JP2004508805A

JP2004508805A - Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding them

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Publication number: JP2004508805A
Application number: JP2001567332A
Authority: JP
Inventors: ベーカー，ケヴィン，ピー．; チェン，ジアン; デスノイヤース，ルーク; ゴッダード，オードリー; ゴドフスキー，ポール，ジェー．; ガーニー，オースティン，エル．; パン，ジェームス; スミス，ヴィクトリア; ワタナベ，コリン，ケー．; ウッド，ウィリアム，アイ．; ジャン，ゼミン
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2004-03-25
Also published as: CA2534018A1; WO2001068848A3; CA2534186A1; CA2534030A1; CA2534391A1; CA2401448A1; EP1259614A2; JP2008301822A; CA2531917A1; AU2001268028A1; CA2533991A1; CA2539214A1; JP2006081548A; CA2533903A1; CA2533831A1; WO2001068848A2; AU6802801A

Abstract

本発明は、新規なポリペプチド、及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。また、これらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体及び本発明のポリペプチドを生成するための方法を提供する。The present invention relates to novel polypeptides and nucleic acid molecules encoding these polypeptides. Also, vectors and host cells containing these nucleic acid sequences, chimeric polypeptide molecules containing the polypeptides of the present invention fused to heterologous polypeptide sequences, antibodies that bind to the polypeptides of the present invention, and polypeptides of the present invention are produced. To provide a way to:

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及び新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、翻って多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。また、膜タンパク質であるこれらレセプターは、治療又は診断薬剤としての潜在力を有する。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【０００３】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【０００４】
（発明の概要）
一実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００５】
他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドＤＮＡのコード配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【０００６】
さらなる側面では、本発明は、（ａ）ここに開示されたＡＴＴＣに寄託した任意のヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされている同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【０００７】
本発明の他の側面は、膜貫通ドメインが欠失又は膜貫通ドメインが不活性化のいずれかのＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここで開示される。従って、ここで記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【０００８】
他の実施態様はＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体に向けられ、例えば、場合によっては抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリダイゼーションプローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は、全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むＰＲＯポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯポリペプチド断片も考慮される。
【０００９】
その他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
或る側面では、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドに対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されているＡＴＣＣに寄託した任意のヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１１】
特別な側面では、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これらを製造する方法もここに記載され、これらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失又は膜貫通ドメインが不活性化のいずれかの単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを製造する方法もここに記載され、その方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
【００１２】
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ抗体を担体と組み合わせて含む組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
【００１３】
本発明のその他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＰＲＯ抗体に反応性のある症状の治療に有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。ここに記載の任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
【００１４】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載の任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
さらに他の実施態様では、本発明は、下記の実施例に示される機能的生物学的アッセイデータに基づく種々の利用についての本発明のＰＲＯポリペプチドの利用方法に関する。
【００１５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（すなはち、ＰＲＯ／番号）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」がここで使用される実際の数値符号である、ここで使用される「ＰＲＯ／番号ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／番号」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここで記載されているＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。「ＰＲＯポリペプチド」という用語は、ここで開示されている各個々のＰＲＯ／番号ポリペプチドに指す。「ＰＲＯポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個別にも組み合わせとしても言及する。例えば、調製の、精製の、誘導の、抗体の形成、投与の、含有する組成物、疾患の治療、などの記述は、本発明の各ポリペプチドに個別に関係する。また、「ＰＲＯポリペプチド」という用語は、ここに開示されているＰＲＯ／番号ポリペプチドの変異体を含む。
【００１６】
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＰＲＯポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているＰＲＯポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置１において示されている一方で、図のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【００１７】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
【００１８】
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）及びｖｏｎＨｅｉｎｊｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、１つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ−末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００１９】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの特に同定された他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２０】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所，ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、サウスサンフランシスコ，カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ」が対象となる仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２２】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて決定してもよい。さらに、殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２が用いられた場合には、、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象であるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２３】
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００２４】
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２５】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００２６】
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００２７】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所，ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、サウスサンフランシスコ，カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２８】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２９】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて決定してもよい。さらに、殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００３０】
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００３１】
核酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３２】
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３３】
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３４】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗ＰＲＯ抗体、及び抗ＰＲＯ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００３５】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００３６】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００３７】
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０の残基）を有する。
【００３８】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
【００３９】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００４０】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４１】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
【００４２】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）_２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００４３】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００４４】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）内で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に結合した重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。
【００４５】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」、又は「特異的な」抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【００４６】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
ここで開示されたポリペプチドの「有効量」、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニストとは、特別に言及された目的を実行するために十分な量のことである。「有効量」とは、言及された目的に関連して、経験的及び常套的方法によって決定することができる。
【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】
ＩＩ．　本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００６９】
Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００７０】
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００７１】
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００７２】

【００７３】
ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン，ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ，ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ，ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。
【００７４】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．ＬｏｎｄｏｎＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【００７５】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００７６】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つの型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００７７】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【００７８】
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【００７９】
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）により、及びＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００８０】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
【００８１】
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００８２】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＣｏ．，サンフランシスコ，カリフォルニア（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター　シティー，カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【００８３】
１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９５）］。
【００８４】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら，に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋら，の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら，に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【００８５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋら，上掲に見出すことができる。
【００８６】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＰＯ_４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら，に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗら，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎｄｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、ＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【００８７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスリチェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバチルスリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｒｔ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｋａｎ^ｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ　５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｒｂｓ７　ｉｌｖＧ　ｋａｎ^ｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行　米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日発行のＥＰ１３９，３８３）；クルベロミセス宿主（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えばクルベロミセスラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、クルベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ　１２，４２４）、クルベロミセスブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ　１６，０４５）、クルベロミセスウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、クルベロミセスワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ　５６，５００）、クルベロミセスドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ　３６，９０６；ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、クルベロミセス・テモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルベロミセス・マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ　４０２，２２６）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ　１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら，Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２８：２６５−２７８［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ　２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）及びアスペルギルスニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯＪ．，４：４７５−４７９［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（Ｃ１化合物資化性、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＭｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に記載されている。
【００８９】
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ　８０６５）；及びマウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ　ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００９０】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００９１】
ＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ−コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００９２】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００９３】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのようにＰＲＯ−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂらによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ−コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
【００９４】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９８７）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３，６５７に更に記載されている。
【００９５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００９６】
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【００９７】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９８】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ＭｅｔｈｏｄｅｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【００９９】
Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用である。
【０１００】
全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示したＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１０１】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２６５９：１９８８）及びｖａｎｄｅｒＫｒｏｌら，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８，１９８８）に記載されている。
【０１０２】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、ＷＯ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−（Ｌ−リジン）に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１０３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ_４−媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１０４】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、あるいはそれ以上である。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１０５】
ＰＲＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯがレセプターである場合）、ＰＲＯは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１０６】
また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０１０７】
あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Ｌｉら，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１０８】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：４１４３−４１４６［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１０９】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である（Ｄｚａｕら，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，２０５−２１０（１９９３））。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０１１０】
ここに記載したＰＲＯポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよく、単離された核酸配列を、これらのマーカーを組み換え発現に用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各ＰＲＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯポリペプチドは、好ましくは同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１１１】
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．，［１９８０］）、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１２】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、ＴｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄＮｅｗＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら，編，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９８９，ｐｐ．４２−９６のＭｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅｕｓｅｏｆｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓｓｃａｌｉｎｇｉｎｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」に記載された原理に従って実施できる。
【０１１３】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，「ＤｅｓｉｇｎａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＳｉｎｇｌｅＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＶａｃｃｉｎｅｓＵｓｉｎｇＰｏｌｙａｃｔｉｄｅＰｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅＳｙｓｔｅｍｓ」ＶａｃｃｉｎｅＤｅｓｉｇｎ：ＴｈｅＳｕｂｕｎｉｔａｎｄＡｄｊｕｖａｎｔＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ及びＮｅｗｍａｎ編，（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９５），ｐ．４３９−４６２；ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１１４】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ，「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｂｉｏａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓｆｒｏｍｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅｐｏｌｙｍｅｒ」：Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編），ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒｓａｓＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１１５】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１１６】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５７８９−５７９３（１９９１）］に開示されているように、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者ら［Ｆｉｅｌｓ及びＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０，２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，９５７８−９５８２（１９９１）］に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
【０１１７】
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコトロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１１８】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにＰＲＯポリペプチドを細胞へ添加してもよく、ＰＲＯポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＰＲＯポリペプチドと膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでＰＲＯポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートによって同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎ．，１（２）：第５章（１９９１）。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＰＲＯポリペプチドで暴露する。このＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１１９】
レセプター同定の代替的方法として、標識下ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで溶解させ、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１２０】
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ，ＡｃｉｄＲｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；ＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｓＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＲＳＰｒｅｓｓ：ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２１】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ，ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ４：４６９−４７１（１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
【０１２２】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ９７／３３５５１、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
また、ここで開示されている分子の診断的及び治療的利用は、下記に開示及び記載のポジティブ機能アッセイヒットに基づいている。
【０１２３】
Ｆ．抗ＰＲＯ抗体
本発明は、さらに抗ＰＲＯ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【０１２４】
１．ポリクローナル抗体
抗ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１２５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１２６】
免疫剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬｓ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１２７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｅｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１２８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ，上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１２９】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１３０】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１３１】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．ＯｐＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１３２】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３３】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ．ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ３６８８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１３４】
また、抗体は、上記に記載のような既知の選択及び／又は突然変異誘発法を利用して親和的に成熟している。好ましい親和性成熟抗体は、５倍、より好ましくは１０倍、さらにより好ましくは２０又は３０倍も成熟抗体の調製の元である出発抗体（一般的には、マウス、ヒト化又はヒト）より高い親和性を有する。
【０１３５】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯＪ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１３６】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１３７】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１３８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。ＴｕｔｔらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１３９】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＰＲＯポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１４０】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１４１】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ３：２１９−２３０（１９８９）参照。
【０１４２】
７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。
【０１４３】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１４４】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｊ．ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）参照。
【０１４５】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，７８８９−７８９３（１９９３）参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１４６】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１４７】
Ｇ．抗ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Ｚｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはＨｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載された方法が含まれる。
【０１４８】
また、抗ＰＲＯ抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１４９】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１５０】
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要なら、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発したデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ，　ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，　ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（ＰｈｉｌＧｒｅｅｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（全てではない）ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
【０１５１】
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら，　ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡなどの市販試薬を用いる標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を有するオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断してゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適合するクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照）の唯一のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１５２】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡの試薬及びプロトコールを用いて、対象とするヒト組織からｍＲＮＡを単離した（ＦａｓｔＴｒａｃｋ２）。このＲＮＡを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄｓｙｓｔｅｍ）の試薬及びプロトコールを利用するベクターｐＲＫ５ＤでのオリゴｄＴプライム化ｃＤＮＡライブラリの生成に用いた。この方法においては、二本鎖ｃＤＮＡを１０００ｂｐを越えるサイズに分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩリンカー化ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断化ベクターへクローニングした。ｐＲＫ５Ｄは、ＸｈｉＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位の前に位置するＳｆｉＩ制限酵素部位が後に続くｓｐ６転写開始部位を有するクローニングベクターである。
【０１５３】
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために、二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（上で参照したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを利用するベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０でのランダムプライム化ｃＤＮＡライブラリの生成に用いた。この方法においては、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐへサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断化ベクターへクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、並びにアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区が後に続くマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）をクローニング部位の後に有するクローニングベクターである。従って、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターへクローニングされたｃＤＮＡは、適切に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導く。
【０１５４】
３．形質転換及び検出
上記のパラグラフ２に記載したライブラリのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートからこすり取り、この細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ−勾配を用いてＤＮＡを単離した。次に、、以下の酵母プロトコールを精製ＤＮＡへ適用した。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーからの直接的な挿入物のＰＣＲ増幅、並びに配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
【０１５５】
用いた酵母菌株はＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ^＋、ＳＵＣ^＋、ＧＡＬ^＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、ＳＳＡ１ｐ−４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好まれて用いられる。
形質転換は、Ｇｉｅｔｚら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：１４２５（１９９２）によって概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Ｋａｉｓｅｒら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０７（１９９４）に記載のように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０^６細胞／ｍｌ（約ＯＤ_６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０^７細胞／ｍｌ（約ＯＤ_６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
【０１５６】
次いで細胞を収穫し、５，０００ｒｐｍで５分間のＳｏｒｖａｌＧＳ３ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することで形質転換のために調製し、そして次に５０ｍｌのファルコン管でＢｅｃｋｍａｎＧＳ−６ＫＲ遠心機において３，５００ｒｐｍで再度遠心分離した。その上清を捨て、続いて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ７．５，１００ｍＭのＬｉ_２ＯＯＣＣＨ_３）で洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（ＬｏｆｓｔｒａｎｄＬａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇｖｏｌ．＜１０μｌ）と混合することにより開始した。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ，４０％のポリエチレングリコール−４０００，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，１００ｍＭのＬｉＯＯＣＣＨ_３，ｐＨ７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカントし、そしてＴＥ（５００μｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、一定分量（２００μｌ）を１５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に広げた。
【０１５７】
もう１つの方法として、複数の少量反応に代わって、試薬の量はしかるべくスケールアップし、形質転換を１回の大規模反応で実施した。
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０８−２１０（１９９４）に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ−Ｕｒａ）であった。形質転換体を３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを包含することによって実施した。Ｂｉｅｌｙら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：１７６−１７９（１９８８）に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性Ｒｅｄ−１２０，Ｓｉｇｍａ）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレートへ最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で組み入れ、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝化した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
十分に単離されていて同定可能な単一コロニーを得るために、ポジティブコロニーを拾い、これを新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線した。アミラーゼ分泌についてポジティブであり、十分に単離されたコロニーの検出は、緩衝化ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色デンプンの直接組み入れによっておこなった。コロニーのデンプンを分解することでポジティブコロニーの周囲に直接目視できる明瞭なハローを形成する能力によって、ポジティブコロニーを決定した。
【０１５８】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合には、その一部を楊枝でひろい、９６ウェルプレートで無菌水（３０μｌ）によって希釈した。この時点では、ポジティブコロニーを凍結して次の分析のために保存するか、或いは即座に増幅するかのいずれかである。細胞の一定分量（５μｌ）を、０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）；４．０μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）；２．５μｌのＫｅｎｔａｑバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；０．２５μｌの正方向オリゴ１；０．２５μｌの逆方向オリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含有する２５μｌ容量でのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。
正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ−３’
（配列番号：６１１）
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴ −３’
（配列番号：６１２）
であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：

【０１５９】
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングし、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０の３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。従って、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応の一定分量（５μｌ）を、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されているように１％アガロースゲル中でトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動によって検討した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物を生じるクローンを、９６ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ清浄化カラム（ＱｕａｇｅｎＩｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）での精製の後にＤＮＡ配列によってさらに分析した。
【０１６０】
実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
ジェネンテク，インク（サウスサンフランシスコ，カリフォルニア）が独自に開発した配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び／又は個人の（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標），ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）データベースから集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片だけでなくＥＳＴｓへ適用することで、種々のポリペプチド−コード化核酸配列を同定した。このシグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片の５’末端にある第１、あるいは第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドには、停止コドンを持たない少なくとも３５の明白なアミノ酸がコードされていなければならない。第１のＡＴＧが必須のアミノ酸を有する場合、第２のものは検討しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列に、分泌シグナルに関連することが知られている７つのセンサー（評価パラメータ）の一組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムを利用することで、多くのポリペプチド−コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１６１】
実施例４：ヒトＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例１から３に記載されている技術を用いて、ここに開示されているように、多くの全長ｃＤＮＡクローンがＰＲＯポリペプチドをコードしているものと同定された。そして、これらのｃＤＮＡは、下記の表７示してあるように、ブダペスト条約の条項に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１　ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア　２０１１０−２２０９米国（ＡＴＣＣ）へ寄託した。
【０１６２】

【０１６３】

【０１６４】

【０１６５】

【０１６６】

【０１６７】

【０１６８】

【０１６９】

【０１７０】

【０１７１】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０１７２】
実施例５：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＰＲＯの利用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての利用を示している。
ここに開示されている全長又は成熟ＰＲＯをコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯの天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
ハイブリダイゼーション及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄を、次の高緊縮性条件下において実施する。放射標識ＰＲＯ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中において４２℃で２０時間実施する。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ水溶液中において４２℃で実施する。
次いで、全長天然配列をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られている標準的技術を用いて同定することができる。
【０１７３】
実施例６：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯの非グリコシル化型の調製を例証する。
ＤＮＡ配列コード化は選択されたＰＣＲプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）を参照のこと）がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターにライゲーションする。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード領域、ラムダ転写集結因子及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をＬＢプレート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、それを制限分析及びＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＰＲＯタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１７４】
以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグ形態でＰＲＯを大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎｇａｌＥｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄｈｙｃａｓｅＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ_４の混合で調製）中にて５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪によって約２０−３０時間成長させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をＢｅｃｋｍａｎＵｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、透明にするために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎＮｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
【０１７５】
試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、ＰｏｒｏｓＲ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製した。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。
【０１７６】
実施例７：哺乳動物細胞におけるＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯの調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２４７参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
【０１７７】
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａＰＯ_４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１７８】
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１７９】
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを添加する。細胞を、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は^３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１８０】
また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ^２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施される。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態として発現される。
【０１８１】
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ３．１６，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Ｌｕｃａｓら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：９，１７７４−１７７９（１９９６）に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ），Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）約１千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ等に記載されているように成長させる。約３ｘ１０^７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
【０１８２】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させる。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択成長培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用する。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０^６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ３６５ＭｅｄｉｃａｌＧｒａｄｅＥｍｕｌｓｉｏｎ）をとった。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填する。
【０１８３】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加する。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速によって４℃でポンプ供給する。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール，ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下通りに条件培地から精製する。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へポンプ注入する。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価する。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１８４】
実施例８：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【０１８５】
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１８６】
実施例９：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ又はＰＲＯコード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９４）に記載されているように実施した。
【０１８７】
次に、発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯは、例えばＮｉ^２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Ｒｕｐｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ_２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ_２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に複合したＮｉ^２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ_１０−タグＰＲＯを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１８８】
実施例１０：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｈ，ハミルトン，モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１８９】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１９０】
実施例１１：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ−ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ−ＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０１９１】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０１９２】
実施例１２：薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、（ｉ）試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１９３】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１９４】
実施例１３：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１））。
【０１９５】
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：７７９６−７８０１（１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３：７４２−７４６（１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１９６】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１９７】
実施例１４：ヒト血液でのＴＮＦ−αの放出を刺激するＰＲＯポリペプチドの同定（アッセイ１２８）
このアッセイは、本発明のあるＰＲＯポリペプチドが、ヒト血液におけるＴＮＦ−αの放出を刺激することを示している。このアッセイでポジティブ（陽性）と検定されたＰＲＯポリペプチドは、他の事例を含めて、ＴＮＦ−αの放出を刺激が所望されている研究目的、及びＴＮＦ−αの放出の増加が有益である症状の治療上の処置にとって有用である。特に、５０ｍＭＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．２）で補充した２００μｌのヒト血液を、９６ウェルテストプレートのウェルへ等分して配する。次いで、各ウェルへは、５０ｍＭＨｅｐｅｓバッファーに含まれる試験ＰＲＯポリペプチド（種々の濃度）又は５０ｍＭＨｅｐｅｓバッファーのみ（ネガティブ（負）のコントロール）のいずれかを３００μｌ添加し、このプレートを３７℃で６時間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、各ウェルから５０μｌの血漿を収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＴＮＦ−αの存在を試験した。アッセイでのポジティブ（陽性）とは、ネガティブ（負）のコントロール試料と比較して、ＰＲＯポリペプチド処理試料中により多量のＴＮＦ−αがあることである。
以下のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてポジティブ（陽性）であった：
ＰＲＯ１０７９、ＰＲＯ８２７、ＰＲＯ７９１、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ１３１６、ＰＲＯ１１８３、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１７６０、ＰＲＯ１５６７、及びＰＲＯ４３３３。
【０１９８】
実施例１５：軟骨細胞再分化の促進（アッセイ１２９）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが、培地で軟骨細胞の増殖及び／又は再分化を誘導する能力を示すか否かを確定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと評価されるＰＲＯポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び／又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待される。
ブタ軟骨細胞を、４−６ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨の一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、この単離された細胞を、１０％ＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むハムＦ−１２へ２５，０００細胞／ｃｍ^２の割合で播種する。培地を３日ごとに交換する。１２日目には、細胞を血清を含まない１００μｌの同じ培地へ５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートへ播種し、１００μｌの無血清培地（ネガティブコントロール）、スタウロスポリン（最終濃度が５ｎＭ；ポジティブコントロール）又は試験ＰＲＯポリペプチドのいずれかを添加して最終容量を２００μｌ／ウェルとする。３７℃での５日間の後、１００μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２及び５０μｇ／ｍｌ５−ＣＦＤＡを含む２２μｌの培地を各ウェルへ添加し、さらに１０分間に渡って３７℃でインキュベートする。各ウェルの緑色蛍光を写真に取り、形態計測分析によって軟骨細胞の分化段階を計算する。＞５０％のＰＲＯポリペプチドで処理した細胞が分化している場合には（ネガティブコントロールによって得られたバックグラウンドと比較して）、このアッセイでポジティブな結果が得られていることになる。
このアッセイにおいて、ＰＲＯ６０２９ポリペプチドがポジティブであると評価された。
【０１９９】
実施例１６：癌牲腫瘍でのＰＲＯポリペプチドの過剰発現を検出するためのマイクロアレイ分析
幾千もの遺伝子配列を殆ど場合において含む核酸マイクロアレイは、組織の正常な対応物と比較して、疾患組織において差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアッセイを用いると、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料が逆転写され、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識される。次いで、このｃＤＮＡプローブは、固体支持体上に固定化さた多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。例えば、ある疾患段階で発現することが知られている遺伝子から選ばれたものを固体支持体上に整列してもよい。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験（疾患組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、疾患組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味は、疾患組織で過剰発現しているタンパク質は、疾患症状の存在のための診断的マーカーとしてだけではなく、疾患症状の治療のための治療上の標的としても有用であるということである。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願された米国仮出願番号６０／１９３，７６７にすべて詳述されており、ここにおいて文献として取り入れられている。
【０２００】
本実施例では、癌牲腫瘍で過剰発現しているＰＲＯポリペプチドを同定するための試みとして、非癌牲ヒト組織に関連するＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子発現のために、種々のヒト組織から誘導された癌牲腫瘍が研究された。２セットの実験データーが作成された。１つのセットでは、同じ患者からの癌牲ヒト結腸腫瘍組織、及び適合した非癌牲ヒト結腸腫瘍組織（「適合した直腸コントロール」）を得て、そして上記で記載したマイクロアレイ技術を用いてＰＲＯポリペプチド発現について分析した。二番目のセットのデーターでは、任意の種々の異なるヒト腫瘍を得て、肝臓、腎臓、及び肺を含む上皮由来の非癌牲ヒト組織をプールすることによって調製される「普遍的」上皮コントロール試料と比較した。プールされた組織から単離されたｍＲＮＡは、これら異なる組織での発現遺伝子産物の混合物を示す。プールされたコントロール試料を用いたマイクロアレイハイブリダイゼーション実験は、二色分析において直線的なプロットを生じた。次いで、二色分析において生じたこの線の傾斜を、各実験の（試験：コントロール検出）の比率を標準化するために用いた。次いで、種々の実験の標準化された比率を比較し、そして遺伝子発現の集積牲を同定するために用いた。従って、プール化された「普遍的なコントロール」試料は、単純な二つの試料の比較における有効で相対的遺伝子発現の判定を可能にするだけではなく、幾つかの実験に渡る複数の試料の比較をも可能にする。
本実験では、ここに記載のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの作製に用い、上記に列挙した腫瘍組織のＲＮＡをさらにハイブリダイゼーションに用いた。標準化比：実験比に基づく値は、「カットオフ」と命名された。このカットオフを上回る値のみを重要であると判定した。下記の表８は、これらの実験の結果を示しており、本発明の種々のＰＲＯポリペプチドが非癌牲ヒト組織コントロールと比べて種々のヒト腫瘍組織において著しく過剰発現していることを示している。上記にて記載のように、これらのデーターは、本発明のＰＲＯポリペプチドが一つ以上の癌牲腫瘍の存在を示す診断マーカーとしてだけではなく、これら腫瘍の治療のための治療上の標的としての機能も果たすことを示している。
【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【０２０６】

【０２０７】

【０２０８】

【０２０９】

【０２１０】

【０２１１】

【０２１２】

【０２１３】

【０２１４】

【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】天然配列ＰＲＯ２７６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ１６４３５−１２０８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２】Ｆｉｇ．１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【Ｆｉｇ．３】天然配列ＰＲＯ２８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。配列番号：３は、ここで「ＤＮＡ２３３１８−１２１１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４】Ｆｉｇ．３に示した配列番号：３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【Ｆｉｇ．５】天然配列ＰＲＯ１９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。配列番号：５は、ここで「ＤＮＡ２３３２２−１３９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６】Ｆｉｇ．５に示した配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【Ｆｉｇ．７】天然配列ＰＲＯ１９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。配列番号：７は、ここで「ＤＮＡ２３３３４−１３９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８】Ｆｉｇ．７に示した配列番号：７コード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【Ｆｉｇ．９】天然配列ＰＲＯ１８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す。配列番号：９は、ここで「ＤＮＡ２６８４３−１３８９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１０】Ｆｉｇ．９に示した配列番号：９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【Ｆｉｇ．１１】天然配列ＰＲＯ１９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。配列番号：１１は、ここで「ＤＮＡ２６８４４−１３９４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２】Ｆｉｇ．１１に示した配列番号：１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【Ｆｉｇ．１３】天然配列ＰＲＯ２１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す。配列番号：１３は、ここで「ＤＮＡ３０８６７−１３３５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４】Ｆｉｇ．１３に示した配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【Ｆｉｇ．１５】天然配列ＰＲＯ２６０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示す。配列番号：１５は、ここで「ＤＮＡ３３４７０−１１７５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６】Ｆｉｇ．１５に示した配列番号：１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【Ｆｉｇ．１７】天然配列ＰＲＯ２３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示す。配列番号：１７は、ここで「ＤＮＡ３４４３６−１２３８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８】Ｆｉｇ．１７に示した配列番号：１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【Ｆｉｇ．１９】天然配列ＰＲＯ２３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す。配列番号：１９は、ここで「ＤＮＡ３５５５７−１１３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２０】Ｆｉｇ．１９に示した配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【Ｆｉｇ．２１】天然配列ＰＲＯ２３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示す。配列番号：２１は、ここで「ＤＮＡ３５５９９−１１６８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２】Ｆｉｇ．２１に示した配列番号：２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【Ｆｉｇ．２３】天然配列ＰＲＯ２４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示す。配列番号：２３は、ここで「ＤＮＡ３５６６８−１１７１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４】Ｆｉｇ．２３に示した配列番号：２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【Ｆｉｇ．２５】天然配列ＰＲＯ２６２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５）を示す。配列番号：２５は、ここで「ＤＮＡ３６９９２−１１６８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６】Ｆｉｇ．２５に示した配列番号：２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【Ｆｉｇ．２７】天然配列ＰＲＯ２７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示す。配列番号：２７は、ここで「ＤＮＡ３９４２３−１１８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８】Ｆｉｇ．２７に示した配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【Ｆｉｇ．２９】天然配列ＰＲＯ２６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示す。配列番号：２９は、ここで「ＤＮＡ３９４２７−１１７９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３０】Ｆｉｇ．２９に示した配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【Ｆｉｇ．３１】天然配列ＰＲＯ２７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示す。配列番号：３１は、ここで「ＤＮＡ３９５１０−１１８１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２】Ｆｉｇ．３１に示した配列番号：３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【Ｆｉｇ．３３】天然配列ＰＲＯ３５５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３）を示す。配列番号：３３は、ここで「ＤＮＡ３９５１８−１２４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４】Ｆｉｇ．３３に示した配列番号：３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【Ｆｉｇ．３５】天然配列ＰＲＯ２９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。配列番号：３５は、ここで「ＤＮＡ３９９７５−１２１０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６】Ｆｉｇ．３５に示した配列番号：３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【Ｆｉｇ．３７】天然配列ＰＲＯ２９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す。配列番号：３７は、ここで「ＤＮＡ３９９７６−１２１５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８】Ｆｉｇ．３７した配列番号：３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。
【Ｆｉｇ．３９】天然配列ＰＲＯ２９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示す。配列番号：３９は、ここで「ＤＮＡ３９９７９−１２１３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４０】Ｆｉｇ．３９に示した配列番号：３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
【Ｆｉｇ．４１】天然配列ＰＲＯ３２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示す。配列番号：４１は、ここで「ＤＮＡ４０５９４−１２３３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２】Ｆｉｇ．４１に示した配列番号：４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【Ｆｉｇ．４３】天然配列ＰＲＯ３３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３）を示す。配列番号：４３は、ここで「ＤＮＡ４０６０３−１２３２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４】Ｆｉｇ．４３に示した配列番号：４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す。
【Ｆｉｇ．４５】天然配列ＰＲＯ２９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５）を示す。配列番号：４５は、ここで「ＤＮＡ４０６０４−１１８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６】Ｆｉｇ．４５に示した配列番号：４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。
【Ｆｉｇ．４７】天然配列ＰＲＯ３００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７）を示す。配列番号：４７は、ここで「ＤＮＡ４０６２５−１１８９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８】Ｆｉｇ．４７に示した配列番号：４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。
【Ｆｉｇ．４９】天然配列ＰＲＯ３０７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示す。配列番号：４９は、ここで「ＤＮＡ４１２２５−１２１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５０】Ｆｉｇ．４９に示した配列番号：４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。
【Ｆｉｇ．５１】天然配列ＰＲＯ３３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示す。配列番号：５１は、ここで「ＤＮＡ４１３７９−１２３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２】Ｆｉｇ．５１に示した配列番号：５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。
【Ｆｉｇ．５３】天然配列ＰＲＯ３５２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３）を示す。配列番号：５３は、ここで「ＤＮＡ４１３８６−１３１６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４】Ｆｉｇ．５３に示した配列番号：５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す。
【Ｆｉｇ．５５】天然配列ＰＲＯ７１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５）を示す。配列番号：５５は、ここで「ＤＮＡ４４１６１−１４３４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６】Ｆｉｇ．５５に示した配列番号：５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す。
【Ｆｉｇ．５７】天然配列ＰＲＯ８７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７）を示す。配列番号：５７は、ここで「ＤＮＡ４４１７９−１３６２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８】Ｆｉｇ．５７に示した配列番号：５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８）を示す。
【Ｆｉｇ．５９】天然配列ＰＲＯ３５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９）を示す。配列番号：５９は、ここで「ＤＮＡ４４１９２−１２４６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６０】Ｆｉｇ．５９に示した配列番号：５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【Ｆｉｇ．６１】天然配列ＰＲＯ１１５１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６１）を示す。配列番号：６１は、ここで「ＤＮＡ４４６９４−１５００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６２】Ｆｉｇ．６１に示した配列番号：６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６２）を示す。
【Ｆｉｇ．６３】天然配列ＰＲＯ３８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６３）を示す。配列番号：６３は、ここで「ＤＮＡ４５２３４−１２７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６４】Ｆｉｇ．６３に示した配列番号：６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６４）を示す。
【Ｆｉｇ．６５】天然配列ＰＲＯ１８６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６５）を示す。配列番号：６５は、ここで「ＤＮＡ４５４０９−２５１１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６６】Ｆｉｇ．６５に示した配列番号：６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６６）を示す。
【Ｆｉｇ．６７】天然配列ＰＲＯ３８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６７）を示す。配列番号：６７は、ここで「ＤＮＡ４５４１５−１３１８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６８】Ｆｉｇ．６７に示した配列番号：６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６８）を示す。
【Ｆｉｇ．６９】天然配列ＰＲＯ５４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６９）を示す。配列番号：６９は、ここで「ＤＮＡ４５４１７−１４３２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．７０】Ｆｉｇ．６９に示した配列番号：６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７０）を示す。
【Ｆｉｇ．７１】天然配列ＰＲＯ８５２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７１）を示す。配列番号：７１は、ここで「ＤＮＡ４５４９３−１３４９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．７２】Ｆｉｇ．７１に示した配列番号：７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７２）を示す。
【Ｆｉｇ．７３】天然配列ＰＲＯ７００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７３）を示す。配列番号：７３は、ここで「ＤＮＡ４６７７６−１２８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．７４】Ｆｉｇ．７３に示した配列番号：７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７４）を示す。
【Ｆｉｇ．７５Ａ−７５Ｂ】天然配列ＰＲＯ７０８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７５）を示す。配列番号：７５は、ここで「ＤＮＡ４８２９６−１２９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．７６】Ｆｉｇ．７５Ａ−７５Ｂに示した配列番号：７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。
【Ｆｉｇ．７７】天然配列ＰＲＯ７０７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７７）を示す。配列番号：７７は、ここで「ＤＮＡ４８３０６−１２９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．７８】Ｆｉｇ．７７に示した配列番号：７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７８）を示す。
【Ｆｉｇ．７９】天然配列ＰＲＯ８６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７９）を示す。配列番号：７９は、ここで「ＤＮＡ４８３２８−１３５５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８０】Ｆｉｇ．７９に示した配列番号：７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８０）を示す。
【Ｆｉｇ．８１】天然配列ＰＲＯ７０６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８１）を示す。配列番号：８１は、ここで「ＤＮＡ４８３２９−１２９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８２】Ｆｉｇ．８１に示した配列番号：８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８２）を示す。
【Ｆｉｇ．８３】天然配列ＰＲＯ７３２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８３）を示す。配列番号：８３は、ここで「ＤＮＡ４８３３４−１４３５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８４】Ｆｉｇ．８３に示した配列番号：８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８４）を示す。
【Ｆｉｇ．８５】天然配列ＰＲＯ５３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８５）を示す。配列番号：８５は、ここで「ＤＮＡ４９１４１−１４３１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８６】Ｆｉｇ．８５に示した配列番号：８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。
【Ｆｉｇ．８７】天然配列ＰＲＯ５４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８７）を示す。配列番号：８７は、ここで「ＤＮＡ４９６２４−１２７９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．８８】Ｆｉｇ．８７に示した配列番号：８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８８）を示す。
【Ｆｉｇ．８９】天然配列ＰＲＯ７１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８９）を示す。配列番号：８９は、ここで「ＤＮＡ４９６４７−１３９８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．９０】Ｆｉｇ．８９に示した配列番号：８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９０）を示す。
【Ｆｉｇ．９１】天然配列ＰＲＯ８７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９１）を示す。配列番号：９１は、ここで「ＤＮＡ４９８１９−１４３９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．９２】Ｆｉｇ．９１に示した配列番号：９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９２）を示す。
【Ｆｉｇ．９３】天然配列ＰＲＯ７０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９３）を示す。配列番号：９３は、ここで「ＤＮＡ５０９１１−１２８８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．９４】Ｆｉｇ．９３に示した配列番号：９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９４）を示す。
【Ｆｉｇ．９５】天然配列ＰＲＯ７０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９５）を示す。配列番号：９５は、ここで「ＤＮＡ５０９１４−１２８９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．９６】Ｆｉｇ．９５に示した配列番号：９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９６）を示す。
【Ｆｉｇ．９７】天然配列ＰＲＯ８７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９７）を示す。配列番号：９７は、ここで「ＤＮＡ５０９１９−１３６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．９８】Ｆｉｇ．９７に示した配列番号：９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９８）を示す。
【Ｆｉｇ．９９】天然配列ＰＲＯ７０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９９）を示す。配列番号：９９は、ここで「ＤＮＡ５０９８０−１２８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１００】Ｆｉｇ．９９に示した配列番号：９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１００）を示す。
【Ｆｉｇ．１０１】天然配列ＰＲＯ９４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：１０１は、ここで「ＤＮＡ５２１８５−１３７０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１０２】Ｆｉｇ．１０１に示した配列番号：１０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０２）を示す。
【Ｆｉｇ．１０３】天然配列ＰＲＯ７３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０３）を示す。配列番号：１０３は、ここで「ＤＮＡ５２７５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１０４】Ｆｉｇ．１０３に示した配列番号：１０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０４）を示す。
【Ｆｉｇ．１０５】天然配列ＰＲＯ９４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０５）を示す。配列番号：１０５は、ここで「ＤＮＡ５３９０６−１３６８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１０６】Ｆｉｇ．１０５に示した配列番号：１０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【Ｆｉｇ．１０７】天然配列ＰＲＯ１０８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０７）を示す。配列番号：１０７は、ここで「ＤＮＡ５３９１２−１４５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１０８】Ｆｉｇ．１０７に示した配列番号：１０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０８）を示す。
【Ｆｉｇ．１０９】天然配列ＰＲＯ１１３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０９）を示す。配列番号：１０９は、ここで「ＤＮＡ５３９１３−１４９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１１０】Ｆｉｇ．１０９に示した配列番号：１０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１０）を示す。
【Ｆｉｇ．１１１】天然配列ＰＲＯ９８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１１）を示す。配列番号：１１１は、ここで「ＤＮＡ５３９７７−１３７１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１１２】Ｆｉｇ．１１１に示した配列番号：１１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１２）を示す。
【Ｆｉｇ．１１３】天然配列ＰＲＯ７８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１３）を示す。配列番号：１１３は、ここで「ＤＮＡ５３９７８−１４４３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１１４】Ｆｉｇ．１１３に示した配列番号：１１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１４）を示す。
【Ｆｉｇ．１１５】天然配列ＰＲＯ７８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１５）を示す。配列番号：１１５は、ここで「ＤＮＡ５３９９６−１４４２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１１６】Ｆｉｇ．１１５に示した配列番号：１１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１６）を示す。
【Ｆｉｇ．１１７】天然配列ＰＲＯ９４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１７）を示す。配列番号：１１７は、ここで「ＤＮＡ５４００２−１３６７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１１８】Ｆｉｇ．１１７に示した配列番号：１１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１８）を示す。
【Ｆｉｇ．１１９】天然配列ＰＲＯ７６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１９）を示す。配列番号：１１９は、ここで「ＤＮＡ５５７３７−１３４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２０】Ｆｉｇ．１１９に示した配列番号：１１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２０）を示す。
【Ｆｉｇ．１２１】天然配列ＰＲＯ１０７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２１）を示す。配列番号：１２１は、ここで「ＤＮＡ５６０５０−１４５５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２２】Ｆｉｇ．１２１に示した配列番号：１２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２２）を示す。
【Ｆｉｇ．１２３】天然配列ＰＲＯ１０７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２３）を示す。配列番号：１２３は、ここで「ＤＮＡ５６０５２−１４５４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２４】Ｆｉｇ．１２３に示した配列番号：１２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２４）を示す。
【Ｆｉｇ．１２５】天然配列ＰＲＯ１０１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２５）を示す。配列番号：１２５は、ここで「ＤＮＡ５６１０７−１４１５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２６】Ｆｉｇ．１２５に示した配列番号：１２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２６）を示す。
【Ｆｉｇ．１２７】天然配列ＰＲＯ７９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２７）を示す。配列番号：１２７は、ここで「ＤＮＡ５６１１０−１４３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１２８】Ｆｉｇ．１２７に示した配列番号：１２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２８）を示す。
【Ｆｉｇ．１２９】天然配列ＰＲＯ１７７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２９）を示す。配列番号：１２９は、ここで「ＤＮＡ５６４０６−１７０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１３０】Ｆｉｇ．１２９に示した配列番号：１２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３０）を示す。
【Ｆｉｇ．１３１】天然配列ＰＲＯ１０１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３１）を示す。配列番号：１３１は、ここで「ＤＮＡ５６４０９−１３７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１３２】Ｆｉｇ．１３１に示した配列番号：１３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３２）を示す。
【Ｆｉｇ．１３３】天然配列ＰＲＯ１０１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３３）を示す。配列番号：１３３は、ここで「ＤＮＡ５６４１０−１４１４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１３４】Ｆｉｇ．１３３に示した配列番号：１３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３４）を示す。
【Ｆｉｇ．１３５】天然配列ＰＲＯ９３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３５）を示す。配列番号：１３５は、ここで「ＤＮＡ５６４３６−１４４８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１３６】Ｆｉｇ．１３５に示した配列番号：１３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３６）を示す。
【Ｆｉｇ．１３７】天然配列ＰＲＯ１４７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３７）を示す。配列番号：１３７は、ここで「ＤＮＡ５６５２９−１６４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１３８】Ｆｉｇ．１３７に示した配列番号：１３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３８）を示す。
【Ｆｉｇ．１３９】天然配列ＰＲＯ８４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３９）を示す。配列番号：１３９は、ここで「ＤＮＡ５６８５５−１４４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４０】Ｆｉｇ．１３９に示した配列番号：１３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４０）を示す。
【Ｆｉｇ．１４１】天然配列ＰＲＯ８３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４１）を示す。配列番号：１４１は、ここで「ＤＮＡ５６８５９−１４４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４２】Ｆｉｇ．１４１に示した配列番号：１４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４２）を示す。
【Ｆｉｇ．１４３】天然配列ＰＲＯ１１８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４３）を示す。配列番号：１４３は、ここで「ＤＮＡ５６８６０−１５１０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４４】Ｆｉｇ．１４３に示した配列番号：１４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４４）を示す。
【Ｆｉｇ．１４５】天然配列ＰＲＯ１１３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４５）を示す。配列番号：１４５は、ここで「ＤＮＡ５６８６５−１４９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４６】Ｆｉｇ．１４５に示した配列番号：１４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４６）を示す。
【Ｆｉｇ．１４７】天然配列ＰＲＯ１１１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４７）を示す。配列番号：１４７は、ここで「ＤＮＡ５６８６８−１４７８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１４８】Ｆｉｇ．１４７に示した配列番号：１４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４８）を示す。
【Ｆｉｇ．１４９】天然配列ＰＲＯ１２７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４９）を示す。配列番号：１４９は、ここで「ＤＮＡ５６８６９−１５４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１５０】Ｆｉｇ．１４９に示した配列番号：１４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５０）を示す。
【Ｆｉｇ．１５１】天然配列ＰＲＯ１１３５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５１）を示す。配列番号：１５１は、ここで「ＤＮＡ５６８７０−１４９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１５２】Ｆｉｇ．１５１に示した配列番号：１５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５２）を示す。
【Ｆｉｇ．１５３】天然配列ＰＲＯ８２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５３）を示す。配列番号：１５３は、ここで「ＤＮＡ５７０３９−１４０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１５４】Ｆｉｇ．１５３に示した配列番号：１５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５４）を示す。
【Ｆｉｇ．１５５】天然配列ＰＲＯ１０５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５５）を示す。配列番号：１５５は、ここで「ＤＮＡ５７２５３−１３８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１５６】Ｆｉｇ．１５５に示した配列番号：１５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５６）を示す。
【Ｆｉｇ．１５７】天然配列ＰＲＯ１１１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５７）を示す。配列番号：１５７は、ここで「ＤＮＡ５７２５４−１４７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１５８】Ｆｉｇ．１５７に示した配列番号：１５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５８）を示す。
【Ｆｉｇ．１５９】天然配列ＰＲＯ１００６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５９）を示す。配列番号：１５９は、ここで「ＤＮＡ５７６９９−１４１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６０】Ｆｉｇ．１５９に示した配列番号：１５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６０）を示す。
【Ｆｉｇ．１６１】天然配列ＰＲＯ１０７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６１）を示す。配列番号：１６１は、ここで「ＤＮＡ５７７０４−１４５２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６２】Ｆｉｇ．１６１に示した配列番号：１６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６２）を示す。
【Ｆｉｇ．１６３】天然配列ＰＲＯ１０７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６３）を示す。配列番号：１６３は、ここで「ＤＮＡ５７７１０−１４５１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６４】Ｆｉｇ．１６３に示した配列番号：１６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６４）を示す。
【Ｆｉｇ．１６５】天然配列ＰＲＯ１１３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６５）を示す。配列番号：１６５は、ここで「ＤＮＡ５７８２７−１４９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６６】Ｆｉｇ．１６５に示した配列番号：１６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６６）を示す。
【Ｆｉｇ．１６７】天然配列ＰＲＯ１００４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６７）を示す。配列番号：１６７は、ここで「ＤＮＡ５７８４４−１４１０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１６８】Ｆｉｇ．１６７に示した配列番号：１６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６８）を示す。
【Ｆｉｇ．１６９】天然配列ＰＲＯ１３４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６９）を示す。配列番号：１６９は、ここで「ＤＮＡ５８７２３−１５８８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１７０】Ｆｉｇ．１６９に示した配列番号：１６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７０）を示す。
【Ｆｉｇ．１７１】天然配列ＰＲＯ１１１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７１）を示す。配列番号：１７１は、ここで「ＤＮＡ５８７２７−１４７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１７２】Ｆｉｇ．１７１に示した配列番号：１７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７２）を示す。
【Ｆｉｇ．１７３】天然配列ＰＲＯ１３７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７３）を示す。配列番号：１７３は、ここで「ＤＮＡ５８７３０−１６０７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１７４】Ｆｉｇ．１７３に示した配列番号：１７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７４）を示す。
【Ｆｉｇ．１７５】天然配列ＰＲＯ１４８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７５）を示す。配列番号：１７５は、ここで「ＤＮＡ５８７３２−１６５０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１７６】Ｆｉｇ．１７５に示した配列番号：１７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７６）を示す。
【Ｆｉｇ．１７７】天然配列ＰＲＯ１１０９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７７）を示す。配列番号：１７７は、ここで「ＤＮＡ５８７３７−１４７３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１７８】Ｆｉｇ．１７７に示した配列番号：１７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７８）を示す。
【Ｆｉｇ．１７９】天然配列ＰＲＯ１３８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７９）を示す。配列番号：１７９は、ここで「ＤＮＡ５８７４３−１６０９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８０】Ｆｉｇ．１７９に示した配列番号：１７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８０）を示す。
【Ｆｉｇ．１８１】天然配列ＰＲＯ１０７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８１）を示す。配列番号：１８１は、ここで「ＤＮＡ５８７４７−１３８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８２】Ｆｉｇ．１８１に示した配列番号：１８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８２）を示す。
【Ｆｉｇ．１８３】天然配列ＰＲＯ１１８９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８３）を示す。配列番号：１８３は、ここで「ＤＮＡ５８８２８−１５１９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８４】Ｆｉｇ．１８３に示した配列番号：１８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８４）を示す。
【Ｆｉｇ．１８５】天然配列ＰＲＯ１００３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８５）を示す。配列番号：１８５は、ここで「ＤＮＡ５８８４６−１４０９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８６】Ｆｉｇ．１８５に示した配列番号：１８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８６）を示す。
【Ｆｉｇ．１８７】天然配列ＰＲＯ１１０８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８７）を示す。配列番号：１８７は、ここで「ＤＮＡ５８８４８−１４７２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１８８】Ｆｉｇ．１８７に示した配列番号：１８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８８）を示す。
【Ｆｉｇ．１８９】天然配列ＰＲＯ１１３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８９）を示す。配列番号：１８９は、ここで「ＤＮＡ５８８４９−１４９４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１９０】Ｆｉｇ．１８９に示した配列番号：１８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９０）を示す。
【Ｆｉｇ．１９１】天然配列ＰＲＯ１１３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９１）を示す。配列番号：１９１は、ここで「ＤＮＡ５８８５０−１４９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１９２】Ｆｉｇ．１９１に示した配列番号：１９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９２）を示す。
【Ｆｉｇ．１９３】天然配列ＰＲＯ１４１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９３）を示す。配列番号：１９３は、ここで「ＤＮＡ５８８５２−１６３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１９４】Ｆｉｇ．１９３に示した配列番号：１９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９４）を示す。
【Ｆｉｇ．１９５】天然配列ＰＲＯ１０５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９５）を示す。配列番号：１９５は、ここで「ＤＮＡ５８８５３−１４２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１９６】Ｆｉｇ．１９５に示した配列番号：１９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９６）を示す。
【Ｆｉｇ．１９７】天然配列ＰＲＯ９９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９７）を示す。配列番号：１９７は、ここで「ＤＮＡ５８８５５−１４２２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．１９８】Ｆｉｇ．１９７に示した配列番号：１９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９８）を示す。
【Ｆｉｇ．１９９】天然配列ＰＲＯ１０６９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９９）を示す。配列番号：１９９は、ここで「ＤＮＡ５９２１１−１４５０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２００】Ｆｉｇ．１９９に示した配列番号：１９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２００）を示す。
【Ｆｉｇ．２０１】天然配列ＰＲＯ１４１１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：２０１は、ここで「ＤＮＡ５９２１２−１６２７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２０２】Ｆｉｇ．２０１に示した配列番号：２０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０２）を示す。
【Ｆｉｇ．２０３】天然配列ＰＲＯ１１２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０３）を示す。配列番号：２０３は、ここで「ＤＮＡ５９２１３−１４８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２０４】Ｆｉｇ．２０３に示した配列番号：２０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０４）を示す。
【Ｆｉｇ．２０５】天然配列ＰＲＯ１３５９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０５）を示す。配列番号：２０５は、ここで「ＤＮＡ５９２１９−１６１３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２０６】Ｆｉｇ．２０５に示した配列番号：２０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０６）を示す。
【Ｆｉｇ．２０７】天然配列ＰＲＯ１１３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０７）を示す。配列番号：２０７は、ここで「ＤＮＡ５９４９７−１４９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２０８】Ｆｉｇ．２０７に示した配列番号：２０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０８）を示す。
【Ｆｉｇ．２０９】天然配列ＰＲＯ１０６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０９）を示す。配列番号：２０９は、ここで「ＤＮＡ５９６０２−１４３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２１０】Ｆｉｇ．２０９に示した配列番号：２０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１０）を示す。
【Ｆｉｇ．２１１】天然配列ＰＲＯ１０２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１１）を示す。配列番号：２１１は、ここで「ＤＮＡ５９６０３−１４１９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２１２】Ｆｉｇ．２１１に示した配列番号：２１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１２）を示す。
【Ｆｉｇ．２１３】天然配列ＰＲＯ１０２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１３）を示す。配列番号：２１３は、ここで「ＤＮＡ５９６０５−１４１８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２１４】Ｆｉｇ．２１３に示した配列番号：２１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１４）を示す。
【Ｆｉｇ．２１５】天然配列ＰＲＯ１１４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１５）を示す。配列番号：２１５は、ここで「ＤＮＡ５９６０７−１４９７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２１６】Ｆｉｇ．２１５に示した配列番号：２１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１６）を示す。
【Ｆｉｇ．２１７】天然配列ＰＲＯ１２９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１７）を示す。配列番号：２１７は、ここで「ＤＮＡ５９６１０−１５５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２１８】Ｆｉｇ．２１７に示した配列番号：２１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１８）を示す。
【Ｆｉｇ．２１９】天然配列ＰＲＯ１１０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１９）を示す。配列番号：２１９は、ここで「ＤＮＡ５９６１２−１４６６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２０】Ｆｉｇ．２１９に示した配列番号：２１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２０）を示す。
【Ｆｉｇ．２２１】天然配列ＰＲＯ１０２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２１）を示す。配列番号：２２１は、ここで「ＤＮＡ５９６１３−１４１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２２】Ｆｉｇ．２２１に示した配列番号：２２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２２）を示す。
【Ｆｉｇ．２２３】天然配列ＰＲＯ１１０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２３）を示す。配列番号：２２３は、ここで「ＤＮＡ５９６１６−１４６５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２４】Ｆｉｇ．２２３に示した配列番号：２２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２４）を示す。
【Ｆｉｇ．２２５】天然配列ＰＲＯ１１００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２５）を示す。配列番号：２２５は、ここで「ＤＮＡ５９６１９−１４６４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２６】Ｆｉｇ．２２５に示した配列番号：２２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２６）を示す。
【Ｆｉｇ．２２７】天然配列ＰＲＯ１１４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２７）を示す。配列番号：２２７は、ここで「ＤＮＡ５９６２５−１４９８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２２８】Ｆｉｇ．２２７に示した配列番号：２２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２８）を示す。
【Ｆｉｇ．２２９】天然配列ＰＲＯ１７７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２９）を示す。配列番号：２２９は、ここで「ＤＮＡ５９８１７−１７０３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２３０】Ｆｉｇ．２２９に示した配列番号：２２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３０）を示す。
【Ｆｉｇ．２３１】天然配列ＰＲＯ１０６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３１）を示す。配列番号：２３１は、ここで「ＤＮＡ５９８２７−１４２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２３２】Ｆｉｇ．２３１に示した配列番号：２３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３２）を示す。
【Ｆｉｇ．２３３】天然配列ＰＲＯ１３７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３３）を示す。配列番号：２３３は、ここで「ＤＮＡ５９８２８−１６０８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２３４】Ｆｉｇ．２３３に示した配列番号：２３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３４）を示す。
【Ｆｉｇ．２３５】天然配列ＰＲＯ３５７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３５）を示す。配列番号：２３５は、ここで「ＤＮＡ５９８３７−２５４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２３６】Ｆｉｇ．２３５に示した配列番号：２３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３６）を示す。
【Ｆｉｇ．２３７】天然配列ＰＲＯ３５６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３７）を示す。配列番号：２３７は、ここで「ＤＮＡ５９８４４−２５４２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２３８】Ｆｉｇ．２３７に示した配列番号：２３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３８）を示す。
【Ｆｉｇ．２３９】天然配列ＰＲＯ１１５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３９）を示す。配列番号：２３９は、ここで「ＤＮＡ５９８５３−１５０５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４０】Ｆｉｇ．２３９に示した配列番号：２３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４０）を示す。
【Ｆｉｇ．２４１】天然配列ＰＲＯ１０９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４１）を示す。配列番号：２４１は、ここで「ＤＮＡ５９８５４−１４５９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４２】Ｆｉｇ．２４１に示した配列番号：２４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４２）を示す。
【Ｆｉｇ．２４３】天然配列ＰＲＯ１１２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４３）を示す。配列番号：２４３は、ここで「ＤＮＡ５９８５５−１４８５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４４】Ｆｉｇ．２４３に示した配列番号：２４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４４）を示す。
【Ｆｉｇ．２４５】天然配列ＰＲＯ１２４８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４５）を示す。配列番号：２４５は、ここで「ＤＮＡ６０２７８−１５３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４６】Ｆｉｇ．２４５に示した配列番号：２４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４６）を示す。
【Ｆｉｇ．２４７】天然配列ＰＲＯ１１２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４７）を示す。配列番号：２４７は、ここで「ＤＮＡ６０２８３−１４８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２４８】Ｆｉｇ．２４７に示した配列番号：２４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４８）を示す。
【Ｆｉｇ．２４９】天然配列ＰＲＯ１３１６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４９）を示す。配列番号：２４９は、ここで「ＤＮＡ６０６０８−１５７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２５０】Ｆｉｇ．２４９に示した配列番号：２４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５０）を示す。
【Ｆｉｇ．２５１】天然配列ＰＲＯ１１９７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５１）を示す。配列番号：２５１は、ここで「ＤＮＡ６０６１１−１５２４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２５２】Ｆｉｇ．２５１に示した配列番号：２５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５２）を示す。
【Ｆｉｇ．２５３】天然配列ＰＲＯ１１２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５３）を示す。配列番号：２５３は、ここで「ＤＮＡ６０６１９−１４８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２５４】Ｆｉｇ．２５３に示した配列番号：２５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５４）を示す。
【Ｆｉｇ．２５５】天然配列ＰＲＯ１１５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５５）を示す。配列番号：２５５は、ここで「ＤＮＡ６０６２５−１５０７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２５６】Ｆｉｇ．２５５に示した配列番号：２５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５６）を示す。
【Ｆｉｇ．２５７】天然配列ＰＲＯ１１２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５７）を示す。配列番号：２５７は、ここで「ＤＮＡ６０６２９−１４８１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２５８】Ｆｉｇ．２５７に示した配列番号：２５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５８）を示す。
【Ｆｉｇ．２５９】天然配列ＰＲＯ１３８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５９）を示す。配列番号：２５９は、ここで「ＤＮＡ６０７４０−１６１５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６０】Ｆｉｇ．２５９に示した配列番号：２５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６０）を示す。
【Ｆｉｇ．２６１】天然配列ＰＲＯ１３７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６１）を示す。配列番号：２６１は、ここで「ＤＮＡ６１６０８−１６０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６２】Ｆｉｇ．２６１に示した配列番号：２６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６２）を示す。
【Ｆｉｇ．２６３】天然配列ＰＲＯ１２８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６３）を示す。配列番号：２６３は、ここで「ＤＮＡ６１７５５−１５５４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６４】Ｆｉｇ．２６３に示した配列番号：２６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６４）を示す。
【Ｆｉｇ．２６５】天然配列ＰＲＯ１２４９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６５）を示す。配列番号：２６５は、ここで「ＤＮＡ６２８０９−１５３１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６６】Ｆｉｇ．２６５に示した配列番号：２６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６６）を示す。
【Ｆｉｇ．２６７】天然配列ＰＲＯ１３３５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６７）を示す。配列番号：２６７は、ここで「ＤＮＡ６２８１２−１５９４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２６８】Ｆｉｇ．２６７に示した配列番号：２６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６８）を示す。
【Ｆｉｇ．２６９】天然配列ＰＲＯ３５７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６９）を示す。配列番号：２６９は、ここで「ＤＮＡ６２８１３−２５４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２７０】Ｆｉｇ．２６９に示した配列番号：２６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７０）を示す。
【Ｆｉｇ．２７１】天然配列ＰＲＯ１５９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７１）を示す。配列番号：２７１は、ここで「ＤＮＡ６２８４５−１６８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２７２】Ｆｉｇ．２７１に示した配列番号：２７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７２）を示す。
【Ｆｉｇ．２７３】天然配列ＰＲＯ１３７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７３）を示す。配列番号：２７３は、ここで「ＤＮＡ６４８４９−１６０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２７４】Ｆｉｇ．２７３に示した配列番号：２７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７４）を示す。
【Ｆｉｇ．２７５】天然配列ＰＲＯ１３４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７５）を示す。配列番号：２７５は、ここで「ＤＮＡ６４８５２−１５８９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２７６】Ｆｉｇ．２７５に示した配列番号：２７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７６）を示す。
【Ｆｉｇ．２７７】天然配列ＰＲＯ１３１１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７７）を示す。配列番号：２７７は、ここで「ＤＮＡ６４８６３−１５７３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２７８】Ｆｉｇ．２７７に示した配列番号：２７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７８）を示す。
【Ｆｉｇ．２７９】天然配列ＰＲＯ１３５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７９）を示す。配列番号：２７９は、ここで「ＤＮＡ６４８８１−１６０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８０】Ｆｉｇ．２７９に示した配列番号：２７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８０）を示す。
【Ｆｉｇ．２８１】天然配列ＰＲＯ１５５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８１）を示す。配列番号：２８１は、ここで「ＤＮＡ６４９０２−１６６７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８２】Ｆｉｇ．２８１に示した配列番号：２８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８２）を示す。
【Ｆｉｇ．２８３】天然配列ＰＲＯ１３０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８３）を示す。配列番号：２８３は、ここで「ＤＮＡ６４９５２−１５６８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８４】Ｆｉｇ．２８３に示した配列番号：２８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８４）を示す。
【Ｆｉｇ．２８５】天然配列ＰＲＯ１３０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８５）を示す。配列番号：２８５は、ここで「ＤＮＡ６５４０３−１５６５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８６】Ｆｉｇ．２８５に示した配列番号：２８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８６）を示す。
【Ｆｉｇ．２８７】天然配列ＰＲＯ１２６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８７）を示す。配列番号：２８７は、ここで「ＤＮＡ６５４１３−１５３４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２８８】Ｆｉｇ．２８７に示した配列番号：２８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８８）を示す。
【Ｆｉｇ．２８９Ａ−２８９Ｂ】天然配列ＰＲＯ１３３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８９）を示す。配列番号：２８９は、ここで「ＤＮＡ６５４２３−１５９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２９０】Ｆｉｇ．２８９Ａ−２８９Ｂに示した配列番号：２８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９０）を示す。
【Ｆｉｇ．２９１】天然配列ＰＲＯ１２７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９１）を示す。配列番号：２９１は、ここで「ＤＮＡ６６３０４−１５４６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２９２】Ｆｉｇ．２９１に示した配列番号：２９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９２）を示す。
【Ｆｉｇ．２９３】天然配列ＰＲＯ１２７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９３）を示す。配列番号：２９３は、ここで「ＤＮＡ６６３０８−１５３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２９４】Ｆｉｇ．２９３に示した配列番号：２９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９４）を示す。
【Ｆｉｇ．２９５】天然配列ＰＲＯ１２９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９５）を示す。配列番号：２９５は、ここで「ＤＮＡ６６５１１−１５６３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２９６】Ｆｉｇ．２９５に示した配列番号：２９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９６）を示す。
【Ｆｉｇ．２９７】天然配列ＰＲＯ１３０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９７）を示す。配列番号：２９７は、ここで「ＤＮＡ６６５１２−１５６４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．２９８】Ｆｉｇ．２９７に示した配列番号：２９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９８）を示す。
【Ｆｉｇ．２９９】天然配列ＰＲＯ１２６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９９）を示す。配列番号：２９９は、ここで「ＤＮＡ６６５１９−１５３５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３００】Ｆｉｇ．２９９に示した配列番号：２９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３００）を示す。
【Ｆｉｇ．３０１】天然配列ＰＲＯ１３２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：３０１は、ここで「ＤＮＡ６６５２１−１５８３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３０２】Ｆｉｇ．３０１に示した配列番号：３０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０２）を示す。
【Ｆｉｇ．３０３】天然配列ＰＲＯ１３２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０３）を示す。配列番号：３０３は、ここで「ＤＮＡ６６６５８−１５８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３０４】Ｆｉｇ．３０３に示した配列番号：３０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０４）を示す。
【Ｆｉｇ．３０５】天然配列ＰＲＯ１３２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０５）を示す。配列番号：３０５は、ここで「ＤＮＡ６６６６０−１５８５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３０６】Ｆｉｇ．３０５に示した配列番号：３０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０６）を示す。
【Ｆｉｇ．３０７】天然配列ＰＲＯ１３３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０７）を示す。配列番号：３０７は、ここで「ＤＮＡ６６６６９−１５９７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３０８】Ｆｉｇ．３０７に示した配列番号：３０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０８）を示す。
【Ｆｉｇ．３０９】天然配列ＰＲＯ１３４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０９）を示す。配列番号：３０９は、ここで「ＤＮＡ６６６７４−１５９９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３１０】Ｆｉｇ．３０９に示した配列番号：３０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１０）を示す。
【Ｆｉｇ．３１１Ａ−３１１Ｂ】天然配列ＰＲＯ１４８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１１）を示す。配列番号：３１１は、ここで「ＤＮＡ６８８３６−１６５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３１２】Ｆｉｇ．３１１Ａ−３１１Ｂに示した配列番号：３１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１２）を示す。
【Ｆｉｇ．３１３】天然配列ＰＲＯ３５７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１３）を示す。配列番号：３１３は、ここで「ＤＮＡ６８８６２−２５４６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３１４】Ｆｉｇ．３１３に示した配列番号：３１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１４）を示す。
【Ｆｉｇ．３１５】天然配列ＰＲＯ１４７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１５）を示す。配列番号：３１５は、ここで「ＤＮＡ６８８６６−１６４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３１６】Ｆｉｇ．３１５に示した配列番号：３１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１６）を示す。
【Ｆｉｇ．３１７】天然配列ＰＲＯ１３８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１７）を示す。配列番号：３１７は、ここで「ＤＮＡ６８８６９−１６１０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３１８】Ｆｉｇ．３１７に示した配列番号：３１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１８）を示す。
【Ｆｉｇ．３１９】天然配列ＰＲＯ１４６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１９）を示す。配列番号：３１９は、ここで「ＤＮＡ６８８７１−１６３８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２０】Ｆｉｇ．３１９に示した配列番号：３１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２０）を示す。
【Ｆｉｇ．３２１】天然配列ＰＲＯ１４２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２１）を示す。配列番号：３２１は、ここで「ＤＮＡ６８８７９−１６３１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２２】Ｆｉｇ．３２１に示した配列番号：３２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２２）を示す。
【Ｆｉｇ．３２３】天然配列ＰＲＯ１５６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２３）を示す。配列番号：３２３は、ここで「ＤＮＡ６８８８０−１６７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２４】Ｆｉｇ．３２３に示した配列番号：３２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２４）を示す。
【Ｆｉｇ．３２５】天然配列ＰＲＯ１５６９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２５）を示す。配列番号：３２５は、ここで「ＤＮＡ６８８８２−１６７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２６】Ｆｉｇ．３２５に示した配列番号：３２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２６）を示す。
【Ｆｉｇ．３２７】天然配列ＰＲＯ１７５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２７）を示す。配列番号：３２７は、ここで「ＤＮＡ６８８８３−１６９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３２８】Ｆｉｇ．３２７に示した配列番号：３２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２８）を示す。
【Ｆｉｇ．３２９】天然配列ＰＲＯ１５７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２９）を示す。配列番号：３２９は、ここで「ＤＮＡ６８８８５−１６７８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３３０】Ｆｉｇ．３２９に示した配列番号：３２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３０）を示す。
【Ｆｉｇ．３３１】天然配列ＰＲＯ１５５９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３１）を示す。配列番号：３３１は、ここで「ＤＮＡ６８８８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３３２】Ｆｉｇ．３３１に示した配列番号：３３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３２）を示す。
【Ｆｉｇ．３３３】天然配列ＰＲＯ１４８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３３）を示す。配列番号：３３３は、ここで「ＤＮＡ７１１８０−１６５５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３３４】Ｆｉｇ．３３３に示した配列番号：３３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３４）を示す。
【Ｆｉｇ．３３５】天然配列ＰＲＯ１４３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３５）を示す。配列番号：３３５は、ここで「ＤＮＡ７１１８４−１６３４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３３６】Ｆｉｇ．３３５に示した配列番号：３３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３６）を示す。
【Ｆｉｇ．３３７】天然配列ＰＲＯ１４９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３７）を示す。配列番号：３３７は、ここで「ＤＮＡ７１２１３−１６５９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３３８】Ｆｉｇ．３３７に示した配列番号：３３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３８）を示す。
【Ｆｉｇ．３３９】天然配列ＰＲＯ１４８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３９）を示す。配列番号：３３９は、ここで「ＤＮＡ７１２３４−１６５１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４０】Ｆｉｇ．３３９に示した配列番号：３３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４０）を示す。
【Ｆｉｇ．３４１】天然配列ＰＲＯ１４０９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４１）を示す。配列番号：３４１は、ここで「ＤＮＡ７１２６９−１６２１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４２】Ｆｉｇ．３４１に示した配列番号：３４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４２）を示す。
【Ｆｉｇ．３４３】天然配列ＰＲＯ１４４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４３）を示す。配列番号：３４３は、ここで「ＤＮＡ７１２７７−１６３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４４】Ｆｉｇ．３４３に示した配列番号：３４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４４）を示す。
【Ｆｉｇ．３４５】天然配列ＰＲＯ１６０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４５）を示す。配列番号：３４５は、ここで「ＤＮＡ７１２８６−１６８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４６】Ｆｉｇ．３４５に示した配列番号：３４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４６）を示す。
【Ｆｉｇ．３４７】天然配列ＰＲＯ１４９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４７）を示す。配列番号：３４７は、ここで「ＤＮＡ７１８８３−１６６０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３４８】Ｆｉｇ．３４７に示した配列番号：３４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４８）を示す。
【Ｆｉｇ．３４９】天然配列ＰＲＯ１４３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４９）を示す。配列番号：３４９は、ここで「ＤＮＡ７３４０１−１６３３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３５０】Ｆｉｇ．３４９に示した配列番号：３４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５０）を示す。
【Ｆｉｇ．３５１Ａ−３５１Ｂ】天然配列ＰＲＯ１５６３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５１）を示す。配列番号：３５１は、ここで「ＤＮＡ７３４９２−１６７１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３５２】Ｆｉｇ．３５１Ａ−３５１Ｂに示した配列番号：３５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５２）を示す。
【Ｆｉｇ．３５３】天然配列ＰＲＯ１５７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５３）を示す。配列番号：３５３は、ここで「ＤＮＡ７３７３０−１６７９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３５４】Ｆｉｇ．３５３に示した配列番号：３５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５４）を示す。
【Ｆｉｇ．３５５】天然配列ＰＲＯ１５７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５５）を示す。配列番号：３５５は、ここで「ＤＮＡ７３７３４−１６８０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３５６】Ｆｉｇ．３５５に示した配列番号：３５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５６）を示す。
【Ｆｉｇ．３５７】天然配列ＰＲＯ１５７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５７）を示す。配列番号：３５７は、ここで「ＤＮＡ７３７３５−１６８１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３５８】Ｆｉｇ．３５７に示した配列番号：３５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５８）を示す。
【Ｆｉｇ．３５９】天然配列ＰＲＯ１５０８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５９）を示す。配列番号：３５９は、ここで「ＤＮＡ７３７４２−１６６２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６０】Ｆｉｇ．３５９に示した配列番号：３５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６０）を示す。
【Ｆｉｇ．３６１】天然配列ＰＲＯ１４８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６１）を示す。配列番号：３６１は、ここで「ＤＮＡ７３７４６−１６５４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６２】Ｆｉｇ．３６１に示した配列番号：３６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６２）を示す。
【Ｆｉｇ．３６３】天然配列ＰＲＯ１５６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６３）を示す。配列番号：３６３は、ここで「ＤＮＡ７３７６０−１６７２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６４】Ｆｉｇ．３６３に示した配列番号：３６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６４）を示す。
【Ｆｉｇ．３６５】天然配列ＰＲＯ１５５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６５）を示す。配列番号：３６５は、ここで「ＤＮＡ７６３９３−１６６４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６６】Ｆｉｇ．３６５に示した配列番号：３６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６６）を示す。
【Ｆｉｇ．３６７】天然配列ＰＲＯ１７５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６７）を示す。配列番号：３６７は、ここで「ＤＮＡ７６３９８−１６９９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３６８】Ｆｉｇ．３６７に示した配列番号：３６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６８）を示す。
【Ｆｉｇ．３６９】天然配列ＰＲＯ１７５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６９）を示す。配列番号：３６９は、ここで「ＤＮＡ７６３９９−１７００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３７０】Ｆｉｇ．３６９に示した配列番号：３６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７０）を示す。
【Ｆｉｇ．３７１】天然配列ＰＲＯ１７８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７１）を示す。配列番号：３７１は、ここで「ＤＮＡ７６５２２−２５００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３７２】Ｆｉｇ．３７１に示した配列番号：３７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７２）を示す。
【Ｆｉｇ．３７３】天然配列ＰＲＯ１６０６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７３）を示す。配列番号：３７３は、ここで「ＤＮＡ７６５３３−１６８９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３７４】Ｆｉｇ．３７３に示した配列番号：３７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７４）を示す。
【Ｆｉｇ．３７５】天然配列ＰＲＯ１７８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７５）を示す。配列番号：３７５は、ここで「ＤＮＡ７７３０３−２５０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３７６】Ｆｉｇ．３７５に示した配列番号：３７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７６）を示す。
【Ｆｉｇ．３７７】天然配列ＰＲＯ１７７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７７）を示す。配列番号：３７７は、ここで「ＤＮＡ７７６２６−１７０５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３７８】Ｆｉｇ．３７７に示した配列番号：３７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７８）を示す。
【Ｆｉｇ．３７９】天然配列ＰＲＯ１６０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７９）を示す。配列番号：３７９は、ここで「ＤＮＡ７７６４８−１６８８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８０】Ｆｉｇ．３７９に示した配列番号：３７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８０）を示す。
【Ｆｉｇ．３８１】天然配列ＰＲＯ１９２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８１）を示す。配列番号：３８１は、ここで「ＤＮＡ８１７５４−２５３２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８２】Ｆｉｇ．３８１に示した配列番号：３８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８２）を示す。
【Ｆｉｇ．３８３】天然配列ＰＲＯ１８６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８３）を示す。配列番号：３８３は、ここで「ＤＮＡ８１７５７−２５１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８４】Ｆｉｇ．３８３に示した配列番号：３８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８４）を示す。
【Ｆｉｇ．３８５】天然配列ＰＲＯ１９２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８５）を示す。配列番号：３８５は、ここで「ＤＮＡ８２３０２−２５２９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８６】Ｆｉｇ．３８５に示した配列番号：３８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８６）を示す。
【Ｆｉｇ．３８７】天然配列ＰＲＯ１９２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８７）を示す。配列番号：３８７は、ここで「ＤＮＡ８２３４０−２５３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３８８】Ｆｉｇ．３８７に示した配列番号：３８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８８）を示す。
【Ｆｉｇ．３８９】天然配列ＰＲＯ２６３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８９）を示す。配列番号：３８９は、ここで「ＤＮＡ８３５５１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３９０】Ｆｉｇ．３８９に示した配列番号：３８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９０）を示す。
【Ｆｉｇ．３９１】天然配列ＰＲＯ３４４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９１）を示す。配列番号：３９１は、ここで「ＤＮＡ８７９９１−２５４０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３９２】Ｆｉｇ．３９１に示した配列番号：３９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９２）を示す。
【Ｆｉｇ．３９３】天然配列ＰＲＯ３３０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９３）を示す。配列番号：３９３は、ここで「ＤＮＡ８８００２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３９４】Ｆｉｇ．３９３に示した配列番号：３９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９４）を示す。
【Ｆｉｇ．３９５】天然配列ＰＲＯ３４４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９５）を示す。配列番号：３９５は、ここで「ＤＮＡ９２２３８−２５３９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３９６】Ｆｉｇ．３９５に示した配列番号：３９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９６）を示す。
【Ｆｉｇ．３９７】天然配列ＰＲＯ４９７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９７）を示す。配列番号：３９７は、ここで「ＤＮＡ９５９３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．３９８】Ｆｉｇ．３９７に示した配列番号：３９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９８）を示す。
【Ｆｉｇ．３９９】天然配列ＰＲＯ５８０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９９）を示す。配列番号：３９９は、ここで「ＤＮＡ１１５２９１−２６８１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４００】Ｆｉｇ．３９９に示した配列番号：３９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４００）を示す。
【Ｆｉｇ．４０１】天然配列ＰＲＯ１９６３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：４０１は、ここで「ＤＮＡ２３３３６−２８６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４０２】Ｆｉｇ．４０１に示した配列番号：４０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０２）を示す。
【Ｆｉｇ．４０３】天然配列ＰＲＯ２０３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０３）を示す。配列番号：４０３は、ここで「ＤＮＡ３０８６２−１３９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４０４】Ｆｉｇ．４０３に示した配列番号：４０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０４）を示す。
【Ｆｉｇ．４０５】天然配列ＰＲＯ２０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０５）を示す。配列番号：４０５は、ここで「ＤＮＡ３０８７１−１１５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４０６】Ｆｉｇ．４０５に示した配列番号：４０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０６）を示す。
【Ｆｉｇ．４０７】天然配列ＰＲＯ２１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０７）を示す。配列番号：４０７は、ここで「ＤＮＡ３２２７９−１１３１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４０８】Ｆｉｇ．４０７に示した配列番号：４０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０８）を示す。
【Ｆｉｇ．４０９】天然配列ＰＲＯ２２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０９）を示す。配列番号：４０９は、ここで「ＤＮＡ３３２０６−１１６５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４１０】Ｆｉｇ．４０９に示した配列番号：４０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１０）を示す。
【Ｆｉｇ．４１１】天然配列ＰＲＯ２４７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１１）を示す。配列番号：４１１は、ここで「ＤＮＡ３５６７３−１２０１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４１２】Ｆｉｇ．４１１に示した配列番号：４１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１２）を示す。
【Ｆｉｇ．４１３】天然配列ＰＲＯ３５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１３）を示す。配列番号：４１３は、ここで「ＤＮＡ４７３６１−１１５４−２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４１４】Ｆｉｇ．４１３に示した配列番号：４１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１４）を示す。
【Ｆｉｇ．４１５】天然配列ＰＲＯ７２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１５）を示す。配列番号：４１５は、ここで「ＤＮＡ４９６３１−１３２８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４１６】Ｆｉｇ．４１５に示した配列番号：４１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１６）を示す。
【Ｆｉｇ．４１７】天然配列ＰＲＯ８６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１７）を示す。配列番号：４１７は、ここで「ＤＮＡ５２５９４−１２７０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４１８】Ｆｉｇ．４１７に示した配列番号：４１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１８）を示す。
【Ｆｉｇ．４１９】天然配列ＰＲＯ７４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１９）を示す。配列番号：４１９は、ここで「ＤＮＡ５５８００−１２６３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２０】Ｆｉｇ．４１９に示した配列番号：４１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２０）を示す。
【Ｆｉｇ．４２１】天然配列ＰＲＯ１４７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２１）を示す。配列番号：４２１は、ここで「ＤＮＡ５６５３１−１６４８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２２】Ｆｉｇ．４２１に示した配列番号：４２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２２）を示す。
【Ｆｉｇ．４２３】天然配列ＰＲＯ１６２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２３）を示す。配列番号：４２３は、ここで「ＤＮＡ５６９６５−１３５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２４】Ｆｉｇ．４２３に示した配列番号：４２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２４）を示す。
【Ｆｉｇ．４２５】天然配列ＰＲＯ８２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２５）を示す。配列番号：４２５は、ここで「ＤＮＡ５７０３７−１４４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２６】Ｆｉｇ．４２５に示した配列番号：４２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２６）を示す。
【Ｆｉｇ．４２７】天然配列ＰＲＯ８１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２７）を示す。配列番号：４２７は、ここで「ＤＮＡ５７６９５−１３４０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４２８】Ｆｉｇ．４２７に示した配列番号：４２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２８）を示す。
【Ｆｉｇ．４２９】天然配列ＰＲＯ８１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２９）を示す。配列番号：４２９は、ここで「ＤＮＡ５７８３４−１３３９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４３０】Ｆｉｇ．４２９に示した配列番号：４２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３０）を示す。
【Ｆｉｇ．４３１】天然配列ＰＲＯ１１９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３１）を示す。配列番号：４３１は、ここで「ＤＮＡ５７８４１−１５２２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４３２】Ｆｉｇ．４３１に示した配列番号：４３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３２）を示す。
【Ｆｉｇ．４３３】天然配列ＰＲＯ８８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３３）を示す。配列番号：４３３は、ここで「ＤＮＡ５８１３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４３４】Ｆｉｇ．４３３に示した配列番号：４３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３４）を示す。
【Ｆｉｇ．４３５】天然配列ＰＲＯ１０７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３５）を示す。配列番号：４３５は、ここで「ＤＮＡ５８８４７−１３８３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４３６】Ｆｉｇ．４３５に示した配列番号：４３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３６）を示す。
【Ｆｉｇ．４３７】天然配列ＰＲＯ１０２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３７）を示す。配列番号：４３７は、ここで「ＤＮＡ５９４９３−１４２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４３８】Ｆｉｇ．４３７に示した配列番号：４３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３８）を示す。
【Ｆｉｇ．４３９】天然配列ＰＲＯ１１９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３９）を示す。配列番号：４３９は、ここで「ＤＮＡ５９５８６−１５２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４０】Ｆｉｇ．４３９に示した配列番号：４３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４０）を示す。
【Ｆｉｇ．４４１】天然配列ＰＲＯ４３３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４１）を示す。配列番号：４４１は、ここで「ＤＮＡ５９６０８−２５７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４２】Ｆｉｇ．４４１に示した配列番号：４４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４２）を示す。
【Ｆｉｇ．４４３】天然配列ＰＲＯ１１５５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４３）を示す。配列番号：４４３は、ここで「ＤＮＡ５９８４９−１５０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４４】Ｆｉｇ．４４３に示した配列番号：４４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４４）を示す。
【Ｆｉｇ．４４５】天然配列ＰＲＯ１１５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４５）を示す。配列番号：４４５は、ここで「ＤＮＡ６０２９２−１５０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４６】Ｆｉｇ．４４５に示した配列番号：４４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４６）を示す。
【Ｆｉｇ．４４７】天然配列ＰＲＯ１１２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４７）を示す。配列番号：４４７は、ここで「ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４４８】Ｆｉｇ．４４７に示した配列番号：４４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４８）を示す。
【Ｆｉｇ．４４９】天然配列ＰＲＯ１１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４９）を示す。配列番号：４４９は、ここで「ＤＮＡ６２８８０−１５１３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４５０】Ｆｉｇ．４４９に示した配列番号：４４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５０）を示す。
【Ｆｉｇ．４５１】天然配列ＰＲＯ１３３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５１）を示す。配列番号：４５１は、ここで「ＤＮＡ６６６７２−１５８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４５２】Ｆｉｇ．４５１に示した配列番号：４５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５２）を示す。
【Ｆｉｇ．４５３】天然配列ＰＲＯ１４８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５３）を示す。配列番号：４５３は、ここで「ＤＮＡ６７９６２−１６４９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４５４】Ｆｉｇ．４５３に示した配列番号：４５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５４）を示す。
【Ｆｉｇ．４５５】天然配列ＰＲＯ１９６４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５５）を示す。配列番号：４５５は、ここで「ＤＮＡ６９５５５−２８６７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４５６】Ｆｉｇ．４５５に示した配列番号：４５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５６）を示す。
【Ｆｉｇ．４５７】天然配列ＰＲＯ９７８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５７）を示す。配列番号：４５７は、ここで「ＤＮＡ７１１６２−２７６４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４５８】Ｆｉｇ．４５７に示した配列番号：４５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５８）を示す。
【Ｆｉｇ．４５９】天然配列ＰＲＯ１４１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５９）を示す。配列番号：４５９は、ここで「ＤＮＡ７１２９０−１６３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６０】Ｆｉｇ．４５９に示した配列番号：４５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６０）を示す。
【Ｆｉｇ．４６１】天然配列ＰＲＯ１５７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６１）を示す。配列番号：４６１は、ここで「ＤＮＡ７６４０１−１６８３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６２】Ｆｉｇ．４６１に示した配列番号：４６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６２）を示す。
【Ｆｉｇ．４６３】天然配列ＰＲＯ１５６７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６３）を示す。配列番号：４６３は、ここで「ＤＮＡ７６５４１−１６７５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６４】Ｆｉｇ．４６３に示した配列番号：４６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６４）を示す。
【Ｆｉｇ．４６５】天然配列ＰＲＯ１８９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６５）を示す。配列番号：４６５は、ここで「ＤＮＡ７６７８８−２５２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６６】Ｆｉｇ．４６５に示した配列番号：４６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６６）を示す。
【Ｆｉｇ．４６７】天然配列ＰＲＯ１８８９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６７）を示す。配列番号：４６７は、ここで「ＤＮＡ７７６２３−２５２４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４６８】Ｆｉｇ．４６７に示した配列番号：４６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６８）を示す。
【Ｆｉｇ．４６９】天然配列ＰＲＯ１７８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６９）を示す。配列番号：４６９は、ここで「ＤＮＡ８０１３６−２５０３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４７０】Ｆｉｇ．４６９に示した配列番号：４６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７０）を示す。
【Ｆｉｇ．４７１】天然配列ＰＲＯ６００３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７１）を示す。配列番号：４７１は、ここで「ＤＮＡ８３５６８−２６９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４７２】Ｆｉｇ．４７１に示した配列番号：４７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７２）を示す。
【Ｆｉｇ．４７３】天然配列ＰＲＯ４３３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７３）を示す。配列番号：４７３は、ここで「ＤＮＡ８４２１０−２５７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４７４】Ｆｉｇ．４７３に示した配列番号：４７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７４）を示す。
【Ｆｉｇ．４７５】天然配列ＰＲＯ４３５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７５）を示す。配列番号：４７５は、ここで「ＤＮＡ８６５７６−２５９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４７６】Ｆｉｇ．４７５に示した配列番号：４７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７６）を示す。
【Ｆｉｇ．４７７】天然配列ＰＲＯ４３５２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７７）を示す。配列番号：４７７は、ここで「ＤＮＡ８７９７６−２５９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４７８】Ｆｉｇ．４７７に示した配列番号：４７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７８）を示す。
【Ｆｉｇ．４７９】天然配列ＰＲＯ４３５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７９）を示す。配列番号：４７９は、ここで「ＤＮＡ９２２５６−２５９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８０】Ｆｉｇ．４７９に示した配列番号：４７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８０）を示す。
【Ｆｉｇ．４８１】天然配列ＰＲＯ４３６９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８１）を示す。配列番号：４８１は、ここで「ＤＮＡ９２２８９−２５９８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８２】Ｆｉｇ．４８１に示した配列番号：４８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８２）を示す。
【Ｆｉｇ．４８３】天然配列ＰＲＯ６０３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８３）を示す。配列番号：４８３は、ここで「ＤＮＡ９６８５０−２７０５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８４】Ｆｉｇ．４８３に示した配列番号：４８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８４）を示す。
【Ｆｉｇ．４８５】天然配列ＰＲＯ４４３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８５）を示す。配列番号：４８５は、ここで「ＤＮＡ９６８５５−２６２９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８６】Ｆｉｇ．４８５に示した配列番号：４８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８６）を示す。
【Ｆｉｇ．４８７】天然配列ＰＲＯ４４２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８７）を示す。配列番号：４８７は、ここで「ＤＮＡ９６８５７−２６３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４８８】Ｆｉｇ．４８７に示した配列番号：４８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８８）を示す。
【Ｆｉｇ．４８９】天然配列ＰＲＯ６０１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８９）を示す。配列番号：４８９は、ここで「ＤＮＡ９６８６０−２７００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４９０】Ｆｉｇ．４８９に示した配列番号：４８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９０）を示す。
【Ｆｉｇ．４９１】天然配列ＰＲＯ１９５６３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９１）を示す。配列番号：４９１は、ここで「ＤＮＡ９６８６１−２８４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４９２】Ｆｉｇ．４９１に示した配列番号：４９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９２）を示す。
【Ｆｉｇ．４９３】天然配列ＰＲＯ６０１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９３）を示す。配列番号：４９３は、ここで「ＤＮＡ９６８６６−２６９８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４９４】Ｆｉｇ．４９３に示した配列番号：４９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９４）を示す。
【Ｆｉｇ．４９５】天然配列ＰＲＯ５７７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９５）を示す。配列番号：４９５は、ここで「ＤＮＡ９６８７０−２６７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４９６】Ｆｉｇ．４９５に示した配列番号：４９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９６）を示す。
【Ｆｉｇ．４９７】天然配列ＰＲＯ５７７６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９７）を示す。配列番号：４９７は、ここで「ＤＮＡ９６８７２−２６７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．４９８】Ｆｉｇ．４９７に示した配列番号：４９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９８）を示す。
【Ｆｉｇ．４９９】天然配列ＰＲＯ４４３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９９）を示す。配列番号：４９９は、ここで「ＤＮＡ９６８７８−２６２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５００】Ｆｉｇ．４９９に示した配列番号：４９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５００）を示す。
【Ｆｉｇ．５０１】天然配列ＰＲＯ４４２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：５０１は、ここで「ＤＮＡ９６８７９−２６１９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５０２】Ｆｉｇ．５０１に示した配列番号：５０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０２）を示す。
【Ｆｉｇ．５０３】天然配列ＰＲＯ４４９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０３）を示す。配列番号：５０３は、ここで「ＤＮＡ９６８８９−２６４１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５０４】Ｆｉｇ．５０３に示した配列番号：５０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０４）を示す。
【Ｆｉｇ．５０５】天然配列ＰＲＯ４４２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０５）を示す。配列番号：５０５は、ここで「ＤＮＡ９６８９３−２６２１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５０６】Ｆｉｇ．５０５に示した配列番号：５０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０６）を示す。
【Ｆｉｇ．５０７】天然配列ＰＲＯ５９９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０７）を示す。配列番号：５０７は、ここで「ＤＮＡ９６８９７−２６８８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５０８】Ｆｉｇ．５０７に示した配列番号：５０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０８）を示す。
【Ｆｉｇ．５０９】天然配列ＰＲＯ４５０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０９）を示す。配列番号：５０９は、ここで「ＤＮＡ９８５６４−２６４３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５１０】Ｆｉｇ．５０９に示した配列番号：５０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１０）を示す。
【Ｆｉｇ．５１１】天然配列ＰＲＯ６２４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１１）を示す。配列番号：５１１は、ここで「ＤＮＡ１０７４４３−２７１８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５１２】Ｆｉｇ．５１１に示した配列番号：５１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１２）を示す。
【Ｆｉｇ．５１３】天然配列ＰＲＯ６２４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１３）を示す。配列番号：５１３は、ここで「ＤＮＡ１０７７８６−２７２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５１４】Ｆｉｇ．５１３に示した配列番号：５１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１４）を示す。
【Ｆｉｇ．５１５】天然配列ＰＲＯ６１７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１５）を示す。配列番号：５１５は、ここで「ＤＮＡ１０８６８２−２７１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５１６】Ｆｉｇ．５１５に示した配列番号：５１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１６）を示す。
【Ｆｉｇ．５１７】天然配列ＰＲＯ９７４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１７）を示す。配列番号：５１７は、ここで「ＤＮＡ１０８６８４−２７６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５１８】Ｆｉｇ．５１７に示した配列番号：５１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１８）を示す。
【Ｆｉｇ．５１９】天然配列ＰＲＯ７１７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１９）を示す。配列番号：５１９は、ここで「ＤＮＡ１０８７０１−２７４９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２０】Ｆｉｇ．５１９に示した配列番号：５１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２０）を示す。
【Ｆｉｇ．５２１】天然配列ＰＲＯ６２３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２１）を示す。配列番号：５２１は、ここで「ＤＮＡ１０８７２０−２７１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２２】Ｆｉｇ．５２１に示した配列番号：５２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２２）を示す。
【Ｆｉｇ．５２３】天然配列ＰＲＯ６４９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２３）を示す。配列番号：５２３は、ここで「ＤＮＡ１０８７２６−２７２９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２４】Ｆｉｇ．５２３に示した配列番号：５２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２４）を示す。
【Ｆｉｇ．５２５Ａ−５２５Ｂ】天然配列ＰＲＯ９７４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２５）を示す。配列番号：５２５は、ここで「ＤＮＡ１０８７２８−２７６０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２６】Ｆｉｇ．５２５Ａ−５２５Ｂに示した配列番号：５２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２６）を示す。
【Ｆｉｇ．５２７】天然配列ＰＲＯ９８２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２７）を示す。配列番号：５２７は、ここで「ＤＮＡ１０８７３８−２７６７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５２８】Ｆｉｇ．５２７に示した配列番号：５２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２８）を示す。
【Ｆｉｇ．５２９】天然配列ＰＲＯ６２４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２９）を示す。配列番号：５２９は、ここで「ＤＮＡ１０８７４３−２７２２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５３０】Ｆｉｇ．５２９に示した配列番号：５２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３０）を示す。
【Ｆｉｇ．５３１】天然配列ＰＲＯ９７４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３１）を示す。配列番号：５３１は、ここで「ＤＮＡ１０８７５８−２７５９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５３２】Ｆｉｇ．５３１に示した配列番号：５３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３２）を示す。
【Ｆｉｇ．５３３】天然配列ＰＲＯ９７３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３３）を示す。配列番号：５３３は、ここで「ＤＮＡ１０８７６５−２７５８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５３４】Ｆｉｇ．５３３に示した配列番号：５３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３４）を示す。
【Ｆｉｇ．５３５】天然配列ＰＲＯ７１７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３５）を示す。配列番号：５３５は、ここで「ＤＮＡ１０８７８３−２７４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５３６】Ｆｉｇ．５３５に示した配列番号：５３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３６）を示す。
【Ｆｉｇ．５３７】天然配列ＰＲＯ７１７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３７）を示す。配列番号：５３７は、ここで「ＤＮＡ１０８７８９−２７４８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５３８】Ｆｉｇ．５３７に示した配列番号：５３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３８）を示す。
【Ｆｉｇ．５３９】天然配列ＰＲＯ６２４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３９）を示す。配列番号：５３９は、ここで「ＤＮＡ１０８８０６−２７２４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４０】Ｆｉｇ．５３９に示した配列番号：５３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４０）を示す。
【Ｆｉｇ．５４１】天然配列ＰＲＯ６２４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４１）を示す。配列番号：５４１は、ここで「ＤＮＡ１０８９３６−２７１９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４２】Ｆｉｇ．５４１に示した配列番号：５４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４２）を示す。
【Ｆｉｇ．５４３】天然配列ＰＲＯ９８３５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４３）を示す。配列番号：５４３は、ここで「ＤＮＡ１１９５１０−２７７１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４４】Ｆｉｇ．５４３に示した配列番号：５４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４４）を示す。
【Ｆｉｇ．５４５】天然配列ＰＲＯ９８５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４５）を示す。配列番号：５４５は、ここで「ＤＮＡ１１９５１７−２７７８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４６】Ｆｉｇ．５４５に示した配列番号：５４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４６）を示す。
【Ｆｉｇ．５４７】天然配列ＰＲＯ７４３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４７）を示す。配列番号：５４７は、ここで「ＤＮＡ１１９５３５−２７５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５４８】Ｆｉｇ．５４７に示した配列番号：５４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４８）を示す。
【Ｆｉｇ．５４９】天然配列ＰＲＯ９８５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４９）を示す。配列番号：５４９は、ここで「ＤＮＡ１１９５３７−２７７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５５０】Ｆｉｇ．５４９に示した配列番号：５４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５０）を示す。
【Ｆｉｇ．５５１】天然配列ＰＲＯ１９６０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５１）を示す。配列番号：５５１は、ここで「ＤＮＡ１１９７１４−２８５１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５５２】Ｆｉｇ．５５１に示した配列番号：５５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５２）を示す。
【Ｆｉｇ．５５３】天然配列ＰＲＯ９８５９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５３）を示す。配列番号：５５３は、ここで「ＤＮＡ１２５１７０−２７８０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５５４】Ｆｉｇ．５５３に示した配列番号：５５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５４）を示す。
【Ｆｉｇ．５５５】天然配列ＰＲＯ１２９７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５５）を示す。配列番号：５５５は、ここで「ＤＮＡ１２９５９４−２８４１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５５６】Ｆｉｇ．５５５に示した配列番号：５５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５６）を示す。
【Ｆｉｇ．５５７】天然配列ＰＲＯ１９６２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５７）を示す。配列番号：５５７は、ここで「ＤＮＡ１２９７９３−２８５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５５８】Ｆｉｇ．５５７に示した配列番号：５５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５８）を示す。
【Ｆｉｇ．５５９】天然配列ＰＲＯ９８３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５９）を示す。配列番号：５５９は、ここで「ＤＮＡ１３０８０９−２７６９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６０】Ｆｉｇ．５５９に示した配列番号：５５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６０）を示す。
【Ｆｉｇ．５６１】天然配列ＰＲＯ１９６７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６１）を示す。配列番号：５６１は、ここで「ＤＮＡ１３１６３９−２８７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６２】Ｆｉｇ．５６１に示した配列番号：５６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６２）を示す。
【Ｆｉｇ．５６３】天然配列ＰＲＯ１９６２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６３）を示す。配列番号：５６３は、ここで「ＤＮＡ１３１６４９−２８５５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６４】Ｆｉｇ．５６３に示した配列番号：５６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６４）を示す。
【Ｆｉｇ．５６５】天然配列ＰＲＯ１９６８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６５）を示す。配列番号：５６５は、ここで「ＤＮＡ１３１６５２−２８７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６６】Ｆｉｇ．５６５に示した配列番号：５６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６６）を示す。
【Ｆｉｇ．５６７】天然配列ＰＲＯ１９６７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６７）を示す。配列番号：５６７は、ここで「ＤＮＡ１３１６５８−２８７５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５６８】Ｆｉｇ．５６７に示した配列番号：５６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６８）を示す。
【Ｆｉｇ．５６９】天然配列ＰＲＯ９８３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６９）を示す。配列番号：５６９は、ここで「ＤＮＡ１３２１６２−２７７０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５７０】Ｆｉｇ．５６９に示した配列番号：５６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７０）を示す。
【Ｆｉｇ．５７１】天然配列ＰＲＯ９７４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７１）を示す。配列番号：５７１は、ここで「ＤＮＡ１３６１１０−２７６３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５７２】Ｆｉｇ．５７１に示した配列番号：５７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７２）を示す。
【Ｆｉｇ．５７３】天然配列ＰＲＯ１９６４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７３）を示す。配列番号：５７３は、ここで「ＤＮＡ１３９５９２−２８６６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５７４】Ｆｉｇ．５７３に示した配列番号：５７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７４）を示す。
【Ｆｉｇ．５７５】天然配列ＰＲＯ１９６２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７５）を示す。配列番号：５７５は、ここで「ＤＮＡ１３９６０８−２８５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５７６】Ｆｉｇ．５７５に示した配列番号：５７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７６）を示す。
【Ｆｉｇ．５７７】天然配列ＰＲＯ１９５９７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７７）を示す。配列番号：５７７は、ここで「ＤＮＡ１４３２９２−２８４８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５７８】Ｆｉｇ．５７７に示した配列番号：５７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７８）を示す。
【Ｆｉｇ．５７９】天然配列ＰＲＯ１６０９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７９）を示す。配列番号：５７９は、ここで「ＤＮＡ１４４８４４−２８４３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８０】Ｆｉｇ．５７９に示した配列番号：５７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８０）を示す。
【Ｆｉｇ．５８１】天然配列ＰＲＯ１９５７６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５８１）を示す。配列番号：５８１は、ここで「ＤＮＡ１４４８５７−２８４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８２】Ｆｉｇ．５８１に示した配列番号：５８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８２）を示す。
【Ｆｉｇ．５８３】天然配列ＰＲＯ１９６４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５８３）を示す。配列番号：５８３は、ここで「ＤＮＡ１４５８４１−２８６８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８４】Ｆｉｇ．５８３に示した配列番号：５８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８４）を示す。
【Ｆｉｇ．５８５】天然配列ＰＲＯ１９８１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５８５）を示す。配列番号：５８５は、ここで「ＤＮＡ１４８００４−２８８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８６】Ｆｉｇ．５８５に示した配列番号：５８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８６）を示す。
【Ｆｉｇ．５８７】天然配列ＰＲＯ１９６６９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５８７）を示す。配列番号：５８７は、ここで「ＤＮＡ１４９８９３−２８７３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５８８】Ｆｉｇ．５８７に示した配列番号：５８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８８）を示す。
【Ｆｉｇ．５８９】天然配列ＰＲＯ１９８１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５８９）を示す。配列番号：５８９は、ここで「ＤＮＡ１４９９３０−２８８４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５９０】Ｆｉｇ．５８９に示した配列番号：５８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９０）を示す。
【Ｆｉｇ．５９１】天然配列ＰＲＯ２００８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９１）を示す。配列番号：５９１は、ここで「ＤＮＡ１５０１５７−２８９８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５９２】Ｆｉｇ．５９１に示した配列番号：５９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９２）を示す。
【Ｆｉｇ．５９３】天然配列ＰＲＯ１６０８９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９３）を示す。配列番号：５９３は、ここで「ＤＮＡ１５０１６３−２８４２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５９４】Ｆｉｇ．５９３に示した配列番号：５９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９４）を示す。
【Ｆｉｇ．５９５】天然配列ＰＲＯ２００２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９５）を示す。配列番号：５９５は、ここで「ＤＮＡ１５３５７９−２８９４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５９６】Ｆｉｇ．５９５に示した配列番号：５９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９６）を示す。
【Ｆｉｇ．５９７】天然配列ＰＲＯ２００４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９７）を示す。配列番号：５９７は、ここで「ＤＮＡ１６４６２５−２８９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．５９８】Ｆｉｇ．５９７に示した配列番号：５９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５９８）を示す。
【Ｆｉｇ．５９９】天然配列ＰＲＯ７９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９９）を示す。配列番号：５９９は、ここで「ＤＮＡ５７８３８−１３３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６００】Ｆｉｇ．５９９に示した配列番号：５９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６００）を示す。
【Ｆｉｇ．６０１】天然配列ＰＲＯ１１３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示す。配列番号：６０１は、ここで「ＤＮＡ５９７７７−１４８０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６０２】Ｆｉｇ．６０１に示した配列番号：６０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０２）を示す。
【Ｆｉｇ．６０３】天然配列ＰＲＯ１３４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６０３）を示す。配列番号：６０３は、ここで「ＤＮＡ６６６７５−１５８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６０４】Ｆｉｇ．６０３に示した配列番号：６０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０４）を示す。
【Ｆｉｇ．６０５】天然配列ＰＲＯ１７６０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６０５）を示す。配列番号：６０５は、ここで「ＤＮＡ７６５３２−１７０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６０６】Ｆｉｇ．６０５に示した配列番号：６０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０６）を示す。
【Ｆｉｇ．６０７】天然配列ＰＲＯ６０２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６０７）を示す。配列番号：６０７は、ここで「ＤＮＡ１０５８４９−２７０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６０８】Ｆｉｇ．６０７に示した配列番号：６０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０８）を示す。
【Ｆｉｇ．６０９】天然配列ＰＲＯ１８０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６０９）を示す。配列番号：６０９は、ここで「ＤＮＡ８３５００−２５０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ．６１０】Ｆｉｇ．６０９に示した配列番号：６０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６１０）を示す。[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates generally to the identification and isolation of novel DNA and the recombinant production of novel polypeptides.
[0002]
(Background of the Invention)
Extracellular proteins play a particularly important role in the formation, differentiation and maintenance of multicellular organisms. The fate of many individual cells, such as proliferation, migration, differentiation or interaction with other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. This information is often transmitted by secreted polypeptides (eg, mitogens, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones), which in turn are received by a variety of cellular receptors or membrane-bound proteins. Is interpreted. These secreted polypeptides or signal molecules usually pass through the cell secretory pathway to reach their site of action in the extracellular environment.
Secreted proteins have various industrial uses, including pharmaceuticals, diagnostics, biosensors and bioreactors. Most currently available protein drugs, such as thrombolytics, interferons, interleukins, erythropoietin, colony stimulating factors, and various other cytokines, are secreted proteins. In addition, these receptors, which are membrane proteins, have potential as therapeutic or diagnostic agents. Efforts have been made by both industry and academia to identify new native secreted proteins. Much effort has been devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify coding sequences for novel secreted proteins. Examples of screening methods and techniques are described in the literature [see, for example, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93; 7108-7113 (1996); U.S. Patent No. 5,536,637].
[0003]
Membrane-bound proteins and receptors play important roles in the formation, differentiation and maintenance of multicellular organisms. The fate of many individual cells, such as proliferation, migration, differentiation or interaction with other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. This information is often transmitted by secreted polypeptides (eg, mitogens, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones), which are then received by various cell receptors or membrane-bound proteins. Will be interpreted. Such membrane-bound proteins and cell receptors include, but are not limited to, cytokine receptors, receptor kinases, receptor phosphatases, receptors involved in cell-cell interactions, and cell adhesion such as selectins and integrins. Including molecules. For example, the transmission of signals that regulate cell growth and differentiation is partially regulated by phosphorylation of various cellular proteins. Protein tyrosine kinase, an enzyme that catalyzes the process, also acts as a growth factor receptor. Specific examples include fibroblast growth factor and nerve growth factor receptor.
Membrane-bound proteins and receptor molecules have various industrial applications, including pharmaceutical and diagnostic agents. For example, receptor immunoadhesins can be used as therapeutics to block receptor-ligand interactions. Membrane-bound proteins can also be used to screen for potential peptide or small molecule inhibitors of relevant receptor / ligand interactions.
Efforts have been made by both industry and academia to identify new natural receptors or membrane-bound proteins. Much effort has been devoted to screening recombinant mammalian DNA libraries to identify coding sequences for novel receptors or membrane-bound proteins.
[0004]
(Summary of the Invention)
In one embodiment, the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.
In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full-length amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a transmembrane protein disclosed herein with or without a signal peptide. A DNA molecule encoding a PRO polypeptide having the extracellular domain of any of the full-length amino acid sequences disclosed herein, or the complement of the DNA molecule of (b) (a). At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% Nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity; Or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% Or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, Alternatively, it comprises a nucleotide sequence having at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity.
[0005]
In another aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a coding sequence for a full-length PRO polypeptide cDNA disclosed herein, a coding sequence for a PRO polypeptide DNA lacking a signal peptide disclosed herein, a signal peptide. A DNA molecule comprising the coding sequence of the extracellular domain of the transmembrane PRO polypeptide disclosed herein, with or without, or any other defined fragment of the full length amino acid sequence disclosed herein; or (b) )) At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83%, to the complement of the DNA molecule of (a). % Nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity. Or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% % Nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity Or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% A nucleotide sequence having the nucleic acid sequence identity of
[0006]
In a further aspect, the invention relates to (a) a DNA molecule encoding the same mature polypeptide encoded by any human protein cDNA deposited with the ATTC disclosed herein, or (b) a DNA molecule of (a). At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity to the complement of Alternatively, at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% Nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% Nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or At least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having sequence identity.
[0007]
Another aspect of the present invention relates to a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide in which either the transmembrane domain is deleted or the transmembrane domain is inactivated, or a nucleotide sequence complementary to such an encoded nucleotide sequence. Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a transmembrane domain of such a polypeptide disclosed herein. Accordingly, the soluble extracellular domains of the PRO polypeptides described herein are contemplated.
[0008]
Other embodiments are directed to fragments of the PRO polypeptide coding sequence, or complement thereof, for example, hybridization of a coding fragment of a PRO polypeptide, optionally encoding a polypeptide comprising a binding site for an anti-PRO antibody. It finds use as a probe or as an antisense oligonucleotide probe. Such nucleic acid fragments are usually at least about 20 nucleotides in length, or at least about 30 nucleotides in length, or at least about 40 nucleotides in length, or at least about 50 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 70 nucleotides in length. Alternatively, at least about 80 nucleotides, or at least about 90 nucleotides, or at least about 100 nucleotides, or at least about 110 nucleotides, or at least about 120 nucleotides, or at least about 130 nucleotides, or at least about 140 nucleotides, or At least about 150 nucleotides in length, or at least about 160 nucleotides in length, or at least about 170 nucleotides in length. Or at least about 180 nucleotides, or at least about 190 nucleotides, or at least about 200 nucleotides, or at least about 250 nucleotides, or at least about 300 nucleotides, or at least about 350 nucleotides, or at least about 400 nucleotides. Length, or at least about 450 nucleotides in length, or at least about 500 nucleotides in length, or at least about 600 nucleotides in length, or at least about 700 nucleotides in length, or at least about 800 nucleotides in length, or at least about 900 nucleotides in length, or at least about 1000 nucleotides in length. Where the content of the word "about" is the plus or minus of the referenced length. It is meant to refer to nucleotide sequence length 0%. Novel fragments of the PRO polypeptide encoding nucleotide sequence can be prepared by aligning the PRO polypeptide encoding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs. By determining whether a PRO polypeptide encoding nucleotide sequence fragment is novel, it may be identified in a routine manner. All such PRO polypeptide encoding nucleotide sequences are contemplated herein. Also contemplated are the PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably the PRO polypeptide fragments that include a binding site for an anti-PRO antibody.
[0009]
In another embodiment, the present invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any of the above-identified isolated nucleic acid sequences.
In one aspect, the invention relates to the extracellular sequences of the full-length amino acid sequences disclosed herein, the amino acid sequences lacking the signal peptides disclosed herein, the transmembrane proteins with or without the signal peptides disclosed herein. At least about 80% amino acid sequence identity to a PRO polypeptide having a domain, or other specifically identified fragment of the full length amino acid sequence disclosed herein, or at least about 81% amino acid sequence identity; or At least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid Sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity Or at least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% Amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, Alternatively, an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. .
[0010]
In a further aspect, the invention provides an amino acid sequence having at least about 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC disclosed herein, or at least about 81% amino acid sequence. Identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity Gender or low At least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid Sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. An isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having the same.
[0011]
In a particular aspect, the invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence as described above without an N-terminal signal sequence and / or an initiation methionine. Methods for making them are also described herein, including culturing host cells containing a vector containing the appropriate encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and removing the PRO polypeptide from the culture medium. Recovering.
Another aspect of the invention provides an isolated PRO polypeptide in which either the transmembrane domain is deleted or the transmembrane domain is inactivated. Also described herein is a method of producing the same, comprising culturing a host cell containing a vector containing the appropriate encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and converting the PRO polypeptide from the cell culture medium. Including collecting.
[0012]
In yet another embodiment, the invention relates to agonists and antagonists of the native PRO polypeptides identified herein. In a particular embodiment, the agonist or antagonist is an anti-PRO antibody or small molecule.
In a further embodiment, the present invention relates to a method of identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide, comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring a biological activity mediated by said PRO polypeptide. including. Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
In yet a further embodiment, the invention relates to a composition comprising a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist of a PRO polypeptide described herein, or an anti-PRO antibody in combination with a carrier. In some cases, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
[0013]
Another embodiment of the present invention is directed to the treatment of a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody, as described above, for a condition responsive to the PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody. It is directed to use for the preparation of useful medicaments.
In a further embodiment of the present invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the polypeptides described herein. Host cells containing any such vectors are also provided. By way of example, the host cell may be a CHO cell, E. coli, or yeast. Further provided are methods for producing any of the polypeptides described herein, which include culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture medium. Including.
[0014]
In another embodiment, the invention provides a chimeric molecule comprising any of the polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the polypeptides described herein fused to an epitope tag sequence or the Fc region of an immunoglobulin.
In another embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to any of the above or below polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment, or a single chain antibody.
In yet another embodiment, the invention provides oligonucleotide probes useful for isolating genomic and cDNA nucleotide sequences or antisense probes, wherein the probes are derived from any of the above or below nucleotide sequences. sell.
In yet another embodiment, the invention relates to the use of the PRO polypeptides of the invention for various uses based on the functional biological assay data set forth in the Examples below.
[0015]
(Detailed description of preferred embodiments)
I. Definition
As used herein, the terms "PRO polypeptide" and "PRO" refer to various polypeptides when preceded by a numerical code, with the full code (i.e., PRO / number) used herein. Means the particular polypeptide sequence described in The terms "PRO / number polypeptide" and "PRO / number" as used herein, where "number" is the actual numerical symbol used herein, refer to native sequence polypeptides and variants (as further detailed herein). Defined). The PRO polypeptides described herein may be isolated from a variety of sources, such as human tissue types or other sources, and may be prepared by recombinant or synthetic methods. The term "PRO polypeptide" refers to each individual PRO / number polypeptide disclosed herein. All disclosures in this specification that refer to "PRO polypeptides" refer to each polypeptide individually or in combination. For example, description of a preparation, purification, induction, formation of antibodies, administration, containing composition, treatment of disease, etc., pertains individually to each polypeptide of the invention. The term "PRO polypeptide" also includes variants of the PRO / number polypeptides disclosed herein.
[0016]
A "native sequence PRO polypeptide" includes a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence PRO polypeptide” specifically refers to naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences), naturally occurring mutant forms (eg, alternatively spliced) of a particular PRO polypeptide. Forms) and naturally occurring allelic variants of the polypeptide. In various embodiments of the invention, the native sequence PRO polypeptide disclosed herein is a mature or full-length native sequence polypeptide containing the full-length amino acid sequence shown in the associated figure. Start and stop codons are shown in bold typeface and underlined in the figure. However, while the PRO polypeptide disclosed in the associated figure is shown to begin at a methionine residue at amino acid position 1 of the figure, other polypeptides located either upstream or downstream of amino acid position 1 of the figure are shown. It is possible and possible that a methionine residue is used as the starting amino acid residue of the PRO polypeptide.
[0017]
A PRO polypeptide “extracellular domain” or “ECD” refers to a form of a PRO polypeptide that has substantially no transmembrane and cytoplasmic domains. Usually, PRO polypeptide ECDs have less than 1% of their transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of such domains. It will be appreciated that any transmembrane domain identified for a PRO polypeptide of the present invention will be identified according to the criteria routinely used in the art to identify its type of hydrophobic domain. . The exact boundaries of the transmembrane domain can vary, but will likely not exceed about 5 amino acids from the end of either of the initially identified domains. Accordingly, the PRO polypeptide extracellular domain can optionally comprise no more than about 5 amino acids from the terminus of any of the transmembrane domains identified in the examples or herein, and have an attachment signal peptide. Such polypeptides with or without, and the nucleic acids encoding them, are contemplated in the present invention.
[0018]
Suitable locations for the "signal peptides" of the various PRO polypeptides disclosed herein are provided herein and in the accompanying drawings. However, as noted, the C-terminal boundary of the signal peptide can vary, but most likely is less than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide as defined herein. Highly, the C-terminal boundary of the signal peptide can be identified according to the criteria routinely used to identify such types of amino acid sequence components (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6). (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986). In addition, it is also noted that in some cases, cleavage of the signal peptide from the secreted polypeptide is not completely uniform, resulting in one or more secreted species. These mature polypeptides, in which the signal peptide is cleaved within less than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide as defined herein, and the polynucleotides that encode them, are contemplated by the present invention. You.
[0019]
“PRO polypeptide variant” refers to a full-length native sequence PRO polypeptide disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a signal, as defined above or below. An active PRO polypeptide having at least about 80% amino acid sequence identity with the extracellular domain of the PRO disclosed herein, with or without peptide, or other fragments of the full-length PRO polypeptide disclosed herein. Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides in which one or more amino acid residues have been added or deleted at the N- or C-terminus of the full length native amino acid sequence. Generally, a PRO polypeptide variant comprises a full-length native amino acid sequence disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, a PRO disclosed herein with or without a signal peptide. At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or at least about 82%, with an extracellular domain or other specifically identified fragment of a full-length PRO polypeptide disclosed herein. Amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence identity, or At least about 87% amino acid sequence identity; Or at least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% Amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, Alternatively, they have at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the PRO variant polypeptide is at least about 10 amino acids in length, or at least about 20 amino acids in length, or at least about 30 amino acids in length, or at least about 40 amino acids in length, or at least about 50 amino acids in length, or at least about 60 amino acids in length. Or at least about 70 amino acids in length, or at least about 80 amino acids in length, or at least about 90 amino acids in length, or at least about 100 amino acids in length, or at least about 150 amino acids in length, or at least about 200 amino acids in length, or at least about 300 amino acids in length, Or more.
[0020]
"Percent (%) amino acid sequence identity", as identified herein for a PRO polypeptide as defined herein, aligns the sequences and introduces gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity. However, any conservative substitutions are defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues of the PRO polypeptide without considering them as part of the sequence identity. Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, eg, publicly available such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megaalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using computer software. One of skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein, the% amino acid sequence identity values were determined by using the sequence comparison program ALIGN-2, the complete source code for which is provided in Table 1 below. can get. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code shown in Table 1 below was obtained from the US Copyright Office, Washington, D.C. C. , 20559, along with user documentation and is registered under U.S. Copyright No. TXU5110087. ALIGN-2 is suitably available from Genentech, Inc., South San Francisco, CA and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX® operating system, preferably digital UNIX® V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0021]
In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparisons, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity thereto (or the given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score that is the same as the score according to the alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be different from the percent amino acid sequence identity of B to A. As an example of calculating percent amino acid sequence identity using this method, "PRO" represents the amino acid sequence of the hypothetical PRO polypeptide of interest, and "comparative protein" is compared to the "comparative" protein of interest. And "X", "Y" and "Z" each represent a different hypothetical amino acid residue, and Tables 2 and 3 show the amino acid sequence "PRO""A method for calculating percent amino acid sequence identity to an amino acid sequence referred to as". "
[0022]
Unless otherwise specified, all% amino acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% amino acid sequence identity values may be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Further, most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When WU-BLAST2 was used, the% amino acid sequence identity value was calculated using (a) the amino acid sequence of the subject PRO polypeptide having a sequence derived from the native PRO polypeptide, and the comparative amino acid sequence of interest. The number of identical identical amino acid residues determined by WU-BLAST-2 between the sequence (ie, the sequence in which the PRO polypeptide of interest may be the PRO polypeptide variant to which it is compared) is determined by ( b) Determined by the quotient divided by the total number of residues of the PRO polypeptide of interest. For example, in the expression "a polypeptide comprising amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B", amino acid sequence A is the comparison amino acid sequence of interest; Amino acid sequence B is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest.
[0023]
% Amino acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov or otherwise obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = possible, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5. , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
[0024]
In situations where NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the percent amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with or to a given amino acid sequence B (or with a given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with being identical by the alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be different from the percent amino acid sequence identity of B to A.
[0025]
A “PRO variant polynucleotide” or “PRO variant nucleic acid sequence” is a nucleic acid molecule that encodes an active PRO polypeptide, as defined below, comprising the full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, A full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a PRO polypeptide disclosed herein with or without a signal peptide, or any other of the full-length PRO polypeptide sequences disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, preferably or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence to a nucleic acid sequence encoding a fragment of Identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or At least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid Sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least About 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence Have identity and / or at least about 99% nucleic acid sequence identity Variants do not include the native nucleotide sequence.
[0026]
Typically, the PRO variant polynucleotide is at least about 30 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 90 nucleotides in length, or at least about 120 nucleotides in length, or at least about 150 nucleotides in length, or at least about 180 nucleotides in length. Or at least about 210 nucleotides in length, or at least about 240 nucleotides in length, or at least about 270 nucleotides in length, or at least about 300 nucleotides in length, or at least about 450 nucleotides in length, or at least about 600 nucleotides in length, or at least about 900 nucleotides in length; Or more.
[0027]
"Percent (%) nucleic acid sequence identity" to a PRO-encoding nucleic acid sequence identified herein refers to the alignment of the sequences, introducing gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity, and the nucleotides of the PRO sequence. Is defined as the percentage of nucleotides in the candidate sequence that are identical to Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity can be obtained by various methods within the purview of those skilled in the art, for example, publicly available computers such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megaalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using software. For the purposes herein,% amino acid sequence identity values are obtained by using the sequence comparison program ALIGN-2, whose complete source code for the ALIGN-2 program is provided in Table 1 below. . The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code shown in Table 1 below was obtained from the US Copyright Office, Washington, D.C. C. , 20559, along with user documentation and is registered under U.S. Copyright No. TXU510087. ALIGN-2 is suitably available from Genentech, Inc., South San Francisco, CA and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use with a UNIX® operating system, preferably digital UNIX® V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0028]
In situations where ALIGN-2 is used for nucleic acid sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of a given nucleic acid sequence C to or to a given nucleic acid sequence D (or alternatively to a given amino acid sequence D, or On the other hand, a given nucleic acid sequence C with or including some% nucleic acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleic acid residues having a score consistent with being identical by the alignment of C and D of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleic acid residues of D. It will be appreciated that when the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the amino acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D is different from the% nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of calculating percent nucleic acid sequence identity using this method, "PRO-DNA" represents a hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, and "Comparative DNA" is a nucleic acid molecule of "PRO-DNA" of interest. Represents the nucleic acid sequence being compared, and "N", "L" and "V" each represent a different hypothetical amino acid residue, and Tables 4 and 5 refer to the nucleic acid sequence designated as "Comparative DNA". 2 shows a method for calculating% nucleic acid sequence identity to a nucleic acid sequence referred to as “PRO-DNA”.
[0029]
Unless otherwise specified, all% nucleic acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as shown in the immediately preceding paragraph. However,% nucleic acid sequence identity values may be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Further, most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. The parameters that are not set to the initial values, i.e. the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When WU-BLAST-2 is used, the% nucleic acid sequence identity value is determined by: (a) the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule of interest having a sequence derived from the native sequence PRO polypeptide encoding nucleic acid; And the comparison nucleic acid sequence of interest (ie, the sequence to which the PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule of interest may be the PRO polypeptide variant to be compared) determined by WU-BLAST-2 The number of matching identical nucleic acid residues is determined by the quotient divided by (b) the total number of nucleotides of the PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule of interest. For example, in the expression "a polypeptide comprising a nucleic acid sequence A having or having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleic acid sequence B", the nucleic acid sequence A is a comparison nucleic acid sequence of interest; Nucleic acid sequence B is the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule of interest.
[0030]
The% nucleic acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov or otherwise obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = possible, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5. , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
[0031]
In situations where NCBI-BLAST2 is used for nucleic acid sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of a given nucleic acid sequence C with or to a given nucleic acid sequence D (or with a given nucleic acid sequence D, or On the other hand, a given nucleic acid sequence C with or including some% nucleic acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleic acid residues having a score consistent with being identical by the alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleic acid residues of D. It will be appreciated that when the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D is different from the% nucleic acid sequence identity of D to C.
[0032]
In another embodiment, the PRO variant polypeptide nucleotides encode an active PRO polypeptide, preferably under stringent hybridization and washing conditions, to a nucleotide sequence encoding a full-length PRO polypeptide disclosed herein. Nucleic acid molecule. The PRO variant polypeptide may be one that is encoded by a PRO variant polynucleotide.
"Isolated," as used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or Preferably, it is purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes protein in situ within recombinant cells, since at least one component of the PRO polypeptide's natural environment will not be present. However, usually, an isolated polypeptide is prepared by at least one purification step.
[0033]
An "isolated" PRO polypeptide-encoding nucleic acid is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule normally associated with the natural source of the nucleic acid encoding the PRO polypeptide. An isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is distinguished from a PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule that is present in natural cells. However, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule includes, for example, a PRO polypeptide nucleic acid molecule contained in a cell that normally expresses the PRO polypeptide at a different chromosomal location than that of the native cell. .
The expression "control sequence" refers to a DNA sequence necessary to express an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, control sequences suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
[0034]
A nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the presequence or secretory leader DNA is operably linked to the polypeptide DNA if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is responsible for transcription of the sequence. If so, it is operably linked to the coding sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is in a position that facilitates translation. Generally, "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading phase. However, enhancers need not be in close proximity. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.
The term "antibody" is used in the broadest sense and includes, for example, a single anti-PRO polypeptide monoclonal antibody (including agonists, antagonists, and neutralizing antibodies), an anti-PRO antibody composition with multiepitope specificity, It includes the present chain anti-PRO antibodies and fragments of the anti-PRO antibodies (see below). The term "monoclonal antibody" as used herein refers to a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies that make up are identical except for naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Refers to antibodies obtained from a population.
[0035]
"Stringency" of hybridization reactions is readily determinable by one of ordinary skill in the art, and generally is an empirical calculation dependent upon probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, longer probes have higher temperatures for proper annealing, while shorter probes have lower temperatures. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is in an environment near but below its melting point. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures reduce stringency. Furthermore, stringency is inversely proportional to salt concentration. See Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) for more details and a description of the stringency of hybridization reactions.
[0036]
As defined herein, "stringent conditions" or "high stringent conditions" means (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.015M sodium chloride / 0.0015M at 50 ° C. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg, 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50mM sodium phosphate buffer pH 6.5 and 750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate; (3) 50% formamide at 42 ° C; 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM Sodium acid (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5x Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate at 42 ° C Identified by washing in 0.2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C. followed by a high stringency wash consisting of 0.1 × SSC with EDTA at 55 ° C.
[0037]
"Medium stringency conditions" were identified as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989), and washing solutions and hybridizations with less stringency as described above. Moderate conditions include the use of conditions such as temperature, ionic strength, and% SDS Moderate stringency conditions include 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.0). 6) Incubation overnight at 37 ° C. in a solution containing 5 × denhard solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / mL denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters in 1 × SSC at 37-50 ° C. A condition such. Those skilled in the art will recognize or necessary to accommodate factors such as probe length, how to adjust the temperature, ionic strength, and the like.
The term "epitope tag" as used herein refers to a PRO polypeptide fused to a "tag polypeptide", or a chimeric polypeptide comprising their domain sequence. A tag polypeptide has a sufficient number of residues to provide an epitope over which the antibody can be produced, or an epitope identifiable by some other reagent, but the length of the PRO polypeptide It is short enough not to inhibit the activity of the peptide. Also, the tag polypeptide is preferably quite unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to about 50 amino acid residues (preferably about 10 to about 20 residues).
[0038]
The term "immunoadhesin" as used herein refers to an antibody-like molecule that binds the binding specificity of a heterologous protein ("adhesin") to an immunoglobulin constant domain. Structurally, immunoadhesins comprise a fusion of an amino acid sequence with the desired binding specificity, other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, "heterologous"), and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least the receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin may be any such as IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. From immunoglobulins.
As used herein, "active" and "activity" refer to forms of PRO that retain the biological and / or immunological activity of the native or naturally occurring PRO polypeptide, and "biological" Activity refers to a biological function (inhibitory or stimulatory) produced by a natural or naturally occurring PRO that excludes the ability of the natural or naturally occurring PRO to generate antibodies to antigenic epitopes. By “immunological” activity is meant the ability to raise antibodies against an antigenic epitope possessed by a native or naturally occurring PRO.
[0039]
The term "antagonist" is used in the broadest sense and refers to any molecule that blocks, inhibits, or neutralizes the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Similarly, the term "agonist" is used in the broadest sense and refers to any molecule that mimics the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include, in particular, agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of native PRO polypeptides, peptides, small organic molecules, and the like. A method for identifying an agonist or antagonist of a PRO polypeptide comprises contacting the PRO polypeptide with a candidate antagonist or agonist and measuring a change in one or more biological activities normally associated with the PRO polypeptide. May be included.
[0040]
As used herein, "treatment" refers to both curative treatment, prophylactic and preventative treatment, wherein a patient is prevented or reduced (reduced) from a targeted pathological condition or disease. Those in need of treatment include those already with the disorder as well as those prone to have the disorder or those in which the disorder is prevented.
"Chronic" administration means administering the drug in a continuous manner, unlike the acute manner, and maintaining the initial therapeutic effect (activity) over a long period of time. "Intermittent" administration is treatment that is not consecutively done without interruption, but rather is cyclic in nature.
A "mammal" for a subject to be treated is classified as a mammal, including humans, domestic and agricultural animals, zoos, sports, or pet animals, such as dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, rabbits, and the like. Means any animal. Preferably, the mammal is a human.
Administration "in combination with" one or more therapeutic agents includes simultaneous (concurrent) and consecutive administration in any order.
[0041]
As used herein, "carrier" includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer, and is non-toxic to cells or mammals exposed to them at the dosages and concentrations employed. . Physiologically acceptable carriers are often aqueous pH buffered solutions. Examples of physiologically acceptable carriers include phosphate, citrate, and other organic acid salts buffers; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; For example, serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophobic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides, including glucose, mannose or dextran, and other carbohydrates; Chelating agents such as mannitol or rubitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or nonionic surfactants such as TWEEN (trade name), polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS (trade name). Name).
[0042]
"Antibody fragments" comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') ₂ Diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules; and multispecific formed from antibody fragments. Sexual antibody.
Papain digestion of antibodies produces two identical antibody-binding fragments, called "Fab" fragments, each of which has a single antigen-binding site, and the rest reflect "Fc", reflecting their ability to crystallize easily. Named fragment. Pepsin treatment is F (ab ') ₂ Generates a fragment that has two antigen binding sites and is capable of cross-linking antigen.
"Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable region in tight, non-covalent association. In this configuration, the three CDRs of each domain interact to form V _H -V _L Determine the antigen binding site on the surface of the oligomer. Rather, the six CDRs confer antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind the antigen .
[0043]
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab 'fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Here, Fab'-SH represents Fab 'in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group. F (ab ') ₂ Antibody fragments are initially produced as pairs of Fab 'fragments, which have hinge cysteines between them. Other chemical linkages of antibody fragments are known.
The “light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species fall into one of two distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequence of their constant domains.
Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further divided into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2.
[0044]
"Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments are derived from the V _H And V _L Antibody fragments that contain domains, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide has a Vv that allows the sFv to form a desired structure for antigen binding. _H And V _L It further comprises a polypeptide linker between the domains. For a review of sFv, see The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, Eds., Springer-Verlag, New York, pp. 139-146. 269-315 (1994).
The term "diabodies" refers to small antibody fragments that have two antigen-binding sites, wherein the fragments are of the same polypeptide chain (V _H -V _L ) Within the light chain variable domain (V _L Heavy chain variable domain (V _H )including. By using a linker that is too short to pair between the two domains of the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of the other chain and create two antigen-binding sites. Diabodies are described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
[0045]
An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminants of the natural environment are substances that would interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody comprises at least 15 residues by using (1) a spinning cup sequenator, to (1) more than 95% of the antibody as measured by the Lowry method, most preferably to more than 99% by weight. Or to (3) homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie Blue or preferably silver staining. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. However, usually, an isolated antibody is prepared by at least one purification step.
An antibody that “specifically binds” or “specifically” binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide is a specific antibody that does not substantially bind to another polypeptide or polypeptide epitope. Or an epitope on a particular polypeptide.
[0046]
The term "label" as used herein refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to the antibody such that a "labeled" antibody is produced. The label may itself be detectable (eg, a radioactive or fluorescent label), or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a chemical transformation of a detectable substrate compound or composition.
By "solid phase" is meant a non-aqueous matrix to which the antibodies of the invention can be attached. Examples of solid phases contemplated herein include those formed in part or in whole from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and silicone. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can constitute a well of an assay plate; in others, it can be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses a discrete solid phase of discrete particles, as described in US Pat. No. 4,275,149.
"Liposomes" are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants, and are useful for transporting drugs (such as PRO polypeptides or antibodies thereof) to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer format similar to the lipid arrangement of biological membranes.
"Small molecule" is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 daltons.
An “effective amount” of a polypeptide disclosed herein, or an agonist or antagonist thereof, is an amount sufficient to carry out a specifically stated purpose. An “effective amount” can be determined empirically and in a routine manner, in relation to the stated purpose.
[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

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[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]
II. Compositions and Methods of the Invention
A. Full length PRO polypeptide
The present invention provides newly identified and isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides referred to in the present application as PRO polypeptides. In particular, as described in further detail in the Examples below, cDNAs encoding various PRO polypeptides have been identified and isolated. It should be noted that although proteins generated in separate rounds of expression are given different PRO numbers, the UNQ numbers are unique to all given DNA and encoded proteins and do not change. However, for the sake of simplicity, the proteins encoded by the full-length natural nucleic acid molecules disclosed herein, as well as additional natural homologs and variants included in the above definition of PRO, will be described in their origin or format of preparation. Regardless of this, it is referred to as “PRO / number”.
Various cDNA clones have been deposited with the ATCC, as disclosed in the Examples below. The exact nucleotide sequence of these clones can be readily determined by sequencing the deposited clones using methods routine in the art. The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using conventional techniques. For the PRO polypeptides and encoding nucleic acids described herein, Applicants have identified what is believed to be the reading frame best matching the sequence information currently available.
[0069]
B. PRO polypeptide variants
It is contemplated that PRO variants may be prepared in addition to the full-length native sequence PRO polypeptides described herein. PRO variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the PRO polypeptide DNA, or by synthesizing the desired PRO polypeptide. One of skill in the art will appreciate that amino acid changes, such as changing the number or position of glycosylation sites or changing membrane anchoring properties can alter the post-translational process of a PRO polypeptide.
[0070]
Mutations in the native full-length sequence PRO or in various domains of the PRO polypeptides described herein can be obtained by any of the techniques and guidelines for conservative and non-conservative mutations described in US Pat. No. 5,364,934. This can be done using A mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding a PRO polypeptide that results in a change in the amino acid sequence of the PRO polypeptide as compared to the native sequence PRO. In some cases, the mutation is the replacement of at least one amino acid by one or more domains of the PRO polypeptide with any other amino acid. Guidance as to which amino acid residues are inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity can be determined by comparing the sequence of the PRO polypeptide to the sequence of a protein molecule of known homology. By minimizing amino acid sequence changes made within the high region of Amino acid substitutions can be the result of substitution of one amino acid for another amino acid having similar structural and / or chemical properties, for example, substitution of leucine for serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions and deletions can optionally be in the range of 1 to 5 amino acids. Tolerable mutations are determined by systematically making amino acid insertions, deletions or substitutions in the sequence and testing the resulting variants for activity in any of the in vitro assays described in the Examples below. Is done.
[0071]
PRO polypeptide fragments are provided herein. Such fragments may be truncated at the N-terminus or C-terminus, for example, as compared to the full length native protein, or may lack internal residues. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the PRO polypeptide.
PRO fragments may be prepared by any of a number of conventional techniques. The desired peptide fragment may be chemically synthesized. Alternative methods include enzymatic digestion, for example, by treating the protein with an enzyme known to cleave the protein at a site determined by a particular amino acid residue, or by digesting the DNA with appropriate restriction enzymes. Including the generation of a PRO fragment by isolating the desired fragment. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired polypeptide fragment by the polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that determine the desired termini of the DNA fragment are used at the 5 'and 3' primers of the PCR. Preferably, a PRO polypeptide fragment shares at least one biological and / or immunological activity with a native PRO polypeptide disclosed herein.
In particular embodiments, conservative substitutions of interest are set forth in Table 6, beginning with the preferred substitution. If such substitutions result in altered biological activity, more substitutional changes may be introduced and the product screened, as designated in Table 6 as exemplary substitutions or as further described in the amino acid classes below. Is done.
[0072]

[0073]
Substitutional modifications of polypeptide function and immunological identity include (a) the structure of the polypeptide backbone in the substitution region, such as a sheet or helical configuration, (b) charge or hydrophobicity of the target site, or (c) side This is achieved by selecting substituents that differ substantially in their effect while maintaining chain bulk. Naturally occurring residues can be divided into groups based on common side chain characteristics:
(1) hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) acidic: asp, glu;
(4) basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
[0074]
Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another. Also, such substituted residues may be introduced at conservative substitution sites, preferably at the remaining (non-conserved) sites.
Mutations can be made by oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res. , 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. , 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restricted selection mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)], or by performing other known techniques on cloned DNA to produce PRO mutant DNA. You can also.
[0075]
Also, scanning amino acid analysis can be used to identify one or more amino acids along a flanking sequence. Preferred scanning amino acids are relatively small, neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Alanine is a typically preferred scanning amino acid within this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is less likely to alter the backbone structure of the mutant [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1108]. (1989)]. Alanine is also typically preferred because it is the most common amino acid. In addition, it is often found in both buried and exposed locations [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. et al. Mol. Biol. , 150: 1 (1976)]. If alanine substitution does not yield a sufficient amount of mutant, isoteric amino acids can be used.
[0076]
C. Modification of PRO
Covalent modifications of the PRO polypeptides are included within the scope of the present invention. One type of covalent modification is to react the targeted amino acid residues of the PRO polypeptide with an organic derivatizing reagent that can react with selected side chains or N- or C-terminal residues of the PRO polypeptide. is there. Derivatization with bifunctional reagents is useful, for example, for cross-linking PRO to a water-insoluble support matrix or surface for use in anti-PRO antibody purification methods or vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example, esters with 4-azidosalicylic acid, and 3,3′-dithiobis (succinimide). Homobifunctional imide esters, including disuccinimidyl esters such as cinimidyl propionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane, and methyl-3-[(p-azido Phenyl) -dithio] propioimidate.
[0077]
Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine, respectively. Methylation of α-amino group of side chain [T. E. FIG. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.C. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 147-64. 79-86 (1983)], acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl groups.
Another type of covalent modification of the PRO polypeptide included within the scope of the present invention involves altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. By "altered native glycosylation pattern" is intended herein a deletion of one or more carbohydrate moieties found in the native sequence PRO (removal of existing glycosylation sites or chemical and / or enzymatic And / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native sequence PRO. In addition, this clause includes qualitative changes in glycosylation of native proteins, including changes in the nature and properties of the various carbohydrate moieties present.
[0078]
Addition of a glycosylation site to a PRO polypeptide may involve altering the amino acid sequence. This change may be made, for example, by the addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native sequence PRO (O-linked glycosylation site). The PRO amino acid sequence is optionally altered through alterations at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the PRO polypeptide at preselected bases to produce codons that are translated into the desired amino acid. Is also good.
Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on a PRO polypeptide is by chemical or enzymatic attachment of glycosides to the polypeptide. Such methods are described in the art, for example, in WO 87/05330 published September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev .. Biochem. Pp. 259-306 (1981).
[0079]
Removal of carbohydrate moieties present on PRO polypeptides can be accomplished chemically or enzymatically, or by mutational substitution of codons encoding amino acid residues presented as targets for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art and are described, for example, in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. , 259: 52 (1987), and Edge et al., Anal. Biochem. , 118: 131 (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on polypeptides is described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987), by using various endo and exoglycosidases.
Another type of covalent modification of the PRO of the present invention is the use of U.S. Pat. No. 640,835; No. 4,496,689; No. 4,301,144; No. 4,670,417; No. 4,791,192 or No. 4,179,337. Including the combination of
Also, the PRO polypeptides of the present invention may be modified in a manner that forms a chimeric molecule comprising the PRO polypeptide fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
[0080]
In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a fusion of the PRO polypeptide with a tag polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. Epitope tags are generally located at the amino or carboxyl terminus of the PRO polypeptide. The presence of such an epitope-tagged form of the PRO polypeptide can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Providing an epitope tag also allows the PRO polypeptide to be readily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or other type of affinity matrix that binds to the epitope tag. Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples include poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-his-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. , 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; Herpes simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include the flag peptide [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; the KT3 epitope peptide [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; [Skinner et al. Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991)]; and a T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
[0081]
In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a fusion of the PRO with an immunoglobulin or a particular region of an immunoglobulin. For a bivalent form of the chimeric molecule (also called an "immunoadhesin"), such a fusion could be the Fc region of an IgG molecule. Ig fusions preferably comprise a solubilized (transmembrane domain deleted or inactivated) form of the PRO polypeptide in place of at least one variable region within an Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3, or the hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of an IgG1 molecule. See U.S. Patent No. 5,428,130 issued June 27, 1995 for the production of immunoglobulin fusions.
[0082]
D. Preparation of PRO
The following description relates primarily to a method of producing PRO by culturing cells transformed or transfected with a vector containing the PRO nucleic acid. Of course, it is contemplated that PRO can be prepared using other methods well known in the art. For example, a PRO sequence, or a portion thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid-phase technology [see, eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. et al. H. Freeman Co. , San Francisco, California (1969); Merrifield, J. et al. Am. Chem. Soc. , 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. The various portions of the PRO may be chemically synthesized separately and combined using chemical or enzymatic methods to produce full-length PRO.
[0083]
1. Isolation of DNA encoding PRO
The DNA encoding PRO can be obtained from a cDNA library prepared from a tissue that contains PRO mRNA and will express it at detectable levels. Thus, human PRODNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. PRO-encoding genes can also be obtained from genomic libraries or by known synthetic methods (eg, automated nucleic acid synthesis).
Libraries can be screened with probes (such as antibodies to PRO or oligonucleotides of at least about 20-80 bases) designed to identify the gene of interest or the protein encoded by the gene. Screening of the cDNA or genomic library with the selected probe is performed using standard procedures described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). be able to. Another method of isolating the gene encoding the desired PRO polypeptide uses the PCR method [Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1995). ].
[0084]
The following example describes a technique for screening a cDNA library. The oligonucleotide sequence selected as a probe must be of sufficient length and sufficiently distinct to minimize false positives. Preferably, the oligonucleotide is labeled such that it is detectable upon hybridization with DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art, ³² Includes the use of radiolabels, such as P-labeled ATP, biotinylation or enzyme labels. Hybridization conditions, including moderate stringency and high stringency, are set forth in Sambrook et al., Supra.
Sequences identified in such library screening methods can be compared and aligned with known sequences that have been deposited in the public database of Genbank et al. Or a personal sequence database and made available to the public. Sequence identity (either at the amino acid or nucleic acid level) within a determined region of the molecule or over the entire length can be determined using methods known in the art and described herein. .
Nucleic acids with protein-encoding sequences may use, for the first time, the deduced amino acid sequences disclosed herein and, if necessary, Sambrook et al., Supra, detecting intermediates and precursors of mRNA not reverse transcribed into cDNA. , By screening a selected cDNA or genomic library using conventional primer extension methods as described in US Pat.
[0085]
2. Selection and transformation of host cells
Host cells are transfected or transformed with the expression or cloning vectors for PRO production described herein to induce a promoter, select transformants, or amplify a gene encoding the desired sequence. Culture in a suitably modified conventional nutrient medium. Culture conditions, such as medium, temperature, pH, etc., can be selected by those skilled in the art without undue experimentation. In general, principles, protocols, and practical techniques for maximizing productivity of cell cultures are described in Mammarian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.D. Butler eds. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra.
[0086]
Methods for Prokaryotic and Eukaryotic Cell Transfection, eg, CaCl 2 ₂ , CaPO ₄ Liposome-mediated and electroporation are known to those skilled in the art. Transformation is accomplished using standard techniques appropriate to the host cell used. Calcium treatment with calcium chloride or electroporation as described in Sambrook et al., Supra, is commonly used for prokaryotes. Infection by Agrobacterium tumefaciens has been described as being described in Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859 published June 29, 1989. Used for conversion. For such mammalian cells without a cell wall, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) is preferred. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in U.S. Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed as described by Van Solingen et al. Bact. , 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations such as polybrene, polyornithine, etc., can also be used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
[0087]
Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors described herein are prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria, eg, Gram-negative or Gram-positive organisms, eg, Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are publicly available, for example, E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other preferred prokaryotic host cells are E. coli, for example, E. coli. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for example, Salmonella typhimurium, Serratia, for example, Serratia marcescans, and Shigella, for example, and bacilli, such as bacillus, bacillus, bacillus, and bacillus. B. subtilis and B. licheniformis (eg, Bacillus licheniformis 41P described in DD266,710 published April 12, 1989), Pseudomonas such as Pseudomonas aeruginosa and Includes Enterobacteriaceae such as Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for recombinant DNA production and issuance. Preferably, the host cells secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. For example, strain W3110 may be modified to make a genetic mutation in a gene encoding a foreign protein in the cell; examples of such hosts include E. coli W3110 strain 1A2 with complete genotype tonA; Escherichia coli W3110 strain 9E4 having a high genotype tonA ptr3; ^r Escherichia coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244) with the complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac) 169 degP ommpT rbs7 ilvG kan ^r Escherichia coli W3110 strain 37D6 having a non-kanamycin-resistant degP deletion mutation; Escherichia coli W3110 strain 40B4, which is a 37D6 strain having a non-kanamycin-resistant degP deletion mutation; E. coli strains having Alternatively, in vitro methods of cloning, such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions, are preferred.
[0088]
In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for PRO polypeptide-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. In addition, Schizosaccharomyces prombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985); Kluveromyses U.S. Pat. Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for example, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. 15 Bacteriol. (2): 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), Kluveromyces K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wikeramii (ATCC 24,178), K. vertiii (K. waltii) (ATCC 56,500), Klubero K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)), C. thermotolerans and K. ver. Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekris Na et al., J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244, 234); Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, e.g., Schwanniomyces occidentalis (EP394,538, issued October 31, 1990); and filamentous fungi, e.g., Neurospora Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, published Jan. 10, 1991); and Aspergillus hosts For example, Aspergillus nidarans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and Aspergillus niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Preferred methylotrophic (C1 compound assimilating, methylotropic) yeasts here include, but are not limited to, Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Methanol-grown yeast selected from the genus Rhodotorula. A list of specific species that is illustrative of this yeast taxonomy can be found in Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[0089]
Suitable host cells for the expression of glycosylated PRO are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodspera Sf9, and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) and COS cells. More detailed examples are monkey kidney CV1 strain (COS-7, ATCC CRL 1651) transformed by SV40; human embryonic kidney strain (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)) human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB8065); and mouse breast tumor cells ( MMT 060562, ATCC CCL 51). The selection of an appropriate host cell is within the skill of the art.
[0090]
3. Selection and use of replicable vectors
A nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) encoding a PRO polypeptide is inserted into a replicable vector for cloning (amplification of the DNA) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle, or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by various techniques. Generally, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Construction of suitable vectors containing one or more of these components employs standard ligation techniques known to those of skill in the art.
[0091]
PRO polypeptides are produced not only directly by recombinant techniques, but also by fusion with a heterologous polypeptide which is a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. It is also produced as a peptide. Generally, the signal sequence is a component of the vector or is part of the PRO-encoding DNA that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include the yeast invertase leader, the alpha factor leader (Saccharomyces) and the Kluyveromyces α factor leader, the latter described in US Pat. No. 5,010,182. Or a signal described in acid phosphatase leader, C. albicans glucoamylase leader (EP 362179 published April 4, 1990), or WO90 / 13646 published November 15, 1990. Can be In mammalian cell expression, mammalian signal sequences may be used for signal secretion from the same or related secreted polypeptides as well as for direct secretion of proteins such as viral secretory leaders.
[0092]
Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for many bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are mammalian. Useful for cloning vectors in animal cells.
Expression and cloning vectors typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are: (a) confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) supplement auxotrophic deficiencies, or (c) encode the gene code for, for example, Basili. Encodes a protein that supplies important nutrients not available from complex media, such as D-alanine racemase.
[0093]
Examples of selectable markers suitable for mammalian cells are those that can identify cellular components that can take up the PRO-encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. Suitable host cells when using wild-type DHFR are described by Urlaub et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980) is a CHO cell line deficient in DHFR activity prepared and grown. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Expression and cloning vectors usually contain a promoter that is operably linked to the PRO-encoding nucleic acid sequence and controls mRNA synthesis. Suitable promoters that are recognized by a variety of possible host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts are the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp). ) Promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res. , 8: 4057 (1980); EP 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Promoters for use in bacterial systems also will contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding the PRO polypeptide.
[0094]
Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al. Biol. Chem. , 255: 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al. Adv. Enzyme Reg. , 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1987)], such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate. Includes acid isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, trioseric acid isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
Other yeast promoters include inducible promoters that have the additional effect of regulating transcription by growth conditions, including alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, and glycerol. There are promoter regions for aldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enzymes that govern maltose and galactose utilization. Vectors and promoters that are suitably used for expression in yeast are further described in EP 73,657.
[0095]
PRO polypeptide transcription from a vector in a mammalian host cell can be, for example, polyomavirus, infectious epithelioma virus (UK2, 211, 504 published July 5, 1989), adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine. Promoters derived from the genomes of viruses such as papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), heterologous mammalian promoters such as actin promoter or immunoglobulin promoter And the promoter obtained from the heat shock promoter, as long as such a promoter is compatible with the host cell system.
Transcription of a DNA encoding the desired PRO polypeptide by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers, usually about 10 to 300 base pairs, are cis-acting elements of DNA that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences from mammalian genes are currently known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin (100-270 base pairs), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers. The enhancer may be spliced into the vector at a position 5 'or 3' to the PRO coding sequence, but is preferably located 5 'from the promoter.
[0096]
Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) contain sequences necessary for terminating transcription and stabilizing mRNA. Including. Such sequences can be obtained from the usually 5 'and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the PRO polypeptide.
Other methods, vectors and host cells suitable for adapting the synthesis of the PRO polypeptide in recombinant vertebrate cell culture are described in Geting et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.
[0097]
4. Gene amplification / expression detection
Amplification and / or expression of the gene can be performed using an appropriately labeled probe based on the sequence provided herein, for example, by a conventional Southern blot method, a Northern blot method for quantifying mRNA transcription [Thomas, Proc. . Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex, including a DNA duplex, an RNA duplex, and a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex, can also be used. The antibody can then be labeled and the assay performed, wherein the duplex is bound to the surface, so that upon formation of the duplex at the surface, the antibody bound to the duplex Presence can be detected.
Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against the native sequence PRO polypeptide or to a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or to an exogenous sequence fused to the PRO DNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared for
[0098]
5. Purification of polypeptide
PRO polypeptide forms can be recovered from the culture medium or from lysates of the host cells. If membrane-bound, they can be detached from the membrane using a suitable washing solution (eg, Triton-X100) or enzymatic cleavage. Cells used for expression of a PRO polypeptide can be disrupted by various chemical or physical means, such as a freeze-thaw cycle, sonication, mechanical disruption, or a cell lysing agent.
It is desirable to purify the PRO polypeptide from recombinant cell proteins or polypeptides. Purified by the following procedure, which is an example of a suitable purification procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin such as DEAE; chromatofocusing; PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; and metal chelation columns to bind epitope-tagged forms of the PRO polypeptide. It is known in the art, for example, Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1992. it can. The purification process chosen will depend, for example, on the production method used and in particular on the nature of the particular PRO being produced.
[0099]
E. FIG. Uses of PRO
The nucleic acid sequences encoding PRO (or their complements) have various uses in the field of molecular biology, including use as hybridization probes, in chromosome and gene mapping, and in the production of antisense RNA and DNA. are doing. PRO nucleic acids are also useful for preparing PRO polypeptides by the recombinant techniques described herein.
[0100]
The full-length native sequence PRO gene, or a portion thereof, may be isolated from the full-length PRO cDNA or other genes having the desired sequence identity to the PRO sequences disclosed herein (eg, naturally occurring variants of PRO or other species). As a hybridization probe for a cDNA library for the isolation of those encoding PRO. In some cases, the length of the probe is from about 20 to about 50 bases. Hybridization probes may be derived, at least in part, from novel regions of the full-length native nucleotide sequence, which regions, without undue experimentation, include genomic sequences that include the promoter, enhancer component, and introns of the native sequence PRO. Can be derived from the sequence. For example, a screening method involves isolating the coding region of the PRO polypeptide gene using known DNA sequences to synthesize a selected probe of about 40 bases. The hybridization probe is ³² P or ³⁵ It can be labeled with various labels, including radioactive nucleotides such as S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase linked to the probe via an avidin / biotin binding system. A labeled probe having a sequence complementary to the PRO polypeptide gene of the invention screens a library of human cDNA, genomic DNA or mRNA and determines which members of the library hybridize to the probe. Can be used to Hybridization techniques are described in further detail in the Examples below.
[0101]
Any of the ESTs disclosed in the present application, as well as the probes, can be used in the methods described herein.
Other useful fragments of PRO nucleic acids include antisense or sense oligonucleotides that include single-stranded nucleic acid sequences (either RNA or DNA) that can bind to a target PRO mRNA (sense) or PRO DNA (antisense) sequence. , Antisense or sense oligonucleotides, according to the present invention, comprise fragments of the coding region of PRO DNA. Such a fragment generally comprises at least about 14 nucleotides, preferably about 14 to 30 nucleotides. The possibility of controlling antisense or sense oligonucleotides based on the cDNA sequence encoding a given protein is described, for example, by Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659: 1988) and van der Kroll et al., (BioTechniques 6: 958, 1988).
[0102]
Binding of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleic acid sequence results in duplex formation, which may be one of several methods, including promoting duplex resolution, premature termination of transcription or translation, or Other methods block transcription or translation of the target sequence. Thus, antisense oligonucleotides are used to block expression of the PRO protein. Antisense or sense oligonucleotides further include oligonucleotides having a modified sugar-phosphodiester backbone (or other sugar linkage, such as those described in WO 91/06629), wherein such sugar linkages are endogenous nuclease resistant. . Oligonucleotides with such resistant sugar linkages are stable in vivo (ie, can withstand enzymatic degradation), but retain sequence specificity for binding to a target nucleotide sequence.
Other examples of sense or antisense oligonucleotides are organic moieties, such as those described in WO 90/10048, and other moieties that enhance the affinity of the oligonucleotide for a target nucleic acid sequence, such as poly- (L -Lysine). Furthermore, an intercalating agent such as ellipticine, an alkylating agent, or a metal construct may be linked to the sense or antisense oligonucleotide to modify the binding specificity of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleotide sequence.
[0103]
Antisense or sense oligonucleotides include, for example, CaPO ₄ -Introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by any method of gene transformation including mediated DNA transfection, electroporation, or by using a gene transformation vector such as Epstein-Barr virus. In a preferred method, the antisense or sense oligonucleotide is inserted into a suitable retroviral vector. Cells containing the target nucleic acid sequence are contacted with the recombinant retroviral vector in vivo or ex vivo. Suitable retroviral vectors include, but are not limited to, those derived from the murine retrovirus M-MuLV, N2 (retrovirus derived from M-MuLV), or the double named DCT5A, DCT5B and DCT5C. Copy vector (see WO90 / 13641).
Alternatively, sense or antisense oligonucleotides may be introduced into cells containing the target sequence by forming a complex with a ligand binding molecule, as described in WO 91/04753. Suitable ligand binding molecules include, but are not limited to, cell surface receptors, growth factors, other cytokines, or other ligands that bind to cell surface receptors. Preferably, the complexing of the ligand binding molecule substantially inhibits the ability of the ligand binding molecule to bind to its corresponding molecule or receptor, or to block the entry of a sense or antisense oligonucleotide or complex thereof into cells. Does not inhibit.
[0104]
Alternatively, sense or antisense oligonucleotides may be introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by formation of an oligonucleotide-lipid complex, as described in WO 90/10448. The sense or antisense oligonucleotide-lipid complex is preferably degraded intracellularly by endogenous lipase.
Antisense RNA or DNA molecules generally have at least about 5 bases, about 10 bases, about 15 bases, about 20 bases, about 25 bases, about 30 bases, about 35 bases, about 40 bases, about 45 bases, about 50 bases, about 55 bases, about 60 bases, about 65 bases, about 70 bases, about 75 bases, about 80 bases, about 85 bases, about 90 bases, about It is 95 bases long, about 100 bases long, or longer.
Probes can also be used in PCR techniques to create a pool of sequences for identification of closely related PRO coding sequences.
In addition, the nucleotide sequence encoding PRO can be used for mapping of the gene encoding PRO and for preparing a hybridization probe for gene analysis of an individual having a genetic disease. The nucleotide sequences provided herein can be mapped to chromosomes and specific regions of chromosomes using well-known techniques such as in situ hybridization, binding analysis to known chromosomal markers, and hybridization screening in libraries. .
[0105]
If the PRO coding sequence encodes a protein that binds to another protein (eg, if PRO is a receptor), PRO can be used in assays to identify its ligand. In this way, inhibitors of the receptor / ligand binding interaction can be identified. Proteins involved in such binding interactions can also be used to screen for peptides or small molecule inhibitors or agonists of binding interactions. Receptor PRO can also be used to isolate related ligands. Screening assays are designed for the discovery of lead compounds that mimic the biological activity of native PRO or its receptor. Such screening assays are also used for high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. Small molecules contemplated include synthetic organic or inorganic compounds. The assays are performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biological screening assays, immunoassays and cell-based assays that are well known and characterized in the art.
[0106]
In addition, nucleic acids encoding PRO or any modified form thereof can be used to produce either transgenic or "knockout" animals, which are useful in the development and screening of therapeutically useful reagents. . A transgenic animal (eg, a mouse or rat) is an animal that has cells containing a transgene introduced into the animal or an ancestor of the animal prenatally, eg, at the embryonic stage. A transgene is a DNA that has been integrated into the genome of the cell in which the transgenic animal develops. In one embodiment, the cDNA encoding PRO is genomic DNA encoding PRO based on the genomic sequence used to generate transgenic animals, including cells expressing the DNA encoding PRO, and established techniques. Can be used for cloning. Methods for producing transgenic animals, particularly certain animals such as mice or rats, have become routine in the art and are described, for example, in U.S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,009. ing. Typically, particular cells are targeted for the introduction of the PRO transgene with a tissue-specific enhancer. Transgenic animals containing a copy of the PRO-encoding transgene introduced into the animal's germline at the embryonic stage can be used to study the effects of increased expression of DNA encoding PRO. Such animals can be used, for example, as tester animals for reagents that would provide protection against pathological conditions involving their overexpression. In this aspect of the invention, treating an animal with a reagent and having a lower incidence of the pathological condition compared to an untreated animal having the transgene indicates a therapeutic treatment for the pathological condition. It is.
[0107]
Alternatively, a non-human homolog of PRO may have a PRO-encoding defect due to homologous recombination between the altered genomic DNA encoding PRO introduced into the embryonic cells of the animal and the endogenous gene encoding PRO. Alternatively, it can be used to create a PRO "knockout" animal having an altered gene. For example, a cDNA encoding PRO can be used for cloning genomic DNA encoding PRO according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding PRO can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker used to monitor integration. Typically, vectors contain several kilobases of unchanged flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) [eg, for homologous recombination vectors, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987). checking]. The vector was introduced into embryonic stem cells (eg, by electroporation) and cells were selected in which the introduced DNA had been homologously recombined with the endogenous DNA [eg, Li et al., Cell, 69: 915 (1992). )reference]. The selected cells are then injected into the blastocyst of an animal (eg, a mouse or rat) to form an assembling chimera [eg, Bradley, Teratocarcinomas and Embronic Stem Cells: A Practical Approach, E. et al. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female nanny, creating a "knockout" animal at intervals. Progeny that have DNA homologously recombined in the embryonic cells are identified by standard techniques and can be used to propagate an animal in which all cells of the animal contain the homologously recombined DNA. . Knockout animals are characterized by certain pathological conditions due to PRO polypeptide deficiency and the ability to protect against the development of that pathological condition.
[0108]
Nucleic acids encoding PRO polypeptides can also be used for gene therapy. In gene therapy applications, genes are introduced to achieve in vivo synthesis of a therapeutically effective amount of the gene product, for example, to replace a defective gene. "Gene therapy" includes both conventional gene therapy, in which a single treatment achieves a sustained effect, and administration of gene therapy agents, including single or repeated administration of a therapeutically effective DNA or mRNA. . Antisense RNA and DNA can be used as therapeutics to block the expression of certain genes in vivo. It has already been shown that short antisense oligonucleotides can be transferred into cells where they act as inhibitors, despite low intracellular concentrations due to limited uptake by cell membranes (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]). Oligonucleotides may be modified to facilitate incorporation by replacing their negatively charged phosphodiester groups with uncharged groups.
[0109]
Various techniques exist for introducing nucleic acids into viable cells. These techniques will vary depending on whether the nucleic acid is to be introduced into cultured cells in vitro or in vivo in cells of the intended host. Suitable methods for transferring nucleic acids into mammalian cells in vitro include liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, and the like. Presently preferred in vivo gene transfer techniques are transfection with viral (typically retroviral) vectors and viral coat protein-liposome-mediated transfection (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). In some situations, it may be desirable to provide the nucleic acid source with an agent that targets the target cell, such as a cell surface membrane protein or an antibody specific for the target cell, a ligand for a receptor on the target cell. When using liposomes, proteins that bind to cell surface membrane proteins with endocytosis, such as capsid proteins or fragments thereof of a particular cell type tropism, antibodies to proteins that undergo internalization in the cycle, intracellular localization Proteins that target intracellular half-life are used for targeting and / or enhancing uptake. Receptor-mediated endocytosis is described, for example, in Wu et al. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). For a review of gene generation and gene therapy protocols, see Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).
[0110]
The PRO polypeptides described herein may be used as molecular weight markers for protein electrophoresis, and the isolated nucleic acid sequences may be used for recombinant expression of these markers.
Nucleic acid molecules encoding the PRO polypeptides or fragments thereof described herein are useful for chromosome identification. At this point, identification of new chromosomal markers is necessary, as few chromosome marking reagents based on the actual sequence are available. Each PRO nucleic acid molecule of the present invention can be used as a chromosome marker.
Also, the PRO polypeptides and nucleic acid molecules of the present invention can be used for tissue typing, and the PRO polypeptides of the present invention are preferably used in diseased tissues as compared to normal tissues of the same type and in one tissue compared to the other. Express differently. PRO nucleic acid molecules will find use for generating probes for PCR, Northern analysis, Southern analysis and Western analysis.
[0111]
The PRO polypeptides described herein may be used as therapeutics. The PRO polypeptides of the present invention are formulated according to known methods for preparing pharmaceutically useful compositions, whereby the PRO product is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier medium. Therapeutic formulations are prepared by mixing, in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution, an optional pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer with the active ingredient having the desired degree of purification ( Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980]), prepared and stored. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and buffers such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid Agent; low molecular weight (less than 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; amino acid such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; Monosaccharides such as mannose or dextrin, disaccharides or other carbohydrates, chelating agents such as EDTA, sugars such as mannitol or sorbitol, salt-forming counterions such as sodium; and / or TWEEN (trade name), PLURONICS (trade name) Or a nonionic surfactant such as PEG.
[0112]
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by filtration through a sterile filter membrane before or after lyophilization and reconstitution.
Here, the pharmaceutical compositions of the invention are generally placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
The route of administration is by well-known methods, for example, injection or infusion by the intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial or intralesional route, topical administration, or a sustained release system.
The dosage and desired drug concentration of the pharmaceutical composition of the invention will vary depending on the particular use intended. Determination of the proper dosage or route of administration is within the skill of the ordinary physician. Animal studies provide reliable guidance for determining effective amounts for human treatment. Interspecific scaling of effective amounts is described in Toxikinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96, Mordenti, J. et al. And Chappell, W.C. It can be performed according to the principles described in "The use of interspecies scaling in toxicokinetics".
[0113]
When in vivo administration of the PRO polypeptide or an agonist or antagonist thereof is used, normal dosages can range from about 10 ng / kg to 100 mg / kg, preferably about 1 μg / day, based on the weight of the mammal, depending on the route of administration. / Kg / day to 10 mg / kg / day. Guidance on specific dosages and modes of delivery is provided in the literature; see, for example, U.S. Patent Nos. 4,657,760, 5,206,344, or 5,225,212. It is expected that different formulations will be effective against different therapeutic compounds and different diseases, for example, administration targeting one organ or tissue will require different delivery than other organs or tissues Is done.
Where sustained release of the PRO polypeptide is desired in a formulation having release characteristics suitable for the treatment of any disease or disorder requiring administration of the PRO polypeptide, microencapsulation of the PRO polypeptide is contemplated. Microencapsulation of recombinant proteins for sustained release has been successfully performed with human growth hormone (rhGH), interferon- (rhIFN-), interleukin-2, and MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med. , 2: 799-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. , 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems" Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach , Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; and U.S. Patent No. 5,654,010.
[0114]
Sustained release formulations of these proteins have been developed using poly-lactic-coglycolic acid (PLGA) polymers based on their biocompatibility and a wide range of biodegradable properties. Lactic acid and glycolic acid, degradation products of PLGA, are cleared immediately in the human body. Furthermore, the degradability of the polymer can be adjusted from months to years, depending on the molecular weight and composition. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide / glycolide polymer": Chasin and R.C. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.
The invention also encompasses methods of screening for compounds to identify those that are similar (agonists) to PRO polypeptides or that inhibit the effects of PRO polypeptides (antagonists). Screening assays for candidate antagonists may include compounds that bind or complex with the PRO polypeptide encoded by the genes identified herein, or that otherwise inhibit the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins. Is designed to identify Such screening assays include those applicable to high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates.
The assays are performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays known in the art.
All assays for antagonists require that they contact the candidate drug with the PRO polypeptide encoded by the nucleic acid identified herein under conditions and for a time sufficient for the two components to interact. And in common.
[0115]
In a binding assay, the interaction is binding and the complex formed is isolated or detected in the reaction mixture. In a particular embodiment, the PRO polypeptide or drug candidate encoded by the gene identified herein is immobilized on a solid phase, eg, a microtiter plate, by covalent or non-covalent attachments. Non-covalent attachment is generally achieved by coating the solid surface with a solution of the PRO polypeptide and drying. Alternatively, an immobilized antibody, eg, a monoclonal antibody, specific for the PRO polypeptide to be immobilized can be used to anchor it to a solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which may be labeled with a detectable label, to the immobilized component, eg, the coated surface containing the anchored component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex fixed on the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the initial non-immobilized component has no label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
[0116]
If the candidate compound interacts but does not bind to a particular PRO polypeptide encoded by the gene identified herein, the interaction with that polypeptide is a well-known method for detecting protein-protein interactions. Can be assayed. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatography column. In addition, protein-protein interactions are described in Chevray and Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)], Fields and co-workers [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]. Many transcription activators, such as yeast GAL4, consist of two physically separate modular domains, one acting as a DNA binding domain and the other as a transcription activation domain. The yeast expression system described in the aforementioned literature (commonly referred to as the "two-hybrid system") takes advantage of this property, as well as using two hybrid proteins, while the target protein is the DNA binding domain of GAL4. And, on the other hand, the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of the GAL4 activating promoter depends on the reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using the two-hybrid technique (MATCHMARKER®) is commercially available from Clontech. This system can also be extended to mapping protein domains involved in specific protein interactions, as well as identifying amino acid residues important for these interactions.
[0117]
Compounds that inhibit the interaction of a gene encoding the PRO polypeptide identified herein with an intracellular or extracellular component can be tested as follows: Usually, the reaction mixture is a mixture of the gene product with extracellular or intracellular components. The components are prepared to include the conditions and over time under which the interaction and binding of these two products is possible. To test the ability of a candidate compound to inhibit binding, reactions are performed in the absence and presence of the test compound. Additionally, a placebo may be added to the third reaction mixture to provide a positive control. Binding (complex formation) between the test compound and the intracellular or extracellular components present in the mixture is monitored as described above. Complex formation in the control reaction, but not in the reaction mixture containing the test compound, indicates that the test compound inhibits the interaction of the test compound with its binding partner.
[0118]
To assay an antagonist, a PRO polypeptide may be added to a cell along with the compound being screened for a particular activity, and the ability of the compound to inhibit a subject activity in the presence of the PRO polypeptide depends on whether the compound is a PRO polypeptide Is an antagonist of Alternatively, antagonists may be detected by binding the PRO polypeptide to a potential antagonist having a membrane-bound PRO polypeptide receptor or a recombinant receptor under conditions suitable for a competitive inhibition assay. The PRO polypeptide can be labeled, such as by radioactivity, and the number of PRO polypeptides bound to the receptor can be used to determine the effectiveness of the potential antagonist. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Coligan et al., Current Protocols in Immun. , 1 (2): Chapter 5 (1991). Preferably, expression cloning is used, polyadenylation RNA is prepared from cells responsive to the PRO polypeptide, and a cDNA library generated from this RNA is partitioned into pools, and COS cells or other non-PRO polypeptide reactive Used for transfection of cells. Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled PRO polypeptide. The PRO polypeptide can be labeled by a variety of means, including iodination or inclusion of a site-specific protein kinase recognition site. After fixation and incubation, slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified, subpools are prepared and re-transfected using an interactive subpooling and rescreening step, ultimately producing a single clone encoding the putative receptor.
[0119]
As an alternative to receptor identification, the labeled PRO polypeptide can be photoaffinity bound to cell membranes or extract preparations expressing the receptor molecule. The crosslinked material is dissolved by PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the receptor can be excited, broken down into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from microsequencing is used to design a set of degenerate oligonucleotide probes to screen a cDNA library that identifies the gene encoding the putative receptor.
In another assay for antagonists, mammalian cells or membrane preparations expressing the receptor are incubated with labeled PRO polypeptide in the presence of the candidate compound. The ability of the compound to promote or block this interaction is then measured.
More specific examples of potential antagonists are oligonucleotides that bind to a fusion of an immunoglobulin and a PRO polypeptide, particularly, but not limited to, polypeptide- and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti- Includes idiotype antibodies, and chimeric or humanized forms of these antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Alternatively, a potential antagonist may be a closely related protein, for example, a mutant form of the PRO polypeptide that recognizes the receptor but has no effect, and thus competitively inhibits the action of the PRO polypeptide.
[0120]
Other potential PRO polypeptide antagonists are antisense RNA or DNA constructs prepared using antisense technology, for example, antisense RNA or DNA hybridizes to target mRNA and interferes with protein translation. By doing so, it acts to directly block the translation of mRNA. Antisense technology can be used to control gene expression through triple helix formation or antisense DNA or RNA, both of which methods are based on the binding of polypeptide nucleotides to DNA or RNA. For example, the 5 'encoded portion of the polypeptide nucleotide sequence encoding the mature PRO polypeptide herein is used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10 to 40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (Triple Helix-Lee et al., Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456. (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and production of the PRO polypeptide. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block translation of the mRNA molecule into a PRO polypeptide (antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense inhibitors of Gastroenterology SRS Press: Boca Raton, FL, 1988)). The oligonucleotides described above can also be delivered to cells and express antisense RNA or DNA in vivo to inhibit production of the PRO polypeptide. When antisense DNA is used, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation initiation site, eg, between positions -10 and +10 of the target gene nucleotide sequence, are preferred.
[0121]
Potential antagonists include small molecules that bind to the active site, receptor binding site, or growth factor or other related binding site of the PRO polypeptide, thereby blocking the normal biological activity of the PRO polypeptide. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptide organic or inorganic compounds.
Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by nucleotide-strand cleavage. Specific ribozyme cleavage sites within potential RNA targets can be identified by known techniques. For further details, see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT Publication No. WO 97/33551 (published September 18, 1997).
[0122]
The nucleic acid molecule in triple helix formation used for transcription inhibition is single-stranded and consists of deoxynucleotides. The basic composition of these oligonucleotides is designed to promote triple helix formation via Hoogstin base pairing, which generally requires a resizable extension of a purine or pyrimidine on one strand of the duplex . For further details, see, for example, PCT Publication No. WO 97/33551, supra.
These small molecules can be identified by any one or more of the screening assays discussed above and / or by any other screening techniques well known to those skilled in the art.
Also, the diagnostic and therapeutic uses of the molecules disclosed herein are based on the positive functional assay hits disclosed and described below.
[0123]
F. Anti-PRO antibody
The present invention further provides an anti-PRO antibody. Examples of antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific and heteroconjugate antibodies.
[0124]
1. Polyclonal antibody
Anti-PRO antibodies include polyclonal antibodies. Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. In mammals, polyclonal antibodies can be raised, for example, by one or more injections of an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant will be injected into the mammal by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent can include the PRO polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to conjugate the immunizing agent to a protein known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one of skill in the art without undue experimentation.
[0125]
2. Monoclonal antibody
Alternatively, the anti-PRO antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is typically immunized with an immunizing agent to generate antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to induce lymphocytes that can be generated. . Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro.
[0126]
The immunizing agent will typically include the PRO polypeptide of interest or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBLs") are used if human-derived cells are desired, or spleen cells or lymph node cells if non-human mammalian sources are desired. Subsequently, the lymphocytes are fused with the immortalized cell lines using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells of rodent, bovine, and human origin. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of the unfused, immortalized cells. For example, if the parental cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxatin, aminoptilin and thymidine ("HAT medium"). This substance blocks the growth of HGPRT deficient cells.
[0127]
Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortalized cell line is a murine myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distributor Center in San Diego, California and the American Type Culture Collection in Rockville, MD. Human myeloma and mouse-human xenomyeloma cell lines for producing human monoclonal antibodies have also been disclosed [Kozbor, J. et al. Immunol. , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications, Marcel Dekker, Inc. , New York, (1987) pp. 51-63].
The culture medium in which the hybridoma cells are cultured is then assayed for the presence of a monoclonal antibody to PRO. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be determined, for example, by the method of Munson and Pollard, Anal. Biochem. , 107: 220 (1980).
[0128]
After the desired hybridoma cells have been identified, clones can be subcloned by limiting dilution and grown by standard methods [Goding, supra]. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
Monoclonal antibodies secreted by the subclones can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, protein A-sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. Separated or purified.
[0129]
Monoclonal antibodies can be prepared by recombinant DNA methods, for example, the method described in US Pat. No. 4,816,567. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be readily prepared using conventional methods (eg, using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector, which is transfected into host cells such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce immunoglobulin proteins. Thus, monoclonal antibodies can be synthesized in recombinant host cells. DNA can also be obtained by substituting human heavy and light chain constant domain coding sequences, eg, for homologous mouse sequences [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra], or immunoglobulin coding The sequence can be modified by covalently attaching part or all of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or for the variable domains of one of the antigen binding sites of the antibodies of the invention, to produce chimeric bivalent antibodies.
[0130]
The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves the recombinant expression of an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. The heavy chain is truncated generally at any point in the Fc region to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are replaced or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Production of fragments thereof, particularly Fab fragments, by digestion of the antibody can be accomplished using conventional techniques known in the art.
[0131]
3. Human and humanized antibodies
The anti-PRO antibody of the present invention further includes a humanized antibody or a human antibody. A humanized form of a non-human (eg, mouse) antibody refers to a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or a fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)). ₂ Or another antigen-binding subsequence of an antibody), which comprises a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. Humanized antibodies are those in which the residues of the complementarity-determining regions (CDRs) of the recipient are residues of CDRs of a non-human species (donor antibody) having the desired specificity, affinity and potency, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulins (recipient antibodies) replaced by In some examples, Fv framework residues of the human immunoglobulin have been replaced by corresponding non-human residues. Also, a humanized antibody may contain residues that are not found in the recipient antibody, nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody will have at least one, typically at least one, typically all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions are of a human immunoglobulin consensus sequence. Contains substantially all of the two variable domains. The humanized antibody optimally comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op Struct. Biol. , 2: 593-596 (1992)].
[0132]
Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more amino acid residues from a non-human are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Humanization is essentially by replacing the relevant sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence [Winter and coworkers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1544-1536 (1988)] by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. Will be implemented. Thus, such "humanized" antibodies are chimeric antibodies (U.S. Pat. No. 4,816,567) in which substantially less than an intact human variable domain has been replaced by the corresponding sequence from a non-human species. is there. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues have been replaced by residues from analogous sites in rodent antibodies.
[0133]
In addition, a human antibody was prepared using a phage display library [Hoogenboom and Winter, J .; Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al. Mol. Biol. , 222: 581 (1991)], and various methods known in the art. Also, the methods of Cole et al. And Boerner et al. Can be used for the preparation of human monoclonal antibodies [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. et al. Lis. p. 77 (1985) and Boerner et al. Immunol. , 147 (1): 86-95 (1991)]. Similarly, human antibodies can be produced by introducing a human immunoglobulin locus into a transgenic animal, eg, a mouse in which the endogenous immunoglobulin gene has been partially or completely inactivated. Upon administration, the production of human antibodies is observed that is very similar to that found in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. This approach is described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425. No. 5,661,016; and the following scientific literature: Marks et al., Bio / Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-. 13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Inter. Rev .. Immunol. 13 65-93 (1995).
[0134]
Antibodies may also be affinity-matured using known selection and / or mutagenesis methods as described above. Preferred affinity matured antibodies are 5-fold, more preferably 10-fold, even more preferably 20 or 30-fold higher than the starting antibody (typically mouse, humanized or human) from which the mature antibody is prepared. Has affinity.
[0135]
4. Bispecific antibodies
Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. In the present case, one of the binding specificities is for PRO and the other is for any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies has been based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs in which the two heavy chains have different specificities [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Because of the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually achieved by an affinity chromatography step. Similar procedures are described in WO 93/08829, published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J. 2005; , 10: 3655-3659 (1991).
[0136]
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion preferably is with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. Desirably, at least one of the fusions has a first heavy chain constant region (CH1) containing sites necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain, are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. For more details on generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
According to another method described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the percentage of heterodimers recovered from recombinant cell culture. Preferred interfaces include at least a portion of the CH3 region of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). A complementary "cavity" of the same or similar size as the large side chain is created at the interface of the second antibody molecule by replacing the large amino acid side chain with a smaller one (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
[0137]
Bispecific antibodies are full-length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab ') ₂ Bispecific antibodies). Techniques for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) dissect proteolytically the intact antibody to F (ab '). ₂ Describes a procedure for producing fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab 'fragment produced is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative to form a bispecific antibody. The produced bispecific antibody can be used as an agent for selective immobilization of an enzyme.
Fab 'fragments can be directly recovered from E. coli, which can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) are fully humanized bispecific antibodies F (ab '). ₂ Describes the production of the molecule. Each Fab 'fragment is separately secreted from E. coli and undergoes directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed can bind to normal human T cells and cells overexpressing the ErbB2 receptor, triggering the cytolytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Become.
[0138]
Various methods for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins are linked to the Fab 'portions of two different antibodies by gene fusion. The antibody homodimer is reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form the antibody heterodimer. This method can also be used for the production of antibody homodimers. See Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 64444-6448 (1993) provided an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. The fragments are joined by a light chain variable domain (V) with a linker that is short enough to allow pairing between the two domains on the same chain. _L ) Has a heavy chain variable domain (V _H ). Therefore, the V of one fragment _H And V _L The domain is the complementary V of other fragments _L And V _H It is forced to pair with a domain, forming two antigen-binding sites. Other strategies for making bispecific antibody fragments by the use of single-chain Fv (sFv) dimers have also been reported. Gruber et al. Immunol. 152: 5368 (1994).
Antibodies with more than two valencies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. Immunol. 147: 60 (1991).
[0139]
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes of a PRO polypeptide provided herein. Alternatively, the arm of the anti-PRO polypeptide can be a trigger molecule on a leukocyte, such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28, or B7) or a cell, such that the cytoprotective mechanism is focused on a particular PRO polypeptide-expressing cell. It can bind to an arm that binds to the Fc receptor for IgG (FcγR), such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic drugs to cells that express a particular PRO polypeptide. These antibodies have a PRO binding arm and an arm that binds a cytotoxic drug or radiochelator, such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Other bispecific antibodies of interest bind the PRO polypeptide and further bind tissue factor (TF).
[0140]
5. Heteroconjugate antibodies
Heteroconjugate antibodies also fall within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies consist of two covalently linked antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells [US Pat. No. 4,676,980] and to treat HIV infection [WO91 / 00360; WO92 / 200373; EP03089. ]Proposed. It is contemplated that the antibodies can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be made using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate, and, for example, those disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980.
[0141]
6. Processing effector functions
It is desirable to modify the antibody of the invention for effector function, for example to improve the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. The homodimeric antibody so generated may have improved internalization capacity and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Caron et al. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B .; J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Also, homodimeric antibodies with enhanced antitumor activity can be prepared using heterobifunctional cross-linking as described in Wolff et al., Cancer research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
[0142]
7. Immunoconjugate
The present invention also provides conjugates with chemotherapeutic agents, cytotoxic agents such as toxins (eg, enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (ie, radioconjugates). The invention relates to an immunoconjugate comprising an antibody.
Chemotherapeutic agents useful for generating such immune complexes have been described above. Enzymatic active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A Chains, alpha-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), momordica charancia, momordica, momordica Curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin (g) elonin), mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene. Various radioactive nucleotides are available for the production of radioconjugate antibodies. For example, ²¹² Bi, ¹³¹ I, ¹³¹ In, ⁹⁰ Y and ¹⁸⁶ Re is included.
[0143]
The conjugate of the antibody and cytotoxic agent can be used to form various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imide ester bifunctionality. Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelating agent for conjugation of radionucleotide to an antibody. See WO 94/11026.
In another embodiment, the antibody may be conjugated to a "receptor" (such as streptavidin) for use in pre-targeting the tumor, and the antibody-receptor complex is administered to the patient, and then the clarifying agent is added. Unbound complex is used to remove unbound complex from the circulation and then administered a "ligand" (such as avidin) conjugated to a cytotoxic agent (such as a radionucleotide).
[0144]
8. Immunoliposome
Also, the antibodies disclosed herein may be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. acad. Sci. ScL USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); and U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation times are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
Particularly useful liposomes are produced by reverse phase evaporation with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derived phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes are extruded through a filter of a predetermined size to produce liposomes having a desired diameter. Fab 'fragments of the antibodies of the present invention are described in Martin et al. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982), and can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction. A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. Gabizon et al. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
[0145]
9. Antibody pharmaceutical composition
Antibodies that specifically bind to the PRO polypeptides identified herein, as well as other molecules identified by the screening assays disclosed above, may be administered in the form of a pharmaceutical composition for the treatment of various diseases. Can be.
Where the PRO polypeptide is intracellular and whole antibodies are used as inhibitors, antibodies that can be taken up are preferred. However, lipofections or liposomes can also be used to introduce antibodies, or antibody fragments, into cells. When antibody fragments are used, minimal inhibitory fragments that specifically bind to the binding domain of the target protein are preferred. For example, peptide molecules that retain the ability to bind to the target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be synthesized chemically or produced by recombinant DNA technology. See, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively, or in addition, the composition may include a cytotoxic drug, cytokine or growth inhibitor. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
[0146]
The active ingredient may also be incorporated in a microcapsule prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in a colloidal drug delivery system (eg, , Liposomes, albumin spherules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules), or microemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, supra.
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily achieved by filtration through a sterile filtration membrane.
Sustained-release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include a semipermeable matrix of a solid hydrophobic polymer containing the antibody, which matrix is in the form of a shaped article, eg, a film, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyester hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polyactides (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ-ethyl. -Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT (trade name) (injectable spheres of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), poly- (D) -3-Hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid enable release of molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins more quickly. When encapsulated antibodies remain in the body for extended periods of time, they denature or aggregate by exposure to 37 ° C. water, resulting in reduced biological activity and possible changes in immunogenicity. . Rational strategies can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of water content, appropriate And the development of specific polymer matrix compositions.
[0147]
G. FIG. Uses of anti-PRO antibodies
The anti-PRO antibodies of the present invention have various utilities. For example, anti-PRO antibodies are used in diagnostic assays for PRO, eg, detecting its expression in specific cells, tissues, or serum. Competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays and immunoprecipitation assays performed in heterogeneous or homogeneous phases [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158] and various diagnostic assay techniques known in the art. Antibodies used in diagnostic assays are labeled at a detectable site. A detectable site must directly or indirectly generate a detectable signal. For example, the detectable site is ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S or ¹²⁵ It may be a radioisotope such as I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin, or an enzyme such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase. Any method known in the art can be used to conjugate a detectable site to an antibody, including Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain. J. et al. Immunol. Meth. , 40: 219 (1981); and Nygren, J. et al. Histochem. and Cytochem. , 30: 407 (1982).
[0148]
Anti-PRO antibodies are also useful for the affinity purification of PRO from recombinant cell culture or natural sources. In this method, antibodies to PRO are immobilized on a suitable support such as Sephadex resin or filter paper using methods well known in the art. Next, after contacting the immobilized antibody with a sample containing PRO to purify, the support is washed with a suitable solvent that removes substantially all substances in the sample other than PRO bound to the immobilized antibody. Wash. Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release PRO from the antibody.
The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
The entirety of all patents and references cited herein are hereby incorporated by reference.
[0149]
(Example)
All commercial reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of the cells identified by the ATCC accession number throughout the examples and throughout the specification is the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
[0150]
Example 1: Extracellular domain homology screening to identify novel polypeptides and cDNAs encoding them
Extracellular domain (ECD) sequences (including secretory signal sequences, if necessary) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database were used to search the EST database. EST databases include public databases (eg, Dayhoff, GenBank) and proprietary databases (eg, LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as a comparison with the six frame translation of the EST sequence of the ECD protein sequence. Comparatives that do not encode a known protein and have a Blast score of 70 (sometimes 90) or higher can be clustered with the program "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) and consensus DNA sequence Built.
Using this extracellular domain homology screen, consensus DNA sequences were constructed with phrap against other identified EST sequences. In addition, the resulting consensus DNA sequences are often extended using (but not all) repeated cycles of BLAST or BLAST-2 and prap, and the consensus sequences are made as far as possible using the sources of EST sequences discussed above. Extended.
[0151]
Based on the consensus sequence obtained as described above, oligonucleotides are then synthesized to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and to isolate a clone of the full-length coding sequence of the PRO polypeptide. Used for use as a probe. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give a PCR product of about 100-1000 bp in length. Probe sequences are typically 40-55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR with a PCR primer pair, such as Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using the probe oligonucleotide and one of the primer pairs.
The cDNA library used to isolate the cDNA clone was created by standard methods using commercially available reagents such as Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT having a NotI site, ligated to the SalI hemikinase adapter with a blunt end, cut with NotI, sorted by gel electrophoresis to the appropriate size, and a compatible cloning vector (such as pRKB or pRKD). PRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; cloned in a defined orientation at the unique XhoI and NotI sites of Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)).
[0152]
Example 2: cDNA clone isolation by amylase screening
1. Preparation of oligo dT primed cDNA library
MRNA was isolated from human tissues of interest using reagents and protocols from Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). This RNA was used to generate an oligo dT primed cDNA library with the vector pRK5D using Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system) reagents and protocol. In this method, the double-stranded cDNA was classified into a size exceeding 1000 bp, and the SalI / NotI linker-linked cDNA was cloned into an XhoI / NotI digested vector. pRK5D is a cloning vector having an sp6 transcription initiation site followed by an SfiI restriction enzyme site located before the XhiI / NotI cDNA cloning site.
[0153]
2. Preparation of random primed cDNA library
To preferably represent the 5 'end of the primary cDNA clone, a secondary cDNA library was created. Sp6 RNA was generated from the primary library (described above) and this RNA was prepared using the vector pSST-AMY.RTM., Which utilizes reagents and protocols from Life Technologies (Super Script Plasmid system referenced above). 0 was used to generate a randomly primed cDNA library. In this method, double stranded cDNA was sized to 500-1000 bp, ligated to the NotI adapter with blunt ends, cut at the SfiI site, and cloned into the SfiI / NotI cut vector. pSST-AMY. No. 0 is a cloning vector having a mouse amylase sequence (mature sequence without a secretion signal) followed by a yeast alcohol dehydrogenase promoter and an alcohol dehydrogenase transcription terminator before the cDNA cloning site. Thus, the cDNA cloned into this vector, which fuses in frame with the amylase sequence, leads to secretion of amylase from a properly transfected yeast colony.
[0154]
3. Transformation and detection
The DNA of the library described in paragraph 2 above was cooled on ice, and electrocompetent DH10B bacteria (Life Technologies, 20 ml) were added. The mixture of bacteria and vector was then electroporated as recommended by the manufacturer. Then, SOC medium (Life Technologies, 1 ml) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Transformants were then plated on 20 standard 150 mm LB plates containing ampicillin and incubated for 16 hours (37 ° C.). Positive colonies were scraped from the plate and DNA was isolated from the bacterial pellet using standard methods, such as a CsCl-gradient. Next, the following yeast protocol was applied to the purified DNA.
Yeast methods fall into three categories: (1) transformation of yeast with a plasmid / cDNA binding vector; (2) detection and isolation of yeast clones secreting amylase; and (3) direct from yeast colonies. Amplification of the insert and purification of the DNA for sequencing and further analysis.
[0155]
The yeast strain used was HD56-5A (ATCC-90785). This strain has the following genotypes: MATalpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL. ⁺ , SUC ⁺ , GAL ⁺ Having. Preferably, yeast mutants with incomplete post-translational pathways can be used. Such variants have translocation-deficient alleles at sec71, sec72, sec62, with truncated sec71 being most preferred. Alternatively, antagonists (including antisense nucleotides and / or ligands) that inhibit the normal operation of these genes, and other proteins involved in this post-translational pathway (eg, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p, SSA1p- 4p) or complex formation of these proteins is also preferably used in combination with an amylase-expressing yeast.
Transformation is described in Gietz et al., Nucl. Acid. Res. , 20: 1425 (1992), based on the protocol outlined. The transformed cells were then inoculated from agar into YEPD complex medium broth (100 ml) and grown overnight at 30 ° C. YEPD broth is described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). The overnight medium is then approximately 2 x 10 in fresh YEPD broth (500 ml). ⁶ Cells / ml (about OD ₆₀₀ = 0.1) and 1 × 10 ⁷ Cells / ml (about OD ₆₀₀ = 0.4-0.5).
[0156]
The cells are then harvested, transferred to a GS3 rotor bottle on a Sorval GS3 rotor for 5 minutes at 5,000 rpm, the supernatant is discarded, then prepared for transformation by resuspension in sterile water, and then 50 ml. Was re-centrifuged in a Beckman GS-6KR centrifuge at 3,500 rpm. The supernatant was discarded, and the cells were subsequently washed with LiAc / TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 100 mM Li ₂ OOCCH ₃ ) And resuspended in LiAc / TE (2.5 ml).
Transformation is initiated by mixing the prepared cells (100 μl) with fresh, denatured single-stranded salmon sperm DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) and transforming DNA (1 μg vol. <10 μl) in a microtube. did. The mixture was mixed briefly by vortexing, then 40% PEG / TE (600 μl, 40% polyethylene glycol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM LiOOCH) ₃ , PH 7.5). The mixture was gently agitated and incubated for 30 minutes at 30 ° C. with agitation. The cells were then heat shocked at 42 ° C. for 15 minutes, the reaction vessel was centrifuged in a microtube at 12,000 rpm for 5-10 seconds, decanted, and TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) followed by centrifugation. The cells were then diluted in TE (1 ml) and aliquots (200 μl) were spread on selective media previously prepared in 150 mm growth plates (VWR).
[0157]
Alternatively, instead of multiple small reactions, the amounts of reagents were scaled up accordingly and transformation was performed in a single large reaction.
The selection medium used was described by Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994) was synthetic complete dextrose agar lacking uracil (SCD-Ura) prepared as described in U.S. Pat. Transformants were grown at 30 ° C for 2-3 days.
Detection of colonies secreting amylase was performed by including red starch in the selective growth medium. See Bielly et al., Anal. Biochem. , 172: 176-179 (1988). The starch was coupled to a red dye (Reactive Red-120, Sigma). The bound starch was incorporated into SCD-Ura agar plates at a final concentration of 0.15% (w / v) and buffered with potassium phosphate to pH 7.0 (final concentration 50-100 mM).
To obtain single colonies that were well isolated and identifiable, positive colonies were picked and streaked onto fresh selection medium (150 mm plates). Detection of colonies that were positive for amylase secretion and were well isolated was performed by direct incorporation of red starch into buffered SCD-Ura agar. Positive colonies were determined by their ability to degrade the starch of the colonies to form distinct halos directly visible around the positive colonies.
[0158]
4. DNA isolation by PCR amplification
If a positive colony was isolated, a portion was picked with a toothpick and diluted with sterile water (30 μl) in a 96-well plate. At this point, the positive colonies are either frozen and stored for further analysis, or are amplified immediately. Aliquots (5 μl) of cells into 0.5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, Calif.); 4.0 μl 10 mM dNTP (Perkin Elmer-Cetus); 2.5 μl Kentaq buffer (Clontech); 0.25 μl positive Direction oligo 1; 0.25 μl reverse oligo 2, used as template for PCR reaction in 25 μl volume containing 12.5 μl distilled water.
The sequence of forward oligonucleotide 1 is:
5'-TGTAAAACGACGGGCCAGTTTAATAGAACCTGCAATTATTAATCT-3 '
(SEQ ID NO: 611)
The sequence of reverse oligonucleotide 2 is:
5′-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGGCACACCTGCAAATCCCATT -3 ′
(SEQ ID NO: 612)
Met.
The PCR was then performed as follows:

[0159]
The underlined regions anneal to the ADH promoter region and the amylase region, respectively. If no insert is present, the vector pSST-AMY. Amplify the 0 307 bp region. Typically, the first 18 nucleotides at the 5 'end of these oligonucleotides contained the annealing site of the sequence primer. Thus, the total product of the PCR reaction from the empty vector was 343 bp. However, the signal sequence fusion cDNA resulted in a considerably longer nucleotide sequence.
Following PCR, an aliquot of the reaction (5 μl) was agarose gel electrophoresed in a 1% agarose gel using a Tris-borate-EDTA (TBE) buffer system in a 1% agarose gel as described in Sambrook et al., Supra. Studied by. Clones yielding a single strong PCR product greater than 400 bp were further analyzed by DNA sequence after purification on a 96 Qiaquick PCR cleanup column (Quagen Inc., Chatsworth, CA).
[0160]
Example 3: cDNA clone isolation using signal algorithm analysis
Genentech, Inc. (South San Francisco, Calif.) Independently developed sequence discovery algorithms in public (eg, GenBank) and / or private (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Calif.) Databases. Various polypeptide-encoding nucleic acid sequences were identified by applying to ESTs as well as EST fragments assembled and assembled from ESTs. This signal sequence algorithm calculates a secretion signal score based on the letters of the DNA nucleotides surrounding the first or second methionine codon (ATG) at the 5 'end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode at least 35 distinct amino acids without a stop codon. If the first ATG has the essential amino acids, the second will not be considered. If none of the requirements are met, no score is assigned to the candidate sequence. In order to determine whether the EST sequence contains a genuine signal sequence, the DNA surrounding the ATG codon and the corresponding amino acid sequence contain one of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with secretory signals. Scores were given using pairs. Using this algorithm, a number of polypeptide-encoding nucleic acid sequences have been identified.
[0161]
Example 4: Isolation of a cDNA clone encoding a human PRO polypeptide
Using the techniques described in Examples 1-3 above, a number of full-length cDNA clones were identified as encoding a PRO polypeptide, as disclosed herein. These cDNAs were deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC) in accordance with the terms of the Budapest Treaty, as shown in Table 7 below.
[0162]

[0163]

[0164]

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[0167]

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[0169]

[0170]

[0171]
These deposits were made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure and its Regulations (Budapest Treaty). This ensures that a viable culture of the deposit is maintained for 30 years from the date of the deposit. Deposits may be obtained from the ATCC pursuant to the provisions of the Budapest Treaty and pursuant to an agreement between Genentech and the ATCC, whether at first or at the time of issuance of the relevant U.S. patent or any Guarantees that progeny of the deposited culture will be made available permanently and without limitation at the time of publication of the U.S. or foreign patent application, and may be obtained under 35 U.S.C. (Including Article 1.14) to ensure that descendants are available to those who have determined that they are entitled in accordance with the United States Patent Office.
The assignee of the present application agrees that if the deposited culture dies or is lost or destroyed when cultured under appropriate conditions, the materials will be replaced immediately with the same other at the time of notice. I do. The availability of the deposited material is not to be construed as a license to practice the present invention in violation of the rights granted under any government authority under patent law.
[0172]
Example 5: Use of PRO as a hybridization probe
The following method illustrates the use of a nucleic acid sequence encoding PRO as a hybridization probe.
The DNAs containing the full-length or mature PRO coding sequences disclosed herein can be used as probes for screening homologous DNA (such as those encoding naturally occurring variants of PRO) of human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries. Used as
Hybridization and washing of the filter containing any library DNA is performed under the following high stringency conditions. Hybridization of the radiolabeled PRO-derived probe to the filter was performed using 50% formamide, 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 2 × Denhardt's solution, and 10% dextran. Performed in a solution of sulfuric acid at 42 ° C. for 20 hours. Washing of the filter is performed at 42 ° C. in 0.1 × SSC and 0.1% SDS aqueous solution.
DNA having the desired sequence identity with the DNA encoding the full-length native sequence can then be identified using standard techniques known in the art.
[0173]
Example 6: Expression of PRO in E. coli
This example illustrates the preparation of a non-glycosylated version of PRO by recombinant expression in E. coli.
The DNA sequence encoding is first amplified using selected PCR primers. This primer must contain a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site on the selected expression vector. Various expression vectors can be used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) which contains genes for ampicillin and tetracycline resistance. The vector is digested by restriction enzymes and dephosphorylated. Next, the PCR amplified sequence is ligated to the vector. The vector preferably encodes an antibiotic resistance gene, a trp promoter, a polyHis leader (including the first six STII codons, a polyHis sequence, and an enterokinase cleavage site), a PRO coding region, a lambda transcription factor and the argU gene. Contains an array.
This ligation mixture was then utilized to transform selected E. coli strains using the methods described in Sambrook et al., Supra. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates, and then antibiotic resistant colonies are selected. Plasmid DNA can be isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.
Selected clones can be grown overnight in a liquid medium such as LB broth supplemented with antibiotics. This overnight culture may then be used to inoculate a larger scale culture. The cells are then grown to the desired optical density, during which the expression promoter begins to act.
After culturing the cells for several more hours, it is possible to collect the cells by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation can be solubilized using various agents known in the art, and then the dissolved PRO protein is metal-chelated under conditions that allow for firm binding of the protein. It is possible to purify using a column.
[0174]
PRO may be expressed in E. coli in poly-His tag form using the following procedure. The DNA encoding PRO was first amplified using selected PCR primers. The primers provide restriction sites corresponding to those of the selected expression vector, and efficient and reliable translation initiation, rapid purification on metal chelate columns, and proteolytic removal with enterokinase. Including other useful sequences to provide. The PCR-amplified poly-His tag sequence was then ligated into an expression vector, which was used for transformation of an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) long galErpoHts (httpRts) clpP (lacIq)). Transformants were initially grown in LB containing 50 mg / ml carbenicillin at 30 ° C. with shaking at 3-5 O.C. D. Grew to reach 600. Then, the culture solution was added to a CRAP medium (3.57 g of (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 0.71 g of sodium citrate.2H ₂ O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco yeast extract, 5.36 g Sheffield hycase SF in 500 mL water, and 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w / v) glucose and 7 mM MgSO ₄ Prepared by mixing 50 to 100 times, and grown by shaking at 30 ° C. for about 20 to 30 hours. A sample was taken out to confirm the expression by SDS-PAGE, and the bulk medium was centrifuged so that the cells became a pellet. The cell pellet was frozen until purification and refolding (refolding).
E. coli paste from 0.5 to 1 L of fermentation (6-10 g pellet) was resuspended at 10 volumes (w / v) in 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Solid sodium sulfate and sodium tetrathionate were added to final concentrations of 0.1 M and 0.02 M, respectively, and the solution was stirred at 4 ° C. overnight. This step results in a denatured protein in which all cysteine residues have been blocked by sulfite. The solution was concentrated in a Beckman Ultracentifuge at 40,000 rpm for 30 minutes. The supernatant is diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6 M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and filtered through a 0.22 micron filter for clarity. The clear extract was loaded onto a 5 ml Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated with a metal chelate column buffer. The column was washed with loading buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein was eluted with a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein were pooled and stored at 4 ° C. Protein concentration was estimated by its absorbance at 280 nm using the extinction coefficient calculated based on its amino acid sequence.
[0175]
By gradually diluting the sample in a freshly prepared regeneration buffer consisting of 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine and 1 mM EDTA, The protein was regenerated. The refolding volume was chosen such that the final protein concentration was 50-100 micrograms / ml. The refolding solution was slowly stirred at 4 ° C. for 12-36 hours. The refolding reaction was stopped by adding TFA at a concentration of 0.4% (pH of about 3). Before further purification of the protein, the solution was filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile was added to a final concentration of 2-10%. The refolded protein was chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column using 0.1% TFA transfer buffer and elution with a 10-80% acetonitrile gradient. Aliquots of fractions with A280 absorbance were analyzed on SDS polyacrylamide gels and fractions containing homologous refolding proteins were pooled. In general, most correctly regenerated protein species are eluted at the lowest concentration of acetonitrile because these species are the most compact and their hydrophobic inner surfaces are shielded from interaction with the reversed-phase resin. Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. In addition to removing misreproduced proteins from the desired form, the reverse phase step also removes endotoxin from the sample.
Fractions containing the desired regenerated PRO polypeptide were pooled and the acetonitrile was removed using a gentle stream of nitrogen directed at the solution. The protein was prepared to 20 mM Hepes, pH 6.8, containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol by dialysis or gel filtration and sterile filtration on G25 Superfine (Pharmacia) resin equilibrated with the preparation buffer.
Many PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed by the methods described above.
[0176]
Example 7: Expression of PRO in mammalian cells
This example illustrates the preparation of a potentially glycosylated form of PRO by recombinant expression in mammalian cells.
The vector pRK5 (see EP 307,247 published March 15, 1989) was used as an expression vector. In some cases, the PRO DNA is bound to pRK5 having the selected restriction enzyme, and the PRO DNA is inserted using the ligation method described in Sambrook et al. The resulting vector is called pRK5-PRO.
[0177]
In one embodiment, the selected host cells can be 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) were grown and confluent in tissue culture plates in a medium such as DMEM supplemented with fetal calf serum and optionally nutrients and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-PRO DNA was mixed with about 1 μg of VA RNA gene-encoding DNA [Thymmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)] and 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M. CaCl ₂ Was dissolved. To this mixture was added dropwise 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO. ₄ Was added and a precipitate was formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate was suspended, added to 293 cells and fixed at 37 ° C. for about 4 hours. The medium was aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS was added for 30 seconds. The 293 cells were then washed with serum-free medium, fresh medium was added, and the cells were incubated for about 5 days.
[0178]
About 24 hours after transfection, the medium was removed and medium (only) or 200 μCi / ml ³⁵ S-cysteine and 200 μCi / ml ³⁵ The medium was replaced with a medium containing S-methionine. After a 12 hour incubation, the conditioned medium was collected, concentrated on a spin filter, and loaded on a 15% SDS gel. The treated gel was dried and exposed to film for a selected period of time to reveal the presence of the PRO polypeptide. The medium containing the transformed cells was subjected to further incubation (in serum-free medium) and the medium was tested in selected bioassays.
[0179]
In an alternative technology, PRO is described in Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 12: 7575 (1981), can be transiently introduced into 293 cells using the dextran sulfate method. 293 cells are grown to maximum density in a spinner flask and 700 μg of pRK5-PRO DNA is added. Cells were first concentrated by centrifugation from spinner flasks and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate was incubated on the cell pellet for 4 hours. Cells were treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue media, and re-introduced into spinner flasks containing tissue media, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the conditioned medium was centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. The sample containing the expressed PRO was then concentrated and purified by a selected method such as dialysis and / or column chromatography.
In another embodiment, PRO can be expressed in CHO cells. pRK5-PRO is CaPO ₄ Alternatively, CHO cells can be transfected using a known reagent such as DEAE-dextran. As described above, incubate the cell culture medium and culture the culture medium (only) or ³⁵ The medium can be replaced with a medium containing a radiolabel such as S-methionine. After identifying the presence of the PRO polypeptide, the medium may be replaced with a serum-free medium. Preferably, the medium is incubated for about 6 days, and then the conditioned medium is collected. The medium containing the expressed PRO can then be concentrated and purified by any selected method.
[0180]
Further, the epitope tag PRO may be expressed in host CHO cells. PRO may be subcloned from the pRK5 vector. The subclone insert can be subjected to PCR and fused to a frame with a selected epitope tag, such as a poly-his tag, in a baculovirus expression vector. The poly-his tag PRO insert can then be subcloned into an SV40 derived vector containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, CHO cells were transfected (as described above) with the SV40 derived vector. Labeling may be performed as described above to confirm expression. The medium containing the expressed poly-his-tagged PRO is then concentrated and Ni ²⁺ -It can be purified by a selected method such as chelate affinity chromatography.
PRO may be expressed in CHO and / or COS cells by a transient expression method and in CHO cells by another stable expression method.
Stable expression in CHO cells is performed using the following method. The proteins may be IgG constructs (immunoadhesins) in which the coding sequence of the soluble form of each protein (eg, extracellular domain) is fused to the IgG1, hinge, CH2 and constant region sequences including the CH2 domain, and / or -Expressed as His-tagged form.
[0181]
Following PCR amplification, the corresponding DNA is subcloned into a CHO expression vector using standard techniques as described in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). . CHO expression vectors have restriction sites compatible with the 5 ′ and 3 ′ of the DNA of interest and are constructed to allow convenient shuttle of cDNA. Vectors are described in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996), using the SV40 early promoter / enhancer to control expression of the cDNA of interest and dihydrofolate reductase (DHFR), as described in CHO cells. DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
12 micrograms of the desired plasmid DNA are introduced into approximately 10 million CHO cells of the commercially available transfection reagents Superfect® (Qiagen), Dosper® and Fugene® (Boehringer Mannheim). Cells are grown as described in Lucas et al., Supra. About 3x10 ⁷ Cells are frozen in ampoules for further growth and production as described below.
[0182]
The ampoule containing the plasmid DNA was placed in a water bath, thawed, and mixed by vortexing. The contents were pipetted into a centrifuge tube containing 10 mL of medium and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant is aspirated and the cells are suspended in 10 mL of selective medium (0.2 μm filtered PS20, with 5% 0.2 μm diafiltered fetal calf serum). The cells are then split into 100 mL spinners containing 90 mL of selective medium. After 1-2 days, transfer the cells to a 250 mL spinner filled with 150 mL of selective growth medium and incubate at 37 ° C. After another 2-3 days, 250 mL, 500 mL and 2000 mL spinners were added to 3 × 10 ⁵ Seed at cells / mL. The cell culture medium was replaced with fresh medium by centrifugation and resuspended in production medium. Any suitable CHO medium may be used, but in practice the production medium described in US Pat. No. 5,122,469, issued Jun. 16, 1992, is used. 1.2x10 3L production spinner ⁶ Seeded at cells / mL. On day 0, cell number and pH were measured. On day 1, the spinner was sampled and sparged with filtered air. On day 2, the spinner is sampled, the temperature is changed to 33 ° C., and 30 mL of 500 g / L glucose and 0.6 mL of 10% antifoam (eg, 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Was taken. Throughout the production, the pH was adjusted and maintained at around 7.2. After 10 days, or until the viability was below 70%, the cell medium was harvested by centrifugation and filtered through a 0.22 μm filter. The filtrate is stored at 4 ° C. or immediately packed into a purification column.
[0183]
For the poly-His tag construct, the protein is purified using a Ni-NTA column (Qiagen). Prior to purification, imidazole is added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium is pumped at 4 ° C. at a flow rate of 4-5 ml / min onto a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole. After loading, the column is further washed with equilibration buffer and the protein is eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. The highly purified protein was subsequently desalted using a 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) column in a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8,- Store at 80 ° C.
The immunoadhesin (containing Fc) construct is purified from the conditioned medium as follows. The conditioned medium is pumped onto a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After packing, the column was washed strongly with the equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein is immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into a tube containing 275 μL of 1 M Tris buffer, pH 9. The highly purified protein is subsequently desalted in a storage buffer as described above for the poly-His tag protein. Homogeneity is assessed by SDS polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0184]
Example 8: Expression of PRO in yeast
The following method describes the recombinant expression of PRO in yeast.
First, a yeast expression vector is created for the intracellular production or secretion of PRO from the ADH2 / GAPDH promoter. The DNA encoding PRO and the promoter are inserted into the appropriate restriction sites of the selected plasmid to direct intracellular expression of PRO. For secretion, the plasmid encoding the PRO-encoding DNA may be placed on a plasmid encoding the ADH2 / GAPDH promoter, a native PRO signal peptide or other mammalian signal peptide, or a yeast α-factor or invertase secretion signal / leader, for example. It can be cloned with the sequence, and (if necessary) the linker sequence for expression of PRO.
[0185]
Yeasts, such as yeast strain AB110, can then be transformed with the expression plasmids described above and cultured in a selected fermentation medium. The transformed yeast supernatant can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separation by SDS-PAGE, and then staining the gel with Coomassie blue staining.
The recombinant PRO can then be isolated and purified by removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation and then concentrating the medium using a selected cartridge filter. The concentrate containing PRO may be further purified using a selected column chromatography resin.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0186]
Example 9: Expression of PRO in insect cells infected with baculovirus
The following method describes the recombinant expression of PRO in baculovirus infected insect cells.
The sequence encoding PRO was fused upstream of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of an IgG). A variety of plasmids can be used, including those derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Novagen). Briefly, the PRO or a predetermined portion of the PRO coding sequence, such as a sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein or a sequence encoding a mature protein when the protein is extracellular, is included in the 5 ′ and 3 ′ regions. Amplified by PCR with complementary primers. The 5 'primer may include an adjacent (selected) restriction enzyme site. The product is then digested with the selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.
The recombinant baculovirus was prepared by co-transforming the above plasmid and BaculoGold (trade name) viral DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda ("Sf9") cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL). Created by populating. After incubation at 28 ° C for 4-5 days, the released virus was recovered and used for further amplification. Viral infection and protein expression were performed as described in O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
[0187]
Next, the expressed poly-his tag PRO is, for example, Ni ²⁺ -Purified by chelate affinity chromatography as follows. Extracts were prepared from virus-infected recombinant Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Briefly, Sf9 cells were washed and sonicated in buffer (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2). ₂ 0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4M KCl) and sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicate was clarified by centrifugation, and the supernatant was diluted 50-fold with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. Ni ²⁺ -An NTA agarose column (commercially available from Qiagen) was prepared in a total volume of 5 mL, washed with 25 mL of water and equilibrated with 25 mL of loading buffer. The filtered cell extract was loaded onto the column at 0.5 mL per minute. The column was changed to A at the point where fraction collection began. ₂₈₀ Washed with loading buffer to baseline. Next, the column was washed with a secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0), which elutes the bound protein non-specifically. A ₂₈₀ After reaching the baseline again, the column was developed with a 0 to 500 mM imidazole gradient in the secondary wash buffer. One mL fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE and silver staining or Ni conjugated to alkaline phosphatase (Qiagen). ²⁺ -Analyzed by Western blot with NTA. His eluted ₁₀ -Fractions containing Tag PRO were pooled and dialyzed against loading buffer.
Alternatively, purification of the IgG-tag (or Fc-tag) PRO can be performed using known chromatography techniques, including, for example, protein A or protein G column chromatography.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
[0188]
Example 10: Preparation of antibodies that bind to PRO
This example illustrates the preparation of a monoclonal antibody that can specifically bind to PRO.
Techniques for the production of monoclonal antibodies are known in the art and are described, for example, in Goding, supra. Immunogens that can be used include purified PRO, fusion proteins containing PRO, and cells expressing recombinant PRO on the cell surface. The selection of an immunogen can be made by one skilled in the art without undue experimentation.
Mice, such as Balb / c, are immunized with PRO immunogen emulsified in complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally at 1-100 micrograms. Alternatively, the immunogen may be emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind footpad. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with an additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. The mice are then boosted with additional immunization injections for several weeks. Serum samples from retro-orbital bleeds may be periodically collected from mice for testing in an ELISA assay for detection of anti-PRO antibodies.
[0189]
After appropriate antibody titers are detected, animals that are "positive" for antibody can be given a final infusion of intravenous PRO injection. Three to four days later, the mice were sacrificed and spleen cells were removed. The spleen cells were then used (with 35% polyethylene glycol) in P3X63AgU.P available from ACTT under the number CRL1597. It was fused to one or more selected mouse myeloma cell lines. The fusion produced hybridoma cells, which were then plated in 96-well tissue culture plates containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) media to inhibit the growth of unfused cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids.
Hybridoma cells are screened in an ELISA for reactivity to PRO. Determination of “positive” hybridoma cells secreting the desired monoclonal antibody to PRO is within the skill of the art.
Positive hybridoma cells are injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to generate ascites containing anti-PRO monoclonal antibodies. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of the monoclonal antibody produced in ascites can be performed using ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on the affinity of the antibody for protein A or protein G can be used.
[0190]
Example 11: Purification of PRO polypeptide using specific antibodies
Native or recombinant PRO polypeptides can be purified by various standard protein purification methods in the art. For example, a pro-PRO, mature, or pre-PRO polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the PRO polypeptide of interest. Generally, immunoaffinity columns are made by covalently attaching an anti-PRO polypeptide antibody to an activated chromatography resin.
Polyclonal immunoglobulins are prepared from immune sera either by precipitation with ammonium sulfate or by purification on immobilized Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography on immobilized Protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently bound to a chromatography resin such as CnBr-activated Sepharose (trade name) (Pharmacia LKB Biotechnology). The antibody is bound to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.
[0191]
Such immunoaffinity columns are utilized in the purification of PRO polypeptide by preparing fractions from cells containing the soluble form of the PRO polypeptide. This preparation is induced by the addition of detergent or solubilization of the whole cell or cell component fraction obtained via differential centrifugation by methods known in the art. Alternatively, the solubilized PRO polypeptide containing the signal sequence is secreted in useful amounts into the medium in which the cells are growing.
The solubilized PRO polypeptide-containing preparation is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow for favorable adsorption of the PRO polypeptide (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). The column is then eluted under conditions that disrupt antibody / PRO polypeptide binding (eg, low pH, such as about 2-3, high concentrations of chaotropes such as urea or thiocyanate ions), and the PRO polypeptide is recovered. .
[0192]
Example 12: Drug screening
The invention is particularly useful for screening compounds by using the PRO polypeptides or binding fragments thereof in various drug screening techniques. The PRO polypeptide or fragment used in such a test may be free in solution, fixed to a solid support, carried on a cell surface, or located intracellularly. One method of drug screening utilizes a eukaryotic or prokaryotic host cell that is stably transfected with a recombinant nucleic acid expressing a PRO polypeptide or fragment. Agents are screened against such transfected cells by competitive binding assays. Such cells, either in viable or immobilized form, can be used in standard binding assays. For example, the formation of a complex between the PRO polypeptide or fragment and the reagent being tested may be measured. Alternatively, the reduction in complex formation between the PRO polypeptide and its target cell caused by the reagent being tested can be tested.
Accordingly, the present invention provides a method of screening for a drug or any other reagent that can affect a PRO polypeptide-related disease or disorder. These methods include contacting the reagent with a PRO polypeptide or fragment, (i) for the presence of a complex between the reagent and the PRO polypeptide or fragment, or (ii) reacting the PRO polypeptide or fragment with Assaying for the presence of the complex between them. In these competitive binding assays, the PRO polypeptide or fragment is typically labeled. After appropriate incubation, the free PRO polypeptide or fragment is separated from that in bound form, and the amount of free or unconjugated label is determined by the amount of the particular reagent bound to the PRO polypeptide or the PRO polypeptide / cell complex. Is a measure of the ability to inhibit
[0193]
Other techniques for drug screening provide high-throughput screening for compounds with appropriate binding affinity for the polypeptide and are described in detail in WO 84/03564 published September 13, 1984. ing. Briefly, a number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support such as a plastic pin or some other surface. When applied to a PRO polypeptide, the peptide test compound reacts with the PRO polypeptide and is washed. Bound PRO polypeptide is detected by methods well known in the art. Purified PRO polypeptide can also be coated directly on a plate for use in the drug screening techniques described above. In addition, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
The invention also contemplates competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies capable of binding to the PRO polypeptide specifically compete with the test compound for the PRO polypeptide or a fragment thereof. In this method, the antibody can be used to detect the presence of any peptide having one or more antigenic determinants on the PRO polypeptide.
[0194]
Example 13: Rational drug design
The goal of rational drug design is to produce structurally analogous biologically active polypeptides of interest (eg, PRO polypeptides) or small molecules with which they interact, eg, agonists, antagonists, or inhibitors. is there. Any of these examples can be used to create more active and stable forms of the PRO polypeptide or drugs that promote or inhibit the function of the PRO polypeptide in vivo (see, Hodgson, Bio / Technology, 9:19). -21 (1991)).
[0195]
In one method, the three-dimensional structure of a PRO polypeptide, or PRO polypeptide-inhibitor complex, is determined by x-ray crystallography, by computer modeling, and most typically by a combination of the two methods. In order to elucidate the structure of the molecule and determine the active site, both the shape and charge of the PRO polypeptide must be ascertained. To a lesser extent, useful information about the structure of the PRO polypeptide may be gained by modeling based on the structure of homologous proteins. In both cases, the relevant structural information is used to design analogous PRO polypeptide-like molecules or to identify effective inhibitors. Useful examples of rational drug design include molecules with enhanced activity or stability, as set forth in Braxton and Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992), or Athauda et al. Biochem. , 113: 742-746 (1993), including molecules that act as inhibitors, agonists or antagonists of the natural peptide.
[0196]
It is also possible to isolate the target-specific antibody selected by the functional assay as described above and to elucidate its crystal structure. This method produces, in principle, a pharmacore upon which subsequent drug design can be based. By generating anti-idiotypic antibodies (anti-ids) to functional pharmacologically active antibodies, protein crystallography can be bypassed. As a mirror image of the mirror image, the binding site of the anti-ids can be expected to be an analog of the original receptor. Anti-ids can then be used to identify and isolate peptides from banks of chemically or biologically produced peptides. The isolated peptide will function as a pharmacore.
In accordance with the present invention, PRO polypeptides are available in sufficient quantities to perform analytical experiments such as X-ray crystallography. In addition, knowledge of the PRO polypeptide amino acid sequence provided herein provides guidance for use in computer modeling techniques that replace or supplement X-ray crystallography.
[0197]
Example 14: Identification of a PRO polypeptide that stimulates the release of TNF-α in human blood (Assay 128)
This assay shows that certain PRO polypeptides of the invention stimulate the release of TNF-α in human blood. PRO polypeptides that test positive in this assay are beneficial, including in other cases, for research purposes where stimulation of TNF-α release is desired, and for increased TNF-α release. Useful for therapeutic treatment of symptoms. In particular, 200 μl of human blood supplemented with 50 mM Hepes buffer (pH 7.2) is aliquoted into wells of a 96-well test plate. Then, to each well, 300 μl of either test PRO polypeptide (various concentrations) contained in 50 mM Hepes buffer or only 50 mM Hepes buffer (negative (negative) control) was added, and the plate was incubated at 37 ° C. for 6 hours. Incubated for hours. The samples were then centrifuged and 50 μl of plasma was collected from each well and tested for the presence of TNF-α by ELISA assay. A positive in the assay is a higher amount of TNF-α in the PRO polypeptide-treated sample compared to a negative (negative) control sample.
The following PRO polypeptides were positive in this assay:
PRO1079, PRO827, PRO791, PRO1131, PRO1316, PRO1183, PRO1343, PRO1760, PRO1567, and PRO4333.
[0198]
Example 15: Promotion of chondrocyte regeneration (Assay 129)
This assay is designed to determine whether a PRO polypeptide of the invention exhibits the ability to induce chondrocyte proliferation and / or regeneration in culture media. PRO polypeptides that evaluate as positive in this assay are expected to be useful in the treatment of various bone and / or cartilage tissue diseases such as, for example, sports injuries and arthritis.
Porcine chondrocytes are isolated by overnight collagenase digestion of articular cartilage of the metacarpophalangeal joints of 4-6 month old sows. The isolated cells were then transferred to Ham F-12 containing 10% FBS and 4 μg / ml gentamicin at 25,000 cells / cm. ² Sowing at a rate of The medium is changed every three days. On day 12, cells were seeded at 5,000 cells / well in 100 μl of the same medium without serum into a 96-well plate, and 100 μl of serum-free medium (negative control), staurosporine (final concentration 5 nM; Add either positive control) or test PRO polypeptide to a final volume of 200 μl / well. After 5 days at 37 ° C., 22 μl of medium containing 100 μg / ml Hoechst 33342 and 50 μg / ml 5-CFDA is added to each well and incubated at 37 ° C. for a further 10 minutes. The green fluorescence of each well is photographed and the stage of chondrocyte differentiation is calculated by morphometric analysis. If cells treated with> 50% PRO polypeptide are differentiated (compared to the background obtained with the negative control), a positive result is obtained in this assay.
In this assay, the PRO6029 polypeptide was evaluated as positive.
[0199]
Example 16: Microarray analysis to detect overexpression of PRO polypeptide in cancerous tumors
Nucleic acid microarrays, which in most cases contain thousands of gene sequences, are useful for identifying genes that are differentially expressed in diseased tissues compared to their normal counterparts. Using nucleic acid microassays, test and control mRNA samples from test and control tissue samples are reverse transcribed and labeled to generate cDNA probes. This cDNA probe is then hybridized to a number of nucleic acids immobilized on a solid support. The array is configured so that the sequence and location of each member of the array is known. For example, one selected from genes known to be expressed at a certain disease stage may be arranged on a solid support. Hybridization of the labeled probe with a particular array member indicates that the sample from which the probe was derived is expressing the gene. If the hybridization signal of the probe from the test (disease tissue) is greater than the hybridization signal of the probe from the control (normal tissue) sample, the gene or genes overexpressed in the disease tissue are identified. The implication of this result is that proteins overexpressed in diseased tissues are useful not only as diagnostic markers for the presence of disease symptoms, but also as therapeutic targets for the treatment of disease symptoms. It is.
The methodology of nucleic acid hybridization and microarray technology is well known to those skilled in the art. In this example, hybridization and special preparation of nucleic acids for probes, slides, and hybridization conditions are all detailed in US Provisional Application No. 60 / 193,767, filed on March 31, 2000. And is incorporated herein by reference.
[0200]
In this example, in an attempt to identify PRO polypeptides that are overexpressed in cancerous tumors, expression of PRO polypeptide-encoding genes associated with non-cancerous human tissues was derived from various human tissues. The cancerous tumors studied were studied. Two sets of experimental data were generated. In one set, cancerous human colon tumor tissue and matched non-cancerous human colon tumor tissue ("matched rectal control") from the same patient were obtained and PRO poly-migrated using the microarray technology described above. Analyzed for peptide expression. In the second set of data, a "universal" epithelial control sample prepared by obtaining any of a variety of different human tumors and pooling non-cancerous human tissues from the epithelium including liver, kidney, and lung And compared. MRNA isolated from pooled tissues represents a mixture of expressed gene products in these different tissues. Microarray hybridization experiments with pooled control samples yielded a linear plot in a two-color analysis. The slope of this line generated in the two-color analysis was then used to normalize the (test: control detection) ratio for each experiment. The normalized ratios of the various experiments were then compared and used to identify gene expression clusters. Thus, pooled "universal control" samples not only allow for the determination of effective and relative gene expression in simple two-sample comparisons, but also allow comparison of multiple samples over several experiments. Also enable.
In this experiment, nucleic acid probes derived from the PRO polypeptide encoding nucleic acid sequences described herein were used for microarray construction, and the above-listed tumor tissue RNA was further used for hybridization. Normalized ratio: The value based on the experimental ratio was named "cutoff". Only values above this cutoff were determined to be significant. Table 8 below shows the results of these experiments, showing that various PRO polypeptides of the present invention are significantly overexpressed in various human tumor tissues compared to non-cancerous human tissue controls. I have. As described above, these data indicate that the PRO polypeptides of the present invention not only serve as diagnostic markers for the presence of one or more cancerous tumors, but also as therapeutic targets for the treatment of these tumors. It also fulfills the function of
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[Brief description of the drawings]
[Fig. 1 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO276 cDNA (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 1 is a clone designated herein as "DNA16435-1208".
[Fig. 2] FIG. 1 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG.
[Fig. 3 This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO284 cDNA (SEQ ID NO: 3). SEQ ID NO: 3 is a clone designated herein as "DNA23318-1211".
[Fig. 4 FIG. 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG.
[Fig. 5 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO193 cDNA (SEQ ID NO: 5). SEQ ID NO: 5 is a clone designated herein as "DNA23322-1393."
[Fig. 6 FIG. 5 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG.
[Fig. 7 This shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) of native sequence PRO190 cDNA. SEQ ID NO: 7 is a clone designated herein as "DNA2334-1392."
[Fig. 8 FIG. 7 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) derived from the coding sequence shown in SEQ ID NO: 7.
[Fig. 9 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO180 cDNA (SEQ ID NO: 9). SEQ ID NO: 9 is a clone designated herein as "DNA26843-1389".
[Fig. FIG. 9 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 9 shown in FIG.
[Fig. 11 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) of native sequence PRO194 cDNA. SEQ ID NO: 11 is a clone designated herein as "DNA26844-1394."
[Fig. FIG. 11 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 11 shown in FIG.
[Fig. 13 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO218 cDNA (SEQ ID NO: 13). SEQ ID NO: 13 is a clone designated herein as "DNA30867-1335."
[Fig. 14 FIG. 13 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 13 shown in FIG.
[Fig. 15 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO260 cDNA (SEQ ID NO: 15). SEQ ID NO: 15 is a clone designated herein as "DNA33470-1175."
[Fig. FIG. 15 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 15 shown in FIG.
[Fig. 17 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO233 cDNA (SEQ ID NO: 17). SEQ ID NO: 17 is a clone designated herein as "DNA3446-1238".
[Fig. FIG. 17 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 17 shown in FIG.
[Fig. 19 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO234 cDNA (SEQ ID NO: 19). SEQ ID NO: 19 is a clone designated herein as "DNA35557-1137."
[Fig. 20. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 19 shown in 19 is shown.
[Fig. 21 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO236 cDNA (SEQ ID NO: 21). SEQ ID NO: 21 is a clone designated herein as "DNA35599-1168."
[Fig. FIG. 21 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 21 shown in FIG.
[Fig. 23 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO244 cDNA (SEQ ID NO: 23). SEQ ID NO: 23 is a clone designated herein as "DNA35668-1171."
[Fig. FIG. 23 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in 23.
[Fig. 25 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO262 cDNA (SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 25 is a clone designated herein as "DNA36992-1168."
[Fig. FIG. 25 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 25 shown in FIG.
[Fig. 27 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO271 cDNA (SEQ ID NO: 27). SEQ ID NO: 27 is a clone designated herein as "DNA3942-1182."
[Fig. FIG. 27 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 27 shown in SEQ ID NO: 27.
[Fig. 29 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO268 cDNA (SEQ ID NO: 29). SEQ ID NO: 29 is a clone designated herein as "DNA39427-1179".
[Fig. FIG. 29 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 30) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 29 shown in 29.
[Fig. 31 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO270 cDNA (SEQ ID NO: 31). SEQ ID NO: 31 is a clone designated herein as "DNA39510-1181."
[Fig. FIG. 31 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 31 shown in FIG.
[Fig. 33 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO355 cDNA (SEQ ID NO: 33). SEQ ID NO: 33 is a clone designated herein as "DNA39518-1247".
[Fig. FIG. 33 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 34) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 33 shown in 33.
[Fig. 35 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO298 cDNA (SEQ ID NO: 35). SEQ ID NO: 35 is a clone designated herein as "DNA39975-1210."
[Fig. 36. 35 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 35 shown in 35.
[Fig. 37 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO299 cDNA (SEQ ID NO: 37). SEQ ID NO: 37 is a clone designated herein as "DNA3997-1215".
[Fig. 38. 37 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 38) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 37.
[Fig. 39 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO296 cDNA (SEQ ID NO: 39). SEQ ID NO: 39 is a clone designated herein as "DNA39979-1213."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 40) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 39 shown in 39 is shown.
[Fig. 41 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO329 cDNA (SEQ ID NO: 41). SEQ ID NO: 41 is a clone designated herein as "DNA40594-1233."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 42) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 41 shown in 41 is shown.
[Fig. 43 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO330 cDNA (SEQ ID NO: 43). SEQ ID NO: 43 is a clone designated herein as "DNA40603-1232."
[Fig. FIG. 43 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 44) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 43 shown in 43.
[Fig. 45 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO294 cDNA (SEQ ID NO: 45). SEQ ID NO: 45 is a clone designated herein as "DNA40604-1187."
[Fig. 46. 45 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 46) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 45 shown in 45.
[Fig. 47 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO300 cDNA (SEQ ID NO: 47). SEQ ID NO: 47 is a clone designated herein as "DNA40625-1189".
[Fig. 48. 47 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 48) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 47 shown in 47.
[Fig. 49 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 49) of native sequence PRO307 cDNA. SEQ ID NO: 49 is a clone designated herein as "DNA41225-1217".
[Fig. 50. 49 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 50) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 49 shown in 49.
[Fig. 51 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO334 cDNA (SEQ ID NO: 51). SEQ ID NO: 51 is a clone designated herein as "DNA41379-1236".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 51 shown in 51 is shown.
[Fig. 53 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO352 cDNA (SEQ ID NO: 53). SEQ ID NO: 53 is a clone designated herein as "DNA41386-1316".
[Fig. FIG. 53 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 54) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 53 shown in 53.
[Fig. 55 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO710 cDNA (SEQ ID NO: 55). SEQ ID NO: 55 is a clone designated herein as "DNA44161-1434."
[Fig. FIG. 55 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 56) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 55 shown in 55.
[Fig. 57 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO873 cDNA (SEQ ID NO: 57). SEQ ID NO: 57 is a clone designated herein as "DNA44179-1362".
[Fig. FIG. 57 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 58) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 57 shown in 57.
[Fig. 59 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO354 cDNA (SEQ ID NO: 59). SEQ ID NO: 59 is a clone designated herein as "DNA44192-1246".
[Fig. 60. 59 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 60) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 59 shown in 59.
[Fig. 61 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1151 cDNA (SEQ ID NO: 61). SEQ ID NO: 61 is a clone designated herein as "DNA44694-1500".
[Fig. FIG. 61 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 62) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 61 shown in 61.
[Fig. 63 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO382 cDNA (SEQ ID NO: 63). SEQ ID NO: 63 is a clone designated herein as "DNA45234-1277."
[Fig. FIG. 63 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 64) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 63 shown in 63.
[Fig. 65 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1864 cDNA (SEQ ID NO: 65). SEQ ID NO: 65 is a clone designated herein as "DNA45409-2511."
[Fig. FIG. 67 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 66) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 65 shown in SEQ ID NO: 65.
[Fig. 67 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO386 cDNA (SEQ ID NO: 67). SEQ ID NO: 67 is a clone designated herein as "DNA45415-1318".
[Fig. 68. 67 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 68) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 67 shown in 67.
[Fig. 69 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO541 cDNA (SEQ ID NO: 69). SEQ ID NO: 69 is a clone designated herein as "DNA45417-1432."
[Fig. 70. 69 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 70) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 69 shown in 69.
[Fig. 71 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO852 cDNA (SEQ ID NO: 71). SEQ ID NO: 71 is a clone designated herein as "DNA45493-1349".
[Fig. 72. 71 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 72) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 71 shown in 71.
[Fig. 73 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO700 cDNA (SEQ ID NO: 73). SEQ ID NO: 73 is a clone designated herein as "DNA46776-1284."
[Fig. 74. 73 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 74) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 73 shown in 73.
[Fig. 75A-75B shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO708 cDNA (SEQ ID NO: 75). SEQ ID NO: 75 is a clone designated herein as "DNA48296-1292."
[Fig. FIG. FIG. 35 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 76) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 75 shown in 75A-75B.
[Fig. 77 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO707 cDNA (SEQ ID NO: 77). SEQ ID NO: 77 is a clone designated herein as "DNA48306-1291".
[Fig. 78. 77 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 78) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 77 shown in 77.
[Fig. 79 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO864 cDNA (SEQ ID NO: 79). SEQ ID NO: 79 is a clone designated herein as "DNA48328-1355."
[Fig. 80. 79 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 80) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 79 shown in 79.
[Fig. 81 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO706 cDNA (SEQ ID NO: 81). SEQ ID NO: 81 is a clone designated herein as "DNA48329-1290".
[Fig. 82. 81 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 82) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 81 shown in 81.
[Fig. 83 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO732 cDNA (SEQ ID NO: 83). SEQ ID NO: 83 is a clone designated herein as "DNA48334-1435."
[Fig. 84. 73 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 84) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 83 shown in 83.
[Fig. 85 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO537 cDNA (SEQ ID NO: 85). SEQ ID NO: 85 is a clone designated herein as "DNA49141-1431".
[Fig. 86. 85 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 86) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 85 shown in 85.
[Fig. 87 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO545 cDNA (SEQ ID NO: 87). SEQ ID NO: 87 is a clone designated herein as "DNA49624-1279".
[Fig. FIG. 87 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 88) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 87 shown in 87.
[Fig. 89 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO718 cDNA (SEQ ID NO: 89). SEQ ID NO: 89 is a clone designated herein as "DNA49647-1398."
[Fig. 90. 89 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 90) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 89 shown in 89.
[Fig. 91 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO872 cDNA (SEQ ID NO: 91). SEQ ID NO: 91 is a clone designated herein as "DNA49819-1439".
[Fig. FIG. 91 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 92) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 91 shown in 91.
[Fig. 93 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO704 cDNA (SEQ ID NO: 93). SEQ ID NO: 93 is a clone designated herein as "DNA50911-1288."
[Fig. FIG. 93 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 94) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 93 shown in 93.
[Fig. 95 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO705 cDNA (SEQ ID NO: 95). SEQ ID NO: 95 is a clone designated herein as "DNA50914-1289."
[Fig. 96. 95 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 96) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 95 shown in 95.
[Fig. 97 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO871 cDNA (SEQ ID NO: 97). SEQ ID NO: 97 is a clone designated herein as "DNA50919-1361."
[Fig. 98. 97 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 98) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 97 shown in 97.
[Fig. 99 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO702 cDNA (SEQ ID NO: 99). SEQ ID NO: 99 is a clone designated herein as "DNA50980-1286."
[Fig. 100. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 100) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 99 shown in SEQ ID NO: 99 is shown.
[Fig. 101 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO944 cDNA (SEQ ID NO: 101). SEQ ID NO: 101 is a clone designated herein as "DNA52185-1370".
[Fig. FIG. 101 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 102) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 101 shown in 101.
[Fig. 103 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO739 cDNA (SEQ ID NO: 103). SEQ ID NO: 103 is a clone designated herein as "DNA52756."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 104) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 103 shown in 103 is shown.
[Fig. 105 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO941 cDNA (SEQ ID NO: 105). SEQ ID NO: 105 is a clone designated herein as "DNA53906-1368."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 106) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 105 shown in 105 is shown.
[Fig. 107 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1082 cDNA (SEQ ID NO: 107). SEQ ID NO: 107 is a clone designated herein as "DNA53912-1457."
[Fig. FIG. 107 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 108) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 107 shown in 107.
[Fig. The nucleotide sequence of the native sequence PRO1133 cDNA (SEQ ID NO: 109) is shown. SEQ ID NO: 109 is a clone designated herein as "DNA53913-1490".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 110) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 109 shown in 109 is shown.
[Fig. 111 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO983 cDNA (SEQ ID NO: 111). SEQ ID NO: 111 is a clone designated herein as "DNA53977-1371."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 112) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 111 shown in 111 is shown.
[Fig. 113 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO784 cDNA (SEQ ID NO: 113). SEQ ID NO: 113 is a clone designated herein as "DNA53974-1443."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 114) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 113 shown in 113 is shown.
[Fig. 115 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO783 cDNA (SEQ ID NO: 115). SEQ ID NO: 115 is a clone designated herein as "DNA53996-1442."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 116) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 115 shown in 115 is shown.
[Fig. 117 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO940 cDNA (SEQ ID NO: 117). SEQ ID NO: 117 is a clone designated herein as "DNA54002-1367."
[Fig. FIG. 117 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 118) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 117 shown in 117.
[Fig. 119 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO768 cDNA (SEQ ID NO: 119). SEQ ID NO: 119 is a clone designated herein as "DNA55737-1345."
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 120 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 119 (SEQ ID NO: 120).
[Fig. 121 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1079 cDNA (SEQ ID NO: 121). SEQ ID NO: 121 is a clone designated herein as "DNA56050-1455".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 122) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 121 shown in 121 is shown.
[Fig. 123 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1078 cDNA (SEQ ID NO: 123). SEQ ID NO: 123 is a clone designated herein as "DNA56052-1454."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 124) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 123 shown in 123 is shown.
[Fig. 125 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1018 cDNA (SEQ ID NO: 125). SEQ ID NO: 125 is a clone designated herein as "DNA56107-1415."
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 125 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 126) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 125.
[Fig. 127 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO793 cDNA (SEQ ID NO: 127). SEQ ID NO: 127 is a clone designated herein as "DNA56110-1437".
[Fig. FIG. 127 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 128) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 127 shown in 127.
[Fig. 129 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1773 cDNA (SEQ ID NO: 129) SEQ ID NO: 129 is a clone designated herein as "DNA56406-1704."
[Fig. FIG. 129 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 130) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 129 shown in FIG.
[Fig. 131 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1014 cDNA (SEQ ID NO: 131). SEQ ID NO: 131 is a clone designated herein as "DNA56409-1377."
[Fig. 132. 131 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 132) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 131 shown in 131.
[Fig. 133 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1013 cDNA (SEQ ID NO: 133). SEQ ID NO: 133 is a clone designated herein as "DNA56410-1414."
[Fig. FIG. 133 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 134) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 133 shown in FIG.
[Fig. 135 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO937 cDNA (SEQ ID NO: 135). SEQ ID NO: 135 is a clone designated herein as "DNA56436-1448".
[Fig. FIG. 135 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 136) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 135 shown in 135.
[Fig. 137 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 137) of the native sequence PRO1377 cDNA. SEQ ID NO: 137 is a clone designated herein as "DNA56529-1647".
[Fig. 138. 137 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 137 (SEQ ID NO: 138).
[Fig. 139 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 139) of native sequence PRO842 cDNA. SEQ ID NO: 139 is a clone designated herein as "DNA56855-1447."
[Fig. FIG. 139 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 140) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 139 shown in FIG.
[Fig. 141 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO839 cDNA (SEQ ID NO: 141). SEQ ID NO: 141 is a clone designated herein as "DNA56859-1445".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 142) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 141 shown in 141 is shown.
[Fig. 143 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1180 cDNA (SEQ ID NO: 143) SEQ ID NO: 143 is a clone designated herein as "DNA56860-1510."
[Fig. FIG. 143 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 144) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 143 shown in SEQ ID NO: 143
[Fig. 145 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1134 cDNA (SEQ ID NO: 145). SEQ ID NO: 145 is a clone designated herein as "DNA56865-1491."
[Fig. 146. 145 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 145 (SEQ ID NO: 146).
[Fig. 147 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1115 cDNA (SEQ ID NO: 147) SEQ ID NO: 147 is a clone designated herein as "DNA56868-1478".
[Fig. 148. 147 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 148) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 147.
[Fig. 149 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 149) of native sequence PRO1277 cDNA. SEQ ID NO: 149 is a clone designated herein as "DNA56869-1545".
[Fig. FIG. 149 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 150) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 149.
[Fig. 151 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1135 cDNA (SEQ ID NO: 151). SEQ ID NO: 151 is a clone designated herein as "DNA56870-1492."
[Fig. 152. 151 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 152) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 151 shown in FIG.
[Fig. 153 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO827 cDNA (SEQ ID NO: 153) SEQ ID NO: 153 is a clone designated herein as "DNA57039-1402".
[Fig. 154. 153 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 154) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 153 shown in SEQ ID NO: 153;
[Fig. 155 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1057 cDNA (SEQ ID NO: 155). SEQ ID NO: 155 is a clone designated herein as "DNA57253-1382".
[Fig. 156. 155 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 156) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 155 shown in 155.
[Fig. 157 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1113 cDNA (SEQ ID NO: 157). SEQ ID NO: 157 is a clone designated herein as "DNA57254-1477."
[Fig. FIG. 157 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 157 (SEQ ID NO: 158).
[Fig. 159 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 159) of native sequence PRO1006 cDNA. SEQ ID NO: 159 is a clone designated herein as "DNA57699-1412."
[Fig. FIG. 159 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 160) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 159 shown in FIG.
[Fig. 161 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 161) of native sequence PRO1074 cDNA. SEQ ID NO: 161 is a clone designated herein as "DNA57704-1452."
[Fig. 162. FIG. 161 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 161 (SEQ ID NO: 162).
[Fig. 163 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1073 cDNA (SEQ ID NO: 163) SEQ ID NO: 163 is a clone designated herein as "DNA57710-1451".
[Fig. 164. 163 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 164) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 163.
[Fig. 165 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1136 cDNA (SEQ ID NO: 165). SEQ ID NO: 165 is a clone designated herein as "DNA57827-1493."
[Fig. 166. 165 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 166) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 165 shown in FIG.
[Fig. 167 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1004 cDNA (SEQ ID NO: 167). SEQ ID NO: 167 is a clone designated herein as "DNA57844-1410".
[Fig. 168. 167 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 167 (SEQ ID NO: 168).
[Fig. 169 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1344 cDNA (SEQ ID NO: 169). SEQ ID NO: 169 is a clone designated herein as "DNA58723-1588."
[Fig. 170. 169 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 170) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 169.
[Fig. 171 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1110 cDNA (SEQ ID NO: 171) SEQ ID NO: 171 is a clone designated herein as "DNA58727-1474."
[Fig. 172. FIG. 17 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 172) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 171 shown in FIG.
[Fig. 173 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1378 cDNA (SEQ ID NO: 173). SEQ ID NO: 173 is a clone designated herein as "DNA58730-1607."
[Fig. 174. 173 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 174) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 173.
[Fig. 175 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1481 cDNA (SEQ ID NO: 175). SEQ ID NO: 175 is a clone designated herein as "DNA58732-1650".
[Fig. 176. 175 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 175 (SEQ ID NO: 176).
[Fig. 177 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 177) of native sequence PRO1109 cDNA. SEQ ID NO: 177 is a clone designated herein as "DNA58737-1473".
[Fig. FIG. 177 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 178) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 177.
[Fig. 179 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1383 cDNA (SEQ ID NO: 179). SEQ ID NO: 179 is a clone designated herein as "DNA58743-1609".
[Fig. 180. 179 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 180) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 179 shown in 179.
[Fig. 181 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 181) of native sequence PRO1072 cDNA. SEQ ID NO: 181 is a clone designated herein as "DNA58747-1384".
[Fig. 182. FIG. 181 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 182) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 181 shown in SEQ ID NO: 181.
[Fig. 183 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1189 cDNA (SEQ ID NO: 183). SEQ ID NO: 183 is a clone designated herein as "DNA58828-1519".
[Fig. 184. 183 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 183 (SEQ ID NO: 184).
[Fig. 185 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1003 cDNA (SEQ ID NO: 185). SEQ ID NO: 185 is a clone designated herein as "DNA58846-1409".
[Fig. 186. FIG. 185 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 186) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 185.
[Fig. 187 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1108 cDNA (SEQ ID NO: 187). SEQ ID NO: 187 is a clone designated herein as "DNA58848-1472".
[Fig. 188. 187 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 188) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 187.
[Fig. 189 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1137 cDNA (SEQ ID NO: 189). SEQ ID NO: 189 is a clone designated herein as "DNA58849-1494."
[Fig. FIG. 189 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 190) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 189.
[Fig. 191 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO1138 cDNA (SEQ ID NO: 191). SEQ ID NO: 191 is a clone designated herein as "DNA58850-1495".
[Fig. 192. 191 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 192) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 191 shown in 191.
[Fig. 193 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1415 cDNA (SEQ ID NO: 193). SEQ ID NO: 193 is a clone designated herein as "DNA58852-1637".
[Fig. 194. 193 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 193 (SEQ ID NO: 194).
[Fig. 195 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1054 cDNA (SEQ ID NO: 195). SEQ ID NO: 195 is a clone designated herein as "DNA58853-1423".
[Fig. 196. FIG. 195 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 196) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 195 shown in 195.
[Fig. 197 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO994 cDNA (SEQ ID NO: 197). SEQ ID NO: 197 is a clone designated herein as "DNA5885-1422."
[Fig. 198. 197 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 198) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 197 shown in 197.
[Fig. 199 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1069 cDNA (SEQ ID NO: 199). SEQ ID NO: 199 is a clone designated herein as "DNA5921-1450".
[Fig. FIG. 199 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 200) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 199.
[Fig. 201 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1411 cDNA (SEQ ID NO: 101). SEQ ID NO: 201 is a clone designated herein as "DNA59212-1627".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 202) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 201 shown in 201 is shown.
[Fig. 203 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1129 cDNA (SEQ ID NO: 203). SEQ ID NO: 203 is a clone designated herein as "DNA59213-1487."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 204) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 203 shown in 203 is shown.
[Fig. 205 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1359 cDNA (SEQ ID NO: 205). SEQ ID NO: 205 is a clone designated herein as "DNA59219-1613."
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 205 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 206) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 205.
[Fig. 207 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1139 cDNA (SEQ ID NO: 207). SEQ ID NO: 207 is a clone designated herein as "DNA59497-1496".
[Fig. FIG. 207 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 208) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 207 shown in 207.
[Fig. 209 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 209) of native sequence PRO1065 cDNA. SEQ ID NO: 209 is a clone designated herein as "DNA59602-1436."
[Fig. FIG. 209 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 210) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 209 shown in 209;
[Fig. 211 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1028 cDNA (SEQ ID NO: 211). SEQ ID NO: 211 is a clone designated herein as "DNA59603-1419".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 212) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 211 shown in 211 is shown.
[Fig. 213 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 213) of native sequence PRO1027 cDNA. SEQ ID NO: 213 is a clone designated herein as "DNA59605-1418".
[Fig. FIG. 213 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 214) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 213.
[Fig. 215 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1140 cDNA (SEQ ID NO: 215). SEQ ID NO: 215 is a clone designated herein as "DNA59607-1497."
[Fig. FIG. 215 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 216) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 215 shown in SEQ ID NO: 215.
[Fig. 217 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 217) of native sequence PRO1291 cDNA. SEQ ID NO: 217 is a clone designated herein as "DNA59610-1556".
[Fig. FIG. 217 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 218) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 217.
[Fig. 219 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1105 cDNA (SEQ ID NO: 219). SEQ ID NO: 219 is a clone designated herein as "DNA59612-1466."
[Fig. FIG. 219 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 220) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 219.
[Fig. 221 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1026 cDNA (SEQ ID NO: 221) SEQ ID NO: 221 is a clone designated herein as "DNA59613-1417".
[Fig. FIG. 221 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 222) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 221.
[Fig. 223 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1104 cDNA (SEQ ID NO: 223) SEQ ID NO: 223 is a clone designated herein as "DNA59616-1465".
[Fig. FIG. 223 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 224) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 223.
[Fig. 225 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1100 cDNA (SEQ ID NO: 225) SEQ ID NO: 225 is a clone designated herein as "DNA59619-1464".
[Fig. FIG. 225 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 226) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 225 shown in SEQ ID NO: 225.
[Fig. 227 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1141 cDNA (SEQ ID NO: 227). SEQ ID NO: 227 is a clone designated herein as "DNA59625-1498".
[Fig. FIG. 227 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 228) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 227 shown in SEQ ID NO: 227.
[Fig. 229 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 229) of native sequence PRO1772 cDNA. SEQ ID NO: 229 is a clone designated herein as "DNA59817-1703."
[Fig. 230. 229 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 230) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 229 shown in FIG.
[Fig. 231 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1064 cDNA (SEQ ID NO: 231) SEQ ID NO: 231 is a clone designated herein as "DNA59827-1426".
[Fig. FIG. 231 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 232) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 231 shown in FIG.
[Fig. 233 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 233) of native sequence PRO1379 cDNA. SEQ ID NO: 233 is a clone designated herein as "DNA59828-1608".
[Fig. FIG. 233 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 234) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 233.
[Fig. 235 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3573 cDNA (SEQ ID NO: 235). SEQ ID NO: 235 is a clone designated herein as "DNA59837-2545."
[Fig. FIG. 235 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 235 (SEQ ID NO: 236).
[Fig. 237 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3566 cDNA (SEQ ID NO: 237). SEQ ID NO: 237 is a clone designated herein as "DNA59844-2542."
[Fig. FIG. 237 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 238) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 237.
[Fig. 239 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1156 cDNA (SEQ ID NO: 239). SEQ ID NO: 239 is a clone designated herein as "DNA59853-1505."
[Fig. 240. 239 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 240) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 239.
[Fig. 241 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1098 cDNA (SEQ ID NO: 241) SEQ ID NO: 241 is a clone designated herein as "DNA59854-1459".
[Fig. 242. FIG. 24 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 242) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 241 shown in FIG.
[Fig. 243 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 243) of native sequence PRO1128 cDNA. SEQ ID NO: 243 is a clone designated herein as "DNA59855-1485."
[Fig. FIG. 243 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 244) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 243.
[Fig. 245 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1248 cDNA (SEQ ID NO: 245). SEQ ID NO: 245 is a clone designated herein as "DNA60278-1530".
[Fig. 246. 245 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 246) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 245.
[Fig. 247 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 247) of native sequence PRO1127 cDNA. SEQ ID NO: 247 is a clone designated herein as "DNA60283-1484".
[Fig. 248. 247 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 248) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 247.
[Fig. 249 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1316 cDNA (SEQ ID NO: 249) SEQ ID NO: 249 is a clone designated herein as "DNA60608-1577."
[Fig. FIG. 249 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 250) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 249.
[Fig. 251 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1197 cDNA (SEQ ID NO: 251) SEQ ID NO: 251 is a clone designated herein as "DNA60611-1524."
[Fig. 252. 251 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 252) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 251.
[Fig. 253 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 253) of native sequence PRO1125 cDNA. SEQ ID NO: 253 is a clone designated herein as "DNA60619-1482".
[Fig. 254. 253 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 253 (SEQ ID NO: 254).
[Fig. 255 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1158 cDNA (SEQ ID NO: 255). SEQ ID NO: 255 is a clone designated herein as "DNA60625-1507."
[Fig. FIG. 255 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 256) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 255 shown in 255.
[Fig. 257 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 257) of native sequence PRO1124 cDNA. SEQ ID NO: 257 is a clone designated herein as "DNA60629-1481."
[Fig. FIG. 257 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 257 (SEQ ID NO: 258).
[Fig. 259 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 259) of native sequence PRO1380 cDNA. SEQ ID NO: 259 is a clone designated herein as "DNA60740-1615."
[Fig. FIG. 259 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 259 (SEQ ID NO: 260).
[Fig. 261 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 261) of native sequence PRO1377 cDNA. SEQ ID NO: 261 is a clone designated herein as "DNA61608-1606".
[Fig. 262. 26 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 262) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 261 shown in FIG.
[Fig. 263 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1287 cDNA (SEQ ID NO: 263). SEQ ID NO: 263 is a clone designated herein as "DNA61755-1554."
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 264 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 264) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 263.
[Fig. 265 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 265) of native sequence PRO1249 cDNA. SEQ ID NO: 265 is a clone designated herein as "DNA62809-1531".
[Fig. FIG. 265 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 266) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 265 shown in SEQ ID NO: 265.
[Fig. 267 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1335 cDNA (SEQ ID NO: 267). SEQ ID NO: 267 is a clone designated herein as "DNA62812-1594."
[Fig. FIG. 267 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 268) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 267.
[Fig. 269 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3572 cDNA (SEQ ID NO: 269). SEQ ID NO: 269 is a clone designated herein as "DNA62813-2544."
[Fig. 270. 269 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 270) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 269.
[Fig. 271 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1599 cDNA (SEQ ID NO: 271) SEQ ID NO: 271 is a clone designated herein as "DNA62845-1684."
[Fig. 272. 271 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 272) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 271.
[Fig. 273 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1374 cDNA (SEQ ID NO: 273). SEQ ID NO: 273 is a clone designated herein as "DNA64849-1604".
[Fig. 274. 273 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 274) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 273.
[Fig. 275 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1345 cDNA (SEQ ID NO: 275) SEQ ID NO: 275 is a clone designated herein as "DNA64852-1589".
[Fig. 276. 275 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 275 (SEQ ID NO: 276).
[Fig. 277 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1311 cDNA (SEQ ID NO: 277). SEQ ID NO: 277 is a clone designated herein as "DNA64863-1573."
[Fig. FIG. 277 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 278) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 277 shown in SEQ ID NO: 277.
[Fig. 279 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1357 cDNA (SEQ ID NO: 279). SEQ ID NO: 279 is a clone designated herein as "DNA64881-1602".
[Fig. FIG. 279 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 280) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 279.
[Fig. 281 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1557 cDNA (SEQ ID NO: 281). SEQ ID NO: 281 is a clone designated herein as "DNA64902-1667".
[Fig. 282. 281 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 282) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 281.
[Fig. 283 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1305 cDNA (SEQ ID NO: 283). SEQ ID NO: 283 is a clone designated herein as "DNA64952-1568".
[Fig. 284. FIG. 283 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 284) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 283.
[Fig. 285 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 285) of native sequence PRO1302 cDNA. SEQ ID NO: 285 is a clone designated herein as "DNA65403-1565."
[Fig. 286. 285 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 285 (SEQ ID NO: 286).
[Fig. 287 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1266 cDNA (SEQ ID NO: 287). SEQ ID NO: 287 is a clone designated herein as "DNA65413-1534".
[Fig. FIG. 287 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 287 (SEQ ID NO: 288).
[Fig. 289A-289B shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1336 cDNA (SEQ ID NO: 289). SEQ ID NO: 289 is a clone designated herein as "DNA65423-1595."
[Fig. 290. FIG. 289A-289B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 290) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 289.
[Fig. 291 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1278 cDNA (SEQ ID NO: 291) SEQ ID NO: 291 is a clone designated herein as "DNA66304-1546."
[Fig. 292. 291 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 292) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 291 shown in 291.
[Fig. 293 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1270 cDNA (SEQ ID NO: 293) SEQ ID NO: 293 is a clone designated herein as "DNA66308-1537".
[Fig. 294. FIG. 293 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 294) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 293.
[Fig. 295 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 295) of native sequence PRO1298 cDNA. SEQ ID NO: 295 is a clone designated herein as "DNA66511-1563".
[Fig. 296. FIG. 295 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 296) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 295.
[Fig. 297 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 297) of native sequence PRO1301 cDNA SEQ ID NO: 297 is a clone designated herein as "DNA66512-1564".
[Fig. 298. 297 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 298) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 297.
[Fig. 299 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1268 cDNA (SEQ ID NO: 299) SEQ ID NO: 299 is a clone designated herein as "DNA66519-1535".
[Fig. FIG. 299 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 300) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 299.
[Fig. 301 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1327 cDNA (SEQ ID NO: 101). SEQ ID NO: 301 is a clone designated herein as "DNA66521-1583."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 302) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 301 shown in 301 is shown.
[Fig. The nucleotide sequence of the native sequence PRO1328 cDNA (SEQ ID NO: 303) is shown. SEQ ID NO: 303 is a clone designated herein as "DNA66658-1584."
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 304) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 303 shown in 303 is shown.
[Fig. 305 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1329 cDNA (SEQ ID NO: 305). SEQ ID NO: 305 is a clone designated herein as "DNA66660-1585."
[Fig. FIG. 305 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 306) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 305 shown in 305.
[Fig. 307 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 307) of native sequence PRO1339 cDNA SEQ ID NO: 307 is a clone designated herein as "DNA66669-1597."
[Fig. FIG. 307 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 308) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 307 shown in SEQ ID NO: 307.
[Fig. 309 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1342 cDNA (SEQ ID NO: 309) SEQ ID NO: 309 is a clone designated herein as "DNA66674-1599."
[Fig. FIG. 309 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 310) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 309 shown in 309.
[Fig. 311A-311B shows the nucleotide sequence of native sequence PRO1487 cDNA (SEQ ID NO: 311). SEQ ID NO: 311 is a clone designated herein as "DNA68836-1656."
[Fig. 312. SEQ ID NO: 311 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 311 shown in 311A to 311B.
[Fig. 313 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3579 cDNA (SEQ ID NO: 313) SEQ ID NO: 313 is a clone designated herein as "DNA68862-2546."
[Fig. 314. 313 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 314) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 313.
[Fig. 315 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1472 cDNA (SEQ ID NO: 315) SEQ ID NO: 315 is a clone designated herein as "DNA68866-1644".
[Fig. 316. 315 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 316) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 315.
[Fig. 317 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1385 cDNA (SEQ ID NO: 317) SEQ ID NO: 317 is a clone designated herein as "DNA68869-1610".
[Fig. FIG. 317 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 318) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 317 shown in 317.
[Fig. 319 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1461 cDNA (SEQ ID NO: 319). SEQ ID NO: 319 is a clone designated herein as "DNA68871-1638".
[Fig. FIG. 319 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 320) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 319 shown in SEQ ID NO: 319.
[Fig. 321 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1429 cDNA (SEQ ID NO: 321) SEQ ID NO: 321 is a clone designated herein as "DNA68879-1631".
[Fig. FIG. 321 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 322) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 321.
[Fig. 323 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1568 cDNA (SEQ ID NO: 323) SEQ ID NO: 323 is a clone designated herein as "DNA68880-1676."
[Fig. 324. 323 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 324) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 323.
[Fig. 325 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1569 cDNA (SEQ ID NO: 325) SEQ ID NO: 325 is a clone designated herein as "DNA68881-1677."
[Fig. FIG. 325 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 326) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 325.
[Fig. 327 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1753 cDNA (SEQ ID NO: 327) SEQ ID NO: 327 is a clone designated herein as "DNA68883-1691."
[Fig. FIG. 327 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 328) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 327.
[Fig. 329 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1570 cDNA (SEQ ID NO: 329) SEQ ID NO: 329 is a clone designated herein as "DNA68885-1678".
[Fig. FIG. 329 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 330) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 329.
[Fig. 331 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1559 cDNA (SEQ ID NO: 331) SEQ ID NO: 331 is a clone designated herein as "DNA68886."
[Fig. FIG. 331 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 332) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 331 shown in FIG.
[Fig. 333 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1486 cDNA (SEQ ID NO: 333). SEQ ID NO: 333 is a clone designated herein as "DNA71180-1655".
[Fig. FIG. 333 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 334) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 333.
[Fig. 335 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1433 cDNA (SEQ ID NO: 335) SEQ ID NO: 335 is a clone designated herein as "DNA71184-1634".
[Fig. FIG. 335 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 336) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 335 shown in 335.
[Fig. 337 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1490 cDNA (SEQ ID NO: 337). SEQ ID NO: 337 is a clone designated herein as "DNA71213-1659".
[Fig. 338. 337 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 338) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 337.
[Fig. 339 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1482 cDNA (SEQ ID NO: 339). SEQ ID NO: 339 is a clone designated herein as "DNA71234-1651".
[Fig. FIG. 339 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 340) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 339.
[Fig. 341 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 341) of native sequence PRO1409 cDNA SEQ ID NO: 341 is a clone designated herein as "DNA71269-1621".
[Fig. 342. 341 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 342) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 341.
[Fig. 343 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1446 cDNA (SEQ ID NO: 343) SEQ ID NO: 343 is a clone designated herein as "DNA71277-1636".
[Fig. 344. 343 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 344) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 343.
[Fig. 345 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1604 cDNA (SEQ ID NO: 345) SEQ ID NO: 345 is a clone designated herein as "DNA71286-1687".
[Fig. 346. 345 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 346) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 345.
[Fig. 347 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1491 cDNA (SEQ ID NO: 347). SEQ ID NO: 347 is a clone designated herein as "DNA7183-1660".
[Fig. 348. 347 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 348) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 347.
[Fig. 349 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 349) of native sequence PRO1431 cDNA. SEQ ID NO: 349 is a clone designated herein as "DNA73401-1633".
[Fig. FIG. 349 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 350) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 349.
[Fig. 351A-351B shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1563 cDNA (SEQ ID NO: 351). SEQ ID NO: 351 is a clone designated herein as "DNA73492-1671."
[Fig. 352. 351 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 352) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 351 shown in 351A-351B.
[Fig. 353 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 353) of native sequence PRO1571 cDNA. SEQ ID NO: 353 is a clone designated herein as "DNA73730-1679".
[Fig. 354. 353 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 354) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 353 shown in 353.
[Fig. 355 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1572 cDNA (SEQ ID NO: 355) SEQ ID NO: 355 is a clone designated herein as "DNA73734-1680".
[Fig. 356. 355 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 356) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 355 shown in 355.
[Fig. 357 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1573 cDNA (SEQ ID NO: 357). SEQ ID NO: 357 is a clone designated herein as "DNA73735-1681."
[Fig. 358. 357 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 358) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 357 shown in 357.
[Fig. 359 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 359) of native sequence PRO1508 cDNA. SEQ ID NO: 359 is a clone designated herein as "DNA73742-1662."
[Fig. 360. 359 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 360) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 359 shown in 359.
[Fig. 361 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1485 cDNA (SEQ ID NO: 361) SEQ ID NO: 361 is a clone designated herein as "DNA73746-1654."
[Fig. 362. 361 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 362) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 361.
[Fig. 363 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 363) of native sequence PRO1564 cDNA. SEQ ID NO: 363 is a clone designated herein as "DNA73760-1672".
[Fig. 364. 363 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 364) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 363.
[Fig. 365 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1550 cDNA (SEQ ID NO: 365). SEQ ID NO: 365 is a clone designated herein as "DNA76393-1664".
[Fig. FIG. 67 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 366) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 365 shown in 365.
[Fig. 367 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 367) of native sequence PRO1757 cDNA. SEQ ID NO: 367 is a clone designated herein as "DNA76398-1699."
[Fig. FIG. 367 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 368) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 367 shown in 367.
[Fig. 369 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1758 cDNA (SEQ ID NO: 369). SEQ ID NO: 369 is a clone designated herein as "DNA76399-1700".
[Fig. 370. 369 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 370) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 369 shown in 369.
[Fig. 371 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1781 cDNA (SEQ ID NO: 371) SEQ ID NO: 371 is a clone designated herein as "DNA76522-2500".
[Fig. FIG. 371 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 372) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 371.
[Fig. 373 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1606 cDNA (SEQ ID NO: 373) SEQ ID NO: 373 is a clone designated herein as "DNA76533-1689".
[Fig. 374. 373 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 374) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 373 shown in 373.
[Fig. 375 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1784 cDNA (SEQ ID NO: 375) SEQ ID NO: 375 is a clone designated herein as "DNA77303-2502".
[Fig. 376. 375 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 375 (SEQ ID NO: 376).
[Fig. 377 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1774 cDNA (SEQ ID NO: 377). SEQ ID NO: 377 is a clone designated herein as "DNA77626-1705".
[Fig. FIG. 377 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 378) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 377.
[Fig. 379 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1605 cDNA (SEQ ID NO: 379). SEQ ID NO: 379 is a clone designated herein as "DNA77648-1688."
[Fig. FIG. 380. 379 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 379 (SEQ ID NO: 380).
[Fig. 381 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1928 cDNA (SEQ ID NO: 381). SEQ ID NO: 381 is a clone designated herein as "DNA81754-2532."
[Fig. 382. 381 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 382) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 381.
[Fig. 383 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1865 cDNA (SEQ ID NO: 383) SEQ ID NO: 383 is a clone designated herein as "DNA81775-2512."
[Fig. 384. 383 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 384) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 383.
[Fig. 385 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1925 cDNA (SEQ ID NO: 385). SEQ ID NO: 385 is a clone designated herein as "DNA82302-2529."
[Fig. 386. 385 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 386) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 385.
[Fig. 387 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO1926 cDNA (SEQ ID NO: 387). SEQ ID NO: 387 is a clone designated herein as "DNA82340-2530."
[Fig. 388. SEQ ID NO: 387 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 388) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 387.
[Fig. 389 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 389) of native sequence PRO2630 cDNA. SEQ ID NO: 389 is a clone designated herein as "DNA83551."
[Fig. FIG. 390. 389 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 390) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 389 shown in FIG.
[Fig. 391 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3443 cDNA (SEQ ID NO: 391) SEQ ID NO: 391 is a clone designated herein as "DNA87999-2540."
[Fig. 392. 391 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 392) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 391 shown in 391.
[Fig. 393 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO3301 cDNA (SEQ ID NO: 393) SEQ ID NO: 393 is a clone designated herein as "DNA88002".
[Fig. 394. 293 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 394) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 393 shown in 393.
[Fig. 395 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 395) of native sequence PRO3442 cDNA. SEQ ID NO: 395 is a clone designated herein as "DNA92238-2539".
[Fig. 396. 395 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 396) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 395.
[Fig. 397 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4978 cDNA (SEQ ID NO: 397). SEQ ID NO: 397 is a clone designated herein as "DNA95930."
[Fig. 398. SEQ ID NO: 398 is an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 397.
[Fig. 399 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO5801 cDNA (SEQ ID NO: 399). SEQ ID NO: 399 is a clone designated herein as "DNA115291-2681".
[Fig. FIG. 399 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 400) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 399.
[Fig. The nucleotide sequence of the native sequence PRO19630 cDNA (SEQ ID NO: 101) is shown. SEQ ID NO: 401 is a clone designated herein as "DNA23336-2861".
[Fig. FIG. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 402) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 401 shown in 401 is shown.
[Fig. 403 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO203 cDNA (SEQ ID NO: 403) SEQ ID NO: 403 is a clone designated herein as "DNA30862-1396."
[Fig. FIG. 403 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 404) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 403 shown in 403;
[Fig. 405 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO204 cDNA (SEQ ID NO: 405). SEQ ID NO: 405 is a clone designated herein as "DNA30871-1157."
[Fig. FIG. 405 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 406) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 405 shown in 405.
[Fig. 407 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO210 cDNA (SEQ ID NO: 407) SEQ ID NO: 407 is a clone designated herein as "DNA32279-1131."
[Fig. FIG. 407 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 407 (SEQ ID NO: 408).
[Fig. 409 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 409) of native sequence PRO223 cDNA. SEQ ID NO: 409 is a clone designated herein as "DNA33206-1165."
[Fig. FIG. 409 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 410) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 409 shown in 409.
[Fig. 411 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO247 cDNA (SEQ ID NO: 411). SEQ ID NO: 411 is a clone designated herein as "DNA35673-1201".
[Fig. FIG. 411 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 412) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 411 shown in 411.
[Fig. 413 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO358 cDNA (SEQ ID NO: 413). SEQ ID NO: 413 is a clone designated herein as "DNA47361-1154-2".
[Fig. 414. 413 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 414) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 413.
[Fig. 415 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO724 cDNA (SEQ ID NO: 415). SEQ ID NO: 415 is a clone designated herein as "DNA49631-1328."
[Fig. FIG. 415 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 416) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 415 shown in 415.
[Fig. 417 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 417) of native sequence PRO868 cDNA. SEQ ID NO: 417 is a clone designated herein as "DNA52594-1270".
[Fig. 418. 417 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 418) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 417 shown in SEQ ID NO: 417.
[Fig. 419 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO740 cDNA (SEQ ID NO: 419). SEQ ID NO: 419 is a clone designated herein as "DNA55800-1263."
[Fig. 420. 419 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 420) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 419 shown in SEQ ID NO: 419.
[Fig. 421 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1478 cDNA (SEQ ID NO: 421). SEQ ID NO: 421 is a clone designated herein as "DNA56531-1648".
[Fig. 422. 421 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 422) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 421.
[Fig. 423 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO162 cDNA (SEQ ID NO: 423). SEQ ID NO: 423 is a clone designated herein as "DNA56965-1356".
[Fig. 424. 423 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 424) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 423.
[Fig. 425 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO828 cDNA (SEQ ID NO: 425). SEQ ID NO: 425 is a clone designated herein as "DNA57037-1444."
[Fig. FIG. 425 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 426) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 425.
[Fig. 427 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO819 cDNA (SEQ ID NO: 427). SEQ ID NO: 427 is a clone designated herein as "DNA57695-1340."
[Fig. FIG. 427 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 428) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 427.
[Fig. 429 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO813 cDNA (SEQ ID NO: 429). SEQ ID NO: 429 is a clone designated herein as "DNA58734-1339".
[Fig. FIG. 429 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 429 (SEQ ID NO: 430).
[Fig. 431 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1194 cDNA (SEQ ID NO: 431) SEQ ID NO: 431 is a clone designated herein as "DNA58741-1522".
[Fig. FIG. 431 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 432) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 431.
[Fig. 433 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO887 cDNA (SEQ ID NO: 433). SEQ ID NO: 433 is a clone designated herein as "DNA58130."
[Fig. 434. 433 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 434) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 433.
[Fig. 435 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1071 cDNA (SEQ ID NO: 435). SEQ ID NO: 435 is a clone designated herein as "DNA58847-1383."
[Fig. FIG. 435 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 435 (SEQ ID NO: 436).
[Fig. 437 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO1029 cDNA (SEQ ID NO: 437). SEQ ID NO: 437 is a clone designated herein as "DNA59493-1420."
[Fig. 438. SEQ ID NO: 438 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 438) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 437.
[Fig. 439 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1190 cDNA (SEQ ID NO: 439). SEQ ID NO: 439 is a clone designated herein as "DNA59586-1520."
[Fig. FIG. 439 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 440) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 439 shown in SEQ ID NO: 439.
[Fig. 441 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 441) of native sequence PRO4334 cDNA. SEQ ID NO: 441 is a clone designated herein as "DNA59608-2577."
[Fig. 442. 441 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 442) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 441.
[Fig. 443 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1155 cDNA (SEQ ID NO: 443). SEQ ID NO: 443 is a clone designated herein as "DNA59849-1504".
[Fig. 444. 443 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 444) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 443.
[Fig. 445 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1157 cDNA (SEQ ID NO: 445). SEQ ID NO: 445 is a clone designated herein as "DNA60292-1506."
[Fig. 446. 445 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 446) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 445 shown in SEQ ID NO: 445.
[Fig. 447 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO1122 cDNA (SEQ ID NO: 447). SEQ ID NO: 447 is a clone designated herein as "DNA62377-1381-1".
[Fig. 448. SEQ ID NO: 447 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 448) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 447.
[Fig. 449 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 449) of native sequence PRO1183 cDNA. SEQ ID NO: 449 is a clone designated herein as "DNA62880-1513."
[Fig. 450 in FIG. 449 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 450) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 449 shown in 449.
[Fig. 451 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 451) of native sequence PRO1337 cDNA. SEQ ID NO: 451 is a clone designated herein as "DNA66672-1586".
[Fig. 452. 451 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 452) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 451 shown in 451.
[Fig. 453 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1480 cDNA (SEQ ID NO: 453). SEQ ID NO: 453 is a clone designated herein as "DNA67962-1649".
[Fig. 454. 453 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 454) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 453.
[Fig. 455 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19645 cDNA (SEQ ID NO: 455). SEQ ID NO: 455 is a clone designated herein as "DNA69555-2867."
[Fig. FIG. 455 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 456) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 455 shown in 455.
[Fig. 457 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9782 cDNA (SEQ ID NO: 457). SEQ ID NO: 457 is a clone designated herein as "DNA71162-2765".
[Fig. 458. 457 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 458) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 457.
[Fig. 459 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1419 cDNA (SEQ ID NO: 459). SEQ ID NO: 459 is a clone designated herein as "DNA71290-1630."
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 459 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 460) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 459.
[Fig. 461 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 461) of native sequence PRO1575 cDNA. SEQ ID NO: 461 is a clone designated herein as "DNA76401-1683".
[Fig. 462. 461 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 462) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 461.
[Fig. 463 Shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1567 cDNA (SEQ ID NO: 463). SEQ ID NO: 463 is a clone designated herein as "DNA76541-1675".
[Fig. 464. 463 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 464) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 463.
[Fig. 465 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1891 cDNA (SEQ ID NO: 465). SEQ ID NO: 465 is a clone designated herein as "DNA76788-2526".
[Fig. 466. 465 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 466) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 465.
[Fig. 467 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1889 cDNA (SEQ ID NO: 467). SEQ ID NO: 467 is a clone designated herein as "DNA77623-2524".
[Fig. 468. 467 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 468) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 467.
[Fig. 469 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1785 cDNA (SEQ ID NO: 469). SEQ ID NO: 469 is a clone designated herein as "DNA80136-2503."
[Fig. 470. 470 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 470) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 469.
[Fig. 471 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6003 cDNA (SEQ ID NO: 471) SEQ ID NO: 471 is a clone designated herein as "DNA83568-2692".
[Fig. 472. 471 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 472) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 471.
[Fig. 473 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4333 cDNA (SEQ ID NO: 473). SEQ ID NO: 473 is a clone designated herein as "DNA84210-2576."
[Fig. 474. 473 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 474) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 473.
[Fig. 475 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4356 cDNA (SEQ ID NO: 475) SEQ ID NO: 475 is a clone designated herein as "DNA86576-2595."
[Fig. 476. 475 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 476) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 475.
[Fig. 477 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO4352 cDNA (SEQ ID NO: 477). SEQ ID NO: 477 is a clone designated herein as "DNA87976-2593."
[Fig. 478. SEQ ID NO: 478, which is derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 477 shown in 477.
[Fig. 479 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4354 cDNA (SEQ ID NO: 479). SEQ ID NO: 479 is a clone designated herein as "DNA92256-2596".
[Fig. 480. 479 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 480) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 479.
[Fig. 481 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4369 cDNA (SEQ ID NO: 481) SEQ ID NO: 481 is a clone designated herein as "DNA92289-2598".
[Fig. 482. 481 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 482) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 481 shown in 481.
[Fig. 483 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6030 cDNA (SEQ ID NO: 483). SEQ ID NO: 483 is a clone designated herein as "DNA96850-2705".
[Fig. 484. 483 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 484) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 483.
[Fig. 485 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4433 cDNA (SEQ ID NO: 485). SEQ ID NO: 485 is a clone designated herein as "DNA96855-2629".
[Fig. 486. 485 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 486) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 485.
[Fig. 487 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4424 cDNA (SEQ ID NO: 487). SEQ ID NO: 487 is a clone designated herein as "DNA96857-2636".
[Fig. 488. 487 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 487 (SEQ ID NO: 488).
[Fig. 489 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 489) of native sequence PRO6017 cDNA. SEQ ID NO: 489 is a clone designated herein as "DNA96860-2700".
[Fig. 490. 489 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 490) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 489.
[Fig. 491 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19563 cDNA (SEQ ID NO: 491). SEQ ID NO: 491 is a clone designated herein as "DNA96861-2844".
[Fig. FIG. 492. 49 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 492) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 491 shown in 491.
[Fig. 493 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 493) of native sequence PRO6015 cDNA. SEQ ID NO: 493 is a clone designated herein as "DNA96866-2698."
[Fig. 494. 493 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 494) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 493.
[Fig. 495 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO5779 cDNA (SEQ ID NO: 495) SEQ ID NO: 495 is a clone designated herein as "DNA96870-2676".
[Fig. 496. 495 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 495 (SEQ ID NO: 496).
[Fig. 497 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO5776 cDNA (SEQ ID NO: 497). SEQ ID NO: 497 is a clone designated herein as "DNA96872-2674".
[Fig. 498. 497 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 498) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 497.
[Fig. 499 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4430 cDNA (SEQ ID NO: 499) SEQ ID NO: 499 is a clone designated herein as "DNA96878-2626".
[Fig. FIG. 499 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 500) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 499.
[Fig. 501 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 101) of native sequence PRO4421 cDNA SEQ ID NO: 501 is a clone designated herein as "DNA96879-2619".
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 501 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 502) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 501.
[Fig. 503 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4499 cDNA (SEQ ID NO: 503) SEQ ID NO: 503 is a clone designated herein as "DNA96889-2641."
[Fig. FIG. 503 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 504) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 503 shown in 503;
[Fig. 505 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4423 cDNA (SEQ ID NO: 505). SEQ ID NO: 505 is a clone designated herein as "DNA96893-2621."
[Fig. FIG. 505 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 505 shown in 505 (SEQ ID NO: 506).
[Fig. 507 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO5998 cDNA (SEQ ID NO: 507) SEQ ID NO: 507 is a clone designated herein as "DNA96897-2688."
[Fig. FIG. 507 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 508) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 507 shown in 507.
[Fig. 509 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO4501 cDNA (SEQ ID NO: 509). SEQ ID NO: 509 is a clone designated herein as "DNA98564-2643".
[Fig. FIG. 509 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 510) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 509 shown in 509.
[Fig. 511 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6240 cDNA (SEQ ID NO: 511) SEQ ID NO: 511 is a clone designated herein as "DNA107443-2718".
[Fig. FIG. 511 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 512) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 511.
[Fig. 513 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6245 cDNA (SEQ ID NO: 513). SEQ ID NO: 513 is a clone designated herein as "DNA107786-2723."
[Fig. 514. 513 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 514) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 513.
[Fig. 515 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6175 cDNA (SEQ ID NO: 515). SEQ ID NO: 515 is a clone designated herein as "DNA108682-2712."
[Fig. 516. 515 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 516) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 515 shown in 515.
[Fig. 517 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9742 cDNA (SEQ ID NO: 517). SEQ ID NO: 517 is a clone designated herein as "DNA108684-2761".
[Fig. 518. 517 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 518) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 517 shown in SEQ ID NO: 517.
[Fig. 519 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO7179 cDNA (SEQ ID NO: 519). SEQ ID NO: 519 is a clone designated herein as "DNA108701-2749".
[Fig. 520. 519 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 520) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 519 shown in 519.
[Fig. 521 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 521) of native sequence PRO6239 cDNA. SEQ ID NO: 521 is a clone designated herein as "DNA108720-2717."
[Fig. FIG. 521 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 522) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 521.
[Fig. 523 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6493 cDNA (SEQ ID NO: 523). SEQ ID NO: 523 is a clone designated herein as "DNA108726-2729."
[Fig. 524. 523 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 523 (SEQ ID NO: 524).
[Fig. 525A-525B shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9741 cDNA (SEQ ID NO: 525). SEQ ID NO: 525 is a clone designated herein as "DNA108728-2760."
[Fig. 526. 525A shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 526) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 525 shown in 525B.
[Fig. 527 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9822 cDNA (SEQ ID NO: 527). SEQ ID NO: 527 is a clone designated herein as "DNA108738-2767".
[Fig. FIG. 527 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 527 (SEQ ID NO: 528).
[Fig. 529 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6244 cDNA (SEQ ID NO: 529). SEQ ID NO: 529 is a clone designated herein as "DNA108743-2722."
[Fig. 530. 529 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 530) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 529 shown in 529.
[Fig. 531 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9740 cDNA (SEQ ID NO: 531). SEQ ID NO: 531 is a clone designated herein as "DNA108758-2759".
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 532 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 532) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 531.
[Fig. 533 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 533) of native sequence PRO9739 cDNA. SEQ ID NO: 533 is a clone designated herein as "DNA108765-2758."
[Fig. 534. 533 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 534) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 533.
[Fig. 535 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO7177 cDNA (SEQ ID NO: 535). SEQ ID NO: 535 is a clone designated herein as "DNA108783-2747."
[Fig. 536. 535 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 536) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 535 shown in 535.
[Fig. 537 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO7178 cDNA (SEQ ID NO: 537). SEQ ID NO: 537 is a clone designated herein as "DNA108789-2748."
[Fig. 538. SEQ ID NO: 537 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 538) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 537.
[Fig. 539 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6246 cDNA (SEQ ID NO: 539). SEQ ID NO: 539 is a clone designated herein as "DNA108806-2724."
[Fig. 540. SEQ ID NO: 540 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 540) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 539.
[Fig. 541 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6241 cDNA (SEQ ID NO: 541) SEQ ID NO: 541 is a clone designated herein as "DNA108936-2719."
[Fig. 542. 521 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 542) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 541.
[Fig. 543 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9835 cDNA (SEQ ID NO: 543). SEQ ID NO: 543 is a clone designated herein as "DNA119510-2771".
[Fig. 544. 543 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 543 shown in SEQ ID NO: 543 (SEQ ID NO: 544).
[Fig. 545 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9857 cDNA (SEQ ID NO: 545). SEQ ID NO: 545 is a clone designated herein as "DNA119517-2778."
[Fig. 546. 545 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 546) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 545.
[Fig. 547 shows the nucleotide sequence of native sequence PRO7436 cDNA (SEQ ID NO: 547). SEQ ID NO: 547 is a clone designated herein as "DNA119535-2756".
[Fig. 548. SEQ ID NO: 548 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 547 (SEQ ID NO: 548).
[Fig. 549 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9856 cDNA (SEQ ID NO: 549). SEQ ID NO: 549 is a clone designated herein as "DNA119357-2777."
[Fig. 550. 549 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 550) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 549 shown in 549.
[Fig. 551 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19605 cDNA (SEQ ID NO: 551). SEQ ID NO: 551 is a clone designated herein as "DNA119714-2851."
[Fig. 552. 551 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 552) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 551 shown in 551.
[Fig. 553 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9859 cDNA (SEQ ID NO: 553). SEQ ID NO: 553 is a clone designated herein as "DNA125170-2780".
[Fig. 554. 553 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 554) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 553.
[Fig. 555 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO12970 cDNA (SEQ ID NO: 555). SEQ ID NO: 555 is a clone designated herein as "DNA129594-2841."
[Fig. 556. 155 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 556) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 555 shown in 555.
[Fig. 557 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19626 cDNA (SEQ ID NO: 557). SEQ ID NO: 557 is a clone designated herein as "DNA129793-2857."
[Fig. 558. 557 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 558) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 557.
[Fig. 559 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9833 cDNA (SEQ ID NO: 559). SEQ ID NO: 559 is a clone designated herein as "DNA130809-2769."
[Fig. 560. FIG. 590 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 559 (SEQ ID NO: 560).
[Fig. 561 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19670 cDNA (SEQ ID NO: 561). SEQ ID NO: 561 is a clone designated herein as "DNA131639-2874".
[Fig. 562. 561 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 562) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 561.
[Fig. 563 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19624 cDNA (SEQ ID NO: 563). SEQ ID NO: 563 is a clone designated herein as "DNA131649-2855".
[Fig. 564. SEQ ID NO: 563 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 564) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 563.
[Fig. 565 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19680 cDNA (SEQ ID NO: 565). SEQ ID NO: 565 is a clone designated herein as "DNA131652-2876".
[Fig. 566. SEQ ID NO: 566 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 566) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 565.
[Fig. 567 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19675 cDNA (SEQ ID NO: 567). SEQ ID NO: 567 is a clone designated herein as "DNA131658-2875."
[Fig. 568. 567 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 568) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 567.
[Fig. 569 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9834 cDNA (SEQ ID NO: 569). SEQ ID NO: 569 is a clone designated herein as "DNA132162-2770."
[Fig. 570. 570 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 570) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 569.
[Fig. 571 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO9744 cDNA (SEQ ID NO: 571). SEQ ID NO: 571 is a clone designated herein as "DNA136110-2763".
[Fig. 572. 571 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 572) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 571.
[Fig. 573 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19644 cDNA (SEQ ID NO: 573). SEQ ID NO: 573 is a clone designated herein as "DNA139592-2866".
[Fig. 574. 573 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 574) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 573.
[Fig. 575 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19625 cDNA (SEQ ID NO: 575). SEQ ID NO: 575 is a clone designated herein as "DNA139608-2856".
[Fig. 576. 575 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 576) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 575.
[Fig. 577 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19597 cDNA (SEQ ID NO: 577). SEQ ID NO: 577 is a clone designated herein as "DNA143292-2848".
[Fig. 578. 577 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 578) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 577.
[Fig. 579 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO16090 cDNA (SEQ ID NO: 579). SEQ ID NO: 579 is a clone designated herein as "DNA144844-2843".
[Fig. 580. 579 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 580) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 579.
[Fig. 581 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19576 cDNA (SEQ ID NO: 581). SEQ ID NO: 581 is a clone designated herein as "DNA144857-2845".
[Fig. 582. 581 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 582) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 581 shown in FIG.
[Fig. 583 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19646 cDNA (SEQ ID NO: 583). SEQ ID NO: 583 is a clone designated herein as "DNA145841-2868."
[Fig. 584. SEQ ID NO: 584 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 584) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 583.
[Fig. 585 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19814 cDNA (SEQ ID NO: 585). SEQ ID NO: 585 is a clone designated herein as "DNA148004-2882".
[Fig. 586. 585 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 586) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 585.
[Fig. 587 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19669 cDNA (SEQ ID NO: 587). SEQ ID NO: 587 is a clone designated herein as "DNA149983-2873."
[Fig. 588. 587 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 587 (SEQ ID NO: 588).
[Fig. 589 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO19818 cDNA (SEQ ID NO: 589). SEQ ID NO: 589 is a clone designated herein as "DNA149930-2884."
[Fig. 590. 589 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 590) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 589.
[Fig. 591 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO20088 cDNA (SEQ ID NO: 591). SEQ ID NO: 591 is a clone designated herein as "DNA150157-2898."
[Fig. 592. SEQ ID NO: 592 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 592) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 591 shown in 591.
[Fig. 593 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 593) of native sequence PRO16089 cDNA. SEQ ID NO: 593 is a clone designated herein as "DNA150163-2842".
[Fig. 594. SEQ ID NO: 594 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 594) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 593.
[Fig. 595 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO20025 cDNA (SEQ ID NO: 595). SEQ ID NO: 595 is a clone designated herein as "DNA153579-2894."
[Fig. 596. 595 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 596) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 595 shown in 595.
[Fig. 597 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO20040 cDNA (SEQ ID NO: 597). SEQ ID NO: 597 is a clone designated herein as "DNA164625-2890."
[Fig. 598. 597 shows the amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 597 (SEQ ID NO: 598).
[Fig. 599 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO791 cDNA (SEQ ID NO: 599). SEQ ID NO: 599 is a clone designated herein as "DNA57838-1337."
[Fig. FIG. 199 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 600) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 599 shown in FIG.
[Fig. 601 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1131 cDNA (SEQ ID NO: 101) SEQ ID NO: 601 is a clone designated herein as "DNA59777-1480".
[Fig. FIG. 601 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 602) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 601 shown in FIG.
[Fig. 603 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1343 cDNA (SEQ ID NO: 603). SEQ ID NO: 603 is a clone designated herein as "DNA6665-1587".
[Fig. FIG. SEQ ID NO: 603 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 604) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 603.
[Fig. 605 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1760 cDNA (SEQ ID NO: 605). SEQ ID NO: 605 is a clone designated herein as "DNA76532-1702."
[Fig. FIG. 605 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 606) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 605 shown in 605.
[Fig. This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO6029 cDNA (SEQ ID NO: 607). SEQ ID NO: 607 is a clone designated herein as "DNA105849-2704."
[Fig. FIG. 607 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 608) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 607 shown in SEQ ID NO: 607.
[Fig. 609 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1801 cDNA (SEQ ID NO: 609). SEQ ID NO: 609 is a clone designated herein as "DNA83500-2506."
[Fig. 610. 609 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 610) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 609.

Claims

FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), FIGURE 10 (SEQ ID NO: 10), FIGURE 12 (SEQ ID NO: 12) : 12), FIGURE 14 (SEQ ID NO: 14), FIGURE 16 (SEQ ID NO: 16), FIGURE 18 (SEQ ID NO: 18), FIGURE 20 (SEQ ID NO: 20), FIGURE 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE FIG. 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36) FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48) : 48), Figure 50 (SEQ ID NO: 50), Figure 52 (SEQ ID NO: 52), Figure 54 (SEQ ID NO: 54), Figure 56 (SEQ ID NO: 56), Figure 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 ( SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80), ΔFIGURE 82 (SEQ ID NO: 82) , FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 92), FIGURE 94 (SEQ ID NO: 94) No. 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), FIGURE 104 (SEQ ID NO: 104), Figure 106 (array No .: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 126) : 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIGURE 136 (SEQ ID NO: 136), FIGURE 138 ( SEQ ID NO: 138), FIGURE 140 (SEQ ID NO: 140), FIGURE 142 (SEQ ID NO: 142), FIGURE 144 (SEQ ID NO: 144), FIGURE 146 (SEQ ID NO: 146), FIGURE 148 (SEQ ID NO: 148) , FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160) No .: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIGURE 168 (SEQ ID NO: 168), FIG. 0 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178), FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIG. 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIG. 190 (SEQ ID NO: 190), FIG. 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIGURE 200 (SEQ ID NO: 200), FIGu e 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210), FIGURE 212 (SEQ ID NO: : 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), Fi Figure 234 (SEQ ID NO: 234), Figure 236 (SEQ ID NO: 236), Figure 238 (SEQ ID NO: 238), Figure 240 (SEQ ID NO: 240), Figure 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: : 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE FIG. 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIGURE 264 (SEQ ID NO: 264) FIG. 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276) : 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), ΔFigure 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 2) 6), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE 318 (SEQ ID NO: 318) ), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 326), FIGURE 328 (SEQ ID NO: : 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (SEQ ID NO: 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 358), FIG. (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIGURE 370 (SEQ ID NO: 370) , FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382) No .: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIGURE 390 (SEQ ID NO: 390), FIG. 39 2 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 (SEQ ID NO: 422), FIGUR 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432), FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIGURE 444 (SEQ ID NO: 444), 4FIG. (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIGURE 454 (SEQ ID NO: 454), FIG ure 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466) : 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), FIGURE 476 (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGURE 486 (SEQ ID NO: 486), FIG. 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIGURE 496 (SEQ ID NO: 496), FIG. 498 (SEQ ID NO: 498) : 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508 (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), FIGURE 518 (SEQ ID NO: 51) ), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528), FIG. (SEQ ID NO: 530), FIGURE 532 (SEQ ID NO: 532), FIGURE 534 (SEQ ID NO: 534), FIGURE 536 (SEQ ID NO: 536), FIGURE 538 (SEQ ID NO: 538), FIGURE 540 (SEQ ID NO: 540) , FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIG. Figure 550), Figure 552 (SEQ ID NO: 552), Figure 554 (SEQ ID NO: 554), Figure 556 (SEQ ID NO: 556), Figure 558 (SEQ ID NO: 558), Figure 560 (SEQ ID NO: 560), Figure 556 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), FIGURE 566 (SEQ ID NO: 566), FIGURE 568 (SEQ ID NO: 568), FIGURE 570 (SEQ ID NO: 570), FIGURE 572 (SEQ ID NO: 572) ), FIGURE 574 (SEQ ID NO: 574), FIGURE 576 (SEQ ID NO: 576), FIGURE 578 (SEQ ID NO: 578), FIGURE 580 (SEQ ID NO: 580), FIG. Figure 584 (SEQ ID NO: 584), Figure 586 (SEQ ID NO: 586), Figure 588 (SEQ ID NO: 588), Figure 590 (SEQ ID NO: 590), Figure 592 (SEQ ID NO: 592), FIGURE 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602), FIGURE 604 (SEQ ID NO: 604) : 604), Figure 606 (SEQ ID NO: 606), Figure 608 (SEQ ID NO: 608), and an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in Figure 610 (SEQ ID NO: 610). An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the encoding nucleotide sequence.

FIGURE 1 (SEQ ID NO: 1), FIGURE 3 (SEQ ID NO: 3), FIGURE 5 (SEQ ID NO: 5), FIGURE 7 (SEQ ID NO: 7), FIGURE 9 (SEQ ID NO: 9), FIGURE 11 (SEQ ID NO: 11) : 11), FIGURE 13 (SEQ ID NO: 13), FIGURE 15 (SEQ ID NO: 15), FIGURE 17 (SEQ ID NO: 17), FIGURE 19 (SEQ ID NO: 19), FIGURE 21 (SEQ ID NO: 21), FIGURE 23 (SEQ ID NO: 23), FIGURE 25 (SEQ ID NO: 25), FIGURE 27 (SEQ ID NO: 27), FIGURE 29 (SEQ ID NO: 29), FIGURE 31 (SEQ ID NO: 31), FIGURE 33 (SEQ ID NO: 33), FIGURE 35 (SEQ ID NO: 35), F figure 37 (SEQ ID NO: 37), FIGURE 39 (SEQ ID NO: 39), FIGURE 41 (SEQ ID NO: 41), FIGURE 43 (SEQ ID NO: 43), FIGURE 45 (SEQ ID NO: 45), FIGURE 47 (SEQ ID NO: 47) : 47), FIGURE 49 (SEQ ID NO: 49), FIGURE 51 (SEQ ID NO: 51), FIGURE 53 (SEQ ID NO: 53), FIGURE 55 (SEQ ID NO: 55), FIGURE 57 (SEQ ID NO: 57), FIGURE FIG. 59 (SEQ ID NO: 59), FIGURE 61 (SEQ ID NO: 61), FIGURE 63 (SEQ ID NO: 63), FIGURE 65 (SEQ ID NO: 65), FIGURE 67 (SEQ ID NO: 67), FIGURE 69 (SEQ ID NO: 69), FIGURE 71 (sequence) Figure 71), Figure 73 (SEQ ID NO: 73), Figures 75A-75B (SEQ ID NO: 75), Figure 77 (SEQ ID NO: 77), Figure 79 (SEQ ID NO: 79), and Figure 81 (SEQ ID NO: 81) ), FIGURE 83 (SEQ ID NO: 83), FIGURE 85 (SEQ ID NO: 85), FIGURE 87 (SEQ ID NO: 87), FIGURE 89 (SEQ ID NO: 89), FIGURE 91 (SEQ ID NO: 91), FIGURE 93 (SEQ ID NO: 91) FIG. 95 (SEQ ID NO: 95), FIGURE 97 (SEQ ID NO: 97), FIGURE 99 (SEQ ID NO: 99), FIGURE 101 (SEQ ID NO: 101), FIGURE 103 (SEQ ID NO: 103) , FIGURE 105 ( Column No .: 105), FIGURE 107 (SEQ ID NO: 107), FIGURE 109 (SEQ ID NO: 109), FIGURE 111 (SEQ ID NO: 111), FIGURE 113 (SEQ ID NO: 113), FIGURE 115 (SEQ ID NO: 115) , FIGURE 117 (SEQ ID NO: 117), FIGURE 119 (SEQ ID NO: 119), FIGURE 121 (SEQ ID NO: 121), FIGURE 123 (SEQ ID NO: 123), FIGURE 125 (SEQ ID NO: 125), FIGURE 127 (SEQ ID NO: 127) No. 127), FIGURE 129 (SEQ ID NO: 129), FIGURE 131 (SEQ ID NO: 131), FIGURE 133 (SEQ ID NO: 133), FIGURE 135 (SEQ ID NO: 135), FIG. 13 (SEQ ID NO: 137), FIGURE 139 (SEQ ID NO: 139), FIGURE 141 (SEQ ID NO: 141), FIGURE 143 (SEQ ID NO: 143), FIGURE 145 (SEQ ID NO: 145), FIGURE 147 (SEQ ID NO: 147) ), FIGURE 149 (SEQ ID NO: 149), FIGURE 151 (SEQ ID NO: 151), FIGURE 153 (SEQ ID NO: 153), FIGURE 155 (SEQ ID NO: 155), FIGURE 157 (SEQ ID NO: 157), FIGURE 159 (SEQ ID NO: 157) SEQ ID NO: 159), FIGURE 161 (SEQ ID NO: 161), FIGURE 163 (SEQ ID NO: 163), FIGURE 165 (SEQ ID NO: 165), FIGURE 167 (SEQ ID NO: 167), FIGURE 169 (SEQ ID NO: 169), FIGURE 171 (SEQ ID NO: 171), FIGURE 173 (SEQ ID NO: 173), FIGURE 175 (SEQ ID NO: 175), FIGURE 177 (SEQ ID NO: 177), FIG. 179 (SEQ ID NO: 179), FIG. 181 (SEQ ID NO: 181), FIG. 183 (SEQ ID NO: 183), FIG. 185 (SEQ ID NO: 185), FIG. 187 (SEQ ID NO: 187), FIG. 189 (SEQ ID NO: 189), FIG. (SEQ ID NO: 191), FIGURE 193 (SEQ ID NO: 193), FIGURE 195 (SEQ ID NO: 195), FIGURE 197 (SEQ ID NO: 197), FIGURE 199 (SEQ ID NO: 199), Fi ure 201 (SEQ ID NO: 201), Figure 203 (SEQ ID NO: 203), Figure 205 (SEQ ID NO: 205), Figure 207 (SEQ ID NO: 207), Figure 209 (SEQ ID NO: 209), Figure 211 (SEQ ID NO: : 211), FIGURE 213 (SEQ ID NO: 213), FIGURE 215 (SEQ ID NO: 215), FIGURE 217 (SEQ ID NO: 217), FIGURE 219 (SEQ ID NO: 219), FIGURE 221 (SEQ ID NO: 221), FIGURE 223 (SEQ ID NO: 223), FIGURE 225 (SEQ ID NO: 225), FIGURE 227 (SEQ ID NO: 227), FIGURE 229 (SEQ ID NO: 229), FIGURE 231 (SEQ ID NO: 231), FIG. 233 (SEQ ID NO: 233), FIGURE 235 (SEQ ID NO: 235), FIGURE 237 (SEQ ID NO: 237), FIGURE 239 (SEQ ID NO: 239), FIGURE 241 (SEQ ID NO: 241), FIGURE 243 (SEQ ID NO: 243) : 243), FIGURE 245 (SEQ ID NO: 245), FIGURE 247 (SEQ ID NO: 247), FIGURE 249 (SEQ ID NO: 249), FIGURE 251 (SEQ ID NO: 251), FIGURE 253 (SEQ ID NO: 253), FIGURE 255 (SEQ ID NO: 255), FIGURE 257 (SEQ ID NO: 257), FIGURE 259 (SEQ ID NO: 259), FIGURE 261 (SEQ ID NO: 261), FIGURE 263 (SEQ ID NO: 26) ), FIGURE 265 (SEQ ID NO: 265), FIGURE 267 (SEQ ID NO: 267), FIGURE 269 (SEQ ID NO: 269), FIGURE 271 (SEQ ID NO: 271), FIGURE 273 (SEQ ID NO: 273), FIG. SEQ ID NO: 275), FIGURE 277 (SEQ ID NO: 277), FIGURE 279 (SEQ ID NO: 279), FIGURE 281 (SEQ ID NO: 281), FIGURE 283 (SEQ ID NO: 283), FIGURE 285 (SEQ ID NO: 285) , FIGURE 287 (SEQ ID NO: 287), FIGURES 289A-289B (SEQ ID NO: 289), FIGURE 291 (SEQ ID NO: 291), FIGURE 293 (SEQ ID NO: 293), FIGURE 2 5 (SEQ ID NO: 295), FIGURE 297 (SEQ ID NO: 297), FIGURE 299 (SEQ ID NO: 299), FIGURE 301 (SEQ ID NO: 301), FIGURE 303 (SEQ ID NO: 303), FIGURE 305 (SEQ ID NO: 305) 305), FIGure 307 (SEQ ID NO: 307), FIGURE 309 (SEQ ID NO: 309), FIGS. 311A-311B (SEQ ID NO: 311), FIGURE 313 (SEQ ID NO: 313), FIGURE 315 (SEQ ID NO: 315), FIG. 317 (SEQ ID NO: 317), FIG. 319 (SEQ ID NO: 319), FIG. 321 (SEQ ID NO: 321), FIG. 323 (SEQ ID NO: 323), FIG. 325 (SEQ ID NO: 325) , FIGURE 327 (SEQ ID NO: 327), FIGURE 329 (SEQ ID NO: 329), FIGURE 331 (SEQ ID NO: 331), FIGURE 333 (SEQ ID NO: 333), FIGURE 335 (SEQ ID NO: 335), FIGURE 337 (SEQ ID NO: 337) No. 337), FIGURE 339 (SEQ ID NO: 339), FIGURE 341 (SEQ ID NO: 341), FIGURE 343 (SEQ ID NO: 343), FIGURE 345 (SEQ ID NO: 345), FIGURE 347 (SEQ ID NO: 347), FIG. 349 (SEQ ID NO: 349), FIGURES 351A-351B (SEQ ID NO: 351), FIGURE 353 (SEQ ID NO: 353), FIG. 355 (SEQ ID NO: 355), FIG. 357 (SEQ ID NO: 357), FIGURE 359 (SEQ ID NO: 359), FIGURE 361 (SEQ ID NO: 361), FIGURE 363 (SEQ ID NO: 363), FIGURE 365 (SEQ ID NO: 365), FIGURE 367 (SEQ ID NO: 367) ), FIGURE 369 (SEQ ID NO: 369), FIGURE 371 (SEQ ID NO: 371), FIGURE 373 (SEQ ID NO: 373), FIGURE 375 (SEQ ID NO: 375), FIGURE 377 (SEQ ID NO: 377), FIG. FIG. 381 (SEQ ID NO: 381), FIG. 383 (SEQ ID NO: 383), FIG. 385 (SEQ ID NO: 385), FIGURE 387 (SEQ ID NO: 387), FIG. 389 (SEQ ID NO: 389), FIGURE 391 (SEQ ID NO: 391), FIGURE 393 (SEQ ID NO: 393), FIGURE 395 (SEQ ID NO: 395), FIGURE 397 (SEQ ID NO: 397), FIGURE 399 (SEQ ID NO: 399), FIGURE 401 (SEQ ID NO: 401), FIGURE 403 (SEQ ID NO: 403), FIGURE 405 (SEQ ID NO: 405), FIGURE 407 (SEQ ID NO: 407), FIGURE 409 (SEQ ID NO: 409), FIG. (SEQ ID NO: 411), FIGURE 413 (SEQ ID NO: 413), FIGURE 415 (SEQ ID NO: 415), FIGURE 417 (SEQ ID NO: 417), FIGURE 419 (SEQ ID NO: 419), FIG re 421 (SEQ ID NO: 421), FIGURE 423 (SEQ ID NO: 423), FIGURE 425 (SEQ ID NO: 425), FIGURE 427 (SEQ ID NO: 427), FIGURE 429 (SEQ ID NO: 429), FIGURE 431 (SEQ ID NO: 431) : 431), Figure 433 (SEQ ID NO: 433), Figure 435 (SEQ ID NO: 435), Figure 437 (SEQ ID NO: 437), Figure 439 (SEQ ID NO: 439), Figure 441 (SEQ ID NO: 441), Figure 443 (SEQ ID NO: 443), FIGURE 445 (SEQ ID NO: 445), FIGURE 447 (SEQ ID NO: 447), FIGURE 449 (SEQ ID NO: 449), FIGURE 451 (SEQ ID NO: 451), F FIGURE 453 (SEQ ID NO: 453), FIGURE 455 (SEQ ID NO: 455), FIGURE 457 (SEQ ID NO: 457), FIGURE 449 (SEQ ID NO: 459), FIGURE 461 (SEQ ID NO: 461), FIGURE 463 (SEQ ID NO: 463) : 463), FIGURE 465 (SEQ ID NO: 465), FIGURE 467 (SEQ ID NO: 467), FIGURE 469 (SEQ ID NO: 469), FIGURE 471 (SEQ ID NO: 471), FIGURE 473 (SEQ ID NO: 473), FIGURE 475 (SEQ ID NO: 475), FIGURE 477 (SEQ ID NO: 477), FIGURE 479 (SEQ ID NO: 479), FIGURE 481 (SEQ ID NO: 481), FIGURE 483 (SEQ ID NO: 483) ), FIGURE 485 (SEQ ID NO: 485), FIGURE 487 (SEQ ID NO: 487), FIGURE 489 (SEQ ID NO: 489), FIGURE 491 (SEQ ID NO: 491), FIGURE 493 (SEQ ID NO: 493), FIG. SEQ ID NO: 495), FIGURE 497 (SEQ ID NO: 497), FIGURE 499 (SEQ ID NO: 499), FIGURE 501 (SEQ ID NO: 501), FIGURE 503 (SEQ ID NO: 503), FIGURE 505 (SEQ ID NO: 505) , FIGURE 507 (SEQ ID NO: 507), FIGURE 509 (SEQ ID NO: 509), FIGURE 511 (SEQ ID NO: 511), FIGURE 513 (SEQ ID NO: 513), FIG. 515 (SEQ ID NO: 15), FIGURE 517 (SEQ ID NO: 517), FIGURE 519 (SEQ ID NO: 519), FIGURE 521 (SEQ ID NO: 521), FIGURE 523 (SEQ ID NO: 523), FIGS. 525A-525B (SEQ ID NO: 525), FIG. 527 (SEQ ID NO: 527), FIG. 529 (SEQ ID NO: 529), FIGURE 531 (SEQ ID NO: 531), FIGURE 533 (SEQ ID NO: 533), FIG. 535 (SEQ ID NO: 535), FIG. : 537), Figure 539 (SEQ ID NO: 539), Figure 541 (SEQ ID NO: 541), Figure 543 (SEQ ID NO: 543), Figure 545 (SEQ ID NO: 545), FIGURE 547 (SEQ ID NO: 547), FIGURE 549 (SEQ ID NO: 549), FIGURE 551 (SEQ ID NO: 551), FIGURE 553 (SEQ ID NO: 553), FIGURE 555 (SEQ ID NO: 555), FIGURE 557 (SEQ ID NO: 557) 557), FIGURE 559 (SEQ ID NO: 559), FIGURE 561 (SEQ ID NO: 561), FIGURE 563 (SEQ ID NO: 563), FIGURE 565 (SEQ ID NO: 565), FIGURE 567 (SEQ ID NO: 567), FIG. (SEQ ID NO: 569), FIGURE 571 (SEQ ID NO: 571), FIGURE 573 (SEQ ID NO: 573), FIGURE 575 (SEQ ID NO: 575), FIGURE 577 (SEQ ID NO: 577), FIG re 579 (SEQ ID NO: 579), Figure 581 (SEQ ID NO: 581), Figure 585 (SEQ ID NO: 583), Figure 585 (SEQ ID NO: 585), Figure 587 (SEQ ID NO: 587), Figure 589 (SEQ ID NO: 589) : 589), FIGURE 591 (SEQ ID NO: 591), FIGURE 593 (SEQ ID NO: 593), FIGURE 595 (SEQ ID NO: 595), FIGURE 597 (SEQ ID NO: 597), FIGURE 599 (SEQ ID NO: 599), FIGURE 601 (SEQ ID NO: 601), FIGURE 603 (SEQ ID NO: 603), FIGURE 605 (SEQ ID NO: 605), FIGURE 607 (SEQ ID NO: 607), and FIGURE 609 (SEQ ID NO: 609) At least 80% of the isolated nucleic acid having a nucleic acid sequence identity to a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence shown in.

FIGURE 1 (SEQ ID NO: 1), FIGURE 3 (SEQ ID NO: 3), FIGURE 5 (SEQ ID NO: 5), FIGURE 7 (SEQ ID NO: 7), FIGURE 9 (SEQ ID NO: 9), FIGURE 11 (SEQ ID NO: 11) : 11), FIGURE 13 (SEQ ID NO: 13), FIGURE 15 (SEQ ID NO: 15), FIGURE 17 (SEQ ID NO: 17), FIGURE 19 (SEQ ID NO: 19), FIGURE 21 (SEQ ID NO: 21), FIGURE 23 (SEQ ID NO: 23), FIGURE 25 (SEQ ID NO: 25), FIGURE 27 (SEQ ID NO: 27), FIGURE 29 (SEQ ID NO: 29), FIGURE 31 (SEQ ID NO: 31), FIGURE 33 (SEQ ID NO: 33), FIGURE 35 (SEQ ID NO: 35), F figure 37 (SEQ ID NO: 37), FIGURE 39 (SEQ ID NO: 39), FIGURE 41 (SEQ ID NO: 41), FIGURE 43 (SEQ ID NO: 43), FIGURE 45 (SEQ ID NO: 45), FIGURE 47 (SEQ ID NO: 47) : 47), FIGURE 49 (SEQ ID NO: 49), FIGURE 51 (SEQ ID NO: 51), FIGURE 53 (SEQ ID NO: 53), FIGURE 55 (SEQ ID NO: 55), FIGURE 57 (SEQ ID NO: 57), FIGURE FIG. 59 (SEQ ID NO: 59), FIGURE 61 (SEQ ID NO: 61), FIGURE 63 (SEQ ID NO: 63), FIGURE 65 (SEQ ID NO: 65), FIGURE 67 (SEQ ID NO: 67), FIGURE 69 (SEQ ID NO: 69), FIGURE 71 (sequence) Figure 71), Figure 73 (SEQ ID NO: 73), Figures 75A-75B (SEQ ID NO: 75), Figure 77 (SEQ ID NO: 77), Figure 79 (SEQ ID NO: 79), and Figure 81 (SEQ ID NO: 81) ), FIGURE 83 (SEQ ID NO: 83), FIGURE 85 (SEQ ID NO: 85), FIGURE 87 (SEQ ID NO: 87), FIGURE 89 (SEQ ID NO: 89), FIGURE 91 (SEQ ID NO: 91), FIGURE 93 (SEQ ID NO: 91) FIG. 95 (SEQ ID NO: 95), FIGURE 97 (SEQ ID NO: 97), FIGURE 99 (SEQ ID NO: 99), FIGURE 101 (SEQ ID NO: 101), FIGURE 103 (SEQ ID NO: 103) , FIGURE 105 ( Column No .: 105), FIGURE 107 (SEQ ID NO: 107), FIGURE 109 (SEQ ID NO: 109), FIGURE 111 (SEQ ID NO: 111), FIGURE 113 (SEQ ID NO: 113), FIGURE 115 (SEQ ID NO: 115) , FIGURE 117 (SEQ ID NO: 117), FIGURE 119 (SEQ ID NO: 119), FIGURE 121 (SEQ ID NO: 121), FIGURE 123 (SEQ ID NO: 123), FIGURE 125 (SEQ ID NO: 125), FIGURE 127 (SEQ ID NO: 127) No. 127), FIGURE 129 (SEQ ID NO: 129), FIGURE 131 (SEQ ID NO: 131), FIGURE 133 (SEQ ID NO: 133), FIGURE 135 (SEQ ID NO: 135), FIG. 13 (SEQ ID NO: 137), FIGURE 139 (SEQ ID NO: 139), FIGURE 141 (SEQ ID NO: 141), FIGURE 143 (SEQ ID NO: 143), FIGURE 145 (SEQ ID NO: 145), FIGURE 147 (SEQ ID NO: 147) ), FIGURE 149 (SEQ ID NO: 149), FIGURE 151 (SEQ ID NO: 151), FIGURE 153 (SEQ ID NO: 153), FIGURE 155 (SEQ ID NO: 155), FIGURE 157 (SEQ ID NO: 157), FIGURE 159 (SEQ ID NO: 157) SEQ ID NO: 159), FIGURE 161 (SEQ ID NO: 161), FIGURE 163 (SEQ ID NO: 163), FIGURE 165 (SEQ ID NO: 165), FIGURE 167 (SEQ ID NO: 167), FIGURE 169 (SEQ ID NO: 169), FIGURE 171 (SEQ ID NO: 171), FIGURE 173 (SEQ ID NO: 173), FIGURE 175 (SEQ ID NO: 175), FIGURE 177 (SEQ ID NO: 177), FIG. 179 (SEQ ID NO: 179), FIG. 181 (SEQ ID NO: 181), FIG. 183 (SEQ ID NO: 183), FIG. 185 (SEQ ID NO: 185), FIG. 187 (SEQ ID NO: 187), FIG. 189 (SEQ ID NO: 189), FIG. (SEQ ID NO: 191), FIGURE 193 (SEQ ID NO: 193), FIGURE 195 (SEQ ID NO: 195), FIGURE 197 (SEQ ID NO: 197), FIGURE 199 (SEQ ID NO: 199), Fi ure 201 (SEQ ID NO: 201), Figure 203 (SEQ ID NO: 203), Figure 205 (SEQ ID NO: 205), Figure 207 (SEQ ID NO: 207), Figure 209 (SEQ ID NO: 209), Figure 211 (SEQ ID NO: : 211), FIGURE 213 (SEQ ID NO: 213), FIGURE 215 (SEQ ID NO: 215), FIGURE 217 (SEQ ID NO: 217), FIGURE 219 (SEQ ID NO: 219), FIGURE 221 (SEQ ID NO: 221), FIGURE 223 (SEQ ID NO: 223), FIGURE 225 (SEQ ID NO: 225), FIGURE 227 (SEQ ID NO: 227), FIGURE 229 (SEQ ID NO: 229), FIGURE 231 (SEQ ID NO: 231), FIG. 233 (SEQ ID NO: 233), FIGURE 235 (SEQ ID NO: 235), FIGURE 237 (SEQ ID NO: 237), FIGURE 239 (SEQ ID NO: 239), FIGURE 241 (SEQ ID NO: 241), FIGURE 243 (SEQ ID NO: 243) : 243), FIGURE 245 (SEQ ID NO: 245), FIGURE 247 (SEQ ID NO: 247), FIGURE 249 (SEQ ID NO: 249), FIGURE 251 (SEQ ID NO: 251), FIGURE 253 (SEQ ID NO: 253), FIGURE 255 (SEQ ID NO: 255), FIGURE 257 (SEQ ID NO: 257), FIGURE 259 (SEQ ID NO: 259), FIGURE 261 (SEQ ID NO: 261), FIGURE 263 (SEQ ID NO: 26) ), FIGURE 265 (SEQ ID NO: 265), FIGURE 267 (SEQ ID NO: 267), FIGURE 269 (SEQ ID NO: 269), FIGURE 271 (SEQ ID NO: 271), FIGURE 273 (SEQ ID NO: 273), FIG. SEQ ID NO: 275), FIGURE 277 (SEQ ID NO: 277), FIGURE 279 (SEQ ID NO: 279), FIGURE 281 (SEQ ID NO: 281), FIGURE 283 (SEQ ID NO: 283), FIGURE 285 (SEQ ID NO: 285) , FIGURE 287 (SEQ ID NO: 287), FIGURES 289A-289B (SEQ ID NO: 289), FIGURE 291 (SEQ ID NO: 291), FIGURE 293 (SEQ ID NO: 293), FIGURE 2 5 (SEQ ID NO: 295), FIGURE 297 (SEQ ID NO: 297), FIGURE 299 (SEQ ID NO: 299), FIGURE 301 (SEQ ID NO: 301), FIGURE 303 (SEQ ID NO: 303), FIGURE 305 (SEQ ID NO: 305) 305), FIGure 307 (SEQ ID NO: 307), FIGURE 309 (SEQ ID NO: 309), FIGS. 311A-311B (SEQ ID NO: 311), FIGURE 313 (SEQ ID NO: 313), FIGURE 315 (SEQ ID NO: 315), FIG. 317 (SEQ ID NO: 317), FIG. 319 (SEQ ID NO: 319), FIG. 321 (SEQ ID NO: 321), FIG. 323 (SEQ ID NO: 323), FIG. 325 (SEQ ID NO: 325) , FIGURE 327 (SEQ ID NO: 327), FIGURE 329 (SEQ ID NO: 329), FIGURE 331 (SEQ ID NO: 331), FIGURE 333 (SEQ ID NO: 333), FIGURE 335 (SEQ ID NO: 335), FIGURE 337 (SEQ ID NO: 337) No. 337), FIGURE 339 (SEQ ID NO: 339), FIGURE 341 (SEQ ID NO: 341), FIGURE 343 (SEQ ID NO: 343), FIGURE 345 (SEQ ID NO: 345), FIGURE 347 (SEQ ID NO: 347), FIG. 349 (SEQ ID NO: 349), FIGURES 351A-351B (SEQ ID NO: 351), FIGURE 353 (SEQ ID NO: 353), FIG. 355 (SEQ ID NO: 355), FIG. 357 (SEQ ID NO: 357), FIGURE 359 (SEQ ID NO: 359), FIGURE 361 (SEQ ID NO: 361), FIGURE 363 (SEQ ID NO: 363), FIGURE 365 (SEQ ID NO: 365), FIGURE 367 (SEQ ID NO: 367) ), FIGURE 369 (SEQ ID NO: 369), FIGURE 371 (SEQ ID NO: 371), FIGURE 373 (SEQ ID NO: 373), FIGURE 375 (SEQ ID NO: 375), FIGURE 377 (SEQ ID NO: 377), FIG. FIG. 381 (SEQ ID NO: 381), FIG. 383 (SEQ ID NO: 383), FIG. 385 (SEQ ID NO: 385), FIGURE 387 (SEQ ID NO: 387), FIG. 389 (SEQ ID NO: 389), FIGURE 391 (SEQ ID NO: 391), FIGURE 393 (SEQ ID NO: 393), FIGURE 395 (SEQ ID NO: 395), FIGURE 397 (SEQ ID NO: 397), FIGURE 399 (SEQ ID NO: 399), FIGURE 401 (SEQ ID NO: 401), FIGURE 403 (SEQ ID NO: 403), FIGURE 405 (SEQ ID NO: 405), FIGURE 407 (SEQ ID NO: 407), FIGURE 409 (SEQ ID NO: 409), FIG. (SEQ ID NO: 411), FIGURE 413 (SEQ ID NO: 413), FIGURE 415 (SEQ ID NO: 415), FIGURE 417 (SEQ ID NO: 417), FIGURE 419 (SEQ ID NO: 419), FIG re 421 (SEQ ID NO: 421), FIGURE 423 (SEQ ID NO: 423), FIGURE 425 (SEQ ID NO: 425), FIGURE 427 (SEQ ID NO: 427), FIGURE 429 (SEQ ID NO: 429), FIGURE 431 (SEQ ID NO: 431) : 431), Figure 433 (SEQ ID NO: 433), Figure 435 (SEQ ID NO: 435), Figure 437 (SEQ ID NO: 437), Figure 439 (SEQ ID NO: 439), Figure 441 (SEQ ID NO: 441), Figure 443 (SEQ ID NO: 443), FIGURE 445 (SEQ ID NO: 445), FIGURE 447 (SEQ ID NO: 447), FIGURE 449 (SEQ ID NO: 449), FIGURE 451 (SEQ ID NO: 451), F FIGURE 453 (SEQ ID NO: 453), FIGURE 455 (SEQ ID NO: 455), FIGURE 457 (SEQ ID NO: 457), FIGURE 449 (SEQ ID NO: 459), FIGURE 461 (SEQ ID NO: 461), FIGURE 463 (SEQ ID NO: 463) : 463), FIGURE 465 (SEQ ID NO: 465), FIGURE 467 (SEQ ID NO: 467), FIGURE 469 (SEQ ID NO: 469), FIGURE 471 (SEQ ID NO: 471), FIGURE 473 (SEQ ID NO: 473), FIGURE 475 (SEQ ID NO: 475), FIGURE 477 (SEQ ID NO: 477), FIGURE 479 (SEQ ID NO: 479), FIGURE 481 (SEQ ID NO: 481), FIGURE 483 (SEQ ID NO: 483) ), FIGURE 485 (SEQ ID NO: 485), FIGURE 487 (SEQ ID NO: 487), FIGURE 489 (SEQ ID NO: 489), FIGURE 491 (SEQ ID NO: 491), FIGURE 493 (SEQ ID NO: 493), FIG. SEQ ID NO: 495), FIGURE 497 (SEQ ID NO: 497), FIGURE 499 (SEQ ID NO: 499), FIGURE 501 (SEQ ID NO: 501), FIGURE 503 (SEQ ID NO: 503), FIGURE 505 (SEQ ID NO: 505) , FIGURE 507 (SEQ ID NO: 507), FIGURE 509 (SEQ ID NO: 509), FIGURE 511 (SEQ ID NO: 511), FIGURE 513 (SEQ ID NO: 513), FIG. 515 (SEQ ID NO: 15), FIGURE 517 (SEQ ID NO: 517), FIGURE 519 (SEQ ID NO: 519), FIGURE 521 (SEQ ID NO: 521), FIGURE 523 (SEQ ID NO: 523), FIGS. 525A-525B (SEQ ID NO: 525), FIG. 527 (SEQ ID NO: 527), FIG. 529 (SEQ ID NO: 529), FIGURE 531 (SEQ ID NO: 531), FIGURE 533 (SEQ ID NO: 533), FIG. 535 (SEQ ID NO: 535), FIG. : 537), Figure 539 (SEQ ID NO: 539), Figure 541 (SEQ ID NO: 541), Figure 543 (SEQ ID NO: 543), Figure 545 (SEQ ID NO: 545), FIGURE 547 (SEQ ID NO: 547), FIGURE 549 (SEQ ID NO: 549), FIGURE 551 (SEQ ID NO: 551), FIGURE 553 (SEQ ID NO: 553), FIGURE 555 (SEQ ID NO: 555), FIGURE 557 (SEQ ID NO: 557) 557), FIGURE 559 (SEQ ID NO: 559), FIGURE 561 (SEQ ID NO: 561), FIGURE 563 (SEQ ID NO: 563), FIGURE 565 (SEQ ID NO: 565), FIGURE 567 (SEQ ID NO: 567), FIG. (SEQ ID NO: 569), FIGURE 571 (SEQ ID NO: 571), FIGURE 573 (SEQ ID NO: 573), FIGURE 575 (SEQ ID NO: 575), FIGURE 577 (SEQ ID NO: 577), FIG re 579 (SEQ ID NO: 579), Figure 581 (SEQ ID NO: 581), Figure 585 (SEQ ID NO: 583), Figure 585 (SEQ ID NO: 585), Figure 587 (SEQ ID NO: 587), Figure 589 (SEQ ID NO: 589) : 589), FIGURE 591 (SEQ ID NO: 591), FIGURE 593 (SEQ ID NO: 593), FIGURE 595 (SEQ ID NO: 595), FIGURE 597 (SEQ ID NO: 597), FIGURE 599 (SEQ ID NO: 599), FIGURE 601 (SEQ ID NO: 601), FIGURE 603 (SEQ ID NO: 603), FIGURE 605 (SEQ ID NO: 605), FIGURE 607 (SEQ ID NO: 607), and FIGURE 609 (SEQ ID NO: 609) Isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleotide sequence selected from the group consisting of the full-length coding sequence of the nucleotide sequence shown in.

An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the full length coding sequence of the DNA deposited under any of the ATCC accession numbers set forth in Table 7.

A vector comprising the nucleic acid of claim 1.

A host cell comprising the vector of claim 5.

7. The host cell of claim 6, wherein said cell is a CHO cell.

7. The host cell of claim 6, wherein said cell is E. coli.

7. The host cell of claim 6, wherein said cell is a yeast.

A method for producing a PRO polypeptide, comprising culturing the host cell of claim 6 under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and recovering the PRO polypeptide from a cell culture medium.

FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), FIGURE 10 (SEQ ID NO: 10), FIGURE 12 (SEQ ID NO: 12) : 12), FIGURE 14 (SEQ ID NO: 14), FIGURE 16 (SEQ ID NO: 16), FIGURE 18 (SEQ ID NO: 18), FIGURE 20 (SEQ ID NO: 20), FIGURE 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE FIG. 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36) FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48) : 48), Figure 50 (SEQ ID NO: 50), Figure 52 (SEQ ID NO: 52), Figure 54 (SEQ ID NO: 54), Figure 56 (SEQ ID NO: 56), Figure 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 ( SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80), ΔFIGURE 82 (SEQ ID NO: 82) , FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 92), FIGURE 94 (SEQ ID NO: 94) No. 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), FIGURE 104 (SEQ ID NO: 104), Figure 106 (array No .: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 126) : 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIGURE 136 (SEQ ID NO: 136), FIGURE 138 ( SEQ ID NO: 138), FIGURE 140 (SEQ ID NO: 140), FIGURE 142 (SEQ ID NO: 142), FIGURE 144 (SEQ ID NO: 144), FIGURE 146 (SEQ ID NO: 146), FIGURE 148 (SEQ ID NO: 148) , FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160) No .: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIGURE 168 (SEQ ID NO: 168), FIG. 0 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178), FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIG. 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIG. 190 (SEQ ID NO: 190), FIG. 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIGURE 200 (SEQ ID NO: 200), FIGu e 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210), FIGURE 212 (SEQ ID NO: : 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), Fi Figure 234 (SEQ ID NO: 234), Figure 236 (SEQ ID NO: 236), Figure 238 (SEQ ID NO: 238), Figure 240 (SEQ ID NO: 240), Figure 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: : 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE FIG. 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIGURE 264 (SEQ ID NO: 264) FIG. 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276) : 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), ΔFigure 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 2) 6), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE 318 (SEQ ID NO: 318) ), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 326), FIGURE 328 (SEQ ID NO: : 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (SEQ ID NO: 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 358), FIG. (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIGURE 370 (SEQ ID NO: 370) , FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382) No .: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIGURE 390 (SEQ ID NO: 390), FIG. 39 2 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 (SEQ ID NO: 422), FIGUR 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432), FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIGURE 444 (SEQ ID NO: 444), 4FIG. (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIGURE 454 (SEQ ID NO: 454), FIG ure 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466) : 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), FIGURE 476 (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGURE 486 (SEQ ID NO: 486), FIG. 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIGURE 496 (SEQ ID NO: 496), FIG. 498 (SEQ ID NO: 498) : 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508 (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), FIGURE 518 (SEQ ID NO: 51) ), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528), FIG. (SEQ ID NO: 530), FIGURE 532 (SEQ ID NO: 532), FIGURE 534 (SEQ ID NO: 534), FIGURE 536 (SEQ ID NO: 536), FIGURE 538 (SEQ ID NO: 538), FIGURE 540 (SEQ ID NO: 540) , FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIG. Figure 550), Figure 552 (SEQ ID NO: 552), Figure 554 (SEQ ID NO: 554), Figure 556 (SEQ ID NO: 556), Figure 558 (SEQ ID NO: 558), Figure 560 (SEQ ID NO: 560), Figure 556 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), FIGURE 566 (SEQ ID NO: 566), FIGURE 568 (SEQ ID NO: 568), FIGURE 570 (SEQ ID NO: 570), FIGURE 572 (SEQ ID NO: 572) ), FIGURE 574 (SEQ ID NO: 574), FIGURE 576 (SEQ ID NO: 576), FIGURE 578 (SEQ ID NO: 578), FIGURE 580 (SEQ ID NO: 580), FIG. Figure 584 (SEQ ID NO: 584), Figure 586 (SEQ ID NO: 586), Figure 588 (SEQ ID NO: 588), Figure 590 (SEQ ID NO: 590), Figure 592 (SEQ ID NO: 592), FIGURE 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602), FIGURE 604 (SEQ ID NO: 604) : 604), FIG. 606 (SEQ ID NO: 606), FIGURE 608 (SEQ ID NO: 608), and FIG. 610 (SEQ ID NO: 610). An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity thereto.

An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by the full length coding sequence of the DNA deposited under any of the ATCC accession numbers set forth in Table 7.

A chimeric molecule comprising the polypeptide of claim 11 fused to a heterologous amino acid sequence.

14. The chimeric molecule of claim 13, wherein said heterologous amino acid sequence is an epitope tag sequence.

14. The chimeric molecule of claim 13, wherein said heterologous amino acid sequence is an Fc region of an immunoglobulin.

An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 11.

17. The antibody of claim 16, wherein said antibody is a monoclonal, humanized or single chain antibody.

(A) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), FIGURE 10 (SEQ ID NO: 2) lacking the linked signal peptide : 10), Figure 12 (SEQ ID NO: 12), Figure 14 (SEQ ID NO: 14), Figure 16 (SEQ ID NO: 16), Figure 18 (SEQ ID NO: 18), Figure 20 (SEQ ID NO: 20), Figure 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 44) : 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48), FIGURE 50 (SEQ ID NO: 50), FIGURE 52 (SEQ ID NO: 52), FIGURE 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE FIG. 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 ( (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80) , FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 90) FIG. 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), Figure 104 (SEQ ID NO: 1 04), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126) ), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIG. 136 (SEQ ID NO: 136), Figure 138 (SEQ ID NO: 138), Figure 140 (SEQ ID NO: 140), Figure 142 (SEQ ID NO: 142), Figure 144 (SEQ ID NO: 144), Figure 146 (SEQ ID NO: 146), FIGURE 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIG. Column No .: 168), FIGURE 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178) , FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190) No .: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIG. 20 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210) ), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (FIG. SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIGURE 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIG re 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274) : 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306) : 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE FIG. 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 326) , FIGURE 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (SEQ ID NO: 338) No. 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIGURE 70 (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380) ), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIG. 390 (SEQ ID NO: No .: 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412) : 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 (FIG. (SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432) , FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIG. No .: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIG. 45 4 (SEQ ID NO: 454), FIGURE 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), 4 FIG. (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGur 486 (SEQ ID NO: 486), FIGURE 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIGURE 496 (SEQ ID NO: 496) 496), Figure 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508. (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), FIG ure 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528) : 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 (SEQ ID NO: 538), Figure 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIG. 550 (SEQ ID NO: 550), FIG. 552 (SEQ ID NO. 552), FIG. 554 (SEQ ID NO. 554), FIG. 556 (SEQ ID NO. 556), FIG. 558 (SEQ ID NO. 558), FIG. : 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 570 (SEQ ID NO: 570), Figure 572 (SEQ ID NO: 572), Figure 574 (SEQ ID NO: 574), Figure 576 (SEQ ID NO: 576), Figure 578 (SEQ ID NO: 578), Figure 580 (SEQ ID NO: 580) ), FIGURE 582 (SEQ ID NO: 582), FIGURE 584 (SEQ ID NO: 584), FIGURE 586 (SEQ ID NO: 586), FIGURE 588 (SEQ ID NO: 588), FIGURE 590 (SEQ ID NO: 590), FIGURE 592 FIG. 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602) 160 # 604 (SEQ ID NO: 604), Figure 606 (SEQ ID NO: 606), Figure 608 (SEQ ID NO: 608), or Figure 610 (SEQ ID NO: 610). Sul nucleotide sequence;
(B) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), and FIGURE 10 (SEQ ID NO: : 10), Figure 12 (SEQ ID NO: 12), Figure 14 (SEQ ID NO: 14), Figure 16 (SEQ ID NO: 16), Figure 18 (SEQ ID NO: 18), Figure 20 (SEQ ID NO: 20), Figure 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34) FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 44) : 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48), FIGURE 50 (SEQ ID NO: 50), FIGURE 52 (SEQ ID NO: 52), FIGURE 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE FIG. 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 ( SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80) , FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 90) FIG. 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), Figure 104 (SEQ ID NO: 04), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126) ), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIGURE 136 (sequence) No .: 136), FIGURE 138 (SEQ ID NO: 138), FIGURE 140 (SEQ ID NO: 140), FIGURE 142 (SEQ ID NO: 142), FIGURE 144 (SEQ ID NO: 144), FIGURE 146 (SEQ ID NO: 146), FIG. 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIG. 156 (SEQ ID NO: 156), FIG. 158 (SEQ ID NO: 158) FIG. 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIG. FIG. 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIG. 178 (SEQ ID NO: 178) , FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190) No .: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIGURE 2 0 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGUR 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIGURE 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), Fi ure 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274) : 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306) : 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 32) ), Figure 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (FIG. 338). SEQ ID NO: 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348) , FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 358), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIG. (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380) ), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIG. No .: 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412) : 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432) , FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIG. No .: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIGURE 4 4 (SEQ ID NO: 454), FIGURE 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), 4 FIG. (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGur e 486 (SEQ ID NO: 486), Figure 488 (SEQ ID NO: 488), Figure 490 (SEQ ID NO: 490), Figure 492 (SEQ ID NO: 492), Figure 494 (SEQ ID NO: 494), Figure 496 (SEQ ID NO: 496) : 496), FIGURE 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508 (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), Fi ure 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528) : 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 (SEQ ID NO: 538), Figure 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIGURE 550 (SEQ ID NO: 550), FIGURE 552 (SEQ ID NO: 552), FIGURE 554 (SEQ ID NO: 554), FIGURE 556 (SEQ ID NO: 556), FIGURE 558 (SEQ ID NO: 558), FIG. 560 (SEQ ID NO: 560) : 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 570 (SEQ ID NO: 570), Figure 572 (SEQ ID NO: 572), FIGURE 574 (SEQ ID NO: 574), FIGURE 576 (SEQ ID NO: 576), FIGURE 578 (SEQ ID NO: 578), FIGURE 580 (SEQ ID NO: 58) ), FIGURE 582 (SEQ ID NO: 582), FIGURE 584 (SEQ ID NO: 584), FIGURE 586 (SEQ ID NO: 586), FIGURE 588 (SEQ ID NO: 588), FIGURE 590 (SEQ ID NO: 590), FIGURE 592 FIG. 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602) , FIGURE 604 (SEQ ID NO: 604), FIGURE 606 (SEQ ID NO: 606), FIGURE 608 (SEQ ID NO: 608), or FIG. 610 (SEQ ID NO: 610) The nucleotide sequences encoding the domain; or
(C) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: : 10), Figure 12 (SEQ ID NO: 12), Figure 14 (SEQ ID NO: 14), Figure 16 (SEQ ID NO: 16), Figure 18 (SEQ ID NO: 18), Figure 20 (SEQ ID NO: 20), Figure 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 44) : 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48), FIGURE 50 (SEQ ID NO: 50), FIGURE 52 (SEQ ID NO: 52), FIGURE 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE FIG. 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 (distribution) (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80) , FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 90) FIG. 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), Figure 104 (SEQ ID NO: 1 4), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126) ), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIG. 136 (SEQ ID NO: 136), Figure 138 (SEQ ID NO: 138), Figure 140 (SEQ ID NO: 140), Figure 142 (SEQ ID NO: 142), Figure 144 (SEQ ID NO: 144), Figure 146 (SEQ ID NO: 146), FIGURE 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIG. Column No .: 168), FIGURE 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178) , FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190) No .: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIG. 20 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210) ), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (FIG. SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIGURE 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIG re 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274) : 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), F FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306) : 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE FIG. 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 326) , FIGURE 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (SEQ ID NO: 338) No. 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 3) 58), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIGURE 70 (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380) ), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIG. 390 (SEQ ID NO: : 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 (FIG. (SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432) , FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIG. No .: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIG. 45 (SEQ ID NO: 454), FIGURE 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464) ), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), FIGURE 476. (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGURE 486 (SEQ ID NO: 486), FIGURE 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIGURE 496 (SEQ ID NO: 496) 496), Figure 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508. (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), FIG re 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528) : 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 (SEQ ID NO: 538), Figure 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIG. 550 (SEQ ID NO: 550), FIG. 552 (SEQ ID NO. 552), FIG. 554 (SEQ ID NO. 554), FIG. 556 (SEQ ID NO. 556), FIG. 558 (SEQ ID NO. 558), FIG. : 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 570 (SEQ ID NO: 570), Figure 572 (SEQ ID NO: 572), Figure 574 (SEQ ID NO: 574), Figure 576 (SEQ ID NO: 576), Figure 578 (SEQ ID NO: 578), Figure 580 (SEQ ID NO: 580) , FIGURE 582 (SEQ ID NO: 582), FIGURE 584 (SEQ ID NO: 584), FIGURE 586 (SEQ ID NO: 586), FIGURE 588 (SEQ ID NO: 588), FIGURE 590 (SEQ ID NO: 590), FIGURE 592 (SEQ ID NO: 592) No .: 592), FIGURE 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602), Extracellular polypeptide of the polypeptide shown in FIG. 604 (SEQ ID NO: 604), FIG. 606 (SEQ ID NO: 606), FIG. 608 (SEQ ID NO: 608), or FIG. 610 (SEQ ID NO: 610) The nucleotide sequence encoding the main:
An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleic acid.

(A) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), FIG. 10 (SEQ ID NO: : 10), Figure 12 (SEQ ID NO: 12), Figure 14 (SEQ ID NO: 14), Figure 16 (SEQ ID NO: 16), Figure 18 (SEQ ID NO: 18), Figure 20 (SEQ ID NO: 20), Figure 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 44) : 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48), FIGURE 50 (SEQ ID NO: 50), FIGURE 52 (SEQ ID NO: 52), FIGURE 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE FIG. 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 (distribution) (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80) , FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 90) FIG. 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), Figure 104 (SEQ ID NO: 1 4), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126) ), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIG. 136 (SEQ ID NO: 136), Figure 138 (SEQ ID NO: 138), Figure 140 (SEQ ID NO: 140), Figure 142 (SEQ ID NO: 142), Figure 144 (SEQ ID NO: 144), Figure 146 (SEQ ID NO: 146), FIGURE 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIG. Column No .: 168), FIGURE 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178) , FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190) No .: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIG. 20 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210) ), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (FIG. SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIGURE 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIG re 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274) : 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), F FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306) : 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE FIG. 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 326) , FIGURE 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (SEQ ID NO: 338) No. 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 3) 58), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIGURE 70 (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380) ), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIG. 390 (SEQ ID NO: : 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 (FIG. (SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432) , FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIG. No .: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIG. 45 (SEQ ID NO: 454), FIGURE 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464) ), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), FIGURE 476. (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGURE 486 (SEQ ID NO: 486), FIGURE 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIGURE 496 (SEQ ID NO: 496) 496), Figure 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508. (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), FIG re 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528) : 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 (SEQ ID NO: 538), Figure 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIG. 550 (SEQ ID NO: 550), FIG. 552 (SEQ ID NO. 552), FIG. 554 (SEQ ID NO. 554), FIG. 556 (SEQ ID NO. 556), FIG. 558 (SEQ ID NO. 558), FIG. : 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 570 (SEQ ID NO: 570), Figure 572 (SEQ ID NO: 572), Figure 574 (SEQ ID NO: 574), Figure 576 (SEQ ID NO: 576), Figure 578 (SEQ ID NO: 578), Figure 580 (SEQ ID NO: 580) , FIGURE 582 (SEQ ID NO: 582), FIGURE 584 (SEQ ID NO: 584), FIGURE 586 (SEQ ID NO: 586), FIGURE 588 (SEQ ID NO: 588), FIGURE 590 (SEQ ID NO: 590), FIGURE 592 (SEQ ID NO: 592) No .: 592), FIGURE 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602), The amino acid of the polypeptide shown in FIG. 604 (SEQ ID NO: 604), FIG. 606 (SEQ ID NO: 606), FIG. 608 (SEQ ID NO: 608), or FIG. 610 (SEQ ID NO: 610) Sequence;
(B) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8), and FIGURE 10 (SEQ ID NO: : 10), Figure 12 (SEQ ID NO: 12), Figure 14 (SEQ ID NO: 14), Figure 16 (SEQ ID NO: 16), Figure 18 (SEQ ID NO: 18), Figure 20 (SEQ ID NO: 20), Figure 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGURE 34 (SEQ ID NO: 34) FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44), FIGURE 46 (SEQ ID NO: 44) : 46), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 48), FIGURE 50 (SEQ ID NO: 50), FIGURE 52 (SEQ ID NO: 52), FIGURE 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE FIG. 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), FIGURE 68 (SEQ ID NO: 68), FIGURE 70 ( SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80) , FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 90) FIG. 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 (SEQ ID NO: 102), Figure 104 (SEQ ID NO: 04), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126) ), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134), FIGURE 136 (sequence) No .: 136), FIGURE 138 (SEQ ID NO: 138), FIGURE 140 (SEQ ID NO: 140), FIGURE 142 (SEQ ID NO: 142), FIGURE 144 (SEQ ID NO: 144), FIGURE 146 (SEQ ID NO: 146), FIG. 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIG. 156 (SEQ ID NO: 156), FIG. 158 (SEQ ID NO: 158) FIG. 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 166), FIG. FIG. 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIG. 178 (SEQ ID NO: 178) , FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190) No .: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198), FIGURE 2 0 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220), FIGURE 222 (SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIGURE 230 (SEQ ID NO: 230), FIGUR 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIGURE 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), Fi ure 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274) : 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 294 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: 304), FIGURE 306 (SEQ ID NO: 306) : 306), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGURE 326 (SEQ ID NO: 32) ), Figure 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: 336), FIGURE 338 (FIG. 338). SEQ ID NO: 338), FIGURE 340 (SEQ ID NO: 340), FIGURE 342 (SEQ ID NO: 342), FIGURE 344 (SEQ ID NO: 344), FIGURE 346 (SEQ ID NO: 346), FIGURE 348 (SEQ ID NO: 348) , FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIGURE 356 (SEQ ID NO: 356), FIGURE 358 (SEQ ID NO: 358), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368), FIG. (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380) ), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388), FIG. No .: 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412) : 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 420), FIGURE 422 SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIGURE 432 (SEQ ID NO: 432) , FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442), FIG. No .: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: 452), FIGURE 4 4 (SEQ ID NO: 454), FIGURE 456 (SEQ ID NO: 456), FIGURE 458 (SEQ ID NO: 458), FIGURE 460 (SEQ ID NO: 460), FIGURE 462 (SEQ ID NO: 462), FIGURE 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), 4 FIG. (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIGURE 484 (SEQ ID NO: 484), FIGur e 486 (SEQ ID NO: 486), Figure 488 (SEQ ID NO: 488), Figure 490 (SEQ ID NO: 490), Figure 492 (SEQ ID NO: 492), Figure 494 (SEQ ID NO: 494), Figure 496 (SEQ ID NO: 496) : 496), FIGURE 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506), FIGURE 508 (SEQ ID NO: 508), FIGURE 510 (SEQ ID NO: 510), FIGURE 512 (SEQ ID NO: 512), FIGURE 514 (SEQ ID NO: 514), FIGURE 516 (SEQ ID NO: 516), Fi ure 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526), FIGURE 528 (SEQ ID NO: 528) : 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 (SEQ ID NO: 538), Figure 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 548 (SEQ ID NO: 548), FIGURE 550 (SEQ ID NO: 550), FIGURE 552 (SEQ ID NO: 552), FIGURE 554 (SEQ ID NO: 554), FIGURE 556 (SEQ ID NO: 556), FIGURE 558 (SEQ ID NO: 558), FIG. 560 (SEQ ID NO: 560) : 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), FIGURE 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 570 (SEQ ID NO: 570), Figure 572 (SEQ ID NO: 572), FIGURE 574 (SEQ ID NO: 574), FIGURE 576 (SEQ ID NO: 576), FIGURE 578 (SEQ ID NO: 578), FIGURE 580 (SEQ ID NO: 58) ), FIGURE 582 (SEQ ID NO: 582), FIGURE 584 (SEQ ID NO: 584), FIGURE 586 (SEQ ID NO: 586), FIGURE 588 (SEQ ID NO: 588), FIGURE 590 (SEQ ID NO: 590), FIGURE 592 FIG. 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602) , FIGURE 604 (SEQ ID NO: 604), FIGURE 606 (SEQ ID NO: 606), FIGURE 608 (SEQ ID NO: 608), or FIG. 610 (SEQ ID NO: 610) (C) FIGURE 2 (SEQ ID NO: 2), FIGURE 4 (SEQ ID NO: 4), FIGURE 6 (SEQ ID NO: 6), FIGURE 8 (SEQ ID NO: 8) lacking the signal peptide to be linked; , FIGURE 10 (SEQ ID NO: 10), FIGURE 12 (SEQ ID NO: 12), FIGURE 14 (SEQ ID NO: 14), FIGURE 16 (SEQ ID NO: 16), FIGURE 18 (SEQ ID NO: 18), FIGURE 20 (SEQ ID NO: 20) No .: 20), FIGURE 22 (SEQ ID NO: 22), FIGURE 24 (SEQ ID NO: 24), FIGURE 26 (SEQ ID NO: 26), FIGURE 28 (SEQ ID NO: 28), FIGURE 30 (SEQ ID NO: 30), FIGURE 32 (SEQ ID NO: 32), FIGu e 34 (SEQ ID NO: 34), FIGURE 36 (SEQ ID NO: 36), FIGURE 38 (SEQ ID NO: 38), FIGURE 40 (SEQ ID NO: 40), FIGURE 42 (SEQ ID NO: 42), FIGURE 44 (SEQ ID NO: 44) : 44), Figure 46 (SEQ ID NO: 46), Figure 48 (SEQ ID NO: 48), Figure 50 (SEQ ID NO: 50), Figure 52 (SEQ ID NO: 52), Figure 54 (SEQ ID NO: 54), FIGURE 56 (SEQ ID NO: 56), FIGURE 58 (SEQ ID NO: 58), FIGURE 60 (SEQ ID NO: 60), FIGURE 62 (SEQ ID NO: 62), FIGURE 64 (SEQ ID NO: 64), FIGURE 66 (SEQ ID NO: 66), Figure 68 (SEQ ID NO: FIG. 70 (SEQ ID NO: 70), FIGURE 72 (SEQ ID NO: 72), FIGURE 74 (SEQ ID NO: 74), FIGURE 76 (SEQ ID NO: 76), FIGURE 78 (SEQ ID NO: 78), FIGURE 80 (SEQ ID NO: 80), FIGURE 82 (SEQ ID NO: 82), FIGURE 84 (SEQ ID NO: 84), FIGURE 86 (SEQ ID NO: 86), FIGURE 88 (SEQ ID NO: 88), FIGURE 90 (SEQ ID NO: 90) ), FIGURE 92 (SEQ ID NO: 92), FIGURE 94 (SEQ ID NO: 94), FIGURE 96 (SEQ ID NO: 96), FIGURE 98 (SEQ ID NO: 98), FIGURE 100 (SEQ ID NO: 100), FIGURE 102 ( SEQ ID NO: 102), Fi figure 104 (SEQ ID NO: 104), FIGURE 106 (SEQ ID NO: 106), FIGURE 108 (SEQ ID NO: 108), FIGURE 110 (SEQ ID NO: 110), FIGURE 112 (SEQ ID NO: 112), FIGURE 114 (SEQ ID NO: : 114), FIGURE 116 (SEQ ID NO: 116), FIGURE 118 (SEQ ID NO: 118), FIGURE 120 (SEQ ID NO: 120), FIGURE 122 (SEQ ID NO: 122), FIGURE 124 (SEQ ID NO: 124), FIGURE 126 (SEQ ID NO: 126), FIGURE 128 (SEQ ID NO: 128), FIGURE 130 (SEQ ID NO: 130), FIGURE 132 (SEQ ID NO: 132), FIGURE 134 (SEQ ID NO: 134) FIG. 136 (SEQ ID NO: 136), FIGURE 138 (SEQ ID NO: 138), FIGURE 140 (SEQ ID NO: 140), FIGURE 142 (SEQ ID NO: 142), FIGURE 144 (SEQ ID NO: 144), FIGURE 146 (SEQ ID NO: 146) FIG. 148 (SEQ ID NO: 148), FIGURE 150 (SEQ ID NO: 150), FIGURE 152 (SEQ ID NO: 152), FIGURE 154 (SEQ ID NO: 154), FIGURE 156 (SEQ ID NO: 156), FIGURE 158 (SEQ ID NO: 158), FIGURE 160 (SEQ ID NO: 160), FIGURE 162 (SEQ ID NO: 162), FIGURE 164 (SEQ ID NO: 164), FIGURE 166 (SEQ ID NO: 16) 6), FIGURE 168 (SEQ ID NO: 168), FIGURE 170 (SEQ ID NO: 170), FIGURE 172 (SEQ ID NO: 172), FIGURE 174 (SEQ ID NO: 174), FIGURE 176 (SEQ ID NO: 176), FIGURE 178 (SEQ ID NO: 178), FIGURE 180 (SEQ ID NO: 180), FIGURE 182 (SEQ ID NO: 182), FIGURE 184 (SEQ ID NO: 184), FIGURE 186 (SEQ ID NO: 186), FIGURE 188 (SEQ ID NO: 188) ), FIGURE 190 (SEQ ID NO: 190), FIGURE 192 (SEQ ID NO: 192), FIGURE 194 (SEQ ID NO: 194), FIGURE 196 (SEQ ID NO: 196), FIGURE 198 (SEQ ID NO: 198) 198), FIGURE 200 (SEQ ID NO: 200), FIGURE 202 (SEQ ID NO: 202), FIGURE 204 (SEQ ID NO: 204), FIGURE 206 (SEQ ID NO: 206), FIGURE 208 (SEQ ID NO: 208), FIGURE 210 (SEQ ID NO: 210), FIGURE 212 (SEQ ID NO: 212), FIGURE 214 (SEQ ID NO: 214), FIGURE 216 (SEQ ID NO: 216), FIGURE 218 (SEQ ID NO: 218), FIGURE 220 (SEQ ID NO: 220) ), FIGURE 222 (SEQ ID NO: 222), FIGURE 224 (SEQ ID NO: 224), FIGURE 226 (SEQ ID NO: 226), FIGURE 228 (SEQ ID NO: 228), FIG. No .: 230), FIGURE 232 (SEQ ID NO: 232), FIGURE 234 (SEQ ID NO: 234), FIGURE 236 (SEQ ID NO: 236), FIGURE 238 (SEQ ID NO: 238), FIGURE 240 (SEQ ID NO: 240), FIG. 242 (SEQ ID NO: 242), FIGURE 244 (SEQ ID NO: 244), FIGURE 246 (SEQ ID NO: 246), FIGURE 248 (SEQ ID NO: 248), FIGURE 250 (SEQ ID NO: 250), FIGURE 252 (SEQ ID NO: 252) : 252), FIGURE 254 (SEQ ID NO: 254), FIGURE 256 (SEQ ID NO: 256), FIGURE 258 (SEQ ID NO: 258), FIGURE 260 (SEQ ID NO: 260), FIGURE 262 (SEQ ID NO: 262), FIGURE 264 (SEQ ID NO: 264), FIGURE 266 (SEQ ID NO: 266), FIGURE 268 (SEQ ID NO: 268), FIGURE 270 (SEQ ID NO: 270), FIGURE 272 (SEQ ID NO: 272) ), FIGURE 274 (SEQ ID NO: 274), FIGURE 276 (SEQ ID NO: 276), FIGURE 278 (SEQ ID NO: 278), FIGURE 280 (SEQ ID NO: 280), FIGURE 282 (SEQ ID NO: 282), FIGURE 284 (FIG. 284) SEQ ID NO: 284), FIGURE 286 (SEQ ID NO: 286), FIGURE 288 (SEQ ID NO: 288), FIGURE 290 (SEQ ID NO: 290), FIGURE 292 (SEQ ID NO: 292), FIGURE 94 (SEQ ID NO: 294), FIGURE 296 (SEQ ID NO: 296), FIGURE 298 (SEQ ID NO: 298), FIGURE 300 (SEQ ID NO: 300), FIGURE 302 (SEQ ID NO: 302), FIGURE 304 (SEQ ID NO: FIG. 306 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 308 (SEQ ID NO: 308), FIGURE 310 (SEQ ID NO: 310), FIGURE 312 (SEQ ID NO: 312), FIGURE 314 (SEQ ID NO: 314), FIGURE 316 (SEQ ID NO: 316), FIGURE 318 (SEQ ID NO: 318), FIGURE 320 (SEQ ID NO: 320), FIGURE 322 (SEQ ID NO: 322), FIGURE 324 (SEQ ID NO: 324), FIGu e 326 (SEQ ID NO: 326), FIGURE 328 (SEQ ID NO: 328), FIGURE 330 (SEQ ID NO: 330), FIGURE 332 (SEQ ID NO: 332), FIGURE 334 (SEQ ID NO: 334), FIGURE 336 (SEQ ID NO: : 336), Figure 338 (SEQ ID NO: 338), Figure 340 (SEQ ID NO: 340), Figure 342 (SEQ ID NO: 342), Figure 344 (SEQ ID NO: 344), Figure 346 (SEQ ID NO: 346), Figure 348 (SEQ ID NO: 348), FIGURE 350 (SEQ ID NO: 350), FIGURE 352 (SEQ ID NO: 352), FIGURE 354 (SEQ ID NO: 354), FIG. 356 (SEQ ID NO: 356), F gure 358 (SEQ ID NO: 358), FIGURE 360 (SEQ ID NO: 360), FIGURE 362 (SEQ ID NO: 362), FIGURE 364 (SEQ ID NO: 364), FIGURE 366 (SEQ ID NO: 366), FIGURE 368 (SEQ ID NO: 368) : 368), FIGURE 370 (SEQ ID NO: 370), FIGURE 372 (SEQ ID NO: 372), FIGURE 374 (SEQ ID NO: 374), FIGURE 376 (SEQ ID NO: 376), FIGURE 378 (SEQ ID NO: 378), FIGURE 380 (SEQ ID NO: 380), FIGURE 382 (SEQ ID NO: 382), FIGURE 384 (SEQ ID NO: 384), FIGURE 386 (SEQ ID NO: 386), FIGURE 388 (SEQ ID NO: 388) FIGURE 390 (SEQ ID NO: 390), FIGURE 392 (SEQ ID NO: 392), FIGURE 394 (SEQ ID NO: 394), FIGURE 396 (SEQ ID NO: 396), FIGURE 398 (SEQ ID NO: 398), FIGURE 400 (SEQ ID NO: 400) : 400), FIGURE 402 (SEQ ID NO: 402), FIGURE 404 (SEQ ID NO: 404), FIGURE 406 (SEQ ID NO: 406), FIGURE 408 (SEQ ID NO: 408), FIGURE 410 (SEQ ID NO: 410), FIGURE 412 (SEQ ID NO: 412), FIGURE 414 (SEQ ID NO: 414), FIGURE 416 (SEQ ID NO: 416), FIGURE 418 (SEQ ID NO: 418), FIGURE 420 (SEQ ID NO: 4) 0), FIGURE 422 (SEQ ID NO: 422), FIGURE 424 (SEQ ID NO: 424), FIGURE 426 (SEQ ID NO: 426), FIGURE 428 (SEQ ID NO: 428), FIGURE 430 (SEQ ID NO: 430), FIG. 32 (SEQ ID NO: 432), FIGURE 434 (SEQ ID NO: 434), FIGURE 436 (SEQ ID NO: 436), FIGURE 438 (SEQ ID NO: 438), FIGURE 440 (SEQ ID NO: 440), FIGURE 442 (SEQ ID NO: 442) ), FIGURE 444 (SEQ ID NO: 444), FIGURE 446 (SEQ ID NO: 446), FIGURE 448 (SEQ ID NO: 448), FIGURE 450 (SEQ ID NO: 450), FIGURE 452 (SEQ ID NO: : 452), Figure 454 (SEQ ID NO: 454), Figure 456 (SEQ ID NO: 456), Figure 458 (SEQ ID NO: 458), Figure 460 (SEQ ID NO: 460), Figure 462 (SEQ ID NO: 462), Figure 464 (SEQ ID NO: 464), FIGURE 466 (SEQ ID NO: 466), FIGURE 468 (SEQ ID NO: 468), FIGURE 470 (SEQ ID NO: 470), FIGURE 472 (SEQ ID NO: 472), FIGURE 474 (SEQ ID NO: 474), FIGURE 476 (SEQ ID NO: 476), FIGURE 478 (SEQ ID NO: 478), FIGURE 480 (SEQ ID NO: 480), FIGURE 482 (SEQ ID NO: 482), FIG. No .: 484), FIGURE 486 (SEQ ID NO: 486), FIGURE 488 (SEQ ID NO: 488), FIGURE 490 (SEQ ID NO: 490), FIGURE 492 (SEQ ID NO: 492), FIGURE 494 (SEQ ID NO: 494), FIG. 496 (SEQ ID NO: 496), FIGURE 498 (SEQ ID NO: 498), FIGURE 500 (SEQ ID NO: 500), FIGURE 502 (SEQ ID NO: 502), FIGURE 504 (SEQ ID NO: 504), FIGURE 506 (SEQ ID NO: 506) : 506), Figure 508 (SEQ ID NO: 508), Figure 510 (SEQ ID NO: 510), Figure 512 (SEQ ID NO: 512), Figure 514 (SEQ ID NO: 514), Figure 516 (SEQ ID NO: 516), FIGURE 518 (SEQ ID NO: 518), FIGURE 520 (SEQ ID NO: 520), FIGURE 522 (SEQ ID NO: 522), FIGURE 524 (SEQ ID NO: 524), FIGURE 526 (SEQ ID NO: 526) ), Figure 528 (SEQ ID NO: 528), Figure 530 (SEQ ID NO: 530), Figure 532 (SEQ ID NO: 532), Figure 534 (SEQ ID NO: 534), Figure 536 (SEQ ID NO: 536), Figure 538 SEQ ID NO: 538), FIGURE 540 (SEQ ID NO: 540), FIGURE 542 (SEQ ID NO: 542), FIGURE 544 (SEQ ID NO: 544), FIGURE 546 (SEQ ID NO: 546), FIGURE 48 (SEQ ID NO: 548), FIGURE 550 (SEQ ID NO: 550), FIGURE 552 (SEQ ID NO: 552), FIGURE 554 (SEQ ID NO: 554), FIGURE 556 (SEQ ID NO: 556), FIGURE 558 (SEQ ID NO: 558) Figure 558), Figure 560 (SEQ ID NO: 560), Figure 562 (SEQ ID NO: 562), Figure 564 (SEQ ID NO: 564), Figure 566 (SEQ ID NO: 566), Figure 568 (SEQ ID NO: 568), Figure 70 (SEQ ID NO: 570), FIGURE 572 (SEQ ID NO: 572), FIGURE 574 (SEQ ID NO: 574), FIGURE 576 (SEQ ID NO: 576), FIGURE 578 (SEQ ID NO: 578), FIGu re 580 (SEQ ID NO: 580), Figure 582 (SEQ ID NO: 582), Figure 584 (SEQ ID NO: 584), Figure 586 (SEQ ID NO: 586), Figure 588 (SEQ ID NO: 588), Figure 590 (SEQ ID NO: 590) : 590), FIGURE 592 (SEQ ID NO: 592), FIGURE 594 (SEQ ID NO: 594), FIGURE 596 (SEQ ID NO: 596), FIGURE 598 (SEQ ID NO: 598), FIGURE 600 (SEQ ID NO: 600), FIGURE 602 (SEQ ID NO: 602), FIGURE! 160 # 604 (SEQ ID NO: 604), FIGURE 606 (SEQ ID NO: 606), FIGURE 608 (SEQ ID NO: 608), or FIGURE 610 (SEQ ID NO: 610) Amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in:
An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to a polypeptide.

A method for promoting the release of TNF-α from human blood, comprising contacting PRO1079, PRO827, PRO791, PRO1131, PRO1316, PRO1183, PRO1343, PRO1760, PRO1567 or PRO4333 polypeptide with the blood, A method comprising promoting the release of TNF-α from said blood.

A method for promoting the growth or differentiation of chondrocytes, comprising contacting a PRO6029 polypeptide with said cell to promote the growth or differentiation of said cell.

A method for detecting the presence of a tumor in a mammal, comprising the steps of (a) a test sample obtained from said mammal and (b) a control sample of normal cells of the same cell type comprising any of the PRO polypeptides shown in Table 8. A method comprising comparing the level of expression, wherein a high level of expression of said PRO polypeptide in a test sample relative to a control sample indicates the presence of a tumor in said mammal.

23. The method of claim 22, wherein said tumor is an adrenal tumor, lung tumor, colon tumor, breast tumor, prostate tumor, rectal tumor, cervical tumor or liver tumor.

Oligonucleotide probes derived from any of the nucleotide sequences shown in the accompanying drawings.