JP2004502938A - 全血のアッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生体外で全血中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の測定方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、白血球接着分子は、Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＶＬＡ−４）またはＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９としても知られるインテグリンα４β１であり、そして血管内皮リガンドはＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）である。本方法は、とりわけ、接着分子とそのリガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の効果の測定に有用である。
Description
【０００１】
本発明は、生体外にて全血中の白血球接着分子（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と血管内皮リガンド（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｇａｎｄ）との間の結合性相互作用を測定する方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、白血球接着分子は、Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＶＬＡ−４）またはＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９としても知られるインテグリンα４β１であり、そして血管内皮リガンドはＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）である。本発明方法の特定の利点は、白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用が全血中で測定され得ることである。本方法は、とりわけ、接着分子とそのリガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の効果の測定に有用である。このような化合物は炎症性疾患の処置において有用性を有し得る。
【０００２】
α４β１は、他の細胞または細胞外マトリックスへの細胞の接着に関与するヘテロ二量体の細胞表面受容体のインテグリンファミリーに属する。インテグリンとそれらのタンパク質リガンドとの間の相互作用は、例えば特定の位置に細胞をつなぐか、細胞移動を促進するか、または細胞に対しそれらの環境から生存シグナルを提供することにより細胞機能を維持することの基本である。インテグリンにより認識されるリガンドには、細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンおよびフィブロネクチン；血漿タンパク質、例えばフィブリノーゲン；ならびに細胞表面分子、例えば免疫グロブリンスーパーファミリーおよび細胞結合補体（ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の膜貫通タンパク質が含まれる。インテグリンは、非共有結合で会合した糖タンパク質のサブユニット（αおよびβ）から構成される。少なくとも１６の異なるヒトインテグリンαサブユニットおよび少なくとも８の異なるβサブユニットが存在し、各βサブユニットは１以上のαサブユニットとヘテロダイマーを形成し得る。インテグリンとリガンドとの間の相互作用の特異性は、αおよびβサブユニット構成物により決定される。
【０００３】
α４β１は造血前駆細胞、末梢性および細胞障害性Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、胸腺細胞および好酸球を含む多数の造血細胞、ならびに確立された細胞系上に発現する。α４β１は２つの主要なリガンドを有し、その１つはＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）はＣＤ１０６としても知られ、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、活性化血管内皮細胞の表面、樹状細胞、マクロファージおよびフィブロブラストを含む他の広範な細胞の表面上に発現し、他は二者択一的にスプライシングされるＩＩＩ型結合セグメント（ＣＳ−１フィブロネクチン）を含むフィブロネクチンのイソフォームである。α４サブユニットは、また、β７サブユニットとヘテロダイマーを形成する。α４β７は、また、リガンドとしてＶＣＡＭ−１およびＣＳ−１フィブロネクチンを認識するが、Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）、主に小腸の血管内皮細胞上に発現した別の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーならびに比較的低い程度で結腸および脾臓に選択的に結合する。α４β７は、胃腸管粘膜および消化管関連リンパ様組織に選択的に戻るリンパ球上に発現し、そして粘膜の免疫の維持に関与し得る。
【０００４】
血液白血球の活性化および血管外遊出は、炎症性疾患の発現および進行に主要な役割を果たす。血管内皮への細胞接着は細胞が血液から炎症組織中に移動する前に必要とされ、血管内皮細胞の表面上の細胞接着分子と循環している白血球との間の特異的な相互作用により仲介される。
【０００５】
α４β１は炎症の間のリンパ球、単球および好酸球の補充に重要な役割を有する。α４β１のリガンドであるＶＣＡＭ−１の発現は、インビトロにおいて、内皮細胞に対し炎症性サイトカインによりアップレギュレーションされる。ＶＣＡＭ−１の発現は、また、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、アレルギー性喘息およびアテローム性動脈硬化症のようなヒトの炎症性疾患においてアップレギュレーションされるが、一方、ＣＳ−１フィブロネクチンの発現は、リウマチ様関節炎においてアップレギュレーションされる。α４インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体および小分子性α４β１インヒビターは、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、アレルギー性喘息、接触性皮膚炎、移植拒絶、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、および糸球体腎炎を含むヒトの炎症性疾患の多数の動物モデルにおいて有効であることが示された。
【０００６】
α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用を阻害する化合物は、喘息、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植拒絶、アテローム性動脈硬化症、接触性皮膚炎、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患および糸球体腎炎を含むヒトの多数の炎症性疾患または状態の処置に有効であると期待される。α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用を阻害する化合物の例は、ＷＯ９６／２０２１６、ＷＯ９７／０２２８９、ＷＯ９７／４９７３１、ＷＯ９９／２４３９８、ＷＯ００／０５２２３およびＷＯ００／０５２２４、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａに開示されている。
【０００７】
α４β１／ＶＣＡＭ−１インヒビターの開発は、これによりそれらの治療効果、すなわち血管内皮細胞上に発現したリガンドとの相互作用後に血液からα４β１を発現している白血球の補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の阻害、の優れた指標を提供するので、ヒトまたは動物への投与後の全血サンプル中のそれらの活性を試験する能力により促進されるであろう。しかしながら、このような全血のアッセイ（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ａｓｓａｙ）は今まで報告されていなかった。
【０００８】
α４β１／ＶＣＡＭ−１インヒビターの探索に使用されてきた現在利用可能な方法には、精製α４β１とリガンドタンパク質との間の相互作用の阻害またはα４β１を発現している細胞とリガンドとの相互作用の阻害をインビトロでスクリーニングすることが含まれる。例えば、Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７， １５８， １７１０−１７１８）は、ＶＣＡＭ−ＩｇＧ−結合ビーズへの蛍光標識ＨＬ−６０およびＲａｍｏｓ細胞系の結合の阻害を測定した。Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ４０， ３３５９−３３６８）は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のフォーマットを用いて９６ウェル・プレートに結合したＶＣＡＭ−１への精製α４β１の結合の阻害およびＶＣＡＭ−１−ＩｇＧキメラで被覆された９６ウェル・プレートへのＲａｍｏｓ細胞系の接着の阻害を測定した。Ｌｉｎら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ４２， ９２０−９３４）は、アルカリホスファターゼと結合したＶＣＡＭ−Ｉｇの結合の阻害を測定した。Ｈａｗｏｒｔｈら（Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０）は、α４β１インヒビターを同定するために９６ウェル・プレート上に被覆されたヒト血漿フィブロネクチンへのＭＯＬＴ−４細胞系の接着の阻害を使用した。
【０００９】
同様の技術は、単離されα４β１を発現している血液白血球とα４β１リガンドとの相互作用に対するインビトロでの化合物の効果を測定するために使用され得る。しかしながら、これらの方法は実験動物またはヒトに投与された可逆的なα４β１インヒビターの生体外での効果を測定するのには不適当である。なぜなら、目的の白血球を他の血液−骨細胞から単離するために要するステップの間に化合物が洗い流されるからである。さらに、プラスチック・プレート中で固定されたα４β１リガンドへのα４β１−介在性白血球の接着の全血測定は、静的な条件下では赤血球細胞が白血球よりも早く沈降し、白血球のα４β１と固定されたリガンドとの間の相互作用が妨げられるので不可能であった。
【００１０】
したがって、現在利用可能な方法の不都合な点を克服する新たな方法の必要性が存在する。特に、α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用が全血中で測定できる新たな方法が必要とされる。このような方法は、本発明において開示される方法により提供される。
【００１１】
本発明において、我々は、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の新規測定方法を開発した。本発明の方法の利点は、特に、全血中で白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の測定を可能にすることである。したがって、本発明の方法は血液白血球の単離を必要としない。血液白血球の単離にかかわる分離および分取の手順は多くの白血球の特性を変えることは、当業者に周知である。したがって、このような分離および分取の手順を必要とする従来の方法では、血管内皮リガンドに結合する白血球接着分子の厳密な表示は提供されない。
【００１２】
本発明の方法は、とりわけ、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の効果の測定に有用である。化合物の効果は、インビトロで血液サンプルを化合物でスパイクする（ｓｐｉｋｉｎｇ）ことにより測定され得る。化合物の効果は、また、任意の簡便な投与経路を用いてヒトまたは動物に該化合物を投与した後に生体外で測定され得る。
【００１３】
本発明の方法は、化合物の活性に関連づけた血漿タンパク質の効果の表示を与えるために使用され得る。それらは、また、化合物の薬物動態学的情報を投与後の活性および作用の持続と関連づけることを可能にする。さらに、全血中の化合物の活性を測定する能力は、ヒトの疾患における化合物の有効性の代用マーカー（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍａｒｋｅｒ）として使用され得、その結果、臨床試験に着手する場合に化合物の有効投与量を自信をもって予測することができる。
【００１４】
本発明の方法において、全血は、目的の血管内皮リガンドが結合している移動可能な固相（ｍｏｂｉｌｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）と、例えば適当なリンカーを介するかまたは直接吸着（ｄｉｒｅｃｔ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により混合される。インキュベーション後、移動可能な固相および接着性の細胞を残りの血液成分から回収し、そして分離し、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用が測定される。
【００１５】
本発明の方法は、特に、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の同定に有用である。
【００１６】
したがって、本発明の１つの観点にしたがって、
（ｉ） 全血中の白血球接着分子を、所望により試験化合物の存在下で、血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントで被覆した移動可能な固相と接触させること；
および
（ｉｉ） 移動可能な固相および接着した細胞を（ｉ）から回収し、分離すること
および
（ｉｉｉ） 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること
および
（ｉｖ） 所望により、試験化合物が白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節するかどうかを測定すること：
を含むアッセイ方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法は、例えば最適のアッセイ条件を見出すため、対象間の相互作用の変動性を測定するため、一塩基多型による相互作用の相違を調べるため、白血球の接着を活性化する刺激の効果を調査するために、試験化合物の不存在下にて生体外で全血中の白血球接着分子と血管内皮細胞リガンドとの間の相互作用の程度を測定するのに有用である。
【００１８】
本発明の方法は、とりわけ、生体外で全血中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用に対する化合物の効果を測定するのに有用である。
【００１９】
したがって、好ましい実施態様において、試験化合物の存在下で実施される場合のステップ（ｉ）には、
（ａ） 試験化合物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与すること
および
（ｂ） 該対象から全血を取得すること
が含まれる。
【００２０】
本発明のさらなる観点にしたがって、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定するための生体外全血アッセイ方法が提供され、該方法には、
（ｉ） 全血中の白血球接着分子を、所望により試験化合物の存在下で、血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）移動可能な固相と接触させること；
（ｉｉ） 移動可能な固相および接着した細胞を（ｉ）から回収し、分離すること；
（ｉｉｉ） 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること；および、
（ｉｖ） 所望により、試験化合物が白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節するかどうかを測定すること：
が含まれる。
【００２１】
本発明のさらなる観点にしたがって、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する試験化合物の能力を測定する方法が提供され、該方法には
（ａ） 試験化合物を対象に投与すること；
（ｂ） 全血を該対象から取得すること；
（ｃ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｄ） 他の血液成分から移動可能な固相と結合した接着細胞を回収し、分離すること；および
（ｅ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること：
が含まれる。
【００２２】
本発明のさらなる観点にしたがって、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する、対象に投与された、試験化合物の能力を測定する方法が提供され、該方法には、
（ａ） 対象から全血を取得すること；
（ｂ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｃ） 他の血液成分から移動可能な固相と結合した接着細胞を回収し、分離すること；および
（ｄ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること：
が含まれる。
【００２３】
本発明のアッセイ方法には、好ましくは、白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の表面の白血球接着分子と固相に付着した血管内皮リガンドフォームとの間の相互作用を介して移動可能な固相に結合／接着した細胞の量または相対数を測定または検出することが含まれる。このような細胞は手で計数され得る。代わりに、タンパク質の結合量を測定すること、細胞内または細胞上に存在するバイオマーカーの存在を測定すること、または細胞表面上に吸着しているかもしくは細胞内に取り込まれた標識を検出することのような間接的な測定も実施され得る。当業者は、本発明において使用するための適当な細胞検出／測定方法を実施できるであろう。
【００２４】
個体から単離された血液は、通常、凝固を避けるために抗凝血剤で処理される。したがって、単離された血液は、好ましくは、ヘパリンのような抗凝血剤中に回収される。
【００２５】
「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）」なる用語は、本明細書においてリンパ球、好酸球、好中球、単球およびマクロファージを含む任意の種類の白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を言及するために使用される。
【００２６】
「白血球接着分子」なる用語は、本明細書において白血球の表面上に発現した接着分子を言及するために使用され、これは白血球と血管壁との間の結合性相互作用を仲介する。
【００２７】
「血管内皮リガンド」なる用語は、本明細書において白血球接着分子との結合性相互作用を受ける血管壁中の接着分子を言及するために使用される。血管内皮リガンドは細胞表面、例えば血管内皮細胞上に発現し得る。代わりに、血管内皮リガンドは細胞外マトリックス内に位置し得る。
【００２８】
本発明の方法における使用に適した白血球接着分子とそれらに対応する血管内皮リガンドの例は、表１に示される。（再考のため、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ−Ｍａｒｋｓ， Ｎ． ＆ Ｌｉｐｓｋｙ， Ｐ．Ｅ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ＆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． １９９６， ７９， ２０３−２１０； Ｅｌａｎｇｂａｕｍ， Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｖｅｔ． Ｐａｔｈｏｌ． １９９７， ３４， ６１−７３参照）
【００２９】
【表１】
【００３０】
本発明の特に好ましい実施態様において、白血球接着分子はα４β１であり、血管内皮リガンドはＶＣＡＭ−１である。
【００３１】
任意の簡便な移動可能な固相が使用され得る。固体支持体は、ガラス、プラスチック、ポリマー、ポリサッカライド、樹脂、シリカまたはシリカベースの物質等でできていてもよい。「移動可能な固相」なる用語は、本明細書において、血管内皮細胞リガンドが結合し得、かつ、血液サンプルが継続的に混合されている場合に血液サンプル中の細胞とともに自由に循環し得る、固体粒状物質を言及するために使用される。好ましい実施態様において、固相は他の血液成分から回収されるか分離される。固相を血液から回収または分離するために、さまざまな方法が利用可能であることは、当業者に明らかである。移動可能な固相は任意の形であり得るが、ビーズの形の固相を使用することが非常に簡便である。本発明の好ましい観点において、固相はマグネチック・ビーズを含み、これには超常磁性ビーズが含まれ、これは磁石を用いて回収され得る。しかしながら、他の適当な方法には、差異遠心法、フローサイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィーなどが含まれる。
【００３２】
本発明の方法は、任意の簡便な供給源からの全血中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定するために使用され得る。好ましくは、全血はヒトまたは動物の血液である。最も好ましくは、全血はヒトの血液である。
【００３３】
いくつかの場合において、白血球接着分子は、不活性なコンホメーションであるかまたは細胞表面上に少量存在するかまたは血管内皮細胞リガンドとの相互作用のアフィニティーが低くなるように細胞表面上に分配されていてもよい。このような場合において、白血球は、接着分子におけるコンホメーションの変化の原因となるかまたはその発現を増加させるかまたは細胞膜の領域内での密集化を引き起こし、その結果、白血球接着分子とその血管内皮細胞リガンドとの間の相互作用のアフィニティーおよび／またはアビディティーを増加させる薬品による活性化を必要とし得る。このような変化は、白血球における一定の細胞内シグナル経路を活性化するかまたは白血球表面上の接着分子と直接相互作用する薬品により引き起こされ得る。例えば、白血球インテグリンＶＬＡ−４は、二価カチオンまたはＶＬＡ−４と相互作用してコンホメーションの変化を引き起こす活性化モノクローナル抗体で白血球を処理することにより活性化され得る。ケモカインまたは補体成分のアナフィラトキシンファミリーは、白血球表面上のレセプターと相互作用し、細胞内シグナル経路を活性化してインテグリンの活性化を引き起こすかまたは白血球表面上での増加した発現を引き起こす。ホルボールエステルでの白血球細胞内プロテインキナーゼの活性化は、また、インテグリンのコンホメーションの変化、密集化または発現を引き起こし得る。したがって、１つの実施態様において、全血は、所望により白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を活性化するための適当な刺激で処置され得る。適当な刺激の例には、マンガンのような二価カチオン；ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）のような細胞内シグナル経路のアクチベーター；バクテリア性リポポリサッカライド、ロイコトリエンＢ４；補体成分Ｃ５ａ；ケモカインファミリーの走化性タンパク質のメンバー、例えば単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）または活性化状態における変化を引き起こすインテグリンに結合する抗体が含まれる（Ｍａｓｕｍｏｔｏ ＆ Ｈｅｍｌｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ２６８， ２２８−２３４； Ｗｅｂｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９６， ９３， １０９３９−１０９４４； Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ＆ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １９９５， ３， １３１−１４２； Ｗｅｂｅｒ Ｋ．Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １９９９， １０， ８６１−８７３； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０００， ２４０，１２５−１３２）。
【００３４】
「ホモログ」なる用語は、血管内皮リガンドタンパク質の配列に対して実質的に類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。ホモログは、同じ種からのタンパク質、すなわち同属のプロテインファミリーのメンバーであり得る。代わりに、ホモログは、ラットまたはマウスのような異なる種由来の類似のタンパク質であってもよい。好ましくは、ホモログはヒトのホモログである。簡便なホモログには、血管内皮リガンドの配列と７０％以上の配列相同性を有するものが含まれる。好適な配列相同性には７５％および８０％の同一性が含まれ、他の好適な配列相同性には８５％および９０％の同一性が含まれ、さらに好ましい配列相同性には９５％の同一性が含まれる。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「血管内皮リガンドフォーム（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒｍ）」なる用語により、本発明、すなわち完全長、フラグメントおよびホモログにおいて使用される各々の完全長または変異体の血管内皮リガンドを意味する。
【００３６】
血管内皮リガンドがＶＣＡＭ−１である場合において、簡便なホモログには、Ｈｅｓｓｉｏｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， ６６８２−６６８５ および Ｏｓｂｏｒｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１において詳説されたように、ＶＣＡＭ−１の配列と７０％以上の配列相同性を有するものが含まれる。好適な配列相同性には７５％および８０％の同一性が含まれ、他の好適な配列相同性には８５％および９０％の同一性が含まれ、さらに好ましい配列相同性には９５％の同一性が含まれる。
【００３７】
インテグリンが、リガンドタンパク質の三次構造により適当なコンホメーション内に存在する短いペプチド配列を認識することによって、それらの血管内皮細胞リガンドに結合することはよく知られている。例えば、インテグリンＶＬＡ−４は、ＶＣＡＭ−１の細胞外第１および第４ドメインに発見された、フィブロネクチンのＩＩＩＣＳドメイン中のロイシン−アスパラギン酸−バリン（ＬＤＶ）トリペプチド（Ｎ末端からＣ末端の順）モチーフおよび対応するイソロイシン−アスパラギン酸−セリン（ＩＤＳ）モチーフを認識する（Ｋｏｍｏｒｉｙａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １５０７５−１５０７９； Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １９９４， １０７， ２１２７−２１３５）。本明細書で使用される「フラグメント」には、例えばＶＬＡ−４、２５アミノ酸のＣＳ−１ペプチドまたはＬＤＶを含む環上ペプチドの場合において、結合性アフィニティーが親タンパク質と同様になるように適当なコンホメーションで存在するこのような認識モチーフを含む６以上の連続的なアミノ酸の血管内皮リガンドを含むペプチドが含まれる（Ｈａｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０）。血管内皮リガンドが炭水化物、例えばＥ−セレクチンである場合には、「フラグメント」なる用語には、６以上の連続的なモノサッカライド単位を含むオリゴサッカライドが含まれる。Ｈｅｓｓｉｏｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， ６６８２−６６８５ および Ｏｓｂｏｒｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１で詳説されたＶＣＡＭ−１配列のＶＣＡＭ−１のフラグメントには６以上の連続的なアミノ酸を含むペプチドが含まれ、ＩＤＳモチーフが含まれる。好ましくは、フラグメントは、それらの由来となる完全長の分子と白血球接着分子に関して同一または本質的に同一の結合性アフィニティーを有する。
【００３８】
特に好適な実施態様において、血管内皮リガンドは、Ｍａｋａｒｅｍ Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ４００５−４０１１に記載されたように、７−ドメインフォーム（経膜部および細胞質ドメインを除く）を含むＶＣＡＭ−１のフラグメントである。ＶＣＡＭ−１のさらに好適なフラグメントには、少なくとも最初の２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメイン（Ｏｓｂｏｒｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９２， １７６， ９９−１０７）；７ドメインＶＣＡＭ−１の４番目の免疫グロブリン様ドメインを欠くＶＣＡＭ−１の別のスプライシングされた６ドメインフォーム（Ｏｓｂｏｒｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１）；および免疫グロブリンＧのＦｃ領域に融合したＶＣＡＭ−１の少なくとも最初の２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメインを含む融合タンパク質（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ＆ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １９９５， ３， １３１−１４２； Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７， １５８， １７１０−１７１８）；
を含むＶＣＡＭ−１のトランケートされた形態が含まれる。
【００３９】
接着した白血球の数を定量できる任意の適当な方法が本発明において使用され得る。これらには、例えば顕微鏡を用いて細胞の数を直接計数すること、タンパク質またはＤＮＡの濃度を測定すること、あるいは構成成分、すなわち白血球内もしくは白血球上に見出されるかまたは白血球により分泌された酵素または他のタンパク質の濃度を測定することが含まれる。好ましい実施態様において、接着した白血球の数は、適当な検出可能な標識、例えば放射活性標識、抗体または蛍光色素を用いて測定され得る。特に好ましい実施態様において、マーカーは細胞に取り込まれそして細胞内に保持されるＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂ−１１５０）である。ＢＣＥＣＦで標識された細胞から放出された蛍光シグナルは、細胞を洗浄しそして溶解させ、そして蛍光計を用いて測定することにより容易に測定され得る。
【００４０】
白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の調節には、刺激または阻害のどちらかが含まれる。しがたって、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の調節が可能な化合物は、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物である。「白血球接着分子／血管内皮リガンドの結合性相互作用のモジュレーター」および「白血球接着分子／血管内皮リガンド・モジュレーター」なる語は、また、本明細書において、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物を言及するために使用される。本発明の化合物は、炎症性疾患の処置における有用性を有する；一般的に、これは白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の阻害により発生する。
【００４１】
同様に、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用の調節には、刺激または阻害のどちらかが含まれる。したがって、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用の調節が可能な化合物は、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物である。「α４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用のモジュレーター」および「α４β１／ＶＡＣＭ−１モジュレーター」なる語は、また、本明細書において、α４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物を言及するために使用される。本発明の化合物は、炎症性疾患の処置における有用性を有する；一般的に、これはα４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用の阻害により発生する。
【００４２】
本発明の方法において試験され得る化合物には、通常「小分子」として知られる単純な有機分子、例えば２０００ダルトン未満の分子量を有するものが含まれる。該方法は、また、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を含むペプチドライブラリーのような化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。他の適当な分子には、抗体、ヌクレオチド配列および白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する他の任意の分子が含まれる。
【００４３】
白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用のモジュレーターを同定後、次いで、医薬化学の技術がさらにその特性を特異化（ｒｅｆｉｎｅ）するため、例えば効力を増大させるためおよび／または副作用を減少させるために適用され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「生体外で化合物の効果を測定すること」なる用語は、化合物を対象に投与し、血液サンプルを採取し、対象から採取された血液サンプル中の化合物の効果を測定することを意味する。
【００４５】
対象は任意の種であり得、好ましくは、対象はヒトまたは動物の対象であり得る。
化合物は任意の適当な経路を用いて、例えば静脈内、腹膜内、皮下もしくは筋肉内注射により、または経口または局所投与により該対象に投与され得る。好適な実施態様において、化合物は経口投与により投与される。
【００４６】
ここで、下記の実施例および図面を参照することにより本発明を例示するが、これにより本発明は制限されない。
【００４７】
図面の説明
図１
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
図２
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、α４β１インテグリンに依存する。
図３
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
図４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【００４８】
図５
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
図６
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
図７
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
図８
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
図９
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
図１０
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
【００４９】
実施例
実施例１
ヒトＶＣＡＭ−１の精製
ヒト組換えＶＣＡＭ−１（経膜部および細胞質ドメインを除いた７ドメインフォーム、Ｍａｋａｒｅｍ Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ４００５−４０１１）をバキュロウイルス発現系（Ｓｒｉｄｈａｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ．， Ｖｏｌ １９， ｐｐ６０３−６１４）を用いて昆虫細胞中で発現させるか、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫ （カタログ番号 ＡＤＰ５）から入手した。ＶＣＡＭ−１を昆虫細胞から下記のようにアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１Ｇ１１モノクローナル抗体（ＲＰＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）を製造者推奨のプロトコールを用いてＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ １７−０４３０−０１）に結合させた。次いで、１Ｇ１１アフィニティーカラムをパッキングし、２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、４℃で平衡化させた。次いで、ＶＣＡＭ−１を含む昆虫細胞の上清を０．４５μｍでろ過し、１Ｇ１１アフィニティーカラムに負荷した。フロースルーを２８０ｎｍでモニターした。痕跡（ｔｒａｃｅ）がベースラインに戻るまで、カラムを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。次いで、ＶＣＡＭ−１を０．２Ｍ酢酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出させた。フラクションはすぐに２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。ＶＣＡＭ−１を含むフラクションをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル解析により同定し、プールし、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で透析した。
【００５０】
実施例２
ＶＣＡＭ−１のビオチン化
ＶＣＡＭ−１を１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２中に透析した。これにリンカー対タンパク質が１：５の比になるようにＮＨＳ−ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ ２１３３５）を加え、得られた溶液を室温で１時間インキュベートした。次いでこれを、保存と未反応のリンカーの除去の両方の目的で、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に透析した。
【００５１】
実施例３
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎへのビオチン化ＶＣＡＭ−１の固定化
使用前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ （ＵＫ） Ｌｔｄ）を、０．０２％ＮａＮ３保存剤を除去するためにダルベッコ・リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １４０４０−０９１）中で２回洗浄した。これは、均質な懸濁液を得るためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをボルテックスで混合し、新たな反応チューブに２０ｍｇ（２ｍｌ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを加えることにより行われた。次いで、該チューブをＤｙｎａｌＭＰＣ（登録商標）（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）中に５分間置いてすべてのビーズを回収し、該チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）においたまま上清を吸引により取り除いた。次いで、該チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）から取り出し、１ｍｌのダルベッコＰＢＳを加え、そしてチューブをゆっくりと逆さにしてすべてのビーズを再懸濁させ、その後Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）に戻すという手順を繰り返した。最後に上清を吸引により除去すると、ビーズのペレットが残った。
【００５２】
次いで、ビオチン化ＶＣＡＭ−１を、ビーズ１ｍｇあたり１４．４μｇのビオチン化ＶＣＡＭ−１の濃度で洗浄されたビーズに加え（ビーズ２０ｍｇあたり３６０μｇ／ｍｌのストックを８００μｌ）、反応チューブをローラーミキサー（ｒｏｌｌｅｒ ｍｉｘｅｒ）上に室温で２時間置いた。
【００５３】
このインキュベーションの後、ビーズを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ（ＩＣＮ ８１００３３）を含むダルベッコＰＢＳ中で前記のように４回洗浄し、最終的に、もとの容積（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｖｏｌｕｍｅ）（２ｍｌ）で０．１％ＢＳＡを含むダルベッコＰＢＳ中に再懸濁させ、４℃で保存した。
【００５４】
実施例４
全血の回収および処理
ヒトまたは動物（例えばラット、マウス、イヌ）の全血を、ヘパリンナトリウム中に回収した（１０単位／ｍｌ血液）。１ｍＭのＭｎ（最終濃度）をヒト、イヌおよびマウスの血液に加えてインテグリンの活性化状態を誘導し（しかし、ラットの血液はこのステップを必要としなかった。）、次いで、室温で１時間ローラーミキサー上に置き、その後、ビーズの食作用を防ぐために１５分間氷上で冷やした。
【００５５】
実施例５
生体外全血アッセイ
薬物またはビヒクルを投与されたヒトまたは動物からのヘパリン処理された全血の４９２．５μｌのアリコートを、７．５μｌのビオチン化ＶＣＡＭ−１ビーズまたは非被覆ビーズのいずれかを含む反応チューブ中に、２μｌの抗α４インテグリン・モノクローナル抗体を入れてまたは入れずに分配し、細胞接着の最大阻害を測定した（例えば、Ｈａｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０に記載された方法により製造したかまたはＳｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １２３０より購入したマウス抗ヒトＣＤ４９ｄ、クローンＨＰ２／１、Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ ６９７；マウス抗ラット ＣＤ４９ｄ、クローンＴＡ−２、Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １３８３Ｚ；ラット抗マウス ＣＤ４９ｄ、クローンＰＳ／２）。抗イヌＣＤ４９ｄ抗体は市販されていないが、抗ヒトＣＤ４９ｄクローンＨＰ２／１はイヌα４と交差反応する。
【００５６】
実施例６
インビトロでスパイクされた全血アッセイ
４８７．５μｌのヘパリン処理されたナイーブ・ヒトまたは動物全血のアリコートを、７．５μｌのビオチン化ＶＣＡＭビーズ、および２μｌの抗α４抗体含有または不含有のいずれか、およびα４β１インテグリン・インヒビターであると考えられる５μｌの化合物の溶液、またはコントロールとして、化合物を溶解させるために使用された５μｌの溶媒を含む反応チューブ中に分散させた。
【００５７】
実施例７
アッセイのプロトコール
上記のように処理された生体外またはインビトロの血液サンプルを含む反応チューブをウインドミル・ミキサー（ｗｉｎｄｍｉｌｌ ｍｉｘｅｒ）で４℃にて２時間回転させ、次いで、５００μｌの冷却ＰＢＳを各チューブに加え、反応チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置いてビーズを回収した。ビーズを６５０μｌの冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、フレキシブルＵ字底９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）３５３９１１， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌ冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後にビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に回収し、１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および −６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂ−１１５０）を各ウェルに加え、プレートを室温で暗所にて１時間インキュベートした。
【００５８】
この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９２８４）を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光をＦｍａｘ蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ）、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。
【００５９】
実施例８
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム（１０単位／ｍｌ）中に回収し、１０ｍｌのアリコートに分割した。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を一方のアリコートに加え、血液をローラーミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆ビーズまたは非被覆ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６０】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６１】
Ｍｎ２＋とのインキュベーションは、コントロールのサンプルにおいて約２倍の全血の細胞接着を誘導する。Ｍｎ２＋含有または不含有での細胞接着は、α４サブユニットのモノクローナル抗体により阻害されるが、イソタイプのコントロールは効果がない。Ｍｎ２＋含有または不含有でのＶＣＡＭ−１で被覆されていないビーズへの細胞接着はほとんど起こらない。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は細胞表面上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に大きく依存していることが、これらの結果により示唆される（図１）。
【００６２】
実施例９
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着はα４β１インテグリンに依存する。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンを入れたローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはマウス抗ヒトβ１、クローン３Ｓ３（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６３】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６４】
α４およびβ１インテグリンサブユニットの抗体は、ヒト全血の細胞接着を阻害するが、コントロールのイソタイプは効果を示さない。これは、接着の大部分がα４β１インテグリンに依存していることを示す（図２）。
【００６５】
実施例１０
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへの全血の細胞接着は、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターによりインビトロで濃度依存的に阻害される。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンを入れたローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０１〜１０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ヒトα４抗体、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６６】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６７】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの抗体は、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着を濃度依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。ヒト全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．０６μＭと評価された（図３）。
【００６８】
実施例１１
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
ＡＰ系統ラット由来のプールされヘパリン処理された全血（２０ｍｌ）を、ローラミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０３〜１０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６９】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００７０】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着を用量依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。ラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．３μＭと評価された（図４）。
【００７１】
実施例１２
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
５匹のラットのグループに浸透性ミニポンプからの皮下連続注入により小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（１０ｍｇ／ｋｇ／日）または生理食塩水（２４０μｌ／日）を投与した。４８時間後、α４β１インテグリン・インヒビターの血漿レベルが定常状態に達したときに、ラットを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した（１０単位／ｍｌ）。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７２】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。生理食塩水を注入されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。
【００７３】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの連続注入により、生体外での全血の細胞接着は７１％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）阻害される（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）（図５）。
【００７４】
実施例１４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
３匹のラットのグループに、静脈内ボラス注射により小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ）を投与した。注射１０、３０または１２０分後に、ラットのグループを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した（１０単位／ｍｌ）。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７５】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。投与後の各時間で、ビヒクルを注射されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。各血漿サンプルのアリコートにおけるα４β１インテグリン・インヒビターの濃度を液体クロマトグラフィー−質量分析計により測定した。
【００７６】
投与１０分後、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは生体外でのα４依存性全血の細胞接着を９９％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）減少させた（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）。投与３０分後、阻害は７８％であったが（Ｐ＜０．００１）、投与１２０分後は全血の細胞接着の阻害はなかった。注射後の時間経過に伴う阻害の減少は、インヒビターの血漿レベルおよびインビトロでラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要とされるインヒビターの濃度（０．２μｇ／ｍｌ）の減少と矛盾しない（図６）。
【００７７】
実施例１４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
４匹のラットのグループに、小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（２０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。投与２時間後に、ラットのグループを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７８】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。投与後の各時間で、ビヒクルを投与されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。各血漿サンプルのアリコートにおけるα４β１インテグリン・インヒビターの濃度を液体クロマトグラフィー−質量分析計により測定した。
【００７９】
投与１時間後、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは生体外でのα４依存性全血の細胞接着を９７％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）減少させた（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）。投与２時間後、阻害は６５％であった（Ｐ＜０．００１）。注射後（ｐｏｓｔ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の時間経過に伴う阻害の減少は、インヒビターの血漿レベルおよびインビトロでラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要とされるインヒビターの濃度（０．０３μｇ／ｍｌ）の減少と矛盾しない（図７）。
【００８０】
実施例１５
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
イヌ血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収した（１０単位／ｍｌ）。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を加え、血液をローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはコントロールのイソタイプ、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００８１】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８２】
イヌ全血の細胞接着は、ヒトα４インテグリンサブユニット（これはイヌα４と交差反応する。）に対するモノクローナル抗体により阻害されるが、コントロールのイソタイプは効果がない。ＶＣＡＭ−１で被覆されていないビーズへの細胞接着はほとんど起こらない。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞表面上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存していることがこれらの結果により示唆される（図８）。
【００８３】
実施例１６
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
イヌ血液（２０ｍｌ）を、ヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンの入ったローラミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０３〜３０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ヒトα４モノクローナル抗体、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００８４】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。インヒビターを含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８５】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着を濃度依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。イヌ全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．１μＭと評価された（図９）。
【００８６】
実施例１７
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
マウス血液をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、プールした。１０ｍｌのアリコートに分割した。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を２ｍｌののアリコートに加え、血液をローラーミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９２．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆ビーズおよび２μｌのラット抗マウスα４、クローンＰＳ／２（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、ラットＩｇＧ２ｂκ（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。代わりに、４８７．５μｌの血液を、７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（３μＭの最終濃度）を含むチューブ内に分配した。
【００８７】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８８】
マウス全血の細胞接着は、マウスα４インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体により阻害されるが、コントロールのイソタイプは効果がない。小分子性のα４β１インテグリン・インヒビターは、また、インビトロでマウス全血の細胞接着を阻害する。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズに対するマウス全血の細胞接着はα４インテグリンに大きく依存することがこれらの結果により示唆される（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
【図２】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、α４β１インテグリンに依存する。
【図３】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図４】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図５】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
【図６】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
【図７】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
【図８】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
【図９】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図１０】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
本発明は、生体外にて全血中の白血球接着分子（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と血管内皮リガンド（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｇａｎｄ）との間の結合性相互作用を測定する方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、白血球接着分子は、Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＶＬＡ−４）またはＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９としても知られるインテグリンα４β１であり、そして血管内皮リガンドはＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）である。本発明方法の特定の利点は、白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用が全血中で測定され得ることである。本方法は、とりわけ、接着分子とそのリガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の効果の測定に有用である。このような化合物は炎症性疾患の処置において有用性を有し得る。
【０００２】
α４β１は、他の細胞または細胞外マトリックスへの細胞の接着に関与するヘテロ二量体の細胞表面受容体のインテグリンファミリーに属する。インテグリンとそれらのタンパク質リガンドとの間の相互作用は、例えば特定の位置に細胞をつなぐか、細胞移動を促進するか、または細胞に対しそれらの環境から生存シグナルを提供することにより細胞機能を維持することの基本である。インテグリンにより認識されるリガンドには、細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンおよびフィブロネクチン；血漿タンパク質、例えばフィブリノーゲン；ならびに細胞表面分子、例えば免疫グロブリンスーパーファミリーおよび細胞結合補体（ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の膜貫通タンパク質が含まれる。インテグリンは、非共有結合で会合した糖タンパク質のサブユニット（αおよびβ）から構成される。少なくとも１６の異なるヒトインテグリンαサブユニットおよび少なくとも８の異なるβサブユニットが存在し、各βサブユニットは１以上のαサブユニットとヘテロダイマーを形成し得る。インテグリンとリガンドとの間の相互作用の特異性は、αおよびβサブユニット構成物により決定される。
【０００３】
α４β１は造血前駆細胞、末梢性および細胞障害性Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、胸腺細胞および好酸球を含む多数の造血細胞、ならびに確立された細胞系上に発現する。α４β１は２つの主要なリガンドを有し、その１つはＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）はＣＤ１０６としても知られ、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、活性化血管内皮細胞の表面、樹状細胞、マクロファージおよびフィブロブラストを含む他の広範な細胞の表面上に発現し、他は二者択一的にスプライシングされるＩＩＩ型結合セグメント（ＣＳ−１フィブロネクチン）を含むフィブロネクチンのイソフォームである。α４サブユニットは、また、β７サブユニットとヘテロダイマーを形成する。α４β７は、また、リガンドとしてＶＣＡＭ−１およびＣＳ−１フィブロネクチンを認識するが、Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）、主に小腸の血管内皮細胞上に発現した別の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーならびに比較的低い程度で結腸および脾臓に選択的に結合する。α４β７は、胃腸管粘膜および消化管関連リンパ様組織に選択的に戻るリンパ球上に発現し、そして粘膜の免疫の維持に関与し得る。
【０００４】
血液白血球の活性化および血管外遊出は、炎症性疾患の発現および進行に主要な役割を果たす。血管内皮への細胞接着は細胞が血液から炎症組織中に移動する前に必要とされ、血管内皮細胞の表面上の細胞接着分子と循環している白血球との間の特異的な相互作用により仲介される。
【０００５】
α４β１は炎症の間のリンパ球、単球および好酸球の補充に重要な役割を有する。α４β１のリガンドであるＶＣＡＭ−１の発現は、インビトロにおいて、内皮細胞に対し炎症性サイトカインによりアップレギュレーションされる。ＶＣＡＭ−１の発現は、また、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、アレルギー性喘息およびアテローム性動脈硬化症のようなヒトの炎症性疾患においてアップレギュレーションされるが、一方、ＣＳ−１フィブロネクチンの発現は、リウマチ様関節炎においてアップレギュレーションされる。α４インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体および小分子性α４β１インヒビターは、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、アレルギー性喘息、接触性皮膚炎、移植拒絶、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、および糸球体腎炎を含むヒトの炎症性疾患の多数の動物モデルにおいて有効であることが示された。
【０００６】
α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用を阻害する化合物は、喘息、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植拒絶、アテローム性動脈硬化症、接触性皮膚炎、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患および糸球体腎炎を含むヒトの多数の炎症性疾患または状態の処置に有効であると期待される。α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用を阻害する化合物の例は、ＷＯ９６／２０２１６、ＷＯ９７／０２２８９、ＷＯ９７／４９７３１、ＷＯ９９／２４３９８、ＷＯ００／０５２２３およびＷＯ００／０５２２４、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａに開示されている。
【０００７】
α４β１／ＶＣＡＭ−１インヒビターの開発は、これによりそれらの治療効果、すなわち血管内皮細胞上に発現したリガンドとの相互作用後に血液からα４β１を発現している白血球の補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の阻害、の優れた指標を提供するので、ヒトまたは動物への投与後の全血サンプル中のそれらの活性を試験する能力により促進されるであろう。しかしながら、このような全血のアッセイ（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ａｓｓａｙ）は今まで報告されていなかった。
【０００８】
α４β１／ＶＣＡＭ−１インヒビターの探索に使用されてきた現在利用可能な方法には、精製α４β１とリガンドタンパク質との間の相互作用の阻害またはα４β１を発現している細胞とリガンドとの相互作用の阻害をインビトロでスクリーニングすることが含まれる。例えば、Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７， １５８， １７１０−１７１８）は、ＶＣＡＭ−ＩｇＧ−結合ビーズへの蛍光標識ＨＬ−６０およびＲａｍｏｓ細胞系の結合の阻害を測定した。Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ４０， ３３５９−３３６８）は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のフォーマットを用いて９６ウェル・プレートに結合したＶＣＡＭ−１への精製α４β１の結合の阻害およびＶＣＡＭ−１−ＩｇＧキメラで被覆された９６ウェル・プレートへのＲａｍｏｓ細胞系の接着の阻害を測定した。Ｌｉｎら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ４２， ９２０−９３４）は、アルカリホスファターゼと結合したＶＣＡＭ−Ｉｇの結合の阻害を測定した。Ｈａｗｏｒｔｈら（Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０）は、α４β１インヒビターを同定するために９６ウェル・プレート上に被覆されたヒト血漿フィブロネクチンへのＭＯＬＴ−４細胞系の接着の阻害を使用した。
【０００９】
同様の技術は、単離されα４β１を発現している血液白血球とα４β１リガンドとの相互作用に対するインビトロでの化合物の効果を測定するために使用され得る。しかしながら、これらの方法は実験動物またはヒトに投与された可逆的なα４β１インヒビターの生体外での効果を測定するのには不適当である。なぜなら、目的の白血球を他の血液−骨細胞から単離するために要するステップの間に化合物が洗い流されるからである。さらに、プラスチック・プレート中で固定されたα４β１リガンドへのα４β１−介在性白血球の接着の全血測定は、静的な条件下では赤血球細胞が白血球よりも早く沈降し、白血球のα４β１と固定されたリガンドとの間の相互作用が妨げられるので不可能であった。
【００１０】
したがって、現在利用可能な方法の不都合な点を克服する新たな方法の必要性が存在する。特に、α４β１とＶＣＡＭ−１との間の結合性相互作用が全血中で測定できる新たな方法が必要とされる。このような方法は、本発明において開示される方法により提供される。
【００１１】
本発明において、我々は、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の新規測定方法を開発した。本発明の方法の利点は、特に、全血中で白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の測定を可能にすることである。したがって、本発明の方法は血液白血球の単離を必要としない。血液白血球の単離にかかわる分離および分取の手順は多くの白血球の特性を変えることは、当業者に周知である。したがって、このような分離および分取の手順を必要とする従来の方法では、血管内皮リガンドに結合する白血球接着分子の厳密な表示は提供されない。
【００１２】
本発明の方法は、とりわけ、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の効果の測定に有用である。化合物の効果は、インビトロで血液サンプルを化合物でスパイクする（ｓｐｉｋｉｎｇ）ことにより測定され得る。化合物の効果は、また、任意の簡便な投与経路を用いてヒトまたは動物に該化合物を投与した後に生体外で測定され得る。
【００１３】
本発明の方法は、化合物の活性に関連づけた血漿タンパク質の効果の表示を与えるために使用され得る。それらは、また、化合物の薬物動態学的情報を投与後の活性および作用の持続と関連づけることを可能にする。さらに、全血中の化合物の活性を測定する能力は、ヒトの疾患における化合物の有効性の代用マーカー（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍａｒｋｅｒ）として使用され得、その結果、臨床試験に着手する場合に化合物の有効投与量を自信をもって予測することができる。
【００１４】
本発明の方法において、全血は、目的の血管内皮リガンドが結合している移動可能な固相（ｍｏｂｉｌｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）と、例えば適当なリンカーを介するかまたは直接吸着（ｄｉｒｅｃｔ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により混合される。インキュベーション後、移動可能な固相および接着性の細胞を残りの血液成分から回収し、そして分離し、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用が測定される。
【００１５】
本発明の方法は、特に、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する化合物の同定に有用である。
【００１６】
したがって、本発明の１つの観点にしたがって、
（ｉ） 全血中の白血球接着分子を、所望により試験化合物の存在下で、血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントで被覆した移動可能な固相と接触させること；
および
（ｉｉ） 移動可能な固相および接着した細胞を（ｉ）から回収し、分離すること
および
（ｉｉｉ） 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること
および
（ｉｖ） 所望により、試験化合物が白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節するかどうかを測定すること：
を含むアッセイ方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法は、例えば最適のアッセイ条件を見出すため、対象間の相互作用の変動性を測定するため、一塩基多型による相互作用の相違を調べるため、白血球の接着を活性化する刺激の効果を調査するために、試験化合物の不存在下にて生体外で全血中の白血球接着分子と血管内皮細胞リガンドとの間の相互作用の程度を測定するのに有用である。
【００１８】
本発明の方法は、とりわけ、生体外で全血中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用に対する化合物の効果を測定するのに有用である。
【００１９】
したがって、好ましい実施態様において、試験化合物の存在下で実施される場合のステップ（ｉ）には、
（ａ） 試験化合物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与すること
および
（ｂ） 該対象から全血を取得すること
が含まれる。
【００２０】
本発明のさらなる観点にしたがって、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定するための生体外全血アッセイ方法が提供され、該方法には、
（ｉ） 全血中の白血球接着分子を、所望により試験化合物の存在下で、血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）移動可能な固相と接触させること；
（ｉｉ） 移動可能な固相および接着した細胞を（ｉ）から回収し、分離すること；
（ｉｉｉ） 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること；および、
（ｉｖ） 所望により、試験化合物が白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節するかどうかを測定すること：
が含まれる。
【００２１】
本発明のさらなる観点にしたがって、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する試験化合物の能力を測定する方法が提供され、該方法には
（ａ） 試験化合物を対象に投与すること；
（ｂ） 全血を該対象から取得すること；
（ｃ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｄ） 他の血液成分から移動可能な固相と結合した接着細胞を回収し、分離すること；および
（ｅ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること：
が含まれる。
【００２２】
本発明のさらなる観点にしたがって、全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する、対象に投与された、試験化合物の能力を測定する方法が提供され、該方法には、
（ａ） 対象から全血を取得すること；
（ｂ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｃ） 他の血液成分から移動可能な固相と結合した接着細胞を回収し、分離すること；および
（ｄ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること：
が含まれる。
【００２３】
本発明のアッセイ方法には、好ましくは、白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の表面の白血球接着分子と固相に付着した血管内皮リガンドフォームとの間の相互作用を介して移動可能な固相に結合／接着した細胞の量または相対数を測定または検出することが含まれる。このような細胞は手で計数され得る。代わりに、タンパク質の結合量を測定すること、細胞内または細胞上に存在するバイオマーカーの存在を測定すること、または細胞表面上に吸着しているかもしくは細胞内に取り込まれた標識を検出することのような間接的な測定も実施され得る。当業者は、本発明において使用するための適当な細胞検出／測定方法を実施できるであろう。
【００２４】
個体から単離された血液は、通常、凝固を避けるために抗凝血剤で処理される。したがって、単離された血液は、好ましくは、ヘパリンのような抗凝血剤中に回収される。
【００２５】
「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）」なる用語は、本明細書においてリンパ球、好酸球、好中球、単球およびマクロファージを含む任意の種類の白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を言及するために使用される。
【００２６】
「白血球接着分子」なる用語は、本明細書において白血球の表面上に発現した接着分子を言及するために使用され、これは白血球と血管壁との間の結合性相互作用を仲介する。
【００２７】
「血管内皮リガンド」なる用語は、本明細書において白血球接着分子との結合性相互作用を受ける血管壁中の接着分子を言及するために使用される。血管内皮リガンドは細胞表面、例えば血管内皮細胞上に発現し得る。代わりに、血管内皮リガンドは細胞外マトリックス内に位置し得る。
【００２８】
本発明の方法における使用に適した白血球接着分子とそれらに対応する血管内皮リガンドの例は、表１に示される。（再考のため、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ−Ｍａｒｋｓ， Ｎ． ＆ Ｌｉｐｓｋｙ， Ｐ．Ｅ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ＆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． １９９６， ７９， ２０３−２１０； Ｅｌａｎｇｂａｕｍ， Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｖｅｔ． Ｐａｔｈｏｌ． １９９７， ３４， ６１−７３参照）
【００２９】
【表１】
本発明の特に好ましい実施態様において、白血球接着分子はα４β１であり、血管内皮リガンドはＶＣＡＭ−１である。
【００３１】
任意の簡便な移動可能な固相が使用され得る。固体支持体は、ガラス、プラスチック、ポリマー、ポリサッカライド、樹脂、シリカまたはシリカベースの物質等でできていてもよい。「移動可能な固相」なる用語は、本明細書において、血管内皮細胞リガンドが結合し得、かつ、血液サンプルが継続的に混合されている場合に血液サンプル中の細胞とともに自由に循環し得る、固体粒状物質を言及するために使用される。好ましい実施態様において、固相は他の血液成分から回収されるか分離される。固相を血液から回収または分離するために、さまざまな方法が利用可能であることは、当業者に明らかである。移動可能な固相は任意の形であり得るが、ビーズの形の固相を使用することが非常に簡便である。本発明の好ましい観点において、固相はマグネチック・ビーズを含み、これには超常磁性ビーズが含まれ、これは磁石を用いて回収され得る。しかしながら、他の適当な方法には、差異遠心法、フローサイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィーなどが含まれる。
【００３２】
本発明の方法は、任意の簡便な供給源からの全血中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定するために使用され得る。好ましくは、全血はヒトまたは動物の血液である。最も好ましくは、全血はヒトの血液である。
【００３３】
いくつかの場合において、白血球接着分子は、不活性なコンホメーションであるかまたは細胞表面上に少量存在するかまたは血管内皮細胞リガンドとの相互作用のアフィニティーが低くなるように細胞表面上に分配されていてもよい。このような場合において、白血球は、接着分子におけるコンホメーションの変化の原因となるかまたはその発現を増加させるかまたは細胞膜の領域内での密集化を引き起こし、その結果、白血球接着分子とその血管内皮細胞リガンドとの間の相互作用のアフィニティーおよび／またはアビディティーを増加させる薬品による活性化を必要とし得る。このような変化は、白血球における一定の細胞内シグナル経路を活性化するかまたは白血球表面上の接着分子と直接相互作用する薬品により引き起こされ得る。例えば、白血球インテグリンＶＬＡ−４は、二価カチオンまたはＶＬＡ−４と相互作用してコンホメーションの変化を引き起こす活性化モノクローナル抗体で白血球を処理することにより活性化され得る。ケモカインまたは補体成分のアナフィラトキシンファミリーは、白血球表面上のレセプターと相互作用し、細胞内シグナル経路を活性化してインテグリンの活性化を引き起こすかまたは白血球表面上での増加した発現を引き起こす。ホルボールエステルでの白血球細胞内プロテインキナーゼの活性化は、また、インテグリンのコンホメーションの変化、密集化または発現を引き起こし得る。したがって、１つの実施態様において、全血は、所望により白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を活性化するための適当な刺激で処置され得る。適当な刺激の例には、マンガンのような二価カチオン；ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）のような細胞内シグナル経路のアクチベーター；バクテリア性リポポリサッカライド、ロイコトリエンＢ４；補体成分Ｃ５ａ；ケモカインファミリーの走化性タンパク質のメンバー、例えば単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）または活性化状態における変化を引き起こすインテグリンに結合する抗体が含まれる（Ｍａｓｕｍｏｔｏ ＆ Ｈｅｍｌｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ２６８， ２２８−２３４； Ｗｅｂｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９６， ９３， １０９３９−１０９４４； Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ＆ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １９９５， ３， １３１−１４２； Ｗｅｂｅｒ Ｋ．Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １９９９， １０， ８６１−８７３； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０００， ２４０，１２５−１３２）。
【００３４】
「ホモログ」なる用語は、血管内皮リガンドタンパク質の配列に対して実質的に類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。ホモログは、同じ種からのタンパク質、すなわち同属のプロテインファミリーのメンバーであり得る。代わりに、ホモログは、ラットまたはマウスのような異なる種由来の類似のタンパク質であってもよい。好ましくは、ホモログはヒトのホモログである。簡便なホモログには、血管内皮リガンドの配列と７０％以上の配列相同性を有するものが含まれる。好適な配列相同性には７５％および８０％の同一性が含まれ、他の好適な配列相同性には８５％および９０％の同一性が含まれ、さらに好ましい配列相同性には９５％の同一性が含まれる。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「血管内皮リガンドフォーム（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒｍ）」なる用語により、本発明、すなわち完全長、フラグメントおよびホモログにおいて使用される各々の完全長または変異体の血管内皮リガンドを意味する。
【００３６】
血管内皮リガンドがＶＣＡＭ−１である場合において、簡便なホモログには、Ｈｅｓｓｉｏｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， ６６８２−６６８５ および Ｏｓｂｏｒｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１において詳説されたように、ＶＣＡＭ−１の配列と７０％以上の配列相同性を有するものが含まれる。好適な配列相同性には７５％および８０％の同一性が含まれ、他の好適な配列相同性には８５％および９０％の同一性が含まれ、さらに好ましい配列相同性には９５％の同一性が含まれる。
【００３７】
インテグリンが、リガンドタンパク質の三次構造により適当なコンホメーション内に存在する短いペプチド配列を認識することによって、それらの血管内皮細胞リガンドに結合することはよく知られている。例えば、インテグリンＶＬＡ−４は、ＶＣＡＭ−１の細胞外第１および第４ドメインに発見された、フィブロネクチンのＩＩＩＣＳドメイン中のロイシン−アスパラギン酸−バリン（ＬＤＶ）トリペプチド（Ｎ末端からＣ末端の順）モチーフおよび対応するイソロイシン−アスパラギン酸−セリン（ＩＤＳ）モチーフを認識する（Ｋｏｍｏｒｉｙａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １５０７５−１５０７９； Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １９９４， １０７， ２１２７−２１３５）。本明細書で使用される「フラグメント」には、例えばＶＬＡ−４、２５アミノ酸のＣＳ−１ペプチドまたはＬＤＶを含む環上ペプチドの場合において、結合性アフィニティーが親タンパク質と同様になるように適当なコンホメーションで存在するこのような認識モチーフを含む６以上の連続的なアミノ酸の血管内皮リガンドを含むペプチドが含まれる（Ｈａｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０）。血管内皮リガンドが炭水化物、例えばＥ−セレクチンである場合には、「フラグメント」なる用語には、６以上の連続的なモノサッカライド単位を含むオリゴサッカライドが含まれる。Ｈｅｓｓｉｏｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， ６６８２−６６８５ および Ｏｓｂｏｒｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１で詳説されたＶＣＡＭ−１配列のＶＣＡＭ−１のフラグメントには６以上の連続的なアミノ酸を含むペプチドが含まれ、ＩＤＳモチーフが含まれる。好ましくは、フラグメントは、それらの由来となる完全長の分子と白血球接着分子に関して同一または本質的に同一の結合性アフィニティーを有する。
【００３８】
特に好適な実施態様において、血管内皮リガンドは、Ｍａｋａｒｅｍ Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ４００５−４０１１に記載されたように、７−ドメインフォーム（経膜部および細胞質ドメインを除く）を含むＶＣＡＭ−１のフラグメントである。ＶＣＡＭ−１のさらに好適なフラグメントには、少なくとも最初の２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメイン（Ｏｓｂｏｒｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９２， １７６， ９９−１０７）；７ドメインＶＣＡＭ−１の４番目の免疫グロブリン様ドメインを欠くＶＣＡＭ−１の別のスプライシングされた６ドメインフォーム（Ｏｓｂｏｒｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １９８９， ５９， １２０３−１２１１）；および免疫グロブリンＧのＦｃ領域に融合したＶＣＡＭ−１の少なくとも最初の２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメインを含む融合タンパク質（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ＆ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １９９５， ３， １３１−１４２； Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７， １５８， １７１０−１７１８）；
を含むＶＣＡＭ−１のトランケートされた形態が含まれる。
【００３９】
接着した白血球の数を定量できる任意の適当な方法が本発明において使用され得る。これらには、例えば顕微鏡を用いて細胞の数を直接計数すること、タンパク質またはＤＮＡの濃度を測定すること、あるいは構成成分、すなわち白血球内もしくは白血球上に見出されるかまたは白血球により分泌された酵素または他のタンパク質の濃度を測定することが含まれる。好ましい実施態様において、接着した白血球の数は、適当な検出可能な標識、例えば放射活性標識、抗体または蛍光色素を用いて測定され得る。特に好ましい実施態様において、マーカーは細胞に取り込まれそして細胞内に保持されるＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂ−１１５０）である。ＢＣＥＣＦで標識された細胞から放出された蛍光シグナルは、細胞を洗浄しそして溶解させ、そして蛍光計を用いて測定することにより容易に測定され得る。
【００４０】
白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の調節には、刺激または阻害のどちらかが含まれる。しがたって、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の調節が可能な化合物は、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物である。「白血球接着分子／血管内皮リガンドの結合性相互作用のモジュレーター」および「白血球接着分子／血管内皮リガンド・モジュレーター」なる語は、また、本明細書において、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物を言及するために使用される。本発明の化合物は、炎症性疾患の処置における有用性を有する；一般的に、これは白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用の阻害により発生する。
【００４１】
同様に、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用の調節には、刺激または阻害のどちらかが含まれる。したがって、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用の調節が可能な化合物は、α４β１とＶＡＣＭ−１との間の結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物である。「α４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用のモジュレーター」および「α４β１／ＶＡＣＭ−１モジュレーター」なる語は、また、本明細書において、α４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用を刺激するかまたは阻害する化合物を言及するために使用される。本発明の化合物は、炎症性疾患の処置における有用性を有する；一般的に、これはα４β１／ＶＡＣＭ−１結合性相互作用の阻害により発生する。
【００４２】
本発明の方法において試験され得る化合物には、通常「小分子」として知られる単純な有機分子、例えば２０００ダルトン未満の分子量を有するものが含まれる。該方法は、また、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を含むペプチドライブラリーのような化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。他の適当な分子には、抗体、ヌクレオチド配列および白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する他の任意の分子が含まれる。
【００４３】
白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用のモジュレーターを同定後、次いで、医薬化学の技術がさらにその特性を特異化（ｒｅｆｉｎｅ）するため、例えば効力を増大させるためおよび／または副作用を減少させるために適用され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「生体外で化合物の効果を測定すること」なる用語は、化合物を対象に投与し、血液サンプルを採取し、対象から採取された血液サンプル中の化合物の効果を測定することを意味する。
【００４５】
対象は任意の種であり得、好ましくは、対象はヒトまたは動物の対象であり得る。
化合物は任意の適当な経路を用いて、例えば静脈内、腹膜内、皮下もしくは筋肉内注射により、または経口または局所投与により該対象に投与され得る。好適な実施態様において、化合物は経口投与により投与される。
【００４６】
ここで、下記の実施例および図面を参照することにより本発明を例示するが、これにより本発明は制限されない。
【００４７】
図面の説明
図１
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
図２
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、α４β１インテグリンに依存する。
図３
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
図４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【００４８】
図５
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
図６
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
図７
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
図８
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
図９
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
図１０
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
【００４９】
実施例
実施例１
ヒトＶＣＡＭ−１の精製
ヒト組換えＶＣＡＭ−１（経膜部および細胞質ドメインを除いた７ドメインフォーム、Ｍａｋａｒｅｍ Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ２６９， ４００５−４０１１）をバキュロウイルス発現系（Ｓｒｉｄｈａｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ．， Ｖｏｌ １９， ｐｐ６０３−６１４）を用いて昆虫細胞中で発現させるか、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫ （カタログ番号 ＡＤＰ５）から入手した。ＶＣＡＭ−１を昆虫細胞から下記のようにアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１Ｇ１１モノクローナル抗体（ＲＰＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）を製造者推奨のプロトコールを用いてＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ １７−０４３０−０１）に結合させた。次いで、１Ｇ１１アフィニティーカラムをパッキングし、２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、４℃で平衡化させた。次いで、ＶＣＡＭ−１を含む昆虫細胞の上清を０．４５μｍでろ過し、１Ｇ１１アフィニティーカラムに負荷した。フロースルーを２８０ｎｍでモニターした。痕跡（ｔｒａｃｅ）がベースラインに戻るまで、カラムを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。次いで、ＶＣＡＭ−１を０．２Ｍ酢酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出させた。フラクションはすぐに２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。ＶＣＡＭ−１を含むフラクションをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル解析により同定し、プールし、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で透析した。
【００５０】
実施例２
ＶＣＡＭ−１のビオチン化
ＶＣＡＭ−１を１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２中に透析した。これにリンカー対タンパク質が１：５の比になるようにＮＨＳ−ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ ２１３３５）を加え、得られた溶液を室温で１時間インキュベートした。次いでこれを、保存と未反応のリンカーの除去の両方の目的で、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に透析した。
【００５１】
実施例３
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎへのビオチン化ＶＣＡＭ−１の固定化
使用前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ （ＵＫ） Ｌｔｄ）を、０．０２％ＮａＮ３保存剤を除去するためにダルベッコ・リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １４０４０−０９１）中で２回洗浄した。これは、均質な懸濁液を得るためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをボルテックスで混合し、新たな反応チューブに２０ｍｇ（２ｍｌ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを加えることにより行われた。次いで、該チューブをＤｙｎａｌＭＰＣ（登録商標）（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）中に５分間置いてすべてのビーズを回収し、該チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）においたまま上清を吸引により取り除いた。次いで、該チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）から取り出し、１ｍｌのダルベッコＰＢＳを加え、そしてチューブをゆっくりと逆さにしてすべてのビーズを再懸濁させ、その後Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）に戻すという手順を繰り返した。最後に上清を吸引により除去すると、ビーズのペレットが残った。
【００５２】
次いで、ビオチン化ＶＣＡＭ−１を、ビーズ１ｍｇあたり１４．４μｇのビオチン化ＶＣＡＭ−１の濃度で洗浄されたビーズに加え（ビーズ２０ｍｇあたり３６０μｇ／ｍｌのストックを８００μｌ）、反応チューブをローラーミキサー（ｒｏｌｌｅｒ ｍｉｘｅｒ）上に室温で２時間置いた。
【００５３】
このインキュベーションの後、ビーズを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ（ＩＣＮ ８１００３３）を含むダルベッコＰＢＳ中で前記のように４回洗浄し、最終的に、もとの容積（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｖｏｌｕｍｅ）（２ｍｌ）で０．１％ＢＳＡを含むダルベッコＰＢＳ中に再懸濁させ、４℃で保存した。
【００５４】
実施例４
全血の回収および処理
ヒトまたは動物（例えばラット、マウス、イヌ）の全血を、ヘパリンナトリウム中に回収した（１０単位／ｍｌ血液）。１ｍＭのＭｎ（最終濃度）をヒト、イヌおよびマウスの血液に加えてインテグリンの活性化状態を誘導し（しかし、ラットの血液はこのステップを必要としなかった。）、次いで、室温で１時間ローラーミキサー上に置き、その後、ビーズの食作用を防ぐために１５分間氷上で冷やした。
【００５５】
実施例５
生体外全血アッセイ
薬物またはビヒクルを投与されたヒトまたは動物からのヘパリン処理された全血の４９２．５μｌのアリコートを、７．５μｌのビオチン化ＶＣＡＭ−１ビーズまたは非被覆ビーズのいずれかを含む反応チューブ中に、２μｌの抗α４インテグリン・モノクローナル抗体を入れてまたは入れずに分配し、細胞接着の最大阻害を測定した（例えば、Ｈａｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９， １２６， １７５１−１７６０に記載された方法により製造したかまたはＳｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １２３０より購入したマウス抗ヒトＣＤ４９ｄ、クローンＨＰ２／１、Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ ６９７；マウス抗ラット ＣＤ４９ｄ、クローンＴＡ−２、Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １３８３Ｚ；ラット抗マウス ＣＤ４９ｄ、クローンＰＳ／２）。抗イヌＣＤ４９ｄ抗体は市販されていないが、抗ヒトＣＤ４９ｄクローンＨＰ２／１はイヌα４と交差反応する。
【００５６】
実施例６
インビトロでスパイクされた全血アッセイ
４８７．５μｌのヘパリン処理されたナイーブ・ヒトまたは動物全血のアリコートを、７．５μｌのビオチン化ＶＣＡＭビーズ、および２μｌの抗α４抗体含有または不含有のいずれか、およびα４β１インテグリン・インヒビターであると考えられる５μｌの化合物の溶液、またはコントロールとして、化合物を溶解させるために使用された５μｌの溶媒を含む反応チューブ中に分散させた。
【００５７】
実施例７
アッセイのプロトコール
上記のように処理された生体外またはインビトロの血液サンプルを含む反応チューブをウインドミル・ミキサー（ｗｉｎｄｍｉｌｌ ｍｉｘｅｒ）で４℃にて２時間回転させ、次いで、５００μｌの冷却ＰＢＳを各チューブに加え、反応チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置いてビーズを回収した。ビーズを６５０μｌの冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、フレキシブルＵ字底９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）３５３９１１， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌ冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後にビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に回収し、１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および −６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｂ−１１５０）を各ウェルに加え、プレートを室温で暗所にて１時間インキュベートした。
【００５８】
この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９２８４）を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光をＦｍａｘ蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ）、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。
【００５９】
実施例８
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム（１０単位／ｍｌ）中に回収し、１０ｍｌのアリコートに分割した。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を一方のアリコートに加え、血液をローラーミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆ビーズまたは非被覆ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６０】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６１】
Ｍｎ２＋とのインキュベーションは、コントロールのサンプルにおいて約２倍の全血の細胞接着を誘導する。Ｍｎ２＋含有または不含有での細胞接着は、α４サブユニットのモノクローナル抗体により阻害されるが、イソタイプのコントロールは効果がない。Ｍｎ２＋含有または不含有でのＶＣＡＭ−１で被覆されていないビーズへの細胞接着はほとんど起こらない。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は細胞表面上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に大きく依存していることが、これらの結果により示唆される（図１）。
【００６２】
実施例９
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着はα４β１インテグリンに依存する。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンを入れたローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはマウス抗ヒトβ１、クローン３Ｓ３（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６３】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６４】
α４およびβ１インテグリンサブユニットの抗体は、ヒト全血の細胞接着を阻害するが、コントロールのイソタイプは効果を示さない。これは、接着の大部分がα４β１インテグリンに依存していることを示す（図２）。
【００６５】
実施例１０
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへの全血の細胞接着は、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターによりインビトロで濃度依存的に阻害される。
ヒト血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンを入れたローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０１〜１０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ヒトα４抗体、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６６】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００６７】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの抗体は、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着を濃度依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。ヒト全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．０６μＭと評価された（図３）。
【００６８】
実施例１１
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
ＡＰ系統ラット由来のプールされヘパリン処理された全血（２０ｍｌ）を、ローラミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０３〜１０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００６９】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００７０】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着を用量依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。ラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．３μＭと評価された（図４）。
【００７１】
実施例１２
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
５匹のラットのグループに浸透性ミニポンプからの皮下連続注入により小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（１０ｍｇ／ｋｇ／日）または生理食塩水（２４０μｌ／日）を投与した。４８時間後、α４β１インテグリン・インヒビターの血漿レベルが定常状態に達したときに、ラットを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した（１０単位／ｍｌ）。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７２】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。生理食塩水を注入されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。
【００７３】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの連続注入により、生体外での全血の細胞接着は７１％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）阻害される（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）（図５）。
【００７４】
実施例１４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
３匹のラットのグループに、静脈内ボラス注射により小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ）を投与した。注射１０、３０または１２０分後に、ラットのグループを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した（１０単位／ｍｌ）。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７５】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。投与後の各時間で、ビヒクルを注射されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。各血漿サンプルのアリコートにおけるα４β１インテグリン・インヒビターの濃度を液体クロマトグラフィー−質量分析計により測定した。
【００７６】
投与１０分後、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは生体外でのα４依存性全血の細胞接着を９９％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）減少させた（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）。投与３０分後、阻害は７８％であったが（Ｐ＜０．００１）、投与１２０分後は全血の細胞接着の阻害はなかった。注射後の時間経過に伴う阻害の減少は、インヒビターの血漿レベルおよびインビトロでラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要とされるインヒビターの濃度（０．２μｇ／ｍｌ）の減少と矛盾しない（図６）。
【００７７】
実施例１４
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
４匹のラットのグループに、小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（２０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。投与２時間後に、ラットのグループを屠殺し、２ｍｌの血液サンプルを各ラットからヘパリン中に回収した。各血液サンプルをローラーミキサーで室温にて０．５時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、各ラットからの血液の２つのアリコート（４９２．５μｌ）を２μｌのマウス抗ラットα４モノクローナル抗体、クローンＴＡ−２（４μｇ／ｍｌ）の入ったまたは入っていない７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００７８】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）含有氷冷ダルベッコリン酸緩衝性生理食塩水を加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。投与後の各時間で、ビヒクルを投与されたラットからのサンプルにおける最大の蛍光の百分率として結果を表す。各血漿サンプルのアリコートにおけるα４β１インテグリン・インヒビターの濃度を液体クロマトグラフィー−質量分析計により測定した。
【００７９】
投与１時間後、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは生体外でのα４依存性全血の細胞接着を９７％（全蛍光と抗ラットα４抗体の存在下での蛍光との差）減少させた（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ−検定）。投与２時間後、阻害は６５％であった（Ｐ＜０．００１）。注射後（ｐｏｓｔ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の時間経過に伴う阻害の減少は、インヒビターの血漿レベルおよびインビトロでラット全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要とされるインヒビターの濃度（０．０３μｇ／ｍｌ）の減少と矛盾しない（図７）。
【００８０】
実施例１５
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
イヌ血液（２０ｍｌ）をヘパリンナトリウム中に回収した（１０単位／ｍｌ）。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を加え、血液をローラーミキサーで室温で１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９０．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび２μｌのマウス抗ヒトα４、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）またはコントロールのイソタイプ、マウスＩｇＧ１（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００８１】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８２】
イヌ全血の細胞接着は、ヒトα４インテグリンサブユニット（これはイヌα４と交差反応する。）に対するモノクローナル抗体により阻害されるが、コントロールのイソタイプは効果がない。ＶＣＡＭ−１で被覆されていないビーズへの細胞接着はほとんど起こらない。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞表面上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存していることがこれらの結果により示唆される（図８）。
【００８３】
実施例１６
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで、小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
イヌ血液（２０ｍｌ）を、ヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、１ｍＭ塩化マンガンの入ったローラミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４８７．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（０．０３〜３０μＭの最終濃度）の希釈液またはＰＢＳまたは２μｌのマウス抗ヒトα４モノクローナル抗体、クローンＨＰ２／１（４μｇ／ｍｌ）を含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。
【００８４】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、１００μｌのアリコートの溶液を各ウェルからきれいな９６ウェル平底プレートに移した。各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。インヒビターを含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８５】
小分子性α４β１インテグリン・インヒビターは、ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着を濃度依存的に阻害する。最大の阻害は、抗α４モノクローナル抗体で得られるものに等しかった。イヌ全血の細胞接着を５０％阻害するのに必要な小分子性インヒビターの濃度（ＩＣ５０）は、０．１μＭと評価された（図９）。
【００８６】
実施例１７
ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
マウス血液をヘパリンナトリウム中に回収し（１０単位／ｍｌ）、プールした。１０ｍｌのアリコートに分割した。塩化マンガン（１ｍＭの最終濃度）を２ｍｌののアリコートに加え、血液をローラーミキサーで室温にて１時間インキュベートした。氷上で１５分間冷却後、血液のアリコート（４９２．５μｌ）を７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆ビーズおよび２μｌのラット抗マウスα４、クローンＰＳ／２（４μｇ／ｍｌ）またはイソタイプのコントロール、ラットＩｇＧ２ｂκ（４μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを含むポリプロピレン微小遠心管中に分配した。代わりに、４８７．５μｌの血液を、７．５μｌのＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズおよび５μｌの小分子性α４β１インテグリン・インヒビター（３μＭの最終濃度）を含むチューブ内に分配した。
【００８７】
チューブをウインドミル・ミキサーで４℃にて２時間回転させ、その後、５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に１０分間置き、ビーズを回収した。ビーズを６５０μｌ冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、９６ウェル・フレキシブルＵ字底プレート中に３つに分けた（２００μｌのアリコート）。プレートをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上に５分間置き、ビーズを回収し、２００μｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネット上で回収し、各ウェルに１００μｌの１００μＭ ＢＣＥＣＦ−ＡＭを加え、プレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。この後に、冷却ＰＢＳでの洗浄の手順を３回繰り返し、その後、各ウェルに蒸留水中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１３０μｌ加えてビーズに接着している細胞を溶解させた。ビーズをもう一度Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）マグネットにより捕捉し、その後、各ウェルからの１００μｌのアリコートの溶液をきれいな９６ウェル平底プレートに移し、各ウェルの蛍光を蛍光計、励起光４８５ｎｍ、放出光５３８ｎｍを用いて測定した。抗体を含まないコントロールのサンプルにおける蛍光の百分率として結果を表す。
【００８８】
マウス全血の細胞接着は、マウスα４インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体により阻害されるが、コントロールのイソタイプは効果がない。小分子性のα４β１インテグリン・インヒビターは、また、インビトロでマウス全血の細胞接着を阻害する。ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズに対するマウス全血の細胞接着はα４インテグリンに大きく依存することがこれらの結果により示唆される（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆しているＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
【図２】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、α４β１インテグリンに依存する。
【図３】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのヒト全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図４】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図５】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内連続注入により阻害される。
【図６】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの静脈内ボラス注射により阻害される。
【図７】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのラット全血の細胞接着は、生体外で小分子性α４β１インテグリン・インヒビターの経口投与により阻害される。
【図８】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、細胞上のα４インテグリンとビーズを被覆するＶＣＡＭ−１との間の相互作用に依存する。
【図９】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのイヌ全血の細胞接着は、インビトロで小分子性α４β１インテグリン・インヒビターにより濃度依存的に阻害される。
【図１０】ＶＣＡＭ−１被覆マグネチック・ビーズへのマウス全血の細胞接着は、α４インテグリン依存性である。
Claims (13)
- 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定するための生体外全血アッセイ方法であって：
（ｉ） 全血中の白血球接着分子を、所望により試験化合物の存在下で、血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と接触させること；
（ｉｉ） 移動可能な固相および接着細胞を（ｉ）から回収および分離すること；
（ｉｉｉ） 白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること；
（ｉｖ） 所望により、試験化合物が白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節するかどうかを測定すること；
を含む方法。 - 試験化合物の存在下で行われる場合に、ステップ（ｉ）が：
（ａ） 試験化合物を対象に投与すること；および
（ｂ） 対象から全血を取得すること；
を含む、請求項１に記載の方法。 - 全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する試験化合物の能力を測定するための方法であって：
（ｆ） 試験化合物を対象に投与すること；
（ｇ） 対象から全血を取得すること；
（ｈ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｉ） 他の血液成分から移動可能な固相に結合した接着細胞を回収し分離すること；そして
（ｊ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること；
を含む方法。 - 全血中の白血球接着分子とその血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を調節する、対象に投与された、試験化合物の能力を測定するための方法であって：
（ｅ） 対象から全血を取得すること；
（ｆ） 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントを提示している移動可能な固相と全血を接触させること；
（ｇ） 他の血液成分から移動可能な固相に結合した接着細胞を回収し分離すること；そして
（ｈ） 血液中の白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を測定すること；
を含む方法。 - 接着細胞の量または相対数が測定される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 接着細胞の量または相対数が、放射性マーカー、抗体または蛍光色素のようなマーカーで細胞を標識することにより測定される、請求項４に記載の方法。
- マーカーが蛍光色素：ＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステルである、請求項６に記載の方法。
- 血管内皮リガンドまたはそのホモログもしくはフラグメントが、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＩＣＡＭ−１；ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ１５０）、Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＭＡｄＣＡＭ）−１、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、グリコシル化依存性細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）−１および血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）−１（ＣＤ３１）からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 血管内皮リガンドが、ＶＣＡＭ−１、そのホモログもしくはフラグメントのいずれかである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- 移動可能な固相がマグネチック・ビーズであるかまたはマグネチック・ビーズを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 全血が、白血球接着分子と血管内皮リガンドとの間の結合性相互作用を活性化する刺激で処理される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- 刺激が、マンガン；ホルボール１２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）またはバクテリア性リポポリサッカライドのような細胞内シグナル経路のアクチベーター；；ケモカインファミリーの走化性タンパク質、例えば単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１；Ｃ５ａのようなアナフィラトキシン；ロイコトリエンＢ４のような他の走化性因子；活性化状態において変化を引き起こす白血球接着分子に結合する抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
- 刺激がマンガンである、請求項１１または１２に記載の方法。
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