JP2004506446A

JP2004506446A - SAM

Info

Publication number: JP2004506446A
Application number: JP2002521528A
Authority: JP
Inventors: ワール、フィリップ; ビッシング、ヘンリク; グロンダール、クリスティアン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-24
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2002016433A3; EP1315751A2; WO2002016433A2; AU2001279616A1

Abstract

ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称する減数分裂活性化ステロールの２つの受容体を同定した。Two receptors for meiotically activated sterols, designated SAM1a and SAM1b, have been identified.

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしているポリヌクレオチド、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしている核酸とハイブリダイズするプローブ、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしている配列を含むＤＮＡ構築物、ＤＮＡ配列がＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードする培養細胞株、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する抗体、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ、およびＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と親和性を有する化合物の存在を検出するための方法、に関する。
【０００２】
【発明の背景】
１９７８年に最初のＩＶＦ妊娠が実現されて以来、この処置は何千もの妊娠を成功させ、不妊カップルの研究および治療に関する多くの新規未研究領域を開拓してきた。なお、今日の不妊症治療様式を改善することに関して多くの要求がある。７カップル中で約１組が受精率低下（ｓｕｂｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）もしくは不妊症の問題を経験することが推定される。
【０００３】
ヒト卵母細胞のＩＶＦは、女性および男性の受精率低下の治療に通常使用されるようになった。標準のＩＶＦ治療は、女性患者の長期フェーズのホルモン刺激を含むものである。吸引された卵母細胞は、次にインビトロで受精され、そして培養される。この処理を最適化し、そして単純化するために絶え間ない努力が費やされた。それにもかかわらず、全体的な妊娠率は、現行の治療様式によって、約２０％を越えて顕著に増加しない。ＩＶＦ患者の大規模な欧州調査において、患者毎の１１．５の吸引した卵母細胞のうち７．２の卵母細胞が受精直前の減数分裂の再開（ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ）を生じ、４．３の卵母細胞のみが受精し、２．２の卵母細胞のみが、受精とインビトロ培養の後に８細胞胚段階（８−ｃｅｌｌｅｍｂｒｙｏｓｔａｇｅ）に達したことが示された（ＥＳＨＲＥ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９９７）。
【０００４】
現行の技術水準による胚の品質が非常に予測しがたいことから、妥当な成功のチャンスを得るためには２以上の胚が移送されなければならない。それ故、２〜３の胚（いくつかの国においては５胚まで）が移植されることが普通であり、これは患者および子供の双方に多大なる不便さとリスクとを伴う多胎妊娠（ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ）という非常に重篤な副作用を伴う。更に、多子出産（双子、三つ子など）による多大な医療保障費は、ＩＶＦ費用全体を上回っていると推測されてきた。
【０００５】
従って、現行の治療法には、いくつかの不利な点がある。
【０００６】
更に、患者自身に注射する不快さと共に、体重増加、鼓脹（ｂｌｏａｔｉｎｇ）、吐き気（ｎａｕｓｅａ）、嘔吐（ｖｏｍｉｔｉｎｇ）、不安定情動（ｌａｂｉｌｅｍｏｏｄ）および他の持続する不快感などが、不利な点として報告されている。
【０００７】
ある種のステロール誘導体が減数分裂の制御に使用できることはＷＯ９６／００２３５より既知である。かかるステロールの例は、４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，１４，２４−トリエン−３β−オル（以後、ＦＦ−ＭＡＳと称する）である。
【０００８】
このようなことから、現在ヒトのインビトロ成熟は、多大な関心と臨床的努力にもかかわらず高い確率で不成功に終わっていることが判明している。
【０００９】
効果的に減数分裂を制御する化合物を発見するための試行方法の１つは、関連するレセプターの使用である。
【００１０】
レセプターは、リガンド結合の際にシグナル伝達機能を実行する蛋白質性の高分子であると定義される。多くのレセプターは、細胞膜外層上に局在しており、他は細胞内に局在する。レセプターに結合する物質はリガンドと呼ばれ、この用語は、その対となるレセプターに関してのみ定義上の意味がある。「リガンド」という用語は、如何なる特定の分子サイズまたは他の構造上もしくは組成上の特性を意味するものではなく、この懸案となる物質は、標的分子に対してレセプターがリガンドの存在に関する情報を伝達するようにレセプターと結合、切断もしくは相互作用する能力がある物質を意味するものである。別に述べているように、特定のレセプターに結合する能力のある全ての物質がリガンドであるということではなく、全てのリガンドが特定のレセプターと結合する能力があるということである。レセプターは、イムノグロブリンのような物質を含まない。
【００１１】
レセプターは、様々に呼称される活性化もしくはシグナル伝達のプロセスにより機能すると信じられている。リガンドは、レセプター分子のコンホメーションが変化する様式でリガンド結合ドメインに結合する。このコンホメーション変化は、活性化と呼ばれ、細胞質部分において、レセプターの効果を修飾する。レセプター活性化により誘発された変化に共通するのは、レセプター酵素活性の変化もしくは発生である。
【００１２】
ｃＡＭＰ、ＩＰ３、キナーゼ、およびホスファターゼなどのシグナル伝達蛋白質は、全ての組織で遍在的に認められる蛋白質である。これらの蛋白質は、様々な経路により、リガンド／レセプター相互作用からの刺激を下流の細胞現象（ｃｅｌｌｕｌａｒｅｖｅｎｔｓ）へと伝達（ｃａｓｃａｄｅ）し、典型的には酵素活性もしくは効果分子の機能状態を変化させる。
【００１３】
近年の製薬産業は、研究を、疾患もしくは傷害におけるレセプターの役割に焦点を合わせた研究、またレセプターと結合する能力のある薬（一般的には低分子量物質）の設計の研究に向けて適応してきた。この初期スクリーニングで同定された薬は、次にインビボもしくは組織外植片（ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｌａｎｔｓ）に対する活性を試験される。結果として、旧来の技術は、大規模スクリーニングに適合しない。標的レセプターを含有する組織サンプルもしくは分離した細胞（例えば、卵巣組織）は、取得にコストがかかり、限定量のみ存在するものであり、且つ機能的に生存可能な状態で維持することが困難である。更に、確実且つ再現よく候補薬を組織サンプルに投与することは時折困難なことである。組織培養における一次外植片を使用したスクリーニングアッセイは、組織サンプルで可能であるスケールよりも大きなスケールで実施される。しかしながら、生理的効果をアッセイすることはより困難であり、そしてアッセイは培養液もしくは培養条件などの多くの干渉の発生源からの干渉にさらされる。最後に、天然物から単離されたレセプターを使用したアッセイには、レセプターが天然の可変性に左右され、且つ適切な天然供給源が必ずしも利用可能ではないとの不利な点が存在する。本発明の課題の１つは、容易に再現可能で、単純なアッセイ系を提供することであり、これはリガンド結合だけでなく、作動的（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）もしくは拮抗的（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）のような結合の特性をも決定するために大規模スケールで実施できるものである。
【００１４】
同様に、意味ある臨床的診断は、大抵は不活性型のリガンド（例えば、試験検体においてリガンドの活性を変化もしくは排除しさえもする、酵素的もしくは他の処理工程に供試されたリガンド）の干渉がない状況下での生物学的に活性なリガンドのアッセイに依存する。免疫アッセイ法は、試験サンプル中のリガンドの測定に広く使用される。しかしながら、リガンドの活性型と不活性型とを区別できる抗体を同定することは大抵は非常に困難である。レセプターは、分析物の結合試薬として抗体に代えて頻繁に使用されている。しかしながら、必ずしもレセプターと結合する全ての物質が、レセプター活性を誘導する（即ち、生物学的に活性）能力があるわけではない。本発明の課題の１つは、それらのレセプターによるシグナル伝達を誘導もしくは阻害することにおいて、活性を有する臨床試験サンプルにおいて、リガンドを同定する方法を提供することである。
【００１５】
リガンドから細胞現象への刺激の伝達において、細胞質蛋白質は、レセプターもしくはシグナル伝達分子として作用できる。様々なレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質のタイプは、異なる経路（例えば、低分子Ｇ蛋白質、カルシウム流入、ホスファターゼ、およびリパーゼ）を利用し、それらの全ては酵素活性もしくは遺伝子転写の変化を生じる。
【００１６】
減数分裂活性化ステロール（以後はＭＡＳと称する）は、卵胞液（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄ）および雄ウシ精巣組織（ｂｕｌｌｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅ）において、最初に同定された活性シグナル伝達分子を構成するものである。前記ステロールは、減数分裂プロセスの強力なアクチベータとしてＢｙｓｋｏｖ１９９５およびＧｒｏｎｄａｈｌ等（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８（１９９８），１２９７以下参照）により記載され、またＷＯ９６／００２３５，９６／２７６５８，９７／００８８４，９８／２８３２３，９８／５４９６５および９８／５５４９８において、より具体的にはそれらの請求項１に記載される。ＭＡＳステロールの減数分裂の効果を直接的もしくは間接的に伝達する如何なるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質も、これまで記載されていない。本発明の前に、推定上のＭＡＳレセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質の性質を有するものの存在は、以前は同定されていなかったが、その存在は示唆されていた〔例えば、Ｇｒｏｎｄａｈｌ等（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６２（２０００），７７５以下参照）によって〕。
【００１７】
２０００年９月２９日にクローンＮＴ２ＲＭ２００１６３２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、アクセッション番号ＡＫ０２２５５４として公表され、そして２００１年５月１０日にクローンＮＴ２ＲＰ２０００４４８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列がアクセッション番号ＡＫ０２７５３５として提出された。それらのクローンに関して、如何なる有用性もしくは作用も言及されていなかった。
【００１８】
単離および精製されたＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に関して、同様に他のレセプターから独立したＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現できる系に関して多大なる必要性が存在する。細胞および組織におけるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の存在を特異的に同定することは更に望ましいだろう、それにより時間を浪費し、複雑で、且つ非特異的な機能的薬理学アッセイを避けることができる。抗不妊症もしくは避妊薬（ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎｄｒｕｇ）の使用に関して、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に特異的な新規のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを選別し、開発することも望ましいことであろうが、現在のところは可能とはなっていない。実に驚くべきことに、本発明は、これら及び他の関連する必要性を達成させるものである。
【００１９】
【発明の概要】
今回、本発明は、減数分裂作用性ステロール（ＭＡＳ、ｍｅｉｏｔｉｃａｃｔｉｎｇｓｔｅｒｏｌｓ）のレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質のヌクレオチド配列を提供する。本発明は、単離され、実質的に純粋なＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質およびそれらの断片を提供する。それらのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質は、３β−ヒドロキシ−４，４−ジメチルコレスト−８，１４，２４−トリエン（以後はＦＦ−ＭＡＳと称する）により誘導される配偶子成熟プロセスに関与することが示され、インビトロで培養されたマウス卵母細胞において、リガンド活性化に際して特異的に誘導される卵核胞崩壊（ｇｅｒｍｉｎａｌｖｅｓｉｃｌｅｂｒｅａｋｄｏｗｎ、以後はＧＶＢと称する）を特異的に誘導する。このようなことから、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＦＦ−ＭＡＳへの結合に際してシグナル伝達機能を実行する蛋白質性の高分子であると定義される。要約すれば、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＦＦ−ＭＡＳに結合する。別の言い方をすると、ＭＡＳシグナル伝達蛋白質はＭＡＳ結合蛋白質であると明示することができる。
【００２０】
ＭＡＳレセプターは、ＦＦ−ＭＡＳもしくは他の内在性の減数分裂活性化ステロール〔例えば、３ β−ヒドロキシコレスト−８，１４−ジエン；３β−ヒドロキシ−４，４ジメチルコレスト−８，２４−ジエン；および３β−ヒドロキシコレスト−８，２４−ジエン、或いはそれらの代謝物（リガンドとして）〕と相互作用する点において、同一の機能的特長を有する蛋白質ＳＡＭ１ａもしくはＳＡＭ１ｂに関連する任意の蛋白質である。機能的特長には、卵母細胞における結合、レセプター活性化、および続く卵核胞崩壊（ＧＶＢ）が含まれる。ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂのアミノ酸配列は、以下の配列番号２および配列番号４に記載される。
【００２１】
ＭＡＳレセプターは、男性および女性に使用できる受精促進性（ｐｒｏｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）および受精阻害性（ａｎｔｉｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）の化合物を発見するために使用できる。
【００２２】
単離もしくは精製された形態でかかるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を供給して、本発明は抗血清および／またはモノクローナル抗体の形態のＭＡＳレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質に対する抗体をも提供する。
【００２３】
別の側面において、本発明は、組換えによる手段によって、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質およびそのポリペプチドもしくはその断片を産生する能力を提供する。発現されたＭＡＳレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質または断片は、生来の（ｎａｔｉｖｅ）レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の生物学的活性を有していても、有していなくてもよい。結果的に、単離および精製されたポリヌクレオチドが記載され、それはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質およびその断片をコードするものであり、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡ（ｃＤＮＡなどの）もしくはＲＮＡの形態で存在してもよい。それらの配列に基づいたプローブは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする遺伝子およびそれらの関連遺伝子をハイブリダイズさせて同定するために使用し得る。前記プローブは、完全長ｃＤＮＡまたは１４から２５ヌクレオチドと同程度に小さいか、またより多くの場合には約４０から約５０以上のヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
関連する態様において、本発明は、転写プロモータ、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質または断片をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーターを含むＤＮＡ構築物に関係しており、各々はレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の発現に関して操作可能な状態で相互に関連している。発現させるために前記構築物は、少なくとも１つのシグナル配列をも含んでいてもよい。更に、大規模生産のために発現したレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を、例えば免疫親和性精製などにより細胞から分離してもよい。
【００２５】
ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現する細胞またはバクテリアは、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が媒介する細胞の代謝を変化させる化合物の同定にも使用し得る。化合物は、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質との結合に関して、および／またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が媒介する宿主細胞の代謝の変化への効果に関して選別されてもよい。ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、リガンド／レセプター相互作用もしくはリガンド／シグナル伝達蛋白質相互作用上の効果に関して、精製されたレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはその結合断片を使用した無細胞系においても選別され得る、または代謝変化を評価する能力をも提供するミセルなどの再構成系を使用した無細胞系においても選別され得る。
【００２６】
更に別の態様において、本発明は、生物学的サンプルにおける哺乳類ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の存在を決定し得る診断の方法に関する。例えば、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、免疫複合体形成を助長する条件下でサンプルとインキュベーションされ、そして該複合体が検出されるが、これは典型的には酵素、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｒ）、粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）、または二次標識抗体などの標識手段により検出される。従って、前記手段は、検査されるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質に関する卵巣または精巣組織を含む組織の免疫化学染色に使用される。
【００２７】
蛋白質レベルでの配列類似性およびステロール結合ドメインの共通の存在に基づくと、本発明のレセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質は、最近　Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４０（１９９９），２２０４に公開されたオキシ・ステロール結合蛋白質（以後はＯＳＰＢと称する）の新規のスーパーファミリーに属するといえる。何れの性（ｇｅｎｄｅｒ）の配偶子成熟または如何なる減数分裂プロセスにおけるどのような機能も、このＯＳＰＢファミリーに帰属するとされたことはない。
【００２８】
【配列の簡単な説明】
配列番号１および配列番号３は、２つのマウス　ＭＡＳレセプターまたはシグナル伝達ペプチド（それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称する）のｃＤＮＡのヌクレオチドであり、それぞれ配列番号２および配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有している。配列番号５および配列番号７は、２つのヒト　ＭＡＳレセプターまたはシグナル伝達ペプチド（それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称する）のｃＤＮＡのヌクレオチドであり、それぞれ配列番号６および配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有している。配列番号９から１４は、実施例５中で言及されたヌクレオチドである。
【００２９】
【好適な態様の記載】
本発明は、単離したＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を提供することによる、ＭＡＳレセプター／リガンド相互作用またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質／リガンド相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する手段を提示するものである。「ＭＡＳレセプター」という用語は、天然のＭＡＳレセプター、または天然のＭＡＳレセプターに固有の多くの構造的および機能的特長を共有するレセプターの何れかに由来する任意の蛋白質を意味する。かかるレセプターは、類似の機能を有する蛋白質を産するように天然のレセプターの領域が削除もしくは置換された際に生じ得る。相同配列、対立遺伝子多型、および自然突然変異体（ｎａｔｕｒａｌｍｕｔａｎｔｓ）；誘導された点（ｐｏｉｎｔ）、欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、および挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）突然変異体；或いは、発現した変種（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｖａｒｉａｎｔｓ）；天然のＭＡＳレセプターをコードする核酸と高もしくは低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる蛋白質；天然の物質から回収された蛋白質；並びにＭＡＳレセプター蛋白質に対する抗血清により回収された密接に関連する蛋白質；も含まれる。同様に、このことはＭＡＳシグナル伝達蛋白質においても適用される。
【００３０】
ＭＡＳレセプター「リガンド」は、ＭＡＳレセプターのリガンド結合ドメイン、ＭＡＳレセプター類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）、またはキメラＭＡＳレセプターにより結合される能力を有する分子を意味し、このことは米国特許明細書番号４，８５９，６０９（本明細書中に引用により援用される）に一般的に記載される。前記分子は化学的に合成し得る、または天然に生じたものであってもよい。リガンドは、アゴニストおよびアンタゴニストにグループ分けできる。アゴニストは、レセプターへのそれらの結合が細胞内の応答経路を誘導する分子である。アンタゴニストは、レセプターへのそれらの結合が細胞内の応答経路をブロックする分子である。
【００３１】
「単離された」ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、哺乳類卵母細胞などのその生来の環境以外に存在するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を言及することを意味しており、例えば、本明細書中で以下に定義されるような実質的に純粋なＭＡＳレセプターを含んでいる。より一般的には、「単離された」は、細胞もしくは他の系の異種構成物としてＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を含むことを意味する。例えば、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた細胞により発現され、該細胞から分離され、そして他の選択されたレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を含有するミセルに添加される。いくつかの事例において、ＭＡＳレセプターという用語は、ＭＡＳレセプターおよびＭＡＳシグナル伝達蛋白質の双方の範囲におよぶ用語である。
【００３２】
精製されたＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）の純度を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を意味する。
【００３３】
ヒトＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂは、それぞれクローンＮＴ２ＲＰ２０００４４８およびＮＴ２ＲＭ２００１６３２である。
【００３４】
本発明のＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を定義する同様の方式は、様々なＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のアミノ酸配列間の類似性によるものであり、配列番号２のアミノ酸配列と比較した際には少なくとも約９０％、好ましくは約９５％である。アミノ酸配列類似性の別の表現は、ホモロジーである。ヌクレオチドレベルでの様々なＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のヌクレオチド間の類似性は、配列番号１のヌクレオチドと比較した際に少なくとも約８０％、好ましくは約９０％である。
【００３５】
「高ストリンジェンシー」条件という用語は、標識プローブ、即ち、配列番号１もしくは配列番号３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、数％、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満（もし存在するのであれば）のミスマッチ塩基を含有する試験されるポリヌクレオチド配列と、高い特異性でハイブリダイズする条件を意味する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）に記載されている。
【００３６】
２００塩基以上のポリヌクレオチドの形態のプローブの場合、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、プローブと、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む膜を、６ｘＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、５０ μｇ／ｍｌサケＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），および２ｘ１０^６ｃｐｍ／ｍｌの放射標識プローブを含有する緩衝液中でインキュベーションすることにより達成される。インキュベーションは、６８ ℃で振盪または回転し、少なくとも２時間、典型的には一晩である。そして膜を、２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中４２ ℃で３０分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６８℃で３０分間洗浄し、そして０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄し、そして最後に０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６８℃で３０分間洗浄する。膜をＸ線フィルムに暴露する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプローブ（長さ２５〜２００塩基）の場合、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８），１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０），５ｘデンハルト溶液，１００ μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，１００ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸，および１８０ μＭの放射標識オリゴヌクレオチド（５ｘ１０^５から１．５ｘ１０^６ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する溶液中で実行される。前記ハイブリダイゼーション温度は、プローブの長さに依存して変化する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記、１１章）は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを生じる条件をいかに計算して、実験的に検証するかを記載している。ハイブリダイゼーションはＴｍより５〜１０ ℃低い温度で、およびハイブリダイゼーション後の洗浄はＴｍの５℃低い温度で実施され、Ｔｍは、次のように計算される、
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（Ｌｏｇ_１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）− （６００／Ｎ）（式中のＮ＝鎖長）。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、振盪または回転して一晩実施される。そして膜を２ｘＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳで室温、１５分間で２回洗浄し、そして０．２ｘＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳでプローブのＴｍの５℃低い温度で６０分間洗浄する。膜をＸ線フィルムに暴露する。
【００３９】
ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の親和定数（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｎｓｔａｎｔ）を決定する手段の１つは、以下の実施例３に記載した試験によるものである。特定のＭＡＳレセプターにＦＦ−ＭＡＳが結合するかどうかを決定する手段の１つは、以下の実施例４に記載される試験によるものである。以下の実施例３に記載される試験は、特定の蛋白質がＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質であるかどうか、或いは他の言葉で表現すると、特定の蛋白質が本願の特許請求の範囲の請求項において特定されるＳＡＭ１ａの類似体であるかどうかを決定することに使用できる。このような背景において、用語「類似体」は、天然の変種（他の動物種、例えば、ヒト，サル，マウスまたはラットにおいて発現されるものを含む）であって、ＭＡＳレセプターまたは「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」（即ち、前記変種をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾した生来のＭＡＳレセプターに由来するポリペプチド）の天然の変種を示すことを意図しており、前記変種は生来のアミノ酸配列のＣ−およびＮ−末端の何れか若しくはその双方における１以上のアミノ酸の付加；生来のアミノ酸配列における１以上の部位での１以上のアミノ酸の置換；生来の配列の何れか若しくはその双方の末端での、または生来の配列内の１以上の部位での、１以上のアミノ酸の削除；或いは生来の配列における１以上のアミノ酸の挿入；を生じている。
【００４０】
別の側面において、本発明は、ＭＡＳレセプター／リガンド相互作用もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質／リガンド相互作用を制御する手段を提供するものである。このような手段によって治療的および／または予防的にＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質またはそのリガンド（ＦＦ−ＭＡＳなどの）に直接的または間接的に関連する疾患を治療するものである。本発明のレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を取得することにより、アゴニストまたはアンタゴニストを同定でき、それらはリガンドと、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質との相互作用をそれぞれ刺激または阻害するものである。アゴニストまたはアンタゴニストの何れかによって、レセプターまたはシグナル伝達蛋白質を発現する細胞の代謝および反応性が制御される。このような様式で不妊症を治療するための、または避妊法の新規原理を達成するための減数分裂を制御する手段を提供する。
【００４１】
従って、本発明は、リガンド／ＭＡＳレセプターもしくはリガンド／ＭＡＳシグナル伝達蛋白質相互作用により媒介される現象のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング処理を提供する。かかるスクリーニングアッセイは、広く多様な形式を採用できるものであり、リガンドの側にある程度依存して、レセプターまたはシグナル伝達蛋白質相互作用が標的とされるものである。例えば、かかるアッセイは、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と結合する化合物を同定するために設計し得るものであり、それによってレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の相互作用をブロックまたは阻害し、それによってレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質とリガンドとの相互作用をブロックまたは阻害する。他のアッセイは、リガンドを代替できる化合物（従って、ＭＡＳレセプター媒介の、またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質媒介の細胞内経路を刺激できる）を同定するため設計される。更に他のアッセイは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質とＦＦ−ＭＡＳとの会合を阻害または促進し、これによりＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質リガンドに関する細胞応答を左右する化合物を同定するために使用できる。
【００４２】
１つの機能的なスクリーニングアッセイにおいて、受精活性化現象の開始が、例えばＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするｍＲＮＡを注射した卵においてモニターされる。そして次に適切なリガンドと共に、または別々に、スクリーニングする選択化合物に暴露される。一般的な事柄はＫｌｉｎｅ等〔Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８），４６４−４６７、本明細書中に引用により援用される〕を参照のこと。
【００４３】
前記スクリーニング処理は、例えばレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合し、そしてリガンドとの相互作用に実質的に影響する抗体などの試薬を同定するために使用できる。前記抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルであってもよく、精製した抗血清もしくはモノクローナル抗体またはそれらの混合物などの抗血清もしくは単一特異的抗体の形態である。例えば、インビボ診断もしくはイメージングのための組成物の構成物としてヒトに投与するために、前記抗体は、好ましくは免疫原性を最小化するため実質的にヒトであり、実質的に純粋な形態で存在する。実質的にヒトとは、一般的にヒトにおいて免疫原性を最小化するため少なくとも約７０％ヒト抗体配列、好ましくは少なくとも約８０％ヒト、最も好ましくは少なくとも約９０〜９５％以上のヒト抗体配列を含有することを意味する。
【００４４】
ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と結合する抗体は、様々な手段で産生し得る。非ヒト抗血清もしくはモノクローナル抗体〔例えば、マウス、ウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、馬（ｅｑｕｉｎｅ）など〕の生産は公知であり、例えばレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質分子またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質分子の目的の一部分を含む調製物（リガンド結合に寄与するドメインもしくはドメイン群など）で動物を免疫することで達成し得る。モノクローナル抗体の産生のために、免疫動物から得られた抗体産生細胞が、不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｅｄ）され、選別されるか、或いはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と結合する抗体の産生について最初に選別され、そして不死化される。ヒトＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生は通常の方法では困難であろうことから、実質的ヒト分子を産生するために非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２もしくは超可変領域）を、ヒト定常領域（Ｆｃ）またはフレームワーク領域に、組換えＤＮＡ技術によって移行することが望ましいだろう。かかる方法は当該技術分野において既知であり、例えば米国特許明細書番号４，８１６，３９７，およびヨーロッパ特許公開番号１７３，４９４および２３９，４００に記載されており、これらの文献は引用によって本明細書内に援用される。或いは、ヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりヒトレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその部分をコードするＤＮＡ配列を単離でき、この処理はＨｕｓｅ等〔Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６（１９８９），１２７５−１２８１、本明細書内に引用により援用される〕により要約された一般的なプロトコールに従って実施することができ、そして望ましい特異性を有する抗体（もしくは結合断片）をコードする配列をクローニングおよび増幅する。
【００４５】
他の態様において、本発明は、インビトロでレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を発現する細胞により実施するスクリーニングアッセイを提供する。例えば、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれらの選択部分をコードするＤＮＡは、当該技術において既知の処理（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと、この文献は本明細書中に引用により援用される）を使用して樹立細胞株（例えば、ＢＨＫおよびＣＨＯなどの哺乳類細胞株）にトランスフェクションされる。そしてレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が培養細胞により発現され、細胞において適切なリガンド（ＦＦ−ＭＡＳまたは他のＭＡＳ化合物など）と別々または一緒に選択された薬剤が、その望まれる効果に関して選別される。レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれらの部分をコードしている配列を増幅するために用いられる核酸配列を増幅する手段は、米国特許明細書番号４，６８３，１９５および４，６８３，２０２（本明細書中に引用により援用される）に記載されている。
【００４６】
更に別の側面において、本発明により提供されるスクリーニングアッセイは、ＭＡＳレセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質をコードする、または前記レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の選択部分（例えば、リガンドと結合する）をコードするヌクレオチド配列を含有する生殖細胞および体細胞を有するトランスジェニック哺乳類に関する。なお更なる一側面において、本発明により提供されるスクリーニングアッセイは、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするヌクレオチド配列が特定のＭＡＳシグナル伝達機能の表現型上の欠損を呈するノックアウト動物を産するために分子ターゲティングされるトランスジェニック哺乳類に関する。好ましくは、分子ノックアウトは、生殖組織（卵巣または精巣）に組織特異的であり、発生において時間的に制御される〔従って、誘導可能（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）である〕。例えば、ヒトＭＡＳレセプターをコードする配列を非ヒト哺乳類胚、或いはノックアウトに導入し得るいくつかの手段が存在し、それらのいくつかは、例えば米国特許明細書番号４，７３６，８６６、Ｊａｅｎｉｓｃｈ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１４６８−１４７４（１９８８）〕およびＷｅｓｔｐｈａｌ等〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５：１８１−１９６（１９８９）〕に記載され、これら文献は本明細書中に引用により援用される。そして動物細胞は、前記レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を発現し、従って選択したアゴニストもしくはアンタゴニストを試験および選別するための便利なモデルとして使用できる。
【００４７】
別の側面において、本発明は診断方法および組成物に関連する。ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質分子およびそれらに対する抗体を備える手段によって、多様な診断アッセイが提供される。例えば、抗体（ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対するモノクローナル抗体を含む）によって、検査を行う特定個体中の選択された細胞もしくは組織または培養物におけるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の存在および／または濃度を決定し得る。これらのアッセイは、例えば男性不妊症、女性不妊症などの疾患の診断および／または治療に使用できる、または双方の性別における避妊法の手段に使用できる。
【００４８】
多くのタイプの免疫アッセイが、利用可能であり、当業者に既知であり、これには、例えば競争的アッセイ、サンドイッチアッセイなどがあり、例えば、米国特許明細書番号４，６４２，２８５；４，３７６，１１０；４，０１６，０４３；３，８７９，２６２；３，８５２，１５７；３，８５０，７５２；３，８３９，１５３；３，７９１，９３２；並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）〕などに一般に記載されており、各々は本明細書中に引用により援用される。１つのアッセイ形式において、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、標識抗体を使用することによって、好ましくは脳組織、例えば卵巣もしくは精巣組織、卵母細胞調製物、または精液サンプルと反応するモノクローナル抗体を使用することによって、そしてそれらへの特異的な結合を決定することによって同定および／または定量され、前記アッセイは典型的には免疫複合体形成を促進する条件下で実行される。非標識一次抗体は、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を検出する一次抗体と反応する標識と組み合わせて使用できる。例えば、一次抗体は、一次抗体を特異的に検出するために作成された標識二次抗体により間接的に検出されてもよい。或いは、抗ＭＡＳレセプター抗体またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質抗体は、直接標識できる。広範囲の多様な標識が用いられ、それには放射性核種、粒子（例えば、金、フェリチン、磁気粒子、赤血球）、蛍光団（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｒｅｓ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、およびリガンド（特にハプテン）などがある。
【００４９】
ＭＡＳレセプターＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＲＮＡは、ＭＡＳレセプターＲＮＡまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質ＲＮＡを標的とする標識合成オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダゼーション処理により細胞中で直接検出し得る。また、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），４８７，および米国特許明細書番号４，６８３，１９５，各々の文献は本明細書中に引用により援用される）をＤＮＡ配列を増幅するために使用でき、これは次にアガロースゲル上のそれらの特徴的サイズ、ＭＡＳレセプターＤＮＡもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブを使用したそれらのゲルのサザンブロット、或いは類似プローブを使用したドットプロットを元に検出される。前記プローブは、約１４ヌクレオチドから約２５以上のヌクレオチド、好ましくは４０から６０ヌクレオチドを含んでもよく、そしていくつかの事例においてはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の大部分またはｃＤＮＡ全体が使用されてもよい。前記プローブは、酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光団、化学発光体、および常磁性体粒子などの検出可能なシグナルで標識される。ハイブリダイゼーションに関連する高ストリンジェンシーは、適切な温度および塩濃度を使用して取得される。
【００５０】
レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれに対する抗体の存在の検出において、本発明の課題のレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質との共に使用するキットも提供される。従って、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体などの単一特異的抗体、またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の組成物が提供され、これらは通常はコンテナ中に凍結乾燥状態で存在するものである。そして単独か或いは例えばアンチ抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、標識、遺伝子プローブ、ポリメラーゼ連鎖反応プライマおよびポリメラーゼなどの付加的な試薬と共に梱包される状態の何れかの形態で提供される。
【００５１】
なおより具体的には、本発明は、単離および／または精製したポリヌクレオチド分子に関し、該ポリヌクレオチド分子は配列番号１または配列番号３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、且つこのポリヌクレオチドは、ａ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、またはｂ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインをコードする。このポリヌクレオチドは、ＲＮＡアンチセンス配列またはｃＤＮＡ配列であってもよい。このポリヌクレオチドは、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質活性を提示するポリペプチドをコードしてもよい。このポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）をコードし得る。前記ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３のヌクレオチドを有してもよい。
【００５２】
更に、本発明は、少なくとも１２ヌクレオチドのプローブに関し、該プローブはＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする核酸とハイブリダイズする能力がある。このプローブは、配列番号１もしくは配列番号３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、或いはその対立遺伝子バリアントおよび種バリアントを含んでいてもよい。これらはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズする能力を有している。このプローブは、長さで約４０から約６０のヌクレオチドを含んでもよい。
【００５３】
このプローブは、検出可能なシグナルを提供するために標識されていてもよい。このプローブは、配列番号１または配列番号３のヌクレオチドを含んでもよい。
【００５４】
更に、本発明は、ａ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、またはｂ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列であって、配列番号１もしくは配列番号３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡ構築物に関する。このＤＮＡ構築物は、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有してもよい。
【００５５】
更に、本発明は、配列番号１もしくは配列番号３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、このＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換もしくはトランスフェクトされた培養した酵母またはバクテリアに関し、このＤＮＡ配列はａ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質；またはｂ）ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインまたは膜貫通ドメイン；をコードする。この細胞株、酵母またはバクテリアは、内在性のＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現しなくてもよい。
【００５６】
本発明に従ってＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩を、単離および／または精製し得る。単離および／または精製した蛋白質（ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質）は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５７】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する単離した抗体に関する。この単離した抗体において、該抗体はモノクローナル抗体であってもよい。この単離した抗体は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質とＭＡＳの結合をブロックし得る。
【００５８】
更に、本発明は、本明細書中で言及したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【００５９】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対して親和性を有する化合物またはその塩の存在を検出するための方法であって、工程ａ）前記化合物と、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩とを接触させることと；および工程ｂ）前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する該化合物の親和性を測定することと、を含む方法に関する。このＭＡＳアンタゴニストの存在を検出するための方法は、工程ａ）ＭＡＳ（ＦＦ−ＭＡＳ）を含むＭＡＳアゴニストの存在下で、化合物を、種々の条件下において応答経路にカップルするＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質および前記経路を介した関連する応答に対する前記化合物の結合を許容する十分な時間暴露することと、並びに工程ｂ）ＭＡＳアゴニスト単独による応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と前記化合物との結合から生じる応答経路の刺激における減少を検出し、この結果からＭＡＳアンタゴニストの存在を決定することと、を含んでいてもよい。更に、ＭＡＳアゴニストの存在を検出するための方法は、工程ａ）ＭＡＳアンタゴニスト存在下で、化合物を、種々の条件下において応答経路にカップルするＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質および前記経路を介した関連する応答に対する前記化合物の結合を許容する十分な時間暴露することと、並びに工程ｂ）ＭＡＳアンタゴニスト単独による応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と前記化合物との結合から生じる応答経路の刺激の増加を検出し、この結果からＭＡＳアゴニストの存在を決定することと、を含んでいてもよい。
【００６０】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達ペプチドに対して親和性を有する化合物またはその塩に関するものであり、この化合物もしくは塩は、本明細書中に記載される方法により検出される。
【００６１】
更に、本発明は、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を産生するための方法に関し、この方法はａ）前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の発現をコードする配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で、形質転換またはトランスフェクションされた細胞、酵母もしくはバクテリアを生育させることと、並びにｂ）前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を、前記細胞から単離することと、を含んでいてもよい。この方法において、前記ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、免疫親和性精製によって、単離し得る。
【００６２】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対して親和性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするためのキットに関し、このキットはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩を含む。
【００６３】
或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号２に示されるアミノ酸、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含むものであると定義し得る。配列番号２に示されるアミノ酸、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６および８のアミノ酸と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号４に示されるアミノ酸、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいてもよい。配列番号４に示されるアミノ酸配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６に示される部分アミノ酸配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいてもよい。配列番号６に示される部分アミノ酸配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号８に示される部分アミノ酸配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいてもよい。配列番号８に示される部分アミノ酸配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。本発明によるＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、リガンドを検出する（例えば、結合アッセイによって、）のに適切な緩衝液中に存在する可溶性の精製された蛋白質であってもよい。リガンドを検出する（例えば、結合アッセイによって）のに適切な緩衝液中に存在する可溶性の精製された蛋白質であるＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。
【００６４】
更に、本発明は、本明細書中に記載されるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードしているＤＮＡ配列、またはその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードしているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物に関する。前記ＤＮＡ構築物は、本明細書中で定義されるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードしているＤＮＡ配列またはその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードするＤＮＡ配列を含み、配列番号５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。本発明のＤＮＡ構築物は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列またはその断片、或いは親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいてもよい。配列番号１に示されるＤＮＡ配列もしくはその断片、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいる本ＤＮＡ構築物は、配列番号５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。本発明によるＤＮＡ構築物は、配列番号５に示される部分ＤＮＡ配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいてもよい。配列番号５に示される部分ＤＮＡ配列、または親和定数１００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいる本ＤＮＡ構築物は、配列番号５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。
【００６５】
更に、本発明は、ＤＮＡ構築物に対して本願の特許請求の範囲に先に記載された請求項の何れか１項による挿入されたＤＮＡ構築物を保有する組換え型発現ベクターに関する。
【００６６】
更に、本発明は、本明細書中で定義される組換え型発現ベクターを含有する細胞に関する。この細胞は、そのゲノム内に統合されるＤＮＡ構築物（本明細書中で定義される）を含有していてもよい。この細胞は、真核細胞、特に昆虫または哺乳類細胞であってもよい。
【００６７】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストもしくはアンタゴニスト）をスクリーニングする方法に関する。該方法は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中で定義される）を、ＦＦ−ＭＡＳのアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＦＦ−ＭＡＳ、またはその類似体と、インキュベーションすることと；並びにＦＦ−ＭＡＳ、またはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する類似体の結合の任意の効果を検出することと、を含んでいる。或いは、ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニング方法は、ＦＦ−ＭＡＳまたはその類似体を、ＦＦ−ＭＡＳの活性のアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中に記載される）と、インキュベーションすることと；並びに前記レセプターとＦＦ−ＭＡＳまたは前記類似体の結合の任意の効果を検出することと；を含んでいてもよい。
【００６８】
更に、本発明は、ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストまたはアンタゴニストに関するスクリーニングのための、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中で定義される）の使用に関する。
【００６９】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の組織および／または器官特異的な変種を単離するためのＤＮＡ構築物（本明細書中で定義される）の使用に関する。
【００７０】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中に記載のとおりに単離される）の使用に関する。
【００７１】
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、本発明を限定するように理解されるものではない。
【００７２】
【実施例】
＜実施例１＞
《マウス卵母細胞へのホスホロチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｎａｔｅ）オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション》
２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（２０ヌクレオチド）をマイクロインジェクションに利用した：本明細書中でそれぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称するｃＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡのコザック配列（ｋｏｚａｋｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して相補的な５’−ＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴ−３’および５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＧ−３’、その双方が以下に示されるそれぞれ配列番号１および配列番号３において定義される。コントロール実験において、対応するセンス・オリゴヌクレオチドがマイクロインジェクションされた：それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂのｍＲＮＡに対して、５’−ＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’および５’−ＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣ− ＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’。ＳＡＭ１ａアンチセンスは、ＳＡＭ１ｂアンチセンスと共にコインジェクションされ、ストック溶液〔１．２５ μｇ／μｌの各ヌクレオチドを１０％ヒト血清アルブミン（以後ＨＳＡと称する）＋５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ値：７．５）中に含む〕から使用された。ＳＡＭ１ａセンスは、ＳＡＭ１ｂセンスと共にコインジェクションされ、ストック溶液〔１．２５ μｇ／μｌの各ヌクレオチドを１０％ＨＳＡ＋５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ値：７．５）中に含む〕から使用された。倒立型顕微鏡のステージ上の３５ｍｍペトリ皿中のミネラルオイル下のアルファ−ＭＥＭ（０．８％ＨＳＡおよび３ｍＭヒポキサンチンを添加した）の液滴中にロードされた個々の卵核胞（ＧＶ）−ステージ卵母細胞の細胞質中に、約１２ｐｇの各オリゴヌクレオチド（１０ｐｌ）をインジェクションした。前記卵母細胞を、Ｇｒｎｄａｈｌ等、１９９８〔Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８（１９９８），１２９７以下参照〕に記載のように卵胞刺激ホルモン（以後ＦＳＨと称する）で４８時間プライミングした２１−２４日齢マウスの卵巣から得た。卵母細胞を保持ピペット（１２０ μｍ外径および２０ μｍ内径）上に吸い込み、そしてインジェクションピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をプレッシャーマイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合させた。ピペットホルダーを、モータつきのマイクロマニピュレーター（ＬｕｉｇｓａｎｄＮｅｕｍａｎｎ，Ｒａｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に備え付けた圧電ポジショニングシステム〔ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ，ＮＹ，ＵＳＡ）〕に取り付けた。インジェクションピペットを、透明帯（ｚｏｎａｐｅｌｌｕｄｉｃａ）に対し押し込み、そして圧電パルスを与え、インジェクションピペットを２０ μｍ前方に移動した。この移動の間にピペットは、透明帯および卵細胞膜（ｏｏｌｅｍａ）を貫通し、そして卵母細胞細胞質中に約１０ μｌの容量を放出するため若干の圧力パルスを適用した。ヒポキサンチン含有培地への１０ μＭＦＦ−ＭＡＳの添加により惹起される減数分裂の再開前に、インジェクションした卵母細胞を、ＣＯ_２インキュベータ中に３７℃で２０時間静置した。ＦＦ−ＭＡＳの効果は、更なるインキュベーションの２４時間後、卵割胞崩壊（以後ＧＶＢＤと称する）した卵母細胞の数として評価された。アンチセンスオリゴヌクレオチドのインジェクションに続く２０時間の培養期間の理論的根拠は、ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ蛋白質をコードするｍＲＮＡの分解を可能とするためである。結果として、ＭＡＳレセプター蛋白質またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のレベルが卵母細胞内で減少する際に、ＭＡＳ応答が鈍くなる（１００％から５０％、下記の表を参照）。
【００７３】
【表１】

表１に示したように、コントロール（即ち、センスをインジェクションした卵母細胞および非インジェクション卵母細胞）と比較して、アンチセンスをインジェクションした卵母細胞において、ＧＶＢＤは５０％近く阻害された。この結果は、アンチセンス・プローブによるＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂをコードするｍＲＮＡの選択的阻害を示している。更に、これらの結果は、ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ蛋白質のＭＡＳシグナル伝達への関与が重要であること、またこれらの分子のデノボ蛋白質合成の機能的ノックアウトが卵母細胞でのＭＡＳシグナルを部分的に中断することからこの重要さが明らかであることを示している。
【００７４】
ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂは、卵母細胞のＭＡＳシグナル伝達に関して相補的な機能を保持する同一遺伝子に由来する２つの密接に関連する蛋白質である。
【００７５】
＜実施例２＞
《ＦＦ−ＭＡＳ結合アッセイ：》
１０ μｌの非標識ＦＦ−ＭＡＳ〔６．６％エタノール（ＥｔＯＨ）中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ〕を、１０μｌの２００ｎＭ　^３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ〔約１２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ；１．５ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセリン；１．０ｍＭ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ−１−プロパンスルホネート（以後ＣＨＡＰＳと称する、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）；１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）中に溶解〕と混合した。１０ μｇのＳＡＭ１ｂ蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに溶解した）を、４０μｌの最終容量になるように添加した。非特異的結合（Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇ）を３０ μＭ非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定し、全体結合（ｔｏｔａｌｂｉｎｄｉｎｇ）を６．６％ＥｔＯＨを含有するアッセイ緩衝液を添加することにより決定した。インキュベーションを４℃で２時間実行した。２％Ｃａｂ−ｏｓｉｌＭ−５（Ｆｌｕｋａのシリカゲル）および０．２％デキストランＴ７０（シグマ）を含有する２５０ μｌ氷冷アッセイ緩衝液を各チュウブに添加し、混合して、若干回転させた。Ｃａｂ−ｏｓｉｌＭ−５の添加の約５分後、チュウブを５分間１４０００ｒｐｍ（ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離した。２００μｌの上清を、マイクロシンチチュウブ（ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−ｔｕｂｅ）に移し、そして３．５ｍｌアトムライト〔ａｔｏｍｌｉｇｈｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）〕を添加した。チュウブを液体シンチレーションカウンタ中で測定した。得られた結果を図１に示す。「ＩＣ−５０」は、結合^３Ｈ　ＦＦ−ＭＡＳの５０％を置換する非標識ＦＦ−ＭＡＳの濃度である。
【００７６】
＜実施例３＞
《特定のポリヌクレオチドがＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質である蛋白質をコードするかどうかを決定するアッセイ：》
１０ μｌの非標識ＦＦ−ＭＡＳ（６．６％ＥｔＯＨ中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）が、１０ μｌの２００ｎＭ　^３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ〔約１２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ；１．５ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセリン；１．０ｍＭＣＨＡＰＳ；１％ＢＳＡ）中に溶解〕と混合される。試験される１０ μｇの特定の蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに希釈される）は、最終容量の４０μｌとなるように添加される。非特異的結合は、３０ μＭ非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定され、全体結合が６．６％ＥｔＯＨを含有する１０ μｌアッセイ緩衝液を添加することにより決定される。インキュベーションが、４℃で２時間実行される。２５０ μｌの氷冷アッセイ緩衝液（２％Ｃａｂ−ｏｓｉｌＭ−５および０．２％デキストランを含有する）が、各チュウブに添加され、混合され、そして若干回転される。Ｃａｂ−ｏｓｉｌＭ−５添加の約５分後、チュウブは５分間、１４０００ｒｐｍ（ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離される。２００ μｌの上清が、マイクロシンチチュウブに移され、そして３．５ｍｌアトムライトが添加される。チュウブは、液体シンチレーションカウンタ中で測定される。もし^３Ｈ　ＦＦ−ＭＡＳ結合が非標識ＦＦ−ＭＡＳにより置換されるならば、試験した蛋白質はＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質である。
【００７７】
＜実施例４＞
《特定の化合物がリガンドであるかどうかを決定するアッセイ：》
試験される１０ μｌの化合物（６．６％ＥｔＯＨ中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）が、１０ μｌの２００ｎＭ　^３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ〔約１２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ；１．５ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセリン；１．０ｍＭＣＨＡＰＳ；１％ＢＳＡ中に溶解）〕と混合される。１０ μｇのＳＡＭ１ａ蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに希釈される）が、最終容量の４０μｌとなるように添加される。非特異的結合が３０ μＭ非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定され、全体結合が６．６％ＥｔＯＨを含有する１０ μｌアッセイ緩衝液の添加により決定される。インキュベーションは、４℃で２時間実行される。２５０ μｌの氷冷アッセイ緩衝液（２％Ｃａｂ−ｏｓｉｌおよび０．２％デキストランを含有する）が、各チュウブに添加され、混合され、そして若干回転される。Ｃａｂ−ｏｓｉｌ添加の約５分後、チュウブは５分間、１４０００ｒｐｍ（ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離される。２００ μｌの上清が、マイクロシンチチュウブに移され、そして３．５ｍｌアトムライトが添加される。チュウブは液体シンチレーションカウンタ中で測定される。もし化合物が特異的ＦＦ−ＭＡＳ結合を置換できるならば、それはＭＡＳレセプターに対する、またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対するリガンドである。
【００７８】
＜実施例５＞
《ＳＡＭ１のクローニング》
ｃＤＮＡライブラリーを、２４日齢マウスの１０，０００卵母細胞から分離したｍＲＮＡから調製した。前記ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＳＰＯＲＴプラスミド・ベクター（ライフテクノロジー）中に構築した。クローンをアトランダムにとり、そして部分的にシークエンスし、配列をフレッド／フラップ　プログラム（ｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐｐｒｏｇｒａｍｓ）を使用して組み立てた。シークエンスした数千クローン中から、２つの配列による１配列アセンブリーがヒトのオキシ・ステロール結合蛋白質（ＯｘｙｓｔｅｒｏｌＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）と２１％アミノ酸同一性を示した。最長のクローンＭＯＣＹ２８６４が完全にシークエンスされ、データベース中で如何なる同一もしくはオルソロガスである遺伝子も発見できなかった。この新規遺伝子はＳＡＭ１と命名された。ＳＡＭ１　ｃＤＮＡの５’端の増幅は、卵母細胞ライブラリ上でｐＳＰＯＲＴに特異的なプライマ＃１７６９５９（配列番号９）およびＳＡＭ１に特異的なプライマ＃１９８２４１（配列番号１０）を使用したＰＣＲによって実行された。この結果は、２つの異なる５’端を有するｃＤＮＡの存在を示し、これらはＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと命名された。完全長ＰＣＲ増幅を、ＳＡＭ１ａに関してプライマ＃１９９７７２（配列番号１１）および＃１９８２３９（配列番号１２）、並びにＳＡＭ１ｂに関して＃２０１７９０（配列番号１３）および＃１９８２３９（配列番号１２）を使用してマウス卵母細胞ライブラリー上で実行した。それぞれＮｈｅｌおよびＮｏｔｌの認識部位が、前記プライマに導入された。ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭｂ　ｃＤＮＡｓを、ＮｈｅｌおよびＮｏｔｌ制限酵素で消化し、そしてｐｃＤＮＡ３．１＋（インビトロジェン）中にクローン化した。
【００７９】
Ｃ端ヒスチジンストレッチ（ニッケルカラムに対する親和性から精製に使用された）に融合したＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ蛋白質を発現させるＤＮＡ構築物を、以下のように作出した。ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ　ｃＤＮＡを、それぞれプライマ＃１９９７７２（配列番号１１）および＃２１１４６５（配列番号１４）並びにプライマ＃２０１７９０（配列番号１３）および＃２１１４６５（配列番号１４）を使用してＰＣＲ増幅した。それぞれＮｈｅｌおよびＸｍａｌの認識部位を、前記プライマに導入した。そして、ＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｈｅｌおよびＸｍａｌを用いてｐＢｌｕｅＢａｃ４，５Ｖ５ＨＩＳ（インビトロジェン）内にクローン化した。そして、この中間構築物を、ＳｍａｌおよびＢｓｔＢｌにより消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片を使用してフィルインさせ、そして再ライゲーションした。これらの構築物は、「ｐＢｌｕｅＢａｃ４，５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１ａ」および「ｐＢｌｕｅＢａｃ４，５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１ｂ」と命名された。
【００８０】
《Ｓｆ９細胞におけるＳＡＭ１発現》
ＳＡＭ１ａ−ＨＩＳおよびＳＡＭ１ｂ−ＨＩＳ蛋白質を、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ^ＴＭトランスフェクション　キット」マニュアル（インビトロジェン）にしたがって組換え型バキュロウイルスを使用してＳｆ９細胞中で発現した。
【００８１】
Ｓｆ９昆虫細胞を感染させるために、０．５ μｇ　Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ^ＴＭ　ＤＮＡおよび組換え型トランスファープラスミド「ｐＢｌｕｅＢａｃ４，５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１」（４ μｇ）を、１ｍｌグレースの昆虫培養液（Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉａ）および２０ μｌのインセクチンプラスリポソーム（ｌｎｓｅｃｔｉｎ−ＰｌｕｓＬｉｐｏｓｏｍｅｓ）で１５分間インキュベーションし、そして混合液を６０ｍｍ培養皿内で２ｘ１０^６　Ｓｆ９細胞に添加した。細胞を２７℃で揺動して９６時間放置した。ビラ（Ｖｉｒａ）を単離して、プラークアッセイを実行した。推測上の組換え型プラークを選別し、Ｐ−１ウイルスストックを作出した。組換え型ウイルスクローンのＰＣＲ分析を行い、そして陽性クローンから高タイターのウイルスストックを調製した。大規模にＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂを発現させるため、５００ｍｌ　Ｓｆ９細胞（２，０ｘ１０^６細胞／ｍｌ）を、それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂに関して２５ｍｌウイルス（１，８ｘ１０８プラーク形成単位／ｍｌ）または６０ｍｌウイルス（６ｘ１０^７　ｐｆｕ／ｍｌ）で感染させた。インキュベーションの７０時間後、細胞を遠心分離で沈殿させ、蛋白質を精製した。
【００８２】
【化１】

＜実施例６＞
《ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂの精製》
ＨＩＳ−ＳＡＭ１ａおよびＨＩＳ−ＳＡＭ１ｂの精製を、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル（ＱｌＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ　第４版）にしたがって実行した。
【００８３】
簡単に説明すると、ＳＦ９昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター内に６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ａまたは６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ｂの構築物を含有する）の細胞培養物を遠心分離し、沈殿物を、溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭＮａＣＩ，１０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８）およびリゾチームを添加し、溶解物を遠心分離で清澄化した後に氷上で６ｘ１０秒間ソニケーションして溶解させた。清澄化した溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン）の５０％スラリーと穏和な撹拌条件下でインキュベーションし（６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ａと結合させるために）、２回洗浄（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，３００ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８）し、高濃度のイミダゾール（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，３００ｍＭＮａＣｌ，２５０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８）で溶出した。精製した蛋白質の収量および純度を、クマシー（ブリリアントブルー、シグマ）染色した。ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓｇｅｌ，インビトロジェン）上で分析した。
【００８４】
【化２−１】

【００８５】
【化２−２】

【化３】

【００８６】
【化４−１】

【００８７】
【化４−２】

【化５】

［配列表］

【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＡＭ１ｂからの^３Ｈ−標識　ＦＦ−ＭＡＳの置換を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention hybridizes with a receptor or signaling protein of FF-MAS, a polynucleotide encoding a receptor or signaling protein of FF-MAS, or a nucleic acid encoding a receptor or signaling protein of FF-MAS. Probe, DNA construct containing sequence encoding FF-MAS receptor or signaling protein, cultured cell line whose DNA sequence encodes FF-MAS receptor or signaling protein, FF-MAS receptor or signaling protein , A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a FF-MAS receptor or signaling protein, and a FF-MAS receptor or signaling protein A method for detecting the presence of a compound having affinity relates.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Since the first IVF pregnancy was realized in 1978, this procedure has successfully completed thousands of pregnancies and pioneered many new areas of research and treatment of infertile couples. In addition, there are many demands for improving today's infertility treatment modalities. It is estimated that about one out of every seven couples will experience subfertility or infertility problems.
[0003]
Human oocyte IVF has become commonly used in the treatment of reduced fertility in women and men. Standard IVF treatment involves long-term hormonal stimulation of female patients. The aspirated oocytes are then fertilized in vitro and cultured. Constant efforts have been made to optimize and simplify this process. Nevertheless, overall pregnancy rates do not increase significantly by more than about 20% with current treatment modalities. In a large European study of IVF patients, 7.2 out of 11.5 aspirated oocytes per patient resulted in meiosis resumption just before fertilization and 4.3 eggs Only mother cells were fertilized, indicating that only 2.2 oocytes reached the 8-cell embryo stage after fertilization and in vitro culture (ESHRE, Edinburgh, 1997).
[0004]
Due to the very unpredictability of embryo quality according to the state of the art, two or more embryos must be transferred in order to have a reasonable chance of success. Therefore, it is common for a few embryos (up to 5 embryos in some countries) to be transferred, which results in multiple pregnancies with great inconvenience and risk to both patients and children. ) With very serious side effects. Furthermore, it has been speculated that the significant health care costs associated with multiple births (twins, triplets, etc.) exceed the overall IVF costs.
[0005]
Thus, current therapies have several disadvantages.
[0006]
In addition, the weight gain, bloating, nausea, vomiting, unstable mood and other persistent discomforts, as well as the discomfort of injecting the patient himself, are disadvantages. It has been reported.
[0007]
It is known from WO 96/00235 that certain sterol derivatives can be used to control meiosis. An example of such a sterol is 4,4-dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol (hereinafter FF-MAS).
[0008]
As such, it has now been determined that in vitro maturation of humans has been highly unsuccessful despite great interest and clinical effort.
[0009]
One approach to discovering compounds that control meiosis effectively is the use of related receptors.
[0010]
Receptors are defined as proteinaceous macromolecules that perform signaling functions upon ligand binding. Many receptors are located on the outer cell membrane, others are located intracellularly. A substance that binds to a receptor is called a ligand, and the term has a defined meaning only with respect to its mating receptor. The term "ligand" does not imply any particular molecular size or other structural or compositional property; the substance of concern is that the receptor conveys information about the presence of the ligand to the target molecule. A substance capable of binding, cleaving or interacting with the receptor as described above. As noted, not all substances capable of binding a particular receptor are ligands, but all ligands capable of binding a particular receptor. Receptors do not contain substances such as immunoglobulins.
[0011]
Receptors are believed to function by variously called activation or signaling processes. The ligand binds to the ligand binding domain in a manner that changes the conformation of the receptor molecule. This conformational change, called activation, modifies the effect of the receptor in the cytoplasmic part. Common to the changes induced by receptor activation are changes or development of receptor enzyme activity.
[0012]
Signaling proteins such as cAMP, IP3, kinases and phosphatases are proteins ubiquitously found in all tissues. These proteins cascade the stimuli from ligand / receptor interactions to downstream cellular events by various pathways, typically altering the enzymatic activity or functional state of the effector molecule. .
[0013]
In recent years, the pharmaceutical industry has adapted research to research that focuses on the role of the receptor in disease or injury, as well as the design of drugs (typically low molecular weight substances) capable of binding to the receptor. Was. Drugs identified in this initial screen are then tested for activity in vivo or against tissue explants. As a result, older technologies are not compatible with large-scale screening. Tissue samples or isolated cells (eg, ovarian tissue) containing the target receptor are expensive to obtain, only present in limited amounts, and difficult to maintain in a functionally viable state . Furthermore, it is sometimes difficult to reliably and reproducibly administer a candidate drug to a tissue sample. Screening assays using primary explants in tissue culture are performed on a larger scale than is possible with tissue samples. However, it is more difficult to assay physiological effects, and the assay is subject to interference from many sources of interference, such as culture media or culture conditions. Finally, assays using receptors isolated from natural sources have the disadvantage that the receptors are subject to natural variability and that suitable natural sources are not always available. One of the problems of the present invention is to provide an easily reproducible and simple assay system, which not only binds ligands but also binds such as agonistic or antagonistic. It can be implemented on a large scale to determine properties as well.
[0014]
Similarly, a meaningful clinical diagnosis is often based on the inactive form of a ligand (eg, a ligand that has been subjected to an enzymatic or other processing step that alters or even eliminates the activity of the ligand in the test sample). Relies on assays for biologically active ligands in the absence of interference. Immunoassays are widely used for measuring ligands in test samples. However, it is often very difficult to identify antibodies that can distinguish between the active and inactive forms of the ligand. Receptors are frequently used in place of antibodies as binding reagents for analytes. However, not all substances that bind to the receptor are capable of inducing receptor activity (ie, biologically active). One object of the present invention is to provide a method for identifying ligands in clinical test samples having activity in inducing or inhibiting signal transduction by their receptors.
[0015]
In transmitting stimuli from a ligand to a cellular phenomenon, cytoplasmic proteins can act as receptors or signaling molecules. Various receptor or signaling protein types utilize different pathways (eg, small G proteins, calcium entry, phosphatases, and lipases), all of which result in altered enzymatic activity or gene transcription.
[0016]
Meiosis-activating sterols (hereinafter referred to as MAS) constitute the first identified active signaling molecules in follicular fluid and bull testicular tissue. Said sterols are described by Byskov 1995 and Grondahl et al. (Biol. Reprod. 58 (1998), 1297 et seq.) As potent activators of the meiotic process and are also described in WO 96/00235, 96/27658, 97 / 00884,98. / 28323, 98/54965 and 98/55498, and more particularly as set forth in their claims. No receptor or signaling protein that directly or indirectly transmits the meiotic effects of MAS sterols has been described previously. Prior to the present invention, the presence of one having the properties of a putative MAS receptor protein or signaling protein had not previously been identified, but its presence has been suggested [eg, Grondahl et al. (Biol. Reprod. 62 (2000), 775 et seq.).
[0017]
The nucleotide and amino acid sequence of clone NT2RM2001632 was published as accession number AK022554 on September 29, 2000, and the nucleotide and amino acid sequence of clone NT2RP200488 was submitted as accession number AK027535 on May 10, 2001. No utility or action was mentioned for those clones.
[0018]
There is a great need for isolated and purified MAS receptors or MAS signaling proteins, as well as for systems capable of expressing MAS receptors or MAS signaling proteins independent of other receptors. It would be further desirable to specifically identify the presence of a MAS receptor or MAS signaling protein in cells and tissues, thereby avoiding time consuming, complex and non-specific functional pharmacology assays. it can. With respect to the use of anti-fertility or contraceptive drugs, it would be desirable to select and develop novel agonists and / or antagonists specific for the MAS receptor or MAS signaling protein, but at present it is Is not possible. Indeed, surprisingly, the present invention fulfills these and other related needs.
[0019]
Summary of the Invention
The present invention now provides the nucleotide sequence of a receptor or signaling protein for meiotic acting sterols (MAS). The present invention provides isolated and substantially pure MAS receptors or MAS signaling proteins and fragments thereof. These receptors or signaling proteins may be involved in the gamete maturation process induced by 3β-hydroxy-4,4-dimethylcholest-8,14,24-triene (hereinafter FF-MAS). And specifically induced germinal vesicle breakdown (hereinafter referred to as GVB) specifically induced upon ligand activation in mouse oocytes cultured in vitro. Thus, the MAS receptor or MAS signaling protein is defined as a proteinaceous macromolecule that performs a signal transduction function upon binding to FF-MAS. Briefly, MAS receptors or MAS signaling proteins bind to FF-MAS. Stated another way, a MAS signaling protein can be designated as a MAS binding protein.
[0020]
The MAS receptor may be FF-MAS or another endogenous meiotic activating sterol [eg, 3β-hydroxycholest-8,14-diene; 3β-hydroxy-4,4dimethylcholest-8,24-diene. And 3β-hydroxycholest-8, 24-diene, or a metabolite thereof (as a ligand)], and any protein related to the protein SAM1a or SAM1b having the same functional characteristics. . Functional features include binding in oocytes, receptor activation, and subsequent germinal vesicle breakdown (GVB). The amino acid sequences of SAM1a and SAM1b are set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 below.
[0021]
The MAS receptor can be used to discover fertility and antifertility compounds that can be used in men and women.
[0022]
Providing such a receptor or signaling protein in isolated or purified form, the present invention also provides antibodies to the MAS receptor or signaling protein in the form of antisera and / or monoclonal antibodies.
[0023]
In another aspect, the invention provides the ability to produce MAS receptors or MAS signaling proteins and polypeptides or fragments thereof by recombinant means. The expressed MAS receptor or signaling protein or fragment may or may not have the biological activity of the native receptor or signaling protein. Consequently, an isolated and purified polynucleotide is described, which encodes a receptor or signaling protein and a fragment thereof, said polynucleotide being present in the form of DNA (such as cDNA) or RNA. Is also good. Probes based on these sequences can be used to hybridize and identify genes encoding MAS receptors or MAS signaling proteins and their related genes. The probe may be as small as a full length cDNA or 14 to 25 nucleotides, and more often from about 40 to about 50 or more nucleotides.
[0024]
In a related aspect, the invention relates to a DNA sequence that encodes a transcriptional promoter, a receptor or signaling protein or fragment, and a DNA construct comprising a transcription terminator, each operable for expression of the receptor or signaling protein. Related to each other. For expression, the construct may also include at least one signal sequence. Further, the expressed receptor or signaling protein for large-scale production may be separated from the cells, for example, by immunoaffinity purification.
[0025]
Cells or bacteria that express the MAS receptor or MAS signaling protein can also be used to identify compounds that alter the metabolism of cells mediated by the receptor or signaling protein. The compounds may be screened for binding to the receptor or signaling protein and / or for effects on receptor or signaling protein-mediated changes in host cell metabolism. Agonists and / or antagonists of the MAS receptor or MAS signaling protein may be used in a cell-free manner using a purified receptor or signaling protein or binding fragment thereof with respect to ligand / receptor interaction or effect on ligand / signaling protein interaction. It can also be screened in systems or in cell-free systems using reconstituted systems such as micelles that also provide the ability to assess metabolic changes.
[0026]
In yet another aspect, the invention relates to a diagnostic method that can determine the presence of a mammalian MAS receptor or MAS signaling protein in a biological sample. For example, a monospecific antibody that specifically binds to a receptor or signaling protein is incubated with the sample under conditions that promote immune complex formation, and the complex is detected, Typically, it is detected by a labeling means such as an enzyme, a fluorophore, a radionuclide, a chemiluminiscer, a particle, or a secondary labeled antibody. Accordingly, said means is used for immunochemical staining of tissues, including ovarian or testis tissue, for the receptor or signaling protein to be tested.
[0027]
Based on sequence similarity at the protein level and the common presence of sterol binding domains, the receptor or signaling proteins of the present invention have recently been described in Lipid. Res. 40 (1999), 2204, belonging to a novel superfamily of oxysterol binding proteins (hereinafter referred to as OSPB). No function in gamete maturation of any gender or in any meiotic process has been assigned to this OSPB family.
[0028]
[Brief explanation of array]
SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 are the nucleotides of the cDNA for two mouse MAS receptors or signaling peptides (designated SAM1a and SAM1b, respectively) and have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively. are doing. SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 are the nucleotides of the cDNA of two human MAS receptors or signaling peptides (designated SAM1a and SAM1b, respectively) and have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8, respectively. are doing. SEQ ID NOs: 9 to 14 are the nucleotides mentioned in Example 5.
[0029]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
The present invention provides means for identifying agonists and antagonists of a MAS receptor / ligand interaction or a MAS signaling protein / ligand interaction by providing an isolated MAS receptor or MAS signaling protein. The term "MAS receptor" refers to any protein derived from either the native MAS receptor or a receptor that shares many of the structural and functional characteristics inherent in the native MAS receptor. Such receptors can occur when regions of the natural receptor have been deleted or substituted to yield a protein having a similar function. Homologous sequences, allelic variants, and natural mutants; point, deletion, and insertion mutants; or expressed variants; A protein encoded by DNA that hybridizes under high or low stringency conditions to a nucleic acid encoding a natural MAS receptor; a protein recovered from a natural substance; and closely related recovered by an antiserum to the MAS receptor protein Proteins that do. This also applies to MAS signaling proteins.
[0030]
MAS receptor “ligand” refers to a molecule capable of being bound by the ligand binding domain of a MAS receptor, a MAS receptor analog, or a chimeric MAS receptor, which is described in US Pat. No. 4,859, 609 (hereby incorporated by reference). The molecule may be chemically synthesized or naturally occurring. Ligands can be grouped into agonists and antagonists. Agonists are molecules whose binding to receptors induces an intracellular response pathway. Antagonists are molecules whose binding to the receptor blocks the intracellular response pathway.
[0031]
"Isolated" MAS receptor or MAS signaling protein is meant to refer to a MAS receptor or MAS signaling protein that is present outside its native environment, such as a mammalian oocyte, and is, for example, described herein. It includes a substantially pure MAS receptor as defined herein below. More generally, "isolated" means including the MAS receptor or MAS signaling protein as a heterologous component of a cell or other system. For example, a MAS receptor or MAS signaling protein is expressed by, separated from, cells transfected with a DNA construct encoding a MAS receptor or MAS signaling protein, and the other selected receptor or signaling protein. Is added to the micelle containing In some cases, the term MAS receptor is a term that extends to both MAS receptors and MAS signaling proteins.
[0032]
Purified MAS receptor or MAS signaling protein means a MAS receptor or MAS signaling protein having a purity of at least 50%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% (w / w).
[0033]
Human SAM1a and SAM1b are clones NT2RP200488 and NT2RM2001632, respectively.
[0034]
A similar manner of defining the MAS receptor or MAS signaling protein of the present invention is due to the similarity between the amino acid sequences of various MAS receptors or MAS signaling proteins and, when compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Is at least about 90%, preferably about 95%. Another expression of amino acid sequence similarity is homology. The similarity between nucleotides of various MAS receptors or MAS signaling proteins at the nucleotide level is at least about 80%, preferably about 90%, when compared to the nucleotides of SEQ ID NO: 1.
[0035]
The term "high stringency" conditions refers to labeled probes, ie, oligonucleotides or polynucleotides of 25 or more contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 that are several percent, preferably less than 10%, more preferably 5% A condition that hybridizes with high specificity to a polynucleotide sequence to be tested that contains fewer (if any) mismatched bases. High stringency hybridization conditions are described, for example, in Sambrook et al., 1989 ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[0036]
In the case of a probe in the form of a polynucleotide of 200 bases or more, high stringency hybridization is performed by combining the probe and a membrane containing target DNA or mRNA with 6 × SSC, 10% dextran sulfate, 1% SDS, 5 × Denhardt, 50 μg / ml salmon DNA (Stratagene), and 2 x 10 ⁶ This is achieved by incubation in a buffer containing cpm / ml of radiolabeled probe. Incubation is shaking or spinning at 68 ° C for at least 2 hours, typically overnight. The membrane is then washed in 2 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. for 30 minutes, then in 2 × SSC, 0.1% SDS at 68 ° C. for 30 minutes, and 0.2 × SSC, 0. Wash at 68 ° C. in 1% SDS and finally wash at 68 ° C. for 30 minutes in 0.1 × SSC, 0.1% SDS. The membrane is exposed to an X-ray film.
[0037]
For oligonucleotide or polynucleotide probes (25-200 bases in length), high stringency hybridization is performed using 6 × SSC, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.8), 1 mM EDTA (pH 8.0). , 5 × Denhardt's solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA, 100 mg / ml dextran sulfate, and 180 μM radiolabeled oligonucleotide (5 × 10 5 ⁵ From 1.5x10 ⁶ (cpm / pmole). The hybridization temperature varies depending on the length of the probe. Sambrook et al. (Supra, Chapter 11) describe how to calculate conditions that produce high stringency hybridization and verify experimentally. Hybridization is performed at 5-10 ° C below Tm, and post-hybridization washes are performed at 5 ° C below Tm, where Tm is calculated as:
Tm = 81.5-16.6 (Log ₁₀ [Na +]) +0.41 (% G + C)-(600 / N) (where N = chain length).
[0038]
Hybridization is performed overnight with shaking or rotation. The membrane is then washed twice with 2 × SSPE, 0.1% SDS at room temperature for 15 minutes, and then with 0.2 × SSPE, 0.1% SDS for 60 minutes at 5 ° C. below the Tm of the probe. The membrane is exposed to an X-ray film.
[0039]
One means for determining the affinity constant of a MAS receptor or MAS signaling protein is by the test described in Example 3 below. One means of determining whether FF-MAS binds to a particular MAS receptor is by the test described in Example 4 below. The test described in Example 3 below determines whether the particular protein is a MAS receptor or a MAS signaling protein, or in other words, if the particular protein is claimed in the claims of the present application. It can be used to determine if it is an analog of the identified SAM1a. In such a context, the term "analog" is a natural variant (including that expressed in other animal species, such as humans, monkeys, mice or rats), which is a MAS receptor or "derivative". ) "(Ie, a polypeptide derived from the native MAS receptor, wherein the DNA sequence encoding the variant is appropriately modified) is intended to indicate a natural variant. And addition of one or more amino acids at either or both of the N-termini; substitution of one or more amino acids at one or more sites in the native amino acid sequence; at either or both termini of the native sequence, Or deletion of one or more amino acids at one or more sites in the native sequence; or insertion of one or more amino acids in the native sequence The has occurred.
[0040]
In another aspect, the invention provides a means of controlling a MAS receptor / ligand interaction or a MAS signaling protein / ligand interaction. By such means, diseases associated directly or indirectly with the MAS receptor or MAS signaling protein or its ligand (such as FF-MAS) are treated therapeutically and / or prophylactically. By obtaining the receptor or signaling protein of the present invention, agonists or antagonists can be identified, which stimulate or inhibit the interaction of the ligand with the MAS receptor or MAS signaling protein, respectively. Either agonists or antagonists control the metabolism and responsiveness of cells that express the receptor or signaling protein. It provides a means of controlling meiosis to treat infertility in this manner or to achieve a new principle of contraception.
[0041]
Accordingly, the present invention provides a screening process for identifying agonists or antagonists of a phenomenon mediated by ligand / MAS receptor or ligand / MAS signaling protein interaction. Such screening assays can employ a wide variety of formats, and will depend, in part, on the ligand side, on receptor or signaling protein interaction. For example, such assays can be designed to identify compounds that bind to a receptor or signaling protein, thereby blocking or inhibiting the interaction of the receptor or signaling protein and thereby blocking the receptor or signaling protein. Blocks or inhibits the interaction between and ligand. Other assays are designed to identify compounds that can displace the ligand (and thus can stimulate MAS receptor-mediated or MAS signaling protein-mediated intracellular pathways). Still other assays can be used to identify compounds that inhibit or promote the association of MAS receptor or MAS signaling protein with FF-MAS, thereby affecting the cellular response for MAS receptor or MAS signaling protein ligand. .
[0042]
In one functional screening assay, the onset of the fertilization activation event is monitored, for example, in eggs injected with mRNA encoding the MAS receptor or MAS signaling protein. It is then exposed to the selected compound to be screened, either with the appropriate ligand or separately. For general information see Kline et al. [Science 241 (1988), 464-467, incorporated herein by reference].
[0043]
The screening process can be used, for example, to identify reagents, such as antibodies, that specifically bind to a receptor or signaling protein and substantially affect interaction with a ligand. The antibody may be monoclonal or polyclonal, and is in the form of an antiserum or a monospecific antibody, such as a purified antiserum or a monoclonal antibody or a mixture thereof. For example, for administration to humans as a component of a composition for in vivo diagnosis or imaging, the antibody is preferably substantially human, to minimize immunogenicity, and in substantially pure form. Exists. Substantially human generally means at least about 70% human antibody sequence, preferably at least about 80% human, and most preferably at least about 90-95% or more human antibody sequence to minimize immunogenicity in humans. It means containing.
[0044]
Antibodies that bind to a MAS receptor or a MAS signaling protein can be produced by various means. The production of non-human antisera or monoclonal antibodies (eg, mouse, lagomorpha, equine, etc.) is known and involves, for example, receptor or signaling protein molecules or portions of receptor or signaling protein molecules of interest. This can be achieved by immunizing an animal with a preparation that contains it (such as a domain or domains that contribute to ligand binding). For production of monoclonal antibodies, antibody-producing cells obtained from the immunized animal are immortalized and sorted, or first sorted for production of antibodies that bind to receptors or signaling proteins, and Immortalized. Since the production of human monoclonal antibodies against human MAS receptor or MAS signaling protein antigen would be difficult using conventional methods, the antigen binding region of a non-human antibody (eg, F (ab ′) ) ₂ Or hypervariable regions) into human constant regions (Fc) or framework regions by recombinant DNA technology. Such methods are known in the art and are described, for example, in U.S. Pat. No. 4,816,397 and European Patent Publication Nos. 173,494 and 239,400, which are hereby incorporated by reference. Will be used within. Alternatively, a human B cell DNA library can be screened to isolate a DNA sequence encoding a human monoclonal antibody or a portion thereof that specifically binds to a human receptor or signaling protein, and this treatment can be performed by Huse et al. [Science 246]. (1989), 1275-1281, which is incorporated herein by reference], and which encodes an antibody (or binding fragment) having the desired specificity. Is cloned and amplified.
[0045]
In another aspect, the invention provides screening assays performed in vitro with cells that express the receptor or signaling protein. For example, DNA encoding a receptor or signaling protein or a selected portion thereof can be prepared using techniques known in the art (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2). ^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.W. Y. , 1989, which is incorporated herein by reference, is used to transfect established cell lines (eg, mammalian cell lines such as BHK and CHO). The receptor or signaling protein is then expressed by the cultured cells, and the agents selected separately or together with the appropriate ligand (such as FF-MAS or other MAS compound) in the cells are selected for their desired effect. Means for amplifying a nucleic acid sequence used to amplify a sequence encoding a receptor or signaling protein or portion thereof are described in U.S. Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202 (herein incorporated by reference). Which is incorporated herein by reference).
[0046]
In yet another aspect, a screening assay provided by the invention comprises a nucleotide sequence encoding a MAS receptor protein or signaling protein, or encoding a selected portion of said receptor or signaling protein (eg, that binds a ligand). And transgenic mammals having germ cells and somatic cells containing In yet a further aspect, the screening assays provided by the present invention are for use in producing knockout animals in which the nucleotide sequence encoding the MAS receptor or MAS signaling protein exhibits a phenotypic defect in a particular MAS signaling function. Transgenic mammals that are molecularly targeted. Preferably, the molecular knockout is tissue-specific for the reproductive tissue (ovary or testis) and is temporally regulated in development [and thus is inducible]. For example, there are several means by which sequences encoding the human MAS receptor can be introduced into non-human mammalian embryos or knockouts, some of which are described, for example, in U.S. Pat. No. 4,736,866, Jaenisch [Science]. 240: 1468-1474 (1988)] and Westphal et al. [Annu. Rev .. Cell Biol. 5: 181-196 (1989)], which are incorporated herein by reference. Animal cells then express the receptor or signaling protein and can thus be used as a convenient model for testing and selecting for selected agonists or antagonists.
[0047]
In another aspect, the invention relates to diagnostic methods and compositions. A variety of diagnostic assays are provided by means of including the MAS receptor or MAS signaling protein molecule and antibodies thereto. For example, antibodies (including monoclonal antibodies to the MAS receptor or MAS signaling protein) determine the presence and / or concentration of the receptor or signaling protein in selected cells or tissues or cultures in the particular individual being tested. obtain. These assays can be used, for example, in the diagnosis and / or treatment of diseases such as male and female infertility, or can be used as a means of contraception in both genders.
[0048]
Many types of immunoassays are available and known to those of skill in the art, including, for example, competitive assays, sandwich assays, and the like, for example, US Pat. Nos. 4,642,285; 376,110; 4,016,043; 3,879,262; 3,852,157; 3,850,752; 3,839,153; 3,791,932; and Harlow and Lane [Antibodies, A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Publications, N.W. Y. (1988)], each of which is incorporated herein by reference. In one assay format, the MAS receptor or MAS signaling protein is preferably a monoclonal antibody that reacts with a brain tissue, such as ovarian or testis tissue, an oocyte preparation, or a semen sample, by using a labeled antibody. Identified and / or quantified by determining specific binding thereto, said assays typically being performed under conditions that promote immune complex formation. An unlabeled primary antibody can be used in combination with a label that reacts with the primary antibody to detect a receptor or a signaling protein. For example, the primary antibody may be detected indirectly by a labeled secondary antibody created to specifically detect the primary antibody. Alternatively, anti-MAS receptor antibodies or MAS signaling protein antibodies can be directly labeled. A wide variety of labels are used, including radionuclides, particles (eg, gold, ferritin, magnetic particles, red blood cells), fluorophores, chemiluminescers, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, Enzyme inhibitors, and ligands (especially haptens).
[0049]
MAS Receptor The RNA encoding the MAS signaling protein can be detected directly in cells by hybridization with a labeled synthetic oligonucleotide probe targeting the MAS receptor RNA or MAS signaling protein RNA. The polymerase chain reaction (Saiki et al., Science 239 (1988), 487, and U.S. Pat. No. 4,683,195, each of which is incorporated herein by reference) amplifies DNA sequences. Which can then be used to determine their characteristic size on agarose gels, Southern blots of those gels using MAS receptor DNA or MAS signaling protein DNA or oligonucleotide probes, or dot plots using similar probes. Is detected based on The probe may comprise from about 14 nucleotides to about 25 or more nucleotides, preferably 40 to 60 nucleotides, and in some cases the majority of the MAS receptor or MAS signaling protein or the entire cDNA may be used. Good. The probe is labeled with a detectable signal such as an enzyme, biotin, a radionuclide, a fluorophore, a chemiluminescer, and a paramagnetic particle. The high stringency associated with hybridization is obtained using the appropriate temperature and salt concentration.
[0050]
Also provided are kits for use with the receptor or signaling protein of the invention in detecting the presence of the receptor or signaling protein or antibody thereto. Accordingly, there is provided an antibody against the MAS receptor or MAS signaling protein, preferably a monospecific antibody such as a monoclonal antibody, or a composition of the receptor or signaling protein, which is usually present in a lyophilized state in the container. Things. It is then provided either alone or packaged with additional reagents such as, for example, anti-antibodies, labels, gene probes, polymerase chain reaction primers and polymerases.
[0051]
Still more particularly, the present invention relates to isolated and / or purified polynucleotide molecules, wherein the polynucleotide molecule comprises an oligonucleotide or polynucleotide of at least 25 contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a high stringency. And the polynucleotide encodes a) a MAS receptor or MAS signaling protein, or b) a ligand binding domain of a MAS receptor or MAS signaling protein. The polynucleotide may be an RNA antisense sequence or a cDNA sequence. The polynucleotide may encode a MAS receptor or a polypeptide that exhibits MAS signaling protein activity. The polynucleotide may encode a MAS receptor or a MAS signaling protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, which can bind to FF-MAS. The polynucleotide may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
[0052]
Furthermore, the present invention relates to a probe of at least 12 nucleotides, said probe being capable of hybridizing to a nucleic acid encoding a MAS receptor or a MAS signaling protein. The probe may comprise an oligonucleotide or polynucleotide of 25 or more contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or allelic and species variants thereof. These have the ability to specifically hybridize to a gene encoding a MAS receptor or a MAS signaling protein. The probe may include about 40 to about 60 nucleotides in length.
[0053]
The probe may be labeled to provide a detectable signal. The probe may include the nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
[0054]
Further, the present invention relates to a DNA sequence encoding a) a MAS receptor or a MAS signaling protein, or b) a DNA sequence encoding a ligand binding domain of a MAS receptor or a MAS signaling protein, wherein the DNA sequence comprises 25 or more contiguous sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. A DNA construct comprising a DNA sequence that hybridizes at high stringency with an oligonucleotide or polynucleotide of the identified nucleotide. The DNA construct may have a DNA sequence encoding a MAS receptor or a MAS signaling protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
[0055]
Furthermore, the present invention relates to a DNA sequence that hybridizes with high stringency to an oligonucleotide or polynucleotide of 25 or more consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and is transformed with a DNA construct containing this DNA sequence. Alternatively, for a transfected cultured yeast or bacterium, the DNA sequence encodes: a) a MAS receptor or MAS signaling protein; or b) a ligand binding domain or transmembrane domain of a MAS receptor or MAS signaling protein. The cell line, yeast or bacteria may not express the endogenous MAS receptor or MAS signaling protein.
[0056]
According to the invention, the MAS receptor or MAS signaling protein, its peptide fragments or its salts can be isolated and / or purified. The isolated and / or purified protein (MAS receptor or MAS signaling protein) may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
[0057]
Further, the present invention relates to an isolated antibody that specifically binds to a MAS receptor or a MAS signaling protein. In this isolated antibody, the antibody may be a monoclonal antibody. This isolated antibody can block the binding of MAS to the MAS receptor or MAS signaling protein.
[0058]
Furthermore, the present invention relates to hybridomas producing the monoclonal antibodies mentioned herein.
[0059]
Further, the present invention relates to a method for detecting the presence of a compound having an affinity for a MAS receptor or a MAS signaling protein or a salt thereof, comprising the steps: Contacting a protein, a peptide fragment thereof or a salt thereof; and step b) measuring the affinity of the compound for the MAS receptor or MAS signaling protein. Methods for detecting the presence of this MAS antagonist include the steps a) in the presence of a MAS agonist, including MAS (FF-MAS), by coupling a compound to a response pathway under various conditions to a MAS receptor or MAS signaling. Exposing the protein to the MAS receptor or MAS signaling protein and a relevant response through the pathway for a time sufficient to allow binding of the compound to the protein; and step b) comparing the MAS agonist alone to stimulation of the response pathway. Detecting a decrease in stimulation of a response pathway resulting from the binding of the compound to the MAS receptor or MAS signaling protein, and determining the presence of a MAS antagonist from the results. In addition, a method for detecting the presence of a MAS agonist comprises the steps of: a) in the presence of a MAS antagonist, converting the compound to a MAS receptor or MAS signaling protein that couples to a response pathway under various conditions; Exposing the compound to a signaling protein and a relevant response through the pathway for a time sufficient to allow binding of the compound, and step b) comparing the MAS receptor or MAS to the MAS antagonist alone, as compared to stimulating the response pathway. Detecting increased stimulation of a response pathway resulting from binding of said compound to a signaling protein and determining the presence of a MAS agonist from the results.
[0060]
Furthermore, the present invention relates to a compound having an affinity for a MAS receptor or a MAS signaling peptide or a salt thereof, and the compound or the salt is detected by the method described herein.
[0061]
The present invention further relates to a method for producing a MAS receptor or a MAS signaling protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, comprising the steps of: a) encoding the expression of said MAS receptor or MAS signaling protein; Growing a cell, yeast or bacterium transformed or transfected with a DNA construct comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and b) transforming said MAS receptor or MAS signaling protein into said cell And isolating from the compound. In this method, the MAS receptor or MAS signaling protein can be isolated by immunoaffinity purification.
[0062]
Furthermore, the present invention relates to a kit for screening a compound having an affinity for a MAS receptor or a MAS signal transduction protein or a salt thereof, and the kit comprises an MAS receptor or a MAS signal transduction protein, a peptide fragment or a salt thereof. Including.
[0063]
Alternatively, the MAS receptor or MAS signaling protein may be defined as comprising the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. A MAS receptor or MAS signaling protein comprising the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, It may be different from an amino acid. Alternatively, the MAS receptor or MAS signaling protein may comprise the amino acid set forth in SEQ ID NO: 4, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. The MAS receptor or MAS signaling protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and 8 It may be different from the amino acid sequence. Alternatively, the MAS receptor or MAS signaling protein may comprise the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. A MAS receptor or MAS signaling protein comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, comprises SEQ ID NO: 6 and 8 may be different. Alternatively, the MAS receptor or MAS signaling protein may comprise the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. . A MAS receptor or MAS signaling protein comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, comprises SEQ ID NO: 6 and 8 may be different. A MAS receptor or MAS signaling protein according to the present invention may be a soluble, purified protein present in a suitable buffer for detecting the ligand (eg, by a binding assay). The MAS receptor or MAS signaling protein, a soluble and purified protein present in a suitable buffer for detecting the ligand (eg, by a binding assay) differs from the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 6 and 8. Is also good.
[0064]
Furthermore, the present invention provides a DNA sequence encoding a MAS receptor or a MAS signaling protein described herein, or a DNA sequence encoding a functional analog thereof (binding to FF-MAS). And a DNA construct comprising: The DNA construct comprises a DNA sequence encoding a MAS receptor or a MAS signaling protein as defined herein or a DNA sequence encoding a functional analog thereof (binding to FF-MAS). It may differ from the nucleotides of numbers 5 and 7. The DNA construct of the present invention comprises the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, or a DNA sequence encoding a functional analog thereof that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. May be included. A DNA construct comprising the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, or a DNA sequence encoding a functional analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, , SEQ ID NOs: 5 and 7 may be different. The DNA construct according to the invention comprises a partial DNA sequence as shown in SEQ ID NO: 5, or a DNA sequence encoding a functional analogue thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. It may be. The DNA construct comprising the partial DNA sequence shown in SEQ ID NO: 5, or a DNA sequence encoding a functional analog thereof that binds FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, comprises It may differ from the nucleotides of numbers 5 and 7.
[0065]
Furthermore, the present invention relates to a recombinant expression vector carrying the inserted DNA construct according to any one of the claims set forth in the claims to the DNA construct.
[0066]
Furthermore, the present invention relates to a cell containing a recombinant expression vector as defined herein. The cell may contain a DNA construct (as defined herein) that is integrated into its genome. The cell may be a eukaryotic cell, especially an insect or mammalian cell.
[0067]
Furthermore, the present invention relates to a method of screening for a ligand for the MAS receptor (ie, an agonist or antagonist of FF-MAS activity). The method comprises combining a MAS receptor or MAS signaling protein (as defined herein) with a substance suspected of being an agonist or antagonist of FF-MAS, and then FF-MAS, or an analog thereof. And incubating; and detecting any effects of binding of the FF-MAS or analog to the MAS receptor or MAS signaling protein. Alternatively, a method for screening for a ligand to the MAS receptor (i.e., an agonist or antagonist of FF-MAS activity) comprises the steps of: FF-MAS or an analog thereof, with a substance suspected to be an agonist or antagonist of FF-MAS activity; And then incubating with a MAS receptor or MAS signaling protein (as described herein); and detecting any effects of binding of the FF-MAS or the analog to the receptor; May be included.
[0068]
Further, the invention relates to the use of a MAS receptor or a MAS signaling protein (as defined herein) for screening for agonists or antagonists of FF-MAS activity.
[0069]
Furthermore, the invention relates to the use of a DNA construct (as defined herein) for isolating a tissue and / or organ specific variant of a MAS receptor or MAS signaling protein.
[0070]
Furthermore, the present invention relates to the use of a MAS receptor or a MAS signaling protein (isolated as described herein).
[0071]
The following examples are provided by way of illustration and are not to be understood as limiting the invention.
[0072]
【Example】
<Example 1>
<< Microinjection of phosphorothionate oligonucleotide into mouse oocytes >>
Two antisense oligonucleotides (20 nucleotides) were utilized for microinjection: 5 'complementary to the kozak sequence of the mRNA encoded by the cDNA sequences referred to herein as SAM1a and SAM1b, respectively. -TCCACGATGGGAGCCATCTT-3 'and 5'-GCCAGCAGGAGAGCCATTCG-3', both of which are defined in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively, shown below. In control experiments, the corresponding sense oligonucleotides were microinjected: 5'-AAGATGGCGTCCATCGTGGA-3 'and 5'-CGAATGGCTCTC-CTGCTGGC-3' for SAM1a and SAM1b mRNA, respectively. SAM1a antisense was coinjected with SAM1b antisense and stock solution [1.25 μg / μl of each nucleotide in 10% human serum albumin (hereinafter referred to as HSA) +5 mM Tris (pH value: 7.5). Included). The SAM1a sense was coinjected with the SAM1b sense and used from a stock solution [1.25 μg / μl of each nucleotide in 10% HSA + 5 mM Tris (pH: 7.5)]. Individual germinal vesicles (GV) loaded in droplets of alpha-MEM (with 0.8% HSA and 3 mM hypoxanthine) under mineral oil in a 35 mm petri dish on the stage of an inverted microscope -Stage About 12 pg of each oligonucleotide (10 pl) was injected into the cytoplasm of the oocyte. The oocyte was prepared according to Grndahl et al., 1998 [Biol. Reprod. 58 (1998), 1297, supra) from ovaries of 21-24 day old mice primed with follicle stimulating hormone (hereinafter referred to as FSH) for 48 hours. Oocytes were aspirated onto holding pipettes (120 μm OD and 20 μm ID) and injection pipettes (Eppendorph, Hamburg, Germany) were fitted to pressure microinjectors (Eppendorph, Hamburg, Germany). The pipette holder was attached to a piezoelectric positioning system (piezoelectric positioning system (Burleigh, NY, USA)) mounted on a motorized micromanipulator (Luigs and Neumann, Ratingen, Germany). The injection pipette was pushed into the zona pellulica and a piezo pulse was applied and the injection pipette was moved 20 μm forward. During this transfer, the pipette penetrated the zona pellucida and the oolema and applied some pressure pulses to release a volume of about 10 μl into the oocyte cytoplasm. Prior to the resumption of meiosis induced by the addition of 10 μM FF-MAS to the medium containing hypoxanthine, the injected oocytes were treated with CO 2. ₂ The plate was allowed to stand at 37 ° C. for 20 hours in an incubator. The effect of FF-MAS was assessed as the number of oocytes that had blastomere disruption (hereinafter GVBD) 24 hours after further incubation. The rationale for the 20 hour incubation period following injection of the antisense oligonucleotide is to allow for the degradation of the mRNA encoding the SAM1a and SAM1b proteins. As a result, as the level of the MAS receptor protein or MAS signaling protein decreases in the oocyte, the MAS response slows down (100% to 50%, see table below).
[0073]
[Table 1]

As shown in Table 1, GVBD was inhibited by nearly 50% in antisense-injected oocytes as compared to controls (ie, sense-injected and non-injected oocytes). This result indicates the selective inhibition of mRNA encoding SAM1a and SAM1b by the antisense probe. Furthermore, these results indicate that the involvement of SAM1a and SAM1b proteins in MAS signaling is important, and that the functional knockout of these molecules for de novo protein synthesis partially disrupts the MAS signal in oocytes. This indicates that this importance is clear.
[0074]
SAM1a and SAM1b are two closely related proteins derived from the same gene that retain complementary functions for MAS signaling in oocytes.
[0075]
<Example 2>
<< FF-MAS binding assay >>
10 μl of unlabeled FF-MAS [1,3,10,30,100,300,1000,3000 nM in 6.6% ethanol (EtOH)] was added to 10 μl of 200 nM. ³ H-labeled FF-MAS [about 12.8 Ci / mmol, assay buffer (10 mM Tris; 1.5 mM EDTA; 10% glycerin; 1.0 mM 3- (3-cholamidopropyl) dimethylamino-1 -Propanesulfonate (hereafter referred to as CHAPS, Boehringer Mannheim); dissolved in 1% BSA (bovine serum albumin) 10 g of SAM1b protein (freshly dissolved in assay buffer) was added to 40 l of Unspecific binding was measured in the presence of 30 μM unlabeled FF-MAS and total binding was determined in assay buffer containing 6.6% EtOH. The incubation was determined by adding 2 hours at 250 ° C. 250 μl ice-cold assay buffer containing 2% Cab-osil M-5 (Fluka silica gel) and 0.2% dextran T70 (Sigma) was added to each tube and mixed. Approximately 5 minutes after addition of the Cab-osil M-5, the tube was centrifuged at 14000 rpm (minifuge) for 5 minutes, and 200 μl of the supernatant was microscint-tube. And 3.5 ml atom light (Packard) was added.The tubes were measured in a liquid scintillation counter.The results obtained are shown in FIG. ³ H is the concentration of unlabeled FF-MAS that displaces 50% of FF-MAS.
[0076]
<Example 3>
<< Assay to Determine Whether a Specific Polynucleotide Encodes a Protein That Is a MAS Receptor or MAS Signaling Protein: >>
10 μl of unlabeled FF-MAS (1,3,10,30,100,300,1000,3000 nM in 6.6% EtOH) was replaced with 10 μl of 200 nM ³ H-labeled FF-MAS [about 12.8 Ci / mmol, dissolved in assay buffer (10 mM Tris; 1.5 mM EDTA; 10% glycerin; 1.0 mM CHAPS; 1% BSA)] You. 10 μg of the specific protein to be tested (freshly diluted in assay buffer) is added to a final volume of 40 μl. Non-specific binding is measured in the presence of 30 μM unlabeled FF-MAS, and total binding is determined by adding 10 μl assay buffer containing 6.6% EtOH. Incubation is performed at 4 ° C. for 2 hours. 250 μl of ice-cold assay buffer (containing 2% Cab-osil M-5 and 0.2% dextran) is added to each tube, mixed and spun slightly. Approximately 5 minutes after addition of Cab-osil M-5, tubing is centrifuged for 5 minutes at 14000 rpm (minifuge). 200 μl of the supernatant is transferred to a micro scintillator tube and 3.5 ml atomite is added. Tubes are measured in a liquid scintillation counter. if ³ If the HFF-MAS binding is displaced by unlabeled FF-MAS, the protein tested is a MAS receptor or a MAS signaling protein.
[0077]
<Example 4>
<< Assay to determine whether a specific compound is a ligand: >>
10 μl of the compound to be tested (1,3,10,30,100,300,1000,3000 nM in 6.6% EtOH) was replaced by 10 μl of 200 nM ³ H-labeled FF-MAS [about 12.8 Ci / mmol, assay buffer (10 mM Tris; 1.5 mM EDTA; 10% glycerin; 1.0 mM CHAPS; dissolved in 1% BSA)]. You. 10 μg of SAM1 a protein (freshly diluted in assay buffer) is added to a final volume of 40 μl. Non-specific binding is measured in the presence of 30 μM unlabeled FF-MAS, and total binding is determined by adding 10 μl assay buffer containing 6.6% EtOH. Incubation is performed at 4 ° C. for 2 hours. 250 μl of ice-cold assay buffer (containing 2% Cab-osil and 0.2% dextran) is added to each tube, mixed and spun slightly. About 5 minutes after Cab-osil addition, the tubing is centrifuged at 14000 rpm (minifuge) for 5 minutes. 200 μl of the supernatant is transferred to a micro scintillator tube and 3.5 ml atomite is added. Tubes are measured in a liquid scintillation counter. If a compound can displace specific FF-MAS binding, it is a ligand for the MAS receptor or for a MAS signaling protein.
[0078]
<Example 5>
<< Cloning of SAM1 >>
A cDNA library was prepared from mRNA isolated from 10,000 oocytes of 24-day-old mice. The cDNA library was constructed in pSPORT plasmid vector (Life Technology). Clones were picked at random and partially sequenced, and sequences were assembled using the fred / frap programs. Out of thousands of clones sequenced, one sequence assembly of the two sequences showed 21% amino acid identity with human oxysterol binding protein. The longest clone, MOCY2864, was completely sequenced and no identical or orthologous genes could be found in the database. This new gene was named SAM1. Amplification of the 5 'end of the SAM1 cDNA was performed on the oocyte library by PCR using primer # 176959 (SEQ ID NO: 9) specific for pSPORT and primer # 198241 (SEQ ID NO: 10) specific for SAM1. Was. This result indicated the presence of cDNAs with two different 5 'ends, which were named SAM1a and SAM1b. Full-length PCR amplification was performed on mice using primers # 199772 (SEQ ID NO: 11) and # 198239 (SEQ ID NO: 12) for SAM1a and # 2017790 (SEQ ID NO: 13) and # 198239 (SEQ ID NO: 12) for SAM1b. Performed on oocyte library. Nhel and Notl recognition sites, respectively, were introduced into the primer. SAM1a and SAMb cDNAs were digested with Nhel and Notl restriction enzymes and cloned into pcDNA3.1 + (Invitrogen).
[0079]
DNA constructs expressing SAM1a and SAM1b proteins fused to a C-terminal histidine stretch (used for purification from affinity for nickel columns) were created as follows. The SAM1a and SAM1b cDNAs were PCR amplified using primers # 199772 (SEQ ID NO: 11) and # 21465 (SEQ ID NO: 14) and primers # 201790 (SEQ ID NO: 13) and # 21465 (SEQ ID NO: 14), respectively. Nhel and Xmal recognition sites, respectively, were introduced into the primer. Then, the PCR product was cloned into pBlueBac4,5V5HIS (Invitrogen) using the restriction enzymes Nhel and Xmal. The intermediate construct was then digested with Smal and BstB1, filled in using the Klenow fragment of DNA polymerase 1, and religated. These constructs were named "SAM1a in pBlueBac4,5V5HIS" and "SAM1b in pBlueBac4,5V5HIS".
[0080]
<< SAM1 expression in Sf9 cells >>
The SAM1a-HIS and SAM1b-HIS proteins were referred to as "Bac-N-Blue ^TM Expression was performed in Sf9 cells using recombinant baculovirus according to the "Transfection Kit" manual (Invitrogen).
[0081]
0.5 μg Bac-N-Blue to infect Sf9 insect cells ^TM DNA and recombinant transfer plasmid “SAM1 in pBlueBac4,5V5HIS” (4 μg) were mixed with 1 ml Grace's insect culture (Grace's Insect Media) and 20 μl of Insectin-Plus Liposomes. Incubate for 15 minutes and mix the mixture in a 60 mm culture dish at 2 × 10 ⁶ Added to Sf9 cells. Cells were rocked at 27 ° C. and left for 96 hours. Vila was isolated and a plaque assay was performed. Putative recombinant plaques were selected to generate a P-1 virus stock. PCR analysis of the recombinant virus clones was performed and high titer virus stocks were prepared from positive clones. To express SAM1a and SAM1b on a large scale, 500 ml Sf9 cells (2,0 × 10 ⁶ Cells / ml) for 25 ml virus (1,8 x 108 plaque forming units / ml) or 60 ml virus (6 x 10) for SAM1a and SAM1b, respectively. ⁷ pfu / ml). After 70 hours of incubation, the cells were spun down and the protein was purified.
[0082]
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<Example 6>
<< Purification of SAM1a and SAM1b >>
Purification of HIS-SAM1a and HIS-SAM1b was performed according to the QIAGEN manual (QIAexpressionist 4th edition).
[0083]
Briefly, cell cultures of SF9 insect cells (containing the 6xHis-SAM1a or 6xHis-SAM1b construct in a baculovirus expression vector) were centrifuged and the pellet was washed with lysis buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM). mM NaCI, 10 mM imidazole, pH 8) and lysozyme were added, and the lysate was clarified by centrifugation followed by sonication on ice for 6 x 10 seconds to dissolve. The clarified lysate was incubated with a 50% slurry of Ni-NTA agarose (Qiagen) under mild agitation (to bind 6xHis-SAM1a) and washed twice (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8) and a high concentration of imidazole (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8). The yield and purity of the purified protein were stained with Coomassie (Brilliant Blue, Sigma). Analysis was performed on SDS-polyacrylamide gel (NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel, Invitrogen).
[0084]
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[0085]
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[0086]
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[0087]
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[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1. From SAM1b ³ FIG. 9 shows substitution of H-labeled FF-MAS.

Claims

An isolated and / or purified polynucleotide molecule that hybridizes with high stringency to an oligonucleotide of 25 or more contiguous nucleotides in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, comprising: a) a MAS receptor [ie, 3β-hydroxy -4,4-dimethylcholest-8,14,24-triene (protein capable of binding to FF-MAS herein)] or MAS signaling protein (ie, binds to FF-MAS) Or b) a ligand-binding domain of a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS).

The polynucleotide of claim 1, wherein said polynucleotide is an RNA antisense sequence.

The polynucleotide of claim 1, wherein said polynucleotide is a cDNA sequence.

The polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, wherein the polypeptide exhibits the activity of a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS). The encoding polynucleotide.

The polynucleotide according to claim 1, which encodes a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Polynucleotide.

The polynucleotide according to any one of claims 1 to 5, having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

A probe of at least 12 nucleotides capable of hybridizing to a nucleic acid encoding a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS).

8. The probe according to claim 7, which comprises a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS), or a gene encoding an allelic variant and species variant thereof. A probe comprising an oligonucleotide or polynucleotide of at least 25 contiguous nucleotides in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 capable of specifically hybridizing.

9. The probe according to claim 8, wherein said probe comprises about 40 to about 60 nucleotides in chain length.

10. The probe according to claim 8 or 9, wherein the probe is labeled to provide a detectable signal.

The probe according to claim 9 or 10, which comprises the nucleotide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

Hybridizes with an oligonucleotide or polynucleotide of 25 or more consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 at high stringency, and a) MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or MAS signaling protein (FF- A DNA construct comprising a DNA sequence encoding a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a ligand binding domain of a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS).

13. The DNA construct according to claim 12, wherein the DNA sequence encodes a MAS receptor or a MAS signaling protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.

Hybridizes with an oligonucleotide or polynucleotide of 25 or more consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 at high stringency, and a) MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or MAS signaling protein (FF- DNA comprising a DNA sequence encoding a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a ligand binding domain or transmembrane domain of a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS); Cultured cell lines, yeast or bacteria transformed or transfected with the construct.

15. A cell line according to claim 14, which is a yeast or a bacterium which does not express an endogenous MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS). Yeast or bacteria.

An isolated and / or purified MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS), a peptide fragment thereof, or a salt thereof.

17. The isolated and / or purified protein according to claim 16, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the sequence of the amino acid sequence capable of binding to FF-MAS. Protein.

An isolated antibody that specifically binds to a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS).

20. The isolated antibody of claim 18, wherein said antibody is a monoclonal antibody.

20. The isolated antibody of claim 18 or 19, wherein the antibody blocks MAS binding to a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS). Antibodies.

A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 19 or 20.

A method for detecting the presence of a compound having an affinity for a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS) or a salt thereof, comprising the steps: Contacting with a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding with FF-MAS), a peptide fragment thereof or a salt thereof; and b) MAS receptor (binding with FF-MAS) Measuring the affinity of the compound for a MAS signaling protein (which can bind to FF-MAS).

23. A method for detecting the presence of a MAS antagonist according to claim 22, wherein step a) in the presence of a MAS agonist comprising MAS, the compound links the compound to a response pathway under various conditions (FF- To the MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS) and MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS) Exposing the relevant response to the compound for a time sufficient to permit binding to the compound; and step b) binding the MAS receptor (FF-MAS to the FF-MAS) as compared to stimulating the response pathway with the MAS agonist alone. Or a combination of MAS signaling protein (which can bind to FF-MAS) Method comprising; said detecting a decrease in the stimulation of the response pathway, then the determining the presence of MAS antagonists of resulting from binding.

24. A method for detecting the presence of a MAS agonist according to any one of claims 22 to 23, wherein step a) in the presence of a MAS antagonist, the compound links the compound to the response pathway under various conditions. A receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS); a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS); Exposing the relevant response via a pathway to the compound for a time sufficient to allow binding of the compound; and step b) comparing the MAS receptor (FF) relative to stimulation of the response pathway with the MAS antagonist alone. -Can bind to MAS) or MAS signaling protein (can bind to FF-MAS) Method comprising; detecting an increase in the stimulation of the response pathway resulting from the binding of the compound, then the determining the presence of MAS agonists.

22. A compound having an affinity for a MAS receptor (which can bind to FF-MAS) or a MAS signaling peptide (which can bind to FF-MAS) or a salt thereof, wherein the compound or salt is according to claim 20 or 21. Or a salt thereof, which is detected by the method of (1).

A method for producing a MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, comprising: a) MAS receptor or MAS signal Growing cells, yeasts or bacteria transformed or transfected with a DNA construct comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 encoding the expression of the transfer protein; and b) the MAS receptor (FF-MAS) Isolating the MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS) from the cell.

27. The method of claim 26, wherein said MAS receptor (capable of binding FF-MAS) or MAS signaling protein (capable of binding FF-MAS) is isolated by immunoaffinity purification.

A kit for screening a compound having an affinity for a MAS receptor (capable of binding to FF-MAS) or a MAS signaling protein (capable of binding to FF-MAS) or a salt thereof, comprising the MAS receptor (FF-MAS). A kit comprising a MAS) or a MAS signaling protein (which can bind to FF-MAS), a peptide fragment thereof, or a salt thereof.

A MAS receptor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an analog thereof that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM.

A MAS receptor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, which satisfies the condition that it binds to FF-MAS and differs from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8 Analog.

A MAS receptor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or an analog thereof that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM.

A MAS receptor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or which binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, and satisfies the condition that it differs from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8 Analog.

A MAS receptor comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or an analog thereof that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM.

MAS receptor comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, and satisfies the condition that it differs from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8. Its analogs.

A MAS receptor comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an analog thereof that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM.

MAS receptor comprising the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, binds to FF-MAS and satisfies the condition that it differs from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8. Its analogs.

37. A MAS receptor according to any one of claims 29 to 36, wherein the receptor is a soluble, purified protein, eg, in a buffer suitable for detecting the ligand in a binding assay. Receptor.

38. The MAS receptor according to any one of claims 29 to 37, which is a soluble, purified protein, for example, in a buffer suitable for detecting a ligand in a binding assay, and SEQ ID NO. A MAS receptor that satisfies the condition that the amino acid sequence differs from that of amino acids 6 and 8.

A DNA construct comprising a DNA sequence encoding the MAS receptor according to any one of claims 29 to 38 relating to the MAS receptor, or a DNA sequence encoding a functional analog thereof (binding to FF-MAS).

39. A DNA sequence encoding the MAS receptor according to any one of claims 29 to 38 relating to the MAS receptor; or a functional analog thereof (binding to FF-MAS) which satisfies the condition that it differs from the nucleotides of SEQ ID NOS: 5 and 7. A DNA sequence encoding the DNA construct.

A DNA construct comprising the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof; or a DNA sequence that binds to FF-MAS with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, and encodes a functional analog thereof.

42. The DNA construct according to claim 41, which binds to FF-MAS with a DNA sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof; or an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, and SEQ ID NOS: 5 and 7. A DNA sequence encoding a functional analog thereof that satisfies the condition that it differs from the nucleotides of

43. The DNA construct according to any one of claims 39 to 42, which binds to FF-MAS with a partial DNA sequence shown in SEQ ID NO: 5; or an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM. A DNA sequence encoding a functional analog.

A DNA construct according to any one of claims 39 to 43, which binds to FF-MAS with a partial DNA sequence shown in SEQ ID NO: 5; or with an affinity constant of less than 100 μM, preferably less than 10 μM, and A DNA sequence encoding a functional analog thereof that satisfies the conditions differing from the nucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 7.

A recombinant expression vector carrying the inserted DNA construct according to any one of claims 39 to 44, which relates to a DNA construct.

A cell containing the recombinant expression vector according to claim 45.

A cell containing a DNA construct according to any one of claims 39 to 44, which relates to a DNA construct integrated into the genome of the cell.

48. A cell according to any one of claims 46 to 47, wherein the cell is a eukaryotic cell, especially an insect or mammalian cell.

A method for screening a ligand for a MAS receptor (i.e., an agonist or antagonist of FF @ MAS activity), wherein the MAS receptor according to any one of claims 29 to 38 is used as an agonist or antagonist of FF-MAS. Incubating with a substance suspected of being, and then with FF-MAS or an analog thereof; and detecting any effect of binding of FF-MAS or the analog to the MAS receptor; A method that includes

A method for screening a ligand for a MAS receptor (that is, an agonist or antagonist of FF-MAS activity), wherein FF-MAS or an analog thereof is identified as a substance suspected to be an agonist or antagonist of FF-MAS activity. And then incubating with the MAS receptor of any one of claims 29 to 38 for the MAS receptor; and detecting any effect of binding of FF-MAS or said analog to said receptor. And a method comprising:

39. Use of a MAS receptor according to any one of claims 29 to 38 for a MAS receptor, for use in screening for agonists or antagonists of FF-MAS activity.

Use of a DNA construct according to any one of claims 39 to 44 for a DNA construct, wherein the tissue and / or tissue of the MAS receptor according to any one of claims 29 to 38 for a MAS receptor. Use for isolating organ-specific variants.

53. Use of a receptor isolated according to claim 52, for use in screening for a MAS agonist or antagonist.