【０００１】
本願は、２０００年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／２２６８６９号、及び２０００年１０月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／２４０６２７号（これらはいずれも本明細書に参照により組み込まれる）の利益を主張している。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明の技術分野は薬学である。
【０００３】
（発明の背景）
多くの薬理学的に活性な分子は、（たいていは哺乳動物、及び典型的にはヒトである）系に経口又は非経口投与されているが、しかしながらそれらは、細胞質又は核のような細胞内区画において所望の活性を示す。従って、このような分子は、作用する領域に到達するために細胞膜を通過する必要がある。さまざまな他の薬理学的に活性な分子の中で、抗ウイルス薬を細胞質及び／又は核に到達させることは、適切な抗ウイルス活性のために特に重要である。
【０００４】
多くの修飾がこのような分子の標的細胞への輸送を促進することが知られている。例えば、いくつかの修飾は、細胞輸送体の一部分又は完全な基質を含む（例えば、ＧＬＵＴ−１におけるグルコース、アシアロ糖タンパクにおけるポリ塩基性アミノ酸など）。残念ながらこのような追加は、高い頻度で、分子量を増大させるか又は薬理学的に活性な分子に所望されない代謝経路を加える。分子の化学構造又は修飾の型に依存して、受容体媒介性の取り込みが、多様な膜輸送体を通して起こり得る。例えば、多様なモノカルボキシレート薬は、モノカルボキシレート輸送体によって移入されてもよく、一方、いくつかの内因性アミン及び生体異物は、有機カチオン輸送体によって細胞内に移入されることが知られている。さらに他の輸送体は、ヌクレオシドを、濃度依存もしくはエネルギー依存の方法で細胞内に移入する。多様な膜輸送体の再考は、Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１，Ｓｕｐｐｌ．２（２０００）：４１−５１）（これは本明細書に参照により組み込まれる）により公開されている。
【０００５】
他の修飾は、部位もしくは器官に特異的な修飾を含む。例えば、肝胆道系での該分子の循環を増強するために、薬理学的に活性な分子から胆汁酸付加物を形成してもよい。しかしながら、このような修飾は、溶解性を減少させる傾向があり、従って、全達成可能濃度を減少させる可能性がある。他の例において、リン酸基上の修飾（例えばホスホネートエステルの形成）は、薬物分子を、器官特異的な酵素系によって元の薬物に変換される、比較的高い器官特異性を持つ、プロドラッグに変換する（米国特許第６，２２５，４６０号又は米国特許第６，１１０，９０３号を参照）。またさらなる修飾は、抗体を持つ薬理学的に活性な分子の標的特異性を高めるために、抗体またはその断片を含む。比較的高い抗体選択性にもかかわらず、抗体は、免疫原性及びそれらの生成及び／又は精製に関して問題がある傾向がある。
【０００６】
当該技術分野において既知の薬理学的に活性な分子への多様な修飾があるにもかかわらず、それらの全て又は殆ど全てが、１又はそれ以上の不都合を有する。従って、薬理学的に活性な分子の特異性を増強するために改良された方法及び組成物を提供することが、まだなお必要とされている。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、肝細胞へ薬物を送達する方法、及び細胞含有系におけるフラビウイルスの増殖を阻害する方法に関する。
【０００８】
本発明の主題の一つの形態において、肝細胞へ薬物を送達する方法は、カルボキサミジン基を持つ抗ウイルス又は抗腫瘍化合物を供給する一つのステップを含む。さらなるステップにおいて、肝細胞は、肝細胞の原形質膜を通して前記化合物を輸送する輸送体であって、前記化合物の輸送がリバビリンによって実質的に阻害されない輸送体を含むことが確定され、及びまたさらなるステップにおいて、前記輸送体は前記化合物を与えられる。
【０００９】
本発明の主題の他の形態において、意図される化合物は、糖と結合した複素環塩基を持つヌクレオシドを含み、塩基は、好ましくは単環の塩基（例えば１，２，４−トリアゾール）であり、及び、糖は、好ましくはベータ−リボフラノースを含む。特に好ましくは、化合物は、Ｄ−及びＬ−ビラミジンＴＭを含む。
【００１０】
本発明の主題のさらなる形態において、意図される化合物のカルボキサミジン基は肝細胞でカルボキサミド基に変換される、及び、化合物が肝細胞で酵素的にリン酸化されて、それにより蓄積されることがさらに好ましい。肝細胞は病変している（例えばウイルスの感染又は侵入）ことが特に意図される。意図される輸送体は、特にＡＴＰ依存性輸送体及び膜透過性タンパクを含む。
【００１１】
本発明の主題のまたさらなる形態において、細胞含有系におけるフラビウイルスのファミリーのウイルスの増殖を阻害する方法は、カルボキサミジン基を持つ薬剤組成物を供給するステップを含む。他のステップにおいて、細胞含有系内の細胞は、化合物が細胞の原形質膜を通して輸送され、及び化合物の輸送がリバビリンによって実質的に阻害されない薬剤組成物を与えられる。
【００１２】
本発明の多様な目的、特性、形態、及び利点は、添付の図面と共に以下に示す本発明の好ましい実施態様の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバビリン）のヒト赤血球への輸送についての研究は、リバビリンが、６−［（４−ニトロベンジル）チオ］−９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルプリン（ＮＢＭＰＲ）−感受性ヌクレオシド輸送体によって赤血球に進入することを示した。また、リバビリンの赤血球への輸送が約０．９９ｎＭのＩＣ５０でＮＢＭＰＲによって阻害されたことが証明されている（例としてＪａｒｖｉｓ等，１９９８年を参照）。
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、近縁化合物である１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミジン（ビラミジンＴＭ）の肝細胞への輸送が、リバビリンの肝細胞への輸送と異なる細胞輸送体を伴うと思われることを見出した。リバビリン及びビラミジンＴＭ両方の構造式を、以下の式１及び２に示す。
【００１５】
【化１】
【００１６】
さらに本発明者らは、ビラミジンＴＭの肝細胞への取り込みの速度は、肝細胞における全濃度と同様に、リバビリンと比較して著しく高く、このことから、肝細胞における抗ウイルス剤の有効濃度を増加させるための新規な手段を提供することを見出した。
【００１７】
リバビリン及びビラミジンＴＭが同様のヒト肝細胞への進入形態をとるかどうかを決定するために、本発明者らはいくつかの実験を行った。第一に、多様な株の肝細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、及びＨｕｈ７）を、多様なヌクレオチド類縁体（例えばリバビリン、レボビリン（リバビリンのＬ−異性体）、及びビラミジンＴＭ）と共にインキュベートした、及び、ヌクレオシドの取り込み実験の結果を図１に示す。取り込み実験の試験データは、３つのトリアゾール型ヌクレオシド類縁体の全てが、異なる速度及び／又は量であるが、試験された全ての肝細胞中に取り込まれることを明確に示している。より具体的には、リバビリンのＤ−異性体は、リバビリンのＬ−異性体よりも、より効果的に取り込まれた。より著しくは、カルボキサミジン含有のヌクレオシド類縁体であるビラミジンＴＭは、Ｄ−及びＬ−配置のカルボキサミド含有のヌクレオシド類縁体よりも著しく高い度合いで、３つの細胞系の全てに取り込まれたことが明らかになる。
【００１８】
これらの、及び他の実験（データは示されていない）は、本発明者らに、ヌクレオシドであるリバビリン及びビラミジンＴＭの取り込みが、実際は異なる取り込みメカニズムによって起こり得ることを示唆した。この疑問を解決するために、本発明者らは、放射性同位体で標識されたリバビリン及びビラミジンＴＭが、標識されていないビラミジンＴＭ及びリバビリンそれぞれと取り込みを競合する、取り込みの競合の実験を行った。これらの実験の結果を図２及び３に示す。驚くべきことに、両実験は、肝細胞によるビラミジンＴＭ及びリバビリンの異なる取り込みを明確に示唆する、リバビリンとビラミジンＴＭの間での少なくとも部分的な競合を示した。
【００１９】
従って、本発明者らは、肝細胞が、完全でなくとも少なくとも部分的にリバビリンのための輸送体の系（すなわちＮＢＭＰＲ感受性ヌクレオシド輸送体）と異なる、ビラミジンＴＭもしくは他のカルボキサミジン含有化合物のための細胞取り込み及び／又は輸送体の系を含むことを意図する。このことから、肝細胞が、ビラミジンＴＭの取り込み及び／又は輸送体の系を選択的に利用する薬理学的分子の標的となり得ることが意図される。「輸送体の系」及び「輸送体」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられ、及び、原形質膜を通して細胞への化合物の流入を促進する、膜に関連のタンパク又はタンパク複合体（膜透過性タンパク、又は、外側又は内側の細胞膜に位置した／固定されたタンパク）を指して言う。典型的には、該輸送体はエネルギー依存性（例えばＡＴＰ依存性）であり、及び意図される輸送体は多様な因子（例えば膜電位、Ｃａ２＋濃度、ｃＧＴＰなど）によってさらに調節され得る。さらに、適当な輸送体の系はカルボキサミジン基を持つ第二の化合物によって阻害され得ることが意図される。
【００２０】
意図される薬理学的分子に関して、適当な分子はビラミジンＴＭだけでなく多くのビラミジンＴＭの修飾を含むことが認識されるべきである。例えば、特に意図される修飾は、ビラミジンＴＭのＬ−異性体を含む。さらに意図される修飾は、特に、モノ、ジ、及びトリリン酸塩の形状のビラミジンＴＭ、及び全ての化学的及び／又は生理的に適当なプロドラッグ形状を含む。該プロドラッグ形状の例は、２００１年３月１５日出願の、発明の名称が「ヌクレオシド化合物及びその使用」であるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０８７１３（これは本明細書に参照により組み込まれる）に示されている。
【００２１】
さらに、さらなる適当なヌクレオシド及びヌクレオシド類縁体は、カルボキサミジン機能もしくは修飾されたカルボキサミド機能を含むヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体を含むことが意図される（「修飾されたカルボキサミド機能」という用語は、詳しくは以下の構造を持つ基を含む：
【００２２】
【化２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、これらの全てが直鎖又は分枝鎖であってもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、及びアルカリルを含み、及びさらに官能基を含んでいてもよい）。特に好ましい官能基は、極性の、塩基性の、酸性の、求電子性の、及び求核性の基（カルボキシレート、チオール、第３級又は第４級アンモニウム基、エステル、ヒドロキシル、アミド、イミド、エーテルなど）、及びハロゲンを含む。さらなる代わりの形態において、適当なヌクレオシドもしくはヌクレオチド類縁体の塩基は、非自然発生の塩基と同様に自然発生の塩基を含むことが意図され、及び特に意図される代わりの塩基は、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシル、シチジン、アデニン、シチジン、フルオロウラシル、単環の塩基（例えば１，２，４−トリアゾール）などである。
【００２３】
同様に、糖部分は、天然の及び／又は修飾された糖を含んでいてもよい。例えば、天然の糖が好ましい場合は、アラビノースのような非リボフラノース糖が取り込まれてもよい。一方、非天然の糖は、立体配置的に制限されたもしくは固定された糖、水酸基以外の置換基（例えばエチニル、ハロゲン、アルキル）を持つ糖、又はデオキシ糖を有利に含んでいてもよい。特に好ましいヌクレオシドは、フラビウイルスに対する抗ウイルス活性及び特にＣ型肝炎ウイルス（例えばＨＣＶウイルス又は疫病のウイルス）に対する抗ウイルス活性、又は腫瘍性肝細胞に対する抗腫瘍活性を示す。
【００２４】
肝細胞以外の多くの細胞（これらは腫瘍性細胞であってもよく、そうでなくてもよい）もまた意図され、及び適当な細胞は、一般的に、図２及び３の実験で使用される濃度範囲で競合しているリバビリンによって実質的に影響を受けないビラミジンＴＭの取り込みを示す全ての細胞を含むであろうことが、さらに認識されるべきである。実質的に影響を受けないという用語は、１５％より多くない、好ましくは１０％より多くない、より好ましくは８％より多くないビラミジンＴＭの取り込みの減少を指して言う。しかしながら、一般的に、肝細胞、及び特に病変した肝細胞（例えばウイルスの感染又は侵入）が好ましい細胞であると意図される。
【００２５】
従って、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド化合物の毒性は、前に定義されるカルボキサミジン基もしくは修飾されたカルボキサミジン基を含み、修飾された化合物の標的細胞が輸送体の系を含み、非標的細胞が欠如するような化合物の修飾によって、低減することができることが認識されるべきである。例えば、リバビリンは、赤血球及び肝細胞によって容易に取り込まれ、細胞内でリン酸化された後に保持されて、患者がリバビリンの高用量もしくは長期の投与計画下にある場合に、しばしば患者に溶血性貧血を引き起こす。しかしながら興味深いことに、ビラミジンＴＭは、肝細胞によって取り込まれるが、赤血球によって取り込まれない。この取り込みにおける差異は、ビラミジンＴＭの取り込み及び／又は輸送体の系の欠如に起因する。実際、実験は、認識されるいかなる度合いにおいてもビラミジンＴＭが赤血球中に検知される量で取り込まれない（データは示されていない）ことを示している。
【００２６】
さらに、肝細胞における比較的高いデアミナーゼ／デアミダーゼ活性に起因して、ビラミジンＴＭは肝臓でリバビリンに変換され（未公開の結果）、その後に細胞内でリン酸化されて、典型的に肝細胞で保持されるリバビリンモノホスフェートとなる。従って、分子にカルボキサミジン基を含むこと及び肝細胞の比較的高いデアミナーゼ／デアミダーゼ活性を利用することによって、分子は、肝臓で特異的に標的とされ得ることが意図される。−Ｃ（ＮＲ１）（ＮＲ２Ｒ３）基を持つ意図される分子に関して、肝細胞の多様なデアミナーゼ／デアミダーゼ活性は、該化合物をプロドラッグ形状から活性薬物形状へと変換するのに十分に高い（例えば薬物の活性はカルボキサミド基が存在するときに増強する）ことが認識されるべきである。
【００２７】
特定の理論又は酵素的なメカニズムが必至であることを望まないが、カルボキサミジン含有化合物の相応するカルボキサミド含有化合物への変換は、酵素的な変換を含んでいてもよく、及び、カルボキサミジン含有化合物を相応するカルボキサミド含有化合物に変換する（例えばビラミジンＴＭをリバビリンに変換する）酵素は、アミノヒドロラーゼのクラスに属することが意図される。特に意図されるアミノヒドロラーゼは、アデノシン−もしくはシトシン−デアミナーゼ、アリール−デアミダーゼ、及びグルタメート−ピルベートトランスアミナーゼを含む。
【００２８】
従って、本発明者らは、薬物を肝細胞へ送達する方法が、カルボキサミジン基を持つ抗ウイルスもしくは抗腫瘍化合物が供給される一つのステップを含むことを意図する。他のステップにおいて、肝細胞が、化合物を肝細胞の原形質膜を通して輸送する輸送体であって、化合物の輸送がリバビリンによって実質的に阻害されない輸送体を含むことが確定される。「リバビリンによって実質的に阻害されない」という用語は、実験の項で定義された試験条件下でリバビリンの濃度が１００μＭから２ｍＭの間であるところの、２０％より多くない、より典型的には１５％より多くない、さらにより典型的には１０％より多くない、及び最も典型的には８％より多くない阻害を指して言う。またさらなるステップにおいて、輸送体は化合物を与えられる。
【００２９】
本発明の主題のさらなる形態において、本発明者らは、特定のウイルスのファミリー、より具体的にはフラビウイルスの増殖が、いくつかの意図される化合物、特にビラミジンＴＭの塩酸塩（１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミジン＊ＨＣｌ）を細胞含有の媒地に添加することによって、細胞含有の媒地中で阻害され得ることを見出した（データは示されていない）。フラビウイルスのファミリーは、近年、７例の報告された死亡及び少なくとも６２例の重篤な疾病の事例を招いた米国東部における西ナイルウイルス脳炎の数回の発生によって、特別な注目を受けている。さらに、Ｃ型肝炎類似ウイルス（及びＨＣＶウイルス）もまた、フラビウイルスのファミリーに属し、公衆及び個人の健康に関してフラビウイルスの深刻さにさらに拍車をかけている。特定の理論又は仮説が必至であることを望まないが、増強したビラミジンＴＭ＊ＨＣｌの輸送は、フラビウイルス感染の治療に対して特に有益であることが意図される。
【００３０】
従って、特にビラミジンＴＭ＊ＨＣｌを用いて治療されることが意図される感染は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ココベラウイルス、マリーバレー脳炎、クンジュンウイルス、及びランガトウイルス、並びに、ダニ媒介脳炎ウイルス群、日本脳炎群、及びデング熱群からのウイルスを含む。
【００３１】
従って、細胞含有系におけるフラビウイルスのファミリーに属するウイルスの増殖を阻害する方法は、カルボキサミジン基を持つ薬剤組成物が供給されるステップを含むであろう。他のステップにおいて、細胞含有系内の細胞は、化合物が細胞の原形質膜を通して輸送され、化合物の輸送はリバビリンによって実質的に阻害されない薬剤組成物を与えられる。特に好ましい細胞含有系は、インビトロ（例えばペトリ皿又は細胞培養）及びインビボの系（例えば哺乳動物及び特にヒト）を含み、及びさらに、適当な細胞はウイルスに感染した肝細胞を含むことが特に意図される。
【００３２】
（Ｄ−又はＬ−配置のいずれかの）ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌは、任意の適当な医薬製剤として、及び任意の適当な手順で投与されるであろうことが意図される。従って、投与は、経口、（皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、胸骨内注射もしくは注入の手法を含む）非経口、吸入スプレー、又は経腸、局所などにより、及び、一般的な非毒性の薬学的に許容できる担体、補助剤、及びビヒクルを含む投与単位製剤で行われてもよい。実施例によって、ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌは、薬学的に許容できる担体との混合物で処方され得ることが意図される。例えば、ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌは、薬学的に許容される塩として経口的に投与され得る。ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌは殆ど水に溶解することから、（例えば約７．２から７．５のｐＨに緩衝された）生理食塩水溶液で、静脈注射で投与され得る。リン酸、重炭酸、又はクエン酸のような一般的な緩衝剤をこの目的で使用することができる。当然ながら、当業者は、ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌを不安定にすることなく、又はその治療活性を損なうことなく、それぞれの投与経路のための多くの製剤を提供するために、明細書の教示の範囲内で製剤を修飾してもよい。詳しくは、水又は他のビヒクルへの溶解性をより高めるためのビラミジンＴＭ＊ＨＣｌの修飾は、例えば、当業者が十分に行なうことができる小規模の修飾（塩の形成、エステル化等）によって容易に達成することができる。本化合物の薬物動態を患者において最大の有利な効果を持つようにするために、特定の化合物の投与経路及び投与計画を修飾することもまた、当業者が十分に行うことができる。
【００３３】
いくつかの薬学的投与形状において、特に本化合物の、アシル化（アセチル化、又はその他の）誘導体、ピリジンエステル、及び多様な塩の形状を含む、化合物のプロドラッグ形状が好ましい。当業者は、容易に本化合物を修飾して宿主器官もしくは患者の標的領域への活性化合物の送達を促進するためのプロドラッグ形状にする方法を理解するであろう。当業者はまた、本化合物の宿主器官もしくは患者の標的領域への送達において化合物の意図される効果を最大化するために、適切であれば、プロドラッグ形状の好ましい薬物動態学パラメーターを利用するであろう。
【００３４】
さらに、前記の感染もしくは病状の治療のために、ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌは、単独で、又は他の成分と併用して投与されてもよい。本発明の併用療法は、少なくとも一つの本発明の化合物もしくはその機能性誘導体、及び少なくとも一つの他の薬学的に活性な成分の投与を含む。活性成分及び薬学的に活性な薬剤は、別々に又は合わせて投与されてもよく、及び、別々に投与される場合は、同時に、又はいずれの順序でもよく別々に投与されてもよい。活性成分及び薬学的に活性な薬剤の量、及び対応する投与のタイミングは、所望の併用療法効果を達成するように選択されるであろう。好ましくは、併用療法は、ビラミジンＴＭ＊ＨＣｌもしくはその生理学的機能性誘導体、及び本明細書で以下に記載される一つの薬剤の投与を含む。
【００３５】
ビラミジンＴＭとの併用において有効であることが意図される他の薬剤又は活性成分の例は、インターフェロンα及びγを含むがこれらに限定されない多様なインターフェロン、リバビリン、アシクロビル、及びＡＺＴＴＭのような抗ウイルス薬；トルナフテート、フンギゾンＴＭ、ロトリミンＴＭ、マイセレクスＴＭ、ナイスタチン、及びアンホテラシンのような抗真菌薬；ミンテゾールＴＭ、ニクロシドＴＭ、ベルモックスＴＭ、及びフラジールＴＭのような駆虫薬、イモジウムＴＭ、ロモチルＴＭ、及びファザイムＴＭのような腸用薬；インターフェロンα及びγ、アドリアマイシンＴＭ、シトキサンＴＭ、イムランＴＭ、メトトレキサート、ミトラシンＴＭ、チアゾフリンＴＭ、タキソールＴＭのような抗腫瘍薬；アクロベートＴＭ、シクロコートＴＭ、デノレクスＴＭ、フロロンＴＭ、オキソラレンＴＭ、コールタール、及びサリチル酸のような皮膚用薬；エルゴタミン化合物のような片頭痛薬；シクロスポリン、ジプロソンＴＭ、ヒドロコルチゾンを含む、前に記載されていないステロイド及び免疫抑制薬；フロロンＴＭ、リデックスＴＭ、トピコート、及びバリソン；及びインシュリンのような代謝性の薬剤、及び、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、及びＩＬ１２のようなサイトカインを含む、前記のカテゴリーに適切に当てはまらない他の薬剤である。特に好ましい主要な薬剤は、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換グアノシン類縁体、２，３−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、ＩαＢ−インターフェロンのようなインターフェロン、ツカレソール、レバミソール、イソプリノシン及びシクロリグナンである。
【００３６】
このような追加の治療薬の例は、ＡＺＴ、３ＴＣ、８−置換グアノシン類縁体、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、インターロイキンＩＩ、α−インターフェロンのようなインターフェロン、ツカレソール、レバミソール、イソプリノシン、及びシクロリグナンのような、免疫系の調節又は関連する病状に有効な薬剤を含む。本発明のいくつかの化合物は、他の化合物の代謝を低減させるか又は不活化することによって本発明のいくつかの薬剤の生物学的活性を高めるために有効であってもよく、及びこのことから、この意図される効果のために共に投与される。
【００３７】
１〜２００ｍｇ／日及びそれより少ない用量を含む、多様な代わりの用量もまた適用できると意図される。好ましい実施態様において、適当な用量は、１０〜２００ｍｇ／日の範囲である。より好ましい実施態様において、用量は、５０〜２００ｍｇ／日の範囲であり、及びさらにより好ましい実施態様において、用量は、５〜１００ｍｇ／日の範囲である。一般的に、適当な用量は、ウイルス感染の型、ウイルス感染の段階、所望されるビラミジンＴＭの血漿濃度、治療の期間等を含む複数のパラメーターに依存するであろう。例えば、いくつかのウイルス感染では、比較的低いビラミジンＴＭの血漿濃度で治療の成功が達成し得る一方で、他のウイルス感染は、比較的高用量を必要とし得る。
【００３８】
活性化合物の投与は、連続的投与（静脈点滴）から、日毎の数回の経口投与（例えばＱ．Ｉ．Ｄ．）にわたっていてもよく、及び、他の投与経路の中でも、経口、局所、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、（浸透促進剤を含んでもよい）経皮、口腔内、及び坐剤の投与を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の薬剤組成物を調製するために、治療学的に有効量の１又は２以上の本発明の化合物は、好ましくは、投与形を製造するための一般的な薬剤調合方法に従って、薬学的に許容できる担体とよく混合される。担体は、例えば経口又は非経口といった投与に対して望まれる製剤の形状に依存して、幅広い多様な形状をとることができる。経口投与形の薬剤組成物の調製において、任意の一般的な薬学的媒体を使用することができる。従って、懸濁剤、エリキシル剤、及び溶液剤のような液状の経口製剤としては、水、グリコール、油、アルコール、香料、保存剤、着色剤などを含む適当な担体及び添加剤を使用してもよい。粉末剤、錠剤、カプセルのような固形の経口製剤、及び、坐剤のような固形の製剤としては、デンプン、（デキストロース、マンニトール、乳糖、及び関連する担体のような）糖担体、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを含む適当な担体及び添加剤を使用してもよい。所望ならば、錠剤又はカプセル剤は、一般的な手法によって腸溶性皮膜又は放出制御を施してもよい。
【００４０】
非経口製剤としては、担体は、滅菌水又は塩化ナトリウム水溶液を通常含むであろうが、分散を補助する成分を含む他の成分を含んでいてもよい。当然ながら、滅菌水が無菌の状態で使用されて保持される場合、組成物及び担体もまた滅菌される。注射用の懸濁剤もまた調製され、この場合、適当な液状の担体、懸濁化剤などを使用してもよい。
【００４１】
（実施例）
異なるヒト肝細胞系による、リバビリン、ビラミジンＴＭ、及びレボビリンＴＭの取り込み
Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、及びＨｕｈ７細胞系を、２４穴プレート内で、５０，０００細胞／穴の濃度で使用し、及び、［３Ｈ］−標識されたリバビリン、レボビリンＴＭ、及びビラミジンＴＭ（２０μＣｉ／ｍｌ）と共に、１０μＭの冷却したヌクレオシドを加えて、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し溶解して、及び、細胞溶解物中の放射能（すなわち、細胞によって取り込まれた、標識されたヌクレオシドの量）を、シンチレーションカウンターで測定した。
【００４２】
ヌクレオシド競争アッセイ
５０，０００ＨｅｐＧ２細胞／穴を、２４穴プレート内に入れ、及び、［３Ｈ］−標識されたヌクレオシド（２０μＣｉ／ｍｌ）と共にインキュベートした。競争を、冷却した（０、１００μＭ、５００μＭ、及び２ｍＭ）競合ヌクレオシドの濃度を増加させて行った。インキュベーションの時間は３７℃で２時間であった。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し溶解した。細胞溶解物中の放射能（すなわち、細胞によって取り込まれた、標識されたヌクレオシドの量）を、シンチレーションカウンターで測定した。
【００４３】
上述のように、肝細胞への薬物送達方法及びフラビウイルス感染の治療方法の具体的な実施態様を開示してきた。しかしながら、本明細書に記載の本発明の思想から逸脱することなく、既に記載されたものに加えて多くのさらなる修飾が可能であることは、当業者に明らかであろう。従って、本発明の主題は、添付された特許請求の範囲の精神を除いて限定されるものではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と合致した方法で可能な限り広く解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、言及される要素、構成成分もしくはステップが、明確に言及されていない他の要素、構成成分もしくはステップと共に、存在してもよく、又は使用されてもよく、又は組み合わされてもよいことを示す非排他的な方法で、要素、構成成分、又はステップに言及したものとして解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は異なる肝細胞系へのヌクレオシドの取り込みを示すグラフである。
【図２】図２はＨｅｐＧ２細胞におけるリバビリン及びビラミジンＴＭによる［３Ｈ］−リバビリンの取り込みの競争を示すグラフである。
【図３】図３はＨｅｐＧ２細胞におけるリバビリン及びビラミジンＴＭによる［３Ｈ］−ビラミジンＴＭの取り込みの競争を示すグラフである。[0001]
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[0002]
(Technical field of the invention)
The technical field of the present invention is pharmacy.
[0003]
(Background of the Invention)
Many pharmacologically active molecules have been administered orally or parenterally to systems (mostly mammals, and typically humans); however, they have been found to be intracellular, such as in the cytoplasm or nucleus. Shows the desired activity in the compartment. Thus, such molecules need to cross cell membranes to reach the area of action. Among various other pharmacologically active molecules, reaching the antiviral drug to the cytoplasm and / or nucleus is particularly important for proper antiviral activity.
[0004]
Many modifications are known to enhance the transport of such molecules to target cells. For example, some modifications include a portion or complete substrate of a cell transporter (eg, glucose in GLUT-1, polybasic amino acids in asialoglycoprotein, etc.). Unfortunately, such additions frequently increase the molecular weight or add undesirable metabolic pathways to the pharmacologically active molecule. Depending on the chemical structure of the molecule or the type of modification, receptor-mediated uptake can occur through a variety of membrane transporters. For example, various monocarboxylate drugs may be imported by monocarboxylate transporters, while some endogenous amines and xenobiotics are known to be imported into cells by organic cation transporters. ing. Still other transporters import nucleosides into cells in a concentration-dependent or energy-dependent manner. A review of various membrane transporters can be found in Lee, V. et al. H. (Eur. J. Pharm. Sci. 11, Suppl. 2 (2000): 41-51), which is incorporated herein by reference.
[0005]
Other modifications include site or organ specific modifications. For example, bile acid adducts may be formed from pharmacologically active molecules to enhance the circulation of the molecule in the hepatobiliary system. However, such modifications tend to reduce solubility, and therefore may reduce the overall achievable concentration. In another example, a modification on the phosphate group (eg, formation of a phosphonate ester) is a prodrug with relatively high organ specificity that converts the drug molecule to the original drug by an organ-specific enzyme system. (See US Pat. No. 6,225,460 or US Pat. No. 6,110,903). Still further modifications include the antibody or fragment thereof to increase the target specificity of the pharmacologically active molecule with the antibody. Despite the relatively high antibody selectivity, antibodies tend to be problematic with respect to immunogenicity and their production and / or purification.
[0006]
Despite the various modifications to pharmacologically active molecules known in the art, all or almost all of them have one or more disadvantages. Thus, there is still a need to provide improved methods and compositions for enhancing the specificity of pharmacologically active molecules.
[0007]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to a method for delivering a drug to hepatocytes and a method for inhibiting the growth of flavivirus in a cell-containing system.
[0008]
In one form of the present inventive subject matter, a method for delivering a drug to hepatocytes comprises one step of providing an antiviral or antitumor compound having a carboxamidine group. In a further step, the hepatocytes are determined to comprise a transporter that transports the compound across the plasma membrane of the hepatocytes, wherein transport of the compound is not substantially inhibited by ribavirin, and In a step, the transporter is provided with the compound.
[0009]
In another aspect of the present subject matter, contemplated compounds include nucleosides having a heterocyclic base linked to a sugar, wherein the base is preferably a monocyclic base (eg, 1,2,4-triazole). And the sugar preferably comprises beta-ribofuranose. Particularly preferably, the compounds are D- and L-viramidine TM including.
[0010]
In a further aspect of the present inventive subject matter, the carboxamidine group of the intended compound is converted to a carboxamide group in hepatocytes, and the compound is enzymatically phosphorylated in hepatocytes, thereby accumulating. preferable. It is specifically contemplated that hepatocytes are diseased (eg, infected or invaded by a virus). Contemplated transporters include ATP-dependent transporters and membrane permeable proteins, among others.
[0011]
In a still further aspect of the present inventive subject matter, a method of inhibiting the growth of a virus of the flavivirus family in a cell-containing system comprises providing a pharmaceutical composition having a carboxamidine group. In another step, the cells in the cell-containing system are provided with a drug composition in which the compound is transported through the plasma membrane of the cell and the transport of the compound is not substantially inhibited by ribavirin.
[0012]
Various objects, features, forms and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the preferred embodiments thereof, taken in conjunction with the accompanying drawings.
[0013]
(Detailed description of the invention)
Studies on the transport of 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ribavirin) to human erythrocytes have shown that ribavirin is 6-[(4-nitrobenzyl) thio] -9-. Beta-D-ribofuranosylpurine (NBMPR) -sensitive nucleoside transporter was shown to enter erythrocytes. In addition, the transport of ribavirin to erythrocytes was about 0.99 nM IC. 50 Has been demonstrated to be inhibited by NBMPR (see, for example, Jarvis et al., 1998).
[0014]
Surprisingly, we have found that a related compound, 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamidine (viramidine). TM ) Was found to be associated with a different cell transporter than that of ribavirin to hepatocytes. Ribavirin and viramidine TM Both structural formulas are shown in Formulas 1 and 2 below.
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[0016]
Furthermore, the inventors have determined that viramidine TM The rate of incorporation into hepatocytes, as well as the total concentration in hepatocytes, is significantly higher compared to ribavirin, providing a new means for increasing the effective concentration of antiviral agents in hepatocytes. I found out.
[0017]
Ribavirin and viramidine TM Performed several experiments in order to determine whether or not took a similar form of entry into human hepatocytes. First, hepatocytes of various strains (Hep3B, HepG2, and Huh7) are converted to various nucleotide analogs (eg, ribavirin, levovirin (the L-isomer of ribavirin), and viramidine). TM 1) and the results of the nucleoside uptake experiments are shown in FIG. The test data of the uptake experiments clearly show that all three triazole-type nucleoside analogs, at different rates and / or amounts, are taken up in all hepatocytes tested. More specifically, the D-isomer of ribavirin was incorporated more efficiently than the L-isomer of ribavirin. More significantly, viramidine, a carboxamidine-containing nucleoside analog TM Is found to be taken up by all three cell lines to a significantly higher degree than carboxamide-containing nucleoside analogs in the D- and L-configuration.
[0018]
These and other experiments (data not shown) indicate that we have the nucleosides ribavirin and viramidine. TM Suggests that uptake can actually occur by different uptake mechanisms. To address this question, we have developed radioisotope-labeled ribavirin and viramidine. TM But unlabeled viramidine TM And Ribavirin, each of which competes for uptake. The results of these experiments are shown in FIGS. Surprisingly, both experiments showed that viramidine was TM And viramidine clearly suggest different uptakes of and ribavirin TM Showed at least partial competition between
[0019]
Thus, we believe that hepatocytes are at least partially, if not completely, different from the transporter system for ribavirin (ie, the NBMPR-sensitive nucleoside transporter). TM Alternatively, it is intended to include a cellular uptake and / or transporter system for other carboxamidine-containing compounds. From this, hepatocytes are viramidine TM It is contemplated that it may be a target for pharmacological molecules that selectively utilize the uptake and / or transporter system. The terms "transporter system" and "transporter" are used interchangeably herein and and are understood to refer to a membrane-associated protein or protein complex that facilitates the entry of a compound through the plasma membrane into a cell. (Membrane permeable proteins or proteins located / immobilized on the outer or inner cell membrane). Typically, the transporter is energy-dependent (eg, ATP-dependent), and the intended transporter depends on a variety of factors (eg, membrane potential, Ca 2+ Concentration, cGTP, etc.). It is further contemplated that a suitable transporter system may be inhibited by a second compound having a carboxamidine group.
[0020]
Regarding the intended pharmacological molecule, a suitable molecule is viramidine TM Not just a lot of viramidine TM It should be appreciated that the modifications include For example, a particularly contemplated modification is viramidine TM L-isomer of Further contemplated modifications are, inter alia, viramidine in the form of mono-, di- and triphosphates TM , And all chemically and / or physiologically suitable prodrug forms. Examples of such prodrug forms are described in PCT application PCT / US01 / 08713, filed March 15, 2001, entitled "Nucleoside Compounds and Uses," which is incorporated by reference herein. It is shown.
[0021]
Further, further suitable nucleosides and nucleoside analogs are intended to include nucleotides and nucleotide analogs that include a carboxamidine function or a modified carboxamide function (the term "modified carboxamide function" is described in more detail below. Including groups with the structure:
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Where R 1 , R 2 , And R 3 Independently include hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, and alkaryl, all of which may be straight or branched, and may further include functional groups). Particularly preferred functional groups are polar, basic, acidic, electrophilic and nucleophilic groups (carboxylate, thiol, tertiary or quaternary ammonium groups, esters, hydroxyls, amides, imides , Ethers, etc.), and halogens. In a further alternative, suitable nucleoside or nucleotide analog bases are intended to include naturally occurring bases as well as non-naturally occurring bases, and particularly contemplated alternative bases are guanine, hypoxanthine Uracil, cytidine, adenine, cytidine, fluorouracil, monocyclic bases (eg, 1,2,4-triazole) and the like.
[0023]
Similarly, the sugar moiety may include natural and / or modified sugars. For example, if a natural sugar is preferred, a non-ribofuranose sugar such as arabinose may be incorporated. On the other hand, the unnatural saccharide may advantageously include a sterically restricted or fixed saccharide, a saccharide having a substituent other than a hydroxyl group (eg, ethynyl, halogen, alkyl), or a deoxy saccharide. Particularly preferred nucleosides exhibit antiviral activity against flaviviruses and especially against hepatitis C virus (eg, HCV virus or plague virus) or antitumor activity against neoplastic hepatocytes.
[0024]
Many cells other than hepatocytes, which may or may not be neoplastic cells, are also contemplated, and suitable cells are generally used in the experiments of FIGS. Viramidine is substantially unaffected by ribavirin competing over a range of concentrations TM It should be further recognized that the cells would include all cells that exhibit uptake of the protein. The term substantially unaffected refers to viramidine not more than 15%, preferably not more than 10%, more preferably not more than 8% TM Refers to a decrease in uptake. However, in general, hepatocytes, and particularly diseased hepatocytes (eg, viral infection or invasion), are intended to be the preferred cells.
[0025]
Thus, the toxicity of a nucleoside or nucleotide compound is such that a compound containing a carboxamidine group or a modified carboxamidine group as defined above, wherein the target cells of the modified compound comprise a transporter system and lack non-target cells. It should be appreciated that the modification of can be reduced. For example, ribavirin is readily taken up by erythrocytes and hepatocytes and is retained after being phosphorylated intracellularly, often causing hemolytic anemia in patients when the patient is on a high dose or long-term regimen of ribavirin. cause. However, interestingly, viramidine TM Is taken up by hepatocytes but not by red blood cells. The difference in this uptake is due to viramidine TM Due to lack of uptake and / or transporter systems. In fact, experiments have shown that to any degree perceived viramidine TM Is not incorporated in the amount detected in the red blood cells (data not shown).
[0026]
Furthermore, due to the relatively high deaminase / deamidase activity in hepatocytes, viramidine TM Is converted to ribavirin in the liver (unpublished result) and is subsequently phosphorylated intracellularly to ribavirin monophosphate, which is typically retained in hepatocytes. Thus, it is contemplated that by including a carboxamidine group in the molecule and utilizing the relatively high deaminase / deamidase activity of hepatocytes, the molecule can be specifically targeted in the liver. −C (NR 1 ) (NR 2 R 3 With respect to the intended molecule bearing the group, the various deaminase / deamidase activities of the hepatocytes are sufficiently high to convert the compound from the prodrug form to the active drug form (eg, the activity of the drug is in the presence of the carboxamide group). It should be appreciated that when you augment).
[0027]
While not wishing to be bound by any particular theory or enzymatic mechanism, the conversion of the carboxamidine-containing compound to the corresponding carboxamide-containing compound may involve an enzymatic conversion, and the carboxamidine-containing compound may be converted accordingly. (For example, viramidine) TM Is converted to ribavirin) is intended to belong to the class of aminohydrolases. Particularly contemplated aminohydrolases include adenosine- or cytosine-deaminase, aryl-deamidase, and glutamate-pyruvate transaminase.
[0028]
Thus, the inventors contemplate that a method of delivering a drug to hepatocytes would include one step in which an antiviral or antitumor compound having a carboxamidine group is provided. In another step, it is determined that the hepatocytes include a transporter that transports the compound across the plasma membrane of the hepatocyte, wherein the transport of the compound is not substantially inhibited by ribavirin. The term “substantially not inhibited by ribavirin” refers to a concentration of ribavirin of between 100 μM and 2 mM, not more than 20%, more typically less than 15%, under the test conditions defined in the experimental section. It refers to inhibition of no more than%, even more typically no more than 10%, and most typically no more than 8%. In yet a further step, the transporter is provided with a compound.
[0029]
In a further aspect of the present inventive subject matter, the present inventors have determined that the growth of a particular family of viruses, more specifically flaviviruses, is dependent on some intended compounds, especially viramidine. TM Hydrochloride (1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamidine) * It has been found that by adding (HCl) to the cell-containing medium, it can be inhibited in the cell-containing medium (data not shown). The flavivirus family has received special attention in recent years with several outbreaks of West Nile virus encephalitis in the eastern United States resulting in seven reported deaths and at least 62 serious illness cases. . In addition, hepatitis C-like virus (and HCV virus) also belongs to the family of flaviviruses, further exacerbating the seriousness of flavivirus with respect to public and personal health. While not wishing a particular theory or hypothesis to be inevitable, enhanced viramidine TM * The transport of HCl is intended to be particularly beneficial for the treatment of flavivirus infection.
[0030]
Therefore, especially viramidine TM * Infections that are intended to be treated with HCl include hepatitis C virus (HCV), West Nile virus, yellow fever virus, Cocobella virus, Mary Valley encephalitis, Kunjung virus, and Langat virus, and Includes viruses from the tick-borne encephalitis virus group, the Japanese encephalitis group, and the dengue group.
[0031]
Thus, a method of inhibiting the growth of a virus belonging to the flavivirus family in a cell-containing system would include the step of providing a pharmaceutical composition having a carboxamidine group. In another step, the cells in the cell-containing system are provided with a pharmaceutical composition in which the compound is transported through the plasma membrane of the cell, and the transport of the compound is not substantially inhibited by ribavirin. Particularly preferred cell-containing systems include in vitro (eg, Petri dishes or cell cultures) and in vivo systems (eg, mammals and especially humans), and furthermore, it is specifically contemplated that suitable cells include hepatocytes infected with the virus. Is done.
[0032]
Viramidine (in either D- or L-configuration) TM * It is contemplated that HCl will be administered as any suitable pharmaceutical formulation and in any suitable procedure. Thus, administration can be oral, parenteral (including subcutaneous, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques), inhalation spray, or enteral, topical, and the like, as well as common nontoxic It may be in unit dosage form containing a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant, and vehicle. By example, viramidine TM * It is contemplated that HCl can be formulated in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, viramidine TM * HCl can be administered orally as a pharmaceutically acceptable salt. Viramidine TM * Since HCl is mostly soluble in water, it can be administered intravenously in a saline solution (eg, buffered to a pH of about 7.2 to 7.5). Common buffers such as phosphoric acid, bicarbonate, or citric acid can be used for this purpose. Naturally, those skilled in the art TM * The formulations may be modified within the teachings of the specification to provide a number of formulations for each route of administration without destabilizing the HCl or impairing its therapeutic activity. More specifically, viramidine for better solubility in water or other vehicles TM * Modification of HCl can be readily achieved, for example, by small-scale modifications (salt formation, esterification, etc.) that are well within the skill of the art. Modification of the route and schedule of administration of a particular compound so that the pharmacokinetics of the compound have the greatest beneficial effect in the patient will also be well within the skill of the art.
[0033]
In some pharmaceutical dosage forms, prodrug forms of the compounds are preferred, especially including the acylated (acetylated or other) derivatives, pyridine esters, and various salt forms of the compounds. Those of skill in the art will readily understand how to modify the present compounds into prodrug forms to facilitate delivery of the active compound to a host organ or target area of the patient. One of skill in the art would also be able to utilize the preferred pharmacokinetic parameters in prodrug form, where appropriate, to maximize the intended effect of the compound in delivering the compound to the host organ or target area of the patient. There will be.
[0034]
Further, for the treatment of the aforementioned infections or medical conditions, viramidine is used. TM * HCl may be administered alone or in combination with other ingredients. The combination therapy of the present invention comprises the administration of at least one compound of the present invention or a functional derivative thereof, and at least one other pharmaceutically active ingredient. The active ingredient and the pharmaceutically active agent may be administered separately or in combination, and when administered separately, may be administered simultaneously or in any order or separately. The amounts of active ingredient and pharmaceutically active agent, and corresponding timing of administration, will be selected to achieve the desired combination therapy effect. Preferably, the combination therapy is viramidine TM * Includes the administration of HCl or a physiologically functional derivative thereof, and one of the agents described herein below.
[0035]
Viramidine TM Examples of other agents or active ingredients that are intended to be effective in combination with are a variety of interferons, including but not limited to interferons α and γ, ribavirin, acyclovir, and AZT TM Antivirals such as tolnaftate, fungizone TM , Lotrimin TM , My Celex TM Antifungals, such as, nystatin, and amphoterasin; TM , Niclosid TM , Bellmox TM And Frazier TM Anthelmintic like Imodium TM , Lomotil TM And fazyme TM Enteric drugs such as; interferon alpha and gamma, adriamycin TM , Cytoxan TM , Imran TM , Methotrexate, mitracin TM , Thiazofurin TM , Taxol TM Antitumor drugs such as acrobate TM , Cyclocoat TM , Denorex TM , Floron TM , Oxoralen TM Dermatological agents, such as arginine, coal tar, and salicylic acid; migraine agents, such as ergotamine compounds; cyclosporine, diprosone TM Steroids and immunosuppressants not previously described, including hydrocortisone; TM , Redex TM Metabolic drugs such as, insulin, and topical, and barison; and other drugs that do not fit properly in the above categories, including cytokines such as IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, and IL12. . Particularly preferred primary agents are AZT, 3TC, 8-substituted guanosine analogs, 2,3-dideoxynucleosides, interferons such as interleukin II, IαB-interferon, tucaresol, levamisole, isoprinosine and cyclolignan.
[0036]
Examples of such additional therapeutic agents include AZT, 3TC, 8-substituted guanosine analogs, 2 ′, 3′-dideoxynucleoside, interleukin II, interferons such as α-interferon, tucaresol, levamisole, isoprinosine, and Includes agents that are effective in modulating the immune system or related medical conditions, such as cyclolignans. Some compounds of the invention may be effective to increase the biological activity of some agents of the invention by reducing or inactivating the metabolism of other compounds, and Are administered together for this intended effect.
[0037]
It is contemplated that a variety of alternative doses, including 1-200 mg / day and lower doses, may also be applicable. In a preferred embodiment, a suitable dose is in the range of 10-200 mg / day. In a more preferred embodiment, the dose ranges from 50 to 200 mg / day, and in an even more preferred embodiment, the dose ranges from 5 to 100 mg / day. In general, the appropriate dose will depend on the type of viral infection, the stage of viral infection, the desired viramidine. TM Will depend on a number of parameters, including the plasma concentration of, the duration of treatment and the like. For example, some viral infections have relatively low viramidine TM While successful treatment can be achieved with plasma concentrations of, other viral infections may require relatively high doses.
[0038]
Administration of the active compounds may range from continuous administration (intravenous infusion) to several oral administrations daily (eg QID) and, among other routes of administration, oral, topical, non-oral administration. It may include oral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, transdermal (which may include penetration enhancers), buccal, and suppository administration.
[0039]
To prepare the pharmaceutical compositions of the present invention, a therapeutically effective amount of one or more compounds of the present invention is preferably administered in accordance with common pharmaceutical compounding methods for preparing dosage forms. Well mixed with acceptable carriers. The carrier can take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration, eg, oral or parenteral. In preparing the pharmaceutical compositions for oral dosage form, any of the usual pharmaceutical media may be employed. Therefore, liquid oral preparations such as suspensions, elixirs, and solutions are prepared using appropriate carriers and additives, including water, glycols, oils, alcohols, flavors, preservatives, and coloring agents. Is also good. Solid oral preparations, such as powders, tablets, capsules, and solid preparations, such as suppositories, include starch, sugar carriers (such as dextrose, mannitol, lactose, and related carriers), diluents, Appropriate carriers and additives, including granulating agents, lubricants, binders, disintegrants, and the like, may be used. If desired, tablets or capsules may be enterically coated or controlled release by conventional means.
[0040]
For parenteral formulations, the carrier will usually include sterile water or aqueous sodium chloride solution, but may also include other ingredients, including those that aid in dispersion. Of course, if sterile water is used and maintained in a sterile condition, the compositions and carriers will also be sterilized. Injectable suspensions may also be prepared, in which case appropriate liquid carriers, suspending agents and the like may be employed.
[0041]
(Example)
Ribavirin, viramidine from different human hepatocyte lines TM And levovirin TM Capture
Hep3B, HepG2, and Huh7 cell lines were used at a concentration of 50,000 cells / well in 24-well plates, and [ 3 H] -labeled ribavirin, levovirin TM And viramidine TM (20 μCi / ml) and 10 μM of cold nucleosides were added and incubated at 37 ° C. for 4 hours. The cells were washed and lysed with PBS, and the radioactivity in the cell lysate (ie, the amount of labeled nucleoside taken up by the cells) was measured with a scintillation counter.
[0042]
Nucleoside competition assay
50,000 HepG2 cells / well were placed in 24-well plates and incubated with [3H] -labeled nucleosides (20 μCi / ml). Competition was performed at increasing concentrations of chilled (0, 100 μM, 500 μM, and 2 mM) competing nucleosides. Incubation time was 2 hours at 37 ° C. Thereafter, the cells were washed and lysed with PBS. Radioactivity in cell lysates (ie, the amount of labeled nucleoside taken up by cells) was measured in a scintillation counter.
[0043]
As described above, specific embodiments of a method for delivering a drug to hepatocytes and a method for treating a flavivirus infection have been disclosed. However, it will be apparent to one skilled in the art that many further modifications in addition to those already described are possible without departing from the spirit of the invention described herein. The inventive subject matter, therefore, is not to be restricted except in the spirit of the appended claims. Furthermore, in interpreting both the specification and the claims, all terms should be interpreted as broadly as possible in a manner consistent with the context. In particular, the terms "comprises" and "comprising" are used to refer to elements, components, or steps that are referred to, together with other elements, components, or steps that are not explicitly mentioned. Should be construed as referring to elements, components, or steps in a non-exclusive manner, indicating that they may be used or used or combined.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing nucleoside incorporation into different hepatocyte lines.
FIG. 2. Ribavirin and viramidine in HepG2 cells. TM by[ 3 FIG. 2 is a graph showing competition of H] -ribavirin uptake.
FIG. 3. Ribavirin and viramidine in HepG2 cells. TM by[ 3 H] -viramidine TM 6 is a graph showing the competition for the incorporation of.
