【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）下、２０００年７月２１日付で出願された米国仮出願シリアル番号６０／２１９，６１６および２００１年２月５日付で出願された米国仮出願シリアル番号６０／２６５，８８８に対する利益を請求する。これらの各出願をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
本発明は、メリーランド州ベセスダのアメリカ国立予防衛生研究所の国立一般医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって授けられた助成金番号ＰＯ１ ＧＭ４８６７７下の政府援助によりなされた。合衆国政府は本発明にある種の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、抗痙攣剤、神経保護剤、心血管剤のごとき神経学および精神医学上の障害の治療を含めた、または痛みを管理するための、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩およびその使用に関する。さらに、本発明は、コノペプチドをコードするおよびプロペプチドをコードする核酸配列ならびにそのプロペプチドに関する。
【０００４】
本発明の背景を説明する場合、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合において、本明細書中で用いる刊行物および他の資料は、出典明示して本明細書の一部とみなし、利便のため、以下の本文中では著者および日付で参照して、添付の参考文献リストにおいて著者のアルファベット順で列記する。
【０００５】
コーヌス（Ｃｏｎｕｓ）は、被食体に毒液を注入する捕食性海洋腹足動物（巻貝）の属である。有毒なイモガイは、高度に発達した毒液器官を用いて、有毒なコノトキシンのそれらのカクテルをそれらの被食体に送達する。Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｕｓのごとき捕魚性種において、該イモガイは、そのサイホン中の化学的感覚器を用いて魚の存在を検知し、該イモガイは閉められる場合その口を十分に延ばし、毒液を含有する中空の銛様の歯を魚に放つ。これは、魚を不動とさせ、イモガイが付属のフィラメント介してその口にそれを巻き込むのを可能とする。コーヌスおよびそれらの毒液に関する一般的な情報については、ウェブサイトアドレス ｈｔｔｐ：／ｇｒｉｍｗａｄｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ／ｃｏｎｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃ．ｈｔｍｌを参照されたし。被食体捕捉は、特殊なイオンチャネルおよび受容体サブタイプを標的とするペプチドの精巧な蓄積を通して達成される。各コーヌス種の毒液は、５０〜２００ペプチドのユニークな組を含有するらしい。毒液の組成は、種間および各種内の個々の巻貝間で大きく異なり、各々は、その被食体を麻痺させるように最適に進化している。毒液の有効成分は、小さなペプチド毒素、典型的には長さが１２〜３０個のアミノ酸残基で、高密度のジスルフィド結合のために典型的には高度に制限されたペプチドである。
【０００６】
該毒液は、分離される場合、ある範囲の生物学的活性を示し；マウスに注射される場合、それらはある範囲のショックないし抑制の生理学的な応答を得る非常に多数の異なるペプチド成分よりなる。最近の研究の焦点となっている毒液の麻痺性成分は、α−、ω−およびμ−コノトキシンである。これらのコノトキシンの全てが、神経伝達を妨害することによって作用するが、各々は、プロセスの異なる点を標的として、これを達成する。該α−コノトキシンは、ニコチン性のリガンド感受性（ｌｉｇａｎｄ ｇａｔｅｄ）チャネルを標的とし、該μ−コノトキシンは、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）ナトリウムチャネルを標的とし、ω−コノトキシンは、電位依存性カルシウムチャネルを標的とする（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９８５；Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９０）。例えば、結合は、α−、αＡ−およびφ−コノトキシンとニコチン性リガンド感受性イオンチャネルとの間；ω−コノトキシンと電位依存性カルシウムチャネルとの間；μ−コノトキシンと電位依存性ナトリウムチャネルとの間；δ−コノトキシンと電位依存性ナトリウムとの間；κ−コノトキシンと電位依存性カリウムチャネルとの間；コナントキン（ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ）とリガンド感受性グルタミン酸（ＮＭＤＡ）チャネルとの間で確立されている。
【０００７】
しかしながら、これらのペプチドの少数だけの構造および機能が現在決定されている。機能が決定されたペプチドでは、３つのクラスの標的：電位依存性イオンチャネル；リガンド感受性イオンチャネルおよびＧタンパク結合受容体が評価された。
【０００８】
電位依存性イオンチャネルを標的とするコーヌスペプチドには、ナトリウムチャネルの不活性化を遅延させるもの、ならびにナトリウムチャネル、カルシウムチャネルおよびカリウムチャネルに特異的なブロッカーが含まれる。リガンド感受性イオンチャネルを標的とするペプチドには、ＮＭＤＡおよびセロトニン受容体のアンタゴニスト、ならびに競合的および非競合的なニコチン性受容体アンタゴニストが含まれる。Ｇ−タンパク受容体に作用するペプチドには、ニューロテンシンおよびバソプレシンの受容体アゴニストが含まれる。コノトキシンの新しい医薬上の選択性は、少なくとも部分的に、ジスルフィド・ループ内の超可変性アミノ酸と結合した特異的ジスルフィド結合骨格によって規定される（概説につきＭｃＩｎｔｏｓｈら、１９９８参照）。
【０００９】
痛みの治療に用いる薬物が存在し、それは論文中でおよび当業者に対して知られている。例えば、Ｍｅｒｋ Ｍａｎｕａｌ、第１６版（１９９２）を参照。しかしながら、減少した副作用および毒性を持ち、常習性がなくより活性な鎮痛剤についての要求が存在する。理想的な鎮痛剤は、痛みの自覚を低下させ、広い範囲の痛みのタイプにわたって鎮痛を生じ、経口的または非経口的に与えられようとも十分に作用し、最小または全く副作用を生じず、寛容性および薬物依存を生じる傾向がないものであろう。
【００１０】
該コノペプチドの高い効力および優れた選択性のために、いくつかのものがヒト障害の治療のために臨床的開発の種々の段階にある。例えば、２つのコーヌスペプチドは、痛みの治療用に開発されている。最も進んでいるは、Ｎ−タイプのカルシウムチャネルブロッカーのω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（ジコノチド（ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ））である（Ｈｅａｄｉｎｇ， Ｃ．， １９９９；米国特許第５，８５９，１８６号参照）。Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｕｓから単離されたω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、モルヒネより約１０００倍強力であり、まだ寛容性および麻薬の嗜癖特性を生じていない。ω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、ヒト臨床試験の第ＩＩＩ相（最終段階）を完了し、治療剤として承認された。ω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、髄腔内に通されたカテーテルを用いて、埋込み可能でプログラム可能なポンプによりヒト患者に導入される。術後疼痛における使用のための前臨床試験は、Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓから単離されたもう一つのコーヌスペプチド、コンツラキン−Ｇに関して実施されている（Ｃｒａｉｇら， １９９９）。コンツラキン−Ｇは１６個のアミノ酸Ｏ−結合糖ペプチドであり、そのＣ末端は、ニューロテンシンに似ている。それは、ニューロテンシン受容体のアゴニストであるが、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでの痛みの阻害において、ニューロテンシンよりかなり強力であるらしい。
【００１１】
中枢神経系（ＣＮＳ）に対する虚血性損傷は、全脳または局所虚血のいずれかから起因し得る。全脳虚血は、全脳への血流が心停止に起因し得るごときある期間止まる条件下で生じる。局所虚血は、一部の脳が、脳血管の血栓塞栓性閉塞、外傷性頭部または脊髄損傷、浮腫または脳もしくは脊髄の腫瘍から起因し得るその通常の血液供給を奪われた状態下で生じる。全脳および局所虚血の双方は、全脳虚血性疾患が一過性であるか、あるいは局所虚血が非常に限定された領域に影響するとしても広範囲の神経損傷につき潜在力を有する。
【００１２】
癲癇は、脳ニューロンの異常な過剰放電によって惹起される変容した意識、運動活性、感覚性現象の突然の短い発作、または不適当行動によって特徴付けられる脳機能の再発性の発作性障害である。最も共通した形態の痙攣発作は、意識および運動制御の喪失、および全肢の強直性または間代性痙攣で始まるが、いずれの再発性の発作パターンも癲癇と称される。原発性または特発性癲癇なる用語は、発作の原因が確認できない場合を示す。二次性または症候性の癲癇は、それが外傷、新生物、感染、発育異常、脳血管疾患または種々の代謝性疾患のごとき因子と関連する場合の疾患を示す。癲癇発作は、部分発作（限局性、局所発作）または全身発作（痙攣性または非痙攣性）に分類される。部分発作のクラスには、単純部分発作、複雑部分発作および副次的な全身性の部分発作が含まれる。全身発作のクラスには、欠神発作、非定型欠神発作、ミオクローヌス発作、間代性発作、強直性発作、硬直性−間代性発作（ｇｒａｎｄ ｍａｌ）および無緊張発作が含まれる。抗痙攣特性を有する治療剤は、発作の治療に用いられる。発作を根絶または緩和するのに用いる大部分の治療剤は、少なくとも、発作中心からの興奮の拡大を低下させ、ニューロンの正常な集合体の機能のデトネーション（ｄｅｔｏｎａｔｉｏｎ）および崩壊を防止する効果を介して作用する。利用されている従来の抗痙攣剤には、フェニトイン、フェノバルビタール、プリミドン、カルバマゼピン、エトスクシイミド（ｅｔｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、クロナゼパムおよびバルプロエートが含まれる。いくつかの新規で化学的に区別される抗痙攣薬が、近年、ラモトリジン、フェルバメート（ｆｅｒｌｂａｍａｔｅ）、ガバペニン（ｇａｂａｐｅｎｉｎ）およびトピラメート（ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）を含めて市販のために承認された。発作およびそれらの治療のさらなる詳細については、Ｒａｌｌ ＆ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ（１９８５）およびＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）参照。
【００１３】
コーヌス種における多数の生物学的に活性な物質に関して、それらをさらに特徴付けし、発作および痛みのごとき電位依存性イオンチャネルに関連する障害を治療することができるペプチドを同定することが望ましい。驚くべきことに、かつ本発明により、出願人は、電位依存性イオンチャネルに関連する障害の治療に有用であり得、安全で有効な治療のための長期の切実な必要性に対処できる新規なコノトキシンを発見した。
【００１４】
発明の概要
本発明は、抗痙攣剤、神経保護剤、心血管剤のごとき、神経学および精神医学上の障害の治療を含めた、または痛みを管理するのための、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩、ならびその使用に指向される。本発明は、さらに、ω−コノペプチドをコードするおよびプロペプチドをコードする核酸配列、ならびにプロペプチドに指向される。
【００１５】
より詳細には、本発明は、後記の表２に記載されるアミノ酸配列を有するω−コノペプチドに指向される。
【００１６】
また、本発明は、ω−コノペプチドの誘導体または医薬上許容される塩、あるいは誘導体に指向される。誘導体の例には、該Ａｒｇ残基は、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換でき；該Ｌｙｓ残基は、Ａｒｇ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換でき；該Ｔｙｒ残基は、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ノル−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ、ニトロ−Ｔｙｒまたはいずれかの合成ヒドロキシ含有アミノ酸で置換でき；該Ｓｅｒ残基は、Ｔｈｒまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換でき；該Ｔｈｒ残基は、Ｓｅｒまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換でき；該Ｐｈｅ残基は、いずれかの合成芳香族アミノ酸で置換でき；該Ｔｒｐ残基は、Ｔｒｐ（Ｄ）、ネオ−Ｔｒｐ、ハロ−Ｔｒｐ（ＤまたはＬ）またはいずれかの合成芳香族アミノ酸で置換でき；および該Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｙｐ残基はグリコシル化できる。該ハロゲンは、ヨード、クロロ、フルオロまたはブロモ；好ましくは、ハロゲン置換−Ｔｙｒにつきヨードおよびハロゲン置換−Ｔｒｐにつきブロモである。また、該Ｔｙｒ残基 は、３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（各々、メタ−Ｔｙｒまたはオルト−Ｔｙｒ）ならびに対応するＯ−スルホ−およびＯ−ホスホ−誘導体で置換できる。酸性アミノ酸残基は、いずれの合成酸性アミノ酸、例えば、ＧｌｙおよびＡｌａのテトラゾリル誘導体で置換できる。脂肪族アミノ酸は、非天然脂肪族のｎ＝８以下の分岐鎖または直鎖ＣｎＨ２ｎ＋２を持つ合成誘導体によって置換できる。該Ｃｙｓ残基は、ＤもしくはＬ配置であり得、所望によりホモシステイン（ＤもしくはＬ）で置換されていてもよい。
【００１７】
合成芳香族アミノ酸の例には、限定されるものではないが、ニトロ−Ｐｈｅ、４−置換−Ｐｈｅ（ここに、置換基はＣ１−Ｃ３アルキル、カルボキシル、ヒドロキシメチル、スルホメチル、ハロ、フェニル、−ＣＨＯ、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈおよび−ＮＨＡｃである）が含まれる。合成ヒドロキシ含有アミノ酸の例には、限定されるものではないが、４−ヒドロキシメチル−Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２，６−ジメチル−Ｔｙｒおよび５−アミノ−Ｔｙｒのごときが含まれる。合成塩基性アミノ酸の例には、限定されるものではないが、Ｎ−１−（２−ピラゾジリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ａｌａ、２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ｇｌｙおよび２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ａｌａが含まれる。これらおよび他の合成塩基性アミノ酸、合成ヒドロキシ含有アミノ酸または合成芳香族アミノ酸は、ＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡによるおよびそこから入手可能であるＢｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（１９９９ カタログ、ヒドロキシ含有アミノ酸および芳香族アミノ酸については４〜４７頁に、および塩基性アミノ酸については６６〜８７頁に記載されており；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ．ｃｏｍも参照されたし）（これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載されている。合成酸性アミノ酸の例には、各々出典明示して本明細書の一部とみなす、Ｏｒｎｓｔｅｉｎら（１９９３）によっておよび米国特許第５，３３１，００１号に記載されるごとき、カルボキシル、リン酸、スルホン酸ならびに合成テトラゾリル誘導体を含む酸性官能基を持つそれらの誘導体が含まれる。
【００１８】
所望により、本発明のω−コノペプチドにおいては、Ａｓｎ残基は修飾されてＮ−グリカンを含んでいてもよく、ＳｅｒおよびＴｈｒおよびＨｙｐ残基は修飾されてＯ−グリカン（例えば、ｇ−Ｎ、ｇ−Ｓ、ｇ−Ｔおよびｇ−Ｈｙｐ）を含んでいてもよい。本発明によれば、グリカンはいずれかのＮ−、Ｓ−またはＯ−結合した単−、二−、三−、多−またはオリゴ糖を意味し、それらは当該技術分野で知られている合成または酵素法によって天然または修飾アミノ酸のいずれかのヒドロキシ、アミノまたはチオール基に結合することができる。グリカンを構成する単糖には、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−フコースまたはＤ−アラビノースが含まれ得る。これらの糖は、例えば、１以上のＯ−硫酸、Ｏ−リン酸、Ｏ−アセチル、またはシアル酸のごとき酸性基ならびにこれらの組合せで、構造的に修飾されていてもよい。グリカンには、Ｄ−ペニシラミン２，５およびそのハロゲン化誘導体のごとき同様のポリヒドロキシ基またはポリプロピレングリコール誘導体も含まれ得る。また、グリコシド結合はベータであって１−４または１−３、好ましくは１−３である。グリカンとアミノ酸との間の結合はアルファまたはベータであってもよく、好ましくはアルファであって１−である。
【００１９】
コアＯ−グリカンは、Ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｅｅｎら（１９９８）（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）によって記載されている。ムチン型Ｏ−結合オリゴ糖はＧａｌＮＡｃ残基によってＳｅｒまたはＴｈｒ（または本ペプチドの他のヒドロキシル化残基）に結合している。単糖形成ブロックおよびこの第１のＧａｌＮＡｃ残基に結合した結合は「コアグリカン」と定義され、そのうちの８が同定されている。各コアグリカンについてグリコシド結合の型（向きおよび結合性）は定義される。適当なグリカンおよびグリカン・アナログは、１９９９年１０月１９日に出願された米国出願第０９／４２０，７９７号および１９９９年１０月１９日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４３８０（ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ００／２３０９２）（各々、出典明示して本明細書の一部とみなす）にさらに記載されている。好ましいグリカンはＧａｌ（β１→３）ＧａｌＮＡｃ（α１→）である。
【００２０】
所望により、前記のω−コノペプチドにおいて、Ｃｙｓ残基の対はＳｅｒ／（ＧｌｕもしくはＡｓｐ）、Ｌｙｓ／（ＧｌｕもしくはＡｓｐ）またはＣｙｓ／Ａｌａ組合せのごとき、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）ラクタムまたはエステル−チオエーテル交換でペアで置きかえることができる。公知の方法（Ｂａｒｎａｙら、２０００；Ｈｒｕｂｙら、１９９４；Ｂｉｔａｎら、１９９７）による順次カップリングは、ラクタム架橋での天然Ｃｙｓ架橋の置換を可能とする。チオエーテル・アナログは、ＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓから市販されているハロ−Ａｌａ残基を用いて容易に合成できる。
【００２１】
本発明は、対象における電位依存性チャネル障害と関連する障害を治療する方法にさらに指向され、該方法は、治療上有効量の、本明細書に記載されたω−コノペプチドまたはその医薬上許容される塩もしくはその溶媒和物を含む医薬組成物を該対象に投与することを特徴とする。また、本発明は、治療上有効量の本明細書に記載されたω−コノペプチドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物に指向される。
【００２２】
より詳細には、本発明は、さらに、抗痙攣剤、神経保護剤のごとき、発作治療のためのごとき、心血管剤のごとき神経障害の治療を含めた、または痛みを管理するための本明細書に記載されたこれらのペプチドまたは核酸の使用に指向される。
【００２３】
より詳細には、本発明は、本発明のコノペプチドをコードするまたはこれらのコノペプチドについての前駆体ペプチドをコードする核酸、ならびに前駆体ペプチドにも指向される。本発明の他のコノペプチドの前駆体ペプチドをコードする核酸配列を表１に記載する。また、表１はこれらの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を記載している。
【００２４】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩に関する。本発明は、さらに、抗痙攣剤、神経保護剤のごとき神経障害の治療のため、心血管剤のごとき発作を治療するためのごとき、または例えば、鎮痛剤として痛みを管理するための本ペプチド、その誘導体およびその医薬上許容される塩の使用に指向される。本発明は、さらに、ω−コノペプチドをコードする核酸配列およびプロペプチドをコードする核酸配列、ならびにそのプロペプチドに指向される。
【００２５】
本発明は、もう一つの態様において、有効量のω−コノペプチド、そのムテイン、その活性断片または医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は、電位依存性イオンチャネルにて作用する能力を有し、かくして、ヒトを含めた動物の生体の障害または疾患を治療するのに有用であり、その障害または疾患は、中枢神経系の電位依存性イオンチャネルの部分的または完全な遮断に応答し、治療上有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とするヒトを含めた動物の生体に投与する工程を含む。
【００２６】
電位依存性カルシウムチャネルは、ニューロン中、および心筋、平滑筋および骨格筋および他の興奮性細胞中に存在し、シナプス伝達におけるごとき、膜興奮性、筋収縮および細胞分泌における様々な役割を演じることが知られている（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。ニューロン細胞において、電位依存性カルシウムチャネルは、それらの電気生理学的ならびにそれらの生化学的（結合）特性によって分類されている。６つのクラスの生理学的に区別されるカルシウムチャネル、すなわち、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、ＱおよびＲ−タイプのチャネルが現在まで同定されている。
【００２７】
脳内カルシウムの蓄積（カルシウム過負荷）は、酸素欠乏症、虚血、片頭痛、および癲癇痙攣の後のごとき、脳の活動亢進期間後に見られることはよく知られている。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞におけるカルシウムが制御されていない高濃度は、前記疾病と関連する大部分の変性変化を引き起こすことが知られている。脳細胞のカルシウムチャネルをブロックできる化合物は、従って、発作、酸素欠乏症、虚血、片頭痛、精神病または癲癇、いずれの他の痙攣性の障害の治療において有用であり、それらの同一物と関連する変性変化の予防において有用である。
【００２８】
ＣＮＳにおけるいわゆるＬ−型カルシウムチャネルをブロックする化合物は、ＣＮＳにおけるカルシウムの取込みを直接的にブロックすることによって前記障害の治療に有用である。さらに、いわゆるＮ−およびＰ−型のカルシウムチャネル、ならびに可能な他の型のカルシウムチャネルは、神経伝達物質の放出の変調に関連付けられる。Ｎ−および／またはＰ−型のカルシウムチャネルをブロックする化合物は、ＣＮＳのかかる活動亢進期間後に見られる神経伝達物質放出の増強、特に、ＣＮＳのかかる活動亢進期間後のグルタミン酸放出の増強を阻害することによって、前記の脳の活動亢進期間後のＣＮＳにおけるカルシウムの過負荷を間接的でかつ非常に強力に防止する。さらに、Ｎ−および／またはＰ−型のカルシウムチャネルのブロッカーは、問題の該化合物の選択性に依存して、アスパラギン酸、ＧＡＢＡ、グリシン、ドーパミン、セロトニンおよびノルアドレナリンのごとき様々な他の神経伝達物質の放出を阻害する。
【００２９】
かくして、本発明の医薬組成物は、神経保護剤、心血管剤、抗痙攣剤、鎮痛剤または全身麻酔薬への補助薬として有用である。「神経学上の障害または疾病」は、限定されるものではないが、総体および限局性の虚血性および出血性の発作、頭部外傷、脊髄損傷、心停止または新生児仮死における低酸素症誘導の神経細胞損傷、あるいは癲癇を含めた神経系の障害または疾患である。加えて、「神経学上の障害または疾病」は、神経保護剤（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、抗痙攣剤、鎮痛剤、および／または全身麻酔における補助物として示され、有用であり、推奨または処方できる疾患状態および疾患である。
【００３０】
より詳細には、本発明は、癲癇の治療および緩和のための、および一般的な抗痙攣剤として、これらの化合物の使用に指向される。また、本発明は、典型的には、発作に続く低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患、脳血管事故、脳または脊髄外傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺死、窒息、分娩仮死または低血糖事象に関連した神経毒性損傷を低下させるためのこれらの化合物の使用に指向される。さらに、本発明は、急性および慢性の痛み、かかる片頭痛、侵害受容性および神経障害性の疼痛を含めた痛みを治療するためのこれらの化合物の使用に指向される。これらの化合物の他の使用は、米国特許第５，８５９，１８６号に記載され、それをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００３１】
「神経保護剤」は、神経の障害または疾患と関連するニューロン死を予防できる化合物である。「抗痙攣剤」は、単純部分発作、複合部分発作、痙攣重積状態、および頭部手術を含めた続いての頭部外傷を引き起こすごとき外傷誘導発作によって生成した痙攣を減少できる化合物である。「鎮痛剤」は、麻酔または意識喪失を生じない侵害受容性刺激に対する認知を変更することによって痛みを緩和できる化合物である。「筋弛緩剤」は、筋肉緊張を低下させる化合物である。「全身麻酔における補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）」は、意識喪失に関連した痛みを知覚する能力の喪失を生じる麻酔剤と組み合せて有用な化合物である。
【００３２】
本発明は、限定されるものではないが、総体および限局性の虚血性および出血性の発作、頭部外傷、脊髄損傷、心停止または新生児仮死における低酸素症誘導の神経細胞損傷、癲癇、または望ましくない副作用のない他の痙攣性障害を含めた神経系の障害および疾患の治療に有用な方法にさらに関連する。
【００３３】
かくして、１つの具体例において、本発明は、対象による痛みの認知を低下／緩和／減少させる方法、または対象における鎮痛を誘導するための方法を提供し、ここに、該方法は、治療上有効量の、本明細書に記載されたω−コノペプチド、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。その痛みは、急性、持続性、炎症性または神経障害性の疼痛であり得る。
【００３４】
第２の具体例において、本発明は、対象における発作、頭部または脊髄の外傷または損傷、酸素欠乏症、低酸素症誘導の神経細胞損傷、虚血、片頭痛、精神病、不安、精神分裂病、炎症、運動障害、癲癇、いずれかの他の痙攣性障害を治療する方法、または同一物と関連した変性変化の予防における方法を提供し、ここに、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載のω−コノペプチド、またはその医薬上許容される塩またはその溶媒和物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３５】
本明細書に記載されたω−コノペプチドは、化学的に合成するのに十分に小さい。前記のω−コノトキシンペプチドを調製するための一般的な化学合成は、後記されている。また、ω−コノペプチドの種々のものが、米国特許第４，４４７，３５６号（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９８４）；第５，５１４，７７４号；第５，７１９，２６４号；および第５，５９１，８２１号、ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ ９８／０３１８９（これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された技術を用いて、特定のコーヌス種からの単離および精製によって得ることができる。
【００３６】
本発明のω−コノペプチドはイモガイからの精製によって得ることができるが、個々の巻貝から得ることができるω−コノペプチドの量は非常に少量であるため、所望の実質的に純粋なω−コノペプチドは、固相戦略を用いる化学合成によって商業的に価値ある量にて現実には最良に得る。例えば、単一のイモガイからの収量は約１０マイクログラム以下のω−コノペプチドペプチドであり得る。「実質的に純粋」とは、該ペプチドが同一タイプの他の生物学的分子の実質的な不存在下にて存在することを意味し；それは好ましくは少なくとも約８５％純度、好ましくは少なくとも約９５％純度の量で存在する。生物学的に活性なω−コノペプチドペプチドの化学合成は、もちろんアミノ酸配列の正確な決定の過程に依存する。
【００３７】
また、ω−コノペプチドは、当該技術分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によっても産生できる。かかる技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されている。注目する遺伝子（すなわち、適当なω−コノペプチドをコードする遺伝子）は、標準的手法を用いることによって適当な発現ベクターのクローニング部位に挿入できる。これらの手法は、当業者によく知られている。次いで、注目する遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、所望の細胞系をトランスフェクトできる。リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはエレクトロポレーションのごとき標準的トランスフェクション手法を利用できる。非常に広範囲の宿主／発現ベクターの組合せを用いて、注目するコノトキシンペプチドをコードする遺伝子を発現できる。かかる組合せは当業者によく知られている。このようにして産生したペプチドを単離し、要すれば還元し、酸化して、正確なジスルフィド結合を形成させる。
【００３８】
本発明のω−コノペプチド中にジスルフィド結合を形成させる１つの方法は、冷室温下または室温にて長時間の線状ペプチドの空気酸化である。この手法の結果、実質量の生物活性のジスルフィド結合ペプチドが創製する。酸化されたペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて分画して、異なる結合立体配置を有するペプチドを分離する。その後、これらの画分を天然物質の溶出と比較するか、または単純なアッセイ方法を用いることによって、最大の生物学的効力の正確な結合を有する特定の画分を容易に決定する。しかしながら、より低い生物効力の他の画分の存在から生じる希釈のため、幾分より高い投与量が必要となり得る。
【００３９】
該ペプチドは、絶対固相技術、部分固相技術、フラグメント縮合または古典的な溶液カップリングによるごとき、適当な方法によって合成される。
【００４０】
通常の液相ペプチド合成においては、ペプチド鎖は、構成アミノ酸を所望の順序で伸長するペプチド鎖に付加する一連のカップリング反応によって調製できる。種々のカップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボニルジイミダゾール、種々の活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのエステル、ならびに種々の切断試薬を用いて溶液中で反応を行い、続いて中間体を単離および精製することはよく知られている古典的なペプチド法である。古典的な溶液合成は、論文「Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）： Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ」（１９７４）に詳記されている。絶対的固相合成の技術は、テキストブック、「Ｓｏｌｉｄ‐Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，１９６９）に記載されており、米国特許第４，１０５，６０３号（Ｖａｌｅら、１９７８）の開示によって例示されている。合成のフラグメント縮合法は米国特許第３，９７２，８５９号（１９７６）に例示されている。他の利用可能な合成は、米国特許第３，８４２，０６７号（１９７４）および第３，８６２，９２５号（１９７５）によって例示されている。γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するペプチドの合成は、Ｒｉｖｉｅｒら（１９８７）、Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉら（１９９３）およびＺｈｏｕら（１９９６）によって例示されている。
【００４１】
かかる化学合成に共通しているのは、当該基が最終的に除去されるまで、その部位で化学反応が起こるのを妨ぐであろう適当な保護基で種々のアミノ酸部位の不安定な側鎖基を保護することである。また、通常共通しているのは、その原子団がカルボキシル基において反応し、続いてα−アミノ保護基を選択的に除去してその位置で続く反応が起こることを許容する間に、アミノ酸または断片上のα−アミノ基を保護することである。したがって、かかる合成における工程として、不安定側鎖を有する残基の種々のものに結合した適当な側鎖保護基を有するペプチド鎖中に所望の順序で位置する各アミノ酸残基を含む中間体化合物を生成することが共通している。
【００４２】
側鎖アミノ保護基の選択に関する限り、一般的に、合成中α−アミノ基の脱保護の間には除去されないものが選択される。しかしながら、いくらかのアミノ酸、例えば、Ｈｉｓについては、保護は一般的には必要でない。ペプチド合成に用いられるべき特定の側鎖保護基の選択においては、以下の一般規則に従う：（ａ）保護基は好ましくはカップリング条件下にてその保護特性を保持し、かつ、分裂しないこと、（ｂ）保護基は合成の各工程にてα−アミノ保護基を除去するために選択した反応条件下で安定でなければならないこと、ならびに、（ｃ）側鎖保護基は、ペプチド鎖を望ましくないように変化させない反応条件下にて、所望のアミノ酸配列を含む合成の完了の際に、除去可能でなければならないこと。
【００４３】
組換えＤＮＡ技術を用いてこれらのペプチドの多くまたは全てでさえ調製することが可能である。しかしながら、ペプチドをそのように調製しない場合には、当該技術分野で知られている他の等価な化学合成も先に述べたごとく用い得るが、それを好ましくはメリフィールド固相合成を用いて調製する。固相合成は、保護α−アミノ酸を適当な樹脂にカップリングさせることによって、ぺプチドのＣ−末端から開始される。かかる出発物質は、α−アミノ−保護アミノ酸を、エステル結合によりクロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂に結合させることによって、あるいは、アミド結合によってベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはパラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂に結合させることによって調製できる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９６６）によって記載されている。クロロメチル化樹脂はＢｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）およびＬａｂ． Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社から市販されている。かかる樹脂の調製は、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９）によって記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成すべき所望のポリペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合に一般的に用いられる。したがって、式−Ｏ−ＣＨ２−樹脂支持体、−ＮＨ ＢＨＡ樹脂支持体または−ＮＨ−ＭＢＨＡ樹脂支持体を有するもののごとく、固体樹脂支持体は当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。未置換アミドが望まれる場合、切断がアミドを直接的に与えるためにＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂の使用が好ましい。Ｎ−メチルアミドが望まれる場合、それはＮ−メチルＢＨＡ樹脂から生成することができる。他の置換されたアミドが所望ならば、米国特許第４，５６９，９６７号の教示（Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈら、１９８６）を用いることができ、あるいは、遊離酸以外のなお他の基がＣ−末端に望まれる場合、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌテキスト（１９７４）に記載された古典的方法を用いてペプチドを合成するのが好ましいであろう。
【００４４】
ＢｏｃまたはＦｍｏｃによって、および側鎖保護基によって保護されたＣ−末端アミノ酸は、適当には、Ｃ−末端に遊離酸を有するペプチドを合成すべき場合、まず、攪拌しつつ約６０℃にて２４時間、ＤＭＦ中のＫＦを用い、Ｋ． Ｈｏｒｉｋｉら（１９７８）に記載された手法に従って、クロロメチル化樹脂にカップリングさせることができる。ＢＯＣ−保護アミノ酸を樹脂支持体にカップリングさせた後に、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡ単独を用いることによって、α−アミノ保護基を除去する。脱保護は約０℃と室温との間の温度で行う。ジオキサン中のＨＣｌのごとき他の標準的な切断試薬および特異的α−アミノ保護基の除去のための条件は、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）に記載されているごとく使用できる。
【００４５】
α−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノ−および側鎖−保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせて本明細書に前記に定義した中間体化合物を得るか、あるいは別法として、合成中に各アミノ酸に別々に付加し、そのうちの幾つかは固相反応器に添加する前に互いにカップリングさせ得る。適当なカップリング試薬の選択は当業者の範囲内にある。カップリング試薬として特に適当なのは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＨｏＢｔまたはＨｏＡｔの存在下でのＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ）である。
【００４６】
ペプチドの固相合成に用いる活性化試薬は、ペプチドの技術分野でよく知られている。適当な活性化試薬の例は、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのごときカルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチド・カップリングにおけるそれらの使用は、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）ならびにＫａｐｏｏｒ（１９７０）によって記載されている。
【００４７】
各保護アミノ酸またはアミノ酸配列を約２倍以上の過剰量で固相反応器に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）の媒体中またはＤＭＦもしくはＣＨ２Ｃｌ２単独中でカップリングを行い得る。中間体カップリングが起こる場合、次のアミノ酸のカップリングより前のα−アミノ保護基の除去前にカップリング手法を繰り返す。手動で行う場合、合成の各段階でのカップリング反応の成功は、好ましくは、Ｋａｉｓｅｒら（１９７０）によって記載されているごとく、ニンヒドリン反応によってモニターする。カップリング反応は、Ｂｅｃｋｍａｎ ９９０自動合成器におけるように、Ｒｉｖｉｅｒら（１９７８）において報告されているごときプログラムを用いて自動的に行い得る。
【００４８】
所望のアミノ酸配列が完成した後に、液体フッ化水素またはＴＦＡ（Ｆｍｏｃ化学を用いる場合）のごとき試薬を用いる処理によって、中間体ペプチドを樹脂支持体から取り外すことができ、それは、樹脂からペプチドを切断するだけではなく、全ての残存する側鎖保護基および以前に除去されていない場合には、Ｎ末端の −アミノ保護基をも切断して、ペプチドを遊離酸の形態で得ることができる。配列中にＭｅｔが存在する場合、好ましくは、ＨＦを用いて樹脂からペプチドを切断する前にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを用いて最初にＢｏｃ保護基を除去して、潜在的なＳ−アルキル化を排除する。フッ化水素またはＴＦＡを切断に用いる場合には、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメチルエチルスルフィドのごとき１以上のスカベンジャーを反応容器に含ませる。
【００４９】
ペプチド−樹脂の一部である場合のペプチドの環化とは対照的に、好ましくは、線状ペプチドの環化に影響してＣｙｓ残基間の結合を創製する。かかるジスルフィド環化結合をもたらすために、当該技術分野でよく知られているごとく、アンモノリシスによって、完全に保護されたペプチドをヒドロキシメチル化樹脂またはクロロメチル化樹脂支持体から切断して、完全に保護されたアミド中間体を得ることができ、その後、それを適当に環化および脱保護することができる。別法として、脱保護ならびに上記の樹脂またはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂もしくはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）からのペプチドの切断は、フッ化水素酸（ＨＦ）またはＴＦＡを用いて０℃で行うことができ、その後、上記のように酸化できる。
【００５０】
また、自動合成器を用いてもペプチドが合成される。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ３５７自動ペプチド合成器を用いて、Ｃ末端にて開始してＭＢＨＡ Ｒｉｎｋ樹脂（典型的には１００ｍｇの樹脂）にアミノ酸を順次カップリングさせる。カップリングは、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中の１，３−ジイソプロピルカルボジイミドを用いるか、または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジエチルイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）によって行う。ＦＭＯＣ保護基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のピペリジンの２０％溶液での処理によって除去する。その後、樹脂をＤＭＦ（２回）、続いてメタノールおよびＮＭＰで洗浄する。
【００５１】
また、前記のコノトキシンペプチドのアナログまたは活性断片のムテインは本明細書に含まれる。例えば、Ｈａｍｍｅｒｌａｎｄら（１９９２）参照。そのコノトキシンペプチドのアナログまたは活性断片の、誘導体ムテインは、米国特許第５，５４５，７２３号（特に、第２欄、第５０行〜第３欄、第８行）；第５，５３４，６１５号（特に、第１９欄、第４５行〜第２２欄、第３３行）；および第５，３６４，７６９号（特に、第４欄、第５５行〜第７欄、第２６行）（各々をここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に概説されたごとき保存的アミノ酸置換を含めた公知の手法により合成できる。
【００５２】
また、本発明のω−コノペプチドは、典型的には、発作、脳血管事故、脳または脊髄外傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺死、窒息、分娩仮死または低血糖事象に続く低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患に関連する神経毒性損傷を減少させるのに有用である。神経毒性損傷を減少させるために、ω−コノペプチドは、患者が経験するであろうＣＮＳ損傷を効果的に最小とするように、低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患の開始の２４時間以内に患者に治療上有効量にて投与されるであろう。
【００５３】
本発明のω−コノペプチドは、さらに、例えば、鎮痛剤として痛みの制御、および片頭痛、急性疼痛または持続性疼痛の治療に有用である。それらは、予防的にあるいは片頭痛エピソードに関連する症状を緩和する、または急性もしくは持続性疼痛を治療するために用いることができる。これらの用途では、ω−コノペプチドは、痛みを克服または和らげる治療上の有効量にて投与される。
【００５４】
有効成分として本発明の化合物を含有する医薬組成物は、慣用的な医薬調剤技術に従って調製できる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．社，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照されたし。典型的には、治療上有効量の有効成分は医薬上許容される担体と混合されるであろう。担体は、投与、例えば、静脈内、経口、非経口または髄腔内、に望ましい製剤の形態に依存して非常に様々な形態を取ることができる。送達方法については、米国特許第５，８４４，０７７号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたし。
【００５５】
「医薬組成物」とは、医薬投与につき適当な物理的に区別される統一性のある部分を意味する。「投与単位形態における医薬組成物」とは、医薬投与につき適当な物理的に区別される統一性のある単位を意味し、各々は、担体と組み合わせたおよび／または包被内に入れられた活性化合物の毎日用量、複数（４回まで）またはサブマルチプル（４０回より下）の毎日用量を含有する。該組成物が毎日用量、または毎日用量の半分または１／３または１／４を含むかは、該医薬組成物が、１日当り１回または例えば、２、３または４回投与されるべきかに依存するであろう。
【００５６】
本明細書に用いられる「塩」なる用語は、無機または有機の酸および／または塩基、好ましくは塩基塩で形成された酸性および／または塩基性塩を示す。特に、本発明の化合物を医薬として使用する場合、医薬上許容される塩が好ましいが、他の塩は、例えば、これらの化合物を処理するのに、または医薬タイプでない使用を意図する場合に有用性を見出せる。これらの化合物の塩は、技術が認識されている手法によって調製できる。
【００５７】
かかる医薬上許容される塩の例には、限定されるものではないが、各々、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩および酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、酢酸テオフィリン、サリチル酸塩等のごとき無機および有機の付加塩が含まれる。低級アルキル四級アンモニウム塩等も同様に適当である。
【００５８】
本明細書に用いる「医薬上許容される」担体なる用語は、非毒性の、不活性固体の、半固形液体の充填剤、希釈剤、カプセル化物質、いずれかのタイプの処方補助剤、または単に、セーラインのごとき無菌水性媒体を意味する。医薬上許容される担体として機能できる物質のいつらかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースのごとき糖、コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンのごときデンプン、セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのごときその誘導体；粉末トラガカントゴム；メルト、ゼラチン、タルク；カカオ脂および坐薬ワックスのごとき賦形剤；落花生油、綿実油、べにばな油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油のごとき油；プロピレングリコールのごときグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのごときポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのごときエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのごとき緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性セーライン、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬処方において用いられる他の非毒性の適合性物質である。
【００５９】
また、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのごとき湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤は、処方者の判断により該組成物中に存在できる。医薬上許容される抗酸化剤の例には、限定されるものではないが、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のごとき水溶性抗酸化剤；アスコルビルパルチメート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）またはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レクチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等のごとき油可溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のごとき金属キレート化剤が含まれる。
【００６０】
経口投与に関しては、化合物をカプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、メルト剤、散剤、懸濁剤または乳剤のごとき固体または液体の製剤に処方化できる。経口投与形態での組成物の調製においては、いずれかの通常の医薬媒体を用いることができ、これは例えば、（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤のごとき）経口液体製剤の場合においては、水、グリコール、油剤、アルコール、矯味剤、保存料、着色剤、懸濁化剤等；あるいは（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤のごとき）経口固体製剤の場合においては、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のごとき担体である。投与におけるそれらの簡便性のために、錠剤およびカプセル剤は最も有利な投与単位形態を表し、その場合、固体医薬担体を明らかに用いる。所望ならば、錠剤は標準的な技術によって糖衣または腸溶衣をかけ得る。活性薬剤をカプセル化して、それが血液脳関門を通過することを許容すると同時に胃腸管を安定に通過させ得る。例えば、ＷＯ９６／１１６９８を参照されたし。
【００６１】
非経口投与に関しては、化合物を医薬担体に溶解して、液剤または懸濁剤として投与できる。適当な担体の例示は水、セーライン、デキストロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油剤である。また、担体は、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等も含むこともできる。また、化合物を髄腔内投与する場合、それらを脳脊髄液に溶解できる。
【００６２】
様々な投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、選択された特定の薬物、治療されるべき疾患状態の重篤度および治療上の効力のために必要とされる用量にもちろん依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容できるいずれの様式の投与を用いても実施でき、臨床的に許容できない副作用を生じることなく、活性化合物の有効レベルを生じるいずれの様式も意味する。かかる投与様式には、経口、直腸、舌下、局所、経鼻、経皮または非経口の経路が含まれる。「非経口」なる用語は、皮下、静脈内、硬膜外、潅注、筋肉内、放出ポンプまたは注入が含まれる。
【００６３】
例えば、本発明による活性薬剤の投与は、いずれの適当な送達手段を用いても達成でき、
（ａ）ポンプ（例えば、ＬａｕｅｒおよびＨａｔｔｏｎ（１９９３）、Ｚｉｍｍら（１９８４）ならびにＥｔｔｉｎｇｅｒら（１９７８）参照）；
（ｂ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；第４，３５３，８８８号および第５，０８４，３５０号参照）；
（ｃ）持続性放出ポリマー埋込み剤（例えば、米国特許第４，８８３，６６６号参照）；
（ｄ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号および第４，９６８，７３３号ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２参照）；
（ｅ）ＣＮＳに対する裸のまたは非カプセル化の細胞移植（例えば、米国特許第５，０８２，６７０号および第５，６１８，５３１号参照）；
（ｆ）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは他の適当な部位への注射；または
（ｇ）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤または持続性放出製剤における経口投与
が含まれる。
【００６４】
本発明の１つの具体例において、活性薬剤は、ＣＮＳ、好ましくは、脳室、脳実質、髄腔または他の適当なＣＮＳ位置、最も好ましくは髄腔内に直接的に送達される。
【００６５】
あるいは、ターゲティング治療を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのごときターゲティング・システムの使用によって、さらにとりわけ、ある種のタイプの細胞に活性薬剤を送達できる。ターゲティングは、種々の理由、例えば、薬剤が許容できない毒性があるならば、余りにも高用量を必要とするならば、または標的細胞に入ることができないならば望ましい。
【００６６】
また、ペプチドである活性薬剤は、活性薬剤をコードするＤＮＡ配列を患者の体内、特に脊髄領域に移植するために設計された細胞に導入する細胞ベースの送達システムにて投与できる。適当な送達システムは、米国特許第５，５５０，０５０号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載されている。適当なＤＮＡ配列は、開示された配列および公知の遺伝暗号に基づいて、各活性薬剤について合成により調製できる。
【００６７】
活性薬剤は、好ましくは、治療上有効量にて投与される。活性化合物の「治療上有効量」または単に「有効量」とは、いずれの医学的治療にも適用できる適当な利益／リスク比にて、所望の疾患を治療するのに十分な化合物の量を意味する。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療すべき疾患の性質および重篤度に依存するであろう。治療の処方箋、例えば、投与量、時期等に関する決定は、一般医師または専門医の責任の範囲内にあり、典型的には治療すべき障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、および実践者に知られている他の因子を考慮する。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。
【００６８】
用量は、局所的または全身的に所望の薬物レベルを達成するように適当に調製できる。典型的には、本発明の活性薬剤は、活性薬剤の約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約７５ｍｇ／ｋｇの用量範囲にてそれらの効果を示す。適当な用量は、１日当り複数のサブ用量にて投与できる。典型的には、用量またはサブ用量は、単位投与形態当り約０．１ｍｇないし約５００ｍｇの活性薬剤を含有できる。より好ましい用量は、単位投与形態当り約０．５ｍｇないし約１００ｍｇの活性薬剤を含有するであろう。用量は、一般的には、低レベルにて開始され、所望の効果が達成されるまで増加させる。対象における応答がかかる用量にて不十分である事象において、より高用量（または異なるより局所化された送達経路による有効なより高用量）さえ、患者耐容性が許される範囲まで使用できる。例えば、２４時間にわたる連続投与または１日当りの複数用量は、化合物の適当な全身レベルを達成すると考えられる。
【００６９】
痛みの治療では、投与経路がＣＮＳに直接的であるならば、考えられる用量は、１日当り約１ｎｇないし約１００ｍｇ、好ましくは１日当り約１００ｎｇないし約１０ｍｇ、より好ましくは１日当り約１μｇないし約１００μｇである。末梢的に投与されるならば、考えられる用量は、いくらか高く、１日当り約１００ｎｇないし約１０００ｍｇ、好ましくは１日当り約１０μｇないし約１００ｍｇ、より好ましくは１日当り約１００μｇないし約１０ｍｇである。コノペプチドが連続注入によって（例えば、ポンプ送達、生分解性ポリマー送達または細胞ベースの送達により）送達されるならば、低用量がボーラス送達についてよりも考えられる。
【００７０】
有利には、該組成物は、投与単位として処方され、各単位は、活性薬剤の固定用量を供給するように適合される。錠剤、被覆錠、カプセル剤、アンプル剤および坐剤は、本発明による投与形態の例である。
【００７１】
活性薬剤は、すなわち、適当な有効用量が、単一または複数の単位用量にて用いられた投与形態と一致するであろうように、有効量を構成することを必要とするにすぎない。正確な個々の用量、ならびに毎日用量は、使用ヒトまたは動物につき医師または獣医の指示の下、標準的医学原理により決定される。
【００７２】
医薬組成物は、一般的には、全組成物の重量当り、活性薬剤の約０．０００１ないし９９重量％、好ましくは約０．００１ないし５０重量％、より好ましくは約０．０１ないし１０重量％を含有するであろう。また、活性薬剤に加えて、該医薬組成物および医薬品は、他の医薬上活性な化合物を含有できる。他の医薬上活性な化合物の例には、限定されるものではないが、鎮痛剤、サイトカインおよび臨床医学の全ての主要領域における治療剤が含まれる。他の医薬上活性な化合物と共に用いる場合、本発明のコノペプチドは、薬物カクテルの形態にて送達できる。カクテルは、本発明で有用ないずれかの化合物と、もう一つの薬物または薬剤の混合物である。本具体例において、共通の投与ビヒクル（例えば、丸剤、錠剤、埋込み剤、ポンプ、注射溶液等）は、薬剤を補足的に増強する組合せにて本組成物の双方を含有するであろう。カクテルの個々の薬物は、治療上有効量にて各々投与される。治療上の有効量は、前記のパラメーターによって決定されるであろうが；それは、いずれの事象においても薬物が、所望の効果を達成するのに有効である時間に必要とされる身体の領域における薬物レベルを確立するその量である。
【００７３】
本発明の実施には、特記されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニックバイオロジーを使用し、それらは当該技術分野の技量内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５；Ａｎａｎｄ、１９９２；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ、１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）参照。
【００７４】
実施例
本発明を以下の実施例に参照することによって説明するが、それは例示的な方法によって提供するもので、如何なる場合においても本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準的な技術、または以下に特記される技術を利用した。
【００７５】
実施例１
ω−コノペプチドの単離
毒液管から粗製毒液を抽出し（Ｃｒｕｚら、１９７６）、従前に記載されているごとく成分を精製した（Ｃａｒｔｉｅｒら、１９９６）。毒液管からの粗製抽出物を、ＶｙｄａｃＣ１８半分取用カラム（１０×２５０ｍｍ）を用いる逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によって精製した。生物活性ピークのさらなる精製は、ＶｙｄａｃＣ１８分析用カラム（４．６×２２０ｍｍ）にて行った。流出物は２２０ｍｍでモニターした。ピークを収集し、そのアリコートを活性につきアッセイした。精製中に、ＨＰＬＣ画分をマウスへの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入によりアッセイした（Ｃｌａｒｋら、１９８１）。
【００７６】
精製ペプチドのアミノ酸配列は、標準的な方法によって決定した。１２０Ａ アナライザを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａタンパク質シークエンサー（ＤＮＡ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）上の自動エドマン分解によって配列決定する前に、精製したペプチドを還元し、アルキル化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９５；Ｓｈｏｎら、１９９４）。
【００７７】
本方法により、表１に「単離」ごとく記載されたω−コノペプチドを得た。これらのω−コノペプチド、ならびに表１に記載された他のω−コノペプチドおよびω−コノペプチド前駆体を米国特許第５，５９１，８２１号に記載されたごとく合成する。
【００７８】
実施例２
ω−コノペプチドをコードするＤＮＡの単離
ω−コノペプチドをコードするＤＮＡは、Ｏｌｉｖｅｒａら（１９９６）に記載されているごとき、当該技術分野でよく知られている一般的手法を用いる慣用技術に従って単離およびクローン化した。別法として、ｃＤＮＡライブラリーは、慣用技術を用いてコーヌス毒液管から調製した。単一クローンからのＤＮＡは、Ｍ１３ユニバーサル・プライミング部位およびＭ１３リバース・ユニバーサル・プライミング部位にほぼ対応するプライマーを用いる慣用技術によって増幅させた。ほぼ３００〜５００ヌクレオチドのサイズを有するクローンを配列決定し、既知のω−コノペプチドに対する配列中の類似性につきスクリーニングした。ＤＮＡ配列およびコードされたプロペプチド配列を表１に記載する。また、成熟毒素をコードするＤＮＡ配列は、表１に記載されたＤＮＡ配列に基づいて調製できる。本発明のω−コノペプチドの整列を表２に記載する。
【００７９】
表１
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
名称： Ｓｘ６．３
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【表１】
【表２】
【０１８９】
実施例３
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
フリングス（ Ｆｒｉｎｇｓ ）聴覚原性痙攣感受性マウス
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ抗痙攣活性をＷｈｉｔｅら（１９９２）によって記載されたフリングスの聴覚原性痙攣感受性マウスにおいて分析する。該ω−コノペプチドは、本アッセイにおいて抗痙攣活性を有することを見出す。
【０１９０】
実施例４
ＣＦ Ｎｏ ． １におけるω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ抗痙攣活性を、最大電気ショック、皮下ペンチレンテトラゾール（Ｍｅｔｒａｚｏｌ）痙攣閾値および閾値硬直性伸展テストを用いて、Ｗｈｉｔｅら（１９９２）によって記載されたＣＦ ＮＯ．１マウスにおいて分析する。ω−コノペプチドは、抗痙攣活性を有することを見出す。
【０１９１】
実施例５
ペンチレンテトラゾール誘発閾値痙攣モデルにおける
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性をペンチレンテトラゾールの持続静脈内注射を用いて分析する（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）。ピーク効果の時点にて、痙攣溶液（１０単位（米国薬局方）／ｍｌヘパリンナトリウムを含有する０．９％セーライン中の０．５％ペンチレンテトラゾール）を０．３４ｍｌ／分の一定速度にて尾静脈に注入する。注入の開始から最初の痙攣および間代性痙攣の始まりまでの秒単位の時間を薬物処置したまたは対照動物につき記録する。各指標に対する時間を各マウスにつきペンチレンテトラゾールのｍｇ／ｋｇに変換し、平均およびその平均の標準誤差を計算する。ω−コノペプチドはｉ．ｖ． ペンチレンテトラゾール痙攣閾値を上昇させることを見出す。
【０１９２】
実施例６
疼痛モデルにおけるω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドの抗疼痛活性をいくつかの動物モデルで示す。これらのモデルには、神経損傷モデル（Ｃｈａｐｌａｎら、１９９７）、ラットにおけるｓ．ｃ．ホルマリン注射に対する侵害受容性応答（Ｃｏｄｅｎｅ、１９９３）およびＮＭＤＡ−誘導持続性疼痛モデル（Ｌｉｕら、１９９７）が含まれる。これらの各モデルにおいて、ω−コノペプチドおよびω−コノペプチド誘導体が鎮痛特性を有することを見出す。
【０１９３】
より詳細には、本試験は、侵害受容性および神経障害性の疼痛のマウスモデルにおいて、ω−コノペプチドの髄腔内投与の効果を評価する。侵害受容性疼痛では、ω−コノペプチドの効果は、炎症性の痛みの２つの異なる試験において試験した。第１のものは、相対的に短期的だか、信頼性のある痛み行動を生じるために理想的なホルマリン試験であり、それは容易に定量化される。痛み行動には２つの相が存在し、その第２のものは、後肢のホルマリン誘発炎症から大きく誘因されると推測される。ω−コノペプチドは、ホルマリン注射に先立ち１０分前に投与される。注射によって生じたひるみ回数および／またはなめ期間をモニターする。第１の相は一次影響の直接的な活性化のためであり、かくして、脊髄の長時間の変化にほとんど依存しなく、ω−コノペプチドは第２の相における疼痛行動の大きさに最大の効果を有すると推測される。
【０１９４】
また、後肢に完全フロインドアジュバンドの注射を受けた動物における機械的および熱的な閾値を試験する。これは、後肢の腫脹を含めた局所炎症、および機械的および熱的な閾値における激しい減少を生じ、注射後２４時間以内に検出される。ω−コノペプチドを受けたラットにおける閾値の変化は、ビヒクルの髄腔内注射を受けたラットのものと比較される。
【０１９５】
重要な課題は、疼痛モデルが確立された後に投与される場合に薬物が効果的であるかどうか、または前処置として用いられるだけならばそれらが効果的であるかどうかである。明らかに、臨床的要求は、痛みが発生した後に効果的である薬物についてである。この問題を扱うために、炎症（ＣＦＡ）または神経損傷が確立された後に、動物が試験され、ここに、ω−コノペプチドが反復して投与される。これらの実験において、ω−コノペプチドは、髄腔内（ｉ．ｔ．）経路により毎日注射される。機械的および熱的閾値（各々、自由に運動する動物におけるホン・フレイ・ヘアー（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒ）で、また自由に運動する動物におけるハーグレイブ（Ｈａｒｇｒａｖｅ’ｓ）試験で測定）を、損傷が誘導され、測定された疼痛変化を経時的にモニターした後、２ないし４週間反復する。
【０１９６】
実施例７
疼痛モデルにおけるω−コノペプチドの効果
また、ω−コノペプチドの鎮痛活性を以下の疼痛モデルにて試験する：
【０１９７】
持続性疼痛（ホルマリン試験）。髄腔内（ｉｔ）薬物注射をＨｙｌｄｅｎおよびＷｉｌｃｏｘ（１９８０）によって記載されたごとく行う。ω−コノペプチドまたはビヒクルを５ ｌの容量で投与する。ｉ．ｔ．注射１５分後に、右後肢に２０ ｌの５％ホルマリンを注射する。動物は、観察を促すために鏡が背後にある透明なプレキシガラスの筒に入れる。動物を５分間当り２分間詳しく観察し、動物が注射された肢をなめるのに費やした時間量を合計４５〜５０分間このように記録する。結果を５分当りの秒で表すなめ時間として表す。その実験の終わりにて、全動物を加速回転棒に配置し、最初の落下までの潜伏時間を記録した。ω−コノペプチドは、神経障害性疼痛を治療するための効力を予測する本モデルにおいて活性であると見出される。
【０１９８】
急性疼痛（テイル−フリック法（ ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ ））。ω−コノペプチドまたはセーラインを５μｌの一定容量にてＨｙｌｄｅｎおよびＷｉｌｃｏｘ（１９８０）の方法により髄腔内（ｉ．ｔ．）投与する。マウスを尾を曝露してタオルで穏やかに包む。ｉ．ｔ．注射後の種々の時点にて、尾を５４Ｃに維持した水浴中に浸け、積極的な尾の引込め時間を記録する。８秒まで引込めなければ、組織損傷を避けるために尾を取り出す。
【０１９９】
神経障害性疼痛。部分的坐骨神経結紮を用いて、神経障害性疼痛におけるＭａｒ１の効力を評価する。神経損傷はＭａｌｍｂｅｒｇおよびＢａｓｂａｕｍ（１９９８）の方法により生成する。動物をケタミン／キシラジン溶液で麻酔し、坐骨神経を曝露し、神経の１／３ないし１／２の周囲の８−０絹縫合糸でしっかりと結紮する。偽手術のマウスにおいては、神経を曝露したが結紮はしない。動物は、試験実施前少なくとも１週間回復させる。試験日に、マウスを金網フレーム上のプレキシガラスの筒に入れ、少なくとも６０分間馴化させる。機械的異痛をＣｈａｐｌａｎら（１９９４）に記載されるアップ−ダウン法を用いて較正されたフォン・フレイ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）で評価し、５０％引込め閾値を計算する。その一連のフィラメントのいずれにも応答しない動物を最大値３．６グラムで示し、それは、典型的には、屈曲なくして後肢を持ち上げたフィラメントであり、動物体重のほぼ１／１０に一致する。
【０２００】
得られたデータは、ω−コノペプチドが、痛みの３種の共通して用いたモデル：急性、持続性／炎症および神経障害性疼痛モデルにおいて強力な鎮痛特性を有することを示す。
【０２０１】
実施例８
カルシウム−チャネルアンタゴニスト活性：イオン電流の阻害
カルシウムチャネルを介するイオン電流を単一パッチ−クランプ電極により電圧固定された細胞中で評価する。主として、これらの全細胞パッチ−クランプ試験をＮ１Ｅ１１５マウス神経芽細胞腫細胞に対して行うが、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＩＭＲ−３２を含めた種々の細胞タイプも評価される。
【０２０２】
大部分の測定は、他のイオン電流の不存在下でカルシウム電流の評価を可能とするバス・セーライン（ｂａｔｈ ｓａｌｉｎｅ）を用いて得られる。これらの溶液は、８０ｍＭ ＮＭＤＧ（ナトリウム置換体として）、３０ｍＭ ＴＥＡＣ１（カリウム電流の遮断）、１０ｍＭ ＢａＣｌ２（カルシウムチャネルを介する電荷−担体として）、およびｐＨ７．３の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有した。また、いくらかの溶液が、２ｍＭキニジン（カリウム電流の遮断）および３μＭテトロドトキシン（ナトリウム電流の遮断）を含有した。通常のバス・セーラインは、（ｍＭ）：１４０ ＮａＣｌ、１０ グルコース、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３である。細胞内溶液は、（ｍＭ）：ｐＨ７．３〜７．４の１５０ ＣｓＣｌ、０．５ ＣａＣｌ２、５ ＥＧＴＡ、５ ＭｇＣｌ２、２ Ｋ２ＡＴＰである。バス・セーラインおよび全ての内部溶液は使用前に濾過する。
【０２０３】
ピペットをコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）７０５２ガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ， Ｃａｌｉｆ． ９１７１１）から作成し、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｍｉｎｇ， Ｍｉｄｌａｎｄ， Ｍｉｃｈ． ４８６４０）でコーティングし、使用前にファイヤーポリッシュ（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈ）した。気泡数は、典型的は、５ないし６であり、ピペット抵抗は典型的には２〜５ＭＯｈｍである。カルシウム電流に対する顕著な効果が観察されないコーニング８１６１、キンブル（Ｋｉｍｂｌｅ）および他のガラスを用いる。
【０２０４】
記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ １−Ｃ 増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ． ９４４０４）で室温にて行い、ｐＣＬＡＭＰ ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析する。データを０．１ＫＨｚの典型的なサンプリング速度で１０００Ｈｚにてフルターをかけ；全ての場合に、データはバイアスを回避するためのサンプリング速度のせいぜい１／５の頻度にてフィルターをかける。データをソフトウェアによってオンラインで集める。分析を画面上で行い、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＬａｓｅｒＪｅｔ Ｐｒｉｎｔｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ． ９４３０６）を介して出力する。
【０２０５】
典型的な実験は、以下のごとく行なう：シール形成に続いて、シリーズ抵抗補正（ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）および容量一過性解除（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃａｎｃｅｌｌａｔｉｏｎ）後に、電位固定プロトコールを行い、ここに、細胞電位は、保持用電位（典型的には、−１００ｍＶ）から、１０ｍＶずつ増量して−６０ｍＶないし＋２０ｍＶの範囲とする試験電位まで段階的に進める。細胞は、パルスの間、５秒間保持電位に保持する。他の保持電位から開始するプロトコールは、通常、同一範囲の試験電位をカバーした。ω−コノペプチドは、そのような細胞系にてカルシウムチャネル遮断活性を有することが見出される。
【０２０６】
本発明の方法および組成物は、様々な具体例の形態において組込むことができ、そのいくつかだけを本明細書に開示すると認められるであろう。他の具体例が存在し、それは本発明の精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。かくして、記載された具体例は例示であり、制限として構成されるべきものではない。
【０２０７】
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ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９２／１９１９５．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９４／２５５０３．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９５／０１２０３．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９５／０５４５２．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／０２２８６．
【０２２２】
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／０２６４６．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／４０８７１．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／４０９５９．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９７／１２６３５．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９８／０３１８９．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ００／２３０９２．[0001]
Cross-reference of related applications
This application is related to U.S. Provisional Application Serial No. 60 / 219,616 filed July 21, 2000, and U.S. Provisional Application Serial No. Claim the benefit to the number 60 / 265,888. Each of these applications is hereby expressly incorporated herein by reference.
[0002]
This invention was made with government support under Grant No. PO1 GM48677 awarded by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health, Bethesda, MD. The United States Government has certain rights in the invention.
[0003]
Background of the Invention
The present invention relates to an omega-conopeptide, a derivative thereof or a pharmaceutically acceptable agent thereof, including the treatment of neurological and psychiatric disorders such as anticonvulsants, neuroprotectives, cardiovascular agents or for managing pain. To be used and their use. Furthermore, the present invention relates to nucleic acid sequences encoding conopeptides and encoding propeptides and the propeptides thereof.
[0004]
In describing the background of the invention, particularly in providing further details on the practice, the publications and other materials used herein are expressly incorporated by reference and are considered part of this specification for their convenience. Therefore, in the following text, reference is made by author and date, and the authors are listed in the attached reference list in alphabetical order.
[0005]
Conus is a genus of predatory marine gastropods (conchs) that inject venom into prey. Toxic mussels use a highly developed venom organ to deliver their cocktail of toxic conotoxins to their prey. In fish-catching species such as Conus magus, the mussel uses a chemical sensory organ in its siphon to detect the presence of the fish, and when closed the mussel has its mouth fully extended and a hollow venom containing venom. Release a harpoon-like tooth to the fish. This immobilizes the fish and allows the mussel to engulf it in its mouth via an attached filament. For general information about Cornus and their venoms, see the website at http: / grimwade. biochem. unimelb. edu. au / cone / reference. html. Prey capture is achieved through the elaborate accumulation of peptides targeting specific ion channels and receptor subtypes. The venom of each Conus species appears to contain a unique set of 50-200 peptides. The composition of the venom varies greatly between species and between individual snails within each species, each evolving optimally to paralyze its prey. The active ingredient of the venom is a small peptide toxin, typically a peptide 12 to 30 amino acid residues in length, typically highly restricted due to high density of disulfide bonds.
[0006]
The venoms, when separated, exhibit a range of biological activities; when injected into mice, they consist of a large number of different peptide components that obtain a range of physiological responses to shock or inhibition. . The paralytic components of venom, which have been the focus of recent research, are α-, ω- and μ-conotoxins. All of these conotoxins act by interfering with neurotransmission, but each accomplishes this by targeting different points of the process. The α-conotoxin targets a nicotinic ligand-gated channel, the μ-conotoxin targets a voltage-gated sodium channel, and ω-conotoxin targets a voltage-gated calcium channel. (Olivera et al., 1985; Olivera et al., 1990). For example, binding is between α-, αA- and φ-conotoxins and nicotinic ligand sensitive ion channels; between ω-conotoxins and voltage-gated calcium channels; between μ-conotoxins and voltage-gated sodium channels. Between δ-conotoxin and voltage-gated sodium; between κ-conotoxin and voltage-gated potassium channels; between conantokin and ligand-sensitive glutamate (NMDA) channels.
[0007]
However, the structure and function of only a few of these peptides are currently being determined. For the peptides whose function was determined, three classes of targets were evaluated: voltage-gated ion channels; ligand-sensitive ion channels and G protein-coupled receptors.
[0008]
Cornus peptides targeting voltage-gated ion channels include those that delay sodium channel inactivation, as well as blockers specific for sodium, calcium and potassium channels. Peptides targeting ligand-sensitive ion channels include NMDA and serotonin receptor antagonists, as well as competitive and non-competitive nicotinic receptor antagonists. Peptides acting on the G-protein receptor include neurotensin and vasopressin receptor agonists. The new pharmaceutical selectivity of conotoxins is defined, at least in part, by a specific disulfide-bonded scaffold linked to a hypervariable amino acid in a disulfide loop (for review, see McIntosh et al., 1998).
[0009]
There are drugs used to treat pain, which are known in the literature and to those skilled in the art. See, for example, Merk @ Manual, 16th edition (1992). However, there is a need for less addictive and more active analgesics with reduced side effects and toxicity. Ideal analgesics reduce pain awareness, produce pain relief over a wide range of pain types, work well whether given orally or parenterally, produce minimal or no side effects, and are tolerant It will not be prone to gender and drug dependence.
[0010]
Due to the high potency and excellent selectivity of the conopeptide, several are at various stages of clinical development for the treatment of human disorders. For example, two Cornus peptides have been developed for the treatment of pain. The most advanced is the N-type calcium channel blocker ω-conotoxin MVIIA (ziconotide) (Heading, C., 1999; see US Pat. No. 5,859,186). The omega-conotoxin MVIIA isolated from Conus @ magus is about 1000 times more potent than morphine and has not yet produced tolerance and addictive properties of narcotics. ω-Conotoxin MVIIA has completed Phase III (final phase) of human clinical trials and has been approved as a therapeutic. ω-Conotoxin MVIIA is introduced into a human patient by an implantable and programmable pump using a catheter passed intrathecally. Preclinical studies for use in postoperative pain have been performed on another conus peptide, Contulakin-G, isolated from Conus geographus (Craig et al., 1999). Contulakin-G is a 16 amino acid O-linked glycopeptide whose C-terminus resembles neurotensin. It is an agonist of the neurotensin receptor, but appears to be significantly more potent than neurotensin in inhibiting pain in in vivo assays.
[0011]
Ischemic damage to the central nervous system (CNS) can result from either whole brain or focal ischemia. Global cerebral ischemia occurs under conditions in which blood flow to the whole brain stops for a period of time, such as may be due to cardiac arrest. Regional ischemia occurs when some brains are deprived of their normal blood supply, which can result from thromboembolic obstruction of cerebral blood vessels, traumatic head or spinal cord injury, edema or tumors of the brain or spinal cord. Occurs. Both global and focal ischemia have the potential for extensive nerve damage, even if global cerebral ischemic disease is transient or if regional ischemia affects very limited areas.
[0012]
Epilepsy is a recurrent paroxysmal disorder of brain function characterized by altered consciousness, motor activity, sudden short attacks of sensory phenomena, or inappropriate behavior triggered by abnormal overdischarge of brain neurons. The most common form of seizures begins with loss of consciousness and motor control, and tonic or clonic seizures of all limbs, but any recurrent seizure pattern is called epilepsy. The term primary or idiopathic epilepsy refers to cases where the cause of the seizure cannot be ascertained. Secondary or symptomatic epilepsy indicates a disease when it is associated with a factor such as trauma, neoplasm, infection, developmental abnormalities, cerebrovascular disease or various metabolic diseases. Epileptic seizures are classified as partial seizures (localized, focal seizures) or generalized seizures (spastic or nonconvulsive). The classes of partial seizures include simple partial seizures, complex partial seizures and secondary systemic partial seizures. Classes of generalized seizures include absence seizures, atypical absence seizures, myoclonic seizures, clonic seizures, tonic seizures, rigid-clonic seizures (grand mal) and atonic seizures. Therapeutic agents having anticonvulsant properties are used to treat seizures. Most therapeutic agents used to eradicate or alleviate seizures, at least through the effects of reducing the spread of excitement from the seizure center and preventing detonation and disruption of the functioning of normal populations of neurons Act. Conventional anticonvulsants utilized include phenytoin, phenobarbital, primidone, carbamazepine, etosuximide, clonazepam and valproate. Several new and chemically distinct anticonvulsants have recently been approved for marketing, including lamotrigine, ferlbamate, gabapenin and topiramate. For more details on attacks and their treatment see Rall & Schleifer (1985) and The Merck Manual (1992).
[0013]
With respect to the large number of biologically active substances in Conus species, it is desirable to further characterize them and identify peptides that can treat disorders associated with voltage-gated ion channels such as seizures and pain. Surprisingly, and in accordance with the present invention, Applicants have a novel need to address the long-felt need for safe and effective treatment that can be useful in treating disorders associated with voltage-gated ion channels. Discovered conotoxin.
[0014]
Summary of the Invention
The present invention relates to omega-conopeptides, derivatives or medicaments thereof, including the treatment of neurological and psychiatric disorders, such as anticonvulsants, neuroprotectives, cardiovascular agents, or for managing pain. It is directed to the above acceptable salts and their use. The present invention is further directed to nucleic acid sequences encoding the ω-conopeptide and encoding the propeptide, as well as the propeptide.
[0015]
More specifically, the present invention is directed to ω-conopeptides having the amino acid sequences set forth in Table 2 below.
[0016]
The present invention is also directed to derivatives or pharmaceutically acceptable salts or derivatives of the ω-conopeptide. In examples of derivatives, the Arg residue is Lys, ornithine, homoarginine, nor-Lys, N-methyl-Lys, N, N-dimethyl-Lys, N, N, N-trimethyl-Lys or any of The Lys residue can be replaced by Arg, ornithine, homoarginine, nor-Lys or any synthetic basic amino acid; the Tyr residue can be meta-Tyr, ortho-Tyr, Nor-Tyr, mono-halo-Tyr, di-halo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-phospho-Tyr, nitro-Tyr or any synthetic hydroxy-containing amino acid can be substituted; the Ser residue is Thr Or any synthetic hydroxylated amino acid; the Thr residue may be Ser or any synthetic hydroxylated amino acid. The Phe residue can be replaced with any synthetic aromatic amino acid; the Trp residue can be Trp (D), neo-Trp, halo-Trp (D or L) or any Synthetic aromatic amino acids can be substituted; and the Asn, Ser, Thr or Hyp residue can be glycosylated. The halogen is iodo, chloro, fluoro or bromo; preferably iodo for halogen-substituted -Tyr and bromo for halogen-substituted -Trp. Also, the Tyr residue can be substituted with a 3-hydroxyl or 2-hydroxyl isomer (meta-Tyr or ortho-Tyr, respectively) and the corresponding O-sulfo- and O-phospho-derivatives. The acidic amino acid residue can be replaced with any synthetic acidic amino acid, for example, a tetrazolyl derivative of Gly and Ala. Aliphatic amino acids are non-natural aliphatic branched or straight chain C with n = 8 or less.nH2n + 2Can be replaced by a synthetic derivative having The Cys residue may be in the D or L configuration and may be optionally substituted with homocysteine (D or L).
[0017]
Examples of synthetic aromatic amino acids include, but are not limited to, nitro-Phe, 4-substituted-Phe (where the substituent is C1-C3Alkyl, carboxyl, hydroxymethyl, sulfomethyl, halo, phenyl, -CHO, -CN, -SO3H and -NHAc). Examples of synthetic hydroxy-containing amino acids include, but are not limited to, 4-hydroxymethyl-Phe, 4-hydroxyphenyl-Gly, 2,6-dimethyl-Tyr, and 5-amino-Tyr. Examples of synthetic basic amino acids include, but are not limited to, N-1- (2-pyrazodilinyl) -Arg, 2- (4-piperinyl) -Gly, 2- (4-piperinyl) -Ala, -[3- (2S) pyrrolininyl] -Gly and 2- [3- (2S) pyrrolininyl] -Ala. These and other synthetic basic amino acids, synthetic hydroxy containing amino acids or synthetic aromatic amino acids are available from RSP Amino Acid Analogues, Inc. Building Block Index, Version 3.0 by and available from Worcester, MA (1999 catalog, pages 4-47 for hydroxy-containing and aromatic amino acids and pages 66-87 for basic amino acids). And also see http://www.amino-acids.com, which are hereby incorporated by reference. Examples of synthetic acidic amino acids include carboxyls, phosphoric acids, sulfones, as described by Ornstein et al. (1993) and in US Pat. No. 5,331,001, each of which is hereby incorporated by reference. Included are acids as well as their derivatives with acidic functional groups, including synthetic tetrazolyl derivatives.
[0018]
Optionally, in the ω-conopeptide of the invention, the Asn residue may be modified to include N-glycans, and the Ser and Thr and Hyp residues may be modified to include O-glycans (eg, gN , GS, gT and g-Hyp). According to the present invention, glycans mean any N-, S- or O-linked mono-, 2-, 3-, poly- or oligosaccharides, which are synthetic as known in the art. Alternatively, it can be attached to the hydroxy, amino or thiol group of either natural or modified amino acids by enzymatic methods. Monosaccharides constituting glycans include D-allose, D-altrose, D-glucose, D-mannose, D-gulose, D-idose, D-galactose, D-talose, D-galactosamine, D-glucosamine, DN-acetyl-glucosamine (GlcNAc), DN-acetyl-galactosamine (GalNAc), D-fucose or D-arabinose may be included. These sugars may be structurally modified, for example, with one or more acidic groups such as O-sulfate, O-phosphate, O-acetyl, or sialic acid, and combinations thereof. Glycans may also include similar polyhydroxy groups or polypropylene glycol derivatives, such as D-penicillamine 2,5 and its halogenated derivatives. The glycosidic bond is beta and is 1-4 or 1-3, preferably 1-3. The bond between the glycan and the amino acid may be alpha or beta, preferably alpha and 1-.
[0019]
Core O-glycans have been described by Van de Steen et al. (1998), which is hereby incorporated by reference. Mucin-type O-linked oligosaccharides are linked to Ser or Thr (or other hydroxylated residues of the peptide) by a GalNAc residue. The monosaccharide building block and the linkage attached to this first GalNAc residue are defined as "core glycans", eight of which have been identified. For each core glycan, the type of glycosidic bond (orientation and binding) is defined. Suitable glycans and glycan analogs are described in US application Ser. No. 09 / 420,797, filed Oct. 19, 1999, and PCT Application No. PCT / US99 / 24380, filed Oct. 19, 1999 (PCT Publication). No. WO 00/23092, each of which is incorporated herein by reference. A preferred glycan is Gal (β1 → 3) GalNAc (α1 →).
[0020]
Optionally, in said ω-conopeptide, the pair of Cys residues is an isoteric lactam or an ester-thioether, such as Ser / (Glu or Asp), Lys / (Glu or Asp) or a Cys / Ala combination. Can be exchanged in pairs. Sequential coupling by known methods (Barney et al., 2000; Hruby et al., 1994; Bitan et al., 1997) allows replacement of a natural Cys bridge with a lactam bridge. Thioether analogs can be readily synthesized using halo-Ala residues commercially available from RSP Amino Acid Analogues.
[0021]
The invention is further directed to a method of treating a disorder associated with a voltage-gated channel disorder in a subject, the method comprising a therapeutically effective amount of an ω-conopeptide described herein or a pharmaceutically acceptable salt thereof. And administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the salt or a solvate thereof. The present invention is also directed to a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an ω-conopeptide described herein or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. You.
[0022]
More particularly, the present invention further relates to the present description, including the treatment of neuropathy, such as anticonvulsants, neuroprotective agents, such as stroke treatments, cardiovascular agents, or for managing pain. It is directed to the use of these peptides or nucleic acids described herein.
[0023]
More specifically, the invention is also directed to nucleic acids encoding the conopeptides of the invention or to precursor peptides for these conopeptides, as well as precursor peptides. The nucleic acid sequences encoding other conopeptide precursor peptides of the invention are set forth in Table 1. Table 1 also shows the amino acid sequences of these precursor peptides.
[0024]
Detailed description of preferred embodiments
The present invention relates to an ω-conopeptide, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The present invention further provides an anticonvulsant, a peptide for treating a neuropathy such as a neuroprotective agent, for treating a seizure such as a cardiovascular agent, or for example, for managing pain as an analgesic, It is directed to the use of its derivatives and its pharmaceutically acceptable salts. The present invention is further directed to the nucleic acid sequence encoding the ω-conopeptide and the nucleic acid sequence encoding the propeptide, and the propeptide.
[0025]
The invention, in another aspect, relates to a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an omega-conopeptide, a mutein thereof, an active fragment thereof, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate. Such pharmaceutical compositions have the ability to act on voltage-gated ion channels, and are thus useful for treating disorders or diseases in living organisms of animals, including humans, wherein the disorder or disease is a central nervous system. Administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention to the body of an animal, including a human, in need thereof, in response to partial or complete blockade of the voltage-gated ion channels of the system.
[0026]
Voltage-gated calcium channels are present in neurons and in myocardium, smooth and skeletal muscle and other excitable cells and play various roles in membrane excitability, muscle contraction, and cell secretion, such as in synaptic transmission Is known (McCleskey). In neuronal cells, voltage-gated calcium channels have been classified by their electrophysiological as well as by their biochemical (binding) properties. Six classes of physiologically distinct calcium channels have been identified to date, namely, T, L, N, P, Q and R-type channels.
[0027]
It is well known that the accumulation of calcium in the brain (calcium overload) is seen after periods of brain hyperactivity, such as after anoxia, ischemia, migraine, and epileptic seizures. Uncontrolled high concentrations of calcium in cells of the central nervous system (CNS) are known to cause most of the degenerative changes associated with the disease. Compounds that can block calcium channels in brain cells are therefore useful in the treatment of seizures, hypoxia, ischemia, migraine, psychosis or epilepsy, and any other convulsive disorder, and are associated with those same Useful in preventing degenerative changes.
[0028]
Compounds that block the so-called L-type calcium channels in the CNS are useful for treating the disorders by directly blocking calcium uptake in the CNS. In addition, so-called N- and P-type calcium channels, as well as possible other types of calcium channels, have been linked to modulation of neurotransmitter release. Compounds that block N- and / or P-type calcium channels inhibit the enhanced neurotransmitter release seen after such a hyperactive period of the CNS, in particular the enhanced glutamate release after such a hyperactive period of the CNS. This indirectly and very strongly prevents calcium overload in the CNS after the above brain hyperactivity period. In addition, blockers of N- and / or P-type calcium channels may depend on various other neurotransmitters, such as aspartic acid, GABA, glycine, dopamine, serotonin and noradrenaline, depending on the selectivity of the compound in question. Inhibits the release of
[0029]
Thus, the pharmaceutical compositions of the present invention are useful as adjuvants to neuroprotective agents, cardiovascular agents, anticonvulsants, analgesics or general anesthetics. A "neurological disorder or disease" includes, but is not limited to, hypoxia-induced hypoxia in global and focal ischemic and hemorrhagic stroke, head trauma, spinal cord injury, cardiac arrest, or neonatal asphyxia. Nervous cell damage or disorders or diseases of the nervous system, including epilepsy. In addition, a "neurological disorder or disease" is indicated as a neuroprotectant, anticonvulsant, analgesic, and / or adjuvant in general anesthesia and is a useful, recommended or prescribed disease state. And disease.
[0030]
More particularly, the invention is directed to the use of these compounds for the treatment and alleviation of epilepsy and as general anticonvulsants. Also, the present invention typically relates to hypoxia, hypoxia or ischemic disease following a stroke, cerebrovascular accident, brain or spinal cord injury, myocardial infarction, physical trauma, drowning, asphyxia, delivery asphyxia or hypoglycemia It is directed to the use of these compounds to reduce event related neurotoxic damage. Furthermore, the present invention is directed to the use of these compounds for treating pain, including acute and chronic pain, such migraine, nociceptive and neuropathic pain. Other uses for these compounds are described in US Pat. No. 5,859,186, which is hereby incorporated by reference.
[0031]
"Neuroprotectants" are compounds that can prevent neuronal death associated with a neurological disorder or disease. "Anticonvulsants" are compounds that can reduce the seizures produced by trauma-induced seizures, such as causing partial seizures, complex partial seizures, status epilepticus, and subsequent head trauma, including head surgery. "Analgesics" are compounds that can relieve pain by altering their perception of nociceptive stimuli that do not cause anesthesia or loss of consciousness. "Muscle relaxants" are compounds that reduce muscle tone. “Adjuncts in general anesthesia” are compounds useful in combination with anesthetics that result in a loss of the ability to perceive pain associated with loss of consciousness.
[0032]
The present invention includes, but is not limited to, hypoxia-induced neuronal injury in global and focal ischemic and hemorrhagic stroke, head trauma, spinal cord injury, cardiac arrest or neonatal asphyxia, epilepsy, or It further relates to methods useful for treating nervous system disorders and diseases, including other convulsive disorders without undesirable side effects.
[0033]
Thus, in one embodiment, the present invention provides a method for reducing / alleviating / reducing pain perception by a subject, or for inducing analgesia in a subject, wherein the method is therapeutically effective. Administering to a subject an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an amount of an omega-conopeptide described herein, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. The pain can be acute, persistent, inflammatory or neuropathic pain.
[0034]
In a second embodiment, the invention provides a method for treating seizures, head or spinal cord trauma or injury, hypoxia, hypoxia-induced neuronal injury, ischemia, migraine, psychosis, anxiety, schizophrenia, There is provided a method of treating inflammation, movement disorders, epilepsy, any other convulsive disorder, or in the prevention of degenerative changes associated with the same, wherein the method comprises a therapeutically effective amount of a subject herein. Administering to the subject an effective amount of a pharmaceutical composition comprising the ω-conopeptide described herein, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
[0035]
The ω-conopeptides described herein are small enough to be chemically synthesized. A general chemical synthesis for preparing the ω-conotoxin peptide is described below. Also, various of the ω-conopeptides have been described in U.S. Patent Nos. 4,447,356 (Olivera et al., 1984); 5,514,774; 5,719,264; and 5,591, No. 821, as well as by isolation and purification from certain Conus species using the techniques described in PCT published application WO 98/03189, which are incorporated herein by reference. be able to.
[0036]
Although the ω-conopeptide of the present invention can be obtained by purification from mussels, the amount of ω-conopeptide that can be obtained from individual snails is so small that the desired substantially pure ω-conopeptide can be obtained. Conopeptides are actually best obtained in commercially valuable quantities by chemical synthesis using a solid phase strategy. For example, the yield from a single mussel can be about 10 micrograms or less of the ω-conopeptide peptide. "Substantially pure" means that the peptide is present in the substantial absence of other biological molecules of the same type; it is preferably at least about 85% pure, preferably at least about 85% pure. It is present in an amount of 95% purity. The chemical synthesis of biologically active ω-conopeptide peptides, of course, depends on the precise sequence of amino acid sequence determination.
[0037]
Ω-Conopeptides can also be produced by recombinant DNA techniques well known in the art. Such a technique has been described by Sambrook et al. (1989). The gene of interest (ie, the gene encoding the appropriate ω-conopeptide) can be inserted into the cloning site of an appropriate expression vector using standard techniques. These techniques are well-known to those skilled in the art. The desired cell line can then be transfected with an expression vector containing the gene of interest. Standard transfection techniques such as calcium phosphate co-precipitation, DEAE-dextran transfection or electroporation can be used. A very wide range of host / expression vector combinations can be used to express the gene encoding the conotoxin peptide of interest. Such combinations are well-known to those skilled in the art. The peptide thus produced is isolated, optionally reduced and oxidized, to form the correct disulfide bond.
[0038]
One method of forming disulfide bonds in the omega-conopeptides of the present invention is air oxidation of the linear peptide under cold or at room temperature for an extended period of time. The result of this approach is the creation of substantial amounts of biologically active disulfide-linked peptides. The oxidized peptide is fractionated using reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) or the like to separate peptides having different binding configurations. Thereafter, by comparing these fractions with the elution of the natural substance or by using simple assay methods, the specific fraction with the correct binding of maximum biological potency is easily determined. However, somewhat higher doses may be required due to dilution resulting from the presence of other fractions of lower biopotency.
[0039]
The peptides are synthesized by any suitable method, such as by absolute solid phase techniques, partial solid phase techniques, fragment condensation or classical solution coupling.
[0040]
In normal liquid phase peptide synthesis, a peptide chain can be prepared by a series of coupling reactions that add constituent amino acids to a growing peptide chain in a desired order. The reaction is performed in solution using various coupling reagents, for example, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbonyldiimidazole, various active esters, for example, esters of N-hydroxyphthalimide or N-hydroxy-succinimide, and various cleavage reagents. The subsequent isolation and purification of the intermediate is a well-known classical peptide method. Classical solution synthesis is described in detail in the article "Method der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthesis von Peptiden" (1974). The technique of absolute solid-phase synthesis is described in the textbook, "Solid-Phase Peptide Synthesis" (Stewart and Young, 1969), and is disclosed by US Pat. No. 4,105,603 (Vale et al., 1978). Is illustrated. Synthetic fragment condensation methods are exemplified in US Pat. No. 3,972,859 (1976). Other available syntheses are exemplified by US Pat. Nos. 3,842,067 (1974) and 3,862,925 (1975). The synthesis of peptides containing γ-carboxyglutamic acid residues is exemplified by Rivier et al. (1987), Nishiuchi et al. (1993) and Zhou et al. (1996).
[0041]
Common to such chemical syntheses is the labile side of various amino acid sites with a suitable protecting group that will prevent a chemical reaction from taking place at that site until the group is finally removed. To protect the chain group. Also common in common is that the group reacts at the carboxyl group, followed by the selective removal of the α-amino protecting group, allowing the subsequent reaction to take place at that position, resulting in an amino acid or To protect the α-amino group on the fragment. Thus, as a step in such a synthesis, an intermediate compound comprising each amino acid residue located in a desired order in a peptide chain having an appropriate side chain protecting group attached to a variety of residues having an unstable side chain Is common to generate
[0042]
As far as the choice of the side chain amino protecting group is concerned, one is generally chosen which is not removed during the deprotection of the α-amino group during the synthesis. However, for some amino acids, such as His, protection is generally not required. In selecting a particular side-chain protecting group to be used in peptide synthesis, the following general rules are followed: (a) the protecting group preferably retains its protective properties under coupling conditions and does not split; (B) the protecting group must be stable under the reaction conditions chosen to remove the α-amino protecting group at each step of the synthesis; and (c) the side chain protecting group desirably Must be removable upon completion of the synthesis containing the desired amino acid sequence under unaltered reaction conditions.
[0043]
Many or even all of these peptides can be prepared using recombinant DNA technology. However, if the peptide is not so prepared, other equivalent chemical synthesis known in the art may be used as described above, but preferably prepared using Merrifield solid phase synthesis. I do. Solid phase synthesis is initiated from the C-terminus of the peptide by coupling the protected α-amino acid to a suitable resin. Such starting materials are obtained by coupling an α-amino-protected amino acid to a chloromethylated resin or a hydroxymethyl resin by an ester bond, or by a amide bond to a benzhydrylamine (BHA) resin or paramethylbenzhydrylamine (MBHA). ) Can be prepared by binding to a resin. The preparation of hydroxymethyl resins is described by Bodansky et al. (1966). Chloromethylated resins are available from Bio Rad Laboratories (Richmond, CA) and Lab. Systems, Inc. It is commercially available from the company. The preparation of such resins is described by Stewart and Young (1969). BHA and MBHA resin supports are commercially available and are commonly used when the desired polypeptide to be synthesized has an unsubstituted amide at the C-terminus. Thus, the formula -O-CH2The solid resin support may be any known in the art, such as those having a -resin support, -NH BHA resin support or -NH-MBHA resin support. If an unsubstituted amide is desired, the use of a BHA or MBHA resin is preferred because cleavage directly gives the amide. If N-methylamide is desired, it can be produced from N-methyl BHA resin. If other substituted amides are desired, the teachings of U.S. Pat. No. 4,569,967 (Kornreich et al., 1986) can be used, or still other groups besides the free acid are desired at the C-terminus. If so, it may be preferable to synthesize the peptide using the classical method described in Houben-Weyl text (1974).
[0044]
The C-terminal amino acid protected by Boc or Fmoc and by the side-chain protecting group may be suitably added to a peptide having a free acid at the C-terminus, first with stirring at about 60 ° C at 24 ° C. Time, using KF in DMF, Coupling to chloromethylated resins can be performed according to the procedure described in Horiki et al. (1978). After coupling the BOC-protected amino acid to the resin support, the α-amino protecting group is removed by using trifluoroacetic acid (TFA) in methylene chloride or TFA alone. Deprotection is performed at a temperature between about 0 ° C. and room temperature. Other standard cleavage reagents, such as HCl in dioxane, and conditions for the removal of specific α-amino protecting groups can be used as described by Schroder and Lubke (1965).
[0045]
After removal of the α-amino protecting group, the remaining α-amino- and side-chain-protected amino acids can be coupled stepwise in the desired order to give an intermediate compound as defined herein above, or alternatively, As a method, each amino acid may be added separately during synthesis, some of which may be coupled to each other before being added to the solid state reactor. The selection of an appropriate coupling reagent is within the skill of the art. Particularly suitable as coupling reagents are N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, DIC, HBTU, HATU, TBTU in the presence of HoBt or HoAt).
[0046]
Activating reagents used for solid phase synthesis of peptides are well known in the peptide art. Examples of suitable activating reagents are carbodiimides such as N, N'-diisopropylcarbodiimide and N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide. Other activating reagents and their use in peptide coupling are described by Schroder and Lubke (1965) and Kapoor (1970).
[0047]
Each protected amino acid or amino acid sequence is introduced into a solid-state reactor in an excess amount of about 2 times or more, and dimethylformamide (DMF): CH2Cl2(1: 1) medium or DMF or CH2Cl2The coupling may be performed alone. If intermediate coupling occurs, the coupling procedure is repeated prior to removal of the α-amino protecting group prior to coupling of the next amino acid. When performed manually, the success of the coupling reaction at each stage of the synthesis is preferably monitored by a ninhydrin reaction, as described by Kaiser et al. (1970). The coupling reaction can be performed automatically using a program such as that reported in Rivier et al. (1978), as in the Beckman 990 automated synthesizer.
[0048]
After the desired amino acid sequence is completed, the intermediate peptide can be removed from the resin support by treatment with a reagent such as liquid hydrogen fluoride or TFA (if using Fmoc chemistry), which cleaves the peptide from the resin Not only do all of the remaining side-chain protecting groups and, if not previously removed, the N-terminal -amino protecting group can be cleaved, giving the peptide in free acid form. If Met is present in the sequence, the potential Boc protecting group is preferably first removed with trifluoroacetic acid (TFA) / ethanedithiol before cleaving the peptide from the resin with HF to remove potential Soc. -Eliminate alkylation. If hydrogen fluoride or TFA is used for cleavage, one or more scavengers such as anisole, cresol, dimethyl sulfide and methyl ethyl sulfide are included in the reaction vessel.
[0049]
In contrast to cyclization of the peptide when it is part of a peptide-resin, it preferably affects the cyclization of the linear peptide to create bonds between Cys residues. To effect such a disulfide cyclization bond, the fully protected peptide is cleaved from the hydroxymethylated or chloromethylated resin support by ammonolysis, as is well known in the art, to provide complete protection. An amide intermediate can be obtained, which can then be cyclized and deprotected appropriately. Alternatively, deprotection and cleavage of the peptide from the above resin or benzhydrylamine (BHA) resin or methylbenzhydrylamine (MBHA) may be performed at 0 ° C. using hydrofluoric acid (HF) or TFA. And then oxidized as described above.
[0050]
Also, peptides can be synthesized using an automatic synthesizer. Amino acids are sequentially coupled to MBHA Rink resin (typically 100 mg resin) starting at the C-terminus using an Advanced Chemtech 357 automated peptide synthesizer. The coupling is performed using 1,3-diisopropylcarbodiimide in N-methylpyrrolidinone (NMP) or 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium @ hexa. Performed with fluorophosphate (HBTU) and diethylisopropylethylamine (DIEA). The FMOC protecting group is removed by treatment with a 20% solution of piperidine in dimethylformamide (DMF). Thereafter, the resin is washed with DMF (twice), followed by methanol and NMP.
[0051]
Also, muteins of analogs or active fragments of the aforementioned conotoxin peptides are included herein. See, e.g., Hammerland et al. (1992). Derivatives muteins of analogs or active fragments of the conotoxin peptides are described in US Pat. No. 5,545,723 (particularly at column 2, line 50 to column 3, line 8); (In particular, column 19, line 45 to column 22, line 33); and No. 5,364,769 (in particular, column 4, line 55 to column 7, line 26) (each Can be synthesized by known techniques, including conservative amino acid substitutions, as outlined herein.
[0052]
Also, the omega-conopeptides of the invention are typically used in the context of seizures, cerebrovascular accidents, brain or spinal cord trauma, myocardial infarction, physical trauma, drowning, asphyxia, delivery asphyxia or hypoxia following a hypoglycemic event, Useful for reducing neurotoxic damage associated with anoxia or ischemic disease. To reduce neurotoxic damage, the omega-conopeptide should be used within 24 hours of the onset of hypoxia, hypoxia or ischemic disease so as to effectively minimize the CNS damage that the patient will experience. Will be administered to the patient in a therapeutically effective amount.
[0053]
The ω-conopeptides of the present invention are further useful, for example, as painkillers for controlling pain and treating migraine, acute pain or persistent pain. They can be used prophylactically or to alleviate symptoms associated with migraine episodes, or to treat acute or persistent pain. In these uses, the ω-conopeptide is administered in a therapeutically effective amount to overcome or relieve pain.
[0054]
Pharmaceutical compositions containing the compounds of the present invention as active ingredients can be prepared according to conventional pharmaceutical compounding techniques. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Typically, a therapeutically effective amount of the active ingredient will be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. The carrier can take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration, eg, intravenous, oral, parenteral, or intrathecal. See US Pat. No. 5,844,077 for a method of delivery, which is incorporated herein by reference.
[0055]
By “pharmaceutical composition” is meant a physically distinct unitary moiety suitable for pharmaceutical administration. By "pharmaceutical composition in dosage unit form" is meant a physically distinct unitary unit suitable for pharmaceutical administration, each of which may be associated with a carrier and / or contained within an encapsulation. Contains daily doses of the compound, multiple (up to 4) or sub-multiple (less than 40) daily doses. Whether the composition comprises a daily dose or half or one-third or one-fourth of the daily dose depends on whether the pharmaceutical composition is to be administered once or for example 2, 3 or 4 times per day. Will depend.
[0056]
The term "salt" as used herein refers to acidic and / or basic salts formed with inorganic or organic acids and / or bases, preferably base salts. Particularly when the compounds of the present invention are used as medicaments, pharmaceutically acceptable salts are preferred, but other salts are useful, for example, for treating these compounds or when intended for use as a non-pharmaceutical type. You can find the nature. Salts of these compounds can be prepared by art-recognized techniques.
[0057]
Examples of such pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, hydrochloride, sulfate, nitrate or phosphate and acetate, trifluoroacetate, propionate, succinate, respectively. Inorganic and organic addition salts such as benzoate, citrate, tartrate, fumarate, maleate, methanesulfonate, isothionate, theophylline acetate, salicylate and the like are included. Also suitable are lower alkyl quaternary ammonium salts and the like.
[0058]
The term "pharmaceutically acceptable" carrier as used herein refers to a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid filler, diluent, encapsulating material, any type of formulation aid, or It simply means a sterile aqueous medium, such as a saline. Some examples of substances that can function as pharmaceutically acceptable carriers are lactose, sugars such as glucose and sucrose, starches such as corn starch and potato starch, cellulose and derivatives thereof such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; Powdered tragacanth gum; melt, gelatin, talc; excipients such as cocoa butter and suppository wax; oils such as peanut oil, cottonseed oil, rapeseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol; Polyols such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate, agar; magnesium hydroxide and hydroxide Aluminum such as buffering agents; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer, as well as compatible substances other non-toxic to be used in pharmaceutical formulations.
[0059]
Wetting agents, emulsifiers and lubricants, such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, as well as colorants, release agents, coatings, sweeteners, flavors and fragrances, preservatives and antioxidants may also It can be present in the composition by judgment. Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include, but are not limited to, water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, sodium sulfite, and the like; ascorbyl Oil-soluble antioxidants such as palmitate, butylhydroxyanisole (BHA) or butylhydroxytoluene (BHT), lectin, propyl gallate, alpha-tocopherol; and citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, Metal chelating agents such as phosphoric acid are included.
[0060]
For oral administration, the compounds can be formulated into solid or liquid preparations, such as capsules, pills, tablets, troches, melts, powders, suspensions or emulsions. In preparing the compositions in oral dosage form, any of the usual pharmaceutical media may be employed, for example, in the case of oral liquid preparations (eg, suspensions, elixirs and solutions) Water, glycols, oils, alcohols, flavoring agents, preservatives, coloring agents, suspending agents and the like; or, in the case of oral solid preparations (eg, powders, capsules and tablets), starch, sugar, dilution And carriers such as agents, granulating agents, lubricants, binders, disintegrants and the like. Because of their ease in administration, tablets and capsules represent the most advantageous dosage unit form, in which case solid pharmaceutical carriers are obviously employed. If desired, tablets may be sugar-coated or enteric-coated by standard techniques. The active agent may be encapsulated to allow it to cross the blood-brain barrier while stably passing through the gastrointestinal tract. See, for example, WO 96/11698.
[0061]
For parenteral administration, the compounds can be dissolved in a pharmaceutical carrier and administered as a solution or suspension. Examples of suitable carriers are water, saline, dextrose solution, fructose solution, ethanol, or oils of animal, vegetable or synthetic origin. The carrier can also include other components, such as preservatives, suspending agents, solubilizing agents, buffers, and the like. Also, when the compounds are administered intrathecally, they can be dissolved in the cerebrospinal fluid.
[0062]
Various routes of administration are available. The particular mode chosen will, of course, depend on the particular drug chosen, the severity of the disease condition to be treated and the dose required for therapeutic efficacy. The methods of the present invention can be practiced generally using any mode of administration that is medically acceptable and produce any effective level of active compound without producing clinically unacceptable side effects. Also means. Such modes of administration include oral, rectal, sublingual, topical, nasal, transdermal or parenteral routes. The term "parenteral" includes subcutaneous, intravenous, epidural, irrigation, intramuscular, release pump or infusion.
[0063]
For example, administration of an active agent according to the present invention can be accomplished using any suitable delivery means,
(A) pumps (see, eg, Lauer and Hatton (1993), Zimm et al. (1984) and Ettinger et al. (1978));
(B) microencapsulation (see, for example, U.S. Patent Nos. 4,352,883; 4,353,888 and 5,084,350);
(C) sustained release polymer implants (see, for example, US Pat. No. 4,883,666);
(D) microencapsulation (eg, US Pat. Nos. 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 and 4,968,733 and published PCT patent application WO 92 / 19195, WO95 / 05452);
(E) naked or non-encapsulated cell transplantation to the CNS (see, for example, US Pat. Nos. 5,082,670 and 5,618,531);
(F) injection subcutaneously, intravenously, intraarterially, intramuscularly or at any other suitable site; or
(G) Oral administration in capsules, solutions, tablets, pills or sustained release formulations
Is included.
[0064]
In one embodiment of the invention, the active agent is delivered directly to the CNS, preferably into the ventricle, brain parenchyma, medullary cavity or other suitable CNS location, most preferably into the medullary cavity.
[0065]
Alternatively, targeted therapeutics can be used to deliver the active agent to certain types of cells, and more particularly to the use of targeting systems such as antibodies or cell-specific ligands. Targeting is desirable for various reasons, for example, if the drug has unacceptable toxicity, requires too high a dose, or cannot enter the target cells.
[0066]
Also, the active agent, which is a peptide, can be administered in a cell-based delivery system that introduces the DNA sequence encoding the active agent into cells designed for implantation in the body of a patient, particularly in the spinal cord region. Suitable delivery systems are described in US Patent No. 5,550,050 and PCT Application Publication Nos. WO92 / 19195, WO94 / 25503, WO95 / 01203, WO95 / 05452, WO96 / 02286, WO96 / 02646, WO96 / 40871, WO96 /. 40959 and WO 97/12635. Suitable DNA sequences can be prepared synthetically for each active agent based on the disclosed sequences and the known genetic code.
[0067]
The active agent is preferably administered in a therapeutically effective amount. A “therapeutically effective amount” or simply “effective amount” of an active compound is an amount of the compound that is sufficient to treat the desired disease, at an appropriate benefit / risk ratio applicable to any medical treatment. means. The actual amount administered, and rate and time-course of administration, will depend on the nature and severity of the disease being treated. Prescriptions of treatment, e.g., decisions regarding dosage, timing, etc., are within the responsibility of the general practitioner or specialist and typically involve the disorder being treated, the condition of the individual patient, the site of delivery, the mode of administration, and the practice. Consider other factors known to the aged. Examples of techniques and protocols can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences.
[0068]
Dosage may be adjusted appropriately to achieve desired drug levels, locally or systemically. Typically, the active agent of the present invention comprises from about 0.001 mg / kg to about 250 mg / kg of the active agent, preferably, from about 0.01 mg / kg to about 100 mg / kg, most preferably, about 0.05 mg / kg It shows their effect in the dose range of about 75 mg / kg to about 75 mg / kg. Suitable doses can be administered in multiple sub-doses per day. Typically, a dose or sub-dose will contain from about 0.1 mg to about 500 mg of active agent per unit dosage form. A more preferred dose will contain from about 0.5 mg to about 100 mg of active agent per unit dosage form. The dose is generally started at a low level and increased until the desired effect is achieved. In the event that the response in a subject is insufficient at such doses, even higher doses (or effective higher doses with different, more localized delivery routes) can be used to the extent that patient tolerance is acceptable. For example, continuous administration over a 24-hour period or multiple doses per day will achieve appropriate systemic levels of the compound.
[0069]
For the treatment of pain, if the route of administration is direct to the CNS, possible doses will be about 1 ng to about 100 mg per day, preferably about 100 ng to about 10 mg per day, more preferably about 1 μg to about 100 μg per day. It is. If administered peripherally, possible doses are somewhat higher, from about 100 ng to about 1000 mg per day, preferably from about 10 μg to about 100 mg per day, more preferably from about 100 μg to about 10 mg per day. If the conopeptide is delivered by continuous infusion (eg, by pump delivery, biodegradable polymer delivery or cell-based delivery), lower doses are contemplated than for bolus delivery.
[0070]
Advantageously, the compositions are formulated as dosage units, each unit being adapted to supply a fixed dose of the active agent. Tablets, coated tablets, capsules, ampoules and suppositories are examples of dosage forms according to the present invention.
[0071]
The active agent need only constitute an effective amount, ie, such that a suitable effective dose will be consistent with the dosage form employed in single or multiple unit doses. The exact individual dose, as well as the daily dose, will be determined by standard medical principles under the supervision of a physician or veterinarian for the human or animal being used.
[0072]
Pharmaceutical compositions generally comprise from about 0.0001 to 99%, preferably from about 0.001 to 50%, more preferably from about 0.01 to 10%, by weight of active agent, of the total composition. %. Also, in addition to the active agent, the pharmaceutical compositions and medicaments can contain other pharmaceutically active compounds. Examples of other pharmaceutically active compounds include, but are not limited to, analgesics, cytokines and therapeutics in all major areas of clinical medicine. When used with other pharmaceutically active compounds, the conopeptides of the invention can be delivered in the form of a drug cocktail. A cocktail is a mixture of any compound useful in the present invention with another drug or agent. In this embodiment, a common administration vehicle (eg, pills, tablets, implants, pumps, injection solutions, etc.) will contain both of the compositions in a combination that complements the drug. The individual drugs of the cocktail are each administered in a therapeutically effective amount. The therapeutically effective amount will be determined by the parameters set forth above; it is because in any event the area of the body where the drug is needed at a time that is effective to achieve the desired effect. That is the amount that establishes the drug level.
[0073]
The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, chemistry, molecular biology, microbiology, recombinant DNA, genetics, immunology, cell biology, cell culture and transgenic biology, which are described in the art. Within the skill of. For example, Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Andand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988; Jakoby and Pastan, 1979; Hames and SJ Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (BD Hames and SJ Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells, R.I.L. 1987); Immobilized Cells And Enzyme (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Dissertation, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY); Gene Trans. Vector Cars. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (ed. Wu et al.), Immunochemical Methods In Cellon de der Colonial Medical Bank, ed. k Of Expertial Immunology, Volume I-IV (Edited by DM Weir and CC Blackwell, 1986); Riot, Essential Immunology, 6th edition, Blackwell Scientific Medicine, Pharmaceutical Sciences, Inc., Blackwell Scientific Medicine, 1988; See Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986).
[0074]
Example
The invention will be illustrated by reference to the following examples, which are provided by way of example and are not intended to limit the invention in any way. Standard techniques well known in the art or techniques noted below were utilized.
[0075]
Example 1
Isolation of ω-conopeptide
Crude venom was extracted from the venom tube (Cruz et al., 1976) and the components were purified as previously described (Cartier et al., 1996). The crude extract from the venom tube was used for VydacC18Purified by reverse phase liquid chromatography (RPLC) using a semi-prep column (10 × 250 mm). Further purification of the biological activity peak was carried out using VydacC18The analysis was performed using an analytical column (4.6 × 220 mm). The effluent was monitored at 220 mm. Peaks were collected and aliquots were assayed for activity. During purification, HPLC fractions were assayed by intracerebroventricular (icv) injection into mice (Clark et al., 1981).
[0076]
The amino acid sequence of the purified peptide was determined by standard methods. Prior to sequencing by automated Edman degradation on an Applied Biosystems 477A protein sequencer (DNA / Peptide Facility, University of Utah) equipped with a 120A analyzer, purified peptides were reduced and alkylated (Martinez et al., 1995; Martinez et al., 1995; , 1994).
[0077]
By this method, the ω-conopeptide described as “isolated” in Table 1 was obtained. These ω-conopeptides, as well as other ω-conopeptides and ω-conopeptide precursors listed in Table 1, are synthesized as described in US Pat. No. 5,591,821.
[0078]
Example 2
Isolation of DNA encoding ω-conopeptide
DNA encoding the ω-conopeptide was isolated and cloned according to conventional techniques using general techniques well known in the art, as described in Olivera et al. (1996). Alternatively, a cDNA library was prepared from Conus venom tubes using conventional techniques. DNA from a single clone was amplified by conventional techniques using primers approximately corresponding to the M13 universal priming site and the M13 reverse universal priming site. Clones having a size of approximately 300-500 nucleotides were sequenced and screened for similarities in sequence to known ω-conopeptides. The DNA sequence and the encoded propeptide sequence are set forth in Table 1. In addition, a DNA sequence encoding a mature toxin can be prepared based on the DNA sequences described in Table 1. Table 2 shows the alignment of the ω-conopeptides of the present invention.
[0079]
Table 1
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[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[Table 1]
[Table 2]
[0189]
Example 3
In vivo activity of ω-conopeptide
Frings ( Frings ) Antogenic convulsive mice
The in vivo anticonvulsant activity of the ω-conopeptide is analyzed in Frings audiogenic spasm-sensitive mice described by White et al. (1992). The ω-conopeptide is found to have anticonvulsant activity in this assay.
[0190]
Example 4
CF No . Vivo activity of ω-conopeptide in Example 1
The in vivo anticonvulsant activity of the ω-conopeptide was determined using CF NO. Analyze in one mouse. The ω-conopeptide is found to have anticonvulsant activity.
[0191]
Example 5
Pentylenetetrazole-induced threshold spasm model
In vivo activity of ω-conopeptide
The in vivo activity of the omega-conopeptide is analyzed using continuous intravenous injection of pentylenetetrazole (White et al., 1995). At the time of peak effect, the convulsive solution (0.5% pentylenetetrazole in 0.9% saline containing 10 units (USP) / ml sodium heparin) at a constant rate of 0.34 ml / min. Inject into the tail vein. The time in seconds from the start of the infusion to the onset of the first convulsions and clonic convulsions is recorded for drug-treated or control animals. The time for each index is converted to mg / kg of pentylenetetrazole for each mouse, and the mean and standard error of the mean are calculated. The ω-conopeptide is i. v. Pentylenetetrazole found to increase convulsion threshold.
[0192]
Example 6
In vivo activity of ω-conopeptide in pain model
The anti-pain activity of ω-conopeptide is shown in several animal models. These models include nerve injury models (Chaplan et al., 1997), s. c. Nociceptive responses to formalin injection (Codene, 1993) and the NMDA-induced persistent pain model (Liu et al., 1997) are included. In each of these models, we find that ω-conopeptide and ω-conopeptide derivatives have analgesic properties.
[0193]
More specifically, this study evaluates the effect of intrathecal administration of ω-conopeptide in a mouse model of nociceptive and neuropathic pain. In nociceptive pain, the effect of ω-conopeptide was tested in two different tests of inflammatory pain. The first is the formalin test, which is ideal for producing relatively short-term or reliable pain behavior, which is easily quantified. There are two phases of pain behavior, the second of which is speculated to be largely triggered by formalin-induced inflammation of the hind limbs. The ω-conopeptide is administered 10 minutes prior to formalin injection. Monitor the number of slacks and / or licking periods caused by the injection. The first phase is due to the direct activation of primary effects, and thus is largely independent of long-term changes in the spinal cord, and the ω-conopeptide has the greatest effect on the magnitude of pain behavior in the second phase. It is presumed to have an effect.
[0194]
Also, the mechanical and thermal thresholds in animals that have been injected with complete Freund's adjuvant in the hind limbs are tested. This results in local inflammation, including hind limb swelling, and a sharp decrease in mechanical and thermal thresholds, which are detected within 24 hours after injection. Threshold changes in rats receiving the omega-conopeptide are compared to those of rats receiving intrathecal injection of vehicle.
[0195]
An important issue is whether the drugs are effective when administered after a pain model has been established, or whether they are effective only if used as pretreatment. Clearly, the clinical need is for a drug to be effective after pain has occurred. To address this issue, animals are tested after inflammation (CFA) or nerve damage has been established, where the ω-conopeptide is administered repeatedly. In these experiments, ω-conopeptide is injected daily by the intrathecal (it) route. The mechanical and thermal thresholds (measured in von Frey hair in freely moving animals and in the Hargrave's test in freely moving animals, respectively) were measured to determine the injury. Monitor the measured changes in pain over time and repeat for 2-4 weeks.
[0196]
Example 7
Effect of ω-conopeptide in pain model
The analgesic activity of ω-conopeptide is also tested in the following pain model:
[0197]
Persistent pain (formalin test). Intrathecal (it) drug injections are performed as described by Hylden and Wilcox (1980). The omega-conopeptide or vehicle is administered in a volume of 5 l. i. t. Fifteen minutes after injection, the right hind limb is injected with 20 l of 5% formalin. Animals are placed in a clear plexiglass cylinder behind a mirror to facilitate observation. The animals are closely observed for 2 minutes every 5 minutes and the amount of time the animals spent licking the injected limb is thus recorded for a total of 45-50 minutes. The results are expressed as lick time expressed in seconds per 5 minutes. At the end of the experiment, all animals were placed on an accelerating spinning rod and the latency to first fall was recorded. The ω-conopeptide is found to be active in this model to predict efficacy for treating neuropathic pain.
[0198]
Acute pain (tail-flick method ( tail-flick )). The ω-conopeptide or saline is administered intrathecally (it) by the method of Hylden and Wilcox (1980) in a fixed volume of 5 μl. The mice are wrapped gently in a towel with their tails exposed. i. t. At various times after injection, the tail is immersed in a water bath maintained at 54C and the time of aggressive tail withdrawal is recorded. If not retracted for up to 8 seconds, remove tail to avoid tissue damage.
[0199]
Neuropathic pain. Partial sciatic nerve ligation will be used to evaluate the efficacy of Mar1 in neuropathic pain. Nerve damage is generated by the method of Malmberg and Basbaum (1998). Animals are anesthetized with a ketamine / xylazine solution, the sciatic nerve is exposed, and tightly ligated with 8-0 silk suture around 1/3 to 1/2 of the nerve. In sham-operated mice, nerves were exposed but not ligated. Animals are allowed to recover for at least one week before the test is performed. On the test day, the mice are placed in a plexiglass tube on a wire mesh frame and acclimated for at least 60 minutes. Mechanical allodynia is assessed on a von Frey filament calibrated using the up-down method described in Chaplan et al. (1994) and a 50% withdrawal threshold is calculated. Animals that do not respond to any of the series of filaments are shown with a maximum value of 3.6 grams, which is typically a filament that lifted its hind limbs without bending, corresponding to approximately 1/10 of the animal's body weight.
[0200]
The data obtained indicate that ω-conopeptide has potent analgesic properties in three commonly used models of pain: acute, persistent / inflammatory and neuropathic pain models.
[0201]
Example 8
Calcium-channel antagonist activity: inhibition of ionic current
Ion current through calcium channels is assessed in cells voltage clamped by a single patch-clamp electrode. Primarily, these whole cell patch-clamp studies are performed on N1E115 mouse neuroblastoma cells, but various cell types are also evaluated, including the human neuroblastoma cell line IMR-32.
[0202]
Most measurements are obtained using a bath saline that allows the assessment of calcium current in the absence of other ionic currents. These solutions were 80 mM NMDG (as sodium substitute), 30 mM TEAC1 (block potassium current), 10 mM BaCl2(As a charge-carrier through a calcium channel), and 10 mM HEPES at pH 7.3. Some solutions also contained 2 mM quinidine (blocking potassium current) and 3 μM tetrodotoxin (blocking sodium current). Normal bath saline is (mM): 140 NaCl, 10 glucose, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl210 mM HEPES pH 7.3. The intracellular solution was (mM): 150 CsCl, 0.5 CaCl, pH 7.3-7.4.25, EGTA, 5 MgCl2, 2K2ATP. The bath saline and all internal solutions are filtered before use.
[0203]
Pipettes were made from Corning 7052 glass (Garner Glass Company, Clarmont, Calif. 91711) and coated with Sylgard (Dow Coming, Midland, Mich. 48640) and fire polished before use. The bubble number is typically 5-6 and the pipette resistance is typically 2-5 MOhm. Corning 8161, Kimble and other glasses are used where no significant effect on calcium current is observed.
[0204]
Recordings are made at room temperature with an Axopatch 1-C amplifier (Axon Instruments, Foster City, Calif. 94404) and analyzed with pCLAMP software (Axon Instruments). The data is filtered at 1000 Hz with a typical sampling rate of 0.1 KHz; in all cases, the data is filtered at no more than one-fifth of the sampling rate to avoid bias. Data is collected online by software. The analysis is performed on the screen and output via a Hewlett-Packard LaserJet Printer (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif. 94306).
[0205]
A typical experiment is performed as follows: Following formation of the seal, a series of resistance resistance compensation and a capacitive transient cancellation, followed by a voltage clamp protocol, wherein the cell potential is From the holding potential (typically -100 mV) to a test potential in increments of 10 mV to a test potential ranging from -60 mV to +20 mV. Cells are held at the holding potential for 5 seconds during the pulse. Protocols starting from other holding potentials typically covered the same range of test potentials. The ω-conopeptide is found to have calcium channel blocking activity in such cell lines.
[0206]
It will be appreciated that the methods and compositions of the present invention can be incorporated in various exemplary embodiments, only some of which are disclosed herein. It will be apparent to those skilled in the art that other embodiments exist and do not depart from the spirit of the invention. Thus, the specific examples described are illustrative and should not be construed as limiting.
[0207]
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