JP2004507260A - 抗細菌作用がある4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(dhcp)に対する耐性を与える遺伝子、それによりコードされるタンパク質、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)の抗細菌活性に対する耐性を与える遺伝子、depに関連する。本発明は更に、depによってコードされ、疎水性であり、DHCPに対して特異的な膜貫通型の流出タンパク質である、推定上のタンパク質に関連する。本発明は更にdep遺伝子を含有するプラスミド、及びdepを発現する細菌細胞に関連する。更に、本発明は、生物中で、抗細菌活性に対する耐性を与えることにおいて用いる為の利用を供する。dep遺伝子はDHCP又はDHCPと機能的に等しい化合物に対する耐性を担う流出活性を阻害する化合物を同定するのに用いることが出来うる。
Description
【0001】
この特許出願は2000年8月29日に提出された米国仮出願第60/228,727号の優先権を主張する。この先の仮出願はここで参照として組み込まれている。
【0002】
様々な細菌に対して有効な多くの抗生物質(がある)にもかかわらず、多剤耐性株の出現により、より新しく且つ効果的な抗細菌化合物に関する研究が続いている。4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)(図1を参照のこと)は、様々なグラム陽性及び陰性細菌、例えばエシエリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス(Bacillus)属、サルモネラ(Salmonella)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属等に対する抗細菌活性を有する化合物である。DHCPの製造及び特性は特許化されている(Koyamaら、1999)。それはウロン酸又はその誘導体の熱処理によって調製されている。ここにおいてウロン酸は、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸又は、イズロン酸である。それは又火であぶったもしくは乾燥した野菜、果物、穀類、マッシュルーム、海藻、皮質もしくは軟骨からも生産されている。この化合物は、ガン細胞の分化及びアポトーシスを誘導することが示されている。それは、ガンに対する治療剤又は予防剤としての潜在的な利用がありそして又消毒剤、歯磨粉、化粧品及び入浴剤中での抗細菌剤としての利用もある(Koyamaら、1999)。
【0003】
我々は大腸菌(E.coli)ゲノムライブラリーからDHCPの毒性に対する多重コピー型サプレッサーを単離した。この遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質は、多くの抗生物質、例えば、クロラムフェニコール、ビシクロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える公知の流出タンパク質に対する高い相同性を示した。遺伝子は大腸菌染色体上で37.5分でマッピングされた。それを、dep;DHCP efflux proteinとして命名している。しかし、Depタンパク質は試験した全抗生物質に対しても交叉耐性を与えない。
【0004】
先行技術分野
Koyamaらへの米国特許第6,087,401号、シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【0005】
この特許では、4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)を製造する方法が開示してある。又DHCPの抗細菌活性も記載してある。
【0006】
一方で、本仮出願中で開示した発明は、細菌細胞中で多重コピーにおいて存在する時に、DHCPの抗細菌活性に対する耐性を与え、故に当該細菌にDHCPによる殺菌(作用)に対する耐性を持たせる遺伝子、depに関連する。本出願は又dep遺伝子によりコードされるタンパク質も記載している。
【0007】
Koyamaらへのヨーロッパ特許 EP0 941 981 A1.シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【0008】
この特許出願は本質的に、Koyamaらへの米国特許第6,087,401号に記載されたような同じ題目に関連する。
【0009】
Kobayashi らへの米国特許第6,111,145号。シクロペンテン誘導体。
【0010】
この特許は、機能的に等しいDHCPのエーテル誘導体に関連し、そしてこれらの誘導体の活性を開示する。
【0011】
Kobayashi らへのヨーロッパ特許刊行物 EP1 000 923 A1。シクロペンテノン誘導体。
【0012】
この特許出願は本質的に、Kobayashi らへの米国特許第6,111,145号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【0013】
Koyamaらへの米国特許第6,136,854号。シクロペンテノン誘導体。
【0014】
この特許は、DHCPの機能的に等しいエステル誘導体に関連し、そしてこれら誘導体の生物活性を開示する。
【0015】
Koyamaらへのヨーロッパ特許刊行物 EP0 976 717 A1。シクロペンテノン誘導体。
【0016】
この特許出願は本質的に、Koyamaらへの米国特許第6,136,854号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【0017】
Clinical significance of P−glycoprotein expression and function for response to induction chemotherapy, relapse rate and overall survival in acute leukemia. C. Wuchter, ら、Haematologica 85 (7) : 711−21 (2000)。
【0018】
急性の白血病において、P−糖タンパク質(P−gp)により仲介される多剤耐性(MDR)表現型は、化学療法が失敗する原因である。この研究では、P−gp発現のレベル又は機能的なP−gp活性が急性の白血病における導入補助化学療法、再発率及び全体的な生存率に対する応答のよりよい予測因子であったかどうかが調べられた。機能的ローダミン−123−(rh123)流出アッセイは、急性の白血病におけるモノクローナル抗体によるP−gp発現解析よりも好ましいことを示した。
【0019】
Increased drug delivery to the brain by P−glycoprotein inhibition. A.J. Sadeque, ら、Clinical Pharmacology & Therapeutics 68 (3) : 231−7 (2000)。
【0020】
in vitro研究では、止痢薬のロペラミドは流出膜輸送体P−糖タンパク質の為の基質であることが示されている。ロペラミドは有力な麻酔薬であるが、患者へ通常の投与量で与えられた時に、中枢神経系の効果、例えば呼吸抑制を示さない。この研究では、キニジンによるP−糖タンパク質の阻害が、ロペラミドの中枢神経系への浸入を高め、従って呼吸抑制を生じさせるという仮説を試験した。結果では、ロペラミドは単独で用いられた時には呼吸抑制を生じさせないが、ロペラミドがキニジンと共に投与された時には呼吸抑制が見られることが示された。
【0021】
Expression of the multidrug−resistance−associated protein in myelodysplastic syndromes. S. Poulain, ら、British Journal of Haematology 110 (3) : 591−8 (2000)。
【0022】
骨髄異形成症候群(MDS)において、P−糖タンパク質(P−gp)の発現は薬物耐性に関連している一方で、多剤耐性関連タンパク質(MRP1)の臨床的な意義は不明である。MDSを有する患者由来の骨髄のこの研究において、MRP1の発現は、MDSにおける病期との相関関係があった。P−gpに関して、MRP1の不均衡な発現/機能が、あるケースにおいて発見されており、MDSにおける無機能輸送タンパク質の存在が示唆されている。MRP1の発現はMDSにおける予後因子ではなかったようだ。
【0023】
Soft tissue leiomyosarcomas and malignant gastrointestinal stromal tumors : differences in clinical outcome and expression of multidrug resistance proteins. B.E. Plaat, ら、Journal of Clinical Oncology 18 (18) : 3211−20 (2000)。
【0024】
この研究において、多剤耐性(MDR)と関連するパラメータが軟組織平滑筋肉腫(LMS)と悪性の消化間質腫瘍(maligmant gastrointestinal stromal tumors)(GIST)との間で比較された。免疫組織化学を用いて、P−糖タンパク質(P−gp)、多剤耐性タンパク質(MRP(1))、肺耐性タンパク質(LRP)、及びC−キットを検出した。結果では、LMS患者はGIST患者と比較して生存率が良く、転移の傾向は2つの患者の群の間では異なることが示されている。試験したMDRタンパク質の発現量は、GISTにおいてよりもLMSにおいて少ないことが予測されている。
【0025】
Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi : A new family of genes responsible for autoinducer production. M.G. Surette, ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 1639−44 (1999)。
【0026】
細菌において、クオラムセンシングといわれる、細胞密度における変化に応じて発現する遺伝子の調節は、細菌によって生産されそして細菌の細胞数が増加するにつれ外部環境中に蓄積される自己誘導物質として公知のホルモン様分子に依存している。海洋性細菌ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)は、各々がセンサー−自己誘導物質の対から成る2つの並行するクオラムセンシング系を持つことが分かっている。各系に属する2つの異なる自己誘導物質を、自己誘導物質1(AI−1)及び自己誘導物質2(AI−2)という。大腸菌、S.チヒムリウム(S. typhimurium)及びV.ハーベイにおいてAI−2生産の為に必要な遺伝子の同定及び解析が報告されている。
【0027】
Quorum sensing in Vibrio fischeri : Probing autoinducer−LuxR interactions with autoinducer analogs. A.L. Schaefer, ら、Journal of Bacteriology 178 : 2897−2901 (1996)。
【0028】
ビブリオ・フィッシェリ(Vibrio fischeri)において、発光遺伝子は、自己誘導物質として公知の拡散性のシグナル化合物との組み合わせにおける転写因子LuxRによって活性化される。この研究では、LuxRと相互作用する多くの自己誘導物質の能力を解析した。
【0029】
Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and Sigma−54. B.N. Lilley及びB.L. Bassler. Molecular Microbiology 36 (4) : 940−954 (2000)。
【0030】
生物発光海洋性細菌のビブリオ・ハーベイは、発光(lux)をクオラムセンシング回路によって制御する。この研究では、応答調節タンパク質LuxOが、選択的σ因子、σ54との相互作用によりアクチベータータンパク質として機能することが示されている。LuxOはルシフェラーゼ構造オペロン(luxCDABEGH)の抑制を担うので、これらの結果は、LuxOが、σ54と一緒になり機能して、発光の負の調節因子を活性化することを示唆している。
【表1】
【表2】
【0031】
発明の詳細な説明
本仮出願は、大腸菌由来の膜貫通タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを記載している。このタンパク質は、多重コピープラスミドより発現した時に4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)を細胞外へ輸送する機能を果たす。
【0032】
DHCP及び機能的に等しい化合物は、式〔I〕及び式〔II〕によって表わされており、そしてその光学活性化合物を含む。式Iにおいて、R1 及びR2 は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しR1 =ベンジル基及びR2 =Hは除かれる。
【0033】
参考文献3及び4を参照のこと。R3 −R6 は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばC1 −C6 アルキルである。
【化1】
【0034】
式IIにおいて、R1 及びR2 は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しR1 =R2 =CH3 は除かれる。参考文献5及び6を参照のこと。R3 −R6 は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばC1 −C6 アルキルである。
【0035】
DHCPは抗細菌活性を有することが分かっており;細胞増殖を350μM以上の濃度で阻害する。より低い濃度では、細胞を細長くしそして増殖を乏しくする。大腸菌が天然にDHCPに対して耐性であるかを特定する為に、大腸菌ゲノムDNA断片のライブラリーをJM83株に形式転換させ、そして400μMのDHCPを含有するアガープレート上で増殖させた。この培地上で増殖できたコロニーを単離した。DNAをこれらのコロニーから単離し、所定の耐性を有するクローン化されたゲノムDNAを同定しそして配列限定した。4つの遺伝子を耐性が与えられた断片中で発見した。これら4つの遺伝子の様々な組み合わせの不活性化で、ORF389は耐性を与えることを担うという結論につながった。これはORF389をそれ自身pUC19(多重コピープラスミド)でクローニングすること及びJM83株を形質転換することによって確められた。生じた細胞はDHCPに対して耐性であった。
【0036】
大腸菌遺伝子データベースとのORF389のヌクレオチド配列の比較で、それは、クロラムフェニコール及び他の抗生物質に対する耐性を与えることに関わる公知の流出タンパク質に類似することが分かった。ORF389によりコードされるタンパク質の予測された構造の更なる解析では、それは膜タンパク質であり;多重膜貫通ドメインを有し、且つ前述のクロラムフェニコール流出ポリペプチドと構造的な類似性を共有することが示された。
【0037】
ORF389が、他の抗生物質、例えばクロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びキトラサイクリンに対する耐性を与えるかを特定する為に、pUC19/ORF389プラスミドを含有する形質転換したJM83細胞をこれらの抗生物質を含有する培地上に塗布した。DHCP以外の任意の抗生物質に対する耐性を付与できないORF389の存在は、Depタンパク質の流出活性がDHCPに対して特異的であることを示唆する。
【0038】
ORF389がDHCPに対する耐性を与えるのは、それが細胞中で多重コピーの状態で存在する時のみであることに気づくことが重要である。前記遺伝子は天然には大腸菌細胞のゲノム中で発見されるが、単一コピーにおいて存在する。係る細胞はDHCPの抗細菌活性に感受性である。ORF389がpUC19中にクローン化されそしてJM83細胞に導入された時、それは多重コピー(最大で数百コピーの遺伝子/細胞)において存在する。その理由は、pUC19は数百コピー/細胞迄に保持されているからだ。遺伝子の投与量が増加した時のみ、DHCPに対して耐性であることが分かった。耐性の機構は単純に、形質転換細胞中での流出タンパク質の発現の増加により流出活性の高まりが生じることである。
【0039】
遺伝暗号の縮重により、DHCP又はDHCPと機能的に等しい化合物に対する耐性を与えることを担う流出タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中で開示した核酸配列により変わりうることに気付くべきだ。
【0040】
本発明の更なる説明
作用形態
DHCPは抗細菌及び抗腫瘍活性を示す化合物である。様々なウロン酸(グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等)を加熱することによって調製される。発明者は、DHCPを細胞外へ輸送できるタンパク質をコードする、大腸菌由来の遺伝子をクローン化した。この輸送タンパク質は、クロラムフェニコールのような抗生物質を細胞外に輸送する機能を果たす公知の流出タンパク質と配列の類似性を示す。輸送タンパク質を過度に発現する生物はDHCPに対して耐性になることが示されている。その理由は、おそらく効率的にDHCPを輸送できるからだ。輸送タンパク質の過度の発現は、大腸菌における内因性の遺伝子の発現の増加よりむしろ多重コピーの遺伝子の存在により生じる。換言すれば、全ての大腸菌は輸送遺伝子の単一コピーを有する。しかしながら、単一コピーの遺伝子による輸送タンパク質の発現のレベルはDHCPに対する耐性を与えるのには不十分である。発明者は、遺伝子を高いコピー数のプラスミド、大腸菌細胞中で200〜500コピー/細胞で保持されるpUC19中でクローン化した。従って、このプラスミド構築体を含有する形質転換した大腸菌は、200〜500コピーの輸送遺伝子を有するだろうし、そして多重コピー由来のタンパク質の発現は、単一コピー由来よりも多い。これら形質転換細胞は、DHCPに対して耐性である。
【0041】
DHCPの一般的な作用形態はそれが標的細胞に入ることを必要とする。DHCPに対する耐性は、DHCPが細胞内へ入るのと同時か又はそれより早く細胞外へ輸送されるならば生じうる。そのような場合、細胞内のDHCPの濃度は、毒性量まで蓄積することは決してなく、そして当該細胞は化合物の抗細菌作用に対して耐性となる。見掛上、開示された遺伝子によってコードされる輸送タンパク質は、とても効率的にはDHCPを輸送しない、又は内因性の遺伝子により発現される輸送タンパク質の量はとても低い。どちらの場合も、(遺伝子の多くのコピーにより生ずる)更なる輸送タンパク質の存在は、細胞外へのDHCPのより効率的な輸送をもたらすだろう。
【0042】
用途
本発明の遺伝子の重要な用途は、流出活性の阻害物質を同定する研究においてそれを用いることであろう。係る阻害性の化合物は、輸送活性を阻害するように機能するだろう。従ってDHCPに対して耐性である微生物又は腫瘍細胞は、耐性細胞が化合物を輸送し追い出すことを妨げることによって前記化合物に対して一層感受性であるように作製できうる。本発明の輸送遺伝子の阻害物質は又、他の流出タンパク質、例えば、クロラムフェニコールを輸送する流出タンパク質、又は多剤耐性タンパク質のP糖タンパク質ファミリーによる輸送を遮断することにおいても活性がありうると考えられる。P糖タンパク質は多くの腫瘍細胞中で発現しており、これらの腫瘍細胞を化学療法剤に対して耐性にする。P糖タンパク質の研究に関する要約は先述のとおり。
【0043】
図面の詳細な説明
図1は、4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)の化学構造である。
【0044】
図2は、大腸菌の増殖に対するDHCP濃度の作用である。
A.JM83細胞をLB培地中最大でKlett単位50迄増殖させ、そしてDHCPを様々な濃度(0〜400μM)で添加した。増殖がKlett単位90〜100に達した後、細胞を各濃度のDHCPを含む培地で希釈し、そして増殖を更に観察した。DHCP濃度は:0μM、白抜き四角;50μM、黒ひし形;100μM、白抜き丸;250μM、白抜きひし形;400μM、黒四角。
B.一晩に渡り増殖させた腸菌細胞JM83を適度に希釈し、そして様々な濃度のDHCP(0〜350μM)を含有するLBプレート上に塗布した。DHCPがないプレート上の多くのコロニーを100%として考えそして他の数値を相対的な百分率として表わした。
【0045】
図3は、DHCPに対する耐性を与えるプラスミドpSP001の制限地図である。DHCPに対する耐性を与えるDNA断片(5.2kb)及びフランキングORFを含んで成る4つのORFを示している。各ORFの方向を矢印で示した。制限酵素部位も又示してある。このORFの尺度を合わせてはいない。DHCPに対する耐性を与えるDNA断片を含有するプラスミドpSP001を制限酵素で消化し、各4つのORFを中断し、再度ライゲーションさせそしてJM83細胞に形質転換させた。次いで形質転換体をそのDHCP(400μM)に対する感受性に関して試験した。消化に用いた酵素は:purRに対して:MluI、ydhBに対して:NruI−Eco47III :ORF389、purR、及びydhBに対して:NruI及びSmaI、ORF389に対して:AvaI、並びにpurR及びydhBに対して:MluI及びNruIであった。ORF389(dep)を有するプラスミドの構築の為に、プラスミドpSP001をSmaI及びMscIで消化し、断片を精製し、そしてpUC19中でクローン化しpSP007を生産した。
【0046】
図4は、Dep、Cmr、CmrA、Cmx、CmlV、BcR、Bmr3、YjcC及びTet間の配列の相同性を示している。同一及び類似の配列を黒の囲み及び灰色の囲みでそれぞれ印した。膜貫通タンパク質に関するコンセンサス配列を点線で印しそしてI、II及びIII 範囲として示している。
【0047】
図5は、Dep(A)、ロドコッカス・ファシエンス(Rhodococcus faciens )由来のCmr(B)(6)及びストレプトミセス・リビタンス(Streptomyces lividans )由来のCml(C)(8)の水治療特性を示している。水平のバーは、予測された膜貫通領域を示している。
【0048】
図6は、dep遺伝子の配列を含有する大腸菌ゲノムの領域のDNA配列を示すヌクレオチド配列である。大腸菌ゲノムの領域は、Accession No. AE000261 U00096 で入手可能である。示されている配列は、4381−8280のヌクレオチドである。dep遺伝子はヌクレオチド4627−5838によってコードされている。dep配列を〔 〕内に示している。
【0049】
図7はdep遺伝子の単離したDNA配列を示すヌクレオチド配列である。プラスミドpSP007は、1.7kbの挿入体の一端からDNA配列のデータを得ることによって、dep遺伝子を含んだことが確められた。この方法で得られた配列は最初のものと一致する。
【0050】
実験研究の詳細な説明
大腸菌の増殖に対するDHCPの作用
大腸菌野生型系統JM83〔F−araΔ(lac−proAB)rpsL(strr)〕(Yanisch−Perronら、1985)はLuria培養液(LB)中で増殖した。培地に必要な時はいつでもアンピシリン(最終濃度50μg/ml)を補給した。大腸菌の増殖に対するDHCPの作用を確かめる為に、LB培地中で一晩増殖した細胞を新鮮なLB培地中で希釈した。Klett単位50に増殖が到達した後、DHCPを様々な濃度(0〜400μM)で添加しそして増殖を更に観測した。Klett単位90〜100に到達後、10倍に希釈して、各々の濃度のDHCPを含有する培地に入れた。図2Aは大腸菌に対する様々な濃度のDHCPの作用を示している。増殖は、50μMのDHCPの存在における3時間のインキュベーションの後緩やかになったが、DHCPがない場合に類似して8時間後に最大密度に到達した。細胞は、100μMのDHCPとのインキュベーション3時間後に一層緩やかに増殖し、最大細胞密度はDHCPがない場合よりも低かった。250μMのDHCPの存在において、増殖はインキュベーションの3時間後に大幅に減衰しそして5時間後には細胞の増殖が停まった。400μMのDHCPの存在において、細胞の増殖はインキュベーションの4時間後に停止した。250μMのDHCPで8時間に渡る細胞の増殖の顕微鏡検査では、細胞は細長い(コントロールの細胞より約15倍長い)フィラメントを形成することが分かった。これらの細胞のDAPI(ジアミジノフェニルインドール)染色で、これらの細胞の染色体の凝集がDHCPによって損われうることが分かった(データは示していない)。
【0051】
様々な濃度のDHCPでの大腸菌のコロニーを形成する能力を調べる為に、LB培地中で一晩増殖させた細胞を適度に希釈しそしてDHCP(0〜350μM)を含有するLBプレート上に塗布した。37℃でのインキュベーション後、各プレート上のコロニーの数を計測した。DHCPを有さないコントロールのプレート上のコロニーの数を100%とし、そして他の数を相対的な百分率として表した(図2B)。300μMのDHCPの存在において、コロニーの数は100倍減少したことが観察された。1×104 の細胞を350μMのDHCPを含有するLB培地上に塗布した時、コロニーは得られなかった。
【0052】
DHCPに対する耐性を与える遺伝子の大腸菌ゲノムライブラリーのスクリーニング
大腸菌がDHCPに対する耐性を与える遺伝子(群)を含有するかを試験する為に、大腸菌ゲノムライブラリーをスクリーニングした。大腸菌ゲノムライブラリーの構造は従前に記載された(Lu及びInouye,1998)。大腸菌JM83由来の部分的に消化したSau3AI染色体DNA断片をpUC19のBamHI部位中でクローン化した。JM83細胞はゲノムライブラリーで形質転換された。形質転換体を、DHCP(400μM)含有LBプレート上37℃での増殖する能力に関して単離した。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、精製してJM83細胞中に形質転換させ、DHCPに対する耐性を与えるその能力を確めた。プラスミドをpSP001と命名し、そして5.2kbのDNA断片を含有することが分かった。この断片はSequenaseを用いて両端からシークエンシングされそしてBLASTサーチを大腸菌ゲノム全体とこの断片との相同性の解析の為に実行した。このDNA断片は大腸菌染色体上の37.5分に位置し且つ4つのORF(図3):プリン合成のリプレッサーをコードするORF389,purR、Cynオペロン転写活性化因子の相同物をコードするydhB及びビシクロマイシン耐性タンパク質の相同物をコードするydhC(Berlynら、1996)を含んだ。
【0053】
どの遺伝子がDHCPに対する耐性を与えることを担うのかを特定する為に、いくつかの欠失構築体を図3に示すように作製した。purR、ydhB並びにpurR及びyahBの両方の中断はDHCPに対する耐性への影響を持たなかった(構築体はそれぞれpSP002、pSP003及びpSP006である)。しかし、purR及びydhBとORF389(pSP004)の中断並びにORF389単独(pSP005)の中断はDHCP耐性の欠失につながった。従って我々は、pUC19においてORF389を別にクローン化し、(pSP007)生じたプラスミドをJM83中に形質転換し、そしてDHCPに対する感受性を調べた。このプラスミドはDHCPに対する耐性を与えた。これらの結果で、ORF389は、多重コピープラスミド中でクローン化され、そしてプラスミドpSP007を用いた更なる研究を行った時にDHCPに対する耐性を担うことが明らかに証明された。ORF389をdep−DHCP efflux protein(以下を参照のこと)と命名した。
【0054】
薬物耐性を与える他の遺伝子を伴うORF389の相同性解析
BLAST−相同性検索コンピュータプログラムを用いて、我々はdepによってコードされる推定上のタンパク質の相同性検索を行った。図4には、有意にDepと高い相同性を示す9つのタンパク質を示している。これらのタンパク質の半分は、クロラムフェニコールに対する耐性を与える。最高程度の相同性を示すタンパク質は、ロドコッカス・ファシエンス(Rhodococcus fasciens)由来のCmr(Desomerら、1992)、R.エリトロポリス(R. erythropolis)(Nagyら、1997)由来のCmrA、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)1326由来のCml(Dittrich ら、1991)、コリネバクテリウム・ストリアタム(Corynebacterium striatum)(Accession no. U72639)由来のCmx、及びS.ベネズエラエ(S. venezuelae)ISP5230(Mosher ら、1995)由来のCmlVが挙げられる。図4から分かるように、Depは、他のタンパク質と比べた場合、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cmr)の産物Cmrと最高程度の相同性を有する。Cmrタンパク質は、Rouch ら(1990)によって特定された膜貫通タンパク質に関する3つのコンセンサス配列を含有することが示されている。これらの配列は予測された膜貫通タンパク質との関係で類似の位置で類似にある。これらは図6に破線で印してあり且つI、II、III と命名されている。Depの場合、LPを含んで成る第1の範囲(I)は、これらの作者によって特定された範囲と完全に相同性を持つ。第2の範囲(II)はCmrタンパク質のそれと50%の類似性を示しそして第3の範囲(III) は1つの残基以外これら2つのタンパク質の間で相同である。Rouch ら(1990)により提案されたモデルによると、範囲I及びIII は細胞膜の外部に位置し、そして範囲IIは膜の内部に位置する。qacAによりコードされる推定上のタンパク質に関する膜ループの位置は、抗原性指標特性(antigeric index profile)を調査し、そして予測を変えることによって確められた。係る領域は高い抗原性指標を有しそして確率を変更する(Rouch ら、1990)。
【0055】
一次配列における相同性に加えて、Depの水治療特性(図5A)は、R.ファシエンス(R. faciens)のCmr(Desomerら、1992)及びS.リビダンス(S. lividans)のCml(図.5C)のものと有意に類似している。Depは主に疎水性でありそしておそらく12個の予測される膜貫通α−ヘリックスを含有する(図5A)。
【0056】
Depと相同的な他のタンパク質は、大腸菌由来のBcR(ビシクロマイシン耐性タンパク質)(Bentleyら、1993)、B.サブチリス(B. subtilis)由来のピューロマイシン、トスフロキサシン、ノルフロキサシンに対する耐性を与える多剤流出ポンプに関与するBmr3(Ohki及びMurata, 1997)、スタフィロコッカス・ヒカス(Staphylococcus hyicus)由来のテトラサイクリン耐性を与えるTet(Schwarzら、1992)及びテトラセノマイシン耐性を与えるYjcC(Accession no D90826)(図4)が挙げられる。すべてこれらは流出タンパク質であり、それは薬剤耐性の為の最も共通の機構の1つである。我々はdepがDHCPに対して特異的な細胞質チャネルを形成する、推定上の流出タンパク質をコードすると推測する。相同性はタンパク質のN末端近くで顕著であり、またそれは流出タンパク質の共通の特徴である(Desomerら1992)。
【0057】
pUC19及びpSP007を含有する細胞に対する最小阻害濃度の測定
Depは、多剤耐性の為の流出タンパク質に対して相同性を示すので、我々はそれが他の抗生物質に対する耐性も同じように与えるのかを調べた。pUC19又はpSP007プラスミドを含む大腸菌の野生型の細胞をアンピシリンを含有するLB培地中で一晩に渡り増殖させた。細胞を10及び1000倍に希釈し、そして5μlの各希釈物(それぞれ3.5×105 細胞及び3.5×103 細胞に対応する)を、様々な希釈率のカナマイシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、テトラサイクリン及びDHCPを含有するLB培地に滴下した。プレートを37℃で20時間に渡りインキュベートした。表1から分かるように、pSP007は、試験した全ての抗生物質に対しても有意な交叉耐性を与えなかった。pUC19及びpSP007を含有する細胞に対するMIC値はスペクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンについて同じであった。MIC値は、pUC19を含有する細胞よりもpSP007を含有する細胞に対するカナマイシンについて2倍高かった。一方でDHCPに関するMIC値は、pUC19を含有する細胞よりもpSP007を含有する細胞について8倍高かった。Depは、cmrに対する高い相同性にも関わらず、クロラムフェニコールに対する耐性を与えなかったことは注目に値する。
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】
4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)の化学構造である。
【図2A】
大腸菌の増殖に対するDHCP濃度の作用のグラフ表示である。
【図2B】
大腸菌の生存率に対するDHCP濃度の作用のグラフ表示である。
【図3】
DHCPに対する耐性を与えるDNA断片を示すプラスミドpSP001の制限地図である。
【図4】
depによってコードされるポリペプチドとcmr、cmrA、cmx、cmlv、bcr、bmr3、yjcC及びtetによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の比較である。
【図5】
dep、cmr及びcmlによってコードされる推定タンパク質の水治療特性の比較である。
【図6】
dep遺伝子の配列を含有する大腸菌のゲノムの領域のDNA配列を示すヌクレオチド配列である。
【図7】
dep遺伝子の単離したDNA配列を示すヌクレオチド配列である。
この特許出願は2000年8月29日に提出された米国仮出願第60/228,727号の優先権を主張する。この先の仮出願はここで参照として組み込まれている。
【0002】
様々な細菌に対して有効な多くの抗生物質(がある)にもかかわらず、多剤耐性株の出現により、より新しく且つ効果的な抗細菌化合物に関する研究が続いている。4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)(図1を参照のこと)は、様々なグラム陽性及び陰性細菌、例えばエシエリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス(Bacillus)属、サルモネラ(Salmonella)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属等に対する抗細菌活性を有する化合物である。DHCPの製造及び特性は特許化されている(Koyamaら、1999)。それはウロン酸又はその誘導体の熱処理によって調製されている。ここにおいてウロン酸は、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸又は、イズロン酸である。それは又火であぶったもしくは乾燥した野菜、果物、穀類、マッシュルーム、海藻、皮質もしくは軟骨からも生産されている。この化合物は、ガン細胞の分化及びアポトーシスを誘導することが示されている。それは、ガンに対する治療剤又は予防剤としての潜在的な利用がありそして又消毒剤、歯磨粉、化粧品及び入浴剤中での抗細菌剤としての利用もある(Koyamaら、1999)。
【0003】
我々は大腸菌(E.coli)ゲノムライブラリーからDHCPの毒性に対する多重コピー型サプレッサーを単離した。この遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質は、多くの抗生物質、例えば、クロラムフェニコール、ビシクロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える公知の流出タンパク質に対する高い相同性を示した。遺伝子は大腸菌染色体上で37.5分でマッピングされた。それを、dep;DHCP efflux proteinとして命名している。しかし、Depタンパク質は試験した全抗生物質に対しても交叉耐性を与えない。
【0004】
先行技術分野
Koyamaらへの米国特許第6,087,401号、シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【0005】
この特許では、4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)を製造する方法が開示してある。又DHCPの抗細菌活性も記載してある。
【0006】
一方で、本仮出願中で開示した発明は、細菌細胞中で多重コピーにおいて存在する時に、DHCPの抗細菌活性に対する耐性を与え、故に当該細菌にDHCPによる殺菌(作用)に対する耐性を持たせる遺伝子、depに関連する。本出願は又dep遺伝子によりコードされるタンパク質も記載している。
【0007】
Koyamaらへのヨーロッパ特許 EP0 941 981 A1.シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【0008】
この特許出願は本質的に、Koyamaらへの米国特許第6,087,401号に記載されたような同じ題目に関連する。
【0009】
Kobayashi らへの米国特許第6,111,145号。シクロペンテン誘導体。
【0010】
この特許は、機能的に等しいDHCPのエーテル誘導体に関連し、そしてこれらの誘導体の活性を開示する。
【0011】
Kobayashi らへのヨーロッパ特許刊行物 EP1 000 923 A1。シクロペンテノン誘導体。
【0012】
この特許出願は本質的に、Kobayashi らへの米国特許第6,111,145号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【0013】
Koyamaらへの米国特許第6,136,854号。シクロペンテノン誘導体。
【0014】
この特許は、DHCPの機能的に等しいエステル誘導体に関連し、そしてこれら誘導体の生物活性を開示する。
【0015】
Koyamaらへのヨーロッパ特許刊行物 EP0 976 717 A1。シクロペンテノン誘導体。
【0016】
この特許出願は本質的に、Koyamaらへの米国特許第6,136,854号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【0017】
Clinical significance of P−glycoprotein expression and function for response to induction chemotherapy, relapse rate and overall survival in acute leukemia. C. Wuchter, ら、Haematologica 85 (7) : 711−21 (2000)。
【0018】
急性の白血病において、P−糖タンパク質(P−gp)により仲介される多剤耐性(MDR)表現型は、化学療法が失敗する原因である。この研究では、P−gp発現のレベル又は機能的なP−gp活性が急性の白血病における導入補助化学療法、再発率及び全体的な生存率に対する応答のよりよい予測因子であったかどうかが調べられた。機能的ローダミン−123−(rh123)流出アッセイは、急性の白血病におけるモノクローナル抗体によるP−gp発現解析よりも好ましいことを示した。
【0019】
Increased drug delivery to the brain by P−glycoprotein inhibition. A.J. Sadeque, ら、Clinical Pharmacology & Therapeutics 68 (3) : 231−7 (2000)。
【0020】
in vitro研究では、止痢薬のロペラミドは流出膜輸送体P−糖タンパク質の為の基質であることが示されている。ロペラミドは有力な麻酔薬であるが、患者へ通常の投与量で与えられた時に、中枢神経系の効果、例えば呼吸抑制を示さない。この研究では、キニジンによるP−糖タンパク質の阻害が、ロペラミドの中枢神経系への浸入を高め、従って呼吸抑制を生じさせるという仮説を試験した。結果では、ロペラミドは単独で用いられた時には呼吸抑制を生じさせないが、ロペラミドがキニジンと共に投与された時には呼吸抑制が見られることが示された。
【0021】
Expression of the multidrug−resistance−associated protein in myelodysplastic syndromes. S. Poulain, ら、British Journal of Haematology 110 (3) : 591−8 (2000)。
【0022】
骨髄異形成症候群(MDS)において、P−糖タンパク質(P−gp)の発現は薬物耐性に関連している一方で、多剤耐性関連タンパク質(MRP1)の臨床的な意義は不明である。MDSを有する患者由来の骨髄のこの研究において、MRP1の発現は、MDSにおける病期との相関関係があった。P−gpに関して、MRP1の不均衡な発現/機能が、あるケースにおいて発見されており、MDSにおける無機能輸送タンパク質の存在が示唆されている。MRP1の発現はMDSにおける予後因子ではなかったようだ。
【0023】
Soft tissue leiomyosarcomas and malignant gastrointestinal stromal tumors : differences in clinical outcome and expression of multidrug resistance proteins. B.E. Plaat, ら、Journal of Clinical Oncology 18 (18) : 3211−20 (2000)。
【0024】
この研究において、多剤耐性(MDR)と関連するパラメータが軟組織平滑筋肉腫(LMS)と悪性の消化間質腫瘍(maligmant gastrointestinal stromal tumors)(GIST)との間で比較された。免疫組織化学を用いて、P−糖タンパク質(P−gp)、多剤耐性タンパク質(MRP(1))、肺耐性タンパク質(LRP)、及びC−キットを検出した。結果では、LMS患者はGIST患者と比較して生存率が良く、転移の傾向は2つの患者の群の間では異なることが示されている。試験したMDRタンパク質の発現量は、GISTにおいてよりもLMSにおいて少ないことが予測されている。
【0025】
Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi : A new family of genes responsible for autoinducer production. M.G. Surette, ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 1639−44 (1999)。
【0026】
細菌において、クオラムセンシングといわれる、細胞密度における変化に応じて発現する遺伝子の調節は、細菌によって生産されそして細菌の細胞数が増加するにつれ外部環境中に蓄積される自己誘導物質として公知のホルモン様分子に依存している。海洋性細菌ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi)は、各々がセンサー−自己誘導物質の対から成る2つの並行するクオラムセンシング系を持つことが分かっている。各系に属する2つの異なる自己誘導物質を、自己誘導物質1(AI−1)及び自己誘導物質2(AI−2)という。大腸菌、S.チヒムリウム(S. typhimurium)及びV.ハーベイにおいてAI−2生産の為に必要な遺伝子の同定及び解析が報告されている。
【0027】
Quorum sensing in Vibrio fischeri : Probing autoinducer−LuxR interactions with autoinducer analogs. A.L. Schaefer, ら、Journal of Bacteriology 178 : 2897−2901 (1996)。
【0028】
ビブリオ・フィッシェリ(Vibrio fischeri)において、発光遺伝子は、自己誘導物質として公知の拡散性のシグナル化合物との組み合わせにおける転写因子LuxRによって活性化される。この研究では、LuxRと相互作用する多くの自己誘導物質の能力を解析した。
【0029】
Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and Sigma−54. B.N. Lilley及びB.L. Bassler. Molecular Microbiology 36 (4) : 940−954 (2000)。
【0030】
生物発光海洋性細菌のビブリオ・ハーベイは、発光(lux)をクオラムセンシング回路によって制御する。この研究では、応答調節タンパク質LuxOが、選択的σ因子、σ54との相互作用によりアクチベータータンパク質として機能することが示されている。LuxOはルシフェラーゼ構造オペロン(luxCDABEGH)の抑制を担うので、これらの結果は、LuxOが、σ54と一緒になり機能して、発光の負の調節因子を活性化することを示唆している。
【表1】
【表2】
【0031】
発明の詳細な説明
本仮出願は、大腸菌由来の膜貫通タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを記載している。このタンパク質は、多重コピープラスミドより発現した時に4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)を細胞外へ輸送する機能を果たす。
【0032】
DHCP及び機能的に等しい化合物は、式〔I〕及び式〔II〕によって表わされており、そしてその光学活性化合物を含む。式Iにおいて、R1 及びR2 は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しR1 =ベンジル基及びR2 =Hは除かれる。
【0033】
参考文献3及び4を参照のこと。R3 −R6 は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばC1 −C6 アルキルである。
【化1】
【0034】
式IIにおいて、R1 及びR2 は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しR1 =R2 =CH3 は除かれる。参考文献5及び6を参照のこと。R3 −R6 は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばC1 −C6 アルキルである。
【0035】
DHCPは抗細菌活性を有することが分かっており;細胞増殖を350μM以上の濃度で阻害する。より低い濃度では、細胞を細長くしそして増殖を乏しくする。大腸菌が天然にDHCPに対して耐性であるかを特定する為に、大腸菌ゲノムDNA断片のライブラリーをJM83株に形式転換させ、そして400μMのDHCPを含有するアガープレート上で増殖させた。この培地上で増殖できたコロニーを単離した。DNAをこれらのコロニーから単離し、所定の耐性を有するクローン化されたゲノムDNAを同定しそして配列限定した。4つの遺伝子を耐性が与えられた断片中で発見した。これら4つの遺伝子の様々な組み合わせの不活性化で、ORF389は耐性を与えることを担うという結論につながった。これはORF389をそれ自身pUC19(多重コピープラスミド)でクローニングすること及びJM83株を形質転換することによって確められた。生じた細胞はDHCPに対して耐性であった。
【0036】
大腸菌遺伝子データベースとのORF389のヌクレオチド配列の比較で、それは、クロラムフェニコール及び他の抗生物質に対する耐性を与えることに関わる公知の流出タンパク質に類似することが分かった。ORF389によりコードされるタンパク質の予測された構造の更なる解析では、それは膜タンパク質であり;多重膜貫通ドメインを有し、且つ前述のクロラムフェニコール流出ポリペプチドと構造的な類似性を共有することが示された。
【0037】
ORF389が、他の抗生物質、例えばクロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びキトラサイクリンに対する耐性を与えるかを特定する為に、pUC19/ORF389プラスミドを含有する形質転換したJM83細胞をこれらの抗生物質を含有する培地上に塗布した。DHCP以外の任意の抗生物質に対する耐性を付与できないORF389の存在は、Depタンパク質の流出活性がDHCPに対して特異的であることを示唆する。
【0038】
ORF389がDHCPに対する耐性を与えるのは、それが細胞中で多重コピーの状態で存在する時のみであることに気づくことが重要である。前記遺伝子は天然には大腸菌細胞のゲノム中で発見されるが、単一コピーにおいて存在する。係る細胞はDHCPの抗細菌活性に感受性である。ORF389がpUC19中にクローン化されそしてJM83細胞に導入された時、それは多重コピー(最大で数百コピーの遺伝子/細胞)において存在する。その理由は、pUC19は数百コピー/細胞迄に保持されているからだ。遺伝子の投与量が増加した時のみ、DHCPに対して耐性であることが分かった。耐性の機構は単純に、形質転換細胞中での流出タンパク質の発現の増加により流出活性の高まりが生じることである。
【0039】
遺伝暗号の縮重により、DHCP又はDHCPと機能的に等しい化合物に対する耐性を与えることを担う流出タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中で開示した核酸配列により変わりうることに気付くべきだ。
【0040】
本発明の更なる説明
作用形態
DHCPは抗細菌及び抗腫瘍活性を示す化合物である。様々なウロン酸(グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等)を加熱することによって調製される。発明者は、DHCPを細胞外へ輸送できるタンパク質をコードする、大腸菌由来の遺伝子をクローン化した。この輸送タンパク質は、クロラムフェニコールのような抗生物質を細胞外に輸送する機能を果たす公知の流出タンパク質と配列の類似性を示す。輸送タンパク質を過度に発現する生物はDHCPに対して耐性になることが示されている。その理由は、おそらく効率的にDHCPを輸送できるからだ。輸送タンパク質の過度の発現は、大腸菌における内因性の遺伝子の発現の増加よりむしろ多重コピーの遺伝子の存在により生じる。換言すれば、全ての大腸菌は輸送遺伝子の単一コピーを有する。しかしながら、単一コピーの遺伝子による輸送タンパク質の発現のレベルはDHCPに対する耐性を与えるのには不十分である。発明者は、遺伝子を高いコピー数のプラスミド、大腸菌細胞中で200〜500コピー/細胞で保持されるpUC19中でクローン化した。従って、このプラスミド構築体を含有する形質転換した大腸菌は、200〜500コピーの輸送遺伝子を有するだろうし、そして多重コピー由来のタンパク質の発現は、単一コピー由来よりも多い。これら形質転換細胞は、DHCPに対して耐性である。
【0041】
DHCPの一般的な作用形態はそれが標的細胞に入ることを必要とする。DHCPに対する耐性は、DHCPが細胞内へ入るのと同時か又はそれより早く細胞外へ輸送されるならば生じうる。そのような場合、細胞内のDHCPの濃度は、毒性量まで蓄積することは決してなく、そして当該細胞は化合物の抗細菌作用に対して耐性となる。見掛上、開示された遺伝子によってコードされる輸送タンパク質は、とても効率的にはDHCPを輸送しない、又は内因性の遺伝子により発現される輸送タンパク質の量はとても低い。どちらの場合も、(遺伝子の多くのコピーにより生ずる)更なる輸送タンパク質の存在は、細胞外へのDHCPのより効率的な輸送をもたらすだろう。
【0042】
用途
本発明の遺伝子の重要な用途は、流出活性の阻害物質を同定する研究においてそれを用いることであろう。係る阻害性の化合物は、輸送活性を阻害するように機能するだろう。従ってDHCPに対して耐性である微生物又は腫瘍細胞は、耐性細胞が化合物を輸送し追い出すことを妨げることによって前記化合物に対して一層感受性であるように作製できうる。本発明の輸送遺伝子の阻害物質は又、他の流出タンパク質、例えば、クロラムフェニコールを輸送する流出タンパク質、又は多剤耐性タンパク質のP糖タンパク質ファミリーによる輸送を遮断することにおいても活性がありうると考えられる。P糖タンパク質は多くの腫瘍細胞中で発現しており、これらの腫瘍細胞を化学療法剤に対して耐性にする。P糖タンパク質の研究に関する要約は先述のとおり。
【0043】
図面の詳細な説明
図1は、4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)の化学構造である。
【0044】
図2は、大腸菌の増殖に対するDHCP濃度の作用である。
A.JM83細胞をLB培地中最大でKlett単位50迄増殖させ、そしてDHCPを様々な濃度(0〜400μM)で添加した。増殖がKlett単位90〜100に達した後、細胞を各濃度のDHCPを含む培地で希釈し、そして増殖を更に観察した。DHCP濃度は:0μM、白抜き四角;50μM、黒ひし形;100μM、白抜き丸;250μM、白抜きひし形;400μM、黒四角。
B.一晩に渡り増殖させた腸菌細胞JM83を適度に希釈し、そして様々な濃度のDHCP(0〜350μM)を含有するLBプレート上に塗布した。DHCPがないプレート上の多くのコロニーを100%として考えそして他の数値を相対的な百分率として表わした。
【0045】
図3は、DHCPに対する耐性を与えるプラスミドpSP001の制限地図である。DHCPに対する耐性を与えるDNA断片(5.2kb)及びフランキングORFを含んで成る4つのORFを示している。各ORFの方向を矢印で示した。制限酵素部位も又示してある。このORFの尺度を合わせてはいない。DHCPに対する耐性を与えるDNA断片を含有するプラスミドpSP001を制限酵素で消化し、各4つのORFを中断し、再度ライゲーションさせそしてJM83細胞に形質転換させた。次いで形質転換体をそのDHCP(400μM)に対する感受性に関して試験した。消化に用いた酵素は:purRに対して:MluI、ydhBに対して:NruI−Eco47III :ORF389、purR、及びydhBに対して:NruI及びSmaI、ORF389に対して:AvaI、並びにpurR及びydhBに対して:MluI及びNruIであった。ORF389(dep)を有するプラスミドの構築の為に、プラスミドpSP001をSmaI及びMscIで消化し、断片を精製し、そしてpUC19中でクローン化しpSP007を生産した。
【0046】
図4は、Dep、Cmr、CmrA、Cmx、CmlV、BcR、Bmr3、YjcC及びTet間の配列の相同性を示している。同一及び類似の配列を黒の囲み及び灰色の囲みでそれぞれ印した。膜貫通タンパク質に関するコンセンサス配列を点線で印しそしてI、II及びIII 範囲として示している。
【0047】
図5は、Dep(A)、ロドコッカス・ファシエンス(Rhodococcus faciens )由来のCmr(B)(6)及びストレプトミセス・リビタンス(Streptomyces lividans )由来のCml(C)(8)の水治療特性を示している。水平のバーは、予測された膜貫通領域を示している。
【0048】
図6は、dep遺伝子の配列を含有する大腸菌ゲノムの領域のDNA配列を示すヌクレオチド配列である。大腸菌ゲノムの領域は、Accession No. AE000261 U00096 で入手可能である。示されている配列は、4381−8280のヌクレオチドである。dep遺伝子はヌクレオチド4627−5838によってコードされている。dep配列を〔 〕内に示している。
【0049】
図7はdep遺伝子の単離したDNA配列を示すヌクレオチド配列である。プラスミドpSP007は、1.7kbの挿入体の一端からDNA配列のデータを得ることによって、dep遺伝子を含んだことが確められた。この方法で得られた配列は最初のものと一致する。
【0050】
実験研究の詳細な説明
大腸菌の増殖に対するDHCPの作用
大腸菌野生型系統JM83〔F−araΔ(lac−proAB)rpsL(strr)〕(Yanisch−Perronら、1985)はLuria培養液(LB)中で増殖した。培地に必要な時はいつでもアンピシリン(最終濃度50μg/ml)を補給した。大腸菌の増殖に対するDHCPの作用を確かめる為に、LB培地中で一晩増殖した細胞を新鮮なLB培地中で希釈した。Klett単位50に増殖が到達した後、DHCPを様々な濃度(0〜400μM)で添加しそして増殖を更に観測した。Klett単位90〜100に到達後、10倍に希釈して、各々の濃度のDHCPを含有する培地に入れた。図2Aは大腸菌に対する様々な濃度のDHCPの作用を示している。増殖は、50μMのDHCPの存在における3時間のインキュベーションの後緩やかになったが、DHCPがない場合に類似して8時間後に最大密度に到達した。細胞は、100μMのDHCPとのインキュベーション3時間後に一層緩やかに増殖し、最大細胞密度はDHCPがない場合よりも低かった。250μMのDHCPの存在において、増殖はインキュベーションの3時間後に大幅に減衰しそして5時間後には細胞の増殖が停まった。400μMのDHCPの存在において、細胞の増殖はインキュベーションの4時間後に停止した。250μMのDHCPで8時間に渡る細胞の増殖の顕微鏡検査では、細胞は細長い(コントロールの細胞より約15倍長い)フィラメントを形成することが分かった。これらの細胞のDAPI(ジアミジノフェニルインドール)染色で、これらの細胞の染色体の凝集がDHCPによって損われうることが分かった(データは示していない)。
【0051】
様々な濃度のDHCPでの大腸菌のコロニーを形成する能力を調べる為に、LB培地中で一晩増殖させた細胞を適度に希釈しそしてDHCP(0〜350μM)を含有するLBプレート上に塗布した。37℃でのインキュベーション後、各プレート上のコロニーの数を計測した。DHCPを有さないコントロールのプレート上のコロニーの数を100%とし、そして他の数を相対的な百分率として表した(図2B)。300μMのDHCPの存在において、コロニーの数は100倍減少したことが観察された。1×104 の細胞を350μMのDHCPを含有するLB培地上に塗布した時、コロニーは得られなかった。
【0052】
DHCPに対する耐性を与える遺伝子の大腸菌ゲノムライブラリーのスクリーニング
大腸菌がDHCPに対する耐性を与える遺伝子(群)を含有するかを試験する為に、大腸菌ゲノムライブラリーをスクリーニングした。大腸菌ゲノムライブラリーの構造は従前に記載された(Lu及びInouye,1998)。大腸菌JM83由来の部分的に消化したSau3AI染色体DNA断片をpUC19のBamHI部位中でクローン化した。JM83細胞はゲノムライブラリーで形質転換された。形質転換体を、DHCP(400μM)含有LBプレート上37℃での増殖する能力に関して単離した。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、精製してJM83細胞中に形質転換させ、DHCPに対する耐性を与えるその能力を確めた。プラスミドをpSP001と命名し、そして5.2kbのDNA断片を含有することが分かった。この断片はSequenaseを用いて両端からシークエンシングされそしてBLASTサーチを大腸菌ゲノム全体とこの断片との相同性の解析の為に実行した。このDNA断片は大腸菌染色体上の37.5分に位置し且つ4つのORF(図3):プリン合成のリプレッサーをコードするORF389,purR、Cynオペロン転写活性化因子の相同物をコードするydhB及びビシクロマイシン耐性タンパク質の相同物をコードするydhC(Berlynら、1996)を含んだ。
【0053】
どの遺伝子がDHCPに対する耐性を与えることを担うのかを特定する為に、いくつかの欠失構築体を図3に示すように作製した。purR、ydhB並びにpurR及びyahBの両方の中断はDHCPに対する耐性への影響を持たなかった(構築体はそれぞれpSP002、pSP003及びpSP006である)。しかし、purR及びydhBとORF389(pSP004)の中断並びにORF389単独(pSP005)の中断はDHCP耐性の欠失につながった。従って我々は、pUC19においてORF389を別にクローン化し、(pSP007)生じたプラスミドをJM83中に形質転換し、そしてDHCPに対する感受性を調べた。このプラスミドはDHCPに対する耐性を与えた。これらの結果で、ORF389は、多重コピープラスミド中でクローン化され、そしてプラスミドpSP007を用いた更なる研究を行った時にDHCPに対する耐性を担うことが明らかに証明された。ORF389をdep−DHCP efflux protein(以下を参照のこと)と命名した。
【0054】
薬物耐性を与える他の遺伝子を伴うORF389の相同性解析
BLAST−相同性検索コンピュータプログラムを用いて、我々はdepによってコードされる推定上のタンパク質の相同性検索を行った。図4には、有意にDepと高い相同性を示す9つのタンパク質を示している。これらのタンパク質の半分は、クロラムフェニコールに対する耐性を与える。最高程度の相同性を示すタンパク質は、ロドコッカス・ファシエンス(Rhodococcus fasciens)由来のCmr(Desomerら、1992)、R.エリトロポリス(R. erythropolis)(Nagyら、1997)由来のCmrA、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)1326由来のCml(Dittrich ら、1991)、コリネバクテリウム・ストリアタム(Corynebacterium striatum)(Accession no. U72639)由来のCmx、及びS.ベネズエラエ(S. venezuelae)ISP5230(Mosher ら、1995)由来のCmlVが挙げられる。図4から分かるように、Depは、他のタンパク質と比べた場合、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cmr)の産物Cmrと最高程度の相同性を有する。Cmrタンパク質は、Rouch ら(1990)によって特定された膜貫通タンパク質に関する3つのコンセンサス配列を含有することが示されている。これらの配列は予測された膜貫通タンパク質との関係で類似の位置で類似にある。これらは図6に破線で印してあり且つI、II、III と命名されている。Depの場合、LPを含んで成る第1の範囲(I)は、これらの作者によって特定された範囲と完全に相同性を持つ。第2の範囲(II)はCmrタンパク質のそれと50%の類似性を示しそして第3の範囲(III) は1つの残基以外これら2つのタンパク質の間で相同である。Rouch ら(1990)により提案されたモデルによると、範囲I及びIII は細胞膜の外部に位置し、そして範囲IIは膜の内部に位置する。qacAによりコードされる推定上のタンパク質に関する膜ループの位置は、抗原性指標特性(antigeric index profile)を調査し、そして予測を変えることによって確められた。係る領域は高い抗原性指標を有しそして確率を変更する(Rouch ら、1990)。
【0055】
一次配列における相同性に加えて、Depの水治療特性(図5A)は、R.ファシエンス(R. faciens)のCmr(Desomerら、1992)及びS.リビダンス(S. lividans)のCml(図.5C)のものと有意に類似している。Depは主に疎水性でありそしておそらく12個の予測される膜貫通α−ヘリックスを含有する(図5A)。
【0056】
Depと相同的な他のタンパク質は、大腸菌由来のBcR(ビシクロマイシン耐性タンパク質)(Bentleyら、1993)、B.サブチリス(B. subtilis)由来のピューロマイシン、トスフロキサシン、ノルフロキサシンに対する耐性を与える多剤流出ポンプに関与するBmr3(Ohki及びMurata, 1997)、スタフィロコッカス・ヒカス(Staphylococcus hyicus)由来のテトラサイクリン耐性を与えるTet(Schwarzら、1992)及びテトラセノマイシン耐性を与えるYjcC(Accession no D90826)(図4)が挙げられる。すべてこれらは流出タンパク質であり、それは薬剤耐性の為の最も共通の機構の1つである。我々はdepがDHCPに対して特異的な細胞質チャネルを形成する、推定上の流出タンパク質をコードすると推測する。相同性はタンパク質のN末端近くで顕著であり、またそれは流出タンパク質の共通の特徴である(Desomerら1992)。
【0057】
pUC19及びpSP007を含有する細胞に対する最小阻害濃度の測定
Depは、多剤耐性の為の流出タンパク質に対して相同性を示すので、我々はそれが他の抗生物質に対する耐性も同じように与えるのかを調べた。pUC19又はpSP007プラスミドを含む大腸菌の野生型の細胞をアンピシリンを含有するLB培地中で一晩に渡り増殖させた。細胞を10及び1000倍に希釈し、そして5μlの各希釈物(それぞれ3.5×105 細胞及び3.5×103 細胞に対応する)を、様々な希釈率のカナマイシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、テトラサイクリン及びDHCPを含有するLB培地に滴下した。プレートを37℃で20時間に渡りインキュベートした。表1から分かるように、pSP007は、試験した全ての抗生物質に対しても有意な交叉耐性を与えなかった。pUC19及びpSP007を含有する細胞に対するMIC値はスペクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンについて同じであった。MIC値は、pUC19を含有する細胞よりもpSP007を含有する細胞に対するカナマイシンについて2倍高かった。一方でDHCPに関するMIC値は、pUC19を含有する細胞よりもpSP007を含有する細胞について8倍高かった。Depは、cmrに対する高い相同性にも関わらず、クロラムフェニコールに対する耐性を与えなかったことは注目に値する。
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】
4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)の化学構造である。
【図2A】
大腸菌の増殖に対するDHCP濃度の作用のグラフ表示である。
【図2B】
大腸菌の生存率に対するDHCP濃度の作用のグラフ表示である。
【図3】
DHCPに対する耐性を与えるDNA断片を示すプラスミドpSP001の制限地図である。
【図4】
depによってコードされるポリペプチドとcmr、cmrA、cmx、cmlv、bcr、bmr3、yjcC及びtetによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の比較である。
【図5】
dep、cmr及びcmlによってコードされる推定タンパク質の水治療特性の比較である。
【図6】
dep遺伝子の配列を含有する大腸菌のゲノムの領域のDNA配列を示すヌクレオチド配列である。
【図7】
dep遺伝子の単離したDNA配列を示すヌクレオチド配列である。
Claims (14)
- 4,5−ジヒドロキシ−2−シクロペンテン−1−オン(DHCP)に対して特異的である、DHCP流出タンパク質。
- DHCPの流出輸送に対して特異的な細胞質チャネルを形成する膜貫通タンパク質である、請求項1記載のタンパク質。
- DHCPに対する耐性を与える請求項1記載のタンパク質。
- 大腸菌(E.Coli)由来のタンパク質である、請求項1記載のタンパク質
- 以下のいずれの抗生物質:クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンに対する交叉耐性を与えない、請求項1記載のタンパク質。
- タンパク質が予測された13個の膜貫通横断α−ヘリックスを有する、請求項1記載のタンパク質。
- depである前記DHCP流出タンパク質をコードする遺伝子。
- 前記dep遺伝子は大腸菌由来である、請求項7記載のdep遺伝子。
- 細菌細胞中で多重コピーにて存在する場合に、前記遺伝子がDHCP又は機能的に等しい化合物に対する耐性を与える、請求項7記載の遺伝子。
- dep遺伝子を含んで成るプラスミドであって、当該プラスミドで形質転換されている細菌細胞中でdep遺伝子の多重コピーの発現を与える、プラスミド。
- 前記プラスミドがDHCPに対する耐性を与え且つ以下のいずれの抗生物質:クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンに対する交叉耐性を与えない、請求項10記載のプラスミド。
- 請求項10記載のプラスミドの多重コピーを含有する細菌細胞。
- 細菌細胞がDHCPに対して耐性である、請求項12記載の細菌細胞。
- 請求項7記載の遺伝子を利用し、DHCP又は機能的に等しい化合物に対する耐性を担う流出活性を阻害する化合物を同定する方法。
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