JP2004503226A - 核ホルモンレセプター遺伝子の破壊を含む、トランスジェニックマウス - Google Patents
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Abstract
本発明は、トランスジェニック動物ならびに遺伝子機能の特徴付けに関する組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、MCARオーファン核ホルモンレセプター遺伝子における変異を含むトランスジェニックマウスを提供し、このようなトランスジェニックマウスは、疾患ならびに遺伝子発現および遺伝子機能を調節する薬剤の同定のためのモデルとして、そして種々の疾患状態および疾患の状況(特に、脾臓、胸腺またはリンパ節の疾患のための潜在的な処置として有用である。
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、遺伝子機能の特徴付けに関連するトランスジェニック動物、組成物、および方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
より高等な生物において、核ホルモンレセプタースーパーファミリーは、ジンクフィンガー転写因子をコードする独特の遺伝子を含み、これらの各々はステロイド、甲状腺ホルモン(T3)またはレチノイン酸(RA)のようなリガンドに結合することによって特異的に活性化される。公知のどのリガンドにも結合せず、応答もしないタンパク質をコードするcDNAの群は、オーファンレセプターとして公知である。これらのオーファンレセプターの機能は不明である。
【0003】
核ホルモンレセプタースーパーファミリーの多くの従来のメンバーおよびオーファンメンバーは、第一のジンクフィンガーの重要な領域において同一かまたは非常に類似したアミノ酸配列を共有する。遺伝的分析およびX線結晶学の両方は、Pボックスと呼ばれるこの領域がDNAと配列特異的に接触することを示す。このPボックスによって規定されるサブグループにおける従来のレセプターとしては、エストロゲン、ビタミンD、T3およびRAに結合するものが挙げられ、そして現在までに同定されたオーファンレセプターのほぼ全てもまた、このクラスに分類される。結合特異性におけるこの重複の結果として、多くのホルモン応答エレメントは1つより多いレセプター型に結合し得る。
【0004】
レチノイン酸応答の構成的アクチベーター(CAR)のレセプターである、このスーパーファミリーのさらなるメンバーは記載されている(例えば、米国特許第5,756,448号を参照のこと)。CARがRA応答性遺伝子の発現を制御する調節的ネットワークにおいて重要な役割を果たし得ることが示唆されている。最近、mCARと呼ばれる新しいマウスオーファンメンバーが同定され、これは以前に同定されたヒトオーファンCAR(hCAR)に対して近縁である(例えば、Choiら、J.Biol.Chem.272(38):23565〜71(1997)を参照のこと)。hCARと同じように、mCARの発現は肝臓において最も高い。mCAR1およびhCARは両方とも、明らかに構成的転写アクチベーターである。この活性は、保存されたC末端AF−2転写活性化モチーフの存在に依存する。それがDNAに結合できないことから予想すると、このmCAR2改変体は、それ自身によるトランス活性化も、hCARまたはmCAR1によるトランス活性化の阻害もまた行わない。
【0005】
核ホルモンレセプターの重要性を考慮すると、機能不全または疾患の予防、改善、または修復において役割を果たし得る核ホルモンレセプターのさらなる特徴付けが明らかに必要とされている。
【0006】
(発明の要旨)
本発明は一般に、遺伝子機能の特徴付けに関連するトランスジェニック動物、ならびに組成物および方法に関連する。
【0007】
本発明は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞から構成される。本発明の細胞は、好ましくは幹細胞であり、そしてより好ましくは胚性幹(ES)細胞であり、そして最も好ましくはマウスのES細胞である。1つの実施形態によると、このトランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入して相同組換えを生じさせ、核ホルモンレセプター遺伝子の変異を生じることによって産生される。別の実施形態において、トランスジェニック細胞は、以下に記載のトランスジェニック動物から誘導される。トランスジェニック動物に由来する細胞としては、単離された細胞か、あるいは組織または器官に存在する細胞、および任意の細胞株または任意のその子孫が挙げられる。
【0008】
本発明はまた、幹細胞に導入された場合に相同組換え体を産生する標的化構築物およびこの標的化構築物を作製する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明の標的化構築物は、核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第一および第二のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、好ましくは、構築物内の2つの異なる相同的ポリヌクレオチド配列間に配置された選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、相同組換えを増強し得る他の調節エレメントを含み得る。
【0009】
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物およびそのような非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子における変異についてヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。1つの局面において、本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子の機能が欠損している。別の局面において、本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子の変異を有することに関連した表現型を含む。好ましい実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、脾臓、胸腺、およびリンパ節の異常を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、正常動物と比較して共調およびバランスの低下を証明する。
【0010】
本発明はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響し得る薬剤を同定する方法を提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物に投与され、そして推定薬剤に対するそのトランスジェニック動物の応答が測定され、そして「正常」または野生型マウスの応答と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール(薬剤投与なし)と比較される。本発明はさらに、このような方法によって同定される薬剤を提供する。本発明はまた、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療的薬剤として有益な薬剤を同定する方法を提供する。
【0011】
本発明はさらに、核ホルモンレセプターの発現または機能に関する有効性を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック動物、好ましくはマウスに対して有効量の薬剤を投与する工程を含む。この方法は、例えば、トランスジェニック動物のその薬剤に対する応答を測定する工程、およびトランスジェニック動物の応答をコントロール動物(例えば、野生型動物、またはトランスジェニック動物コントロールであり得る)と比較する工程を含む。核ホルモンレセプターの発現または機能に関する有効性を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するための細胞ベースのアッセイ(cell−based assays)で細胞に対してスクリーニングされ得る。
【0012】
本発明はまた、核ホルモンレセプター遺伝子の核酸配列を含む細胞株を提供する。このような細胞株は、この細胞株において機能的なプロモーターへと作動可能に連結することによってこのような配列を発現し得る。好ましくは、核ホルモンレセプター遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。核ホルモンレセプター遺伝子配列に相互作用する薬剤を同定する方法もまた、提供され、この方法は、核ホルモンレセプター遺伝子を、薬剤に接触させ、そして薬剤および薬剤/核ホルモンレセプター遺伝子複合体を検出する工程を含む。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能マーカーの発現を測定することによって検出され得る。
【0013】
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊、そしてさらに特に核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能の破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能の破壊に関連した疾患または状態を処置することを含み、これは、核ホルモンレセプターの発現または機能をもたらす治療的薬剤を、必要のある被験体に投与する工程を含む。この実施形態に従って、この方法は、天然、合成、半合成、または組換えの核ホルモンレセプター遺伝子、核ホルモンレセプター遺伝子産物またはそのフラグメント、あるいは天然、合成、半合成または組換えのアナログの治療有効量の投与を含む。
【0014】
本発明は、破壊された標的化遺伝子の発現または機能に関連する疾患または状態を処置する方法をさらに提供し、ここでその方法は、変異した核ホルモンレセプター遺伝子を検出し、そして遺伝子治療によって置き換える工程を含む。
【0015】
(定義)
用語「遺伝子」は、(a)本明細書中に開示のDNA配列の少なくとも1つを含む遺伝子;(b)本明細書中に開示のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のDNA配列および/または;(c)本明細書中に開示のコード配列の相補体にハイブリダイズする任意のDNA配列をいう。好ましくは、この用語はコード領域および非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含め、正常な遺伝子発現に必要な全ての配列を含む。
【0016】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態をいうために交換可能に使用される。このポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはそれらのアナログを含み得る。ヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、かつ公知または公知でない任意の機能を遂行し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖および三本鎖のらせん分子を含む。
【0017】
「オリゴヌクレオチド」は、5ヌクレオチドと約100ヌクレオチドとの間の一本鎖DNAまたは二本鎖DNAのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、または当該分野で公知の方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」は、通常一本鎖の、酵素媒介核酸合成の開始のための3’ヒドロキシル末端を提供するオリゴヌクレオチドをいう。以下はポリヌクレオチドの非制限的な実施形態である:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA,rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子アナログのような修飾された核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンのアナログは当該分野で公知であり、そして以下を含むが、それらに限定されない:アジリジニシトシン(aziridinycytosine)、4−アセチルシトシン、5−フルオロウラシル、6−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルーアミノメチルウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、プソイドウラシル、5−ペンチルニルウラシル(5−pentylnyluracil)および2,6−ジアミノプリン。デオキシリボ核酸中のチミンに代わる置換基としてのウラシルの使用もまた、ピリミジンのアナログ形態と考えられる。
【0018】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも9個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも45個のヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドである。
【0019】
用語「遺伝子標的化」とは、ゲノムDNAフラグメントが哺乳動物細胞に導入され、そしてそのフラグメントが内在性相同配列の位置に配置されてこの配列と組み換わる場合に生じる、相同組換えの型をいう。
【0020】
用語「相同組換え」とは、相同なヌクレオチド配列の部位における2つのDNA分子間または染色分体間のDNAフラグメントの交換をいう。
【0021】
本明細書中に使用される用語「相同」は、参照配列と比較して少なくとも約70%の配列同一性、代表的には少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、およびより好ましくは約98%の配列同一性、ならびに最も好ましくは参照配列と比較して約100%の配列同一性を有するDNA配列の特徴を意味する。相同性は、「BLASTN」アルゴリズムを用いて決定され得る。相同的配列は、ヌクレオチド配列中に挿入、欠失および置換を含み得ることが理解される。従って、ヌクレオチドの直鎖状配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確には対応しなくても、または整列にされなくても、本質的に同一であり得る。この参照配列は、遺伝子配列または隣接配列の一部分、あるいは染色体の反復部分のような、より長い配列の部分集合であり得る。
【0022】
用語「標的遺伝子」(あるいは、「標的遺伝子配列」、「標的DNA配列」または「標的配列」という)は、相同組換えによって改変された任意の遺伝子の任意の核酸分子またはポリヌクレオチドをいう。標的配列としては、インタクトな遺伝子、エキソンまたはイントロン、調節配列あるいは遺伝子間の任意の領域が挙げられる。この標的遺伝子は、個々のゲノムDNA中の特定遺伝子または遺伝子座の一部分を含む。本明細書中に提供されるように、本発明のこの標的遺伝子は、核ホルモンレセプター遺伝子である。「核ホルモンレセプター遺伝子」とは、配列番号1を含む配列またはオーファン核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2をコードする配列(登録番号AF009328;GI番号:2267577としてGenebankで同定された)を含む配列をいう。1つの局面において、核ホルモンレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号1を含むか、または核ホルモンレセプター遺伝子(登録番号AF009328;GI番号:2267577としてGenebankで同定される)を含む。
【0023】
核ホルモンレセプター遺伝子の「破壊」は、ゲノムDNAのフラグメントが内在性相同配列の位置に配列されてこの配列と組み換わる場合に生じる。これらの配列の破壊または改変としては、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、もしくは置換、またはDNA配列の置き換え、あるいはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。挿入としては、動物、植物、原核生物、またはウイルス起源の遺伝子であり得る遺伝子全体の挿入が挙げられる。破壊は、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライシング部位を変更または置き換え得、そしてその産生を部分的または完全に阻害することによって、あるいは正常遺伝子産物の活性を促進することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【0024】
用語「トランスジェニック細胞」は、遺伝子標的化の方法によって破壊されるか、改変されるか、変更されるか、あるいは完全にまたは部分的に置換されている、そのゲノム中に核ホルモンレセプター遺伝子を含む細胞をいう。
【0025】
用語「トランスジェニック動物」は、遺伝子標的化の方法によって破壊された特定の遺伝子をそのゲノム中に含む動物をいう。このトランスジェニック動物としては、ヘテロ接合型動物(すなわち、1つの欠損対立遺伝子および1つの野生型対立遺伝子)およびホモ接合型動物(すなわち、2つの欠損対立遺伝子)の両方が挙げられる。
【0026】
本明細書中に使用される、用語「選択マーカー」または「正の選択マーカー」とは、この遺伝子を保有する細胞のみが特定の条件下で生存および/または増殖することを可能にする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン抵抗性(Neor)遺伝子を発現する植物細胞および動物細胞は、化合物G418に対して抵抗性である。Neor遺伝子マーカーを保有しない細胞は、G418によって殺される。他の正の選択マーカーは、当業者に公知である。
【0027】
「宿主細胞」は、ベクター用または核酸分子および/もしくはタンパク質の取り込み用のレシピエントであり得るかまたはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然変異、偶発的変異または意図的変異に起因して元の親に対して(形態または総DNA相補体において)必ずしも完全に同一ではないかもしれない。宿主細胞は、本発明の構築物をトランスフェクトした細胞を含む。
【0028】
本明細書中に使用の用語「調節する」とは、核ホルモンレセプターの機能、発現、活性、あるいは核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した表現型の阻害、減少、増加または増強をいう。
【0029】
用語「改善する」とは、状態、疾患、障害、あるいは表現型(核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した異常または症状を含む)の減少、縮小または除去をいう。
【0030】
用語「異常」は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊が関係している、任意の疾患、障害、状態、または表現型(病理学的状態を含む)をいう。
【0031】
(発明の詳細な説明)
本発明は、遺伝子および遺伝子発現産物(主に核ホルモンレセプターに関連するもの)の発現および役割の評価に一部分基づいている。中でも、本発明は、疾患経路の定義ならびに診断的および治療的に有用な標的の同定を可能にする。例えば、疾患状態下で変異されるまたはダウンレギュレートされる遺伝子は、この疾患状態の誘発または悪化に関与し得る。このような遺伝子の活性のアップレギュレートに指向された処置または代替経路を含む処置は、その疾患の状態を改善させ得る。
【0032】
(標的化構築物の産生)
本発明の標的化構築物は、当該分野で公知の標準方法を用いて産生され得る。(例えば、Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York;E.N.Glover(編)、1985、DNA Cloning:A Practical Approach、第I巻および第II巻;M.J.Gait(編)、1984、Oligonucleotide Synthesis;B.D.Hames & S.J.Higgins(編)、1985、Nucleic Acid Hybridization;B.D.Hames & S.J.Higgins(編)、1984、Transcription and Translation;R.I.Freshney(編)、1986、Animal Cell Culture;Immobilized Cells and Enzymes、IRL Press、1986;B.Perbal、1984、A Practical Guide To Molecular Cloning;F.M.Ausubelら、1994、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.を参照のこと)。例えば、標的化構築物は、従来の方法によって調製され得、ここで配列は、合成、天然供給源からの単離、操作、クローニング、連結、インビトロでの変異誘発に供すること、プライマー修復などが行われ得る。種々の段階で、結合された配列は、クローニングされ得、そして制限分析、配列決定などによって分析され得る。
【0033】
標的化DNAは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、標的化DNAは、オリゴヌクレオチドの化学的合成、二本鎖DNAテンプレートのニックトランスレーション、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅(またはリガーゼ連鎖反応増幅)、所定の配列を有する原核生物ベクターまたは標的クローニングベクター(例えば、クローニングされたcDNAまたはゲノムDNA、合成DNA、あるいは前述の任意の組み合わせ(例えば、プラスミド、ファージミド(phagemid)、YAC、コスミド、バクテリオファージDNA、他のウイルスDNAまたは複製中間体))の精製、あるいはその精製された制限フラグメント、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源によって産生され得る。さらに、相同な長さは当該分野で公知の方法を用いて選択され得る。例えば、選択は、規定の内在性標的DNA配列の配列の組成および複雑さに基づき得る。
【0034】
本発明の標的化構築物は、典型的に、核ホルモンレセプター遺伝子の一部分または領域に相同な第一の配列および核ホルモンレセプター遺伝子の第二部分または領域に相同な第二の配列を含む。標的化構築物は、さらに正の選択マーカーを含み、これは、好ましくは標的DNA配列の一部分または領域に対して相同な第一のDNA配列と、標的DNA配列の一部分または領域に対して相同な第二のDNA配列との間に配置される。この正の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。
【0035】
当該分野で公知の他の調節配列は、特異的細胞型において特定遺伝子の発現を破壊するかまたは制御するために標的化構築物中に組み込まれ得る。さらに、標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)または別の改変された蛍光タンパク質をコードする配列も含み得る。
【0036】
相同配列の大きさは重大ではないけれども、わずか50塩基対から100kbほどの長い範囲におよび得、好ましくは各フラグメントは約1kbの長さよりも長く、さらに好ましくは約1kbと約10kbとの間、なおさらに好ましくは約1kbと約5kbとの間であり得る。当業者は、より長いフラグメントは、ES細胞での相同組換え事象数を増加させ得るが、より長いフラグメントはまた、クローニングがより難しいことを認識する。
【0037】
本発明の好ましい実施形態において、この標的化構築物は、1997年11月17日出願の係属中の米国特許第08/971,310号(この開示は本明細書中にその全体が援用される)に記載の方法を用いてプラスミドゲノムライブラリーから直接的に調製される。一般的に、目的の配列は、単一工程(例えば、長範囲PCR)を使用してプラスミドライブラリーから同定され、そして単離される。この配列の単離に続いて、標的配列を破壊する第二のポリヌクレオチドは、目的の配列をコードする2つの領域の間に容易に挿入され得る。この局面に従って、この構築物は以下によって2工程で産生される:(1)標的配列に相同な配列を(例えば、長範囲PCRを用いて)増幅する工程、および(2)別のポリヌクレオチド(例えば、選択マーカー)を、相同配列によって隣接されるようにPCR産物中に挿入する工程。代表的に、このベクターはプラスミドゲノムライブラリーに由来するプラスミドである。この完成された構築物はまた、代表的に環状プラスミドである。
【0038】
別の実施形態において、標的化構築物は、2000年9月15日出願の米国特許出願第60/232,957号(この開示は本明細書中にその全体が援用される)に記載の調節された正の選択方法によって設計される。この標的化構築物は、PGKプロモーター中に配置された2つのlacO部位を有するPGK−neo融合遺伝子、およびSV40 T抗原に由来するNLSをコードする配列に融合されたlacリプレッサーを含むNLS−lacI遺伝子を含むように設計される。
【0039】
別の実施形態において、この標的化構築物は、1つより多くの選択マーカー遺伝子を含み得、これは、単純疱疹ウイルスtk(HSV−tk)遺伝子のような負の選択マーカーを含む。この負の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。(例えば、米国特許第5,464,764号;同第5,487,992号;同第5,627,059号;および同第5,631,153号を参照のこと)。
【0040】
(細胞の生成および相同組換え事象の確認)
一旦、適切な標的化構築物が調製されると、標的化構築物は、当該分野で公知の任意の方法を使って適切な宿主細胞に導入され得る。種々の技術は、本発明において利用され得、例としては、前核マイクロインジェクション;生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入;胚性幹細胞での遺伝子標的化;胚のエレクトロポレーション;精子媒介遺伝子移入;およびリン酸カルシウム/DNA共沈、核内へのDNAマイクロインジェクション、細菌プロトプラストとインタクトな細胞との融合、トランスフェクション、ポリカチオン(例えば、ポリブレン、ポリオルニチン)など(例えば、米国特許第4,873,191号;Van der Puttenら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 82:6148−6152;Thompsonら、1989、Cell 56:313−321;Lo、1983、Mol Cell.Biol.3:1803−1814;Lavitranoら、1989、Cell、57:717−723を参照のこと)が挙げられる。哺乳動物細胞を形質転換させるための種々の技術は、当該分野において公知である(例えば、Gordon、1989、Intl.Rev.Cytol.、115:171−229;Keownら、1989、Methods in Enzymology;Keownら、1990、Methods and Enzymology、第185巻、527−537頁;Mansourら、1988、Nature、336:348−352を参照のこと)。
【0041】
本発明の好ましい局面において、標的化構築物は、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入される。この過程において、高い場の強度の電気インパルスは、生体膜を可逆的に透過可能にして、構築物の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に作られた小孔はDNAのような高分子の取り込みを許す。(例えば、Potter、H.ら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7161−7165を参照のこと)。
【0042】
相同組換え能力のある任意の細胞型は、本発明の実行において使用され得る。このような標的細胞の例として、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、ネズミ種、サル種のような哺乳動物を含む脊椎動物から誘導される細胞および糸状菌のようないずれかの真核生物、ならびに植物のような高等多細胞生物が挙げられる。
【0043】
好ましい細胞型は、典型的にインビトロで培養された着床前の胚から得られる胚性幹(ES)細胞が含まれる(例えば、Evans、M.J.ら、1981、Nature 292:154−156;Bradley、M.O.ら、1984、Nature 309:255−258;Gosslerら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065−9069;およびRobertsonら、1986、Nature 322:445−448を参照のこと)。このES細胞は、当業者に周知の方法を用いて標的化構築物の導入のために培養され、そして調製される。(例えば、Robertson、E.J.編「Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells、a Practical Approach」、IRL Press、Washington D.C.、1987;Bradleyら、1986、Current Topics in Devel.Biol.20:357−371;Hoganら「Manipulating the Mouse Embryo」:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor N.Y.、1986;Thomasら、1987、Cell 51:503;Kollerら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:10730;Dorinら、1992、Transgenic Res.1:101;およびVeisら、1993、Cell 75:229を参照のこと)。この標的化構築物を導入されるES細胞は、それらが導入される発生中の胚と同種の胚または胚盤胞から誘導される。ES細胞は、発生の胚盤胞段階の胚において哺乳動物に導入される場合に、典型的にそれらの内部細胞塊中へと統合する能力および個々の生殖系列に寄与する能力に関して選択される。従って、この能力を有する任意のES細胞株は、本発明の実行における使用に適切である。
【0044】
本発明はまた、幹細胞のような他の細胞型において遺伝子をノックアウトするために使用され得る。例として、幹細胞は、骨髄、リンパ、または神経の前駆体(progenitor)細胞または前駆(precursor)細胞であり得る。遺伝子の破壊またはノックアウトを含む細胞は、個々の発生経路における核ホルモンレセプター遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの任意のの脊椎動物種から誘導され得る。
【0045】
その標的化構築物が細胞中に導入された後、この遺伝子標的化が成功した細胞が同定される。この標的とされる遺伝子中に標的化構築物を挿入することは、典型的にマーカー遺伝子の発現に関して細胞を同定することによって検出される。好ましい実施形態において、この本発明の標的化構築物で形質転換された細胞は、選択マーカーを発現していない細胞を除去するように選択する適切な薬剤を用いた処置に供される。この選択マーカー遺伝子を発現している細胞のみが、特定条件下で生存および/または増殖する。例えば、導入されたネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、化合物G418に対して耐性であり、一方neo遺伝子マーカーを発現しない細胞はG418によって殺される。この標的化構築物がまたGFPのようなスクリーニングマーカーを含む場合、相同組換えは蛍光下での細胞コロニーのスクリーニングによって同定され得る。相同組換えを受けた細胞は、GFP遺伝子を欠損しており、そして蛍光を発しない。
【0046】
調節された正の選択方法が相同組換え事象の同定に使用される場合、その標的化構築物は、発現が無作為組み込みの後に抑制されるが、相同組換えの後に可能になる(抑制解除される)様式で選択マーカー遺伝子の発現が調節されるように設計される。より詳細には、トランスフェクトされた細胞は、neo遺伝子の発現に関してスクリーニングされ、これは(1)この細胞がうまくエレクトロポレーションされ、そして(2)neo転写のlacリプレッサー阻害が相同組換えによって解除されることを必要とする。この方法は、トランスフェクトされた細胞および相同組換え体の同定が、単一薬物の添加をともなう一工程において生じることを可能にする。
【0047】
あるいは、正の−負の選択技術は、相同組換え体を選択するために使用され得る。この技術は、トランスフェクトされた細胞の増殖に関して選択する(すなわち、正の選択)ために第一の薬物(例えば、ネオマイシン様薬物)がその細胞集団に与えられるプロセスを含む。FIAUのような第二の薬物は、負の選択マーカーを発現する細胞を殺傷させる(すなわち、負の選択)ために続いて与えられる。負の選択マーカーを含みそして発現する細胞は、選択薬剤によって殺傷され、一方、この負の選択マーカーを含まずそして発現しない細胞は、生存する。例えば、この構築物の非相同的な挿入を有する細胞は、HSVチミジンキナーゼを発現し、そしてそれゆえ、ガンシクロビル(gancyclovir)(GANC)またはFIAU(1−(2−デオキシ2−フルオロ−B−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードウラシル)(1−(2−deoxy 2−fluoro−B−D−arabinofluranosyl)−5−iodouracil)のようなヘルペス薬物に対して感受性である。(例えば、Mansourら、Nature 336:348−352:(1988);Capecchi、Science 244:1288−1292、(1989);Capecchi、Trends in Genet.5:70−76(1989)を参照のこと)。
【0048】
成功した組換えは、相同組換えを確認するために、その選択された細胞のDNAを分析することによって同定され得る。PCRおよび/またはサザン分析のような当該分野で公知の種々の技術は、相同組換え事象を確認するために使用され得る。
【0049】
相同組換えはまた、幹細胞および全能性胚性幹細胞ではない他の細胞型において遺伝子を破壊するために使用され得る。例として、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経の前駆体(progenitor)細胞および前駆(precursor)細胞であり得る。このようなトランスジェニック細胞は、個々の発生経路における核ホルモンレセプター遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの任意の脊椎動物種から誘導され得る。
【0050】
全能性でない細胞において、当該分野で公知の方法を用いて標的の両方のコピーをノックアウトすることが所望され得る。例えば、正の選択マーカー(Neor)の発現に関して選択され、そして非無作為組み込みに関してスクリーニングされた標的遺伝子座に相同組換えを含む細胞は、上昇したレベルの選択的薬剤(例えば、G418)への曝露によって、複数コピーの選択マーカー遺伝子に関してさらに選択され得る。次いで、この細胞は標的遺伝子座でホモ接合性に関して分析される。あるいは、第二の構築物は、2つの相同配列間に挿入された異なる正の選択マーカーを用いて産生され得る。この2つの構築物は、正のマーカー遺伝子のそれぞれに適切な選択に従って、連続的かまたは同時的かのいずれかでその細胞に導入され得る。最終的な細胞は、標的の両対立遺伝子の相同組換えに関してスクリーニングされる。
【0051】
(トランスジェニック動物の産生)
選択された細胞は、次いで、動物(例えば、マウス)の胚盤胞(または例えば、桑実胚のような生存可能な動物を作成する目的に適した発生の他の段階)に、キメラを形成するために注入される(例えば、Bradley、A.、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、E.J.Robertson、編、IRL、Oxford、113−152頁(1987)を参照のこと)。あるいは、選択されたES細胞は、凝集キメラを形成するために解離されたマウス胚性細胞と凝集され得る。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠した雌性里親動物中に移植され得、そして胚は出産され得る。それらの生殖細胞に相同的に組換えられたDNAを有するキメラ後代は、動物の全ての細胞に相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させるために用いられ得る。1つの実施形態において、キメラ後代マウスは、核ホルモンレセプター遺伝子がヘテロ接合性に破壊をされたマウスを作製するために使用される。次いで、ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスを、交尾させ得る。典型的に、このような交尾の子孫の1/4が、核ホルモンレセプター遺伝子がヘテロ接合性に破壊されていることは、当該分野において周知である。
【0052】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性のトランスジェニックマウスは、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊が表現型の変化、特に病理学的変化を引き起こすかどうかを決定するために、正常な野生型マウスと比較され得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスは、理学的検査、剖検、組織像、臨床化学、全血球算定、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価によって表現型変化について評価され得る。
【0053】
1つの実施形態において、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連する表現型(または表現型の変化)は、データベースに入れられるか、または蓄えられる。好ましくは、このデータベースは、(i)遺伝子型データ(例えば、破壊された遺伝子の同定)および(ii)遺伝子型データに関連する表現型データ(例えば、遺伝子破壊から生じる表現型)を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは好ましくは、このデータベースが検索可能であるように探索ツールと組み合わされる。
【0054】
(条件的トランスジェニック動物)
本発明はさらに、組換え方法を用いて産生された条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物などの条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物を意図する。酵母プラスミドに由来するバクテリオファージP1 Creリコンビナーゼおよびflpリコンビナーゼは、部位特異的なDNAリコンビナーゼ酵素の2つの非制限的な例であり、これらの酵素は、特異的標的部位(creリコンビナーゼではlox P部位、そしてflpリコンビナーゼではfrt部位)でDNAを切断し、そして第二の切断部位へのこのDNAの連結を触媒する。多数の適切な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、それらの遺伝子は、本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのIntリコンビナーゼ(Xisを有するかまたは有さない)(Weisberg、R.ら、Lambda II、(Hendrix、R.ら、編)、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、211−50頁(1983)(本明細書中に参考として援用される));TpnIおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン(Mercierら、J.Bacteriol.、172:3745−57(1990));Tn3レソルバーゼ(Flanagan & Fennewald、J.Molec.Biol.、206:295−304(1989);Starkら、Cell、58:779−90(1989));酵母リコンビナーゼ(Matsuzakiら、J.Bacteriol.、172:610−18(1990));B.subtilis SpoIVCリコンビナーゼ(Satoら、J.Bacteriol.172:1092−98(1990));Flpリコンビナーゼ(Schwartz & Sadowski、J.Molec.Biol.、205:647−658(1989);Parsonsら、J.Biol.Chem.、265:4527−33(1990);Golic & Lindquist、Cell、59:499−509(1989);Aminら、J.Molec.Biol.、214:55−72(1990));Hinリコンビナーゼ(Glasgowら、J.Biol.Chem.、264:10072−82(1989));免疫グロブリンリコンビナーゼ(Malynnら、Cell、54:453−460(1988));およびCinリコンビナーゼ(Haffter & Bickle、EMBO J.、7:3991−3996(1988);Hubnerら、J.Molec.Biol.、205:493−500(1989))(全ては参考として本明細書中に援用される)が挙げられる。このようなシステムは、:Echols(J.Biol.Chem.265:14697−14700(1990));de Villartay(Nature、335:170−74(1988));Craig、(Ann.Rev.Genet.、22:77−105(1988));Poyart−Salmeronら、(EMBO J.8:2425−33(1989));Hunger−Bertlingら、(Mol Cell.Biochem.、92:107−16(1990));およびCregg & Madden(Mol.Gen.Genet.、219:320−23(1989))(全ては参考として本明細書中に援用される)によって議論されている。
【0055】
Creは、均質になるまで精製され、そしてloxP部位との反応は、広く特徴付けられている(Abremski & Hess J.Mol.Biol.259:1509−14(1984)、参考として本明細書中に援用される)。Creタンパク質は、35,000の分子量を有し、そしてNew England Nuclear/DuPontから商業的に入手可能である。このcre遺伝子(Creタンパク質をコードする)はクローン化され、そして発現されている(Abremskiら、Cell 32:1301−11(1983)、参考として本明細書中に援用される)。このCreタンパク質は、同じDNA分子または異なるDNA分子に存在し得る2つのloxP配列間の組換えを仲介する(Sternbergら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.45:297−309(1981))。loxP部位の内部スペーサー配列は非対称性であるので、2つのloxP部位は互いに対して方向性を呈し得る(Hoess & Abremski、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1026−29(1984))。従って、同じDNA分子上の2つの部位が、直接的に繰り返された方向にある場合、Creはその部位間のDNAを切り出す(Abremskiら、Cell 32:1301−11(1983))。しかしながら、この部位が互いに関して反転している場合、それらの間のDNAは組換え後に切り出されるのではなく、単に反転される。したがって、直接方向に2つのloxP部位を有する環状DNA分子が組換えられて、2つのより小さな環を生産する。これに対して、反転した方向に2つのloxP部位を有する環状分子は、loxP部位が隣接するDNA配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のDNA分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【0056】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルにおいて遺伝子機能を特徴付けるために重要な適用を有する。本明細書中に記載される構築物が核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用される場合、正の選択マーカーの挿入が核ホルモンレセプター遺伝子の翻訳開始部位の下流(3’)に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うあるレベルのタンパク質発現を生じ得る。正の選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化に関連しているか、またはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているかを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。正の選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、正の選択マーカーが除去される。このようにして、正の選択マーカーまたは融合転写物の発現により生じる影響は避けられる。
【0057】
1つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は、直接マイクロインジェクションによって細胞へもたらされる。別の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態のさらなる局面は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ媒介組換えを実行するための1つの方法は、誘導性または組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントを使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用を含む。誘導性発現エレメントは好ましくは、所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または誘導性活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用することができるさらなる制御エレメントとしては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを組み込んだベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【0058】
(疾患のモデル)
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ(micro−pig)、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。このようなアッセイは、例えば、疾患症状を回復させることが可能である化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に曝露され得る。これは、曝露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。曝露された後、細胞は1つ以上の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に曝露され得る。これは、曝露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。曝露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転(reversal)を評価してモニターされ得る。曝露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を曝露することを含み得る。新生児、若年および成体の動物もまた曝露され得る。
【0059】
より具体的には、本発明の動物モデル(具体的には、トランスジェニックマウス)を使用して、薬剤(化合物を含む)を同定する方法が、好ましくは、核ホルモンレセプター遺伝子中の破壊に関連する少なくとも1つの表現型に影響を与える能力に基づいて提供される。1つの実施形態では、本発明は、核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能に影響を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、薬剤に対する動物の生理学的応答を測定する工程、およびコントロール動物に対してそのような動物の生理学的応答を比較する工程を包含し、ここで、コントロール動物と比較した、核ホルモンレセプター中に破壊を含む動物の生理学的応答が、この薬剤の特異性を示す。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ(例えば、遺伝子転写、タンパク質産生および分解速度)、物理的パラメーター(例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、PTT.T、またはTT)および細胞アッセイ(例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力)が使用され得る。
【0060】
本発明のトランスジェニック動物および細胞は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。1つの局面において、核ホルモンレセプターをコードする遺伝子中の破壊に関連する表現型は、以下に示される実施例に記載されるように、脾臓、胸腺、およびリンパ節中で見出される。
【0061】
本発明は、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【0062】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム(例えば、「分散分析」またはANOVAなど)を使用して実施され得る。約0.05以下の「p」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いp値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物(またはその群)の挙動と野生型マウス(またはその群)の挙動との間での比較を、典型的にはある定められた条件下にて行う。本明細書中に使用されるように、「異常な行動」とは、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を有しない動物(例えば野生型マウス)と異なる、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を有する動物(例えばトランスジェニック動物)によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定(または観察)および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る(例えば、CrawleyおよびPaylor,Hormones and Behavior 31:197−211(1997)を参照のこと)。
【0064】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを曝露することを含む。動物の社会的挙動(例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾)が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る(例えば、S.E.Fileら,Pharmacol.Bioch.Behav.22:941−944(1985);R.R.Holson,Phys.Behav.37:239−247(1986)参照)。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【0065】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚(通常、聴覚性)刺激に曝露し、動物の驚愕反応を測定することを含む(例えば、M.A.Geyerら,Brain Res.Bull.25:485−498(1990);PaylorおよびCrawley,Psychopharmacology 132:169−180(1997)参照)。(正常な驚愕反応からの)抑制パーセントが、驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える(cueing)」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた、使用され得る。
【0066】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への曝露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、G.J.Kantら、Pharm.Bioch.Behav.20:793−797(1984);N.J.Leidenheimerら、Pharmacol.Bioch.Behav.30:351−355(1988)参照)。
【0067】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ/または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である(例えば、M.Bertolucci D’Angicら、Neurochem.55:1208−1214(1990)参照)。
【0068】
新規の試験は、通常、新規な環境および/または新規な対象への曝露を含む。新規な環境および/または新規な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される(例えば、D.K.Reinsteinら、Pharm.Bioch.Behav.17:193−202(1982);B.Poucet,Behav.Neurosci.103:1009−10016(1989);R.R.Holsonら、Phys.Behav.37:231−238(1986)を参照のこと)。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【0069】
学習された無力(helplessness)試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への曝露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る(例えば、A.Leshnerら、Behav.Neural Biol.26:497−501(1979)参照)。
【0070】
あるいは、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると考えられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると考えられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先だってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させることが研究によって示されている。
【0071】
モーリス水迷路試験(Morris water−maze test)は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、E.M.Spruijtら、Brain Res.527:192−197(1990)を参照のこと)。
【0072】
あるいは、Y字型迷路が使用され得る(例えば、McFarland,D.J.,Pharmacology,Biochemistry and Behavior 32:723−726(1989);Dellu,F.ら、Neurobiology of Learning and Memory 73:31−48(2000)を参照のこと)。Y迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Y迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約40cm×8cm×20cmであり得る。各アームもまた、例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた16のフォトビームを有することができる。少なくとも2種の異なった試験がこのようなY迷路を使用して実施され得る。連続Y迷路パラダイムでは、マウスに例えば約10分間、Y迷路の3つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は動物が2回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的(egocentrically)に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。2つの試験的Y迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新規性および空間記憶に対する反応を測定する。第1の試験(取得)中、動物は、例えば約15分間、自由にY迷路の2つのアームを訪問し得る。第3のアームはこの試験中、遮蔽されている。第2の試験(回復)は例えば約2時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約5分間、3つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の3つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの間の区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり(cue)に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を媒介するその遺伝子の役割を示し得る。
【0073】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には2つ以上の環境への曝露を含み、そのうちの1つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む(例えば、R.Aderら、Psychon.Sci.26:125−128(1972);R.R.Holson,Phys.Behav.37:221−230(1986)参照)。あるいは、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、2つの開放および2つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約5分間、探索させる。このパラダイムは、ゲッ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安のレベルを測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【0074】
食物回避試験は、新しい食物への曝露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、B.A.Campbellら、J.Comp.Physiol.Psychol.67:15−22(1969)を参照のこと)。
【0075】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に曝露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、H.A.Baldwinら、Brain Res.Bull,20:603−606(1988)参照)。
【0076】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤(例えば、アンフェタミン、コカイン、PCPなど)の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.B.S.Clarkeら、Psychopharmacology 96:511−520(1988);P.Kuczenskiら、J.Neuroscience 11:2703−2712(1991)を参照のこと)。
【0077】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および/または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される(例えば、S.Nassifら、Brain Res.,332:247−257(1985);W.L.Isaacら、Behav.Neurosci.103:345−355(1989)参照)。
【0078】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、L.E.Jarrardら、Exp.Brain Res.61:519−530(1986)参照)。
【0079】
DRL(低反応率差次的強化(differential reinforcement to low rates of responding))実施試験は間欠的報酬パラダイムに曝露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、J.D.Sindenら、Behav.Neurosci.100:320−329(1986);V.Nalwaら、Behav.Brain Res.17:73−76(1985);およびA.J.Nonnemanら、J.Comp.Physiol.Psych.95:588−602(1981)を参照のこと)。
【0080】
空間学習試験は、複雑で新規の環境に曝露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、N.Pitsikasら、Pharm.Bioch.Behav.38:931−934(1991);B.Poucetら,Brain Res.37:269−280(1990);D.Christieら,Brain Res.37:263−268(1990);およびF.Van Haarenら、Behav.Neurosci.102:481−488(1988)を参照のこと)。あるいは、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド(of)試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な(すなわち心配性でない)マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【0081】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に曝露し、例えば環境に適応する(orientating)反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、J.M.Vargoら、Exp.Neurol.102:199−209(1988)を参照のこと)。
【0082】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.J.Fletcherら、Psychopharmacol.102:301−308(1990);M.G.Cordaら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:2072−2076(1983)参照)。
【0083】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。1つまたは2つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約5〜10分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間(対象物への接近、すなわち、例えば約3〜5cm以内での動きが対象物の探索とみなされる)が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新規な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新規な対象物を探索することに費やす時間の割合(再び、約5〜10分間の時間をかけて)が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新規な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物(好ましくは単純なブロック)がスプレーされるか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ;新規な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新規恐怖症(neophobia)を示す。
【0084】
熱板痛覚脱失試験(hot plate analgesia test)は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約55℃の熱板上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間(例えば、後足を持ち上げて後足をなめる時間)が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【0085】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調およびバランスを測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル(または回転丸太)のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約60rpmの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低20分間あけて少なくとも3回、試験される。もっとも長くロッド上に留まることができるマウスはより良好な協調およびバランスを有すると考えられる。
【0086】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール5mg/ml溶液は、例えば、約0.375ml/分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。4つの区別される生理学的段階が記録され得る:注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展(tonic extension)」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【0087】
(核ホルモンレセプター遺伝子産物)
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子産物を産生するための核ホルモンレセプター遺伝子配列の使用を意図する。核ホルモンレセプター遺伝子産物としては、機能的に等価な遺伝子産物を示すタンパク質が挙げられ得る。このような等価な遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これらは、サイレント(silent)な変化を生じ、従って、機能的に等価な核ホルモンレセプター遺伝子産物を産生する。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、変化、可溶性、疎水性、親水性、および両親媒性の性質に基づいてなされ得る。
【0088】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ;極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ;ならびに、負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「機能的に等価な」とは、本明細書中に使用される場合、核ホルモンレセプター遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に類似のインビボ活性を示し得るタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価な」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分と実質的に類似の様式で、他の細胞分子または細胞外分子と相互作用し得るペプチドを言及し得る。
【0089】
本発明の方法に従う有用な他のタンパク質産物は、組換え手段または合成手段によって産生された核ホルモンレセプター遺伝子から誘導されるかまたはこれらに基づく、ペプチド(誘導ペプチド)である。
【0090】
核ホルモンレセプター遺伝子産物は、当該分野で周知の技術を用いて組換えDNA技術によって産生され得る。従って、遺伝子配列をコードする核酸を発現させることによって本発明の遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製するための方法が、本明細書中に開示される。当業者に周知の方法を使用して、遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組み換えが挙げられる(例えば、Sambrookら、1989(前出)、ならびにAusubelら、1989(前出)を参照のこと)。あるいは、遺伝子タンパク質配列をコードし得るRNAが、例えば、自動化合成機を使用して、化学合成され得る(例えば、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Gait,M.J.ら編、IRL Press,Oxford(1984)を参照のこと)。
【0091】
種々の宿主発現ベクター系を使用して、本発明の遺伝子コード配列を発現させ得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、そして実質的に精製され得るビヒクルだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、インサイチュで本発明の遺伝子タンパク質を示す細胞を呈する。これらとしては、遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミド発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、B.subtilis);遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia);遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)感染された植物細胞系、または遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS細胞系、CHO細胞系、BHK細胞系、293細胞系、3T3細胞系)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0092】
細菌系において、多くの発現ベクターが、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望まれ得る。このようなベクターとしては、E.coli発現ベクターpUR278(このベクターにおいて、この遺伝子のタンパク質コード配列は、融合タンパク質が生産されるように、lacZコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結され得る)(Rutherら、EMBO J.、2:1791−94(1983));pINベクター(Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.、13:3101−09(1985);Van Heekeら、J.Biol.Chem.、264:5503−9(1989))などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、トロンビンプロテアーゼ切断部位またはXa因子プロテアーゼ切断部位を含み、クローン化された核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質がGST部分から放出され得るように、設計され得る。
【0093】
好ましい実施形態では、完全長のcDNA配列が、標準的PCR方法論(Innisら(編)、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press、San Diego (1990))を使用して、アミノ末端でインフレームBamHI部位に、そしてカルボキシ末端でインフレームEcoRI部位に付加され、pGEX−2TKベクター(Pharmacia、Uppsala、Sweden)中に連結される。得られたcDNA構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンS−トランスフェラーゼ配列を含む(Nilssonら、EMBO J.、4:1075−80(1985);Zabeauら、EMBO J.、1:1217−24(1982))。
【0094】
昆虫系では、Autographa californica核多角体ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローン化され得、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置され得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活化および非閉鎖性(non−occluded)組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性夾膜(proteiaceous coat)を欠くウイルス)の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞を感染させるために使用され、この細胞において、挿入された遺伝子が発現される(例えば、Smithら、J.Virol.46:584−93(1983);米国特許第4,745,051号参照)。
【0095】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列)に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1領域またはE3領域)への挿入は、生存可能でありかつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質発現が可能な、組換えウイルスを生じる(例えば、Loganら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、81:3655−59(1984)を参照のこと)。特定の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合が、あり得る。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが、提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームと位相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源(天然および合成の両方)由来であり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る(Bitterら、Methods in Enzymol.、153:516−44(1987)を参照のこと)。
【0096】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする、宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が、操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択マーカーで、形質転換され得る。外来DNAの導入後に、操作された細胞は、富化培地中で1〜2日間増殖させられ得、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与えそしてプラスミドを染色体中に安定して組み込みかつ増殖する細胞にフォーカスを形成させ、次いでこれはクローン化され得、細胞株に拡大し得る。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【0098】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および/または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネイン応答性プロモーター、エクジソン応答性プロモーターおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス(特にHIV)プロモーターなどの特定転写因子を必要とするプロモーターが、挙げられる。1つの実施形態では、Tet誘導性遺伝子発現系が使用される(Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547−51(1992);Gossenら、Science、268:1766−69 (1995))。Tet発現系は、E.coli Tn10トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の2つの調節エレメント(テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)、およびTetRが結合するテトラサイクリンオペレーター配列(tetO))に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はtetOオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同時トランスフェクトされたTetRの存在下で、組換えタンパク質の発現は、tetO調節エレメントへのTetRタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルで調節された遺伝子発現は、TetRへの結合についてtetOエレメントと競合する、種々の濃度のテトラサイクリン(Tc)またはドキシサイクリン(Dox)などのTc誘導体に応答して、誘導され得る。tet誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、CLONTECH Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA.から市販されている。
【0099】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は、直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。125Iなどの放射性同位元素;基質に曝されたときに検出可能な発色性シグナルまたは光を発生する酵素標識系;および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えDNA技術が、このようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定および/または検出を容易し得る融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【0100】
間接的標識は、遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質(標識抗体など)の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
(抗体の生成)
1つ以上のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が、本明細書に記載される。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の核ホルモンレセプター遺伝子の検出に、あるいは、異常な核ホルモンレセプター遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は、疾患治療方法の一部として使用され得、そして/または診断技術の一部として使用され得、それにより、患者は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【0102】
抗体の生産のために、種々の宿主動物が、核ホルモンレセプター遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより、免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントが、宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、このようなアジュバントとして、フロイント(完全または不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル(mineral gel)、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント(BCG(bacille Calmette−Guerin)および(Corynebacterium parvum)など)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0103】
ポリクローナル抗体は、抗原(例えば、核ホルモンレセプター遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体)で免疫された動物の血清由来抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物が、これもまた上記したようなアジュバントを補充された、遺伝子産物を注射することにより、免疫化され得る。
【0104】
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術によって、得られ得る。これらとしては、KoehlerおよびMilstein、Nature、256:495−7(1975);および米国特許第4,376,110号のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today、4:72(1983);Coteら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:2026−30(1983))およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Anitbodies And Cancer Therapy、Alan R. Liss,Inc.New York、77−96頁(1985))が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびこれらの任意サブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のmAbを生成するハイブリドーマは、インビトロでもまたはインビボでも培養され得る。インビボでの高力価のmAbの生産が、これを現時点での好ましい生産方法とする。
【0105】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Takedaら、Nature、314:452−54(1985))が、使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子(例えば、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子)である。
【0106】
あるいは、単鎖抗体の生産について記載される技術(米国特許第4,946,778号;Bird、Science 242:423−26(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879−83(1988);およびWardら、Nature、334:544−46(1989))が、遺伝子−単鎖抗体を生成するために適合され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結することによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。
【0107】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、所望な特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするために、Fab発現ライブラリーが構築され得る(Huse, et al., Science, 246: 1275−81 (1989))。
【0108】
(スクリーニング方法)
本発明には、薬剤(例えば、アゴニスト(すなわち、核ホルモンレセプターポリペプチドに結合しかつ活性化する薬剤)またはアンタゴニスト(すなわち、核ホルモンレセプターポリペプチドの活性および核ホルモンレセプターポリペプチドとそのリガンドとの相互作用を阻害する薬剤))についてスクリーニングするためのプロセスにおいて、使用され得る。従って、本発明のポリペプチドはまた、例えば、当該分野で公知の、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー、および天然産物混合物において、低分子物質とリガンドとの結合を評価するために使用され得る。レセプターを調節し得る薬剤を同定しそしてスクリーニングするために慣用的に使用され得る任意の方法が、本発明に従って使用され得る。
【0109】
本発明は、核ホルモンレセプターの発現または機能を調節する薬剤を同定するための方法およびそのような薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。より詳細には、核ホルモンレセプター遺伝子配列を含みかつ発現する細胞が、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、U937(ATCC番号CRL−1593)、THP−1(ATCC番号TIB−202)、およびP388D1(ATCC番号TIB−63)などの非組換え単球細胞株;HUVECおよびウシ大動脈内皮細胞(BAEC)などの内皮細胞;ならびにHeLa細胞およびCOS細胞(例えば、COS−7(ATCC番号CRL−1651))などの一般的な哺乳動物細胞系が、挙げられ得る。さらに、このような細胞としては、組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のトランスジェニックマウスは、疾患に関与する1以上の細胞型を含む細胞株を生成するために、使用され得、このマウスは、その障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物が使用され得るが、連続的な細胞株の生成が、好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Smallら、Mol Cell Biol.、5:642−48(1985)を参照のこと。
【0110】
核ホルモンレセプター遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。核ホルモンレセプター遺伝子配列を過剰発現するために、核ホルモンレセプター遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験をなすことなく利用され得る。核ホルモンレセプター遺伝子配列はまた、破壊され得るかあるいは過小発現され得る。核ホルモンレセプター遺伝子破壊を有する細胞または過小発現された核ホルモンレセプター遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に起因する機能のすべての欠失をも補償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために、使用される。
【0111】
核ホルモンレセプター遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するためのインビトロ系が、設計され得る。このような化合物としては、D−配置アミノ酸および/またはL−配置アミノ酸から作られたペプチド(例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態;例えば、Lamら、Nature、354:82−4(1991)を参照のこと)、ホスホペプチド(例えば、ランダムであるかまたは部分的に縮重した、指向性ホスホペプチドライブラリーの形態;例えば、Songyangら、Cell、72:767−78 (1993)を参照のこと)、抗体、および有機低分子または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質、好ましくは変異体核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の活性を調節することにおいてか;核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成することにおいてか;または正常な核ホルモンレセプター遺伝子相互作用を破壊する化合物、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて、有用であり得る。
【0112】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパクと試験化合物との反応混合物を、その2つの化合物が相互作用および結合することを可能にするに十分な条件および時間で調製し、それによりその反応混合物から取り除かれ得、そして/または検出され得る、複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは、種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う1つの方法は、固相上に核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質または試験物質を固着する工程、および固相上に固着させた標的タンパク質/試験物質複合体を反応の終わりに検出する工程を包含する。このような方法の1つの実施形態では、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質は、固体表面上に固着され得、そして固着されていない試験化合物が、直接的または間接的いずれかで標識され得る。
【0113】
実際には、マイクロタイタープレートが、好都合に使用される。固着された成分は、非共有結合または共有結合によって固定され得る。非共有結合は、単にそのタンパク質溶液で固体表面を被覆し乾燥することによって、達成され得る。あるいは、タンパク質に特異的な固定抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、固体表面にそのタンパク質を固着するために使用され得る。その表面は、予め調製され保存されていてもよい。
【0114】
このアッセイを実施するために、固定されていなかった成分が、固着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定されたまま残るような条件下で(例えば、水洗により)除去される。固体表面上に固着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。以前に固定されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。以前に固定されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が、例えば、以前に固定されていない成分に特異的な標識抗体(その抗体は、次に、直接標識される得か、または標識抗Ig抗体で間接的に標識され得る)を使用して、表面上に固着された複合体を検出するために、使用され得る。
【0115】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物が、未反応成分から分離され得、複合体が、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定抗体を使用して溶液中に形成されるすべての複合体を固着し、そして生じ得る複合体のもう一方の成分に特異的な抗体を使用して固着された複合体を検出することによって、検出される。
【0116】
上記された方法の1つによって特定の核ホルモンレセプター遺伝子産物に結合することが示される化合物は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力についてさらに試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび/またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【0117】
(アンチセンス、リボザイム、および抗体)
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、核ホルモンレセプター遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異体核ホルモンレセプター遺伝子活性を低下または阻害する薬剤が、疾患症状を軽減するために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【0118】
アンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズしそしてタンパク質翻訳を阻害することにより、mRNAの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスDNAに関して、翻訳開始部位(例えば、目的の核ホルモンレセプター遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間)に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが、好ましい。
【0119】
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することが可能な、酵素的RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断を含む。リボザイム分子の組成は、核ホルモンレセプター遺伝子mRNAに対して相補的な1つ以上の配列を含まなければならず、そしてmRNA切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列について、米国特許第5,093,246号(その全体が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。従って、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒する、操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内にある。
【0120】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、以下の配列GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位のための、目的の分子をスキャニングすることにより、同定される。一旦、同定されると、この切断部位を含む核ホルモンレセプター遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る推定構造的特徴(二次構造など)について評価され得る。候補配列の適合性もまた、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのその接近可能性を試験することにより、評価され得る。
【0121】
転写の阻害のための三重らせん形成に使用される核酸分子は、1本鎖でありかつデオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対形成の法則を介して三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、この法則は、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖にプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが存在することを必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重らせんの3本の会合した鎖にまたがるTATトリプットおよびCGCトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。このピリミジンに富む分子は、その二重鎖のうちの一本の鎖のプリンに富む領域に相補的でありその鎖に平行な方向にある、塩基を提供する。さらに、例えば、G残基のストレッチを含む、プリンに富む核酸分子が、選択され得る。これらの分子は、GC対に富むDNA二重鎖と三重らせんを形成し、このらせん中では、そのプリン残基のうちの大多数は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に位置し、その三重鎖の3本の鎖にまたがるGGCトリプレットを生じる。
【0122】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化され得る潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの相当な大きさの伸長の必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式で合成される。
【0123】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび/または三重螺旋分子は、正常および変異の核ホルモンレセプター遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるmRNAの転写(三重螺旋)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低減あるいは阻止し得る。核ホルモンレセプター遺伝子活性の十分に正常なレベルが維持されることを確証するために、正常な活性を示す核ホルモンレセプター遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性の配列を含まない細胞中へ導入され得る。あるいは、細胞または組織の核ホルモンレセプター遺伝子活性の必要なレベルを維持するために、細胞または組織中に正常な核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましくあり得る。
【0124】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重螺旋分子は、DNAおよびRNA分子の合成に関して当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート(phosphoramidite)化学合成法のような当該分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。あるいはRNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入され得る。あるいは、使用されるプロモーターに依存して、構成的にまたは誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞株中に安定的に導入され得る。
【0125】
DNA分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能性ある修飾としては、分子の5’および/または3’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは2’O−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0126】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異核ホルモンレセプター遺伝子機能を阻害するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自体に対して、またはタンパク質の一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0127】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ抗体全体が使用される例では、抗体を内部移行させることが好ましくあり得る。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、核ホルモンレセプター遺伝子エピトープに結合する抗体またはFab領域のフラグメントを細胞中へ送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または拡大した標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成されるか、あるいは組換えDNA技術により生成され得る(例えば、Creighton,Proteins: Structures and Molecular Principles (1984) W.H. Freeman, New York 1983, 前出;およびSambrookら、1989,前出を参照のこと)。あるいは、細胞内核ホルモンレセプター遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体も投与され得る。このような単鎖抗体は、Marascoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889−93 (1993)に記載されるような技術を使用することにより、例えば、標的細胞集団内で単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することにより投与され得る。
【0128】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質をコードするRNA配列は、疾患症状が改善されるようなレベルの核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質を生産するのに十分な濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与される。患者は遺伝子置換治療法によって治療されてもよい。1つ以上のコピーの正常な核ホルモンレセプター遺伝子、または核ホルモンレセプター遺伝子機能を有する正常な核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入される。これらのベクターとしては、リポソームのような細胞中にDNAを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な核ホルモンレセプター遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【0129】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な核ホルモンレセプター遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者に導入されるかあるいは再導入され得る。
【0130】
(薬学的組成物、有効投薬量、および投与経路)
標的変異遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を処置または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【0131】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、LD50(集団の50%の致死量)およびED50(集団の50%の治療的に有効な用量)を測定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性効果と治療的効果との用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る場合、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へこのような化合物を標的化する送達系を設計することに注意すべきである。
【0132】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないED50を含む循環濃度範囲内にある。この投薬量は使用される投与形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用される任意の化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【0133】
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、1つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。従って、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気(口または鼻のいずれかから)、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方され得る。薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され得、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも意図される。
【0134】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤(例えば、前糊化(pregelatinized)トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコールデンプンナトリウム);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態(例えば錠剤またはカプセル)をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供され得る。このような液体調製物は懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)のような薬学的に受容可能な添加剤を用いる従来の手段によって調製され得る。これらの調製剤はまた、適切な場合、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含む。
【0135】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に処方され得る。
【0136】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の様式で処方された錠剤または菓子錠剤の形態をとり得る。
【0137】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は、適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、計測量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または注入器に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンのような適した粉末基剤との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【0138】
この化合物は、注入(例えば、ボーラス注入(bolus injection)または連続注入)による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、添加された保存剤とともに、単位投薬形態(例えば、アンプル)または複数用量容器で、提供され得る。この組成物は、懸濁液、溶液、または油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の乳化液のような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。あるいは、その活性成分は、使用前に、適切なビヒクル(例えば、滅菌した発熱物質を含まない水)を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【0139】
この化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含む、座剤または停留浣腸などの直腸用組成物として処方され得る。経口摂取は、何らかの薬剤を摂取するためのおそらく最も容易な方法である。このような投与経路は、一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これは、タンパク質および他の生理活性組成物を含む多くの物質には敵である環境である、胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性かつタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口摂取した場合、広範囲に多様な生理活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかまたはいくらかしか胃の通過を生き延びて、小腸で体内に吸収されないことは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤は、非経口法(しばしば皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射による)のような、別の方法で摂取されなければならない。
【0140】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液(例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩)、可溶化剤(例えば、Tween、ポリソルベート)、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤(チメロサール、ベンジルアルコール)、およびアスコルビン酸のような抗酸化剤を含み得る。安定化剤は、Tween−20、Tween−80、NP−40またはTritonX−100のような、界面活性剤であり得る。EBPはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の粒子調製物中に組み込まれ得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な調査は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版、 A.R. Gennaro(編)、 Mack Publishing, Easton, Pa.(1990)に見出される。
【0141】
先に記載した処方物のほかに、この化合物はまた、デポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方物は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射により、投与され得る。従って、例えば、この化合物は、適切な高分子物質もしくは疎水性物質(例えば、受容可能な油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂とともに処方され得るか、または難溶解性誘導体として(例えば、難溶解性塩として)処方され得る。
【0142】
この組成物は、所望であれば、活性成分を含む1つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置中にて与えられてもよい。このパックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔(例えば、ブリスターパック)を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書が添付され得る。
【0143】
(診断薬)
核ホルモンレセプター遺伝子に関連した疾患状態を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的には、試薬が、例えば核ホルモンレセプター遺伝子変異の存在を検出するために、または核ホルモンレセプター遺伝子mRNAの過剰発現(over expression)または過小発現(under expression)のいずれかを検出するために、使用され得る。
【0144】
本発明の診断および予後判定(prognostic)方法によれば、野生型核ホルモンレセプター遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法は、野生型核ホルモンレセプター遺伝子座を検出し、素因または新形成の欠如を確認することによって、実施され得る。「野生型遺伝子の変化」は、コード領域および非コード領域中の欠失、挿入ならびに点変異を含む、すべての形態の変異を包含する。欠失は、遺伝子全体であってもまたは遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は、停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異は、ある組織(例えば腫瘍組織)にだけ生じるものであり、生殖系列において遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され得、遺伝される。ただ1つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかしながら、もしも両方の対立遺伝子が変異されるなら、そのときは、後期新形成状態が示され得る。従って、遺伝子変異の知見は、診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない核ホルモンレセプター遺伝子対立遺伝子(例えば、核ホルモンレセプター遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる)は、挿入、小欠失および点変異のような他の変異についてスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見出される変異は、核ホルモンレセプター遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異もまた、癌状態に関連し得る。点変異事象は、この遺伝子のプロモーター中のような調節領域中で生じ得、そのmRNAの発現の損失または減少をもたらし得る。点変異はまた、適切なRNAプロセッシングを無効とし得、核ホルモンレセプター遺伝子産物の発現の損失をもたらし得るか、あるいはmRNAの安定性または翻訳効率の減少をもたらし得る。
【0145】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な1つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接的に比較することである。あるいは、例えばPCRによる増幅後、メッセンジャーRNAを配列決定し、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要性を排除することができる。核ホルモンレセプター遺伝子のコード領域の外側にある癌患者の変異は、核ホルモンレセプター遺伝子の近くまたはその中の非コード領域(例えば、イントロンおよび調節配列)を調査することにより、検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさまたは多さのメッセンジャーRNA分子を明らかにする、ノーザンブロット実験に由来し得る。
【0146】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの特定の遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を備える、あらかじめパッケージングされた診断キットを使用して、実施され得、このキットは、疾患症状を示すか、あるいは疾患を発症する危険性のある患者を診断するために、例えば、臨床状況において便利に使用され得る。
【0147】
その遺伝子が発現される任意の細胞型または組織(好ましくは、単球、内皮細胞または平滑筋細胞)が、以下に記載される診断において使用され得る。
【0148】
分析される細胞型または組織由来のDNAまたはRNAは、当業者にで周知である手順を使用して、容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片(固定および/または凍結されている)に対して、直接にインサイチュにて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュ手順のためのプローブおよび/またはプライマーとして使用され得る(例えば、Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Raven Press, N.Y. (1992)を参照)。
【0149】
遺伝子ヌクレオチド配列(RNAまたはDNAのいずれか)は、例えば、疾患関連遺伝子の構造および発現を検出するために、生物学的試料のハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。このようなアッセイとしては、サザン分析またはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、一本鎖高次構造多型分析、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子発現パターンの定量的局面、ならびに遺伝子発現および/または遺伝子組成物の定性的局面の両方を明らかにし得る。すなわち、このような局面としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配列、および/または遺伝子発現の活性化もしくは不活化が挙げられ得る。
【0150】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、分析される細胞型または組織に由来する核酸を、1つ以上の標識された核酸試薬と、目的の核酸分子内のその相補的配列にこれらの試薬を特異的アニーリングするために好ましい条件下で、接触させる工程およびインキュベートする工程を包含する。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも9〜30ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールしていない核酸は、核酸:フィンガープリント分子ハイブリッドから除去される。フィンガープリント組織由来のハイブリダイズした核酸の存在が、このような分子が存在する場合に検出される。このような検出スキームを使用して、目的の組織または細胞型由来の核酸は、例えば、膜、またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズのようなプラスチック表面などのような固体支持体に固定され得る。この場合、インキュベーション後、アニールしていない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールされた標識核酸試薬の検出は、当業者に周知である標準的技術を使用して達成される。
【0151】
遺伝子特異的核酸分子の検出に関する代替の診断方法は、その増幅、例えばPCR(Mullis 米国特許第4,683,202号(1987)に記載の実験の実施形態)、リガーゼ連鎖反応(Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189−93(1991))、自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874−78(1990))、転写増幅システム(Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173−77(1989))、Q βレプリカーゼ(Lizardiら、Bio/Technology,6:1197(1988))、または任意の他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知である技術を使用して増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、このような分子が非常に小数で存在する場合に、核酸分子の検出のために特に有用である。
【0152】
このような検出スキームの1つの実施形態では、cDNA分子が目的のRNA分子から(例えば、cDNAへのRNA分子の逆転写によって)得られる。このようなRNAが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および/または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、cDNA内の配列が、PCR増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬(例えば、プライマー)として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出には、核酸増幅が放射性または非放射性標識ヌクレオチドを使用して実施され得る。あるいは、充分に増幅された産物は、この産物が標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【0153】
野生型遺伝子ペプチドまたは変異遺伝子ペプチドに対する抗体はまた、疾患診断薬または予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現のレベルの異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および/または組織、細胞内、または細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に対する、変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられ得る。
【0154】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない、当業者に周知である技術を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、Sambrookら、(1989)前出、18章を参照されたい。本明細書で使用されるタンパク質検出および単離方法はまた、例えばHarlowおよびLane(Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1988))に記載されるものなどであり得る。
【0155】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【0156】
例えば、本発明で有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用される。これは、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出法と組み合わせて蛍光標識抗体(以下を参照)を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に特に好ましい。
【0157】
本発明で有用である抗体(またはそのフラグメント)は、さらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法で組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は患者から組織学的検体を取り出し、その検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成される。抗体(またはフラグメント)は、好ましくは生物学的試料上に標識抗体(またはフラグメント)を上に重ねることにより適用される。このような手順の使用によって、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみならず、試験された組織中のその分布を決定することも可能である。本発明を使用して、このようなインサイチュ検出を達成するために、当業者は、広範囲の組織学的方法(染色)のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。
【0158】
野生型、変異体または広がったフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、新鮮な袖手した細胞、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的試料をインキュベートし、そして当該技術分野で周知である多くの技術のいずれかによって、結合された抗体を検出することを含む。
【0159】
生物学的試料が、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得るニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリア、または他の固体支持体上と接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体を適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理し得る。次いで、固相支持体を2回目の緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去し得る。次いで、固相支持体上の結合標識の量を従来の手段で検出し得る。
【0160】
用語「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合可能ないかなる支持体をも含むこと意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的において、可溶性からある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合された分子が抗原または抗体に結合可能なかぎり、実質的にいかなる可能性のある構造的立体配置を有していてもよい。したがって、支持体の立体配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面のような円筒状、または棒状体の外表面であってもよい。あるいは、その表面はシート、試験片などのように平らであってもよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適したキャリアを知っているか、または、日常の実験を使用することによりこれを確証できるであろう。
【0161】
所定の多数の(a given lot of)抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知方法によって測定され得る。当業者は日常の実験を使用することにより各測定のための操作的および最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【0162】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の1つは、酵素にこの抗体を連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ(EIA)にこれを使用することである(Voller,Ric Clin Lab,8:289−98(1978)[“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”,Diagnostic Horizons 2:1−7,1978,Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.];Vollerら、J.Clin.Pathol.,31: 507−20(1978);Butler,Meth.Enzymol.,73: 482−523(1981);Maggio(編)、Enzyme Immunoassay,CRC Press.Boca Raton,Fla.(1980);Ishikawaら(編)、Enzyme Immunoassay,Igaku−Shoin,Tokyo(1981))。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分を製造するような方法で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する比色定量方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較される基質の酵素反応の程度を可視的に比較して達成され得る。
【0163】
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用により、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または広がったペプチドを検出することができる(例えば、Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986を参照のこと)。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【0164】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に暴露されると、次いで、その存在が蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、蛍光性イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【0165】
抗体はまた、152Euなどの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン−テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【0166】
抗体はまた、化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の進行中に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光性標識合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【0167】
同様に、生物発光性化合物が本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の一種である。生物発光性タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0168】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許出願は、確認する引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する先行技術の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【0169】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、本発明をいずれも限定するように解釈されるべきでない。
【0170】
(実施例)
(実施例1:核ホルモンレセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
核ホルモンレセプターの役割を研究するために、核ホルモンレセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、図2に示されるように、特に配列番号1を含む核ホルモンレセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有する核ホルモンレセプター特異的標的化構築物を、この構築物中に標的化アーム(相同性配列)として使用することによって作製し、このオリゴヌクレオチド配列を、配列番号3または配列番号4として本明細書中で同定した。
【0171】
標的化構築物を、129/Sv−+P+Mgf−SLJ/Jマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と飼育して生成した。F2ホモ接合性変異体マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑して生成した。
【0172】
核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。核レセプター遺伝子における破壊に関連した表現型を、決定した。ホモ接合性マウスは、以下の表現型のうちの少なくとも1つを示した:
脾臓。野生型マウスと比較して、変異マウスにおいて脾臓のサイズの減少および脾臓重量の減少を含む、脾臓における異常。特に、ホモ接合性マウスは、図3および以下の表1に示されるように野生型マウスと比較して、検死において小さな脾臓ならびに脾臓重量の減少および脾臓対体重比の減少を有したことが報告された。
(表1 核ホルモンレセプター(オーファンNHR):mCAR2)
【0173】
【表1】
リンパ球枯渇(脾臓のリンパ鞘の小動脈周囲におけるリンパ球枯渇を含む)もまた、脾臓において検出可能であった。
【0174】
胸腺。野生型マウスと比較して、変異マウスにおいて胸腺のサイズの減少および胸腺重量の減少を含む、胸腺における異常を、検出した。特に、ホモ接合性マウスは、図4および上の表1に示されるように野生型マウスと比較して、検死において小さな胸腺ならびに胸腺重量の減少および胸腺対体重比の減少を有することが報告されたあ。
【0175】
胸腺におけるリンパ球枯渇もまた、検出した。特に、皮質のリンパ球およびHassall小体の数の減少は、その数が減少し、そしてほとんど形成されなかった。胸腺に見られる変化は、胸腺の異常形成および重篤な萎縮と一致した。胸腺の異常形成(T細胞免疫不全と関連する先天性病変)は、変動する程度で以下の特徴からなる:胸腺のサイズの劇的な減少、腺が葉状に見えること、リンパ細胞の枯渇および初期に見られ、そしてHassall小体への適切な分化に失敗した上皮細胞の成熟の欠損。胸腺の異常形成は、腺の発生学的な発生における失敗または抑制を示し得る。胸腺の萎縮性変化は、後天性であり、そしてストレス関連副腎皮質機能亢進、成長ホルモンのレベルの減少および直接的な毒性によって誘導され得る。
【0176】
リンパ節。リンパ節におけるリンパ球枯渇を検出した。リンパ節のサイズの減少およびリンパ球の減少を見出した。GALT(胃腸関連リンパ組織)の不全または欠損も検出された。
【0177】
発現。総RNAを、成体C57B1/6野生型マウ由来の器官または組織から単離した。RNAを、DNaseIで処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたcDNAを、転写されていないゲノムマウスDNAに特異的なプライマーを使用してゲノム夾雑物の非存在をチェックした。cDNAを、HPRTプライマーを使用して濃度について平均化した。RNA転写物は、肝臓、胆嚢、副腎、小腸および盲腸において検出可能であった。
【0178】
(挙動)
挙動研究に関して、ホモ接合性マウスを、以下のように産生した:
上記される標的化構築物を、129/SvEvマウス亜系統から誘導されたES細胞中に導入し、キメラマウスを生成した。F1N0マウスを、雌性C57BL/6と交雑することによって生成した。F2N0ホモ接合性変異体マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。F1N0ヘテロ接合性マウスをC57BL/6マウスと戻し交雑して、F1N1ヘテロ接合性を産生した。F2N1ホモ接合性マウスを、F1N1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって産生した。
【0179】
ホモ接合性マウスは、以下の挙動表現型を示した:
ホモ接合性マウスは、ロータロッド試験において全体的な能力の低下を示した。ロータロッド試験は、マウスにおける協調およびバランスを測定するために設計される。ホモ接合性マウスは、野生型マウスと比較して協調およびバランスの低下を示した。さらに、野生型マウスとは対照的に、変異体マウスは、試験された3回の継続的な試験にわたってロータロッドにおける能力の改善を示さなかった。
【0180】
当業者には明らかなように、上記実施形態の種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。これらの改変および変更は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、オーファン核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2(配列番号1)のポリヌクレオチド配列を示す。図1はまた、核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2(配列番号2)のアミノ酸配列を示す。
【図2A】
図2Aは、核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用した標的化構築物の設計を示す。
【図2B】
図2Bは、核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用した標的化構築物の設計を示す。図2Bは、配列番号3および配列番号4として同定された配列を示し、これらは核ホルモンレセプター標的化構築物中の標的化アーム(相同配列)として使用される。
【図3】
図3は、野生型マウス、ヘテロ接合性のマウスおよびホモ接合性のマウスにおける脾臓重量と体重との比率に関連するグラフを示す。
【図4】
図4は、野生型マウス、ヘテロ接合性のマウスおよびホモ接合性のマウスにおける胸腺重量と体重との比率に関連するグラフを示す。
(発明の分野)
本発明は、遺伝子機能の特徴付けに関連するトランスジェニック動物、組成物、および方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
より高等な生物において、核ホルモンレセプタースーパーファミリーは、ジンクフィンガー転写因子をコードする独特の遺伝子を含み、これらの各々はステロイド、甲状腺ホルモン(T3)またはレチノイン酸(RA)のようなリガンドに結合することによって特異的に活性化される。公知のどのリガンドにも結合せず、応答もしないタンパク質をコードするcDNAの群は、オーファンレセプターとして公知である。これらのオーファンレセプターの機能は不明である。
【0003】
核ホルモンレセプタースーパーファミリーの多くの従来のメンバーおよびオーファンメンバーは、第一のジンクフィンガーの重要な領域において同一かまたは非常に類似したアミノ酸配列を共有する。遺伝的分析およびX線結晶学の両方は、Pボックスと呼ばれるこの領域がDNAと配列特異的に接触することを示す。このPボックスによって規定されるサブグループにおける従来のレセプターとしては、エストロゲン、ビタミンD、T3およびRAに結合するものが挙げられ、そして現在までに同定されたオーファンレセプターのほぼ全てもまた、このクラスに分類される。結合特異性におけるこの重複の結果として、多くのホルモン応答エレメントは1つより多いレセプター型に結合し得る。
【0004】
レチノイン酸応答の構成的アクチベーター(CAR)のレセプターである、このスーパーファミリーのさらなるメンバーは記載されている(例えば、米国特許第5,756,448号を参照のこと)。CARがRA応答性遺伝子の発現を制御する調節的ネットワークにおいて重要な役割を果たし得ることが示唆されている。最近、mCARと呼ばれる新しいマウスオーファンメンバーが同定され、これは以前に同定されたヒトオーファンCAR(hCAR)に対して近縁である(例えば、Choiら、J.Biol.Chem.272(38):23565〜71(1997)を参照のこと)。hCARと同じように、mCARの発現は肝臓において最も高い。mCAR1およびhCARは両方とも、明らかに構成的転写アクチベーターである。この活性は、保存されたC末端AF−2転写活性化モチーフの存在に依存する。それがDNAに結合できないことから予想すると、このmCAR2改変体は、それ自身によるトランス活性化も、hCARまたはmCAR1によるトランス活性化の阻害もまた行わない。
【0005】
核ホルモンレセプターの重要性を考慮すると、機能不全または疾患の予防、改善、または修復において役割を果たし得る核ホルモンレセプターのさらなる特徴付けが明らかに必要とされている。
【0006】
(発明の要旨)
本発明は一般に、遺伝子機能の特徴付けに関連するトランスジェニック動物、ならびに組成物および方法に関連する。
【0007】
本発明は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞から構成される。本発明の細胞は、好ましくは幹細胞であり、そしてより好ましくは胚性幹(ES)細胞であり、そして最も好ましくはマウスのES細胞である。1つの実施形態によると、このトランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入して相同組換えを生じさせ、核ホルモンレセプター遺伝子の変異を生じることによって産生される。別の実施形態において、トランスジェニック細胞は、以下に記載のトランスジェニック動物から誘導される。トランスジェニック動物に由来する細胞としては、単離された細胞か、あるいは組織または器官に存在する細胞、および任意の細胞株または任意のその子孫が挙げられる。
【0008】
本発明はまた、幹細胞に導入された場合に相同組換え体を産生する標的化構築物およびこの標的化構築物を作製する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明の標的化構築物は、核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第一および第二のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、好ましくは、構築物内の2つの異なる相同的ポリヌクレオチド配列間に配置された選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、相同組換えを増強し得る他の調節エレメントを含み得る。
【0009】
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物およびそのような非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子における変異についてヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。1つの局面において、本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子の機能が欠損している。別の局面において、本発明のトランスジェニック動物は、核ホルモンレセプター遺伝子の変異を有することに関連した表現型を含む。好ましい実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、脾臓、胸腺、およびリンパ節の異常を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、正常動物と比較して共調およびバランスの低下を証明する。
【0010】
本発明はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響し得る薬剤を同定する方法を提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物に投与され、そして推定薬剤に対するそのトランスジェニック動物の応答が測定され、そして「正常」または野生型マウスの応答と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール(薬剤投与なし)と比較される。本発明はさらに、このような方法によって同定される薬剤を提供する。本発明はまた、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療的薬剤として有益な薬剤を同定する方法を提供する。
【0011】
本発明はさらに、核ホルモンレセプターの発現または機能に関する有効性を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック動物、好ましくはマウスに対して有効量の薬剤を投与する工程を含む。この方法は、例えば、トランスジェニック動物のその薬剤に対する応答を測定する工程、およびトランスジェニック動物の応答をコントロール動物(例えば、野生型動物、またはトランスジェニック動物コントロールであり得る)と比較する工程を含む。核ホルモンレセプターの発現または機能に関する有効性を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するための細胞ベースのアッセイ(cell−based assays)で細胞に対してスクリーニングされ得る。
【0012】
本発明はまた、核ホルモンレセプター遺伝子の核酸配列を含む細胞株を提供する。このような細胞株は、この細胞株において機能的なプロモーターへと作動可能に連結することによってこのような配列を発現し得る。好ましくは、核ホルモンレセプター遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。核ホルモンレセプター遺伝子配列に相互作用する薬剤を同定する方法もまた、提供され、この方法は、核ホルモンレセプター遺伝子を、薬剤に接触させ、そして薬剤および薬剤/核ホルモンレセプター遺伝子複合体を検出する工程を含む。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能マーカーの発現を測定することによって検出され得る。
【0013】
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊、そしてさらに特に核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能の破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能の破壊に関連した疾患または状態を処置することを含み、これは、核ホルモンレセプターの発現または機能をもたらす治療的薬剤を、必要のある被験体に投与する工程を含む。この実施形態に従って、この方法は、天然、合成、半合成、または組換えの核ホルモンレセプター遺伝子、核ホルモンレセプター遺伝子産物またはそのフラグメント、あるいは天然、合成、半合成または組換えのアナログの治療有効量の投与を含む。
【0014】
本発明は、破壊された標的化遺伝子の発現または機能に関連する疾患または状態を処置する方法をさらに提供し、ここでその方法は、変異した核ホルモンレセプター遺伝子を検出し、そして遺伝子治療によって置き換える工程を含む。
【0015】
(定義)
用語「遺伝子」は、(a)本明細書中に開示のDNA配列の少なくとも1つを含む遺伝子;(b)本明細書中に開示のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のDNA配列および/または;(c)本明細書中に開示のコード配列の相補体にハイブリダイズする任意のDNA配列をいう。好ましくは、この用語はコード領域および非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含め、正常な遺伝子発現に必要な全ての配列を含む。
【0016】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態をいうために交換可能に使用される。このポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはそれらのアナログを含み得る。ヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、かつ公知または公知でない任意の機能を遂行し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖および三本鎖のらせん分子を含む。
【0017】
「オリゴヌクレオチド」は、5ヌクレオチドと約100ヌクレオチドとの間の一本鎖DNAまたは二本鎖DNAのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、または当該分野で公知の方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」は、通常一本鎖の、酵素媒介核酸合成の開始のための3’ヒドロキシル末端を提供するオリゴヌクレオチドをいう。以下はポリヌクレオチドの非制限的な実施形態である:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA,rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子アナログのような修飾された核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンのアナログは当該分野で公知であり、そして以下を含むが、それらに限定されない:アジリジニシトシン(aziridinycytosine)、4−アセチルシトシン、5−フルオロウラシル、6−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルーアミノメチルウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、プソイドウラシル、5−ペンチルニルウラシル(5−pentylnyluracil)および2,6−ジアミノプリン。デオキシリボ核酸中のチミンに代わる置換基としてのウラシルの使用もまた、ピリミジンのアナログ形態と考えられる。
【0018】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも9個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも45個のヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチドである。
【0019】
用語「遺伝子標的化」とは、ゲノムDNAフラグメントが哺乳動物細胞に導入され、そしてそのフラグメントが内在性相同配列の位置に配置されてこの配列と組み換わる場合に生じる、相同組換えの型をいう。
【0020】
用語「相同組換え」とは、相同なヌクレオチド配列の部位における2つのDNA分子間または染色分体間のDNAフラグメントの交換をいう。
【0021】
本明細書中に使用される用語「相同」は、参照配列と比較して少なくとも約70%の配列同一性、代表的には少なくとも約85%の配列同一性、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、およびより好ましくは約98%の配列同一性、ならびに最も好ましくは参照配列と比較して約100%の配列同一性を有するDNA配列の特徴を意味する。相同性は、「BLASTN」アルゴリズムを用いて決定され得る。相同的配列は、ヌクレオチド配列中に挿入、欠失および置換を含み得ることが理解される。従って、ヌクレオチドの直鎖状配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確には対応しなくても、または整列にされなくても、本質的に同一であり得る。この参照配列は、遺伝子配列または隣接配列の一部分、あるいは染色体の反復部分のような、より長い配列の部分集合であり得る。
【0022】
用語「標的遺伝子」(あるいは、「標的遺伝子配列」、「標的DNA配列」または「標的配列」という)は、相同組換えによって改変された任意の遺伝子の任意の核酸分子またはポリヌクレオチドをいう。標的配列としては、インタクトな遺伝子、エキソンまたはイントロン、調節配列あるいは遺伝子間の任意の領域が挙げられる。この標的遺伝子は、個々のゲノムDNA中の特定遺伝子または遺伝子座の一部分を含む。本明細書中に提供されるように、本発明のこの標的遺伝子は、核ホルモンレセプター遺伝子である。「核ホルモンレセプター遺伝子」とは、配列番号1を含む配列またはオーファン核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2をコードする配列(登録番号AF009328;GI番号:2267577としてGenebankで同定された)を含む配列をいう。1つの局面において、核ホルモンレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号1を含むか、または核ホルモンレセプター遺伝子(登録番号AF009328;GI番号:2267577としてGenebankで同定される)を含む。
【0023】
核ホルモンレセプター遺伝子の「破壊」は、ゲノムDNAのフラグメントが内在性相同配列の位置に配列されてこの配列と組み換わる場合に生じる。これらの配列の破壊または改変としては、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、もしくは置換、またはDNA配列の置き換え、あるいはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。挿入としては、動物、植物、原核生物、またはウイルス起源の遺伝子であり得る遺伝子全体の挿入が挙げられる。破壊は、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライシング部位を変更または置き換え得、そしてその産生を部分的または完全に阻害することによって、あるいは正常遺伝子産物の活性を促進することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【0024】
用語「トランスジェニック細胞」は、遺伝子標的化の方法によって破壊されるか、改変されるか、変更されるか、あるいは完全にまたは部分的に置換されている、そのゲノム中に核ホルモンレセプター遺伝子を含む細胞をいう。
【0025】
用語「トランスジェニック動物」は、遺伝子標的化の方法によって破壊された特定の遺伝子をそのゲノム中に含む動物をいう。このトランスジェニック動物としては、ヘテロ接合型動物(すなわち、1つの欠損対立遺伝子および1つの野生型対立遺伝子)およびホモ接合型動物(すなわち、2つの欠損対立遺伝子)の両方が挙げられる。
【0026】
本明細書中に使用される、用語「選択マーカー」または「正の選択マーカー」とは、この遺伝子を保有する細胞のみが特定の条件下で生存および/または増殖することを可能にする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン抵抗性(Neor)遺伝子を発現する植物細胞および動物細胞は、化合物G418に対して抵抗性である。Neor遺伝子マーカーを保有しない細胞は、G418によって殺される。他の正の選択マーカーは、当業者に公知である。
【0027】
「宿主細胞」は、ベクター用または核酸分子および/もしくはタンパク質の取り込み用のレシピエントであり得るかまたはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然変異、偶発的変異または意図的変異に起因して元の親に対して(形態または総DNA相補体において)必ずしも完全に同一ではないかもしれない。宿主細胞は、本発明の構築物をトランスフェクトした細胞を含む。
【0028】
本明細書中に使用の用語「調節する」とは、核ホルモンレセプターの機能、発現、活性、あるいは核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した表現型の阻害、減少、増加または増強をいう。
【0029】
用語「改善する」とは、状態、疾患、障害、あるいは表現型(核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連した異常または症状を含む)の減少、縮小または除去をいう。
【0030】
用語「異常」は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊が関係している、任意の疾患、障害、状態、または表現型(病理学的状態を含む)をいう。
【0031】
(発明の詳細な説明)
本発明は、遺伝子および遺伝子発現産物(主に核ホルモンレセプターに関連するもの)の発現および役割の評価に一部分基づいている。中でも、本発明は、疾患経路の定義ならびに診断的および治療的に有用な標的の同定を可能にする。例えば、疾患状態下で変異されるまたはダウンレギュレートされる遺伝子は、この疾患状態の誘発または悪化に関与し得る。このような遺伝子の活性のアップレギュレートに指向された処置または代替経路を含む処置は、その疾患の状態を改善させ得る。
【0032】
(標的化構築物の産生)
本発明の標的化構築物は、当該分野で公知の標準方法を用いて産生され得る。(例えば、Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York;E.N.Glover(編)、1985、DNA Cloning:A Practical Approach、第I巻および第II巻;M.J.Gait(編)、1984、Oligonucleotide Synthesis;B.D.Hames & S.J.Higgins(編)、1985、Nucleic Acid Hybridization;B.D.Hames & S.J.Higgins(編)、1984、Transcription and Translation;R.I.Freshney(編)、1986、Animal Cell Culture;Immobilized Cells and Enzymes、IRL Press、1986;B.Perbal、1984、A Practical Guide To Molecular Cloning;F.M.Ausubelら、1994、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.を参照のこと)。例えば、標的化構築物は、従来の方法によって調製され得、ここで配列は、合成、天然供給源からの単離、操作、クローニング、連結、インビトロでの変異誘発に供すること、プライマー修復などが行われ得る。種々の段階で、結合された配列は、クローニングされ得、そして制限分析、配列決定などによって分析され得る。
【0033】
標的化DNAは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、標的化DNAは、オリゴヌクレオチドの化学的合成、二本鎖DNAテンプレートのニックトランスレーション、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅(またはリガーゼ連鎖反応増幅)、所定の配列を有する原核生物ベクターまたは標的クローニングベクター(例えば、クローニングされたcDNAまたはゲノムDNA、合成DNA、あるいは前述の任意の組み合わせ(例えば、プラスミド、ファージミド(phagemid)、YAC、コスミド、バクテリオファージDNA、他のウイルスDNAまたは複製中間体))の精製、あるいはその精製された制限フラグメント、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源によって産生され得る。さらに、相同な長さは当該分野で公知の方法を用いて選択され得る。例えば、選択は、規定の内在性標的DNA配列の配列の組成および複雑さに基づき得る。
【0034】
本発明の標的化構築物は、典型的に、核ホルモンレセプター遺伝子の一部分または領域に相同な第一の配列および核ホルモンレセプター遺伝子の第二部分または領域に相同な第二の配列を含む。標的化構築物は、さらに正の選択マーカーを含み、これは、好ましくは標的DNA配列の一部分または領域に対して相同な第一のDNA配列と、標的DNA配列の一部分または領域に対して相同な第二のDNA配列との間に配置される。この正の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。
【0035】
当該分野で公知の他の調節配列は、特異的細胞型において特定遺伝子の発現を破壊するかまたは制御するために標的化構築物中に組み込まれ得る。さらに、標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)または別の改変された蛍光タンパク質をコードする配列も含み得る。
【0036】
相同配列の大きさは重大ではないけれども、わずか50塩基対から100kbほどの長い範囲におよび得、好ましくは各フラグメントは約1kbの長さよりも長く、さらに好ましくは約1kbと約10kbとの間、なおさらに好ましくは約1kbと約5kbとの間であり得る。当業者は、より長いフラグメントは、ES細胞での相同組換え事象数を増加させ得るが、より長いフラグメントはまた、クローニングがより難しいことを認識する。
【0037】
本発明の好ましい実施形態において、この標的化構築物は、1997年11月17日出願の係属中の米国特許第08/971,310号(この開示は本明細書中にその全体が援用される)に記載の方法を用いてプラスミドゲノムライブラリーから直接的に調製される。一般的に、目的の配列は、単一工程(例えば、長範囲PCR)を使用してプラスミドライブラリーから同定され、そして単離される。この配列の単離に続いて、標的配列を破壊する第二のポリヌクレオチドは、目的の配列をコードする2つの領域の間に容易に挿入され得る。この局面に従って、この構築物は以下によって2工程で産生される:(1)標的配列に相同な配列を(例えば、長範囲PCRを用いて)増幅する工程、および(2)別のポリヌクレオチド(例えば、選択マーカー)を、相同配列によって隣接されるようにPCR産物中に挿入する工程。代表的に、このベクターはプラスミドゲノムライブラリーに由来するプラスミドである。この完成された構築物はまた、代表的に環状プラスミドである。
【0038】
別の実施形態において、標的化構築物は、2000年9月15日出願の米国特許出願第60/232,957号(この開示は本明細書中にその全体が援用される)に記載の調節された正の選択方法によって設計される。この標的化構築物は、PGKプロモーター中に配置された2つのlacO部位を有するPGK−neo融合遺伝子、およびSV40 T抗原に由来するNLSをコードする配列に融合されたlacリプレッサーを含むNLS−lacI遺伝子を含むように設計される。
【0039】
別の実施形態において、この標的化構築物は、1つより多くの選択マーカー遺伝子を含み得、これは、単純疱疹ウイルスtk(HSV−tk)遺伝子のような負の選択マーカーを含む。この負の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。(例えば、米国特許第5,464,764号;同第5,487,992号;同第5,627,059号;および同第5,631,153号を参照のこと)。
【0040】
(細胞の生成および相同組換え事象の確認)
一旦、適切な標的化構築物が調製されると、標的化構築物は、当該分野で公知の任意の方法を使って適切な宿主細胞に導入され得る。種々の技術は、本発明において利用され得、例としては、前核マイクロインジェクション;生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入;胚性幹細胞での遺伝子標的化;胚のエレクトロポレーション;精子媒介遺伝子移入;およびリン酸カルシウム/DNA共沈、核内へのDNAマイクロインジェクション、細菌プロトプラストとインタクトな細胞との融合、トランスフェクション、ポリカチオン(例えば、ポリブレン、ポリオルニチン)など(例えば、米国特許第4,873,191号;Van der Puttenら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 82:6148−6152;Thompsonら、1989、Cell 56:313−321;Lo、1983、Mol Cell.Biol.3:1803−1814;Lavitranoら、1989、Cell、57:717−723を参照のこと)が挙げられる。哺乳動物細胞を形質転換させるための種々の技術は、当該分野において公知である(例えば、Gordon、1989、Intl.Rev.Cytol.、115:171−229;Keownら、1989、Methods in Enzymology;Keownら、1990、Methods and Enzymology、第185巻、527−537頁;Mansourら、1988、Nature、336:348−352を参照のこと)。
【0041】
本発明の好ましい局面において、標的化構築物は、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入される。この過程において、高い場の強度の電気インパルスは、生体膜を可逆的に透過可能にして、構築物の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に作られた小孔はDNAのような高分子の取り込みを許す。(例えば、Potter、H.ら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7161−7165を参照のこと)。
【0042】
相同組換え能力のある任意の細胞型は、本発明の実行において使用され得る。このような標的細胞の例として、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、ネズミ種、サル種のような哺乳動物を含む脊椎動物から誘導される細胞および糸状菌のようないずれかの真核生物、ならびに植物のような高等多細胞生物が挙げられる。
【0043】
好ましい細胞型は、典型的にインビトロで培養された着床前の胚から得られる胚性幹(ES)細胞が含まれる(例えば、Evans、M.J.ら、1981、Nature 292:154−156;Bradley、M.O.ら、1984、Nature 309:255−258;Gosslerら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065−9069;およびRobertsonら、1986、Nature 322:445−448を参照のこと)。このES細胞は、当業者に周知の方法を用いて標的化構築物の導入のために培養され、そして調製される。(例えば、Robertson、E.J.編「Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells、a Practical Approach」、IRL Press、Washington D.C.、1987;Bradleyら、1986、Current Topics in Devel.Biol.20:357−371;Hoganら「Manipulating the Mouse Embryo」:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor N.Y.、1986;Thomasら、1987、Cell 51:503;Kollerら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:10730;Dorinら、1992、Transgenic Res.1:101;およびVeisら、1993、Cell 75:229を参照のこと)。この標的化構築物を導入されるES細胞は、それらが導入される発生中の胚と同種の胚または胚盤胞から誘導される。ES細胞は、発生の胚盤胞段階の胚において哺乳動物に導入される場合に、典型的にそれらの内部細胞塊中へと統合する能力および個々の生殖系列に寄与する能力に関して選択される。従って、この能力を有する任意のES細胞株は、本発明の実行における使用に適切である。
【0044】
本発明はまた、幹細胞のような他の細胞型において遺伝子をノックアウトするために使用され得る。例として、幹細胞は、骨髄、リンパ、または神経の前駆体(progenitor)細胞または前駆(precursor)細胞であり得る。遺伝子の破壊またはノックアウトを含む細胞は、個々の発生経路における核ホルモンレセプター遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの任意のの脊椎動物種から誘導され得る。
【0045】
その標的化構築物が細胞中に導入された後、この遺伝子標的化が成功した細胞が同定される。この標的とされる遺伝子中に標的化構築物を挿入することは、典型的にマーカー遺伝子の発現に関して細胞を同定することによって検出される。好ましい実施形態において、この本発明の標的化構築物で形質転換された細胞は、選択マーカーを発現していない細胞を除去するように選択する適切な薬剤を用いた処置に供される。この選択マーカー遺伝子を発現している細胞のみが、特定条件下で生存および/または増殖する。例えば、導入されたネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、化合物G418に対して耐性であり、一方neo遺伝子マーカーを発現しない細胞はG418によって殺される。この標的化構築物がまたGFPのようなスクリーニングマーカーを含む場合、相同組換えは蛍光下での細胞コロニーのスクリーニングによって同定され得る。相同組換えを受けた細胞は、GFP遺伝子を欠損しており、そして蛍光を発しない。
【0046】
調節された正の選択方法が相同組換え事象の同定に使用される場合、その標的化構築物は、発現が無作為組み込みの後に抑制されるが、相同組換えの後に可能になる(抑制解除される)様式で選択マーカー遺伝子の発現が調節されるように設計される。より詳細には、トランスフェクトされた細胞は、neo遺伝子の発現に関してスクリーニングされ、これは(1)この細胞がうまくエレクトロポレーションされ、そして(2)neo転写のlacリプレッサー阻害が相同組換えによって解除されることを必要とする。この方法は、トランスフェクトされた細胞および相同組換え体の同定が、単一薬物の添加をともなう一工程において生じることを可能にする。
【0047】
あるいは、正の−負の選択技術は、相同組換え体を選択するために使用され得る。この技術は、トランスフェクトされた細胞の増殖に関して選択する(すなわち、正の選択)ために第一の薬物(例えば、ネオマイシン様薬物)がその細胞集団に与えられるプロセスを含む。FIAUのような第二の薬物は、負の選択マーカーを発現する細胞を殺傷させる(すなわち、負の選択)ために続いて与えられる。負の選択マーカーを含みそして発現する細胞は、選択薬剤によって殺傷され、一方、この負の選択マーカーを含まずそして発現しない細胞は、生存する。例えば、この構築物の非相同的な挿入を有する細胞は、HSVチミジンキナーゼを発現し、そしてそれゆえ、ガンシクロビル(gancyclovir)(GANC)またはFIAU(1−(2−デオキシ2−フルオロ−B−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードウラシル)(1−(2−deoxy 2−fluoro−B−D−arabinofluranosyl)−5−iodouracil)のようなヘルペス薬物に対して感受性である。(例えば、Mansourら、Nature 336:348−352:(1988);Capecchi、Science 244:1288−1292、(1989);Capecchi、Trends in Genet.5:70−76(1989)を参照のこと)。
【0048】
成功した組換えは、相同組換えを確認するために、その選択された細胞のDNAを分析することによって同定され得る。PCRおよび/またはサザン分析のような当該分野で公知の種々の技術は、相同組換え事象を確認するために使用され得る。
【0049】
相同組換えはまた、幹細胞および全能性胚性幹細胞ではない他の細胞型において遺伝子を破壊するために使用され得る。例として、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経の前駆体(progenitor)細胞および前駆(precursor)細胞であり得る。このようなトランスジェニック細胞は、個々の発生経路における核ホルモンレセプター遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの任意の脊椎動物種から誘導され得る。
【0050】
全能性でない細胞において、当該分野で公知の方法を用いて標的の両方のコピーをノックアウトすることが所望され得る。例えば、正の選択マーカー(Neor)の発現に関して選択され、そして非無作為組み込みに関してスクリーニングされた標的遺伝子座に相同組換えを含む細胞は、上昇したレベルの選択的薬剤(例えば、G418)への曝露によって、複数コピーの選択マーカー遺伝子に関してさらに選択され得る。次いで、この細胞は標的遺伝子座でホモ接合性に関して分析される。あるいは、第二の構築物は、2つの相同配列間に挿入された異なる正の選択マーカーを用いて産生され得る。この2つの構築物は、正のマーカー遺伝子のそれぞれに適切な選択に従って、連続的かまたは同時的かのいずれかでその細胞に導入され得る。最終的な細胞は、標的の両対立遺伝子の相同組換えに関してスクリーニングされる。
【0051】
(トランスジェニック動物の産生)
選択された細胞は、次いで、動物(例えば、マウス)の胚盤胞(または例えば、桑実胚のような生存可能な動物を作成する目的に適した発生の他の段階)に、キメラを形成するために注入される(例えば、Bradley、A.、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、E.J.Robertson、編、IRL、Oxford、113−152頁(1987)を参照のこと)。あるいは、選択されたES細胞は、凝集キメラを形成するために解離されたマウス胚性細胞と凝集され得る。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠した雌性里親動物中に移植され得、そして胚は出産され得る。それらの生殖細胞に相同的に組換えられたDNAを有するキメラ後代は、動物の全ての細胞に相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させるために用いられ得る。1つの実施形態において、キメラ後代マウスは、核ホルモンレセプター遺伝子がヘテロ接合性に破壊をされたマウスを作製するために使用される。次いで、ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスを、交尾させ得る。典型的に、このような交尾の子孫の1/4が、核ホルモンレセプター遺伝子がヘテロ接合性に破壊されていることは、当該分野において周知である。
【0052】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性のトランスジェニックマウスは、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊が表現型の変化、特に病理学的変化を引き起こすかどうかを決定するために、正常な野生型マウスと比較され得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスは、理学的検査、剖検、組織像、臨床化学、全血球算定、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価によって表現型変化について評価され得る。
【0053】
1つの実施形態において、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関連する表現型(または表現型の変化)は、データベースに入れられるか、または蓄えられる。好ましくは、このデータベースは、(i)遺伝子型データ(例えば、破壊された遺伝子の同定)および(ii)遺伝子型データに関連する表現型データ(例えば、遺伝子破壊から生じる表現型)を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは好ましくは、このデータベースが検索可能であるように探索ツールと組み合わされる。
【0054】
(条件的トランスジェニック動物)
本発明はさらに、組換え方法を用いて産生された条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物などの条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物を意図する。酵母プラスミドに由来するバクテリオファージP1 Creリコンビナーゼおよびflpリコンビナーゼは、部位特異的なDNAリコンビナーゼ酵素の2つの非制限的な例であり、これらの酵素は、特異的標的部位(creリコンビナーゼではlox P部位、そしてflpリコンビナーゼではfrt部位)でDNAを切断し、そして第二の切断部位へのこのDNAの連結を触媒する。多数の適切な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、それらの遺伝子は、本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのIntリコンビナーゼ(Xisを有するかまたは有さない)(Weisberg、R.ら、Lambda II、(Hendrix、R.ら、編)、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、211−50頁(1983)(本明細書中に参考として援用される));TpnIおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン(Mercierら、J.Bacteriol.、172:3745−57(1990));Tn3レソルバーゼ(Flanagan & Fennewald、J.Molec.Biol.、206:295−304(1989);Starkら、Cell、58:779−90(1989));酵母リコンビナーゼ(Matsuzakiら、J.Bacteriol.、172:610−18(1990));B.subtilis SpoIVCリコンビナーゼ(Satoら、J.Bacteriol.172:1092−98(1990));Flpリコンビナーゼ(Schwartz & Sadowski、J.Molec.Biol.、205:647−658(1989);Parsonsら、J.Biol.Chem.、265:4527−33(1990);Golic & Lindquist、Cell、59:499−509(1989);Aminら、J.Molec.Biol.、214:55−72(1990));Hinリコンビナーゼ(Glasgowら、J.Biol.Chem.、264:10072−82(1989));免疫グロブリンリコンビナーゼ(Malynnら、Cell、54:453−460(1988));およびCinリコンビナーゼ(Haffter & Bickle、EMBO J.、7:3991−3996(1988);Hubnerら、J.Molec.Biol.、205:493−500(1989))(全ては参考として本明細書中に援用される)が挙げられる。このようなシステムは、:Echols(J.Biol.Chem.265:14697−14700(1990));de Villartay(Nature、335:170−74(1988));Craig、(Ann.Rev.Genet.、22:77−105(1988));Poyart−Salmeronら、(EMBO J.8:2425−33(1989));Hunger−Bertlingら、(Mol Cell.Biochem.、92:107−16(1990));およびCregg & Madden(Mol.Gen.Genet.、219:320−23(1989))(全ては参考として本明細書中に援用される)によって議論されている。
【0055】
Creは、均質になるまで精製され、そしてloxP部位との反応は、広く特徴付けられている(Abremski & Hess J.Mol.Biol.259:1509−14(1984)、参考として本明細書中に援用される)。Creタンパク質は、35,000の分子量を有し、そしてNew England Nuclear/DuPontから商業的に入手可能である。このcre遺伝子(Creタンパク質をコードする)はクローン化され、そして発現されている(Abremskiら、Cell 32:1301−11(1983)、参考として本明細書中に援用される)。このCreタンパク質は、同じDNA分子または異なるDNA分子に存在し得る2つのloxP配列間の組換えを仲介する(Sternbergら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.45:297−309(1981))。loxP部位の内部スペーサー配列は非対称性であるので、2つのloxP部位は互いに対して方向性を呈し得る(Hoess & Abremski、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1026−29(1984))。従って、同じDNA分子上の2つの部位が、直接的に繰り返された方向にある場合、Creはその部位間のDNAを切り出す(Abremskiら、Cell 32:1301−11(1983))。しかしながら、この部位が互いに関して反転している場合、それらの間のDNAは組換え後に切り出されるのではなく、単に反転される。したがって、直接方向に2つのloxP部位を有する環状DNA分子が組換えられて、2つのより小さな環を生産する。これに対して、反転した方向に2つのloxP部位を有する環状分子は、loxP部位が隣接するDNA配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のDNA分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【0056】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルにおいて遺伝子機能を特徴付けるために重要な適用を有する。本明細書中に記載される構築物が核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用される場合、正の選択マーカーの挿入が核ホルモンレセプター遺伝子の翻訳開始部位の下流(3’)に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うあるレベルのタンパク質発現を生じ得る。正の選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化に関連しているか、またはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているかを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。正の選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、正の選択マーカーが除去される。このようにして、正の選択マーカーまたは融合転写物の発現により生じる影響は避けられる。
【0057】
1つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は、直接マイクロインジェクションによって細胞へもたらされる。別の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態のさらなる局面は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ媒介組換えを実行するための1つの方法は、誘導性または組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントを使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用を含む。誘導性発現エレメントは好ましくは、所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または誘導性活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用することができるさらなる制御エレメントとしては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを組み込んだベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【0058】
(疾患のモデル)
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ(micro−pig)、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。このようなアッセイは、例えば、疾患症状を回復させることが可能である化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に曝露され得る。これは、曝露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。曝露された後、細胞は1つ以上の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に曝露され得る。これは、曝露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。曝露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転(reversal)を評価してモニターされ得る。曝露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を曝露することを含み得る。新生児、若年および成体の動物もまた曝露され得る。
【0059】
より具体的には、本発明の動物モデル(具体的には、トランスジェニックマウス)を使用して、薬剤(化合物を含む)を同定する方法が、好ましくは、核ホルモンレセプター遺伝子中の破壊に関連する少なくとも1つの表現型に影響を与える能力に基づいて提供される。1つの実施形態では、本発明は、核ホルモンレセプター遺伝子の発現または機能に影響を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、薬剤に対する動物の生理学的応答を測定する工程、およびコントロール動物に対してそのような動物の生理学的応答を比較する工程を包含し、ここで、コントロール動物と比較した、核ホルモンレセプター中に破壊を含む動物の生理学的応答が、この薬剤の特異性を示す。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ(例えば、遺伝子転写、タンパク質産生および分解速度)、物理的パラメーター(例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、PTT.T、またはTT)および細胞アッセイ(例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力)が使用され得る。
【0060】
本発明のトランスジェニック動物および細胞は、核ホルモンレセプター遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。1つの局面において、核ホルモンレセプターをコードする遺伝子中の破壊に関連する表現型は、以下に示される実施例に記載されるように、脾臓、胸腺、およびリンパ節中で見出される。
【0061】
本発明は、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【0062】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム(例えば、「分散分析」またはANOVAなど)を使用して実施され得る。約0.05以下の「p」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いp値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物(またはその群)の挙動と野生型マウス(またはその群)の挙動との間での比較を、典型的にはある定められた条件下にて行う。本明細書中に使用されるように、「異常な行動」とは、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を有しない動物(例えば野生型マウス)と異なる、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を有する動物(例えばトランスジェニック動物)によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定(または観察)および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る(例えば、CrawleyおよびPaylor,Hormones and Behavior 31:197−211(1997)を参照のこと)。
【0064】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを曝露することを含む。動物の社会的挙動(例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾)が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る(例えば、S.E.Fileら,Pharmacol.Bioch.Behav.22:941−944(1985);R.R.Holson,Phys.Behav.37:239−247(1986)参照)。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【0065】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚(通常、聴覚性)刺激に曝露し、動物の驚愕反応を測定することを含む(例えば、M.A.Geyerら,Brain Res.Bull.25:485−498(1990);PaylorおよびCrawley,Psychopharmacology 132:169−180(1997)参照)。(正常な驚愕反応からの)抑制パーセントが、驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える(cueing)」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた、使用され得る。
【0066】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への曝露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、G.J.Kantら、Pharm.Bioch.Behav.20:793−797(1984);N.J.Leidenheimerら、Pharmacol.Bioch.Behav.30:351−355(1988)参照)。
【0067】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ/または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である(例えば、M.Bertolucci D’Angicら、Neurochem.55:1208−1214(1990)参照)。
【0068】
新規の試験は、通常、新規な環境および/または新規な対象への曝露を含む。新規な環境および/または新規な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される(例えば、D.K.Reinsteinら、Pharm.Bioch.Behav.17:193−202(1982);B.Poucet,Behav.Neurosci.103:1009−10016(1989);R.R.Holsonら、Phys.Behav.37:231−238(1986)を参照のこと)。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【0069】
学習された無力(helplessness)試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への曝露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る(例えば、A.Leshnerら、Behav.Neural Biol.26:497−501(1979)参照)。
【0070】
あるいは、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると考えられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると考えられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先だってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させることが研究によって示されている。
【0071】
モーリス水迷路試験(Morris water−maze test)は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、E.M.Spruijtら、Brain Res.527:192−197(1990)を参照のこと)。
【0072】
あるいは、Y字型迷路が使用され得る(例えば、McFarland,D.J.,Pharmacology,Biochemistry and Behavior 32:723−726(1989);Dellu,F.ら、Neurobiology of Learning and Memory 73:31−48(2000)を参照のこと)。Y迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Y迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約40cm×8cm×20cmであり得る。各アームもまた、例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた16のフォトビームを有することができる。少なくとも2種の異なった試験がこのようなY迷路を使用して実施され得る。連続Y迷路パラダイムでは、マウスに例えば約10分間、Y迷路の3つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は動物が2回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的(egocentrically)に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。2つの試験的Y迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新規性および空間記憶に対する反応を測定する。第1の試験(取得)中、動物は、例えば約15分間、自由にY迷路の2つのアームを訪問し得る。第3のアームはこの試験中、遮蔽されている。第2の試験(回復)は例えば約2時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約5分間、3つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の3つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの間の区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり(cue)に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を媒介するその遺伝子の役割を示し得る。
【0073】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には2つ以上の環境への曝露を含み、そのうちの1つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む(例えば、R.Aderら、Psychon.Sci.26:125−128(1972);R.R.Holson,Phys.Behav.37:221−230(1986)参照)。あるいは、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、2つの開放および2つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約5分間、探索させる。このパラダイムは、ゲッ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安のレベルを測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【0074】
食物回避試験は、新しい食物への曝露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、B.A.Campbellら、J.Comp.Physiol.Psychol.67:15−22(1969)を参照のこと)。
【0075】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に曝露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、H.A.Baldwinら、Brain Res.Bull,20:603−606(1988)参照)。
【0076】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤(例えば、アンフェタミン、コカイン、PCPなど)の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.B.S.Clarkeら、Psychopharmacology 96:511−520(1988);P.Kuczenskiら、J.Neuroscience 11:2703−2712(1991)を参照のこと)。
【0077】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および/または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される(例えば、S.Nassifら、Brain Res.,332:247−257(1985);W.L.Isaacら、Behav.Neurosci.103:345−355(1989)参照)。
【0078】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、L.E.Jarrardら、Exp.Brain Res.61:519−530(1986)参照)。
【0079】
DRL(低反応率差次的強化(differential reinforcement to low rates of responding))実施試験は間欠的報酬パラダイムに曝露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、J.D.Sindenら、Behav.Neurosci.100:320−329(1986);V.Nalwaら、Behav.Brain Res.17:73−76(1985);およびA.J.Nonnemanら、J.Comp.Physiol.Psych.95:588−602(1981)を参照のこと)。
【0080】
空間学習試験は、複雑で新規の環境に曝露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、N.Pitsikasら、Pharm.Bioch.Behav.38:931−934(1991);B.Poucetら,Brain Res.37:269−280(1990);D.Christieら,Brain Res.37:263−268(1990);およびF.Van Haarenら、Behav.Neurosci.102:481−488(1988)を参照のこと)。あるいは、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド(of)試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な(すなわち心配性でない)マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【0081】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に曝露し、例えば環境に適応する(orientating)反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む(例えば、J.M.Vargoら、Exp.Neurol.102:199−209(1988)を参照のこと)。
【0082】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される(例えば、P.J.Fletcherら、Psychopharmacol.102:301−308(1990);M.G.Cordaら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80:2072−2076(1983)参照)。
【0083】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。1つまたは2つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約5〜10分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間(対象物への接近、すなわち、例えば約3〜5cm以内での動きが対象物の探索とみなされる)が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新規な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新規な対象物を探索することに費やす時間の割合(再び、約5〜10分間の時間をかけて)が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新規な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物(好ましくは単純なブロック)がスプレーされるか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ;新規な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新規恐怖症(neophobia)を示す。
【0084】
熱板痛覚脱失試験(hot plate analgesia test)は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約55℃の熱板上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間(例えば、後足を持ち上げて後足をなめる時間)が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【0085】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調およびバランスを測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル(または回転丸太)のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約60rpmの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低20分間あけて少なくとも3回、試験される。もっとも長くロッド上に留まることができるマウスはより良好な協調およびバランスを有すると考えられる。
【0086】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール5mg/ml溶液は、例えば、約0.375ml/分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。4つの区別される生理学的段階が記録され得る:注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展(tonic extension)」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【0087】
(核ホルモンレセプター遺伝子産物)
本発明はさらに、核ホルモンレセプター遺伝子産物を産生するための核ホルモンレセプター遺伝子配列の使用を意図する。核ホルモンレセプター遺伝子産物としては、機能的に等価な遺伝子産物を示すタンパク質が挙げられ得る。このような等価な遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これらは、サイレント(silent)な変化を生じ、従って、機能的に等価な核ホルモンレセプター遺伝子産物を産生する。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、変化、可溶性、疎水性、親水性、および両親媒性の性質に基づいてなされ得る。
【0088】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ;極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ;ならびに、負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「機能的に等価な」とは、本明細書中に使用される場合、核ホルモンレセプター遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に類似のインビボ活性を示し得るタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価な」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分と実質的に類似の様式で、他の細胞分子または細胞外分子と相互作用し得るペプチドを言及し得る。
【0089】
本発明の方法に従う有用な他のタンパク質産物は、組換え手段または合成手段によって産生された核ホルモンレセプター遺伝子から誘導されるかまたはこれらに基づく、ペプチド(誘導ペプチド)である。
【0090】
核ホルモンレセプター遺伝子産物は、当該分野で周知の技術を用いて組換えDNA技術によって産生され得る。従って、遺伝子配列をコードする核酸を発現させることによって本発明の遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製するための方法が、本明細書中に開示される。当業者に周知の方法を使用して、遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組み換えが挙げられる(例えば、Sambrookら、1989(前出)、ならびにAusubelら、1989(前出)を参照のこと)。あるいは、遺伝子タンパク質配列をコードし得るRNAが、例えば、自動化合成機を使用して、化学合成され得る(例えば、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Gait,M.J.ら編、IRL Press,Oxford(1984)を参照のこと)。
【0091】
種々の宿主発現ベクター系を使用して、本発明の遺伝子コード配列を発現させ得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、そして実質的に精製され得るビヒクルだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、インサイチュで本発明の遺伝子タンパク質を示す細胞を呈する。これらとしては、遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミド発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、B.subtilis);遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia);遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)感染された植物細胞系、または遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS細胞系、CHO細胞系、BHK細胞系、293細胞系、3T3細胞系)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0092】
細菌系において、多くの発現ベクターが、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望まれ得る。このようなベクターとしては、E.coli発現ベクターpUR278(このベクターにおいて、この遺伝子のタンパク質コード配列は、融合タンパク質が生産されるように、lacZコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結され得る)(Rutherら、EMBO J.、2:1791−94(1983));pINベクター(Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.、13:3101−09(1985);Van Heekeら、J.Biol.Chem.、264:5503−9(1989))などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。pGEXベクターは、トロンビンプロテアーゼ切断部位またはXa因子プロテアーゼ切断部位を含み、クローン化された核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質がGST部分から放出され得るように、設計され得る。
【0093】
好ましい実施形態では、完全長のcDNA配列が、標準的PCR方法論(Innisら(編)、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press、San Diego (1990))を使用して、アミノ末端でインフレームBamHI部位に、そしてカルボキシ末端でインフレームEcoRI部位に付加され、pGEX−2TKベクター(Pharmacia、Uppsala、Sweden)中に連結される。得られたcDNA構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンS−トランスフェラーゼ配列を含む(Nilssonら、EMBO J.、4:1075−80(1985);Zabeauら、EMBO J.、1:1217−24(1982))。
【0094】
昆虫系では、Autographa californica核多角体ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローン化され得、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置され得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活化および非閉鎖性(non−occluded)組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性夾膜(proteiaceous coat)を欠くウイルス)の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞を感染させるために使用され、この細胞において、挿入された遺伝子が発現される(例えば、Smithら、J.Virol.46:584−93(1983);米国特許第4,745,051号参照)。
【0095】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列)に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1領域またはE3領域)への挿入は、生存可能でありかつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質発現が可能な、組換えウイルスを生じる(例えば、Loganら、Proc.Natl.Acd.Sci.USA、81:3655−59(1984)を参照のこと)。特定の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合が、あり得る。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが、提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームと位相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源(天然および合成の両方)由来であり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る(Bitterら、Methods in Enzymol.、153:516−44(1987)を参照のこと)。
【0096】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする、宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が、操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択マーカーで、形質転換され得る。外来DNAの導入後に、操作された細胞は、富化培地中で1〜2日間増殖させられ得、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与えそしてプラスミドを染色体中に安定して組み込みかつ増殖する細胞にフォーカスを形成させ、次いでこれはクローン化され得、細胞株に拡大し得る。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【0098】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および/または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネイン応答性プロモーター、エクジソン応答性プロモーターおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:3346−51(1996);Furthら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:9302−6(1994))。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス(特にHIV)プロモーターなどの特定転写因子を必要とするプロモーターが、挙げられる。1つの実施形態では、Tet誘導性遺伝子発現系が使用される(Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547−51(1992);Gossenら、Science、268:1766−69 (1995))。Tet発現系は、E.coli Tn10トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の2つの調節エレメント(テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)、およびTetRが結合するテトラサイクリンオペレーター配列(tetO))に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はtetOオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同時トランスフェクトされたTetRの存在下で、組換えタンパク質の発現は、tetO調節エレメントへのTetRタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルで調節された遺伝子発現は、TetRへの結合についてtetOエレメントと競合する、種々の濃度のテトラサイクリン(Tc)またはドキシサイクリン(Dox)などのTc誘導体に応答して、誘導され得る。tet誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、CLONTECH Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA.から市販されている。
【0099】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は、直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。125Iなどの放射性同位元素;基質に曝されたときに検出可能な発色性シグナルまたは光を発生する酵素標識系;および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えDNA技術が、このようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定および/または検出を容易し得る融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【0100】
間接的標識は、遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質(標識抗体など)の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
(抗体の生成)
1つ以上のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が、本明細書に記載される。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の核ホルモンレセプター遺伝子の検出に、あるいは、異常な核ホルモンレセプター遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は、疾患治療方法の一部として使用され得、そして/または診断技術の一部として使用され得、それにより、患者は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【0102】
抗体の生産のために、種々の宿主動物が、核ホルモンレセプター遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより、免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントが、宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、このようなアジュバントとして、フロイント(完全または不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル(mineral gel)、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント(BCG(bacille Calmette−Guerin)および(Corynebacterium parvum)など)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0103】
ポリクローナル抗体は、抗原(例えば、核ホルモンレセプター遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体)で免疫された動物の血清由来抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物が、これもまた上記したようなアジュバントを補充された、遺伝子産物を注射することにより、免疫化され得る。
【0104】
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術によって、得られ得る。これらとしては、KoehlerおよびMilstein、Nature、256:495−7(1975);および米国特許第4,376,110号のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today、4:72(1983);Coteら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:2026−30(1983))およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Anitbodies And Cancer Therapy、Alan R. Liss,Inc.New York、77−96頁(1985))が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびこれらの任意サブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のmAbを生成するハイブリドーマは、インビトロでもまたはインビボでも培養され得る。インビボでの高力価のmAbの生産が、これを現時点での好ましい生産方法とする。
【0105】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術(Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855(1984);Takedaら、Nature、314:452−54(1985))が、使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子(例えば、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子)である。
【0106】
あるいは、単鎖抗体の生産について記載される技術(米国特許第4,946,778号;Bird、Science 242:423−26(1988);Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879−83(1988);およびWardら、Nature、334:544−46(1989))が、遺伝子−単鎖抗体を生成するために適合され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結することによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。
【0107】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るFabフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、所望な特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするために、Fab発現ライブラリーが構築され得る(Huse, et al., Science, 246: 1275−81 (1989))。
【0108】
(スクリーニング方法)
本発明には、薬剤(例えば、アゴニスト(すなわち、核ホルモンレセプターポリペプチドに結合しかつ活性化する薬剤)またはアンタゴニスト(すなわち、核ホルモンレセプターポリペプチドの活性および核ホルモンレセプターポリペプチドとそのリガンドとの相互作用を阻害する薬剤))についてスクリーニングするためのプロセスにおいて、使用され得る。従って、本発明のポリペプチドはまた、例えば、当該分野で公知の、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー、および天然産物混合物において、低分子物質とリガンドとの結合を評価するために使用され得る。レセプターを調節し得る薬剤を同定しそしてスクリーニングするために慣用的に使用され得る任意の方法が、本発明に従って使用され得る。
【0109】
本発明は、核ホルモンレセプターの発現または機能を調節する薬剤を同定するための方法およびそのような薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。より詳細には、核ホルモンレセプター遺伝子配列を含みかつ発現する細胞が、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、U937(ATCC番号CRL−1593)、THP−1(ATCC番号TIB−202)、およびP388D1(ATCC番号TIB−63)などの非組換え単球細胞株;HUVECおよびウシ大動脈内皮細胞(BAEC)などの内皮細胞;ならびにHeLa細胞およびCOS細胞(例えば、COS−7(ATCC番号CRL−1651))などの一般的な哺乳動物細胞系が、挙げられ得る。さらに、このような細胞としては、組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のトランスジェニックマウスは、疾患に関与する1以上の細胞型を含む細胞株を生成するために、使用され得、このマウスは、その障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物が使用され得るが、連続的な細胞株の生成が、好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Smallら、Mol Cell Biol.、5:642−48(1985)を参照のこと。
【0110】
核ホルモンレセプター遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。核ホルモンレセプター遺伝子配列を過剰発現するために、核ホルモンレセプター遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験をなすことなく利用され得る。核ホルモンレセプター遺伝子配列はまた、破壊され得るかあるいは過小発現され得る。核ホルモンレセプター遺伝子破壊を有する細胞または過小発現された核ホルモンレセプター遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に起因する機能のすべての欠失をも補償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために、使用される。
【0111】
核ホルモンレセプター遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するためのインビトロ系が、設計され得る。このような化合物としては、D−配置アミノ酸および/またはL−配置アミノ酸から作られたペプチド(例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態;例えば、Lamら、Nature、354:82−4(1991)を参照のこと)、ホスホペプチド(例えば、ランダムであるかまたは部分的に縮重した、指向性ホスホペプチドライブラリーの形態;例えば、Songyangら、Cell、72:767−78 (1993)を参照のこと)、抗体、および有機低分子または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質、好ましくは変異体核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の活性を調節することにおいてか;核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成することにおいてか;または正常な核ホルモンレセプター遺伝子相互作用を破壊する化合物、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて、有用であり得る。
【0112】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパクと試験化合物との反応混合物を、その2つの化合物が相互作用および結合することを可能にするに十分な条件および時間で調製し、それによりその反応混合物から取り除かれ得、そして/または検出され得る、複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは、種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う1つの方法は、固相上に核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質または試験物質を固着する工程、および固相上に固着させた標的タンパク質/試験物質複合体を反応の終わりに検出する工程を包含する。このような方法の1つの実施形態では、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質は、固体表面上に固着され得、そして固着されていない試験化合物が、直接的または間接的いずれかで標識され得る。
【0113】
実際には、マイクロタイタープレートが、好都合に使用される。固着された成分は、非共有結合または共有結合によって固定され得る。非共有結合は、単にそのタンパク質溶液で固体表面を被覆し乾燥することによって、達成され得る。あるいは、タンパク質に特異的な固定抗体(好ましくはモノクローナル抗体)は、固体表面にそのタンパク質を固着するために使用され得る。その表面は、予め調製され保存されていてもよい。
【0114】
このアッセイを実施するために、固定されていなかった成分が、固着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定されたまま残るような条件下で(例えば、水洗により)除去される。固体表面上に固着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。以前に固定されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。以前に固定されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が、例えば、以前に固定されていない成分に特異的な標識抗体(その抗体は、次に、直接標識される得か、または標識抗Ig抗体で間接的に標識され得る)を使用して、表面上に固着された複合体を検出するために、使用され得る。
【0115】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物が、未反応成分から分離され得、複合体が、例えば、核ホルモンレセプター遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定抗体を使用して溶液中に形成されるすべての複合体を固着し、そして生じ得る複合体のもう一方の成分に特異的な抗体を使用して固着された複合体を検出することによって、検出される。
【0116】
上記された方法の1つによって特定の核ホルモンレセプター遺伝子産物に結合することが示される化合物は、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力についてさらに試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび/またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【0117】
(アンチセンス、リボザイム、および抗体)
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、核ホルモンレセプター遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異体核ホルモンレセプター遺伝子活性を低下または阻害する薬剤が、疾患症状を軽減するために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【0118】
アンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズしそしてタンパク質翻訳を阻害することにより、mRNAの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスDNAに関して、翻訳開始部位(例えば、目的の核ホルモンレセプター遺伝子ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間)に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが、好ましい。
【0119】
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することが可能な、酵素的RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断を含む。リボザイム分子の組成は、核ホルモンレセプター遺伝子mRNAに対して相補的な1つ以上の配列を含まなければならず、そしてmRNA切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列について、米国特許第5,093,246号(その全体が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。従って、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒する、操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内にある。
【0120】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、以下の配列GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位のための、目的の分子をスキャニングすることにより、同定される。一旦、同定されると、この切断部位を含む核ホルモンレセプター遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る推定構造的特徴(二次構造など)について評価され得る。候補配列の適合性もまた、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのその接近可能性を試験することにより、評価され得る。
【0121】
転写の阻害のための三重らせん形成に使用される核酸分子は、1本鎖でありかつデオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対形成の法則を介して三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、この法則は、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖にプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが存在することを必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重らせんの3本の会合した鎖にまたがるTATトリプットおよびCGCトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。このピリミジンに富む分子は、その二重鎖のうちの一本の鎖のプリンに富む領域に相補的でありその鎖に平行な方向にある、塩基を提供する。さらに、例えば、G残基のストレッチを含む、プリンに富む核酸分子が、選択され得る。これらの分子は、GC対に富むDNA二重鎖と三重らせんを形成し、このらせん中では、そのプリン残基のうちの大多数は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に位置し、その三重鎖の3本の鎖にまたがるGGCトリプレットを生じる。
【0122】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化され得る潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの相当な大きさの伸長の必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式で合成される。
【0123】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび/または三重螺旋分子は、正常および変異の核ホルモンレセプター遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるmRNAの転写(三重螺旋)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低減あるいは阻止し得る。核ホルモンレセプター遺伝子活性の十分に正常なレベルが維持されることを確証するために、正常な活性を示す核ホルモンレセプター遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性の配列を含まない細胞中へ導入され得る。あるいは、細胞または組織の核ホルモンレセプター遺伝子活性の必要なレベルを維持するために、細胞または組織中に正常な核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましくあり得る。
【0124】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重螺旋分子は、DNAおよびRNA分子の合成に関して当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート(phosphoramidite)化学合成法のような当該分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。あるいはRNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入され得る。あるいは、使用されるプロモーターに依存して、構成的にまたは誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞株中に安定的に導入され得る。
【0125】
DNA分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能性ある修飾としては、分子の5’および/または3’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは2’O−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0126】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異核ホルモンレセプター遺伝子機能を阻害するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自体に対して、またはタンパク質の一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0127】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ抗体全体が使用される例では、抗体を内部移行させることが好ましくあり得る。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、核ホルモンレセプター遺伝子エピトープに結合する抗体またはFab領域のフラグメントを細胞中へ送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または拡大した標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成されるか、あるいは組換えDNA技術により生成され得る(例えば、Creighton,Proteins: Structures and Molecular Principles (1984) W.H. Freeman, New York 1983, 前出;およびSambrookら、1989,前出を参照のこと)。あるいは、細胞内核ホルモンレセプター遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体も投与され得る。このような単鎖抗体は、Marascoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889−93 (1993)に記載されるような技術を使用することにより、例えば、標的細胞集団内で単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することにより投与され得る。
【0128】
核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質をコードするRNA配列は、疾患症状が改善されるようなレベルの核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質を生産するのに十分な濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与される。患者は遺伝子置換治療法によって治療されてもよい。1つ以上のコピーの正常な核ホルモンレセプター遺伝子、または核ホルモンレセプター遺伝子機能を有する正常な核ホルモンレセプター遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入される。これらのベクターとしては、リポソームのような細胞中にDNAを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な核ホルモンレセプター遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【0129】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な核ホルモンレセプター遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者に導入されるかあるいは再導入され得る。
【0130】
(薬学的組成物、有効投薬量、および投与経路)
標的変異遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を処置または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【0131】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、LD50(集団の50%の致死量)およびED50(集団の50%の治療的に有効な用量)を測定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性効果と治療的効果との用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る場合、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へこのような化合物を標的化する送達系を設計することに注意すべきである。
【0132】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないED50を含む循環濃度範囲内にある。この投薬量は使用される投与形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用される任意の化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【0133】
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、1つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。従って、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気(口または鼻のいずれかから)、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方され得る。薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され得、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも意図される。
【0134】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤(例えば、前糊化(pregelatinized)トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコールデンプンナトリウム);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態(例えば錠剤またはカプセル)をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供され得る。このような液体調製物は懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)のような薬学的に受容可能な添加剤を用いる従来の手段によって調製され得る。これらの調製剤はまた、適切な場合、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含む。
【0135】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に処方され得る。
【0136】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の様式で処方された錠剤または菓子錠剤の形態をとり得る。
【0137】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は、適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、計測量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または注入器に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンのような適した粉末基剤との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【0138】
この化合物は、注入(例えば、ボーラス注入(bolus injection)または連続注入)による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、添加された保存剤とともに、単位投薬形態(例えば、アンプル)または複数用量容器で、提供され得る。この組成物は、懸濁液、溶液、または油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の乳化液のような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。あるいは、その活性成分は、使用前に、適切なビヒクル(例えば、滅菌した発熱物質を含まない水)を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【0139】
この化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含む、座剤または停留浣腸などの直腸用組成物として処方され得る。経口摂取は、何らかの薬剤を摂取するためのおそらく最も容易な方法である。このような投与経路は、一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これは、タンパク質および他の生理活性組成物を含む多くの物質には敵である環境である、胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性かつタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口摂取した場合、広範囲に多様な生理活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかまたはいくらかしか胃の通過を生き延びて、小腸で体内に吸収されないことは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤は、非経口法(しばしば皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射による)のような、別の方法で摂取されなければならない。
【0140】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液(例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩)、可溶化剤(例えば、Tween、ポリソルベート)、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤(チメロサール、ベンジルアルコール)、およびアスコルビン酸のような抗酸化剤を含み得る。安定化剤は、Tween−20、Tween−80、NP−40またはTritonX−100のような、界面活性剤であり得る。EBPはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の粒子調製物中に組み込まれ得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な調査は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版、 A.R. Gennaro(編)、 Mack Publishing, Easton, Pa.(1990)に見出される。
【0141】
先に記載した処方物のほかに、この化合物はまた、デポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方物は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射により、投与され得る。従って、例えば、この化合物は、適切な高分子物質もしくは疎水性物質(例えば、受容可能な油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂とともに処方され得るか、または難溶解性誘導体として(例えば、難溶解性塩として)処方され得る。
【0142】
この組成物は、所望であれば、活性成分を含む1つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置中にて与えられてもよい。このパックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔(例えば、ブリスターパック)を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書が添付され得る。
【0143】
(診断薬)
核ホルモンレセプター遺伝子に関連した疾患状態を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的には、試薬が、例えば核ホルモンレセプター遺伝子変異の存在を検出するために、または核ホルモンレセプター遺伝子mRNAの過剰発現(over expression)または過小発現(under expression)のいずれかを検出するために、使用され得る。
【0144】
本発明の診断および予後判定(prognostic)方法によれば、野生型核ホルモンレセプター遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法は、野生型核ホルモンレセプター遺伝子座を検出し、素因または新形成の欠如を確認することによって、実施され得る。「野生型遺伝子の変化」は、コード領域および非コード領域中の欠失、挿入ならびに点変異を含む、すべての形態の変異を包含する。欠失は、遺伝子全体であってもまたは遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は、停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異は、ある組織(例えば腫瘍組織)にだけ生じるものであり、生殖系列において遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され得、遺伝される。ただ1つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかしながら、もしも両方の対立遺伝子が変異されるなら、そのときは、後期新形成状態が示され得る。従って、遺伝子変異の知見は、診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない核ホルモンレセプター遺伝子対立遺伝子(例えば、核ホルモンレセプター遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる)は、挿入、小欠失および点変異のような他の変異についてスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見出される変異は、核ホルモンレセプター遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異もまた、癌状態に関連し得る。点変異事象は、この遺伝子のプロモーター中のような調節領域中で生じ得、そのmRNAの発現の損失または減少をもたらし得る。点変異はまた、適切なRNAプロセッシングを無効とし得、核ホルモンレセプター遺伝子産物の発現の損失をもたらし得るか、あるいはmRNAの安定性または翻訳効率の減少をもたらし得る。
【0145】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な1つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接的に比較することである。あるいは、例えばPCRによる増幅後、メッセンジャーRNAを配列決定し、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要性を排除することができる。核ホルモンレセプター遺伝子のコード領域の外側にある癌患者の変異は、核ホルモンレセプター遺伝子の近くまたはその中の非コード領域(例えば、イントロンおよび調節配列)を調査することにより、検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさまたは多さのメッセンジャーRNA分子を明らかにする、ノーザンブロット実験に由来し得る。
【0146】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも1つの特定の遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を備える、あらかじめパッケージングされた診断キットを使用して、実施され得、このキットは、疾患症状を示すか、あるいは疾患を発症する危険性のある患者を診断するために、例えば、臨床状況において便利に使用され得る。
【0147】
その遺伝子が発現される任意の細胞型または組織(好ましくは、単球、内皮細胞または平滑筋細胞)が、以下に記載される診断において使用され得る。
【0148】
分析される細胞型または組織由来のDNAまたはRNAは、当業者にで周知である手順を使用して、容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片(固定および/または凍結されている)に対して、直接にインサイチュにて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュ手順のためのプローブおよび/またはプライマーとして使用され得る(例えば、Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Raven Press, N.Y. (1992)を参照)。
【0149】
遺伝子ヌクレオチド配列(RNAまたはDNAのいずれか)は、例えば、疾患関連遺伝子の構造および発現を検出するために、生物学的試料のハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。このようなアッセイとしては、サザン分析またはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、一本鎖高次構造多型分析、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子発現パターンの定量的局面、ならびに遺伝子発現および/または遺伝子組成物の定性的局面の両方を明らかにし得る。すなわち、このような局面としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配列、および/または遺伝子発現の活性化もしくは不活化が挙げられ得る。
【0150】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、分析される細胞型または組織に由来する核酸を、1つ以上の標識された核酸試薬と、目的の核酸分子内のその相補的配列にこれらの試薬を特異的アニーリングするために好ましい条件下で、接触させる工程およびインキュベートする工程を包含する。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも9〜30ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールしていない核酸は、核酸:フィンガープリント分子ハイブリッドから除去される。フィンガープリント組織由来のハイブリダイズした核酸の存在が、このような分子が存在する場合に検出される。このような検出スキームを使用して、目的の組織または細胞型由来の核酸は、例えば、膜、またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズのようなプラスチック表面などのような固体支持体に固定され得る。この場合、インキュベーション後、アニールしていない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールされた標識核酸試薬の検出は、当業者に周知である標準的技術を使用して達成される。
【0151】
遺伝子特異的核酸分子の検出に関する代替の診断方法は、その増幅、例えばPCR(Mullis 米国特許第4,683,202号(1987)に記載の実験の実施形態)、リガーゼ連鎖反応(Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189−93(1991))、自己配列複製(self sustained sequence replication)(Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874−78(1990))、転写増幅システム(Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173−77(1989))、Q βレプリカーゼ(Lizardiら、Bio/Technology,6:1197(1988))、または任意の他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知である技術を使用して増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、このような分子が非常に小数で存在する場合に、核酸分子の検出のために特に有用である。
【0152】
このような検出スキームの1つの実施形態では、cDNA分子が目的のRNA分子から(例えば、cDNAへのRNA分子の逆転写によって)得られる。このようなRNAが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および/または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、cDNA内の配列が、PCR増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬(例えば、プライマー)として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出には、核酸増幅が放射性または非放射性標識ヌクレオチドを使用して実施され得る。あるいは、充分に増幅された産物は、この産物が標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【0153】
野生型遺伝子ペプチドまたは変異遺伝子ペプチドに対する抗体はまた、疾患診断薬または予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現のレベルの異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および/または組織、細胞内、または細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に対する、変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられ得る。
【0154】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない、当業者に周知である技術を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、Sambrookら、(1989)前出、18章を参照されたい。本明細書で使用されるタンパク質検出および単離方法はまた、例えばHarlowおよびLane(Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1988))に記載されるものなどであり得る。
【0155】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【0156】
例えば、本発明で有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用される。これは、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出法と組み合わせて蛍光標識抗体(以下を参照)を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に特に好ましい。
【0157】
本発明で有用である抗体(またはそのフラグメント)は、さらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法で組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は患者から組織学的検体を取り出し、その検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成される。抗体(またはフラグメント)は、好ましくは生物学的試料上に標識抗体(またはフラグメント)を上に重ねることにより適用される。このような手順の使用によって、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみならず、試験された組織中のその分布を決定することも可能である。本発明を使用して、このようなインサイチュ検出を達成するために、当業者は、広範囲の組織学的方法(染色)のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。
【0158】
野生型、変異体または広がったフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、新鮮な袖手した細胞、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的試料をインキュベートし、そして当該技術分野で周知である多くの技術のいずれかによって、結合された抗体を検出することを含む。
【0159】
生物学的試料が、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得るニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリア、または他の固体支持体上と接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体を適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理し得る。次いで、固相支持体を2回目の緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去し得る。次いで、固相支持体上の結合標識の量を従来の手段で検出し得る。
【0160】
用語「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合可能ないかなる支持体をも含むこと意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的において、可溶性からある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合された分子が抗原または抗体に結合可能なかぎり、実質的にいかなる可能性のある構造的立体配置を有していてもよい。したがって、支持体の立体配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面のような円筒状、または棒状体の外表面であってもよい。あるいは、その表面はシート、試験片などのように平らであってもよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適したキャリアを知っているか、または、日常の実験を使用することによりこれを確証できるであろう。
【0161】
所定の多数の(a given lot of)抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知方法によって測定され得る。当業者は日常の実験を使用することにより各測定のための操作的および最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【0162】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の1つは、酵素にこの抗体を連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ(EIA)にこれを使用することである(Voller,Ric Clin Lab,8:289−98(1978)[“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”,Diagnostic Horizons 2:1−7,1978,Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.];Vollerら、J.Clin.Pathol.,31: 507−20(1978);Butler,Meth.Enzymol.,73: 482−523(1981);Maggio(編)、Enzyme Immunoassay,CRC Press.Boca Raton,Fla.(1980);Ishikawaら(編)、Enzyme Immunoassay,Igaku−Shoin,Tokyo(1981))。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分を製造するような方法で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する比色定量方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較される基質の酵素反応の程度を可視的に比較して達成され得る。
【0163】
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用により、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または広がったペプチドを検出することができる(例えば、Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986を参照のこと)。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【0164】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に暴露されると、次いで、その存在が蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、蛍光性イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【0165】
抗体はまた、152Euなどの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン−テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【0166】
抗体はまた、化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の進行中に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光性標識合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【0167】
同様に、生物発光性化合物が本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の一種である。生物発光性タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0168】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許出願は、確認する引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する先行技術の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【0169】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、本発明をいずれも限定するように解釈されるべきでない。
【0170】
(実施例)
(実施例1:核ホルモンレセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析)
核ホルモンレセプターの役割を研究するために、核ホルモンレセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、図2に示されるように、特に配列番号1を含む核ホルモンレセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有する核ホルモンレセプター特異的標的化構築物を、この構築物中に標的化アーム(相同性配列)として使用することによって作製し、このオリゴヌクレオチド配列を、配列番号3または配列番号4として本明細書中で同定した。
【0171】
標的化構築物を、129/Sv−+P+Mgf−SLJ/Jマウス亜系統から誘導されたES細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。F1マウスを、雌C57BL/6と飼育して生成した。F2ホモ接合性変異体マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑して生成した。
【0172】
核ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。核レセプター遺伝子における破壊に関連した表現型を、決定した。ホモ接合性マウスは、以下の表現型のうちの少なくとも1つを示した:
脾臓。野生型マウスと比較して、変異マウスにおいて脾臓のサイズの減少および脾臓重量の減少を含む、脾臓における異常。特に、ホモ接合性マウスは、図3および以下の表1に示されるように野生型マウスと比較して、検死において小さな脾臓ならびに脾臓重量の減少および脾臓対体重比の減少を有したことが報告された。
(表1 核ホルモンレセプター(オーファンNHR):mCAR2)
【0173】
【表1】
リンパ球枯渇(脾臓のリンパ鞘の小動脈周囲におけるリンパ球枯渇を含む)もまた、脾臓において検出可能であった。
【0174】
胸腺。野生型マウスと比較して、変異マウスにおいて胸腺のサイズの減少および胸腺重量の減少を含む、胸腺における異常を、検出した。特に、ホモ接合性マウスは、図4および上の表1に示されるように野生型マウスと比較して、検死において小さな胸腺ならびに胸腺重量の減少および胸腺対体重比の減少を有することが報告されたあ。
【0175】
胸腺におけるリンパ球枯渇もまた、検出した。特に、皮質のリンパ球およびHassall小体の数の減少は、その数が減少し、そしてほとんど形成されなかった。胸腺に見られる変化は、胸腺の異常形成および重篤な萎縮と一致した。胸腺の異常形成(T細胞免疫不全と関連する先天性病変)は、変動する程度で以下の特徴からなる:胸腺のサイズの劇的な減少、腺が葉状に見えること、リンパ細胞の枯渇および初期に見られ、そしてHassall小体への適切な分化に失敗した上皮細胞の成熟の欠損。胸腺の異常形成は、腺の発生学的な発生における失敗または抑制を示し得る。胸腺の萎縮性変化は、後天性であり、そしてストレス関連副腎皮質機能亢進、成長ホルモンのレベルの減少および直接的な毒性によって誘導され得る。
【0176】
リンパ節。リンパ節におけるリンパ球枯渇を検出した。リンパ節のサイズの減少およびリンパ球の減少を見出した。GALT(胃腸関連リンパ組織)の不全または欠損も検出された。
【0177】
発現。総RNAを、成体C57B1/6野生型マウ由来の器官または組織から単離した。RNAを、DNaseIで処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたcDNAを、転写されていないゲノムマウスDNAに特異的なプライマーを使用してゲノム夾雑物の非存在をチェックした。cDNAを、HPRTプライマーを使用して濃度について平均化した。RNA転写物は、肝臓、胆嚢、副腎、小腸および盲腸において検出可能であった。
【0178】
(挙動)
挙動研究に関して、ホモ接合性マウスを、以下のように産生した:
上記される標的化構築物を、129/SvEvマウス亜系統から誘導されたES細胞中に導入し、キメラマウスを生成した。F1N0マウスを、雌性C57BL/6と交雑することによって生成した。F2N0ホモ接合性変異体マウスを、F1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。F1N0ヘテロ接合性マウスをC57BL/6マウスと戻し交雑して、F1N1ヘテロ接合性を産生した。F2N1ホモ接合性マウスを、F1N1ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって産生した。
【0179】
ホモ接合性マウスは、以下の挙動表現型を示した:
ホモ接合性マウスは、ロータロッド試験において全体的な能力の低下を示した。ロータロッド試験は、マウスにおける協調およびバランスを測定するために設計される。ホモ接合性マウスは、野生型マウスと比較して協調およびバランスの低下を示した。さらに、野生型マウスとは対照的に、変異体マウスは、試験された3回の継続的な試験にわたってロータロッドにおける能力の改善を示さなかった。
【0180】
当業者には明らかなように、上記実施形態の種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。これらの改変および変更は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、オーファン核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2(配列番号1)のポリヌクレオチド配列を示す。図1はまた、核ホルモンレセプターアイソフォームmCAR2(配列番号2)のアミノ酸配列を示す。
【図2A】
図2Aは、核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用した標的化構築物の設計を示す。
【図2B】
図2Bは、核ホルモンレセプター遺伝子を破壊するために使用した標的化構築物の設計を示す。図2Bは、配列番号3および配列番号4として同定された配列を示し、これらは核ホルモンレセプター標的化構築物中の標的化アーム(相同配列)として使用される。
【図3】
図3は、野生型マウス、ヘテロ接合性のマウスおよびホモ接合性のマウスにおける脾臓重量と体重との比率に関連するグラフを示す。
【図4】
図4は、野生型マウス、ヘテロ接合性のマウスおよびホモ接合性のマウスにおける胸腺重量と体重との比率に関連するグラフを示す。
Claims (38)
- 標的化構築物であって、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド配列;
(b)該核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第二のポリヌクレオチド配列;および
(c)選択マーカー、
を包む、標的化構築物。 - スクリーニングマーカーをさらに含む、請求項1に記載の標的化構築物。
- 標的化構築物を生成する方法であって、該方法は以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド配列を提供する工程;
(b)該核ホルモンレセプター遺伝子に相同な第二のポリヌクレオチド配列を提供する工程;
(c)選択マーカーを提供する工程;および
(d)ベクターに該第一の配列、該第二の配列および該選択マーカーを挿入して、該標的化構築物を生成する工程、
を包含する、方法。 - 標的化構築物を生成する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子の第一の領域に相同な第一の配列および核ホルモンレセプター遺伝子の第二の領域に相同な第二の配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程;
(b)該第一の配列と該第二の配列との間に陽性選択マーカーを挿入して、該標的化構築物を形成する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む、細胞。
- 前記細胞が、マウス細胞である、請求項5に記載の細胞。
- 前記マウス細胞が、胚性幹細胞である、請求項6に記載の細胞。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、細胞。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、以下:
(a)請求項1に記載の標的化構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスは、キメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプターの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する工程;および
(c)該非ヒトトランスジェニック動物における該核ホルモンレセプターの発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプターの機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する工程;および
(c)該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された核ホルモンレセプター遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプターの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と薬剤とを接触させる工程;および
(c)該核ホルモンレセプターの発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプター遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と薬剤とを接触させる工程;および
(c)該核ホルモンレセプター遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞が、請求項8に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、請求項13または請求項14に記載の方法。
- 請求項11、請求項12、請求項13、または請求項14に記載の方法によって同定される、薬剤。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、少なくとも1つの以下の表現型:脾臓の異常、胸腺の異常またはリンパ節における異常、を示す、トランスジェニックマウス。
- 前記脾臓の異常が、野生型マウスと比較した脾臓重量の減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記脾臓の異常が、野生型マウスと比較した脾臓サイズの減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記脾臓の異常が、野生型マウスと比較した、体重に対する脾臓の比の減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前期脾臓が、リンパ涸渇を含む、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記リンパ涸渇が、小動脈周辺のリンパ鞘中に見出される、請求項21に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した胸腺サイズの減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した胸腺重量の減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した、体重に対する胸腺の比の減少である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前期脾臓が、リンパ涸渇を含む、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記胸腺の異常が、胸腺形成異常症と一致する、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記胸腺の異常が、胸腺萎縮症と一致する、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記リンパ節の異常が、リンパ涸渇である、請求項17に記載のトランスジェニックマウス。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスは、少なくとも1つの以下の表現型:脾臓の異常、胸腺の異常またはリンパ節における異常、を示し、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子標的化構築物を細胞に導入する工程;
(b)該細胞を胚盤胞に導入する工程;
(c)得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程;および
(d)該キメラマウスを飼育して、核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。 - 請求項17または請求項30に記載のトランスジェニックマウスに由来する、細胞。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程;および
(b)該薬剤が、少なくとも1つの以下の表現型:脾臓の異常、胸腺の異常またはリンパ節における異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプターの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程;および
(b)該薬剤が該トランスジェニックマウスにおける核ホルモンレセプターの発現を調節するか否かを決定する工程であって、該薬剤が、少なくとも1つの以下の挙動:脾臓の異常、胸腺の異常またはリンパ節における異常、に対して影響を有する、工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプター遺伝子中の破壊に関連する挙動を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程;および
(b)該薬剤が、トランスジェニックマウスの協調およびバランスを調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 核ホルモンレセプター遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程;
(b)該細胞と薬剤とを接触させる工程;および
(c)該薬剤が、核ホルモンレセプター遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、該薬剤が、核ホルモンレセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程
を包含する、方法。 - 前記表現型が、少なくとも1つの以下:脾臓の異常、胸腺の異常またはリンパ節における異常、を含む、請求項35に記載の方法。
- 請求項32、請求項33、請求項34または請求項35に記載の方法によって同定される、薬剤。
- 核ホルモンレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスは、野生型のマウスと比較して、低下した協調およびバランスを示す、トランスジェニックマウス。
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