JP2004500803A

JP2004500803A - Isoflavonoid methylase

Info

Publication number: JP2004500803A
Application number: JP2000620113A
Authority: JP
Inventors: ディクスン，リチァド，エイ; ヒー，クシァン，ズィー
Original assignee: ザ、サミュアル、ラバツ、ノゥブル、ファウンデイシャン、インク
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2004-01-15
Also published as: AU780464B2; CA2373751A1; AU5018700A; WO2000071736A1; EP1183376A1; AR030390A1

Abstract

生物学的に活性な４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを遺伝子操作する方法は、ｉｎｖｉｖｏにおけるイソフラボン７−ＯＭＴの位置特異性に基づいて見出された。イソフラボノイドＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）遺伝子で形質転換して、それを発現させるときに、トランスジェニック植物におけるＩＯＭＴのアップレギュレーションを用いて４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンの蓄積を増大させ、植物に対し増大した病害抵抗性を付与することができる。同様の方法を用いて、植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質の蓄積を増大することもできる。天然で４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生する植物におけるＩＯＭＴのダウンレギュレーションのためには、ＩＯＭＴ遺伝子配列がアンチセンス方向で形質転換され得る。Methods for engineering biologically active 4'-O-methylated isoflavonoids have been found based on the regiospecificity of isoflavone 7-OMT in vivo. Increased accumulation of 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins using up-regulation of IOMT in transgenic plants when transformed and expressed with the isoflavonoid O-methyltransferase (IOMT) gene To impart increased disease resistance to the plant. Similar methods can be used to increase the accumulation of 4'-O-methylated isoflavonoid supplements in plants. For down-regulation of IOMT in plants that naturally produce 4'-O-isoflavonoid phytoalexins and 4'-O-methylated isoflavonoid supplements, the IOMT gene sequence is transformed in the antisense orientation. obtain.

Description

【０００１】
発明の技術分野
本発明は植物の遺伝子操作に関する。
【０００２】
発明の背景
マメ科植物（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）のイソフラボノイドは、フェニルプロパノイドから誘導される植物性天然産物の最も重要な生物学的活性を有するクラスのものである。ダイゼイン、ゲニステインおよびバイオチャニンＡなどのイソフラボンは、広範囲の薬理作用、例えばエストロゲン様活性、抗脈管形成活性、抗酸化活性および抗癌活性を示すものであり（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．１９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｕ．Ｓａｎｋａｗａ編，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ７７３−８２３）、ダイズ高含有食餌の健康増進活性はイソフラボン成分にあると考えられている（Ｂａｒｎｅｓら、１９９０． ”Ｓｏｙｂｅａｎｓｉｎｈｉｂｉｔｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｓｉｎｍｏｄｅｌｓｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．”，Ｍ．Ｗ．Ｐａｒｉｚａ編，ＭｕｔａｇｅｎｓａｎｄＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｎｔｈｅＤｉｅｔ（食餌中の突然変異誘発物質および発癌性物質），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ２３９−２５３；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚら、１９９１． ”ＵｒｉｎａｒｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｌｉｇｎａｎｓａｎｄｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓｉｎＪａｐａｎｅｓｅｍｅｎａｎｄｗｏｍｅｎｃｏｎｓｕｍｉｎｇａｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＪａｐａｎｅｓｅｄｉｅｔ，” ＡｍＪＣｌｉｎＮｕｔｒ５４：１０９３−１１００；Ｌｅｅら、１９９１． ”Ｄｉｅｔａｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｎｂｒｅａｓｔ−ｃａｎｃｅｒｒｉｓｋｉｎＳｉｎｇａｐｏｒｅ，” Ｌａｎｃｅｔ３３７：１１９７−１２００）。ダイゼインおよびゲニステインは、多種多様なマメ科植物における種々の抗菌性イソフラボノイドフィトアレキシンの生合成において前駆体として機能する（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＮ．Ｌ．Ｐａｉｖａ．１９９５． ”Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ”ＰｌａｎｔＣｅｌｌ７：１０８５−１０９７）。更にそのエストロゲン様活性のために、高レベルのイソフラボノイド（フィトエストロゲンホルムオノネチンなど）は、飼料用マメ科植物を食するヒツジの生殖能に有害な影響を及ぼす可能性がある（Ｓｈｕｔｔ，Ｄ．Ａ．１９７６． ”Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｌａｎｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓｏｎａｎｉｍａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ７５：１１０−１１３）。
【０００３】
イソフラボノイドは、植物病原菌の相互作用に重要な役割を果たしていると考えられている。その理由は、イソフラボノイドの多くが非常に強力な抗菌活性を有するからである。抗菌性イソフラボノイドは、２つの機能的なクラス、すなわち前産生「フィトアンチシピン類（ｐｈｙｔｏａｎｔｉｃｉｐｉｎｓ）」および誘導性「フィトアレキシン類」に分類される（ＶａｎＥｔｔｅｎら、１９９４． ”Ｔｗｏｃｌａｓｓｅｓｏｆｐｌａｎｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓｖｅｒｓｕｓｐｈｙｔｏａｎｔｉｃｉｐｉｎｓ，” ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１１９１−１１９２）。前者のクラスの例としては、ルピナス（ｌｕｐｉｎ）のプレニル化イソフラボンが挙げられ、これは、幼植物の発育過程で植物の種々の器官において合成されるものである（Ｉｎｇｈａｍら、１９８３． ”ＦｕｎｇｉｔｏｘｉｃｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｆｒｏｍＬｕｐｉｎｕｓａｌｂｕｓａｎｄｏｔｈｅｒＬｕｐｉｎｕｓｓｐｅｃｉｅｓ，”ＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔｆｕｒＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，Ｃ３８：１９４−２００）。後者の例としては、数種のプテロカルパンが挙げられ、この生合成は、特に、それぞれインゲン、アルファルファ、エンドウおよびダイズに由来するファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｌｉｎ）、メジカルピン、ピサチンおよびグリセオリン（ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ）に関しては、詳細な研究が行われている（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．１９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ”ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学），Ｖｏｌ．１，Ｕ．Ｓａｎｋａｗａ，編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．７７３−８２３）。
【０００４】
イソフラボノイド化合物は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて抗菌性であると知られているレベルにまで感染植物細胞中に蓄積することが示されている。この蓄積に関する時間的、空間的および量的特徴は、病害抵抗性に関するこれらの化合物の機能と一致するものである（Ｒａｈｅ，Ｊ．Ｅ．１９７３． ”ＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｐｈａｓｅｏｌｌｉｎｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｄｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎａｔｓｉｔｅｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓｂｙＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ，” ＣａｎＪＢｏｔａｎｙ５１：２４２３−２４３０；Ｈａｄｗｉｇｅｒ，Ｌ．Ａ．およびＤ．Ｍ．Ｗｅｂｓｔｅｒ．１９８４． ”ＰｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｆｉｖｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆｐｅａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｔｈｒｅｅｒａｃｅｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．Ｐｉｓｉ，” Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ７４：１３１２−１３１４；Ｌｏｎｇら、１９８５． ”ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｏｙｂｅａｎｌｅａｖｅｓｔｏＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．Ｇｌｙｃｉｎｅａ，” Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ７５：２３５−２３９；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｍ．Ｋ．およびＥ．Ｗ．Ｗａｒｄ．１９８７． ”ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎＩｉｎｓｏｙｂｅａｎｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｗｏｕｎｄｉｎｇｏｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｆ．ｓｐ．Ｇｌｙｃｉｎｅａ，” ＰｈｙｓｉｏｌＭｏｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ３１：３８７−４０５）。ダイズ幼植物に対しＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）阻害剤を作用させることにより生じるグリセオリンの合成阻害は、疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）に対する抵抗性を破壊するものである（Ｍｏｅｓｔａ，Ｐ．およびＨ．Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ．１９８２． ”Ｌ−２−Ａｍｉｎｏｏｘｙ−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄｉｎｈｉｂｉｔｓｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎｗｉｔｈｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｏｓｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｆ．ｓｐ．Ｇｌｙｃｉｎｅａ， ”ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ２１：６５−７０）。真菌性病原体であるネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａｈｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）の、エンドウのフィトアレキシンピサチンを弱める能力が低減された単離体は、エンドウに対する毒性が低減されたものであり、このことは、ピサチンが病害抵抗性応答に機能的に関与していることを示唆している（Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｃ．およびＨ．Ｄ．ＶａｎＥｔｔｅｎ．１９８４． ”ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｉｓａｔｉｎｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎＮｅｃｔｒｉａｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｐｉｓａｔｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，” ＪＧｅｎＭｉｃｒｏ１３０：２６０５−２６１３）。
【０００５】
フィトアレキシンは、植物とその微生物病原体との間の抵抗性相互作用の過程で、病害をもたらす罹病性相互作用の過程よりも迅速にそして高いレベルで蓄積する（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＭ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ．１９９０． ”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｆｅｎｓｅｉｎｐｌａｎｔｓ，” ＡｄｖＧｅｎｅｔ２８：１６５−２３４）。従って、フィトアレキシンが蓄積する速度および絶対的なレベルに到達する速度の増大によって、抵抗性が高まると考えられている（Ｌａｍｂら、１９９２． ”Ｅｍｅｒｇｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｅｎｈａｎｃｉｎｇｃｒｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓ，” Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１４３６−１４４５）。
【０００６】
イソフラボンの特定のメチル化形態、例えばホルムオノネチン（７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）およびバイオチャニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）は、栄養補助物質としての利点を提供するものと示されている。例えば、バイオチャニンＡおよびホルムオノネチンはフィトエストロゲンであると報告されており、バイオチャニンＡは動物の癌研究モデルにおいて有効であることが示されている（Ｙａｎｇｉｈａｒａら、１９９３． ”Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｏｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ， ”ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５３：５８１５−５８２１；およびＺｈｏｕ−Ｊｉｎ−Ｒｏｎｇら、１９９８． ”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｂｌａｄｄｅｒｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｂｙｓｏｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｖｉａａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，” ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５８：５２３１−５２３８）。
【０００７】
上述した例からわかるように、トランスジェニック植物におけるイソフラボノイド生合成の遺伝子操作は、植物、動物およびヒトの健康に対し肯定的に影響を与えるものでありうる（Ｄｉｘｏｎら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｎｔｒｏｌｓｆｏｒｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｌａｎｔａｎｄｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ，” ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１３３−１６０）。しかしながら、イソフラボノイドフィトアレキシン蓄積の増大に関与する酵素は同定されておらず、イソフラボノイドフィトアレキシン生合成酵素をコードする遺伝子もまだ全てがクローニングされたわけではない。
【０００８】
植物におけるイソフラボンを導く生合成分岐経路は、カルコンシンターゼ反応およびカルコンイソメラーゼ反応によりフェニルプロパノイドおよびアセテート誘導前駆体から産生されるフラバノン中間体のチトクロムＰ４５０が媒介する２−水酸化／アリール移動を含むものである（図１）（Ｋｏｃｈｓ，Ｇ．およびＨ．Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ．１９８６． ”Ｅｎｚｙｍｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ，” ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１５５：３１１−３１８；Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９１． ”Ｐ−４５０ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｉｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆＰ−４５０ａｎｄＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４７：５９６９−５９７８；Ｓｔｅｅｌｅら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｚｉｎｇｔｈｅａｒｙｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｓｏｙｂｅａｎ，” ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３６７：１４６−１５０；ならびにＪｕｎｇら、２０００． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ：ｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｆｏｒｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｉｎｌｅｇｕｍｅｓ，” ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：２０８−２１２）。アリールの移動後、２−ヒドロキシイソフラバノン中間体は脱水されて、対応するイソフラボンが得られる（Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９８． ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＰｕｅｒａｒｉａｌｏｂａｔａ， ”Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４９：４９７−５０５）。ゲニステイン（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン）は、ナリンゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラバノン）のアリール移動／脱水により得られる生成物であるが、ダイゼイン（４’，７−ジヒドロキシイソフラボン）は、リキリチゲニン（４’，７−ジヒドロキシフラバノン）から同様に生成されるものである。ダイゼインの４’−Ｏ−メチル化によってホルムオノネチン（７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）が得られるが、ゲニステインの４’−Ｏ−メチル化からはバイオチャニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）が得られ、このバイオチャニンＡは、ヒヨコマメにおいて見出された抗癌作用を有する重要な化合物である（Ｙａｎａｇｉｈａｒａら、１９９３． ”Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｏｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ，” ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５３：５８１５−５８２１）（図１）。
【０００９】
アルファルファおよび他のある種のマメ科植物（ヒヨコマメなど）において、４’−ヒドロキシルのメチル化は、メジカルピンなどのプテロカルパンフィトアレキシンに至るイソフラボノイドのベンゼン核をさらに置換するための前提条件である（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．１９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，” Ｕ．Ｓａｎｋａｗａ編，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ７７３−８２３）。この反応は、ヒト抗癌活性を有するイソフラボンが、植物に対し抗菌活性を有する下流の代謝産物に変換する経路の開始点であるため、生物学的に重要である。しかしながら、このＯ−メチル化反応の正確な機構には未だ不明な点がある。プテロカルパンメジカルピンにダイゼインではなくホルムオノネチンが導入された銅誘導型アルファルファ幼植物の放射性標識研究に基づいて、４’−Ｏ−メチル化がイソフラボン生合成のアリール移動反応の必要不可欠な部分でありうることが提案されている（Ｄｅｗｉｃｋ，Ｐ．Ｍ．およびＭ．Ｍａｒｔｉｎ．１９７９． ”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎ，ｉｓｏｆｌａｖａｎａｎｄｃｏｕｍｅｓｔａｎｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ：ｃｈａｌｃｏｎｅ，ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅａｎｄｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，” Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５９７−６０２）。しかしながら、アリール移動は、ｉｎｖｉｔｒｏではメチル化を受けずに起こるものであり（Ｋｏｃｈｓ，Ｇ．およびＨ．Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ．１９８６．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１５５：３１１−３１８；Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９１．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４７：５９６９−５９７８；Ｋｅｓｓｍａｎｎら、１９９０． ”Ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）ＩＩＩ．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃａｒｐｉｎａｎｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，” ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ９：３８−４１；Ｓｔｅｅｌｅら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｚｉｎｇｔｈｅａｒｙｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｓｏｙｂｅａｎ，” ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３６７：１４６−１５０）、サブタレニアン・クローバ（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎｃｌｏｖｅｒ）の突然変異体では、ホルムオノネチンおよびバイオチャニンＡが実際には不在であり、代わりにダイゼインおよびゲニステインが蓄積する（Ｗｏｎｇ，Ｅ．およびＣ．Ｍ．Ｆｒａｎｃｉｓ．１９６８． ”ＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＴｒｉｆｏｌｉｕｍｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ−ＩＩ．ＭｕｔａｎｔｓｏｆｔｈｅＧｅｒａｌｄｔｏｎｖａｒｉｅｔｙ，”Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７：２１３１−２１３７）が、このことは、イソフラボンが４’−Ｏ−メチル化のための天然の基質であることを示している。この問題はまた、ダイゼインの４’−Ｏメチル化を触媒しうるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）を精製できることが証明されていないという事実により生ずるものでもある。その代わりに、アルファルファに由来するＳＡＭ依存性イソフラボンＯＭＴ（Ｈｅ，Ｘ−ＺおよびＲ．Ａ．Ｄｉｘｏｎ．１９９６． ”Ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｉｓｏｆｌａｖｏｎｅＯ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．），” ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３３６：１２１−１２９）によって、７位のヒドロキシル基のメチル化によりｉｎｖｉｔｒｏにて７−Ｏ−メチルダイゼイン（イソホルムオノネチン）が産生される。イソホルムオノネチンは、稀少な植物性天然産物であり、アルファルファ由来のものは報告されていない。
【００１０】
イソフラボン７−ＯＭＴは、アルファルファからクローニングされており、この組換え酵素は、大腸菌において発現された場合にダイゼインを専らイソホルムオノネチンに変換する（Ｈｅら、１９９８． ”Ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）ＸＸＩＩ．ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ７−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，” ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：４３−５４）。この酵素活性およびその対応する転写産物は、メジカルピン生合成の他の酵素と同等に、誘発した（ｅｌｉｃｉｔｅｄ）アルファルファ細胞培養物において強力に誘導される（Ｄａｌｋｉｎら、１９９０． ”Ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）Ｉ．Ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｉｎｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓ，” ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ９２：４４０−４４６；Ｈｅら、１９９８．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：４３−５４）。
【００１１】
多数の植物のＯＭＴ配列が現在データベースにおいて入手可能であり、その大部分は、リグニン生合成のヒドロキシケイ皮酸中間体、またはフラボノイド誘導体に対し作用する酵素をコードするものである（Ｉｂｒａｈｉｍら、１９９８． ”ＰｌａｎｔＯ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓ，ｃｏｍｍｏｎｓｉｇｎａｔｕｒｅａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”　ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：１−１０；Ｊｏｓｈｉ，Ｃ．Ｐ．およびＶ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．１９９８． ”ＣｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓｉｎｐｌａｎｔＳ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，” ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３７：６６３−６７４）。ほぼ全ての場合において、この酵素は厳密な位置特異性を示す。例えば、一連の別個の位置特異的ＯＭＴは、クリソスプレニウム・アメリカナム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）におけるポリメチル化フラボノールの合成に関与している（Ｉｂｒａｈｉｍら、１９８７． ”ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙａｎｄｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓｉｎＣｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，” Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：１２３７−１２４５；Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９６． ”ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ３’／５’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｏｒｐａｒｔｉａｌｌｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｆｌａｖｏｎｏｌｓｆｒｏｍＣｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，” ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３２：１１６３−１１６９）。しかしながら、数種のＯＭＴは、より特異性がなく、フラボノイドおよびヒドロキシケイ皮酸の双方に対し作用する（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９８． ”ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅＯ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｆｏｒｔｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｔｈｆｌａｖｏｎｏｉｄａｎｄｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，” ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３５１：２４３−２４９）か、または、リグニン生合成の十分に研究されているカフェー酸／５−ヒドロキシフェルラ酸ＯＭＴなどの１種以上の関連基質に対し特異性があると考えられる（Ｂｕｇｏｓら、１９９１． ”ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｇｎｉｎ−ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ／５−ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄＯ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｏｆａｓｐｅｎ，” ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ１７：１２０３−１２１５；Ｌｉら、２０００． ”５−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｍｏｄｕｌａｔｅｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｆｏｒｓｙｒｉｎｇｙｌｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｅｗｖｉｅｗｏｆｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ，” ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５：６５３７−６５４５）。しかしながら、ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏにおいて異なる位置特異性を示すＯＭＴまたは他の植物性天然産物の生合成酵素に関しては報告されていない。
【００１２】
イソフラボン７−ＯＭＴの異なる位置特異性をｉｎｖｉｖｏにて利用することによって、生物学的に活性な４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを遺伝的に操作することが可能となる。
【００１３】
発明の概要
一態様において、本発明は、ターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物のレベルを増大する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて該イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させることが含まれる。特に、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンであってもよいし、または４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質であってもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１４】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生しないターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させることが含まれ、ここで該トランスジェニック植物は４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するものである。特に、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンであってもよいし、または４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質であってもよい。ターゲット植物は、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をコードする天然のＤＮＡを含有していてもよい。あるいは、ターゲット植物がその必要な酵素を欠損する場合には、欠損酵素をコードするＤＮＡ断片を用いて形質転換されたものであってもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１５】
他の態様において、本発明は、非植物細胞系において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生する方法であり、該方法は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するように遺伝的に形質転換された細胞において、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて発現させることにより行うものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１６】
他の態様において、本発明は、アルファルファなどのトランスジェニック飼料用マメ科植物においてホルムオノネチン、少なくとも１種のそのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを低減する方法であり、該方法には、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いてアンチセンス発現またはセンス遺伝子介在型のサイレンシングを行うことが含まれる。あるいは、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼは、核酸介在型の挿入不活化によりダウンレギュレートされてもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１７】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを低減する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現、センス遺伝子介在型のサイレンシングまたは核酸介在型の挿入不活化を誘導することが含まれる。この方法は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシン、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群より選択される化合物の低減に有用である。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１８】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質またはそのコンジュゲートの合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを低減する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現またはセンス遺伝子介在型のサイレンシングを誘導し、それにより対応する非メチル化前駆体、そのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを増大させることが含まれる。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１９】
他の態様において、本発明は、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の製造方法であり、該方法には、全植物体または細胞懸濁培養物に７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の非メチル化イソフラボン前駆体を接触させることが含まれ、ここで該全植物体または細胞懸濁培養物は、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されているものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２０】
他の態様において、本発明は、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の産生方法であり、該方法には、可溶性のまたは固定化したイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ酵素と非メチル化イソフラボン前駆体を接触させて７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物にすることが含まれ、ここで該酵素は、トランスジェニック植物または異種系における対応するイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の発現により産生されたものである。好ましい実施形態において、異種系は、トランスフェクトした細菌、酵母および昆虫細胞からなる群より選択されるものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２１】
さらに他の態様において、本発明は、植物における４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのトランスジーン発現を判定するための試薬として使用する４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼに対する抗血清である。
【００２２】
さらに他の態様において、本発明は、ターゲット植物の病害抵抗性を増大させる方法であり、該方法は、該ターゲット植物をイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換することにより行うものであり、ここで該形質転換植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物の少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルと比較した場合に該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルの増大を示すものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２３】
さらに他の態様において、本発明は、食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含む組成物であり、該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドはイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されたトランスジェニック植物の少なくとも一部から単離されたものであり、該トランスジェニック植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルと比較した場合に該４’−Ｏメチル化イソフラボノイドレベルの増大を示すものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。植物としてはマメ科植物が挙げられる。
【００２４】
他の態様において、本発明は、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であり、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルの増大を示すものである。本発明はまた、上記トランスジェニック植物から得られる種子、子孫、および種子から得られる子孫を包含する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であり、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルの低減を示すものである。本発明はまた、上記トランスジェニック植物から得られる種子、子孫、および種子から得られる子孫を包含する。
【００２６】
詳細な説明
トランスジェニックアルファルファにおいて逆遺伝学および異所性発現手法を利用することにより、アルファルファイソフラボンＯＭＴが、異なる産物、すなわちｉｎｖｉｔｒｏではイソホルムオノネチンであるのに対してｉｎｖｉｖｏではホルムオノネチンの形成に関与していることが見出された。アルファルファイソフラボンＯＭＴのｉｎｖｉｖｏ位置特異性によって、トランスジェニック植物におけるホルムオノネチンレベルは、現在この化合物のレベルを低減させる目的で遺伝的に操作されており、それによって飼料の品質が改善されうる。他の実施形態において、イソフラボン４’−Ｏ−メチル化のトランスジェニック低減を利用すると、この反応の中間体の前駆体、すなわち重要な栄養補助物質であるダイゼインおよびゲニステインのレベルを増大させうる。本明細書では、イソフラボンＯＭＴは、感染したアルファルファ葉において、抗菌性フィトアレキシンメジカルピン産生のための律速酵素として機能的に作用し、その結果トランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボンＯＭＴの過剰発現によって、病原菌による感染後のメジカルピンレベルが有意に増大し、それにより病害抵抗性が強力に増大することが示される。アルファルファＩＯＭＴの機能特定は、ホルムオノネチンまたは他の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質（例えばバイオチャニンＡ、テキサシン、アフロルモシンおよびプソイドバプチゲニン）のレベルを、これらの化合物を産生する植物において増大または低減する、あるいはメジカルピンまたは関連する４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシン（例えばマアキアインまたはピサチン）のレベルを増大することにより病害抵抗性を改善するために現在可能な方法で行った。従って、マメ科植物におけるイソフラボンＯＭＴのトランスジェニック発現は、病害抵抗性を改善するためのフィトアレキシンレベルおよび健康促進栄養補助用植物化学物質の両者を遺伝子操作するために利用可能である。更に、ＩＯＭＴはまた、天然にはイソフラボノイド類を産生しないが、必要なイソフラボンシンターゼの導入によりイソフラボイド類を遺伝子操作した植物または他の生物においてイソフラボン４’−Ｏ−メチル化を遺伝子操作するために利用しうる。
【００２７】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）が、図１に示す経路によりホルムオノネチン、従ってホルムオノネチンに由来するメジカルピンのｉｎｖｉｖｏ産生に関与することを証明するため、ＩＯＭＴを過少発現または過剰発現するトランスジェニックアルファルファ植物を以下のようにして作製した。
【００２８】
実施例１：　典型的なＩＯＭＴｃＤＮＡを含む発現プラスミドの構築および特性決定
全長アルファルファＩＯＭＴ８ｃＤＮＡ（配列番号１および図２）を、アルファルファにおける構成的発現のためにカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下でセンスおよびアンチセンス方向に配置した。全ての組換えＤＮＡ技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載のとおり実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９．「分子クローニング：実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」（第２版），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。センスベクターの構築のために、全長ＩＯＭＴ８ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ／ＩＯＭＴ８（Ｈｅら，１９９８．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：４３−５４）を、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化した。１．２Ｋｂの断片を単離し、プラスミドｐＲＴＬ２（Ｒｅｓｔｒｅｐｏら，１９９０．「植物性ポリウイルスタンパク質の核輸送（Ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｐｌａｎｔｐｏｌｙｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：９８７−９９８）のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。アンチセンスベクターの構築のために、全長ＩＯＭＴ８ｃＤＮＡを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：５’−ＧＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３）、これらには、Ｋｐｎ１およびＢａｍＨＩ制限部位が加えられており、ＰＣＲ産物をＫｐｎ１およびＢａｍＨＩで消化して、ｐＲＴＬ２にサブクローン化した。ｐＲＴＬ２中にＩＯＭＴ配列を含むプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、タバコエッチウイルス５’非翻訳リーダー配列、ＩＯＭＴ配列、およびＣａＭＶターミネーターを含む２．２Ｋｂの断片を単離し、バイナリーベクターｐＧＡ４８２（Ａｎ，Ｇ．１９８６．「植物性プロモーター発現ベクターの開発および形質転換されたタバコ細胞におけるノパリン合成酵素プロモーターの示差的活性の分析のためのそれらの利用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｌａｎｔｐｒｏｍｏｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｐｒｏｍｏｔｏｒｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｂａｃｃｏｃｅｌｌｓ）」，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ８１：８６−９１）のＨｉｎｄＩＩＩ部位へ連結した。該構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４中へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ−ｐｏｒａｔｏｒ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって導入した。中間体プラスミドｐＲＴＬ２およびバイナリーベクターｐＧＡ４８２を利用する遺伝子構築物を図３Ａに示す。
【００２９】
実施例２：　アルファルファの形質転換によるＩＯＭＴトランスジーンのゲノム挿入
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）Ｌ．栽培品種ＲｅｇｅｎＳＹを、選択マーカーとしてカナマシン（２５ｍｇ／Ｌ）を使用して、形質転換し、不定胚形成によって再生した（Ｔｈｏｍａｓら，１９９０．「アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換組織を使用することによるメディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）における異種間体細胞ハイブリッドの選択（ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓｏｆＭｅｄｉｃａｇｏｂｙｕｓｉｎｇＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｉｓｓｕｅ）」，ＰｌａｎｔＳｃｉ６９：１８９−１９８）。三葉性の葉を、７０％エタノールで１０秒間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面を滅菌し、次にＩＯＭＴ構築物または空のベクター（対照）を収容するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４の懸濁液中に１０〜１５分間浸漬した。蒸留水ですすいだ後、組織をペーパータオル上で吸い取らせ、ＭＳ培地上にプレーティングした（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．およびＳｋｏｏｇ，Ｆ．１９６２．「タバコ組織培養を用いた迅速な生長およびバイオアッセイのための改変培地（Ａｒｅｖｉｓｅｄｍｅｄｉａｆｏｒｒａｐｉｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｂｉｏａｓｓａｙｗｉｔｈｔｏｂａｃｃｏｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ）」，ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ１５：４７３−４９７）。該培地には、Ｂ５ビタミン類、０．２５ｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０μＭ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、５μＭ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．１ｍＭアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）および３０ｇ／ｌスクロースを含む（Ａ１培地）。共培養の３日後に、組織を上記培地であるけれども２μＭＢＡＰ、５００μｇ／ｍｌカルベネシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含み、アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）を含まない培地（Ａ２培地）に移した。２次培養の４週間後に、胚の成長のためにカルス（ｃａｌｌｉ）を３０ｍＭＬ−プロリン添加するけれども、ＢＡＰは含まないＡ２培地（Ａ３培地）に移した。不定胚を胚の発芽のために２，４Ｄを含まないＡ３培地（Ａ４培地）に移した。発生した幼植物を最終的に根付かせるためにカゼイン加水分解物およびプロリンを含まないＡ４培地に移した。鉢植えのカナマイシン耐性小植物を温室で維持した。
【００３０】
上記の不定胚形成を介する植物再生後、形質転換体を、ＩＯＭＴトランスジーン配列のゲノムへの挿入についてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。ゲノムＤＮＡは、Ｅｄｗａｒｄｓら（Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９１．「ＰＣＲ分析のための植物ゲノムＤＮＡの単純かつ迅速な調製方法（ＡｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｏｒＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓ）」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：１３５９）にしたがって抽出した。形質転換体の葉の組織を、２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で抽出し、小型微量遠心機中でで５分間遠心分離した。そして、上清を、２−プロパノールが等量となるように添加した新しいエッペンドルフチューブに移した。室温で２分間インキュベーションした後、ＤＮＡを遠心分離によって沈澱させた。ペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で再懸濁した。ＰＣＲ反応を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．２５ｍＭＭｇＣｌ_２、２００μＭｄＮＴＰｓ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．４μＭオリゴヌクレオチドプライマーおよび２００ｎｇの植物ＤＮＡを含む５０μｌ容量中で実施した。ＩＯＭＴ配列のＰＣＲ増幅を、プライマーとしてＩＯＭＴ８の５’（５’−ＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣ−３’）（配列番号４）および３’（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡ−３’）（配列番号５）の配列を用いて実施した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ４８０サーモサイクラーを用いて、変性（９４℃、１分間）、アニーリング（５５℃、１分間）、および伸長（７２℃、１分間）を３５サイクルならびに最終サイクルに５分間の伸長を行なう増幅を行った。対照は、空のベクターを形質転換した植物および形質転換しない植物由来のＤＮＡを含んだ。７０％を超える形質転換体が、全長ＩＯＭＴｃＤＮＡ挿入物を含んでいた（データは示さず）。作製された全てのトランスジェニック系統は表現型的には正常であった。トランスジーンのゲノムへの組み込みが、サザンブロット分析によって形質転換体のサブセット中に確認された。これを実施するために、ゲノムＤＮＡを葉の組織から単離し（Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９１．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：１３５９）、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動し、キャピラリーブロッティングによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。この膜を^３２Ｐで標識した８００ｂｐのＩＯＭＴプローブ（配列番号１および図２のヌクレオチド２４９−１０３５由来）とハイブリダイズし、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において４２℃で２０分間、ならびに６５℃で３０分間を３回の洗浄を行なった。センス形質転換体＃５２、＃６１、＃６２、＃６７、＃６９および＃７８は分析した他の系統よりもより多いトランスジーンコピー数を有していた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化およびＴ−ＤＮＡ左境界領域によるハイブリダイゼーションに続くサザンブロット分析によって個々の形質転換体が独立した組み込み事象から生ずることが示唆された。
【００３１】
実施例３：　アルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清の使用によるＩＯＭＴトランスジーンの確認
ＩＯＭＴ転写産物は健常なアルファルファの葉においては発現されず（Ｈｅら，１９９８．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：４３−５４）、それゆえ、葉におけるＩＯＭＴ活性の存在を実証することによってＩＯＭＴトランス遺伝子の発現が確認される。従って、代表的なセンス形質転換体およびベクター対照トランスジェニックアルファルファ植物由来の葉の組織抽出物を、葉における酵素の異所性発現のレベルを評価するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるアルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を使用して、ウェスタンブロット分析を行なった。ＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現されたタンパク質抗原を用いてウサギ（ＣｏｖａｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）を免疫化することによって産生した（Ｈｅら，１９９８．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ３６：４３−５４）。葉の組織由来のタンパク質抽出物をサンプルバッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１％ＳＤＳ，２．５％２−メルカプトエタノール，５％グリセロール）中で可溶化した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、転写バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，１５０ｍＭグリシン，２０％ｖ／ｖメタノール）中での電気泳動ブロッティングによってニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。ブロットを、１次抗体として精製アルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を、２次抗体として抗（ウサギＩｇＧ）ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いてプローブした。ＩＯＭＴシグナルを、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と一緒にインキュベーションした後すぐにブロットをＸ線フィルムに感光させることによって検出した。
【００３２】
実施例４：　トランスジェニック発現ＩＯＭＴの影響
ＩＯＭＴ酵素活性を温室で維持された植物から取られた葉の組織由来の抽出物で測定した。ＩＯＭＴ活性を先に記載された通り分析した（Ｈｅ，Ｘ−ＺおよびＲ．Ａ．Ｄｉｘｏｎ．１９９６．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３３６：１２１−１２９）。葉の組織を液体窒素中で粉末に破砕し、酵素アッセイバッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５ｍＭＥＤＴＡ，１４ｍＭ２−メルカプトエタノール，１０％ＰＶＰＰ）中で抽出した。遠心分離後、上清を酵素活性アッセイのために使用した。該反応混合物は、総容量１２０μｌ中に１００ｎｍｏｌダイゼイン、３００ｎｍｏｌＳ−［^３Ｈ−メチル］アデノシル−Ｌ−メチオニンおよび酵素抽出物を含んだ。反応を、３０℃で３０分間行ない、１００μｌの酢酸の添加によって停止させた。反応混合物を０．５ｍｌ酢酸エチルで抽出し、窒素下で酢酸エチルを蒸発させ、そして残渣をメタノール中で再懸濁した。生成物分析のため、再懸濁した残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｓｉ２５０；Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）にアプライした。クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン（８：１：１，ｖ／ｖ）中での展開に続いて、対象の生成物をＴＬＣプレートから掻き取り、放射能を液体シンチレーションカウントによって定量した。ＨＰＬＣによる生成物分析のために、再懸濁した残渣２０μｌをＣ１８カラム（粒径５μｍ，４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ）にアプライし、溶媒Ａ中で溶媒Ｂを増加させる勾配によって溶出した（溶媒Ａ：１％リン酸水溶液；溶媒Ｂアセトニトリル：０〜４０分、２０〜４５％Ｂ；４０〜４２分、４５〜９５％Ｂ）。溶出物を、２８７ｎｍでモニターした。生成物の同定を、ホルムオノネチンおよびイソホルムオノネチンの基準サンプルを用いて共溶出（ｃｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）およびＵＶスペクトルのダイオードアレイ分析によって確認した。
【００３３】
ＩＯＭＴセンス構築物を収容する複数の独立したトランスジェニック系統が高いＩＯＭＴ活性を発現した（図３Ｂ）。しかしながら、高いトランスジーンコピー数を有する＃６２および＃７８系統は、ＩＯＭＴ活性を発現しなかった。免疫ブロッティングによって測定したＩＯＭＴタンパク質レベルと葉から抽出可能な酵素活性との間には直接の関係があった。ダイゼインおよびＳ−［^３Ｈ−メチル］アデノシル−Ｌ−メチオニンから形成される標識生成物のＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析によって、イソホルムオノネチンのみが健常な非形質転換アルファルファの葉（データ示さず）から抽出された酵素によって生成されて、これは先にイソフラボン７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの酵素機能とされているものと一致した。
【００３４】
アルファルファの根は、ホルムオノネチンマロニルグルコシド（ＦＭＧ）、メジカルピンおよびメジカルピンマロニルグリコシド（ＭＭＧ）を蓄積する（Ｓｕｍｎｅｒら，１９９６．「マメ科植物抽出物中のフラボノイドグルコシドについての高性能液体クロマトグラフィー／連続流液体２次イオン質量分光測定（Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗｌｉｑｕｉｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓｉｎｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓｐｌａｎｔｅｘｔｒａｃｔｓ）」，ＪＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ３１：４７２−４８５）。ＩＯＭＴのダウンレギュレーションが根における上記化合物のレベルに影響を与えるか否かを調べるために、フェノール化合物の抽出およびＨＰＬＣ分析を先に記載の通りに実施した（Ｄａｌｋｉｎら，１９９０．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ９２：４４０−４４６）。等量の組織を液体窒素中で粉砕し、アセトンを用いて一晩室温で２回抽出した。抽出物を、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を回収した。アセトンを窒素下で蒸発させ、残渣をメタノール中に溶解した。不溶性物質を、１２，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって除去した。該溶液２０μｌをＣ１８ＨＰＬＣカラム（粒径５μｍ，４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ）にアプライし、溶媒Ｂを増加させる勾配によって溶出した（溶媒Ａ：１％リン酸水溶液；溶媒Ｂ、アセトニトリル：０〜４０分、２０〜４５％Ｂ；４０〜４２分、４５〜９５％Ｂ）。溶離液の吸光度を２８７ｎｍでモニターした。ホルムオノネチン、イソホルムオノネチン、メジカルピンおよびそれらのコンジュゲートについての保持時間および検量線を基準サンプルにより確立した。温室で生育させた植物からの根の抽出物のＨＰＬＣ分析によって、ホルムオノネチン、ＦＭＧおよびＭＭＧレベルは非常に変化しやすく、代謝産物レベルにおける差異が有意であるか否かを調べるのを困難にしていることが示された。それゆえ、アンチセンストランスジェニック系統の分析のために、代謝産物レベルに基づいて最初に選択された植物を生長繁殖させ、生育チャンバー条件下で生育した。３種類の独立したアンチセンス＃４２、＃５４および＃６０系統が、４６の独立して繁殖させた対照植物の集団の平均値と比較して、ＦＭＧについては３３％〜４４％、メジカルピンについては２９％〜７１％、およびＭＭＧについては１８％〜５１％、これらの化合物レベルの有意な減少を示した。上記結果はＩＯＭＴアンチセンス構築物の発現が構成的根イソフラボンレベルを減少させることを示す。
【００３５】
葉におけるＩＯＭＴの強力な異所性発現を有する多数の独立したアルファルファ形質転換体を、構成的イソフラボノイド中間体レベルについて分析した。イソフラボノイド経路のみ、感染または誘発などのストレスに続いてアルファルファ葉中で有意に発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｖ．Ｊ．１９７２．「アルファルファのスリー・リーフ・スポット病（ｔｈｒｅｅｌｅａｆｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅｓ）におけるフィトアレキシンであるメジカルピンの役割（Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｍｅｄｉｃａｒｐｉｎｉｎｔｈｒｅｅｌｅａｆｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅｓｏｆａｌｆａｌｆａ）」，ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ２：２８９−３００；Ｐａｉｖａら，１９９４．「アルファルファにおけるイソフラボノイド代謝の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎａｌｆａｌｆａ）」，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔ３８：２１３−２２０）。それゆえ、初期イソフラボノイド経路基質を生成する酵素の誘導がない場合に、ＩＯＭＴを過剰発現する葉と対照の葉のＨＰＬＣプロファイルは同一であった（図４Ａおよび図４Ｂ）。イソホルムオノネチンは検出されなかった。Ｐｉバッファーで処理した対照およびＩＯＭＴを過剰発現する植物、ならびに葉にダイゼインを与えた対照植物由来の抽出物中におけるイソホルムオノネチンの保持時間に非常に近似して動く少数の化合物は、フラボノイド生合成の中間体である２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンであることが示された（図４Ａ−４Ｃ）。しかしながら、ＩＯＭＴを過剰発現するトランスジェニックアルファルファの葉に未標識ダイゼインを与えた際にイソホルムオノネチンが生成したのに対して（図４Ｄ）、対照植物の葉に与えた時にはダイゼインは未変換のまま残った（図４Ｃ）。したがって、植物中におけるＩＯＭＴの位置特異性は、ストレスを受けていない組織へ基質を外因的に与えた場合のｉｎｖｉｔｒｏで示されるものと同一であり、再度これはイソフラボン７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼという名称の酵素と一致した。
【００３６】
切片を、センス＃６７および＃６９系統から、ならびにある範囲の非形質転換体系統および空のベクターを用いた対照系統から取り、生育チャンバー中で繁殖させた。イソフラボノイド経路の酵素を誘導するために、切断した葉柄から取った三葉性の葉を８時間室温で３ｍＭＣｕＣｌ_２に曝露することによって誘発した。本方法はアルファルファにおけるイソフラボノイド蓄積の誘発のための信頼し得る方法である（Ｄｅｗｉｃｋ，Ｐ．Ｍ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｍ．１９７９．「アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）におけるプテロカルパンおよびイソフラバンフィトアレキシン類の生合成：プテロカルパンおよび２’−ヒドロキシイソフラバン類の生化学的相互転換（ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎａｎｄｉｓｏｆｌａｖａｎｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓｉｎＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ：ｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｓａｎｄ２’−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｓ），Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５９１−５９６）。三葉性の葉をペトリ皿中で２層の湿性フィルターの上に置き、さらに２４時間インキュベートした。次に、誘導したイソフラボノイド類レベルを上記の通りＨＰＬＣによって測定した。銅に曝露しなかった葉は、図５Ｃおよび５Ｄに示すように検出可能なホルムオノネチンまたはメジカルピンを含まなかった。銅処理によって種々の対照系統においてホルムオノネチンおよびメジカルピンの適度な誘導を生ずるが、ＩＯＭＴ過剰発現系統において非常に強力な誘導を生じた（図５Ａおよび図５Ｂ）。イソフラボノイド経路が誘発によって最初に誘導される場合に、誘発したアルファルファの葉におけるＩＯＭＴの過剰発現がホルムオノネチンおよびメジカルピンレベルの有意な増加につながることをそれぞれの系統からの切片の反復分析によって明確に示された（図５Ｃおよび５Ｈ）。重要なことに、対照またはＣｕＣｌ_２処理をしたさまざまな系統の葉からの抽出物中でＩＯＭＴ活性を測定した場合に、生成物が常にイソホルムオノネチンであった。これはＣｕＣｌ_２自体は酵素の位置特異性に影響を与えないことを示す。誘発した葉のサンプルのいずれにもイソホルムオノネチンは観察されなかった。
【００３７】
上記実験はアルファルファ茎枯病菌（Ｐｈｏｍａｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）の胞子による感染を利用して繰り返した。この処理は、アルファルファの葉においてイソフラボノイド経路の酵素を誘導し、結果的にメジカルピンの蓄積が起きる（Ｐａｉｖａら，１９９４．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔ３８：２１３−２２０）。アルファルファ茎枯病菌（Ｐ．ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）に曝露した後の対照の空のベクターを用いた植物およびＩＯＭＴを過剰発現する植物（＃６７系統）由来の葉についての代謝産物プロファイルをそれぞれ図６Ａおよび図６Ｂに示す。菌の感染によって対照系統において、ホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンの出現を生ずるが（図６Ａ）、ＩＯＭＴを過剰発現する系統において非常に強力な誘導を生じた（図６Ｂ）。またイソホルムオノネチンは感染させた葉のいずれのサンプルにおいても観察されなかった（図６Ｂ）。感染させていない対照植物においてホルムオノネチングルコシドまたはメジカルピンは観察されなかった（図６Ｃおよび図６Ｄ）。菌感染後さまざまな時間で回収した系統のそれぞれからの切片についての反復分析によって、感染したアルファルファの葉においてＩＯＭＴの過剰発現が、対照系統と比較してホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンをより初期に誘導しレベルを増大させることが明確に示された（図６Ｅおよび図６Ｆ）。
【００３８】
センス形質転換体＃７８は高いトランスジーンコピー数を有するが、葉においてＩＯＭＴタンパク質は発現しなかった（図３Ｂ）。後成的発現（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）遺伝子サイレンシングを示すと思われた（Ｍａｔｚｋｅ，Ｍ．Ａ．およびＡ．Ｊ．Ｍ．Ｍａｔｚｋｅ．１９９５．「いかにそしてなぜ植物は相同的遺伝子（トランスジーン）を不活性化するのか？（Ｈｏｗａｎｄｗｈｙｄｏｐｌａｎｔｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ（ｔｒａｎｓ）ｇｅｎｅｓ？）」，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１０７：６７９−６８５）。＃７８系統および空のベクターを用いた対照＃５６Ｃ系統の切片についての反復分析によって、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ．ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）を用いた感染後、＃７８系統におけるホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンの誘導が対照植物におけるものよりも有意に少ないことが示された（図７Ａおよび図７Ｂ）。総体的には、減少はホルムオノネチンコンジュゲートに対して６５％およびメジカルピンに対して５８％であり、これは２種類の系統の植物における相対的ＩＯＭＴ活性を反映するものであった。したがって、誘発または感染させたアルファルファの葉におけるＩＯＭＴのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションに関するデータは、イソフラボノイド経路の残りの部分が誘導される場合に、ＩＯＭＴが、イソホルムオノネチンを生成する７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてよりも、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド（アルファルファにおけるホルムオノネチンおよびメジカルピン）の形成において機能的に作用する。
【００３９】
アルファルファ茎枯病菌（Ｐｈｏｍａｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）は、遺伝的形質転換のために利用される栽培品種（ＲｅｇｅｎＳＹ）に対して病状を生じさせる、成功的なアルファルファの病原体である。フィトアレキシンであるメジカルピンのより迅速な蓄積によって、ＩＯＭＴを過剰発現する植物におけるＰｈｏｍａに対する耐性を生じるか否かを決定するために、菌胞子が入り、罹患しやすいアルファルファ栽培種に対して感染を開始させるように、ＩＯＭＴを過剰発現している植物および対照植物の葉の上に小さい傷の線を生じるためにピンホイールを用いて接種した。次いで、感染後５日目に茶色いＰｈｏｍａによる傷のサイズを測定した。結果は、傷のサイズは対照と比較して、ＩＯＭＴを過剰発現している＃６７および＃６９系統において非常に減少していることが示された。図８Ａおよび８Ｂに示すように、感染後５日目の複数の傷の測定によって、平行して生育および感染させた対応する対照系統についての１．１７ｍｍ（ｎ＝１００）に対して、対照植物については０．９６ｍｍ（ｎ＝１００）、および＃６９系統については０．４１ｍｍ（ｎ＝１００）、ならびにＩＯＭＴ過剰発現＃６７系統については０．４６ｍｍ（ｎ＝１００）の平均の傷のサイズが得られた。したがって、ＩＯＭＴのトランスジェニック過剰発現は、アルファルファにおいて、およびその相似性により４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドがフィトアレキシンとして働く他の植物において病気への耐性を操作するための効果的に機能するストラテジーである。
【００４０】
トランスジェニックアルファルファを用いた酵素アッセイ、供給、誘発および感染の研究結果を総合すると、ｉｎｖｉｔｒｏおよび植物中の両方において外因的に供給されるダイゼインからイソホルムオノネチンを生成するようにダイゼインの７位をＩＯＭＴがメチル化するが、ダイゼインが植物中の内因性イソフラボノイド経路を通して供給される場合には、ホルムオノネチンを生成する４’位特異的メチル化に関与することが示される。天然には本酵素を含有するトランスジェニック植物における酵素の発現を改変するためにリバース遺伝子的実験を行なうことによって、ｉｎｖｉｔｒｏと比較してｉｎｖｉｖｏにおいてこの珍しい異なるＩＯＭＴ位置特異性が今回見出された。
【００４１】
トランスジェニックアルファルファにおけるＩＯＭＴ発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド類のレベルに対して量的に対応する影響を及ぼし、このことはＩＯＭＴがアルファルファにおけるこれらの化合物の合成のための律速酵素として機能的に作用することを示す。対照的に、イソフラボノイド生合成における主要な律速段階はイソフラボン合成酵素チトクロームＰ４５０によって触媒されるイソフラボノイド分枝経路への導入点であることが先に報告されている（Ｓｔｅｅｌｅら，１９９９．「ダイズにおけるイソフラボノイド生合成のアリール移動反応を触媒する酵素の分子特性決定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｚｉｎｇｔｈｅａｒｙｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｓｏｙｂｅａｎ）」，ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ３６７：１４６−１５０；およびＪｕｎｇら，２０００．「マメ科植物におけるイソフラボン類生合成のための主要酵素であるイソフラボン合成酵素の同定および発現（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｆｏｒｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓｉｎｌｅｇｕｍｅｓ），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：２０８−２１２）。
【００４２】
上記データは、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド類の生成の増大およびＩＯＭＴ過剰発現植物における結果として生じる病気への耐性が、上昇したＩＯＭＴレベルの直接の結果であるかもしれないことを示唆し、それゆえ、律速段階としてのこれらの化合物の合成におけるＩＯＭＴの直接的関与を指摘する。しかしながら、４’−Ｏ−メチル化化合物はアルファルファにおけるストレス誘導性フィトアレキシンであることから、ＩＯＭＴ活性が上昇した系統は、ＩＯＭＴによる流れ（ｆｌｕｘ）とは別に、フィトアレキシンの生成を増大させるようなある種の代謝性ストレスを有する可能性がある。非誘発または非感染ＩＯＭＴ過剰発現植物においては、検出可能なフィトアレキシンが欠如していることを考慮して、代謝性ストレスを有さないと思われる（図５Ｃと５Ｄ、および図６Ｃと６Ｄ）。さらにこの可能性を除外するために、およびイソフラボノイド経路の他の酵素がＩＯＭＴの発現後にモジュレートされるか否かを調べるために、本発明者らは、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ．ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）による感染後の時間の関数として、対照およびＩＯＭＴ過剰発現系統におけるフェニルアラニンからメジカルピンへの変換に関与する８つの酵素をコードする転写産物のレベルを調べた。表１の結果から、先ず第一にＩＯＭＴ転写産物がＰｈｏｍａ感染のない＃６９系統において構成的に高く、トランスジーンが３５Ｓプロモーターの制御下にあることと一致することが確認される。異所的にＩＯＭＴを発現する非感染葉において、フェニルプロパノイド／イソフラボノイド経路の他の酵素の転写産物レベルは、対照レベルよりも有意には上昇しなかった。したがって、ＩＯＭＴの過剰発現は、それ自体では、ストレス応答としてイソフラボノイド経路を誘導せず、このことは図５および６の代謝プロファイルデータと一致する。
【００４３】
イソフラボノイド経路の様々な酵素に対する標識ｃＤＮＡを用いて、空のベクターを用いた対照（＃６４Ｃ系統）およびＩＯＭＴ過剰発現（＃６９系統）アルファルファのＰｈｏｍａを感染させた葉におけるイソフラボノイド経路転写産物のＲＮＡゲルブロット分析を表１に示す。全ＲＮＡを、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ．ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）感染（レーンＰ）または水処理（レーンＷ）後、６、２４、および４８時間目に葉から単離し、アルファルファＰＡＬ、アルファルファＣ４Ｈ、アルファルファアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アルファルファＣＨＩ、ＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａＩＦＳ、アルファルファＩＯＭＴ、ＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａＩ２’ＯＨおよびアルファルファＩＦＲに対する標識ｃＤＮＡプローブを用いてプローブした。ブロットを取り除き、ローディングおよび転写効率を調べるためにリボソームＲＮＡプローブと再プローブした。Ｐｈｏｍａによる感染に後には、空のベクターを用いた対照アルファルファ葉のフィトアレキシン経路酵素転写産物の弱い、比較的緩徐な誘導があった。この応答は、互換性相互作用に見出される典型的なものである（Ｌａｍｂら，１９９２．「細菌性病原体に対する作物の耐性を増大させるための新進のストラテジー（Ｅｍｅｒｇｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｅｎｈａｎｃｉｎｇｃｒｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓ）」，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１４３６−１４４５）。しかしながら、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、およびイソフラボン還元酵素（ＩＦＲ）をコードする転写産物レベルは、感染１２時間後までの対照系統においてよりもＩＯＭＴ過剰発現＃６９系統においてより多い。またこれらの転写産物は、感染６時間後までに＃６９系統で有意に誘導され、一方対照において感染６時間後まででは、ＩＦＳおよびＩＦＲ転写産物は誘導されないままだった。カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）およびイソフラボン２’−ヒドロキシラーゼ（Ｉ２’ＯＨ）の転写産物レベルは、感染後に対照と比較して＃６９系統においてわずかに上昇した。対照的に、カルコン合成酵素反応のためにマロニルＣｏＡを提供し、誘発アルファルファ細胞においてフィトアレキシン応答の一部分として共誘導（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ）される酵素である（Ｓｈｏｒｒｏｓｃｈら，１９９４．「アルファルファにおけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの分子クローニング、特性決定および誘発（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎａｌｆａｌｆａ）」，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１：４３２３−４３２７）、サイトゾルアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする転写産物は、いずれの処理においても空のベクターを用いた対照系統においてよりも＃６９系統において有意には高くなかった。
【００４４】
【表１】

【００４５】
さまざまな実施形態において、ＩＯＭＴ遺伝子は、限定されるものではないが、アグロバクテリウム介在型形質転換（Ｈｏｒｓｈ，Ｂ．ら，１９８５．「植物中へ遺伝子を形質転換するための単純かつ一般的な方法（Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｔｏｐｌａｎｔｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９−１２３１）」またはパーティクル銃撃（Ｋｌｅｉｎら，１９８８．「パーティクル銃撃工程による天然型のタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）細胞の恒常的遺伝的形質転換（ＳｔａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｉｎｔａｃｔＮｉｃｏｔｉａｎａｃｅｌｌｓｂｙｔｈｅｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔｐｒｏｃｅｓｓ）」，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５：８５０２−８５０５）を含む標準的植物形質転換手法により植物中へ導入することができる。
【００４６】
本発明において、４−Ｏ−メチル化フィトアレキシン、栄養補助物質（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、それらのコンジュゲートまたはそれらの混合物の生成を誘導する特性を有するＩＯＭＴをコードする任意のポリヌクレオチドを利用してもよい。本発明において有用なＩＯＭＴをコードするポリヌクレオチドには、ＩＯＭＴの優性陰性型をコードするポリヌクレオチドである配列番号１および図２の配列、ならびに配列番号１および図２の配列と相補的な核酸配列が挙げられる。相補的配列にはアンチセンスヌクレオチドを含んでもよい。配列がＲＮＡである場合、配列番号１および図２の配列のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴは、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵと置き換えられる。本発明においては、上記核酸配列の断片も含まれ、該断片は生理的条件またはＩＯＭＴの近縁のファミリーのメンバーにおいて配列番号１および図２の配列のタンパク質をコードするＤＮＡと選択的にハイブリダイズできる十分な長さのヌクレオチドである。配列番号１および図２の配列の変性変異体、ＴがＵであってもよい配列番号１および図２の配列、ならびにＩＯＭＴをコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしうるこれらの配列の断片も含まれる。用語「選択的にハイブリダイズする」とは、関連しないヌクレオチドは排除する中程度または高度にストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。
【００４７】
ＩＯＭＴによる速度制御によって、植物の病気への耐性の改良のための機構として抗菌性フィトアレキシンの蓄積の増大を促進するか、またはイソフラボン類のレベルおよび／またはメチル化状態を増大もしくは低減するＩＯＭＴ発現の操作が可能となる。イソフラボン類は栄養補助物質として有益であり（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，Ｈ．およびＷ．Ｍａｚｕｒ．１９９７．「植物性エストロゲン化合物と欧米の疾病（ｗｅｓｔｅｒｎｄｉｓｅａｓｅｓ）（Ｐｈｙｔｏ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓａｎｄｗｅｓｔｅｒｎｄｉｓｅａｓｅｓ）），ＡｎｎＭｅｄ２９：９５−１２０）、それらは、天然にはマメ科植物（ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｃ）に限られるが、そこでは４’−ヒドロキシル基がメチル化されているか（ホルムオノネチンおよびバイオチャニンＡ）または遊離している（ダイゼインおよびゲニステイン）。ＩｎｖｉｖｏにおけるＩＯＭＴ発現修飾を利用して植物イソフラボン類の４’−Ｏ−メチル化を改変することができる。本明細書中で使用する４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンには、限定するものではないが、メジカルピン、マーキアン（ｍａａｃｋｉａｉｎ）、ピサチン、これら各々のコンジュゲート、またはそれらの混合物が挙げられ；４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養補助物質には、限定するものではないが、ホルムオノネチン、バイオチャニンＡ、テキサシン（ｔｅｘａｓｉｎ）、アフロモシン（ａｆｒｏｍｏｓｉｎ）、シュードバプチゲニン（ｐｓｅｕｄｏｂａｐｔｉｇｅｎｉｎ）、これら各々のコンジュゲート、またはこれらの混合物が挙げられる。上記化合物を天然に産生する植物のトランスジェニック植物におけるＩＯＭＴ遺伝子の過剰発現によって、および上記化合物を天然には産生しない植物のトランスジェニック植物におけるＩＯＭＴ遺伝子の発現によって、４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養薬物のレベルが増加しうる。さらに、４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養補助物質は非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝子工学的に形質転換されたものなど）で製造することができる、これらは、当技術分野において周知の方法を用いて適切な恒常性または誘導性プロモーターの制御下におけるＩＯＭＴ遺伝子の発現による（Ｆｒｉｃｋ，Ｓ．，Ｋｕｔｃｈａｎ，Ｔ．Ｍ．１９９９．「イソキノリンアルカロイドおよびフェニルプロパノイド生合成に共通するＯ−メチルトランスフェラーゼの分子クローニングおよび機能発現（ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｃｏｍｍｏｎｔｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄａｎｄｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，ＰｌａｎｔＪ１７：３２９−３３９；Ｂａｔａｒｄら，１９９８．「Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来の生体異物誘導性７−エトキシクマリンＯ−デ−エチラーゼである、酵母ＣＹＰ７６Ｂ１における分子クローニングおよび機能発現（ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｙｅａｓｔｏｆＣＹＰ７６Ｂ１，ａｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ７−ｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎｅＯ−ｄｅ−ｅｔｈｙｌａｓｅｆｒｏｍＨｅｌｉａｎｔｈｕｓｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）」，ＰｌａｎｔＪ１４：１１１−１２０）。
【００４８】
本発明はまた、食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含有する組成物であって、該組成物中における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドの供給源は本発明のイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植物であるものを含む。４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含むトランスジェニック植物の一部、またはトランスジェニック植物から抽出した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを利用してもよい。
【００４９】
天然に４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養薬物を産生する植物におけるＩＯＭＴのダウンレギュレーションのために、ＩＯＭＴ遺伝子配列をアンチセンス方向にトランスフォームすることができ（Ｂｏｕｒｑｕｅ，Ｊ．Ｅ．１９９５．「植物における遺伝子操作のためのアンチセンス技法（Ａｎｔｉｓｅｎｎｓｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｓ）」，ＰｌａｎｔＳｃｉ１０５：１２５−１４９）、または遺伝子サイレンス化を活性化するように設計されたベクターから発現することができる（Ａｎｇｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．およびＤ．Ｃ．Ｂａｕｌｏｃｏｍｂｅ．１９９７．「複製するポテトウイルスＸＲＮＡを発現するトランスジェニック植物における一貫した遺伝子サイレンス化（ＣｏｎｓｉｓｔｅｎｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸＲＮＡ）」，ＥＭＢＯＪ１６：３６７５−３６８４）。使用するＩＯＭＴ配列は、配列番号１および図２で示したアルファルファＩＯＭＴ８、または、プローブとしてＩＯＭＴ８を用いるハイブリダイゼーション技法によって単離され得るｉｎｖｉｖｏでの４’−Ｏ−メチル化特性を有する任意の他のＩＯＭＴ遺伝子であり得る。
【００５０】
７位の位置がメチル化されたイソフラボノイド化合物（例えば、イソホルムオノネチンおよびプルネチン）も栄養補助物質活性を有し得る。またアルファルファＩＯＭＴを用いて、非メチル化イソフラボン前駆体を、全植物体、植物細胞懸濁培養液、または非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝的に形質転換されたものが挙げられる）であって、適した恒常性または誘導性プロモーターの存在下でＩＯＭＴ遺伝子でトランスフォームされているものへ供給することによってこれらの化合物を産生することができる。あるいは、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を、非メチル化イソフラボン前駆体に単離された可溶性のまたは固定化したイソフラボン−Ｏ−トランスフェラーゼ酵素を接触させることによるｉｎｖｉｔｒｏの工程を利用して産生することができる。該イソフラボン−Ｏ−トランスフェラーゼ酵素は、トランスジェニック植物、植物細胞懸濁培養液、または非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝的に形質転換されたものが挙げられる）から産生および単離されている。本明細書中で使用する、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物には、限定するものではないが、イソホルムオノネチン、プルネチン、これら各々のコンジュゲート、またはこれらの混合物が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
植物におけるイソフラボンの産生およびＯ−メチル化経路を示す。フラバノンナリンゲニンおよびリキリチゲニンは、カルコンシンターゼおよびカルコンイソメラーゼの作用により産生し、リキリチゲニン中の５−ヒドロキシルの欠損によって、カルコンレダクターゼとカルコンシンターゼとの共作用により生じる。Ｂ環のアリール移動は、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼにより触媒されて、脱水後、ダイゼインまたはゲニステインに至る。ホルムオノネチンのメジカルピンへの変換は、２’−水酸化、還元および閉環ステップを介して進行する（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．１９９９．Ｕ．Ｓａｎｋａｗａ編，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ７７３−８２３）。
【図２】
アルファルファイソフラボン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｂは、ＩＯＭＴ発現を改変したトランスジェニックアルファルファの作製および分子学的分析を示す。図３Ａは、ＩＯＭＴ配列をセンス配向およびアンチセンス配向で含有するバイナリーベクター構築物を示す。図３Ｂは、未形質転換「Ｃ」および空のベクターを用いて形質転換した「Ｖ」対照ならびに一連のＩＯＭＴ８センス形質転換体に由来する葉組織におけるＩＯＭＴの酵素活性を示す。
【図４】
図４Ａ〜４Ｄは、未処理のアルファルファ葉に浸漬した後のダイゼインの代謝を示す。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＰｉバッファー中に浸漬した２４時間後における、空のベクターを用いた対照植物の第６２Ｃ系統およびＩＯＭＴセンストランスジェニックの第６９系統の葉から得たフェノール化合物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のプロフィールを示す。図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ葉をＰｉバッファー中に浸漬することによりダイゼイン供給した２４時間後における、同じベクター対照およびセンストランスジェニックの系統から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールを示す。図４Ｅおよび４Ｆは、それぞれ２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンおよびイソホルムオノネチンのＵＶスペクトルを示す。
【図５】
図５Ａ〜５Ｈは、対照およびＩＯＭＴ過剰発現トランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボノイド化合物の非生物性誘発を示す。図５Ａおよび５Ｂは、れぞれ３ｍＭＣｕＣｌ_２に暴露した３２時間後における、ベクター対照の第９Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統のＣｕＣｌ_２処理植物から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。標識ピークである１〜４は、それぞれアピゲニンコンジュゲート、７，４’−ジヒドロキシフラボン、７，４’−ジヒドロキシフラバノンおよびアピゲニンアグリコンとして同定された。図５Ｃおよび５Ｄは、それぞれ水中に幼植物を移して３２時間後におけるベクター対照である第９Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統の植物から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図５Ｅおよび５Ｇは、Ｈ_２Ｏまたは３ｍＭＣｕＣｌ_２に暴露した３２時間後における、栄養増殖させたベクター対照の第９Ｃ系統および第６２Ｃ系統（対照系統）ならびにＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統および第６９系統の葉におけるホルムオノネチンレベルを示し、図５Ｆおよび５Ｈは、メジカルピンレベルを示す。
【図６】
図６Ａ〜６Ｆは、対照およびＩＯＭＴ過剰発現トランスジェニックアルファルファにおける細菌感染に応答したイソフラボノイド化合物の蓄積を示す。図６Ａおよび６Ｂは、フォマ・メジカギニス（Ｐｈｏｍａｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）感染の１２時間後における、それぞれ空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統の感染した葉から得た抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｃおよび６Ｄは、それぞれ第６４Ｃ系統および第６７系統の未接種の葉から得た抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｅおよび６Ｆは、Ｐ．メジカギニスの接種後種々の時間における、栄養増殖させたベクター対照（第６４Ｃ系統）ならびにＩＯＭＴ過剰発現（第６７系統および第６９系統）植物の葉における、それぞれホルムオノネチングルコシドまたはメジカルピンレベルを示す。
【図７】
図７Ａ〜７Ｂは、対照および推定上ＩＯＭＴ遺伝子がサイレンシングされたトランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボノイド化合物の蓄積を示す。ホルムオノネチングルコシドレベル（図７Ａ）およびメジカルピンレベル（図７Ｂ）は、フォマ・メジカギニスの胞子を接種した２０時間後における、ベクター対照の第５６Ｃ系統およびＩＯＭＴセンス形質転換体第７８系統の挿し木から得た葉において測定した。
【図８】
図８Ａ〜８Ｂは、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変したトランスジェニックアルファルファの病害抵抗性を示す。図８Ａは、接種後５日目に測定した、空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６９系統の葉における１００個の傷のサイズを示す。１００個の傷害部位を有する並行系統のトレースホイール単独のものにより生じた傷のサイズの平均値は減じた。実線は、対照系統の平均値を示し、波線はＩＯＭＴ過剰発現系統の平均値を示す。バーは標準偏差を示す。図８Ｂは、上述のように接種した後５日目に測定した葉の１００個の傷のサイズを示すが、同時に感染させたＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統および空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統の傷を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to genetic engineering of plants.
[0002]
Background of the Invention
Leguminosae isoflavonoids are a class of the most important biological activities of plant natural products derived from phenylpropanoids. Isoflavones, such as daidzein, genistein and biochanin A, exhibit a wide range of pharmacological actions, such as estrogenic, anti-angiogenic, antioxidant and anti-cancer activities (Dixon, RA 1999. "Isoflavonoids"). Biochemistry, molecular biology and biological functions. ”Edited by U. Sankawa, Comprehensive Natural Products, foodstuffs, and a natural foodstuff. (Barnes et al., 1990. "Soybeans inhibit mammary tum." rs in models of breast cancer. ", edited by MW Pariza, Mutagens and Carcinogens in the Diet (mutagens and carcinogens in the diet), Wiley-Liss, Inc., Nyc, Np, k, Np, k, Np-2, Nc-2 . Adlercreutz et al., 1991 "Urinary excretion of lignans and isoflavonoid phytoestrogens in Japanese men and women consuming a traditional Japanese diet," Am J Clin Nutr 54:. 1093-1100; Lee et al., 1991 "Dietary effects on breast-canc r risk in Singapore, "Lancet 337: 1197-1200). Daidzein and genistein function as precursors in the biosynthesis of various antibacterial isoflavonoid phytoalexins in a wide variety of legumes (Dixon, RA and N.L. Paiva. 1995. "Stress-induced"). phenylpropanoid metabolism, "Plant Cell 7: 1085-1097). Furthermore, because of their estrogenic activity, high levels of isoflavonoids (such as phytoestrogens form ononetin) can have a detrimental effect on the fertility of sheep that feed on forage legumes (Shutt, DA 1976. "The effects of plant oestrogens on animal reproduction," Endeavor 75: 110-113).
[0003]
Isoflavonoids are thought to play an important role in the interaction of plant pathogens. The reason is that many isoflavonoids have very strong antibacterial activity. Antibacterial isoflavonoids are classified into two functional classes: pre-produced "phytoanticipines" and inducible "phytoalexins" (VanEtten et al., 1994. "Two classes of plant antibiotics". : Phytoalexins versus phytoantiticins, "The Plant Cell 6: 1191-1192). Examples of the former class include lupin prenylated isoflavones, which are synthesized in various organs of plants during the development of young plants (Ingham et al., 1983. "Fungitoxy isoflavones"). from Lupinus albus and other Lupinus specifications, "Zeitschrift fur Natureforschung, C 38: 194-200). Examples of the latter include several pterocarpans whose biosynthesis is particularly detailed with respect to phaseolin, medicarpine, pisatin and glyceollin, respectively from bean, alfalfa, pea and soybean, respectively. Research is being conducted (Dixon, RA 1999. "Isoflavonoids: biochemistry, molecular biology and biological functions, eds.," Comprehensive Natural Products, Natural Chemicals, U.S.A. , Elsevier, pp. 773-823).
[0004]
Isoflavonoid compounds have been shown to accumulate in infected plant cells to levels known to be antimicrobial in vitro. The temporal, spatial and quantitative characteristics of this accumulation are consistent with the function of these compounds with respect to disease resistance (Rahe, JE 1973. "Occurrence and levels of the phytoalexin phaseollin in relation to delimitation." at sites of infection of Phaseolus vulgaris by Colletotrichum lindemuthianum, "Can J Botany 51:. 2423-2430; Hadwiger, L. A. and D. M. Webster 1984." Phytoalexin production in five cultivars of pea differentially resistant to three races of Pseudomonas syringae pv Pisi,.. "Phytopathology 74:. 1312-1314; Long et al., 1985" Further studies on the relationship between glyceollin accumulation and the resistance of soybean leaves to Pseudomonas syringae pv Glycinea, "Phytopathology 75: 235-239; Bhattacharya, MK and EW Ward 1987. "Biosynthesis and metabolism of glyceollin I in so. ybean hypocotyls following joining or inoculation with Phytophthora megasperma f. sp. Glycinea, "Physiol Mol Plant Pathol 31: 387-405). The inhibition of glyceoline synthesis caused by the action of an L-phenylalanine ammonia lyase (PAL) inhibitor on soybean seedlings destroys the resistance to the disease-causing fungus (Phytophthora megasperma f. Sp. Glycinea) (Moesta, . P. and H. Grisebach 1982. ".. L-2-Aminooxy-3-phenylpropionic acid inhibits phytoalexin accumulation in soybean with concomitant loss of resistance against Phytophthora megasperma f sp Glycinea," Physiol Plant Pathol 21: 65 70). Isolates of the fungal pathogen Nectria hematococca, which have reduced ability to attenuate pea phytoalexin pisatin, have reduced toxicity to pea, indicating that pisatin is a disease-causing agent. Suggests that it is functionally involved in the resistance response (Kistler, H. C. and HD Van Etten. 1984. "Regulation of pisatin demethylation in Nectria haematocerance and infections influenza interference influenza interference influenza incluence indusence influenza incluence influenza incluence indusance inflections infensence influencer influenzae infancence indus "J Gen Micro 130: 2605-2613).
[0005]
Phytoalexins accumulate more rapidly and at higher levels in the course of resistant interactions between plants and their microbial pathogens than do disease-causing susceptible interactions (Dixon, RA and M.A.). J. Harrison, 1990. "Activation, structure and organization of geneses involved in microbiological defense in plants," Adv Genet 28: 165-234). Therefore, it is believed that increased resistance to increased rates of phytoalexin accumulation and reaching absolute levels (Lamb et al., 1992. "Emerging strategies for enhancing crop resistance to microbiological pathogens," Bio. / Technology 10: 1436-1445).
[0006]
Certain methylated forms of isoflavones, such as formonenetin (7-hydroxy-4'-methoxyisoflavone) and biochanin A (5,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone) provide benefits as nutritional supplements. It is shown. For example, biochanin A and formononetin are reported to be phytoestrogens, biochanin A has been shown to be effective in animal cancer research model (Yangihara et, 1993. "Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer cell Lines established from the gastrointestinal tract, "Cancer Res 53: 5815-5821; and Zhou-Jin-Rong et al., 1998." ycle, apoptosis, and angiogenesis, "Cancer Res 58: 5231-5238).
[0007]
As can be seen from the above examples, genetic engineering of isoflavonoid biosynthesis in transgenic plants can have a positive impact on plant, animal and human health (Dixon et al., 1999. "Molecular controls for." isoflavonoid biosynthesis in relation to plant and human health, "Recent Advances in Phytochemistry 33: 133-160). However, an enzyme involved in increasing the accumulation of isoflavonoid phytoalexin has not been identified, and not all of the genes encoding the isoflavonoid phytoalexin biosynthetic enzyme have been cloned.
[0008]
The biosynthetic branching pathway leading to isoflavones in plants involves the 2-hydroxylation / aryl transfer mediated by the cytochrome P450, a flavanone intermediate produced from phenylpropanoid and acetate derived precursors by the chalcone synthase and chalcone isomerase reactions. (Fig. 1) (Kochs, G. and H. Grisebach 1986. "Enzymic synthesis of isoflavones," Eur J Biochem 155:.. 311-318; Hakamatsuka et, 1991 "P-450 dependent oxidative rearrangement in isoflavone biosynthesis: reconstitution of P-450 and NADPH: P 450 reductase ", Tetrahedron 47:. 5969-5978; Steele et al., 1999" Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of isoflavonoid biosynthesis in soybean, "Arch Biochem Biophys 367: 146-150; and Jung et al., 2000." Identification and expression of isoflavone synthase: the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legs, "Nature Biotechno ogy 18: 208-212). After the transfer of the aryl, the 2-hydroxyisoflavanone intermediate is dehydrated to give the corresponding isoflavones (Hakamatsuka et al., 1998. "Purification of 2-hydroxyisoflavanone dehydration phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate from phthalate phthalate phthalate phthalate phthalate from phthalate phthalate phthalate from the terrestrial phthalate phthalate from the cellulase. 505). Genistein (4 ', 5,7-trihydroxyisoflavone) is a product obtained by the aryl transfer / dehydration of naringenin (4', 5,7-trihydroxyflavanone), while daidzein (4 ', 7-dihydroxy isoflavone). Isoflavones) are likewise produced from liquiritigenin (4 ', 7-dihydroxyflavanone). Formonenetin (7-hydroxy-4'-methoxyisoflavone) is obtained by 4'-O-methylation of daidzein, but biochanin A (5,7-dihydroxy-4'-) is obtained from 4'-O-methylation of genistein. methoxy isoflavone) is obtained, this biochanin a is an important compound having anticancer activity which was found in chickpea (Yanagihara et al, 1993. "antiproliferative effects of isoflavones on human cancer cell lines established from the gastrointestinal tract, "Cancer Res 53: 5815-5821) (Figure 1).
[0009]
In alfalfa and certain other legumes (such as chickpea), methylation of the 4'-hydroxyl is a prerequisite for further replacing the benzene nucleus of the isoflavonoids leading to pterocarpanphytoalexins such as medicarpine. (Dixon, RA 1999. "Isoflavonoids: biochemistry, molecular biology and biological functions.", U.S. Sankawa, ed. This reaction is biologically important as it is the starting point of the pathway by which isoflavones with human anticancer activity are converted into downstream metabolites with antibacterial activity on plants. However, the exact mechanism of this O-methylation reaction still has unclear points. Based on radiolabelling studies of copper-induced alfalfa seedlings in which formoneonetin rather than daidzein has been introduced into pterocarpan medicarpine, 4'-O-methylation is an essential part of the aryl transfer reaction in isoflavone biosynthesis ur it has been proposed (Dewick, P. M. and M. Martin 1979.. "Biosynthesis of pterocarpan, isoflavan and coumestan metabolites of Medicago sativa: chalcone, isoflavone and isoflavanone precursors," Phytochemistry 18: 597-602). However, aryl migration occurs in vitro without undergoing methylation (Kochs, G. and H. Grisebach. 1986. Eur J Biochem 155: 311-318; Hakamatsusuka et al., 1991. Tetrahedron 47: 5969-5969. 5978;. Kessmann et al., 1990 ". Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L.) III Induction of medicarpin and cytochrome P450 enzyme activities in elicitor-treated cell suspension cultures and protoplasts," Plant Cell Rep 9 . 38-41; Steele et al., 1999 "Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of isoflavonoid biosynthesis in soybean," Arch Biochem Biophys 367: 146-150), a mutant of Sabutarenian-clover (subterranean clover) , Formonenetin and biochanin A are actually absent, instead accumulating daidzein and genistein (Wong, E. and CM Francis. 1968. "Flavonoids in geneotypes of Trifolium subranan). Mutants of the Geraldton variability, "Phytochemistry 7: 2131-2137), indicating that isoflavones are a natural substrate for 4'-O-methylation. This problem is also caused by the fact that it has not been proven possible to purify S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent O-methyltransferase (OMT), which can catalyze the 4'-O methylation of daidzein. is there. Instead, the SAM-dependent isoflavones OMT derived from alfalfa (He, XZ and RA Dixon. 1996. "Affinity chromatography and employment of a specific activity and a participatory chemistry and analytic activity system." Medicago sativa L.), "Arch Biochem Biophys 336: 121-129) produces 7-O-methyldaidzein (isoformononetin) in vitro by methylation of the hydroxyl group at position 7. Isoformononetin is a rare natural plant product and no one derived from alfalfa has been reported.
[0010]
Isoflavone 7-OMT has been cloned from alfalfa, and this recombinase converts daidzein exclusively to isoformononetin when expressed in E. coli (He et al., 1998. "Stress responses in alfalfa (Medicago)." sativa L.) XXII.cDNA cloning and characterization of an elicitor-inducible isoflavone 7-O-methyltransferase, "Plant Mol Biol 36: 43-54). This enzymatic activity and its corresponding transcript are as strongly induced in elicited alfalfa cell cultures as other enzymes in medicarpine biosynthesis (Dalkin et al., 1990. "Stress responses in alfalfa (Medicago). sativa L.) I. Elicitor-induction of phenylpropanoid biosynthesis and hydrolytic enzymes in cell suspension cultures, et al., 1992;
[0011]
OMT sequences for a number of plants are currently available in databases, most encoding hydroxycinnamic acid intermediates for lignin biosynthesis, or enzymes that act on flavonoid derivatives (Ibrahim et al., 1998). "Plant O-methyltransferases: molecular analysis, common signature and classification," "Plant Mol Biol 36: 1-10; Joshi, CP, and V.L. L-methionine-dependent methyltransferases, "Plant Mol Biol 37: 663-674). In almost all cases, the enzyme shows strict regiospecificity. For example, a series of distinct regiospecific OMTs have been implicated in the synthesis of polymethylated flavonols in Chrysosplenium americanum (Ibrahim et al., 1987. "Enzymology and promotion of chemistry." Gauthier et al., 1996. "CDNA cloning and characterization of a 3 '/ 5'-O-methyltransferase for methylation.", Phytochemistry 26: 1237-1245; ls from Chrysosplenium americanum, "Plant Mol Biol 32: 1163-1169). However, some OMTs are less specific and act on both flavonoids and hydroxycinnamic acids (Gauthier et al., 1998. "Characterization of two cDNA clones who encode the O-methyltransferases the other methion for the other meth ylation of the other meth ylation of the other meth ylation of the other methion phenylpropanoid compounds, "Arch Biochem Biophys 351: 243-249) or one or more related substrates such as the well-studied caffeic acid / 5-hydroxyferulic acid OMT such as lignin biosynthesis. (Bugos et al., 1991. "cDNA cloning, sequence" nce analysis and seasonal expression of lignin-bispecific caffeic acid / 5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase of aspen, "Plant Mol Biol 17:. 1203-1215; Li et al., 2000" 5-Hydroxyconiferyl aldehyde modulates enzymatic methylation for syringyl monolignol formation, a new view of monolignol biosynthesis in angiosperms, "J Biol Chem 275: 6537-6545). However, no report has been made on biosynthetic enzymes of OMT or other natural plant products that exhibit different regiospecificities in vivo and in vitro.
[0012]
By exploiting the different regiospecificities of isoflavone 7-OMT in vivo, it is possible to genetically manipulate biologically active 4'-O-methylated isoflavonoids.
[0013]
Summary of the Invention
In one aspect, the invention is a method of increasing the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant, comprising the steps of: providing a DNA fragment comprising an isoflavone O-methyltransferase gene. And transforming said target plant to produce a transgenic plant, and in said transgenic plant, overexpressing said isoflavone O-methyltransferase gene under the control of an appropriate construct or inducible promoter. In particular, the 4'-O-methylated isoflavonoid compound may be a 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexin or a 4'-O-methylated isoflavonoid nutritional supplement. Good. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0014]
In another aspect, the present invention is a method of producing at least one 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant that does not produce a 4'-O-methylated isoflavonoid compound, the method comprising: A transgenic plant is produced by transforming the target plant with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene, and isoflavone O-methyl is produced in the transgenic plant under the control of an appropriate structure or an inducible promoter. Expressing the transferase gene, wherein the transgenic plant contains all the other isoflavonoid biosynthetic enzymes necessary to produce a 4'-O-methylated isoflavonoid compound. In particular, the 4'-O-methylated isoflavonoid compound may be a 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexin or a 4'-O-methylated isoflavonoid nutritional supplement. Good. The target plant may contain natural DNA encoding other enzymes required for isoflavonoid biosynthesis. Alternatively, when the target plant lacks the necessary enzyme, it may be transformed with a DNA fragment encoding the defective enzyme. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0015]
In another aspect, the invention is a method of producing at least one 4'-O-methylated isoflavonoid supplement in a non-plant cell line, the method comprising the steps of: In a cell that has been genetically transformed to contain all of the other isoflavonoid biosynthetic enzymes necessary to produce a nutraceutical, the DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene can be appropriately constructed or derived from an inducible promoter. The expression is performed under the control of. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0016]
In another aspect, the invention is a method of reducing the level of formononetin, at least one conjugate thereof or a mixture thereof in a transgenic forage legume such as alfalfa, comprising a suitable composition Alternatively, antisense expression or sense gene-mediated silencing is performed using a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene under the control of an inducible promoter. Alternatively, isoflavone O-methyltransferase may be down-regulated by nucleic acid-mediated insertion inactivation. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0017]
In another embodiment, the present invention reduces the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant that contains all of the enzymes required for the synthesis of the 4'-O-methylated isoflavonoid compound. A transgenic plant is produced by transforming the target plant with a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene, under the control of an appropriate configuration or an inducible promoter. Inducing antisense expression of the isoflavone O-methyltransferase gene, sense gene mediated silencing or nucleic acid mediated insertion inactivation. The method is useful for reducing compounds selected from the group consisting of 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins, 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins and mixtures thereof. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0018]
In another embodiment, the present invention provides at least one 4'-O-methylated isoflavonoid in a target plant that contains all of the enzymes necessary for the synthesis of a dietary supplement or a conjugate thereof. A method for reducing the level of an isoflavonoid nutraceutical, at least one 4'-O-methylated isoflavonoid conjugate or a mixture thereof, comprising the steps of: providing a DNA fragment comprising an isoflavone O-methyltransferase gene; To produce a transgenic plant, and to induce antisense expression of an isoflavone O-methyltransferase gene or sense gene-mediated silencing under the control of an appropriate configuration or an inducible promoter. And the corresponding non- Chill precursor includes increasing the level of the conjugates or mixtures thereof. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0019]
In another aspect, the present invention is a method of producing a 7-O-methylated isoflavonoid compound, the method comprising the step of producing a 7-O-methylated isoflavonoid compound in a whole plant or cell suspension culture. Contacting a methylated isoflavone precursor, wherein the whole plant or cell suspension culture uses a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene under the control of the appropriate construct or inducible promoter. Have been transformed. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0020]
In another aspect, the invention is a method of producing a 7-O-methylated isoflavonoid compound, comprising contacting a soluble or immobilized isoflavone O-methyltransferase enzyme with an unmethylated isoflavone precursor. Wherein the enzyme is produced by expression of a DNA fragment containing the corresponding isoflavone O-methyltransferase gene in a transgenic plant or heterologous system. It is. In a preferred embodiment, the heterologous system is one selected from the group consisting of transfected bacteria, yeast and insect cells. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0021]
In yet another aspect, the invention is an antiserum to 4'-O-methyltransferase for use as a reagent for determining transgene expression of 4'-O-methyltransferase in a plant.
[0022]
In yet another aspect, the present invention is a method for increasing the disease resistance of a target plant, which is performed by transforming the target plant with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene. Wherein the transformed plant is characterized by its 4'-O-methylated isoflavonoid level when compared to the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid of a plant of the same species that does not contain the DNA fragment. It shows an increase in flavonoid levels. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.
[0023]
In yet another aspect, the present invention provides a composition comprising at least one 4'-O-methylated isoflavonoid suitable for administration as a food, nutritional supplement, animal feed supplement, functional food or medicament. Wherein the 4′-O-methylated isoflavonoid is isolated from at least a part of a transgenic plant transformed with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene, The plant exhibits an increase in the level of the 4'-O-methylated isoflavonoid when compared to the level of the 4'-O-methylated isoflavonoid in a homologous plant that does not contain the DNA fragment. In a preferred embodiment, the DNA fragment used for transforming a plant is one containing SEQ ID NO: 1 or a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1. Plants include legumes.
[0024]
In another aspect, the invention is a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a portion of an isoflavone O-methyltransferase gene, wherein the plant, upon expression of the gene, FIG. 4 shows an increase in 4′-O-methylated isoflavonoid compound levels compared to 4′-O-methylated isoflavonoid compound levels in plants of the same species that do not contain a DNA sequence. The present invention also includes seeds, progeny, and progeny obtained from the seeds obtained from the transgenic plants.
[0025]
In another aspect, the invention is a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a portion of an isoflavone O-methyltransferase gene, wherein the plant, upon expression of the gene, FIG. 4 shows a decrease in 4′-O-methylated isoflavonoid compound levels compared to 4′-O-methylated isoflavonoid compound levels in plants of the same species that do not contain a DNA sequence. The present invention also includes seeds, progeny, and progeny obtained from the seeds obtained from the transgenic plants.
[0026]
Detailed description
Utilizing reverse genetics and ectopic expression techniques in transgenic alfalfa, the alfalfa flavone OMT is involved in the formation of a different product, i.e., isoformononetin in vitro, whereas in vivo, it is isoformononetin. It was found to be. Due to the in vivo positional specificity of the alfalfa flavone OMT, formonenetin levels in transgenic plants are now genetically engineered to reduce the levels of this compound, which may improve feed quality. In other embodiments, the use of transgenic reduction of isoflavone 4'-O-methylation may increase the levels of intermediate precursors to this reaction, the key nutritional supplements daidzein and genistein. As used herein, isoflavone OMT functionally acts as a rate-limiting enzyme for the production of antimicrobial phytoalexin medicarpine in infected alfalfa leaves, resulting in overexpression of isoflavone OMT in transgenic alfalfa and The post-infection level of medical carpine is significantly increased, indicating a strong increase in disease resistance. The functional specification of alfalfa IOMT determines the levels of formonenetin or other 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceuticals (e.g., biochanin A, texin, aflormosin and pseudobaptigenin) in plants producing these compounds. This was done in a currently feasible way to increase or decrease or to improve disease resistance by increasing the level of medicarpine or related 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins (e.g., macchiain or pisatin). . Thus, transgenic expression of isoflavone OMT in legumes can be used to engineer both phytoalexin levels to improve disease resistance and phytochemicals for health-promoting nutritional supplements. In addition, IOMTs also do not naturally produce isoflavones, but do engineer isoflavone 4'-O-methylation in plants or other organisms in which isoflavoids have been engineered by the introduction of the necessary isoflavone synthase. It can be used for
[0027]
To demonstrate that isoflavone O-methyltransferase (IOMT) is involved in the in vivo production of formonenetin, and thus medicalpine derived from formonenetin, by the pathway shown in FIG. It was produced as follows.
[0028]
Example 1 : Typical IOMT cDNA And characterization of expression plasmids containing
The full length alfalfa IOMT8 cDNA (SEQ ID NO: 1 and FIG. 2) was placed in sense and antisense orientation under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter for constitutive expression in alfalfa. All recombinant DNA techniques were performed as described by Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory. New York). For construction of the sense vector, the expression plasmid pET15b / IOMT8 (He et al., 1998. Plant Mol Biol 36: 43-54) containing the full length IOMT8 cDNA was digested with BamHI and NcoI. The 1.2 Kb fragment was isolated and placed at the NcoI and BamH sites in plasmid pRTL2 (Restrepo et al., 1990. “Nuclear transport of plant polyviral proteins”, Plant Cell 2: 987-998). Subcloned. For construction of the antisense vector, full-length IOMT8 cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the following primers: 5'-GGGGTACCTGGATATAGCTCAATAAGAGA-3 '(SEQ ID NO: 2) and 5'-CGCGGGATCCCATGGCTTCATCAATTAATGG-3' (SEQ ID NO: 3), which had Kpn1 and BamHI restriction sites added, and the PCR product was digested with Kpn1 and BamHI and subcloned into pRTL2. The plasmid containing the IOMT sequence in pRTL2 was digested with HindIII, and a 2.2 Kb fragment containing the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the tobacco etch virus 5 'untranslated leader sequence, the IOMT sequence, and the CaMV terminator was isolated, and the binary vector pGA482 was isolated. (An, G. 1986. "Development of plant promoter expression vectors and their use for analyzing the differential activity of the nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells" (Development of plant promoter vectors and the airflow). analysis of differential activity of nopaline synthase promote r in transformed tobacco cells) ", Plant Physiol 81: 86-91) was ligated to the HindIII site of. The construct was introduced into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 by electroporation (Cell-porator, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). A genetic construct utilizing the intermediate plasmid pRTL2 and the binary vector pGA482 is shown in FIG. 3A.
[0029]
Example 2: By alfalfa transformation IOMT Transgene genome insertion
Alfalfa (Medicago sativa) Cultivar Regen SY was transformed using kana machine (25 mg / L) as a selectable marker and regenerated by somatic embryogenesis (Thomas et al., 1990. "Using Agrobacterium-transformed tissue" Selection of interstitial somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium-transformated tissue 98: 1980. Trilobular leaves are surface sterilized with 1% (v / v) sodium hypochlorite solution containing 0.1% Tween 20 in 70% ethanol for 10 seconds, then IOMT construct or empty vector (control ) Were immersed in a suspension of Agrobacterium LBA4404 for 10 to 15 minutes. After rinsing with distilled water, tissues were blotted on paper towels and plated on MS medium (Murashige, T. and Skoog, F. 1962. "For rapid growth and bioassay using tobacco tissue culture" Modified medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture ", Physiol Plant 15: 473-497). The medium includes B5 vitamins, 0.25 g / l casein hydrolyzate, 10 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 5 μM 6-benzylaminopurine (BAP), 0.1 mM acetosyline Gon (acetosyringone) and 30 g / l sucrose (A1 medium). Three days after co-culture, the tissues were transferred to the above medium but containing 2 μM BAP, 500 μg / ml carbenicillin, 25 μg / ml kanamycin and no acetosyringone (A2 medium). Four weeks after the subculture, calli were transferred to A2 medium (A3 medium) supplemented with 30 mM L-proline but not BAP for embryo growth. Somatic embryos were transferred to A3 medium without 2,4D (A4 medium) for embryo germination. The emerging seedlings were transferred to A4 medium without casein hydrolyzate and proline for final rooting. Potted kanamycin resistant plantlets were maintained in a greenhouse.
[0030]
After plant regeneration through somatic embryogenesis as described above, transformants were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for insertion of the IOMT transgene sequence into the genome. Genomic DNA can be obtained from Edwards et al. (Edwards et al., 1991. "A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for Radionuclides analysis by PCR analysis"). 19: 1359). The leaf tissue of the transformant was extracted in 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and placed in a small microcentrifuge. For 5 minutes. Then, the supernatant was transferred to a new Eppendorf tube to which 2-propanol was added in an equal amount. After a 2 minute incubation at room temperature, the DNA was precipitated by centrifugation. The pellet was resuspended in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. The PCR reaction was performed with 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.25 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 0.5 units of Taq polymerase, 0.4 μM oligonucleotide primers and 200 ng of plant DNA in a 50 μl volume. PCR amplification of the IOMT sequence was performed using the 5 ′ (5′-GGCCATATGGCTTTCATCAATTATGGC-3 ′) (SEQ ID NO: 4) and 3 ′ (5′-CGGGATCCTTATGGATAGATCTCAA-3 ′) (SEQ ID NO: 5) of IOMT8 as primers. did. Using a Perkin Elmer Cetus 480 thermocycler, perform 35 cycles of denaturation (94 ° C., 1 minute), annealing (55 ° C., 1 minute), and extension (72 ° C., 1 minute) and a 5 minute extension to the final cycle. Amplification was performed. Controls contained DNA from plants transformed with the empty vector and plants not transformed. More than 70% of the transformants contained the full-length IOMT cDNA insert (data not shown). All transgenic lines generated were phenotypically normal. Integration of the transgene into the genome was confirmed in a subset of transformants by Southern blot analysis. To do this, genomic DNA is isolated from leaf tissue (Edwards et al., 1991. Nucleic Acids Res 19: 1359), digested with EcoRI or HindIII, and electrophoresed on a 0.8% agarose gel. Transferred to a Hybond-N membrane (Amersham, Piscataway, NJ) by capillary blotting. This membrane³²Hybridized with a P-labeled 800 bp IOMT probe (from nucleotides 249-1035 of SEQ ID NO: 1 and FIG. 2) and in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. for 20 minutes and at 65 ° C. Washing was performed three times for 30 minutes. Sense transformants # 52, # 61, # 62, # 67, # 69 and # 78 had higher transgene copy numbers than the other lines analyzed. Southern blot analysis following digestion with HindIII and hybridization with the T-DNA left border region indicated that individual transformants resulted from independent integration events.
[0031]
Example 3: Alfalfa IOMT Use of polyclonal antiserum against IOMT Check the transgene
IOMT transcripts are not expressed in healthy alfalfa leaves (He et al., 1998. Plant MoI Biol 36: 43-54), and therefore expression of the IOMT transgene is demonstrated by demonstrating the presence of IOMT activity in leaves. It is confirmed. Thus, leaf tissue extracts from representative sense transformants and vector control transgenic alfalfa plants were expressed in E. coli to assess the level of ectopic expression of the enzyme in leaves. Western blot analysis was performed using a polyclonal antiserum to Alfalfa IOMT. Polyclonal antisera to IOMT was produced by immunizing rabbits (Covance Research Products Inc., Denver, PA) with protein antigens expressed from E. coli (He et al., 1998. Plant Mol. Biol 36: 43-54). The protein extract from leaf tissue was solubilized in sample buffer (25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 2.5% 2-mercaptoethanol, 5% glycerol). Proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham, Piscataway, NJ) by electrophoretic blotting in transfer buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM glycine, 20% v / v methanol). did. The blot was probed with a polyclonal antiserum against purified alfalfa IOMT as the primary antibody using an anti- (rabbit IgG) peroxidase conjugate as the secondary antibody. The IOMT signal was detected by exposing the blot to X-ray film immediately after incubation with the ECL reagent (Amersham, Piscataway, NJ).
[0032]
Example 4: Transgenic expression IOMT Impact of
IOMT enzyme activity was measured on extracts from leaf tissue taken from plants maintained in a greenhouse. IOMT activity was analyzed as previously described (He, XZ and RA Dixon. 1996. Arch Biochem Biophys 336: 121-129). Leaf tissue was ground into powder in liquid nitrogen and extracted in enzyme assay buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.3, 5 mM EDTA, 14 mM 2-mercaptoethanol, 10% PVPP). After centrifugation, the supernatant was used for the enzyme activity assay. The reaction mixture contains 100 nmol daidzein, 300 nmol S- [³[H-methyl] adenosyl-L-methionine and enzyme extract. The reaction was performed at 30 ° C. for 30 minutes and stopped by the addition of 100 μl acetic acid. The reaction mixture was extracted with 0.5 ml ethyl acetate, the ethyl acetate was evaporated under nitrogen, and the residue was resuspended in methanol. The resuspended residue was applied to silica gel thin layer chromatography (TLC) plates (Si250; Baker, Philipsburg, NJ) for product analysis. Following development in chloroform: methanol: triethylamine (8: 1: 1, v / v), the product of interest was scraped from the TLC plate and radioactivity was quantified by liquid scintillation counting. For product analysis by HPLC, 20 μl of the resuspended residue was applied to a C18 column (5 μm particle size, 4.6 mm × 250 mm) and eluted with a gradient of increasing solvent B in solvent A (solvent A: 1% phosphoric acid aqueous solution; solvent B acetonitrile: 0 to 40 minutes, 20 to 45% B; 40 to 42 minutes, 45 to 95% B). The eluate was monitored at 287 nm. Product identification was confirmed by co-elution and diode array analysis of UV spectra using reference samples of formonenetin and isoformonenetin.
[0033]
Multiple independent transgenic lines harboring the IOMT sense construct expressed high IOMT activity (FIG. 3B). However, the # 62 and # 78 lines with high transgene copy numbers did not express IOMT activity. There was a direct relationship between IOMT protein levels measured by immunoblotting and enzyme activity extractable from leaves. Daidzein and S- [³By TLC and HPLC analysis of the labeled product formed from [H-methyl] adenosyl-L-methionine, only isoformonenetin was produced by the enzyme extracted from healthy untransformed alfalfa leaves (data not shown). This was consistent with what was previously considered to be the enzyme function of isoflavone 7-O-methyltransferase.
[0034]
Alfalfa root accumulates formonenetin malonyl glucoside (FMG), medicarpine and medicarpine malonyl glycoside (MMG) (Sumner et al., 1996. "High performance liquid chromatography for flavonoid glucosides in legume extracts. / Continuous flow liquid secondary ion mass spectrometry (High-performance liquid chromatography / continuous-flow liquid ionization mass spectrometry of flavonoid gastrometry). To determine whether down-regulation of IOMT affected the levels of the compound in roots, extraction of phenolic compounds and HPLC analysis were performed as described previously (Dalkin et al., 1990. Plant Physiol 92: 440). -446). Equal amounts of tissue were triturated in liquid nitrogen and extracted twice with acetone overnight at room temperature. The extract was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was collected. The acetone was evaporated under nitrogen and the residue was dissolved in methanol. Insoluble material was removed by centrifugation at 12,000 xg for 30 minutes. 20 μl of the solution was applied to a C18 HPLC column (particle size 5 μm, 4.6 mm × 250 mm) and eluted with a gradient increasing solvent B (solvent A: 1% phosphoric acid aqueous solution; solvent B, acetonitrile: 0 to 40 min. 20-45% B; 40-42 min, 45-95% B). The absorbance of the eluate was monitored at 287 nm. Retention times and calibration curves for formonenetin, isoformonenetin, medicalpin and their conjugates were established with reference samples. By HPLC analysis of root extracts from plants grown in the greenhouse, formononetin, FMG and MMG levels are very variable, making it difficult to determine if differences in metabolite levels are significant It was shown. Therefore, for the analysis of antisense transgenic lines, plants originally selected based on metabolite levels were grown and propagated and grown under growth chamber conditions. Three independent antisense # 42, # 54 and # 60 lines showed 33% to 44% for FMG and 33% for medicarpine compared to the average of a population of 46 independently bred control plants. 29% to 71%, and 18% to 51% for MMG, showed significant decreases in the levels of these compounds. The above results indicate that expression of the IOMT antisense construct reduces constitutive root isoflavone levels.
[0035]
A number of independent alfalfa transformants with strong ectopic expression of IOMT in leaves were analyzed for constitutive isoflavonoid intermediate levels. Only the isoflavonoid pathway is significantly expressed in alfalfa leaves following stresses such as infection or induction (Higgins, VJ 1972. "Phytoalexium in three leaf spot diseases of alfalfa." Role of the phytoalexin medicarpin in three-leaf spot diseases of alfalfa, "Physiol Plant Pathol 2: 289-300; alfalfa) ", Plant Cell , Tissue and Organ Cult 38: 213-220). Therefore, in the absence of induction of the enzyme that produces the early isoflavonoid pathway substrate, the HPLC profiles of IOMT overexpressing leaves and control leaves were identical (FIGS. 4A and 4B). Isoformononetin was not detected. A small number of compounds that move very closely to the retention time of isoformononetin in extracts from control and IOMT-overexpressing plants treated with Pi buffer and control plants with daidzein in their leaves are flavonoids It was shown to be 2 ′, 4,4′-trihydroxychalcone, an intermediate in biosynthesis (FIGS. 4A-4C). However, when unlabeled daidzein was given to leaves of transgenic alfalfa overexpressing IOMT, isoformonenetin was produced (FIG. 4D), whereas daidzein was not converted when given to leaves of control plants. (FIG. 4C). Thus, the regiospecificity of IOMT in plants is identical to that shown in vitro when exogenously substrate is given to unstressed tissue, and again this is called isoflavone 7-O-methyltransferase. It matched the named enzyme.
[0036]
Sections were taken from sense # 67 and # 69 lines, and from a range of non-transformant lines and control lines with empty vector, and propagated in growth chambers. To induce enzymes of the isoflavonoid pathway, trilobal leaves from cut petioles were treated with 3 mM CuCl for 8 hours at room temperature.₂Induced by exposure to The method is a reliable method for the induction of isoflavonoid accumulation in alfalfa (Dewick, PM and Martin, M. 1979. "Production of pterocarpan and isoflavanphytoalexins in alfalfa (Medicago sativa). synthesis: Puterokarupan and 2'-hydroxy-biochemical interconversion of iso flavans (Biosynthesis of pterocarpan and isoflavan phytoalexins in Medicago sativa: the biochemical interconversion of pterocarpans and 2'-hydroxyisoflavans), Phytochemistry 18:. 591-596) three Sex leaves were placed in a Petri dish over two layers of wet filters and incubated for an additional 24 hours, and the levels of induced isoflavonoids were measured by HPLC as described above. No detectable formonenetin or medicarpine as shown in Figures 5C and 5D.Copper treatment resulted in modest induction of formonenetin and medicarpine in various control lines, but very strong induction in IOMT overexpressing lines. (FIGS. 5A and 5B). When the isoflavonoid pathway is first induced by induction, overexpression of IOMT in induced alfalfa leaves leads to a significant increase in formononetin and medicalpine levels, respectively. By repeated analysis of sections from the lineage (Figures 5C and 5H) Importantly, control or CuCl₂The product was always isoformonenetin when IOMT activity was measured in extracts from leaves of the various treated lines. This is CuCl₂It shows that it does not itself affect the regiospecificity of the enzyme. No isoformonenetin was observed in any of the induced leaf samples.
[0037]
The above experiment was repeated using the infection by spores of alfalfa stem canker (Pharma medicaginis). This treatment induces enzymes of the isoflavonoid pathway in alfalfa leaves, resulting in the accumulation of medicarpine (Paiva et al., 1994. Plant Cell, Tissue and Organic Cult 38: 213-220). 6A and 6B show metabolite profiles for leaves from control empty vector plants and IOMT overexpressing plants (strain # 67) after exposure to alfalfa shoot blight (P. medicaginis), respectively. Shown in Bacterial infection resulted in the appearance of formononetin glucoside and medicarpine in control lines (FIG. 6A), but very strong induction in lines overexpressing IOMT (FIG. 6B). Also, isoformononetin was not observed in any of the infected leaf samples (FIG. 6B). No formonenetin glucoside or medicarpine was observed in uninfected control plants (FIGS. 6C and 6D). Repeated analysis on sections from each of the lines collected at various times after bacterial infection showed that overexpression of IOMT in infected alfalfa leaves showed earlier onomonetin glucoside and medicarpine compared to control lines. It was clearly shown to induce and increase levels (FIGS. 6E and 6F).
[0038]
Sense transformant # 78 had a high transgene copy number, but did not express the IOMT protein in the leaves (FIG. 3B). Epigenetic appeared to show gene silencing (Matzke, MA and AJM Matzke. 1995. "How and why plants inactivate homologous genes (transgenes). (How and why do plants inactive homologous (trans) genes?) ", Plant Physiol 107: 679-685). Induction of formonenetin glucoside and medicarpine in strain # 78 after infection with alfalfa stem rot (P. medicaginis) by repeat analysis on sections of strain # 78 and control strain # 56C with empty vector Was shown to be significantly less than in control plants (FIGS. 7A and 7B). Overall, the reduction was 65% for the formonenetin conjugate and 58% for medicarpine, reflecting the relative IOMT activity in the two lines of plants. Thus, data on the up-regulation and down-regulation of IOMT in induced or infected alfalfa leaves indicate that when the rest of the isoflavonoid pathway is induced, IOMT produces isoformononetin when 7-O -It acts more functionally in the formation of 4'-O-methylated isoflavonoids (formononetin and medicarpine in alfalfa) than as methyltransferase.
[0039]
Alfalfa Bacterial Blight (Pharma medicaginis) is a successful alfalfa pathogen that causes disease to the cultivar (Regen SY) used for genetic transformation. To determine if the faster accumulation of the phytoalexin medicarpine would result in resistance to Phoma in plants overexpressing IOMT, infection was carried out against susceptible alfalfa cultivars with fungal spores. To start, the plants overexpressing IOMT and control plants were inoculated using a pinwheel to produce small scratch lines on the leaves. The size of the brown Photoshop wound was then measured 5 days after infection. The results showed that the size of the wound was greatly reduced in the # 67 and # 69 lines overexpressing IOMT compared to the control. As shown in FIGS. 8A and 8B, measurement of multiple wounds on day 5 post-infection showed that the control plants were 1.17 mm (n = 100) for the corresponding control lines grown and infected in parallel. The average wound size was 0.96 mm (n = 100) for S.A., and 0.41 mm (n = 100) for the # 69 line, and 0.46 mm (n = 100) for the IOMT overexpressing # 67 line. Obtained. Thus, transgenic overexpression of IOMT effectively functions to engineer disease resistance in alfalfa and in other plants whose similarity causes 4'-O-methylated isoflavonoids to act as phytoalexins. Strategy.
[0040]
Taken together, the results of the enzymatic assay, feeding, induction and infection studies using transgenic alfalfa show that 7 of daidzein was generated such that isoformononetin was generated from exogenously supplied daidzein both in vitro and in plants. When the IOMT is methylated at the position, but daidzein is supplied through the endogenous isoflavonoid pathway in plants, it is shown to be involved in the 4'-specific methylation to form formonenetin. This unusually different IOMT regiospecificity has now been found in vivo compared to in vitro by performing reverse genetic experiments to modify the expression of the enzyme in transgenic plants that naturally contain the enzyme. Was.
[0041]
Up-regulation and down-regulation of IOMT expression in transgenic alfalfa had a quantitatively corresponding effect on the levels of 4'-O-methylated isoflavonoids, indicating that IOMT was able to synthesize these compounds in alfalfa. Act as a rate-limiting enzyme for In contrast, it has been previously reported that the major rate-limiting step in isoflavonoid biosynthesis is the entry point into the isoflavonoid branching pathway catalyzed by the isoflavone synthase cytochrome P450 (Steele et al., 1999. Soybean). Molecular characterization of the enzyme that catalyzes the aryl transfer reaction of isoflavonoid biosynthesis in M.P. "Main enzymes for isoflavone biosynthesis in legumes Identification and expression of isoflavone synthase is (Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes), Nature Biotechnology 18: 208-212).
[0042]
The above data suggest that increased production of 4'-O-methylated isoflavonoids and the resulting resistance to disease in IOMT overexpressing plants may be a direct consequence of elevated IOMT levels. Indicate, therefore, the direct involvement of IOMT in the synthesis of these compounds as the rate-limiting step. However, since the 4'-O-methylated compound is a stress-induced phytoalexin in alfalfa, strains with elevated IOMT activity increase phytoalexin production independently of IOMT flux. May have some sort of metabolic stress. Uninduced or uninfected IOMT overexpressing plants do not appear to have metabolic stress in view of the lack of detectable phytoalexin (FIGS. 5C and 5D, and FIGS. 6C and 6D). ). To further rule out this possibility, and to determine whether other enzymes in the isoflavonoid pathway are modulated after expression of IOMT, we have studied P. medicaginis. The levels of transcripts encoding the eight enzymes involved in the conversion of phenylalanine to medicarpine in control and IOMT overexpressing lines as a function of time after infection with E. coli were investigated. The results in Table 1 confirm first of all that the IOMT transcript is constitutively high in the # 69 line without the Phoma infection, consistent with the transgene being under the control of the 35S promoter. In uninfected leaves that ectopically express IOMT, transcript levels of other enzymes in the phenylpropanoid / isoflavonoid pathway were not significantly increased over control levels. Thus, overexpression of IOMT does not, by itself, induce the isoflavonoid pathway as a stress response, which is consistent with the metabolic profile data in FIGS.
[0043]
Using labeled cDNAs for various enzymes of the isoflavonoid pathway, control with empty vector (strain # 64C) and IOMT overexpression (strain # 69) of isoflavonoid pathway transcripts in leaves infected with the alfalfa, Phoma. The RNA gel blot analysis is shown in Table 1. Total RNA was isolated from leaves at 6, 24, and 48 hours after P. medicaginis infection (lane P) or water treatment (lane W), and alfalfa PAL, alfalfa C4H, alfalfa acetyl CoA Probes were probed with labeled cDNA probes for carboxylase, alfalfa CHI, Medicago truncatula IFS, alfalfa IOMT, Medicago truncatula I2'OH and alfalfa IFR. The blot was removed and reprobed with a ribosomal RNA probe to determine loading and transcription efficiency. Subsequent to infection with Pharma, there was a weak, relatively slow induction of phytoalexin pathway enzyme transcripts in control alfalfa leaves with empty vector. This response is typical of that found in compatible interactions (Lamb et al., 1992. "Emerging strategies for enhancing crop resistance to microbiological patogens"). Bio / technology 10: 1436-1445). However, the transcript levels encoding phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4H), and isoflavone reductase (IFR) were lower in IOMT overexpressing # 69 lines than in control lines up to 12 hours post infection. More in Also, these transcripts were significantly induced in line # 69 by 6 hours post infection, while IFS and IFR transcripts remained uninduced in controls by 6 hours post infection. Transcript levels of chalcone isomerase (CHI) and isoflavone 2'-hydroxylase (I2'OH) were slightly elevated in strain # 69 after infection compared to controls. In contrast, an enzyme that provides malonyl-CoA for the chalcone synthase reaction and is co-induced as part of the phytoalexin response in induced alfalfa cells (Shorrosch et al., 1994. "Acetyl in alfalfa" Molecular cloning, characterization and elicitation of CoA carboxylase in CoA carboxylase-CoA carboxylase in alfalfa ", Proc Natl Acad Sci USA, Proc Natl Acad Sci USA, Proc Natl Acad Sci USA Code 91: 433-43 , More than in the control line with empty vector Significantly it was not high in # 69 strains.
[0044]
[Table 1]

[0045]
In various embodiments, the IOMT gene includes, but is not limited to, Agrobacterium-mediated transformation (Horsh, B. et al., 1985. “Simple and general method for transforming genes into plants. Method (A simple and general method for transferring genes into plants), Science 227: 1229-1231) or particle bombardment (Klein et al., 1988.) Transformation (Stable Genetic Transformation of Intact Nicotiana cells by the Particle Bombardment Process) s) ", Proc Natl Acad Sci USA 85: 8502-8505) can be introduced into a plant by standard plant transformation techniques, including.
[0046]
In the present invention, any polynucleotide encoding IOMT having the property of inducing the production of 4-O-methylated phytoalexins, nutraceuticals, conjugates thereof, or mixtures thereof may be used. Good. Polynucleotides encoding IOMT useful in the present invention include polynucleotides encoding the dominant negative forms of IOMT, the sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2, and nucleic acid sequences complementary to the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2. Is mentioned. The complementary sequence may include antisense nucleotides. When the sequence is RNA, deoxynucleotides A, G, C, and T in SEQ ID NO: 1 and the sequence of FIG. 2 are replaced with ribonucleotides A, G, C, and U, respectively. The present invention also includes fragments of the above nucleic acid sequences which selectively hybridize under physiological conditions or in members of a closely related family of IOMTs to DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 1 and the sequence of FIG. Nucleotides of sufficient length as possible. Also included are denatured variants of the sequences of SEQ ID NO: 1 and FIG. 2, the sequences of SEQ ID NO: 1 and FIG. 2 wherein T may be U, and fragments of these sequences capable of hybridizing to DNA or RNA encoding IOMT. It is. The term "selectively hybridize" means hybridization under moderate or highly stringent conditions that eliminates unrelated nucleotides.
[0047]
IOMT that promotes increased accumulation of antimicrobial phytoalexins as a mechanism for improving plant disease resistance, or that increases or reduces isoflavone levels and / or methylation status, by IOMT rate control Manipulation of expression becomes possible. Isoflavones are beneficial as nutritional supplements (Adlercreutz, H. and W. Mazur. 1997. "Phytoestrogenic compounds and western diseases (Phyto-estrogens and western diseases), M. Ann. 95). -120), they are naturally restricted to leguminous plants (leguminosac), where the 4'-hydroxyl group is methylated (formononetin and biochanin A) or free (daidzein and genistein). Modification of IOMT expression in vivo can be used to alter the 4'-O-methylation of plant isoflavones 4'-O-isoflavonoid phytos as used herein Lexins include, but are not limited to, medicarpine, macchiain, pisatin, their respective conjugates, or mixtures thereof; 4'-O-isoflavonoid nutraceuticals include, but are not limited to, Examples include, but are not limited to, formonenetin, biochanin A, texasin, afromosine, pseudobaptigenin, conjugates of each of these, or mixtures thereof. By overexpression of the IOMT gene in transgenic plants, and by expression of the IOMT gene in transgenic plants of plants that do not naturally produce the compound, 4'-O-isoflavones The levels of idphytoalexin and 4'-O-isoflavonoid nutritional drugs may be increased, and 4'-O-isoflavonoid nutritional supplements may be non-plant-based (including, but not limited to, transfected bacteria). , Yeast, or insect cells, which have been genetically engineered to contain all of the other enzymes required for isoflavonoid biosynthesis), which are known in the art. By expression of the IOMT gene under the control of an appropriate homeostatic or inducible promoter using well-known methods (Frick, S., Kutchan, TM 1999. "Os common to isoquinoline alkaloids and phenylpropanoid biosynthesis. -Methyltransferase Molecular Cloning and Functional Expression (Molecule r cloning and functional expression of O-methyltransferases common to isoquinoline alkaloid and phenylpropanoid biosynthesis) ", Plant J 17: 329-339; Batard et al., 1998. "Molecular cloning and functioning expression expression in ceremony of CYP76-Bioxen-bio-integration of CYP76B1." -Ethyl from Helianthus tuberosus) ", Plant J 14: 111-120).
[0048]
The present invention also provides a composition comprising at least one 4'-O-methylated isoflavonoid suitable for administration as a food, nutritional supplement, animal feed supplement, functional food or medicament, Sources of 4'-O-methylated isoflavonoids in the composition include those that are transgenic plants that express the isoflavone O-methyltransferase gene of the present invention. A part of a transgenic plant containing a 4'-O-methylated isoflavonoid or a 4'-O-methylated isoflavonoid extracted from a transgenic plant may be used.
[0049]
Transform the IOMT gene sequence in the antisense direction for down-regulation of IOMT in plants that naturally produce 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins and 4'-O-methylated isoflavonoid nutritional drugs (Bourque, JE 1995) "Antisense strategies for genetic manipulations in plants", Plant Sci 105: 125-149, or activate gene silencing. (Angell, SM and DC Baulocombe. 1997. "Replicating potato virus XR"). Consistent gene silencing in transgenic plants expressing A (Consistent gene silencing in transgenic plants expressing a replicating potato virus X RNA) ", EMBO J 16: 3675-3684). The IOMT sequence used may be alfalfa IOMT8 as shown in SEQ ID NO: 1 and FIG. 2 or any other having in vivo 4′-O-methylation properties that can be isolated by hybridization techniques using IOMT8 as a probe. IOMT gene.
[0050]
Isoflavonoid compounds methylated at position 7 (eg, isoformononetin and prunetin) may also have nutritional supplement activity. Alfalfa IOMT can also be used to convert unmethylated isoflavone precursors into whole plants, plant cell suspension cultures, or non-plant systems (including, but not limited to, transfected bacteria, yeast, or insect cells). And those that have been genetically transformed to contain all of the other enzymes necessary for isoflavonoid biosynthesis), which are transfected with the IOMT gene in the presence of a suitable homeostatic or inducible promoter. These compounds can be produced by feeding into what has been formed. Alternatively, a 7-O-methylated isoflavonoid compound is produced using an in vitro process by contacting an isolated or immobilized isoflavone-O-transferase enzyme with an unmethylated isoflavone precursor. can do. The isoflavone-O-transferase enzyme can be a transgenic plant, a plant cell suspension culture, or a non-plant system (including, but not limited to, transfected bacteria, yeast, or insect cells, and Including those that have been genetically transformed to contain all of the other enzymes required for synthesis). As used herein, 7-O-methylated isoflavonoid compounds include, but are not limited to, isoformonenetin, prunetin, conjugates of each of these, or mixtures thereof.
[Brief description of the drawings]
FIG.
1 shows isoflavone production and O-methylation pathways in plants. Flavanone naringenin and liquiritigenin are produced by the action of chalcone synthase and chalcone isomerase, and are produced by the action of chalcone reductase and chalcone synthase due to the lack of 5-hydroxyl in liquiritigenin. Ring B aryl transfer is catalyzed by 2-hydroxyisoflavanone synthase, leading to daidzein or genistein after dehydration. The conversion of formononetin to medicarpine proceeds via 2'-hydroxylation, reduction and ring closure steps (Dixon, RA 1999. U. Sankawa, eds. Comprehensive Natural Products Chemistry). , Elsevier, pp 773-823).
FIG. 2
1 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of alfalfisoflavone 4'-O-methyltransferase (IOMT) 8 cDNA.
FIG. 3
3A-3B show the generation and molecular analysis of transgenic alfalfa with altered IOMT expression. FIG. 3A shows a binary vector construct containing the IOMT sequence in sense and antisense orientations. FIG. 3B shows the enzymatic activity of IOMT in leaf tissue from untransformed “C” and “V” controls transformed with an empty vector and a series of IOMT8 sense transformants.
FIG. 4
4A-4D show the metabolism of daidzein after immersion in untreated alfalfa leaves. FIGS. 4A and 4B show high performance liquid chromatographs of phenolic compounds from the leaves of control plant line 62C and IOMT sense transgenic line 69, respectively, after 24 hours immersion in Pi buffer. 1 shows a photographic (HPLC) profile. Figures 4C and 4D show the HPLC profiles of leaf extracts from the same vector control and sense transgenic lines, respectively, 24 hours after daidzein feeding by immersing the leaves in Pi buffer. Figures 4E and 4F show the UV spectra of 2 ', 4,4'-trihydroxychalcone and isoformonenetin, respectively.
FIG. 5
5A-5H show abiotic induction of isoflavonoid compounds in control and IOMT overexpressing transgenic alfalfa. FIGS. 5A and 5B show 3 mM CuCl, respectively.₂Of the vector control strain 9C and IOMT overexpression strain 67 at 32 hours after exposure to₂Figure 4 is an HPLC profile of a leaf extract obtained from a treated plant. Labeled peaks 1-4 were identified as apigenin conjugate, 7,4'-dihydroxyflavone, 7,4'-dihydroxyflavanone and apigenin aglycone, respectively. FIGS. 5C and 5D are HPLC profiles of leaf extracts obtained from line 9C and IOMT overexpressing line 67 plants, which are vector controls, 32 hours after transfer of the young plants into water, respectively. 5E and 5G show H₂O or 3 mM CuCl₂Figure 8 shows formononetin levels in vegetatively propagated vector control lines 9C and 62C (control line) and leaves of

IOMT overexpressing lines

67 and 69 at 32 hours after exposure to E. coli. 5F and 5H indicate medical pin levels.
FIG. 6
6A-6F show the accumulation of isoflavonoid compounds in response to bacterial infection in control and IOMT overexpressing transgenic alfalfa. FIGS. 6A and 6B show extracts from extracts of control lines 64C and 67 with IOMT overexpression, respectively, with an empty vector at 12 hours post-Phoma medicaginis infection. It is an HPLC profile. 6C and 6D are HPLC profiles of extracts from uninoculated leaves of lines 64C and 67, respectively. FIGS. 6E and 6F show P.A. Figure 9 shows formononetin glucoside or medicarpine levels in leaves of vegetatively grown vector control (line 64C) and IOMT overexpressing (line 67 and line 69) plants at various times after inoculation with Medicaginis. .
FIG. 7
7A-7B show the accumulation of isoflavonoid compounds in control and putative IOMT gene silenced transgenic alfalfa. Formononetin glucoside levels (FIG. 7A) and medicarpine levels (FIG. 7B) were determined 20 hours after inoculation with the spores of Foma medicaginis, cuttings of the vector control line 56C and the IOMT sense transformant line 78. Was measured in leaves obtained from
FIG. 8
8A-8B show disease resistance of transgenic alfalfa with altered isoflavone O-methyltransferase expression. FIG. 8A shows the size of 100 wounds in the leaves of control line 64C and IOMT overexpressing line 69 using the empty vector, measured 5 days after inoculation. The average size of the wounds caused by the parallel line of trace wheels alone with 100 injury sites was reduced. The solid line indicates the average value of the control line, and the dashed line indicates the average value of the IOMT overexpressing line. Bars indicate standard deviation. FIG. 8B shows the size of 100 wounds of the leaves measured at day 5 after inoculation as described above, but with the concurrently infected IOMT overexpressing line 67 and the control with the empty vector. The 64C strain is shown.

Claims

A method for increasing the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant, the method comprising transforming the target plant with a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene. The above method comprising producing a transgenic plant and overexpressing the gene in the transgenic plant under the control of an appropriate construct or inducible promoter.

The method of claim 1, wherein the compound is a 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexin.

The method of claim 1, wherein the compound is a 4'-O-methylated isoflavonoid nutritional supplement.

The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the fragment comprises a sequence showing at least moderate hybridization with SEQ ID NO: 1.

A method for producing at least one kind of 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant that does not produce 4'-O-methylated isoflavonoid compound, comprising using a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene Producing a transgenic plant by transforming the target plant, and expressing the isoflavone O-methyltransferase gene in the transgenic plant under the control of an appropriate construct or inducible promoter. The above method, wherein the genic plant contains all of the other isoflavonoid biosynthetic enzymes necessary to produce the 4'-O-methylated isoflavonoid compound.

7. The method according to claim 6, wherein the compound is a 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexin.

7. The method of claim 6, wherein the compound is a 4'-O-methylated isoflavonoid nutritional supplement.

The method according to claim 6, 7 or 8, wherein the natural DNA of the target plant encodes the enzyme.

9. The method of claim 6, 7 or 8, wherein the target plant has been genetically transformed to encode at least one of the above enzymes.

The method according to claim 9, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

10. The method of claim 9, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

The method according to claim 10, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

The method of claim 10, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

A method of producing at least one 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceutical in a non-plant cell line, the method comprising the additional step of producing a 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceutical. In a cell that has been genetically transformed to contain all isoflavonoid biosynthetic enzymes, a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene is expressed under an appropriate configuration or under the control of an inducible promoter, Method.

The method of claim 15, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

16. The method of claim 15, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

A method for reducing the level of formonenetin, at least one conjugate thereof, or a mixture thereof in a transgenic forage legume, comprising the steps of: providing the isoflavone O-methyltransferase gene under appropriate control or control of an inducible promoter; The above method comprising performing antisense expression, sense gene-mediated silencing, or nucleic acid-mediated insertion inactivation of the DNA fragment containing the fragment.

19. The method according to claim 18, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

19. The method of claim 18, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

21. The method according to claim 18, 19 or 20, wherein the legume is alfalfa.

A method for reducing the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid compound in a target plant containing all of the enzymes necessary for the synthesis of a 4'-O-methylated isoflavonoid compound, comprising the steps of: A transgenic plant is produced by transforming the target plant with a DNA fragment containing a methyltransferase gene, and under the control of an appropriate configuration or an inducible promoter, antisense expression and sense expression of the isoflavone O-methyltransferase gene. Such a method, comprising inducing gene-mediated silencing or nucleic acid-mediated insertion inactivation.

23. The method of claim 22, wherein the compound is selected from the group consisting of 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins, 4'-O-methylated isoflavonoid phytoalexins conjugates, and mixtures thereof. .

The method according to claim 22 or 23, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

24. The method of claim 22 or 23, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

In a target plant containing all of the enzymes necessary for the synthesis of a 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceutical or a conjugate thereof, at least one 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceutical, at least one A method for reducing the level of a 4'-O-methylated isoflavonoid nutraceutical or a mixture thereof, comprising transforming the target plant with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene. Creating a transgenic plant to induce antisense expression or sense gene-mediated silencing of the isoflavone O-methyltransferase gene under the control of the appropriate construct or inducible promoter, thereby producing the corresponding unmethylated precursor, Conjugate or Comprising increasing levels of a mixture of al, the methods described above.

27. The method of claim 26, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

27. The method of claim 26, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

A method for producing a 7-O-methylated isoflavonoid compound, comprising contacting a whole plant or cell suspension culture with a non-methylated isoflavone precursor of a 7-O-methylated isoflavonoid compound. The above method, wherein the whole plant or the cell suspension culture has been transformed with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene under the control of an appropriate configuration or an inducible promoter.

30. The method of claim 29, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

30. The method of claim 29, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

A method for producing a 7-O-methylated isoflavonoid compound, comprising contacting a soluble or immobilized isoflavone O-methyltransferase enzyme with an unmethylated isoflavone precursor to form a 7-O-methylated isoflavonoid compound. Wherein the enzyme has been produced by expression of a DNA fragment containing the corresponding isoflavone O-methyltransferase gene in a transgenic plant or heterologous system.

33. The method of claim 32, wherein said heterologous system is selected from the group consisting of transfected bacteria, yeast and insect cells.

34. The method according to claim 32 or 33, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

34. The method of claim 32 or 33, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

An antiserum against 4'-O-methyltransferase, which is used as a reagent for determining the transgene expression of 4'-O-methyltransferase in plants.

A method for increasing disease resistance of a target plant, which is carried out by transforming the target plant with a DNA fragment containing an isoflavone O-methyltransferase gene, wherein the transformed plant comprises the DNA fragment A method according to any of the preceding claims, wherein said method exhibits increased levels of said 4'-O-methylated isoflavonoids as compared to the level of at least one 4'-O-methylated isoflavonoid in a homologous plant that does not contain.

38. The method of claim 37, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

38. The method of claim 37, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

A composition comprising at least one 4'-O-methylated isoflavonoid suitable for administration as a food, nutritional supplement, animal feed supplement, functional food or medicament, wherein the 4'-O- The methylated isoflavonoid is isolated from at least a part of a transgenic plant transformed with a DNA fragment containing the isoflavone O-methyltransferase gene, and the transgenic plant does not contain the DNA fragment. Such a composition, wherein the composition exhibits increased levels of the 4'-O-methylated isoflavonoid relative to the level of the 4'-O-methylated isoflavonoid in a plant of the same species.

41. The composition of claim 40, wherein the fragment comprises SEQ ID NO: 1.

41. The composition of claim 40, wherein the fragment comprises a sequence that exhibits at least moderate hybridization to SEQ ID NO: 1.

43. The composition according to claim 40, 41 or 42, wherein the transgenic plant is a legume.

A transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of the isoflavone O-methyltransferase gene, wherein the expression of said gene results in a 4'- Such a transgenic plant, which exhibits increased 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to O-methylated isoflavonoid compound levels.

A seed obtained from a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of an isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising said recombinant DNA sequence upon expression of said gene. Such a seed, wherein the seed exhibits increased 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in the same plant.

A progeny obtained from a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of an isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising said recombinant DNA sequence upon expression of said gene. The above progeny, which exhibit increased 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in the same plant.

Progeny obtained from the seed of a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of the isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising, upon expression of said gene, said recombinant DNA sequence The progeny of the above, which exhibit increased 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in similar plants that do not contain the same.

A transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of the isoflavone O-methyltransferase gene, wherein the expression of said gene results in a 4'- Such a transgenic plant, wherein the transgenic plant exhibits reduced 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to O-methylated isoflavonoid compound levels.

A seed obtained from a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of an isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising said recombinant DNA sequence upon expression of said gene. The above seed, wherein the seed exhibits reduced 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in the same plant.

A progeny obtained from a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of an isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising said recombinant DNA sequence upon expression of said gene. The above progeny, which exhibit reduced 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in the same plant.

Progeny obtained from the seed of a transgenic plant comprising at least one recombinant DNA sequence encoding a part of the isoflavone O-methyltransferase gene, said plant comprising, upon expression of said gene, said recombinant DNA sequence The progeny of the above, which exhibit reduced levels of 4'-O-methylated isoflavonoid compounds as compared to 4'-O-methylated isoflavonoid compound levels in the same species of plants that do not contain the same.