JP2004500007A - Stabilizing mutant of subtilisin inhibitor of Streptomyces - Google Patents

Abstract

The present invention relates to mutants of Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) and inhibitors having homology with SSI. Such variants are useful with enzymes, particularly proteases, in cleaning and personal care compositions. The variant includes an amino acid substitution at position 63 corresponding to SSI. Such variants provide greater proteolytic stability in cleaning and personal care compositions. The present invention also relates to cleaning and personal care compositions comprising the variants of the present invention, as well as the genes encoding the variants.

Description

【００１９】
定義
本明細書中で用いる場合、「突然変異」という用語は、遺伝子配列及びそれらの遺伝子配列により生成されるアミノ酸配列における変化を指す。突然変異は、野生型又は親配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換又は付加であり得る。
【００２０】
「親」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＳＳＩに対応する位置６３でのアミノ酸置換を有さないプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、タンパク質又はペプチド、野生型又は変異体を指す（即ち、位置６３でのアミノ酸置換は天然に生じる）。これらの親の一例は、ストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）として既知のインヒビターである（配列番号１で表される）。ＳＳＩはさらに、Ｉｋｅｎａｋａ等（「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｕｌｕｓ Ｓ−３２５３」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ７６， ｐｐ． １１９１−１２０９（１９７４））により記載されている。本明細書中で用いる場合、ＳＳＩのアミノ酸番号は、Ｉｋｅｎａｋａ等のものである。本発明者等は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡと同様に、アデニン及びチミンが多くなるよう設計された合成ＳＳＩ遺伝子も用いる。この合成遺伝子は、発現プラスミド構築法により、ペプチドのアミノ末端の４つの余分のアミノ酸残基をコードする。この改変アミノ酸配列は、これら４つの付加的アミノ酸を含めて、配列番号２で表される。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「野生型」という用語は、非突然変異化生物体により生成されるタンパク質又はペプチド、本明細書中では特に、プロテアーゼ又はプロテアーゼインヒビターを指す。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「変異体」という用語は、それぞれ親プロテアーゼインヒビター又はプロテアーゼのものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド、本明細書中では特に、プロテアーゼインヒビター又はプロテアーゼを意味する。
【００２３】
本発明の変異体
本発明者等は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、そしてクリーニング及びパーソナルケア組成物物質の存在下で、より安定であるプロテアーゼインヒビターの変異体を発見した。さらに、このような変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏでも同様により安定であり、したがって生物体からのプロテアーゼ収量を増大し得る。
【００２４】
本発明者等は、増殖、収穫、精製、貯蔵中、及びクリーニング工程中に、プロテアーゼの適切な阻害を提供する好ましい結合定数（Ｋ_ｉ）を示す変異体も発見した。このような好ましい結合は、より良好な安定性及びより長い保存寿命を提供する。
【００２５】
本発明の変異体は、プロテアーゼに対する改良された安定性を有し、クリーニング又はパーソナルケア組成物中のプロテアーゼを阻害するが、しかしクリーニング環境中での稀釈時に解離する。
【００２６】
本発明の変異体は、親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有し、この場合、改変アミノ酸配列がストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（本明細書中ではＳＳＩと呼ぶ）に対応する位置６３でのアミノ酸置換を包含し、親アミノ酸配列がＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体から選択される。ＳＳＩに対応する位置６３での置換は、親アミノ酸配列に対して安定性増大を付与する如何なるアミノ酸残基によるものでもあり得る。最も好ましくは、ＳＳＩに対応する位置６３での置換は、イソロイシンによるものである。このような変異体は、「Ｌ６３Ｉ」として表され得る。この変異体を説明する場合、最初に親アミノ酸配列中に生じる元のアミノ酸が、２番目に位置番号が、３番目に置換アミノ酸が示される。したがって、Ｌ６３Ｉは、元のインヒビターＳＳＩ中の６３番目のアミノ酸位置（位置６３）として出現したロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）と代替することを意味する。位置番号はＩｋｅｎａｋａ等（上記）に対応しており（配列番号１）、合成ＳＳＩ（配列番号２）のアミノ末端に存在する４つの付加的アミノ酸残基は無視する。本明細書中に列挙した他の置換に関するこのような表現は、一定の様式で示されている。
【００２７】
変異体は、本明細書中では、位置６３で置換されるＳＳＩに限定されない。むしろ、位置６３での置換は、親アミノ酸配列（もちろん、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む）においてもなされ得、この場合、親は、それ自体、ＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター又はＳＳＩ様インヒビターの変異体である。より好ましい親アミノ酸配列としては、ＳＳＩ及びＳＳＩの変異体が挙げられる。最も好ましい親アミノ酸配列は、ＳＳＩの変異体である。ＳＳＩの変異体は、例えば、Ｋｏｊｉｍａ 等、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ｂｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ Ｐ１ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １０９， ｐｐ．３７７−３８２（１９９１）； Ｔａｍｕｒａ 等、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ， Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ８６ Ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ３０， ｐｐ．５２７５−５２８６（１９９１）； ＪＯ３０９９−０９９−Ａ（Ｔｓｕｍｕｒａ ＆ Ｃｏ．に譲渡。１９８９年９月１２日公開）；米国特許第５，６７４，８３３号（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ等、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９７年１０月７日発行）；及びＷＯ９３／１７０８６（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、 Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９３年９月２日公開）に開示されている。ＳＳＩのその他の変異体は、米国特許出願第６０／０２６，９４４号（Ｃｏｒｒｅａ等。ＷＯ９８／１３３８７に対応。Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏ．に譲渡。１９９８年４月２日公開）に開示されていて、このような変異体は、本明細書中では、「Ａ群インヒビター」として集合的に記載される。ＳＳＩの好ましい変異体（本明細書中で親アミノ酸配列として用いるために）は、Ａ群インヒビターである。本明細書中で親アミノ酸配列として有用であるさらに好ましい変異体を、以下の表２〜６に列挙する。ここでも、位置番号全ては、Ｉｋｅｎａｋａ等が説明したのと同様に、ＳＳＩに対応する。
【００２８】
【表２】

【００２９】
【表３】

【００３０】
【表４】

【００３１】
【表５】

【００３２】
【表６】

【００３３】
したがって、本発明の変異体の例は、変異体１、変異体２等として記載され得るが、これらに限定されない。この場合、例えば、変異体１はＬ６３^＊＋Ｄ８３Ｃとして表され、「^＊」はＳＳＩにおける６３に対応する位置に本来生じるもの以外の任意のアミノ酸を表し、そして、変異体１−ＩはＬ６３Ｉ＋Ｄ８３Ｃとして表され得る。したがって、本発明の好ましい変異体を、以下の表７に列挙する。表７に列挙した変異体の中のより好ましいものは、位置６３で置換するイソロイシンを有するものである。
【００３４】
【表７】

【００３５】
【表８】

【００３６】
その他の好ましい親アミノ酸配列には、本明細書中では、ＳＳＩに対応する位置６２に置換を包含するものが含まれる。位置６２での置換は、親において天然に生じているもの以外のアミノ酸残基のいずれでもあり得る（ＳＳＩの場合、天然アミノ酸残基はアラニンである）。好ましくは、位置６２での置換アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＴｒｐ、さらに好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ、さらに好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、さらに好ましくはＬｙｓ及びＡｒｇから選択され、最も好ましくは、Ｌｙｓである。好ましい親アミノ酸配列は、本明細書中では、表２〜６に列挙した置換に加えて、位置６２での置換を有する。このような親の例は、親Ｘ−Ａ６２^＊として設計され、この場合、「Ｘ」は、表２〜６に例示した親に対応する。したがって、親６−Ａ６２^＊は、Ａ６２^＊＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。同様に、親６−Ａ６２Ｋは、Ａ６２Ｋ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。同様に、本発明の例示的な変異体は、変異体６−Ｉ−Ａ６２^＊であり、これはＡ６２^＊＋Ｌ６３Ｉ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。したがって、変異体６−Ｉ−Ａ６２Ｋは、Ａ６２Ｋ＋Ｌ６３Ｉ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。この方式で、表８は、本発明のその他の好ましい変異体を列挙する。
【００３７】
【表９】

【００３８】
【表１０】

【００３９】
【表１１】

【００４０】
【表１２】

【００４１】
本発明に有用なその他の好ましい親アミノ酸配列（ＳＳＩの変異体である）には、ＳＳＩに対応する位置９８で単一置換を有するもの、ならびに位置６２で１つと位置９８で１つの２つの置換を有するものが含まれる。表９は、この種類の好ましい親アミノ酸配列を列挙する。
【００４２】
【表１３】

【００４３】
本発明の変異体の対応例を、以下の表１０に列挙する。
【００４４】
【表１４】

【００４５】
ＳＳＩは、二量体形態で存在し得る。したがって、理論に縛られずに考えると、二量体ＳＳＩの安定化は過剰プロテアーゼに対するプロテアーゼ耐性の増大をもたらす。好ましくは、この安定化二量体ＳＳＩ変異体は、一緒に共有結合した２つのＳＳＩ変異体モノマーからなる。これは、エステル、アミド、ジスルフィド又はその他の結合により、一般にアミノ酸及びそれらの側鎖に生じる場合がある。したがって、「共有二量体化」及び「共有安定化」とは、二量体を形成するこのような共有結合モノマーを指す。好ましくは、この二量体化は、ジスルフィド結合を介して起こる。本発明の変異体は、分子内力であろうと又は分子間力によろうと、二量体形態で存在するものを含むよう意図される。
【００４６】
ここで有用な他の親アミノ酸配列には、ＳＳＩ様インヒビター（しばしばＳＳＩ様（ＳＩＬ）タンパク質と呼ばれる）及びＳＳＩ様インヒビターの変異体が含まれる。ＳＳＩ様インヒビターに関連する背景情報はＬａｓｋｏｗｓｋｉ ら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ”， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ４９， ｐｐ． ５９３ − ６２６ （１９８０）に見出されるであろう。好適なＳＳＩ様インヒビターは約５０％を越える、好ましくは６５％を越える、より好ましくは７０％を越えるＳＳＩとのアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはインヒビターはＩＩＩ族インヒビターとして分類され得る。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、前掲を参照のこと。このようなＳＳＩ様インヒビターの例には、ＳＩＬ１０（この配列は配列番号４として挙げられている）、ＳＩＬ１３（配列番号５）及びＳＩＬ１４（配列番号６）（これらの各々はＴｅｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｒｅｅ Ｎｏｖｅｌ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １１６， ｐｐ． １１５６ − １１６３ （１９９４）に更に記述されている）、並びにＳＩＬ２（この配列は配列番号９として挙げられている）、ＳＩＬ３（配列番号１０）及びＳＩＬ４（配列番号１１）（これらの各々はＴａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２２０， ｐｐ． ９１１ − ９１８ （１９９４）に更に記述されている）が含まれる。このようなＳＳＩ様インヒビターの他の２つの例には、ＳＴＩ１（この配列は配列番号７として挙げられている）及びＳＴＩ２（配列番号８）が含まれ、これはＳｔｒｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｗｏ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２６７， Ｎｏ． ５， ｐｐ． ３２３６ − ３２４１ （１９９２）に更に記述されている。他のＳＳＩ様インヒビターはプラスミノストレプチン（この配列は配列番号１２として挙げられている）として既知であり、Ｓｕｇｉｎｏら、“Ｐｌａｓｍｉｎｏｓｔｒｅｐｔｉｎ， ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２５３， Ｎｏ．５，ｐｐ．１５４６−１５５５ （１９７８）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＬＰＩ（この配列は配列番号１３として挙げられている）であり、Ｕｅｄａら．，“Ａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ６６ Ｅｘｈｉｂｉｔｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｔｏｗａｒｄ Ｂｏｔｈ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ａｎｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．１１２，ｐｐ．２０４−２１１ （１９９３）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＡＣ Ｉ（この配列は配列番号１４として挙げられている）であり、Ｔａｎａｂｅら、“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ （ＳＡＣ）， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ．７５２−７６１ （１９９４）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＩＬ１（この配列は配列番号１５として挙げられている）であり、Ｋｏｊｉｍａら、“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｃａｏｉ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．１２０７，ｐｐ．１２０−１２５ （１９９４）に更に記述されている。他のＳＳＩ様インヒビターはＴａｇｕｃｈら、“Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ＳＳＩ−Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ａｍｏｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．５２２−５２４ （１９９３）、Ｔａｇｕｃｈｉら、“Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｒｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ”， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ．４３３８−４３４１ （Ｄｅｃ． １９９３）、及びＳｕｚｕｋｉら、“Ｐａｒｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．６２９−６３４ （１９８１）において議論されている。当業者が理解しているように、更に他のＳＳＩ様インヒビターが当業界で記述されている。
【００４７】
ＳＳＩ様インヒビターの変異体は、本明細書中では親アミノ酸配列としても利用され得る。このような変異体には、本明細書中で上述したように、選定ＳＳＩ様インヒビターのアミノ酸配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を有するものが含まれる。特に、本明細書中に示した変異体で例示した置換はすべて、ＳＳＩ様インヒビターの対応する位置でなされて、親アミノ酸配列を提供し得る。親アミノ酸配列として利用され得るＳＳＩ様インヒビターの変異体の他の例は、ＷＯ９３／１７０８６（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９３年９月２日公開）に開示されているが、これらに限定されない。
【００４８】
当業者が理解するように、その元々の番号付けを用いて、ＳＳＩ様インヒビター、その変異体、又はＳＳＩの変異体の位置６３（例えば）は、ＳＳＩの位置６３に対応しなくても良い。したがって、当業界では容易に理解されるように、配列番号は、ＳＳＩの位置６３（例えば）に対応する位置を突き止めるために調整を要してもよい。配列アラインメントは、本明細書中に引用した参考文献、ならびに当業界のその他の参考文献中に容易に見出される。
【００４９】
好ましくは、本発明の変異体は、変異体が、クリーニング又はパーソナルケア組成物中のほとんどすべてのプロテアーゼ（好ましくは、約６０％より多く、さらに好ましくは約９９％）を阻害可能にするが、しかし稀釈時及び／又はクリーニング工程中に変異体がプロテアーゼから解離することを可能にするＫ_ｉを示す。
【００５０】
例えば、２：１の化学量論値の変異体対プロテアーゼが用いられる場合、インヒビターは、プロテアーゼに対して約１０^−１２Ｍ〜約１０^−４Ｍ、さらに好ましくは約１０^−１０Ｍ〜約１０^−６Ｍ、最も好ましくは約１０^−８Ｍ〜約１０^−７ＭのＫ_ｉを示すのが好ましい。もちろん、洗濯機の寸法又は製品の濃度が変われば、Ｋ_ｉはそれにしたがって調整される。有用なＫ_ｉ範囲の予測は、使用時の組成物の稀釈、用いられるクリーニング方法の温度に関連した結合定数の温度依存性、プロテアーゼのインヒビターの化学量論値等のようなパラメーターを考慮することにより、不相応な実験をせずに、熟練当業者により容易に確定される。
【００５１】
変異体は最終的にはｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡによりコードされるため、ＤＮＡは、変異体の配列を決定するため用いられることができる。変異体をコードするＤＮＡは、任意の数のプラスミド及び／又は発現系中で用いられることが可能であり、それらの例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系及びｉｎ ｖｉｖｏ系、例えば、植物（好ましくはバイオテクノロジーに用いられるもの、例えば、タバコ、脂肪種子植物、例えば、ナタネ、ダイズ等、穀類、例えば、トウモロコシ、オオムギ、カラスムギ、その他の野菜、例えば、トマト、ジャガイモ等）及び微生物、例えば真菌、例えば、酵母菌、ならびに細菌、例えば、バチルス属、大腸菌等が挙げられる。好ましくは、発現系は、微生物、さらに好ましくは自然の細菌、最も好ましくは大腸菌又はバチルス属、さらに好ましくはバチルス属細菌である。
【００５２】
変異体をコードするＤＮＡは、プラスミド又はファージ中に組み入れられ、細胞中で活性であるか、又は本発明の変異体のクローニング又は発現に用いられる生物のゲノム中に直接組み入れられてもよい。
【００５３】
本発明の説明を見れば、本発明の変異体をコードするために用いられるＤＮＡは、本発明の他の変異体と同一プラスミド、ファージ又は染色体中に置かれ得ると、当業者は認識することが理解されるべきである。さらに、このようなプラスミド、ファージ又は染色体は、本発明の変異体により阻害され得るか又は阻害されないこともある、融合タンパク質の一部としてインヒビター及び／又はプロテアーゼを含む融合タンパク質を含めたプロテアーゼもコードし得る。
【００５４】
前記のＤＮＡはＤＮＡのＲＮＡ転写物も意図し、開示する、ということも当業者には十分理解される。当業者は、もちろん、実験しなくても、ＤＮＡ配列の検査によりＲＮＡ配列を知ることができる。
【００５５】
本発明は、本発明の変異体をコードする遺伝子にも関する。
当業者が本発明の変異体に対する抗体を調製することを望み得ることも意図される。これらの抗体は、既知の方法を用いて調製し得る。
例えば、本発明の変異体は、適切な哺乳類被験体、例えば、マウス、ウサギ等に注入されることができる。適切なプロトコールは、血清中での抗体の産生を増強するスケジュールにしたがって、アジュバントの存在下での免疫原を反復注入することを含む。免疫血清の力価は、抗原として本発明の変異体を用いて、当業界での目下の標準であるイムノアッセイ法を用いて、容易に測定し得る。
【００５６】
得られた抗血清は直接用いられるか、あるいは免疫感作動物の末梢血リンパ球又は脾臓を採取し、抗体産生細胞を不死化した後、標準イムノアッセイ技法を用いて適切な抗体産生体を同定することにより、モノクローナル抗体が得られる。
【００５７】
その場合、ポリクローナル又はモノクローナル調製物は、標準検定法を用いて、本発明の発現をモニタリングするのに有用である。したがって、発現レベル等を確定するために用いるために、これらの抗体を用いて、キットが調製され得ることも意図される。
【００５８】
このような抗体はまた、標準結合法を用いて、シンチグラフ用標識、例えば、テクネチウム９９又はＩ−１３１あるいは蛍光標識といった標識と結合されることができる。標識化抗体はまた、競合アッセイ、例えばＫ_ｉを確定するために用いられる動態論的アッセイにも用いられることができる。
【００５９】
当業界で認識されているように、ＤＮＡ及びアミノ酸配列決定法には、時折、エラーが生じる。その結果、本明細書中の開示から本発明者等の仕事を再現する当業者は、ルーチン技能を用いてあらゆる配列決定エラーを発見し、適切な場合には変更を加え得る。
【００６０】
製造及び使用方法
以下の実施例は、いかなる点でも本発明を限定するものではなく、むしろ本発明の製造及び使用方法の指針を当業者に提供するものである。実施例の指針、本明細書中のその他の開示及び当業者に容易に利用可能な情報が示されれば、当業者は本発明を製造し、使用し得る。要するに、技術の網羅的詳述及び当業界で既知の技法等は、十分に当業者の範囲内であるために、除去される。
変異体は親アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を突然変異し、それにより改変アミノ酸配列を有する変異体を得ることにより製造され得る。このような方法は当業界では周知であり、そのような方法の１つを以下に説明する。
【００６１】
親アミノ酸配列に相当する遺伝子を含むファージミドを、大腸菌ｄｕｔ−ｕｎｇ−株ＣＪ２３６に形質転換するために使用し、一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型を、Ｙｕｃｋｅｎｂｅｒｇらによる “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｕｒａｃｉｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ”， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．ｅｄ．，ｐ２７−４８（１９９１）により改変されたＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｋｕｎｋｅｌらの “Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５４、３６７−３８２頁（１９８７））を用いて生成する。Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，及び Ｍ．Ｓｍｉｔｈらの “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ − Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ − Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１０、ｐ６４８７−６５００（１９８２）に記載された方法により改変された位置指定変異プライマーが、（本質的には上記のＹｕｃｋｅｎｂｅｒｇらにより提供されるような）全ての変異体を生成するために使用される。
【００６２】
オリゴヌクレオチドは、３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて作製される。変異反応生成物を、大腸菌ＭＭ２９４株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション Ｅ．ｃｏｌｉ ３３６２５）に形質転換させる。全ての突然変異は、ＤＮＡ配列決定により確認され、単離したＤＮＡを、バチルス サブチリス発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（Ｓａｕｎｄｅｒらの “Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｆ ａ ３４−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ”， Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０２、２７７−２８２頁（１９９１）、及びＹａｎｇらの “Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｃｒｅａｔｅ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６０、ｐ１５−２１（１９８４））。
【００６３】
変異体調製物は、以下のように作製する：２０ｇ／ｌのトリプトン、２０ｇ／ｌの酵母抽出物及び５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含有し、１．２５％のマルトリンＭ１００（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ， ＩＡ）、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、８０μＭのＭｎＣｌ_２及び５０μＭのカナマイシンを補充した培地中で、対象プラスミドを含有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養する。培養物を３７℃で２４時間インキュベートする。
【００６４】
遠心分離により先ず細胞を除去して、変異体を精製する。１ＮのＨＣｌを付加して、ｐＨを約４に下げる。遠心分離により、不溶性物質をペレット化する。典型的には、変異体は上清中に見出される。次に、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４に対して上清を透析する。変異体は、典型的には、この工程で沈澱する。トリス塩基中に両沈殿物を再懸濁させて、サブチリシンＢＰＮ’のＹ２１７Ｌ誘導体の阻害に関してアッセイする。いくつかの場合には、変異体はこれらの沈降工程中、可溶性のままである。このような場合には、可溶性分画をＳセファロースカラム上で分離し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４中で走行させる。試料を漸増濃度の塩化ナトリウムで溶離し、プロテアーゼ阻害に関してアッセイする。すべての場合に、使用前に、１ｍＭトリス、ｐＨ８．０に対して、変異体含有分画を透析する。
【００６５】
本発明の変異体の特徴づけ
ＳＳＩは、とりわけサブチリシンＢＰＮ’及びサブチリシンＢＰＮ’のＹ２１７Ｌ変異体を阻害する。本発明の変異体の阻害活性は、例えばＳＳＩを用いて、以下のように測定する。ＳＳＩをプロテアーゼと混合し、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．６、１０ｍＭのＣａＣｌ_２の存在下で、室温で１５分間インキュベートする。次に、ＤｅｌＭａｒ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ９９， ｐｐ．３１６−３２０（１９７９））の方法を用いて、プロテアーゼ活性を測定する。１０μＬのＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（２０ｍｇ／ｍＬ）を付加して反応を開始させる。プロテアーゼの阻害を示す４１０ｎｍでの吸光度の増大により、反応率を測定する。本発明の変異体の阻害特性を同様に確定する。
【００６６】
クリーニング又はパーソナルケア組成物中に、プロテアーゼとともに本発明の変異体を組み入れるのが望ましい（適切なプロテアーゼは本明細書中で後述する）ために、生成物環境での安定性も検査する。変異体の安定性は、時間中のプロテアーゼ活性を測定することによりモニタリングし得る。変異体が安定な場合には、プロテアーゼ活性のレベルは一定である。しかしながら、変異体が破壊された場合には、プロテアーゼ活性は上昇する。この例では、変異体をＹ２１７Ｌ置換を有する１．１ｎｍｏｌのサブチリシンＢＰＮ’変異体と混合する。全試料の容積が同一になるように、水を付加する。以下の処方により作られた液体洗剤組成物中で１０分で、複合体を生成させる。
【００６７】
【表１５】

【００６８】
この組成物は、全試料容積の３分の１を構成する。１５μＬの試料を９７５μＬの０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．６、０．０１ＭのＣａＣｌ_２と混合する。この稀釈液を室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、基質を付加し、プロテアーゼの量を測定する。数週間に亘るプロテアーゼ活性の増大により、変異体の分解を検出する。このような分解は、例えばＳＳＩの場合と直接比較し得る。
【００６９】
変異体のＫ_ｉを、以下のようにして確定する。変異体及び６００μｇ／ｍＬのスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを９９０μＬの５０ｍＭトリス、ｐＨ８溶液に混合する。選定したプロテアーゼ（適切なプロテアーゼは、本明細書に後述する）の付加により、反応を開始させる。加水分解速度を、２０分間追跡する。最後の１０〜１５分間に、一定速度が観察される。この速度を、変異体が存在しない場合の速度と比較して、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（「Ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２７， ｐｐ．５２９−５８０（１９４４））の方程式によりＫ_ｉを算出するために用いる。
【００７０】
本発明のクリーニング組成物
本発明の別の実施態様では、有効量の１つ又はそれ以上の本発明の変異体は、ペプチド汚れ除去を必要とする種々の表面をクリーニングするのに有用なクリーニング組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物としては、織物リーニング組成物、硬質表面クレンジング組成物、ライトデューティークリーニング組成物、例えば、食器クレンジング組成物、及び自動食器洗浄機用洗剤組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
クリーニング組成物は、本明細書中では、有効量の１つ又はそれ以上の本発明の変異体と、クリーニング組成物担体とを包含し、この担体にはプロテアーゼが含まれる。本明細書中で用いる場合、「有効量の変異体」等といった表現は、特定のクリーニング組成物中に必要なタンパク質分解活性を達成するのに必要な変異体の量を指す。このような有効量は、当業者には容易に確定され、そして、多数の因子、例えば、用いられる特定の変異体、クリーニング用途、クリーニング組成物の特定の組成、ならびに望ましいのは液体か乾燥（例えば、顆粒、棒状）組成物か等に基づいている。好ましくは、クリーニング組成物は、約０．０００１％〜約１０％、さらに好ましくは約０．００１％〜約１％、最も好ましくは約０．０１％〜約０．１％の１つ又はそれ以上の本発明の変異体を包含する。変異体が用いられ得る種々のクリーニング組成物のいくつかの例を以下でさらに詳細に考察する。
【００７２】
本発明の変異体は、貯蔵中にその中のプロテアーゼを阻害し、それによりプロテアーゼが自己分解したり、組成物中に存在する付加的酵素のような他の供給源により加水分解するのを防止するために、クリーニング組成物において有用である。したがって、本発明のクリーニング組成物中の必須成分はプロテアーゼであって、これを本発明の変異体が阻害する。プロテアーゼは、動物、植物、又は好ましくは微生物起源のものである。好ましいプロテアーゼには、ＳＳＩが阻害剤であるものが含まれる。このようなプロテアーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物により産生されるものが挙げられる。このようなプロテアーゼの中で、好ましいものとしては、例えば、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ及びサーミターゼ、例えばＡ／Ｓアルカラーゼ（商品名）（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）、エスペラーゼ（商品名）（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、サビナーゼ（商品名）（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、マキサターゼ（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ， Ｄｅｌｆｔ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、マキサカル（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）、マキサペム１５（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及び前記の変異体が挙げられる。本明細書中で用いるのに特に好ましいプロテアーゼとしては、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるもの及びその変異体が挙げられる。最も好ましい野生型プロテアーゼは、サブチリシンＢＰＮ’である。
【００７３】
サブチリシンＢＰＮ’の変異体（以後、集合的に「Ａ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、本明細書中のプロテアーゼとして有用であり、米国特許第５，０３０，３７８号（Ｖｅｎｅｇａｓ、１９９１年７月９日）に開示され、以下の突然変異を有するサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列（その配列は配列番号３で表される）を特徴とする：
（ａ）位置１６６のＧｌｙが、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ又はＧｌｕで置換され；位置１６９のＧｌｙがＳｅｒで置換される；位置２２２のＭｅｔがＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ又はＴｈｒで置換され；あるいは、
（ｂ）位置１６０のＧｌｙがＡｌａで置換され、そして位置２２２のＭｅｔがＡｌａで置換される。
【００７４】
サブチリシンＢＰＮ’の別の変異体（以後、集合的に「Ｂ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、本明細書中のプロテアーゼとして有用であり、欧州特許第ＥＰ−Ｂ−２５１，４４６号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．に譲渡。１９８８年１月７日公開、１９９４年１２月２８日特許付与）に開示され、以下の位置の１つ又はそれ以上で突然変異を有する野生型ＢＰＮ’アミノ酸配列：Ｔｙｒ２１、Ｔｈｒ２２、Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ３６、Ａｌａ４５、Ａｌａ４８、Ｓｅｒ４９、Ｍｅｔ５０、Ｈｉｓ６７、Ｓｅｒ８７、Ｌｙｓ９４、Ｖａｌ９５、Ｇｌｙ９７、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ｉｌｅ１０７、Ｇｌｙ１１０、Ｍｅｔ１２４、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｐｒｏ１２９、Ｌｅｕ１３５、Ｌｙｓ１７０、Ｔｙｒ１７１、Ｐｒｏ１７２、Ａｓｐ１９７、Ｍｅｔ１９９、Ｓｅｒ２０４、Ｌｙｓ２１３、Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５及びＳｅｒ２２１；あるいは上記列挙の位置の２又はそれ以上とＡｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ１０４、Ａｌａ１５２、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７及びＭｅｔ２２２との組合せを特徴とする。
【００７５】
本明細書中のプロテアーゼとして有用な別の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体は、以後、集合的に「Ｃ群プロテアーゼ」と呼び、ＷＯ９５／１０６１５（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．に譲渡。１９９５年４月２０日公開）に記載され、位置Ａｓｎ７６に対する突然変異を、以下からなる群から選択される１つ又はそれ以上の他の位置の突然変異との組合せを有する野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする：Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｎ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｉｌｅ１０７、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、Ｌｅｕ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｌｅｕ１３５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｕ１９５、Ａｓｐ１９７、Ｓｅｒ２０４、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２１０、Ａｌａ２１６、Ｔｙｒ２１７、Ａｓｎ２１８、Ｍｅｔ２２２、Ｓｅｒ２６０、Ｌｙｓ２６５及びＡｌａ２７４。
【００７６】
本明細書中のプロテアーゼとして有用なその他の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体（以後、集合的に「Ｄ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、米国特許第４，７６０，０２５号（Ｅｓｔｅｌｌ等、１９８８年７月２６日）に記載され、Ａｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７及びＭｅｔ２２２からなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸位置に対する突然変異を有する野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする。
【００７７】
本明細書中で用いられる場合に、さらに好ましいプロテアーゼは、アルカラーゼ（商品名）、サブチリシンＢＰＮ’、Ａ群プロテアーゼ、Ｂ群プロテアーゼ、Ｃ群プロテアーゼ及びＤ群プロテアーゼからなる群から選択される。最も好ましいプロテアーゼは、Ｄ群プロテアーゼから選択される。
【００７８】
本発明の組成物は、組成物の重量比で約０．０００１重量％〜約１重量％、好ましくは約０．０００５重量％〜約０．２重量％、最も好ましくは約０．００２重量％〜約０．１重量％の活性プロテアーゼを包含する。プロテアーゼの混合物も含まれ得る。もちろん、クリーニング組成物中のプロテアーゼの重量％は、完成組成物の含水量、ビルダー含量等によって変わり得る。例えば、顆粒洗剤では、組成物中のプロテアーゼは約０．０６４ｍｇ／ｇ〜約０．６４ｍｇ／ｇであるのが望ましい。
【００７９】
好ましい実施態様では、クリーニング組成物中の変異体対プロテアーゼの好ましいモル比（変異体対プロテアーゼ比）は、約３：１〜約１：１，さらに好ましくは約３：１〜約１．５：１、最も好ましくは約２：１である。
【００８０】
本発明の変異体に加えて、本クリーニング組成物は更に、変異体及び／又はプロテアーゼに適合する１つ以上のクリーニング組成物物質を含むクリーニング組成物担体を含む。用語「クリーニング組成物物質」とは、ここで用いられる場合、所望されるクリーニング組成物の特定のタイプ及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、棒状、スプレー、スティック、ペースト、ジェル）に選択された如何なる物質をも意味し、これらの物質はまた本組成物に使用される変異体に適合するものでもある。クリーニング組成物物質の特定の選択は、クリーニングされる物質、使用中のクリーニング条件のための組成物の所望形態を考慮することにより容易に成される。用語「適合」とは、ここで用いられる場合、クリーニング組成物物質が、変異体の阻害活性及び／又はプロテアーゼのタンパク質分解活性を、プロテアーゼが通常使用状態の間に所望されるように有効とならない程度まで低下しないことを意味する。特別のクリーニング組成物物質は、以下に詳細に例示される。
【００８１】
本発明の変異体は、高度に起泡し良好なクレンジング活性が所望される種々の洗剤組成物に使用され得る。従って、変異体は、十分に配合された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、織物洗濯組成物などを提供するために種々の慣用の配合剤と共に使用できる。このような組成物は、液体、顆粒、棒状などの形態であることができる。このような組成物は、約３０重量％から約６０重量％ほどの界面活性剤を含有する「濃縮」洗剤として配合できる。
【００８２】
ここでのクリーニング組成物は任意に、また好ましくは、種々の界面活性剤（例えば、アニオン、ノニオン又は双性イオン性界面活性剤）を含有し得る。このような界面活性剤は、普通、組成物の約５％から約３５％のレベルで存在する。
【００８３】
ここで有用な界面活性剤の非限定例には、慣用のＣ_１１−Ｃ_１８アルキルベンゼンスルホネート並びに一級及びランダムアルキルスルフェート、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｘ（ＣＨＯＳＯ_３）⁻Ｍ^＋）ＣＨ_３及びＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｙ（ＣＨＯＳＯ_３）⁻Ｍ^＋） ＣＨ_２ＣＨ_３のＣ_１０−Ｃ_１８二級（２，３）アルキルスルフェートであって、式中、ｘ及び（ｙ＋１）は少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムであるもの、Ｃ_１０−Ｃ_１８アルキルアルコキシスルフェート（特にＥＯ１−５エトキシスルフェート）、Ｃ_１０−Ｃ_１８アルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１−５エトキシカルボキシレート）、Ｃ_１０−Ｃ_１８アルキルポリグリコシド、並びにその対応スルフェート化ポリグリコシド、Ｃ_１２−Ｃ_１８α−スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ_１２−Ｃ_１８アルキル及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ_１２−Ｃ_１８ベタイン及びスルホベタイン（「スルタイン」）、Ｃ_１０−Ｃ_１８アミンオキシドなどが含まれる。アルキルアルコキシスルフェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）がここでは好ましい。このような界面活性剤のアミンオキシド及び／又はベタイン又はスルタイン界面活性剤との組合わせての使用も好ましく、これは配合者の希望による。他の慣用の有用な界面活性剤は、標準的なテキストに列記されている。特に有用な界面活性剤には、Ｃ_１０−Ｃ_１８のＮ−メチルグルカミドが含まれ、これは１９９３年３月１６日発行のＣｏｎｎｏｒらの米国特許第５，１９４，６３９号に開示されている。
【００８４】
本クリーニング組成物に有用な広範な種々の他の配合剤は、例えば他の活性配合剤、担体、ヒドロトロープ、プロセシング助剤、染料又は顔料並びに、液体配合物のための溶媒を含む。起泡の更なる増進が所望される場合、起泡増進剤、例えばＣ_１０−Ｃ_１６アルコールアミド（ａｌｋｏｌａｍｉｄｅｓ）が、普通約１％から約１０％のレベルで本組成物に組み込まれることができる。Ｃ_１０−Ｃ_１４モノエタノール及びジエタノールアミドは、普通のクラスのこのような起泡増進剤を説明する。このような起泡増進剤の高度起泡補助界面活性剤、例えばアミンオキシド、ベタイン及び上記したスルタインとの使用もまた有効である。所望される場合、可溶性マグネシウム塩、例えばＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４などは、更なる起泡をもたらすために、普通、約０．１％から約２％のレベルで付加されることができる。
【００８５】
ここでの液体洗剤組成物は、担体として水及び他の溶媒を含んでもよい。メタノール、エタノール、プロパノール及びｉｓｏ−プロパノールにより例示される低分子量の一級又は二級アルコールが適している。一価アルコールは可溶性界面活性剤に好適であるが、ポリオール、例えば約２から約６の炭素原子及び約２から約６のヒドロキシ基を有するもの（例えば、１，３−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリン及び１，２−プロパンジオール）もまた使用されることができる。本組成物は約５％から約９０％、普通約１０％から約５０％のこのような担体を含み得る。
【００８６】
ここでの洗剤組成物は好ましくは水性クリーニング操作での使用中に洗浄水が約６．８と約１１との間のｐＨを有するように配合されることが好ましいであろう。最終製品は普通この範囲で配合される。ｐＨを推奨使用レベルに調整する技術には、例えば緩衝剤、アルカリ、及び酸の使用が含まれる。このような技術は当業者に公知である。
本発明の硬質表面クリーニング組成物及び織物クリーニング組成物を配合するときに、配合者は種々のビルダーを約５重量％から約５０重量％のレベルで用いたいと思うであろう。普通のビルダーには、１−１０ミクロンのゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシトレート及びオキシジスクシネート、層状シリケート、ホスフェートなどが含まれる。他の慣用ビルダーは標準配合書に列記されている。
【００８７】
同様に、配合者は種々の付加的な酵素、例えばセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼを、このような組成物に普通約０．００１重量％から約１重量％のレベルで使おうとするかもしれない。種々の洗浄性及び織物ケア酵素は洗濯洗剤分野で公知である。
【００８８】
種々の漂白化合物、例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩等は、普通、約１重量％から約１５重量％のレベルでこのような組成物に用いられることができる。所望すれば、このような組成物はまた、テトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート等の漂白活性剤も含有することができ、これらもまた当業界で既知である。使用レベルは普通約１重量％から約１０重量％に及ぶ。
【００８９】
汚れ遊離剤（ｓｏｉｌ ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔｓ）、特にアニオン性オリゴエステル型、キレート剤、特にアミノホスフェート及びエチレンジアミンジスクシネート、クレイ汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレート及びポリアスパラテート、増白剤、特にアニオン増白剤、泡抑制剤、特にシリコーン及び二級アルコール、織物柔軟剤、特にスメクタイトクレイ等は、このような組成物に約１重量％から約３５重量％に及ぶレベルで全て使用されることができる。標準配合書及び公開特許は、このような慣用の物質の多数の詳細な記述を含む。
【００９０】
酵素安定剤も本クリーニング組成物に使用しても良い。このような酵素安定剤には、プロピレングリコール（好ましくは約１％から約１０％）、ナトリウムホルメート（好ましくは約０．１％から約１％）及びカルシウムホルメート（好ましくは約０．１％から約１％）が含まれる。
他の有用なクリーニング組成物物質には、クレイ汚れ除去剤、分散剤、増白剤、泡抑制剤及び織物柔軟剤が含まれる。
【００９１】
本変異体は硬質表面クリーニング組成物に有用である。ここで用いられる場合「硬質表面クリーニング組成物」とは、硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイル等をクリーニングするための液体及び顆粒の洗剤組成物を指す。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、普通、界面活性剤と、水溶性金属イオン封鎖剤ビルダーとを含む。しかしながら、所定の特別製品、例えばスプレー窓クリーナーでは、ガラス表面に薄膜状及び／又はむらのある残査を生成し得るので、界面活性剤は時として使用されない。
【００９２】
存在する場合、界面活性剤成分は、ここでの組成物の約０．１％程度で含まれてもよいが、普通、組成物は約０．２５％から約１０％、より好ましくは約１％から約５％の界面活性剤を含むであろう。
普通、本組成物は約０．５％から約５０％の洗浄性ビルダー、好ましくは約１％から約１０％で含まれ得る。
【００９３】
好ましくはｐＨは約７から約１２の範囲にあるべきである。慣用のｐＨ調整剤、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸が、調整の必要があれば使用されることができる。
【００９４】
溶媒は、本組成物に含まれてもよい。有用な溶媒には、グリコールエーテル、例えばジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテル、並びにジオール、例えば２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール及び２−エチル−１，３−ヘキサンジオールが含まれるが、これらに限定されない。使用する場合、このような溶媒は普通、約０．５％から約１５％、より好ましくは約３％から約１１％のレベルで存在する。
【００９５】
付加的に、高度揮発性溶媒、例えばｉｓｏ−プロパノール又はエタノールは、表面に対して本組成物の「十分な強さでの」塗布後に表面が濯がれない場合、表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本発明において使用されることができる。使用される場合、揮発性溶媒は普通、約２％から約１２％のレベルで本組成物中に存在する。
【００９６】
本変異体はまた、以下に記述されているクリーニング組成物における含有物として有用である：１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，４７７号；１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，３９７号；１９９８年３月２６日発行のＷｅｉｓｇｅｒｂｅｒらの米国特許出願第０９／０４８，１７４号；１９９８年６月２日出願の Ｗｅｉｓｇｅｒｂｅｒの米国特許第出願第０９／０４８，１７４号に優先権を主張した米国特許第出願第０９／０８８９１２号。
【００９７】
本発明の硬質表面クリーニング組成物を、以下の実施例により説明する。
実施例１−６
【００９８】
【表１６】

【００９９】
実施例１−６において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体６−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１００】
本発明の他の実施形態では、皿洗い組成物は、本発明の変異体の１つ以上を含む。ここで用いられる場合「皿洗い組成物」とは、皿類をクリーニングするための組成物の全ての形態を指し、これには顆粒及び液体形態が含まれるが、これらに限定されない。本発明の皿洗い組成物を、以下の実施例により説明する。
実施例７−１０
【０１０１】
【表１７】

【０１０２】
実施例７−１０において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体７−Ｉ−Ａ６２Ｋと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１０３】
本発明の液体織物クリーニング組成物を以下の実施例で説明する。
実施例１１−１３
【０１０４】
【表１８】

【０１０５】
実施例１１−１３において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体２−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１０６】
パーソナルケア組成物
本変異体は、パーソナルケア組成物での使用にとくに適切であり、前記パーソナルケア組成物は、例えば、リーブオン及びリンスオフヘアコンディショナー、シャンプー、リーブオン及びリンスオフにきび組成物、フェイシャルミルク及びコンディショナー、シャワ−ジェル、石鹸、泡立ち及び非泡立ちフェイシャルクレンザー、化粧品、ハンド、フェイシャル及びボディーローション、モイスチャライザー、リーブオンフェイシャルモイスチャライザー、化粧品及びクレンジングワイプ、口腔ケア組成物、及びコンタクトケア組成物である。本発明のパーソナルケア組成物は、有効量の本発明の一つ以上の変異体組成物とパーソナルケア担体とを含み、パーソナルケア担体は、プロテアーゼを含む。適切なプロテアーゼは、好適なものを含め、クリーニング組成物についてここで記述されている。 【０１０７】
説明するために、本発明の変異体は、プロテアーゼと共に、下記参考文献に記載された組成物中の含有物に対して適当である：１９９７年６月２４日発行のＬｉｎａｒｅｓらの米国特許第５，６４１，４７９号（スキンクレンザー）； １９９７年２月４日発行のＷｉｖｅｌｌらの米国特許第５，５９９，５４９号（スキンクレンザー）； １９９６年１２月１７日発行のＨａらの米国特許第５，５８５，１０４号（スキンクレンザー）； １９９６年７月３０日発行のＫｅｆａｕｖｅｒらの米国特許第５，５４０，８５２号（スキンクレンザー）； １９９６年４月２３日発行のＤｕｎｂａｒらの米国特許第５，５１０，０５０号（スキンクレンザー）； １９９７年３月１８日発行のＧｕａｎｇ Ｌｉｎらの米国特許第５，６１２，３２４号（坑にきび調製物）； １９９６年１２月２４日発行のＷａｒｒｅｎらの米国特許第５，５８７，１７６号（坑にきび調製物）； １９９６年８月２７日発行のＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎの米国特許第５，５４９，８８８号（坑にきび調製物）； １９９５年１１月２８日発行のＣｏｒｌｅｓｓらの米国特許第５，４７０，８８４号（坑にきび調製物）； １９９７年７月２２日発行のＧｏｒｄｏｎらの米国特許第５，６５０，３８４号（シャワージェル）； １９９７年３月４日発行のＭｏｏｒｅらの米国特許第５，６０７，６７８号（シャワージェル）； １９９７年４月２９日発行のＣｏｆｆｉｎｄａｆｆｅｒらの米国特許第５，６２４，６６６号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年４月８日発行のＢｏｌｉｃｈらの米国特許第５，６１８，５２４号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年３月１８日発行のＩｎｍａｎの米国特許第５，６１２，３０１号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９６年１１月１２日発行のＷｅｌｌｓの米国特許第５，５７３，７０９号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９６年１月９日発行のＰｉｎｇｓの米国特許第５，４８２，７０３号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９４年４月１２日再発行のＧｒｏｔｅらの米国再発行特許第３４，５８４号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年６月２４日発行のＤａｔｅらの米国特許第５，６４１，４９３号（化粧品）； １９９７年２月２５日発行のＢｌａｎｋらの米国特許第５，６０５，８９４号（化粧品）； １９９６年１２月１７日発行のＹｏｓｈｉｏｋａらの米国特許第５，５８５，０９０号（化粧品）； １９９０年７月３日発行のＣｈｅｎｅｙらの米国特許第４，９３９，１７９号（ハンド、フェイス及び／又はボディーローション）； １９９７年３月４日発行のＭｃＡｔｅｅらの米国特許第５，６０７，９８０号（ハンド、フェイス及び／又はボディーローション）； １９７７年８月３０日発行のＲｉｃｈｔｅｒらの米国特許第４，０４５，３６４号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９４年１０月１２日の公開のＴｏｕｃｈｅｔらの欧州特許明細書 ＥＰ ０ ６１９ ０７４号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９０年１２月４日発行のＢｒｏｗｎ−Ｓｋｒｏｂｏｔらの米国特許第４，９７５，２１７号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９２年３月１７日発行のＳｅｉｂｅｌの米国特許第５，０９６，７００号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒの米国特許第５，０２８，４１４号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＢｅｎｅｄｉｃｔらの米国特許第５，０２８，４１５号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＢｅｎｅｄｉｃｔらの米国特許第５，０２８，４１５号（口腔洗浄組成物）； １９８９年９月５日発行のＤａｖｉｅｓらの米国特許第４，８６３，６２７号（コンタクトレンズ洗浄液）； １９８８年５月２４日再発行のＨｕｔｈらの米国再発行特許第３２，６７２号（コンタクトレンズ洗浄液）；及び１９８６年９月２日発行のＳｃｈａｆｅｒの米国特許第４，６０９，４９３号（コンタクトレンズ洗浄液）。
【０１０８】
本変異体はまた、以下に記述されているパーソナルケア組成物における含有物として有用である：１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，４７７号；１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，３９７号；１９９８年３月２６日発行のＷｅｉｓｇｅｒｂｅｒらの米国特許出願第０９／０４８，１７４号；１９９８年６月２日出願の Ｗｅｉｓｇｅｒｂｅｒの米国特許第出願第０９／０４８，１７４号に優先権を主張した米国特許第出願第０９／０８８９１２号。
【０１０９】
本発明の口腔クリーニング組成物をさらに説明するために、本発明の１つ以上の変異体と１つ以上のプロテアーゼが、歯又は義歯からタンパク質性の汚れを除去するために有用な組成物中に含有される。ここで使用されるような「口腔クリーニング組成物」は、歯磨き剤、練り歯磨き、ジェル歯磨き、歯磨き粉、マウスウォッシュ、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、薬用ドロップ、香粉（サッシェ）、タブレット、バイオゲル、歯科掃除用ペースト、歯科治療液等をさす。好ましくは、口腔クリーニング組成物は、プロテアーゼと共に、組成物に対して約０．０００１重量％〜約２０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約１０重量％、さらに好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％の本発明の変異体の１つ以上と、パーソナルケア担体とを含む。
【０１１０】
典型的な口腔クリーニング組成物の口腔クリーニング成分のパーソナルケア担体成分は、一般的に、組成物に対して約５０重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５重量％〜約９９．９９重量％、より好ましくは約６５重量％〜約９９重量％を構成し得る。
【０１１１】
本発明の口腔クリーニング組成物に含有されてもよいパーソナルケア担体成分及び任意成分は、当業者によく知られているものである。口腔クリーニング組成物に有用な広範な種類の組成物タイプ、担体成分及び任意成分は、上記引用文献に開示されている。
【０１１２】
本発明のその他の実施形態において、口腔外の義歯を洗浄するための義歯クリーニング組成物は、プロテアーゼと共に、本発明の１つ以上の変異体を含む。そのような義歯クリーニング組成物は、有効量の１つ以上の変異体、好ましくは組成物に対して約０．０００１重量％〜約５０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約３５重量％、さらに好ましくは約０．０１重量％〜約２０重量％の１つ以上の変異体と、パーソナルケア担体とを含む。発泡性の錠剤等のような種々の義歯クレンジング組成物の形式等は、当業界でよく知られており（Ｙｏｕｎｇの米国特許第５，０５５，３０５号参照）、義歯からタンパク質性の汚れを除去するために１つ以上の変異体を組み込むことが概ね適切である。
【０１１３】
本発明のその他の実施形態において、コンタクトレンズクリーニング組成物は、本発明の１つ以上の変異体を含む。そのようなコンタクトレンズクリーニング組成物は、有効量の１つ以上の変異体、好ましくは組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約２０重量％、さらに好ましくは約１重量％〜約５重量％の１つ以上の変異体と、パーソナルケア担体とを含む。錠剤、液体等のような種々のコンタクトレンズクリーニング組成物の形式等は、当業界でよく知られており、コンタクトレンズからタンパク質性の汚れを除去するために本発明の変異体の１つ以上を組み込むことが概ね適切である。
【０１１４】
本発明のコンタクトレンズクリーニング組成物実施形態は、実施例１４−１７によって説明される。
実施例１４−１７
【０１１５】
【表１９】

【０１１６】
実施例１４−１７において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体９−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１１７】
実施例１８−２１は、ボディウォッシュ製品における本変異体の使用を説明する。
実施例１８−２１
【０１１８】
【表２０】

【０１１９】
実施例１８−２１において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体１４−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１２０】
実施例２２−２５は、フェイスウォッシュ製品における本変異体の使用を説明する。
実施例２２−２５
【０１２１】
【表２１】

【０１２２】
実施例２２−２５において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体２４−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１２３】
実施例２６−２７は、リーブオン皮膚保湿組成物における本変異体の使用を説明する。
実施例２６−２７
【０１２４】
【表２２】

【０１２５】
実施例２６−２７において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体１３−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１２６】
実施例２８は、クレンジングワイプ組成物における本変異体の使用を説明する。
実施例２８
【０１２７】
【表２３】

【０１２８】
上記組成物を、セルロース及び／又はポリエステルで構成された織込み吸収シートに、吸収シートの約２５０重量％で染み込ませる。
実施例２８において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、変異体２０−Ｉと置換すると、実質的に同様の結果となる。[0001]
[Citation of related application]
This application claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 091,911, filed July 7, 1998.
[0002]
[Technical field]
The present invention relates to a mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) and an inhibitor having homology with SSI (SSI-like inhibitor). Such variants are useful with enzymes, particularly proteases, in cleaning and personal care compositions. The present invention also relates to cleaning and personal care compositions comprising the variants of the present invention, as well as the genes encoding the variants.
[0003]
[Background of the Invention]
Enzymes make up the largest class of natural proteins. One type of enzyme is a protease that catalyzes the hydrolysis of other proteins. This ability to hydrolyze proteins has been developed by incorporating natural and protein engineered proteases into cleaning compositions, especially those associated with laundry applications. Further, while less studied, others have incorporated such proteases into personal care compositions. However, even during storage of the composition, or even during expression of the protease, the protease can often degrade itself or degrade other enzymes present in the composition. Because of this degradation, cleaning and personal care compositions are limited in their ability to achieve the intended enhancing performance.
[0004]
Therefore, it is beneficial to incorporate inhibitors of protease activity into the composition to limit protease autolysis and the degradation of others. Provides a reversible inhibitor of the protease so that upon dilution of the composition during cleaning, or in the cleaning environment, the protease is no longer inhibited, but rather is available to hydrolyze proteinaceous soils It is advantageous to do so. Further, such inhibitors must be sufficiently stable to properly perform their inhibitory function.
[0005]
Synthetic protease inhibitors or stabilizers have been disclosed, particularly for such uses in laundry environments. For example, U.S. Pat. No. 5,422,030 (assigned to Panandiker et al., The Procter & Gamble Co., issued Jun. 6, 1995) discloses an aromatic hough for stabilizing enzymes in laundry compositions. An acid ester is disclosed. In addition, U.S. Patent No. 4,566,985 (assigned to Bruno et al., Applied Biochemists, Inc., issued January 28, 1986) proposes the use of benzamidine hydrochloride as an enzyme inhibitor. Such a synthetic approach to inhibition may provide a longer shelf life, but is expensive and cannot improve isolation yield due to proteolysis in the fermentor.
[0006]
Recognizing these drawbacks, those skilled in the art have experimented with using proteinaceous protease inhibitors to stabilize enzymes in cleaning compositions. Nature provides protein-like protease inhibitors to regulate proteases in vivo. However, because these natural proteinaceous protease inhibitors tend to be unstable, their commercial use in the presence of proteases and cleaning and personal care carriers may be somewhat limited.
[0007]
Protein-like protease inhibitors are typically long peptides that bind to the active site of the protease and inhibit its activity. These inhibitors are typically classified into several families (Groups I-IX) on the basis of primary amino acid sequence homology (Laskowski et al., "Protein Inhibitors of Proteinases", Annual Review of Biochemistry. , Vol. 49, pp. 593-626 (1980)). Included among these inhibitors are generally group VI inhibitors (including, for example, eglin and barley chymotrypsin inhibitor), and group III inhibitors (eg, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) and plasminostreptin). It is called.
[0008]
Such inhibitors tend to bind some proteases better to others. Therefore, it is convenient to consider inhibitors with a particular protease in mind. For this reason, the art often considers "protease / peptide inhibitor pairs". One example of a known protease / peptide inhibitor set is subtilisin BPN '/ SSI (e.g., Mitsui et al., "Crystal Structure of a Bacterial Protein Protein Inhibitor Biosolvent Inhibitor, Inc., Streptomyces Inhibitor, Australia). 131, pp. 697-724 (1979), and Hirono et al., "Crystal Structure at 1.6 Å Resolution of the Complex of Substitution in BizTrib. urnal of Molecular Biology, Vol. 178, pp. 389-413 (1984)).
[0009]
SSI is stable in the presence of subtilisin BPN ', as long as the inhibitor is present in an amount sufficient to inhibit total protease activity. However, it has been suggested that inhibitors with high affinity for proteases do not dissociate upon dilution in a laundry environment (WO 92/03529, Mikkelson et al., Assigned to Novo Nordisk A / S; March 1992. Published on March 5th, see).
[0010]
However, the binding constant of the inhibitor (K _i If) provides some protease activity in the cleaning composition containing the enzyme / inhibitor set, the inhibitor in the composition as well as the enzyme may be hydrolyzed. Thus, it would be advantageous to find variants of SSI or other inhibitors that are appropriately stable in the presence of proteases, and cleaning and personal care compositions. Furthermore, these inhibitors preferably have a preferred K for the particular protease to be inhibited. _i Having. Such a K _i Need to be able to inhibit proteases in the final composition and during its storage. However, upon dilution of the cleaning or personal care composition, or during the cleaning step, the proteases and inhibitors need to dissociate, allowing the activity of non-inhibitory proteases.
[0011]
Kojima et al. (“Inhibition of Subtilisin BPN 'by Reaction Site P1 Mutants of Streptomyces Subtilisin Inhibitor, Subsidiary of Biotechnology, Subs. K of the P1 position (position 73) mutant _i Was devised and measured. As another example, Mikkelsen et al. Disclose a mutation in a group VI inhibitor that is said to reduce binding affinity. WO 93/17086 (assigned to Nielsen et al., Novo Nordisk A / S; published September 2, 1993) discloses a mutation to plasminostreptin that is said to reduce binding affinity.
[0012]
However, the stability of such protease inhibitors was questionable. WO 98/13387 (Correa et al., Assigned to The Procter & Gamble Co., published April 2, 1998) (corresponding to US Patent Application No. 60 / 026,944) is disclosed as providing increased stability. Are disclosed.
[0013]
Despite the various approaches described in the art, there remains a need for more stable and effective protease inhibitors useful in cleaning and personal care compositions. The present invention provides that SSI inhibitors, SSI-like inhibitors and variants thereof are readily hydrolyzed between positions 63 and 64 corresponding to SSI, for example, during expression and / or in cleaning and personal care compositions. Surprisingly discovered that Thus, we provide herein variants of SSI inhibitors and SSI-like inhibitors that are modified by substitution of amino acid residues, particularly at position 63. Such substitutions confer increased stability on the protease inhibitor. Such inhibitors are further advantageous for binding proteases at the preferred levels as defined herein. Accordingly, the present invention provides proteinaceous protease inhibitor variants that have greater proteolytic stability, especially in cleaning and personal care compositions, and a lower affinity for proteases than the corresponding parent inhibitor.
[0014]
[Summary of the Invention]
The present invention relates to a variant having a modified amino acid sequence of the parent amino acid sequence, wherein the modified amino acid sequence includes an amino acid substitution at position 63 corresponding to SSI, and the parent amino acid sequence is SSI, an SSI-like inhibitor, Mutants selected from the group consisting of mutants of SSI-like inhibitors. Such variants are useful, for example, for inhibiting proteases, particularly during storage or expression. The present invention also relates to genes encoding such variants, as well as cleaning and personal care compositions that include such variants.
[0015]
[Detailed description of the present invention]
The essential components of the present invention will now be described below. A non-limiting description of various optional and suitable ingredients useful in embodiments of the present invention is also included.
[0016]
The invention includes, consists of, and can consist essentially of any of the essential or optional components and / or limitations described herein.
All percentages and ratios are by weight unless otherwise indicated. All percentages are calculated on a total composition basis unless otherwise indicated.
Here, trade names are referenced for substances including but not limited to proteases and optional components. We do not intend here to restrict the substance to a given trade name. Substances equivalent to those referred to by trade names (eg, different names or catalog (reference) numbers, obtained from different sources) may be substituted in the compositions herein, and Is also good.
[0017]
All ingredient and composition levels are based on the activity level of the ingredient or composition, and exclude impurities, such as residual solvents or by-products, which may be present in commercial sources.
All documents referred to herein include all patents, patent applications, and printed publications, which are incorporated by reference in their entirety.
As used herein, abbreviations are used to describe amino acids. Table 1 is a list of abbreviations used here.
[0018]
[Table 1]

[0019]
Definition
As used herein, the term "mutation" refers to changes in gene sequences and the amino acid sequences produced by those gene sequences. Mutations can be deletions, substitutions or additions of amino acid residues relative to the wild-type or parent sequence.
[0020]
The term "parent" as used herein refers to a protease, protease inhibitor, protein or peptide, wild-type or variant that does not have an amino acid substitution at position 63 corresponding to SSI (ie, position 63). Amino acid substitutions occur naturally). An example of these parents is an inhibitor known as Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) (represented by SEQ ID NO: 1). SSI further, Ikenaka like are described by ( "Amino Acid Sequence of an Alkaline Proteinase Inhibitor (Streptomyces Subtilisin Inhibitor) from Streptomyces albogriseoulus S-3253", Journal of Biochemistry, Vol. 76, pp. 1191-1209 (1974)) I have. As used herein, SSI amino acid numbers are those of Ikenaka and the like. We use synthetic SSI genes designed to be rich in adenine and thymine, as well as B. subtilis DNA. This synthetic gene encodes four extra amino acid residues at the amino terminus of the peptide by the expression plasmid construction method. This modified amino acid sequence, including these four additional amino acids, is represented by SEQ ID NO: 2.
[0021]
As used herein, the term "wild type" refers to a protein or peptide produced by a non-mutated organism, particularly a protease or protease inhibitor, herein.
[0022]
As used herein, the term "variant" refers to a protein or peptide having an amino acid sequence that differs from that of the parent protease inhibitor or protease, respectively, and, in particular, herein, a protease inhibitor or protease.
[0023]
Mutants of the invention
The present inventors have discovered variants of protease inhibitors that are more stable, for example, in vitro and in the presence of cleaning and personal care composition materials. In addition, such variants are similarly more stable in vivo and may therefore increase protease yield from the organism.
[0024]
We have found that the preferred binding constants (K) that provide adequate inhibition of the protease during growth, harvest, purification, storage, and during the cleaning process. _i ) Was also found. Such preferred linkages provide better stability and longer shelf life.
[0025]
The variants of the present invention have improved stability to proteases and inhibit proteases in cleaning or personal care compositions, but dissociate upon dilution in a cleaning environment.
[0026]
The variants of the present invention have a modified amino acid sequence of the parent amino acid sequence, wherein the modified amino acid sequence is at position 63 corresponding to a Streptomyces subtilisin inhibitor (referred to herein as SSI). Includes amino acid substitutions, wherein the parent amino acid sequence is selected from SSI, SSI-like inhibitors, variants of SSI and variants of SSI-like inhibitors. The substitution at position 63 corresponding to SSI can be with any amino acid residue that confers increased stability on the parent amino acid sequence. Most preferably, the substitution at position 63 corresponding to SSI is with isoleucine. Such a variant may be designated as “L63I”. In describing this variant, the original amino acid that occurs in the parent amino acid sequence is shown first, the position number is shown second, and the substituted amino acid is shown third. Therefore, L63I means that leucine (L) that appeared as the 63rd amino acid position (position 63) in the original inhibitor SSI replaces isoleucine (I). The position numbers correspond to Ikenaka et al. (Supra) (SEQ ID NO: 1), ignoring the four additional amino acid residues present at the amino terminus of the synthetic SSI (SEQ ID NO: 2). Such expressions for other substitutions recited herein are set forth in a certain format.
[0027]
Variants are not limited herein to the SSI substituted at position 63. Rather, the substitution at position 63 can also be made in the parent amino acid sequence (including, of course, the nucleotide sequence encoding that amino acid sequence), in which case the parent can itself replace the SSI, SSI-like inhibitor or SSI-like inhibitor. Mutant. More preferred parent amino acid sequences include SSI and variants of SSI. The most preferred parent amino acid sequence is a variant of SSI. Mutants of SSI are described in, for example, Kojima et al., "Inhibition of Subtilisin BPN 'by Reaction Site P1 Mutants of Streptomyces Substitutional Institutional Biotechnology, Journal of Biotechnology. 109 pp. 377-382 (1991); Tamura et al., "Mechanisms of Temporary Inhibition in Streptomyces Subtilisin Inhibitor Indeed, Conducted by Biopharmaceuticals, Int. 30, pp. 5275-5286 (1991); JO3099-099-A (assigned to Tsumura & Co., published on September 12, 1989); U.S. Patent No. 5,674,833 (assigned to Mikkelsen et al., Novo Nordisk A / S). Published October 7, 1997) and WO 93/17086 (assigned to Nielsen et al., Novo Nordisk A / S; published September 2, 1993). Other variants of SSI are disclosed in U.S. Patent Application Serial No. 60 / 026,944 (Correa et al., WO 98/13387, assigned to The Procter & Gamble Co., published April 2, 1998). Such variants are collectively described herein as "Group A inhibitors." Preferred variants of SSI (for use herein as the parent amino acid sequence) are Group A inhibitors. More preferred variants useful herein as the parent amino acid sequence are listed in Tables 2-6 below. Again, all the position numbers correspond to the SSI, as described by Ikenaka et al.
[0028]
[Table 2]

[0029]
[Table 3]

[0030]
[Table 4]

[0031]
[Table 5]

[0032]
[Table 6]

[0033]
Thus, examples of variants of the present invention may be described as, but not limited to, variant 1, variant 2 and the like. In this case, for example, mutant 1 is L63 ^* + D83C, " ^* Represents any amino acid other than that naturally occurring at the position corresponding to 63 in the SSI, and variant 1-I can be represented as L63I + D83C. Accordingly, preferred variants of the present invention are listed in Table 7 below. More preferred among the variants listed in Table 7 are those having an isoleucine substituted at position 63.
[0034]
[Table 7]

[0035]
[Table 8]

[0036]
Other preferred parent amino acid sequences include those containing a substitution at position 62 corresponding to SSI herein. The substitution at position 62 can be any amino acid residue other than that naturally occurring in the parent (in the case of SSI, the natural amino acid residue is alanine). Preferably, the substituted amino acid at position 62 is Lys, Arg, Glu, Asp, Thr, Ser, Gln, Asn and Trp, more preferably Lys, Arg, Glu, Asp, Thr, Ser, Gln and Asn, more preferably Is selected from Lys, Arg, Glu and Asp, more preferably from Lys and Arg, most preferably Lys. Preferred parent amino acid sequences herein have a substitution at position 62 in addition to the substitutions listed in Tables 2-6. An example of such a parent is parent X-A62 ^* Where "X" corresponds to the parents illustrated in Tables 2-6. Therefore, the parent 6-A62 ^* Is A62 ^* + M73P + D83C + S98A. Similarly, parent 6-A62K corresponds to A62K + M73P + D83C + S98A. Similarly, an exemplary variant of the invention is a variant 6-IA62 ^* And this is A62 ^* + L63I + M73P + D83C + S98A. Thus, mutant 6-IA62K corresponds to A62K + L63I + M73P + D83C + S98A. In this manner, Table 8 lists other preferred variants of the invention.
[0037]
[Table 9]

[0038]
[Table 10]

[0039]
[Table 11]

[0040]
[Table 12]

[0041]
Other preferred parent amino acid sequences useful in the present invention (which are variants of SSI) include those having a single substitution at position 98 corresponding to SSI, as well as two substitutions, one at position 62 and one at position 98. Are included. Table 9 lists preferred parent amino acid sequences of this type.
[0042]
[Table 13]

[0043]
Corresponding examples of the variants of the present invention are listed in Table 10 below.
[0044]
[Table 14]

[0045]
SSI may exist in dimeric form. Thus, without being bound by theory, stabilization of the dimeric SSI results in increased protease resistance to excess protease. Preferably, the stabilized dimeric SSI variant consists of two SSI variant monomers covalently linked together. This can generally occur on amino acids and their side chains by esters, amides, disulfides or other bonds. Thus, "covalent dimerization" and "covalent stabilization" refer to such covalently linked monomers that form dimers. Preferably, this dimerization occurs via a disulfide bond. Variants of the present invention, whether by intramolecular or intermolecular forces, are intended to include those that exist in dimeric forms.
[0046]
Other parent amino acid sequences useful herein include SSI-like inhibitors (often called SSI-like (SIL) proteins) and variants of SSI-like inhibitors. Background information relating to SSI-like inhibitors is provided by Laskowski et al., "Protein Inhibitors of Proteases", Annual Review of Biochemistry, Vol. 49, pp. 593-626 (1980). Suitable SSI-like inhibitors have an amino acid sequence identity with SSI of greater than about 50%, preferably greater than 65%, more preferably greater than 70%, and preferably the inhibitor may be classified as a group III inhibitor. See Laskowski et al., Supra. Examples of such SSI-like inhibitors include SIL10 (this sequence is listed as SEQ ID NO: 4), SIL13 (SEQ ID NO: 5) and SIL14 (SEQ ID NO: 6) (each of which is described in Terabet et al., “ The Tree Novel Subtilisin-Trypsin Inhibitors from Streptomyces: The sequences described in the Primary Structures and Inhibitory Properties are described in the following sequences: "IL", "Journal. SIL3 (SEQ ID NO: 10) and SIL4 (SEQ ID NO: 11) (each of which is Taguchi et al.) . Al, "Comparative Studies on the Primary Structures and Inhibitory Properties of Subtilisin-trypsin Inhibitors from Streptomyces", European Journal of Biochemistry, Vol 220, pp 911 -.. 918 are further described in the (1994)) are included. Two other examples of such SSI-like inhibitors include STI1 (this sequence is listed as SEQ ID NO: 7) and STI2 (SEQ ID NO: 8), which are described in Strickler et al. , "Two Novel Streptomyces Protein Protein Inhibitors", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 267, no. 5, pp. 3236-3241 (1992). Another SSI-like inhibitor is known as plasminostreptin (this sequence is listed as SEQ ID NO: 12), and is described by Sugino et al. Vol. 253, no. 5, pp. 1546-1555 (1978). Yet another SSI-like inhibitor is SLPI (this sequence is listed as SEQ ID NO: 13) and is described in Ueda et al. , "A Protease Inhibitor Produced by Streptomyces lividans 66 Exhibits Inhibitory Activities Activities, Both Bottom of the Registry, BTN 'and New Trial in BTN' and Free Trial in BPN 'and New Trib. 112, pp. 204-211 (1993). Yet another SSI-like inhibitor is SACI (this sequence is listed as SEQ ID NO: 14), which is described by Tanabet et al., "Primary Structure and Reactive Site of Streptoverticillium nitrocelloBactilog itarovitrognoborg.com. Streptoverticillium cinnamoneum subsp. Cinnamoneum ", Journal of Biochemistry, Vol. 115 pp. 752-761 (1994). Yet another SSI-like inhibitor is SIL1 (this sequence is listed as SEQ ID NO: 15), which is described by Kojima et al. 1207, pp. 120-125 (1994). Other SSI-like inhibitors are disclosed by Taguch et al., "High Frequency of SSI-Like Protease Inhibitors Amon Streptomyces", Bioscience, Biotechnology, and biotechnology, and ed. 57 pp. 522-524 (1993), Taguchi et al., "Streptomyces Subtilisin Inhibitor-Like Proteins Are Distributed Widley in Streptomyces, Applied International Associates. 4338-4341 (Dec. 1993), and Suzuki et al., "Partial Amino Acid Sequence of an Alkaline Protease Inhibitor", Agricultural Biological Chemistry. 45 pp. 629-634 (1981). Still other SSI-like inhibitors have been described in the art, as those skilled in the art will appreciate.
[0047]
Variants of SSI-like inhibitors can also be used herein as the parent amino acid sequence. Such variants include those having one or more mutations in the amino acid sequence of the selected SSI-like inhibitor, as described herein above. In particular, all of the substitutions exemplified for the variants set forth herein may be made at corresponding positions in the SSI-like inhibitor to provide the parent amino acid sequence. Other examples of mutants of SSI-like inhibitors that can be used as the parent amino acid sequence are disclosed in WO 93/17086 (Nielsen et al., Assigned to Novo Nordisk A / S; published September 2, 1993). It is not limited to.
[0048]
As the skilled artisan will appreciate, using its original numbering, position 63 (for example) of an SSI-like inhibitor, a variant thereof, or a variant of SSI may not correspond to position 63 of SSI. Thus, as will be readily understood in the art, the SEQ ID NO may require adjustment to locate a position corresponding to position 63 (for example) of the SSI. Sequence alignments are readily found in the references cited herein, as well as in other references in the art.
[0049]
Preferably, the variant of the invention allows the variant to inhibit almost all proteases (preferably greater than about 60%, more preferably about 99%) in a cleaning or personal care composition, However, a K that allows the mutant to dissociate from the protease during dilution and / or during the cleaning step _i Is shown.
[0050]
For example, if a 2: 1 stoichiometric variant-to-protease is used, the inhibitor will have about 10-10 ^-12 M to about 10 ^-4 M, more preferably about 10 ^-10 M to about 10 ^-6 M, most preferably about 10 ^-8 M to about 10 ^-7 M's K _i Preferably. Of course, if the size of the washing machine or the concentration of the product changes, K _i Is adjusted accordingly. Useful K _i Estimation of range may be compromised by considering parameters such as dilution of the composition at the time of use, temperature dependence of the binding constants associated with the temperature of the cleaning method used, stoichiometry of protease inhibitors, etc. Without experimentation, it is easily determined by the skilled artisan.
[0051]
Since the variant is ultimately encoded by the DNA in vivo, the DNA can be used to determine the sequence of the variant. The DNA encoding the variant can be used in any number of plasmids and / or expression systems, examples of which include in vitro expression systems and in vivo systems, such as plants (preferably bio Those used in technology, for example, tobacco, oilseed plants, for example, rapeseed, soybeans, cereals, for example, corn, barley, oats, other vegetables, for example, tomatoes, potatoes, etc.) and microorganisms, for example fungi, for example Examples include yeasts and bacteria, for example, Bacillus, Escherichia coli, and the like. Preferably, the expression system is a microorganism, more preferably a natural bacterium, most preferably an E. coli or Bacillus, more preferably a Bacillus bacterium.
[0052]
The DNA encoding the mutant may be incorporated into a plasmid or phage and active in the cell, or may be integrated directly into the genome of the organism used to clone or express the mutant of the present invention.
[0053]
In view of the description of the present invention, those skilled in the art will recognize that the DNA used to encode the variants of the present invention may be located on the same plasmid, phage or chromosome as other variants of the present invention. Should be understood. In addition, such plasmids, phages or chromosomes may also encode proteases, including fusion proteins that include inhibitors and / or proteases as part of the fusion protein, which may or may not be inhibited by the variants of the present invention. I can do it.
[0054]
It is well understood by those skilled in the art that the DNA also contemplates and discloses RNA transcripts of the DNA. Those skilled in the art can, of course, know the RNA sequence by testing the DNA sequence without experimentation.
[0055]
The present invention also relates to genes encoding the variants of the present invention.
It is also contemplated that one of skill in the art may wish to prepare antibodies against the variants of the present invention. These antibodies can be prepared using known methods.
For example, the variants of the present invention can be injected into a suitable mammalian subject, eg, a mouse, rabbit, and the like. A suitable protocol involves repeated injections of the immunogen in the presence of an adjuvant according to a schedule that enhances the production of antibodies in the serum. The titer of immune sera can be readily determined using the variants of the invention as antigen and using immunoassays, which are the current standard in the art.
[0056]
The obtained antiserum can be used directly, or the peripheral blood lymphocytes or spleen of the immunized animal can be collected, the antibody-producing cells immortalized, and then an appropriate antibody producer can be identified using standard immunoassay techniques. As a result, a monoclonal antibody is obtained.
[0057]
In that case, polyclonal or monoclonal preparations are useful for monitoring expression of the invention using standard assays. Thus, it is also contemplated that kits can be prepared using these antibodies for use in determining expression levels and the like.
[0058]
Such antibodies can also be conjugated to scintigraphic labels, for example, technetium-99 or 1-131 or fluorescent labels, using standard conjugation techniques. Labeled antibodies can also be used in competitive assays, eg, K _i Can also be used in kinetic assays used to determine
[0059]
As is recognized in the art, DNA and amino acid sequencing methods sometimes introduce errors. As a result, one of ordinary skill in the art to reproduce our work from the disclosure herein will be able to use routine skill to find any sequencing errors and make changes where appropriate.
[0060]
Manufacturing and usage
The following examples do not limit the invention in any way, but rather provide those skilled in the art with guidance on how to make and use the invention. Given the guidance of the examples, other disclosures herein, and information readily available to those skilled in the art, those skilled in the art will be able to make and use the invention. In short, exhaustive details of the technology, techniques known in the art, and the like, are eliminated because they are well within the skill of those in the art.
Variants can be produced by mutating the nucleotide sequence encoding the parent amino acid sequence, thereby obtaining a variant having an altered amino acid sequence. Such methods are well known in the art, and one such method is described below.
[0061]
A phagemid containing the gene corresponding to the parent amino acid sequence was used to transform Escherichia coli dut-ung-strain CJ236, and a single-stranded uracil-containing DNA template was used as described in "Site-Directed in vitro Mutagenesis Uracil-U. Containing DNA and Phasemid Vectors ", Directed Mutagenesis-A Practical Approach, McPherson, M.C. J. ed. , P27-48 (1991), a VCSM13 helper phage (Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis With Without Phenotypic Selection", using a 3rd ed. Generate. Zoller, M .; J. , And M.S. Smith et al., "Oligonucleotides-Directed Mutagenesis Using M13-Derived Vectors: An Efficient and General Promotion Program for the Promotion of Promotion of DNA." 10, relocated mutated primers modified by the method described in p. 6487-6500 (1982) are used to generate all variants (essentially as provided by Yuckenberg et al., Supra). You.
[0062]
Oligonucleotides are made using a 380B DNA synthesizer (Applied Biosystems Inc.). The mutagenesis reaction product is transformed into E. coli strain MM294 (American Type Culture Collection E. coli 33625). All mutations were confirmed by DNA sequencing, and the isolated DNA was transformed into the Bacillus subtilis expression strain PG632 (Saunder et al., "Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site fore- sacrifice sacrifice bacillus sacrifice sacrifice sacrifice sacrifice sac Amino acid Fragment of Human Parathyroid Hormone ", Gene, Vol. 102, pages 277-282 (1991), and Yang et al.," Cloning of the Neutral Protease in the Gutters of the Gutters of the Chemicals. Tro-Derived Deletion Mutation "Journal of Bacteriology, Vol. 160, pp. 15-21 (1984)).
[0063]
The mutant preparation is made as follows: 20 g / l tryptone, 20 g / l yeast extract and 5 g / l sodium chloride, 1.25% maltrin M100 (Grain Processing Corporation, Muscatine). IA), 100 mM HEPES, pH 7.5, 80 μM MnCl ₂ And Bacillus subtilis containing the plasmid of interest in a medium supplemented with 50 μM kanamycin. The culture is incubated at 37 ° C. for 24 hours.
[0064]
The mutants are purified by first removing the cells by centrifugation. The pH is reduced to about 4 by adding 1N HCl. Pellet the insoluble material by centrifugation. Typically, the mutant is found in the supernatant. Next, the supernatant is dialyzed against 20 mM sodium acetate, pH 4. Variants typically precipitate at this step. Both precipitates are resuspended in Tris base and assayed for inhibition of the Y217L derivative of subtilisin BPN '. In some cases, the mutant remains soluble during these precipitation steps. In such cases, the soluble fraction is separated on an S Sepharose column and run in 20 mM sodium acetate, pH 4. Samples are eluted with increasing concentrations of sodium chloride and assayed for protease inhibition. In all cases, the mutant-containing fraction is dialyzed against 1 mM Tris, pH 8.0 before use.
[0065]
Characterization of variants of the invention
SSI inhibits, inter alia, subtilisin BPN 'and the Y217L variant of subtilisin BPN'. The inhibitory activity of the mutant of the present invention is measured using, for example, SSI as follows. SSI is mixed with protease, 0.1 M Tris, pH 8.6, 10 mM CaCl ₂ For 15 minutes at room temperature in the presence of. Next, the protease activity is measured using the method of DelMar et al. (Analytical Biochemistry, Vol. 99, pp. 316-320 (1979)). The reaction is started by adding 10 μL of N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (20 mg / mL). The reaction rate is determined by the increase in absorbance at 410 nm, which indicates protease inhibition. The inhibitory properties of the variants according to the invention are likewise determined.
[0066]
Because it is desirable to incorporate a variant of the invention with the protease in a cleaning or personal care composition (suitable proteases are described later herein), the stability in the product environment is also examined. Mutant stability can be monitored by measuring protease activity over time. If the mutant is stable, the level of protease activity is constant. However, if the mutant is destroyed, the protease activity will increase. In this example, the mutant is mixed with 1.1 nmol of the subtilisin BPN 'mutant having a Y217L substitution. Water is added so that the volume of all samples is the same. The complex is formed in 10 minutes in a liquid detergent composition made according to the following formulation.
[0067]
[Table 15]

[0068]
This composition makes up one third of the total sample volume. Fifteen microliters of the sample was combined with 975 μL of 0.1 M Tris HCl, pH 8.6, 0.01 M CaCl ₂ Mix with. The dilution is incubated for 30 minutes at room temperature. After incubation, the substrate is added and the amount of protease is measured. Degradation of the mutant is detected by an increase in protease activity over several weeks. Such a decomposition can be compared directly with, for example, the case of SSI.
[0069]
Mutant K _i Is determined as follows. The mutant and 600 μg / mL of succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide are mixed with 990 μL of 50 mM Tris, pH 8 solution. The reaction is initiated by the addition of a selected protease (suitable proteases are described later herein). The hydrolysis rate is followed for 20 minutes. During the last 10-15 minutes, a constant rate is observed. This rate was compared to the rate in the absence of the mutant, and Goldstein (“The Mechanism of Enzyme-Inhibitor-Substrate Reactions”, Journal of General Physiology, Vol. 5, p. 29, Vol. 27, Vol. 27, Vol. 27, No. 5, p. 29, Vol. 27, p. 27, p. 5, p. 29, p. 27, p. 29, p. 27, p. 29, p. K by the equation _i Is used to calculate
[0070]
Cleaning composition of the present invention
In another embodiment of the present invention, an effective amount of one or more variants of the present invention is contained in a cleaning composition useful for cleaning various surfaces that require peptide stain removal. . Such cleaning compositions include, but are not limited to, textile cleaning compositions, hard surface cleansing compositions, light duty cleaning compositions, such as dishwashing compositions, and automatic dishwashing detergent compositions. Not done.
[0071]
The cleaning composition herein includes an effective amount of one or more variants of the invention and a cleaning composition carrier, wherein the carrier comprises a protease. As used herein, expressions such as "effective amount of variant" and the like refer to the amount of variant required to achieve the required proteolytic activity in a particular cleaning composition. Such an effective amount is readily determined by those skilled in the art, and depends on a number of factors, such as the particular variant used, the cleaning application, the particular composition of the cleaning composition, and the desirability of liquid or dry ( (E.g., granules, rods) compositions and the like. Preferably, the cleaning composition comprises one or more of about 0.0001% to about 10%, more preferably about 0.001% to about 1%, and most preferably about 0.01% to about 0.1%. The above-mentioned mutants of the present invention are included. Some examples of various cleaning compositions in which the variants may be used are discussed in further detail below.
[0072]
The variants of the present invention inhibit the protease therein during storage, thereby preventing the protease from autolyzing or hydrolyzing by other sources such as additional enzymes present in the composition. To be useful in cleaning compositions. Therefore, an essential component in the cleaning composition of the present invention is a protease, which is inhibited by the mutant of the present invention. The protease is of animal, plant, or preferably microbial origin. Preferred proteases include those in which SSI is an inhibitor. Such proteases include, for example, Bacillus alcalophilus, starch liquefied bacillus (Bacillus amyloliquefaciens), Bacillus amylosaccharicus, Bacillus licheniformis, microorganisms produced by Bacillus lentus, and Bacillus bacillus produced by Bacillus ltus bacillus. Among such proteases, preferred are, for example, subtilisin BPN, subtilisin BPN ', subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, subtilisin 309, proteinase K and thermitase, such as A / S Alcalase (trade name) (Novo Industries) , Copenhagen, Denmark, Esperase (trade name) (Novo Industries), Savinase (trade name) (Novo Industries), Maxatase (trade name) (Gist-Brocades, Delft, Netherlands, trade name), Maxacals (trade name) ), Maxapem 15 (trade name) (Gist-Brocades) and the aforementioned mutants. Particularly preferred proteases for use herein include those obtained from starch liquefied Bacillus (Bacillus amyloliquefaciens) and variants thereof. The most preferred wild-type protease is subtilisin BPN '.
[0073]
Mutants of subtilisin BPN '(hereinafter collectively referred to as "Group A proteases") are useful as proteases herein and are described in U.S. Patent No. 5,030,378 (Venegas, July 9, 1991). And subtilisin BPN 'amino acid sequence (the sequence is represented by SEQ ID NO: 3) having the following mutations:
(A) Gly at position 166 is replaced with Asn, Ser, Lys, Arg, His, Gln, Ala or Glu; Gly at position 169 is replaced with Ser; Met at position 222 is Gln, Phe, His, Substituted with Asn, Glu, Ala or Thr;
(B) Gly at position 160 is replaced with Ala, and Met at position 222 is replaced with Ala.
[0074]
Another variant of subtilisin BPN '(hereinafter collectively referred to as "group B protease") is useful as a protease herein and is described in EP-B-251,446 (Genencor International, Inc., published Jan. 7, 1988, granted on Dec. 28, 1994) and has a mutation at one or more of the following positions: wild-type BPN 'amino acid sequence: Tyr21, Thr22 , Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, Ser101, Gly102, Gly103, Ile107, Gly110, Met124, Gly127, Gly128, Pro129, Leu135. 0, Tyr171, Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr214, Gly215 and Ser221; or two or more and Asp32 positions listed above, Ser33, Tyr104, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 And Met222.
[0075]
Another preferred subtilisin BPN 'variant useful as a protease herein is hereinafter collectively referred to as "Group C Protease" and is assigned to WO 95/10615 (Genencor International, Inc .; April 20, 1995). Published), characterized in that the mutation for position Asn76 comprises a wild-type subtilisin BPN 'amino acid sequence having a combination with a mutation at one or more other positions selected from the group consisting of: Asp99, Ser101, Gln103, Tyr104, Ser105, Ile107, Asn109, Asn123, Leu126, Gly127, Gly128, Leu135, Glu156, Gly166, Glu195, Asp197, Ser204, Gln206, Pro21 0, Ala216, Tyr217, Asn218, Met222, Ser260, Lys265 and Ala274.
[0076]
Other preferred subtilisin BPN 'variants useful herein as proteases (hereinafter collectively referred to as "Group D proteases") are described in U.S. Patent No. 4,760,025 (Estell et al., July 1988). 26) and has a mutation for one or more amino acid positions selected from the group consisting of Asp32, Ser33, His64, Tyr104, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 and Met222. It is characterized by a subtilisin BPN 'amino acid sequence.
[0077]
As used herein, more preferred proteases are selected from the group consisting of Alcalase (trade name), subtilisin BPN ', Group A protease, Group B protease, Group C protease and Group D protease. Most preferred proteases are selected from Group D proteases.
[0078]
The compositions of the present invention comprise from about 0.0001% to about 1%, preferably from about 0.0005% to about 0.2%, most preferably about 0.002% by weight of the composition. From about 0.1% by weight of active protease. A mixture of proteases may also be included. Of course, the weight percentage of protease in the cleaning composition can vary depending on the water content, builder content, etc. of the finished composition. For example, for a granular detergent, it is desirable that the protease in the composition be from about 0.064 mg / g to about 0.64 mg / g.
[0079]
In a preferred embodiment, the preferred molar ratio of variant to protease in the cleaning composition (variant to protease ratio) is from about 3: 1 to about 1: 1, more preferably from about 3: 1 to about 1.5: 1, most preferably about 2: 1.
[0080]
In addition to the variants of the present invention, the present cleaning compositions further comprise a cleaning composition carrier comprising one or more cleaning composition materials that are compatible with the variant and / or protease. The term "cleaning composition material" as used herein is selected for the particular type of cleaning composition desired and the form of the product (eg, liquid, granule, bar, spray, stick, paste, gel). Any substances are meant, which are also compatible with the variants used in the composition. The particular choice of cleaning composition material is readily made by considering the material to be cleaned, the desired form of the composition for the cleaning conditions in use. The term "compatible", as used herein, does not render the cleaning composition material effective in inhibiting the mutant and / or proteolytic activity of the protease as desired during normal use of the protease. It does not decrease to the extent. Specific cleaning composition materials are exemplified in detail below.
[0081]
The variants of the present invention can be used in various detergent compositions where high foaming and good cleansing activity are desired. Thus, the variants can be used with a variety of conventional ingredients to provide well formulated hard surface cleaners, dishwashing compositions, textile laundry compositions, and the like. Such compositions can be in the form of liquids, granules, rods and the like. Such compositions can be formulated as "concentrated" detergents containing from about 30% to about 60% by weight of the surfactant.
[0082]
The cleaning compositions herein may optionally and preferably contain various surfactants, such as anionic, nonionic or zwitterionic surfactants. Such surfactants are usually present at a level of about 5% to about 35% of the composition.
[0083]
Non-limiting examples of surfactants useful herein include the conventional C ₁₁ -C ₁₈ Alkyl benzene sulphonates and primary and random alkyl sulphates, of the formula CH ₃ (CH ₂ ) _x (CHOSO ₃ ) ⁻ M ⁺ ) CH ₃ And CH ₃ (CH ₂ ) _y (CHOSO ₃ ) ⁻ M ⁺ ) CH ₂ CH ₃ C ₁₀ -C ₁₈ Secondary (2,3) alkyl sulfates wherein x and (y + 1) are integers of at least about 7, preferably at least about 9, and M is a water-soluble cation, especially sodium, C ₁₀ -C ₁₈ Alkylalkoxysulfate (especially EO1-5 ethoxysulfate), C ₁₀ -C ₁₈ Alkyl alkoxycarboxylates (especially EO1-5 ethoxycarboxylate), C ₁₀ -C ₁₈ Alkyl polyglycosides, and their corresponding sulfated polyglycosides, C ₁₂ -C ₁₈ α-sulfonated fatty acid ester, C ₁₂ -C ₁₈ Alkyl and alkylphenol alkoxylates (especially ethoxylates and mixed ethoxy / propoxy), C ₁₂ -C ₁₈ Betaine and sulfobetaine ("sultaine"), C ₁₀ -C ₁₈ Amine oxide and the like are included. Alkyl alkoxy sulphates (AES) and alkyl alkoxy carboxylates (AEC) are preferred here. The use of such surfactants in combination with amine oxide and / or betaine or sultaine surfactants is also preferred, depending on the wishes of the formulator. Other conventional useful surfactants are listed in standard text. Particularly useful surfactants include C ₁₀ -C ₁₈ No. 5,194,639 issued to Connor et al. On Mar. 16, 1993.
[0084]
A wide variety of other ingredients useful in the present cleaning compositions include, for example, other active ingredients, carriers, hydrotropes, processing aids, dyes or pigments, and solvents for liquid formulations. If further enhancement of foaming is desired, a foaming enhancer such as C ₁₀ -C ₁₆ Alcolamides can be incorporated into the composition, usually at a level of about 1% to about 10%. C ₁₀ -C ₁₄ Monoethanol and diethanolamide describe a common class of such foam enhancers. The use of such foam enhancers with high foaming co-surfactants, such as amine oxides, betaines and the sultaines described above, is also effective. If desired, soluble magnesium salts such as MgCl ₂ , MgSO ₄ Etc. can usually be added at a level of about 0.1% to about 2% to provide additional frothing.
[0085]
The liquid detergent compositions herein may include water and other solvents as carriers. Suitable are low molecular weight primary or secondary alcohols, exemplified by methanol, ethanol, propanol and iso-propanol. Monohydric alcohols are suitable for soluble surfactants, but polyols such as those having about 2 to about 6 carbon atoms and about 2 to about 6 hydroxy groups (eg, 1,3-propanediol, ethylene glycol, Glycerin and 1,2-propanediol) can also be used. The compositions may contain from about 5% to about 90%, usually from about 10% to about 50% of such carriers.
[0086]
The detergent compositions herein will preferably be formulated such that the wash water has a pH between about 6.8 and about 11 during use in an aqueous cleaning operation. The final product is usually formulated in this range. Techniques for adjusting pH to recommended use levels include, for example, the use of buffers, alkalis, and acids. Such techniques are known to those skilled in the art.
When formulating the hard surface cleaning compositions and fabric cleaning compositions of the present invention, formulators will want to use various builders at levels from about 5% to about 50% by weight. Common builders include 1-10 micron zeolites, polycarboxylates such as citrates and oxydisuccinates, layered silicates, phosphates, and the like. Other conventional builders are listed in the standard recipe.
[0087]
Similarly, formulators may wish to use various additional enzymes, such as cellulases, lipases, amylases and proteases, in such compositions, usually at levels of about 0.001% to about 1% by weight. . Various detergency and fabric care enzymes are known in the laundry detergent art.
[0088]
Various bleaching compounds, such as percarbonates, perborates, and the like, can generally be used in such compositions at a level of about 1% to about 15% by weight. If desired, such compositions can also contain a bleaching activator, such as tetraacetylethylenediamine, nonanoyloxybenzenesulfonate, which are also known in the art. Usage levels usually range from about 1% to about 10% by weight.
[0089]
Soil release agents, especially anionic oligoester types, chelating agents, especially aminophosphates and ethylenediamine disuccinates, clay soil removers, especially ethoxylated tetraethylenepentamine, dispersants, especially polyacrylates and polyasparas Tates, whitening agents, especially anionic whitening agents, suds suppressors, especially silicone and secondary alcohols, fabric softeners, especially smectite clays, etc., range from about 1% to about 35% by weight in such compositions. All can be used at the level. Standard recipes and published patents contain numerous detailed descriptions of such conventional materials.
[0090]
Enzyme stabilizers may also be used in the present cleaning compositions. Such enzyme stabilizers include propylene glycol (preferably about 1% to about 10%), sodium formate (preferably about 0.1% to about 1%) and calcium formate (preferably about 0.1% to about 1%). % To about 1%).
Other useful cleaning composition materials include clay stain removers, dispersants, brighteners, suds suppressors, and fabric softeners.
[0091]
The variants are useful in hard surface cleaning compositions. As used herein, "hard surface cleaning composition" refers to liquid and granular detergent compositions for cleaning hard surfaces, such as floors, walls, bathroom tiles, and the like. The hard surface cleaning composition of the present invention typically comprises a surfactant and a water-soluble sequestrant builder. However, for certain specialty products, such as spray window cleaners, surfactants are sometimes not used because they can produce a thin and / or uneven residue on the glass surface.
[0092]
When present, the surfactant component may comprise as much as about 0.1% of the composition herein, but usually the composition will comprise from about 0.25% to about 10%, more preferably about 1%. % To about 5% of a surfactant.
Generally, the compositions may comprise from about 0.5% to about 50% of a detersive builder, preferably from about 1% to about 10%.
[0093]
Preferably, the pH should be in the range of about 7 to about 12. Conventional pH adjusters such as sodium hydroxide, sodium carbonate or hydrochloric acid can be used if necessary.
[0094]
A solvent may be included in the composition. Useful solvents include glycol ethers such as diethylene glycol monohexyl ether, diethylene glycol monobutyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, ethylene glycol monohexyl ether, propylene glycol monobutyl ether, dipropylene glycol monobutyl ether, and diols such as 2,2,4 -Trimethyl-1,3-pentanediol and 2-ethyl-1,3-hexanediol, but are not limited thereto. When used, such solvents are typically present at a level of about 0.5% to about 15%, more preferably about 3% to about 11%.
[0095]
Additionally, highly volatile solvents, such as iso-propanol or ethanol, can rapidly evaporate the composition from the surface if the surface is not rinsed after "sufficient" application of the composition to the surface. Can be used in the present invention to promote When used, volatile solvents are typically present in the compositions at a level of about 2% to about 12%.
[0096]
The variants are also useful as inclusions in the cleaning compositions described below: Rubbingh et al., US Provisional Patent Application No. 60 / 079,477, issued March 26, 1998; March 1998. U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 079,397 to Rubingh et al. Issued on 26th; Weisgerber et al. U.S. Application No. 09 / 048,174 issued March 26, 1998; Weisgerber filed on June 2, 1998 U.S. Patent Application Serial No. 09/088892, which claims priority to U.S. Patent Application Serial No. 09 / 048,174.
[0097]
The hard surface cleaning composition of the present invention is illustrated by the following examples.
Example 1-6
[0098]
[Table 16]

[0099]
In Examples 1-6, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 6-I gives substantially similar results.
[0100]
In another embodiment of the present invention, the dishwashing composition comprises one or more of the variants of the present invention. As used herein, "dishwashing composition" refers to all forms of compositions for cleaning dishes, including, but not limited to, granular and liquid forms. The dishwashing composition of the present invention is illustrated by the following example.
Example 7-10
[0101]
[Table 17]

[0102]
In Examples 7-10, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 7-IA62K gives substantially similar results. Become.
[0103]
The liquid textile cleaning composition of the present invention is described in the following examples.
Examples 11-13
[0104]
[Table 18]

[0105]
In Examples 11-13, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 2-I gives substantially similar results.
[0106]
Personal care composition
The variants are particularly suitable for use in personal care compositions, such as, for example, leave-on and rinse-off hair conditioners, shampoos, leave-on and rinse-off acne compositions, facial milks and conditioners, showers, and the like. Gels, soaps, lathering and non-lathering facial cleansers, cosmetics, hands, facials and body lotions, moisturizers, leave-on facial moisturizers, cosmetics and cleansing wipes, oral care compositions, and contact care compositions. The personal care compositions of the present invention comprise an effective amount of one or more variant compositions of the present invention and a personal care carrier, wherein the personal care carrier comprises a protease. Suitable proteases are described herein for the cleaning composition, including suitable ones. [0107]
To illustrate, the variants of the present invention, along with proteases, are suitable for inclusion in the compositions described in the following references: Linares et al., US Pat. U.S. Pat. No. 5,599,549 issued Feb. 4, 1997 (Skin Cleanser); Ha et al. Issued US Pat. No. 5,599,549 issued Feb. 4, 1997. U.S. Pat. No. 5,540,852 issued Jul. 30, 1996 to Skin Cleanser; Dunbar et al. Issued to U.S. Pat. U.S. Pat. No. 5,612,324 issued March 18, 1997 to Guang Lin et al. Warren et al., U.S. Patent No. 5,587,176 issued December 24, 1996 (pit acne preparation); Venkateswaran U.S. Patent No. 5,549,888 issued August 27, 1996. U.S. Patent No. 5,470,884 issued November 28, 1995 to Corless et al. (Pit acne preparation); U.S. Patent No. 5, issued July 22, 1997 to Gordon et al. No. 5,650,384 (shower gel); Moore et al., U.S. Pat. No. 5,607,678, issued Mar. 4, 1997; Coffinderuffer et al., US Pat. No. 624,666 (hair conditioner and / or shampoo); Bolich et al., Published April 8, 1997. No. 5,618,524 (hair conditioner and / or shampoo); Inman U.S. Pat. No. 5,612,301 issued March 18, 1997 (hair conditioner and / or shampoo); November 1996 Wells U.S. Pat. No. 5,573,709 issued on the 12th (hair conditioner and / or shampoo); Pings U.S. Pat. No. 5,482,703 issued Jan. 9, 1996 (hair conditioner and / or shampoo) Grote et al., U.S. Pat. No. 34,584 (Hair Conditioner and / or Shampoo), reissued Apr. 12, 1994; Date et al., U.S. Pat. No. 5,641, issued June 24, 1997. No. 493 (cosmetics); Blank issued on February 25, 1997 U.S. Pat. No. 5,605,894 (cosmetics); Yoshioka et al., U.S. Pat. No. 5,585,090 (Cosmetics) issued December 17, 1996; Cheney et al. No. 4,939,179 (hand, face and / or body lotion); McAtee et al., U.S. Pat. No. 5,607,980, issued Mar. 4, 1997 (hand, face and / or body lotion); Richter et al., U.S. Pat. No. 4,045,364 (Cosmetics and Cleansing Wipes) issued Aug. 30, 1977; And Cleansing Wipes); Brown-Skrobot et al., Issued December 4, 1990; No. 4,975,217 (cosmetics and cleansing wipes); U.S. Pat. No. 5,096,700 to Seibel issued on Mar. 17, 1992 (mouthwashing composition); Sampathkumar issued on Jul. 2, 1991. U.S. Patent No. 5,028,414 (Mouthwash composition); Benedict et al., U.S. Patent No. 5,028,415 (Mouthwash composition) issued July 2,1991; July 2,1991. U.S. Patent No. 5,028,415 to Benedict et al. (Mouthwash composition); U.S. Patent No. 4,863,627 to Davies et al. Issued September 5, 1989 (contact lens cleaning solution); May 1988. Et al., U.S. Pat. No. 32,672 (contact lens cleaning solution), issued on Sep. 24, 1986; Chafer, U.S. Pat. No. 4,609,493 (contact lens cleaning solution).
[0108]
The variants are also useful as inclusions in personal care compositions described below: Rubingh et al., U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 079,477, issued March 26, 1998; U.S. Provisional Patent Application Ser. No. 60 / 079,397 issued to Rubingh et al. On Mar. 26, 1998; U.S. Ser. Application No. 09 / 048,174 issued to Mar. 26, 1998; filed on Jun. 2, 1998 U.S. patent application Ser. No. 09/088912, which claims priority to U.S. patent application Ser. No. 09 / 048,174 to Weisgerber.
[0109]
To further illustrate the oral cleaning compositions of the present invention, one or more variants of the present invention and one or more proteases are provided in compositions useful for removing proteinaceous soil from teeth or dentures. Contained. "Oral cleaning compositions" as used herein include dentifrices, toothpastes, gel toothpastes, toothpastes, mouthwashes, mouth sprays, mouse gels, chewing gums, medicinal drops, sachets, tablets, biogels, dental Cleaning paste, dental treatment liquid, etc. Preferably, the oral cleaning composition, together with the protease, comprises from about 0.0001% to about 20%, more preferably from about 0.001% to about 10%, even more preferably from about 0. It comprises from 01% to about 5% by weight of one or more of the variants of the invention and a personal care carrier.
[0110]
The personal care carrier component of the oral cleaning component of a typical oral cleaning composition generally comprises from about 50% to about 99.99%, preferably from about 65% to about 99.99%, by weight of the composition. %, More preferably from about 65% to about 99% by weight.
[0111]
The personal care carrier components and optional components that may be included in the oral cleaning compositions of the present invention are those well known to those skilled in the art. A wide variety of composition types, carrier components and optional ingredients useful in oral cleaning compositions are disclosed in the above-cited references.
[0112]
In another embodiment of the present invention, a denture cleaning composition for cleaning extra-oral dentures comprises one or more variants of the present invention along with a protease. Such denture cleaning compositions may contain an effective amount of one or more variants, preferably from about 0.0001% to about 50%, more preferably from about 0.001% to about 35% by weight of the composition. %, More preferably from about 0.01% to about 20% by weight of one or more variants and a personal care carrier. Various denture cleansing composition formats, such as effervescent tablets, etc., are well known in the art (see Young US Pat. No. 5,055,305) and remove proteinaceous soil from dentures. It is generally appropriate to incorporate one or more variants in order to do so.
[0113]
In another embodiment of the present invention, the contact lens cleaning composition comprises one or more variants of the present invention. Such contact lens cleaning compositions may comprise an effective amount of one or more variants, preferably from about 0.01% to about 50%, more preferably from about 0.01% to about 20%, by weight of the composition. %, More preferably from about 1% to about 5% by weight of one or more variants and a personal care carrier. Various contact lens cleaning composition forms, such as tablets, liquids, and the like, are well known in the art and include one or more of the variants of the present invention for removing proteinaceous soil from contact lenses. Incorporation is generally appropriate.
[0114]
Embodiments of the present contact lens cleaning compositions are illustrated by Examples 14-17.
Examples 14-17
[0115]
[Table 19]

[0116]
In Examples 14-17, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 9-I gives substantially similar results.
[0117]
Examples 18-21 illustrate the use of this variant in body wash products.
Example 18-21
[0118]
[Table 20]

[0119]
In Examples 18-21, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 14-I gives substantially similar results.
[0120]
Examples 22-25 illustrate the use of this variant in a face wash product.
Examples 22-25
[0121]
[Table 21]

[0122]
In Examples 22-25, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 24-I gives substantially similar results.
[0123]
Examples 26-27 illustrate the use of this variant in a leave-on skin moisturizing composition.
Examples 26-27
[0124]
[Table 22]

[0125]
In Examples 26-27, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 13-I gives substantially similar results.
[0126]
Example 28 illustrates the use of this variant in a cleansing wipe composition.
Example 28
[0127]
[Table 23]

[0128]
The composition is impregnated into a woven absorbent sheet composed of cellulose and / or polyester at about 250% by weight of the absorbent sheet.
In Example 28, substituting the variants listed in Tables 7, 8 and 10, and especially the preferred variants mentioned herein, with variant 20-I gives substantially similar results.

Claims (10)

A variant characterized by a modified amino acid sequence of the parent amino acid sequence, wherein the modified amino acid sequence is characterized by an amino acid substitution at position 63 corresponding to SSI, and the parent amino acid sequence is SSI, an SSI-like inhibitor, a variant of SSI, A variant selected from the group consisting of variants of SSI-like inhibitors. 2. The variant of claim 1, wherein the amino acid substitution at position 63 corresponding to SSI is with isoleucine. The variant according to any of the preceding claims, wherein the parent amino acid sequence is selected from the group consisting of SSI and variants of SSI. The variants are:
(A) mutants and protease inhibiting proteases in compositions comprising, and (b) shows a K _i that dissociate from the protease upon dilution, mutant as claimed in any one of the preceding claims. The variant of any one of the preceding claims, which exhibits a K _i of about 10 ⁻¹² M to about 10 ⁻⁴ M. A variant according to any one of the preceding claims, selected from the group consisting of:
(A) L63I + D83C;
(B) L63I + M73D;
(C) L63I + M73D + D83C;
(D) L63I + M73P + D83C;
(E) L63I + M70Q + D83C;
(F) L63I + M70Q + M73P + V74F + D83C;
(G) L63I + M70Q + M73P + V74W + D83C;
(H) L63I + M70Q + M73P + D83C + S98A;
(I) L63I + G47D + M73P + V74F + D83C;
(J) L63I + G47D + M73P + V74W + D83C;
(K) L63I + G47D + M73P + D83C + S98A;
(L) L63I + G47D + M70Q + M73P + V74F + D83C;
(M) L63I + G47D + M70Q + M73P + V74W + D83C;
(N) L63I + G47D + M73P + V74F + D83C + S98A;
(O) L63I + G47D + M73P + V74W + D83C + S98A;
(P) A62 * + L63I + D83C;
(Q) A62 * + L63I + M73D;
(R) A62 * + L63I + M73D + D83C;
(S) A62 * + L63I + M73P + D83C;
(T) A62 * + L63I + M70Q + D83C;
(U) A62 * + L63I + M73P + D83C + S98A;
(V) A62 * + L63I + M73P + Y75A + D83C;
(W) A62 * + L63I + M73P + D83C + S98V;
(X) A62 * + L63I + M70Q + M73P + D83C;
(Y) A62 * + L63I + M73P + V74A + D83C;
(Z) A62 * + L63I + M73P + V74F + D83C;
(Aa) A62 * + L63I + M70Q + D83C + S98A;
(Bb) A62 * + L63I + G47D + M70Q + D83C;
(Cc) A62 * + L63I + G47D + D83C + S98A;
(Dd) A62 * + L63I + G47D + M73P + D83C;
(Ee) A62 * + L63I + G47D + M73D + D83C;
(Ff) A62 * + L63I + M70Q + M73P + V74F + D83C;
(Gg) A62 * + L63I + M70Q + M73P + V74W + D83C;
(Hh) A62 * + L63I + M70Q + M73P + D83C + S98A;
(Ii) A62 * + L63I + G47D + M73P + V74F + D83C;
(Jj) A62 * + L63I + G47D + M73P + V74W + D83C;
(Kk) A62 * + L63I + G47D + M73P + D83C + S98A;
(11) A62 * + L63I + G47D + M70Q + M73P + V74F + D83C;
(Mm) A62 * + L63I + G47D + M70Q + M73P + V74W + D83C;
(Nn) A62 * + L63I + G47D + M73P + V74F + D83C + S98A;
(Oo) A62 * + L63I + G47D + M73P + V74W + D83C + S98A;
(Pp) L63I + A62K + S98Q;
(Qq) L63I + A62K + S98D;
(Rr) L63I + A62K + S98E;
(Ss) L63I + A62R + S98Q;
(Tt) L63I + A62R + S98D;
(Uu) L63I + A62R + S98E;
(Vv) L63I + S98A;
(Ww) L63I + M73P + D83C + S98D;
(Xx) L63I + M73P + D83C + S98E;
(Yy) L63I + M73P + S98D;
(Zz) L63I + M73P + S98E;
(Aaa) L63I + M73P + S98A;
(Bbb) A62K + L63I + M73P + D83C + S98D;
(Ccc) A62R + L63I + M73P + D83C + S98D;
(Ddd) A62K + L63I + M73P + D83C + S98E;
(Ee) A62R + L63I + M73P + D83C + S98E;
(Fff) A62K + L63I + M73P + S98A;
(Gggg) A62R + L63I + M73P + S98A;
(Hhhh) L63I + G47D + M73P + D83C + S98D;
(Iii) L63I + G47D + M73P + D83C + S98E; and
(Jjj) L63I + M73P. A variant according to any one of the preceding claims, selected from the group consisting of:
(A) A62K + L63I + M73P + D83C + S98Q;
(B) A62K + L63I + M73P + D83C + S98D;
(C) A62K + L63I + M73P + D83C + S98E;
(D) A62K + L63I + S98Q;
(E) A62K + L63I + S98D;
(F) A62K + L63I + S98E;
(G) A62R + L63I + M73P + D83C + S98Q;
(H) A62R + L63I + M73P + D83C + S98D;
(I) A62R + L63I + M73P + D83C + S98E;
(J) L63I + M73P + D83C + S98A;
(K) A62R + L63I + S98Q;
(L) A62R + L63I + S98D;
(M) A62R + L63I + S98E;
(N) L63I + S98A;
(O) A62K + L63I + M73P + D83C + S98D;
(P) A62R + L63I + M73P + D83C + S98D;
(Q) A62K + L63I + M73P + D83C + S98E;
(R) A62R + L63I + M73P + D83C + S98E;
(S) A62K + L63I + M73P + S98A; and
(T) A62R + L63I + M73P + S98A. A mutated gene encoding the mutant of any one of the preceding claims. A composition comprising the variant of any one of the preceding claims and a carrier selected from the group consisting of a cleaning composition carrier and a personal care carrier. 10. The composition of claim 9, wherein said variant to protease ratio is from about 3: 1 to about 1: 1.