JP2004500102A - 標的遺伝子破壊を含むトランスジェニックマウス - Google Patents
標的遺伝子破壊を含むトランスジェニックマウス Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、トランスジェニックマウス、ならびに遺伝子機能の特徴付けに関連する組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを提供し、これは、疾患のモデルならびに遺伝子の発現および遺伝子の機能を調節する因子を同定するためのモデルとして、ならびに種々の疾患状態および疾患条件の潜在的な処置として有用である。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞からなる。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹(ES)細胞、そして最も好ましくは、マウスES細胞である。
Description
【0001】
(関連出願)
本願は、米国出願番号第60/190,348号(2000年3月16日提出)、米国出願番号第60/191,128号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,236号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,235号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,129号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,142号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,240号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/204,227号(2000年5月15日提出)、米国出願番号第60/204,230号(2000年5月15日提出)、米国出願番号第60/215,214号(2000年6月29日提出)、米国出願番号第60/216,249号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/216,264号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/216,765号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/218,075号(2000年7月12日提出)、米国出願番号第60/219,167号(2000年7月19日提出)、米国出願番号第60/219,182号(2000年7月19日提出)、米国出願番号第60/221,485号(2000年7月27日提出)および米国出願番号第60/223,173号(2000年8月7日提出)の優先権を主張する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、遺伝子機能の特性化に関するトランスジェニック動物、組成物および方法に関する。
【0003】
(発明の背景)
実験動物モデルは、遺伝子の役割を理解するための重要な手段である。より詳細には、変更または不活性化された特定遺伝子を有する動物を開発する能力は、遺伝子機能の研究にとって計り知れないほど貴重であり、そしてヒトにおける同様な発現を有する疾患の原因となる遺伝子および/または機構の予期せぬ発見につながっている。これらの遺伝的に操作された動物はまた、種々の疾患および障害のための治療的処置を同定および試験するためにも有用である。
【0004】
多くの遺伝子の機能を同定することは、疾患におけるその役割を確認することおいて有用である。ヒトとマウスとの間の高レベルな相同性のため、マウスの選択された遺伝子の標的生殖系列変異を行うことによって、個々のヒト遺伝子の機能を明確にすることが可能である。結果として得られる変異マウスの表現型は、ヒトにおける表現型を定義するのに役立てるために用いられ得る。
【0005】
数種の興味ある遺伝子が最近、発見されている。これらの遺伝子およびその発現産物の役割を確認することは、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上で有用な標的の同定を可能とし得る。
【0006】
多くの医療上、有意義な生物学的プロセスは、G−タンパク質および/またはcAMPなどの第2メッセンジャーを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質によって仲介される。G−タンパク質結合レセプター(GPCR)の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、ホルモン、ウイルス性、成長因子および神経レセプターなどの広範囲の生物学的活性レセプターを含む。GPCRは、7種の推定膜貫通ドメイン(TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と称する)を有するとして特性化されている。これらは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通α−へリックスを表すと考えられている。ほとんどのG−タンパク質結合レセプターは、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の2つの細胞外ループのそれぞれに1つの保存システイン残基を有する。G−タンパク質結合レセプターは、ヘテロ三量体G−タンパク質によって細胞内で種々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合され得る。異なったG−タンパク質α−サブユニットは、優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能を調節する。
【0007】
網膜疾患において潜在的に重要であり得る核レセプター遺伝子、特に網膜特異的核レセプター遺伝子が同定されている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15149)。網膜特異的核レセプターは、網膜色素上皮およびグリア細胞内で発現された細胞性レチンアルデヒド(retinaldehyde)結合タンパク質の潜在的調節因子であり得る。このような遺伝子は、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質との相互作用により視覚サイクルを調節するとみなされている。
【0008】
GPCRファミリーのリンパ系特異的メンバーは、縮重オリゴヌクレオチドを使用するPCRによって同定されている(Genomics 23(3), 643−50 (1994))。エプスタイン−バー−誘導cDNA EBI1として報告されるこのレセプターは、正常なリンパ系組織中、および数種のB−およびT−リンパ球細胞系列中で発現される。この遺伝子は、ヒト染色体17q12−q21.2にコードされる。他のG−タンパク質結合レセプターのいずれもこの領域にマップされていないが、C−Cケモカインファミリーは、17q11−q21にマップされている。マウスEBI1cDNAも単離されていて、そしてヒト相同体に86%の同一性を有するタンパク質をコードする。マウスEBI1はC−Cケモカイン7型レセプター(CCR−7、C−C CKR−7またはCC−CKR−7と様々に呼ばれる)である。その遺伝子構造は、公知であり得るが、その機能およびリガンドEBI1は、未知である。
【0009】
メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)は、色素沈着機能を調節する。このペプチドもまた、脳、下垂体および免疫系を含む他の領域において種々の生物学的活性を有する。マウスメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター(MSH−R)mRNAは、クローン化され(1260bp)、そしてカンナビノイドレセプターを含み得るグアニンヌクレオチド−結合タンパク質に結合されたレセプターのサブファミリーを定義することが見出されている(Science 257(5074), 1248−1251 (1992))。
【0010】
ホスファターゼは、低分子阻害および薬理学的介入に対して特殊かつ誘引性の標的を表す。タンパク質リン酸化/脱リン酸化サイクルは、成長および分化、細胞間接触、細胞周期ならびに腫瘍形成を含む細胞活性を制御する真核生物細胞によって使用される主要な調節機構の1つである。典型的な哺乳動物細胞の10%より多い活性タンパク質は、リン酸化されていると推定される。タンパク質リン酸化/脱リン酸化中、リン酸基は、タンパク質キナーゼによってアデノシン三リン酸(ATP)分子からタンパク質へ移動され、そしてタンパク質ホスファターゼによってタンパク質から除去される。
【0011】
ヒト新形成のほとんど全ての形態は、細胞周期制御を変更するので、細胞周期制御でのホスファターゼの役割は、これらの分子を薬学的介入の誘引性な標的にする。異常な細胞活性を妨害するホスファターゼインヒビターの能力は、実証されている。例えば、天然に存在するセリン/スレオニンホスファターゼインヒビター、オカダ酸は、骨髄性白血病細胞(J.Cell.Physiol.150,484(1992))、およびラット肝実質細胞、ラット下垂体腺腫細胞、ヒト乳癌細胞およびヒト神経芽腫細胞(Exp.Cell Res.195,237(1991))中でアポトーシスを誘導することが示されている。
【0012】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼは、cAMP−活性化タンパク質キナーゼ活性、Ca2+−依存性シグナル伝達、tRNAスプライシング、および熱ショック反応に関連するシグナル伝達を調節することを含む広い種類の機能に関与するようである。最近、PP2C、αアイソフォーム(すなわちPP2C−α)をコードする完全なcDNA配列は、マウス脳からクローン化されたと報告された。PP2C−α(GIまたはNID番号:532678;受託番号:D28117)は、計算された分子量42,432Daを有する382個のアミノ酸のタンパク質をコードする1387bpの配列である(Gene 145(2),311−312(1994))。
【0013】
別の重要なGPCRサブファミリーは、走化性サイトカインとして公知であるケモカインレセプターファミリーである。ケモカイン作用の機構は、標的細胞上の7種の膜貫通スパニングGPCRへの初期特異的結合を含む。炎症性反応におけるケモカインの中心的役割は、多くの研究で立証されている。皮下注射によるαケモカイン、例えばIL−8の局所投与は、好中球浸潤により支配される急性炎症性反応となる。最近、ラットCXCケモカインレセプター1(CXCR1)遺伝子のクローニングが報告されている(J. Biol. Chem. 271(51), 32770−6 (1996))。このCXCR1遺伝子(GIまたはNID番号:1589930;受託番号:U71089)は、ヒトインターロイキン−8(IL−8)AおよびBレセプターサブタイプと約70〜85%同一であるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン−8(IL−8)レセプターと相同であり、マウスCXCR1遺伝子とも相同である。
【0014】
ホスホジエステラーゼ(PDE)は、ホスホジエステル結合の分解の原因である1群の酵素である。特に環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CN−PDE)は、プリン環状ヌクレオチド基質に対する特異性を示し、そして環状アデノシン一リン酸(cAMP)および環状グアノシン一リン酸(cGMP)を加水分解する(Pharmac. Ther. 51, 13−33 (1991))。CN−PDEは、cAMPおよびcGMPの定常レベルを調節し、そして環状ヌクレオチドシグナルの振幅および持続時間の両方を調節する。次に、cAMPおよびcGMPは、シグナル伝達、すなわち細胞が細胞外シグナル(ホルモン、薬物、神経伝達物質、成長および分化因子、ならびに他の薬剤)に反応することによる一般的なプロセスにおいて重要な「第2メッセンジャー」分子である。シグナル伝達は、細胞増殖、分化および遺伝子転写を含む全ての型の細胞機能を調節する。少なくとも8種の異なっているが相同であるCN−PDEの遺伝子サブファミリーは、哺乳動物組織に存在することが目下、公知である。
【0015】
PDEの6型サブファミリー(PDE6)のメンバーは、網膜光伝達に関係している(J. Biol. Chem. 266, 10711−14 (1991))。光伝達では、光レセプター細胞に衝突する光は、PDE6によるcGMPの加水分解となる生化学的事象のカスケードを活性化することによって神経シグナルを誘発する。PDE6は、触媒的アルファおよびベータ(αおよびβ)サブユニット、および2つの抑制ガンマ(γ)サブユニットから構成される四量体タンパク質である。酵素複合体からの抑制ガンマサブユニットの解離は、トランスデューシンと呼ばれる膜関連タンパク質によって誘導され、そして酵素を活性化する。PDE6欠損は、網膜変性を特徴とする遺伝性網膜変性疾患に関与している。ホスホジエステラーゼ、特に網膜機能に関与するPDE(例えば、PDE6)の重要性を考えると、機能不全または疾患、および網膜変性(RD)および特に網膜色素変性(RP)などの特に視覚関連機能不全および疾患を阻止、改善または矯正する役割を果たし得るホスホジエステラーゼの同定および特性化が明らかに必要である。
【0016】
多くの薬物、生体異物、神経伝達物質およびホルモンの物質代謝は、硫酸(SO4)基の酵素的付加に関与する工程を含む。硫酸基の付加は、一般に硫酸結合体化、または単に硫酸化と呼ばれる。硫酸結合体化の原因となる酵素は、スルホトランスフェラーゼ(すなわちST)として公知であり、これは、当該酵素がスルホトランスフェラーゼ反応において1つの生物学的分子(硫酸ドナー)から別の生物学的分子(硫酸アクセプター)へ硫酸基を転移させることにより作用するためである。
【0017】
ヒト肝臓中のサイトゾルのスルホトランスフェラーゼ酵素は、硫酸化がほとんどの化合物の水溶解性を増加し、したがってその腎排泄を増加するので、集中的に研究に供されている。硫酸化はまた、通常、生物学的活性の減少となる。しかしながら、いくつかの場合では、硫酸結合体化は、降圧薬ミノキシジルなどの薬物を活性化するために必要とされ(Biochem.Pharmacol.,31,2949−2954(1982))、そしてまた、ヒドロキシルアリールアミンなどの前発癌物質の生物学的活性化において役割を果たし得る(Science,215,403(1982);Chem.Biol.Interact.109,221−35(1998))。
【0018】
現在まで、硫酸物質代謝の分野での遺伝的操作の努力から、数種のスルホトランスフェラーゼ酵素:ヒト肝臓DHEA ST(Mol.Pharmacol.41,865−872(1992))、TS PST(Mol.Pharmacol.43,70−77(1993))、TL PST(Biochem.Biophys.Res.Commun.198,1119−1127(1994))および非ヒト哺乳動物種の数種の組織から単離された1群のエストロゲンスルホトランスフェラーゼ(Aust.J.Biol.Sci.41,507−516(1988);Mol.Endocrinol.6,589−597(1992))に対するcDNAのクローニングおよび発現を生じている。
【0019】
また、マウス肝臓フェノール/アリール形態のスルホトランスフェラーゼ(mSTp1)のcDNA配列(1269bp)が決定されている(Biochim.Biophys.Acta 1171(3),315−8(1993))。クローン化されたcDNAは、34.7kDである298個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド65で始まる897個のヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)を含むと報告された。mSTp1遺伝子は、GIまたはNID番号201069および受託番号L02331を有する。ヒトSTp1遺伝子は、広く特性化されている(Pharmacogenetics 6,473−487(1996);Biochem.Biophys.Res.Commun.228,134−140(1996))。STp1遺伝子はまた、SULT1A1遺伝子とも呼ばれている。
【0020】
実験動物モデルは、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を理解する重要な手段を提供する。このような役割の理解は、疾患経路の決定、診断上および治療上、有用な標的の同定、および潜在的治療処置の試験および研究を可能とし得る。
【0021】
(発明の要旨)
本発明は、一般的にトランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特性化に関する組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、種々の遺伝子およびそのインビボでの特性化および機能に関する。
【0022】
本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞からなる。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹(ES)細胞、そして最も好ましくは、マウスES細胞である。1つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。他の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。
【0023】
本発明はまた、標的化構築物、および幹細胞中に導入される場合、相同組換え体を産生する標的化構築物を産生する方法を提供する。1つの実施形態では、本発明の標的化構築物は、標的遺伝子に相同である第1および第2のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、構築物中で2つの異なった相同ポリヌクレオチド配列間に位置することが好ましい選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列も含む。標的化構築物は、相同組換えを強化し得る他の調節因子も含み得る。
【0024】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック動物、および標的遺伝子に破壊を含むこのような非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子中の変異に対してヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。1つの局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子の機能を欠損している。別の局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子に変異を有することに関連した表現型を含む。
【0025】
本発明はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法も提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物へ投与され、そして推定薬剤に対するトランスジェニック動物の反応が測定され、そして「正常」または野生型マウスの反応と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール(薬剤投与されない)と比較される。本発明は、このような方法に従って同定された薬剤をさらに提供する。本発明はまた、標的遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療薬剤として有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【0026】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対してある効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有するトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。この方法は、例えば薬剤に対するトランスジェニック動物の反応を測定し、例えば野生型動物あるいはトランスジェニック動物制御とし得るコントロール動物とトランスジェニック動物の反応を比較する工程を包含する。遺伝子の発現または機能に対してある効果を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するために、細胞ベースアッセイで細胞に対してスクリーニングされ得る。
【0027】
本発明はまた、標的遺伝子の核酸配列を含む細胞系列を提供する。このような細胞系列は、細胞系中で機能するプロモーターへの作動可能な連結によって、このような配列を発現することが可能であり得る。好ましくは、標的遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。標的遺伝子を薬剤と接触させる工程および薬剤/標的遺伝子複合体を検出する工程を包含する、標的遺伝子に相互作用する薬剤を同定する方法も提供される。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能なマーカーの発現を測定して検出され得る。
【0028】
本発明はさらに、標的遺伝子における破壊、より詳細には標的遺伝子の発現または機能における破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、必要とする患者へ標的遺伝子の発現または機能をもたらす治療薬剤を投与する工程を包含する、標的遺伝子の発現または機能中の破壊に関連した疾患または状態を処置する工程を包含する。この実施形態に従って、この方法は、治療上、有効な量の天然、合成、半合成、または組換え標的遺伝子、標的遺伝子産物またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成または組換え類似体の投与を含む。
【0029】
本発明はさらに、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連した疾患または状態を処置する方法を提供し、この方法は、変異された標的遺伝子を検出し、かつ遺伝子治療によって置換する工程を包含する。
【0030】
(定義)
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」とは、(a)本明細書に開示されるDNA配列の少なくとも1つを含む遺伝子;(b)本明細書中に開示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のDNA配列、および/または;(c)本明細書中に記載されるコード配列の補体にハイブリダイズする任意のDNA配列をいう。好ましくは、この用語は、コード領域ならびに非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要である全ての配列を含む。
【0031】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、いかなる長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を呼ぶために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはその類似体を含み得る。ヌクレオチドは、いかなる3次元構造をも有し得、そして公知または未知であるいかなる機能をも発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、1本鎖、2本鎖および三重ヘリックス分子を含む。
【0032】
「オリゴヌクレオチド」とは、5と約100ヌクレオチドとの間の1本鎖または2本鎖DNAのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、あるいは当該技術分野で公知である方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」とは、酵素仲介核酸合成の開始に3’−ヒドロキシ末端を提供する、通常、1本鎖であるオリゴヌクレオチドをいう。
【0033】
下記のもの:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、すべての配列の単離DNA、すべての配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子類似体などの改変核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンの類似体は、当該技術分野で公知であり、アジリジニルシトシン(aziridinycytosine)、4−アセチルシトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルシュードウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、シュードウラシル、5−ペンチニルウラシルおよび2,6−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンの類似形態と考えられる。
【0034】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも9個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも45個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「bp」とも表示される「塩基対」とは、相補的核酸分子をいう。DNAには、4「種」の塩基が存在する:プリン塩基アデニン(A)は、ピリミジン塩基チミジン(T)と水素結合され、そしてプリン塩基グアニン(G)は、ピリミジン塩基シトシン(C)と水素結合される。各水素結合された塩基対セットはまた、ワトソン−クリック塩基対としても公知である。1000塩基対は、しばしばキロベース対またはkbと呼ばれる。「塩基対ミスマッチ」とは、塩基が相補的ワトソン−クリック対でない核酸分子中の位置をいう。句「いかなる位置にも少なくとも1種の塩基を含まない」とは、いかなる位置にも4種の塩基のうちの1つを有しないヌクレオチド配列をいう。例えば、1つのヌクレオチドを欠く(すなわち1種の塩基を欠く)配列は、A、G、T塩基対から構成され、そしてC残基を含まないものであり得る。
【0036】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子標的化」は、ゲノムDNAのフラグメントが哺乳動物細胞中に導入され、かつ、そのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、これと再び結合する場合に生じる1種の相同的組換えである。
【0037】
用語「相同組換え」とは、相同ヌクレオチド配列の部位での2つのDNA分子または染色分体間のDNAフラグメントの交換をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相同」は、参照配列と比べて、少なくとも約70%の配列同一性、典型的には、少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、そしてより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは参照配列に比べて約100%の配列同一性を有するDNA配列の特性を示す。相同性は、「BLASTN」アルゴリズムを使用して決定され得る。相同配列は、ヌクレオチド配列中の挿入、欠失および置換に適応する(accommodate)ことが理解される。したがって、ヌクレオチドの線形配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応しないか、または整列しなくても、本質的に同一であり得る。参照配列とは、遺伝子またはフランキング配列の一部、または染色体の反復部分などのより大きな配列のサブセットであり得る。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「標的遺伝子」(または「標的遺伝子配列」または「標的DNA配列」または「標的配列」と呼ぶ)とは、相同組換えによって改変される任意の遺伝子の任意の核酸分子またはポリヌクレオチドをいう。標的配列は、インタクト遺伝子、エキソンまたはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域を含む。1つの局面では、一般的集団中に1つの配列を有する核酸分子は、いずれの疾患または認識可能な表現型にも関連していない。一般的な集団中において、野生型遺伝子は、互いに関連した配列中の変化を含む複数の有力なバージョン(prevalent version)を含み得るにも関わらず、認識可能な病理学的効果を引き起こさないことが注目される。これらの変異は、「多型性」または「対立遺伝子変異」と命名される。標的遺伝子は、個人のゲノムDNA中に特定遺伝子または遺伝子座の一部を含む。本明細書中に提供されるように、本発明の標的遺伝子は、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子、または天然に存在する対立遺伝子変異体またはその相同体からなる。
【0039】
本明細書中で使用される場合、用語「網膜特異的核レセプター遺伝子」とは、配列番号19を含む配列、または受託番号:AF148129;GI番号:6651226としてGenBankで同定された網膜特異的核レセプター遺伝子をいう。1つの局面では、網膜特異的核レセプター遺伝子のコード配列は、配列番号19、あるいは受託番号:AF148129;GI番号:6651226としてGenBankで同定された配列を含む。
【0040】
本明細書中で使用される場合、用語「リンパ系特異的GPCR遺伝子」とは、配列番号22を含む配列、または受託番号:L31580;GI番号:468340であるGenBankのリンパ系特異的GPCR遺伝子をいう。1つの局面では、リンパ系特異的GPCR遺伝子のコード配列は、配列番号22、または受託番号:L31580;GI番号:468340としてGenBankで同定された配列を含む。
【0041】
本明細書中で使用される場合、用語「メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子」とは、配列番号25を含む配列、または受託番号:X65635;GI番号:53244としてGenBankで同定されたメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子をいう。1つの局面では、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号25または受託番号:X65635;GI番号:53244としてGenBankで同定された配列を含む。
【0042】
本明細書中で使用される場合、用語「マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子」とは、配列番号28を含む配列、または受託番号:D28117;GI番号:532678としてGenBankで同定されたマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子をいう。1つの局面では、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子のコード配列は、配列番号28または受託番号:D28117;GI番号:532678としてGenBankで同定された配列を含む。
【0043】
本明細書中で使用される場合、用語「ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子」とは、配列番号31を含む配列、または受託番号:U71089;GI番号:1589930としてGenBankで同定されたケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子をいう。1つの局面では、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子のコード配列は、配列番号31または受託番号:U71089;GI番号:1589930としてGenBankで同定された配列を含む。
【0044】
本明細書中で使用される場合、用語「cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子」とは、配列番号34を含む配列、または受託番号:X60664;GI番号:53587としてGenBankで同定されたcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子をいう。1つの局面では、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号34または受託番号:X60664;GI番号:53587としてGenBankで同定された配列を含む。
【0045】
本明細書中で使用される場合、用語「スルホトランスフェラーゼ遺伝子」とは、配列番号37を含む配列、または受託番号:L02331;GI番号:201069としてGenBankで同定されたスルホトランスフェラーゼ遺伝子をいう。1つの局面では、スルホトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号37または受託番号:L02331;GI番号:201069としてGenBankで同定された配列を含む。
【0046】
標的遺伝子の「破壊」は、ゲノムDNAのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、そしてこれと再び結合する場合に生じる。これらの配列破壊または改変は、DNA配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、または代替、または置換、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。挿入は、動物、植物、原核生物、またはウイルス起源のものであってもよい全遺伝子の挿入を含む。例えば、破壊は、標的遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライシング部位を変更または置換し得、そして正常な遺伝子産物の産生を部分的に、または完全に阻止するか、あるいは正常遺伝子産物の活性を強化することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【0047】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、変性、変更または置換されている標的遺伝子をそのゲノム内に含む細胞をいう。
【0048】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、または不活性化されている特定遺伝子をそのゲノム内に含む動物である。トランスジェニック動物は、ヘテロ接合性動物(すなわち、1つの欠損対立遺伝子および1つの野生型対立遺伝子)ならびにホモ接合性動物(すなわち、2つの欠損対立遺伝子)の両方を含む。
【0049】
本明細書中で使用される場合、用語「構築物」とは、標的組織、細胞系列またはヒトを含む動物中に移入されるべき人工的に組み立てられたDNAセグメントをいう。典型的には、構築物は、遺伝子、または特別の目的の配列、マーカー遺伝子および適切な制御配列を含む。「プラスミド」との用語は、自律性自己複製染色体外DNA分子をいう。好ましい実施形態では、本発明のプラスミド構築物は、目的の遺伝子の2つのフランキング領域間に位置されるポジティブ選択マーカーを含む。必要に応じて、この構築物はまた、スクリーニングマーカー、例えば緑色蛍光性タンパク質(GFP)を含み得る。存在する場合、スクリー−ニングマーカーは、フランキング領域の外側で、かつある距離だけ離れて配置される。
【0050】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」または「ポジティブ選択マーカー」とは、遺伝子を保有する細胞のみがある条件下に生き残り、かつ/または成長し得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン抵抗性(Neor)遺伝子を発現する植物および動物細胞は、化合物G418に対して抵抗性である。Neor遺伝子マーカーを保有しない細胞は、G418によって死滅される。他のポジティブ選択マーカーは、当業者には公知である。
【0051】
「ポジティブ−ネガティブ選択」は、特定の標的化された位置に組み込まれたDNA挿入物を保有する細胞を選択するプロセス(ポジティブ選択)、および非標的化された染色体部位に組み込まれたDNA挿入物を保有する細胞をまた選択する(select against)(ネガティブ選択)をいう。ネガティブ選択挿入物の非限定的例としては、チミジンキナーゼ(tk)をコードする遺伝子が挙げられる。ポジティブ−ネガティブ選択に適した遺伝子は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,464,764号参照。
【0052】
「スクリーニングマーカー」または「レポーター遺伝子」は、容易に分析され得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、レポーター遺伝子は、特定DNA構築物が細胞、器官または組織中に首尾よく導入されたか否かを決定するために使用され得る。スクリーニングマーカーの非限定的例としては、緑色蛍光性タンパク質(GFP)をコードする遺伝子、または改変された蛍光性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「ネガティブスクリーニングマーカー」は、ネガティブ選択マーカー;それを発現する細胞を典型的には死滅させるネガティブ選択マーカーとして解釈されるべきでない。
【0053】
用語「ベクター」は、挿入されたDNAを保有し得、宿主細胞中に不滅化され得るDNA分子をいう。ベクターはまた、クローニングベクター、クローニングビヒクルまたはビヒクルとして公知である。この用語は、細胞中に核酸分子を挿入するために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクター、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の1より多くをもたらすベクターもまた、含まれる。
【0054】
「宿主細胞」は、ベクターのため、あるいは核酸分子および/またはタンパク質の導入のためのレセプターであり得るかまたはそうである、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、1つの宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、天然の変異、偶発的な変異または故意の変異に起因して、必ずしも元の親と(形態学的にまたは全DNA相補体(complement)において)完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
【0055】
用語「ゲノムライブラリー」は、1セットのランダムに生成された重複する、生物体のゲノムを表現するDNAフラグメントから作られたクローンの集合をいう。「cDNAライブラリー」(相補的DNAライブラリー)は、酵素逆転写酵素でcDNA分子に変換され、次いで、ベクター(外来DNAの添加後に複製し続けることができる他のDNA分子)中に挿入された、細胞、組織または生物体に存在するmRNA分子の集合である。ライブラリーのためのベクターの例としては、バクテリオファージ(「ファージ」としても公知である)が挙げられる。これは、細菌を感染するウイルス(例えば、λファージ)である。次いで、ライブラリーは、目的の特定cDNA(従って、mRNA)のためにプローブされ得る。1つの実施形態では、高効率のファージベクター系をプラスミド系の便宜性と組み合わせるライブラリー系(例えば、Stratagene,La Jolla, CAからのZAP系)が本発明の実施に使用される。
【0056】
用語「エキソヌクレアーゼ」は、線状核酸基質の自由端から連続してヌクレオチドを切断する酵素をいう。エキソヌクレアーゼは、2本鎖または1本鎖のヌクレオチドに特異的であり得、ならびに/あるいは、例えば3’−5’および/または5’−3’の方向に特異的であり得る。いくつかのエキソヌクレーゼは、他の酵素活性を示す。例えば、T4DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼおよび活性3’−5’エキソヌクレアーゼの両方である。他のエキソヌクレアーゼの例としては、リン酸化3’末端を有さない2重鎖DNAの5’末端から1つずつヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼIII、1本鎖DNAの両端からヌクレオチドを切断することによってオリゴヌクレオチドを作るエキソヌクレアーゼVI、および結合する5’リン酸基を有する2重鎖DNAの5’末端からヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼλが挙げられる。
【0057】
用語「リコンビナーゼ」は、組換えを誘導、媒介または促進する酵素、および核酸配列の再配列、または第2の核酸配列から第1の核酸配列を切除または第2の核酸配列の中へ第1の核酸配列を挿入することを誘起、媒介または促進する酵素を改変する他の核酸を包含する。リコンビナーゼの「標的部位」は、リコンビナーゼによって認識(例えば、特異的に結合する)および/または作用される(組換えのための切除、切断または誘導)核酸配列または領域である。本明細書中で使用される場合、「酵素指向性部位特異的組換え」との表現は、次の事象を含むことが意図される:リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたDNAセグメントの欠失;リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたDNAセグメントのヌクレオチド配列の反転;および異なったDNA分子上に配置されたリコンビナーゼ標的部位に近接したDNAセグメントの相互交換。
【0058】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する(modulate)」は、標的遺伝子の機能、発現、または代替的に、標的遺伝子における破壊に関連した表現型の、阻止、低下または増強をいう。
【0059】
用語「回復する」は状態、疾患、障害、または標的遺伝子における破壊に関連した異常性もしくは病徴を含む表現型を、減少、低下または除去することをいう。
【0060】
用語「異常性」は、任意の疾患、障害、状態、または病理学的状態を含む標的遺伝子の破壊が関係する表現型をいう。
【0061】
(発明の詳細な説明)
本発明は、部分的に、遺伝子の発現および役割ならびに遺伝子発現産物の評価に基づく。とりわけ、本発明は、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上有用な標的の同定を可能とする。例えば、疾患状態で変異あるいは下方制御される遺伝子は、疾患状態を生じるかまたは悪化させることに関与し得る。このような遺伝子の活性を上方制御することに指向された治療、または代替の経路に関与する治療は、疾患状態を改善させ得る。
【0062】
当該技術分野で公知である技術はいずれも、動物中に標的遺伝子導入遺伝子を導入してトランスジェニック動物のファウンダー系(founder line)を生産するために使用され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号);生殖系列中へのレトロウイルス仲介遺伝子導入(Van der Puttenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82:6148−6152(1985));胚性幹細胞での遺伝子標的化(Thompsonら、Cell,56:313−321(1989));胎児のエレクトロポレーション(Lo,Mol Cell.Biol.,3:1803−1814(1983)):および精子仲介遺伝子移送(Lavitranoら、Cell,57:717−723(1989));などが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の概説については、Gordon,Transgenic Animals,Intl.Rev.Cytol.,115:171−229(1989)(本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと。
【0063】
好ましい実施形態では、相同組換えは、本発明のノックアウトマウスを生成するために使用される。好ましくは、構築物は(1)標的配列に対して相同である配列を増幅する工程(例えば、長距離(long−range)PCRを使用して)、および(2)相同配列が隣接するようにPCR産物中に別のポリヌクレオチド(例えば、選択マーカー)を挿入する工程による2工程で生成される。典型的には、ベクターは、プラスミドゲノムライブラリー由来のプラスミドである。完全な構築物はまた、典型的には、環状プラスミドである。従って、図1に示されるように、「外方向に向かう(pointing)」オリゴヌクレオチドを用いる長距離PCRを使用すると、選択マーカーが容易に、好ましくは連結非依存性クローニングにより挿入され得るベクターが生じる。次いで、この構築物は、相同標的配列の機能を破壊し得るES細胞中に導入され得る。
【0064】
相同組換えはまた、分化全能性の胚性幹細胞でない幹細胞および他の細胞型の遺伝子をノックアウトするために使用され得る。その例として、幹細胞には骨髄、リンパ、または神経前駆体および前駆細胞であり得る。このようなトランスジェニック細胞は特に、個々の発生経路の標的遺伝子機能の研究において有用であり得る。幹細胞は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの全ての脊椎動物種から誘導され得る。
【0065】
分化全能性でない細胞では、当該技術分野で公知である方法を使用して、標的の両コピーをノックアウトすることが望ましい場合がある。例えば、ポジティブ選択マーカー(例えば、Neor)の発現のために選択され、そして非ランダム組込みのためにスクリーニングされている標的遺伝子座での相同組換えを含む細胞は、高レベルの選択試薬(例えば、G418)に暴露されることによって、選択マーカー遺伝子の多数のコピーについてさらに選択され得る。次いで、これらの細胞は、標的遺伝子座でのホモ接合性について分析される。代替的に、第2の構築物は、異なったポジティブ選択マーカーを用いて2つの相同配列間に挿入して生成され得る。2つの構築物は、連続してかまたは同時にかのいずれかで細胞中に導入され、続いて、ポジティブマーカー遺伝子の各々について適切に選択され得る。最終細胞は標的の両対立遺伝子の相同組換えについてスクリーニングされる。
【0066】
別の局面では、目的のクローンの2つの別々なフラグメントが増幅され、そして連結非依存性クローニング技術を使用してポジティブ選択マーカーを含むベクター中に挿入される。この実施形態では、目的のクローンは、一般的にはファージライブラリー由来であり、PCR技術を使用して同定かつ単離される。連結非依存性クローニングは、2工程または1工程で実施され得る。
【0067】
好ましい方法によれば、5’−3’ 1本鎖領域が作製され得る場合、多数の部位を有する構築物が使用される。これらの構築物、好ましくはプラスミドは、指向性の四方向連結非依存性クローニングが可能なベクターを含む。
【0068】
構築物は、典型的には、例えば、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子などの、ポジティブ選択マーカーをコードする配列;ポジティブ選択マーカーのいずれかの側部の制限酵素部位、および4塩基対の1つを含まない制限酵素部位に隣接する配列を含む。この配置によって、適切な制限酵素で構築物を消化し、そしてエキソヌクレアーゼ活性を有する化合物(例えば、T4DNAポリメラーゼ)でそのフラグメントを処理することによって、この配列中に1本鎖末端が生成され得る。
【0069】
1つの好ましい実施形態では、標的化された変異をES細胞中に導入するために適した構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。特異的プライマーを用いる長距離PCRを使用して、目的の配列がプラスミドライブラリーから1工程で同定かつ単離される。この配列の単離に続いて、標的配列を破壊する第2のポリヌクレオチドは、目的の配列をコードする2つの領域の間に容易に挿入され得る。この直接的方法を使用して、標的化構築物は、72時間ほどの短い時間で生成され得る。別の実施形態では、標的化構築物は、以下に詳細に記載されるように、ファージゲノムライブラリー中の目的のクローンの同定の後に調製される。
【0070】
本明細書中に記載される方法は、ハイブリダイゼーション単離工程、制限酵素マッピング工程および多数クローニング工程を必要としない。さらに、いかなる遺伝子の機能も、これらの方法を使用して決定し得る。例えば、短い配列(例えば、EST)が、オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。これらのプローブは、構築物を作製する直接的増幅方法において使用されるか、またはより長い完全長の遺伝子のためのゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。従って、いかなる遺伝子もES細胞中での使用のために迅速かつ効率的に調製され得ることが意図される。
【0071】
好ましい実施形態では、構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。このライブラリーは、当該技術分野で公知であるいかなる方法によっても生産され得る。好ましくは、マウスES細胞から得たDNAは単離され、DNAをフラグメントに切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して処理される。次いで、DNAフラグメントは、ベクター(例えば、バクテリオファージまたはファージミド(例えば、Lamda ZAPTM、Stratagene, La Jolla, CA)系)に挿入される。ライブラリーがZAPTM系で作製される場合、DNAフラグメントは、好ましくは約5〜約20キロベースである。
【0072】
好ましくは、ライブラリーが作られる生物は、識別可能な疾患または表現型効果を示さない。好ましくは、このライブラリーは、マウスライブラリーである。このDNAは、いかなる細胞源または体液からも取得され得る。臨床業務で入手可能な細胞源の非限定的な例としては、ES細胞、肝臓、腎臓、血球、口腔内細胞、頸膣部細胞、尿からの上皮細胞、胎児性細胞、または組織診によって得られる組織中に存在する任意の細胞が挙げられる。体液としては、尿、血液脳脊髄液(CSF)、および感染または炎症の部位の組織浸出液が挙げられる。DNAは、細胞または体液から、当該技術分野で公知である任意の方法を使用して抽出した。好ましくは、DNAは、胚性幹細胞のコンフルエントな100mmプレートに、5mlの溶解緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5))、10mM EDTA(pH8.0)、10mM NaCl、0.5%SDSおよび1mg/mlプロテイナーゼK)を添加して抽出される。次いで、これらの細胞は、約60℃で数時間または完全に溶解されるまでインキュベートされる。ゲノムDNAは、溶解された細胞からフェノール:クロロホルムによる穏やかな抽出を数回繰り返し、続いてエタノール沈殿によって精製される。便宜的には、ゲノムライブラリーは、プール中に配列される。
【0073】
好ましい実施形態では、目的の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび長距離PCRを使用してプラスミドライブラリーから同定される。典型的には、プライマーは、部分的遺伝子配列(例えば、cDNAまたはEST配列)から得られた配列情報に基づいて設計される外方向に向かうプライマーである。例えば、図1に示されるように、生成物は、各プライマー間に配置される領域を除外した線状フラグメントである。
【0074】
好適であると判断されたPCR条件は、以下の実施例中に記載される。最適なPCR条件は当業者によって容易に決定され得ることが理解される(例えば、PCR2:A Practical Approach(1995)M.J.McPherson,B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、IRL Press,Oxford;Yuら、Methods Mol.Bio.,58:335−9(1996);Munroeら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.,USA,92:2209−13(1995)を参照のこと)。ライブラリーのPCRスクリーニングは、ライブラリーが平板化され、フィルターが作られ、放射活性プローブが調製され、かつ、ハイブリダイゼーション条件が確定されなければならない、従来のハイブリダイゼーションスクリーニングに関連する問題および時間的遅延の多くを取り除く。PCRスクリーニングは、目的の配列(遺伝子)に対するオリゴヌクレオチドプライマーのみを必要とする。PCR産物は、微量濾過、透析、ゲル電気泳動などを含むがこれらに限定されない種々の方法で精製され得る。新規なDNA合成が生じ得ないように、PCRに使用されるポリメラーゼを取り除くことが望ましい場合がある。好適な熱安定性DNAポリメラーゼは、市販される(例えば、VentTM DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、Deep VentTM DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、HotTubTM DNAポリメラーゼ(Amersham)、Thermo SequenaseTM(Amersham)、rBstTM DNAポリメラーゼ(Epicenter)、PfuTM DNAポリメラーゼ(Stratagene)、Amplitaq GoldTM (Perkin Elmer)、およびExpandTM (Boehringer−Mannheim))。
【0075】
完成された構築物を形成するために、標的配列を破壊する配列は、PCR増幅産物中に挿入される。例えば、本明細書中に記載される場合、直接的方法は、長距離PCR産物(すなわち、ベクター)および1つのフラグメント(すなわち、選択マーカーをコードする遺伝子)を連結することを含む。上記のように、ベクターは、標的DNA配列に相同である2つの異なった配列領域を含む。好ましくは、ベクターはまた、選択マーカー(例えば、アンピシリン)をコードする配列を含む。ベクターおよびフラグメントは、1本鎖末端を形成するために処理される場合、フラグメントが標的遺伝子と実質的に相同である2つの異なった領域間に配置されるようにアニールするように設計される。
【0076】
クローニングのいかなる方法も好適であるけれども、連結非依存性クローニング戦略が、選択マーカーに隣接する2つの異なった相同領域を含む構築物をアセンブリするために使用されることが好ましい。連結非依存性クローニング(LIC)は、キナーゼまたはリガーゼを使用することなくポリヌクレオチドを指向性クローニングするための戦略である(例えば、Aslanidisら、Nucleic Acids Res.,18:6069−74(1990);Rashtchian,Current Opin.Biotech.,6:30−36(1995)を参照のこと)。1本鎖テール(tail)(クローニング部位またはアニーリング配列とも呼ばれる)は、通常たった1つのdNTPの存在下にT4DNAポリメラーゼでベクターを(消化される制限酵素部位で)処理することによって、LICベクター中に作製される。T4DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は、反応混合物中に存在する1つのdNTPに対応する残基に遭遇するまでヌクレオチドを除去する。この時点で、この酵素の5’−3’ポリメラーゼ活性は、さらなる切除を阻止するためにエキソヌクレアーゼ活性を相殺する。ベクターは、作製される1本鎖テールが非相補的であるように設計される。例えば、pDG2ベクターでは、4つのアニーリング部位のうち1本鎖テールはいずれも互いに相補的でない。PCR産物は、オリゴヌクレオチドプライマー中に適切な5’伸長を形成することによって作製される。PCR産物は、dNTP(および(鋳型として使用される場合)元々のプラスミド)を取り除くために精製され、次いで、適切なdNTPの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理されて、特異的ベクター適合性オーバーハングを生成する。クローニングは、適合性テールのアニーリングによって生じる。1本鎖テールは、例えば、化学的手段または酵素的手段を使用して、クローンフラグメントの末端で作製される。相補的テールは、ベクター上で作製されるが、挿入物を有さないベクターのアニーリングを阻止するために、ベクターテールは、互いに相補的でない。テールの長さは、少なくとも約5ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約12ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【0077】
1つの実施形態では、重複するベクターおよびフラグメントを同じ反応物中に置くことは、それらをアニールするには充分である。代替的に、相補的配列は、結合され、加熱され、そしてゆっくりと冷却され得る。好ましくは、加熱工程は、約60℃〜約100℃、より好ましくは約60℃〜80℃、さらにより好ましくは60℃〜70℃である。次いで、加熱反応物は、冷却され得る。一般的には、冷却は、かなりゆっくり生じる。例えば、この反応物は、約1時間後に徐々にほぼ室温となる。冷却は、アニーリングが可能となるように充分にゆっくりでなければならない。アニールされたフラグメント/ベクターは、直ちに使用され得るか、または使用まで−20℃で冷凍保存され得る。
【0078】
さらにアニーリングは、適切な条件を達成するために塩および温度を調節して実施され得る。ハイブリダイゼーション反応は、約10mM NaCl〜約600mM NaClの範囲の溶液中で約37℃〜約65℃の範囲の温度で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、塩濃度および温度の両方で決定されることが理解される。例えば、10mMの塩中にて37℃で実施されるハイブリダイゼーションは、500mMの塩中にて65℃で実施されるものと同様なストリンジェンシーであり得る。本発明については、相同的な相補性配列の間にハイブリッドを形成するいかなるハイブリダイゼーション条件も使用され得る。
【0079】
図1に示されるように、1つの実施形態では、ベクター部分が(長距離PCRを使用して、プラスミドライブラリーから増幅された)標的遺伝子に対して実質的に相同である2つの異なった領域を含み、そして、フラグメントが選択マーカーをコードする遺伝子である場合、構築物は、これらの任意のアニーリング手順を使用した後に作成される。
【0080】
アニーリング後、構築物は、当該技術分野で公知である方法によってコンピテントなE.coli細胞中へ形質転換され、構築物を増幅する。次いで、単離された構築物は、ES細胞中への導入のための準備が整う。
【0081】
別の実施形態では、目的のクローンは、PCRを使用してプールされたゲノムライブラリー中で同定される。1つの実施形態では、PCR条件は、選択マーカーをコードする遺伝子がポジティブに同定されたクローン中に直接的に挿入され得るようなものである。このマーカーは、標的DNAに対して実質的な相同性を有する2つの異なった配列の間に配置される。
【0082】
ゲノムファージライブラリーは、当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。好ましくは、マウス肺性幹細胞ライブラリーは、λファージ中でゲノムDNAを長さ約20キロベースであるフラグメントに切断して調製される。次いで、これらのフラグメントは、任意の好適なλクローニングベクター(例えば、λFix IIまたはλDash II(Stratagene,La Jolla,Ca))中に挿入される。
【0083】
ライブラリーから多数のクローンを迅速に、かつ効率的にスクリーニングするために、プールは、平板培養されたライブラリーを作製し得る。好ましい実施形態では、ゲノムλファージライブラリーは、プレート当たり約1,000クローン(プラーク)の密度で平板培養される。生物の全ゲノムを何度も表すに充分なプレートが、作製される。例えば、約1,000,000クローン(1000プレート)は、約8個のゲノム等価物を生じる。次いで、プラークが、例えば、緩衝溶液でプレートを覆い、プレートをインキュベートし、そして緩衝液を再収集して回収される。使用される緩衝液の量は、プレートの大きさによって変化する。一般的に、直径100mmの1つのプレートは、約4mlの緩衝液を使用して覆われ、約2mlが回収される。
【0084】
個々のプレート溶解物はこの手順のいずれの時点でもプールされ得、これらはいかなる組み合わせでもプールされ得ることが理解されるだろう。しかし、1つのクローンのその後の同定を容易にするには、各プレート溶解物を別個に保存し、次いでプールとすることが好ましい。例えば、各2mlの溶解物は、96穴ディープウェルプレートに置かれ得る。次いで、プールは、各ウェルからある量、好ましくは約100μlを取り出し、新規なプレートのウェル中でそれらを一緒にすることによって形成され得る。好ましくは、12の個々のプレート溶解物100μlが1つのウェルで一緒にされ、12,000クローンのライブリラリーを表す1.2mlのプールを形成する。
【0085】
次いで各プールは、標的遺伝子を増幅することが公知である1セットのPCRプライマーを使用してPCR増幅される。標的遺伝子は、GenBankまたはEMBLなどの公に入手可能である核酸配列データベースから得られる公知の全長遺伝子、またはより好ましくは、部分的cDNA配列であり得る。これらのデータベースは、発現配列タグ(EST)として公知である部分的cDNA配列を含む。オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、当該技術分野で公知である任意の方法でいかなる生物からも単離され得るか、あるいは好ましくは、化学的手段で合成され得る。
【0086】
一旦、標的遺伝子のポジティブクローンがゲノムライブラリーで同定されると、標的遺伝子の別個の部分をコードする2つのフラグメントが、生成されなければならない。言い換えると、標的の小さな公知領域(例えばEST)のフランキング領域が生成される。各フランキング領域のサイズは重大でなく、100塩基対ほど少ないものから100kbほど多いものまでにわたり得るが、好ましくは、各フランキングフラグメントは、約1kb長より長く、より好ましくは約1〜約10kb、さらにより好ましくは約1〜約5kbである。当業者は、より大きなフラグメントがES細胞での相同組換え事象の数を増加し得るが、より大きなフラグメントはまた、クローニングするにはより困難であることを認識する。
【0087】
1つの実施形態では、フランキングフラグメントを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドPCRプライマーの1つは、ライブラリークローニングベクター(例えば、λファージ)に特異的である。従って、ライブラリーがλファージライブラリーである場合、λファージアームに特異的なプライマーは、長いフランキングフラグメントを生成するポジティブクローンに特異的なプライマーと組合わせて使用され得る。多数のPCR反応が、異なった組み合わせのプライマーを試験するためにセットアップされ得る。好ましくは、使用されるプライマーは、長さ約2〜約6kbのフランキング配列を生成する。
【0088】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、フラグメントがクローニングされるベクターに相補的な5’配列を有するように設計される。さらに、プライマーはまた、構築物がアセンブリされる場合、フランキング配列がベクターおよび互いに関して適切な3’−5’方向にあるように設計される。
【0089】
従って、PCRに基づく方法を使用して、例えば、ポジティブクローンは、電気泳動ゲル上のバンドを可視化することにより同定され得る。
【0090】
1つの局面では、クローニングは、ベクターおよび2つのフラグメントを含む。ベクターは、ポジティブ選択マーカー、好ましくはNeor、および標的遺伝子の2つの異なった領域のためのポジティブ選択マーカーの両側部上のクローニング部位を含む。必要に応じて、このベクターはまた、好ましくはポジティブ選択マーカーの反対に配置されるスクリーニングマーカー(レポーター遺伝子)をコードする配列を含む。スクリーニングマーカーは、相同配列のフランキング領域の外側に配置されるであろう。図3Aは、ベクターの1つの側部に配置される、スクリーニングマーカーであるGFPを有するベクターの1つの実施形態を示す。しかし、スクリーニングマーカーは、ポジティブ選択マーカーであるNeorの反対の側部上のNotIおよびSite4の間のどこにでも配置され得る。 【0091】
好適なベクターの1つの例は、配列番号1の配列を有する図2に示されるプラスミドベクターである。図1で「部位1、2、3または4」と呼ばれる特異的核酸連結非依存性クローニング部位(本明細書中ではアニーリング部位とも呼ぶ)は、本明細書中でも示される。一般的に、クローニング部位は、少なくとも1つの型の塩基、すなわちチミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)またはアデニン(A)を欠く。従って、1つの欠失するヌクレオチドのみの存在下にポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼの両者として作用する酵素とベクターを反応させることは、オーバーハングを作製する。例えば、T4DNAポリメラーゼは3’−5’エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼの両者として作用する。従って、ポリメラーゼ活性に利用可能なヌクレオチドが不充分である場合、T4は、エキソヌクレアーゼとして作用する。従って、特異的オーバーハングは、dTTPのみの存在下にT4DNAポリメラーゼとpDG2ベクターを反応させることによって作製され得る。本発明の実施において有用な他の酵素、例えばウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)(例えば、WO93/18175を参照のこと)は当業者には公知である。本明細書中に例示されるベクターは、24ヌクレオチドのオーバーハングを有する。首尾よい連結非依存性クローニングには、5ヌクレオチドほどしか必要でないことは、当業者には公知である。
【0092】
別の実施形態では、構築物は、2工程クローニング手順でアセンブリされる。第1工程で、相同な各クローニング領域は、ベクターのアニーリング部位の2つに別個にクローニングされる。例えば、相同な「上流」領域は、アニーリング部位1および2にクローニングされ、一方、別個のクローニングである相同な「下流」領域はアニーリング部位3および4中にクローニングされる。一旦、相同な1つの領域の各々を含むクローンが同定されると、制限酵素で各クローンを消化することによって、相同性を有する両領域を含むターゲティング構築物が作製され得る(ここで、1つの酵素はアニーリング部位1(例えば、図2AのNotI)の外側を消化し、別の酵素はポジティブ選択マーカーとアニーリング部位3(例えば、図2AのSalI)との間を消化する)。それぞれの構築物から得たフランキング相同領域を含むフラグメントは、(例えば、ゲル電気泳動で)精製され、そして当該技術分野で公知である標準的連結技術を使用して結合されて、結果として得られるターゲティング構築物を生産する。
【0093】
さらに別の実施形態では、本発明の1つの局面による構築物は単一工程、四方向連結手法で形成され得る。ベクターおよびフラグメントは上記のように処理される。簡単には、ベクターは処理されて2片を形成し、各片は各末端に特異的配列の1本鎖テイルを有する。同様に、PCR増幅フランキングフラグメントも処理されて、ベクター片のテイルと相補的である1本鎖テイルを形成する。処理されたベクター片およびフラグメントは結合され、上記のようにアニールされる。1本鎖テイルの特異性ゆえに、最終構築物は適切な配向性を有するポジティブ選択マーカーによって分離されたフラグメントを含むであろう。
【0094】
最終プラスミド構築物は細菌内で増幅され、精製され、次いでES細胞中に導入され得るか、あるいは使用まで−20℃に冷凍貯蔵される。所望である場合には、ベクターは胚幹細胞株中に導入され(例えば、エレクトロポレーションで)、そして導入されたDNAが内因性DNAと相同組換えされた細胞が選択される(例えば、Li,et.al.,Cell,69:91526(1992)を参照のこと)。成功する組換えは、PCRおよび/またはサザン分析のような当該分野で公知である種々の技術を使用して立証され得る。代表的に、数百の個々のコロニーがG418(Neoカセットについて)での薬剤選択により選択され、DNA調製のために拡大され、そしてPCR分析によって相同組換えについてスクリーニングされる。PCRスクリーニング手順は、ターゲティングベクターに存在しない標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、およびNeo(または他の選択可能マーカー)カセットに対応するオリゴヌクレオチドを使用する。ターゲティングベクターの外側にあるオリゴヌクレオチドの選択は、ターゲティングベクターのランダムな組込みから相同組換え体を区別するために使用される。一般的には、ターゲティングベクター上に存在しない4つの非依存性標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、Neoの挿入部位に隣接する標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせた野生型ES細胞DNA上で試験される(図9)。バックグラウンドのバンドを生成するか、あるいは予定された大きさの産物を生ずることができないオリゴヌクレオチドは除かれる。1つの標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは選択され、Neoカセットに対応するオリゴヌクレオチドと対を形成する。このスクリーニングでPCRポジティブであるES細胞は、もとのオリゴヌクレオチド対に隣接するがこれとは区別される異なった対の標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびNeo遺伝子(または他の選択可能マーカー)特異的オリゴヌクレオチドを使用する第2のPCR実験によって確認される。さらに、この方法は、マーカー特異的オリゴヌクレオチドと結合した選択可能マーカーの反対側に配置される標的遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して繰り返され得る。この方法では、ターゲティングベクターの両相同配列の適切な組込みが立証される。
【0095】
サザンブロットハイブリダイゼーションもまた、ターゲティングベクター上に含まれないが、相同組換えの予定されるクロスオーバー部位に隣接するプローブを使用して、ES細胞標的化事象を確認するために使用し得る。相同組換えについて試験するサザンブロット実験は、野生型染色体と変異体遺伝子標的対立遺伝子を表す2つの区別されるバンドを検出すべきである。高分子量ゲノムDNAは、コントロールES細胞親株、および相同組換えに関してPCRポジティブであるES細胞株から調製される。このDNAは、標的遺伝子DNA相同性のアーム内でターゲティングベクターを切断せず相同組換えの診断となることが制限酵素マッピングによって証明されている制限酵素(EcoRI)で消化される。EcoRI部位がNeo遺伝子中に存在するので、相同組換え事象は、Neoカセットの挿入およびEcoRI部位の付加となるべきである。この部位の付加は、プローブにハイブリダイズするバンドの大きさの全体的低下となることが予測される。消化されたDNAは1%TAEアガロースゲル上で分離され、ナイロン膜に移送され、紫外線(StrataLinker)で架橋され、そして32−P標識DNAプローブでハイブリダイズされる。このプローブは、ターゲティングベクター上にあるDNA配列とハイブリダイズするのでなく、相同組込みの部位に隣接する位置にハイブリダイズする。
【0096】
次いで、選択された細胞は動物(例えば、マウス)の胚盤胞(または例えば桑実胚などの生存可能な動物を作製する目的に適した発育の他の段階)中に注入されて、キメラを形成する(例えば、Bradley,.in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.,IRL,Oxford, 113−152 (1987)(参照)。また、選択されたES細胞を、分離されたマウス胚性細胞と凝集させて、凝集キメラを形成し得る。次いで、キメラ胚は好適な偽妊娠したメスの里親動物中に移植され、胚は満期まで導かれ得る。相同的に組換えられたDNAをその生殖細胞中に有するキメラ子孫が、動物の細胞の全てが相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させるために使用され得る。1つの実施形態では、キメラ子孫マウスは、標的遺伝子にヘテロ接合性破壊を有するマウスを生成するために使用される。次いで、ヘテロ接合性ノックアウトマウスは交尾され得る。通常、このような交尾の結果の1/4が標的遺伝子にホモ接合性破壊を有するであろうことは、当該技術分野で周知である。
【0097】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性ノックアウトマウスは正常な野生型マウスと比較されて、標的遺伝子の破壊が表現型変化、特に病理学的変化を引き起こすか否かを決定し得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスは、物理的試験、検死、組織像、臨床化学、全血球数、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価により、表現型変化について評価され得る。
【0098】
1つの実施形態では、標的遺伝子の破壊に関連する表現型(または表現型変化)はデータベース中に入れるか、あるいは蓄えられる。好ましくは、データベースは、(i)遺伝子型データ(例えば、破壊された遺伝子の同定)および(ii)遺伝子型データに関連する表現型データ(例えば、遺伝子破壊から生じる表現型)を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは検索可能であるように、好ましくは検索ツールと組み合わされる。
【0099】
さらに、本発明は、組換え方法を使用して生産された動物などの条件ノックアウト動物を意図する。バクテリオファージP1Creリコンビナーゼ、および酵母プラスミドから得たflpリコンビナーゼは、特異的標的部位(creリコンビナーゼではloxP部位およびflpリコンビナーゼではfrt部位)でDNAを切断し、第2の切断部位へこのDNAの連結を触媒する部位特異的DNAリコンビナーゼ酵素の2つの非制限的例である。多数の好適な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、これらの遺伝子は本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのIntリコンビナーゼ(Xisを有するか、あるいは有さない)(Weisberg,R.et al.,in Lambda II,(Hendrix,R.,et al.編),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,211−50頁(1983)(本明細書中に参考として導入される));TpnIおよびβ−ラクタマーゼ転移因子(Mercier,et al.,J.Bacteriol.,172:3745−57(1990));Tn3リソルバーゼ(Flanagan & Fennewald J.Molec.Biol.206:295−304(1989);Stark,et al.,Cell,58:779−90(1989));酵母リコンビナーゼ(Matsuzaki,et al.,J. Bacteriol.,172:610−18(1990));B.スブチリス(subtilis)SpoIVCリコンビナーゼ(Sato,et al.,J.Bacteriol.,172:1092−98 (1990));Flpリコンビナーゼ(Schwartz & Sadowski,J.Molec.Biol.,205:647−658(1989);Parsons,et al.,J.Biol.Chem.,265:4527−33(1990);Golic & Lindquist,Cell,59:499−50
(1989);Amin,et al.,J.Molec.Biol.,214:55−72(1990));Hinリコンビナーゼ(Glasgow et al.,J.Biol.Chem.,264:10072−82 (1989));免疫グロブリンリコンビナーゼ(Malynn,et al.,Cell,54:453−460(1988));およびCinリコンビナーゼ(Haffer & Bickle,EMBO J.,7:3991−3996(1988);Hubner,et al.,J.Molec.Biol.,205:493−500(1989))(全ては本明細書中に参考として導入される)が挙げられる。このようなシステムは、Echols(J.Biol.Chem.265:14697−14700(1990)):de Villartay(Nature,335:170−74(1998):Craig(Ann.Rev.Genet.,22:77−105(1988));Poyart−Salmeron,et al.,(EMBO J.8:2425−33(1989));Hunger−Bertling,et al.,(Mol Cell.Biochem.,92:107−16(1990));およびCregg & Madden (Mol.Gen.Genet.,219:320−23(1989))(全てが本明細書中に参考として導入される)によって議論されている。
【0100】
Creは均質に精製され、loxP部位との反応は広く特性化されている(Abremski & Hess J.Mol.Biol.259:1509−14(1984)(本明細書中に参考として導入される))。Creタンパク質は分子量35,000を有し、New England Nuclear/Du Pontから市場で入手され得る。このcre遺伝子(Creタンパク質をコードする)はクローン化され、発現されている(Abremski,et al. Cell32:1301−11(1983)(本明細書中に参考として導入される)。Creタンパク質は、同じまたは異なったDNA分子上に存在し得る2つのloxP配列の間の組換えを仲介する(Sternberg,et al.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.45:297−309(1981))。loxP部位の内部スペーサー配列は非対称であるから、2つのloxP部位は互いに相対する方向性を示し得る(Hoess & Abremski Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1026−29(1984))。したがって、同じDNA分子上の2つの部位が直接的に繰り返された方向にある場合、Creは部位間のDNAを切除するであろう(Abremski,et al.Cell 32:1301−11(1983))。しかしながら、もしもこの部位が互いに反転されるなら、これらの間のDNAは組換え後に切除されるのではなく単に反転される。したがって、直接方向に2つのloxP部位を有する環状DNA分子が組換えられて、2つのより小さな環を生産する。これに対して、反転された方向に2つのloxP部位を有する環状分子は、loxP部位が隣接するDNA配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のDNA分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【0101】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルの遺伝子機能を特性化する重要な用途を有する。本明細書中に記載される構築物が標的遺伝子を破壊するために使用される場合、ポジティブ選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始部位の下流(3’)に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うある程度のタンパク質発現を生じ得る。ポジティブ選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化、あるいはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているか否かを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。ポジティブ選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、ポジティブ選択マーカーが除去される。このようにして、ポジティブ選択マーカーにより生じる効果または融合転写物の発現は避けられる。
【0102】
1つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は直接微量注入法によって細胞へもたらされる。他の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態の別な態様は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ仲介組換えを実行するための1つの方法は、誘導性であるかあるいは組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節因子を使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用に関する。誘導性発現要素は、好ましくは所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節因子の例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない(No,et al.Proc.Natl.Acd.Sci.USA,93:3346−51(1996);Furth,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:9302−6(1994))。使用することができるさらなる調節因子としては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを導入するベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【0103】
当該技術分野で公知である他の方法が、本発明のトランスジェニック細胞およびノックアウトマウスを生産するために使用され得る。例えば、米国特許第5,464,764号、米国特許第5,487,992号、米国特許第5,627,059号、米国特許第5,631,153号に記載される方法は、本発明によってもたらされる標的遺伝子の破壊を含むトランスジェニック細胞またはノックアウトマウスを生産するために使用され得る。
【0104】
(疾患のモデル)
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ(micro−pig)、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。例えば、細胞および動物に基づいたモデル系は、標的遺伝子をさらに特性化するために使用され得る。このようなアッセイは、疾患症状を回復させることが可能である化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に暴露され得る。これは、暴露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。暴露された後、細胞は1つまたは複数の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に暴露され得る。これは、暴露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。暴露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転(reversal)を評価してモニターされ得る。暴露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を暴露することを含み得る。新生児、若年および成人の動物もまた暴露され得る。
【0105】
より具体的には、本発明の動物モデルを使用して、薬剤および/または化合物を同定する方法が、好ましくは、標的遺伝子をコードする遺伝子中の破壊に関連する生理学的、組織学的または行動的表現型に影響を与える薬剤および/または化合物の能力に基づいて提供される。
【0106】
1つの実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現または機能を調節する能力を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有する、本発明の非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与することを含む。この方法は、例えば薬剤に対する動物の反応を測定し、このような動物の反応をコントロール動物と比較することを含む。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ(例えば、遺伝子転写、タンパク質生産および分解速度)、物理的パラメーター(例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、PTT.T、またはTT)および細胞アッセイ(例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力)が使用され得る。
【0107】
本発明の動物および細胞は、標的遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。
【0108】
本発明はまた、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【0109】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム(例えば、「分散分析」またはANOVAなど)を使用して実施され得る。約0.05以下の「p」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いp値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物(またはその群)の挙動と野生型マウス(またはその群)の挙動を、典型的にはある定められた条件下に比較を行う。本明細書中に使用されるように、「異常な行動」とは、標的遺伝子に破壊を有しない動物(例えば野生型マウス)と異なる、標的遺伝子に破壊を有する動物(例えばトランスジェニック動物)によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定(または観察)および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る(例えば、CrawleyおよびPaylor,Hormones and Behavior 31:197−211(1997)を参照のこと)。
【0111】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを暴露することを含む。動物の社会的挙動(例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾)が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る(例えば、S.E.File,et al.,Pharmacol.Bioch.Behav.22:941−944(1985);R.R.Holson,Phys.Behav.37:239−247(1986)参照)。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【0112】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚(通常、聴覚性)刺激に暴露し、動物の驚愕反応を測定することを含む(例えば、M.A.Geyer,et al.,Brain Res.Bull.25:485−498(1990);PaylorおよびCrawley,Psychopharmacology 132:169−180(1997)参照)。(正常な驚愕反応からの)抑制パーセントは驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える(cueing)」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた使用され得る。
【0113】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への暴露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、G.J.Kant,et al.,Pharm.Bioch.Behav.20:793−797(1984);N.J.Leidenheimer,et al.,Pharmacol.Bioch.Behav.30:351−355(1988)参照)。
【0114】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ/または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である(例えば、M.Bertolucci D’Angic,et al.,Neurochem.55:1208−1214(1990)参照)。
【0115】
新規の試験は、通常、新奇な環境および/または新奇な対象への暴露を含む。新奇な環境および/または新奇な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される(例えば、D.K.Reinstein,et al.,Pharm.Bioch.Behav.17:193−202(1982);B.Poucet,Behav.Neurosci.103:1009−10016(1989);R.R.Holson,et al.,Phys.Behav.37:231−238(1986)を参照のこと)。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【0116】
学習された無力(helplessness)試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への暴露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る(例えば、A.Leshner,et al.,Behav.Neural Biol.26:497−501(1979)参照)。
【0117】
また、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると信じられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると信じられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先たってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させると研究が示している。
【0118】
モーリス水迷路試験(Morris water−maze test)は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、E.M.Spruijt,et al.,Brain Res.527:192−197(1990)を参照のこと)。
【0119】
また、Y字型迷路が使用され得る(例えば、McFarland,D.J.,Pharmacology,Biochemistry and Behavior 32:723−726(1989);Dellu,F.,et al.,Neurobiology of Learning and Memory 73:31−48(2000)を参照のこと)。Y迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Y迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約40cm×8cm×20cmであり得る。各アームは例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた16のフォトビームも有することができる。少なくとも2種の異なった試験がこのようなY迷路を使用して実施され得る。連続Y迷路パラダイムでは、マウスに例えば約10分間、Y迷路の3つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は動物が2回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的(egocentrically)に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。2つの試験的Y迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新奇性および空間記憶に対する反応を測定する。第1の試験(取得)中、動物は、例えば約15分間、自由にY迷路の2つのアームを訪問し得る。第3のアームはこの試験中、遮蔽されている。第2の試験(回復)は例えば約2時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約5分間、3つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の3つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり(cue)に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を仲介するその遺伝子の役割を示し得る。
【0120】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には2つ以上の環境への暴露を含み、そのうちの1つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む(例えば、R.Ader,et al.,Psychon.Sci.26:125−128(1972);R.R.Holson,Phys.Behav.37:221−230(1986)参照)。また、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、2つの開放および2つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約5分間、探索させる。このパラダイムは、ゲッ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安の程度を測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【0121】
食物回避試験は、新しい食物への暴露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、B.A.Campbell,et al.,J.Comp.Physiol.Psychol.67:15−22(1969)を参照のこと)。
【0122】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に暴露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、H.A.Baldwin,et al.,Brain Res.Bull,20:603−606(1988)参照)。
【0123】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤(例えば、アンフェタミン、コカイン、PCPなど)の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.B.S.Clarke,et al.,Psychopharmacology 96:511−520(1988);P. Kuczenski,et al.,J.Neuroscience11:2703−2712(1991)を参照のこと)。
【0124】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および/または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される(例えば、S.Nassif,et al.,Brain Res.,332:247−257(1985);W.L.Isaac,et al.,Behav.Neurosci.103:345−355(1989)参照)。
【0125】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、L.E.Jarrard,et al.,Exp.Brain Res.61:519−530(1986)参照)。
【0126】
DRL(低反応率分化強化)実施試験は間欠的報酬パラダイムに暴露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、J.D.Sinden,et al.,Behav.Neurosci.100:320−329(1986);V.Nalwa,et al.,Behav.Brain Res.17:73−76(1985);およびA.J.Nomneman,et al.,J.Comp.Physiol.Psych.95:588−602(1981)を参照のこと)。
【0127】
空間学習試験は、複雑で新奇の環境に暴露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、N.Pitsikas,et al.,Pharm.Bioch.Behav.38:931−934(1991);B.poucet,etal.,Brain Res.37:269−280(1990);D.Christie,etal.,Brain Res.37:263−268(1990);およびF.Van Haaren,et al.,Behav.Neurosci.102:481−488(1988)を参照のこと)。また、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド(of)試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な(すなわち心配性でない)マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【0128】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に暴露し、例えば環境に適応する(orienting)反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、J.M.Vargo.et al.,Exp.Neurol.102:199−209(1988)を参照のこと)。
【0129】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験(例えば、P.J.Fletcherら、Psychopharmacol.102:301−308(1990);M.G.Cordaら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:2072−2076(1983)参照)を使用して統計的に解析される。
【0130】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。1つまたは2つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約5〜10分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間(対象物への接近、例えば約3〜5cm以内での動きが対象物の探索とみなされる)が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新奇な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新奇な対象物を探索することに費やす時間の割合(再び、約5〜10分間の時間をかけて)が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新奇な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物(好ましくは単純なブロック)がスプレーされるか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ、新奇な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新奇恐怖症(neophobia)を示す。
【0131】
熱板痛覚脱失試験(hot plate analgesia test)は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約55℃の熱板上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間(例えば、後足を持ち上げて後足をなめる時間)が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【0132】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調および平衡を測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル(または回転丸太)のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約60rpmの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低20分間あけて少なくとも3回、試験される。もっとも長くロッド上に留まることができるマウスはより良好な協調および平衡を有すると考えられる。
【0133】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール5mg/ml溶液は、例えば、約0.375ml/分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。4つの区別される生理学的段階が記録され得る:注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展(tonic extension)」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【0134】
(標的遺伝子産物)
本発明はさらに、標的遺伝子産物を生産するための標的遺伝子配列の使用を意図する。標的遺伝子産物は、機能的に等価な遺伝子産物を代表するタンパク質を含み得る。このような等価遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これはサイレント変化を生じ、したがって機能的に等価な標的遺伝子産物を生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性の性質の類似性に基づいて作製され得る。
【0135】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ;極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ;そして負に荷電した(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書中に使用されるよ場合、「機能的に等価である」とは、標的遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に同様なインビボ活性を示すことができるタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価である」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分が行う方法と実質的に同様な方法で他の細胞内分子または細胞外分子と相互作用することができるペプチドをいう場合がある。
【0136】
本発明の方法により有用である他のタンパク質産物は、組換えまたは合成手段で生産された標的遺伝子から誘導されるか、あるいはこれに基づくペプチド(誘導ペプチド)である。
【0137】
標的遺伝子産物は、当該技術分野で周知である技術を使用して、組換えDNA技術によって生産され得る。したがって、遺伝子配列をコードする核酸を発現して本発明の遺伝子のポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。当業者に周知である方法は、タンパク質コード遺伝子配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には例えばインビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる(例えば、Sambrookら、1989(上掲)およびAusubelら、1989(上掲)参照)。あるいは、タンパク質の遺伝子配列をコードすることができるRNAは、例えば自動合成器(例えば、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Gait,M.J.編、IRL Press,Oxford(1984)参照)を使用して化学的に合成され得る。
【0138】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列を発現するために使用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が生産され、続いて精製され得る媒体を示すが、適切な配列をコードするヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明の遺伝子のタンパク質を示し得る細胞も示すことができる。これらには、タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、S.subtilis)などの微生物;タンパク質コード遺伝子配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia;タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染されるか、あるいはタンパク質コード遺伝子配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換される植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0139】
細菌系では、多くの発現ベクターは、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、たとえば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、E.coli発現ベクターpUR278(このベクターにおいて、タンパク質コード遺伝子配列は、融合タンパク質が生産されるように、lacZコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結される)(Rutherら、EMBO J.、2:1791−94(1983));pINベクター(Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.、13:3101−09(1985);Van Heekeら、J.Biol.Chem.、264:5503−9(1989))などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)を用いて外来ポリペプチドを融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、結果として、クローン化された標的遺伝子タンパク質がGST部分から放出され得る。
【0140】
好ましい実施形態では、完全長のcDNA配列が、標準的PCR方法論(Innisら(編)、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press、San Diego (1990))を使用してアミノ末端でインフレームBamHI部位に、そしてカルボキシ末端でインフレームEcoRI部位に付加され、pGEX−2TKベクター(Pharmacia、Uppsala、Sweden)中に連結される。得られたcDNA構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンS−トランスフェラーゼ配列を含む(Nilssonら、EMBO J.、4:1075−80(1985);Zabeauら、EMBO J.、1:1217−24(1982))。
【0141】
昆虫系では、Autographa californica核多角体ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置かれ得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖性組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性被覆を欠くウイルス)の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞を感染するために使用される(例えば、Smithら、J.Virol.46:584−93(1983);米国特許第4,745,051号参照)。
【0142】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用される。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、対象の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列)に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子はインビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)での挿入は、生存可能かつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質発現が可能な組換えウイルスを生じる(例えば、Loganら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、81:3655−59(1984)参照)。特異の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームを有する相(phase)中になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源(天然および合成の両方)のものであり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入(inclusion)によって増強される(Bitterら、Methods in Enzymol.、153:516−44(1987)参照)。
【0143】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)はタンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0144】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が操作される。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現調節因子(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択可能マーカーで形質転換され得る。外来DNAの導入後に操作された細胞は富化培地中で1〜2日間、増殖させられ、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは選択に対して耐性を与え、その染色体中にプラスミドを安定して組み込み、そして増殖する細胞が、次々にクローン化され、細胞株において広がり得る病巣を形成させる。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【0145】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および/または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソンおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス性、特にHIVプロモーターなどの特定転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。1つの実施形態では、Tet誘導性遺伝子発現系が使用される(Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547−51(1992);Gossenら、Science、268:1766−69 (1995))。Tet発現系は、E.coliTn10トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の2つの調節エレメント(テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)およびTetRに結合するテトラサイクリンオペレーター配列(tetO))に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はtetOオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同じにトランスフェクトされたTetRの存在下で、組換えタンパク質の発現はtetO調節エレメントへのTetRタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルで調節された遺伝子発現はTetRに結合するためのtetOエレメントと競合するテトラサイクリン(Tc)またはドキシサイクリン(Dox)などのTc誘導体の濃度を変化させることに応答して誘導され得る。tet誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、CLONTECH Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA.から市販されている。
【0146】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。125Iなどの放射性同位元素;基質に暴露されたときに検出可能な発色性シグナルまたは光を発生する酵素標識系;および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えDNA技術がこのようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定化および/または検出を容易にすることができる融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【0147】
間接的標識は遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質(標識抗体など)の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、1本鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0148】
(抗体の生成)
1つまたは複数のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が本明細書に記載される。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化抗体またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の標的遺伝子の検出に、あるいは、異常な標的遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は疾患治療方法の一部として使用してもよく、そして/または診断技術の一部として使用してもよい。その際、患者は標的遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【0149】
抗体の生産について、種々の宿主動物は標的遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントは宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバンドとして、フロイント(完全または不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル(mineral gel)、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびBCG(bacille Calmette−Guerin)および(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0150】
ポリクローナル抗体は標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来抗体分子の異種の集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物は、上記したようなアジュバントを補充された遺伝子産物を注射することにより免疫化され得る。
【0151】
特定の抗原に対する抗体の同種の集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供するための任意の技術によって得られ得る。これらは、KohlerおよびMilstein、Nature、256:495−7(1975);および米国特許第4,376,110号のハイブリドーマ技術、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today、4:72(1983);Coteら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:2026−30(1983))およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、in Monoclonal Anitbodies And Cancer Therapy、Alan R. Liss,Inc.New York、77−96頁(1985))が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびこれらの任意サブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明のmAbを生成するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のmAbの生産が、これを現時点での好ましい生産方法とする。
【0152】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Takedaら、Nature、314:452−54(1985))が使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子(例えば、ネズミmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子)である。
【0153】
また、1本鎖抗体の生産について記載される技術(米国特許第4,946,778号;Bird、Science 242:423−26(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879−83(1988);およびWardら、Nature、334:544−46(1989))は、遺伝子1本鎖抗体を生成するために適用され得る。1本鎖抗体はアミノ酸架橋によってFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、1本鎖ポリペプチドを生じる。
【0154】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知技術によって生成され得る。このようなフラグメントとしては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を低下させることによって生成され得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Fab発現ライブラリーが構築され得(Huse, et al., Science, 246: 1275−81 (1989))、所望な特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【0155】
(治療薬剤のスクリーニング)
標的遺伝子配列を含み、かつ発現する細胞は、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、U937(ATCC#CRL−1593)、THP−1(ATCC#TIB−202)、およびP388D1(ATCC#TIB−63)などの非組換え単球細胞株、HUVECなどの内皮細胞およびウシ大動脈内皮細胞(BAEC);ならびにHeLa細胞およびCOS細胞(例えば、COS−7(ATCC#CRL−1651))などの一般的な哺乳動物細胞系が挙げられ得る。さらに、このような細胞としては組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のノックアウトマウスは疾患に関与する1以上の細胞型を含む細胞株を生成するために使用され得る。これはその障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物は使用され得るが、連続的な細胞株の生成が好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Smallら、Mol Cell Biol.、5:642−48(1985)を参照のこと。
【0156】
標的遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験がなくても利用され得る。標的遺伝子配列はまた破壊されるかあるいは過少発現され得る。標的遺伝子破壊または過少発現された標的遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に寄与する機能の任意の欠失を代償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。
【0157】
インビトロ系は標的遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するために設計され得る。このような化合物としては、D−および/またはL−立体配置アミノ酸から作られたペプチド(例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態;例えば、Lamら、Nature、354:82−4(1991)参照)、ホスホペプチド(例えば、無作為にまたは部分的に縮重した、指向されたホスホペプチドライブラリーの形態;例えば、Songyangら、Cell、72:767−78 (1993)参照)、抗体、および有機または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、標的遺伝子タンパク質、好ましくは変異標的遺伝子タンパク質の活性を調節すること;標的遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成すること;または正常な標的遺伝子相互作用を破壊するか、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて有用であり得る。
【0158】
標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、2つの化合物が相互作用および結合することを可能にするために充分な条件下で十分な時間、標的遺伝子タンパクと試験化合物の反応混合物を調製し、反応混合物から取り除かれ、そして/または検出され得る複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う1つの方法は、固相上に標的遺伝子タンパク質または試験物質を付着する工程、および反応の最後に固相上に付着させた標的タンパク質/試験物質複合体を検出する工程を包含する。このような方法の1つの実施形態では、標的遺伝子タンパク質は固体表面上に付着され得、そして付着されない試験化合物が直接的または間接的にのいずれかで標識され得る。
【0159】
実際には、マイクロタイタープレートが便宜的に使用される。付着された成分は非共有または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は単にタンパク質溶液で固体表面を被覆し、乾燥することによって達成され得る。あるいは、固定化抗体、好ましくはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を付着するために使用され得る。その表面は予め調製され、かつ貯蔵されていてもよい。
【0160】
アッセイを実施するために、固定化されなかった成分は、付着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下に除去(例えば、水洗)される。固体表面上に付着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。既に固定化されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。前に固体化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が表面上に付着された複合体を検出するために、使用され得る;例えば、前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体(順次、標識された抗−Ig抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る抗体)を使用する。
【0161】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体は、例えば、標的遺伝子産物に特異的な固定化抗体または溶液中に形成された任意の複合体を付着する試験化合物、および付着された複合体を検出するために可能性ある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して検出される。
【0162】
上記された方法の1つによって特定の標識遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力について試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび/またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【0163】
(アンチセンス、リボザイム、および抗体)
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、標的遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異標的遺伝子活性を低下または阻害する薬剤は、疾患症状を回復させるために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重螺旋分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【0164】
アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズし、かつタンパク質翻訳を阻害することにより、mRNAの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンスDNAに関して、翻訳開始部位、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【0165】
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒することが可能な酵素的RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断(endonucleolytic cleavage)を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子mRNAに対して相補的な1以上の配列を含まなければならず、そしてmRNA切断に起因する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列としては、米国特許第5,093,246号を参照のこと(その全体が本明細書中に参考として援用される)。本発明の範囲内で、標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒するハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が操作される。
【0166】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は最初、以下の配列、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位のための目的の分子をスキャニングすることにより同定される。一旦、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20の間のリボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を所望のものでなくし得る、二次構造などの予想される構造的特徴について評価され得る。候補配列の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためのそれらの接触性を試験することにより評価され得る。
【0167】
転写の阻害のための三重螺旋形成に使用される核酸分子は1本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Hoogsteen型塩基対の法則によって三重螺旋形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長(stretch)を必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重螺旋の3本の関連した鎖にわたってTATおよびCGCトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。ピリミジンに富む分子は、その鎖に平行に配向した二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域に相補的である塩基を提供する。さらに、例えばG残基の伸長を含む、プリンに富む核酸分子が選択され得る。これらの分子は、GC対に富むDNA二重鎖とともに三重螺旋を形成する。そこでは、大多数のプリン残基は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に配置され、三重鎖の3本鎖にわたりGGCトリプレットを生じる。
【0168】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化することができる潜在的配列は、「スイッチバック」核酸分子と呼ばれるものを作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長の必要性を排除するように、交互5’−3’、3’−5’様式で合成される。
【0169】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび/または三重螺旋分子は、正常および変異標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるmRNAの転写(三重螺旋)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低減あるいは阻止し得る。標的遺伝子活性の十分に正常な程度が維持されることを確証するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性を有する配列を含まない細胞中へ導入され得る。また、細胞または組織の標的遺伝子活性の必須の程度を維持するために、細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合もある。
【0170】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重螺旋分子はDNAおよびRNA分子の合成に関する当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート(phosphoramidate)化学合成法など、当該技術分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。またはRNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入される。また、使用されるプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導可能にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞系中に安定して導入され得る。
【0171】
DNA分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入される。可能性ある修飾としては、分子の5’および3’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの主鎖内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは2’O−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【0172】
標的遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異標的遺伝子機能を阻止するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自身に対して、またはタンパク質一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、1本鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0173】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ全抗体が使用される例では、抗体を内在化させることが好ましい場合がある。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、細胞中へ標的遺伝子エピトープに結合する抗体またはFab領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または広がった標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成されるか、あるいは組換えDNA技術により生産され得る(例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles (1984) W.H. Freeman, New York 1983, 前出;およびSambrookら、 1989,前出、参照)。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する1本鎖中和抗体も投与され得る。このような1本鎖抗体は、例えばMarascoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889−93 (1993)に記載される技術などを使用することにより、例えば、標的細胞集団内の1本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することで投与され得る。
【0174】
標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列は、疾患症状が改善されるような、ある程度の標的遺伝子タンパク質の生産に十分である濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与される。患者は遺伝子置換治療法で治療されてもよい。正常な標的遺伝子の1つまたは複数の複製物、または標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入される。ベクターとしては、リポソームなどの細胞中にDNAを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な標的遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【0175】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な標的遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者の中に導入されるかあるいは再導入され得る。
【0176】
(薬学的組成物、有効量、および投与経路)
標的変異体遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を治療または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【0177】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、LD50(集団の50%の致死量)およびED50(集団の50%の治療的有効量)を測定することについて、細胞培養物または実験動物の標準的な薬学的方法により決定され得る。毒性と治療的効果との用量割合は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用される間は、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へのこのような化合物を標的とする送達系を設計するように注意すべきである。
【0178】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方することに使用され得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないED50を含む循環濃度範囲内にある。この用量は使用される投与形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなIC50(すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方される。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【0179】
本発明により使用するための薬学的組成物は、1つまたは複数の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。したがって、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気(口または鼻のいずれかから)、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方される。また、薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも考えられる。
【0180】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤(例えば、前糊化(pregelatinised)トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸塩ナトリウムスターチ(sodium starch glycolate));または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態(例えば錠剤またはカプセル)をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適した媒体を用いて構成する乾燥製品として存在してもよい。このような液体調製剤は懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水溶性媒体(例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などの薬学的に受容可能な添加剤を使用する従来の手段によって調製され得る。この調製剤はまた、適切に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含む。
【0181】
経口投与の場合の調製剤は、活性化合物を制御して放出させるように適切に処方され得る。
【0182】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【0183】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー形態で便宜的に送達される。加圧エアゾールの場合には、用量単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入または通気に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基材との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【0184】
この化合物は注射、例えば、一回大量注入(bolus injection)または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、単位用量形態、例えば添加された保存剤とともにアンプルまたは多用量容器に入れられ得る。この組成物は懸濁液、溶液、または油性または水性媒体中の乳化液のような形態をとることができ、懸濁、安定化および/または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。また、活性成分は使用前に適切な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【0185】
この化合物はまた、例えば、ココア脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基材を含む座薬または保持性浣腸(retention enemas)などの直腸用組成物として処方される。経口摂取はおそらく、いなかる投薬の中で最も容易な方法である。このような投与経路は一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これはタンパク質および他の生物学的活性組成物を含む多くの物質には好ましくない環境である胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性およびタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口から摂取した場合、広範囲に多様な生物学的活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかのものが胃を通過して、小腸で体内に吸収されることは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤はしばしば皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口などの他の方法で摂取されなければならない。
【0186】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液(例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩)、可溶化剤(例えば、ツィーン(Tween)、ポリソルベート)、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤(チメロサール、ベンジルアルコール)およびアスコルビン酸などの抗酸化剤を含み得る。安定化剤はTween−20、Tween−80、NP−40またはTritonX−100などの界面活性剤であり得る。EBPはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の微粒子調製物中に導入され得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な検索は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th(編)、 A.R. Gennaro(編)、 Mack Publishing, Easton, Pa (1990)に見られる。
【0187】
先に記載した処方剤のほかに、化合物はまたデポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方剤は移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、化合物は適切な高分子または疎水性物質(例えば、受容可能な油中の乳化剤として)またはイオン交換樹脂とともに処方されるか、または難溶解性誘導体として(例えば、難溶解性塩として)処方され得る。
【0188】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む1つまたは複数の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れられていてもよい。このパックは例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は投与のための指示書が添付されていてもよい。
【0189】
(診断薬)
標的遺伝子に関連した疾患症状を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的に、試薬が、例えば標的遺伝子変異の存在を検出するために、あるいは標的遺伝子mRNAの過剰発現(over expression)または不完全な発現(under expression)のいずれかを検出するために使用される。
【0190】
本発明の診断および予後判定(prognostic)方法によれば、野生型標的遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法はまた、野生型標的遺伝子座を検出し、疾病素因または新形成の欠如を確認することによって実施され得る。「野生型遺伝子の変化」はコードまたは非コード領域の欠失、挿入および点変異を含む変異のすべての形態を包含する。欠失は全遺伝子または遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異はある組織(例えば腫瘍組織)にだけ生じるものであり、生殖系列に遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され、遺伝され得る。ただ1つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかしながら、もしも両方の対立遺伝子が変異されるなら、そのときは、後期新形成状態が示される。したがって、遺伝子変異の発見は診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない標的遺伝子対立遺伝子(例えば、標的遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる)は、挿入、小欠失および点変異などの他の変異のためにスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見られる変異は、標的遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異はまた、癌状態にも関連し得る。点変異事象は、mRNAの発現の損失または減少をもたらす遺伝子のプロモーター中などの調節領域中で生じ得る。点変異はまた、標的遺伝子産物の発現の損失をもたらすか、あるいはmRNAの安定性または翻訳効率の減少をもたらす適切なRNAプロセッシングを無効とする。
【0191】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な1つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接に比較することである。また、例えばPCRによって増幅後、メッセンジャーRNAを配列決定し、それによって候補遺伝子のエクソン構造を決定する必要性を排除することができる。標的遺伝子のコード領域の外側に起こる(fall)癌患者の変異は、標的遺伝子の近くまたはその中のイントロンおよび調節配列などの非コード領域を試験することにより検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさのまたは多量のメッセンジャーRNA分子を明らかにするノザンブロット実験から判明し得る。
【0192】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含むプレパックされた診断キットを使用して実施され得る。これは、例えば、疾患症状を示すか、あるいは疾患が進展する危険性のある患者を診断する臨床設定において便宜的に使用される。
【0193】
遺伝子が発現されるいかなる細胞型または組織、好ましくは単球、内皮細胞または平滑筋細胞も、以下に記載される診断において使用される。
【0194】
分析される細胞型または組織から得たDNAまたはRNAは、当該技術分野で周知である方法を使用して容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片(固定および/または凍結されている)上で、直接にインサイチュー(in situ)にて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュー手法のためのプローブおよび/またはプライマーとして使用され得る(例えば、Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Raven Press, N.Y. (1992)を参照)。
【0195】
遺伝子ヌクレオチド配列、RNAまたはDNAのいずれかは、例えば、疾患関連遺伝子構造および発現を検出するために生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。このようなアッセイとしては、サザンまたはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、1本鎖配座多型分析、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子発現パターンの定量的態様、ならびに遺伝子発現および/または遺伝子組成物の定性的態様の両方を明らかにし得る。すなわち、このような態様としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配列、および/または遺伝子発現の活性化または不活性化が挙げられ得る。
【0196】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、1つまたは複数の標識された核酸試薬と、分析される細胞型または組織から誘導された核酸を、対象の核酸分子内のその相補的配列に、これらの試薬を特異的アニーリングするために好ましい条件下で、接触およびインキュベートすることを含む。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールされない核酸は、核酸:フィンガープリント分子ハイブリッドから除去される。ハイブリダイズしたフィンガープリント組織から得た核酸の存在は、このような分子が存在する場合に検出される。このような検出スキームを使用して、対象の組織または細胞型から得た核酸は、例えば、膜などの固体支持体、またはマイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズなどのプラスチック表面などに固定化される。この場合、インキュベーション後、アニールされない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールされた標識核酸試薬の検出は、当該技術分野で周知である標準的技術を使用して達成される。
【0197】
遺伝子特異的核酸分子の検出に関する別の診断方法は、その増幅、例えばPCR(Mullis米国特許第4,683,202号(1987)に記載の実験の実施形態)、リガーゼ連鎖反応(Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189−93 (1991))、自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelliら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874−78 (1990))、転写増幅システム(Kwohら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173−77 (1989))、Qβレプリカーゼ(Lizardiら、 Bio/Technology, 6: 1197 (1988))、または他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知である技術を使用して増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合に、核酸分子の検出のために特に有用である。
【0198】
このような検出スキームの1つの実施形態では、cDNA分子が対象のRNA分子から(例えば、cDNAへのRNA分子の逆転写によって)得られる。このようなRNAが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および/または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、cDNA内の配列が、PCR増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬(例えば、プライマー)として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出には、核酸増幅が放射性または非放射性標識ヌクレオチドを使用して実施され得る。また、充分に増幅された産物は、この産物が標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【0199】
野生型または変異遺伝子ペプチドに対する抗体はまた、疾患診断薬または予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現の程度の異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および/または組織、細胞内、または細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に関連する変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられる。
【0200】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない、当業者に周知である技術を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、Sambrookら、 (1989)前出、18章を参照されたい。本明細書で使用されるタンパク質検出および単離方法はまた、例えばHarlow および Lane(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988))に記載されるものなどである。
【0201】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【0202】
例えば、本発明で有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用される。これは、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出法と組み合わせて蛍光標識抗体(以下を参照)を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に特に好ましい。
【0203】
本発明で有用である抗体(またはそのフラグメント)は、さらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュー検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法で組織学的に使用され得る。インサイチュー検出は患者から組織学的検体を取り出し、その検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成される。抗体(またはフラグメント)は、好ましくは生物学的試料上に標識抗体(またはフラグメント)を上に重ねることにより適用される。このような方法の使用によって、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみならず、試験された組織中のその分布を決定することも可能である。本発明を使用して、このようなインサイチュー検出を達成するために、当業者は、広範囲の組織学的方法(染色方法など)のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。
【0204】
野生型、変異体または広がったフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定可能な検出可能に標識された抗体の存在下に、生物学的流体、組織抽出物、新鮮な収穫細胞、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的試料をインキュベートし、当該技術分野で周知である多くの技術のいずれかによって、結合された抗体を検出することを含む。
【0205】
生物学的試料が、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化可能なニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリア、または他の固体支持体上に接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体を適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理し得る。次いで、固相支持体を2回目の緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去する。次いで、固相支持体上の結合標識の量を従来の手段で検出し得る。
【0206】
「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合可能ないかなる支持体をも意図するものである。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的において、ある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合された分子が抗原または抗体に結合可能なかぎり、実質的にいかなる可能性のある構造的立体配置を有していてもよい。したがって、支持体の立体配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面のような円筒状、または棒状体の外表面であってもよい。また、その表面はシート、試験片などのように平らであってもよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適したキャリアを知っているか、また、日常の実験を使用することによりこれを確証できるであろう。
【0207】
所定の多数の(a given lot of)抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知方法によって測定され得る。当業者は日常の実験を使用することにより各測定のための操作的および最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【0208】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の1つは、酵素にこれを連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ(EIA)にこれを使用することである(Voller, Ric Clin Lab, 8: 289−98 (1978)[“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”, Diagnostic Horizons 2: 1−7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.]; Vollerら、 J. Clin. Pathol., 31: 507−20 (1978); Butler, Meth. Enzymol., 73: 482−523 (1981); Maggio(編)、 Enzyme Immunoassay, CRC Press. Boca Raton, Fla. (1980); Ishikawaら(編)、 Enzyme Immunoassay, Igaku−Shoin, Tokyo (1981))。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分(moiety)を製造するような方法で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する発色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較される基質の酵素反応の程度を可視的に比較して達成され得る。
【0209】
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用により、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または広がったペプチドを検出することができる(例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Scociety, March, 1986)。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【0210】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に暴露されると、次いで、その存在が蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、蛍光性イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【0211】
抗体はまた、152Euなどの蛍光放出金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン−テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【0212】
抗体はまた、化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の進行中に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光性標識合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【0213】
同様に、生物発光性化合物が本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の一種である。生物発光性タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0214】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許公報は、確認する引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する先行技術の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【0215】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、主題である発明を限定するように解釈されるべきでない。
【0216】
(実施例)
(実施例1:プラスミドライブラリーからの直接構築物構築)
ラムダZAPTM系を使用するゲノムライブラリーは、以下のようにして調製された。胚性幹細胞は100mm組織培養プレート中で成長させた。高分子量ゲノムDNAは、胚性幹細胞の集密的な100mmプレートに5mlの溶解緩衝液(トリス−HCl(pH7.5)10mM、EDTA(pH8.0)10mM、NaCl 10mM、0.5%SDS、および1mg/mlプロティナーゼK)を添加してこれらのES細胞から単離した。次いで、これらの細胞を60℃で数時間、または完全に可溶化されるまでイキュベートした。ゲノムDNAは、穏やかなフェノール:クロロホルム抽出を数回行い、次いでエタノール沈殿を行って溶解細胞から精製した。
【0217】
ゲノムDNAを、制限酵素Sau3AIを使用して部分的に消化して、約5〜20kbのフラグメントを生成した。これらのフラグメントの末端を、Klenow DNAポリメラーゼの存在下にてdATPおよびdGTPの添加によって部分的に充填して、ゲノムフラグメントに不適合性末端を作製した。次いで、5kbと10kbとの間の大きさのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動(1×TAE、0.8%ゲル)によって精製した。次いで、このDNAを、QIAquick gel抽出キット(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)を使用して、切除されたアガロース片から単離した。
【0218】
ゲノムフラグメントを、XhoIで切断され、かつdTTP、dCTPおよびKlenow DNAポリメラーゼを使用して部分的に充填されているλZapTMIIベクター(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)中に連結させた。連結後、DNAは、λ packaging mix(Gigapack III gold,Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)を使用してパッケージングして、力価を測定した。
【0219】
環状ファージミドDNAを、M13ヘルパーファージである、ExAssist(Stratagene,Inc.,)の存在下にて適切な細菌株(XL−1 Blue MRF1、Stratagene,Inc.)でλクローンを増殖させることによって、λライブラリーから誘導した。具体的には、約100,000個のλクローンを10〜100倍過剰の細菌およびヘルパーファージの両方とともに37℃で20分間、インキュベートした。1mlのLB培地と10mM MgSO4を、各切除反応へ添加し、37℃で一晩、攪拌下にてインキュベートした。通常、24〜96のこれらの反応を、96ウェルのディープウェルブロックに同時に準備した。翌朝、このブロックを、65℃まで15分間加熱し、細菌およびλファージの両方を死滅させた。細菌残骸を、約3000gで15分間の遠心分離によって除去した。環状ファージミドDNAを含む上清を残し、そして.プラスミドPCRに直接使用した。
【0220】
上記されたファージミドDNAのプールを、長距離(long−range)PCR、および公知配列(図1に示される)に基づき上記したように選択された「外方向に向かう(outward pointing)」オリゴを使用して、目的の特定遺伝子についてスクリーニングした。PCR反応液は、2μlのプールファージミドDNAサンプル、3μlの10×PCR緩衝液3(Boehringer Mannheim)、1.1μlの10mM dNTP、50nMのプライマー、0.3μlのEXPAND Long Template PCR Enzyme Mix(Boehringer−Mannheim)および30μlのH2Oを含む。サイクリング条件は94℃で2分間(1サイクル)、94℃で10秒間、65℃で30秒間、68℃で15秒間(15サイクル);94℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で15秒間およびさらなる各サイクル(25サイクル)毎に20秒間の増加;68℃で7分間(1サイクル)そして4℃で保持した。
【0221】
PCR反応産物を、1×TAE緩衝液を含むアガロースゲルを介する電気泳動により分離し、臭化エチジウムおよびUV光で可視化した。首尾よい長距離PCRを示す大きなフラグメントをいずれもゲルから切除し、そしてQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製した。
【0222】
PCRフラグメントを制限マッピングする必要性を除くために、次の連結非依存性クローニング戦略を使用した。目的の長距離PCRフラグメントを、QIAquickPCR精製キット(Qiagen,Inc.,Santa Clarita,California)を使用して、「精製」した。PCRフラグメントの1本鎖末端を、0.1〜2μgのフラグメント、2μlのNEB(New England BioLabs)緩衝液4;1μlの2mM dTTP、6単位のT4DNAポリメラーゼ(NEB)、H2Oを混合して、全容量20μlとして、25℃で30分間、インキュベートすることにより生成した。ポリメラーゼを、75℃で20分間の加熱によって不活性化した。1本鎖末端をまた、独特な制限酵素部位で、SacIおよびSacIIを使用してプラスミドベクターpDG2(図2Aに示されるpDG2)を消化し、上記のようにT4DNAポリメラーゼで各反応物を処理することによって、NeOr選択マーカーフラグメント上に作製した。図1に示されるベクターを、長距離PCRフラグメント上のものと相補的な1本鎖末端を使用して調製した。
【0223】
次いで、ベクターとフラグメントを、2工程クローニング戦略または四方向1工程プロトコールのいずれかを使用して構築物中へアセンブリした。簡単には、10ngのT4処理Neorカセット、1μlのT4処理PCRフラグメント、0.2μlの0.5M EDTA、0.3μlの0.5M NaClおよび4μlまでのH2Oを含む反応物を、65℃まで加熱し、約45分かけて室温にまで冷却させた。次いで、この混合物を、サブクローニングに効率的なDH5−αコンピテント細胞中に形質転換した。
【0224】
(実施例2:ファージライブラリーからの構築物の生成)
マウス胚性幹細胞ライブラリーを、以下のようにλファージ中で調製した。ゲノムライブラリーを、Sau3AI部位でのDNAの部分的切断によってゲノムDNAから構築し、長さ約20kbのゲノムフラグメントを得た。これらのDNAフラグメントの末端配列を、dGTPおよびdATPの存在下にてKlenow酵素を使用して部分的に充填し、そのフラグメントを、dTTPおよびdCTPの存在下にてKlenowを使用して部分的に充填されている適切なλクローニングベクター、例えばλFixII(Stratagene,Inc.,La Jolla,California)のXhoI部位中にT4DNAリガーゼを使用して連結させた。代替的に、部分的に消化させたゲノムDNAを、蔗糖勾配および選択される約20kbの配列を使用してサイズ選択した。富化された画分を、BamHI切断λベクター、例えば、λ Datsh II(Stratagene,Inc.,La Jolla,California)中へクローン化した。
【0225】
このライブラリーを、各プレートが約1,000個のクローンを含む1,152のプレート上に平板培養した。したがって、全部で1.1百万個のクローン(8ゲノムに等しい)を平板培養した。
【0226】
ファージを、各プレートへ4mlのλ溶出緩衝液(10mM MgCl2、10mM Tris(pH8.0))を添加して、室温で3〜5時間インキュベートすることにより各プレートから溶出した。インキュベーション後、2mlの緩衝液を各プレートから収集して、96ディープウェルプレート(Costar,In.)の1つのウェルの中に置いた。12個の96ウェルプレートを充填し、「サブプール(sub−pool)ライブラリー」と呼んだ。
【0227】
サブプールライブラリーを使用して、「プールライブラリー」を、新規な96ウェルプレートの1つのウェルの中に12の異なったサブプールウェルの100μlを置くことによって作製した。12個のサブプールプレートを組み合わせて1つのプレートのプールライブラリーを形成した。
【0228】
目的の遺伝子をPCR増幅することが知られている1対のオリゴヌクレオチドを使用して、「大きなプール(large−pool)ライブラリー」の96プールからの上清を増幅した。PCRはを、0.5単位のAmplitaq GoldTM(Perkin Elmer)、1μMの各オリゴヌクレオチド、200μM dNTP、2μlのプール(またはサブプール)上清の1〜5倍希釈物、50mM KCl、100mM Tris−HCl(pH8.3)、および1.5mMまたは1.25mMのいずれかのMgCl2の存在下にて実施した。サイクリング条件は、95℃で8分間(1サイクル);95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で45秒間(55サイクル)、72℃で7分間(1サイクル)そして4℃で保持した。遺伝子に依存して、実施例1に記載されるアガロースゲル上で同定した場合にポジティブシグナルが約3および12プールの間で産生した。さらに精製が必要な場合(すなわち、明瞭なシグナルが増幅後に存在しない場合)、プールを作る12のサブプールを、同じプライマーを使用する増幅に供し、1つのサブプール(1000クローン)を同定した。
【0229】
(フランキングフラグメントの生成)
上記されたように、ノックアウト構築物は、ポジティブ選択マーカーに隣接する標的遺伝子に対して相同であるDNA配列の2つのブロックを含む。長距離PCRを、実施例2に上記したようにしてポジティブに同定されたλクローンのプールから実施した。各フラグメントを、1つの型の塩基を欠き、かつベクター上の所定の配列に相補的である所定の配列を有する1対のオリゴヌクレオチドを使用して生成した。得られたフラグメントは1kbと5kbとの間であった。5kbより長い第3のフラグメントも、適切なオリゴヌクレオチドを使用して生成する。次いで、この第3のフラグメントを、ノックアウトされる遺伝子の近くであるが、ベクターの外側にあるDNA配列を得るために使用した。
【0230】
(実施例3:2工程クローニング−一般的方法)
pDG2プラスミドベクター(図2A)は、独特な制限部位SacIIおよびSacIを含む。適切な1本鎖アニーリング部位を、制限酵素SacIIまたはSacIのいずれかを使用してpDG2ベクターを消化し、そして上記したように各反応物をT4DNAポリメラーゼおよびdTTPで処理することによって生成した。4つの反応物を、各ベクターについてマイクロタイタープレートに準備した。反応物は(1)T4DNAポリメラーゼ処理フラグメント;(2)T4処理フラグメント反応物の1:10倍希釈物;(3)T4処理フラグメントの1:100倍希釈物または(4)H2O(挿入物のないコントロール)のいずれかを1μl含む。マイクロタイタープレートを密封し、65℃まで加熱された2つの温度ブロックの間に置き、室温で30〜45分間、ゆっくり冷却させた。
【0231】
次いで、マイクロタイタープレートを氷上に置き、20〜25μlのサブクローニングに効率的なコンピテントな細胞を各ウェルに添加した。プレートを、氷上で20〜30分間インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、42℃までに加熱された2つの温度ブロックの間に2分間置き、続いて氷上に2分間置いた。100μlのLBを各ウェルに添加し、プレートをパラフィルムで覆い、そして37℃で30〜60分間インキュベートした。各ウェルの全内容物は1つのLB−Ampプレート上に平板培養し、そして37℃で一晩インキュベートした。
【0232】
約12と24との間のコロニーを、挿入物のないコントロールよりも少なくとも2〜4倍も多いコロニーを有するプレートからピックアップした。これらのコロニーを37℃で一晩ディープウェルプレートで増殖させ、次いで、プラスミドDNAをQiagenミニプレップキットを使用して抽出した。
【0233】
プラスミドDNAを、NotI酵素およびSalI酵素を使用して消化した。図2Aに示されるように、NotI/SalI消化は、クローニング部位3および4を含む大きなフラグメント、ならびにクローニング部位1および2およびNeor遺伝子を含む小さなフラグメントを生成する。消化後、反応物は、0.2μg/mlの臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲル上にかけた。挿入物がない場合、2つのバンド、1975塩基対のものと2793塩基対のものが存在した。挿入フラグメントが存在する場合、これらのバンドの少なくとも1つは、より大きい。なぜなら、アニーリング部位1/2または部位3/4のいずれかでフラグメント(挿入物1または2)をも含むからである。挿入物バンドを切除し、QIAquickゲル抽出キットで処理した。1μlの10×リガーゼ緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン)、1μl T4DNAリガーゼ、1〜2μlフラグメント(部位3/4バンド)、5μlの部位1/2バンドおよび10μlまでのH2Oを含む第2の連結反応を実施した。コントロールもまた、部位3/4フラグメントまたは部位1/2フラグメントのいずれかを水に代えて準備した。反応物を、室温で1〜2時間インキュベートし、そして25μlのコンピテント細胞で形質転換した。
【0234】
これらの実施例の文脈における「フランキングDNA」とは、欠失または変異されるべき標的遺伝子中の領域に隣接するゲノム配列を指す。「フランキングDNA」はまた、標的遺伝子と相同であるDNA配列のブロックとして上記される。R1ゲノムライブラリーは、R1 ES細胞株から調製されたゲノムライブラリーをいう。このようなライブラリーを、実施例1に記載されるように調製し得る。
【0235】
(実施例4:網膜特異的核内レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
網膜特異的核内レセプターの役割を研究するために、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より特定には、特に配列番号19を含む網膜特異的核内レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有する網膜特異的ターゲティング構築物を、配列番号20または配列番号21として本明細書中で同定されるオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/Sv−+P+Mgf−SLJ/Jマウス亜系統から誘導されたES細胞中に導入し、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌性C57BL/6とともに交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型は、以下のようにして決定した。
【0236】
(ホモ接合性マウス)
分析したホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも1つを示した。
【0237】
目:以下によって特徴付けられる重度の網膜異形成症を含む目の異常:大きなロゼット形成および網膜フォールディング;病巣を満たす棹状体および錐状体を有する網膜の外側核内層の分節菲薄化(segmental thinning);ならびに、網膜の完全な片側欠如。さらに、網膜によって正常に占められる空間は、線維性結合組織、骨様骨棘およびいくつかの鉱質で充填されていた。ある範囲で、結合組織は後方水晶体包に付着していた。水晶体の前方面に付着する肥厚化した虹彩を有する後方癒着を検出した。網膜の着色された上皮層は肥厚化され、そしてその細胞は大きさおよび数が増加した。水晶体の内部構造は組織崩壊され、腫脹および変性した線維を含んだ。網膜が片側で欠損する例では、小さな病巣痕跡が存在していた。
【0238】
胃腸管:胃腸管の異常は、胃の深部粘膜および粘膜下組織に好中球の多巣性浸潤物を含んだ。
【0239】
皮膚:皮膚の異常は、真皮内に病巣リンパ性炎症を含んだ。
【0240】
精巣/副睾丸:精巣および副睾丸の異常は、低下した精子形成を含んだ。特に、輸精細管には変性または壊死性精子形成上皮細胞および多核性巨細胞が散らばっていた。副睾丸は精子細胞の数が低下し、変性細胞が細管内に存在した。いくつかの副睾丸細管の上皮細胞は、空胞化されていた。
【0241】
臨床化学/血液分析:異常は、野生型コントロール値に比べて、低いアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)値、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、およびクレアチニンキナーゼ(CK)値を含んだ。しかし、アルカリホスファターゼ(ALP)活性は上昇していた。血液学的評価は、より低い全白血球数を示した。
【0242】
(ヘテロ接合性マウス)
皮膚:異常は、局所的線維症およびリンパ系皮膚炎を含んだ。
【0243】
肝臓:異常は、胆管肥厚化および線維症を有する胆管周囲炎を含んだ。
【0244】
(実施例5:リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成および分析)
リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプターの役割を研究するために、リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号22を含むリンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有するリンパ系特異的GPCRターゲティング構築物を、配列番号23および配列番号24として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と飼育して生成した。F2ホモ接合性変異体動物を、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑して生成した。リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。リンパ系特異的GPCRにおける破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0245】
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、下記の表現型の少なくとも1つを示した:
肺:肺の異常は細気管支の周りに細胞性浸潤液を含んだ。様々な程度の斑状気管支周辺リンパ球性細胞性浸潤液を示す肺の変化が検出された。浸潤液は、主に小リンパ球から構成された。気管支周辺リンパ球性袖口様縁形成は、リンパ球の病巣胸膜下集合;血管壁のフィブリノイド壊死;および気管支上皮の肥厚化を含んだ。
【0246】
膵臓:膵臓の異常は、膵管および島の近くに膵臓細胞性浸潤液を含んだ。特に、管周辺細胞性浸潤液または島周辺細胞性浸潤液が存在し、主に小リンパ球から構成された。
【0247】
胃:胃の異常は、小リンパ球、顆粒球および血漿細胞から構成される胃液混合細胞性浸潤液を含んだ。浸潤液は、胃の深在粘膜、粘膜下組織および/または筋層を含んだ。
【0248】
肝臓:肝臓の異常は、細胞性浸潤液、主に門脈三管に関与するリンパ球を含んだ。
【0249】
(発現分析)
LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、脾臓およびリンパ節で検出した。特に、リンパ節で、数種の細胞が強いX−Gal染色を示した。脾臓では、強い染色を、赤脾髄のいくつかの細胞で検出した。
【0250】
(実施例6:メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモンの役割を研究するために、GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号25を含むメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプターをコードする遺伝子を破壊または改変する能力を有するメラニン形成細胞刺激ホルモンターゲティング構築物を、配列番号26および配列番号27として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHadマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0251】
メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0252】
挙動分析:ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験で移動した全体距離において野生型マウスとは有意に異なっていた。ホモ接合性マウスは、その野生型対応物よりも著しく(significantly)動きまわり、かつオープンフィールドを探索するという点で、活動低下していた。オープンフィールド試験を、活動のレベルおよび不安における変化を証明するために使用した。したがって、オープンフィールドデータは、ホモ接合性マウスが野生型コントロールマウスよりも活動低下していることを示す。
【0253】
LaZ発現分析:LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、食道、皮膚および雄生殖系で検出した。
【0254】
(実施例7:マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の役割を研究するために、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、特に配列番号28を含む遺伝子を破壊および改変する能力を有するマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号29および配列番号30として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0255】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0256】
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、以下の表現型のうちの少なくとも1つを示した:
肺:肺の異常は、異物誤嚥性肺炎を示唆する肺損傷を含んだ。関連する肉芽腫瘍(おそらく異物)、泡沫肺胞マクロファージ、および肺胞マクロファージ内の好酸球増加性結晶を伴う斑状気管支周辺急性炎症が肺の中で見られた。肺の斑状黄赤色変色も検出された。
【0257】
血液学:血液中の異常は、上昇した白血球(WBC)数を含んだ。
【0258】
剖検試験:斑状赤黄色肺変色。筋肉と骨は、野生型コントロールよりも軟らかった。
【0259】
(発現分析)
強いlacZ発現は、脳、脊髄、坐骨神経、眼、ハーダー腺、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、大動脈、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、気管、喉頭、食道、甲状腺、下垂体、副腎、唾液腺、舌、骨格筋、皮膚および雌雄生殖系を含む、試験された全ての組織または器官において検出可能であった。
【0260】
(実施例8:ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子の役割を研究するために、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号31を含むケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子を破壊および改変する能力を有するケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号32および配列番号33として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0261】
(実施例9:cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の役割を研究するために、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号34を含むcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子を破壊および改変する能力を有するcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号35および配列番号36として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0262】
cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した:
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも1つを示した:
眼:ホモ接合性マウスは、特に網膜に関与する眼の異常、より具体的には光レセプター層(すなわち、棹状体と錐状体、外核層、外網状層)の完全な非存在を伴う重症の両側網膜変性または網膜異形成を含む網膜変性(RD)を示した。棹状体と錐状体は、光レセプター細胞の樹状突起であり、外核層は、光レセプター細胞の核を示し、そして外網状層は、光レセプター細胞の軸索線維を示す。このような眼の異常は、視覚障害または盲目を伴い得る。これらのマウスの眼の他の異常は、内核層の菲薄化および空胞化;内網状層の菲薄化;神経節細胞核、特に大きな神経節細胞の損失;神経線維層の神経膠症;ならびに網膜脈管構造の減弱を含んだ。マウスで観察されたRDは、ヒトの網膜色素変性症(RP)に類似している。
【0263】
大動脈:大動脈の異常は、大動脈の外膜または炎症を含んだ。
【0264】
腎臓:腎臓異常は、尿細管拡大または腎盂炎を含んだ。
【0265】
肝臓:検出された肝臓異常は、髄外造血を含んだ。
【0266】
リンパ節:リンパ節の異常は、リンパ球増殖症、リンパ球萎縮または出血を含んだ。
【0267】
皮膚:皮膚異常は、皮膚炎を含んだ。
【0268】
体重:異常は、増加した体重と体長を含んだ。特に、コントロールマウスに対して体重は雄で約11%〜37%増加し、体長は約13%増加していた。体長に対する体重の比は、約23%増加していた。
【0269】
器官重量:増加した器官重量が脾臓および胸腺、腎臓および肝臓で見られた。特に脾臓重量は、約13%〜28%の範囲で増加し、胸腺重量は、約17%〜30%の範囲で増加した。腎臓重量は約16%増加し、肝臓重量は約38%増加していた。
【0270】
臨床化学:上昇したレベルのALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)、リン、カリウム、またはビリルビンを検出した。
【0271】
挙動分析:ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験においてより大きな総距離を動き、オープンフィールドをより多く探索する有意に増加した活動を示した。この観察はホモ接合性マウスの多動を示した。
【0272】
(ヘテロ接合性マウス)
眼:眼の異常はピンクアイを含む変色を含んだ。
【0273】
(LacZ発現分析)
LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、胸腺、唾液腺プロパー、喉頭の唾液腺、気管の気管周腺および粘膜下腺および舌の粘液腺に検出した。
【0274】
(実施例10:スルホトランスフェラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を研究するために、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子、特に配列番号37を含む遺伝子を破壊または改変する能力を有するスルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号38および配列番号39として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。これらの動物を、表現型変化について評価した。スルホトランスフェラーゼ遺伝子の破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した:
(ホモ接合性マウス)
肝臓:ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べて肝臓で異常を示した。ホモ接合性マウスは以下の少なくとも1つを示した:斑状蒼白の腺房帯3肝実質細胞;肝実質細胞の細胞質内の核内陥入を有する様々な大きさの好酸性小球;または赤血球大小不同、核の大小不同および野生型マウスに比べて増加した有糸分裂細胞活性。
【0275】
唾液腺:ホモ接合性マウスは、ハーダー腺および唾液腺の異常を示した。特に、これらの腺に病巣の色素沈着が、そして顎下腺に萎縮症および線維症が存在した。
【0276】
挙動分析:ホモ接合性マウスは野生型マウスに比べて、積極的で、多動であり、かつ不安の少ない挙動を示した。特に、2週齢に始まってホモ接合性変異体雄マウスは、野生型同腹仔に比べて増大した攻撃性を示した。飼育室を観察中、これらの動物は正常な雄マウスよりもその部屋のマウスを攻撃し、そのような攻撃を阻止するために別の飼育室へ入れなければならなかった。さらに、ホモ接合性変異体マウスは、オープンフィールド試験において野生型マウスとは有意に異なっていた。変異体は動きまわり、かつ野生型マウスよりもより敏速にオープンフィールドを探索して多動であり、野生型マウスに比べて増加した活動および低下した不安を示した。
【0277】
ホモ接合性マウスは、オープンフィールドで野生型と有意に異なっていた(中央で過ごす時間の%)。ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べてオープンフィールドの中心部分でより長い割合の時間を過ごし、不安がより少なかった。
【0278】
当業者には明らかなように、上記実施形態の種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。これらの改変および変更は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明のターゲティングベクターを構築する1つの方法を示す概略図である。プラスミドPCR法は、実施例9および10に記載される。
【図2】
図2Aは、pDG2ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン(Neor)遺伝子を含む。Neor遺伝子の両側部は、制限部位とともに連結非依存性クローニングのための2つの部位である。pDG2の配列は、図2Bおよび配列番号1に示される。
【図3】
図3Aは、pDG4ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン(Neor)遺伝子および緑色蛍光性タンパク質(GFP)遺伝子を含む。Neor遺伝子の両側には、制限酵素認識部位とともに連結非依存性クローニングのための2つの部位である。pDG4の配列は、図3Bおよび配列番号2に示される。
【図4】
図4(配列番号3〜配列番号10)は、PCR増幅されたゲノムDNAの末端に含まれるアニーリング部位1〜4のT4DNAポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図5】
図5(配列番号11〜配列番号18)は、pDG2ベクター内に含まれるアニーリング部位1〜4のT4DNAポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図6】
図6は、アニーリング反応中のpDG2ベクター内のアニーリング部位1、2、3および4に関連した5’および3’フランキングDNAの配置を示す。
【図7】
図7は、アニーリング反応中のpDG4ベクター内のアニーリング部位1、2、3および4に関連した5’および3’フランキングDNAならびにGFPスクリーニングマーカーの配置を示す。
【図8】
図8は、配列番号19として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図8はまた、配列番号20および配列番号21として同定された配列を示す。これらは、網膜特異的核内レセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図9】
図9は、配列番号22として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図9はまた、配列番号23および配列番号24として同定された配列を示す。これらは、リンパ系特異的GPCR遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図10】
図10は、配列番号25として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図10はまた、配列番号26および配列番号27として同定された配列を示す。これらは、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図11】
図11は、配列番号28として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図11はまた、配列番号29および配列番号30として同定された配列を示す。これらは、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図12】
図12は、配列番号31として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図12はまた、配列番号32および配列番号33として同定された配列を示す。これらは、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図13】
図13は、配列番号34として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図13Bは、配列番号35および配列番号36として同定された配列を示す。これらは、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図14】
図14は、配列番号37として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図14はまた、配列番号36および配列番号37として同定された配列を示す。これらは、スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
(関連出願)
本願は、米国出願番号第60/190,348号(2000年3月16日提出)、米国出願番号第60/191,128号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,236号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,235号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,129号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,142号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/191,240号(2000年3月22日提出)、米国出願番号第60/204,227号(2000年5月15日提出)、米国出願番号第60/204,230号(2000年5月15日提出)、米国出願番号第60/215,214号(2000年6月29日提出)、米国出願番号第60/216,249号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/216,264号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/216,765号(2000年7月6日提出)、米国出願番号第60/218,075号(2000年7月12日提出)、米国出願番号第60/219,167号(2000年7月19日提出)、米国出願番号第60/219,182号(2000年7月19日提出)、米国出願番号第60/221,485号(2000年7月27日提出)および米国出願番号第60/223,173号(2000年8月7日提出)の優先権を主張する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、遺伝子機能の特性化に関するトランスジェニック動物、組成物および方法に関する。
【0003】
(発明の背景)
実験動物モデルは、遺伝子の役割を理解するための重要な手段である。より詳細には、変更または不活性化された特定遺伝子を有する動物を開発する能力は、遺伝子機能の研究にとって計り知れないほど貴重であり、そしてヒトにおける同様な発現を有する疾患の原因となる遺伝子および/または機構の予期せぬ発見につながっている。これらの遺伝的に操作された動物はまた、種々の疾患および障害のための治療的処置を同定および試験するためにも有用である。
【0004】
多くの遺伝子の機能を同定することは、疾患におけるその役割を確認することおいて有用である。ヒトとマウスとの間の高レベルな相同性のため、マウスの選択された遺伝子の標的生殖系列変異を行うことによって、個々のヒト遺伝子の機能を明確にすることが可能である。結果として得られる変異マウスの表現型は、ヒトにおける表現型を定義するのに役立てるために用いられ得る。
【0005】
数種の興味ある遺伝子が最近、発見されている。これらの遺伝子およびその発現産物の役割を確認することは、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上で有用な標的の同定を可能とし得る。
【0006】
多くの医療上、有意義な生物学的プロセスは、G−タンパク質および/またはcAMPなどの第2メッセンジャーを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質によって仲介される。G−タンパク質結合レセプター(GPCR)の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、ホルモン、ウイルス性、成長因子および神経レセプターなどの広範囲の生物学的活性レセプターを含む。GPCRは、7種の推定膜貫通ドメイン(TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と称する)を有するとして特性化されている。これらは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通α−へリックスを表すと考えられている。ほとんどのG−タンパク質結合レセプターは、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の2つの細胞外ループのそれぞれに1つの保存システイン残基を有する。G−タンパク質結合レセプターは、ヘテロ三量体G−タンパク質によって細胞内で種々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合され得る。異なったG−タンパク質α−サブユニットは、優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能を調節する。
【0007】
網膜疾患において潜在的に重要であり得る核レセプター遺伝子、特に網膜特異的核レセプター遺伝子が同定されている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15149)。網膜特異的核レセプターは、網膜色素上皮およびグリア細胞内で発現された細胞性レチンアルデヒド(retinaldehyde)結合タンパク質の潜在的調節因子であり得る。このような遺伝子は、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質との相互作用により視覚サイクルを調節するとみなされている。
【0008】
GPCRファミリーのリンパ系特異的メンバーは、縮重オリゴヌクレオチドを使用するPCRによって同定されている(Genomics 23(3), 643−50 (1994))。エプスタイン−バー−誘導cDNA EBI1として報告されるこのレセプターは、正常なリンパ系組織中、および数種のB−およびT−リンパ球細胞系列中で発現される。この遺伝子は、ヒト染色体17q12−q21.2にコードされる。他のG−タンパク質結合レセプターのいずれもこの領域にマップされていないが、C−Cケモカインファミリーは、17q11−q21にマップされている。マウスEBI1cDNAも単離されていて、そしてヒト相同体に86%の同一性を有するタンパク質をコードする。マウスEBI1はC−Cケモカイン7型レセプター(CCR−7、C−C CKR−7またはCC−CKR−7と様々に呼ばれる)である。その遺伝子構造は、公知であり得るが、その機能およびリガンドEBI1は、未知である。
【0009】
メラニン形成細胞刺激ホルモン(MSH)は、色素沈着機能を調節する。このペプチドもまた、脳、下垂体および免疫系を含む他の領域において種々の生物学的活性を有する。マウスメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター(MSH−R)mRNAは、クローン化され(1260bp)、そしてカンナビノイドレセプターを含み得るグアニンヌクレオチド−結合タンパク質に結合されたレセプターのサブファミリーを定義することが見出されている(Science 257(5074), 1248−1251 (1992))。
【0010】
ホスファターゼは、低分子阻害および薬理学的介入に対して特殊かつ誘引性の標的を表す。タンパク質リン酸化/脱リン酸化サイクルは、成長および分化、細胞間接触、細胞周期ならびに腫瘍形成を含む細胞活性を制御する真核生物細胞によって使用される主要な調節機構の1つである。典型的な哺乳動物細胞の10%より多い活性タンパク質は、リン酸化されていると推定される。タンパク質リン酸化/脱リン酸化中、リン酸基は、タンパク質キナーゼによってアデノシン三リン酸(ATP)分子からタンパク質へ移動され、そしてタンパク質ホスファターゼによってタンパク質から除去される。
【0011】
ヒト新形成のほとんど全ての形態は、細胞周期制御を変更するので、細胞周期制御でのホスファターゼの役割は、これらの分子を薬学的介入の誘引性な標的にする。異常な細胞活性を妨害するホスファターゼインヒビターの能力は、実証されている。例えば、天然に存在するセリン/スレオニンホスファターゼインヒビター、オカダ酸は、骨髄性白血病細胞(J.Cell.Physiol.150,484(1992))、およびラット肝実質細胞、ラット下垂体腺腫細胞、ヒト乳癌細胞およびヒト神経芽腫細胞(Exp.Cell Res.195,237(1991))中でアポトーシスを誘導することが示されている。
【0012】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼは、cAMP−活性化タンパク質キナーゼ活性、Ca2+−依存性シグナル伝達、tRNAスプライシング、および熱ショック反応に関連するシグナル伝達を調節することを含む広い種類の機能に関与するようである。最近、PP2C、αアイソフォーム(すなわちPP2C−α)をコードする完全なcDNA配列は、マウス脳からクローン化されたと報告された。PP2C−α(GIまたはNID番号:532678;受託番号:D28117)は、計算された分子量42,432Daを有する382個のアミノ酸のタンパク質をコードする1387bpの配列である(Gene 145(2),311−312(1994))。
【0013】
別の重要なGPCRサブファミリーは、走化性サイトカインとして公知であるケモカインレセプターファミリーである。ケモカイン作用の機構は、標的細胞上の7種の膜貫通スパニングGPCRへの初期特異的結合を含む。炎症性反応におけるケモカインの中心的役割は、多くの研究で立証されている。皮下注射によるαケモカイン、例えばIL−8の局所投与は、好中球浸潤により支配される急性炎症性反応となる。最近、ラットCXCケモカインレセプター1(CXCR1)遺伝子のクローニングが報告されている(J. Biol. Chem. 271(51), 32770−6 (1996))。このCXCR1遺伝子(GIまたはNID番号:1589930;受託番号:U71089)は、ヒトインターロイキン−8(IL−8)AおよびBレセプターサブタイプと約70〜85%同一であるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン−8(IL−8)レセプターと相同であり、マウスCXCR1遺伝子とも相同である。
【0014】
ホスホジエステラーゼ(PDE)は、ホスホジエステル結合の分解の原因である1群の酵素である。特に環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(CN−PDE)は、プリン環状ヌクレオチド基質に対する特異性を示し、そして環状アデノシン一リン酸(cAMP)および環状グアノシン一リン酸(cGMP)を加水分解する(Pharmac. Ther. 51, 13−33 (1991))。CN−PDEは、cAMPおよびcGMPの定常レベルを調節し、そして環状ヌクレオチドシグナルの振幅および持続時間の両方を調節する。次に、cAMPおよびcGMPは、シグナル伝達、すなわち細胞が細胞外シグナル(ホルモン、薬物、神経伝達物質、成長および分化因子、ならびに他の薬剤)に反応することによる一般的なプロセスにおいて重要な「第2メッセンジャー」分子である。シグナル伝達は、細胞増殖、分化および遺伝子転写を含む全ての型の細胞機能を調節する。少なくとも8種の異なっているが相同であるCN−PDEの遺伝子サブファミリーは、哺乳動物組織に存在することが目下、公知である。
【0015】
PDEの6型サブファミリー(PDE6)のメンバーは、網膜光伝達に関係している(J. Biol. Chem. 266, 10711−14 (1991))。光伝達では、光レセプター細胞に衝突する光は、PDE6によるcGMPの加水分解となる生化学的事象のカスケードを活性化することによって神経シグナルを誘発する。PDE6は、触媒的アルファおよびベータ(αおよびβ)サブユニット、および2つの抑制ガンマ(γ)サブユニットから構成される四量体タンパク質である。酵素複合体からの抑制ガンマサブユニットの解離は、トランスデューシンと呼ばれる膜関連タンパク質によって誘導され、そして酵素を活性化する。PDE6欠損は、網膜変性を特徴とする遺伝性網膜変性疾患に関与している。ホスホジエステラーゼ、特に網膜機能に関与するPDE(例えば、PDE6)の重要性を考えると、機能不全または疾患、および網膜変性(RD)および特に網膜色素変性(RP)などの特に視覚関連機能不全および疾患を阻止、改善または矯正する役割を果たし得るホスホジエステラーゼの同定および特性化が明らかに必要である。
【0016】
多くの薬物、生体異物、神経伝達物質およびホルモンの物質代謝は、硫酸(SO4)基の酵素的付加に関与する工程を含む。硫酸基の付加は、一般に硫酸結合体化、または単に硫酸化と呼ばれる。硫酸結合体化の原因となる酵素は、スルホトランスフェラーゼ(すなわちST)として公知であり、これは、当該酵素がスルホトランスフェラーゼ反応において1つの生物学的分子(硫酸ドナー)から別の生物学的分子(硫酸アクセプター)へ硫酸基を転移させることにより作用するためである。
【0017】
ヒト肝臓中のサイトゾルのスルホトランスフェラーゼ酵素は、硫酸化がほとんどの化合物の水溶解性を増加し、したがってその腎排泄を増加するので、集中的に研究に供されている。硫酸化はまた、通常、生物学的活性の減少となる。しかしながら、いくつかの場合では、硫酸結合体化は、降圧薬ミノキシジルなどの薬物を活性化するために必要とされ(Biochem.Pharmacol.,31,2949−2954(1982))、そしてまた、ヒドロキシルアリールアミンなどの前発癌物質の生物学的活性化において役割を果たし得る(Science,215,403(1982);Chem.Biol.Interact.109,221−35(1998))。
【0018】
現在まで、硫酸物質代謝の分野での遺伝的操作の努力から、数種のスルホトランスフェラーゼ酵素:ヒト肝臓DHEA ST(Mol.Pharmacol.41,865−872(1992))、TS PST(Mol.Pharmacol.43,70−77(1993))、TL PST(Biochem.Biophys.Res.Commun.198,1119−1127(1994))および非ヒト哺乳動物種の数種の組織から単離された1群のエストロゲンスルホトランスフェラーゼ(Aust.J.Biol.Sci.41,507−516(1988);Mol.Endocrinol.6,589−597(1992))に対するcDNAのクローニングおよび発現を生じている。
【0019】
また、マウス肝臓フェノール/アリール形態のスルホトランスフェラーゼ(mSTp1)のcDNA配列(1269bp)が決定されている(Biochim.Biophys.Acta 1171(3),315−8(1993))。クローン化されたcDNAは、34.7kDである298個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド65で始まる897個のヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)を含むと報告された。mSTp1遺伝子は、GIまたはNID番号201069および受託番号L02331を有する。ヒトSTp1遺伝子は、広く特性化されている(Pharmacogenetics 6,473−487(1996);Biochem.Biophys.Res.Commun.228,134−140(1996))。STp1遺伝子はまた、SULT1A1遺伝子とも呼ばれている。
【0020】
実験動物モデルは、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を理解する重要な手段を提供する。このような役割の理解は、疾患経路の決定、診断上および治療上、有用な標的の同定、および潜在的治療処置の試験および研究を可能とし得る。
【0021】
(発明の要旨)
本発明は、一般的にトランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特性化に関する組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、種々の遺伝子およびそのインビボでの特性化および機能に関する。
【0022】
本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞からなる。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹(ES)細胞、そして最も好ましくは、マウスES細胞である。1つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。他の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。
【0023】
本発明はまた、標的化構築物、および幹細胞中に導入される場合、相同組換え体を産生する標的化構築物を産生する方法を提供する。1つの実施形態では、本発明の標的化構築物は、標的遺伝子に相同である第1および第2のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、構築物中で2つの異なった相同ポリヌクレオチド配列間に位置することが好ましい選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列も含む。標的化構築物は、相同組換えを強化し得る他の調節因子も含み得る。
【0024】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック動物、および標的遺伝子に破壊を含むこのような非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子中の変異に対してヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。1つの局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子の機能を欠損している。別の局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子に変異を有することに関連した表現型を含む。
【0025】
本発明はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法も提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物へ投与され、そして推定薬剤に対するトランスジェニック動物の反応が測定され、そして「正常」または野生型マウスの反応と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール(薬剤投与されない)と比較される。本発明は、このような方法に従って同定された薬剤をさらに提供する。本発明はまた、標的遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療薬剤として有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【0026】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対してある効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有するトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。この方法は、例えば薬剤に対するトランスジェニック動物の反応を測定し、例えば野生型動物あるいはトランスジェニック動物制御とし得るコントロール動物とトランスジェニック動物の反応を比較する工程を包含する。遺伝子の発現または機能に対してある効果を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するために、細胞ベースアッセイで細胞に対してスクリーニングされ得る。
【0027】
本発明はまた、標的遺伝子の核酸配列を含む細胞系列を提供する。このような細胞系列は、細胞系中で機能するプロモーターへの作動可能な連結によって、このような配列を発現することが可能であり得る。好ましくは、標的遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。標的遺伝子を薬剤と接触させる工程および薬剤/標的遺伝子複合体を検出する工程を包含する、標的遺伝子に相互作用する薬剤を同定する方法も提供される。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能なマーカーの発現を測定して検出され得る。
【0028】
本発明はさらに、標的遺伝子における破壊、より詳細には標的遺伝子の発現または機能における破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、必要とする患者へ標的遺伝子の発現または機能をもたらす治療薬剤を投与する工程を包含する、標的遺伝子の発現または機能中の破壊に関連した疾患または状態を処置する工程を包含する。この実施形態に従って、この方法は、治療上、有効な量の天然、合成、半合成、または組換え標的遺伝子、標的遺伝子産物またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成または組換え類似体の投与を含む。
【0029】
本発明はさらに、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連した疾患または状態を処置する方法を提供し、この方法は、変異された標的遺伝子を検出し、かつ遺伝子治療によって置換する工程を包含する。
【0030】
(定義)
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」とは、(a)本明細書に開示されるDNA配列の少なくとも1つを含む遺伝子;(b)本明細書中に開示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のDNA配列、および/または;(c)本明細書中に記載されるコード配列の補体にハイブリダイズする任意のDNA配列をいう。好ましくは、この用語は、コード領域ならびに非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要である全ての配列を含む。
【0031】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、いかなる長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を呼ぶために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはその類似体を含み得る。ヌクレオチドは、いかなる3次元構造をも有し得、そして公知または未知であるいかなる機能をも発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、1本鎖、2本鎖および三重ヘリックス分子を含む。
【0032】
「オリゴヌクレオチド」とは、5と約100ヌクレオチドとの間の1本鎖または2本鎖DNAのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、あるいは当該技術分野で公知である方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」とは、酵素仲介核酸合成の開始に3’−ヒドロキシ末端を提供する、通常、1本鎖であるオリゴヌクレオチドをいう。
【0033】
下記のもの:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、すべての配列の単離DNA、すべての配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子類似体などの改変核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンの類似体は、当該技術分野で公知であり、アジリジニルシトシン(aziridinycytosine)、4−アセチルシトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルシュードウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、シュードウラシル、5−ペンチニルウラシルおよび2,6−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンの類似形態と考えられる。
【0034】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも9個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも45個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「bp」とも表示される「塩基対」とは、相補的核酸分子をいう。DNAには、4「種」の塩基が存在する:プリン塩基アデニン(A)は、ピリミジン塩基チミジン(T)と水素結合され、そしてプリン塩基グアニン(G)は、ピリミジン塩基シトシン(C)と水素結合される。各水素結合された塩基対セットはまた、ワトソン−クリック塩基対としても公知である。1000塩基対は、しばしばキロベース対またはkbと呼ばれる。「塩基対ミスマッチ」とは、塩基が相補的ワトソン−クリック対でない核酸分子中の位置をいう。句「いかなる位置にも少なくとも1種の塩基を含まない」とは、いかなる位置にも4種の塩基のうちの1つを有しないヌクレオチド配列をいう。例えば、1つのヌクレオチドを欠く(すなわち1種の塩基を欠く)配列は、A、G、T塩基対から構成され、そしてC残基を含まないものであり得る。
【0036】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子標的化」は、ゲノムDNAのフラグメントが哺乳動物細胞中に導入され、かつ、そのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、これと再び結合する場合に生じる1種の相同的組換えである。
【0037】
用語「相同組換え」とは、相同ヌクレオチド配列の部位での2つのDNA分子または染色分体間のDNAフラグメントの交換をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相同」は、参照配列と比べて、少なくとも約70%の配列同一性、典型的には、少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、そしてより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは参照配列に比べて約100%の配列同一性を有するDNA配列の特性を示す。相同性は、「BLASTN」アルゴリズムを使用して決定され得る。相同配列は、ヌクレオチド配列中の挿入、欠失および置換に適応する(accommodate)ことが理解される。したがって、ヌクレオチドの線形配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応しないか、または整列しなくても、本質的に同一であり得る。参照配列とは、遺伝子またはフランキング配列の一部、または染色体の反復部分などのより大きな配列のサブセットであり得る。
【0038】
本明細書中で使用される場合、用語「標的遺伝子」(または「標的遺伝子配列」または「標的DNA配列」または「標的配列」と呼ぶ)とは、相同組換えによって改変される任意の遺伝子の任意の核酸分子またはポリヌクレオチドをいう。標的配列は、インタクト遺伝子、エキソンまたはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域を含む。1つの局面では、一般的集団中に1つの配列を有する核酸分子は、いずれの疾患または認識可能な表現型にも関連していない。一般的な集団中において、野生型遺伝子は、互いに関連した配列中の変化を含む複数の有力なバージョン(prevalent version)を含み得るにも関わらず、認識可能な病理学的効果を引き起こさないことが注目される。これらの変異は、「多型性」または「対立遺伝子変異」と命名される。標的遺伝子は、個人のゲノムDNA中に特定遺伝子または遺伝子座の一部を含む。本明細書中に提供されるように、本発明の標的遺伝子は、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子、または天然に存在する対立遺伝子変異体またはその相同体からなる。
【0039】
本明細書中で使用される場合、用語「網膜特異的核レセプター遺伝子」とは、配列番号19を含む配列、または受託番号:AF148129;GI番号:6651226としてGenBankで同定された網膜特異的核レセプター遺伝子をいう。1つの局面では、網膜特異的核レセプター遺伝子のコード配列は、配列番号19、あるいは受託番号:AF148129;GI番号:6651226としてGenBankで同定された配列を含む。
【0040】
本明細書中で使用される場合、用語「リンパ系特異的GPCR遺伝子」とは、配列番号22を含む配列、または受託番号:L31580;GI番号:468340であるGenBankのリンパ系特異的GPCR遺伝子をいう。1つの局面では、リンパ系特異的GPCR遺伝子のコード配列は、配列番号22、または受託番号:L31580;GI番号:468340としてGenBankで同定された配列を含む。
【0041】
本明細書中で使用される場合、用語「メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子」とは、配列番号25を含む配列、または受託番号:X65635;GI番号:53244としてGenBankで同定されたメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子をいう。1つの局面では、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号25または受託番号:X65635;GI番号:53244としてGenBankで同定された配列を含む。
【0042】
本明細書中で使用される場合、用語「マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子」とは、配列番号28を含む配列、または受託番号:D28117;GI番号:532678としてGenBankで同定されたマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子をいう。1つの局面では、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子のコード配列は、配列番号28または受託番号:D28117;GI番号:532678としてGenBankで同定された配列を含む。
【0043】
本明細書中で使用される場合、用語「ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子」とは、配列番号31を含む配列、または受託番号:U71089;GI番号:1589930としてGenBankで同定されたケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子をいう。1つの局面では、ケモカインレセプター1−様タンパク質遺伝子のコード配列は、配列番号31または受託番号:U71089;GI番号:1589930としてGenBankで同定された配列を含む。
【0044】
本明細書中で使用される場合、用語「cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子」とは、配列番号34を含む配列、または受託番号:X60664;GI番号:53587としてGenBankで同定されたcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子をいう。1つの局面では、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号34または受託番号:X60664;GI番号:53587としてGenBankで同定された配列を含む。
【0045】
本明細書中で使用される場合、用語「スルホトランスフェラーゼ遺伝子」とは、配列番号37を含む配列、または受託番号:L02331;GI番号:201069としてGenBankで同定されたスルホトランスフェラーゼ遺伝子をいう。1つの局面では、スルホトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号37または受託番号:L02331;GI番号:201069としてGenBankで同定された配列を含む。
【0046】
標的遺伝子の「破壊」は、ゲノムDNAのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、そしてこれと再び結合する場合に生じる。これらの配列破壊または改変は、DNA配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、または代替、または置換、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。挿入は、動物、植物、原核生物、またはウイルス起源のものであってもよい全遺伝子の挿入を含む。例えば、破壊は、標的遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライシング部位を変更または置換し得、そして正常な遺伝子産物の産生を部分的に、または完全に阻止するか、あるいは正常遺伝子産物の活性を強化することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【0047】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、変性、変更または置換されている標的遺伝子をそのゲノム内に含む細胞をいう。
【0048】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、または不活性化されている特定遺伝子をそのゲノム内に含む動物である。トランスジェニック動物は、ヘテロ接合性動物(すなわち、1つの欠損対立遺伝子および1つの野生型対立遺伝子)ならびにホモ接合性動物(すなわち、2つの欠損対立遺伝子)の両方を含む。
【0049】
本明細書中で使用される場合、用語「構築物」とは、標的組織、細胞系列またはヒトを含む動物中に移入されるべき人工的に組み立てられたDNAセグメントをいう。典型的には、構築物は、遺伝子、または特別の目的の配列、マーカー遺伝子および適切な制御配列を含む。「プラスミド」との用語は、自律性自己複製染色体外DNA分子をいう。好ましい実施形態では、本発明のプラスミド構築物は、目的の遺伝子の2つのフランキング領域間に位置されるポジティブ選択マーカーを含む。必要に応じて、この構築物はまた、スクリーニングマーカー、例えば緑色蛍光性タンパク質(GFP)を含み得る。存在する場合、スクリー−ニングマーカーは、フランキング領域の外側で、かつある距離だけ離れて配置される。
【0050】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」または「ポジティブ選択マーカー」とは、遺伝子を保有する細胞のみがある条件下に生き残り、かつ/または成長し得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン抵抗性(Neor)遺伝子を発現する植物および動物細胞は、化合物G418に対して抵抗性である。Neor遺伝子マーカーを保有しない細胞は、G418によって死滅される。他のポジティブ選択マーカーは、当業者には公知である。
【0051】
「ポジティブ−ネガティブ選択」は、特定の標的化された位置に組み込まれたDNA挿入物を保有する細胞を選択するプロセス(ポジティブ選択)、および非標的化された染色体部位に組み込まれたDNA挿入物を保有する細胞をまた選択する(select against)(ネガティブ選択)をいう。ネガティブ選択挿入物の非限定的例としては、チミジンキナーゼ(tk)をコードする遺伝子が挙げられる。ポジティブ−ネガティブ選択に適した遺伝子は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,464,764号参照。
【0052】
「スクリーニングマーカー」または「レポーター遺伝子」は、容易に分析され得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、レポーター遺伝子は、特定DNA構築物が細胞、器官または組織中に首尾よく導入されたか否かを決定するために使用され得る。スクリーニングマーカーの非限定的例としては、緑色蛍光性タンパク質(GFP)をコードする遺伝子、または改変された蛍光性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「ネガティブスクリーニングマーカー」は、ネガティブ選択マーカー;それを発現する細胞を典型的には死滅させるネガティブ選択マーカーとして解釈されるべきでない。
【0053】
用語「ベクター」は、挿入されたDNAを保有し得、宿主細胞中に不滅化され得るDNA分子をいう。ベクターはまた、クローニングベクター、クローニングビヒクルまたはビヒクルとして公知である。この用語は、細胞中に核酸分子を挿入するために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクター、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の1より多くをもたらすベクターもまた、含まれる。
【0054】
「宿主細胞」は、ベクターのため、あるいは核酸分子および/またはタンパク質の導入のためのレセプターであり得るかまたはそうである、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、1つの宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、天然の変異、偶発的な変異または故意の変異に起因して、必ずしも元の親と(形態学的にまたは全DNA相補体(complement)において)完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
【0055】
用語「ゲノムライブラリー」は、1セットのランダムに生成された重複する、生物体のゲノムを表現するDNAフラグメントから作られたクローンの集合をいう。「cDNAライブラリー」(相補的DNAライブラリー)は、酵素逆転写酵素でcDNA分子に変換され、次いで、ベクター(外来DNAの添加後に複製し続けることができる他のDNA分子)中に挿入された、細胞、組織または生物体に存在するmRNA分子の集合である。ライブラリーのためのベクターの例としては、バクテリオファージ(「ファージ」としても公知である)が挙げられる。これは、細菌を感染するウイルス(例えば、λファージ)である。次いで、ライブラリーは、目的の特定cDNA(従って、mRNA)のためにプローブされ得る。1つの実施形態では、高効率のファージベクター系をプラスミド系の便宜性と組み合わせるライブラリー系(例えば、Stratagene,La Jolla, CAからのZAP系)が本発明の実施に使用される。
【0056】
用語「エキソヌクレアーゼ」は、線状核酸基質の自由端から連続してヌクレオチドを切断する酵素をいう。エキソヌクレアーゼは、2本鎖または1本鎖のヌクレオチドに特異的であり得、ならびに/あるいは、例えば3’−5’および/または5’−3’の方向に特異的であり得る。いくつかのエキソヌクレーゼは、他の酵素活性を示す。例えば、T4DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼおよび活性3’−5’エキソヌクレアーゼの両方である。他のエキソヌクレアーゼの例としては、リン酸化3’末端を有さない2重鎖DNAの5’末端から1つずつヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼIII、1本鎖DNAの両端からヌクレオチドを切断することによってオリゴヌクレオチドを作るエキソヌクレアーゼVI、および結合する5’リン酸基を有する2重鎖DNAの5’末端からヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼλが挙げられる。
【0057】
用語「リコンビナーゼ」は、組換えを誘導、媒介または促進する酵素、および核酸配列の再配列、または第2の核酸配列から第1の核酸配列を切除または第2の核酸配列の中へ第1の核酸配列を挿入することを誘起、媒介または促進する酵素を改変する他の核酸を包含する。リコンビナーゼの「標的部位」は、リコンビナーゼによって認識(例えば、特異的に結合する)および/または作用される(組換えのための切除、切断または誘導)核酸配列または領域である。本明細書中で使用される場合、「酵素指向性部位特異的組換え」との表現は、次の事象を含むことが意図される:リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたDNAセグメントの欠失;リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたDNAセグメントのヌクレオチド配列の反転;および異なったDNA分子上に配置されたリコンビナーゼ標的部位に近接したDNAセグメントの相互交換。
【0058】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する(modulate)」は、標的遺伝子の機能、発現、または代替的に、標的遺伝子における破壊に関連した表現型の、阻止、低下または増強をいう。
【0059】
用語「回復する」は状態、疾患、障害、または標的遺伝子における破壊に関連した異常性もしくは病徴を含む表現型を、減少、低下または除去することをいう。
【0060】
用語「異常性」は、任意の疾患、障害、状態、または病理学的状態を含む標的遺伝子の破壊が関係する表現型をいう。
【0061】
(発明の詳細な説明)
本発明は、部分的に、遺伝子の発現および役割ならびに遺伝子発現産物の評価に基づく。とりわけ、本発明は、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上有用な標的の同定を可能とする。例えば、疾患状態で変異あるいは下方制御される遺伝子は、疾患状態を生じるかまたは悪化させることに関与し得る。このような遺伝子の活性を上方制御することに指向された治療、または代替の経路に関与する治療は、疾患状態を改善させ得る。
【0062】
当該技術分野で公知である技術はいずれも、動物中に標的遺伝子導入遺伝子を導入してトランスジェニック動物のファウンダー系(founder line)を生産するために使用され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号);生殖系列中へのレトロウイルス仲介遺伝子導入(Van der Puttenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82:6148−6152(1985));胚性幹細胞での遺伝子標的化(Thompsonら、Cell,56:313−321(1989));胎児のエレクトロポレーション(Lo,Mol Cell.Biol.,3:1803−1814(1983)):および精子仲介遺伝子移送(Lavitranoら、Cell,57:717−723(1989));などが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の概説については、Gordon,Transgenic Animals,Intl.Rev.Cytol.,115:171−229(1989)(本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと。
【0063】
好ましい実施形態では、相同組換えは、本発明のノックアウトマウスを生成するために使用される。好ましくは、構築物は(1)標的配列に対して相同である配列を増幅する工程(例えば、長距離(long−range)PCRを使用して)、および(2)相同配列が隣接するようにPCR産物中に別のポリヌクレオチド(例えば、選択マーカー)を挿入する工程による2工程で生成される。典型的には、ベクターは、プラスミドゲノムライブラリー由来のプラスミドである。完全な構築物はまた、典型的には、環状プラスミドである。従って、図1に示されるように、「外方向に向かう(pointing)」オリゴヌクレオチドを用いる長距離PCRを使用すると、選択マーカーが容易に、好ましくは連結非依存性クローニングにより挿入され得るベクターが生じる。次いで、この構築物は、相同標的配列の機能を破壊し得るES細胞中に導入され得る。
【0064】
相同組換えはまた、分化全能性の胚性幹細胞でない幹細胞および他の細胞型の遺伝子をノックアウトするために使用され得る。その例として、幹細胞には骨髄、リンパ、または神経前駆体および前駆細胞であり得る。このようなトランスジェニック細胞は特に、個々の発生経路の標的遺伝子機能の研究において有用であり得る。幹細胞は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの全ての脊椎動物種から誘導され得る。
【0065】
分化全能性でない細胞では、当該技術分野で公知である方法を使用して、標的の両コピーをノックアウトすることが望ましい場合がある。例えば、ポジティブ選択マーカー(例えば、Neor)の発現のために選択され、そして非ランダム組込みのためにスクリーニングされている標的遺伝子座での相同組換えを含む細胞は、高レベルの選択試薬(例えば、G418)に暴露されることによって、選択マーカー遺伝子の多数のコピーについてさらに選択され得る。次いで、これらの細胞は、標的遺伝子座でのホモ接合性について分析される。代替的に、第2の構築物は、異なったポジティブ選択マーカーを用いて2つの相同配列間に挿入して生成され得る。2つの構築物は、連続してかまたは同時にかのいずれかで細胞中に導入され、続いて、ポジティブマーカー遺伝子の各々について適切に選択され得る。最終細胞は標的の両対立遺伝子の相同組換えについてスクリーニングされる。
【0066】
別の局面では、目的のクローンの2つの別々なフラグメントが増幅され、そして連結非依存性クローニング技術を使用してポジティブ選択マーカーを含むベクター中に挿入される。この実施形態では、目的のクローンは、一般的にはファージライブラリー由来であり、PCR技術を使用して同定かつ単離される。連結非依存性クローニングは、2工程または1工程で実施され得る。
【0067】
好ましい方法によれば、5’−3’ 1本鎖領域が作製され得る場合、多数の部位を有する構築物が使用される。これらの構築物、好ましくはプラスミドは、指向性の四方向連結非依存性クローニングが可能なベクターを含む。
【0068】
構築物は、典型的には、例えば、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子などの、ポジティブ選択マーカーをコードする配列;ポジティブ選択マーカーのいずれかの側部の制限酵素部位、および4塩基対の1つを含まない制限酵素部位に隣接する配列を含む。この配置によって、適切な制限酵素で構築物を消化し、そしてエキソヌクレアーゼ活性を有する化合物(例えば、T4DNAポリメラーゼ)でそのフラグメントを処理することによって、この配列中に1本鎖末端が生成され得る。
【0069】
1つの好ましい実施形態では、標的化された変異をES細胞中に導入するために適した構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。特異的プライマーを用いる長距離PCRを使用して、目的の配列がプラスミドライブラリーから1工程で同定かつ単離される。この配列の単離に続いて、標的配列を破壊する第2のポリヌクレオチドは、目的の配列をコードする2つの領域の間に容易に挿入され得る。この直接的方法を使用して、標的化構築物は、72時間ほどの短い時間で生成され得る。別の実施形態では、標的化構築物は、以下に詳細に記載されるように、ファージゲノムライブラリー中の目的のクローンの同定の後に調製される。
【0070】
本明細書中に記載される方法は、ハイブリダイゼーション単離工程、制限酵素マッピング工程および多数クローニング工程を必要としない。さらに、いかなる遺伝子の機能も、これらの方法を使用して決定し得る。例えば、短い配列(例えば、EST)が、オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。これらのプローブは、構築物を作製する直接的増幅方法において使用されるか、またはより長い完全長の遺伝子のためのゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。従って、いかなる遺伝子もES細胞中での使用のために迅速かつ効率的に調製され得ることが意図される。
【0071】
好ましい実施形態では、構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。このライブラリーは、当該技術分野で公知であるいかなる方法によっても生産され得る。好ましくは、マウスES細胞から得たDNAは単離され、DNAをフラグメントに切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して処理される。次いで、DNAフラグメントは、ベクター(例えば、バクテリオファージまたはファージミド(例えば、Lamda ZAPTM、Stratagene, La Jolla, CA)系)に挿入される。ライブラリーがZAPTM系で作製される場合、DNAフラグメントは、好ましくは約5〜約20キロベースである。
【0072】
好ましくは、ライブラリーが作られる生物は、識別可能な疾患または表現型効果を示さない。好ましくは、このライブラリーは、マウスライブラリーである。このDNAは、いかなる細胞源または体液からも取得され得る。臨床業務で入手可能な細胞源の非限定的な例としては、ES細胞、肝臓、腎臓、血球、口腔内細胞、頸膣部細胞、尿からの上皮細胞、胎児性細胞、または組織診によって得られる組織中に存在する任意の細胞が挙げられる。体液としては、尿、血液脳脊髄液(CSF)、および感染または炎症の部位の組織浸出液が挙げられる。DNAは、細胞または体液から、当該技術分野で公知である任意の方法を使用して抽出した。好ましくは、DNAは、胚性幹細胞のコンフルエントな100mmプレートに、5mlの溶解緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5))、10mM EDTA(pH8.0)、10mM NaCl、0.5%SDSおよび1mg/mlプロテイナーゼK)を添加して抽出される。次いで、これらの細胞は、約60℃で数時間または完全に溶解されるまでインキュベートされる。ゲノムDNAは、溶解された細胞からフェノール:クロロホルムによる穏やかな抽出を数回繰り返し、続いてエタノール沈殿によって精製される。便宜的には、ゲノムライブラリーは、プール中に配列される。
【0073】
好ましい実施形態では、目的の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび長距離PCRを使用してプラスミドライブラリーから同定される。典型的には、プライマーは、部分的遺伝子配列(例えば、cDNAまたはEST配列)から得られた配列情報に基づいて設計される外方向に向かうプライマーである。例えば、図1に示されるように、生成物は、各プライマー間に配置される領域を除外した線状フラグメントである。
【0074】
好適であると判断されたPCR条件は、以下の実施例中に記載される。最適なPCR条件は当業者によって容易に決定され得ることが理解される(例えば、PCR2:A Practical Approach(1995)M.J.McPherson,B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、IRL Press,Oxford;Yuら、Methods Mol.Bio.,58:335−9(1996);Munroeら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.,USA,92:2209−13(1995)を参照のこと)。ライブラリーのPCRスクリーニングは、ライブラリーが平板化され、フィルターが作られ、放射活性プローブが調製され、かつ、ハイブリダイゼーション条件が確定されなければならない、従来のハイブリダイゼーションスクリーニングに関連する問題および時間的遅延の多くを取り除く。PCRスクリーニングは、目的の配列(遺伝子)に対するオリゴヌクレオチドプライマーのみを必要とする。PCR産物は、微量濾過、透析、ゲル電気泳動などを含むがこれらに限定されない種々の方法で精製され得る。新規なDNA合成が生じ得ないように、PCRに使用されるポリメラーゼを取り除くことが望ましい場合がある。好適な熱安定性DNAポリメラーゼは、市販される(例えば、VentTM DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、Deep VentTM DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、HotTubTM DNAポリメラーゼ(Amersham)、Thermo SequenaseTM(Amersham)、rBstTM DNAポリメラーゼ(Epicenter)、PfuTM DNAポリメラーゼ(Stratagene)、Amplitaq GoldTM (Perkin Elmer)、およびExpandTM (Boehringer−Mannheim))。
【0075】
完成された構築物を形成するために、標的配列を破壊する配列は、PCR増幅産物中に挿入される。例えば、本明細書中に記載される場合、直接的方法は、長距離PCR産物(すなわち、ベクター)および1つのフラグメント(すなわち、選択マーカーをコードする遺伝子)を連結することを含む。上記のように、ベクターは、標的DNA配列に相同である2つの異なった配列領域を含む。好ましくは、ベクターはまた、選択マーカー(例えば、アンピシリン)をコードする配列を含む。ベクターおよびフラグメントは、1本鎖末端を形成するために処理される場合、フラグメントが標的遺伝子と実質的に相同である2つの異なった領域間に配置されるようにアニールするように設計される。
【0076】
クローニングのいかなる方法も好適であるけれども、連結非依存性クローニング戦略が、選択マーカーに隣接する2つの異なった相同領域を含む構築物をアセンブリするために使用されることが好ましい。連結非依存性クローニング(LIC)は、キナーゼまたはリガーゼを使用することなくポリヌクレオチドを指向性クローニングするための戦略である(例えば、Aslanidisら、Nucleic Acids Res.,18:6069−74(1990);Rashtchian,Current Opin.Biotech.,6:30−36(1995)を参照のこと)。1本鎖テール(tail)(クローニング部位またはアニーリング配列とも呼ばれる)は、通常たった1つのdNTPの存在下にT4DNAポリメラーゼでベクターを(消化される制限酵素部位で)処理することによって、LICベクター中に作製される。T4DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は、反応混合物中に存在する1つのdNTPに対応する残基に遭遇するまでヌクレオチドを除去する。この時点で、この酵素の5’−3’ポリメラーゼ活性は、さらなる切除を阻止するためにエキソヌクレアーゼ活性を相殺する。ベクターは、作製される1本鎖テールが非相補的であるように設計される。例えば、pDG2ベクターでは、4つのアニーリング部位のうち1本鎖テールはいずれも互いに相補的でない。PCR産物は、オリゴヌクレオチドプライマー中に適切な5’伸長を形成することによって作製される。PCR産物は、dNTP(および(鋳型として使用される場合)元々のプラスミド)を取り除くために精製され、次いで、適切なdNTPの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理されて、特異的ベクター適合性オーバーハングを生成する。クローニングは、適合性テールのアニーリングによって生じる。1本鎖テールは、例えば、化学的手段または酵素的手段を使用して、クローンフラグメントの末端で作製される。相補的テールは、ベクター上で作製されるが、挿入物を有さないベクターのアニーリングを阻止するために、ベクターテールは、互いに相補的でない。テールの長さは、少なくとも約5ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約12ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【0077】
1つの実施形態では、重複するベクターおよびフラグメントを同じ反応物中に置くことは、それらをアニールするには充分である。代替的に、相補的配列は、結合され、加熱され、そしてゆっくりと冷却され得る。好ましくは、加熱工程は、約60℃〜約100℃、より好ましくは約60℃〜80℃、さらにより好ましくは60℃〜70℃である。次いで、加熱反応物は、冷却され得る。一般的には、冷却は、かなりゆっくり生じる。例えば、この反応物は、約1時間後に徐々にほぼ室温となる。冷却は、アニーリングが可能となるように充分にゆっくりでなければならない。アニールされたフラグメント/ベクターは、直ちに使用され得るか、または使用まで−20℃で冷凍保存され得る。
【0078】
さらにアニーリングは、適切な条件を達成するために塩および温度を調節して実施され得る。ハイブリダイゼーション反応は、約10mM NaCl〜約600mM NaClの範囲の溶液中で約37℃〜約65℃の範囲の温度で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、塩濃度および温度の両方で決定されることが理解される。例えば、10mMの塩中にて37℃で実施されるハイブリダイゼーションは、500mMの塩中にて65℃で実施されるものと同様なストリンジェンシーであり得る。本発明については、相同的な相補性配列の間にハイブリッドを形成するいかなるハイブリダイゼーション条件も使用され得る。
【0079】
図1に示されるように、1つの実施形態では、ベクター部分が(長距離PCRを使用して、プラスミドライブラリーから増幅された)標的遺伝子に対して実質的に相同である2つの異なった領域を含み、そして、フラグメントが選択マーカーをコードする遺伝子である場合、構築物は、これらの任意のアニーリング手順を使用した後に作成される。
【0080】
アニーリング後、構築物は、当該技術分野で公知である方法によってコンピテントなE.coli細胞中へ形質転換され、構築物を増幅する。次いで、単離された構築物は、ES細胞中への導入のための準備が整う。
【0081】
別の実施形態では、目的のクローンは、PCRを使用してプールされたゲノムライブラリー中で同定される。1つの実施形態では、PCR条件は、選択マーカーをコードする遺伝子がポジティブに同定されたクローン中に直接的に挿入され得るようなものである。このマーカーは、標的DNAに対して実質的な相同性を有する2つの異なった配列の間に配置される。
【0082】
ゲノムファージライブラリーは、当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。好ましくは、マウス肺性幹細胞ライブラリーは、λファージ中でゲノムDNAを長さ約20キロベースであるフラグメントに切断して調製される。次いで、これらのフラグメントは、任意の好適なλクローニングベクター(例えば、λFix IIまたはλDash II(Stratagene,La Jolla,Ca))中に挿入される。
【0083】
ライブラリーから多数のクローンを迅速に、かつ効率的にスクリーニングするために、プールは、平板培養されたライブラリーを作製し得る。好ましい実施形態では、ゲノムλファージライブラリーは、プレート当たり約1,000クローン(プラーク)の密度で平板培養される。生物の全ゲノムを何度も表すに充分なプレートが、作製される。例えば、約1,000,000クローン(1000プレート)は、約8個のゲノム等価物を生じる。次いで、プラークが、例えば、緩衝溶液でプレートを覆い、プレートをインキュベートし、そして緩衝液を再収集して回収される。使用される緩衝液の量は、プレートの大きさによって変化する。一般的に、直径100mmの1つのプレートは、約4mlの緩衝液を使用して覆われ、約2mlが回収される。
【0084】
個々のプレート溶解物はこの手順のいずれの時点でもプールされ得、これらはいかなる組み合わせでもプールされ得ることが理解されるだろう。しかし、1つのクローンのその後の同定を容易にするには、各プレート溶解物を別個に保存し、次いでプールとすることが好ましい。例えば、各2mlの溶解物は、96穴ディープウェルプレートに置かれ得る。次いで、プールは、各ウェルからある量、好ましくは約100μlを取り出し、新規なプレートのウェル中でそれらを一緒にすることによって形成され得る。好ましくは、12の個々のプレート溶解物100μlが1つのウェルで一緒にされ、12,000クローンのライブリラリーを表す1.2mlのプールを形成する。
【0085】
次いで各プールは、標的遺伝子を増幅することが公知である1セットのPCRプライマーを使用してPCR増幅される。標的遺伝子は、GenBankまたはEMBLなどの公に入手可能である核酸配列データベースから得られる公知の全長遺伝子、またはより好ましくは、部分的cDNA配列であり得る。これらのデータベースは、発現配列タグ(EST)として公知である部分的cDNA配列を含む。オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、当該技術分野で公知である任意の方法でいかなる生物からも単離され得るか、あるいは好ましくは、化学的手段で合成され得る。
【0086】
一旦、標的遺伝子のポジティブクローンがゲノムライブラリーで同定されると、標的遺伝子の別個の部分をコードする2つのフラグメントが、生成されなければならない。言い換えると、標的の小さな公知領域(例えばEST)のフランキング領域が生成される。各フランキング領域のサイズは重大でなく、100塩基対ほど少ないものから100kbほど多いものまでにわたり得るが、好ましくは、各フランキングフラグメントは、約1kb長より長く、より好ましくは約1〜約10kb、さらにより好ましくは約1〜約5kbである。当業者は、より大きなフラグメントがES細胞での相同組換え事象の数を増加し得るが、より大きなフラグメントはまた、クローニングするにはより困難であることを認識する。
【0087】
1つの実施形態では、フランキングフラグメントを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドPCRプライマーの1つは、ライブラリークローニングベクター(例えば、λファージ)に特異的である。従って、ライブラリーがλファージライブラリーである場合、λファージアームに特異的なプライマーは、長いフランキングフラグメントを生成するポジティブクローンに特異的なプライマーと組合わせて使用され得る。多数のPCR反応が、異なった組み合わせのプライマーを試験するためにセットアップされ得る。好ましくは、使用されるプライマーは、長さ約2〜約6kbのフランキング配列を生成する。
【0088】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、フラグメントがクローニングされるベクターに相補的な5’配列を有するように設計される。さらに、プライマーはまた、構築物がアセンブリされる場合、フランキング配列がベクターおよび互いに関して適切な3’−5’方向にあるように設計される。
【0089】
従って、PCRに基づく方法を使用して、例えば、ポジティブクローンは、電気泳動ゲル上のバンドを可視化することにより同定され得る。
【0090】
1つの局面では、クローニングは、ベクターおよび2つのフラグメントを含む。ベクターは、ポジティブ選択マーカー、好ましくはNeor、および標的遺伝子の2つの異なった領域のためのポジティブ選択マーカーの両側部上のクローニング部位を含む。必要に応じて、このベクターはまた、好ましくはポジティブ選択マーカーの反対に配置されるスクリーニングマーカー(レポーター遺伝子)をコードする配列を含む。スクリーニングマーカーは、相同配列のフランキング領域の外側に配置されるであろう。図3Aは、ベクターの1つの側部に配置される、スクリーニングマーカーであるGFPを有するベクターの1つの実施形態を示す。しかし、スクリーニングマーカーは、ポジティブ選択マーカーであるNeorの反対の側部上のNotIおよびSite4の間のどこにでも配置され得る。 【0091】
好適なベクターの1つの例は、配列番号1の配列を有する図2に示されるプラスミドベクターである。図1で「部位1、2、3または4」と呼ばれる特異的核酸連結非依存性クローニング部位(本明細書中ではアニーリング部位とも呼ぶ)は、本明細書中でも示される。一般的に、クローニング部位は、少なくとも1つの型の塩基、すなわちチミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)またはアデニン(A)を欠く。従って、1つの欠失するヌクレオチドのみの存在下にポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼの両者として作用する酵素とベクターを反応させることは、オーバーハングを作製する。例えば、T4DNAポリメラーゼは3’−5’エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼの両者として作用する。従って、ポリメラーゼ活性に利用可能なヌクレオチドが不充分である場合、T4は、エキソヌクレアーゼとして作用する。従って、特異的オーバーハングは、dTTPのみの存在下にT4DNAポリメラーゼとpDG2ベクターを反応させることによって作製され得る。本発明の実施において有用な他の酵素、例えばウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)(例えば、WO93/18175を参照のこと)は当業者には公知である。本明細書中に例示されるベクターは、24ヌクレオチドのオーバーハングを有する。首尾よい連結非依存性クローニングには、5ヌクレオチドほどしか必要でないことは、当業者には公知である。
【0092】
別の実施形態では、構築物は、2工程クローニング手順でアセンブリされる。第1工程で、相同な各クローニング領域は、ベクターのアニーリング部位の2つに別個にクローニングされる。例えば、相同な「上流」領域は、アニーリング部位1および2にクローニングされ、一方、別個のクローニングである相同な「下流」領域はアニーリング部位3および4中にクローニングされる。一旦、相同な1つの領域の各々を含むクローンが同定されると、制限酵素で各クローンを消化することによって、相同性を有する両領域を含むターゲティング構築物が作製され得る(ここで、1つの酵素はアニーリング部位1(例えば、図2AのNotI)の外側を消化し、別の酵素はポジティブ選択マーカーとアニーリング部位3(例えば、図2AのSalI)との間を消化する)。それぞれの構築物から得たフランキング相同領域を含むフラグメントは、(例えば、ゲル電気泳動で)精製され、そして当該技術分野で公知である標準的連結技術を使用して結合されて、結果として得られるターゲティング構築物を生産する。
【0093】
さらに別の実施形態では、本発明の1つの局面による構築物は単一工程、四方向連結手法で形成され得る。ベクターおよびフラグメントは上記のように処理される。簡単には、ベクターは処理されて2片を形成し、各片は各末端に特異的配列の1本鎖テイルを有する。同様に、PCR増幅フランキングフラグメントも処理されて、ベクター片のテイルと相補的である1本鎖テイルを形成する。処理されたベクター片およびフラグメントは結合され、上記のようにアニールされる。1本鎖テイルの特異性ゆえに、最終構築物は適切な配向性を有するポジティブ選択マーカーによって分離されたフラグメントを含むであろう。
【0094】
最終プラスミド構築物は細菌内で増幅され、精製され、次いでES細胞中に導入され得るか、あるいは使用まで−20℃に冷凍貯蔵される。所望である場合には、ベクターは胚幹細胞株中に導入され(例えば、エレクトロポレーションで)、そして導入されたDNAが内因性DNAと相同組換えされた細胞が選択される(例えば、Li,et.al.,Cell,69:91526(1992)を参照のこと)。成功する組換えは、PCRおよび/またはサザン分析のような当該分野で公知である種々の技術を使用して立証され得る。代表的に、数百の個々のコロニーがG418(Neoカセットについて)での薬剤選択により選択され、DNA調製のために拡大され、そしてPCR分析によって相同組換えについてスクリーニングされる。PCRスクリーニング手順は、ターゲティングベクターに存在しない標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、およびNeo(または他の選択可能マーカー)カセットに対応するオリゴヌクレオチドを使用する。ターゲティングベクターの外側にあるオリゴヌクレオチドの選択は、ターゲティングベクターのランダムな組込みから相同組換え体を区別するために使用される。一般的には、ターゲティングベクター上に存在しない4つの非依存性標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、Neoの挿入部位に隣接する標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせた野生型ES細胞DNA上で試験される(図9)。バックグラウンドのバンドを生成するか、あるいは予定された大きさの産物を生ずることができないオリゴヌクレオチドは除かれる。1つの標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは選択され、Neoカセットに対応するオリゴヌクレオチドと対を形成する。このスクリーニングでPCRポジティブであるES細胞は、もとのオリゴヌクレオチド対に隣接するがこれとは区別される異なった対の標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびNeo遺伝子(または他の選択可能マーカー)特異的オリゴヌクレオチドを使用する第2のPCR実験によって確認される。さらに、この方法は、マーカー特異的オリゴヌクレオチドと結合した選択可能マーカーの反対側に配置される標的遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して繰り返され得る。この方法では、ターゲティングベクターの両相同配列の適切な組込みが立証される。
【0095】
サザンブロットハイブリダイゼーションもまた、ターゲティングベクター上に含まれないが、相同組換えの予定されるクロスオーバー部位に隣接するプローブを使用して、ES細胞標的化事象を確認するために使用し得る。相同組換えについて試験するサザンブロット実験は、野生型染色体と変異体遺伝子標的対立遺伝子を表す2つの区別されるバンドを検出すべきである。高分子量ゲノムDNAは、コントロールES細胞親株、および相同組換えに関してPCRポジティブであるES細胞株から調製される。このDNAは、標的遺伝子DNA相同性のアーム内でターゲティングベクターを切断せず相同組換えの診断となることが制限酵素マッピングによって証明されている制限酵素(EcoRI)で消化される。EcoRI部位がNeo遺伝子中に存在するので、相同組換え事象は、Neoカセットの挿入およびEcoRI部位の付加となるべきである。この部位の付加は、プローブにハイブリダイズするバンドの大きさの全体的低下となることが予測される。消化されたDNAは1%TAEアガロースゲル上で分離され、ナイロン膜に移送され、紫外線(StrataLinker)で架橋され、そして32−P標識DNAプローブでハイブリダイズされる。このプローブは、ターゲティングベクター上にあるDNA配列とハイブリダイズするのでなく、相同組込みの部位に隣接する位置にハイブリダイズする。
【0096】
次いで、選択された細胞は動物(例えば、マウス)の胚盤胞(または例えば桑実胚などの生存可能な動物を作製する目的に適した発育の他の段階)中に注入されて、キメラを形成する(例えば、Bradley,.in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.,IRL,Oxford, 113−152 (1987)(参照)。また、選択されたES細胞を、分離されたマウス胚性細胞と凝集させて、凝集キメラを形成し得る。次いで、キメラ胚は好適な偽妊娠したメスの里親動物中に移植され、胚は満期まで導かれ得る。相同的に組換えられたDNAをその生殖細胞中に有するキメラ子孫が、動物の細胞の全てが相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させるために使用され得る。1つの実施形態では、キメラ子孫マウスは、標的遺伝子にヘテロ接合性破壊を有するマウスを生成するために使用される。次いで、ヘテロ接合性ノックアウトマウスは交尾され得る。通常、このような交尾の結果の1/4が標的遺伝子にホモ接合性破壊を有するであろうことは、当該技術分野で周知である。
【0097】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性ノックアウトマウスは正常な野生型マウスと比較されて、標的遺伝子の破壊が表現型変化、特に病理学的変化を引き起こすか否かを決定し得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスは、物理的試験、検死、組織像、臨床化学、全血球数、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価により、表現型変化について評価され得る。
【0098】
1つの実施形態では、標的遺伝子の破壊に関連する表現型(または表現型変化)はデータベース中に入れるか、あるいは蓄えられる。好ましくは、データベースは、(i)遺伝子型データ(例えば、破壊された遺伝子の同定)および(ii)遺伝子型データに関連する表現型データ(例えば、遺伝子破壊から生じる表現型)を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは検索可能であるように、好ましくは検索ツールと組み合わされる。
【0099】
さらに、本発明は、組換え方法を使用して生産された動物などの条件ノックアウト動物を意図する。バクテリオファージP1Creリコンビナーゼ、および酵母プラスミドから得たflpリコンビナーゼは、特異的標的部位(creリコンビナーゼではloxP部位およびflpリコンビナーゼではfrt部位)でDNAを切断し、第2の切断部位へこのDNAの連結を触媒する部位特異的DNAリコンビナーゼ酵素の2つの非制限的例である。多数の好適な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、これらの遺伝子は本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのIntリコンビナーゼ(Xisを有するか、あるいは有さない)(Weisberg,R.et al.,in Lambda II,(Hendrix,R.,et al.編),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,211−50頁(1983)(本明細書中に参考として導入される));TpnIおよびβ−ラクタマーゼ転移因子(Mercier,et al.,J.Bacteriol.,172:3745−57(1990));Tn3リソルバーゼ(Flanagan & Fennewald J.Molec.Biol.206:295−304(1989);Stark,et al.,Cell,58:779−90(1989));酵母リコンビナーゼ(Matsuzaki,et al.,J. Bacteriol.,172:610−18(1990));B.スブチリス(subtilis)SpoIVCリコンビナーゼ(Sato,et al.,J.Bacteriol.,172:1092−98 (1990));Flpリコンビナーゼ(Schwartz & Sadowski,J.Molec.Biol.,205:647−658(1989);Parsons,et al.,J.Biol.Chem.,265:4527−33(1990);Golic & Lindquist,Cell,59:499−50
(1989);Amin,et al.,J.Molec.Biol.,214:55−72(1990));Hinリコンビナーゼ(Glasgow et al.,J.Biol.Chem.,264:10072−82 (1989));免疫グロブリンリコンビナーゼ(Malynn,et al.,Cell,54:453−460(1988));およびCinリコンビナーゼ(Haffer & Bickle,EMBO J.,7:3991−3996(1988);Hubner,et al.,J.Molec.Biol.,205:493−500(1989))(全ては本明細書中に参考として導入される)が挙げられる。このようなシステムは、Echols(J.Biol.Chem.265:14697−14700(1990)):de Villartay(Nature,335:170−74(1998):Craig(Ann.Rev.Genet.,22:77−105(1988));Poyart−Salmeron,et al.,(EMBO J.8:2425−33(1989));Hunger−Bertling,et al.,(Mol Cell.Biochem.,92:107−16(1990));およびCregg & Madden (Mol.Gen.Genet.,219:320−23(1989))(全てが本明細書中に参考として導入される)によって議論されている。
【0100】
Creは均質に精製され、loxP部位との反応は広く特性化されている(Abremski & Hess J.Mol.Biol.259:1509−14(1984)(本明細書中に参考として導入される))。Creタンパク質は分子量35,000を有し、New England Nuclear/Du Pontから市場で入手され得る。このcre遺伝子(Creタンパク質をコードする)はクローン化され、発現されている(Abremski,et al. Cell32:1301−11(1983)(本明細書中に参考として導入される)。Creタンパク質は、同じまたは異なったDNA分子上に存在し得る2つのloxP配列の間の組換えを仲介する(Sternberg,et al.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.45:297−309(1981))。loxP部位の内部スペーサー配列は非対称であるから、2つのloxP部位は互いに相対する方向性を示し得る(Hoess & Abremski Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1026−29(1984))。したがって、同じDNA分子上の2つの部位が直接的に繰り返された方向にある場合、Creは部位間のDNAを切除するであろう(Abremski,et al.Cell 32:1301−11(1983))。しかしながら、もしもこの部位が互いに反転されるなら、これらの間のDNAは組換え後に切除されるのではなく単に反転される。したがって、直接方向に2つのloxP部位を有する環状DNA分子が組換えられて、2つのより小さな環を生産する。これに対して、反転された方向に2つのloxP部位を有する環状分子は、loxP部位が隣接するDNA配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のDNA分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【0101】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルの遺伝子機能を特性化する重要な用途を有する。本明細書中に記載される構築物が標的遺伝子を破壊するために使用される場合、ポジティブ選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始部位の下流(3’)に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うある程度のタンパク質発現を生じ得る。ポジティブ選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化、あるいはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているか否かを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。ポジティブ選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、ポジティブ選択マーカーが除去される。このようにして、ポジティブ選択マーカーにより生じる効果または融合転写物の発現は避けられる。
【0102】
1つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は直接微量注入法によって細胞へもたらされる。他の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態の別な態様は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ仲介組換えを実行するための1つの方法は、誘導性であるかあるいは組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節因子を使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用に関する。誘導性発現要素は、好ましくは所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節因子の例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない(No,et al.Proc.Natl.Acd.Sci.USA,93:3346−51(1996);Furth,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:9302−6(1994))。使用することができるさらなる調節因子としては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを導入するベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【0103】
当該技術分野で公知である他の方法が、本発明のトランスジェニック細胞およびノックアウトマウスを生産するために使用され得る。例えば、米国特許第5,464,764号、米国特許第5,487,992号、米国特許第5,627,059号、米国特許第5,631,153号に記載される方法は、本発明によってもたらされる標的遺伝子の破壊を含むトランスジェニック細胞またはノックアウトマウスを生産するために使用され得る。
【0104】
(疾患のモデル)
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ(micro−pig)、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。例えば、細胞および動物に基づいたモデル系は、標的遺伝子をさらに特性化するために使用され得る。このようなアッセイは、疾患症状を回復させることが可能である化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に暴露され得る。これは、暴露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。暴露された後、細胞は1つまたは複数の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に暴露され得る。これは、暴露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。暴露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転(reversal)を評価してモニターされ得る。暴露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を暴露することを含み得る。新生児、若年および成人の動物もまた暴露され得る。
【0105】
より具体的には、本発明の動物モデルを使用して、薬剤および/または化合物を同定する方法が、好ましくは、標的遺伝子をコードする遺伝子中の破壊に関連する生理学的、組織学的または行動的表現型に影響を与える薬剤および/または化合物の能力に基づいて提供される。
【0106】
1つの実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現または機能を調節する能力を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有する、本発明の非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与することを含む。この方法は、例えば薬剤に対する動物の反応を測定し、このような動物の反応をコントロール動物と比較することを含む。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ(例えば、遺伝子転写、タンパク質生産および分解速度)、物理的パラメーター(例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、PTT.T、またはTT)および細胞アッセイ(例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力)が使用され得る。
【0107】
本発明の動物および細胞は、標的遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。
【0108】
本発明はまた、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【0109】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム(例えば、「分散分析」またはANOVAなど)を使用して実施され得る。約0.05以下の「p」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いp値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物(またはその群)の挙動と野生型マウス(またはその群)の挙動を、典型的にはある定められた条件下に比較を行う。本明細書中に使用されるように、「異常な行動」とは、標的遺伝子に破壊を有しない動物(例えば野生型マウス)と異なる、標的遺伝子に破壊を有する動物(例えばトランスジェニック動物)によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定(または観察)および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る(例えば、CrawleyおよびPaylor,Hormones and Behavior 31:197−211(1997)を参照のこと)。
【0111】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを暴露することを含む。動物の社会的挙動(例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾)が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る(例えば、S.E.File,et al.,Pharmacol.Bioch.Behav.22:941−944(1985);R.R.Holson,Phys.Behav.37:239−247(1986)参照)。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【0112】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚(通常、聴覚性)刺激に暴露し、動物の驚愕反応を測定することを含む(例えば、M.A.Geyer,et al.,Brain Res.Bull.25:485−498(1990);PaylorおよびCrawley,Psychopharmacology 132:169−180(1997)参照)。(正常な驚愕反応からの)抑制パーセントは驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える(cueing)」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた使用され得る。
【0113】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への暴露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、G.J.Kant,et al.,Pharm.Bioch.Behav.20:793−797(1984);N.J.Leidenheimer,et al.,Pharmacol.Bioch.Behav.30:351−355(1988)参照)。
【0114】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ/または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である(例えば、M.Bertolucci D’Angic,et al.,Neurochem.55:1208−1214(1990)参照)。
【0115】
新規の試験は、通常、新奇な環境および/または新奇な対象への暴露を含む。新奇な環境および/または新奇な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される(例えば、D.K.Reinstein,et al.,Pharm.Bioch.Behav.17:193−202(1982);B.Poucet,Behav.Neurosci.103:1009−10016(1989);R.R.Holson,et al.,Phys.Behav.37:231−238(1986)を参照のこと)。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【0116】
学習された無力(helplessness)試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への暴露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る(例えば、A.Leshner,et al.,Behav.Neural Biol.26:497−501(1979)参照)。
【0117】
また、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると信じられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると信じられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先たってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させると研究が示している。
【0118】
モーリス水迷路試験(Morris water−maze test)は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、E.M.Spruijt,et al.,Brain Res.527:192−197(1990)を参照のこと)。
【0119】
また、Y字型迷路が使用され得る(例えば、McFarland,D.J.,Pharmacology,Biochemistry and Behavior 32:723−726(1989);Dellu,F.,et al.,Neurobiology of Learning and Memory 73:31−48(2000)を参照のこと)。Y迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Y迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約40cm×8cm×20cmであり得る。各アームは例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた16のフォトビームも有することができる。少なくとも2種の異なった試験がこのようなY迷路を使用して実施され得る。連続Y迷路パラダイムでは、マウスに例えば約10分間、Y迷路の3つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は動物が2回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的(egocentrically)に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。2つの試験的Y迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新奇性および空間記憶に対する反応を測定する。第1の試験(取得)中、動物は、例えば約15分間、自由にY迷路の2つのアームを訪問し得る。第3のアームはこの試験中、遮蔽されている。第2の試験(回復)は例えば約2時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約5分間、3つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の3つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり(cue)に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を仲介するその遺伝子の役割を示し得る。
【0120】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には2つ以上の環境への暴露を含み、そのうちの1つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む(例えば、R.Ader,et al.,Psychon.Sci.26:125−128(1972);R.R.Holson,Phys.Behav.37:221−230(1986)参照)。また、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、2つの開放および2つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約5分間、探索させる。このパラダイムは、ゲッ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安の程度を測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【0121】
食物回避試験は、新しい食物への暴露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、B.A.Campbell,et al.,J.Comp.Physiol.Psychol.67:15−22(1969)を参照のこと)。
【0122】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に暴露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、H.A.Baldwin,et al.,Brain Res.Bull,20:603−606(1988)参照)。
【0123】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤(例えば、アンフェタミン、コカイン、PCPなど)の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.B.S.Clarke,et al.,Psychopharmacology 96:511−520(1988);P. Kuczenski,et al.,J.Neuroscience11:2703−2712(1991)を参照のこと)。
【0124】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および/または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される(例えば、S.Nassif,et al.,Brain Res.,332:247−257(1985);W.L.Isaac,et al.,Behav.Neurosci.103:345−355(1989)参照)。
【0125】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、L.E.Jarrard,et al.,Exp.Brain Res.61:519−530(1986)参照)。
【0126】
DRL(低反応率分化強化)実施試験は間欠的報酬パラダイムに暴露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、J.D.Sinden,et al.,Behav.Neurosci.100:320−329(1986);V.Nalwa,et al.,Behav.Brain Res.17:73−76(1985);およびA.J.Nomneman,et al.,J.Comp.Physiol.Psych.95:588−602(1981)を参照のこと)。
【0127】
空間学習試験は、複雑で新奇の環境に暴露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、N.Pitsikas,et al.,Pharm.Bioch.Behav.38:931−934(1991);B.poucet,etal.,Brain Res.37:269−280(1990);D.Christie,etal.,Brain Res.37:263−268(1990);およびF.Van Haaren,et al.,Behav.Neurosci.102:481−488(1988)を参照のこと)。また、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド(of)試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な(すなわち心配性でない)マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【0128】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に暴露し、例えば環境に適応する(orienting)反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、J.M.Vargo.et al.,Exp.Neurol.102:199−209(1988)を参照のこと)。
【0129】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験(例えば、P.J.Fletcherら、Psychopharmacol.102:301−308(1990);M.G.Cordaら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:2072−2076(1983)参照)を使用して統計的に解析される。
【0130】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。1つまたは2つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約5〜10分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間(対象物への接近、例えば約3〜5cm以内での動きが対象物の探索とみなされる)が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新奇な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新奇な対象物を探索することに費やす時間の割合(再び、約5〜10分間の時間をかけて)が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新奇な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物(好ましくは単純なブロック)がスプレーされるか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ、新奇な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新奇恐怖症(neophobia)を示す。
【0131】
熱板痛覚脱失試験(hot plate analgesia test)は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約55℃の熱板上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間(例えば、後足を持ち上げて後足をなめる時間)が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【0132】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調および平衡を測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル(または回転丸太)のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約60rpmの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低20分間あけて少なくとも3回、試験される。もっとも長くロッド上に留まることができるマウスはより良好な協調および平衡を有すると考えられる。
【0133】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール5mg/ml溶液は、例えば、約0.375ml/分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。4つの区別される生理学的段階が記録され得る:注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展(tonic extension)」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【0134】
(標的遺伝子産物)
本発明はさらに、標的遺伝子産物を生産するための標的遺伝子配列の使用を意図する。標的遺伝子産物は、機能的に等価な遺伝子産物を代表するタンパク質を含み得る。このような等価遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これはサイレント変化を生じ、したがって機能的に等価な標的遺伝子産物を生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性の性質の類似性に基づいて作製され得る。
【0135】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ;極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ;そして負に荷電した(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書中に使用されるよ場合、「機能的に等価である」とは、標的遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に同様なインビボ活性を示すことができるタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価である」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分が行う方法と実質的に同様な方法で他の細胞内分子または細胞外分子と相互作用することができるペプチドをいう場合がある。
【0136】
本発明の方法により有用である他のタンパク質産物は、組換えまたは合成手段で生産された標的遺伝子から誘導されるか、あるいはこれに基づくペプチド(誘導ペプチド)である。
【0137】
標的遺伝子産物は、当該技術分野で周知である技術を使用して、組換えDNA技術によって生産され得る。したがって、遺伝子配列をコードする核酸を発現して本発明の遺伝子のポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。当業者に周知である方法は、タンパク質コード遺伝子配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には例えばインビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる(例えば、Sambrookら、1989(上掲)およびAusubelら、1989(上掲)参照)。あるいは、タンパク質の遺伝子配列をコードすることができるRNAは、例えば自動合成器(例えば、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Gait,M.J.編、IRL Press,Oxford(1984)参照)を使用して化学的に合成され得る。
【0138】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列を発現するために使用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が生産され、続いて精製され得る媒体を示すが、適切な配列をコードするヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明の遺伝子のタンパク質を示し得る細胞も示すことができる。これらには、タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、S.subtilis)などの微生物;タンパク質コード遺伝子配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia;タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染されるか、あるいはタンパク質コード遺伝子配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換される植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0139】
細菌系では、多くの発現ベクターは、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、たとえば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、E.coli発現ベクターpUR278(このベクターにおいて、タンパク質コード遺伝子配列は、融合タンパク質が生産されるように、lacZコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結される)(Rutherら、EMBO J.、2:1791−94(1983));pINベクター(Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.、13:3101−09(1985);Van Heekeら、J.Biol.Chem.、264:5503−9(1989))などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)を用いて外来ポリペプチドを融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、結果として、クローン化された標的遺伝子タンパク質がGST部分から放出され得る。
【0140】
好ましい実施形態では、完全長のcDNA配列が、標準的PCR方法論(Innisら(編)、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press、San Diego (1990))を使用してアミノ末端でインフレームBamHI部位に、そしてカルボキシ末端でインフレームEcoRI部位に付加され、pGEX−2TKベクター(Pharmacia、Uppsala、Sweden)中に連結される。得られたcDNA構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンS−トランスフェラーゼ配列を含む(Nilssonら、EMBO J.、4:1075−80(1985);Zabeauら、EMBO J.、1:1217−24(1982))。
【0141】
昆虫系では、Autographa californica核多角体ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置かれ得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖性組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性被覆を欠くウイルス)の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞を感染するために使用される(例えば、Smithら、J.Virol.46:584−93(1983);米国特許第4,745,051号参照)。
【0142】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用される。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、対象の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列)に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子はインビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)での挿入は、生存可能かつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質発現が可能な組換えウイルスを生じる(例えば、Loganら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、81:3655−59(1984)参照)。特異の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームを有する相(phase)中になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源(天然および合成の両方)のものであり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入(inclusion)によって増強される(Bitterら、Methods in Enzymol.、153:516−44(1987)参照)。
【0143】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)はタンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0144】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が操作される。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現調節因子(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択可能マーカーで形質転換され得る。外来DNAの導入後に操作された細胞は富化培地中で1〜2日間、増殖させられ、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは選択に対して耐性を与え、その染色体中にプラスミドを安定して組み込み、そして増殖する細胞が、次々にクローン化され、細胞株において広がり得る病巣を形成させる。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【0145】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および/または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソンおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス性、特にHIVプロモーターなどの特定転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。1つの実施形態では、Tet誘導性遺伝子発現系が使用される(Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547−51(1992);Gossenら、Science、268:1766−69 (1995))。Tet発現系は、E.coliTn10トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の2つの調節エレメント(テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)およびTetRに結合するテトラサイクリンオペレーター配列(tetO))に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はtetOオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同じにトランスフェクトされたTetRの存在下で、組換えタンパク質の発現はtetO調節エレメントへのTetRタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルで調節された遺伝子発現はTetRに結合するためのtetOエレメントと競合するテトラサイクリン(Tc)またはドキシサイクリン(Dox)などのTc誘導体の濃度を変化させることに応答して誘導され得る。tet誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、CLONTECH Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA.から市販されている。
【0146】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。125Iなどの放射性同位元素;基質に暴露されたときに検出可能な発色性シグナルまたは光を発生する酵素標識系;および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えDNA技術がこのようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定化および/または検出を容易にすることができる融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【0147】
間接的標識は遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質(標識抗体など)の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、1本鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0148】
(抗体の生成)
1つまたは複数のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が本明細書に記載される。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化抗体またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の標的遺伝子の検出に、あるいは、異常な標的遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は疾患治療方法の一部として使用してもよく、そして/または診断技術の一部として使用してもよい。その際、患者は標的遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【0149】
抗体の生産について、種々の宿主動物は標的遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントは宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバンドとして、フロイント(完全または不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル(mineral gel)、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびBCG(bacille Calmette−Guerin)および(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0150】
ポリクローナル抗体は標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来抗体分子の異種の集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物は、上記したようなアジュバントを補充された遺伝子産物を注射することにより免疫化され得る。
【0151】
特定の抗原に対する抗体の同種の集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供するための任意の技術によって得られ得る。これらは、KohlerおよびMilstein、Nature、256:495−7(1975);および米国特許第4,376,110号のハイブリドーマ技術、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today、4:72(1983);Coteら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:2026−30(1983))およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、in Monoclonal Anitbodies And Cancer Therapy、Alan R. Liss,Inc.New York、77−96頁(1985))が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびこれらの任意サブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明のmAbを生成するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のmAbの生産が、これを現時点での好ましい生産方法とする。
【0152】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Takedaら、Nature、314:452−54(1985))が使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子(例えば、ネズミmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子)である。
【0153】
また、1本鎖抗体の生産について記載される技術(米国特許第4,946,778号;Bird、Science 242:423−26(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879−83(1988);およびWardら、Nature、334:544−46(1989))は、遺伝子1本鎖抗体を生成するために適用され得る。1本鎖抗体はアミノ酸架橋によってFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、1本鎖ポリペプチドを生じる。
【0154】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知技術によって生成され得る。このようなフラグメントとしては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を低下させることによって生成され得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Fab発現ライブラリーが構築され得(Huse, et al., Science, 246: 1275−81 (1989))、所望な特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【0155】
(治療薬剤のスクリーニング)
標的遺伝子配列を含み、かつ発現する細胞は、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、U937(ATCC#CRL−1593)、THP−1(ATCC#TIB−202)、およびP388D1(ATCC#TIB−63)などの非組換え単球細胞株、HUVECなどの内皮細胞およびウシ大動脈内皮細胞(BAEC);ならびにHeLa細胞およびCOS細胞(例えば、COS−7(ATCC#CRL−1651))などの一般的な哺乳動物細胞系が挙げられ得る。さらに、このような細胞としては組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のノックアウトマウスは疾患に関与する1以上の細胞型を含む細胞株を生成するために使用され得る。これはその障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物は使用され得るが、連続的な細胞株の生成が好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Smallら、Mol Cell Biol.、5:642−48(1985)を参照のこと。
【0156】
標的遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験がなくても利用され得る。標的遺伝子配列はまた破壊されるかあるいは過少発現され得る。標的遺伝子破壊または過少発現された標的遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に寄与する機能の任意の欠失を代償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。
【0157】
インビトロ系は標的遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するために設計され得る。このような化合物としては、D−および/またはL−立体配置アミノ酸から作られたペプチド(例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態;例えば、Lamら、Nature、354:82−4(1991)参照)、ホスホペプチド(例えば、無作為にまたは部分的に縮重した、指向されたホスホペプチドライブラリーの形態;例えば、Songyangら、Cell、72:767−78 (1993)参照)、抗体、および有機または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、標的遺伝子タンパク質、好ましくは変異標的遺伝子タンパク質の活性を調節すること;標的遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成すること;または正常な標的遺伝子相互作用を破壊するか、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて有用であり得る。
【0158】
標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、2つの化合物が相互作用および結合することを可能にするために充分な条件下で十分な時間、標的遺伝子タンパクと試験化合物の反応混合物を調製し、反応混合物から取り除かれ、そして/または検出され得る複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う1つの方法は、固相上に標的遺伝子タンパク質または試験物質を付着する工程、および反応の最後に固相上に付着させた標的タンパク質/試験物質複合体を検出する工程を包含する。このような方法の1つの実施形態では、標的遺伝子タンパク質は固体表面上に付着され得、そして付着されない試験化合物が直接的または間接的にのいずれかで標識され得る。
【0159】
実際には、マイクロタイタープレートが便宜的に使用される。付着された成分は非共有または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は単にタンパク質溶液で固体表面を被覆し、乾燥することによって達成され得る。あるいは、固定化抗体、好ましくはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を付着するために使用され得る。その表面は予め調製され、かつ貯蔵されていてもよい。
【0160】
アッセイを実施するために、固定化されなかった成分は、付着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下に除去(例えば、水洗)される。固体表面上に付着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。既に固定化されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。前に固体化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が表面上に付着された複合体を検出するために、使用され得る;例えば、前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体(順次、標識された抗−Ig抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る抗体)を使用する。
【0161】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体は、例えば、標的遺伝子産物に特異的な固定化抗体または溶液中に形成された任意の複合体を付着する試験化合物、および付着された複合体を検出するために可能性ある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して検出される。
【0162】
上記された方法の1つによって特定の標識遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力について試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび/またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【0163】
(アンチセンス、リボザイム、および抗体)
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、標的遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異標的遺伝子活性を低下または阻害する薬剤は、疾患症状を回復させるために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重螺旋分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【0164】
アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズし、かつタンパク質翻訳を阻害することにより、mRNAの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンスDNAに関して、翻訳開始部位、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【0165】
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒することが可能な酵素的RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断(endonucleolytic cleavage)を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子mRNAに対して相補的な1以上の配列を含まなければならず、そしてmRNA切断に起因する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列としては、米国特許第5,093,246号を参照のこと(その全体が本明細書中に参考として援用される)。本発明の範囲内で、標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒するハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が操作される。
【0166】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は最初、以下の配列、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位のための目的の分子をスキャニングすることにより同定される。一旦、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20の間のリボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を所望のものでなくし得る、二次構造などの予想される構造的特徴について評価され得る。候補配列の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためのそれらの接触性を試験することにより評価され得る。
【0167】
転写の阻害のための三重螺旋形成に使用される核酸分子は1本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Hoogsteen型塩基対の法則によって三重螺旋形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長(stretch)を必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重螺旋の3本の関連した鎖にわたってTATおよびCGCトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。ピリミジンに富む分子は、その鎖に平行に配向した二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域に相補的である塩基を提供する。さらに、例えばG残基の伸長を含む、プリンに富む核酸分子が選択され得る。これらの分子は、GC対に富むDNA二重鎖とともに三重螺旋を形成する。そこでは、大多数のプリン残基は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に配置され、三重鎖の3本鎖にわたりGGCトリプレットを生じる。
【0168】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化することができる潜在的配列は、「スイッチバック」核酸分子と呼ばれるものを作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長の必要性を排除するように、交互5’−3’、3’−5’様式で合成される。
【0169】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび/または三重螺旋分子は、正常および変異標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるmRNAの転写(三重螺旋)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低減あるいは阻止し得る。標的遺伝子活性の十分に正常な程度が維持されることを確証するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性を有する配列を含まない細胞中へ導入され得る。また、細胞または組織の標的遺伝子活性の必須の程度を維持するために、細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合もある。
【0170】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重螺旋分子はDNAおよびRNA分子の合成に関する当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート(phosphoramidate)化学合成法など、当該技術分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。またはRNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入される。また、使用されるプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導可能にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞系中に安定して導入され得る。
【0171】
DNA分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入される。可能性ある修飾としては、分子の5’および3’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの主鎖内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは2’O−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【0172】
標的遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異標的遺伝子機能を阻止するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自身に対して、またはタンパク質一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、1本鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0173】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ全抗体が使用される例では、抗体を内在化させることが好ましい場合がある。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、細胞中へ標的遺伝子エピトープに結合する抗体またはFab領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または広がった標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成されるか、あるいは組換えDNA技術により生産され得る(例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles (1984) W.H. Freeman, New York 1983, 前出;およびSambrookら、 1989,前出、参照)。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する1本鎖中和抗体も投与され得る。このような1本鎖抗体は、例えばMarascoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889−93 (1993)に記載される技術などを使用することにより、例えば、標的細胞集団内の1本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することで投与され得る。
【0174】
標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列は、疾患症状が改善されるような、ある程度の標的遺伝子タンパク質の生産に十分である濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与される。患者は遺伝子置換治療法で治療されてもよい。正常な標的遺伝子の1つまたは複数の複製物、または標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入される。ベクターとしては、リポソームなどの細胞中にDNAを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な標的遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【0175】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な標的遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者の中に導入されるかあるいは再導入され得る。
【0176】
(薬学的組成物、有効量、および投与経路)
標的変異体遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を治療または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【0177】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、LD50(集団の50%の致死量)およびED50(集団の50%の治療的有効量)を測定することについて、細胞培養物または実験動物の標準的な薬学的方法により決定され得る。毒性と治療的効果との用量割合は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用される間は、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へのこのような化合物を標的とする送達系を設計するように注意すべきである。
【0178】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方することに使用され得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないED50を含む循環濃度範囲内にある。この用量は使用される投与形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなIC50(すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方される。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【0179】
本発明により使用するための薬学的組成物は、1つまたは複数の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。したがって、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気(口または鼻のいずれかから)、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方される。また、薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも考えられる。
【0180】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤(例えば、前糊化(pregelatinised)トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸塩ナトリウムスターチ(sodium starch glycolate));または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態(例えば錠剤またはカプセル)をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適した媒体を用いて構成する乾燥製品として存在してもよい。このような液体調製剤は懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水溶性媒体(例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などの薬学的に受容可能な添加剤を使用する従来の手段によって調製され得る。この調製剤はまた、適切に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含む。
【0181】
経口投与の場合の調製剤は、活性化合物を制御して放出させるように適切に処方され得る。
【0182】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【0183】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー形態で便宜的に送達される。加圧エアゾールの場合には、用量単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入または通気に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基材との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【0184】
この化合物は注射、例えば、一回大量注入(bolus injection)または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、単位用量形態、例えば添加された保存剤とともにアンプルまたは多用量容器に入れられ得る。この組成物は懸濁液、溶液、または油性または水性媒体中の乳化液のような形態をとることができ、懸濁、安定化および/または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。また、活性成分は使用前に適切な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【0185】
この化合物はまた、例えば、ココア脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基材を含む座薬または保持性浣腸(retention enemas)などの直腸用組成物として処方される。経口摂取はおそらく、いなかる投薬の中で最も容易な方法である。このような投与経路は一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これはタンパク質および他の生物学的活性組成物を含む多くの物質には好ましくない環境である胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性およびタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口から摂取した場合、広範囲に多様な生物学的活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかのものが胃を通過して、小腸で体内に吸収されることは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤はしばしば皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口などの他の方法で摂取されなければならない。
【0186】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液(例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩)、可溶化剤(例えば、ツィーン(Tween)、ポリソルベート)、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤(チメロサール、ベンジルアルコール)およびアスコルビン酸などの抗酸化剤を含み得る。安定化剤はTween−20、Tween−80、NP−40またはTritonX−100などの界面活性剤であり得る。EBPはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の微粒子調製物中に導入され得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な検索は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th(編)、 A.R. Gennaro(編)、 Mack Publishing, Easton, Pa (1990)に見られる。
【0187】
先に記載した処方剤のほかに、化合物はまたデポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方剤は移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、化合物は適切な高分子または疎水性物質(例えば、受容可能な油中の乳化剤として)またはイオン交換樹脂とともに処方されるか、または難溶解性誘導体として(例えば、難溶解性塩として)処方され得る。
【0188】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む1つまたは複数の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れられていてもよい。このパックは例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は投与のための指示書が添付されていてもよい。
【0189】
(診断薬)
標的遺伝子に関連した疾患症状を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的に、試薬が、例えば標的遺伝子変異の存在を検出するために、あるいは標的遺伝子mRNAの過剰発現(over expression)または不完全な発現(under expression)のいずれかを検出するために使用される。
【0190】
本発明の診断および予後判定(prognostic)方法によれば、野生型標的遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法はまた、野生型標的遺伝子座を検出し、疾病素因または新形成の欠如を確認することによって実施され得る。「野生型遺伝子の変化」はコードまたは非コード領域の欠失、挿入および点変異を含む変異のすべての形態を包含する。欠失は全遺伝子または遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異はある組織(例えば腫瘍組織)にだけ生じるものであり、生殖系列に遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され、遺伝され得る。ただ1つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかしながら、もしも両方の対立遺伝子が変異されるなら、そのときは、後期新形成状態が示される。したがって、遺伝子変異の発見は診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない標的遺伝子対立遺伝子(例えば、標的遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる)は、挿入、小欠失および点変異などの他の変異のためにスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見られる変異は、標的遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異はまた、癌状態にも関連し得る。点変異事象は、mRNAの発現の損失または減少をもたらす遺伝子のプロモーター中などの調節領域中で生じ得る。点変異はまた、標的遺伝子産物の発現の損失をもたらすか、あるいはmRNAの安定性または翻訳効率の減少をもたらす適切なRNAプロセッシングを無効とする。
【0191】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な1つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接に比較することである。また、例えばPCRによって増幅後、メッセンジャーRNAを配列決定し、それによって候補遺伝子のエクソン構造を決定する必要性を排除することができる。標的遺伝子のコード領域の外側に起こる(fall)癌患者の変異は、標的遺伝子の近くまたはその中のイントロンおよび調節配列などの非コード領域を試験することにより検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさのまたは多量のメッセンジャーRNA分子を明らかにするノザンブロット実験から判明し得る。
【0192】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含むプレパックされた診断キットを使用して実施され得る。これは、例えば、疾患症状を示すか、あるいは疾患が進展する危険性のある患者を診断する臨床設定において便宜的に使用される。
【0193】
遺伝子が発現されるいかなる細胞型または組織、好ましくは単球、内皮細胞または平滑筋細胞も、以下に記載される診断において使用される。
【0194】
分析される細胞型または組織から得たDNAまたはRNAは、当該技術分野で周知である方法を使用して容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片(固定および/または凍結されている)上で、直接にインサイチュー(in situ)にて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュー手法のためのプローブおよび/またはプライマーとして使用され得る(例えば、Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Raven Press, N.Y. (1992)を参照)。
【0195】
遺伝子ヌクレオチド配列、RNAまたはDNAのいずれかは、例えば、疾患関連遺伝子構造および発現を検出するために生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。このようなアッセイとしては、サザンまたはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、1本鎖配座多型分析、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子発現パターンの定量的態様、ならびに遺伝子発現および/または遺伝子組成物の定性的態様の両方を明らかにし得る。すなわち、このような態様としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配列、および/または遺伝子発現の活性化または不活性化が挙げられ得る。
【0196】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、1つまたは複数の標識された核酸試薬と、分析される細胞型または組織から誘導された核酸を、対象の核酸分子内のその相補的配列に、これらの試薬を特異的アニーリングするために好ましい条件下で、接触およびインキュベートすることを含む。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールされない核酸は、核酸:フィンガープリント分子ハイブリッドから除去される。ハイブリダイズしたフィンガープリント組織から得た核酸の存在は、このような分子が存在する場合に検出される。このような検出スキームを使用して、対象の組織または細胞型から得た核酸は、例えば、膜などの固体支持体、またはマイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズなどのプラスチック表面などに固定化される。この場合、インキュベーション後、アニールされない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールされた標識核酸試薬の検出は、当該技術分野で周知である標準的技術を使用して達成される。
【0197】
遺伝子特異的核酸分子の検出に関する別の診断方法は、その増幅、例えばPCR(Mullis米国特許第4,683,202号(1987)に記載の実験の実施形態)、リガーゼ連鎖反応(Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189−93 (1991))、自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelliら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874−78 (1990))、転写増幅システム(Kwohら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173−77 (1989))、Qβレプリカーゼ(Lizardiら、 Bio/Technology, 6: 1197 (1988))、または他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知である技術を使用して増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合に、核酸分子の検出のために特に有用である。
【0198】
このような検出スキームの1つの実施形態では、cDNA分子が対象のRNA分子から(例えば、cDNAへのRNA分子の逆転写によって)得られる。このようなRNAが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および/または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、cDNA内の配列が、PCR増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬(例えば、プライマー)として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出には、核酸増幅が放射性または非放射性標識ヌクレオチドを使用して実施され得る。また、充分に増幅された産物は、この産物が標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【0199】
野生型または変異遺伝子ペプチドに対する抗体はまた、疾患診断薬または予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現の程度の異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および/または組織、細胞内、または細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に関連する変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられる。
【0200】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない、当業者に周知である技術を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、Sambrookら、 (1989)前出、18章を参照されたい。本明細書で使用されるタンパク質検出および単離方法はまた、例えばHarlow および Lane(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988))に記載されるものなどである。
【0201】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【0202】
例えば、本発明で有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用される。これは、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出法と組み合わせて蛍光標識抗体(以下を参照)を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に特に好ましい。
【0203】
本発明で有用である抗体(またはそのフラグメント)は、さらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュー検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法で組織学的に使用され得る。インサイチュー検出は患者から組織学的検体を取り出し、その検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成される。抗体(またはフラグメント)は、好ましくは生物学的試料上に標識抗体(またはフラグメント)を上に重ねることにより適用される。このような方法の使用によって、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみならず、試験された組織中のその分布を決定することも可能である。本発明を使用して、このようなインサイチュー検出を達成するために、当業者は、広範囲の組織学的方法(染色方法など)のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。
【0204】
野生型、変異体または広がったフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定可能な検出可能に標識された抗体の存在下に、生物学的流体、組織抽出物、新鮮な収穫細胞、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的試料をインキュベートし、当該技術分野で周知である多くの技術のいずれかによって、結合された抗体を検出することを含む。
【0205】
生物学的試料が、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化可能なニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリア、または他の固体支持体上に接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体を適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理し得る。次いで、固相支持体を2回目の緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去する。次いで、固相支持体上の結合標識の量を従来の手段で検出し得る。
【0206】
「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合可能ないかなる支持体をも意図するものである。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的において、ある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合された分子が抗原または抗体に結合可能なかぎり、実質的にいかなる可能性のある構造的立体配置を有していてもよい。したがって、支持体の立体配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面のような円筒状、または棒状体の外表面であってもよい。また、その表面はシート、試験片などのように平らであってもよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適したキャリアを知っているか、また、日常の実験を使用することによりこれを確証できるであろう。
【0207】
所定の多数の(a given lot of)抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知方法によって測定され得る。当業者は日常の実験を使用することにより各測定のための操作的および最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【0208】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の1つは、酵素にこれを連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ(EIA)にこれを使用することである(Voller, Ric Clin Lab, 8: 289−98 (1978)[“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”, Diagnostic Horizons 2: 1−7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.]; Vollerら、 J. Clin. Pathol., 31: 507−20 (1978); Butler, Meth. Enzymol., 73: 482−523 (1981); Maggio(編)、 Enzyme Immunoassay, CRC Press. Boca Raton, Fla. (1980); Ishikawaら(編)、 Enzyme Immunoassay, Igaku−Shoin, Tokyo (1981))。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分(moiety)を製造するような方法で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する発色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較される基質の酵素反応の程度を可視的に比較して達成され得る。
【0209】
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用により、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または広がったペプチドを検出することができる(例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Scociety, March, 1986)。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【0210】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に暴露されると、次いで、その存在が蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、蛍光性イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【0211】
抗体はまた、152Euなどの蛍光放出金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン−テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【0212】
抗体はまた、化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の進行中に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光性標識合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【0213】
同様に、生物発光性化合物が本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の一種である。生物発光性タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0214】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許公報は、確認する引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する先行技術の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【0215】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、主題である発明を限定するように解釈されるべきでない。
【0216】
(実施例)
(実施例1:プラスミドライブラリーからの直接構築物構築)
ラムダZAPTM系を使用するゲノムライブラリーは、以下のようにして調製された。胚性幹細胞は100mm組織培養プレート中で成長させた。高分子量ゲノムDNAは、胚性幹細胞の集密的な100mmプレートに5mlの溶解緩衝液(トリス−HCl(pH7.5)10mM、EDTA(pH8.0)10mM、NaCl 10mM、0.5%SDS、および1mg/mlプロティナーゼK)を添加してこれらのES細胞から単離した。次いで、これらの細胞を60℃で数時間、または完全に可溶化されるまでイキュベートした。ゲノムDNAは、穏やかなフェノール:クロロホルム抽出を数回行い、次いでエタノール沈殿を行って溶解細胞から精製した。
【0217】
ゲノムDNAを、制限酵素Sau3AIを使用して部分的に消化して、約5〜20kbのフラグメントを生成した。これらのフラグメントの末端を、Klenow DNAポリメラーゼの存在下にてdATPおよびdGTPの添加によって部分的に充填して、ゲノムフラグメントに不適合性末端を作製した。次いで、5kbと10kbとの間の大きさのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動(1×TAE、0.8%ゲル)によって精製した。次いで、このDNAを、QIAquick gel抽出キット(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)を使用して、切除されたアガロース片から単離した。
【0218】
ゲノムフラグメントを、XhoIで切断され、かつdTTP、dCTPおよびKlenow DNAポリメラーゼを使用して部分的に充填されているλZapTMIIベクター(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)中に連結させた。連結後、DNAは、λ packaging mix(Gigapack III gold,Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)を使用してパッケージングして、力価を測定した。
【0219】
環状ファージミドDNAを、M13ヘルパーファージである、ExAssist(Stratagene,Inc.,)の存在下にて適切な細菌株(XL−1 Blue MRF1、Stratagene,Inc.)でλクローンを増殖させることによって、λライブラリーから誘導した。具体的には、約100,000個のλクローンを10〜100倍過剰の細菌およびヘルパーファージの両方とともに37℃で20分間、インキュベートした。1mlのLB培地と10mM MgSO4を、各切除反応へ添加し、37℃で一晩、攪拌下にてインキュベートした。通常、24〜96のこれらの反応を、96ウェルのディープウェルブロックに同時に準備した。翌朝、このブロックを、65℃まで15分間加熱し、細菌およびλファージの両方を死滅させた。細菌残骸を、約3000gで15分間の遠心分離によって除去した。環状ファージミドDNAを含む上清を残し、そして.プラスミドPCRに直接使用した。
【0220】
上記されたファージミドDNAのプールを、長距離(long−range)PCR、および公知配列(図1に示される)に基づき上記したように選択された「外方向に向かう(outward pointing)」オリゴを使用して、目的の特定遺伝子についてスクリーニングした。PCR反応液は、2μlのプールファージミドDNAサンプル、3μlの10×PCR緩衝液3(Boehringer Mannheim)、1.1μlの10mM dNTP、50nMのプライマー、0.3μlのEXPAND Long Template PCR Enzyme Mix(Boehringer−Mannheim)および30μlのH2Oを含む。サイクリング条件は94℃で2分間(1サイクル)、94℃で10秒間、65℃で30秒間、68℃で15秒間(15サイクル);94℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で15秒間およびさらなる各サイクル(25サイクル)毎に20秒間の増加;68℃で7分間(1サイクル)そして4℃で保持した。
【0221】
PCR反応産物を、1×TAE緩衝液を含むアガロースゲルを介する電気泳動により分離し、臭化エチジウムおよびUV光で可視化した。首尾よい長距離PCRを示す大きなフラグメントをいずれもゲルから切除し、そしてQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製した。
【0222】
PCRフラグメントを制限マッピングする必要性を除くために、次の連結非依存性クローニング戦略を使用した。目的の長距離PCRフラグメントを、QIAquickPCR精製キット(Qiagen,Inc.,Santa Clarita,California)を使用して、「精製」した。PCRフラグメントの1本鎖末端を、0.1〜2μgのフラグメント、2μlのNEB(New England BioLabs)緩衝液4;1μlの2mM dTTP、6単位のT4DNAポリメラーゼ(NEB)、H2Oを混合して、全容量20μlとして、25℃で30分間、インキュベートすることにより生成した。ポリメラーゼを、75℃で20分間の加熱によって不活性化した。1本鎖末端をまた、独特な制限酵素部位で、SacIおよびSacIIを使用してプラスミドベクターpDG2(図2Aに示されるpDG2)を消化し、上記のようにT4DNAポリメラーゼで各反応物を処理することによって、NeOr選択マーカーフラグメント上に作製した。図1に示されるベクターを、長距離PCRフラグメント上のものと相補的な1本鎖末端を使用して調製した。
【0223】
次いで、ベクターとフラグメントを、2工程クローニング戦略または四方向1工程プロトコールのいずれかを使用して構築物中へアセンブリした。簡単には、10ngのT4処理Neorカセット、1μlのT4処理PCRフラグメント、0.2μlの0.5M EDTA、0.3μlの0.5M NaClおよび4μlまでのH2Oを含む反応物を、65℃まで加熱し、約45分かけて室温にまで冷却させた。次いで、この混合物を、サブクローニングに効率的なDH5−αコンピテント細胞中に形質転換した。
【0224】
(実施例2:ファージライブラリーからの構築物の生成)
マウス胚性幹細胞ライブラリーを、以下のようにλファージ中で調製した。ゲノムライブラリーを、Sau3AI部位でのDNAの部分的切断によってゲノムDNAから構築し、長さ約20kbのゲノムフラグメントを得た。これらのDNAフラグメントの末端配列を、dGTPおよびdATPの存在下にてKlenow酵素を使用して部分的に充填し、そのフラグメントを、dTTPおよびdCTPの存在下にてKlenowを使用して部分的に充填されている適切なλクローニングベクター、例えばλFixII(Stratagene,Inc.,La Jolla,California)のXhoI部位中にT4DNAリガーゼを使用して連結させた。代替的に、部分的に消化させたゲノムDNAを、蔗糖勾配および選択される約20kbの配列を使用してサイズ選択した。富化された画分を、BamHI切断λベクター、例えば、λ Datsh II(Stratagene,Inc.,La Jolla,California)中へクローン化した。
【0225】
このライブラリーを、各プレートが約1,000個のクローンを含む1,152のプレート上に平板培養した。したがって、全部で1.1百万個のクローン(8ゲノムに等しい)を平板培養した。
【0226】
ファージを、各プレートへ4mlのλ溶出緩衝液(10mM MgCl2、10mM Tris(pH8.0))を添加して、室温で3〜5時間インキュベートすることにより各プレートから溶出した。インキュベーション後、2mlの緩衝液を各プレートから収集して、96ディープウェルプレート(Costar,In.)の1つのウェルの中に置いた。12個の96ウェルプレートを充填し、「サブプール(sub−pool)ライブラリー」と呼んだ。
【0227】
サブプールライブラリーを使用して、「プールライブラリー」を、新規な96ウェルプレートの1つのウェルの中に12の異なったサブプールウェルの100μlを置くことによって作製した。12個のサブプールプレートを組み合わせて1つのプレートのプールライブラリーを形成した。
【0228】
目的の遺伝子をPCR増幅することが知られている1対のオリゴヌクレオチドを使用して、「大きなプール(large−pool)ライブラリー」の96プールからの上清を増幅した。PCRはを、0.5単位のAmplitaq GoldTM(Perkin Elmer)、1μMの各オリゴヌクレオチド、200μM dNTP、2μlのプール(またはサブプール)上清の1〜5倍希釈物、50mM KCl、100mM Tris−HCl(pH8.3)、および1.5mMまたは1.25mMのいずれかのMgCl2の存在下にて実施した。サイクリング条件は、95℃で8分間(1サイクル);95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で45秒間(55サイクル)、72℃で7分間(1サイクル)そして4℃で保持した。遺伝子に依存して、実施例1に記載されるアガロースゲル上で同定した場合にポジティブシグナルが約3および12プールの間で産生した。さらに精製が必要な場合(すなわち、明瞭なシグナルが増幅後に存在しない場合)、プールを作る12のサブプールを、同じプライマーを使用する増幅に供し、1つのサブプール(1000クローン)を同定した。
【0229】
(フランキングフラグメントの生成)
上記されたように、ノックアウト構築物は、ポジティブ選択マーカーに隣接する標的遺伝子に対して相同であるDNA配列の2つのブロックを含む。長距離PCRを、実施例2に上記したようにしてポジティブに同定されたλクローンのプールから実施した。各フラグメントを、1つの型の塩基を欠き、かつベクター上の所定の配列に相補的である所定の配列を有する1対のオリゴヌクレオチドを使用して生成した。得られたフラグメントは1kbと5kbとの間であった。5kbより長い第3のフラグメントも、適切なオリゴヌクレオチドを使用して生成する。次いで、この第3のフラグメントを、ノックアウトされる遺伝子の近くであるが、ベクターの外側にあるDNA配列を得るために使用した。
【0230】
(実施例3:2工程クローニング−一般的方法)
pDG2プラスミドベクター(図2A)は、独特な制限部位SacIIおよびSacIを含む。適切な1本鎖アニーリング部位を、制限酵素SacIIまたはSacIのいずれかを使用してpDG2ベクターを消化し、そして上記したように各反応物をT4DNAポリメラーゼおよびdTTPで処理することによって生成した。4つの反応物を、各ベクターについてマイクロタイタープレートに準備した。反応物は(1)T4DNAポリメラーゼ処理フラグメント;(2)T4処理フラグメント反応物の1:10倍希釈物;(3)T4処理フラグメントの1:100倍希釈物または(4)H2O(挿入物のないコントロール)のいずれかを1μl含む。マイクロタイタープレートを密封し、65℃まで加熱された2つの温度ブロックの間に置き、室温で30〜45分間、ゆっくり冷却させた。
【0231】
次いで、マイクロタイタープレートを氷上に置き、20〜25μlのサブクローニングに効率的なコンピテントな細胞を各ウェルに添加した。プレートを、氷上で20〜30分間インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、42℃までに加熱された2つの温度ブロックの間に2分間置き、続いて氷上に2分間置いた。100μlのLBを各ウェルに添加し、プレートをパラフィルムで覆い、そして37℃で30〜60分間インキュベートした。各ウェルの全内容物は1つのLB−Ampプレート上に平板培養し、そして37℃で一晩インキュベートした。
【0232】
約12と24との間のコロニーを、挿入物のないコントロールよりも少なくとも2〜4倍も多いコロニーを有するプレートからピックアップした。これらのコロニーを37℃で一晩ディープウェルプレートで増殖させ、次いで、プラスミドDNAをQiagenミニプレップキットを使用して抽出した。
【0233】
プラスミドDNAを、NotI酵素およびSalI酵素を使用して消化した。図2Aに示されるように、NotI/SalI消化は、クローニング部位3および4を含む大きなフラグメント、ならびにクローニング部位1および2およびNeor遺伝子を含む小さなフラグメントを生成する。消化後、反応物は、0.2μg/mlの臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲル上にかけた。挿入物がない場合、2つのバンド、1975塩基対のものと2793塩基対のものが存在した。挿入フラグメントが存在する場合、これらのバンドの少なくとも1つは、より大きい。なぜなら、アニーリング部位1/2または部位3/4のいずれかでフラグメント(挿入物1または2)をも含むからである。挿入物バンドを切除し、QIAquickゲル抽出キットで処理した。1μlの10×リガーゼ緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン)、1μl T4DNAリガーゼ、1〜2μlフラグメント(部位3/4バンド)、5μlの部位1/2バンドおよび10μlまでのH2Oを含む第2の連結反応を実施した。コントロールもまた、部位3/4フラグメントまたは部位1/2フラグメントのいずれかを水に代えて準備した。反応物を、室温で1〜2時間インキュベートし、そして25μlのコンピテント細胞で形質転換した。
【0234】
これらの実施例の文脈における「フランキングDNA」とは、欠失または変異されるべき標的遺伝子中の領域に隣接するゲノム配列を指す。「フランキングDNA」はまた、標的遺伝子と相同であるDNA配列のブロックとして上記される。R1ゲノムライブラリーは、R1 ES細胞株から調製されたゲノムライブラリーをいう。このようなライブラリーを、実施例1に記載されるように調製し得る。
【0235】
(実施例4:網膜特異的核内レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
網膜特異的核内レセプターの役割を研究するために、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より特定には、特に配列番号19を含む網膜特異的核内レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有する網膜特異的ターゲティング構築物を、配列番号20または配列番号21として本明細書中で同定されるオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/Sv−+P+Mgf−SLJ/Jマウス亜系統から誘導されたES細胞中に導入し、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌性C57BL/6とともに交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型は、以下のようにして決定した。
【0236】
(ホモ接合性マウス)
分析したホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも1つを示した。
【0237】
目:以下によって特徴付けられる重度の網膜異形成症を含む目の異常:大きなロゼット形成および網膜フォールディング;病巣を満たす棹状体および錐状体を有する網膜の外側核内層の分節菲薄化(segmental thinning);ならびに、網膜の完全な片側欠如。さらに、網膜によって正常に占められる空間は、線維性結合組織、骨様骨棘およびいくつかの鉱質で充填されていた。ある範囲で、結合組織は後方水晶体包に付着していた。水晶体の前方面に付着する肥厚化した虹彩を有する後方癒着を検出した。網膜の着色された上皮層は肥厚化され、そしてその細胞は大きさおよび数が増加した。水晶体の内部構造は組織崩壊され、腫脹および変性した線維を含んだ。網膜が片側で欠損する例では、小さな病巣痕跡が存在していた。
【0238】
胃腸管:胃腸管の異常は、胃の深部粘膜および粘膜下組織に好中球の多巣性浸潤物を含んだ。
【0239】
皮膚:皮膚の異常は、真皮内に病巣リンパ性炎症を含んだ。
【0240】
精巣/副睾丸:精巣および副睾丸の異常は、低下した精子形成を含んだ。特に、輸精細管には変性または壊死性精子形成上皮細胞および多核性巨細胞が散らばっていた。副睾丸は精子細胞の数が低下し、変性細胞が細管内に存在した。いくつかの副睾丸細管の上皮細胞は、空胞化されていた。
【0241】
臨床化学/血液分析:異常は、野生型コントロール値に比べて、低いアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)値、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、およびクレアチニンキナーゼ(CK)値を含んだ。しかし、アルカリホスファターゼ(ALP)活性は上昇していた。血液学的評価は、より低い全白血球数を示した。
【0242】
(ヘテロ接合性マウス)
皮膚:異常は、局所的線維症およびリンパ系皮膚炎を含んだ。
【0243】
肝臓:異常は、胆管肥厚化および線維症を有する胆管周囲炎を含んだ。
【0244】
(実施例5:リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成および分析)
リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプターの役割を研究するために、リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号22を含むリンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有するリンパ系特異的GPCRターゲティング構築物を、配列番号23および配列番号24として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と飼育して生成した。F2ホモ接合性変異体動物を、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑して生成した。リンパ系特異的G−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。リンパ系特異的GPCRにおける破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0245】
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、下記の表現型の少なくとも1つを示した:
肺:肺の異常は細気管支の周りに細胞性浸潤液を含んだ。様々な程度の斑状気管支周辺リンパ球性細胞性浸潤液を示す肺の変化が検出された。浸潤液は、主に小リンパ球から構成された。気管支周辺リンパ球性袖口様縁形成は、リンパ球の病巣胸膜下集合;血管壁のフィブリノイド壊死;および気管支上皮の肥厚化を含んだ。
【0246】
膵臓:膵臓の異常は、膵管および島の近くに膵臓細胞性浸潤液を含んだ。特に、管周辺細胞性浸潤液または島周辺細胞性浸潤液が存在し、主に小リンパ球から構成された。
【0247】
胃:胃の異常は、小リンパ球、顆粒球および血漿細胞から構成される胃液混合細胞性浸潤液を含んだ。浸潤液は、胃の深在粘膜、粘膜下組織および/または筋層を含んだ。
【0248】
肝臓:肝臓の異常は、細胞性浸潤液、主に門脈三管に関与するリンパ球を含んだ。
【0249】
(発現分析)
LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、脾臓およびリンパ節で検出した。特に、リンパ節で、数種の細胞が強いX−Gal染色を示した。脾臓では、強い染色を、赤脾髄のいくつかの細胞で検出した。
【0250】
(実施例6:メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモンの役割を研究するために、GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、GPCRメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号25を含むメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプターをコードする遺伝子を破壊または改変する能力を有するメラニン形成細胞刺激ホルモンターゲティング構築物を、配列番号26および配列番号27として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHadマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0251】
メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0252】
挙動分析:ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験で移動した全体距離において野生型マウスとは有意に異なっていた。ホモ接合性マウスは、その野生型対応物よりも著しく(significantly)動きまわり、かつオープンフィールドを探索するという点で、活動低下していた。オープンフィールド試験を、活動のレベルおよび不安における変化を証明するために使用した。したがって、オープンフィールドデータは、ホモ接合性マウスが野生型コントロールマウスよりも活動低下していることを示す。
【0253】
LaZ発現分析:LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、食道、皮膚および雄生殖系で検出した。
【0254】
(実施例7:マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の役割を研究するために、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、特に配列番号28を含む遺伝子を破壊および改変する能力を有するマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号29および配列番号30として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0255】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【0256】
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、以下の表現型のうちの少なくとも1つを示した:
肺:肺の異常は、異物誤嚥性肺炎を示唆する肺損傷を含んだ。関連する肉芽腫瘍(おそらく異物)、泡沫肺胞マクロファージ、および肺胞マクロファージ内の好酸球増加性結晶を伴う斑状気管支周辺急性炎症が肺の中で見られた。肺の斑状黄赤色変色も検出された。
【0257】
血液学:血液中の異常は、上昇した白血球(WBC)数を含んだ。
【0258】
剖検試験:斑状赤黄色肺変色。筋肉と骨は、野生型コントロールよりも軟らかった。
【0259】
(発現分析)
強いlacZ発現は、脳、脊髄、坐骨神経、眼、ハーダー腺、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、大動脈、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、気管、喉頭、食道、甲状腺、下垂体、副腎、唾液腺、舌、骨格筋、皮膚および雌雄生殖系を含む、試験された全ての組織または器官において検出可能であった。
【0260】
(実施例8:ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子の役割を研究するために、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号31を含むケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子を破壊および改変する能力を有するケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号32および配列番号33として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0261】
(実施例9:cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の役割を研究するために、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号34を含むcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子を破壊および改変する能力を有するcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号35および配列番号36として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【0262】
cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した:
(ホモ接合性マウス)
ホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも1つを示した:
眼:ホモ接合性マウスは、特に網膜に関与する眼の異常、より具体的には光レセプター層(すなわち、棹状体と錐状体、外核層、外網状層)の完全な非存在を伴う重症の両側網膜変性または網膜異形成を含む網膜変性(RD)を示した。棹状体と錐状体は、光レセプター細胞の樹状突起であり、外核層は、光レセプター細胞の核を示し、そして外網状層は、光レセプター細胞の軸索線維を示す。このような眼の異常は、視覚障害または盲目を伴い得る。これらのマウスの眼の他の異常は、内核層の菲薄化および空胞化;内網状層の菲薄化;神経節細胞核、特に大きな神経節細胞の損失;神経線維層の神経膠症;ならびに網膜脈管構造の減弱を含んだ。マウスで観察されたRDは、ヒトの網膜色素変性症(RP)に類似している。
【0263】
大動脈:大動脈の異常は、大動脈の外膜または炎症を含んだ。
【0264】
腎臓:腎臓異常は、尿細管拡大または腎盂炎を含んだ。
【0265】
肝臓:検出された肝臓異常は、髄外造血を含んだ。
【0266】
リンパ節:リンパ節の異常は、リンパ球増殖症、リンパ球萎縮または出血を含んだ。
【0267】
皮膚:皮膚異常は、皮膚炎を含んだ。
【0268】
体重:異常は、増加した体重と体長を含んだ。特に、コントロールマウスに対して体重は雄で約11%〜37%増加し、体長は約13%増加していた。体長に対する体重の比は、約23%増加していた。
【0269】
器官重量:増加した器官重量が脾臓および胸腺、腎臓および肝臓で見られた。特に脾臓重量は、約13%〜28%の範囲で増加し、胸腺重量は、約17%〜30%の範囲で増加した。腎臓重量は約16%増加し、肝臓重量は約38%増加していた。
【0270】
臨床化学:上昇したレベルのALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)、リン、カリウム、またはビリルビンを検出した。
【0271】
挙動分析:ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験においてより大きな総距離を動き、オープンフィールドをより多く探索する有意に増加した活動を示した。この観察はホモ接合性マウスの多動を示した。
【0272】
(ヘテロ接合性マウス)
眼:眼の異常はピンクアイを含む変色を含んだ。
【0273】
(LacZ発現分析)
LacZ(β−ガラクトシダーゼ)発現を、胸腺、唾液腺プロパー、喉頭の唾液腺、気管の気管周腺および粘膜下腺および舌の粘液腺に検出した。
【0274】
(実施例10:スルホトランスフェラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を研究するために、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子、特に配列番号37を含む遺伝子を破壊または改変する能力を有するスルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号38および配列番号39として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、129/OlaHsdマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と交雑することによって生成した。F2ホモ接合性変異マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。これらの動物を、表現型変化について評価した。スルホトランスフェラーゼ遺伝子の破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した:
(ホモ接合性マウス)
肝臓:ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べて肝臓で異常を示した。ホモ接合性マウスは以下の少なくとも1つを示した:斑状蒼白の腺房帯3肝実質細胞;肝実質細胞の細胞質内の核内陥入を有する様々な大きさの好酸性小球;または赤血球大小不同、核の大小不同および野生型マウスに比べて増加した有糸分裂細胞活性。
【0275】
唾液腺:ホモ接合性マウスは、ハーダー腺および唾液腺の異常を示した。特に、これらの腺に病巣の色素沈着が、そして顎下腺に萎縮症および線維症が存在した。
【0276】
挙動分析:ホモ接合性マウスは野生型マウスに比べて、積極的で、多動であり、かつ不安の少ない挙動を示した。特に、2週齢に始まってホモ接合性変異体雄マウスは、野生型同腹仔に比べて増大した攻撃性を示した。飼育室を観察中、これらの動物は正常な雄マウスよりもその部屋のマウスを攻撃し、そのような攻撃を阻止するために別の飼育室へ入れなければならなかった。さらに、ホモ接合性変異体マウスは、オープンフィールド試験において野生型マウスとは有意に異なっていた。変異体は動きまわり、かつ野生型マウスよりもより敏速にオープンフィールドを探索して多動であり、野生型マウスに比べて増加した活動および低下した不安を示した。
【0277】
ホモ接合性マウスは、オープンフィールドで野生型と有意に異なっていた(中央で過ごす時間の%)。ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べてオープンフィールドの中心部分でより長い割合の時間を過ごし、不安がより少なかった。
【0278】
当業者には明らかなように、上記実施形態の種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。これらの改変および変更は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明のターゲティングベクターを構築する1つの方法を示す概略図である。プラスミドPCR法は、実施例9および10に記載される。
【図2】
図2Aは、pDG2ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン(Neor)遺伝子を含む。Neor遺伝子の両側部は、制限部位とともに連結非依存性クローニングのための2つの部位である。pDG2の配列は、図2Bおよび配列番号1に示される。
【図3】
図3Aは、pDG4ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン(Neor)遺伝子および緑色蛍光性タンパク質(GFP)遺伝子を含む。Neor遺伝子の両側には、制限酵素認識部位とともに連結非依存性クローニングのための2つの部位である。pDG4の配列は、図3Bおよび配列番号2に示される。
【図4】
図4(配列番号3〜配列番号10)は、PCR増幅されたゲノムDNAの末端に含まれるアニーリング部位1〜4のT4DNAポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図5】
図5(配列番号11〜配列番号18)は、pDG2ベクター内に含まれるアニーリング部位1〜4のT4DNAポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図6】
図6は、アニーリング反応中のpDG2ベクター内のアニーリング部位1、2、3および4に関連した5’および3’フランキングDNAの配置を示す。
【図7】
図7は、アニーリング反応中のpDG4ベクター内のアニーリング部位1、2、3および4に関連した5’および3’フランキングDNAならびにGFPスクリーニングマーカーの配置を示す。
【図8】
図8は、配列番号19として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図8はまた、配列番号20および配列番号21として同定された配列を示す。これらは、網膜特異的核内レセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図9】
図9は、配列番号22として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図9はまた、配列番号23および配列番号24として同定された配列を示す。これらは、リンパ系特異的GPCR遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図10】
図10は、配列番号25として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図10はまた、配列番号26および配列番号27として同定された配列を示す。これらは、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図11】
図11は、配列番号28として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図11はまた、配列番号29および配列番号30として同定された配列を示す。これらは、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図12】
図12は、配列番号31として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図12はまた、配列番号32および配列番号33として同定された配列を示す。これらは、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図13】
図13は、配列番号34として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図13Bは、配列番号35および配列番号36として同定された配列を示す。これらは、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図14】
図14は、配列番号37として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図14はまた、配列番号36および配列番号37として同定された配列を示す。これらは、スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
Claims (155)
- 以下:
(a)標的遺伝子に相同な第1のポリヌクレオチド配列であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、第1のポリヌクレオチド配列;
(b)該標的遺伝子に相同な第2のポリヌクレオチド配列;および
(c)選択マーカー、
を包む、ターゲッティング構築物。 - 前記ターゲッティング構築物がスクリーニングマーカーをさらに含む、請求項1に記載のターゲッティング構築物。
- 標的遺伝子に対するターゲッティング構築物を生成する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は以下:
(a)標的遺伝子に相同な第1のポリヌクレオチド配列を獲得する工程;
(b)該標的遺伝子に相同な第2のポリヌクレオチド配列を獲得する工程;
(c)選択マーカーを含むベクターを提供する工程;および
(d)該ベクターに該第1および該第2の配列を挿入して、該ターゲッティング構築物を生成する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子に対するターゲッティング構築物を生成する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下:
(a)該標的遺伝子に相同なポリヌクレオチド配列を提供する工程;
(b)該ポリヌクレオチド配列の2つの異なるフラグメントを生成する工程;
(c)選択マーカーをコードする遺伝子を有するベクターを提供する工程;および
(d)該2つの異なるフラグメントを該ベクターに挿入して、該ターゲッティング構築物を形成する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子における破壊を含む細胞であって、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、細胞。
- 前記細胞がマウス細胞である、請求項5に記載の細胞。
- 前記マウス細胞が胚性幹細胞である、請求項6に記載の細胞。
- 標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、細胞。
- 標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1に記載のターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスは、キメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下:
(a)該標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に因子を投与する工程;および
(c)該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下:
(a)該標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に因子を投与する工程;および
(c)該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下:
(a)標的遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 標的遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的GPCR遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター1様タンパク質遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下:
(a)標的遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞が、請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、請求項13または請求項14に記載の方法。
- 請求項11、請求項12、請求項13、または請求項14に記載の方法により同定される因子。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが眼の異常を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記眼の異常が網膜の異常である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記網膜の異常が網膜異形成症により特徴付けられる、請求項18に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、以下の特徴:網膜におけるロゼット形成、網膜ひだ、網膜の外核層の断片菲薄化もしくは欠損、または網膜の欠損、の少なくとも1つを示す、請求項19に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスは眼の異常を示し、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスは、以下の表現型:胃腸管の異常;皮膚の異常;精巣または精巣上体の異常;または血液における異常、の少なくとも1つを示す、トランスジェニックマウス。
- 請求項17、請求項23、または請求項24に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、該細胞が、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む、細胞。
- 眼の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの該眼の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記眼の異常が網膜の異常である、請求項26に記載の方法。
- 前記網膜の異常が網膜異形成症により特徴付けられる、請求項27に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法であって、ここで、前記トランスジェニックマウスが、以下の特徴:網膜におけるロゼット形成、網膜ひだ、網膜の外核層の断片菲薄化もしくは欠損、または網膜の欠損、の少なくとも1つを示す、方法。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおける網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:眼の異常;胃腸管の異常;皮膚の異常;精巣または精巣上体の異常;あるいは血液における異常、のいずれか1つを含む、請求項30に記載の方法。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:眼の異常;胃腸管の異常;皮膚の異常;精巣または精巣上体の異常;あるいは血液における異常、のいずれか1つを含む、請求項32に記載の方法。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する否かを決定するであって、ここで、該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項34に記載の方法であって、ここで、前記表現型が以下:眼の異常;胃腸管の異常;皮膚の異常;精巣または精巣上体の異常;あるいは血液における異常、のいずれか1つを含む、方法。
- 網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;(b)該細胞と該因子を接触させる工程;および
(b)該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:眼の異常;胃腸管の異常;皮膚の異常;精巣または精巣上体の異常;あるいは血液における異常、のいずれか1つを含む、請求項36に記載の方法。
- 請求項26、請求項30、請求項32、請求項34、または請求項36に記載の方法により同定される、因子。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが細胞浸潤を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項39に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記細胞浸潤が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおいて生じる、請求項40に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項39に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項39に記載のトランスジェニックマウス。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは細胞浸潤を示し、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCRターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、以下:肺における細気管支周囲の細胞浸潤;膵臓における細気管支周囲の細胞浸潤;胃の深粘膜、粘膜下組織、または筋層における細胞浸潤;またあるいは肝臓の門脈三管における細胞浸潤、の表現型の少なくとも1つを示す、トランスジェニックマウス。
- 請求項39、請求項44、または請求項45に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含む、細胞。
- 細胞浸潤を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの該細胞浸潤を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項47に記載の方法。
- 前記細胞浸潤が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおいて生じる、請求項48に記載の方法。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるリンパ系特異的GPCR遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおける細胞浸潤を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項51に記載の方法。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がリンパ系特異的GPCR遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおける細胞浸潤を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項54に記載の方法。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がリンパ系特異的GPCR遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおける細胞浸潤を含む、請求項56に記載の方法。
- リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)リンパ系特異的GPCR遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が、以下:肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか1つにおける細胞浸潤を含む、請求項58に記載の方法。
- 請求項47、請求項50、請求項53、請求項56、または請求項58に記載の方法により同定される、因子。
- メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが機能低下の挙動を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項61に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項61に記載のトランスジェニックマウス。
- メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは機能低下の挙動を示し、該方法は、以下:
(a)メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製するために該キメラマウスを飼育する工程、
を包含する、方法。 - 請求項61または請求項64に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含む、細胞。
- 機能低下の挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの該機能低下の挙動を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるメラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、該トランスジェニックマウスの機能低下の挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。 - メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に関連する機能低下を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの機能低下の挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項66、請求項67、または請求項68に記載の方法により同定される、因子。
- マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが肺の異常または増加した白血球細胞数を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項70に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項71に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項70に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項70に記載のトランスジェニックマウス。
- マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは肺の異常または増加した白血球細胞数を示し、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 請求項70または請求項75に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
- 肺の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの肺の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項78に記載の方法。
- 白血球細胞数を減少させる因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの白血球細胞数を減少させる否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項82に記載の方法。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項83に記載の方法。
- マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項87に記載の方法。
- マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項89に記載の方法。
- 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項90に記載の方法。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項91に記載の方法。
- マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項94に記載の方法。
- 前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項95に記載の方法。
- 請求項77、請求項80、請求項81、請求項85、請求項89、または請求項93に記載の方法により同定される、因子。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが眼の異常を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記眼の異常が網膜の異常である、請求項98に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記網膜の異常が、網膜変性または網膜異形成症により特徴付けられる、請求項99に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが光レセプター層の非存在を示す、請求項100に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記眼の異常が視覚の問題または失明と相反しない、請求項98に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記網膜の異常が色素性網膜炎と相反しない、請求項99に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記眼の異常が以下:該眼の内核層の菲薄化または空胞化;該眼の内網状層の菲薄化;神経節細胞核の喪失;神経線維層の神経膠症;または網膜脈管構造の減衰、の少なくとも1つを含む、請求項98に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項98に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項98に記載のトランスジェニックマウス。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは眼の異常を示し、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが以下の表現型:大動脈の異常;腎臓の異常;肝臓の異常;リンパ節の異常;皮膚の異常;増加した体重および器官重量;あるいは上昇したレベルのALT、リン、カリウム、またはビリルビン、の少なくとも1つを示す、トランスジェニックマウス。
- 請求項98、請求項104または請求項108に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
- 眼の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの眼の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記眼の異常が網膜の異常を含む、請求項110に記載の方法。
- 前記網膜の異常が網膜退化または網膜異形成症により特徴付けられる、請求項111に記載の方法。
- 前記トランスジェニックマウスが光レセプター層の非存在を示す、請求項110に記載の方法。
- 前記眼の異常が以下:該眼の内核層の菲薄化または空胞化;該眼の内網状層の菲薄化;神経節細胞核の喪失;神経線維層の神経膠症;または眼の網膜脈管構造の減衰、の少なくとも1つを含む、請求項110に記載の方法。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:眼の異常;大動脈の異常;腎臓の異常;肝臓の異常;リンパ節の異常;皮膚の異常;増加した体重または器官重量;あるいは上昇したレベルのALT、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか1つを含む、請求項115に記載の方法。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:眼の異常;大動脈の異常;腎臓の異常;肝臓の異常;リンパ節の異常;皮膚の異常;増加した体重または器官重量;あるいは上昇したレベルのALT、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか1つを含む、請求項117に記載の方法。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:眼の異常;大動脈の異常;腎臓の異常;肝臓の異常;リンパ節の異常;皮膚の異常;増加した体重または器官重量;あるいは上昇したレベルのALT、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか1つを含む、請求項119に記載の方法。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:眼の異常;大動脈の異常;腎臓の異常;肝臓の異常;リンパ節の異常;皮膚の異常;増加した体重または器官重量;あるいは上昇したレベルのALT、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか1つを含む、請求項121に記載の方法。
- 請求項110、請求項115、請求項117、請求項119、または請求項121に記載の方法により同定される因子。
- cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが減少した不安性挙動を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項124に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項125に記載のトランスジェニックマウス。
- 機能亢進性の挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるcGMPホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。 - cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)cGMPホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項127、請求項128、または請求項129に記載の方法により同定される、因子。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが以下の少なくとも1つを示す、トランスジェニックマウス:攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動。
- 前記トランスジェニックマウスが、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項131に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記トランスジェニックマウスが、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項131に記載のトランスジェニックマウス。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは以下:攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動、の少なくとも1つを示し、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 請求項131または請求項134に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。 - スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する挙動を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が、該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項136、請求項137、または請求項138に記載の方法により同定される、因子。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、の少なくとも1つを示す、トランスジェニックマウス。
- 前記肝臓における異常が以下:肝細胞異常、赤血球大小不同、核の大小不同および肝臓における増加した有糸分裂細胞活性、の少なくとも1つにより特徴付けられる、請求項140に記載のトランスジェニックマウス。
- 唾液腺における異常が以下:該唾液腺における病巣の色素沈着、萎縮、または線維症、の少なくとも1つにより特徴付けられる、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウス。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が、該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか1つを含む、請求項143に記載の方法。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか1つを含む、請求項145に記載の方法。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか1つを含む、請求項147に記載の方法。
- スルホトランスフェラーゼの機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と因子とを接触させる工程;および
(c)該因子がスルホトランスフェラーゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか1つを含む、請求項149に記載の方法。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程;および
(b)該因子が該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子がホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。 - 前記表現型が以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか1つを含む、請求項151に記載の方法。
- 請求項143、請求項145、請求項147、請求項149、または請求項151に記載の方法により同定される、因子。
- スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは以下:肝臓における異常または唾液腺における異常、の少なくとも1つを示し、該方法は、以下:
(a)スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 請求項140または請求項154に記載のトランスジェニックマウスに由来する、細胞。
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