開始させた。３７℃で３０分経過した後に、反応ビーズを６５℃で６Ｍグアニジンで洗浄し、ビーズに取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンタで測定する。ビーズ結合ペプチドに移送された［^３５Ｓ］硫酸を測定し、サンプルにおけるＤＭＥ活性を決定する。１単位の活性は１分間に１ｐｍｏｌの生成物が生成されると定義する（Ｏｕｙａｎｇ， Ｙ−Ｂ．他 （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９５：２８９６−２９０１）。
【０３８１】
別法では、ＤＭＥスルホトランスフェラーゼのアッセイを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ （ｐＨ７．０）、２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭジチオスレイトール、１４μＭ［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、およびドーパミン（２５μＭ），ρ−ニトロフェノール（５μＭ）またはその他の候補基質を含む最終容量３０μｌにおいて硫酸供与体として［^３５Ｓ］ＰＡＰＳを用いて行った。アッセイの反応は、精製されたＤＭＥ酵素試薬或いはＤＭＥ活性を含むサンプルを加えて開始させ、その反応を３７℃で１５分間続け、１００℃で３分間加熱して停止させる。生成された沈降物を遠心分離によって除去する。次に^３５Ｓ硫酸化物を調べるために、上澄みを薄膜クロマトグラフィ或いは二次元薄膜分離方法のいずれかによって分析する。^３５Ｓ硫酸化物の同定ができるように好適な標準を上澄みと平行に流し、反応性生物の移動の相対速度に基づいてＤＭＥ含有サンプルの酵素特異性を決定する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｙ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：６２４２−６２４７）。
【０３８２】
ＤＭＥのスクアレンエポキシラーゼ活性を、精製したＤＭＥ （またはＤＭＥを含む未精製の混合液）， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、０．０１ｍＭ ＦＡＤ、０．２単位のＮＡＤＰＨ−チトクロームＣ （Ｐ−４５０）レダクターゼ、０．０１ ｍＭ［^ｌ４Ｃ］スクアレン（２０μｌのＴｗｅｅｎ ８０を用いて拡散された）、および０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む混合液においてアッセイする。１ｍＭ ＮＡＤＰＨを加えて反応を開始させ、３７℃で３０分間インキュベートする。非けん化脂質を、酢酸エチル／ベンゼン（０．５：９９．５， ｖ／ｖ）で作製したシリカゲルＴＬＣによって分析する。反応生成物を、ＤＭＥを含まない反応混合液による反応生成物と比較する。２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンの存在を、好適な脂質標準を用いて確認する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ．他（１９９５） ２７０：１７−２０）。
【０３８３】
ＤＭＥのエポキシドヒドロラーゼ活性を、エーテル抽出物のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析を用いて基質を除去した後、或いはアセトンで失活させた反応混合液をＧＣ分析により基質を除去してジオールを生成した後に測定する。ＤＭＥを含むサンプルまたはエポキシドヒドロラーゼコントロールサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、および５ｍＭ エポキシド基質（例えば、エチレンオキシド、スチレンオキシド、プロピレンオキシド、ｉｓｏｐｒｅｎｅ ｍｏｎｏｘｉｄｅ、エピクロロヒドリン、ｅｐｉｂｒｏｍｏｈｙｄｒｉｎ、ｅｐｉｆｌｕｏｒｏｈｙｄｒｉｎ、グリシドール、１，２−ｅｐｏｘｙｂｕｔａｎｅ、１，２−ｅｐｏｘｙｈｅｘａｎｅ、または１，２−ｅｐｏｘｙｏｃｔａｎｅ）でインキュベートする。様々な時点でサンプルの一部を反応混合液から取り出して、内部標準を含む１ｍｌの氷冷アセトンに加えてＧＣ分析を行う（例えば、１−ノナノール）。タンパク質および塩を遠心分離（１５分、４０００×ｇ）によって除去し、抽出物を０．２ｍｍ×２５ｍ ＣＰ−Ｗａｘ５７−ＣＢカラム（ＣＨＲＯＭＰＡＣＫ， Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および水素炎イオン化検出器を用いてＧＣにより分析する。ＧＣ産物の同定は、当分野で周知の好適な標準およびコントロールを用いて行う。１単位のＤＭＥ活性は、１分間に１μｍｏｌのジオール生成を触媒する酵素の量と定義する（Ｒｉｎｋ， Ｒ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７）。
【０３８４】
ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性は、ＤＭＥを含むサンプルを、１ｍＭ Ｌ−キヌレニンおよび１ｍＭ ２−オキソグルタル酸の存在下で、最終容量２００μｌの７０μＭ ＰＬＰを含む１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ 酢酸バッファ（ｐＨ８．０）で３７℃で１時間インキュベートしてアッセイする。キヌレニン酸の生成は、当分野で周知の好適な標準およびコントロールを用いて３３０ｎｍで分光光度検出によりＨＰＬＣで定量する。別法では、Ｌ−３−ヒドロキシキヌレニンを基質として用い、キサンツレン酸の生成を３４０ｎｍでのＵＶ検出で生成物のＨＰＬＣ分析により測定する。キヌレニン酸およびキサンツレン酸の生成はそれぞれ、アミノトランスフェラーゼ活性を示す（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【０３８５】
別法では、ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、酵素結合補助因子であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）のＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルにおける変化をモニタリングして、一回のターンオーバーの条件下で精製したＤＭＥのサンプル或いはＤＭＥを含む未精製のサンプルの様々なアミノ酸およびオキソ酸基質に対する活性をして決定して行う。この反応は、９μＭ 精製ＤＭＥ またはサンプル含有ＤＭＥおよび検査する基質（アミノ酸およびオキソ酸基質）を含む５０ｍＭ４−メチルモルフォリン（ｐＨ７．５）において２５℃で行う。アミノ酸からオキソ酸への半反応の後に、酵素結合ＰＬＰのピリドキサミン５’リン酸（ＰＭＰ）への変換により生じる３６０ｎｍにおける吸収率の低下および３３０ｎｍにおける吸収率の増加を測定する。ＤＭＥの特異性および相対的な活性を、特定の基質に対する酵素活性によって測定する（Ｖａｃｃａ， Ｒ． Ａ．他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２１９３２−２１９３７）
ＤＭＥのスーパーオキシドジスムターゼ活性を、細胞ペレット、培養した上澄み、または精製したタンパク質試薬からアッセイする。サンプルすなわち溶解物を１５％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動法によって分離する。このゲルを、２．５ｍＭニトロブルーテトラゾリウムにおいて３０分間インキュベートし、その後３０ｍＭリン酸カリウム、３０ｍＭ ＴＥＭＥＤ、および３０μＭリボフラビン（ｐＨ７．８）において２０分間インキュベートする。スーパーオキシドジスムターゼ活性は、背景のブルーに対して白いバンドとして見ることができ、ライトボックスでゲルに照明を当てる。スーパーオキシドジスムターゼ活性の定量は、好適なスーパーオキシドジスムターゼのポジティブおよびネガティブコントロール（例えば、様々な量の市販されている大腸菌スーパーオキシドジスムターゼなど）を用いて活性ゲルの比重走査により行う（Ｈａｒｔｈ， Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４２８１−４２９２）。
【０３８６】
１８　 ＤＭＥ インヒビターの同定
検査する化合物を、実施例１７のアッセイで記載したように、好適なバッファおよび基質と共に様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに入れる。ＤＭＥ活性をそれぞれのウェルについて測定し、それぞれの化合物のＤＭＥ活性を阻害する能力を決定して用量反応曲線を作成する。このアッセイを用いてＤＭＥ活性を促進する分子を同定することが可能であろう。
【０３８７】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【０３８８】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に対する系統的な名称を示す。
【０３８９】
表２は、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋの相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号およびアノテーションを示す。ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋの相同体との間の一致を表す確率値スコアも示す。
【０３９０】
表３は、推定上のモチーフおよびドメインを含む本発明のポリペプチド配列の構造的な特徴、並びに本発明のポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム、および検索可能なデータベースを示す。
【０３９１】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたｃＤＮＡ断片およびゲノムＤＮＡ断片のリスト、並びに本発明のポリヌクレオチド配列の選択された断片のリストを示す。
【０３９２】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３９３】
表６は、表５に示すｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを示す付録である。
【０３９４】
表７は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメータを示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to a nucleic acid sequence and an amino acid sequence of a drug metabolizing enzyme. The present invention also relates to the use of these sequences for the diagnosis, treatment and prevention of gastrointestinal diseases, including autoimmune / inflammatory diseases, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, ocular disorders, metabolic disorders, and liver disorders. About using it. The invention further relates to the evaluation of the effects of foreign compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of drug metabolizing enzymes.
[0002]
(Background of the Invention)
The metabolism of a drug and the movement of the drug through the body (pharmacokinetics) are important in determining its efficacy, toxicity, and interaction with other drugs. Three processes govern pharmacokinetics: drug absorption, drug distribution to various tissues, and elimination of drug metabolites. These processes are closely related to drug metabolism because various metabolic controls alter most of the physicochemical and pharmaceutical properties of drugs, including solubility, binding to receptors, and rate of excretion . Drug-altering metabolic pathways also accept various natural substrates such as steroids, fatty acids, prostaglandins, leukotrienes, and vitamins. Thus, enzymes in these pathways are important sites for biochemical and pharmacological interactions between natural compounds, drugs, carcinogens, mutagens, and xenobiotics.
[0003]
It has long been known that genetic differences in drug metabolism cause significant differences in drug efficacy and toxicity levels between individuals. Such a gene polymorphism is extremely important for a drug having a narrow therapeutic index or a drug requiring bioactivity such as codeine. Furthermore, promising new drugs are often excluded in clinical trials from the toxicity of causing side effects only in some groups of patients. Advances in pharmacogenomics research, where drug metabolizing enzymes are an important part, will develop tools that can withstand the efficacy and toxicity questions of drugs and expand such information (Evans, W.E. And R. V. Relling (1999) Science 286: 487-492).
[0004]
Drug metabolism reactions are classified into Phase I and Phase II, in which the drug molecule functions and prepares for further metabolism, which are continuous. In general, the reaction products of Phase I are partially or completely inert and the reaction products of Phase II are mainly excreted species. However, the phase I reaction product may be more active than the parent drug administered, and this principle of metabolic activity is utilized as a prodrug (eg, levodopa). In addition, certain toxic compounds (eg, aflatoxins, benzo-a-pyrene) are metabolized via these pathways to toxic intermediates. Phase I reactions are usually the rate-limiting step in drug metabolism. Prior exposure to the compound or compounds can cause expression of the phase I enzyme, thereby increasing the influx of substrate through this metabolic pathway (Klaassen, CD, Amdur, MO). And J. Doull (1996)Casalett and Doull's Toxicology : The Basic Science of Poisons, McGraw-Hill, New York, NY, pp. 113-186; G. FIG. Katzung (1995)Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT, pp. 147-64. 48-59; G. FIG. Gibson and P.M. Skett (1994)Introduction to Drug Metabolism, Blackie Academic and Professional, London).
[0005]
Drug metabolizing enzymes (DMEs) have a wide range of substrate properties. This is in contrast to the immune system, where a wide variety of antibodies have high specificity for their antigen. The ability of DME to metabolize various molecules creates potential drug interactions at certain metabolic levels. For example, induction of one compound's DME can cause the enzyme to metabolize another compound.
[0006]
DMEs can be classified according to the type of reaction they catalyze and the cofactors involved. The main classes of Phase I enzymes include, but are not limited to, cytochrome P450 and flavin-containing monooxygenase. Classes of phase I catalytic cycle and other enzymes involved in the reaction include, but are not limited to, NADPH cytochrome P450 reductase (CPR), microsomal cytochrome b5 / NADH cytochrome b5 reductase system, ferredoxin / ferredoxin reductase redox pair. , Aldo / keto reductase, and alcohol dehydrogenase. The main classes of Phase II enzymes include, but are not limited to, UDP glucuronyltransferase, sulfotransferase, glutathione S-transferase, N-acyltransferase, and N-acetyltransferase.
[0007]
Cytochrome P450 and P450 Catalytic cycle related enzymes
Members of the superfamily of enzymes cytochrome P450 catalyze the oxidative metabolism of various substrates. Such substrates include natural compounds such as steroids, fatty acids, prostaglandins, leukotrienes, and vitamins, as well as drugs, carcinogens, mutagens, and xenobiotics. Cytochrome P450, also known as P450 heme-thiolate protein, usually acts as a terminal oxidase in a multi-component electron transport chain called the P450-containing monooxygenase system. Specific reactions catalyzed include hydroxylation, epoxidation, N-oxidation, sulfoxidation, N-dealkylation, S-dealkylation, and O-dealkylation, desulfation, deamination, and azo, nitro, And reduction of the N-oxide group. These reactions are associated with steroid production of glucocorticoids, cortisol, estrogens and androgens in animals, insecticide resistance in insects, herbicide resistance in plants and flower coloration, and microbial bioremediation by microorganisms. Cytochrome P450 can act on drugs, carcinogens, mutagens, and xenobiotics, causing the substance to be detoxified or converted to more toxic products. Cytochrome P450 is abundant in the liver, but is also present in other tissues, and its enzyme is present in microsomes (ExPASY ENZYME EC 1.1 14.14.1; EP450I E-Class P450 Group I signature; Graham-Lorence, S. and Peterson, JA (1996) FASEB J. 10: 206-214).
[0008]
400 cytochrome P450s have been identified in various organisms, including bacteria, fungi, plants, and animals (Graham-Lorence, supra). Class B is found in prokaryotes and fungi, and Class E is found in bacteria, plants, insects, vertebrates, and mammals. Five subclasses or groups are included in the large family of E-class cytochrome P450s (PRINTS EP450IE E-Class P450 Group I signature).
[0009]
All cytochrome P450s use heme cofactors and share structural properties. Most cytochrome P450s are 400-530 amino acids long. The secondary structure of the enzyme is about 70% alpha helix and about 22% beta sheet. The region around the heme binding site at the C-terminus of the protein is conserved in all cytochrome P450s. A signature sequence of 10 amino acids in the heme-iron binding region has been identified, including a conserved cysteine involved in heme-iron binding at the fifth coordination site. In eukaryotic cytochrome P450, the transmembrane region is usually found in the first 15-20 amino acids of the protein and usually consists of about 15 hydrophobic residues followed by positively charged residues (before Prosite PDOC00081). See; Graham-Lorence, supra).
[0010]
Cytochrome P450 enzymes are involved in cell growth and development. This enzyme plays a role in chemical mutagenesis and carcinogenesis caused by metabolizing chemicals into reactive intermediates that form adducts with DNA (Nebert, D.W. and Gonzalez, FJ). (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 945-993). These adducts can cause nucleotide alterations and DNA rearrangements that cause carcinogenesis. Cytochrome P450 expression in liver and other tissues is caused by xenobiotics such as polycyclic aromatic hydrocarbons, peroxisome proliferators, phenobarbital, and glucocorticoid dexamethasone (Dogra, SC et al. (1998)). Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 25: 1-9). The cytochrome P450 protein can be involved in eye development such that mutations in the P450 gene CYP1B1 cause primary congenital glaucoma (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) * 601177 Cytochrome P450, subfamilidid-id (id) ), Polypeptide 1; CYP1B 1).
[0011]
Cytochrome P450 is involved in inflammation and infection. Liver cytochrome P450 activity is significantly increased or decreased by various infectious and inflammatory stimuli (Morgan, ET (1997) Drug Metab. Rev. 29: 1129-1188).in VivoCan be mimicked by pro-inflammatory cytokines and interferons. Autoantibodies to two cytochrome P450 proteins have been found in patients with autoimmune polyglandular endocrine deficiency type I (APECED), a polyglandular autoimmune syndrome (OMIM * 240300 Autoimmune polycrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy).
[0012]
Mutations in cytochrome P450 are characterized by adrenocortical hyperplasia, pseudovitamin D-deficient rickets, cerebrotendinous xanthomatosis, and progressive neuropathy that are most common in adrenal insufficiency in infancy and infancy Associated with metabolic disorders, including lipid storage disease, premature atherosclerosis, cataract, and hereditary resistance to the anticoagulants coumarin and warfarin (Isselbacher, KJ et al. (1994)).Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc. New York, NY, pp. 1968-1970; Takeyama, K .; (1997) Science 277: 1827-1830; Kitanaka, S. et al. Et al. Engl. J. Med. 338: 653-661; OMIM * 213700 Cerebrotendinous xanthomatosis; and OMIM # 122700 Coomarin resistance). Extremely high expression levels of cytochrome P450 protein aromatase were found in fibrolamellar hepatocellular carcinoma in boys with severe gynecomastia (feminization) (Agarwal, VR (1998) J. Clin. Endocrinol. Metab. 83: 1797-1800).
[0013]
The cytochrome P450 catalytic cycle is completed by reduction of cytochrome P450 by NADPH cytochrome P450 reductase (CPR). Another microsomal electron transport system consisting of cytochrome b5 and NADPH cytochrome b5 reductase is widely seen as a small donor of electrons to the cytochrome P450 catalytic cycle. However, Lamb, D.A. C. (1999; FEBS Lett. 462: 283-8) show that it can be effectively reduced and supported by the microsomal cytochrome b5 / NADPH cytochrome b5 reductase system.Candida albicansCytochrome P450 (CYP51) was confirmed. Thus, it is likely that there are many cytochrome P450s supported by this alternative electron donating system.
[0014]
Cytochrome b5 reductase also reduces oxidized hemoglobin (methemoglobin that cannot retain oxygen) in red blood cells to activated hemoglobin. The presence of high levels of oxidizing agents, or abnormal hemoglobin that is not sufficiently reduced (hemoglobin M), causes methemoglobinemia. Methemoglobinemia can also result from a congenital deficiency of erythrocyte cytochrome b5 reductase (see Mansour, A. and Lurie, AA (1993) Am. J. Hematol. 42: 7-12). .
[0015]
Members of the cytochrome P450 family are also closely involved in vitamin D synthesis and catabolism. Vitamin D exists as two biologically equivalent prohormones to ergocalciferol (vitamin D2) produced in plant tissues and cholecalciferol (vitamin D3) produced in animal tissues. The latter cholecalciferol is formed when 7-dehydrocholesterol is exposed to near-ultraviolet radiation (eg, 290-310 nm). It is usually produced when the skin is briefly exposed to sunlight (see Miller, WL and Portale, A.A. (2000) Trends in Endocrinology and Metabolism 11: 315-319).
[0016]
Both hormone types are further metabolized in the liver by the enzyme 25-hydroxylase to 25-hydroxyvitamin D (25 (OH) D). 25 (OH) D is the most abundant precursor of vitamin D and is further activated by the enzyme 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase (1α-hydroxylase) to form the active form of 1α, 25-dihydroxyvitamin D (1α, 25 (OH)₂D) is metabolized in the kidney. 1α, 25 (OH)₂Regulation of D production is mainly performed in the last step of the synthesis route. The 1α-hydroxylase activity is determined by the enzyme product (1α, 25 (OH)₂It depends on the circulating levels of D) and several physiological factors including the levels of parathyroid hormone (PTH), calcitonin, insulin, calcium, phosphorus, growth factors and prolactin. In addition, extrarenal 1α-hydroxylase activity has been reported, and tissue-specific and local lα, 25 (OH)₂It is believed that regulation of D production is biologically important. lα, 25 (OH)₂D, 24,25-dihydroxyvitamin D (24,25 (OH)₂Catalysis to D) also occurs in the kidney with the enzyme 25-hydroxyvitamin D24-hydroxylase (24-hydroxylase). 24-hydroxylase can also utilize 25 (OH) D as a substrate (Shinki, T. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12920-12925; Miller). , WL, and Portal, A.A., supra.).
[0017]
Vitamin D25-hydroxylase, lα-hydroxylase, and 24-hydroxylase are all NADPH-dependent type I (mitochondrial) cytochrome P450 enzymes with high homology to other members of the family. Vitamin D25-hydroxylase also has broad substrate specificity, performing 26-hydroxylation of bile acid intermediates and 25-, 26-, and 27-hydroxylation of cholesterol (Dilworth, F .; J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16766-16774; Miller, WL and Portal, AA, supra).
[0018]
Active form of vitamin D (lα, 25 (OH)₂D) is involved in calcium and phosphate homeostasis and promotes differentiation of bone marrow cells and skin cells. Vitamin D deficiency caused by the deficiency of enzymes involved in the metabolism of vitamin D (eg, 1α-hydroxylase) can cause hypocalcemia, hypophosphatemia, vitamin D-dependent (susceptible) rickets, Causes a disease exhibiting symptoms of varus knees and O-legs with decline and duck walking. Deficiency of vitamin D25-hydroxylase causes cerebrotendinous xanthomatosis and lipid storage diseases characterized by the accumulation of cholesterol and cholestanol in the Achilles tendon, brain, lungs, and many other tissues. The disease represents progressive neuropathy, including post-pubertal cerebellar ataxia, atherosclerosis, and cataracts. The lack of vitamin D25-hydroxylase deficiency does not cause rickets, suggesting that another pathway for 25 (OH) D synthesis exists (Griffin, JE and Zerwekh, JE). (1983) J. Clin. Invest. 72: 1190-1199; Gamblin, GT et al. (1985) J. Clin. Invest. 75: 954-960; and WL and Portal, A.A. Supra).
[0019]
Ferredoxin and ferredoxin reductase are electron transport accessory proteins that support at least one human cytochrome P450 species, cytochrome P450c27 encoded by the CYP27 gene (Dilworth, FJ et al. (1996) Biochem. J. 320: 267). -71). CYP104D1, a Streptomyces-Glyceus cytochrome P450, is co-expressed in E. coli and is reduced by endogenous ferredoxin and ferredoxin reductase enzymes (Taylor, M. et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 263). : 838-42). This suggests that many cytochrome P450 species are supported by the ferredoxin / ferredoxin reductase pair. Ferredoxin reductase is also found in model drug metabolism systems and is known to reduce the antitumor antibiotic actinomycin D to reactive free radical species (Flitter, WD and Mason, R., et al. P. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 267: 632-9).
[0020]
Flavin-containing monooxygenase ( FMO )
Flavin-containing monooxygenases oxidize nucleophilic nitrogen, sulfur, and phosphorus heteroatoms outside the normal range of substrates. Like cytochrome P450, FMO is a microsomal enzyme, NADPH and O₂And its substrate overlaps extensively with that of cytochrome P450. FMO is distributed in tissues such as liver, kidney, and lung.
[0021]
Five different tissue specific expressed isoforms of FMO (FM01, FM02, FM03, FM04, and FM05) are found in mammals. These isoforms differ in tissue specificity, as well as other properties, such as inhibition by various compounds and stereospecificity of the reaction. FMO has a 13 amino acid signature sequence whose components span the N-terminal two-thirds of the sequence and include the FATGY motif and the FAD binding region found in many N-hydroxylase enzymes (Stehr, M. et al. (1998) Trends Biochem. Sci. 23: 56-57; PRINTS FMXYGENASE Flavin-containing monooxygenase signature.
[0022]
Specific reactions include oxidation of nucleophilic tertiary amines to N-oxides, oxidation of secondary amines to hydroxylamines and nitrones, oxidation of primary amines to hydroxylamines and oximes, and of sulfur-containing compounds and phosphines. Includes oxidation to S-oxide and P-oxide. Hydrazine, iodide, selenide, and boron-containing compounds are also substrates. Although FMO is chemically similar to cytochrome P450, FMO is based on its thermal instability and nonionic detergent sensitivity of cytochrome P450.in in vitroCan usually be distinguished from the cytochrome P450. However, the use of these properties for discrimination is complex due to differences in thermal stability and surfactant sensitivity among the FMO isoforms.
[0023]
FMO plays an important role in the metabolism of some drugs and xenobiotics. FMO (pulmonary FMO3) plays a major role in the metabolism of (S) nicotine excreted in urine to (S) nicotine N-1'-oxide. FMO is also widely used in the treatment of gastric ulcer H₂-Is involved in the S-oxygenation of the antagonist cimetidine. The lung phenotype of FMO is not under the same regulatory control as cytochrome P450. For example, in rats, phenobarbital treatment produces cytochrome P450, but FMO1 is suppressed.
[0024]
Endogenous substrates for FMO include cysteamine, which is oxidized to disulfide, and trimethylamine (TMA), which is metabolized to trimethylamine N-oxide. TMA smells like rotten fish, and mutations in the FM03 isoform cause large amounts of the foul-smelling free amines to be excreted from sweat, urine, and exhaled breath. Such a phenomenon causes a fishy odor syndrome (OMIM 602079 Trimethylaminouria).
[0025]
Lysyl oxidase
Lysyl oxidase (lysine 6-oxidase LO) is a copper-dependent amine oxidase involved in the formation of a connective tissue matrix by cross-linking collagen and elastin. LO is secreted as an approximately 50 kDa N-glycosylated precursor protein, which is also active, but is cleaved by the metalloprotease into the mature form of the enzyme. The copper atom of the LO is involved in transferring electrons to oxygen and vice versa, and promotes the oxidative deamination of lysine residues in these extracellular matrix proteins. Copper coordination is essential for LO activity, but apoenzyme expression is unaffected even if the diet does not ingest copper. However, the absence of functional LO is associated with diseases of the skeletal and vascular tissues associated with dietary copper deficiency. LO is also inhibited by various semicarbazides, hydrazine, and amino nitrite, and heparin. β-aminopropiononitrile is commonly used as an inhibitor. LO activity increases in response to elevated levels of hormones released in response to ozone, cadmium, and local tissue trauma. Such hormones include transforming growth factor-β, platelet-derived growth factor, angiotensin II, fibroblast growth factor, and the like. Abnormalities in LO activity are associated with Menkes syndrome and occipital horn syndrome. Cytosolic enzymes are associated with abnormal cell growth (Rucker, RB et al. (1998) Am. J. Clin. Nutr. 67: 996S-1002S and Smith-Mungo. L.I. and Kagan, H. M. (1998) Matrix Biol. 16: 387-398).
[0026]
Dihydrofolate reductase
Dihydrofolate reductase (DHFR) is a ubiquitous enzyme that catalyzes the NADPH-dependent reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate. This reaction is a key step in the de novo synthesis of glycine and purines and the conversion of deoxyuridine monophosphate (dUMP) to deoxythymidine monophosphate (dTMP). The basic reaction is 7,8-dihydrofolate + NADPH → 5,6,7,8-tetrahydrofolate + NADP⁺It is. This enzyme can be inhibited by various dihydrofolate analogs, including trimethroprim and methotrexate. Rapid cell division requires DHFR activity because abundant TMP is required for DNA synthesis. Replication of DNA viruses (eg, herpes virus) also requires high levels of DHFR activity. Therefore, agents that target DHFR have been used in cancer chemotherapy to suppress DNA virus replication (for similar reasons, thymidylate synthase is the target enzyme). An agent that inhibits DHFR is preferably cytotoxic to rapidly dividing cells (or cells infected with a DNA virus) but has no specificity and indiscriminately destroys dividing cells. Furthermore, cancer cells can become resistant to drugs such as methotrexate as a result of acquired transport disorders or replication of one or more DHFR genes (Stryer, L (1988) Biochemistry. WH). Freeman and Co., Inc. New York. Pp. 511-5819).
[0027]
Aldo / keto reductase
Aldo / keto reductase is a monomeric NADPH-dependent oxidoreductase with broad substrate specificity (Bohren, KM, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 9547-51). These enzymes catalyze the reduction of carbonyl-containing compounds, including carbonyl-containing sugars and aromatics, to the corresponding alcohols. Thus, various carbonyl-containing drugs and xenobiotics are likely to be metabolized by this class of enzymes.
[0028]
One known reaction catalyzed by the family member aldose reductase is that glucose is reduced to sorbitol and further metabolized to fructose by sorbitol dehydrogenase. Under normal conditions, the reduction of glucose to sorbitol is not the main route. However, in hyperglycemic conditions, sorbitol accumulation is associated with the development of diabetic complications (OMIM * 103880 Aldo-keto reductase family 1, member B1). Members of this family of enzymes are also highly expressed in certain liver cancers (Cao, D. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 11429-35).
[0029]
Alcohol dehydrogenase
Alcohol dehydrogenase (ADH) oxidizes simple alcohols to the corresponding aldehyde. ADH is a cytosolic enzyme that prefers the cofactor NAD + and binds zinc ions. ADH levels are highest in the liver and low in kidney, lung, and gastric mucosa.
[0030]
The known ADH isoform is a dimeric protein consisting of a 40 kDa subunit. There are five known loci encoding these subunits (a, b, g, p, c), some of which are characteristic allelic variants (b1, b2, b3, g1,. g2). Subunits can form homodimers and heterodimers, and the composition of the subunits determines the specific properties of the active enzyme. Thus, holoenzymes are classified as class I (subunit composition, aa, ab, ag, bg, gg), class II (pp), and class III (cc). Class I ADH isoenzymes oxidize ethanol and other small aliphatic alcohols and are inhibited by pyrazole. Class II isozymes prefer long-chain aliphatic and aromatic alcohols and cannot oxidize methanol. It is not inhibited by pyrazole. Class III isozymes prefer longer long-chain fatty alcohols (5 carbons and more) and aromatic alcohols and are not inhibited by pyrazole.
[0031]
Short-chain alcohol dehydrogenases include several related enzymes with different substrate specificities. Included in this group are the mammalian enzymes D-β-hydroxybutyrate dehydrogenase, (R) -3-hydroxybutyrate dehydrogenase, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase, NADPH-dependent carbonyl reductase, corticosteroid 11-. β-dehydrogenase, estradiol-17-β-dehydrogenase, bacterium acetoacetyl-CoA reductase, glucose 1-dehydrogenase, 3-β-hydroxysteroid dehydrogenase, 20-β-hydroxysteroid dehydrogenase, ribitol dehydrogenase, 3-oxo Acyl reductase, 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate dehydrogenase, sorbitol-6-phosphate -Dehydrogenase, 7-α-hydroxysteroid dehydrogenase, cis-1,2-dihydroxy-3,4cyclohexadienene-1-carboxylate dehydrogenase, cis-toluenedihydrodiol dehydrogenase, cis-benzeneglycol dehydrogenase, biphenyl-2,3-dihydro-2. , 3-diol dehydrogenase, N-acylmannosamine 1 dehydrogenase, and 2-deoxy-D-gluconate 3-dehydrogenase (Krozowski, Z. (1994) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 130 kol. Z. (1992) Mol. Cell Endocrino. . 84:.. C25-31; and Marks, A. R. Other (1992) J. Biol Chem 267: 15459-15463).
[0032]
UDP Glucuronyltransferase
Members of the UDP glucuronyltransferase family (UGT) catalyze the transfer of the glucuronic acid group from the cofactor uridine diphosphate-glucuronic acid (UDP-glucuronic acid) to the substrate. This transfer is usually to an olfactory heteroatom (O, N, or S). Substrates include xenobiotics that become functional through a Phase I reaction, as well as endogenous compounds such as bilirubin, steroid hormones, and thyroid hormones. The product of glucuronidation is excreted in urine if the molecular weight of the substrate is less than about 250 g / mol, but is excreted in bile if the glucuronidated substrate is larger.
[0033]
UGT is localized in microsomes of the liver, kidney, small intestine, skin, brain, spleen, and nasal mucosa. Because these localization sites are on the same side of the endoplasmic reticulum membrane as the cytochrome P450 enzyme and the flavin-containing monooxygenase, they are ideal locations for reaching the products of phase I drug metabolism. UGT has a C-terminal transmembrane domain that anchors the UGT to the endoplasmic reticulum membrane, as well as a conserved signature domain of about 50 amino acid residues in its C-terminal portion (Prosite PDOC00359 UDP-glycosyltransferase signature).
[0034]
UGTs involved in drug metabolism are encoded by two gene families, UGT1 and UGT2. Members of the UGT1 family are obtained by alternative splicing of a single locus with constant regions and variable substrate binding domains involved in cofactor binding and membrane insertion. Members of the UGT2 family are encoded by different loci and fall into two families, UGT2A and UGT2B. The 2A subfamily is expressed in the olfactory epithelium and the 2B subfamily is expressed in liver microsomes. Mutations in the UGT gene include hyperbilirubinemia (OMIM # 143500 Hyperbilirubinemia I), Crigler-Najar syndrome (OMIM # 218800 Crigler-Najjar syndrome), characterized by severe hyperbilirubinemia from offspring, Gilbert disease It is associated with mild hyperbilirubinemia called (OMIM * 191740 UGT1).
[0035]
Sulfotransferase
Sulfate conjugation occurs on many of the same substrates, and O-glucuronidation produces highly water-soluble sulfates. Sulfotransferase (ST) converts SO 3 from the cofactor 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) to the substrate.₃To catalyze this reaction. ST substrates are primarily phenols and aliphatic alcohols, but also include aromatic and aliphatic amines that conjugate to form the corresponding sulfamic acid. The products of these reactions are mainly excreted in urine.
[0036]
ST is found in various tissues, including liver, kidney, intestinal tract, lung, platelets, and brain. These enzymes are generally cytosolic enzymes and many forms are often expressed simultaneously. For example, more than 12 types of ST are present in rat liver cytosol. These biochemically characterized STs are classified into five classes based on their substrate selectivity: arylsulfotransferases, alcohol sulfotransferases, estrogensulfotransferases, tyrosine ester sulfotransferases, and bile salt sulfotransferases. Is done.
[0037]
ST enzyme activity varies significantly with gender and age of the rat. It is believed that the combined effects of developmental cues and sex-related hormones result in differences in ST expression profiles and profiles of other DMEs such as cytochrome P450. Of note, high expression of ST in cats partially compensates for reduced levels of UDP glucuronyltransferase activity.
[0038]
Several forms of ST have been purified and cloned from human liver cytosol. There are two phenol sulfotransferases that differ in thermostability and substrate selectivity. Thermostable enzymes catalyze the sulfation of phenols such as paranitrophenol, minoxidil, and acetaminophen, and thermolabile enzymes prefer monoamine substrates such as dopamine, epinephrine, and levadopa. Other cloned STs include estrogen sulfotransferase and N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferase. This last enzyme demonstrates another important role for ST in cell biochemistry. That is, modification of hydrocarbon substrates that can be important for cell differentiation and maturation of proteoglycans. Indeed, congenital abnormalities of sulfotransferases are associated with macular corneal degeneration, a disorder characterized by defective synthesis of mature keratan sulfate proteoglycans (Nakazawa, K. et al. (1984) J. Biol. Chem. 259). : 13751-7; OMIM * 217800 Molecular dystrophy, corneal).
[0039]
Galactosyltransferase
Galactosyltransferases are a subset of glycosyltransferases that transfer galactose (Gal) to N-terminal acetylglucosamine (GlcNAc) oligosaccharide chains that are part of glycolipids or glycoproteins that are free in solution (Kolbinger, F. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 433-440; Amado, M. et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473: 35-53). Galactosyltransferase is a soluble extracellular protein found on the cell surface and is also present in the Golgi apparatus. β1,3-galactosyltransferase forms a type I hydrocarbon chain with a Gal (β1-3) GlcNAc bond. Known human and mouse β1,3-galactosyltransferases are thought to have a short cytosolic domain, one transmembrane domain, and a catalytic domain with eight conserved regions (Kolbinger, F., supra and Hennet). (1998) J. Biol. Chem. 273: 58-65). Region 1 of mouse UDP-galactose β-N-acetylglucosamine β1,3-galactosyltransferase-I has 78-83 amino acid residues, region 2 has 93-102 amino acid residues, and region 3 has 116 amino acid residues. -119, region 4 is amino acid residues 147-158, region 5 is amino acid residues 172-183, region 6 is amino acid residues 203-206, region 7 is amino acid residues 236-246, and region 8 is amino acids It is located at residues 264-275. Since region 8 of β-N-acetylglucosamine β1,3-galactosyltransferase-I, which is a variant of the sequence found in mouse UDP-galactose, is also found in bacterial galactosyltransferase, this sequence is a galactosyltransferase sequence motif. (Hennet, T., supra). Recent studies have reported that the brainiac protein is a β1,3-galactosyltransferase (Yuan, Y. et al. (1997) Cell 88: 9-11; and Hennet, T. supra).
[0040]
GlcNAc-1,4-galactosyltransferase (-1,4-GalT) which is UDP-Gal (Sato, T. et al. (1997) EMBO J. 16: 1850-1857) binds Gal (βl-4) GlcNAc. Catalyze the formation of type II hydrocarbon chains. As with βl, 3-galactosyltransferase, a soluble form of the enzyme is formed by membrane-bound cleavage. Amino acids conserved in βl, 4-galactosyltransferase include two cysteine residues linked by a disulfide bond and a putative UDP-galactose binding site in the catalytic domain (Yadav, S. and Brew, K. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14163-14169; Yadav, SP and Brew, K. (1991) J. Biol. Chem. 266: 698-703; and Shaper, N.L., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 31389-31399). βl, 4-galactosyltransferase has several specific roles in addition to synthesizing carbohydrate chains on glycoproteins or glycolipids. In mammals, βl, 4-galactosyltransferase as part of a heterodimer with α-lactalbumin acts on the milk production of lactating mammals. Β1,4-galactosyltransferase on the surface of sperm acts as a receptor that specifically recognizes eggs. Cell surface β1,4-galactosyltransferase also affects cell adhesion, cell / basal plate interaction, normal cell migration, and metastatic cell migration (Shur, B. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5). : 854-863; and Shaper, J. (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 376: 95-104).
[0041]
Glutathione S Transferase
The basic reaction catalyzed by glutathione S-transferase (GST) is the conjugation of reduced glutathione (GSH) with an electrophile. GST is a homodimeric or heterodimeric protein, localized primarily in the cytosol, but some activity is also found in microsomes. The major isoenzymes have common structural and catalytic properties and in humans they fall into four main classes: α, μ, π, and θ. The two largest classes, α and μ, are identified by their respective protein isoelectric points (α is up to 7.5-9.0 and μ is up to 6.6). Each GST has a common binding site for GSH and a variable hydrophobic binding site. The hydrophobic binding site on each isoenzyme is specific for a particular electrophilic substrate. Certain amino acid residues within GST have been identified as important for their binding site and catalytic activity. Residues Q67, T68, D101, E104, and R131 are important for GSH binding (Lee, HC et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 99-109). Residues R13, R20, and R69 are important for the catalytic activity of GST (Stenberg G et al. (1991) Biochem. J. 274: 549-55).
[0042]
In most cases, GST acts favorably, such as inactivating and detoxifying potential mutagenic and carcinogenic chemicals. However, in some cases their effects are detrimental and can activate chemicals to be mutagenic and carcinogenic. Certain types of rat and human GSTs are reliable preneoplastic markers that help detect carcinogenesis. The expression of human GST in bacterial strains such as Salmonella typhimurium used in the well-known Ames test to determine mutagenicity helps determine the role of these enzymes in mutagenesis. Dihalomethanes, which cause liver tumors in mice, is thought to be activated by GST. This notion is supported by the fact that dihalomethanes is more mutagenic in bacterial cells expressing human GST than in uninfected cells (Thier, R. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90). : 8567-80). Mutagenicity of ethylene dibromide and ethylene dichloride is increased in bacterial cells expressing human αGST, A1-1, and mutagenesis of aflatoxin B1 is substantially reduced by enhanced GST expression ( Simula, T. P. et al. (1993) Carcinogenesis 14: 1371-6). Thus, controlling GST activity would be useful in controlling mutagenesis and carcinogenesis.
[0043]
GST is involved in acquiring resistance to drug treatment in many cancers known as multidrug resistance (MDR). MDR occurs in cancer patients treated with cytotoxins such as cyclophosphamide and becomes resistant to the drug and then to a variety of other cytotoxins . Elevated GST levels are associated with these drug-resistant cancers, and it is thought that GST-catalyzed GSH conjugation inactivates the drug after increasing GST levels in response to the drug. The increased GST levels then protect the cancer cells from cytotoxics that bind to other GSTs. Elevated levels of A1-1 in tumors are associated with drug resistance caused by cyclophosphamide treatment (Dirven HA et al. (1994) Cancer Res. 54: 6215-20). Thus, modulation of GST activity in cancerous tissue would be useful for treating MDR in cancer patients.
[0044]
γ-glutamyl transpeptidase
γ-glutamyl transpeptidase is a widely expressed enzyme that breaks γ-glutamylamide bonds and initiates extracellular glutathione (GSH) degradation. GSH degradation provides cells with an area of cysteine accumulation for the biosynthetic pathway. γ-glutamyl transpeptidase also contributes to antioxidation of cells, the expression of which is caused by oxidative stress. Cell surface-localized glycoproteins are expressed at high levels in cancer cells. Studies have shown that high levels of activity of γ-glutamyl transpeptidase on the surface of cancer cells can be used to activate prodrugs, and that high levels of anticancer therapeutics can be accumulated locally (Hanigan, MH. (1998) Chem. Biol. Interact. 111-112: 333-42; Taniguchi, N. and Ikeda, Y. (1998) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 72: 239-78; (1999) Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 122: 367-80).
[0045]
Acyltransferase
N-acyltransferase enzymes catalyze the transfer of an amino acid conjugate to an activated carboxyl group. Endogenous compounds and xenobiotics are activated by acyl-CoA synthetases in the cytosol, microsomes, and mitochondria. The acyl-CoA intermediate is then converted to an amino acid (usually glycine, glutamine, or taurine, but ornithine, arginine, histidine, serine, aspartic acid, and some dipeptides) by N-acyltransferase in the cytosol or mitochondria. To form metabolites having amide bonds. Although this reaction is complementary to O-glucuronidation, amino acid conjugation does not produce reactive and toxic metabolites often caused by glucuronidation.
[0046]
Bile acid-CoA, amino acid N-acyltransferase (BAT), is one of the well-characterized enzymes of this class. BAT is involved in the production of bile acid conjugates that act as surfactants in the intestinal tract (Falany, CN et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 19375-9; Johnson, MR et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 10227-33). BAT is also useful as a predictive marker for the prognosis of liver cancer patients after partial hepatectomy (Furutani, M. et al. (1996) Hepatology 24: 1441-1-5).
[0047]
Acetyltransferase
Acetyltransferase has been thoroughly studied for its role in histone acetylation. Histone acetylation relaxes the chromatin structure in eukaryotic cells, thereby allowing transcription factors to reach the promoter element of the DNA template in the affected region of the genome (or the entire genome). In contrast, histone deacetylation closes the chromatin structure, restricting access to transcription factors and reducing transcripts. Finally, the use of chemicals that inhibit histone deacetylation (eg, sodium butyrate) as a general means of stimulating cell transcription results in an overall increase in gene expression, an artifact. Regulation of gene expression by acetylation can also be achieved by acetylation of other proteins, including but not limited to p53, GATA-1, MyoD, ACTR, TFIIE, TFIIF, and high mobility proteins. In the case of p53, acetylation increases binding to DNA and stimulates transcription of p53-regulated genes. The prototype histone acetylase (HAT) is Gcn5 from Saccharomyces cerevisiae. Gcn5 is a family member of an acetylase that includes Tetrahymena p55, human Gcn5, and human p300 / CBP. For histone acetylation, see literature (Cheng, WL et al. (2000) Current Opinion in Cell Biology 12: 326-333 and Berger, SL (1999) Current Opinion in Cell Biology 11: 336-341). I want to be. Certain acetyltransferase enzymes are α / β hydrolase folds (Center) that are common to several major classes of enzymes, including but not limited to acetylcholinesterase and carboxylesterase. . of Applied Molecular Engineering Inst of Chemistry and Biochemistry University of Salzburg, with a http://predict.sanger.ac.uk/irbm-course97/Docs/ms/) (Structural Classification of Proteins, http: //scop.mrc -Lmb.cam.ac.uk/sc p / index.html).
[0048]
N -Acetyltransferase
Aromatic amines and hydrazine-containing compounds are N-acetylated by N-acetyltransferase enzymes in liver and other tissues. Certain xenobiotics are O-acetylated to some extent by the same enzyme. N-acetyltransferase is a cytosolic enzyme that transfers acetyl groups in two steps using the cofactor acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA). In the first step, the acetyl group is transferred from acetyl-CoA to the active site cysteine residue, and in the second step, the acetyl group is transferred to the substrate amino group to regenerate the enzyme.
[0049]
In contrast to most other DME classes, the number of known N-acetyltransferases is low. In humans, there are two highly similar enzymes, NAT1 and NAT2, and in mice, a type 3 enzyme, NAT3. The human form of N-acetyltransferase has independent regulation (NAT1 is widely expressed, but NAT2 is expressed only in liver and organs) and overlapping substrate specificities. While both enzymes accept to some extent most substrates, NAT1 prefers certain substrates (para-aminobenzoic acid, para-aminosalicylic acid, sulfamethoxazole, and sulfanilamide), while NAT2 prefers other substrates (isoniazid, Hydralazine, procainamide, dapsone, aminoglutethimide, and sulfamethiazine).
[0050]
In the 1950's, clinical trials of patients receiving the antituberculosis drug isoniazid reported rapid and slow acetylation of the compound. These phenotypes were later shown to be due to mutations in the NET2 gene that affected the activity or stability of the enzyme. The slow acetylation phenotype of isoniazid is dominant in the Middle East population (about 70%), slightly inferior in Caucasians (about 50%), and less than 25% in the Asian population. More recently, functional polymorphisms in NET1 have been detected and about 8% of the population tested have a slow acetylation phenotype (Butcher, NJ et al. (1998) Pharmacogenetics 8:67). -72). Because NAT1 is able to activate certain known aromatic amine carcinogens, polymorphisms in the widely expressed NAT1 enzyme are thought to be important in determining the risk of cancer (OMIM * 108345 N- acetyltransferase1).
[0051]
Aminotransferase
Aminotransferases comprise a family of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) -dependent enzymes and catalyze the transformation of amino acids. Aspartate aminotransferase (AspAT) is the most studied PLP-containing enzyme. AspAT catalyzes the reversible transamination of dicarboxylic L-amino acids, aspartic acid and glutamic acid, and the corresponding 2-oxo, oxaloacetic, and 2-oxoglutaric acids. Other members of this family include putative aminotransferases, branched-chain amino acid aminotransferases, tyrosine aminotransferases, aromatic aminotransferases, alanine-glyoxylate aminotransferases (AGT) and kynurenine aminotransferases (Vacca, R. et al. A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 21932-21937).
[0052]
Primary hyperoxaluria type I is an autosomal recessive disorder in which a deficiency of the liver-specific peroxisomal enzyme alanine-glyoxylate aminotransferase-1 occurs. The phenotype of this disease is a defect in glyoxylate metabolism. In the absence of AGT, glyoxylic acid is oxidized to oxalic acid rather than being transferred to glycine. As a result, insoluble calcium oxalate accumulates in the kidney and ureter, eventually leading to renal failure (Lumb, MJ et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 20587-20596).
[0053]
Nurenine aminotransferase catalyzes the irreversible transamination of the L-tryptophan metabolite L-kynurenine to form kynurenic acid. The enzyme may also catalyze the reversible transamination of L-2-aminoadipic acid to 2-oxoglutarate and vice versa to produce 2-oxoadipate and L-glutamic acid. Since quinureic acid is a putative modulator of glutamatergic neurotransmission, deficiency of quinurein aminotransferase appears to be related to the pleotropic effect (Buchli, R. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 29330). -29335).
[0054]
Catechol- O -Methyltransferase
Catechol-O-methyltransferase (COMT) involves the transfer of the methyl group of an S-adenosyl-L-methionine (AdoMet; SAM) donor to one hydroxyl group (eg, levodopa, dopamine, or DBA) on a catechol substrate. Catalyze. Methylation of the 3'-hydroxyl group takes precedence over methylation of the 4'-hydroxyl group, and the membrane-bound isoform of COMT is more regiospecific than the soluble form. Translation of the soluble form of this enzyme is by use of the internal start codon of full-length mRNA (1.5 kb) or by translation of a short mRNA (1.3 kb) transcribed from an internal promoter. Proposed S_NFor the two-way methylation reaction, use Mg²⁺Is required, and Ca²⁺Is suppressed by Binding of the donor and substrate to COMT occurs continuously. First, AdoMet is Mg²⁺Independently binds to COMT,²⁺Followed by catechol substrate binding.
[0055]
The amount of COMT in the tissue is difficult to inhibit because it is present in excess of that normally required for activity. However, if the inhibitorin in vitro(E.g., gallic acid, tropolone, U-0521, and 3 ', 4'-dihydroxy-2-methyl-propiophetropolone) and clinical uses (e.g., nitratecatechol-based compounds and tolcapone). . Administration of these inhibitors increases the half-life of levodopa, followed by dopamine production. Inhibition of COMT appears to increase the half-life of various other catechol-structured compounds, including epinephrine / norepinephrine, isoprenaline, limiterol, dobutamine, fenoldopam, apomorphine, and α-methyldopa. Since norepinephrine deficiency leads to clinical depression, the use of COMT inhibitors may be useful in treating depression. COMT inhibitors usually have minimal side effects and are ultimately metabolized in the liver, leaving only small amounts of metabolites in the body (Mannisto, PT and Kaakkola, S. (1999) Pharmacological Reviews 51). : 593-628).
[0056]
Copper-zinc superoxide dismutase
Copper-zinc superoxide dismutase is a compact dimeric metalloenzyme that is involved in cellular defense against oxidative damage. This enzyme contains one zinc atom and one copper atom in each subunit, and the superoxide anion O₂And H₂O₂Catalyzes the disproportionation reaction to The rate of this disproportionation reaction limits diffusion and is later facilitated by favorable electrostatic interactions between the substrate and the enzyme active site. Examples of this class of enzymes have been identified in the cytoplasm of all eukaryotic cells and also in the periplasm of certain bacterial species. Copper-zinc superoxide dismutase is a lively enzyme, has high resistance to proteolysis, and is denatured by urea and SDS. In addition to the compact structure of the enzyme, it is believed that metal ions and disulfide bonds of internal subunits contribute to the stability of the enzyme. The enzyme is reversibly denatured at temperatures as high as 70 ° C. (Battistoni, A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 5655-5661).
[0057]
Overexpression of superoxide dismutase has been implicated in enhancing the freezing tolerance of genetically modified alfalfa and confers resistance to environmental poisons such as the diphenyl ether herbicide acifluorfen (McKersie, BD et al. (1993) Plant Physiol. 103: 1155-1163). In addition, yeast cells become more resistant to thawing and thawing damage after exposure to hydrogen peroxide. This is because the up-regulation of superoxide dismutase expression upon exposure causes the yeast cells to adapt to additional peroxidative stress. The study shows that mutations in the yeast superoxide dismutase gene suddenly affect the regulation of glutathione metabolism, which has long been considered important in determining whether or not an organism exists through the cryopreservation process. It has a more adverse effect on freeze-thaw resistance than mutation (Jong-In Park, JI, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 22921-22928).
[0058]
Superoxide dismutase expression is also associated with Mycobacterium tuberculosis, an organism that causes tuberculosis. Superoxide dismutase is one of the 10 major proteins excreted by M. tuberculosis and its expression is up-regulated about 5-fold in response to oxidative stress. Mycobacterium tuberculosis is a non-pathogenic mycobacteriumM. smegmatisIt expresses superoxide dismutase almost two orders of magnitude more and secretes the expressed enzyme at an extremely high rate. As a result,M. smegmatisSecretes up to 350 times more enzyme than does it, and confers substantial resistance to oxidative stress (Harth, G. and Horwitz, MA (1999) J. Biol. Chem. 274: 4281-4292). Decreased expression of copper-zinc superoxide dismutase, as well as reduced expression of other enzymes with antioxidant capacity, is associated with early stage cancer. Expression levels of copper-zinc superoxide dismutase are lower in prostate epithelial neoplasia and prostate cancer compared to normal prostate tissue (Boswick, DG (2000) Cancer 89: 123-134).
[0059]
Phosphodiesterase
Phosphodiesterases constitute a class of enzymes that catalyze the hydrolysis of one of the two ester bonds of a phosphodiester compound. Thus, phosphodiesterases are important for various cellular processes. Phosphodiesterases include DNA and RNA endonucleases and exonucleases that are essential for cell growth and replication, and topoisomerases that degrade and reform nucleic acid strands during DNA topology rearrangement. Tyr-DNA phosphodiesterase acts on DNA repair by hydrolyzing the dead end covalent intermediate formed between topoisomerase type I and DNA (Pouliot, JJ et al. (1999) Science 286: 552). Yang, S.-W. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11534-11539).
[0060]
Acid sphingomyelinase is a phosphodiesterase that hydrolyzes the membrane phospholipid sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine. Phosphorylcholine is used in the synthesis of phosphatidylcholines involved in various intracellular signaling pathways, whereas ceramide is an essential precursor for the production of gangliosides, a membrane lipid found at high concentrations in nerve tissue. Deficiency of acid sphingomyelinase causes sphingomyeli molecules to accumulate in the isosomes, thereby causing Niemann-Pick disease (Schuchman, E.H. and S.R. Miranda (1997) Genet. Test. 1:13. -19).
[0061]
Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (also referred to as glycerophosphodiester phosphodiesterase) is a diacetylated phospholipid glycerophosphoesterase that hydrolyzes diacetylated phospholipidose phospholipidose and alcoholic phospholipidose. It is. Glycerophosphocholine, glycerophosphoethanolamine, glycerophosphoglycerol, and glycerophosphoinositol are examples of the glycerophosphoryl diester phosphodiesterase, which is a substrate of glycerophosphoryl diester. Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase from E. coli has broad specificity for glycerophosphodiester substrates (Larson, TJ et al. (1983) J. Biol. Chem. 248: 5428-5432).
[0062]
Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) is a crucial enzyme for the regulation of cyclic nucleotides cAMP and cGMP. cAMP and cGMP function as intracellular second messengers that transmit a variety of extracellular signals, including hormones, light, and neurotransmitters. PDEs break down cyclic nucleotides to their corresponding monophosphates, thereby regulating the intracellular concentration of cyclic nucleotides and their effect on signal transduction. Because their role is a regulator of signal transduction, PDEs have been extensively studied as targets for chemotherapy (Perry, MJ and GA Higgs (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 472-481; Torphy, JT (1998) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 157: 351-370).
[0063]
The family of mammalian PDEs is categorized based on their substrate specificity and affinity, sensitivity to cofactors, and sensitivity to inhibitors (Beavo, JA (1995) Physiol. Rev. 75: 725-). 748; Conti, M. et al. (1995) Endocrine Rev. 16: 370-389). Some of these families contain unique genes, many of which are expressed as splice variants in various tissues. Within the PDE family, there are a number of isozymes and a number of splice variants of these isoenzymes (Conti, M. and S-LC Jin (1999) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol). 63: 1-38). The presence of numerous PDE families, isoenzymes, and splice variants demonstrates the diversity and complexity of regulatory pathways involving cyclic nucleotides (Houslay, MD and G. Milligan (1997) Trends Biochem. Sci. 22: 217-224).
[0064]
PDE1 type (PDE1) is Ca²⁺/ Calmodulin-dependent and likely encoded by at least three different genes, each with at least two different splice variants (Kakkar, R. et al. (1999) Cell Mol. Life Sci. 55: 1164-1186). PDE1 has been found in lung, heart, and brain. Certain PDE1 isoenzymes arein in vitroAnd is regulated by phosphorylation / dephosphorylation. Phosphorylation of these PDE1 isoenzymes reduces the affinity of this enzyme for calmodulin, reduces PDE activity and stabilizes cAMP levels (Kakkar, supra). PDE1 may provide a useful therapeutic target for diseases of the central nervous system and cardiovascular, immune system by involving PDE1 in both cyclic nucleotide and calcium signaling (Perry, MJ and GA Higgs (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 472-481).
[0065]
PDE2 is a cGMP-stimulated PDE found in the cerebellum, neocortex, heart, kidney, lung, pulmonary artery, and skeletal muscle (Sadhu, K. et al. (1999) J. Histochem. Cytochem. 47: 895-906). PDE2 mediates the effects of cAMP on catecholamine secretion, is involved in the regulation of aldosterone (Beavo, supra), and may also play a role in olfactory signaling (Juilfs, DM et al. (1997)). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3388-3395).
[0066]
Since PDE3 has a high affinity for both cGMP and cAMP, these cyclic nucleotides act as a competitive substrate for PDE3. PDE3 acts on stimulation of myocardial contraction, inhibition of platelet aggregation, relaxation of vascular and airway smooth muscle, inhibition of proliferation of T lymphocytes and cultured vascular smooth muscle cells, and regulation of catecholamine-induced free fatty acid release from adipose tissue I do. The PDE3 family of phosphodiesterases is sensitive to certain inhibitors, such as cilostamide, enoximone, and lixazinone. The PDE3 isoenzyme can be inhibited by cAMP-dependent protein kinase or insulin-dependent kinase (Degerman, E. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 6823-6826).
[0067]
PDE4 is specific for cAMP, is localized to airway smooth muscle, vascular epithelium, and all inflammatory cells, and can be activated by cAMP-dependent dependent phosphorylation. Because elevated levels of cAMP can suppress inflammatory cell activity and relax tracheal smooth muscle, PDE4 is extensively studied as a potential target for new anti-inflammatory agents with emphasis on the discovery of asthma treatments Was done. PDE inhibitors are being tested in clinical trials as a treatment for asthma, chronic embolic pulmonary disease, and atopic eczema. All four known isoenzymes of PDE4 are sensitive to inhibitor rolipram, a compound known to improve behavioral memory in mice (Barad, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA 95: 15020-15025). PDE4 inhibitors have also been studied as potential therapeutics for acute lung injury, endotoxemia, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and various neurological and gastrointestinal disorders (Doherty, A. M.). (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 466-473).
[0068]
PDE5 has high selectivity for cGMP as a substrate (Turko, IV et al. (1998) Biochemistry 37: 4200-4205) and has two allosteric cGMP-specific binding sites (McAllister-Lukas, L. M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 30671-30679). Binding of cGMP to these allosteric binding sites appears to be more important for phosphorylation of PDE5 by cGMP-dependent protein kinase than for direct regulation of catalytic activity. High levels of PDE5 are found in vascular smooth muscle, platelets, lung, and kidney. Inhibitor zaprinast is effective against PDE5 and PDE1. Zaprinast was modified to obtain specificity for PDE5 to generate sildenafil (VIAGRA; Pfizer, Inc., New York NY). This sildenafil is a therapeutic agent for male erectile dysfunction (Terrett, N. et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. Lett. 6: 1819-1824). Inhibitors of PDE5 are currently being studied as cardiovascular therapeutics (Perry, MJ and GA Higgs (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 472-481).
[0069]
PDE6, a photoreceptor cyclic nucleotide phosphodiesterase, is a key component of the light transduction cascade. PDE6 binds to the G protein transducin and hydrolyzes cGMP to regulate cGMP-gated cation channels in photoreceptor membranes. In addition to the cGMP binding active site, PDE6 also has two high affinity cGMP binding sites that are thought to play a regulatory role in the function of PDE6 (Artemiev, N.O. et al. (1998) Methods 14:93). -104). PDE6 deficiency is associated with retinal disease. rd mouse retinal degeneration (Yan, W. et al. (1998) Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 39: 2529-1536), human autosomal recessive pigmentary retinitis (Danciger, M. et al. (1995) Genomics). 30: 1-7), and rod / cone dysplasia type 1 of Irish Setter dogs (Suber, M.L. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3968-3972). Is due to a mutation in the PDE6B gene.
[0070]
The PDE7 family of PDEs consists of only one known member with multiple splice variants (Bloom, TJ and JA BEAVO (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14188-14192. ). Although PDE7 is cAMP-specific, little is known about other physiological functions. Although mRNA encoding PDE7 is found in skeletal muscle, heart, brain, lung, kidney, and pancreas, PDE7 protein expression is restricted to certain tissue types (Han, P. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16152-16157; Perry, MJ and GA Higgs (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 472-481). PDE7 is closely related to the PDE4 family, but is not inhibited by rolipram, a specific inhibitor of PDE4 (Beavo, supra).
[0071]
PDE8 is cAMP-specific and is closely related to the PDE4 family. PDE8 is expressed in thyroid, testis, eye, lung, skeletal muscle, heart, kidney, ovary, and brain. The cAMP hydrolysis activity of PDE8 is not inhibited by the PDE inhibitors rolipram, vinpocetine, milrinone, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) or zaprinast, but PDE8 is inhibited by dipyridamole (Fisher, D. et al. A. et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-577; Hayashi, M. et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-756; Sotherling. 1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991-8996).
[0072]
PDE9 is cAMP-specific and most similar to the PDE8 family of PDEs. PDE9 is expressed in kidney, lung, liver, brain, spleen, and small intestine. PDE9 is not inhibited by sildenafil (VIAGRA; Pfizer, Inc., New York NY), rolipram, vinpocetine, dipyridamole, or IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), but is susceptible to the PDE5 inhibitor zaprinast. (Fisher, DA et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 15559-15564; Soderling, SH et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 15553-15558).
[0073]
PDE10 is a dual-substrate PDE that hydrolyzes both cAMP and cGMP. PDE10 is expressed in the brain, thyroid, and testis (Soderling, SH et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-7076; Fujishige, K. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 18438-18445; Loughney, K. et al. (1999) Gene 234: 109-117).
[0074]
PDEs contain a catalytic domain of about 270-300 amino acids, and an N-terminal regulatory domain required for cofactor binding, and in some cases a hydrophilic C-terminal domain of unknown function (Conti, M. and S. et al. -LC Jin (1999) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 63: 1-38). A conserved putative zinc binding motif, HDXXHXGXXN, was identified in the catalytic domain of all PDEs. The N-terminal regulatory domain has a non-catalytic cGMP binding domain in PDE2, PDE5, and PDE6, a calmodulin binding domain in PDE1, and a domain containing phosphorylation sites in PDE3 and PDE4. In PDE5, the N-terminal cGMP binding domain spans about 380 amino acid residues and a conserved sequence motif N (R / K) XnFX₃Including tandem repeats of DE (McAllister-Lukas, LM et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22863-22873). The NKXnD motif is found by mutagenesis and is important for cGMP binding (Turko, IV et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 22240-22244). The PDE family has about 30% amino acid identity within the catalytic domain, but isozymes within the same family usually show about 85 to 95% identity in this region (eg, PDE4A and PDE4B). Furthermore, while the similarity outside the catalytic domain within a family is high (greater than 60%), there is little sequence similarity outside this domain between families.
[0075]
Many of the actions that make up the immune and inflammatory responses are inhibited by drugs that increase the level of intracellular cAMP (Verghese, MW et al. (1995) Mol. Pharmacol. 47: 1164-1171). Various diseases occur due to increased PDE activity and are associated with reduced levels of cyclic nucleotides. For example, one type of diabetes insipidus in mice is associated with elevated PDE4 activity,_mIncreased cAMPPED activity is found in leukocytes of atopic patients, and PDE3 is associated with heart disease.
[0076]
Many inhibitors of PDEs have been identified and clinical trials are underway (Perry, MJ and GA Higgs (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 472-481; Torphy, T. et al. J. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157: 351-370). PDE3 inhibitors have been developed as platelet aggregation inhibitors, antihypertensives, and inotropic drugs useful in the treatment of congestive heart failure. Rolipram, a PDE4 inhibitor, is used to treat depression, and other inhibitors of PDE4 are being evaluated as anti-inflammatory drugs. Rolipram alsoin in vitroInhibit lipopolysaccharide (LPS) -induced TNF-a, which was observed to promote HIV-1 replication. Thus, rolipram is thought to inhibit HIV-1 replication (Angel, JB, et al. (1995) AIDS 9: 1137-1144). Furthermore, rolipram was shown to be effective in treating meningitis based on its ability to suppress the production of cytokines such as TNF-a, TNF-b, and interferon-g. Rolipram was also thought to be effective in tardive dyskinesia and was effective in treating multiple sclerosis in experimental animal models (Somer, N. et al. (1995) Nat. Med. 1: 244-248; Sasaki, H. et al. (1995) Eur. J. Pharmacol. 282: 71-76).
[0077]
Theophylline is a non-specific PDE inhibitor used in the treatment of bronchial asthma and other respiratory diseases. Theophylline acts on the function of airway smooth muscle and is thought to have an anti-inflammatory or immunomodulatory capacity in the treatment of respiratory diseases (Banner, KH and CP Page (1995) Eur. Respir. J. 8: 996-1000). Pentoxifylline is another non-specific PDE inhibitor used for the treatment of intermittent claudication and diabetic peripheral vascular disease. Pentoxifylline may also block TNF-a production and inhibit HIV-1 replication (Angel et al., Supra).
[0078]
PDEs affect cell proliferation in various cell types (Conti et al. (1995) Endocrine Rev. 16: 370-389) and have been reported to be involved in various cancers. Growth of the prostate cancer cell lines DU145 and LNCaP was suppressed by the delivery of cAMP derivatives and PDE inhibitors (Bang, YJ, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5330-5334). These cells also showed a permanent conversion in phenotype from epithelial to neuronal morphology. PDE inhibitors may also regulate mesangial cell proliferation (Matousovic, K. et al. (1995) J. Clin. Invest. 96: 401-410) and may also regulate lymphocyte proliferation. (Joulain, C. et al. (1995) J. Lipid Mediat. Cell Signal. 11: 63-79). Cancer treatment has been described as delivering PDEs to specific cell compartments of tumors and leading to cell death (Deonarain, MP and AA Epenetos (1994) Br. J. Cancer 70. : 786-794).
[0079]
Phosphotriesterase
Phosphotriesterase (PTE, paraoxonases) is an enzyme that hydrolyzes toxic organophosphorus compounds and has been isolated from various tissues. This enzyme is abundant in mammals but appears to be deficient in birds and insects, explaining the low resistance of birds and insects to organophosphate compounds (Vilanova, E. and Sogorb, M. A. (1999) Crit. Rev. Toxicol. 29: 21-57). Phosphotriesterases play a central role in the detoxification of pesticides by mammals. Phosphotriesterase activity varies from individual to individual and is lower in infants than in adults. Knockout mice have significant sensitivity to the organophosphorus toxins diazoxon and chlorpyrifos oxon (Furlong, CE, et al. (2000) Neurotoxicology 21: 91-100). PTEs have received attention as organophosphorus-containing chemical waste and chemical weapons (eg, parathion), as well as enzymes that have the ability to detoxify pesticides and pesticides. One study has shown that phosphotriesterase is involved in atherosclerosis and diseases associated with lipoprotein metabolism.
[0080]
Thioesterase
Two soluble thioesterases involved in fatty acid biosynthesis have been isolated from mammalian tissues. One of them is active only on long-chain fatty acyl thioesters, and the other is active on thioesters having various lengths of fatty acyl chains. These thioesterases catalyze the end-of-read step in the new synthesis of fatty acids. The chain-terminating step involves the hydrolysis of a thioester bond that links the fatty acyl chain to the 4'-phosphopantethein prosthetic group of the acyl carrier protein (ACP) subunit of fatty acid synthase (Smith, S. (1981a) Methods Enzymol. 71: 181-188; Smith, S. (1981b) Methods Enzymol. 71: 188-200).
[0081]
E. coli contains two soluble thioesterases, thioesterase type I, which is active only for long chain acyl thioesters, and thioesterase type II (TEII), which has specificity for chains of various lengths (Naggert, J (1991) J. Biol. Chem. 266: 11044-11050). E. coli TEII has no sequence similarity to any of the two types of mammalian thioesterases that function as a chain-terminating enzyme in a novel fatty acid biosynthesis. Unlike mammalian thioesterases, E. coli TEII does not contain the characteristic serine active site gly-X-ser-X-gly sequence motif and is not inactivated by the serine denaturant diisopropylfluorophosphate. However, modification of histidine 58 with iodoacetamide and diethyl pyrocarbonate results in loss of PEII activity. Overexpression of TEII does not alter the fatty acids contained in E. coli. This indicates that the enzyme does not function as an end-of-read enzyme in fatty acid biosynthesis (Naggert et al., Supra). For this reason, Naggert et al. (Supra) believe that the physiological substrate for E. coli TEII is not ACP-phosphopantethein fatty acid ester but coenzyme A (CoA) fatty acid ester.
[0082]
Carboxylesterase
Mammalian carboxylesterases constitute a multigene family that is expressed in various tissues and cell types. Isoenzymes have significant sequence homology and are classified primarily based on amino acid sequence. Acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, and carboxylesterase are classified in the serine superfamily of esterases (B esterases). Other carboxylesterases include thyroglobulin, thrombin, factor IX, glioactin, and plasminogen. Carboxylesterases catalyze the hydrolysis of ester and amide groups of the molecule and are involved in detoxifying drugs, environmental poisons, and carcinogens. Substrates for carboxylesterase include short and long chain acylglycerols, acylcarnitines, carbonates, dipivefrin hydrochloride, cocaine, salicylates, capsaicin, palmitoyl-CoA, imidapril, haloperidol, pyrrolididine alkaloids, steroids, p -Nitrophenylacetic acid, malathion, butanilicaine, and isocarboxazide. This enzyme often exhibits low substrate specificity. Carboxylesterases are also important for converting prodrugs to the corresponding free acids. The corresponding free acid can be, for example, the active form of its prodrug, such as lovastatin, used to lower blood cholesterol (Satoh, T. and Hosokawa, M. (1998) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38: 257-288).
[0083]
neuroligins (i) have an N-terminal signal sequence, (ii) resemble a cell surface receptor, (iii) contain a carboxylesterase domain, (iv) are highly expressed in the brain, and (v) are calcium-dependent. A class of molecules that bind to neulexin. Despite having homology to carboxylesterases, neuroligins do not contain an active site serine residue and are thought to play a role in substrate binding rather than as a catalyst (Ichtchenko, K. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 2676-2682).
[0084]
Squalene epoxidase
Squalene epoxidase (squalene monooxygenase, SE) is a microsomal membrane-bound FAD-dependent oxidoreductase that catalyzes the first oxygen loading step in the eukaryotic sterol biosynthesis pathway. Cholesterol is an essential component of the cytoplasmic membrane acquired by the LDL receptor-mediated or biosynthetic pathway. In the latter case, all 27 carbon atoms in the cholesterol molecule are derived from acetyl-CoA (Stryer, L., supra). SE converts squalene first to 2,3 (S) -oxidesqualene, then to lanosterol, and then to cholesterol. The steps involved in cholesterol biosynthesis are summarized below (Stryer, L (1988)Biochemistry. W. H Freeman and Co. , Inc., Inc. New York. pp. 554-560 and Sakakibara, J. et al. (1995) 270: 17-20).
[0085]
Acetate (from acetyl-CoA) → 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl CoA → mevalonic acid → 5-phosphomevalonic acid → 5-pyrophosphomevalonic acid → isopentenyl pyrophosphate → dimethylallyl pyrophosphate → geranyl pyrophosphate → farnesyl pyrophosphate → squalene → squalene epoxide → lanosterol → cholesterol
Cholesterol is essential for eukaryotic cell survival, but excessive levels of serum cholesterol cause atherosclerotic plaques to form in the arteries of higher organisms. For example, the accumulation of insoluble lipids in essential blood vessel walls, such as the coronary arteries, can reduce blood flow and prevent sufficient blood from flowing into tissues, resulting in tissue necrosis. HMG-CoA reductase is required for the conversion of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA) to mevalonic acid, which is the first step in cholesterol biosynthesis. HMG-CoA is a target for various pharmaceutical compounds designed to lower plasma cholesterol levels. However, inhibition of MHG-CoA also reduces the synthesis of non-sterol intermediates (eg, mevalonic acid) required for other biosynthetic pathways. SE catalyzes the rate-limiting reaction that occurs later in the sterol synthesis pathway, and cholesterol is the end product of the pathway after the catalytic step by SE. Thus, SE is an ideal target for designing anti-hyperlipidemic drugs that do not reduce other required intermediates (Nakamura, Y. et al. (1996) 271: 8053-8056).
[0086]
Epoxide hydrolase
Epoxide hydrolases catalyze the addition of water of an epoxide-containing compound, whereby the epoxide is hydrolyzed to its corresponding 1,2-diol. These are related to bacterial haloalkane dehalogenases and have sequence similarity to other members of the α / β hydrolase fold family of enzymes (eg,Streptomyces aureofaciensBromoperoxidase A2 (derived from bromoperoxidase A2), hydroxymuconic seminaldehyde hydrolases derived from Pseudomonas putida, andXanthobacter autotropicusDerived haloalkane dehalogenase). Epoxide hydrolases are ubiquitous and are found in mammals, vertebrates, plants, fungi, and bacteria. This family of enzymes is important for the detoxification of xenobiotic epoxide compounds, which are often highly electrophilic and destructive when introduced into an organism. Examples of epoxide hydrolase reactions include hydrolysis of cis-9,10-epoxyoctadec-9 (Z) -enoic acid (leukotoxin) to its corresponding diol, threo-9,10-dihydroxyoctadec-12 (Z)-. enoic acid (leukotoxin diol), and cis-12,13-epoxyoctadec-9 (Z) -enoic acid (isoleukotoxin), and the corresponding diol threo-12,13-dihydroxyxisoic-toxin-9 (Zero-co-toxin-9). Diol). Leukotoxin alters the permeability of the membrane to transport ions and trigger an inflammatory response. In addition, epoxide carcinogens are known to be produced by cytochrome P450 as an intermediate in the detoxification of drugs and environmental toxins.
[0087]
This enzyme has three catalytic moieties: Asp (nucleophilic), Asp (acid supporting histidine), and His (water activated histidine). The mechanism of epoxide hydrolase reaction begins with a covalent ester intermediate initiated by a nucleophilic attack on one of the Asp residues on the first carbon atom of the epoxide ring of the target molecule, forming a covalent ester intermediate. (Michael Arand, M. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 4223-4229; Rink, R. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 14650-14657; Argiriadi, M.A. (2000) J. Biol. Chem. 275: 15265-15270).
[0088]
Enzymes involved in tyrosine catalysis
The degradation of the amino acid tyrosine to succinic and pyruvate or fumaric and acetoacetic acids requires a number of enzymes and produces a number of intermediate compounds. In addition, many xenobiotic compounds can be metabolized using one or more reactions that are part of the tyrosine degradation pathway. Although this pathway was first studied in bacteria, tyrosine degradation is known to occur in a variety of organisms and may involve a number of similar biological reactions.
[0089]
Enzymes involved in the degradation of tyrosine into succinic acid and pyruvate include 4-hydroxyphenylpyruvate oxidase, 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase, and 3,4-dihydroxyphenylacetic acid. (3,4-dihydroxyphenylate 2,3-dioxygenase), 5-carboxymethyl-2-hydroxymuconic acid semialdehyde dehydrogenase (5-carboxymethyl-2-hydroxymuconic seminaldehydedehydrogenase), trans-cis-hydroxy-cis-hydroxy-cis Muconic acid isomerase (trans, cis-5-carboxymethyl) -2-hydroxymuconate isomerase, homoprotocatechuate isomerase / decarboxylase, cis-2-oxohept-3-ene-1 ene-1,7-dioxide aldolase, and succinic semidehyde dehydrogenase.
[0090]
Enzymes involved in the degradation of tyrosine to fumarate and acetoacetate include 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, homogentisate-1,2-dioxygenase, maleyl acetoacetate isomerase, and fumarylacetoacetase. It is. If an intermediate from the succinate / pyruvate pathway is accepted, 4-hydroxyphenylacetate 1-hydroxylase may be involved.
[0091]
Additional enzymes involved in tyrosine metabolism in different organisms include 4-chlorophenylacetate-3,4-dioxygenase, aromatic aminotransferases, 5-oxopent-3-ene. -1,2,5-tricarboxylate decarboxylase, 2-oxo-hept-3-ene-1,7-dioxide hydratase, and 5-carboxymethyl-2-hydroxymuconic acid isomerase (5-carboxymethyl-2-hydroxymuconateis) (Ellis, LBM, et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 373-376; Wackett). , L. P. and Ellis, L. B. M. (1996) J. Microbiol Meth 25:..... 91-93; and Schmidt, M. (1996) Amer Soc Microbiol News 62: 102).
[0092]
In humans, acquired or congenital genetic defects in enzymes in the tyrosine degradation pathway can cause hereditary tyrosineemia type I. One type of this disease, hereditary tyrosinemia type I (HT1), is caused by a deficiency in the enzyme flumaryl acetoacetase hydrolase, the last enzyme in the pathway in organisms that metabolize tyrosine to fumaric acid and acetate acetate. Can be HT1 is characterized by progressive liver injury beginning in childhood and has an increased risk of liver cancer (Endo, F. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 24426-24432).
[0093]
The discovery of multiple novel drug metabolizing enzymes, and polynucleotides encoding them, can meet the needs in the art by providing novel compositions. The novel compositions are useful in the diagnosis, treatment and prevention of gastrointestinal disorders, including autoimmune / inflammatory disorders, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, ocular disorders, metabolic disorders, and liver disorders. Yes, it is also useful for evaluating the effect of foreign compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of drug metabolizing enzymes.
[0094]
(Summary of the Invention)
The present invention is collectively referred to as "DME", and individually as "DME-1", "DME-2", "DME-3", "DME-4", "DME-5", "DME-6". , "DME-7", "DME-8", "DME-9", and "DME-10" provided purified polypeptides that are drug metabolizing enzymes. In one embodiment of the invention, (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) a polypeptide comprising the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Biological activity of a natural polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence, and (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-10 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. provide. Alternatively, provided is an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-10.
[0095]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A polypeptide comprising a natural amino acid sequence having 90% or more sequence identity, and (c) a biologically active fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 And (d) an immunogenic fragment of the polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Provide nucleotides. Alternatively, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Alternatively, the polynucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20.
[0096]
Furthermore, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. And (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of: a fragment; and (d) an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Provided is a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked. Alternatively, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In yet another alternative, the invention provides a transgenic organism comprising the recombinant polynucleotide.
[0097]
The present invention also provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. And (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A method for producing a polypeptide selected from the group consisting of a fragment and an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (d) SEQ ID NOs: 1-10. . The method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide. And (b) recovering the polypeptide thus expressed.
[0098]
Furthermore, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. And (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of a fragment and an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: (d) SEQ ID NOs: 1-10. An isolated antibody is provided.
[0099]
Further, the present invention provides a polynucleotide sequence comprising: (a) a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20; and (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20. A natural polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence having 90% or more sequence identity to a polynucleotide sequence; (c) a polynucleotide sequence complementary to (a); and (d) a polynucleotide sequence complementary to (b). An isolated polynucleotide selected from the group consisting of a natural polynucleotide sequence and (e) the RNA equivalent of the above (a) to (d). Alternatively, the polynucleotide comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0100]
Further, the present invention provides (a) a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20, and (b) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20. A natural polynucleotide comprising a polynucleotide sequence having 90% or more sequence identity with the sequence; (c) a polynucleotide sequence complementary to (a); and (d) a polynucleotide sequence complementary to (b). A method is provided for detecting in a sample a target polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence and (e) the RNA equivalent of (a) to (d). The method comprises the steps of: (a) hybridizing a sample containing at least 20 contiguous nucleotides constituting a sequence complementary to a target polynucleotide in the sample with the sample, the method comprising: Said step of specifically hybridizing said probe to said target polynucleotide under conditions in which a hybridization complex is formed with nucleotides or fragments thereof, and (b) whether said hybridization complex is present And optionally measuring its yield, if present. Alternatively, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0101]
Further, the present invention provides (a) a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20, and (b) a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20. A natural polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence having 90% or more sequence identity with a nucleotide sequence; (c) a polynucleotide sequence complementary to (a); and (d) a polynucleotide sequence complementary to (b). And (e) detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the above-mentioned (a) to (d) RNA equivalents in a sample. The method comprises: (a) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification; and (b) detecting whether the amplified target polynucleotide or a fragment thereof is present. Optionally measuring the yield, if present.
[0102]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A biologically active fragment of a natural polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity and (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 An effective amount of a polypeptide selected from the group consisting of: (d) an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 1-10; A composition comprising a novel pharmaceutical excipient. In one embodiment, there is provided a composition comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. Furthermore, the present invention provides a method for treating a disease or a symptom thereof associated with reduced expression of functional DME, which comprises administering the composition to a patient.
[0103]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A biologically active fragment of a natural polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity and (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. To provide a method for screening. The method comprises: (a) exposing a sample comprising the polypeptide to a compound; and (b) detecting agonist activity of the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In a further alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional DME, comprising administering the composition to a patient.
[0104]
Furthermore, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. And (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A fragment and an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: (d) SEQ ID NO: 1-10, as an antagonist of a polypeptide selected from the group consisting of: Methods for screening compounds are provided. The method includes: (a) exposing a sample containing the polypeptide to a compound; and (b) detecting the antagonist activity of the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an antagonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with over-expression of functional DME, comprising administering the composition to a patient.
[0105]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A biologically active fragment of a natural polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity and (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, wherein the compound specifically binds to a polypeptide selected from the group. To provide a method for screening. The method comprises the steps of: (a) binding the polypeptide to at least one compound under suitable conditions; and (b) detecting binding of the polypeptide to the test compound to specifically bind the polypeptide to the test compound. Identifying a compound that binds to.
[0106]
Further, the present invention provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. A biologically active fragment of a natural polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity and (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10, wherein the compound modulates the activity of a polypeptide selected from the group consisting of: A method for screening is provided. The screening method comprises the steps of (a) binding the polypeptide to at least one compound under conditions permitting its activity; and (b) assessing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. (C) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, Is characterized by the fact that a change in the activity of the polypeptide in E. coli indicates the presence of a compound that modulates the activity of the polypeptide.
[0107]
The invention further provides a method of screening for a compound effective to alter expression of a target polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20, comprising: The present invention provides the screening method, comprising: exposing a sample containing nucleotides to a compound; and (b) detecting a change in expression of the target polynucleotide.
[0108]
The invention further provides a method for assessing the toxicity of a test compound. The method comprises the steps of (a) treating a biological sample containing a nucleic acid with the test compound, (b) hybridizing the nucleic acid of the treated biological sample with a probe, and (c) yield of a hybridization complex. And (d) comparing the yield of the hybridization complex in the treated biological sample with the yield of the hybridization complex in the untreated biological sample. Differences in the yield of hybridization complexes indicate toxicity of the test compound. The probe in this method comprises: (1) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20; and (2) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20. A natural polynucleotide sequence having at least 90% sequence identity, (3) a polynucleotide sequence complementary to (1), (4) a polynucleotide sequence complementary to (2), (5) And) at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents of (1) to (4). In addition, the hybridization is performed under a condition where a specific hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide of the biological sample. The target polynucleotide may be (1) a polynucleotide sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 11-20, and (2) a polynucleotide sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 11-20. (3) a polynucleotide sequence complementary to (1), (4) a polynucleotide sequence complementary to (2), and (3) a polynucleotide sequence complementary to (1). 5) RNA equivalents of the above (1) to (5). Alternatively, said target polynucleotide is a fragment of said polynucleotide sequence.
[0109]
(About the description of the present invention)
Before describing the protein and nucleic acid sequences and methods of the present invention, it is to be understood that this invention is not limited to particular devices, materials, and methods disclosed herein, which may vary in its embodiments. Further, the terms used herein are used only for the purpose of describing a specific embodiment, and are limited only by the claims described below, and are not intended to limit the scope of the present invention. It should be understood that.
[0110]
It should be noted that in the specification and claims, the terms "a", "an", and the like include "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, “a host cell” includes a plurality of host cells, and the “antibody” includes a plurality of antibodies, including equivalents well known to those skilled in the art.
[0111]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although all devices and materials and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice and testing of the present invention, the preferred devices, materials and methods are described here. All references mentioned herein have been cited to describe and disclose the cell lines, protocols, reagents, and vectors described in the literature that may be used in connection with the present invention. Citing a conventional invention does not, however, be construed as impairing the novelty of the present invention.
[0112]
(Definition)
The term "DME" refers to substantially purified DME amino acids obtained from all species, including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, particularly mammals, including cows, sheep, pigs, mice, horses and humans. Points to an array.
[0113]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of DME. The agonist may interact directly with DME or interact with components of the biological pathway in which DME is involved to regulate the activity of DME, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds, It may include a composition.
[0114]
The term "allelic variant" refers to another form of the gene encoding DME. Allelic variant sequences result from at least one mutation in the nucleic acid sequence, resulting in a variant mRNA or variant polypeptide, whose structure and function may or may not change. Some genes have no natural allelic variant, one or a large number thereof. In general, mutations that result in allelic variants are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these mutations may occur alone or concurrently with other mutations, and may occur one or more times within a given sequence.
[0115]
A “mutated” nucleic acid sequence encoding DME refers to a polypeptide that retains the same polypeptide as DME or has at least one of the functional properties of DME, despite the deletion, insertion, or substitution of various nucleotides. This definition includes improper or unexpected hybridization of the polynucleotide sequence encoding DME with the allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotide probes of the polynucleotide encoding DME. And polymorphisms that are easily detectable or difficult to detect using The encoded protein can also be mutated and contain deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and are functionally equivalent to DME. Intentional amino acid substitutions may be similar to residues in terms of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as the biological or immunological activity of DME is retained. It can be done based on For example, negatively charged amino acids can include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids can include lysine and arginine. Amino acids with similar hydrophilicity values and polar uncharged side chains may include asparagine, glutamine, serine, threonine. Amino acids with similar hydrophilicity values and uncharged side chains may include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, phenylalanine and tyrosine.
[0116]
The terms "amino acid" and "amino acid sequence" refer to oligopeptides, peptides, polypeptides, protein sequences, or any fragment thereof, and include natural and synthetic molecules. Where "amino acid sequence" refers to the sequence of a naturally occurring protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the described protein molecule.
[0117]
The term "amplification" relates to making a copy of a nucleic acid sequence. Generally, amplification is performed by the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art.
[0118]
The term "antagonist" is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of DME. Antagonists are antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds or compositions that directly interact with DME or interact with components of the biological pathway in which DME is involved to modulate the activity of DME. Can include proteins such as objects.
[0119]
The term "antibody" refers to Fab and F (ab ') that are capable of binding an antigenic determinant.₂, And their fragments, Fv fragments and the like. Antibodies that bind DME polypeptides can be made using intact molecules or fragments thereof, including small peptides that immunize the antibody. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit) can be synthesized from the translation of RNA or chemically, and can be coupled to a carrier protein if necessary. It is also possible. Commonly used carriers that are chemically coupled to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet haemonian (KLH). The animal is then immunized with the conjugated peptide.
[0120]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that contacts a particular antibody. When a protein or a fragment of a protein is used to immunize a host animal, various regions of the protein may be antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region or three-dimensional structure on the protein). Can be induced. Antigenic determinants can compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) to bind the antibody.
[0121]
As used herein, "antisense" refers to any composition capable of base-pairing with the sense (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense components include DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA), oligonucleotides having a modified backbone linkage such as phosphorothionate, methylphosphonate, benzylphosphonate, and 2 ′. Oligonucleotides having a modified sugar, such as -methoxyethyl sugar or 2'-methoxyethoxy sugar, and oligos having a modified base, such as 5-methylcytosine or 2'-deoxyuracil, 7-deaza-2'-deoxyguanosine May contain nucleotides. Antisense molecules can be created by any method, including chemical synthesis and transcription. Once introduced into a cell, a complementary antisense molecule base pairs with a natural nucleic acid sequence created by the cell to form a duplex and inhibit transcription and translation. The expression "negative" or "minus" is the antisense strand, and the expression "positive" or "plus" is the sense strand.
[0122]
The term "biologically active" refers to a protein having structural, regulatory, or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, the term "immunologically active" or "immunogenic" refers to natural or recombinant DME, synthetic DME, or any of their oligopeptides, that is capable of eliciting a specific immune response in a suitable animal or cell. Refers to the ability to induce and bind to a particular antibody.
[0123]
The term "complementary" refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, the sequence "5'AGT3 '" pairs with the complementary sequence "3'TCA5'."
[0124]
"Composition comprising a given polynucleotide sequence" or "composition comprising a given amino acid sequence" refers in a broad sense to any composition comprising a given nucleotide or amino acid sequence. The composition may include a dry formulation or an aqueous solution. Compositions comprising a polynucleotide sequence encoding DME or a fragment of DME can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, the probe is developed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, SDS: sodium dodecyl sulfate), and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). obtain.
[0125]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to separate unnecessary bases, and is extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), One or more overlapping cDNAs using a resequenced nucleic acid sequence or a computer program for fragment construction such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). And ESTs, or nucleic acid sequences constructed from genomic DNA fragments. Some consensus sequences are constructed by both extension and duplication.
[0126]
The term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the structure and function of the protein are not significantly changed by the substitution, and the structure of the protein, particularly its function, is preserved. The following shows conservative amino acid substitutions in which the original amino acid of one protein is replaced by another amino acid.

In general, for conserved amino acid substitutions, a) the backbone structure of the polypeptide in the substituted region, for example, a β-sheet or α-helical conformation; b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substituted site; And / or c) the majority of the side chains are maintained.
[0127]
The term "deletion" refers to a change in the amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in the nucleic acid sequence that lacks one or more nucleotides.
[0128]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. Chemical modifications of a polynucleotide sequence include, for example, replacement of hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group. A derivative polynucleotide encodes a polypeptide that retains at least one of the biological or immunological functions of the native molecule (the unmodified molecule). A derivative polypeptide is a polypeptide modified by glycosylation, polyethyleneglycolation, or any similar process that maintains at least one of the biological or immunological functions of the original polypeptide. That is.
[0129]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal, covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0130]
The term "fragment" refers to a unique portion of DME or a polynucleotide encoding DME that is identical to, but shorter in length than, its parent sequence. The maximum length of a "fragment" is the parent sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, some fragments contain from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. At least 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250, or 500 probes, primers, antigens, therapeutic molecules, or fragments used for other purposes Is the length of consecutive nucleotides or amino acid residues. Fragments may be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment can include a predetermined length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids set forth in the predetermined sequence (or the first 25% or 50% of the polypeptide). . These lengths are examples, and any length described in the specification including the sequence listing and the tables and drawings can be included in the examples of the present invention.
[0131]
Fragments of SEQ ID NOS: 11-20 include, for example, regions of the unique polynucleotide sequence that unambiguously identify SEQ ID NOS: 11-20 that are distinct from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NO: 11-20 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 11-20 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 11-20 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0132]
Certain fragments with SEQ ID NOs: 1-10 are encoded by certain fragments with SEQ ID NOs: 11-20. Certain fragments of SEQ ID NOs: 1-10 include regions of unique amino acid sequences that specifically identify SEQ ID NOs: 1-10. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-10 are useful as immunogenic peptides in the development of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-10. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 1-10 that corresponds to a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0133]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine) followed by an open reading frame and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
[0134]
"Homology" is sequence similarity between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences. This sequence similarity can be translated into sequence identity.
[0135]
The terms "percent identity" or "% identity" with respect to polynucleotide sequences are the percentage of matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is. Such an algorithm can insert gaps in the sequences to make a more meaningful comparison between the two sequences in a standardized and reproducible manner to optimize the alignment between the two sequences.
[0136]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and is a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is available from Higgins, D.W. G. FIG. And P.A. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Higgins, D.W. G. FIG. Et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For alignment of pairs of polynucleotide sequences, the default parameters are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. Percent identity is reported by CLUSTAL V as "percent similarity" between the aligned polynucleotide sequences.
[0137]
Alternatively, National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. A complete set of free sequence comparison algorithms is available from several sources, including NCBI (Bethesda, MD) and the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The BLAST software suite includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available and is used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / b12. You can access html and use it interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are commonly used with gaps and other parameters to set defaults. For example, when comparing two nucleotide sequences, one would use blastn with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set to default parameters. Such default parameters are, for example, as follows.
[0138]
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for Mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
Percent identity may be measured, for example, for the entire length of a given sequence, as determined by a particular SEQ ID NO: or for a shorter length, for example, from a larger given sequence. It may be measured against the length of a given fragment, for example a fragment of at least 20 or 30, 40, 50, 70, 100, 200 nucleotides in a row. Such lengths are merely examples, and any length fragment of the sequences set forth in the specification, including the sequence listing and the tables and drawings, may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
[0139]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of identity may encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It should be understood that degeneracy can be used to alter nucleic acid sequences to produce various nucleic acid sequences, each encoding substantially the same protein.
[0140]
The terms "percent identity" or "% identity" as used in polypeptide sequences refer to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is. Methods for polypeptide sequence alignment are well known. Some alignment methods take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as described in detail above, generally preserve the charge and hydrophobicity of the substitution site and preserve the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0141]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (described above). In the case of paired polypeptide sequence alignment using CLUSTAL V, the default parameters are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagons saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. As with polynucleotide alignments, the percent identity of a pair of aligned polypeptide sequences is reported by CLUSTAL V as "percent similarity".
[0142]
Alternatively, the NCBI BLAST software suite is used. For example, when comparing two polypeptide sequences in pairs, one may use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. There will be. Such default parameters are, for example, as follows.
[0143]
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
Percent identity may be measured, for example, over the entire length of a given polypeptide sequence, as determined by a particular SEQ ID NO: It may be measured against the length of fragments obtained from the peptide sequence, for example fragments of at least 15,20 or 30,40,50,70,150 contiguous residues. Such lengths are merely examples, and any length fragment of the sequences set forth in the specification, including the sequence listing and the tables and drawings, may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
[0144]
"Human artificial chromosomes (HACs)" are linear, small elements containing all the elements necessary for the separation and maintenance of stable mitotic chromosomes, which can include DNA sequences of about 6 kb (kilobases) to 10 Mb in size. It is a chromosome.
[0145]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been changed to more closely resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0146]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms a base pair with a complementary single-strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization means that two nucleic acid sequences have high homology. Under conditions that permit annealing, a specific hybridization complex is formed and remains hybridized after the washing step. The washing step is particularly important in determining the stringency or stringency of the hybridization process; in more stringent conditions, non-specific binding, ie, binding of pairs between nucleic acid strands that are not perfectly matched. Decrease. The conditions under which annealing between nucleic acid sequences is permissible are routinely determined by those skilled in the art, and are constant during hybridization, but the washing process is altered during the process to achieve the desired stringency. And hybridization specificity is obtained. Conditions that permit annealing include, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS at about 68 ° C., and about 100 μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
[0147]
In general, the stringency of hybridization also depends on the temperature at which the washing step is performed. This washing temperature is usually selected to be about 5-20C below the thermal melting point (Tm) of the particular arrangement at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature (under a given ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes with a perfectly matched probe. The equation for calculating the Tm and the conditions for nucleic acid hybridization are well known and are described in Sambrook, J. et al. By others, 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY;
[0148]
High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a washing step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. The concentration of SSC ranges from about 0.1 to 2x SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking reagents are used to block non-specific hybridization. Such blocking reagents include, for example, about 100-200 μg / ml of cleaved and denatured salmon sperm DNA. Organic solvents such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can be used in certain cases, such as, for example, hybridization of RNA and DNA. Useful modifications of these washing conditions are well known to those skilled in the art. Hybridization under particularly high stringency conditions can indicate evolutionary similarities between nucleotides. Such similarities strongly suggest that their nucleotides and encoded polypeptides play a similar role.
[0149]
The term "hybridization complex" refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. The hybridization complex is in solution (eg, C₀t or R₀t analysis) or one nucleic acid sequence in solution and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin, or glass slide, or any suitable fixation of cells and their nucleic acids) And another nucleic acid sequence immobilized on another substrate.
[0150]
The term "insertion" or "addition" refers to a change in the amino acid or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0151]
"Immune response" refers to symptoms associated with inflammatory diseases and trauma, immune disorders, infectious diseases, genetic diseases, and the like. These conditions are characterized by the expression of various factors, such as cytokines and chemokines, and other signaling molecules, that affect the cell line and the systemic defense system.
[0152]
The term “immunogenic fragment” refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of DME that elicits an immune response when introduced into a living animal, eg, a mammal. The term “immunogenic fragment” also includes polypeptide or oligopeptide fragments of DME useful herein for any of the methods for producing antibodies disclosed herein or known in the art.
[0153]
The term "microarray" refers to an arrangement of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0154]
The term "element" or "array element" refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound that has a unique, designated location on a microarray.
[0155]
The term "modulation" refers to a change in the activity of DME. For example, modulation results in a change in the protein activity, or binding properties, or other biological, functional, or immunological properties of DME.
[0156]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, or fragments thereof, single or double stranded, of genomic or synthetic origin that are sense or antisense strands DNA or RNA, peptide nucleic acid (PNA), any DNA-like substance, and RNA-like substance.
[0157]
"Operably linked" refers to the state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, when a promoter affects the transcription or expression of a coding sequence, the promoter is operably linked to the coding sequence. Generally, operably linked DNA sequences are very close together or contiguous if, in the same reading frame, the regions encoding the two proteins need to be joined.
[0158]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or an antigenic agent that comprises an oligonucleotide at least about 5 nucleotides in length attached to a peptide backbone of amino acid residues terminating in lysine. This terminal lysine renders the composition soluble. PNAs can preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA, stop transcript elongation, and become polyethylene glycolated to extend cell life.
[0159]
"Post-translational modifications" of DME may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of DME and can vary from cell type to cell type.
[0160]
The term "probe" refers to a nucleic acid sequence encoding DME, its complementary sequence, or a fragment thereof, which is used to detect the same or allele nucleic acid sequence or a related nucleic acid sequence. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide to which a detectable label or reporter molecule has been attached. Typical labels include radioisotopes and ligands, chemiluminescent reagents, and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. After the primer anneals to the polynucleotide, it is extended along the target DNA single strand by a DNA polymerase enzyme. The set of primers can be used, for example, for amplification (and identification) of a nucleic acid sequence in a PCR method.
[0161]
Probes and primers used in the present invention comprise at least 15 contiguous nucleotides of a known sequence. Longer probes and primers can be used to increase specificity. For example, it comprises at least 20 or 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences. It is to be understood that probes and primers can be used which are considerably longer than the examples described above, and that nucleotides of any length shown in the tables, drawings and sequence listings herein can be used.
[0162]
For the preparation and use of probes and primers, see, for example, Sambrook, J. et al. 1989, entitled "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Volume 1-3 (Cold Spring Harbor Press, Plainview NY), or Ausubel, F.C. M. In 1987, "Current Protocols in Molecular Biology" (Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY), and in 1990, by Innis et al. (Academic Press, San Diego CA.). A set of primers for PCR can be derived from a known sequence using a computer program for such purposes, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA). Can be.
[0163]
Oligonucleotides to be used as primers are selected by a computer program for selecting primers well known in the art. For example, OLIGO 4.06 software can select primer pairs for PCR up to 100 nucleotides each, and large polynucleotides and oligonucleotides up to 5,000 nucleotides from input polynucleotide sequences of up to 32,000 bases. It is useful for analysis. Similar primer selection programs include additional features to expand capacity. For example, the PrimOU primer selection program (available from the Genome Center at University of Texas South West Medical Center, Dallas TX) allows the selection of specific primers from the megabase sequence, thus providing a primer for genome-wide design. Useful for The Primer3 primer selection program (available from Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1) allows the user to enter a "non-priming library" that allows the designation of sequences to be avoided as primer binding sites. In addition, Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs can be obtained from the respective sources and modified to meet the needs of the user. You can also). The PrimerGen program (available from the UK Human Genome Mapping Project Resource Center, Cambridge UK) designs the primers based on multiple sequence alignments, and therefore the most conserved or least conserved regions of the aligned nucleic acid sequences. Can be selected. Thus, the program is useful for identifying unique and conserved oligonucleotide and polynucleotide fragments. Oligonucleotide or polynucleotide fragments identified by any of the selection methods described above may be used, for example, to identify polynucleotides, sequencing primers, microarray elements, or polynucleotides that completely or partially complement the nucleic acids of the sample. Useful for hybridization techniques, such as a probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the method described above.
[0164]
As used herein, a “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence in which two or more separate segments of a sequence are artificially combined. Although this artificial combination is often made by chemical synthesis, it is more common to artificially manipulate discrete segments of nucleic acids using genetic engineering techniques such as those described in Sambrook, supra. is there. The “recombinant nucleic acid” also includes a nucleic acid that has been changed simply by adding, replacing, or deleting a part of the nucleic acid. A recombinant nucleic acid may include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can be, for example, part of a vector used to transform a cell.
[0165]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid may be one of vaccinia virus-based viral vectors that, when used for vaccination of a mammal expressing the recombinant nucleic acid, elicits a protective immune response in the mammal. Department.
[0166]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, and includes enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription or translation, or RNA stability.
[0167]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and other components known in the art.
[0168]
As used herein, the term "RNA equivalent" for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as the reference DNA sequence, but the thymine of the nitrogenous base is replaced with uracil, and the backbone of the sugar chain is Consists of ribose, not deoxyribose.
[0169]
The term "sample" is used in its broadest sense. A sample presumed to contain DME, a nucleic acid encoding DME, or a fragment thereof is composed of a body fluid, an extract from a cell, a chromosome or an organelle isolated from a cell, a membrane, a cell, Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, tissue, tissue prints and the like.
[0170]
The terms "specific binding" and "specifically bind" refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction depends on the presence of specific structures of the protein, such as, for example, antigenic determinants or epitopes, recognized by the binding molecule. For example, if the antibody is specific for the epitope "A", the unbound labeled "A" and the reaction solution containing the antibody may contain the polypeptide containing epitope A or the unlabeled "A" ”Reduces the amount of label A that binds to the antibody.
[0171]
The term "substantially purified" refers to an isolated or isolated nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and has at least about 60% of its naturally associated composition removed. Preferably at least about 75% removed, most preferably at least 90% removed.
[0172]
"Substitution" refers to the replacement of one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0173]
The term "substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate has various surface features, such as walls or trenches, pins, channels, pores, etc., to which polynucleotides or polypeptides bind.
[0174]
"Transcription image" refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0175]
"Transformation" refers to the process by which foreign DNA is introduced into recipient cells. Transformation can occur under natural or artificial conditions by a variety of methods known in the art, and can be performed by any known method of inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. . The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. The methods include, but are not limited to, bacteriophage or viral infection, electroporation, lipofection, and microparticle irradiation. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that express the introduced DNA or introduced RNA temporarily for a limited time are also included.
[0176]
As used herein, a "genetically modified organism" is any organism in which a human has introduced a heterologous nucleic acid into one or more cells of the organism, using genetically well-known techniques in the art, and the like. And plants, but is not limited thereto. Heterologous nucleic acids are introduced into cells directly or indirectly into their precursors by careful genetic manipulation, such as microinjection or infection with recombinant viruses. "Genetic manipulation" refers to typical cross breeding andin in vitroIs to introduce a recombinant DNA molecule instead of fertilization at Genetically modified organisms according to the present invention include bacteria and cyanobacteria, fungi, plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods well known in the art, for example, infection, transfection, transformation, transconjugation, and the like. Techniques for introducing the DNA of the present invention into such organisms are well known and are described in Sambrook et al. (1989), supra.
[0177]
The “variant sequence” of a specific nucleic acid sequence is defined as a specific sequence for a certain nucleic acid sequence by blastn using a “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings. Is a nucleic acid sequence whose identity is determined to be at least 40%. Such pairs of nucleic acids may be, for example, at least 50% or 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% %, 98%, 99%, or more. Certain variant sequences can be referred to, for example, as "allelic" variant sequences (described above) or "splice" variant sequences, "species" variant sequences, "polymorphic" variant sequences. A splice variant may have very high identity to a reference molecule, but will have more or less polynucleotides due to alternative splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains present in the reference molecule, or may lack domains present in the reference molecule. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides have high amino acid identity with each other. Polymorphic variant sequences differ in the polynucleotide sequence of a particular gene in a given species. Polymorphic variant sequences can also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which one nucleotide of the polynucleotide sequence differs. The presence of a SNP may, for example, indicate a certain population, condition, or propensity for the condition.
[0178]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a blastp using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings to determine the length of a given polypeptide sequence. A polypeptide sequence for which the identity of the particular polypeptide sequence has been determined to be at least 40%. Such pairs of polypeptides may be, for example, at least 50% or 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, It can show 97%, 98%, 99% or more identity.
[0179]
(invention)
The present invention is based on the discovery of novel human drug metabolizing enzymes (DMEs) and polynucleotides encoding DMEs, and uses these compositions to treat autoimmune / inflammatory diseases, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders. Diagnosis, treatment, and prevention of gastrointestinal disorders, including, but not limited to, eye disorders, metabolic disorders, and liver disorders.
[0180]
Table 1 shows the identification numbers of the polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlate to one Incyte Project ID number (Incyte Project ID). Each polypeptide sequence is indicated by both a polypeptide sequence identification number (Polypeptide SEQ ID NO :) and an incyte polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID) as described. Each polynucleotide sequence is indicated by both a polynucleotide sequence identification number (Polynucleotide SEQ ID NO :) and an incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte Polynucleotide ID) as described.
[0181]
Table 2 shows sequences having homology to the polypeptides of the invention identified by BLAST analysis in the GenBank protein (genept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (Polypeptide SEQ ID NO :) and the corresponding insite polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the GenBank identification number (Genbank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score representing the match between each polypeptide and its GenBank homolog. Column 5 shows the annotation of the GwnBank homolog, with the appropriate citation in place. These are incorporated herein by reference.
[0182]
Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding insite polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID) of each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues in each polypeptide. Rows 4 and 5 show the potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI) of the GCG sequence analysis software package. Column 6 shows the amino acid residues that include the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for analysis of the structure / function of the protein, and the relevant part shows a searchable database used for the analysis method.
[0183]
Tables 2 and 3 both list the properties of the polypeptides of the present invention, and these properties demonstrate that the claimed polypeptide is a drug metabolizing enzyme. For example, SEQ ID NO: 9 has been shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 32% identity to the putative human N-acetyltransferase Camello2 (GenBank ID g66514438) (see Table 2). The BLAST probability score is 6.50E-23, indicating the probability that the polypeptide sequence alignment sought is obtained by chance. SEQ ID NO: 9 was also determined by searching for signal peptide signature sequences determined by the SPScan program and statistically significant matches in the Hidden Markov Model (HMM) -based PFAM database of conserved protein family domains. Acetyltransferase. The probability of HMM for acetyltransferase is 3.2e-12 (see FIG. 3). Based on BLAST and HMM analysis, the protein of SEQ ID NO 9 is an N-acetyltransferase (see Table 7). All of these signature sequences are highly statistically significant (see Table 7 for thresholds), for example, the HMM probability value for the ald-keto reductase family signature sequence is 5.6e-170. is there. Based on BLAST, HMM, BLIMPS, MOTI, and ProfileScan analysis, the protein of SEQ ID NO 10 is an aldo / keto reductase, including but not limited to glucose and carbonyl containing drug molecules and xenobiotics Reduces carbonyl-containing sugars and aromatics. SEQ ID NOs: 1-8 were analyzed and annotated with similar rules. The algorithms and parameters of SEQ ID NOs: 1-10 are described in Table 7.
[0184]
As shown in Table 4, the full length polynucleotide sequences of the present invention were assembled using cDNA sequences, or coding (exon) sequences from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Columns 1 and 2 show the polynucleotide sequence identification number (Polynucleotide SEQ ID NO :) of each polynucleotide of the present invention and the corresponding insite polynucleotide consensus sequence number (Incyte Polynucleotide ID), respectively. Column 3 shows the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Column 4 contains polynucleotide sequences useful for hybridization or amplification techniques, eg, to identify SEQ ID NO: 11-20 or to distinguish SEQ ID NO: 11-20 from related polynucleotide sequences. Shows a fragment. Column 5 indicates the cDNA sequence, the coding sequence (exons) deduced from genomic DNA, and / or the identification number corresponding to the group consisting of both cDNA and genomic DNA. These sequences were used to construct a full length polynucleotide sequence of the present invention. Columns 6 and 7 of Table 4 indicate the starting nucleotide (5 ') and ending nucleotide (3') positions of the cDNA and genomic sequences, respectively, corresponding to the sequence of column 5.
[0185]
Specifically, the identification numbers shown in column 5 of Table 4 indicate, for example, the identification numbers of in-site cDNAs and their corresponding cDNA libraries. For example, 370605F6 is the identification number of the insite cDNA sequence, and SININOT05 is the identification number of the cDNA library from which it was derived. Insite cDNAs for which no cDNA library is shown are derived from a pooled cDNA library (eg, 71447910V1). Alternatively, the identification number in column 5 may be the identification number of the GenBank cDNA or EST (eg, g5663459) used to assemble the polynucleotide sequence. Alternatively, the identification number in column 5 may be the coding region of the genomic DNA deduced by Genscan analysis. For example, GNN. g7025744 — 000055 — 002 is the identification number of the Genscan deduced coding sequence, and g7025744 is the identification number of the GenBank sequence obtained by Genscan analysis. This Genscan putative coding sequence may be edited before the sequence is assembled (Example 4See). Alternatively, the identification number in column 5 may be a group consisting of both cDNA and Genscan putative exons by the "exon-stitching" algorithm. For example, FL152824_00001 is a stitched sequence (“stitched” sequence), where 152824 indicates the cluster identification number of the sequence used in the algorithm, and 00001 indicates the number estimated by the algorithm (Example 5See). Alternatively, the identification number in column 5 may be a group consisting of both cDNA and Genscan putative exons by the “exon-stretching” algorithm (Example 5See). In some cases, a range of in-site cDNAs that overlap the range of sequences shown in column 5 is obtained and the final consensus sequence is determined, but the corresponding in-site cDNA identification numbers are indicated. Absent.
[0186]
Table 5 shows a representative cDNA library from these full-length polynucleotide sequences assembled using the insite cDNA sequence. A typical cDNA library is an insite cDNA library containing the largest amount of insite cDNA sequences used for assembling and determining the polynucleotide sequence. The tissues and vectors used to generate the cDNA libraries shown in Table 5 are shown in Table 6.
[0187]
The present invention also includes variants of DME. Preferred variants of DME have at least one of functional and / or structural characteristics of DME and have at least about 80% amino acid sequence identity to the DME amino acid sequence, or at least about 90% amino acid sequence. Have identity, and even at least about 95% amino acid sequence identity.
[0188]
The present invention also provides a polynucleotide encoding DME. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20 encoding DME. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 11-20 shown in the sequence listing contains an equivalent RNA sequence in which thymine, a nitrogenous base, is substituted with uracil, and the backbone of the sugar chain is composed of ribose instead of deoxyribose.
[0189]
The invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding DME. In particular, such a variant of the polynucleotide sequence may have at least 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding DME, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 95%. Has polynucleotide sequence identity. Certain embodiments of the present invention provide for at least 70% polynucleotide sequence identity, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 85% polynucleotide sequence identity to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20. A variant sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20 having as much as 95% polynucleotide sequence identity is provided. Each of the above-described polynucleotide variants encodes an amino acid sequence having at least one of the functional or structural characteristics of DME.
[0190]
One of skill in the art will recognize that the various polynucleotide sequences encoding DME that can be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known naturally occurring genes. Will understand. Thus, the present invention may include all possible polynucleotide sequence variations that may be made by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are made based on the standard triplet genetic code as applied to the polynucleotide sequence of native DME, and all variations are considered to be expressly disclosed.
[0191]
Nucleotide sequences encoding DME and mutated sequences thereof are generally capable of hybridizing to the nucleotide sequence of naturally occurring DME under suitably selected stringent conditions, but are substantially non-naturally occurring, such as including non-naturally occurring codons. It may be advantageous to generate nucleotide sequences encoding DME or derivatives thereof with different usage codons. Codons can be selected based on the frequency with which particular codons are utilized by the host to increase the rate at which expression of the peptide occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding DME and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA transcripts with favorable properties, such as longer half-lives, than transcripts made from the native sequence Is to make things.
[0192]
The invention also includes the creation of DNA sequences encoding DME and its derivatives or fragments thereof entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations into the sequence encoding DME or any fragment thereof.
[0193]
The invention further includes polynucleotide sequences that can hybridize under various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NOS: 11-20 and fragments thereof ( See, for example, Wahl, GM, and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; and Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511.). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in Definitions.
[0194]
Any of the embodiments of the present invention can be performed using DNA sequencing methods well known in the art. This method includes, for example, a Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech or Pisca Nevada, Biotech, Pisca, NY, USA). Enzymes, such as a combination of a proofreading exonuclease and a polymerase, such as those found in Gaithersburg MD, are used. Preferably, a device such as MICROLAB2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), PTC200 Thermal Cycler200 (MJ Research, Watertown MA) and ABI CATARYST 800 (PE Biosystems) are used to automatically prepare and arrange devices. Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (PE Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics. Sunnyvale CA), or another method known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg, Ausubel, FM (1997)).Short Protocols in Molecular BiologyMeyers, R., John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853. See).
[0195]
Various methods based on the PCR method known in the art are used to extend the nucleic acid sequence encoding DME using partial nucleotide sequences to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. For example, one method utilizing restriction site PCR involves amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using common and nested primers (eg, Sarkar, G. (1993)). PCR Methods Appl. 2: 318-322). Another method using the inverse PCR method uses primers that amplify an unknown sequence from a circularized template that has been extended in a wide range of directions. This template is derived from restriction fragments containing known genomic loci and surrounding sequences (see, eg, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). A third method using the capture PCR method involves PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA (eg, Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-). 119). In this method, it is possible to insert the recombinant double-stranded sequence into a region of unknown sequence before performing PCR using digestion and ligation with a number of restriction enzymes. It is also possible to obtain unknown sequences using other methods well known in the art. (See, e.g., Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Furthermore, the use of PCR, nested primers, and a PROMOTERFINDER library (Clontech, Palo Alto CA) allows walking within genomic DNA. This method eliminates the need to screen libraries and is useful for finding intron / exon junctions. In all PCR-based methods, the primers are 22-30 nucleotides in length using a commercially available OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program. It is designed to anneal to the mold at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C with a content of 50% or more.
[0196]
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries whose size has been selected to include large cDNAs. In addition, if the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA, a randomly primed library, often containing a sequence having the 5 'region of the gene, is useful. Genomic libraries will be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
[0197]
Using a commercially available capillary electrophoresis system, it is possible to analyze or confirm the size of the nucleotide sequence of the sequencing or PCR product. Specifically, for capillary sequencing, a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye specific for four different nucleotides, and a CCD camera for detecting the emitted wavelength It is possible to use The output / light intensity is converted to an electrical signal using appropriate software (eg, GENOTYPER and SEQUENCE NAVIGATOR, PE Biosystems), and the process from sample loading to computer analysis and electronic data display are computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that may be present in small amounts in a particular sample.
[0198]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding DME, or a fragment thereof, can be cloned into a recombinant DNA molecule to express DME, a fragment, or a functional equivalent, in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, alternative DNA sequences that encode substantially the same or a functionally equivalent amino acid sequence can be generated, and these sequences can be used for cloning and expression of DME.
[0199]
To alter the sequence encoding DME for various purposes, the nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods commonly known in the art. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Recombination of nucleotide sequences is possible using mixing of DNA with random fragments or PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, oligonucleotide-mediated directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon choices, create splice variants, and the like.
[0200]
The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). The biological properties of DME, such as its biological or enzymatic activity, or its ability to bind to other molecules or compounds, can be altered or improved. DNA shuffling is a process for preparing a library of gene variants by recombination of gene fragments by the PCR method. Next, the library is selected or screened to identify gene variants having the desired properties. These preferred variants are pooled and the DNA shuffling and selection / screening is repeated. Thus, diverse genes are created by artificial breeding and rapid molecular evolution. For example, recombination, screening, and shuffling of a single gene fragment having a mutation at a random position can be performed until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene fragment may be recombined with a homologous gene fragment of the same gene family of the same or a different species, thereby controlling the genetic diversity of the large number of native genes in a controllable manner according to the protocol. Can be maximized.
[0201]
According to another embodiment, the sequence encoding DME can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH, et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232. Alternatively, DME itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using a variety of solid-phase techniques (eg, Creighton, T. (1984)).Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60; Roberte, J .; Y. (1995) Science 269: 202-204). Automation of the synthesis can also be achieved using, for example, an ABI 431A peptide synthesizer (PE Biosystems). In addition, the amino acid sequence of DME, or any portion thereof, may be altered by direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof using chemical methods, to produce the natural sequence. It is possible to produce a polypeptide having a polypeptide sequence or a variant polypeptide.
[0202]
This peptide can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (see, for example, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see, eg, Creighton, supra, pp. 28-53).
[0203]
To express a biologically active DME, the nucleotide sequence encoding DME or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding DME. Such elements vary in their length and specificities. With a specific initiation signal, it is possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding DME. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding DME, its initiation codon and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG initiation codon must be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be obtained from a variety of sources, both natural and synthetic. Inclusion of suitable enhancers for the particular host cell line used can increase the efficiency of expression. (See, e.g., Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162.).
[0204]
Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector containing a sequence encoding DME and suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoGenetic recombination techniques are included. (See, for example, Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory ManualAusubel, F., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. (See Chapters 9 and 13 1-4).
[0205]
A variety of expression vector / host systems can be used to retain and express the sequence encoding DME. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors. (E.g., baculovirus) -infected insect cell lines, and plants transformed with a viral expression vector (e.g., cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (e.g., Ti or pBR322 plasmid). Cell lines, animal cell lines, etc. (for example, Sambrook, supra, Ausubel, Van Heke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509; Enge Lhard, EK, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987). ) EMBOJ.6: 307-311;The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY, pp. 146-64. 191-196, Logan, J.M. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 81: 3655-3659, Harrington, J.M. J. Et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355). Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to transport nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, 5 (6): 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, R. M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1985) Nature 317 (6040): 813-815; 1997) Na See 239-242, etc.): ure 389. The present invention is not limited by the host cell used.
[0206]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors are available depending on the use of the polynucleotide sequence encoding DME. For example, for routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide sequence encoding DME, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the DME-encoding sequence into multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, using these vectors,in in vitroTranscription, dideoxin screening, single-stranded rescue by helper phage, and nested deletions can be created (eg, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.). For example, when a large amount of DME is required, such as for the production of antibodies, a vector that induces DME expression at a high level can be used. For example, vectors containing a T5 or T7 bacteriophage promoter that strongly induces expression can be used.
[0207]
A yeast expression system can be used for DME expression. A variety of vectors containing constitutive or inducible promoters, such as α-factor, alcohol oxidase, and PGH promoter, have been used for yeast Saccharomyces cerevisiaePichia pastorisIt can be used for Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention in cells, incorporating foreign sequences into the host genome for stable growth. (See, for example, Ausubel, 1995, supra, Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544, and Scorer. CA, et al. (1994) Bio / Technology 121-181-184. reference).
[0208]
Plant systems can also be used for expressing DME. Transcription of the DME-encoding sequence is carried out, for example, by using a viral promoter such as the CaMV-derived 35S and 19S promoters alone, or by TMV (eg, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie). , R. et al. (1984) Science 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. (For example,The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw-Hill NY, pp. 191-196).
[0209]
In mammalian cells, a variety of virus-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding DME may be ligated to an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion of the viral genome into a non-essential E1 or E3 region makes it possible to obtain a live virus expressing DME in infected host cells (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. To express proteins at high levels, vectors based on SV40 or EBV can be used.
[0210]
Human artificial chromosomes (HACs) can be used to provide fragments of DNA larger than those expressed and contained in a plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb of HACs are made for treatment and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (See, e.g., Harrington. JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355.).
[0211]
For long-term production of mammalian-based recombinant proteins, stable expression of DME in cell lines is desirable. For example, an expression vector can be used to transform a DME-encoding sequence into a cell line. Such expression vectors include replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selective mediator, and its presence allows the growth and recovery of cells that reliably express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0212]
The transformed cell lines can be recovered using any number of selection systems. Selection systems include, but are not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase gene and the adenine phosphoribosyltransferase gene, each with a tk⁻Or apr⁻Used in cells. (See, e.g., Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als or pat confers resistance to chlorsulfuron, phosphinotricin acetyltransferase (eg, phosphinotricin acetyltransferase). (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). In addition, genes available for selection, such as trpB and hisD, which alter what cells need for metabolism, have been described in the literature (eg, Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51). Visible markers such as anitocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate GUS, luciferase and its substrate luciferin are used. Green fluorescent protein (GFP) (Clontech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers can be used to not only identify transformants, but also quantify transient or stable protein expression due to particular vector systems (see, eg, Rhodes, CA et al. 1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131).
[0213]
Even if the presence / absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding DME is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding DME can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be aligned with the sequence encoding DME under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0214]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding DME and that express DME can be identified using a variety of methods known to those of skill in the art. These methods include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, and protein biology including membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for the detection and / or quantification of nucleic acids or proteins. Test methods or immunological assays include, but are not limited to.
[0215]
Immunological methods for detecting and measuring the expression of DME using either specific polyclonal or monoclonal antibodies are well known in the art. Such techniques include immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIAs), and fluorescence activated cell sorters (FACS) coupled to enzymes. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on DME is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are well known in the art. (For example, Hampton. R. et al. (1990)Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV; Coligan, J .; E. FIG. otherCurrent Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; and Pound, J .; D. (1990)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ).
[0216]
Various labeling and conjugation techniques are well known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to a polynucleotide encoding DME include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding DME, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating an mRNA probe. Such vectors, which are well known and commercially available in the art, can be prepared by adding a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. These methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech and Promega (Madison WI), U.S. Pat. S. Biochemical Corp (Cleveland OH) can use various kits commercially available. Suitable reporter molecules or labels that can be used for easy detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0217]
Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding DME are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence used and / or the vector. Those skilled in the art will appreciate that expression vectors containing a polynucleotide encoding DME can be designed to include a signal sequence that directs secretion of DME across prokaryotic and eukaryotic cell membranes.
[0218]
In addition, a host cell strain may be chosen for its ability to modulate expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify the target protein, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38) with specific cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD). And selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0219]
In another embodiment of the present invention, a natural or altered or recombinant nucleic acid sequence encoding DME is linked to a heterologous sequence which translates into a fusion protein in any of the host systems described above. For example, a chimeric DME protein containing a heterologous moiety that can be recognized by a commercially available antibody may facilitate screening of peptide libraries for inhibitors of DME activity. Also, the heterologous protein portion and the heterologous peptide portion can facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such portions include glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-mc, hemagglutinin (HA). Including, but not limited to. GST and MBP, Trx, CBP, 6-His allow the purification of homologous fusion proteins with immobilized glutathione, maltose, phenylarsine oxide, calmodulin, and metal chelating resins, respectively. FLAG, c-mc, and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of the fusion protein using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, genetic manipulation of the fusion protein to include a proteolytic cleavage site between the sequence encoding DME and the heterologous protein sequence can result in cleavage of the DME from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel. (1995, supra ch 10). It is described in. Various commercially available kits can be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0220]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is used.in in vitroThe synthesis of radiolabeled DME is possible. These systems link the transcription and translation of sequences encoding proteins operably linked to the T7 or T3, SP6 promoter. Translation, for example,³⁵It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor that is S-methionine.
[0221]
Using the DME of the present invention or a fragment thereof, a compound that specifically binds to DME can be screened. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to DME. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0222]
In one embodiment, the compound so identified is closely related to a natural ligand of DME, eg, a ligand or a fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which DME binds, or at least some fragment of the receptor, eg, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves producing suitable cells that express DME as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, E. coli. Cells expressing DME or cell membrane fragments containing DME are contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either DME or the compound.
[0223]
Some assays simply allow the test compound to be experimentally bound to the polypeptide and the binding detected by a fluorophore, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include binding at least one test compound to DME in solution or immobilized on a solid support, and detecting binding of the DME to the compound. Alternatively, detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed using cell release agents, chemical libraries or natural product mixtures, wherein the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0224]
Using the DME of the present invention or a fragment thereof, it is possible to screen for a compound that regulates DME activity. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions where the activity of the DME is such that the DME binds to at least one test compound, and the activity of the DME in the presence of the test compound is increased by the activity of the DME in the absence of the test compound. Compare with activity. A change in the activity of DME in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of DME. Alternatively, the test compound comprises DME under conditions suitable for the activity of DMEin in vitroAlternatively, the assay is performed in combination with a cell release system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of DME can bind indirectly and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one and a plurality of test compounds can be screened.
[0225]
In another example, a polynucleotide encoding DME or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from an early mouse embryo and can be grown in a medium. These ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected, for example, from the C57BL / 6 mouse line. The blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are determined, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested for potential therapeutic or toxic agents.
[0226]
A polynucleotide encoding DMEin in vitroIt is possible to operate on ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0227]
Using a polynucleotide encoding DME, it is possible to create a "knock-in" humanized animal (pig) or transgenic animal (mouse or rat) using human disease as a model. Using knock-in technology, a region of a polynucleotide encoding DME is injected into animal ES cells, and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into a blastula and the blastula is implanted as described above. Study transgenic progeny or inbred lines, treat with potential medicines, and get information about the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress DME, eg, secrete DME into milk, can be a convenient source of proteins (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55). -74).
[0228]
(Treatment)
There is chemical and structural similarity between certain regions of DME and certain regions of drug metabolizing enzymes, for example, in the context of sequence and motifs. Furthermore, DME expression is closely associated with liver tumor cell lines, liver tumor tissue, pancreatic tissue, pituitary tumor, brain tumor, small intestinal cells, fetal brain tissue, and unequal cortical brain tissue. Thus, DME is thought to play a role in gastrointestinal disorders, including autoimmune / inflammatory disorders, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, ocular disorders, metabolic disorders, and liver disorders. In treating diseases associated with increased DME expression or activity, it is desirable to reduce DME expression or activity. In the treatment of a disease associated with decreased DME expression or activity, it is desirable to increase DME expression or activity.
[0229]
Thus, in one embodiment, it is possible to administer DME or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced DME expression or activity. Such disorders include, but are not limited to, autoimmune / inflammatory disorders, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, eye disorders, metabolic disorders, and gastrointestinal disorders, including liver disorders. Included among autoimmune / inflammatory diseases are inflammation and actinic keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, Anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, clone Disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocytic temporary lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasti Syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis , Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications Disease, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoan infections, helminthic infections, trauma, and solar keratosis among cell proliferation abnormalities And atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia, psoriasis, primary thrombocythemia, and Cancer and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver Cancer of the lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, and some developmental or developmental disorders include tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonad dysplasia, WAGR syndrome (Wilms' tumor, aniridia, genitourinary dysfunction, mental retardation), Smith-Magenis syndrome Hereditary nerves such as myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratosis, Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis , Hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spinal plexus, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss. Hypothalamus resulting from lesions such as primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations, thrombosis, infections, immune abnormalities, and head trauma complications. And pituitary disorders and associated hypogonadism including hypogonadism and Sheehan syndrome, diabetes insipidus, Kalman's disease, Hand-Schuller-Christian disease, Letra-Sybe disease, sarcoidosis, empty sera syndrome, dwarfism Disorders and inappropriate antidiuretic hormone (ADH) secretion syndrome (SIADH) and acromegaly, giant, prone to benign nematode And hypothyroidism including goiter and myxedema, bacterial infectious acute thyroiditis, viral infectious subacute thyroiditis, autoimmune thyroiditis (Hashimoto's disease), and cretinism And thyroid poisoning and its various forms, Graves' disease, anterior tibial myxedema, toxic multinodular goiter, thyroid carcinoma, hyperthyroidism including Plummer's disease, and Conn's disease (chronic hypercaremia) ), Pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications, hyperplasia and adenoma carcinomas and adenomas, hypertension, amyloidosis, hypokalemia, Cushing's disease associated with alkalosis Disorders related to the adrenal glands such as, Riddle syndrome, Arnold-Heally-Gordon syndrome, brown cell tumor, adrenal insufficiency And abnormal prolactin production and infertility in women, endometriosis, menstrual cycle perturbation, polycystic ovarian disease, hyperprolactinemia, selective gonadotropin deficiency, amenorrhea, milk leakage , Semi-yin and yang, hirsutism and virilization, breast cancer, postmenopausal osteoporosis, Leydig cell hyperplasia in men, menopause, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumors, lack of androgen receptor Related diseases include gonad steroid hormones such as androgen resistance, 5α-reductase syndrome, and female mastosis. Among diseases of the eye, conjunctivitis, keratoconjunctivitis sicca, keratitis, episcleritis, Iritis, posterior uveitis, glaucoma, transient amaurosis, ischemic optic neuropathy, optic neuritis, Leber hereditary optic neuropathy, Includes coelectomy, retinal detachment, cataract, macular degeneration, central serous chorioretinopathy, retinitis pigmentosa, choroidal melanoma, retrobulbar tumor, chiasmal tumor, and some metabolic disorders , Adrenal insufficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, adrenocortical hyperplasia, coumarin resistance, cystic fibrosis, diabetes, fatty cirrhosis, fructose-1,6-diphosphatase deficiency, galactosemia, goiter, glucagonoma, Glycogenosis, hereditary fructose intolerance, hyperadrenergic disease, renal insufficiency, hyperparathyroidism, hypoparathyroidism, hypercholesterolemia, hyperthyroidism, hypoglycemia, hypothyroidism, hyperlipidemia Disease, lipid myopathy, lipodystrophy, lysosomal storage disease, Menkes syndrome, occipital horn syndrome, ma Nosidosis, neuraminidase deficiency, obesity, pentose-phenylketonuria, pseudovitamin D deficiency, hypocalcemia, hypophosphatemia, postpubertal cerebellar ataxia, tyrosinemia, Some gastrointestinal disorders include dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, digestive disorders, gastritis, stomach cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema , Abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreatic cancer, biliary disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, hereditary hyperbilirubinemia , Cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel Syndrome, short and small intestine syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hepatic steatosis, hemochromatosis, Wilson's disease, α-1 -Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal venous occlusion and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes sexually acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular regeneration and adenomas, carcinomas.
[0230]
In another embodiment, a vector capable of expressing DME or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of DME, including but not limited to the diseases listed above, is provided. It can also be administered to patients.
[0231]
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified DME for the treatment or prevention of a disease associated with reduced DME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. Can be administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0232]
In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of DME is administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced DME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible.
[0233]
In a further example, a patient can be administered an antagonist of DME for the treatment or prevention of a disease associated with increased DME expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, the autoimmune / inflammatory disorders described above, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, ocular disorders, metabolic disorders, and liver disorders described above. Includes gastrointestinal disorders. In one embodiment, an antibody that specifically binds to DME can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver an agent to cells or tissues that express DME.
[0234]
In another embodiment, the complement of a polynucleotide encoding DME is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased DME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. The vector can be administered to the patient.
[0235]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, and vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. One skilled in the art can select a suitable therapeutic agent to use in combination therapy according to conventional pharmaceutical principles. Combinations with therapeutic agents can have synergistic effects in the treatment or prevention of the various diseases listed above. Using this method, it is possible to achieve a medicinal effect with a small amount of each drug, and to reduce the possibility of a wide range of side effects.
[0236]
DME antagonists can be prepared using methods common in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified DME, or a therapeutic drug library can be screened to identify those that specifically bind to DME. Antibodies to DME can also be produced using methods common in the art. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. For therapeutic use, neutralizing antibodies (ie, those that inhibit dimer formation) are particularly preferred.
[0237]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are immunized by injection of DME or any fragment, or oligopeptide thereof with immunogenic properties. Can be done. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include surfactants such as Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. However, the present invention is not limited to these. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) andCorynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0238]
Oligopeptides, peptides, or fragments used to elicit antibodies against DME are composed of at least about 5 amino acids, and generally are preferably composed of about 10 or more amino acids. Desirably, these oligopeptides or peptides, or fragments thereof, are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein. Short stretches of DME amino acids can be fused to sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0239]
Monoclonal antibodies to DME can be produced by continuous cell lines in culture using any technique that produces antibody molecules. These technologies include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-495). (497) Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81-8-42; Cote, RJ. Et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; (See SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).
[0240]
In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene to a human antibody gene developed for the production of a “chimeric antibody” are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81-4855-14855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. ) Nature 314: 452,454). Alternatively, the techniques described for the production of single-chain antibodies are applied using methods well known in the art to generate DME-specific single-chain antibodies. Antibodies of related idiotype composition with related specificity can also be generated by chain mixing from random combinations of immunoglobulin libraries (see, eg, Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-3).
[0241]
Antibodies in lymphocyte populationsin VivoIt can also be obtained by inducing production, or by screening immunoglobulin libraries or by screening a panel of highly specific binding reagents as indicated in the literature (eg, Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0242]
Antibodies containing specific binding sites for DME can also be obtained. For example, such fragments include F (ab ') generated by pepsin digestion of an antibody molecule.₂Fragments and Fab fragments generated by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment include, but are not limited to. Alternatively, creating a Fab expression library allows for the rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (eg, Huse, WD et al. (1989) Science 254: 1275-). 1281).
[0243]
Screening is performed using various immunoassays to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding assays, using either polyclonal or monoclonal antibodies with sequestered specificity, or immunoradiation assays, are well known in the art. Usually, such immunoassays involve the measurement of modulation of the complex between DME and its specific antibody. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering DME epitopes is commonly used, but a competitive binding assay can also be used (Pound, supra).
[0244]
Various methods, such as Scatchard analysis, are used in conjunction with radioimmunoassay techniques to assess the affinity of the antibody for DME. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the value obtained by dividing the molar concentration of the DME antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The Ka of a polyclonal antibody drug with heterogeneous affinity for multiple DME epitopes represents the average affinity or avidity of the antibody for DME. The Ka of a monoclonal antibody drug monospecific for a particular DME epitope represents a true measure of affinity. Ka value is 10⁹-10¹²The L / mol high affinity antibody drug is preferably used in immunoassays where the DME antibody conjugate must withstand severe manipulations. Ka value is 10⁶-10⁷The L / mol low affinity antibody drug is preferably used for immunopurification and similar treatments where DME must ultimately dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; E. FIG. and Cryer, A.C. (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0245]
To determine the quality and suitability of such drugs for certain downstream applications, the antibody titer and avidity of the polyclonal antibody drug are further evaluated. For example, polyclonal antibody medicaments containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used in processes where DME antibody complexes must be precipitated. Guidance on antibody specificity and titer, binding activity, antibody quality and usage in various applications is generally available. (See, eg, Catty, supra, and Colligan et al., Supra).
[0246]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding DME, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In one embodiment, gene expression can be altered by designing sequences and antisense molecules (DNA and RNA, modified nucleotides) that are complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding DME. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the sequence encoding DME, or from various locations along the coding region.
[0247]
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing the antisense sequences into suitable target cells can be used. Antisense sequences can be delivered intracellularly in the form of an expression plasmid that, upon transcription, expresses a sequence that is complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (see, eg, Slater, JE. Et al. 1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475; and Scanlon, KJ. Et al. (1995) 9 (13): 1288-1296. Antisense sequences can also be introduced into cells using, for example, viral vectors such as retroviruses and adeno-associated virus vectors (eg, Miller, AD (1990) Blood 76: 271; Ausubel, supra). Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347). Other genetic delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes, and other systems well known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217-225; Boado, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315; and Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730. -2736.).
[0248]
In another embodiment of the present invention, the polynucleotide encoding DME can be used for somatic or germ cell gene therapy. Gene therapy involves (i) a severe combined immunodeficiency (SCID) -X1 characterized by a genetic deficiency (eg, X chromosome linkage (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)). ), A hereditary adenosine-deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480; Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475). Complex immunodeficiency, cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene @ Therapy 6: 643-666; Crystal, RG Others (199 Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to factor VIII or factor IX deficiency (Crystal, 35 ° RG (1995) Science 270: Verma, IM and Somia, N. (1997) Nature 389: 239-242), or (ii) a conditional lethal gene product (eg, in cancer due to uncontrolled cell proliferation). And (iii) intracellular parasites such as the human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396; Poescbla, E. et al. (1996) Proc. Natl.Aca USA 93: 11395-11399), hepatitis B or C virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites, such asPlasmodium falciparumas well asTrypanosoma cruziEtc.) can be carried out by expressing a protein having a protective function against parasite parasites such as If a deficiency in the gene required for DME expression or regulation causes the disease, DME can be expressed from a suitable population of the introduced cells to mitigate the symptoms caused by the gene deficiency.
[0249]
In a further embodiment of the invention, diseases and disorders caused by DME deficiency are treated by creating mammalian expression vectors encoding DME and introducing these vectors into DME-deficient cells by mechanical means. .in VivoOrex in vitroMechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) microinjection of DNA into individual cells, (ii) bombardment of gold particles, (iii) liposome-mediated transfection, (iv) receptor-mediated Gene transfer and (v) DNA transposon (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217; Ivics, Z. (1997) Cell 91: 501-). 510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0250]
Expression vectors that can affect DME expression include, but are not limited to, PCDNA 3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX vector (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTT-OFF, PTTET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express DME, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene); (Ii) Inducible promoter (eg, a tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Inc.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Bluu (1998) Curr. Opin. Biotechno. 9: 451-456)), ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), FK506 / rapamycin inducible promoter, or RU486 / mifepristone inducible promoter ( Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) the natural or tissue-specific promoter of an endogenous gene encoding DME from a normal individual. It is.
[0251]
Using commercially available liposome transformation kits (eg, PERFECT LIPID and TRANSFECTION KIT sold by Invitrogen), one skilled in the art can introduce polynucleotides into target cells in culture without much recourse to experience. . Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845. ). In order to introduce DNA into primary cells, these standard mammalian transfection protocols need to be modified.
[0252]
In another embodiment of the invention, the disease or disorder caused by a genetic defect associated with the expression of DME is characterized in that (i) polymorphism encoding DME under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter Nucleotides and (ii) a suitable RNA packaging signal and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences necessary for efficient vector propagation. Retrovirus vectors can be produced and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are available from Stratagene and published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6733-6737). ) Based on. The above data is incorporated herein by reference. This vector is VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650; Bender, MA. Et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646; Adam, MA. and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806; Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471; Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. : 9873-9880) or a suitable vector producing cell line (VPCL) that expresses a promiscuous envelope protein or an envelope gene that has an affinity for the receptor on the target cell. U.S. Patent No. 5,910,434 to RIGG ("Method for observing retrovirus packaging cell lines producing high transducing effect"; a method for disseminating the virus in a retrospective system) Citation is incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, certain cell populations (eg, CD4⁺Methods for transducing T cells) and returning the transduced cells to the patient are well known in the field of gene therapy and are described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997) J. Virol. 71: 7020-7029; Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267; Bonyhadi, M. L. (1997) J. Virol. 71: 4707-4716; Ranga, U. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206: Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0253]
Alternatively, an adenovirus-based gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding DME to cells having one or more genetic abnormalities associated with DME expression. The production and packaging of adenovirus-based vectors is well known in the art. Replication-defective adenovirus vectors have been shown to be variable to introduce genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets of the pancreas (Csete, ME et al. (1995)). Transplantation 27: 263-268). Adenovirus vectors that may be used are described in US Pat. No. 5,707,618 (“Adenovirus vectors for gene therapy”), which is hereby incorporated by reference. For adenovirus vectors, see also Antinozzi, P. et al. A. Et al. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544; and Verma, I .; M. and N.M. Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242, which is hereby incorporated by reference.
[0254]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a DME-encoding polynucleotide to target cells that have one or more genetic abnormalities associated with DME expression. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors are particularly important for introducing DME into central nervous cells with HSV affinity. The production and packaging of herpes-based vectors is well known in the art. Vectors of the replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385). -395). The construction of the HSV-1 viral vector is described in U.S. Pat. No. 5,804,413 to DeLuca (Herpes simple viruses against genes transfer), which is incorporated herein by reference. . U.S. Patent No. 5,804,413 discloses a recombinant HSV comprising a genome containing at least one endogenous gene introduced into a cell under the control of a suitable promoter for purposes including human gene therapy. There is a description about d92. The patent also discloses methods for making and using recombinant HSV strains that are removed for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. Et al. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; Et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161, which are hereby incorporated by reference. Manipulation of cloned herpesvirus sequences, passage of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the genome of the herpesvirus giant, growth and propagation of herpesvirus, and transfer to herpesvirus cells Infection is a technique well known in the art.
[0255]
Alternatively, a polynucleotide encoding DME is delivered to target cells using an alpha virus (positive single-stranded RNA virus) vector. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been performed extensively and found that the gene transfer vector is based on the SFV genome (Garoff). , H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is usually created that encodes the viral capsid protein. Because this subgenomic RNA is replicated at a higher level than full-length genomic RNA, capsid proteins are produced in excess of viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding DME into a region encoding the capsid of the alphavirus genome, a large number of DME-encoding RNAs are produced in the vector-transfected cells, and DME is synthesized at a high level. Alpha virus infection usually involves cell lysis within 2-3 days, but the ability to establish persistent infection of normal kidney cells of hamsters (BHK-21) with Sindbis virus (SIN) variants Suggest that the lytic replication of the α virus can be suitably altered to be applicable to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). ). Since the α virus can be introduced into various hosts, DME can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of the cells before transduction. The manipulation of infectious cDNA clones of α-virus, transfection of α-virus cDNA and RNA, and methods of infecting α-virus are well known in the art.
[0256]
For example, oligonucleotides derived from the transcription initiation site from about -10 to about +10 from the start site can be used to inhibit gene expression. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing. Triple helix structures are useful because they prevent the double helix from spreading sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules. Recent therapeutic advances using triple-stranded DNA have been described in the literature (eg, Gee, JE et al. (1994) In: Huber, BE and BI Carr,Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing Co., Ltd. , Mt. Kisco, NY). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to prevent translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
[0257]
Ribozymes, which are enzymatic RNA molecules, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand breaks. For example, a recombinant hammerhead ribozyme molecule that specifically and effectively catalyzes the cleavage of a nucleotide sequence of a sequence encoding DME is included.
[0258]
Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are initially identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites that include the following sequences GUA, GUU, and GUC. Once identified, the short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site is evaluated for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional Is possible. The suitability of a candidate target can also be assessed by using a ribonuclease protection assay to test the ease of hybridization with a complementary oligonucleotide.
[0259]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made for synthesis of the nucleic acid molecule using methods well known in the art. These methods include methods for chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, the RNA moleculein in vitroas well asin VivoSuch DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6, by transcription of the DNA sequence encoding DME. Alternatively, those cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into a cell line, cell, or tissue.
[0260]
Modification of an RNA molecule can increase intracellular stability and increase half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end of the molecule, or modifications using phosphorothioate or 2'O methyl instead of phosphodiester bonds in the backbone of the molecule. Including, but not limited to. This concept inherent in the production of PNAs includes acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine that are not readily recognized by endogenous endonucleases, as well as These molecules can be expanded throughout by including non-conventional bases such as inosine, queosine, and wybutosine.
[0261]
A further embodiment of the invention includes a method of screening for a compound that is effective in altering the expression of a polynucleotide encoding DME. Compounds that are effective in altering the expression of a particular polynucleotide include, but are not limited to, non-polymeric chemicals, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides that can interact with a particular polynucleotide sequence. Includes nucleotides, transcription factors and other polypeptide transcription regulators. An effective compound can act as an inhibitor or enhancer of polynucleotide expression and alter polynucleotide expression. Accordingly, in the treatment of diseases associated with increased DME expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding DME are therapeutically useful, and are associated with decreased DME expression or activity. In treating disease, compounds that specifically enhance the expression of a polynucleotide encoding DME may be therapeutically useful.
[0262]
At least one to a plurality of test compounds can be screened to determine the effectiveness of an alteration in the expression of a particular polynucleotide. Test compounds can be obtained by any method known in the art, including chemical modification of an effective compound. Such methods may be based on the chemical and / or structural properties of the target polynucleotide when altering the expression of the polynucleotide, selecting from a library of commercially available or proprietary natural or non-natural compounds, and altering the expression of the polynucleotide. It is effective when designing a compound rationally and further selecting from a library of compounds generated in combination or randomly. A sample comprising a polynucleotide encoding DME is obtained by exposing to at least one test compound. Samples include, for example, intact cells, permeabilized cells,in in vitroCell free or reconstituted biochemical systems may be included. Changes in the expression of a polynucleotide encoding DME are assayed by any method known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding DME. The hybridization yield is quantified, and that value can be a basis for comparing the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. A change in the expression of a polynucleotide that is exposed to the test compound is detected, indicating that the test compound is effective in altering the expression of the polynucleotide. To determine compounds that are effective at altering the expression of a particular polynucleotide, for example,Schizosaccharomyces pombeGene expression system (Atkins, D. et al. (1999) U.S. Pat. No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell lines such as HeLa cells (Clarke) , ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). A particular embodiment of the present invention involves screening a combinatorial library of each oligonucleotide (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, and modified oligonucleotides) for antisense activity against a specific polynucleotide sequence (Bruice). (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0263]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitro,as well asex VivoEqually suitable for use inex VivoIn the case of treatment with, the vector is introduced into hepatocytes collected from a patient and cloned and propagated to return the same patient by autologous transplantation. Transfection, ribosome injection, or delivery by polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (eg, Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462-66: See).
[0264]
Any of the treatment methods described above can be applied to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, and monkeys.
[0265]
Another embodiment of the present invention relates to the administration of a medicament or sterile composition with a pharmaceutically acceptable carrier for all of the above-mentioned therapeutic effects. Such compositions comprise DME, antibodies to DME, mimetics, agonists, antagonists, or inhibitors of DME, and the like. The composition can be administered alone or in combination with one or more other agents, such as stabilizers, to a sterile, biocompatible pharmaceutical carrier. Such pharmaceutical carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water, and the like. The composition can be administered alone or with another drug, such as a drug or hormone.
[0266]
The composition used in the present invention can be administered using various routes. This route includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, or rectal Is not limited to these.
[0267]
Compositions for pulmonary administration can be prepared in liquid or dry powder form. Such compositions typically aerosolize shortly before inhalation by the patient. In the case of small molecules (eg, conventional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast acting formulations is well known in the art. In the case of macromolecules (e.g., larger peptides and proteins), the technology for pulmonary transport through the alveolar region of the lung has improved in recent years, making it possible to actually transport drugs such as insulin into the blood ( See Patton, JS, et al., US Patent No. 5,997,848). Pulmonary delivery is advantageous in that it can be administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0268]
Suitable compositions for use in the present invention include compositions that contain an effective amount of the active ingredient to achieve its intended purpose. One skilled in the art can determine the effective dose with sufficient ability.
[0269]
Preferably, the composition is prepared in a special form to deliver the macromolecule containing DME or a fragment thereof directly into the cell. For example, a liposome formulation containing a cell-impermeable polymer can promote cell fusion and intracellular transport of the polymer. Alternatively, DME or a fragment thereof can be attached to the cationic N-terminus of the HIV Tat-1 protein. It has been confirmed that the fusion protein thus produced is transduced into cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285: 1569-). 1572).
[0270]
For any composition, a therapeutically effective dose can be estimated initially either in tumor cell assays, for example, on tumor cells, or in animal models. Usually, a mouse, rabbit, dog, monkey, pig, or the like is used as an animal model. Animal models can also be used to determine suitable enrichment ranges and routes of administration. Based on such treatment, beneficial dosages and routes for administration in humans can be determined.
[0271]
A medically effective dosage relates to the amount of active ingredient that ameliorates the symptoms or condition, eg, DME or a fragment thereof, an antibody to DME, an agonist or antagonist of DME, an inhibitor, and the like. Medicinal efficacy and toxicity are, for example, ED₅₀(Dose that is pharmaceutically effective in 50% of the population for taking) or LD₅₀(Dose that is lethal to 50% of the population for dosing) can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, such as calculating statistics. The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and the LD₅₀/ ED₅₀It can be shown. Compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for human application. Dosages in which such compositions are included may have little or no toxicity, ED₅₀It is desirable that the concentration be in the blood concentration range containing The dosage varies within this range depending upon the dosage form employed, the sensitivity of the patient, and the route of administration.
[0272]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the patient requiring treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors to consider include dose severity, general health of the patient, age, weight, and gender of the patient, time and frequency of administration, concomitant medications, response sensitivities, and Response is included. Long-acting compositions can be administered once every three or four days, once a week, once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0273]
Normal dosage amounts will vary depending on the route of administration, but will range up to about 0.1-100,000 μg up to about 1 gram. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to practitioners in the art. One skilled in the art will utilize formulations of nucleotides that are different from the protein or inhibitor. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
[0274]
(Diagnosis)
In another embodiment, an assay for diagnosing a disease characterized by the expression of DME, or monitoring a patient being treated with a DME or an agonist or antagonist or inhibitor of DME, wherein the antibody that specifically binds to DME is used. Used for Antibodies useful for diagnosis are formulated in the same manner as described for therapy. Diagnostic assays for DME include methods that use antibodies and labels to detect DME from human body fluids or from cells or tissues. These antibodies can be used with or without modification, and can be labeled by covalent or non-covalent attachment of a reporter molecule. Various reporter molecules known in the art may be used, some of which are described above.
[0275]
Various protocols for measuring DME, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide a basis for diagnosing abnormal or abnormal levels of DME expression. Normal or standard DME expression values are determined by combining an antibody against DME with body fluids or cells taken from a subject, such as a normal mammal, eg, a human, under conditions suitable for complex formation. I do. The amount of standard complex formation can be quantified by various methods such as photometric. The amount of DME expression in the subject, control and disease, samples from biopsy tissue are compared to baseline values. The deviation between the reference value and the subject is a diagnostic indicator.
[0276]
According to another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding DME may be used for diagnosis. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotide is used to detect and quantify the expression of the gene in a biopsy tissue that expresses DME that can be correlated with the disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of DME, as well as overexpression, and to monitor modulation of DME levels during treatment.
[0277]
In one embodiment, the nucleic acid sequence encoding DME can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising the gene sequence encoding DME or a closely related molecule. The specificity of a probe, whether it is made from a highly specific region, for example, the 5 'regulatory region, or a region of relatively low specificity, such as a conserved motif, and the stringency of hybridization or amplification, Will identify only natural sequences that encode DME, or only natural sequences that encode alleles and related sequences.
[0278]
Probes can also be used for the detection of related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding DME. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 11-20 or a genomic sequence containing the promoter, enhancer, and intron of the DME gene.
[0279]
As a method for producing a hybridization probe specific to DNA encoding DME, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding DME and a DME derivative into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are commercially available and are well known to those skilled in the art, and by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroUsed to synthesize RNA probes. Hybridization probes are, for example,³²P or³⁵It can be labeled with a population of various reporters, such as radionuclides such as S, or enzymatic labels such as alkaline phosphatase linked to the probe by an avidin / biotin binding system.
[0280]
The polynucleotide sequence encoding DME can be used to diagnose a disease associated with DME expression. Such disorders include, but are not limited to, autoimmune / inflammatory disorders, abnormal cell proliferation, developmental or developmental disorders, endocrine disorders, eye disorders, metabolic disorders, and gastrointestinal disorders, including liver disorders. Included among autoimmune / inflammatory diseases are inflammation and actinic keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, Anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, clone Disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocytic temporary lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasti Syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, psoriasis , Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications Disease, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoan infections, helminthic infections, trauma, and solar keratosis among cell proliferation abnormalities And atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia, psoriasis, primary thrombocythemia, and Cancer and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver Cancer of the lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterus, and some developmental or developmental disorders include tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, chondrodysplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonad dysplasia, WAGR syndrome (Wilms' tumor, aniridia, genitourinary dysfunction, mental retardation), Smith-Magenis syndrome Hereditary nerves such as myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratosis, Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis , Hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spinal plexus, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss. Hypothalamus resulting from lesions such as primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations, thrombosis, infections, immune abnormalities, and head trauma complications. And pituitary disorders and associated hypogonadism including hypogonadism and Sheehan syndrome, diabetes insipidus, Kalman's disease, Hand-Schuller-Christian disease, Letra-Sybe disease, sarcoidosis, empty sera syndrome, dwarfism Disorders and inappropriate antidiuretic hormone (ADH) secretion syndrome (SIADH) and acromegaly, giant, prone to benign nematode And hypothyroidism including goiter and myxedema, bacterial infectious acute thyroiditis, viral infectious subacute thyroiditis, autoimmune thyroiditis (Hashimoto's disease), and cretinism And thyroid poisoning and its various forms, Graves' disease, anterior tibial myxedema, toxic multinodular goiter, thyroid carcinoma, hyperthyroidism including Plummer's disease, and Conn's disease (chronic hypercaremia) ), Pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications, hyperplasia and adenoma carcinomas and adenomas, hypertension, amyloidosis, hypokalemia, Cushing's disease associated with alkalosis Disorders related to the adrenal glands such as, Riddle syndrome, Arnold-Heally-Gordon syndrome, brown cell tumor, adrenal insufficiency And abnormal prolactin production and infertility in women, endometriosis, menstrual cycle perturbation, polycystic ovarian disease, hyperprolactinemia, selective gonadotropin deficiency, amenorrhea, milk leakage , Semi-yin and yang, hirsutism and virilization, breast cancer, postmenopausal osteoporosis, Leydig cell hyperplasia in men, menopause, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumors, lack of androgen receptor Related diseases include gonad steroid hormones such as androgen resistance, 5α-reductase syndrome, and female mastosis. Among diseases of the eye, conjunctivitis, keratoconjunctivitis sicca, keratitis, episcleritis, Iritis, posterior uveitis, glaucoma, transient amaurosis, ischemic optic neuropathy, optic neuritis, Leber hereditary optic neuropathy, Includes coelectomy, retinal detachment, cataract, macular degeneration, central serous chorioretinopathy, retinitis pigmentosa, choroidal melanoma, retrobulbar tumor, chiasmal tumor, and some metabolic disorders , Adrenal insufficiency, cerebrotendinous xanthomatosis, adrenocortical hyperplasia, coumarin resistance, cystic fibrosis, diabetes, fatty cirrhosis, fructose-1,6-diphosphatase deficiency, galactosemia, goiter, glucagonoma, Glycogenosis, hereditary fructose intolerance, hyperadrenergic disease, renal insufficiency, hyperparathyroidism, hypoparathyroidism, hypercholesterolemia, hyperthyroidism, hypoglycemia, hypothyroidism, hyperlipidemia Disease, lipid myopathy, lipodystrophy, lysosomal storage disease, Menkes syndrome, occipital horn syndrome, ma Nosidosis, neuraminidase deficiency, obesity, pentose-phenylketonuria, pseudovitamin D deficiency, hypocalcemia, hypophosphatemia, postpubertal cerebellar ataxia, tyrosinemia, Some gastrointestinal disorders include dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, digestive disorders, gastritis, stomach cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema , Abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreatic cancer, biliary disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, hereditary hyperbilirubinemia , Cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, colon cancer, colonic obstruction, irritable bowel Syndrome, short and small intestine syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hepatic steatosis, hemochromatosis, Wilson's disease, α-1 -Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal venous occlusion and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes sexually acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, and liver cancer including nodular regeneration and adenomas, carcinomas. The polynucleotide sequence encoding DME can be obtained by Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin, ELISA, and the expression of mutant DME. Can be used for microarrays utilizing body fluids or tissues collected from patients to detect Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.
[0281]
In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding DME will be useful in assays that detect related diseases, particularly those described above. The nucleotide sequence encoding DME could be labeled by standard methods and added to a sample of bodily fluid or tissue taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a reference value. If the amount of signal in the patient's sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding DME in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can be used to estimate the efficacy of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or monitoring the treatment of an individual patient.
[0282]
A normal or standard profile of expression is established to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with DME expression. This can be achieved by combining a DME-encoding sequence or a fragment thereof with a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from normal subjects to values from experiments in which known amounts of substantially purified polynucleotides are used. Standard values obtained from normal samples can be compared to values obtained from subjects exhibiting symptoms of the disease. The deviation between the reference value and the subject's value is used to determine whether the subject is affected.
[0283]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to estimate if the level of expression in the subject has begun to approach the value shown in a normal patient. is there. The results of repeated assays can be used to see the effect of treatment over a period of days to months.
[0284]
In cancer, abnormal amounts of transcripts in living tissue from an individual are predisposed to the development of the disease and can provide a way to detect the disease before actual clinical symptoms occur. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early to prevent the development or progression of cancer.
[0285]
Additional diagnostic uses for oligonucleotides designed from DME-encoding sequences may include the use of PCR. Such oligomers can be chemically synthesized, enzymatically produced, orin in vitroCan be generated. The oligomer preferably includes a fragment of a polynucleotide encoding DME or a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding DME, and is used to identify a specific gene or condition under optimal conditions. You. Oligomers can also be used for the detection and / or quantification of closely related DNA or RNA sequences under somewhat mild stringent conditions.
[0286]
In certain embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding DME may be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are nucleotide substitutions, insertions, and deletions that often cause congenital or acquired genetic disorders in humans. Non-limiting methods for detecting SNPs include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP) methods. In SSCP, DNA is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers derived from the polynucleotide sequence encoding DME. This DNA can be derived, for example, from lesions or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. The SNPs in this DNA cause a difference in the secondary and tertiary structure of the single-stranded PCR product. This difference is detectable using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, by labeling oligonucleotide primers with fluorescence, it becomes possible to detect an amplimer with a high-throughput device such as a DNA sequencing device. Further, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) can identify polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments used to construct a common consensus sequence. . These computer-based methods eliminate sequence variability due to automated analysis of DNA sequence chromatograms and sequencing errors using statistical models and laboratory DNA preparation. Alternatively, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry using, for example, a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0287]
Methods that can be used to quantify DME expression include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of regulatory nucleic acids, and standard curves with the results added (eg, (See Melby, PC et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-44; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The rate of quantification of large numbers of samples will be faster using high-throughput assays. In this assay, the oligomer or polynucleotide of interest is contained in various diluents and quantitation is rapid by spectrophotometry or non-color response.
[0288]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as targets in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relative expression levels of large numbers of genes, as described above. Microarrays can also be used to identify genetic mutations, mutations and polymorphisms. This information is used to determine gene function, elucidate the genetic basis of the disease, diagnose the disease, monitor the progression / regression of the disease associated with gene expression, and develop and develop therapeutic agents in the treatment of the disease. Monitoring. In particular, this information can be used to create a pharmacological genomic profile for the patient in order to select the optimal and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, one can select a therapeutic that is extremely effective for the patient but has few side effects.
[0289]
In another embodiment, DME, fragments of DME, antibodies specific for DME can be used as elements on the microarray. Microarrays can be used to monitor and measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0290]
Particular embodiments relate to the use of the polynucleotides of the present invention to produce transcribed images of certain tissues or cell types. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns are analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under given conditions (Seilliamer et al., US Patent No. 5,840,484, "Comparative Gene"). Transscript Analysis ", which is incorporated herein by reference to this patent). Thus, by hybridizing all of the transcripts or reverse transcripts of a particular tissue or cell type with the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence, a transcribed image can be generated. In some embodiments, the polynucleotides of the invention or their complements are hybridized on a microarray in a high-throughput format that constitutes a subset of a plurality of elements. The resulting transcribed image can be a profile of gene activity.
[0291]
Transcript images may be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsy samples, or other biological samples. Therefore, the transcribed image isin Vivo, Or in the case of cell linesin in vitroReflects gene expression in
[0292]
Transcript images showing the expression profile of the polynucleotide of the present invention can also be used not only for toxicity testing of synthetic or natural compounds,in in vitroIt can be used in connection with preclinical evaluation of model systems and drugs. All compounds cause characteristic gene expression patterns, often referred to as molecular fingerprints or toxic signatures, suggesting mechanisms of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog. 24: 153-159, Steiner, S. and N. L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, also incorporated herein by reference. And). If the test compounds have the same signature as the signature of a known toxic compound, it is likely that they share toxic properties. The more useful a fingerprint or signature becomes, the more useful it is and the more accurate it contains expression information from genes and gene families. Ideally, expression should be measured across the genome to provide the highest quality signature. Genes that are not altered by any test compound are equally important. This is because the expression levels of these genes can be used to normalize the remaining expression data. The standardization process is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of a toxic signature helps to elucidate the mechanism of toxicity, but knowledge of gene function is not required for statistical matching of signatures leading to toxicity prediction (eg, February 29, 2000). See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences, which is available at http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm. Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences in a toxicity screen using a toxicity signature.
[0293]
In one example, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound. The nucleic acid expressed in the treated biological sample is hybridized with one or more probes specific for the polynucleotide of the present invention, whereby the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the present invention can be quantified. The transcript level in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. Differences in transcript levels between the two samples indicate a toxic reaction caused by the test compound in the treated sample.
[0294]
Another example involves analyzing a tissue or cell type proteome using a polypeptide sequence of the invention. The term "proteome" refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein that makes up the proteome can be further analyzed individually. Proteome expression patterns or profiles are analyzed by quantifying the number of proteins expressed at a given time under given conditions and their relative abundance. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, such separation is performed by two-dimensional gel electrophoresis. In the two-dimensional gel electrophoresis, proteins are first separated from a sample by one-dimensional isoelectric focusing, and then separated according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis (Steiner and above). Anderson). These proteins are usually visualized in the gel as dispersed discretely located spots by staining the gel with a stain such as Coomassie blue or silver or fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical densities of equipotent protein spots obtained from different samples, eg, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, are compared to determine changes in protein spot density associated with treatment. The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods of mass spectrometry, for example, after cleavage chemically or enzymatically. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its partial sequence, which is preferably at least 5 contiguous amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
[0295]
Proteome profiles can also be generated by quantifying DME expression levels using an antibody specific for DME. In one embodiment, protein expression levels are quantified using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999). ) Anal. Biochern. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed in a variety of ways known in the art, for example, reacting proteins in a sample with a thiol-reactive or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at each array element .
[0296]
Toxic signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxic signatures at the transcript level. For certain proteins in certain tissues, the correlation between the abundance of the transcript and the abundance of the protein may be low (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537). The proteome toxicity signature may be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect the transcribed image but alter the proteome profile. In addition, analysis of transcription in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA. Thus, in such cases, proteome profiling is more reliable and informative.
[0297]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the treated biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. A difference in the amount of protein in both samples is indicative of a toxic response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing their amino acid residues and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0298]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. A protein obtained from a biological sample is incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. A difference in the amount of protein between the two samples indicates a toxic response to the test compound in the treated sample.
[0299]
Microarrays are prepared, used and analyzed by methods well known in the art. (See, for example, Brennan, TM et al. (1995) U.S. Patent No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995)). PCT Application No. WO95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155; and Heller, M. J. et al. (1997) U.S. Patent No. 5,605,662). Various types of microarrays are well known, and for more informationDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, ed. (1999) Oxford University Press, London. This document is incorporated herein by reference.
[0300]
In another embodiment of the invention, nucleic acid sequences encoding DME can also be used to generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Although either coding or non-coding sequences can be used, in certain instances, non-coding sequences are preferred over coding sequences. For example, conserved coding sequences between members of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. This sequence may be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificial chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product, or a single chromosome cDNA library. (Harrington, JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355, Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127-134, Trask, BJ. (1991) Trends Genet. 7: 149-154 and the like). Once mapped, a nucleic acid sequence of the present invention can be used to create a genetic linkage map that correlates, for example, the inheritance of a disease state with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Lander , ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357).
[0301]
in sitFluorescence hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see, eg, Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, pp. 965-968). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or on the World Wide Web site of Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Since the correlation between the location of the gene encoding DME on the physical chromosomal map and a particular disease, or a predisposition to a particular disease, can help determine the DNA region associated with such a disease, additional locations may be required. Determining cloning is performed.
[0302]
Chromosome specimenin sitThe genetic map can also be extended using physical mapping techniques such as hybridization and binding analysis using defined chromosomal markers. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, often reveals related markers, even if the exact location of the human chromosome is not known. This information is valuable to researchers working on genetic diseases using positional cloning or other gene discovery techniques. Once the location of one or more genes involved in the disease or syndrome has been roughly determined by gene binding to a particular gene region, such as 11q22-23 in telangiectasia, any sequence mapping for that region (See, eg, Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580) for further investigation. The target nucleotide sequence of the present invention may be used to detect a difference in chromosomal position between a normal person and a carrier, that is, an infected person due to translocation or inversion.
[0303]
In another embodiment of the invention, DME, its catalytic or immunogenic fragments or its oligopeptides can be used to screen libraries of compounds in any of a variety of drug screening techniques. The fragments used for such screening are free in solution, fixed to a solid support, retained on the surface of a cell, or exist in a cell. Complex formation due to binding of DME to the agent to be tested may be measured.
[0304]
Another method used for drug screening is used to increase the screening capacity of compounds having suitable binding affinity for the protein of interest (eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. WO84 / 03564). See). In this method, a significant number of different small test compounds are synthesized on plastic pins or other substrates. The test compound is reacted with DME, or a fragment thereof, and then washed. Next, the bound DME is detected by methods well known in the art. Purified DME can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
[0305]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding to DME specifically compete with the test compound for binding to DME. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with DME.
[0306]
In another embodiment, the nucleotide sequence encoding DME is used in developing molecular biology techniques to characterize nucleotide sequences such as, but not limited to, the currently known triplet code and specific base pairing interactions. Can provide new technologies that depend on
[0307]
Those skilled in the art will be able to utilize the present invention to its fullest extent without the need for further explanation. Therefore, the specific preferred embodiments described below are for illustration purposes and do not limit the invention.
[0308]
All patent applications, patents and publications mentioned above and below, especially US patent applications Ser. Nos. 60 / 197,590, 60 / 198,403, 60 / 200,185, 60 Nos./202,234 and 60 / 203,509 are incorporated herein by reference.
[0309]
(Example)
1 cDNA Creating a library
Incyte cDNA is derived from the cDNA library contained in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA) and is shown in column 4 of Table 4. One tissue may be homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while another may be dissolved in phenol or a denaturant such as TRIZOL (Life Technologies), which is a single phase solution of guanidinium isothiocyanate and phenol. The mixture was homogenized and dissolved in an appropriate mixture. The lysate was extracted by centrifugation on cesium chloride or with chloroform. RNA was precipitated from this lysate in either isopropanol or sodium acetate and ethanol, or another common method.
[0310]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. Optionally, the RNA is treated with a DNase. For most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega) or OLIGOTEX latex particles (QIAGEN. Valencia CA) and the OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, isolation was performed directly from tissue lysates using another RNA isolation kit such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0311]
In some cases, the RNA was provided to Stratagene and Stratagene generated a corresponding cDNA library. If not, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) by recommended or similar methods well known in the art to create a cDNA library. (See, e.g., Ausubel, 1997, supra, units 5.1-6.6). Reverse transcription was initiated using oligo d (T) or random primers. After binding the synthetic oligonucleotide adapter to the double-stranded cDNA, the cDNA was digested with one or more suitable restriction enzymes. For most libraries, the size of the cDNA (300-1000 bp) was selected by SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B, SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech), or agarose gel electrophoresis. PBLUESCRIPT plasmids (Stratagene), pSPORT1 plasmids (Life Technologies), pcDNA2.1 plasmids (Invitrogen Carlsbad CA), PBK-CMV plasmids (Stratagene), pINCY plasmids (such as Incyte Pharmaceuticals, Alcya Pacific, etc.) The cDNA was ligated to the compatible restriction enzyme sites of the polylinker of the plasmid. This recombinant plasmid was introduced into competent E. coli cells containing XL1-Blue, XL1-BIueMRF, SOLR from Stratagene, or DH5α or DH10B, ELECTROMAX DH10B from Life Technologies, and transformed.
[0312]
2 cDNA Clone isolation
the aboveExample 1Plasmids obtained as described in 1. above were obtained using the UNIZAP vector system (Stratagene) or cell lysis.in VivoRecovered from host cells by excision. For purification of plasmids, Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAGEN Purification System QIAWELL 8Plus, QIAGEN Lapse or QIAWELL 8Plus At least one of the REAL Prep 96 plasmid kits was used. After precipitation, they were resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0313]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates by a high-throughput direct binding PCR method. (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling steps of the host cells were performed in one reaction mixture. Samples were processed and then transferred to a 384-well plate and stored, and the concentration of amplified plasmid DNA was measured using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a Fluoroskan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). It was measured quantitatively.
[0314]
3 Sequencing and analysis
Example 2The in-site cDNA recovered from the plasmid as described in, was sequenced as shown below. The cDNA sequencing reaction is performed by standard methods, or ABI CATALYST 800 (PE Biosystems) thermal cycler or PTC-Mercer Cycler with a HYDRA microdispenser (Robbins Scientific) or MICROLAB 2200 (Hamilton) liquid transfer device. ) Was performed using a high-throughput apparatus. The cDNA sequencing reaction is carried out using Amersham Pharmacia Biotech's reagent or ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (PE Biosystems). Separation of cDNA sequencing reactions by electrophoresis and detection of labeled polynucleotides was performed using the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics), the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using standard ABI protocols and base pairing software. (PE Biosystems) or other sequence analysis systems well known in the art. The reading frame within the cDNA sequence was determined using standard methods (Ausubel, 1997, supra, unit 7.7). Select some of the cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the method described in (1).
[0315]
Confirmation of the polynucleotide sequence derived from the insite cDNA can be performed by using programs and algorithms based on BLAST, dynamic programming, and analysis of dinucleotide neighbors, using vectors, linkers, and polyA. This was done by removing the sequence and further masking ambiguous base pairs. Next, the insite cDNA sequences and their translations were compiled from the public databases of the primates, rodents, mammals, vertebrates, and eukaryotes of GenBank, and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM, and PFAM. (HMM is a probabilistic method for analyzing the main consensus structure of a gene family. For example, see Eddy, S. et al., Hidden Markov Model (HMM). R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365). Such an inquiry was made using a program based on BLAST, FASTA, BLIMPS, and HMMR. The in-site cDNA sequence was assembled to generate a full-length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNAs, GenBank ESTs, stitched sequences, stretched sequences, or Genscan-predicted coding sequences (Examples 4 and 5) To extend the insite cDNAs to the full length sequence. Sequence assembly was performed using a program based on Phred, Phrap, and Consed, and a panel of cDNAs was screened to determine open reading frames using programs based on GeneMark, BLAST, and FASTA. The full-length polynucleotide sequence was translated to obtain the corresponding full-length polypeptide sequence. Alternatively, a polynucleotide of the invention may begin at any methionine residue of a full-length translated polypeptide. Next, the full-length polypeptide sequences are queried and analyzed against a GenBank protein database (genpept), a protein family database based on a Hidden Markov Model (HMM) such as SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM, Prosite, and PFAM. did. These full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Alignments of polynucleotide and polypeptide sequences were made using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm incorporated into the MEGALIGN multi-sequence alignment program (DNASTAR), which also calculates the percent identity between the aligned sequences.
[0316]
Table 7 briefly lists the tools, programs, and algorithms used to assemble the insite cDNA and full-length sequences and analyze the assembled sequences, along with descriptions, citations, and threshold parameters. Column 1 in Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used, column 2 gives a brief description of them, column 3 shows the cited references which are incorporated herein by reference, and column 4 describes the part. Indicates the score, probability value, and other parameters used to evaluate the degree of match between the two sequences (the higher the score, the lower the probability value, the higher the homology between the sequences) Become).
[0317]
The programs described above for assembling and analyzing full-length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NOS: 11-20. Fragments of about 20 to about 4000 nucleotides that are useful for hybridization and amplification techniques are set forth in Table 4, column 4.
[0318]
4 Genome DNA Identification and editing of coding sequences from
Putative drug-metabolizing enzymes were first identified by running the Genscan gene identification program in public genomic sequence databases (eg, gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program for analyzing genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94, Burge, C. And S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). This program ligates putative exons to construct an assembled cDNA sequence extending from methionine to a stop codon. The sequences obtained by Genscan become the polynucleotide and polypeptide sequences of the FASTA database. The maximum length of a sequence that can be analyzed at one time by Genscan is set to 30 kb. To determine which of these Genscan deduced cDNA sequences encodes a drug metabolizing enzyme, the encoded polypeptide was queried and analyzed for drug metabolizing enzymes in a PFAM model (7tm_1, 7tm_2, 7tm_3, and 7tm_4). Potential drug-metabolizing enzymes were identified based on homology to an in-site cDNA sequence annotated as a drug-metabolizing enzyme. These selected Genscan deduced sequences were then compared to sequences in the genept and gbpri public databases using BLAST analysis. If necessary, the Genscan putative cDNA sequence was compared with the sequence that BLAST hit most in genept to correct and edit errors such as extra exons or omitted exons in the Genscan putative sequence. Finding in-site or public cDNA containing the Genscan deduced cDNA sequence using BLAST analysis provides evidence of transcription. If the insite cDNA contains a Genscan deduced cDNA sequence, this information can be used to correct or confirm the Genscan deduced sequence. The full-length polynucleotide sequence isExample 3The Genscan deduced coding sequence and the insite cDNA and / or public cDNA sequence were assembled and prepared using the assembly method described in. Alternatively, full-length polynucleotide sequences were generated from all-edited or unedited Genscan deduced coding sequences.
[0319]
5 Genome sequence data and cDNA Assembling with sequence data
Stitch arrangement ( Stitched Sequence )
Partial cDNA sequence,Example 4In the exon estimated by the Genscan gene identification program described in.Example 3The partial cDNA, assembled as described in, was mapped to genomic DNA and placed in multiple clusters containing the relevant cDNA and the relevant putative Genscan exons from one or more genomic sequences. Each cluster is integrated and analyzed with cDNA and genomic information using algorithms based on graph theory and dynamic programming, generating potential splice variants that are later identified, edited or extended to full length. Was prepared. Sequence sections in which the entire length of a section exists in two or more sequences of a cluster are identified, and sections identified by transitivity are considered to be equivalent. For example, if a section exists in each of the cDNA and two genomic sequences, all three sections are considered equivalent. In this way, unrelated but continuous genomic sequences are joined together by cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequences. The joining of sections connected along a parent sequence of a certain type (cDNA and cDNA, or a genomic sequence and a genomic sequence) is more preferable than the connection of different parent sequence types (cDNA and genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated and compared by BLAST analysis to sequences in the genpept and gbpri public databases. The incorrect exons estimated by Genscan are corrected in genept compared to the BLAST most hit sequences. Such sequences were extended with additional cNDA sequences and examined with genomic DNA as needed.
[0320]
Stretch array ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First,Example 3The partial cDNA, assembled as described in, was queried against public databases, such as the GenBank primate, rodent, mammalian, vertebrate, and eukaryotic databases using the BLAST program. Next, the highest homology protein of GenBank isExample 4Were compared with either the insite cDNA or the GenScan exon deduced sequence described above. A chimeric protein was prepared using the obtained plurality of high-scoring segment pairs (HSP), and the translated sequence was mapped on a homologous protein of GenBnak. Insertion or deletion may occur in the chimeric protein with respect to the original GenBnak homologous protein. Both GenBnak homologous and chimeric proteins were used as probes to search for homologous genomic sequences from public human genome databases. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of a homologous genomic sequence. The resulting stretch sequences containing the complete gene were examined.
[0321]
6 DME Chromosome Mapping of Polynucleotide Encoding
The sequence used to construct SEQ ID NO: 11-20 was compared to the sequences in the Insight LIFESEQ database and the public domain database using the BLAST and Smith-Waterman algorithms. Sequences from these databases that match SEQ ID NOs: 11-20 were incorporated into clusters of contiguous and overlapping sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 7). Radiation hybrid and gene mapping data are already clustered using radiation hybrid and gene mapping data available from public sources such as the Stanford Human Genonce Center (SHGC), the Whitehead Institute for Genome Research (WIGR) and Genethon. Find out if. If the cluster contained a sequence that was mapped, all sequences in that cluster (including the specific SEQ ID NO) were assigned to that mapping location.
[0322]
Genetic map locations are represented by ranges, intervals, or human chromosomes. The range of the mapping position indicated by centiMorgan was measured from the end of the short arm (p) of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit indicating a distance based on the crossover rate between genes on the same chromosome. On average, 1 cM is approximately equal to one megabase of human chromosome, but can vary greatly due to high and low recombination rates). The distance cM is based on Genethon-mapped gene markers that can detect the boundaries of radiation hybrid markers whose sequences are contained in each cluster. Diseases in which the above sections have been identified using publicly available human genetic maps and other sources, such as the NCBI "GeneMap99" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap). Whether it is located in or near the genetic map can be determined.
[0323]
7. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of a gene transcript, which involves the hybridization of a labeled nucleotide sequence to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. (See, eg, Sambrook, supra, chapter 7, and Ausubel FM et al., Supra, chapters 4 and 16).
[0324]
Similar computer techniques used for BLAST are used to search for identical or related molecules in a cDNA database such as GenBank or LIFESEQ (Incyte Pharmaceuticals). This analysis is much faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be changed to determine whether any particular match is classified as an exact match or a homologous match. Search criteria are:
[0325]
(Equation 1)

Is the product score defined as The product score is a standardized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent identity of the nucleotide sequences and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. A BLAST score is calculated by assigning a +5 score to each matching base in the high score segment pair (HSP) and -4 to each mismatched base pair. The two sequences may share more than one HSP (separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the shorter length of the two compared sequences. The product score 70 is either 100% identity with 70% overlap or 100% with 88% identity. The product score 50 is either 100% identity and 50% overlap, or 79% identity and 100% overlap.
[0326]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding DME is analyzed against the tissue from which it was derived. For example, certain full-length sequences are assembled with at least partially overlapping insite cDNA sequences (Example 3See). Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue has a cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryo structure, endocrine system, exocrine glands, female genitalia, male genitalia, germ cells, blood and immune system, lung, musculoskeletal system, nervous system, pancreas, respiration Fall into one organism / tissue category such as organs, sensory organs, skin, stomatognathic system, unclassified / mixed, or ureter. Count the number of libraries in each category and divide the total by the number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is categorized into one disease / symptom category, such as cancer, cell line, development, inflammation, neurology, trauma, cardiovascular, pooled, and the number of libraries in each category is counted. , And divide the total number by the number of libraries in all categories. The percentage obtained reflects the disease-specific expression of the cDNA encoding DME. cDNA sequence and cDNA library / tissue information can be obtained from the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0327]
8 DME Of polynucleotides encoding
Full length polynucleotide sequences were generated by extending a suitable fragment of the full length molecule using oligonucleotide primers designed from the suitable fragment of the full length molecule. One primer was synthesized to initiate the 5 'extension of a known fragment and the other primer was synthesized to initiate the 3' extension of a known fragment. The starting primer is about 22 to about 30 nucleotides in length, has a GC content of about 50% or more, using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or other suitable program, and has a GC content of about 68%. It was designed to anneal to the target sequence at a temperature of ７２72 ° C. Nucleotides were extended to avoid hairpin structures and primer-primer dimers.
[0328]
This sequence was extended using a selected human cDNA library. If more than one step extension is required or desired, additional or nested primer sets are designed.
[0329]
Amplification was performed with high fidelity by a PCR method using a method known in the art. PCR was performed in a 96-well block plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture was composed of template DNA and 200 nmol of each primer, Mg^{2 +}And (NH₄)₂SO₄And a buffer containing β-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 60 ° C
Step 4 @ 68 ° C for 2 minutes
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 @ 68 ° C for 5 minutes
Step 7 Store at 4 ℃
Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 57 ° C
Step 4 @ 68 ° C for 2 minutes
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 @ 68 ° C for 5 minutes
Step 7 Store at 4 ° C.
[0330]
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25% (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence The solution is distributed to each well of a photometer plate (Coming Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent and the measurement is performed. The plate is scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) and the fluorescence of the sample is measured to quantify the DNA concentration. An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture is analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction has successfully extended the sequence.
[0331]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested with CviJI choleravirus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) before sonication. Or shear was performed. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel to cut the fragments and the agar was digested with Agar ACE (Promega). A clone extended using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA) was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech), and Pfu DNA polymerase (Stratagene) was used to extend the restriction site in E. coli cells by treating with Pfu DNA polymerase (Stratagene). Was transfected. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing an antibiotic, and each colony was cut out and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture at 37 ° C. overnight.
[0332]
The cells were lysed, and the DNA was PCR-amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 60 ° C
Step 4-2 minutes at 72 ° C
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 29 times
Step 6-5 minutes at 72 ° C
Step 7 Store at 4 ° C.
DNA was quantified with the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with poor DNA recovery were amplified again under the conditions described above. The sample was diluted with 20% dimethylsulfoxide (1: 2, v / v), and the DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or the ABI PRISM BIGDYE responsivity quantification cycle kit was used. Thing.
[0333]
Similarly, the full length polynucleotide sequence can be tested using the procedure described above, or the full length polynucleotide sequence can be used to control 5 'regulation using oligonucleotides designed for this extension and a suitable genomic library. The sequence was obtained.
[0334]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
A cDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using a hybridization probe derived from SEQ ID NO: 11-20. Particular mention is made of the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs, but essentially the same procedure is used for larger cDNA fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software such as OLIGO 4.06 software (National Bioscience), and 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ-³²P] Adenosine triphosphate (Amersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA) are used in combination for labeling. The labeled oligonucleotide is substantially purified using a SEPHADEX G-25 ultra-fine exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). 10 per minute⁷An aliquot containing the labeled probe in counts is typically human genomic DNA cut with one of the following endonucleases: Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xbal or Pvu II (DuPont NEN). Used in membrane-based hybridization analysis.
[0335]
DNA from each cut is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, blots are sequentially washed at room temperature, for example, under conditions of up to 0.1 × sodium salt citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared by autoradiography or other imaging means.
[0336]
10 microarray
The concatenation or synthesis of array elements on a microarray can be achieved using photolithography, piezo printing (see inkjet printers, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. . In each of the above techniques, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999), supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, arrays similar to dot or slot blots can be used to place and attach elements to the surface of the substrate by thermal, ultraviolet, or chemical or mechanical binding means. Regular arrays can be made using available methods and machines and can include any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Shalon. D. et al. ( 1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0337]
Full-length cDNA, expressed gene sequence fragments (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software well known in the art such as LASERGENE software (DNASTAR). The array element is hybridized with a polynucleotide in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization at each array element is detected using a fluorescence scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
[0338]
Preparation of tissue or cell samples
Total RNA was isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) was isolated using the oligo (dT) cellulose method.⁺Purify the RNA. Each poly (A)⁺RNA samples were MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand buffer, 0.03 units / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, Reverse transcription is performed using 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). This reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGHT kit (Incyte) using 200 ng of poly (A).⁺Perform in a 25 ml volume containing RNA. Specific control poly (A)⁺RNA isin in vitroIt is synthesized from non-coding yeast genomic DNA by transcription. After incubation at 370 ° C. for 2 hours, each reaction sample (one Cy3 label and the other Cy5 label) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 850 ° C. for 20 minutes to stop the reaction. To denature the RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After binding, the two reaction samples are ethanol precipitated using 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then dried and finished using a SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0339]
Preparation of microarray
Array elements are made using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from bacterial cells containing the vector containing the cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence adjacent to the cDNA insert. The array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg by 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0340]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope glass slides (Corning) are washed during and after treatment with large amounts of distilled water and ultrasonically in 0.1% SDS and acetone. Slides are etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed extensively in distilled water, and 0.05% aminopropylsilane in 95% ethanol (Sigma). ). The coated slide glass is cured by heating at 110 ° C.
[0341]
Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The specification is incorporated herein by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed mechanical device. The device then dispense approximately 5 nl of array element samples per slide.
[0342]
The microarray is UV cross-linked using the STRATALLINKER UV crosslinker (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. Non-specific binding sites were determined by incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) at 60 ° C. for 30 minutes, followed by 0 minutes as described above. Block by washing with 2% SDS and distilled water.
[0343]
Hybridization
The hybridization reaction solution contained 9 μl of a sample mixture containing 0.2 μg each of Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis products in a 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated at 65 ° C. for 5 minutes, dispensed aliquots on the microarray surface and then 1.8 cm² Cover with cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. 140 μl of 5 × SSC is added to the corner of the chamber to keep the inside of the chamber at 100% humidity. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. Arrays were washed three times in a first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) for 10 minutes at 45 ° C. and in a second wash buffer (0.1 × SSC) for 10 minutes at 45 ° C. And then dried.
[0344]
detection
The reporter-labeled hybridization complex is an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of producing 488 nm spectral lines for exciting Cy3 and 632 nm for exciting Cy3. Detect with a microscope equipped with. Focus the excitation laser light on the array using a 20 × microscope objective lens (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of a microscope and raster scanned through an objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example is scanned at a resolution of 20 μm.
[0345]
In two different scans, the mixed gas multi-line laser excites the two phosphors sequentially. The emitted light is split into two photomultiplier tube detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two phosphors based on wavelength. The signal is filtered using a suitable filter disposed between the array and the photomultiplier. The maximum emission of the phosphor used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both phosphors simultaneously, but scans once for each phosphor and usually twice for each array, using filters suitable for the laser source.
[0346]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by the cDNA control species added to the known concentration of the sample mixture. Specific locations on the array include complementary DNA sequences so that the intensity of the signal at that location correlates to a 1: 100,000 weight ratio of hybridizing species. When two samples from different samples (eg, representative of test and control cells) are each labeled with a different fluorophore and hybridized to a single array to identify genes that are differentially expressed The calibration is performed by labeling a cDNA sample to be calibrated having two fluorophores, and adding an equal amount to each of the hybridization mixtures.
[0347]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (AID) conversion board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensity is mapped to a pseudo-color range from blue (low signal) to red (high signal) using a linear 20-color conversion. The data is also analyzed quantitatively. If two different phosphors are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the phosphors (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each phosphor. .
[0348]
The grid is superimposed on the fluorescent signal image so that the signal from each spot is centered on each element of the grid. The fluorescent signal within each element is integrated to give a numerical value corresponding to the average intensity of the signal. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0349]
11 Complementary polynucleotide
A sequence that is complementary to the sequence encoding DME or any part thereof is used to reduce or inhibit the expression of native DME. Although the use of oligonucleotides containing from about 15 to about 30 base pairs is noted, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. The appropriate oligonucleotides are designed using the Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of DME. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent ribosomes from binding to transcripts encoding DME.
[0350]
12 DME Expression of
Expression and purification of DME can be performed using a bacterial or viral based expression system. For expression of DME in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that increases antibiotic resistance and the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter and the trp-lac (tac) hybrid promoter associated with the lac operator regulatory element. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express DME when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of DME in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect or mammalian cell linesAutographica californicaIt is performed by infecting with a nuclear pleiotropic virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with the cDNA encoding DME by either homologous recombination or bacterial mediated gene transfer with transfer plasmid mediated. The infectivity of the virus is maintained and the strong polyhedrin promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda (Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (See, for example, Engelhard. EK. Et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.) .
[0351]
In most expression systems, DME will be a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, so that the recombinant fusion protein from crude cell lysate Can be performed quickly and in one go.Schistosoma japonicumThe 26-kilodalton enzyme, GST, allows purification of fusion proteins with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from the DME at specific manipulation sites. FLAG, an eight amino acid peptide, allows for immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His, a stretch of six consecutive histidine residues, allows purification on metal chelating resins (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995, supra, ch 10, 16). The assays of Examples 16, 17 and 18 below can be performed directly using DME purified by these methods.
[0352]
13 Function Assay
DME function is assessed by expression of DME-encoding sequences at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Such vectors include pCMV SPORT^TM (Life Technologies.) And pCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into human cell lines, eg, endothelial or hematopoietic, by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows one to distinguish between transfected and non-transfected cells. In addition, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. Such labeled proteins include green fluorescent protein (GFP; Clontech), and CD64 or CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells that express GFP or CD64-GFP using automated flow cytometry (FCM) using laser optics-based technology and evaluate the apoptotic state and other cellular properties of the cells I do. In addition, the FCM detects and measures the incorporation of a fluorescent molecule that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by staining of DNA with propidium iodide, down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, and specific antibodies. And changes in plasma membrane composition as measured by binding of the fluorescent complex annexin V protein to the cell surface, as measured by the reactivity of E. coli. Flow cytometry is described in Ormerod, M .; G. FIG. By (1994)Flow Cytometry Oxford, New York, NY. It is described in.
[0353]
The effect of DME on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with the sequence encoding DME and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the surface of transformed cells and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding DME and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0354]
14 DME Of antibodies specific for
Standard DME using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 1816-3088-495) or other purification techniques. Immunize rabbits with a simple protocol to produce antibodies.
[0355]
Alternatively, the DME amino acid sequence is analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine the region of high immunogenicity, and the corresponding oligopeptide is synthesized and used to generate antibodies using methods well known to those skilled in the art. Produce. The selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).
[0356]
Usually, an oligopeptide having a length of about 15 residues is synthesized by an Fmoc method chemistry using an Applied Biosystems ABI 431A peptide synthesizer (PE Biosystems) to give N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). The reaction used binds KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see, eg, Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in Freund's complete adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-DME activity of the obtained antiserum, peptide or DME was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further radioactively treated. React with iodine-labeled goat anti-rabbit IgG.
[0357]
15 Natural using specific antibodies DME Purification
Natural or recombinant DME is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for DME. The immunoaffinity column is formed by covalently linking an anti-DME antibody to an activated chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
[0358]
The culture solution containing DME is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of DME (for example, with a buffer having high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that disrupt the binding of the antibody to DME (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ions such as urea or thiocyanate ions) to recover DME.
[0359]
16 DME Of molecules that interact with
DME or a biologically active fragment thereof,¹²⁵Label with I Bolton Hunter reagent (see, for example, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529). Candidate molecules pre-arranged in a multiwell plate are incubated with labeled DME, washed, and all wells with labeled DME complexes are assayed. Using the data obtained at the various DME concentrations, values are calculated for the quantity and affinity of DME bound to the candidate molecule and for association.
[0360]
Alternatively, molecules that interact with DME are identified in Fields, S .; And O. The analysis is performed using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the yeast two-hybrid system described in Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech).
[0361]
DME is also used in the PATHCHALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0362]
17 DME Demonstration of activity
The cytochrome P450 activity of DME is measured using 4-hydroxylation of aniline. Aniline is converted to 4-aminophenol by the enzyme and has the highest light absorption at 630 nm (Gibsono and Skett, supra). Although this assay is a convenient method, overall hydroxylation is underestimated because hydroxylation also occurs at positions 2 and 3. Assays are performed at 37 ° C. and the reaction buffer contains an aliquot of the enzyme and a suitable amount of aniline (up to 2 mM). The buffer must contain NADPH or a NADPH production cofactor system for the reaction. In one preparation of this reaction buffer, 85 mM Tris pH 7.4, 15 mM MgCl₂, 50 mM nicotinamide, 40 mg trisodium isocitrate, and 2 units of isocitrate dehydrogenase, 8 mg NADP prior to assay⁺To 10 mL of reaction buffer stock. The reaction is performed in a fluorescent cuvette and the absorbance is measured at 630 nm. The rate of increase in absorbance is proportional to the enzyme activity in the assay. A standard curve can be generated using known concentrations of 4-aminophenol.
[0363]
1α, 25-Dihydroxyvitamin D24-hydroxylase activity of DME was measured in transgenic rats expressing DME.³H-labeled 1α, 25-dihydroxyvitamin D (1α, 25 (OH)₂D) 24,25-dihydroxyvitamin D (24,25 (OH)₂The conversion to D) is monitored and determined. 1 μg of 1α, 25 (OH) dissolved in ethanol (or ethanol only as a control)₂D is administered intravenously to approximately 6-week-old transgenic male rats that express the same DME as the control rats except that they express the disrupted mutant of DME or do not express DME. Rats were sacrificed 8 hours later by decapitation, kidneys were quickly removed, washed, and 9 volumes of ice-cold buffer (15 mM Tris-acetate (pH 7.4), 0.19 M sucrose, 2 mM magnesium acetate, and 5 mM sodium succinate) ). Next, a predetermined amount (for example, 3 ml) of each homogenate was added to 0.25 nM 1α, 25 (OH) having a specific activity of about 3.5 GBq / mmol.₂[1-³H] D, incubate for 15 minutes at 37 ° C. in the presence of oxygen with constant shaking (Bright, EG and Dyer, WJ (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-). 917). Next, the chloroform phase was analyzed by HPLC using a FINEPAK SIL column (JASCO, Tokyo, Japan) containing a solution of n-hexane / chloroform / methanol (10: 2.5: 1.5) at a flow rate of 1 ml / min. I do. Alternatively, the chloroform phase is reversed using a JSPHERE ODS-AM column (YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan) in an acetonitrile buffer system (40-100%, 30 minutes in water) at a flow rate of 1 ml / min. Analyze by phase HPLC. The eluate is collected every 30 seconds (or less than 30 seconds) and³The amount of H present is measured with a scintillation counter. Control samples (ie, 1α, 25-dihydroxyvitamin D or 24,25-dihydroxyvitamin D (24,25 (OH)₂The chromatogram of the sample containing D) is compared with the chromatogram of the reaction product, and the substrate (24, 25 (OH)₂D) and the product (24,25 (OH)₂[1-³H] D) is determined, and its value correlates with abundance in the collected volume. 24,25 (OH) produced in control rats₂[1-³H] D was determined by comparing 24,25 (OH) in transgenic rats expressing DME.₂[1-³H] Subtract from the amount of D. 24,25 (OH) between transgenic rats and control rats₂[1-³The difference in the product of [H] D is proportional to the level of DME 25-hydrolase activity present in the sample. Substrates and products are identified by mass spectroscopy (Miyamoto, Y. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 1415-1414).
[0364]
The flavin-containing monooxygenase activity of DME is measured by chromatographic analysis of metabolites. For example, Ring, B.A. J. Et al. (1999; Drug Metab. Dis. 27: 1099-1103), incubate FMO at 37 ° C. in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4 or 8.3) and 1 mM NADPH and run the reaction in an organic solvent. Stop and determine product formation by HPLC. Alternatively, activity is measured by monitoring carbon uptake using a Clark-type electrode. See, for example, Ziegler, D.A. M. And Poulsen, L .; L. (1978; Methods Enzymol. 52: 142-151) incubated this enzyme at 37 ° C. in a NADPH production cofactor system (similar to that described above) with the substrate methimazole. The rate of oxygen uptake is proportional to the enzyme activity.
[0365]
The UDP gluconyltransferase activity of DME is measured using colorimetric measurement of free amino groups (Gibson and Skett, supra). An amine-containing substrate such as 2-aminophenol can be prepared using a reaction buffer (40 mM Tris pH 8.0, 7.5 mM MgCl 2) containing the necessary cofactors.₂, 0.025% Triton X-100, 1 mM ascorbic acid, 0.75 mM UDP-glucuronic acid) at 37 ° C. with an aliquot of the enzyme. After a sufficient time has elapsed, 0. The reaction is stopped by adding ice-cold 20% trichloroacetic acid to 1 M phosphate buffer pH 2.7, incubated on ice, and centrifuged to remove the supernatant. Any unreacted 2-aminophenol is destroyed in this step. Next, newly prepared sodium nitrite is added so that a diazonium salt, which is a glucuronic acid conjugate, is formed. Excess nitrous acid is removed by adding sufficient ammonium sulfamate and reacting the diazonium salt with an aromatic amine (eg, N-naphthylethylenediamine) to produce a colored azo compound that can be assayed spectrophotometrically (eg, at 540 nm). Produce compound. A standard curve can be constructed using known concentrations of aniline which form a chromophore with similar properties to 2-aminophenol glucuronide.
[0366]
Glutathione S-transferase activity of DME is measured using a model substrate having a maximum absorbance at 340 nm. This model substrate includes 2,4-dinitro-1-chlorobenzene, which reacts with glutathione to produce 2,4-dinitrophenylglutathione. It is important that GSTs have various substrate specificities, and model substrates must be selected based on the target GST substrate selectivity. The assay is performed at room temperature and an aliquot of the enzyme is included in a suitable reaction buffer (eg, 1 mM glutathione, 1 mM dinitrochlorobenzene, 90 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5). The reaction is performed in a fluorescent cuvette, and the absorbance at 340 nm is measured. The rate of increase in absorbance is proportional to the enzyme activity in the assay.
[0367]
The N-acyltransferase activity of DME is determined using a radiolabeled amino acid substrate and measuring the radiolabel incorporated into the conjugate. The enzyme is incubated in a reaction buffer containing an unlabeled acyl-CoA compound and a radiolabeled amino acid, and the unreacted amino acid is extracted by extracting the radiolabeled acyl conjugate into n-butanol or other suitable organic solvent. Separate from See, for example, Johnson, M.A. R. (1990; J. Biol. Chem. 266: 10227-10233) describe this enzyme as cholyl-CoA and cholyl-CoA.³H glycine or³The tritiated cholic acid conjugate was extracted into n-butanol by incubation with H-taurine, and the radioactivity in the extracted product was measured with a scintillation counter to determine the bile acid CoA: amino acid N-acyltransferase activity. Were determined. Alternatively, N-acyltransferase activity is determined by measuring reduced CoA (CoASH) described below with a spectrophotometer.
[0368]
The N-acetyltransferase activity of DME was determined by [^l4C] Measured using the transfer of a radiolabel from acetyl-CoA to a substrate molecule (see, for example, Deguchi, T. (1975) J. Neurochem. 24: 1083-5). Alternatively, a spectrophotometric assay based on the reaction of CoASH with DTNB (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid); Ellman's reagent) can be used. During the N-acetyltransferase-catalyzed transfer of an acetyl group to a substrate, free thiol-containing CoASH is produced. CoASH is determined using the absorbance of the DTNB complex at 412 nm (De Angelis, J. et al. (1997) J. Biol. Chem. 273: 3045-3050). Enzyme activity is proportional to the rate of radioactivity incorporated into the substrate or the rate of increase in absorption in a spectrophotometric assay.
[0369]
The protein arginine methyltransferase activity of DME is measured at various time intervals at 37 ° C. S-adenosyl-L- [methyl-³H] methionine ([³H] AdoMet; specific activity p = 75 Ci / mmol; NEN Life Science Products) has been used as a methyl donor substrate. Useful methyl acceptor substrates include glutathione S-transferase nucleolar protein glycine-arginine domain fusion protein (GST-GAR), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP), or adenosine dialdehyde-treated cells in lysate. Includes hypomethylated proteins present. The methylation reaction is stopped by adding SDS-PAGE sample buffer. Reaction products are resolved by SDS-PAGE and shown by fluorography.³H-labeled methyl donor substrates exhibit protein arginine methyltransferase activity of DME (Tang, J. et al., (2000) J. Biol. Chem. 275: 7723730 and Tang, J. et al. (2000). ) J. Biol. Chem. 275: 19866-19876).
[0370]
The catechol-O-methyltransferase activity of DME was measured using 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1.2 mM MgCI._{2 ,}200 μM SAM (S-adenosyl-L-methionine) iodide (0.5 μCi of methyl- [H³], Including SAM), 1 mM dithiothreitol, and various concentrations of catechol substrate (eg, levodopa, dopamine, or DBA) in a final reaction volume of 1.0 ml. The reaction was started by adding 250-500 μg of a sample containing purified or unpurified DME and was performed at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction is stopped by rapid cooling on ice and immediately followed by extraction with ice-cold n-heptane. After centrifugation at 1000 xg for 10 minutes, a 3 ml aliquot of the organic extract was analyzed in a liquid scintillation counter for radioactivity contained therein. The level of catechol-related radioactivity in the organic phase is proportional to the catechol-O-methyltransferase activity of DME (Zhu, BT Liehr, JG (1996) 271: 1357-1363).
[0371]
The DHFR activity of DME was measured at 340 nm (ε₃₄₀ = 11,800 M^-1・ Cm^-1) Is measured spectrophotometrically at 15 ° C. after the disappearance of NADPH. The standard assay mix contains 100 μM NADPH, 14 mM 2-mercaptoethanol, MTEN buffer (50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid, 25 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, 25 mM ethanolamine, and 100 mM NaCl, pH 7.0, final volume 7.0). To 2.0 ml. The reaction is started by the addition of 50 μm dihydrofolate (as substrate). NADP of NADPH in reaction solution⁺Oxidation to is consistent with the reduction of dihydrofolate and is proportional to the amount of DHFR activity in the sample (Nakamura, T. and Iwakura, M. (1999) J. Biol. Chem. 274: 19041-19047).
[0372]
The aldo / keto reductase activity of DME is measured by the decrease in absorbance at 340 nm when NADPH is consumed. A standard reaction mixture contains 135 mM sodium phosphate buffer (pH 6.2-7.2 depending on the enzyme), 0.2 mM NADPH, 0.3 M lithium sulfate, 0.5-2.5 μg enzyme, and High levels of substrate. The mixture is incubated at 30 ° C. and the reaction is measured continuously on a spectrophotometer. Enzyme activity is calculated as moles of NADPH consumed per μg of enzyme.
[0373]
The alcohol dehydrogenase activity of DME was determined by NAD⁺Is measured using the increase in absorbance at 340 nm when is reduced to NADH. The standard reaction mixture is 50 mM sodium phosphate, pH 7.5, and 0.25 mM EDTA. The reaction is incubated at 25 ° C. and monitored on a spectrophotometer. Enzyme activity is calculated as moles of NADH produced per μg of enzyme.
[0374]
The carboxylesterase activity of DME is measured using 4-methylumbelliferyl acetate as a substrate. The enzymatic reaction was performed by adding about 10 μl of the sample containing DME to 1 ml of reaction buffer (90 mM KHH) containing 0.5 mM 4-methylumbelliferyl 4-acetate.₂PO₄, 40 mM KC1, pH 7.3). The production of 4-methylumbellferon was determined by a spectrophotometer (ε₃₅₀ = 12.2 mM^-1・ Cm^-1) And monitor for 1 minute 30 seconds. Enzyme activity is produced at 1 mg protein per minute and can be expressed as μmoles of product and is unparalleled to DME activity in samples (Evgenia, V. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 14769). -14775).
[0375]
Alternatively, the cocaine benzoyl ester hydrolase activity of DME can be increased by adding about 0.1 ml of enzyme and 3.3 mM cocaine to a reaction buffer containing 1 mM benzamidine and 1 mM EDTA (50 mM NaHH).₂PO₄, PH 7.4) and incubated at 37 ° C. Incubate a total of 0.4 ml of the reaction for 1 hour and terminate with an equal volume of 5% trichloroacetic acid. Add 0.1 ml of the internal standard 3,4-dimethylbenzoic acid (10 μg / ml). The precipitated protein is separated by centrifugation at 12,000 xg for 10 minutes. Transfer the supernatant to a new tube and extract twice with 0.4 ml of methylene chloride. The two extracts are mixed and flushed with nitrogen to dry. The residue is washed with 14% acetonitrile containing 8 μl of diethylamine per 100 ml, 250 mM KH₂PO_{4 ,}Resuspend at pH 4.0 and separate by injection onto a C18 reverse phase HPLC column. The column eluate is monitored at 235 nm. DME activity is quantified by comparing the ratio of the peak area of the analyte to the internal standard. A standard curve is generated with benzoic acid standards prepared in trichloroacetic acid-treated protein substrate (Evgenia, V. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 14769-14775).
[0376]
Alternatively, DME carboxylesterase activity on the water-soluble substrate paranitrophenylbutyrate is measured by spectrophotometry well known in the art. In this method, a sample containing DME is diluted with 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4 or 8.0) or sodium acetate (pH 5.0) in the presence of 6 mM taurocholate. The assay is started by adding freshly prepared paranitrophenylbutyric acid solution (100 μg / ml in sodium acetate, pH 5.0). The carboxylesterase activity is then monitored and compared with a control autohydrolysis of the substrate with a spectrophotometer set at 405 nm (Wan, L. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 10041-10046).
[0377]
The sulfotransferase activity of DME was³⁵S] PAPS into model substrates such as phenol³⁵Measured using S incorporation (Folds, A. and Meek, JL (1973) Biochim. Biophys. Acta 327: 365-374). Aliquots of enzyme were added to 1 mL of 10 mM phosphate buffer, pH 6.4, 50 μM phenol, and 0.4-4.0 μM [³⁵[S] Incubate at 37 ° C. with PAPS. After sufficient time has passed for 5-20% of the radiolabel to transfer to the substrate, 0.2 mL of 0.1 M barium acetate is added to precipitate the protein and phosphate buffer. Then 0.2 mL of 0.1 M Ba (OH)₂Followed by 0.2 mL of ZnSO₄Add. Centrifuged to clarify the supernatant, and the protein and unreacted [³⁵[S] Remove PAPS. The radioactivity of the supernatant is measured with a scintillation counter. Enzyme activity is determined from the number of moles of radioactivity in the reaction product.
[0378]
The heparan sulfate 6-sulfotransferase activity of the DME was measured using 2.5 μmol imidazole HCl (pH 6.8), 3.75 μg protamine chloride, 25 nmol completely desulfated and N-reactive. Sulfated heparin (as hexosamine), and 50 pmol (about 5 × 10⁵cpm) [³⁵S] Incubate with adenosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate (PAPS) in a final reaction volume of 50 [mu] l at 37 [deg.] C for 20 minutes,in in vitroMeasure with The reaction is stopped by immersing the reaction tube in boiling water for 1 minute. 0.1 μmol of chondroitin sulfate A (as glucuronic acid) is added as a carrier to the reaction mixture.³⁵The S-labeled polysaccharide was precipitated with three volumes of cold ethanol containing 1.3% potassium acetate and was not incorporated by gel chromatography using a desalting column [³⁵[S] Completely separated from PAPS and its degradation products. One unit of enzyme activity was defined as the amount required to transport 1 pmol of sulfuric acid per minute and was incorporated into the precipitated polysaccharide [³⁵S] Measured by the amount of PAPS (Habuchi, H. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 4172-4179).
[0379]
Alternatively, heparan sulfate 6-sulfotransferase activity of DME is separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and then the enzyme is extracted from the gel, regenerated and measured. After separation, the gel is washed with buffer (0.05 M Tris-HCl, pH 8.0), cut into 3-5 mm segments, and the same buffer containing 0.15 M NaCI is stirred in 100 μl at 4 ° C. for 48 hours. . The eluted enzyme is collected by centrifugation and assayed for sulfotransferase activity as described above (Habuchi, H. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 4172-4179).
[0380]
Alternatively, the sulfotransferase activity of DME is³⁵[S] from PAPS to immobilized peptide³⁵[S] is determined by measuring the transfer of sulfuric acid. This immobilized peptide is the N-terminal 15 residues of the mature P-selectin glycoprotein ligand-1 polypeptide with a C-terminal cysteine residue added. This peptide spans three potential tyrosine sulfation sites. This peptide is bound to the iodoacetamide activated resin by cysteine residues (density of 1.5-3.0 μmol peptide / ml resin). This enzymatic assay comprises 140 mM Pipes (pH 6.8), 0.3 M NaCl, 20 mM MnCl._{2 ,}This was performed by combining 10 μl of peptide derivative beads with 2-20 μl of DME-containing sample in a final volume of 130 μl containing 50 mM NaF, 1% Triton X-100, and 1 mM 5′-AMP. The assay uses 0.5 μCi of [³⁵[S] PAPS (1.7 μM; 1 Ci = 37 GBq) was added to start. After 30 minutes at 37 ° C., the reaction beads are washed with 6 M guanidine at 65 ° C., and the radioactivity incorporated into the beads is measured with a liquid scintillation counter. Transferred to the bead-bound peptide [³⁵S] Measure sulfuric acid and determine DME activity in the sample. One unit of activity is defined as 1 pmol of product being produced per minute (Ouyang, YB. Et al. (1998) Biochemistry 95: 2896-2901).
[0381]
Alternatively, the assay for DME sulfotransferase was performed using 50 mM Hepes-NaOH (pH 7.0), 250 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol, 14 μM [³⁵[S] PAPS (15 Ci / mmol) and as a sulfate donor in a final volume of 30 μl containing dopamine (25 μM), ρ-nitrophenol (5 μM) or other candidate substrate [³⁵[S] PAPS. The assay reaction is started by adding a purified DME enzyme reagent or a sample containing DME activity, and the reaction is continued at 37 ° C for 15 minutes and stopped by heating at 100 ° C for 3 minutes. The precipitate formed is removed by centrifugation. next³⁵The supernatant is analyzed by either thin-film chromatography or two-dimensional thin-film separation methods to check for sulfur oxides.³⁵A suitable standard is run parallel to the supernatant to allow identification of S sulphate, and the enzyme specificity of the DME-containing sample is determined based on the relative rate of migration of the reactive organism (Sakakibara, Y. et al. (1998) J Biol. Chem. 273: 6242-6247).
[0382]
The squalene epoxylase activity of DME was measured using purified DME (or an unpurified mixture containing DME), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.01 mM FAD, 0.2 units NADPH-cytochrome C (P- 450) Reductase, 0.01 mM [^l4C] Assay in a mixture containing squalene (spread with 20 μl Tween 80) and 0.2% Triton X-100. The reaction is started by adding 1 mM NADPH and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Unsaponifiable lipids are analyzed by TLC on silica gel made with ethyl acetate / benzene (0.5: 99.5, v / v). The reaction product is compared with the reaction product from a reaction mixture without DME. The presence of 2,3 (S) -oxidesqualene is confirmed using a suitable lipid standard (Sakakibara, J. et al. (1995) 270: 17-20).
[0383]
The epoxide hydrolase activity of DME was determined after removing the substrate using gas chromatography (GC) analysis of the ether extract or removing the substrate from the reaction mixture quenched with acetone by GC analysis to form the diol. Measure. A sample containing DME or an epoxide hydrolase control sample was prepared using 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and 5 mM epoxide substrate (eg, ethylene oxide, styrene oxide, propylene oxide, isoprene monooxide, epichlorohydride). Incubate with phosphorus, epibromohydrin, epifluorohydrin, glycidol, 1,2-epoxybutane, 1,2-epoxyhexane, or 1,2-epoxyhexane. At various time points, aliquots of the sample are removed from the reaction mixture and added to 1 ml of ice-cold acetone containing an internal standard for GC analysis (eg, 1-nonanol). Proteins and salts were removed by centrifugation (15 min, 4000 × g) and the extract was analyzed using a 0.2 mm × 25 m CP-Wax57-CB column (CHROMPACK, Middelburg, The Netherlands) and a flame ionization detector using a flame ionization detector. Analyze by Identification of GC products is performed using suitable standards and controls well known in the art. One unit of DME activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol of diol per minute (Rink, R. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 14650-14657).
[0384]
The aminotransferase activity of DME was determined by subjecting a sample containing DME to a final volume of 1 mM L-kynurenine and 1 mM 2-oxoglutarate in 150 mM Tris acetate buffer (pH 8.0) containing 70 μM PLP at 37 ° C. in a final volume of 200 μl. Incubate for hours and assay. Kynurenic acid production is quantified by HPLC with spectrophotometric detection at 330 nm using suitable standards and controls well known in the art. Alternatively, using L-3-hydroxykynurenine as a substrate, the production of xanthurenic acid is measured by HPLC analysis of the product with UV detection at 340 nm. The production of kynurenic acid and xanthurenic acid each exhibit aminotransferase activity (Buchli, R. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 29330-29335).
[0385]
Alternatively, the measurement of the aminotransferase activity of DME can be performed by monitoring changes in the UV / VIS absorption spectrum of pyridoxal 5'-phosphate (PLP), an enzyme-binding cofactor, under conditions of a single turnover. The activity is determined by determining the activity of purified DME samples or unpurified samples containing DME against various amino acid and oxo acid substrates. The reaction is performed at 25 ° C. in 50 mM 4-methylmorpholine (pH 7.5) containing 9 μM purified or sample-containing DME and the substrate to be tested (amino acid and oxo acid substrate). Following the half-reaction of the amino acid to oxo acid, the decrease in absorbance at 360 nm and the increase in absorbance at 330 nm resulting from the conversion of enzyme-linked PLP to pyridoxamine 5 'phosphate (PMP) are measured. The specificity and relative activity of DME is measured by enzymatic activity on a specific substrate (Vacca, RA et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 21932-21937).
Superoxide dismutase activity of DME is assayed from cell pellets, cultured supernatants, or purified protein reagents. Samples or lysates are separated by electrophoresis on a 15% non-denaturing polyacrylamide gel. The gel is incubated for 30 minutes in 2.5 mM nitroblue tetrazolium, followed by 20 minutes in 30 mM potassium phosphate, 30 mM TEMED, and 30 μM riboflavin, pH 7.8. Superoxide dismutase activity can be seen as a white band against a blue background, illuminating the gel with a light box. Quantification of superoxide dismutase activity is performed by specific gravity scanning of the active gel using suitable superoxide dismutase positive and negative controls (eg, various amounts of commercially available E. coli superoxide dismutase) (Harth, G. et al. And Horwitz, MA (1999) J. Biol. Chem. 274: 4281-4292).
[0386]
18 DME Inhibitor identification
Compounds to be tested are placed in wells of a multiwell plate at various concentrations with suitable buffers and substrates as described in the assay of Example 17. DME activity is measured for each well and the ability of each compound to inhibit DME activity is determined to generate a dose response curve. Using this assay, it would be possible to identify molecules that promote DME activity.
[0387]
Those skilled in the art will be able to make various modifications of the described method and system without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described with reference to certain preferred embodiments, it is to be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described embodiments of the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are within the scope of the following claims.
[0388]
(Brief description of the table)
Table 1 shows the systematic names for the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0389]
Table 2 shows the GenBank identification numbers and annotations of the GenBank homologs closest to the polypeptides of the invention. Also shown is the probability score representing the match between the polypeptide and its GenBank homolog.
[0390]
Table 3 shows the structural features of the polypeptide sequences of the invention, including putative motifs and domains, and the methods, algorithms, and searchable databases used to analyze the polypeptides of the invention.
[0391]
Table 4 shows a list of the cDNA and genomic DNA fragments used to assemble the polynucleotide sequences of the present invention, and a list of selected fragments of the polynucleotide sequences of the present invention.
[0392]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotide of the present invention.
[0393]
Table 6 is an appendix showing tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0394]
Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with descriptions, references, and threshold parameters.
[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Table 5]

[Table 6]

[Table 7]

[Table 8]

[Table 9]

[Table 10]

[Table 11]

[Table 12]

Claims (64)

An isolated polypeptide,
(A) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 1-10);
(B) a natural amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10;
(C) a biologically active fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10;
(D) an isolated polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. 2. The isolated polypeptide of claim 1, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. 5. The isolated polynucleotide of claim 4, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11-20. A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. A cell transformed with the recombinant polynucleotide of claim 6. A transgenic organism comprising the recombinant polynucleotide of claim 6. A method for producing the polypeptide of claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Steps and
(B) recovering the polypeptide thus expressed. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. An isolated polynucleotide, comprising:
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20;
(B) a natural polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence having at least 90% sequence identity to a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 11-20;
(C) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a),
(D) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (b),
(E) an isolated polynucleotide selected from the group consisting of the RNA equivalents of (a) to (d) above. An isolated polynucleotide comprising at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 11. A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) hybridizing the sample with a probe, wherein the probe comprises at least 20 contiguous nucleotides comprising a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, wherein the probe and the target The probe specifically hybridizing to the target polynucleotide under conditions in which a hybridization complex is formed with the polynucleotide or a fragment thereof;
(B) detecting whether the hybridization complex is present and, if so, optionally measuring the yield thereof. 14. The method of claim 13, wherein said probe comprises at least 60 contiguous nucleotides. A method for detecting, in a sample, a target polynucleotide having the polynucleotide sequence of claim 11,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) detecting whether the amplified target polynucleotide or a fragment thereof is present, and, if present, optionally measuring the yield thereof. Method. A composition comprising the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 17. The composition of claim 16, wherein said polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. 17. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional DME, comprising administering a composition of claim 16 to a patient in need of such treatment. A method for screening a compound effective as an agonist of the polypeptide of claim 1,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting agonist activity in the sample. A composition comprising an agonist compound identified by the screening method of claim 19 and a pharmaceutically acceptable excipient. 21. A method for treating a disease or condition associated with reduced expression of functional DME, comprising administering a composition of claim 20 to a patient in need of such treatment. A method for screening a compound effective as an antagonist of the polypeptide of claim 1,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample. A composition comprising an antagonist compound identified by the screening method of claim 22 and a pharmaceutically acceptable excipient. 24. A method for treating a disease or condition associated with overexpression of functional DME, comprising administering to a patient in need of such treatment the composition of claim 23. A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under suitable conditions;
(B) detecting the binding between the polypeptide of claim 1 and the test compound to identify a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound that changes the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under conditions permitting its activity;
(B) assessing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of said test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound;
A screening method, wherein a change in the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that alters the activity of the polypeptide of claim 1. A method for screening a compound effective for altering the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of claim 5, comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting a change in expression of the target polynucleotide;
(C) comparing expression of the target polynucleotide in the presence of various amounts of the compound with expression of the target polynucleotide in the absence of the compound. . A method for evaluating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) hybridizing a nucleic acid of the treated biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12, wherein the hybridization is performed by the probe and the target of the biological sample. The method is carried out under conditions under which a specific hybridization complex is formed with the polynucleotide, wherein the target polynucleotide is a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 11 or a fragment thereof. Steps and
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the yield of the hybridization complex in the treated biological sample with the yield of the hybridization complex in the untreated biological sample.
A method for evaluating toxicity of a test compound, wherein a difference in the yield of the hybridization complex in the treated biological sample indicates the toxicity of the test compound. A method for performing a diagnostic test for a pathological condition or disease related to DME expression in a biological sample, comprising:
(A) binding the biological sample and the antibody of claim 10 under conditions such that the antibody and the polypeptide bind to form an antibody-polypeptide complex;
(B) detecting the complex;
The method wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. An antibody,
(A) a chimeric antibody;
(B) a single-chain antibody;
(C) a Fab fragment;
(D) F (ab ') ₂ fragment;
11. The antibody according to claim 10, wherein the antibody is (e) a humanized antibody. A composition comprising the antibody of claim 10 and an acceptable excipient. 32. A method for diagnosing a condition or disease associated with the expression of DME, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the composition of claim 31. 32. The composition of claim 31, wherein said antibody is labeled. 34. A method for diagnosing a condition or disease associated with the expression of DME, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of the composition of claim 33. A method for producing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody of claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group comprising a polypeptide of SEQ ID NO: 1-10 or an immunogenic fragment thereof under conditions in which an antibody response occurs;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody with the polypeptide to identify a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group including SEQ ID NOs: 1-10. A method for producing a polyclonal antibody, comprising: An antibody produced by the method of claim 35. 37. A composition comprising the antibody of claim 36 and a suitable carrier. A method for producing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody of claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group comprising a polypeptide of SEQ ID NO: 1-10 or an immunogenic fragment thereof under conditions in which an antibody response occurs;
(B) isolating a cell-forming antibody from the animal;
(C) fusing the cell-forming antibody with the immortalized antibody to form a fused cell-forming monoclonal antibody;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from a culture of a monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. . A monoclonal antibody produced by the method of claim 38. 40. A composition comprising the antibody of claim 39 and a suitable carrier. 11. The antibody of claim 10, wherein said antibody is generated by screening a Fab expression library. 11. The antibody of claim 10, wherein said antibody is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. A method for detecting, in a sample, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10,
(A) incubating the antibody with the sample under conditions that permit specific binding of the antibody of claim 10 to the polypeptide;
(B) detecting specific binding;
The method wherein the specific binding is indicative of the presence of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10 in the sample. A method for purifying, in a sample, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10,
(A) incubating the antibody with the sample under conditions that permit specific binding of the antibody of claim 10 to the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. 2. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. The polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. The polypeptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.